CN101351219A - 包含增效比例的干扰素γ和α的稳定的制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以肠胃外(液体或冻干的)或局部(凝胶、油膏或乳膏)方式应用的稳定药物制剂，其包含增效比例的不同量的重组干扰素γ和α以用于治疗涉及组织或器官的恶性或良性非生理学细胞生长的病理学事件。

Description

包含增效比例的干扰素γ和α的稳定的制剂
技术领域
本发明涉及生物技术和医学，特别是稳定的药物制剂，其包含增效比例的重组干扰素γ和α以用于抑制人类的不同组织或器官中的细胞生长。
现有技术
I型干扰素(缩写为IFN)的各种效应形成了其应用的极大治疗潜力。IFN应用在各种类型的癌症治疗中是有益的，其中包括白血病(US5830455)、基底细胞癌(US 5028422)、鳞状细胞癌(US 5256410)、乳腺癌(US 5024833)、胃肠道肿瘤(US 5444064；5814640)和光化性角化病(US 5002764)。不同细胞类型显示出对于IFN的不同敏感性，并且抑制它们生长的浓度可以在广泛的范围内变化(Borden E.等人(1981)Progress in Hematology.第XII卷，Brown EB.，编辑，299-339)，对此显示出在它们抑制细胞生长的能力(Dahl H.(1983).Human interferon and cell growth inhibition.VII.Reversibility of interferon activities.J Interferon Animal，3：327-332；Willson J.K.V.，Bittner G.等人(1984)Antiproliferative activity of human interferons againstovarian cancer cells grown in human tumor stem cell assay.JInterferon Animal，4：441-447；Hu R.，Gan Y.等人(1993)Evidence for multiple binding sites for several components ofhuman lymphoblastoid interferon-alpha.J Biol Chem，268：12591-12595)以及抗肿瘤活性(Quesada JR.，Talpaz M.等人(1986)Clinical toxicity of interferons in cancer patients：to review.J Clin Oncol，4：234-243)方面的差异。
IFN在癌症治疗中的使用仍未满足从体外研究和这些有力的生物分子所具有的性质中所产生的期望。已测试了不同的治疗方案但无明显的有益效果和影响(Strander H.和Oberg K.，(1992)Clinical useof interferons.Solid tumors INTERFERON.Principles andMedical Applications.Publishing Baron S.，Coppenhaver DH.，Dianzani F.，Fleischmann WR.，Jr.Hughes TK.，Jr.KlimpelGR.，Niesel DW.，Staton GJ.和Tyring SK.，533-561)。
在为了实现疗法的更佳效应的努力中，以高剂量使用IFN，但由于各种因素，未出现预期的有益有效应答，在所述因素中包括由所述剂量产生不良反应(Lane H.C.(1990)Interferon-alpha in patientswith asymptomatic human immunodeficiency virus(HIV)infection.A randomized，placebo-controlled trial.Annals of internalMedicate，112：805-811)。
此外，已经以利用其增效效应的组合形式来使用IFNs。IFNα和IFNγ的组合已在使用来自瘢痕瘤成纤维细胞的培养物的体外研究中得到描述(Tredget EE.，Wang R.等人(2000)Transforming growthfactor-beta mRNA and protein in hypertrophic scar tissues andfibroblasts：antagonism by IFN-alpha and IFN-gamma in vitro andin vivo.J Interferon Cytokine Animal，20：143-151)。在这项工作中，提及了IFNα和γ的组合利用，但所得到的数据来自体外和来自源于来自儿童的瘢痕瘤的细胞。这些作者未进行任何临床试验，并且未评估所述IFN组合对于成人瘢痕瘤的细胞的影响，所述成人瘢痕瘤是干扰素的弱应答者。
专利EP 0107498显示了在黑素瘤Hs294T的细胞系中的干扰素α和γ的组合，但未描述在其他类型的细胞如基底细胞癌、成胶质细胞瘤(GL-5)或喉癌(HEp-2)的原代培养物中的这种效应。
对于肾和肺转移的治疗，还描述了天然IFNα和重组IFNγ的交替利用(Fujii A.，Yui-In K.等人(1999)Preliminary results of thealternating administration of natural interferon-alpha andrecombinant interferon-gamma for metastasic renal cellcarcinoma BJU Int.；84：399-404)。IFNα2或α4或杂合体δ4α2 Bgl II α1与IFNγ的组合已在细胞系RT4(膀胱癌)和A21829(肺腺癌)中得到描述，并具有比单独的I型IFN或IFNγ更佳的抗增殖效应(Hubbell H.R.，Craft J.TO.等人(1987)Synergisticantiproliferative effect of recombinant alpha-interferons withrecombinant gamma-interferon.J Biol Response Mod，6：141-153)。IFNγ(1000 IU/mL)和IFNα2(1000 IU/mL)中的增效效应已在细胞系A459(肺泡肿瘤)(Martyre M.C.，Beaupain R.等人(1987)Potentiation of antiproliferative activity by mixof human recombinant IFN-alpha 2 and-gamma on growth of humancancer nodules maintained in continuous organotypic culture.Eur J Cancer Clin Oncol，23：917-920)以及从大细胞未分化性癌建立的细胞系(Hand A.，Pelin K.等人(1993)Interferon-alpha andinterferon-gamma combined with chemotherapy：in vitrosensitivity studies in non-small cell lung-cancer cell lines.Anticancer Drugs，4：365-368)中显示。
IFNα和IFNγ的组合已在使用细胞系HepG2的研究中(MizukoshiE.，Kaneko S.等人(1999)Up-regulation of type I interferonreceptor by IFN-gamma.J Interferon Cytokine Animal，19：1019-1023)和在细胞系AVA5中(Okuse C.，Rinaudo J.A.等人(2005)Enhancement of antiviral activity against hepatitis C virus invitro by interferon combination therapy.Antiviral Animal，65：23-34)得到描述。这些作者未测定抗增殖效应，也未测定在细胞系HepG2中α和γ干扰素的组合的更有效的比例。此外，已在细胞系Hepal-6(鼠类肝瘤)中探究了TNFα和IFNγ的增效效应(SasagawaT.，Hlaing M.等人(2000)Synergistic induction of apoptosis inmurine hepatoma Hepal-6 cells by IFN-GAMMA and TNF-alpha.Biochem Biophys Common Animal，272：674-680)。
在专利US 5190751中，描述了IFNα和γ的组合对于B型和T型白血病细胞系的生长的抑制。在所评估的T细胞系中均未观察到生长抑制效应的增强，并且在某些实验条件下，所述组合的效应是拮抗性的。在专利EP 010749和一个出版物(Czarniecki C.W.，Fennie C.W.等人(1984)Synergistic antiviral and antiproliferativeactivities of Escherichia coli-derived human alpha，beta，andgamma interferons.J Virol.49：490-496)中，也显示了，IFNα和γ的组合不一定是增效的，而且可以是拮抗性的。提及但并未显示在非常广泛范围内的所述组合的功效。
这些数据说明，应当就实验限定来评估IFNα和γ的组合的利用，所述实验限定允许鉴定何种条件是对于建立用于治疗给定组织或器官中不适当的细胞生长的最佳组合来说有利的条件。由于这个原因，为了支持治疗和适当的剂量，应当在体外实验和对照临床试验中进行评估。
在使用神经胶质瘤细胞系的研究中，IFNγ影响恶性特征例如所研究的肿瘤细胞的增殖和迁移(Knupfer M.M.，Knupfer H.等人(2001)Interferon-gamma inhibits growth and migration of A172 humanglioblastoma cells.Anticancer Animal，21：3989-3994)。另外，已报道了使用IFNγ来治疗神经胶质瘤的阴性结果(Mahaley M.S.，Bertsch L.，Jr.等人(1988)Systemic gamma-interferon therapyfor recurrent gliomas.J Neurosurg，69：826-829)。已证明IFNγ和IFNβ的同时使用在抑制细胞系GBM-18(多抗药性星形细胞瘤)的生长中是有效的(Reddy P.G.等人(1991)Systemicgamma-interferon therapy for recurrent gliomas.J Natl CancerInst，83：1307-1315)。此外，已描述了用于治疗这些肿瘤的IFNγ与α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO)的组合(US 4499072)。专利US 5002879描述了在靠近由淋巴因子和IL-2激活的杀伤细胞之处使用DFMO的类似疗法。就IFNα而言，它与其他药物的组合在神经胶质瘤的治疗中没有有利效应，并且显示出毒性(Buckner J.C.，Burch P.A.等人(1998)Phase II trial of recombinant interferon-alpha-2a andeflornithine in patients with recurrent glioma.J Neurooncol.36：65-70；Chang S.M.，Barker F.G.等人(1998)High dose oraltamoxifen and subcutaneous interferon alpha-2a for recurrentglioma.J Neurooncol，37：169-176)。那么，根据体外实验和临床试验，基于其组合的比例的适当选择，通过组合使用IFNα和IFNγ可以有利于这种肿瘤类型的治疗。
喉是口腔后的上呼吸消化道的第二个较常见的癌症位置。喉癌是最常见的头与颈肿瘤，并且最通常的喉癌是鳞状细胞癌(占所有情况的95％)。在喉肿瘤T3和T3的情况下的存活在大约30％的实施了喉切除术的患者中只有5年(Djordjevic V.，Milovan ovic J.等人(2004)Radical surgery of the malignant laryngeal tumors.Minutes Chir Lugosl，51：31-35)。已显示，放射疗法和化学疗法对于这种癌的治疗并不有效(Chen W.，Guo X.等人(2004)Long-termfollow-up observation of clinical therapy for laryngealcarcinoma recurrence and cervical metastasis Lin Chuang Er BiYan Hou Ke Za Zhi.18：536-537)。
然而，已证明综合化学疗法连同使用IFNα一起在喉癌治疗中是有益的(Mantz C.A.，Vokes E.E.，(2001)Sequential inductionchemotherapy and concomitant chemoradiotherapy in themanagement of locoregionally advanced laryngeal cancer AnnOncol，12：343-347)。在II期试验中作为对于喉癌的疗法评估了IL-2和IFNα的组合，但结果并不令人满意(Clayman G.L.，Young G.等人(1992)Detection of regulatory factors oflymphokine-activated killer cell activity in head and neckcancer patients treated with interleukin-2 and interferon alpha.Ann Otol Rhinol Laryngol，101：909-915)。在喉肿瘤的治疗中存在的进展很少。IFNα和γ的组合使用将能够促进改善现有疗法以对抗这种类型的肿瘤。
专利US 5503828描述了干扰素组合物，其特征在于包含至少50％的IFNα2和IFNα8的等位基因以及一个或多个在由IFNα4、α7、α10、α16、α17和α21形成的组中的另外IFN类别。同时，专利US 4503035显示了某些IFNα类别的制剂，但其不包括α1、α5、α14和IFNω。这些专利未描述由重组IFNγ和IFNα2的组合形成的制剂。
专利US 5762923详细描述了在水中稀释的干扰素液体组合物，其具有数量足以稳定IFNα的非离子型去污剂和苯甲醇，所述组合物另外还包含酸缓冲剂。另一方面，专利US 4847079描述了干扰素和硫柳汞的药物组合物，而专利US 4675184显示了干扰素制剂，其含有多元醇和有机缓冲剂作为稳定剂以及pH3-6的常规载体或稀释剂。该组合物可以另外具有阴离子型表面活性剂和/或白蛋白作为稳定剂。在专利US 5236707和US 5431909中描述了使用作为稳定剂的胺类(脂肪族伯胺)和锂的有机盐，其保护干扰素不被降解且使之稳定。
专利US 4496537涉及干扰素α的稳定的液体制剂，其包括人血清白蛋白组合物、和丙氨酸或甘氨酸、水和能够维持pH 6.5-8.0的缓冲系统。
专利US 5935566描述了干扰素α的稳定制剂，在其组成中包括能够使pH维持在4.5-7.1范围内的缓冲系统、作为稳定剂的聚山梨酯80、作为螯合剂的EDTA、作为等渗剂的氯化钠和作为抗微生物防腐剂的间甲酚。
专利US 0170207描述了干扰素α的稳定制剂，在其组成中包括能够使pH维持在4.5-9.0范围内的缓冲系统、稳定剂、非离子型表面活性剂和渗透压调节剂。
在申请WO 89/04177中描述了干扰素γ的液体药物制剂，其包含使pH维持在4.0-6.0范围内的缓冲溶液、多羟基糖(作为稳定剂)和非离子型去污剂。专利US 4895716涉及用于在甘氨酸/乙酸盐缓冲溶液中，使用乳糖酸稳定干扰素γ的组合物和方法。
专利US 5676942描述了由从天然来源获得的但不与干扰素γ相组合的I型干扰素的亚型所形成的药物组合物，并且未限定那些组合的比例，只描述了用于病毒感染而不是用于肿瘤治疗的那些组合。在先前描述的报道中，均没有利用、表征或提及以增效组合一起包含重组IFNγ和α2的药物制剂。当它们以确定比例进行混合时，存在这样的可能性，即组合利用IFNγ和I型IFN来治疗对于已建立的疗法和/或其组合具有不同程度的抗性的细胞生长。
考虑到这些前提，需要开发包含这些IFN的稳定药物制剂，这些IFN的比例允许它们在具有良性或恶性组织形成的个体中的安全、有效、简单和广泛使用。这将允许更佳地管理所述组合，并且使得在需要这些治疗的患者的治疗中的使用更可行。
发明详述
本发明解决了先前提及的问题，提供了通过肠胃外(液体或冻干的)或局部(凝胶、油膏或乳膏)途径应用的稳定的药物制剂。它们包含增效比例的不同量的重组干扰素γ和α以用于治疗特征在于组织或器官的恶性或良性非生理学细胞生长的病理学事件，并且其另外还包含药学上可接受的赋形剂或载体。
这些制剂是使用对于IFN具有不同敏感性的细胞系的体外测定法和在不同肿瘤实体中的临床试验的结果，以及对于重组IFNγ和α2在药学上可接受的不同赋形剂或载体存在下的生物学和物理化学稳定性所进行的评估的结果。
冻干的稳定药物制剂由在能够维持pH 4.9-7.5的缓冲溶液中混合的重组IFNγ和α2组成，所述缓冲溶液可以是乙酸铵或钠、琥珀酸钠、磷酸钠和/或钾或者柠檬酸/磷酸钠。
这些制剂还由至少一种选自非还原糖化合物、氨基酸、表面活性剂和稳定聚合物的组分组成。非还原糖可以是蔗糖或海藻糖；氨基酸可以是甘氨酸、组氨酸或亮氨酸；而作为表面活性剂可提及聚山梨酯20或聚山梨酯80，和作为稳定化聚合物可提及聚乙二醇、葡聚糖或羟乙基淀粉。
本发明的一个实施方案限定，缓冲溶液应以10-20mM的浓度范围使用。蔗糖或海藻糖应以5-100mg/mL使用；甘氨酸、组氨酸或亮氨酸应以1-20mg/mL的浓度范围使用；聚山梨酯应以0.01-1mg/mL使用；而聚乙二醇、葡聚糖和羟乙基淀粉以5-50mg/mL的浓度范围使用。
本发明的几个实施方案描述了冻干的稳定药物制剂，其包含浓度范围为5.6x108IU-1.4x108IU的重组IFNγ和浓度范围为6.8x108IU-1.7x108IU的重组IFNα2；或浓度范围为2.0x108IU-0.5x108IU的重组IFNγ和浓度范围为12.0x108IU-3.0x108IU的重组IFNα2；或浓度范围为4.0x108IU-1.0x108IU的重组IFNγ和浓度范围为80x108IU-20x108IU的重组IFNα2；以及0.0802g磷酸二氢钾、0.249g二水合磷酸氢二钠、4g蔗糖、0.8g甘氨酸、0.03g Tween 20、1g聚乙二醇6000和对于100mL来说足够量的注射用水，并且对于0.5mL、1mL、5mL和10mL采用各自的等价比例。
在等效线图(isobologram)分析后，获得了对于使重组IFNγ和IFNα以限定组合范围进行混合的限定。在冻干的稳定药物制剂之一中，浓度为5.6x108IU-1.4x108IU的重组IFNγ和浓度范围为6.8x108IU-1.7x108IU的重组IFNα2是根据源自瘢痕瘤(Kel 5a，Kel 17a)和源自CBC III的原代培养物的生长抑制的研究结果而得到的。等效线图分析后，鉴定出了100IU/mL(10ng/mL)重组IFNγ与100IU/mL(0.5ng/mL)重组IFNα2b的组合，其分别使体外细胞生长减少21％、43％和47％的(参见实施例1、2和3，图1、2、3和4，表1)。
使用临床试验和通过同情(compassion)治疗的病例的报道，定义了浓度范围为2.0x108IU-0.5x108IU的重组IFNγ和浓度范围为12.0x108IU-3.0x108IU的重组IFNα2的混合物。随机化的、具有对照的三盲临床试验评估了利用上文限定的稳定的冻干制剂在具有基底细胞癌的患者中进行的损伤内(I.L.)治疗的功效(参见实施例7，表9、10、11和12)。
在同样有助于限定这些比例的通过同情治疗的病例的报道中，治疗了患有表皮样癌的患者(患者1)和患有复发的多发性基底细胞癌并具有先前移植的患者(患者2)(分别参见实施例8，图5a、b、c、d，患者1；和图6a、b、c，患者2)。
使用来自下述研究的结果分析限定了包含浓度范围为4.0x108IU-1.0x108IU的重组IFNγ和浓度范围为80x108IU-20x108IU的重组IFNα2的制剂：通过50IU/mL(5ng/mL)重组IFNγ与100IU/mL(0.5ng/mL)重组IFNα2b来抑制成胶质细胞瘤(GL-5)细胞的生长。以这种方式，达到55％的生长抑制(实施例3)。此外，考虑了使用细胞系HEp-2的研究的分析。在这种情况下，IFN的量是5IU/mL(0.5ng/mL)重组IFNγ与75IU/mL(0.375ng/mL)重组IFNα2b。以此达到最佳组合，从而使体外细胞生长减少76％(参见实施例1、2和3)。
另外开发了液体的稳定药物制剂。在这些制剂中，如对于冻干制剂所描述的来维持重组IFNγ和α的比例，但改变它们的药物学成分以对于这些IFN混合物达到更大的稳定性。
由于这项工作，本发明的一个实施方案描述了液体的稳定药物制剂，其包含缓冲溶液以及至少一种选自非还原糖、氨基酸、表面活性剂、稳定化聚合物、抗氧化/螯合化合物和等渗剂的组分。这些制剂使用水性溶剂，所述溶剂可以包含或不包含防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯的混合物。
本发明的另一个实施方案在于限定了液体的稳定药物制剂，所述液体的稳定药物制剂使用能够维持pH 4.9-6.5的缓冲溶液。这种缓冲剂可以是乙酸铵或钠、琥珀酸钠、磷酸钠和/或钾、柠檬酸盐-磷酸盐。这些制剂可以使用聚山梨酯20或聚山梨酯80作为表面活性剂；使用EDTA或乙酰基-半胱氨酸作为抗氧化剂/螯合剂；而作为氨基酸可以包括组氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸或赖氨酸。作为稳定化聚合物使用羟乙基淀粉或葡聚糖，和作为等渗剂使用氯化钠、氯化钾、丙二醇、甘露醇、甘油、蔗糖或海藻糖。
本发明的一个优选实施方案限定，液体的稳定药物制剂利用浓度范围为10-100mM的缓冲溶液。在这种制剂中，以0.01-1mg/mL的浓度范围使用聚山梨酯；以0.01-1mg/mL的浓度范围使用EDTA或乙酰基-半胱氨酸；以1-20mg/mL的浓度使用组氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸或赖氨酸；以5-50mg/mL的浓度范围使用羟乙基淀粉和葡聚糖，和其中存在足够量的等渗剂以使得该溶液为等渗的。
其他实施方案解释了对于前述重组IFNγ和α的混合物的物理化学和生物学稳定性来说所需的液体稳定药物制剂的所有药物学成分的量。这些液体制剂除IFN外还包含0.708g乙酸钠、0.079mL乙酸、0.01g Tween 20、5g甘露醇和对于100mL来说足够量的注射用水，并且对于0.5mL、1mL、5mL和10mL采用各自的等价比例。
本发明定义了对于治疗良性或恶性的细胞过度生长有利的IFNγ和α的混合物的比例。这将允许使用更小的剂量、更短的治疗时间来维持相同的疗效，或实现超过至今在使用干扰素治疗肿瘤或细胞生长的其他异常事件中已达到的效果。降低剂量将允许预期出现其更少的不良效应或更小的强度，这将为患者提供更佳的生活质量并使得他们能够获得使用这些有力药物的益处。
本发明定义了先前未被描述的重组IFNγ和IFNα2的混合物的制剂，所述制剂有助于这种治疗性组合的管理和临床使用以及其商品化。
本发明中描述了用于抑制增殖的、包含增效比例的重组IFNγ和α2混合物的、冻干和液体的稳定药物制剂，其具有广泛范围的临床用途。体内利用这些制剂显示，在重要的肿瘤学疾病中，以同时和肿瘤内组合形式进行使用时，重组IFNγ和IFNα2的组合是有效的。
当与关于其分开的组分而获得的效应相比较时，这种组合能够在更短的时间中和以更高的美学(esthetic)效果对肿瘤具有相等的治愈效应。这些组合的使用将允许包括对抗癌症的更大的治疗可能性。在本发明的一个实施方案中集合了这些组合，在所述实施方案中显示出，所述冻干或液体制剂可以用于治疗良性或恶性实体瘤，其独立地或与化学疗法、放射疗法或两者的组合联合使用。
这些制剂与其他治疗剂的联合使用得到了从下列获得的结果的支持：使用重组IFNγ和IFNα2的组合连同顺铂一起治疗患巨大基底细胞肿瘤的患者(参见实施例10和图9)。
本发明中描述了干扰素γ和α2的联合使用如何允许减少和/或治愈预后极差和扭曲美学效果的肿瘤。
根据其中不受控制的细胞生长占优势的几种良性和肿瘤学实体的特征，它们可以易受使用这些制剂治疗的影响。其中有：来自造血组织的细胞的肿瘤例如急性或慢性髓细胞性白血病、急性或慢性淋巴细胞性白血病、以及T或B细胞白血病和中枢神经系统淋巴瘤。还可以治疗喉癌、喉乳头状瘤病、脂肪瘤、表皮样和真皮内囊肿、脂肪肉瘤、神经纤维瘤和皮脂增生。使用这些药物制剂可以获益的是来自外周和中枢神经系统的肿瘤，例如星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、室管膜细胞瘤、神经节瘤、纤维性星形细胞瘤、混合性神经胶质瘤、少突神经胶质细胞瘤、视神经神经胶质瘤、原始神经外胚层瘤、听神经瘤、脊索瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤病、脑假瘤、结节状硬化、转移性脑肿瘤。待治疗的其他易感的肿瘤是海绵状血管瘤、肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生、松果体瘤、垂体腺瘤、血管肿瘤、脑脊膜癌病、樱桃样血管瘤、皮脂腺增生。皮肤肿瘤例如基底细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤纤维瘤、脓性肉芽肿、真皮痣、以及脂溢性和光化性角化病可以从使用这些药物制剂的治疗中获益。
本发明的另一个实施方案描述，这些制剂也可以用于治疗增生性事件例如纤维化、发育异常和增生。
根据在实施例7、8和10中进行和描述的临床试验的结果，作为本发明的实施方案，限定了所述制剂的肌内、肿瘤内和损伤周围的应用方式。
其他实施方案描述了局部的稳定药物制剂的应用，其包含浓度范围为0.32x106IU-0.08x106IU的IFNγ和浓度范围为2.0x106IU-0.5x106IU的IFNα2/克半固体。该制剂是由2.2％IFNγ、0.58％IFNα、4％鲸蜡醇、10％凡士林、2％Tween 60、0.2％对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯组成的乳膏。此外，油膏的组成被限定为2.2％IFNγ、0.58％IFNα、60％白色固体矿脂(petrolate)、10％重质液体矿脂、3％Span 20、以及0.2％对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。最后，凝胶制剂由2.2％IFNγ、0.58％IFNα、0.5％卡波普940、0.2％对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、0.2％氢氧化钠、0.01％乙二胺四乙酸二钠钙和2％乙醇组成。
所有这些制剂对于温度波动具有抵抗力，这对于该产品的生产、其运输和贮存是有利的。它们防止干扰素聚集，并因此呈现出在该产物的延长使用期间导致免疫原性的更小风险。半固体的制剂允许由患者自身以非侵入性且安全的形式进行使用。
作为本发明的另一个实施方案定义了使用这些局部的稳定制剂用于治疗皮肤或粘膜的良性或恶性实体瘤，其独立地或与化学疗法、放射疗法或两者的组合联合使用。
本发明的另一个实施方案描述了，局部的稳定药物制剂可以用于治疗脂肪瘤、表皮样和真皮内囊肿、脂肪肉瘤、神经纤维瘤、皮脂增生、血管瘤、局灶性结节性增生、室管膜细胞瘤、神经节瘤、纤维性星形细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体腺瘤、血管肿瘤、脑脊膜癌病、神经纤维瘤病、樱桃样血管瘤、皮脂腺增生、基底细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤纤维瘤、脓性肉芽肿、真皮痣、脂溢性和光化性角化病、和湿疣。
本发明的另一个实施方案描述了试剂盒的配置，其具有包含重组IFNγ的小瓶、包含重组IFNα的小瓶(浓度和关系如先前描述)，以及包含足够量的注射用水的小瓶(用于稀释和/或溶解IFN)。该试剂盒具有合适的注射器和针头以用于IFN的同时施用，所述IFN在包含所述IFN之一的小瓶之一中预先混合。
附图简述：
图1：1000IU/mL重组IFNγ或IFNα2对于源自具有瘢痕瘤的成人患者活组织检查物的成纤维细胞原代细胞培养物的生长抑制。
图2：重组IFNγ和IFNα2b的组合对于来自瘢痕瘤(Kel5a)的成纤维细胞原代细胞培养物的细胞生长抑制的等效线图。
图3：重组IFNγ和IFNα2b的组合对于来自瘢痕瘤(Kel17a)的成纤维细胞原代细胞培养物的细胞生长抑制的等效线图。
图4：重组IFNγ和IFNα2b的组合对于来自基底细胞癌(CBC III)的成纤维细胞原代细胞培养物的细胞生长抑制的等效线图。
图5：重组IFNγ和IFNα2b的组合对于成胶质细胞瘤细胞系GL-5的细胞生长抑制的等效线图。
图6：重组IFNγ和IFNα2b的组合对于来自喉癌细胞系HEp-2的细胞生长抑制的等效线图。
图7：用重组IFNγ和IFNα2b的组合进行治疗的具有表皮样癌的患者。
图8：用重组IFNγ和IFNα2b的组合进行治疗的具有复发性基底细胞癌的患者。
图9：用重组IFNγ和IFNα2b的组合以及顺铂进行治疗的具有复发性基底细胞癌的患者。A：治疗前，B：治疗1年后。
具体实施方案/实施例
实施例1：重组IFNγ和α对于原代细胞培养物的细胞生长抑制。
皮肤活组织检查物得自正常皮肤和发展出基底细胞癌或瘢痕瘤的患者，后者是源于手术或烧伤的损害而引起的。将组织样品立即置于DMEM培养基中并且处理以通过移植法获得原代培养物。对于重组IFNγ和α的抗增殖效应的评估，评估了下述原代培养物：来自瘢痕瘤(1、2、5、7、8、15、17、19、20、24、26、27、31、32)的成纤维细胞原代培养物(CPF)，来自基底细胞癌(CBC III)的CPF和来自正常皮肤(FibN3和FibN5)的CPF。CPF生长在包含庆大霉素(50μg/ml)和12％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640/DMEM培养基混合物中。所有培养物在具有5％湿度的CO2培养箱中于37℃温育。为了测定IFN的抗增殖效应，将细胞以5x104细胞/mL接种在96孔平板中。通过在接种后24小时更换新鲜培养基来使它们同步。在96小时温育结束时，在不同浓度的IFN存在下利用结晶紫染色法来测定3次重复的评估实验条件的生存力，其中测量在580nm处的吸光度并利用平板阅读器。结果定义为基于活细胞计数的生长％：
生长％＝(AT72小时-AC0小时/AC72小时-AC0小时)x100，
AT72小时＝处理72小时的细胞的吸光度，
AC72小时＝处理72小时的对照细胞的吸光度，
AC0小时＝在用IFN处理前的细胞的吸光度。
在图1中显示了重组IFNγ或α对于瘢痕瘤CPF生长的抗增殖作用。尽管在各种原代培养物中可以观察到IFNγ或α2b抑制细胞增殖，而在其他中它们刺激其生长。作为对照评估了FibN3和FibN5原代培养物，以及来自CBC III活组织检查物的原代培养物，和HEp-2、U1752和GL-5细胞系。
实施例2：重组IFNγ或α对于建立的细胞系的细胞生长抑制。
所研究的人细胞系是：Jurkat(ATCC，TIB-152)、GL-5(Perea S.E.等人(1993)Minutes Cient Venez，44：22-27)、HEp-2(ATCC，CCL23)。细胞GL-5培养在DMEM中，并且HEp-2培养在包含庆大霉素(50μg/ml)和10％FBS的MEM-CANE中。将Jurkat细胞温育在具有庆大霉素和10％FBS的RPMI培养基中。所有培养物在具有5％湿度的CO2培养箱中于37℃温育。为了评估对于GL-5和HEp-2细胞的抗增殖效应，将这些细胞3x104细胞/mL接种。在Jurkat细胞的情况下，将其以105细胞/mL接种。在不同浓度的IFN存在下温育72小时后，利用结晶紫染色法评估3次重复的生存力，其中测量在580nm处的吸光度并利用平板阅读器。如实施例1中描述的，将结果定义为基于活细胞计数的生长％。如在表1和图1中观察到的，细胞系HEp-2(喉癌)和GL-5(来自成胶质细胞瘤)对于IFNγ非常敏感而对于IFNα不敏感。
表1.1000IU/mL IFNγ或IFNα2b对于细胞系的细胞生长抑制。
Figure A20068005024200201
在表1中观察到，细胞系HepG2(肝瘤)对于这些IFN不敏感，并且在细胞系Jurkat(T淋巴瘤)中，IFNα是最有效的，该结果与IFNα2在治疗来自淋巴组织的肿瘤中的成功利用相一致。
实施例3：重组IFNγ和α的组合对于原代培养物和细胞系具有更有效的抗增殖作用。
利用CBC-III和瘢痕瘤(Kel-5a和Kel-17a)CPF以及细胞系HEp-2和GL-5，来对重组IFNγ和α2b的组合进行研究，以限定具有抑制细胞生长的增效活性的最佳混合物。分析在所述研究中获得的数据，以建立等效线图。根据源自成人瘢痕瘤(kel 5a和kel 17a)的活组织检查物的CPF的等效线图研究，确定了，用于抑制生长的最佳增效组合应当由100IU/mL(10ng/mL)IFNγ和100IU/mL(0.5ng/mL)IFNα2b组成。使用那种组合，细胞生长在体外减少20％(Kel 5a)和43％(Kel 17a)(图2和3)。
在图4的等效线图中显示了，100IU/mL(10ng/mL)IFNγ和100IU/mL(0.5ng/mL)IFNα2b的组合是增效的，并且在减少CBC III的体外细胞生长中是最有效的，为47％。
根据图5中显示的等效线图，抑制GL-5细胞生长的最佳增效组合是50IU/mL(3ng/mL)IFNγ和600IU/mL(5ng/mL)IFNα2b。使用那种组合，体外细胞生长减少55％。
在图6中表示的等效线图中，显示了用于获得对于HEp-2细胞的最佳抗增殖效应的IFNγ和α的最佳增效组合。IFN的量为5IU/mL(0.5ng/mL)IFNγ和75IU/mL(0.375ng/mL)IFNα2b。使用那种最佳组合达到体外细胞生长减少76％。
实施例4：pH、离子种类和缓冲溶液的浓度对于干扰素α-2b和γ在水溶液中的混合物的稳定性的影响。
为了研究重组干扰素γ和α的增效组合的液体和冻干制剂的稳定性，从它们在不同的试验制剂中的相应活性药物成分(IFA)对IFN进行稀释：缓冲溶液、具有单种赋形剂的缓冲溶液混合物和具有多种赋形剂的缓冲溶液混合物。对于不同制剂的小瓶的代表性样品实施不同处理以评估干扰素的稳定性：冻融循环、冻干、于37℃搅动、光和温度的影响。在不同的加工后，通过不同测定法来评估物理化学稳定性：物理外观、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、反相液相层析(RP-HPLC)和分子排阻层析(ME-HPLC)。通过对于每种干扰素特异的免疫酶测定法(ELISA)和通过关于病毒致细胞病变效应的抑制的生物学测定法来评估生物学稳定性。
所有这些制剂设计研究使用中间浓度的干扰素的混合物(0.5MIUIFNγ和3.0MIU IFNα2b)来进行。使用获得的制剂的最终变化形式(一式两份地制备)，制备了增效组合物并评估了其稳定性。
感观特征：通过对于制剂的外观进行分析来进行测定(是否保持无色、透明和无蛋白质聚集)。在冻干制剂中，还分析了冻干产物的外观。
水份含量：冻干产物的残留水份的含量通过Karl Fischer碘量滴定技术来进行测定，其中使用湿度测量仪Radiometer(Model TIM550)。
化学稳定性：蛋白质的纯度和降解程度在配备有C8 Vydac柱防护装置的C8 Vydac柱(Vydac，Hesperia，CA)中通过RP-HPLC进行测定，其中使用配备有溶剂释放、二极管排列检测器、烤箱和数据处理系统的Merck-Hitachi HPLC系统。蛋白质的纯度还通过SDS-PAGE进行测定。
聚集物测定：重组IFNγ和IFNα2b的聚集通过分子排阻HPLC进行测量，其中使用Superdex-75 HR 10/30柱(Amersham PharmaciaBiotech AB，Sweden)，以及配备有溶剂释放系统、二极管排列检测器、烤箱和数据处理系统的Merck-Hitachi HPLC系统。共价聚集物的含量通过SDS-PAGE进行测定。
干扰素α的ELISA：在我们的实验室中已开发了这种测定法(H.Santana.，Espino Y.等人(1999)Asandwich type enzyme-linkedimmunosorbent assay for the analysis of recombinant humaninterferon α-2b.Biotechnology Techniques，13，341-346)。该测定法使用单克隆抗体并根据所报告的方法来进行。测量结果在本文中报告为在来自每种制剂变化形式的不同样品中干扰素α-2b的残留ELISA活性的百分比，以最初样品中的ELISA活性作为100％。
干扰素γ的ELISA：在我们的实验室中已开发了这种测定法(Bouyón R.，Santana H.等人(2003)Development and validationof an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for recombinanthuman gamma interferon.Journal of Immunoassay andImmunochemistry，24：1-10)。该测定法使用单克隆抗体并根据所报告的方法来进行。测量结果在本文中报告为在来自每种制剂变化形式的不同样品中干扰素γ的残留ELISA活性的百分比，以最初样品中的ELISA活性作为100％。
抗病毒生物活性的定量：生物活性的测量如Ferrero J.，Ochagavia ME.等人(1994，Titulación de la actividad antiviraldel interferón utilizando el sistema de equipos SUMA.Biotecnología Aplicada，11：34-42)所述的来进行。生物活性的计算如Ferrero J.，Duany L.等人(1997，Nuevo programa de cálculo，cuantificación de la actividad antiviral de interferonesmediante la inhibici ón del efecto citopatogénico utilizando elsistema de equipos SUMA.Biotecnología Aplicada，14：267-269)所述的来进行。在本文中将生物活性报告为残留生物活性的百分比，以最初样品的生物活性作为100％。为了了解pH在活性成分的稳定性中的影响，制备了在不同缓冲溶液中包含0.5MIU IFNγ和3.0MIU IFNα2b的不同制剂；即，柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和乙酸盐缓冲液。制备包含重组IFNγ和IFNα2b的混合物与缓冲溶液的制剂并对其实施冻融循环或贮存于45℃，并且以不同时间间隔通过ELISA进行分析。将这些制剂制备为具有4-8的pH，并且所有缓冲溶液浓度为0.1M。表2、3和4报告了在3次冻融循环后和以确定的时间间隔，于45℃从3-12天进行的测定法的结果。
表2.在不同pH的0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲水溶液中，重组IFNγ和IFNα2b混合物(0.5MIU IFNγ和3.0MIU IFNα2b)于45℃和在冻融循环期间的稳定性。
IFNγ和IFNα2b的浓度以百分比(％)表示。
Figure A20068005024200241
D＝天；ND＝无法测定。
IFN/4＝在柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液pH 4.0中的制剂；
IFN/5＝在柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液pH 5.0中的制剂；
IFN/6＝在柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液pH 6.0中的制剂；
IFN/7＝在柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液pH 7.0中的制剂；
IFN/8＝在柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液pH 8.0中的制剂。
表3.在不同pH的0.1M磷酸盐缓冲水溶液中，重组IFNγ和IFNα2b混合物(0.5MIU IFNγ和3.0MIU IFNα2b)于45℃和在冻融循环期间的稳定性。
IFNγ和IFNα2b的浓度以百分比(％)表示。
Figure A20068005024200251
D＝天；ND＝无法测定。
IFN/5＝在磷酸盐缓冲液pH 5.0中的制剂；
IFN/6＝在磷酸盐缓冲液pH 6.0中的制剂；
IFN/7＝在磷酸盐缓冲液pH 7.0中的制剂；
IFN/8＝在磷酸盐缓冲液pH 8.0中的制剂。
来自这些表(2、3、4)的数据表明，具有5-8的pH值的制剂在冻融循环期间具有足够的稳定性，优选地对于接近于5和7的pH和在乙酸盐、磷酸盐和柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中。对于5-5.6的pH值，在水溶液中的热稳定性更大，优选地在乙酸盐和磷酸盐缓冲液中。
来自表5的数据表明，缓冲剂浓度较高的制剂在pH 5.5下在冻融循环期间显示出比浓度较低的那些制剂更好的稳定性，特别是对于在不同的评估缓冲液中的IFNγ。然而，在pH 5.5下热稳定性的结果在乙酸盐缓冲液中更好，随后为磷酸盐。未观察到对于浓度的依赖性。在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的热稳定性在低浓度的缓冲液中更好。
表4.在不同pH的0.1M柠檬酸盐缓冲和乙酸盐缓冲水溶液中，重组IFNγ和IFNα2b混合物(0.5MIU IFNγ和3.0MIU IFNα2b)于45℃和在冻融循环期间的稳定性。
IFNγ和IFNα2b的浓度以百分比(％)表示。
Figure A20068005024200261
D＝天；ND＝无法测定。
IFN/C4＝在柠檬酸盐缓冲液pH 4.0中的制剂；
IFN/C5＝在柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中的制剂；
IFN/C6＝在柠檬酸盐缓冲液pH 6.0中的制剂；
IFN/A4＝在乙酸盐缓冲液pH 4.0中的制剂；
IFN/A5＝在乙酸盐缓冲液pH 5.0中的制剂；
IFN/A5.6＝在乙酸盐缓冲液pH 5.6中的制剂。
表5.在不同浓度的柠檬酸盐-磷酸盐、磷酸盐和乙酸盐缓冲水溶液pH 5.5中，重组IFNγ和IFNα2b混合物(0.5MIU IFNγ和3.0MIU IFNα2b)于45℃和在冻融循环期间的稳定性。
IFNγ和IFNα2b的浓度以百分比(％)表示。
Figure A20068005024200271
D＝天；ND＝无法测定。
IFN/C-F25：在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 5.5，25mM)中的制剂；
IFN/C-F50：在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 5.5，50mM)中的制剂；
IFN/C-F100：在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 5.5，100mM)中的制剂；
IFN/Fk25：在磷酸钾缓冲液(pH 5.5，25mM)中的制剂；
IFN/Fk50：在磷酸钾缓冲液(pH 5.5，50mM)中的制剂；
IFN/Fk100：在磷酸钾缓冲液(pH 5.5，100mM)中的制剂；
IFN/FNa25：在磷酸钠缓冲液(pH 5.5，25mM)中的制剂；
IFN/FNa50：在磷酸钠缓冲液(pH 5.5，50mM)中的制剂；
IFN/FNa100：在磷酸钠缓冲液(pH 5.5，100mM)中的制剂；
IFN/A25：在乙酸盐缓冲液(pH 5.5，25mM)中的制剂；
IFN/A50：在乙酸盐缓冲液(pH 5.5，50mM)中的制剂；
IFN/A100：在乙酸盐缓冲液(pH 5.5，100mM)中的制剂。
实施例5：冻干的制剂(1.4x106IU IFNγ和1.7x106IU IFN2b/瓶)。
组成：2.8x108IU IFNγ、3.4x108IU IFNα2b、0.0802g磷酸二氢钾、0.249g二水合磷酸氢二钠、4g蔗糖、0.8g甘氨酸、0.03g Tween 20、1g聚乙二醇6000、对于100mL来说足够量的注射用水。
测量除干扰素外的所有组分并用注射用水进行稀释。检查溶液的pH，并且必要时用稀释的(1∶2)乙酸或用1M NaOH调整至7.2±0.2的值。添加IFNγ和IFNα2b的活性药物成分并稀释至合适的浓度。将溶液过滤成无菌形式，并且装入小瓶中并在100级区域中盖上塞子以进行冻干。小瓶通过100级隧道进行输送并置于冻干仪中，在那里实施冻干过程。最终，将小瓶覆盖并密封；并将产物贮存于2-8℃。
表6显示了所使用的冻干循环的主要参数。
表6.冻干循环的参数概括。每个时期的温度的计时图(chronogram)。
Figure A20068005024200291
以确定的时间间隔，获取样品并分析产物的残留水份含量、IFNγ和IFNα2b的含量(经由ELISA)、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)以及冻干和重构的产物的外观。结果呈现于表7中。
表7.产物的残留水份含量、IFNγ和IFNα2b的含量、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)的数据。温度5℃。冻干制剂：1.4MIU IFNγ和1.7MIU IFNα2b/瓶。
Figure A20068005024200292
*填充体积为0.5mL/瓶；STI：均匀的、白色的、冻干的；重构后，透明的无色溶液，基本上不含颗粒。
实施例6：冻干的制剂(0.5x106IU IFNγ和3.0x106IU IFNα2b/瓶)。
组成：1.0x108IU IFNγ、6.0x108IU IFNα2b、0.0802g磷酸二氢钾、0.249g二水合磷酸氢二钠、4g蔗糖、0.8g甘氨酸、0.03g Tween 20、1g聚乙二醇6000、对于100mL来说足够量的注射用水。制备方法与在实施例5的冻干制剂中描述的相同。
以确定的时间间隔，获取样品并分析产物的残留水份含量、IFNγ和IFNα2b的含量(经由ELISA)、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)以及冻干和重构的产物的外观。结果呈现于表8中。
表8.产物的残留水份含量、IFNγ和IFNα2b的含量、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)的数据。温度5℃。冻干制剂：0.5MIU IFNγ和3.0MIU IFNα2b/瓶。
*填充体积为0.5mL/瓶；STI：均匀的、白色的、冻干的；重构后，透明的无色溶液，基本上不含颗粒。
实施例7：使用冻干的稳定药物制剂(0.5x106IU IFNγ和3.0x106IU IFNα2b/瓶)的临床试验。在CBC中于损伤内应用。
实施例6中描述的稳定的冻干药物制剂用于实施三盲、具有对照、随机化的临床试验，所述临床试验包括59位患者，他们经临床和组织学诊断出具有有着直径小于4厘米的损伤的皮肤的任何部位和类型的CBC。通过随机化将患者分配至3个治疗组。组I、II和III分别用一半剂量的重组IFNα2b(1.5x106IU/mL)；或重组IFNγ(0.25x106IU/mL)；或稳定的冻干制剂(0.5x106IU/mL IFNγ和3.0x106IU/mLIFNα2b/瓶)以损伤内的方式来治疗损伤。IFN在连续3周期间每周应用3次，在继续的9周期间每周1次，或者直至损伤完全消失，在那时评估治疗的临床功效。使用IFNα2b、IFNγ和所述制剂(0.5x106IU/mLIFNγ和3.0x106IU/mL IFNα2b/瓶)的组分别有9.5％、35.3％和5.3％的损伤在损伤大小减少方面少于50％。在剩余的损伤中，观察到90.5％、57.9％和94.7％(分别为组I、II和III)的客观应答(完全消失或减少超过起始大小的50％)。损伤无一进一步发展(参见表9)。在“未结束治疗的患者”的层面中，观察到使用该制剂进行治疗的优越性(相对于使用IFNα2b的治疗而言17％的差异，和相对于IFNγ而言27％的差异)，所述制剂包含具有增效的抗增殖效应的重组IFNγ和α2b。在“具有少于11周的治疗的患者”的层面中，观察到该制剂的优越性(相对于IFNγ而言约30％的差异，和相对于IFNα2b而言27％的差异)，以及更高的完全应答比例(相对于IFNα2b而言＞40％的优越性，和相对于IFNγ治疗而言＞30％)。关于具有少于12次注射的患者，在使用该制剂的治疗组中达到100％的有利应答(其中50％是完全应答)。在其他2个治疗组中，有利应答的百分比为67％(其中33.3％是完全应答)，即达到约33％的差异，这支持了联合疗法。参见表9。
表9.根据治疗时间进行分层次的临床应答的评估，
所述治疗使用一半剂量的冻干制剂：
0.5MIU IFNγ和3.0MIU IFNα2b/瓶。
Figure A20068005024200321
如在表10中可以观察到的，使用包含重组IFNγ和α2b的稳定的冻干制剂，可以在比使用分开的所述干扰素更短的时间内获得临床完全应答，相对于IFNα而言具有提前约4周的差异。
表10.关于到达完全应答时所需时间的评估。使用一半剂量的冻干制剂进行治疗：0.5MIU IFNγ和3.0MIU IFNα2b/瓶。
  到达完全应答时所需时间(周)   IFNγ(N＝17)   IFNα(N＝21)   制剂(N＝19)   P(Kruskal-Wallis)
  中值±RQ   9.0±7.5   12.0±1.0   8.5±5.8   0.507
没有在治疗病例中观察到瘢痕瘤的形成，相反地所有治疗病例具有损伤的良好疤痕形成，其具有正常的敏感性、正常或轻微降低的弹性且不存在干燥、脆性和粗糙。就颜色而言，在大多数用该制剂治疗的患者中观察到在治疗部位处的正常着色(47.4％)，这是在使用IFNα的组中所观察到的结果(28.6％)的2倍。在试验结束时，在用该制剂治疗的组中，相对于用单独的IFNα2b治疗的组(52.4％)，观察到更大百分比的平坦伤口(63.2％)，这显示在表11中。
表11.在治疗结束时的美学评估。
使用一半剂量的冻干制剂进行治疗：
0.5MIU IFNγ和3.0MIU IFNα2b/瓶。
Figure A20068005024200331
干扰素的组合没有促进不利事件，因为就它们的产生或强度而言，在治疗组之间没有检测到统计学差异。一般而言，它们是轻微(71.2％)或中等的并且是良好耐受的。它们自身不呈现严重或非常严重的不利事件(表12)。
表12.不利事件的频率(相对于检测到的不利事件总数目而言的％)。
使用一半剂量的冻干制剂进行治疗：
0.5MIU IFNγ和3.0MIU IFNα2b/瓶。
  事件   IFNγ   IFNα   制剂   总计
  发热   31(60.8％)   15(38.5％)   11(26.2％)   57(43.2％)
  肌痛   2(3.9％)   15(38.5％)   13(31.0％)   30(22.7％)
  寒战   10(19.6％)   5(12.8％)   9(21.4％)   24(18.2％)
  衰弱   4(7.8％)   1(2.6％)   5(11.9％)   10(7.6％)
  关节痛   --   1(2.6％)   3(7.1％)   4(3.0％)
  瘙痒   3(5.9％)   --   --   3(2.3％)
  重量减轻   --   2(5.1％)   --   2(1.5％)
  过敏   1(2.0％)   --   --   1(0.8％)
  血小板减少症   --   --   1(2.4％)   1(0.8％)
  白细胞减少症   --   --   1(2.4％)   1(0.8％)
  不利事件的总计   39(29.5％)   39(29.5％)   43(32.3％)   133(100％)
如在这个表中可以观察到的，每个治疗组中最常见的不利事件是：发热(38.5％；60.8％和26.2％)、肌痛(38.5％；3.9％和31％)和寒战(12.8％；19.6％和21.4％)，分别对于IFNα、IFNγ和所述组合。所呈现的不利事件总计在用IFNγ治疗的患者组中略微更严重。
一般而言，相对于IFNα组，联合治疗达到32％的完全应答的优越性、提前约4周和具有少于25％的注射。该组合不促进不利事件，并且对于具有完全临床应答的患者，在结束治疗后1年进行随访期间没有发现复发。从美容观点来看，该结果非常好，主要导致平坦且常色的伤口。
实施例8：在具有对于标准治疗不易感的皮肤肿瘤患者中重组IFNγ和α2b混合物的同情使用的结果。病例报告。
患者1
初始：EPR HC：302396 年龄：82岁 性别：男 先前个人病理学(APP)：n/r
于17/10/01移交至National Institute of Oncology andRadiology(INOR)，在胸的前区具有皮肤肿瘤，已接受电灼疗法治疗，这之后以溃疡形式生长，已于03/07/01手术切除。结果：棘细胞癌不完全切除。该患者在原始肿瘤的位置处达到3cm的持续性肿瘤损伤，具有高的边缘。在物理观察时未呈现区域性的转移性神经节。对肿瘤进行了放射疗法，并于29/01/02结束：60Co 50Gy+X-射线12Gy。总剂量/肿瘤为62Gy。
一个月后，该患者显示出使固定至锁骨和胸锁乳突肌的下三分之一处的肿瘤。在短时间内，肿瘤继续快速生长，于04/03/02显示出在右锁骨的中间三分之一、颈底部和部分胸骨上的10x8cm的大溃疡伤口，全都朝向胸的前部。建议对其进行手术干预。他的家人拒绝进行手术干预，因为他已82岁并具有高手术风险。然后，推荐使用IFN进行损伤内治疗。
具有大尺寸(12.5x9cm和厚度1-1.5cm)的肿瘤固定至骨和肌肉。计划将IFN应用在周长的3个扇区中。每个扇区以在约5cm3的组织(1.5x1.5x1.5)中用1.5mL溶液进行浸润，采用在6mL注射用水中的0.5x106IU IFNγ+6x106IU IFNα2b的剂量，每周3次，共3周(图7a)。在第5次应用产物(第2周)后，决定应用更高剂量的IFNγ(2倍，1x106IU)。提议逐步增加剂量，以试图获得对如此大的肿瘤的更佳结果，因为在先前剂量中不存在不良效应，以及根据其中证明了这两种干扰素的增效效应的临床研究的先前信息。
总之，该患者在2个月的治疗中接受了总剂量25x106IU IFNγ+162x106IU IFNα2b的27次应用。在第5次应用中，注意到伤口边缘变平至正常皮肤的水平(图7b)。治疗开始后1个月，该患者提到右上肢的强烈疼痛，观察到臂神经丛的浸润，锁骨的暴露、坏死和骨折。在第20次应用时，观察到在注射位置处肿瘤生长停止，但在其中以叶样形状生长的肿瘤中心处并非如此(图7c)。甚至在第24次应用时也观察到这种情况。此外在肿瘤溃疡的中心处出现败血症和坏死。治疗开始后正好2个月(第27次应用)，该患者遭受经由锁骨下动脉的浸润而引起的强烈动脉出血；该患者的血红蛋白降低至80g/L，并且治疗中断15天，在这结束时由于持续出血和具有进行性衰弱而恢复。该患者2个月后由于动脉破裂而死亡。注射部位维持无肿瘤生长。在前8次应用中，记录了某些不利事件如发热(39℃)、寒战、损伤周围的红斑和衰弱，但所有这些具有轻微强度和是短期的。
结论：在注射位置处达到了临床应答，持续至少2个月，不良效应不显著。
患者2
初始：LGR HC：158390 年龄：65岁 性别：女，APP：n/r
患者遭受基于全脸的多发性癌。该患者在具有移植物的左眼的下眼睑中进行几次手术干预和辐射。目前显示出在眼睑边缘处具有直径5mm的肿瘤复发和在眼睑下朝向颧骨处具有另一个平坦的疤痕样伤口(图8a)。备选治疗将是进行新的手术，而反对理由是已是多次治疗的病例。在同一眼的上眼睑中具有另一个先前未治疗的7mm的基底癌。
于08/05/02提议用IFN进行损伤内治疗(在4mL中的0.5x106IU IFNγ+3x106IU IFNα2b，每周3次，共3周)。总之，该患者接受总剂量为35x106IU干扰素(5x106IU IFNγ+30x106IUIFNα2b)的10次应用。在四分之一浸润中，疤痕样伤口消失并且在眼睑中在肿瘤位置处具有坏死的溃疡(图8b)。治疗后2个月，观察到在眼睑中没有肿瘤和颧骨的疤痕样平坦伤口消失(图8c)。获得局部-区域性效应。观察到左眼的上眼睑的基底癌减少50％，所述基底癌未用IFN直接治疗而是手术切除。3年后，该患者仍保持用IFN浸润的损伤的控制。记录了轻微强度和短期的某些不利事件，例如发热(39℃)、寒战和在接受治疗的眼中的结膜水肿(其使用冷敷而减轻)。
结论：患者直至2005年8月(最后1次控制)具有完全的临床应答，具有最低限度的不良效应。
实施例9：冻干的制剂(0.5x106IU IFNγ和10x106IU IFNα2b/瓶)。
组成：1.0x108IU IFNγ、20x108IU IFNα2b、0.0802g磷酸二氢钾、0.249g二水合磷酸氢二钠、4g蔗糖、0.8g甘氨酸、0.03g Tween 20、1g聚乙二醇6000、对于100mL来说足够量的注射用水。
制备方法与在实施例5的冻干制剂中描述的相同。
以确定的时间间隔，获取样品并分析产物的残留水份含量、IFNγ和IFNα2b的含量(经由ELISA)、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)以及冻干和重构的产物的外观。结果呈现于表13中。
表13.产物的残留水份含量、IFNγ和IFNα2b的含量、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)的数据。温度5℃。
冻干制剂：0.5MIU IFNγ和10.0MIU IFNα2b/瓶。
*填充体积为0.5mL/瓶；STI：均匀的、白色的、冻干的；重构后，透明的无色溶液，基本上不含颗粒。
实施例10：与顺铂相组合地使用由0.5MIU IFNγ和10.0MIU IFNα2b/瓶组成的稳定的冻干制剂。病例报告。
患者3
初始：JGA HC：年龄：33岁 性别：男 APP：n/r
在INOR中患者被记录为具有穿透左眼的内角(internal angle)的基底细胞癌，接受了几次手术干预和辐射。目前，该患者具有到达头骨底部的骨的发生溃疡的肿瘤(图9a)。通过轴向计算机断层摄影术(TAC)进行验证，观察到在鼻和眼眶内壁的自身骨中的腔，对于左鼻孔而留下的无法忍受的恶臭，和相同位置处的脓性的黄色分泌物。
由于伤口扩大，决定进行使用下述的联合治疗：以21天的间隔用6个循环的剂量的顺铂进行全身性化学疗法，和同时局部用该制剂(0.5MIU IFNγ和10.0MIU IFNα2b/瓶)进行浸润，每周3次，共3周。
在第3次应用结束时，已经观察到显著的部分临床应答，其允许眼睑打开和恶臭减少。同时呈现出中等强度的结膜水肿。在1个月后观察到完全的临床应答。保持这种应答，直至化学疗法结束。不利事件很少，稍微有点发热和寒战以及在伤口的疤痕位置处提及的疼痛。1年后该患者保持完全的临床应答(图9b)。
实施例11：液体的稳定药物制剂(1.4x106IU IFNγ和1.7x106IUIFNα2b/瓶)。
组成：2.8x108IU IFNγ、3.4x108IU IFNα2b、0.708g乙酸钠、0.079mL乙酸、0.01g Tween 20、5g甘露醇、对于100mL来说足够量的注射用水。
测量除干扰素外的所有组分并用注射用水进行悬浮。检查溶液的pH，并且必要时用稀释的乙酸(1∶2)或用1M NaOH调整至5.5±0.2的值。添加重组IFNγ和IFNα2b的活性药物成分并稀释至合适的浓度。
将溶液过滤成无菌形式。将该制剂装入小瓶中并且在100级区域中覆盖和密封。最终，将产物贮存于2-8℃。从制备的制剂中获取几个样品，并于2℃和8℃贮存6个月的时间。
以确定的时间间隔，获取样品并分析产物的残留水份含量、IFNγ和IFNα2b的含量(经由ELISA)、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)以及冻干和重构的产物的外观。结果呈现于表14中。
表14.产物的pH、IFNγ和IFNα2b的含量、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)的数据。温度5℃。
液体制剂：1.4MIU IFNγ和1.7MIU IFNα2b/瓶。
Figure A20068005024200391
*填充体积为0.5mL/瓶；STI：透明的无色溶液，基本上不含颗粒。
实施例12：液体的稳定药物制剂(0.5x106IU IFNγ和3.0x106IUIFNα2b/瓶)。
组成：2.0x108IU IFNγ、12.0x108IU IFNα2b、0.708g乙酸钠，0.079mL乙酸、0.01g Tween 20、5g甘露醇、对于100mL来说足够量的注射用水。
制备方法与在实施例11的液体制剂中描述的相同。
以确定的时间间隔，获取样品并分析产物的IFNγ和IFNα2b的含量(经由ELISA)、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)和溶液的澄清度。结果呈现于表15中。
表15.产物的pH、IFNγ和IFNα2b的含量、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)的数据。温度5℃。
液体制剂：0.5MIU IFNγ和3.0MIU IFNα2b/瓶。
Figure A20068005024200401
*填充体积为0.5mL/瓶；STI：透明的无色溶液，基本上不含颗粒。
实施例13：液体的稳定药物制剂(0.5x106IU IFNγ和10x106IUIFNα2b/瓶)。
组成：2.0x108IU IFNγ、40x108IU IFNα2b、0.708g乙酸钠、0.079mL乙酸、0.01g Tween 20、5g甘露醇、对于100mL来说足够量的注射用水。
制备方法与在实施例11的液体制剂中描述的相同。
以确定的时间间隔，获取样品并分析产物的IFNγ和IFNα2b的含量(经由ELISA)、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)和溶液的澄清度。结果呈现于表16中。
表16.产物的pH、IFNγ和IFNα2b的含量、生物活性、纯度(经由RP-HPLC)的数据。温度5℃。
液体制剂：0.5MIU IFNγ和10.0MIU IFNα2b/瓶。
Figure A20068005024200411
*填充体积为0.5mL/瓶；STI：透明的无色溶液，基本上不含颗粒。
实施例14：半固体的药物制剂(0.16x106IU IFNγ和1.0x106IUIFNα2b/克半固体)。
用于局部应用的药物制剂，优选地如乳膏、油膏或凝胶。该药物制剂包含重组干扰素γ和干扰素α2作为有效成分。组成为1.6x107IU IFNγ和1x108IU IFNα2b，这是对于100克半固体来说足够的量。
乳膏的制备：为了制备乳膏，于75℃融化固体凡士林和鲸蜡醇，并通过持续搅动进行混合，维持至过程结束。一旦经均质化，就将Tween 60掺入至该混合物中。另一方面，将对羟基苯甲酸甲酯和丙酯溶解于90℃的水中，并且在温度降低至75℃时掺入至先前的混合物中。随后使该乳状液缓慢冷却直至37℃，并掺入至包含重组IFNγ和IFNα2b的水溶液中。在15g管中，将所得到的乳膏贮存于4℃(参见表17)。
表17.乳膏制剂的成分。
  成分   ％
  IFNγ   2.2
  IFNα2b   0.58
  鲸蜡醇   4
  凡士林   10
  Tween 60   2
  对羟基苯甲酸甲酯、丙酯   0.2
  蒸馏水c.s.p   81.2
油膏的制备：在一个容器中，将对羟基苯甲酸酯溶解于90℃的水中，并放置冷却至37℃。在另一个容器中，在持续搅动下将液体矿脂和Span 20混合。随后，将2个容器中的内容物混合，并且在温度已降低至37℃以下时掺入重组IFNγ和IFNα2b，维持持续搅动。随后掺入白色矿脂直至达到均质化。在15g管中，将所得到的油膏贮存于4℃(参见表18)。
表18.油膏制剂的成分。
  成分   ％
  IFNγ   2.2
  IFNα2b   0.58
  白色固体矿脂   60
  重质液体矿脂   10
  Span 20   3
  对羟基苯甲酸甲酯、丙酯   0.2
  蒸馏水c.s.p   24.02
凝胶的制备：将EDTA、对羟基苯甲酸酯和乙醇溶解于分开的容器中，并随后添加丙二醇。然后在持续搅动下将这些溶液混合，并在剧烈搅动下缓慢掺入卡波普940，直至获得不存在团块的浑浊的分散液。另外在合适的容器中制备1N氢氧化钠溶液，并在搅动下缓慢加入至包含该制剂的其余组分的分散液中。然后，在温和搅动下掺入IFNγ和IFNα2b。一旦形成凝胶，就于4℃装入15g管中(参见表19)。
表19.凝胶制剂的成分。
  成分   ％
  IFNγ   2.2
  IFNα2b   0.58
  卡波普940   0.5
  丙二醇   10
  对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯   0.2
  氢氧化钠   0.2
  乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)   0.01
  乙醇   2
  蒸馏水c.s.p   84.31

Claims (24)

1.通过肠胃外(液体或冻干的)或局部(凝胶、油膏或乳膏)途径应用的稳定药物制剂，其包含增效比例的不同量的重组干扰素γ和α以用于治疗特征在于组织或器官的恶性或良性非生理学细胞生长的病理学事件，并且其另外还包含药学上可接受的赋形剂或载体。
2.权利要求1的冻干的稳定药物制剂，其包含缓冲溶液以及至少一种选自非还原糖化合物、氨基酸、表面活性剂和稳定化聚合物的组分。
3.权利要求2的冻干的稳定药物制剂，其中使用具有维持pH 4.9-7.5的能力的缓冲溶液，例如乙酸铵或钠、琥珀酸钠、磷酸钠和/或钾和柠檬酸-磷酸钠，其中使用蔗糖或海藻糖作为非还原糖，使用甘氨酸、组氨酸或亮氨酸作为氨基酸，使用聚山梨酯20或聚山梨酯80作为表面活性剂，和使用聚乙二醇或葡聚糖或羟乙基淀粉作为稳定化聚合物。
4.权利要求3的冻干的稳定药物制剂，其中以10-20mM的浓度范围使用缓冲溶液；其中以5-100mg/mL的浓度范围使用蔗糖或海藻糖；其中以1-20mg/mL的浓度范围使用甘氨酸、组氨酸或亮氨酸；其中以0.01-1mg/mL的浓度范围使用聚山梨酯；和其中以5-50mg/mL的浓度范围使用聚乙二醇、葡聚糖或羟乙基淀粉。
5.权利要求2的冻干的稳定药物制剂，其由下述成分组成：浓度范围为5.6×108IU-1.4×108IU的IFNγ和浓度范围为6.8×108IU-1.7×108IU的IFNα2、0.0802g磷酸二氢钾、0.249g二水合磷酸氢二钠、4g蔗糖、0.8g甘氨酸、0.03g Tween 20、1g聚乙二醇6000和对于100mL来说足够量的注射用水，并且对于0.5mL、1mL、5mL和10mL采用各自的等价比例。
6.权利要求2的冻干的稳定药物制剂，其由下述成分组成：对于100mL来说，浓度范围为2.0×108IU-0.5×108IU的IFNγ和浓度范围为12.0×108IU-3.0×108IU的IFNα2、0.0802g磷酸二氢钾、0.249g二水合磷酸氢二钠、4g蔗糖、0.8g甘氨酸、0.03g Tween 20、1g聚乙二醇6000和对于100mL来说足够量的注射用水，并且对于0.5mL、1mL、5mL和10mL采用各自的等价比例。
7.权利要求2的冻干的稳定药物制剂，其由下述成分组成：浓度范围为4.0×108IU-1.0×108IU的IFNγ和浓度范围为80×108IU-20×108IU的IFNα2、0.0802g磷酸二氢钾、0.249g二水合磷酸氢二钠、4g蔗糖、0.8g甘氨酸、0.03g Tween 20、1g聚乙二醇6000和对于100mL来说足够量的注射用水，并且对于0.5mL、1mL、5mL和10mL采用各自的等价比例。
8.权利要求1的液体的稳定药物制剂，其包含缓冲溶液以及至少一种选自非还原糖化合物、氨基酸、表面活性剂、稳定化聚合物、螯合/抗氧化化合物和等渗剂的组分，该液体制剂使用水性溶剂，所述水性溶剂可以包含或不包含防腐剂例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯的混合物。
9.权利要求8的液体的稳定药物制剂，其中使用具有维持pH 4.9-6.5的能力的缓冲溶液，例如乙酸铵或钠、琥珀酸钠、磷酸钠和/或钾和柠檬酸盐-磷酸盐，和其中使用聚山梨酯20或聚山梨酯80作为表面活性剂；使用EDTA或乙酰基-半胱氨酸作为抗氧化剂/螯合剂；使用组氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸或赖氨酸作为氨基酸；使用羟乙基淀粉或葡聚糖作为稳定化聚合物；和使用氯化钠、氯化钾、丙二醇、甘露醇、甘油、蔗糖或海藻糖作为等渗剂。
10.权利要求9的液体的稳定药物制剂，其中以10-100mM的浓度范围使用缓冲溶液；其中以0.01-1mg/mL的浓度范围使用聚山梨酯；其中以0.01-1mg/mL的浓度范围使用EDTA或乙酰基-半胱氨酸；以1-20mg/mL的浓度范围使用组氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸或赖氨酸；以5-50mg/mL的浓度范围使用羟乙基淀粉和葡聚糖；和其中等渗剂的量足以使得所述溶液为等渗的。
11.权利要求9的液体的稳定药物制剂，其由下述成分组成：浓度范围为5.6×108IU-1.4×108IU的IFNγ和浓度范围为6.8×108IU-1.7×108IU的IFNα2、0.708g乙酸钠、0.079mL乙酸、0.01g Tween20、5g甘露醇和对于100mL来说足够量的注射用水，并且对于0.5mL、1mL、5mL和10mL采用各自的等价比例。
12.权利要求9的液体的稳定药物制剂，其由下述成分组成：浓度范围为2.0×108IU-0.5×108IU的IFNγ和浓度范围为12.0×108IU-3.0×108IU的IFNα2、0.708g乙酸钠、0.079mL乙酸、0.01gTween 20、5g甘露醇和对于100mL来说足够量的注射用水，并且对于0.5mL、1mL、5mL和10mL采用各自的等价比例。
13.权利要求9的液体的稳定药物制剂，其由下述成分组成：浓度范围为4.0×108IU-1.0×108IU的IFNγ和浓度范围为80×108IU-20×108IU的IFNα2、0.708g乙酸钠、0.079mL乙酸、0.01g Tween20、5g甘露醇和对于100mL来说足够量的注射用水，并且对于0.5mL、1mL、5mL和10mL采用各自的等价比例。
14.权利要求1-13的稳定药物制剂，其独立地或与化学疗法、放射疗法或两者的组合联合用于治疗恶性或良性实体瘤。
15.权利要求14的稳定药物制剂，其用于治疗喉癌、喉乳头状瘤病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、T细胞白血病、B细胞白血病、中枢神经系统淋巴瘤、脂肪瘤、表皮样囊肿、真皮内囊肿、脂肪肉瘤、神经纤维瘤、皮脂增生、海绵状血管瘤、肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、室管膜细胞瘤、神经节瘤、青少年纤维性星形细胞瘤、混合性神经胶质瘤、少突神经胶质细胞瘤、视神经神经胶质瘤、脊索瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体腺瘤、原始神经外胚层瘤、听神经瘤、血管肿瘤、脑脊膜癌病、神经纤维瘤病、脑假瘤、结节状硬化、转移性脑肿瘤、樱桃样血管瘤、皮脂腺增生、基底细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤纤维瘤、脓性肉芽肿、真皮痣、脂溢性角化病、光化性角化病。
16.权利要求1-13的稳定药物制剂，其用于治疗增生性事件例如纤维化、发育异常和增生。
17.权利要求1-13的稳定药物制剂，其用于肌内、肿瘤内和损伤周围施用。
18.权利要求1的局部的稳定药物制剂，其包含浓度范围为0.32×106IU-0.08×106IU的重组IFNγ和浓度范围为2.0×106IU-0.5×106IU的重组IFNα2/克半固体。
19.权利要求18的稳定药物乳膏，其包含2.2％ IFNγ、0.58％IFNα2b、4％鲸蜡醇、10％凡士林、2％ Tween 60、0.2％对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和81.2％蒸馏水，csp。
20.权利要求18的稳定油膏，其包含2.2％ IFNγ、0.58％ IFNα2、60％白色固体矿脂、10％重质液体矿脂、3％ Span 20、0.2％对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯以及24.02％蒸馏水，csp。
21.权利要求18的稳定药物制剂凝胶，其包含2.2％ IFNγ、0.58％ IFNα2、0.5％卡波普940、0.2％对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、0.2％氢氧化钠、0.01％乙二胺四乙酸二钠钙、2％乙醇和84.31％蒸馏水，csp。
22.权利要求18-21的局部的稳定药物制剂，其独立地或与化学疗法、放射疗法或两者的组合联合用于治疗皮肤或粘膜的恶性或良性实体瘤。
23.权利要求22的局部的稳定药物制剂，其用于治疗脂肪瘤、表皮样囊肿、真皮内囊肿、脂肪肉瘤、神经纤维瘤、皮脂增生、血管瘤、局灶性结节性增生、室管膜细胞瘤、神经节瘤、青少年纤维性星形细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体腺瘤、血管肿瘤、脑脊膜癌病、神经纤维瘤病、樱桃样血管瘤、皮脂腺增生、基底细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤纤维瘤、脓性肉芽肿、真皮痣、脂溢性角化病、光化性角化病和湿疣。
24.权利要求5-7和11-13的药物提供形式，其包含一瓶或多瓶重组IFNγ，以及相应瓶数的重组IFNα2，以便以这样的方式混合IFN小瓶的内容物，即维持在所提及的权利要求中限定的IFNγ和IFNα浓度，并且其中所述药物提供形式另外还包含具有注射用水的小瓶、注射器和针头，它们足以执行所述IFN的混合和将所述混合物应用至患者。
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