WO2007051431A2 - Formulaciones estabilizadas que contienen a los interferones gamma y alfa en proporciones potenciadoras - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to biotechnology and medical sciences, in particular with stabilized formulations containing recombinant gamma and alpha interferons in potentiating proportions of cell growth inhibition in different tissues or organs of humans.
  • IFNs type I interferons
  • a great therapeutic potential of applications creates a great therapeutic potential of applications.
  • the use of these is beneficial in the treatment of various types of cancer, including leukemia (US 5830455), basal cell carcinomas (US 5028422), squamous cell carcinoma (US 5256410), breast cancer (US 5024833 ), gastrointestinal tumors (US 5444064; 5814640), and actinic keratosis (US 5002764).
  • Different cell types show a differentiated sensitivity to IFNs, and concentrations to inhibit their growth can vary over a wide range (Borden E., et al. (1981) Progress in Hematology.
  • IFNs In an effort to achieve better effects on therapies, high doses of IFNs have been used, but the expected potential beneficial response is not achieved due to several factors, including adverse reactions that occur with such doses (La ⁇ e HC (1990) Interferon -alpha in patients with asymptomatic human immunodeficiency virus (HIV) infection. A randomized, placebo-controlled trial. Annals ofinternal Medicine, 112: 805-811). IFNs have also been used in combination to exploit their enhancing effects. The combination of IFN alpha and IFN gamma has been described in keloid fibroblast cultures in in vivo studies (Tredget EE, Wang R., et al.
  • EP 0107498 shows the combination of alpha and gamma interferons in the melanoma cell line Hs294T, but this effect is not described in other types of cells such as primary cultures of cell-based carcinoma of a glioblastoma (GL-5), or of a larynx carcinoma (HEp-2).
  • IFN alpha 2, or alpha 4 or the hybrid delta 4 alpha 2 BgI Il alpha 1 with IFN gamma was described in the RT4 cell lines (bladder carcinoma) and in A2182 (lung adenocarcinoma) and has a superior antiproliferative effect to the other combinations between type I IFNs or gamma IFN alone, (Hubbell HR, Craft JA, et al. (1987) Synergistic antiproliferative effect of recombinant alpha-interferons with recombinant gamma-interferon. J Biol Response Mod, 6: 141- 153).
  • IFN alpha and IFN gamma have been described in studies with the HepG2 cell line, (Mizukoshi E., Kaneko S., et al. (1999) Upregulation of type I interferon receptor by IFN-gamma. J Inter ⁇ eron Cytokine Res , 19: 1019-1023) and in the AVA5 cell line (Okuse C, Rinaudo JA, et al. (2005) Enhancement of antiviral activity against hepatitis C virus in vitro by interferon combination therapy. Antiviral Res, 65: 23-34) .
  • IFN gamma In a study with Gliomas cell lines, IFN gamma affected the characteristics of malignancy such as the proliferation and migration of the tumor cells studied (Knupfer MM, Knupfer H., et al. (2001) Interferon- gamma inhibits growth and migration of A172 human glioblastoma cells. Anticancer Res, 21: 3989-3994). Likewise, negative results have been reported with the use of IFN gamma to treat gliomas (Mahaley MS, Bertsch L., Jr. et al. (1988) Systemic gamma-interferon therapy for recurrent gliomas. J Neurosurg, 69: 826- 829).
  • IFN gamma and IFN beta have proven to be effective in inhibiting the growth of the GBM-18 cell line, a multidrug-resistant astrocytoma (Reddy PG, et al. (1991) Systemic gamma-interferon therapy for recurrent gliomas J Nati Cancer Inst, 83: 1307-1315). It has also been described, the combination of IFN gamma with alpha-difluoromethylornitine (DFMO) for the treatment of these tumors (US 4499072). US Patent 5002879 describes a similar therapy using DFMO together with lymphokine activated cells and IL-2.
  • DFMO alpha-difluoromethylornitine
  • IFN alpha its combination with other drugs has not had favorable effects in the treatment of gliomas, and has shown toxicity (Buckner J. C, Burch PA, et al (1998) Phase Il trial of recombinant interferon-alpha- 2a and eflornithine in patients with recurrent glioma. J Neurooncol. 36: 65-70; Chang SM, Barker FG, et al. (1998) High dose oral tamoxifen and subcutaneous interferon alpha-2a for recurrent glioma. J Neurooncol, 37: 169 -176). Then, the treatment of this type of tumor can be favored by the combined use of IFN alpha and IFN gamma, based on an adequate selection of the proportions of their combination based on in vitro and in vivo experiments.
  • the larynx is the second most frequent site of cancer of the upper aero-digestive tract after the oral cavity.
  • Laryngeal carcinoma is the most common head and neck tumor and the most common larynx cancer is squamous cell carcinoma (95% of all cases).
  • Survival in cases of T3 and T4 laryngeal tumors is only 5 years in approximately only 30% of patients undergoing laryngectomy (Djordjevic V., Milovanovic J., et al. (2004) Radical surgery of the malignant laryngeal tumors, Acta Chir Lugosl, 51: 31-35). It has been shown that radiotherapy and chemotherapy are not effective for the treatment of this carcinoma (Chen W., Guo X., et al.
  • US Patent 4503035 shows a preparation of some species of IFN alpha, but does not include alpha 1, alpha 5, alpha 14, and IFN omega. These patents do not describe a formulation formed by the combination of recombinant IFN gamma and IFN alpha 2.
  • US Patent 5762923 details a liquid Interferon composition dissolved in water with a non-ionic detergent and benzyl alcohol in amounts sufficient to stabilize IFN alpha which also contains an acidic buffer.
  • US patent 4847079 describes a pharmaceutical composition of Interferon and thimerosal
  • US patent 4675184 shows an Interferon formulated with polyhydric alcohol and an organic buffer as stabilizer and a conventional carrier or diluent of pH 3-6.
  • the composition may additionally have an anionic surfactant and / or albumin as stabilizer.
  • amines as stabilizers (aliphatic primary amines) and organic lithium salts are described, which protect Interferon from degradation and stabilize it.
  • US Patent 4496537 refers to stable liquid formulations of interferon-alpha that include in its composition human serum albumin, and alanine or glycine, water and a buffer system capable of maintaining the pH between 6.5 and 8.0.
  • US 5935566 discloses stable aqueous formulations of interferon-alpha that include in its composition a buffer system capable of maintaining the pH in the range of 4.5 to 7.1, polysorbate 80 as stabilizer, EDTA as chelating agent, sodium chloride as isotonic agent, and m-cresol as an antimicrobial preservative.
  • US Patent 0170207 describes stable aqueous formulations of interferon-alpha that include in its composition a buffer system capable of maintaining the pH in the range of 4.5 to 9.0, a stabilizing agent, a non-ionic surfactant and an osmotic pressure regulator.
  • liquid pharmaceutical formulations of Interferon-gamma comprising a buffer solution that maintains the pH in the range of 4.0 to 6.0, a polyhydroxylated sugar as a stabilizer and a non-ionic detergent.
  • US Patent 4895716 refers to compositions and methods for stabilizing Interferon-gamma with lactobionic acid in an acetate / glycine buffer solution.
  • US 5676942 describes pharmaceutical compositions formed by subtypes of type I interferons obtained from natural sources, but they do not combine them with gamma interferon and do not define the proportions of those combinations, it only describes those combinations for viral infections and not for the treatment of tumors
  • the present invention solves the aforementioned problem by providing stable pharmaceutical formulations to be applied parenterally (liquid or lyophilized), or topically (gel, ointment or cream) comprising different amounts of the recombinant gamma and alpha interferons in enhancer proportions.
  • Said formulations are useful for the treatment of pathological events that contemplate benign or malignant non-physiological cell growth of tissues or organs and that also comprise pharmaceutically acceptable excipients or vehicles.
  • the lyophilized stable pharmaceutical formulations are composed of the recombinant IFN gamma and alpha 2 mixed together with a buffer solution capable of maintaining the pH between 4.9 and 7.5, which may be the ammonium or sodium acetate, the succinate of sodium, sodium and / or potassium phosphate or sodium citrate / phosphate.
  • Non-reducing sugars can be sucrose or trehalose;
  • the amino acids can be glycine, histidine or leucine; while surfactants are described as polysorbate 20 or polysorbate 80 and as a stabilizing polymer for polyethylene glycol, dextran or hydroxyethyl starch.
  • the buffer solution must be used in a concentration range between 10 and 20 mM; Ia sucrose or trehalose between 5 and 100 mg / mL; Glycine, histidine or leucine should be used in a concentration range between 1 and 20 mg / mL; polysorbate between 0.01 and 1 mg / mL, while polyethylene glycol, dextran, or hydroxyethyl starch, are used in a concentration range between 5 and 50 mg / mL
  • lyophilized stable pharmaceutical formulations containing the recombinant gamma IFN in a concentration range between 5.6 x 10 8 Ul and 1.4 x 10 8 Ul and the recombinant IFN alpha 2 are described in a concentration range between 6.8 x 10 8 Ul and 1.7 x 10 8 Ul, or the recombinant gamma IFN in a concentration range between 2.0 x 10 8 Ul and 0.5 x 10 8 Ul and the recombinant IFN alpha 2 in a range of concentration between 12.0 x 10 8 Ul and 3.0 x 10 8 Ul, or the recombinant gamma IFN in a concentration range between 4.0 x 10 8 Ul and 1.0 x 10 8 Ul and the recombinant IFN alpha 2 in a concentration range between 80 x 10 8 Ul and 20 x 10 8 Ul; together with 0.0802 g of mono-potassium di-hydrogen phosphate, 0.249 g of dihydrated di-sodium
  • the mixture of recombinant gamma IFN in a concentration range between 2.0 x 10 8 Ul and 0.5 x 10 8 Ul and the recombinant IFN alpha 2 in a concentration range between 12.0 x 10 8 Ul and 3.0 x 10 8 Ul for the formulation is defined using a clinical trial and report cases treated for compassion.
  • the randomized, controlled and triple-blind clinical trial evaluated the efficacy of intralesional treatment (IL) in patients with cell-based carcinoma using stable lyophilized formulation composed of said combination (see example 7, tables 9, 10, 11, and 12).
  • the formulation containing the recombinant gamma IFN in a concentration range between 4.0 x 10 8 Ul and 1.0 x 10 8 Ul and the recombinant IFN alpha 2 in a concentration range between 80 x 10 8 Ul and 20 x 10 8 Ul was defined with the analysis of the results of the study of the inhibition of the growth of GL-5 glioblastoma cells by the combination of 50 IU / mL (5 ng / mL) of recombinant gamma IFN with 100 IU / mL (0.5 ng / mL) of IFN alpha 2b recombinant, with which a growth inhibition of 55% is achieved (example 3).
  • the amounts of IFNs are 5 IU / mL (5 ng / mL) of recombinant gamma IFN with 75 IU / mL (0.375 ng / mL) of recombinant IFN alpha 2b.
  • Stable liquid pharmaceutical formulations were also developed. In these formulations the proportions of the gamma and alpha recombinant IFNs described for the lyophilized formulations were maintained, but their other pharmaceutical ingredients varied to achieve greater stability to these mixtures of the IFNs.
  • a materialization of the invention describes stable liquid pharmaceutical formulations comprising a buffer solution and at least one component selected from non-reducing sugars, amino acids, surfactants, stabilizing polymers, antioxidant / chelating compounds and isotonizing agents.
  • These formulations employ an aqueous solvent that may or may not contain preservatives such as the mixture of methyl- and propyl-paraben.
  • Another embodiment of the invention lies in the definition of stable liquid pharmaceutical formulations that employ a buffer solution capable of maintaining the pH between 4.9 and 6.5.
  • This buffer may be ammonium or sodium acetate, sodium succinate, sodium and / or potassium phosphate, citrate / phosphate.
  • These formulations may use as surfactants polysorbate 20 or polysorbate 80; as antioxidant / chelator EDTA or cysteine-acetyl; while as amino acids it can include histidine, L-arginine, L-alanine, glycine or lysine.
  • hydroxyethyl starch or dextran is defined as a stabilizing polymer and sodium chloride, potassium chloride, propylene glycol, mannitol, glycerol, sucrose or trehalose as an isotonic agent.
  • the liquid stable pharmaceutical formulations employ a buffer solution in a concentration range between 10 and 100 mM; where the polysorbate is used in a concentration range between 0.01 and 1 mg / mL; EDTA or cysteine acetyl is they use in a concentration range between 0.01 and 1 mg / mL; Histldine, L-arginine, L-alanine, glycine or lysine are used in a concentration range between 1 and 20 mg / mL; hydroxyethyl starch and dextran are used in a concentration range between 5 and 50 mg / mL and where the isotonic agents are in sufficient quantity to make the solution isotonic.
  • the invention defines formulations of the mixture of recombinant IFN gamma and IFN alpha 2 not described above that facilitate the management and clinical use of this therapeutic combination and its commercialization.
  • the stable lyophilized and liquid pharmaceutical formulations containing mixtures of the recombinant gamma and alpha 2 IFNs in potentiating proportions of the proliferation inhibition described in the invention have a broad spectrum of clinical use. It is demonstrated in vivo using these formulations that in combination of important oncological entities the combination of recombinant IFN gamma and IFN alpha 2 is effectively used simultaneously and intratumorally. This combination is capable of having equal curative effects on tumors in less time and with an aesthetic result superior to that obtained by its components separately. The use of these combinations will allow for greater therapeutic possibilities to fight cancer.
  • lyophilized or liquid formulations can be used in the treatment of benign or malignant solid tumors used independently or in combination with chemotherapy, radiotherapy or the combination thereof.
  • tumors of the hematopoietic tissue such as acute myeloid leukemia, chronic, acute lymphocytic and leukemia may be treated with these formulations.
  • chronic lymphocytes as well as T-cell, B-cell leukemia, and central nervous system lymphoma.
  • Laryngeal carcinomas, laryngeal papillomatosis, lipoma, epidermoid and intradermal cyst, liposarcoma, neurofibroma, and sebaceous hyperplasia can also be treated.
  • tumors of the central and peripheral nervous system such as astrocytomas, multiform glioblastomas, ependymomas, ganglioneuromas, juvenile pilocytic astrocytomas, mixed gliomas, oligodendrogliomas, optic nerve gliomas, primitive neuroectodermal tumors, acoustic neuromas, chordomas, craniopharyngiomas, medulloblastomas, meningiomas, neurofibromatosis, pseudotumor tumors, tuberous sclerosis, metastatic brain tumors.
  • astrocytomas multiform glioblastomas, ependymomas, ganglioneuromas, juvenile pilocytic astrocytomas, mixed gliomas, oligodendrogliomas, optic nerve gliomas, primitive neuroectodermal tumors, acoustic neuromas, chordomas, craniopharyngiomas, medulloblastomas, meningiomas,
  • tumors that can be treated are cavernous hemangiomas, hepatocellular adenomas, focal nodular hyperplasia, pineal tumors, pituitary adenomas, vascular tumors, meningeal carcinomatosis, cherry-shaped angiomas, sebaceous gland hyperplasia.
  • Skin tumors such as basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, dermatofibroma, pyogenic granuloma, Dermal nevus, as well as seborrheic keratosis and actinic keratosis can benefit from the therapy with these formulations.
  • formulations can also be used for the treatment of proliferative events such as fibrosis, dysplasias and hyperplasia.
  • a further embodiment of the present invention consists of topical stable pharmaceutical formulations containing gamma IFN in a concentration range between 0.32 x 10 6 Ul and 0.08 x 10 6 Ul and IFN alpha 2 in a concentration range between 2.0 x 10 6 Ul and 0.5 x 10 6 Ul per gram of semi-solid.
  • the cream composed of IFN gamma 2.2%, 0.58% IFN alpha, 4% alcohol cetilite, 10% petrolatum, 2% Tween 60, and 0.2% methylparaben, propylparaben are described.
  • the ointment composed of IFN gamma 2.2%, 0.58% IFN alpha, 60% white solid petrolatum, 10% heavy liquid petrolatum, 3% span 20, and 0.2% methylparaben and propylparaben was also defined.
  • the semi-solid formulations allow the use by the patients themselves in a safe and non-invasive way. Also part of the present invention is the use of these topical stable formulations in the treatment of benign or malignant solid tumors of the skin or mucous membranes used independently or in combination with chemotherapy, radiotherapy or the combination thereof.
  • topical stable pharmaceutical formulations can be used for the treatment of lipoma, cyst epidermoid, intradermal cyst, liposarcoma, neurofibroma, sebaceous hyperplasia, hemangiomas, focal nodular hyperplasia, ependymomas, ganglioneuromas, juvenile pilocytic astrocytomas, meningiomas, pineal tumors, pituitary adenomas, vascular tumors, meningeal carcinomatosis, hyperpromatosis forms of hyperpromatosis, hyperofromomas, hyperplasia Sebaceous glands, basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, dermatofibroma, pyogenic granuloma, dermal nevus, seborrheic keratosis, actinic keratosis, and condylomas.
  • Another embodiment of the invention describes the conformation of a set of reagents containing a vial of recombinant IFN gamma, a vial of recombinant IFN alpha at the concentrations and ratios described above, together with a sufficient amount of vials with water for injection for dilution. and / or resuspension of the IFNs, as well as syringes and needles suitable for the simultaneous administration of the IFNs prior binding in one of the vials containing one of the IFNs.
  • Figure 8 Patient with recurrent basal cell carcinoma treated with the combination of recombinant IFN gamma and IFN alpha 2b.
  • Figure 9. Patient with recurrent basal cell carcinoma treated with the combination of recombinant IFN gamma and IFN alpha 2b and cisplatin.
  • Example 1 Inhibition of cell growth by recombinant gamma or alpha IFNs on primary cultures.
  • Skin biopsies were obtained from normal skin and from patients who developed basal cell carcinomas or keloids due to damage from surgery or burns.
  • the tissue sample was immediately placed in DMEM medium for processing in order to obtain primary cultures by the explant method.
  • CPF Primary fibroblast cultures
  • CBC III basal cell carcinoma
  • FFB normal CPF
  • AC72h Absorbance of treated control cells 72h.
  • FIG. 1 shows the antiproliferative action of recombinant gamma or alpha IFNs on the growth of keloid CPFs.
  • IFN gamma or alpha 2b inhibit cell proliferation in several primary cultures, while in others they stimulate their growth.
  • the primary FibN3 and FibN5 cultures were evaluated, as well as a biopsy of a CBCIII, and cell lines such as HEp-2, U 1752 and GL-5.
  • Example 2 Inhibition of cell growth by recombinant gamma or alpha IFNs on established cell lines.
  • the human Jurkat (ATCC, TIB-152), GL-5 (Perea SE, et al. (1993) Acta Cient Kunststoff, 44: 22-27), HEp-2 (ATCC, CCL23) cell lines were studied.
  • GL-5 cells were cultured in DMEM, and HEp-2 in MEMCANE containing gentamicin (50 ⁇ g / ml) and 10% SFB.
  • Jurkat were incubated in RPMI medium with gentamicin and 10% SFB. All cultures were incubated at 37 0 C in a CO 2 incubator with 5% humidity.
  • GL-5 and HEp-2 cells were seeded at 3 x 10 4 cells / mL. In the case of the Jurkat they were seeded at 10 5 cells / mL.
  • the viability of 3 replicates per evaluation condition was determined using the violet crystal staining method measuring the absorbance at 580 nm and using a plate reader. The results were defined as the percent (%) of growth based on the viable cell count as described in example 1.
  • the HEp-2 cell lines (laryngeal carcinoma) and GL-5 which comes from a glioblastoma, are very sensitive to gamma IFN and not to IFN alpha.
  • Table 1 shows that the HepG2 line (Hepatoma) is not sensitive to these IFNs and that in the Jurkat cell line (T lymphoma), the IFN alpha is the most effective, a result that coincides with the successful use of IFN alpha 2 in the treatment of lymphoid tissue tumors.
  • Example 3 Combinations of the most effective recombinant gamma and alpha IFNs with antiproliferative action on primary cultures and cell lines.
  • the optimal potentiating combination for growth inhibition should be composed of 100 IU / mL (10 ng / mL) of IFN 100 gamma IU / mL (0.5 ng / mL) of IFN alpha 2b. With this combination, it is possible to reduce cell growth in vitro by 21% (KeI 5a) and 43% (Kel 17a) ( Figures 2 and 3).
  • the sobologram of Figure 4 shows that the combination of 100 IU / mL (10 ng / mL) of IFN gamma with 100 IU / mL (0.5 ng / mL) of IFN alpha 2b is potentiating and the most effective to reduce in vitro cell growth of CBC III by 47%.
  • the optimal enhancer combination to inhibit the growth of GL-5 cells is 50 IU / mL (3 ng / mL) of IFN gamma with 600 IU / mL of IFN ⁇ 2b ( 5 ng / mL) of IFN alpha 2b. With that combination it is possible to reduce cell growth in vitro by 55%.
  • IFN gamma and alpha enhancer are shown to obtain the best antiproliferative effect on HEp-2 cells.
  • the amounts of IFNs are 5 IU / mL (0.5 ng / mL) of gamma IFN with 75 IU / mL (0.375 ng / mL) of IFN alpha 2b. With that optimal combination it is possible to reduce cell growth in vitro by 76%.
  • Example 4 Effect of pH, ionic species and the concentration of the buffer solution on the stability of the mixture of interferon alfa-2b and gamma in aqueous solution.
  • the physical-chemical stability was evaluated by different tests: physical appearance, polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), reverse phase liquid chromatography (RP-HPLC) and molecular exclusion chromatography (SE-HPLC ).
  • the biological stability was evaluated by immuno-enzymatic solid phase assays (ELISA) specific for each interferon and by biological assay for inhibition of the cytopathogenic effect. All these formulation design studies were performed with the mixture of intermediate concentrations of interferons (0.5 MUI of IFN gamma and 3.0 MUI of IFN alpha 2b). With the final formulation variants obtained (prepared in duplicate), the enhancer compositions were prepared and their stability was evaluated.
  • Organoleptic characteristics It was determined by analyzing the appearance of the formulation (if it remained colorless, transparent and without protein aggregation). In the case of the lyophilized formulation, the appearance of the lyophilized product was also analyzed.
  • Moisture content The residual moisture content of the lyophilized product was determined by the Karl Fischer iodometric titration technique, using a Radiometer moisture meter (Model TIM 550).
  • Interferon alpha ELISA This assay has been developed in our laboratory (H. Santana., Espino Y., et al. (1999) A sandwich-type enzyme-linked immunosorbent assay for the analysis of recombinant human interferon ⁇ -2b. Biotechnology Techniques, 13, 341-346). The assay uses monoclonal antibodies and was performed following the reported methodology. The measurement is reported here as a percentage (%) of the residual ELISA activity of interferon alfa-2b in the different treated samples of the different formulation variants, taking the ELISA activity in the initial sample equal to 100%.
  • Interferon gamma ELISA This assay has been developed in our laboratory (Bouyón R., Santana H., et al. (2003) Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for recombinant human gamma interferon. Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 24: 1-10). The assay uses monoclonal antibodies and was performed following the reported methodology. The measurement is reported here as a percentage (%) of the residual ELISA activity of the gamma interferon in the different treated samples of the different formulation variants, taking the ELISA activity in the initial sample equal to 100%.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Biological activity by antiviral titration assay The measurement of the biological activity was performed as described by Ferrero J., Ochagavia ME., Et al. (1994, Titration of the antiviral activity of interferon using the SUMA equipment system. Applied Biotechnology, 11: 34-42). The calculation of the biological activity was performed as described by Ferrero J., Duany L., et al. (1997, New calculation program, quantification of the antiviral activity of interferons through the inhibition of the cytopathogenic effect using the SUMA equipment system. Applied Biotechnology, 14: 267-269). The biological activity is reported here as a percentage of the residual biological activity, taking the biological activity of the initial sample equal to 100%.
  • T O 3D 6D 12D 3D 6D 12D
  • IFN / 8 formulation in citrate / phosphate buffer pH 8.0.
  • IFN / 7 Phosphate buffer formulation pH 7.O .
  • IFN / 8 Phosphate buffer formulation pH 8.0
  • the data contained in these tables indicate that formulations with pH values between 5 and 8 showed adequate stability during the freeze-thaw cycles, preferably for pHs near 5 and 7 and in acetate, phosphate and citrate phosphate buffers.
  • the thermal stability in aqueous solution was higher at pH values between 5 and 5.6, preferably in acetate and phosphate buffers.
  • the data contained in Table 5 indicate that the higher concentration formulations of the buffer showed greater stability during the freeze-thaw cycles than those of lower concentration at pH 5.5, particularly for IFN gamma in the different buffers tested.
  • T O 3D 6D 12D 3D 6D 12D
  • IFN / C4 formulation in citrate buffer pH 4.0.
  • IFN / C5 formulation in citrate buffer pH 5.0
  • IFN / C6 formulation in citrate buffer H 6.0
  • IFN / A4 formulation in acetate buffer pH 4.0
  • IFN / A5 formulation in acetate buffer pH 5.0
  • IFN / A5.6 formulation in acetate buffer pH 5.6.
  • IFN gamma and IFN alpha 2b recombinant 0.5 MIU IFN gamma and 3.0 MIU IFN alpha 2b
  • IFN gamma and IFN alpha 2b concentration in percentage (%).
  • IFN / C-F25 formulation in citrate phosphate buffer pH 5.5 and at 25 mM
  • IFN / C-F50 formulation in citrate phosphate buffer pH 5.5 and at 50 mM
  • IFN / C-F100 formulation in citrate phosphate buffer pH 5.5 and at 100 mM
  • IFN / Fk25 formulation in potassium phosphate buffer pH 5.5 and at 25 mM
  • IFN / Fk50 formulation in potassium phosphate buffer pH 5.5 and at 50 mM
  • IFN / Fk100 formulation in potassium phosphate buffer pH 5.5 and at 100 mM
  • IFN / FNa25 formulation in sodium phosphate buffer pH 5.5 and at 25 mM
  • IFN / FNa 50 formulation in sodium phosphate buffer pH 5.5 and at 50 mM
  • IFN / FNa 100 formulation in sodium phosphate buffer pH 5.5 and at 100 mM
  • IFN / A25 formulation in sodium phosphate buffer pH 5.5 and at 100
  • Composition IFN gamma 2.8 x 10 8 Ul, IFN alpha 2b 3.4 x 10 8 Ul, mono-potassium di-hydrogen phosphate 0.0802g, di-sodium dihydrate hydrogen phosphate 0.249 g, sucrose 4g, glycine 0.8g, Tween 20 0.03g, polyethylene glycol 6000 1g, water for injection sufficient quantity for 100 ml_.
  • the filling volume was 0.5 mL / vial; STI: Uniform white lyophilisate; After reconstitution, a colorless transparent solution, essentially free of visible particles.
  • Example 6 Lyophilized formulation (0.5 x 10 6 Ul of IFN gamma and 3.0 x 10 6 Ul of IFN alpha 2b per vial).
  • Composition IFN gamma 1.0 x 10 8 Ul, IFN alpha 2b 6.0 x 10 8 Ul, mono-potassium di-hydrogen phosphate 0.0802g, di-sodium dihydrate hydrogen phosphate 0.249g, sucrose 4g, glycine 0.8g, Tween 20 0.03g, polyethylene glycol 6000 1g, water for injection sufficient quantity for 100 mL.
  • the preparation method was the same as described in the lyophilized formulation of example 5.
  • the filling volume was 0.5 mL / vial; Antiv .: Antiviral; STI: Uniform white lyophilisate; After reconstitution, a colorless transparent solution, essentially free of visible particles.
  • Example 7 Clinical trial with the lyophilized pharmaceutical formulation (0.5 x 10 6 Ul of IFN gamma and 3.0 x 10 6 Ul of IFN alpha 2b per vial). Intralesional application in the CBC.
  • the stable lyophilized pharmaceutical formulation described in Example 6 was used in the performance of a randomized, controlled and triple-blind clinical trial that included 59 patients with clinical and histological diagnosis of CBC of any location and skin type with lesions of a diameter smaller than four centimeters They were randomized to three treatment groups.
  • the lesions were treated intralesionally with recombinant IFN alpha 2b (1.5 x 10 6 IU / mL); Recombinant gamma IFN (0.25 x10 6 IU / mL) or the stable lyophilized formulation (0.5 x 10 ⁇ Ul of gamma IFN and 3.0 x 10 6 Ul of recombinant IFN alpha 2b per vial) at half of the dose, group I 1 Il and III, respectively, three times per week, for three consecutive weeks, continuing for 9 more weeks once a week or until the total disappearance of the lesion, at which time the efficacy of the treatment was determined from the point of view clinical.
  • the most frequent adverse events in each treatment group were: fever (38.5%; 60.8% and 26.2%), myalgias (38.5%; 3.9% and 31%) and chills (12.8%; 19.6% and 21.4%) with IFN alpha, IFN gamma and the combination, respectively.
  • the total adverse events presented were slightly higher in the group of patients treated with IFN gamma.
  • the combined treatment achieved a 32% superiority of complete responses, with 25% less injections compared to the treatment with IFN alpha and approximately 4 weeks before. It did not potentiate the adverse events and no recurrence was found in the follow-up one year after the end of the treatment in patients who received a complete response. From the cosmetic point of view, the result was very good resulting in mostly flat and normochromic lesions.
  • Example 8 Results of the compassionate use of the mixture of recombinant gamma and alpha 2b IFNs in patients affected by skin tumors not susceptible to standard treatments. Case Report Patient 1
  • Figure 7a Because of the size of the tumor 12.5 x 9 cm fixed to bone and muscle and 1-1.5 cm thick, (Figure 7a) it was planned in three perimeter sectors, infiltrating 1.5 mL of solution in approximately 5 cm 3 of tissue (1.5 x 1.5 x 1.5) at a dose of 0.5 x 10 6 Ul of IFN gamma + 6 x 10 6 Ul of IFN alpha 2b in 6 mL of water for injection, three times a week for three weeks, each sector.
  • intralesional IFN treatment is proposed (0.5 x 10 6 Ul of gamma IFN + 3 x 10 6 Ul of IFN alpha 2b in 4 mL, three times a week for three weeks).
  • the patient received 10 applications for a total dose of 35 x 10 6 Ul of interferon (5 x 10 6 Ul of IFN gamma + 30 x 10 6 Ul of IFN alpha 2b).
  • the flat scar lesion had disappeared and in the eyelid it had a necrotized ulcer at the site of the tumor ( Figure 8b).
  • Two months after treatment no eyelid tumor is observed, and disappearance of the flat scarring of the cheekbone ( Figure 8c).
  • Example 9 Lyophilized formulation (0.5 x 10 6 Ul of IFN gamma and 10 x 10 6 Ul of IFN alpha 2b per vial).
  • Composition IFN gamma 1.0 x 10 8 Ul 1 IFN alpha 2b 20 x 10 8 Ul, mono-potassium di-hydrogen phosphate 0.0802 g, di-sodium dihydrate hydrogen phosphate 0.249 g, sucrose 4 g, glycine 0.8 g, Tween 20 0.03 g, polyethylene glycol 6000 1 g, water for injection sufficient quantity for 100 mL.
  • the preparation method was the same as described in the lyophilized formulation of example 5.
  • Example 10 Use of the stable lyophilized formulation composed of 0.5 MUI IFN gamma / vial and 10.0 MUI IFN alpha 2b / vial in combination with Cisplatin. Case Report Patient 4 Initials: JGA HC: Age: 33 years Sex: Male APP: n / r
  • Example 11 Liquid formulation (1.4 x 10 6 Ul of IFN gamma and 1.7 x 10 6 Ul of IFN alpha 2b per vial).
  • Composition IFN gamma 2.8 x 10 8 Ul, IFN alpha 2b 3.4 x 10 8 IU 1 sodium acetate 0.708 g, acetic acid 0.079 ml_, Tween 20 0.01 g, mannitol 5 g, water for injection sufficient quantity for 100 mL
  • the samples were stored for a period of six months at 2 and 8 0 C. At certain intervals of time samples were taken and the pH, the content of IFN gamma and IFN alpha 2b were analyzed by ELISA, Ia biological activity, the purity by RP-HPLC and the clarity of the solution. The results are presented in table 14.
  • LIQUID 1.4 MUI IFN gamma / vial and 1.7 MUI IFN alpha 2b / vial.
  • the filling volume was 0.5 mL / vial; Antiv .: Antiviral, STI: A colorless transparent solution, essentially free of visible particles.
  • Example 12 Liquid formulation (0.5 x 10 6 Ul of IFN gamma and 3.0 x 10 6 Ul of IFN alpha 2b per vial).
  • composition IFN gamma 2.0 x 10 8 Ul, IFN alpha 2b 12.0 x 10 8 Ul, sodium acetate 0.708 g, acetic acid 0.079 mL, Tween 20 0.01 g, mannitol 5 g, water for injection sufficient quantity for 100 mL.
  • the preparation method was the same as described in the Liquid Formulation of Example 11.
  • the filling volume was 0.5 mL / vial .
  • STI A colorless transparent solution, essentially free of visible particles.
  • Example 13 Liquid formulation (0.5 x 10 6 Ul of IFN gamma and 10 x 10 6 Ul of IFN alpha 2b per vial).
  • composition IFN gamma 2.0 x 10 8 Ul, IFN alpha 2b 40 x 10 8 Ul, sodium acetate 0.708 g, acetic acid 0.079 mL, Tween 20 0.01 g, mannitol 5 g, water for injection sufficient quantity for 100 mL.
  • the preparation method was the same as described in the Liquid Formulation of Example 11.
  • Example 14 Semi-solid formulation (0.16 x 10 6 Ul of IFN gamma and 1.0 x 10 6 Ul of IFN alpha 2b per gram of semi-solid).
  • compositions for topical application preferably in the form of cream, ointment or jelly.
  • the pharmaceutical preparation contains gamma interferon and recombinant interferon alfa 2 as active ingredient.
  • composition is 1.6 x 10 7 Ul of IFN gamma and 1 x 10 8 Ul of IFN alpha 2b, sufficient quantity for 100 grams of semi-solid.
  • Table 17 Ingredients of the cream formulation.
  • the EDTA is dissolved and in another the parabens are dissolved in alcohol and the propylene glycol is added. These solutions are then mixed with constant stirring and carbopol 940 is slowly incorporated with rapid and vigorous stirring until a cloudy dispersion is obtained without the presence of lumps.
  • a solution of 1N sodium hydroxide with the grams of soda is prepared separately in a suitable container and slowly added with stirring to the dispersion containing the rest of the components of the formulation. Subsequently, IFN gamma and IFN alpha 2b are incorporated with gentle agitation. Once formed the jelly is packaged in tubes of 15 g to 4 0 C (see table 19). Table 19. Ingredients of the formulation of the jelly.

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Abstract

La presente invención está relacionada con formulaciones farmacéuticas estables para ser aplicadas por vía parenteral (líquidas o liofilizadas), o tópica (gel, ungüento o crema) que comprenden diferentes cantidades de los interferones recombinantes gamma y alfa en proporciones potenciadoras para el tratamiento de eventos patológicos que contemplan el crecimiento celular no fisiológico benigno o maligno de tejidos u órganos.

Description

FORMULACIONES ESTABILIZADAS QUE CONTIENEN A LOS INTERFERONES GAMMA Y ALFA EN PROPORCIONES POTENCIADORAS.
Campo de Ia técnica La presente invención se relaciona con Ia biotecnología y las ciencias médicas, en particular con formulaciones estabilizadas que contienen a los interferones recombinantes gamma y alfa en proporciones potenciadoras de Ia inhibición del crecimiento celular en diferentes tejidos u órganos de los seres humanos.
Estado de Ia técnica anterior
La variedad de efectos de los interferones tipo I (en inglés "Interferons", abreviado IFNs) crea un gran potencial terapéutico de aplicaciones. El empleo de estos es beneficioso en el tratamiento de varios tipos de cáncer, entre los que se incluyen las leucemias (US 5830455), carcinomas baso celulares (US 5028422), carcinoma de células escamosas (US 5256410), cáncer de mama (US 5024833), tumores gastrointestinales (US 5444064; 5814640), y queratosis actínica (US 5002764). Diferentes tipos celulares muestran una sensibilidad diferenciada a los IFNs, y las concentraciones para inhibir su crecimiento pueden variar en un rango amplio (Borden E., et al. (1981) Progress in Hematology. vol XII, Brown EB., editor, 299- 339), por Io que muestran diferencias en cuanto a su capacidad para inhibir el crecimiento celular (Dahl H. (1983). Human interferon and cell growth inhibition. VII. Reversibility of interferon activities. J Interferon Res, 3:327-332; Willson J.K.V., Bittner G., et al. (1984) Antiproliferative activity of human interferons against ovarían cáncer cells grown in human tumor stem cell assay. J Interferon Res, 4:441-447; Hu R., Gan Y., et al. (1993) Evídence for múltiple binding sites for several components of human lymphoblastoid interferon-alpha. J BIoI Chem, 268:12591-12595), y a Ia actividad antitumoral (Quesada JR., Talpaz M., et al. (1986) Clinical toxicity of interferons in cáncer patients: a review. J Clin Oncol, 4:234-243). El empleo de los IFNs en Ia terapia del cáncer no ha satisfecho las expectativas que los ensayos in vitro y las propiedades de estas potentes moléculas biológicas poseen. Diferentes regímenes han sido probados sin efectos beneficiosos claros y de impacto (Strander H., y Oberg K., (1992) Clinical use of interferons. Solid tumors INTERFERON. Principies and Medical Applications. Editor Barón S., Coppenhaver DH., Dianzani F., Fleischmann WR., Jr. Hughes TK., Jr. Klimpel GR., Niesel DW., Staton GJ., and Tyring SK., 533-561).
En un esfuerzo por alcanzar mejores efectos en las terapias se han empleado dosis altas de IFNs, pero Ia respuesta potencial beneficiosa esperada no se logra debido a varios factores, entre ellos las reacciones adversas que se producen con dichas dosis (Lañe H. C. (1990) Interferon-alpha in patients with asymptomatic human immunodeficiency virus (HIV) infection. A randomized, placebo-controlled trial. Annals ofinternal Medicine, 112:805-811). También se ha empleado a los IFNs de forma combinada explotando sus efectos potenciadores. La combinación de IFN alfa e IFN gamma se ha descrito en cultivos de fibroblastos de queloides en estudios in vito (Tredget E. E., Wang R., et al. (2000) Transforming growth factor-beta mRNA and protein in hypertrophic scar tissues and fibroblasts: antagonism by IFN-alpha and IFN-gamma in vitro and in vivo. J Interíeron Cytokine Res, 20:143-151). En este trabajo se menciona Ia utilización combinada de los IFNs alfa y gamma, pero esto se hace in vitro y en células provenientes de queloides en niños. Estos autores no realizaron ningún ensayo clínico y no evaluaron el efecto de Ia combinación sobre células de adultos, que responden menos a los interferones. La patente EP 0107498 muestra Ia combinación de los interferones alfa y gamma en Ia línea celular de melanoma Hs294T, pero no se describe este efecto en otros tipos de células como cultivos primarios de carcinoma baso celular, de un glioblastoma (GL-5), o de un carcinoma de laringe (HEp-2).
La utilización alternada de IFN alfa natural e IFN gamma recombinante también se ha descrito como tratamiento para las metástasis en el pulmón (Fujii A., Yui-En K., et al. (1999) Preliminary results of the altemating administration of natural interferon- alpha and recombinant interferon-gamma for metastatic renal cell carcinoma BJU Int.; 84:399-404). La combinación de IFN alfa 2, o alfa 4 o el híbrido delta 4 alfa 2 BgI Il alfa 1 con IFN gamma fue descrita en las líneas celulares RT4 (carcinoma de vejiga) y en A2182 (adenocarcinoma de pulmón) y posee un efecto antiproliferativo superior a las otras combinaciones entre IFNs tipo I o al IFN gamma solo, (Hubbell H. R., Craft J.A., et al. (1987) Synergistic antiproliferative effect of recombinant alpha- interferons with recombinant gamma-interferon. J Biol Response Mod, 6:141-153). Un efecto potenciador entre el IFN gamma (1000 UI/mL) y el IFN alfa 2 (1000 UI/mL) se demostró en Ia línea celular A459 (tumor alveolar), (Martyre M. C, Beaupain R., et al. (1987) Potentiation of antiproliferative activity by mixtures of human recombinant IFN-alpha 2 and -gamma on growth of human cáncer nodules maintained in continuous organotypic culture. EurJ Cáncer Clin Oncol, 23:917-920), así como en líneas celulares establecidas de carcinoma anaplástico de células grandes (Hand A., Pelin K., et al. (1993) Interferon-alpha and interferon-gamma combined with chemotherapy: in vitro sensitivity studies in non-small cell lung cáncer cell lines. Anticancer Drugs, 4:365-368).
La combinación de IFN alfa e IFN gamma se ha descrito en estudios con Ia línea celular HepG2, (Mizukoshi E., Kaneko S., et al. (1999) Upregulation of type I ¡nterferon receptor by IFN-gamma. J Interíeron Cytokine Res, 19:1019-1023) y en Ia línea celular AVA5 (Okuse C, Rinaudo J. A., et al. (2005) Enhancement of antiviral activity against hepatitis C virus in vitro by interferon combination therapy. Antiviral Res, 65:23-34). Estos autores no determinan el efecto antiproliferativo, ni las proporciones más efectivas de Ia combinación de los interferones alfa y gamma en Ia línea celular HepG2. También se ha explorado el efecto potenciador, del TNF alfa y el IFN gamma en Ia línea celular Hepa1-6 de un hepatoma murino (Sasagawa T., Hlaing M., et al. (2000) Synergistic induction of apoptosis in murine hepatoma Hepa1-6 cells by IFN-gamma and TNF-alpha. Biochem Biophys Res Común, 272:674-680). En Ia patente US 5190751 se describe Ia inhibición del crecimiento de líneas celulares de leucemias de tipo B y de tipo T por Ia combinación de IFN alfa y gamma. En ninguna de las líneas T evaluadas se observó potenciación del efecto, y en ciertas condiciones experimentales los efectos de las combinaciones son antagónicos. En Ia patente EP 010749 y en una publicación (Czarniecki C. W., Fennie C. W., et al. (1984) Synergistic antiviral and antiproliferative activities of Escherichia coli-derived human alpha, beta, and gamma interferons. J Virol. 49:490- 496), se muestra también que Ia combinación de los IFNs alfa y gamma no siempre es potenciadora y puede llegar a ser antagónica. Se describe Ia eficacia de las combinaciones en un rango muy amplio, pero no se demuestra. Esto indica que el empleo de combinaciones de IFN alfa y gamma debe ser sometido a un proceso de definición experimental el cual permita identificar qué condición es Ia favorable para establecer una combinación óptima para el tratamiento de un crecimiento celular inadecuado en tejidos u órganos dado. Por tal motivo, para sustentar una terapia y dosis adecuadas estas deben ser evaluadas en experimentos in vitro y en ensayos clínicos controlados.
En un estudio con líneas celulares de Gliomas, el IFN gamma afectó las características de malignidad tales como Ia proliferación y Ia migración de las células tumorales estudiadas (Knupfer M. M., Knupfer H., et al. (2001) Interferon- gamma inhibits growth and migration of A172 human glioblastoma cells. Anticancer Res, 21:3989-3994). Así mismo, se han reportado resultados negativos con el empleo de IFN gamma para tratar los gliomas (Mahaley M. S., Bertsch L., Jr. et al. (1988) Systemic gamma-interferon therapy for recurrent gliomas. J Neurosurg, 69:826-829). El empleo de forma simultánea de IFN gamma e IFN beta ha resultado ser eficaz en Ia inhibición del crecimiento de Ia línea celular GBM-18, un astrocitoma multidrogo-resistente (Reddy P. G., et al. (1991) Systemic gamma-interferon therapy for recurrent gliomas. J Nati Cáncer Inst, 83:1307-1315). Se ha descrito además, Ia combinación de IFN gamma con alfa-difluorometilornitina (DFMO) para el tratamiento de estos tumores (US 4499072). La patente US 5002879, describe una terapia similar utilizando DFMO junto a células asesinas activadas por linfocinas e IL-2. Con respecto al IFN alfa, su combinación con otras drogas no ha tenido efectos favorables en el tratamiento de los gliomas, y ha mostrado toxicidad (Buckner J. C, Burch P. A., et al (1998) Phase Il trial of recombinant interferon-alpha-2a and eflornithine in patients with recurrent glioma. J Neurooncol. 36:65-70; Chang S. M., Barker F. G., et al. (1998) High dose oral tamoxifen and subcutaneous interferon alpha-2a for recurrent glioma. J Neurooncol, 37:169-176). Entonces, el tratamiento de este tipo de tumor puede ser favorecido por el uso combinado del IFN alfa y el IFN gamma, sobre Ia base de una adecuada selección de las proporciones de su combinación basado en experimentos in vitro e in vivo.
La laringe es el segundo sitio más frecuente de cáncer del tracto aero-digestivo superior después de Ia cavidad oral. El carcinoma de laringe es el tumor más frecuente de cabeza y cuello y el cáncer de laringe más común es el carcinoma de células escamosas (95 % de todos los casos). La sobrevida en los casos de tumores T3 y T4 de laringe es de solo 5 años en aproximadamente solo el 30 % de los pacientes sometidos a laringectomía (Djordjevic V., Milovanovic J., et al. (2004) Radical surgery of the malignant laryngeal tumors. Acta Chir Lugosl, 51 :31-35). Se ha demostrado que Ia radioterapia y Ia quimioterapia no son efectivas para el tratamiento de este carcinoma (Chen W., Guo X., et al. (2004) Long-term follow-up observation of clinical therapy for laryngeal carcinoma recurrence and cervical metástasis Un Chυang ErBi Yan Hou Ke Za ZN. 18:536-537). Sin embargo, Ia poliquimioterapia junto al empleo de IFN alfa ha resultado beneficiosa en el tratamiento del cáncer de laringe (Mantz C. A., Vokes E. E., (2001) Sequential induction chemotherapy and concomitant chemoradiotherapy in the management of locoregionally advanced laryngeal cáncer Ann Onco\, 12:343-347). La combinación de IL-2 e IFN alfa fue evaluada en un ensayo fase Il como terapia para el carcinoma de laringe, pero los resultados no fueron satisfactorios (Clayman G. L., Young G., et al. (1992) Detection of regulatory factors of lymphokine-activated killer cell activity in head and neck cáncer patients treated with ¡nterleukin-2 and interferon alpha. Ann Otol Rhinol Laryngol, 101 :909-915). Pocos avances existen en Ia terapéutica de los tumores de laringe. El uso combinado de los IFNs alfa y gamma podría contribuir a mejorar las terapias existentes para combatir este tipo de tumores. La patente US 5503828 describe una composición de interferones caracterizada por contener al menos 50% de los alelos de IFN alfa 2 e IFN alfa 8 y uno o más especies adicionales de IFNs de un grupo formado por IFN alfa 4, alfa 7, alfa 10, alfa 16, alfa 17, y alfa 21. Mientras, Ia patente US 4503035 muestra una preparación de algunas especies de IFN alfa, pero que no incluye al alfa 1 , alfa 5, alfa 14, y al IFN omega. Estas patentes no describen una formulación formada por Ia combinación de IFN gamma e IFN alfa 2 recombinantes.
La patente US 5762923 detalla una composición líquida de Interferon disuelta en agua con un detergente no iónico y alcohol bencílico en cantidades suficientes para estabilizar al IFN alfa que contiene además, un tampón ácido. Por otra parte, Ia patente US 4847079 describe una composición farmacéutica de Interferon y timerosal, mientras que Ia patente US 4675184 muestra un Interferon formulado con alcohol polihídrico y un tampón orgánico como estabilizador y un portador convencional o diluente de pH 3-6. La composición puede tener adicionalmente un surfactante aniónico y/o albúmina como estabilizador. En las patentes US 5236707 y US 5431909 se describe el uso de aminas como estabilizantes (aminas primarias alifáticas) y sales orgánicas de litio, que protegen de Ia degradación al Interferon y Io estabilizan. La patente US 4496537 refiere formulaciones líquidas estables de interferón-alfa que incluyen en su composición albúmina de suero humana, y alanina o glicina, agua y un sistema tampón capaz de mantener el pH entre 6.5 y 8.0. La patente US 5935566 describe formulaciones acuosas estables de interferón-alfa que incluyen en su composición un sistema tampón capaz de mantener el pH en el rango de 4.5 a 7.1 , polisorbato 80 como estabilizador, EDTA como agente quelante, cloruro de sodio como agente isotonizante, y m-cresol como preservativo antimicrobiano. La patente US 0170207 describe formulaciones acuosas estables de interferón-alfa que incluyen en su composición un sistema tampón capaz de mantener el pH en el rango de 4.5 a 9.0, un agente estabilizador, un surfactante no iónico y un regulador de Ia presión osmótica.
En Ia solicitud WO 89/04177 se describen formulaciones farmacéuticas líquidas de Interferón-gamma que comprenden una solución tampón que mantiene el pH en el rango de 4.0 a 6.0, un azúcar polihidroxilada como estabilizador y un detergente no iónico. La patente US 4895716 refiere composiciones y métodos para Ia estabilización del Interferón-gamma con ácido lactobiónico en una solución tampón de acetato/glicina.
La patente US 5676942 describe composiciones farmacéuticas formadas por subtipos de interferones del tipo I obtenidos de fuentes naturales, pero no los combinan con el interferón gamma y no definen las proporciones de esas combinaciones, solo describe esas combinaciones para infecciones virales y no para el tratamiento de tumores.
En ninguno de los reportes descritos anteriormente se ha utilizado, caracterizado o mencionado una formulación estabilizada que contenga a los IFNs recombinantes gamma y alfa 2 juntos en combinaciones potenciadoras. Existen potencialidades en Ia utilización combinada de IFN gamma e IFNs tipo I cuando se mezclan en proporciones definidas para el tratamiento del crecimiento celular de diferente grado de resistencia a las terapias establecidas y/o sus combinaciones. Teniendo en cuenta estas premisas, se hace necesario el desarrollo de formulaciones estables que contengan a estos IFNs en proporciones que permitan su empleo de forma amplia, sencilla, eficaz y segura, en individuos con formaciones celulares benignas o malignas que así Io necesiten. Esto permitirá un manejo más óptimo de las combinaciones y hace más viable el empleo en Ia terapéutica de los pacientes necesitados de estos tratamientos. Explicación de Ia invención.
La presente invención resuelve el problema antes mencionado, proporcionando formulaciones farmacéuticas estables para ser aplicadas por vía parenteral (líquidas o liofilizadas), o tópica (gel, ungüento o crema) que comprenden diferentes cantidades de los interferones recombinantes gamma y alfa en proporciones potenciadoras. Dichas formulaciones son útiles para el tratamiento de eventos patológicos que contemplan el crecimiento celular no fisiológico benigno o maligno de tejidos u órganos y que comprende además excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Estas formulaciones son el resultado de los ensayos in vitro con líneas celulares de diferente sensibilidad a dichos IFNs y de ensayos clínicos en diferentes entidades oncológicas, así como de Ia evaluación de estabilidad físico-química y biológica de los IFNs gamma y alfa 2 recombinantes en presencia de los diferentes excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida, las formulaciones farmacéuticas estables liofilizadas se componen de los IFN gamma y alfa 2 recombinantes mezclados junto a una solución tampón capaz de mantener el pH entre 4.9 y 7.5, Ia cual puede ser el acetato de amonio o de sodio, el succinato de sodio, el fosfato de sodio y/o potasio o el citrato/fosfato de sodio. Estas formulaciones también están compuestas de al menos un componente seleccionado de compuestos de azúcares no reductores, aminoácidos, surfactantes y polímeros estabilizantes. Los azúcares no reductores pueden ser Ia sacarosa o Ia trehalosa; los aminoácidos pueden ser Ia glicina, Ia histidina o Ia leucina; mientras que como surfactantes se describen al polisorbato 20 o el polisorbato 80 y como polímero estabilizante al polietilenglicol, Ia dextrana o el almidón hidroxietilo.
Como una materialización de Ia invención se define que Ia solución tampón debe ser empleada en un rango de concentración entre 10 y 20 mM; Ia sacarosa o Ia trehalosa entre 5 y 100 mg/mL; Ia glicina, Ia histidina o Ia leucina deben emplearse en un rango de concentración entre 1 y 20 mg/mL; el polisorbato entre 0,01 y 1 mg/mL, mientras que el polietilen glicol, Ia dextrana, o el almidón hidroxietilo, se emplean en un rango de concentración entre 5 y 50 mg/mL
En otra realización preferida de Ia invención, se describen formulaciones farmacéuticas estables liofilizadas que contienen al IFN gamma recombinante en un rango de concentración entre 5.6 x 108 Ul y 1.4 x 108 Ul y al IFN alfa 2 recombinante en un rango de concentración entre 6.8 x 108 Ul y 1.7 x 108 Ul, o al IFN gamma recombinante en un rango de concentración entre 2.0 x 108 Ul y 0.5 x 108 Ul y al IFN alfa 2 recombinante en un rango de concentración entre 12.0 x 108 Ul y 3.0 x 108 Ul, o al IFN gamma recombinante en un rango de concentración entre 4.0 x 108 Ul y 1.0 x 108 Ul y al IFN alfa 2 recombinante en un rango de concentración entre 80 x 108 Ul y 20 x 108 Ul; junto a 0.0802 g de di-hidrógeno fosfato de mono-potasio, 0.249 g de hidrógeno fosfato de di-sodio di-hidratado, 4 g de sacarosa, 0.8 g de glicina, 0.03 g de Tween 20, 1 g de polietilenglicol 6000, y agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL y para 0.5 mL, 1 ml_, 5 mL y 10 mL en las respectivas proporciones equivalentes.
La definición de mezclar al IFN gamma recombinante en un rango de concentración entre 5.6 x 108 Ul y 1.4 x 108 Ul y al IFN alfa 2 recombinante en un rango de concentración entre 6.8 x 108 Ul y 1.7 x 108 Ul, en una de las formulaciones farmacéuticas estables liofilizadas se alcanzó por el resultado de los estudios de Ia inhibición del crecimiento de los cultivos primarios de fibroblastos provenientes de queloides (KeI 5a, KeI 17a) y del CBC III; en los cuales después de un análisis de isobologramas se identificó Ia combinación de 100 UI/mL (10 ng/mL) de IFN gamma recombinante con 100 UI/mL (0.5 ng/mL) de IFN alfa 2b recombinante que alcanza reducir el crecimiento celular in vitro en un 21%, 43% y 47%, respectivamente (ver ejemplos 1 , 2 y 3, figuras 1 , 2, 3, y 4, y tabla 1 ).
La mezcla de IFN gamma recombinante en un rango de concentración entre 2.0 x 108 Ul y 0.5 x 108 Ul y al IFN alfa 2 recombinante en un rango de concentración entre 12.0 x 108 Ul y 3.0 x 108 Ul para Ia formulación se definió utilizando un ensayo clínico y reporte de casos tratados por compasión. El ensayo clínico aleatorizado, controlado y a triple ciegas evaluó Ia eficacia del tratamiento intralesional (I. L.) en pacientes con carcinoma baso celular utilizando Ia formulación liofilizada estable compuesta por dicha combinación (ver ejemplo 7, tablas 9, 10, 11, y 12). En el reporte de casos tratados por compasión, que también contribuyó a definir estas proporciones, fueron tratados casos de carcinoma epidermoide (paciente 1) y de CBC múltiples, recidivantes y con injertos previos (paciente 2), (ver ejemplo 8 figuras 5 a, b, c, d; paciente 1, y figuras 6 a, b, c; paciente 2, respectivamente). La formulación que contiene al IFN gamma recombinante en un rango de concentración entre 4.0 x 108 Ul y 1.0 x 108 Ul y al IFN alfa 2 recombinante en un rango de concentración entre 80 x 108 Ul y 20 x 108 Ul se definió con el análisis de los resultados del estudio de Ia inhibición del crecimiento de las células del glioblastoma GL-5 por Ia combinación de 50 UI/mL (5 ng/mL) de IFN gamma recombinante con 100 UI/mL (0.5 ng/mL) de IFN alfa 2b recombinante, con Io que se alcanza una inhibición del crecimiento del 55% (ejemplo 3). También se tomó en cuenta el análisis del estudio con Ia línea celular HEp-2. En este caso las cantidades de IFNs son de 5 UI/mL (5 ng/mL) de IFN gamma recombinante con 75 UI/mL (0.375 ng/mL) de IFN alfa 2b recombinante. Con esa combinación óptima se alcanza reducir el crecimiento celular in vitro en un 76% (ver ejemplos 1 , 2 y 3). También fueron desarrolladas formulaciones farmacéuticas líquidas estables. En estas formulaciones se mantuvieron las proporciones de los IFNs gamma y alfa recombinates descritas para las formulaciones liofilizadas, pero sus otros ingredientes farmacéuticos variaron para lograr una mayor estabilidad a estas mezclas de los IFNs. Como resultado de este trabajo una materialización de Ia invención describe formulaciones farmacéuticas estables líquidas que comprenden una solución tampón y al menos un componente seleccionado de azúcares no reductores, aminoácidos, surfactantes, polímeros estabilizantes, compuestos antioxidantes/quelantes y agentes isotonizantes. Estas formulaciones emplean un solvente acuoso que puede contener o no agentes preservantes tal como Ia mezcla de metilo- y propilo-parabeno.
Otra materialización de Ia invención radica en Ia definición de formulaciones farmacéuticas estables líquidas que emplean una solución tampón capaz de mantener el pH entre 4.9 y 6.5. Este tampón puede ser acetato de amonio o de sodio, succinato de sodio, fosfato de sodio y/o potasio, citrato/fosfato. Estas formulaciones pueden emplear como surfactantes el polisorbato 20 o polisorbato 80; como antioxidante/quelante el EDTA o Ia cisteina-acetilo; mientras que como aminoácidos puede incluir Ia histidina, L-arginina, L-alanina, glicina o Ia lisina. Como polímero estabilizante se define Ia utilización del almidón hidroxietilo o Ia dextrana y como agente isotonizante el cloruro de sodio, el cloruro de potasio, el propilenglicol, el manitol, el glicerol, Ia sacarosa o Ia trehalosa.
En una materialización preferida de Ia presente invención recoge que las formulaciones farmacéuticas estables líquidas emplean una solución tampón en un rango de concentración entre 10 y 100 mM; donde el polisorbato se emplea en un rango de concentración entre 0,01 y 1 mg/mL; el EDTA o Ia cisteina-acetilo se emplean en un rango de concentración entre 0,01 y 1 mg/mL; Ia histldina, L- arginina, L-alanina, glicina o Ia lisina se emplean en un rango de concentración entre 1 y 20 mg/mL; el almidón hidroxietilo y Ia dextrana se emplean en un rango de concentración entre 5 y 50 mg/mL y donde los agentes isotonizantes se encuentran en cantidad suficiente para hacer isotónica Ia solución.
Otras materializaciones explican las cantidades de todos los ingredientes farmacéuticos de las formulaciones farmacéuticas estables líquidas necesarios parea Ia estabilidad biológica y físico-química de las mezclas de los IFNs gamma y alfa recombinantes descritas anteriormente. Estas formulaciones líquidas contienen además de los IFNs, 0.708 g de acetato de sodio, 0.079 mL de ácido acético, 0.01 g de Tween 20, 5 g de manitol, y agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL y para 0.5 mL, 1 mL, 5 mL y 10 mL en las respectivas proporciones equivalentes. Esta invención define las proporciones de mezclas de IFNs gamma y alfa que pueden ser ventajosas para el tratamiento del crecimiento celular benigno o maligno. Esto permitirá emplear menor dosis, menos tiempo de tratamiento y mantener los mismos efectos terapéuticos o lograr efectos superiores a los que se han alcanzado hasta hoy con el empleo de los interferones en el tratamiento de los tumores u otros eventos de crecimiento celular en órganos y tejidos. Al disminuir las dosis se podrán esperar menos efectos adversos o de menor intensidad, que les darán una mejor calidad de vida a los pacientes y les permitirá obtener los beneficios del uso de estas potentes drogas.
La invención define formulaciones de Ia mezcla de IFN gamma e IFN alfa 2 recombinantes no descritas anteriormente que facilitan el manejo y uso clínico de esta combinación terapéutica y su comercialización. Las formulaciones farmacéuticas estables liofilizadas y líquidas que contienen mezclas de los IFNs gamma y alfa 2 recombinantes en proporciones potenciadoras de Ia inhibición de Ia proliferación descritas en Ia invención tiene un amplio espectro de uso clínico. Se demuestra in vivo utilizando estas formulaciones que en entidades oncológicas importantes Ia combinación del IFN gamma y el IFN alfa 2 recombinantes es efectiva utilizada de forma combinada simultánea e intratumoral. Esta combinación es capaz de tener ¡guales efectos curativos sobre tumores en menor tiempo y con un resultado estético superior al que se obtiene por sus componentes por separado. El uso de estas combinaciones permitirá contar con mayores posibilidades terapéuticas para combatir el cáncer.
Esto se recoge en una materialización de Ia invención donde se expone que las formulaciones liofilizadas o líquidas pueden emplearse en el tratamiento de tumores sólidos benignos o malignos utilizadas de formas independientes o combinadas con quimioterapia, radioterapia o Ia combinación de estas.
La utilización de estas formulaciones en combinación con otros agentes terapéuticos se sustenta en los resultados obtenidos con el tratamiento de un paciente con un tumor baso celular terebrante con Ia combinación de IFN gamma e IFN alfa 2 recombinantes junto con Cisplatino (ver ejemplo 10 y figura 9).
Se describe en Ia invención cómo el empleo combinado de los interferones gamma y alfa 2 logra reducir y/o curar tumores de muy mal pronóstico y de efectos estéticos deformantes.
De acuerdo con las características de varias entidades oncológicas y benignas donde predomina un crecimiento no controlado de las células constituyentes del tejido u órgano pueden ser susceptibles de ser tratadas con estas formulaciones tumores del tejido hematopoyético tales como las leucemias mieloides agudas, crónicas, linfocíticas agudas y linfocíticas crónicas, así como las leucemias de células T, de células B, y el linfoma del sistema nervioso central. También pueden ser tratados los carcinomas de laringe, Ia papilomatosis laríngea, el lipoma, el cyst epidermoide e intradérmica, el liposarcoma, el neurofibroma, y Ia hiperplasia sebácea. Pueden ser beneficiados con el uso de estas formulaciones tumores del sistema nervioso central y periférico como los astrocitomas, glioblastomas multiformes, ependimomas, ganglioneuromas, astrocitomas pilocíticos juveniles, gliomas mezclados, oligodendrogliomas, gliomas del nervio óptico, tumores neuroectodermal primitivos, neuromas acústicos, cordomas, craniofaringiomas, meduloblastomas, meningiomas, neurofibromatosis, pseudotumores de cerebro, esclerosis tuberosa, tumores cerebrales metastáticos. Otros tumores susceptibles de ser tratados son los hemangiomas cavernosos, adenomas hepatocelulares, las hiperplasias nodulares focales, tumores pineales, adenomas pituitarios, tumores vasculares, carcinomatosis meningeal, angiomas en forma de cereza, hiperplasia de las glándulas sebáceas. Los tumores de piel como el carcinoma basocelular, el carcinoma de células escamosas, el dermatofibroma, el granuloma piogénico, el nevus dérmico, así como queratosis seborreica y queratosis actínicas pueden ser beneficiados por Ia terapia con estas formulaciones.
Otra materialización de Ia invención describe que estas formulaciones también pueden ser empleadas para el tratamiento de eventos proliferativos como Ia fibrosis, displasias e hiperplasias.
Según los resultados de los ensayos clínicos realizados y descritos en los ejemplos 7, 8, y 10 como materialización de Ia invención se definen como vías de aplicación de las formulaciones Ia intramuscular, intratumoral, y perilesionar. Una materialización más de Ia presente invención consiste en formulaciones farmacéuticas estables tópicas que contienen al IFN gamma en un rango de concentración entre 0.32 x 106 Ul y 0.08 x 106 Ul y al IFN alfa 2 en un rango de concentración entre 2.0 x 106 Ul y 0.5 x 106 Ul por gramo de semisólido. Dentro de estas formulaciones se describen Ia crema compuesta por IFN gamma 2.2%, 0.58% IFN alfa, por 4% de alcohol cetilito, 10% vaselina, 2% Tween 60, y 0.2% metilparabeno, propilparabeno. También se definió el ungüento compuesto por IFN gamma 2.2%, 0.58% IFN alfa, 60% de petrolato sólido blanco, 10% de petrolato líquido pesado, 3% de span 20, y 0.2% metilparabeno y propilparabeno. Finalmente se obtuvo Ia formulación de una jalea compuesta por IFN gamma 2.2%, 0.58% IFN alfa, 0.5% de Carbopol 940, 0.2% de metilparabeno y propilparabeno, 0.2% de Hidróxido de sodio, 0.01% de etilendiaminotetraacetato de calcio disódico, y 2% etanol.
Todas estas formulaciones son resistentes a las fluctuaciones de temperatura, Io cual es ventajoso para Ia fabricación del producto, su transportación y almacenamiento. Las mismas previenen Ia agregación de los interferones y por tanto presentan menor riesgo de resultar inmunogénicas durante el uso prolongando del producto.
Las formulaciones de semisólidos permiten el empleo por los propios pacientes de forma segura y no invasiva. También es parte de Ia presente invención el empleo de estas formulaciones estables tópicas en el tratamiento de tumores sólidos benignos o malignos de Ia piel o mucosas utilizadas de formas independientes o combinadas con quimioterapia, radioterapia o Ia combinación de estas.
Otro aspecto de Ia presente invención describe que las formulaciones farmacéuticas estables tópicas pueden ser empleadas para el tratamiento de lipoma, cyst epidermoide, cyst intradérmica, liposarcoma, neurofibroma, hiperplasia sebácea, hemangiomas, hiperplasia nodular focal, ependimomas, ganglioneuromas, astrocitomas pilocíticos juveniles, meningiomas, tumores pineales, adenomas pituitarios, tumores vasculares, carcinomatosis meningeal, neurofibromatosis, angiomas en forma de cereza, hiperplasia de las glándulas sebáceas, carcinoma basocelular, carcinoma de células escamosas, dermatofibroma, granuloma piogénico, nevus dérmico, queratosis seborreica, queratosis actínicas, y condilomas. Otra materialización de Ia invención describe Ia conformación de un juego de reactivos que contiene un vial de IFN gamma recombinante, un vial de IFN alfa recombinante a las concentraciones y relaciones descritas anteriormente, junto a una cantidad suficiente de viales con agua para inyección para Ia dilución y/o resuspensión de los IFNs, así como jeringuillas y agujas adecuadas para Ia administración simultánea de los IFNs previa unión en uno de los viales que contiene a uno de los IFNs.
Breve descripción de las Figuras:
Figura 1. Inhibición del crecimiento de las células de cultivos primarios de fibroblastos procedentes de biopsias de pacientes adultos con queloides por 1000
UI/mL de IFN gamma o IFN alfa 2 recombinantes. Figura 2. Isobolograma de Ia inhibición del crecimiento celular de Ia combinación de
IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes sobre el cultivo primario de fibroblastos de queloides (Kel5a).
Figura 3. Isobolograma de Ia inhibición del crecimiento celular de Ia combinación de
IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes sobre el cultivo primario de fibroblastos de queloides (KeH 7a).
Figura 4. Isobolograma de Ia inhibición del crecimiento celular de Ia combinación de
IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes sobre el cultivo primario de fibroblastos del
CBCIII.
Figura 5. Isobolograma de Ia inhibición del crecimiento celular de Ia combinación de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes sobre Ia línea celular del glioblastoma GL-
5.
Figura 6. Isobolograma de Ia inhibición del crecimiento celular de Ia combinación de
IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes sobre Ia línea celular del carcinoma de laringe HEp-2. Figura 7. Paciente con carcinoma epidermoide tratado con Ia combinación de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes.
Figura 8. Paciente con carcinoma basocelular recidivante tratado con Ia combinación de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes. Figura 9. Paciente con carcinoma basocelular recidivante tratado con Ia combinación de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes y cisplatino. A: antes del tratamiento, B: después de 1 año de tratamiento
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos.
Ejemplo 1. Inhibición del crecimiento celular por los IFNs gamma o alfa recombinantes sobre cultivos primarios.
Las biopsias de piel se obtuvieron de piel normal y de pacientes que desarrollaron carcinomas basocelulares o queloides debido a daño por cirugía o quemaduras. La muestra de tejido fue colocada inmediatamente en medio DMEM para su procesamiento con el objetivo de obtener cultivos primarios por el método de explantes.
Para Ia evaluación del efecto antiproliferativo de los IFNs gamma y alfa recombinantes se utilizaron los siguientes cultivos: Cultivos primarios de fibroblastos (CPF) de queloides (1 , 2, 5, 7, 8, 15, 17, 19, 20, 24, 26, 27, 31 , 32), CPF de un carcinoma basocelular (CBC III) y CPF normales (FibN3 y FibN5). Los CPF se cultivaron en una mezcla de medios de cultivo RPMI-1640/DMEM que contenían gentamicina (50 μg/ml), y 12% de suero fetal bovino (SFB). Todos los cultivos fueron incubados a 370C en una incubadora de CO2 con 5% de humedad. Para determinar el efecto antiproliferativo de los IFNs, las células se sembraron a 5 x 104 células /mL en placas de 96 pocilios. Se sincronizaron por cambio de medio fresco después de 24 horas de ser sembradas. Al término de 96 horas de incubación en presencia de diferentes concentraciones de los IFNs se determinó Ia viabilidad de 3 réplicas por condición de evaluación utilizando el método de tinción por cristal violeta midiendo Ia absorbancia a 580 nm y utilizando un lector de placas. Los resultados se definieron como el % de crecimiento basado en el conteo de células viables: % de crecimiento = (AT72h-AC0h/AC72h-AC0h) x 100. AT72h = Absorbancia de las células tratadas 72h. AC72h = Absorbancia de las células controles tratadas 72h. ACOh = Absorbancia de las células antes de ser incubadas con IFN. En Ia figura 1 se muestra Ia acción antiproliferativa de los IFNs gamma o alfa recombinantes sobre el crecimiento de los CPF de queloides. Como puede observarse el IFN gamma o alfa 2b inhiben Ia proliferación celular en varios cultivos primarios, mientras que en otros estimulan su crecimiento. Como controles se evaluaron los cultivos primarios FibN3 y FibN5, así como de biopsia de un CBCIII, y líneas celulares como Ia HEp-2, U 1752 y GL-5.
Ejemplo 2: Inhibición del crecimiento celular por los IFNs gamma o alfa recombinantes sobre líneas celulares establecidas.
Se estudiaron las líneas celulares humanas Jurkat (ATCC, TIB-152), GL-5 (Perea S.E., et al. (1993) Acta Cient Venez, 44:22-27), HEp-2 (ATCC, CCL23). Las células GL-5 fueron cultivadas en DMEM, y las HEp-2 en MEMCANE conteniendo gentamicina (50 μg/ml) y 10% SFB. Las Jurkat fueron incubadas en medio RPMI con gentamicina y 10% SFB. Todos los cultivos fueron incubados a 370C en una incubadora de CO2 con 5% de humedad. Para hacer las determinaciones del efecto antiproliferativo las células GL-5 y las HEp-2 fueron sembradas a 3 x104 células/mL. En el caso de las Jurkat estas se sembraron a 105 células /mL.
Después de 72 horas de incubación en presencia de diferentes concentraciones de los IFNs se determinó Ia viabilidad de 3 réplicas por condición de evaluación utilizando el método de tinción por cristal violeta midiendo Ia absorbancia a 580 nm y utilizando un lector de placas. Los resultados se definieron como el porciento (%) de crecimiento basado en el conteo de células viables según se describe en el ejemplo 1.
Como se observa en Ia tabla 1 y en Ia figura 1, las líneas celulares HEp-2 (carcinoma de laringe) y el GL-5, que proviene de un glioblastoma, son muy sensibles al IFN gamma y no al IFN alfa.
Tabla 1. Inhibición del crecimiento celular por 1000 UI/mL de IFN gamma o IFN alfa 2b sobre líneas celulares. Coeficiente
Desviación
IFNs de
Promedio Estándar Réplicas Ensayos Variación DS CV
HEp-2
IFN Alfa 2 65% 13.68% 0.211 6 2
IFN gamma 18% 6.26% 0.357 6 2
GL-5
IFN Alfa 2 71% 20.26% 0.287 6 2
IFN gamma 24% 10.21 % 0.421 4 2
HepG2
IFN Alfa 2 103% 13.17% 0.128 6 1
IFN gamma 106% 21.67% 0.204 6 1
Jurkat
IFN Alfa 2 60% 5.28% 0.088 3 1
IFN gamma 107% 16.89% ' 0.157 3 1
En Ia tabla 1 se observa que Ia línea HepG2 (Hepatoma) no es sensible a estos IFNs y que en Ia línea celular Jurkat (linfoma T), el IFN alfa es el más efectivo, resultado que coincide con el empleo exitoso del IFN alfa 2 en el tratamiento de tumores de tejido linfoide.
Ejemplo 3: Combinaciones de los IFNs gamma y alfa recombinantes más efectivas con acción antiproliferativa sobre los cultivos primarios y líneas celulares.
Utilizando los CPF del CBC-III y de los queloides Kel-5a y Kel-17a y las líneas celulares HEp-2 y GL-5, se realizaron estudios de combinaciones de IFNs gamma y alfa 2b recombinantes, para definir mezclas óptimas con actividad potenciadora de Ia inhibición del crecimiento celular. Los datos obtenidos en los estudios fueron analizados construyendo curvas de isobologramas.
De los estudios de isobologramas de los CPF provenientes de biopsias de queloides en adultos (kel 5a y kel 17a) se definió que Ia combinación óptima potenciadora para Ia inhibición del crecimiento debe estar compuesta de 100 UI/mL (10 ng/mL) de IFN gamma 100 UI/mL (0. 5 ng/mL) de IFN alfa 2b. Con esa combinación se alcanza reducir el crecimiento celular in vitro en un 21 % (KeI 5a) y en un 43 % (kel 17a) (figuras 2 y 3). En el ¡sobolograma de Ia figura 4 se muestra que Ia combinación de 100 UI/mL (10 ng/mL) de IFN gamma con 100 UI/mL (0. 5 ng/mL) de IFN alfa 2b es potenciadora y Ia más eficaz para reducir el crecimiento celular in vitro del CBC III en un 47%. Según el isobolograma que se muestra en Ia figura 5, Ia combinación óptima potenciadora para inhibir el crecimiento de las células del GL-5 es de 50 UI/mL (3 ng/mL) de IFN gamma con 600 UI/mL de IFN α2b (5 ng/mL) de IFN alfa 2b. Con esa combinación se alcanza reducir el crecimiento celular in vitro en un 55%. En el isobolograma representado en Ia figura 6 se muestra Ia combinación óptima potenciadora de IFN gamma y alfa para obtener el mejor efecto antiproliferativo sobre las células HEp-2. Las cantidades de IFNs son de 5 UI/mL (0.5 ng/mL) de IFN gamma con 75 UI/mL (0.375 ng/mL) de IFN alfa 2b. Con esa combinación óptima se alcanza reducir el crecimiento celular in vitro en un 76%.
Ejemplo 4: Efecto del pH, las especies iónicas y Ia concentración de Ia solución tampón en Ia estabilidad de Ia mezcla de los interferones alfa-2b y gamma en solución acuosa.
Para estudiar Ia estabilidad de las formulaciones liofilizadas y líquidas de las composiciones potenciadoras de los interferones gamma y alfa recombinantes, se prepararon diferentes formulaciones diluyendo el interferón gamma y el alfa de su correspondiente Ingrediente Farmacéutico Activo (IFA) en diferentes formulaciones de prueba: soluciones tampones, mezcla de soluciones tampones con excipientes individuales y mezcla de soluciones tampones con varios excipientes. Muestras representativas de los viales de las diferentes formulaciones fueron sometidas a diferentes tratamientos para evaluar Ia estabilidad de los interferones: Ciclos de congelación-descongelación, liofilización, agitación a 37°C, efecto de Ia luz y de Ia temperatura. Después de los diferentes tratamientos, Ia estabilidad físico-química fue evaluada mediante diferentes ensayos: apariencia física, electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), cromatografía líquida en fase inversa (RP-HPLC) y cromatografía de exclusión molecular (SE-HPLC). La estabilidad biológica fue evaluada mediante ensayos inmuno-enzimáticos en fase sólida (ELISA) específicos para cada interferón y mediante ensayo biológico de inhibición del efecto citopatogénico. Todos estos estudios de diseño de formulación se realizaron con Ia mezcla de concentraciones intermedia de los interferones (0.5 MUI de IFN gamma y 3.0 MUI de IFN alfa 2b). Con las variantes finales de formulación obtenidas (preparadas por duplicado) se prepararon las composiciones potenciadoras y se evaluó su estabilidad.
Características organolépticas: Se determinó mediante análisis de Ia apariencia de Ia formulación (si se mantenía incolora, transparente y sin agregación de proteínas). En el caso de ser liofilizada Ia formulación, también se analizó Ia apariencia del producto liofilizado.
Contenido de humedad: El contenido de humedad residual del producto liofilizado fue determinado mediante Ia técnica de titulación iodométrica de Karl Fischer, empleando un medidor de humedad Radiometer (Modelo TIM 550).
Estabilidad química: La pureza de las proteínas y Ia magnitud de Ia degradación se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP- HPLC) en una columna C8 Vydac equipada con un guarda-columna C8 Vydac (Vydac, Hesperia, CA) usando un sistema HPLC Merck-Hitachí equipado con un sistema de liberación de solventes, un detector de arreglo de diodo, un horno y un sistema de manejo de datos. La pureza de las proteínas también se determinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Determinación de agregados: La agregación del IFN gamma y del IFN alfa 2b recombinantes fue medida por cromatografía líquida de alta resolución de exclusión molecular (SE-HPLC) mediante una columna Superdex-75 HR 10/30 (Amersham
Pharmacia Biotech AB, Sweden) usando un sistema HPLC Merck-Hitachi equipado con un sistema de liberación de solventes, un detector de arreglo de diodo, un horno y un sistema de manejo de datos. La determinación de agregados covalentes se determinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
ELISA de interferón alfa: Este ensayo ha sido desarrollado en nuestro laboratorio (H. Santana., Espino Y., et al. (1999) A sandwich-type enzyme-linked immunosorbent assay for the analysis of recombinant human interferón α-2b. Biotechnology Techniques, 13, 341-346). El ensayo emplea anticuerpos monoclonales y fue realizado siguiendo Ia metodología reportada. La medición es reportada aquí como porcentaje (%) de Ia actividad ELISA residual del interferón alfa-2b en las diferentes muestras tratadas de las diferentes variantes de formulación, tomando Ia actividad ELISA en Ia muestra inicial igual al 100 %.
ELISA de interferón gamma: Este ensayo ha sido desarrollado en nuestro laboratorio (Bouyón R., Santana H., et al. (2003) Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for recombinant human gamma interferón. Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 24:1-10). El ensayo emplea anticuerpos monoclonales y fue realizado siguiendo Ia metodología reportada. La medición es reportada aquí como porcentaje (%) de Ia actividad ELISA residual del interferón gamma en las diferentes muestras tratadas de las diferentes variantes de formulación, tomando Ia actividad ELISA en Ia muestra inicial igual al 100 %. Actividad biológica mediante ensayo de titulación antiviral: La medición de Ia actividad biológica fue realizada según describe Ferrero J., Ochagavia ME., et al. (1994, Titulación de Ia actividad antiviral del interferón utilizando el sistema de equipos SUMA. Biotecnología Aplicada, 11 :34-42). El cálculo de Ia actividad biológica se realizó según describe Ferrero J., Duany L., et al. (1997, Nuevo programa de cálculo, cuantificación de Ia actividad antiviral de interferones mediante Ia inhibición del efecto citopatogénico utilizando el sistema de equipos SUMA. Biotecnología Aplicada, 14: 267-269). La actividad biológica es reportada aquí como porcentaje de Ia actividad biológica residual, tomando Ia actividad biológica de Ia muestra inicial igual al 100%. Para conocer el efecto del pH en Ia estabilidad de los ingredientes activos, se prepararon diferentes formulaciones conteniendo 0.5 MUI de IFN gamma y 3.0 MUI de IFN alfa 2b en diferentes soluciones tampones; es decir, tampón citrato/fosfato, tampón fosfato, tampón citrato y tampón acetato. Las formulaciones conteniendo las mezclas de IFN gamma y de IFN alfa2b recombinantes con las soluciones tampones fueron preparadas y sometidas a ciclos de congelación-descongelación o almacenadas a Ia temperatura de 45°C y analizadas por ELISA a determinados intervalos de tiempo. Las formulaciones fueron preparadas de forma tal que el pH estuviera entre 4 y 8, y todas las soluciones tampones se encontraban a una concentración de 0.1 M. Las tablas 2, 3 y 4 reportan los resultados de los ensayos realizados después de 3 ciclos de congelación-descongelación y a determinados intervalos de tiempo, de 3 a 12 días a temperatura de 45°C.
Tabla 2. Estabilidad a 45°C y durante ciclos de congelación-descongelación de mezcla de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes (0.5 MUI IFN gamma y 3.0 MUI IFN alfa 2b) en solución acuosa en tampón citrato/fosfato 0.1 M a diferentes pH. Concentración de IFN gamma e IFN alfa 2b en porcentaje (%).
CONGELACIÓN-DESCONGELACIÓN INCUBACIÓN A 45UC
ELISA ELISA
ELISA IFNγ ELISA IFNα IFNγ IFNα
T=O 3D 6D 12D 3D 6D 12D
IFN/4 100
25.9 73.0 4.5 ND ND 78.5 69.9 36.9
2690650 UI/ML
IFN/5 100
82.1 86.5 5.4 ND ND 81.4 62.6 31.7
3820902 UI/ML
IFN/6 100
63.3 82.7 36.5 5.5 3.6 79.8 61.0 38.5
3532107UI/ML
IFN/7 100
63.0 82.4 44.4 26.4 14.0 78.0 63.1 32.0
3532100 UI/ML
IFN/8 100
55.1 76.7 37.6 21.6 11.5 82.5 60.3 34.2
3179500 UI/ML
D= Días; ND = no determinable;
IFN/4= formulación en tampón citrato/fosfato pH 4.0; IFN/5= formulación en tampón citrato/fosfato pH 5.0
IFN/6= formulación en tampón citrato/fosfato pH 6.0; IFN/7= formulación en tampón citrato/fosfato pH 7.0
IFN/8= formulación en tampón citrato/fosfato pH 8.0.
Tabla 3. Estabilidad a 45°C y durante ciclos de congelación-descongelación de mezcla de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes (0.5 MUI IFN gamma y 3.0 MUI IFN alfa 2b) en solución acuosa en tampón fosfato 0.1 M a diferentes valores pH. Concentración de IFN gamma e IFN alfa 2b en porcentaje (%).
Figure imgf000022_0001
D= Días; ND = no determinable; IFN/5= formulación en tampón fosfato pH 5.O.; IFN/6= formulación en tampón fosfato pH 6.0.
IFN/7= formulación en tampón fosfato pH 7.O.; IFN/8= formulación en tampón fosfato pH 8.0 Los datos contenidos en estas tablas indican que las formulaciones con valores de pH entre 5 y 8 mostraron una adecuada estabilidad durante los ciclos de congelación-descongelación, preferiblemente para los pH cercanos a 5 y a 7 y en los tampones acetato, fosfato y citrato-fosfato. La estabilidad térmica en solución acuosa fue mayor a valores de pH entre 5 y 5.6, preferiblemente en los tampones acetato y fosfato. Los datos contenidos en Ia tabla 5 indican que las formulaciones de mayor concentración del tampón mostraron mayor estabilidad durante los ciclos de congelación-descongelación que las de menor concentración a pH 5.5, particularmente para el IFN gamma en los diferentes tampones ensayados. Sin embargo, los resultados de Ia estabilidad térmica fueron mejores a pH 5.5 en los tampones acetato y después en fosfato y no se observó dependencia de Ia concentración. La estabilidad térmica en tampón citrato-fosfato fue mayor a bajas concentraciones del tampón. Tabla 4. Estabilidad a 450C y durante ciclos de congelación-descongelación de mezcla de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes (0.5 MUI IFN gamma y 3.0 MUI IFN alfa 2b) en solución acuosa en tampón citrato y tampón acetato 0.1 M a diferentes valores pH. Concentración de IFN gamma e IFN alfa 2b en porcentaje (%).
CONGELACIÓN-DESCONGELACIÓN INCUBACIÓN A 45υC
ELISA ELISA
ELISA IFNγ ELISA IFNα IFNγ IFNα
T=O 3D 6D 12D 3D 6D 12D
IFN/C4 100
11.9 77.0 1.3 ND ND 66.9 49.9 27.0
2690650 UI/ML
IFN/C5 100
64.6 78.1 2.7 ND ND 71.3 56.6 41.8
3820902 UI/ML
IFN/C6 100
65.8 66.9 12.0 5.9 ND 61.5 43.7 28.2
3532107UI/ML
IFN/A4 100
87.1 82.3 65.9 46.4 27.9 64.5 46.6 29.0
3532100 UI/ML
IFN/A5 100
86.1 79.7 59.4 45.9 24.0 68.3 47.9 30.7
3179500 UI/ML
IFN/A5.6 100
74.8 75.0 50.8 31.3 18.9 67.7 48.3 27.6
3179500 UI/ML
D= Días; ND = no determinable;
IFN/C4= formulación en tampón citrato pH 4.0. , IFN/C5= formulación en tampón citrato pH 5.0, IFN/C6= formulación en tampón citrato H 6.0, IFN/A4= formulación en tampón acetato pH 4.0, IFN/A5= formulación en tampón acetato pH 5.0, IFN/A5.6= formulación en tampón acetato pH 5.6.
Tabla 5. Estabilidad a 450C y durante ciclos de congelación-descongelación de mezcla de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes (0.5 MUI IFN gamma y 3.0 MUI IFN alfa 2b) en solución acuosa a pH 5.5 en tampones citrato-fosfato, fosfato y acetato a 0.1 M y a diferentes concentraciones de Ia solución tampón. Concentración de IFN gamma e IFN alfa 2b en porcentaje (%).
Figure imgf000024_0001
D: Días; ND: no determinable; IFN/C-F25: formulación en tampón citrato-fosfato pH 5.5 y a 25 mM; IFN/C-F50: formulación en tampón citrato-fosfato pH 5.5 y a 50 mM; IFN/C-F100: formulación en tampón citrato-fosfato pH 5.5 y a 100 mM; IFN/Fk25: formulación en tampón fosfato de potasio pH 5.5 y a 25 mM; IFN/Fk50: formulación en tampón fosfato de potasio pH 5.5 y a 50 mM; IFN/Fk100: formulación en tampón fosfato de potasio pH 5.5 y a 100 mM; IFN/FNa25: formulación en tampón fosfato de sodio pH 5.5 y a 25 mM; IFN/FNa 50: formulación en tampón fosfato de sodio pH 5.5 y a 50 mM; IFN/FNa 100: formulación en tampón fosfato de sodio pH 5.5 y a 100 mM; IFN/A25: formulación en tampón acetato pH 5.5 y a 25 mM; IFN/A50: formulación en tampón acetato pH 5.5 y a 50 mM; IFN/A100: formulación en tampón acetato pH 5.5 y a 100 mM. Ejemplo 5. Formulación liofilizada (1.4 x 106 Ul de IFN gamma y 1.7 x 106 Ul de IFN alfa 2b por vial).
Composición: IFN gamma 2.8 x 108 Ul, IFN alfa 2b 3.4 x 108 Ul, di-hidrógeno fosfato de mono-potasio 0.0802g, hidrógeno fosfato de di-sodio di-hidratado 0.249 g, sacarosa 4g, glicina 0.8g, Tween 20 0.03g, polietilenglicol 6000 1g, agua para inyección cantidad suficiente para 100 ml_.
Todos los componentes excepto los interferones fueron medidos y disueltos con agua para inyección. El pH de Ia solución es chequeado y si es necesario, ajustado al valor de 7.2 ± 0.2 con ácido acético diluido (1 :2) o con 1M de NaOH. Los ingredientes farmacéuticos activos de IFN gamma e IFN alfa 2b fueron adicionados y diluidos hasta Ia concentración apropiada. La solución fue filtrada de forma estéril y dispensada en viales a los cuales se les sobrepusieron los tapones para Ia liofilización en un área clase 100. Los viales son transportados a través de un túnel clase 100 y ubicados en Ia máquina de liofilizar donde se realiza el proceso de liofilización. Finalmente los bulbos son tapados y sellados; y el producto es almacenado entre 2 y 8°C. La tabla 6 muestra los principales parámetros del ciclo de liofilización empleado.
Tabla 6. Resumen de los parámetros del ciclo de liofilización, cronograma de temperatura por etapas.
Figure imgf000025_0001
A determinados intervalos de tiempo se tomaron muestras y se analizó el contenido de humedad residual del producto, el contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b contenido de por ELISA, Ia actividad biológica, Ia pureza por RP-HPLC y Ia apariencia tanto del producto liofilizado como del reconstituido. Los resultados son presentados en Ia tabla 7. Tabla 7. Datos de humedad residual del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, Ia actividad biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 5°C. FORMULACIÓN LIOFILIZADA: 1.4 MUI IFN gamma/vial y 1.7 MUI IFN alfa 2b/vial.
Figure imgf000026_0001
*EI volumen de llenado fue de 0.5 mL/vial; STI: Liofilizado blanco uniforme; después de Ia reconstitución, una solución transparente incolora, esencialmente libre de partículas visibles.
Ejemplo 6. Formulación liofilizada (0.5 x 106 Ul de IFN gamma y 3.0 x 106 Ul de IFN alfa 2b por vial).
Composición: IFN gamma 1.0 x 108 Ul, IFN alfa 2b 6.0 x 108 Ul, di-hidrógeno fosfato de mono-potasio 0.0802g, hidrógeno fosfato de di-sodio di-hidratado 0.249g, sacarosa 4g, glicina 0.8g, Tween 20 0.03g, polietilenglicol 6000 1g, agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL. El método de preparación fue el mismo que se describió en Ia formulación liofilizada del ejemplo 5.
A determinados intervalos de tiempo se tomaron muestras y se analizó el contenido de humedad residual del producto, de IFN gamma e IFN alfa 2b por ELISA, Ia actividad biológica, Ia pureza por RP-HPLC y Ia apariencia tanto del producto liofilizado como del reconstituido. Los resultados son presentados en Ia tabla 8.
Tabla 8. Datos de humedad residual del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, la actividad biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 50C. FORMULACIÓN LIOFILIZADA: 0.5 MUI IFN gamma/vial y 3.0 MUI IFN alfa 2b/vial.
Figure imgf000027_0001
*EI volumen de llenado fue de 0.5 mL/vial; Antiv.: Antiviral; STI: Liofilizado blanco uniforme; después de Ia reconstitución, una solución transparente incolora, esencialmente libre de partículas visibles.
Ejemplo 7: Ensayo Clínico con Ia formulación farmacéutica liofilizada (0.5 x 106 Ul de IFN gamma y 3.0 x 106 Ul de IFN alfa 2b por vial). Aplicación intralesional en el CBC.
La formulación farmacéutica liofilizada estable descrita en el ejemplo 6 fue empleada en Ia realización de un ensayo clínico aleatorizado, controlado y a triple ciegas que incluyó 59 pacientes con diagnóstico clínico e histológico de CBC de cualquier localización y tipo de piel con lesiones de un diámetro menor de cuatro centímetros. Los mismos fueron asignados de forma aleatorizada a tres grupos de tratamiento. Las lesiones fueron tratadas intralesionalmente con IFN alfa 2b recombinante (1 ,5 x106 UI/mL); IFN gamma recombinante (0,25 x106 UI/mL) ó Ia formulación liofilizada estable (0.5 x 10δ Ul de IFN gamma y 3.0 x 106 Ul de IFN alfa 2b recombinantes por vial) a Ia mitad de Ia dosis, grupo I1 Il y III, respectivamente, tres veces por semanas, durante tres semanas consecutivas, continuando durante 9 semanas más una vez por semana o hasta Ia desaparición total de Ia lesión, momento en el que se determinó Ia eficacia del tratamiento desde el punto de vista clínico.
El 9.5%, 35,3% y 5,3% de las lesiones del grupo con IFN alfa 2b, IFN gamma y Ia formulación (0.5 x 106 Ul de IFN gamma y 3.0 x 106 Ul de IFN alfa 2b por vial), respectivamente disminuyeron en menos de un 50% el tamaño de Ia lesión. En el resto de las lesiones se observó un 90,5%; 57.9% y 94,7% (grupo I, Il y III, respectivamente) de respuesta objetiva (desaparición total o disminución de más del 50% del tamaño inicial). Ninguna de las lesiones progresó (ver tabla 9). En el estrato de los "pacientes que no terminaron el tratamiento", se observa una ligera superioridad del tratamiento con Ia formulación que contiene a los IFNs gamma y alfa 2b recombinantes en sus proporciones potenciadotas del efecto antiproliferativo (17% de diferencia con respecto al tratamiento con IFN alfa 2b y 27% de diferencia con respecto al tratamiento con IFN gamma). En el estrato de los "pacientes con menos de 11 semanas de tratamiento", se observa superioridad de Ia formulación (aproximadamente 30% de diferencia con respecto al gamma y 27% con respecto al alfa 2b) y Ia proporción de Respuestas Completas es muy superior (> 40% de superioridad con respecto al IFN alfa 2b y >30% con respecto al tratamiento con IFN gamma. Con menos de 12 inyecciones, se logró un 100% de respuestas favorables (de ellas 50% de RC) en el grupo de Ia terapia con Ia formulación, mientras que en los otros 2 tratamientos el porcentaje de respuesta favorable fue de un 67% (de ellas el 33.3% de RC), es decir se logra aproximadamente un 33% de diferencia a favor de Ia terapia combinada. Ver tabla 9.
Tabla 9. Evaluación de Ia respuesta clínica estratificando según tiempo de tratamiento con Ia FORMULACIÓN LIOFILIZADA: 0.5 MUI IFN gamma/vial y 3.0 MUI IFN alfa 2b/vial.
Figure imgf000028_0001
Como podemos observar en Ia Tabla 10, con Ia formulación liofilizada estable que contiene a los IFNs gamma y alfa 2b recombinantes se logran obtener respuestas completas más rápidamente que con los interferones por separados, con una diferencia de aproximadamente 4 semanas antes con respecto al IFN alfa. Tabla 10. Evaluación del tiempo hasta Ia respuesta completa. Tratamiento con Ia formulación liofilizada: 0.5 MUI IFN gamma/vial y 3.0 MUI IFN alfa 2b/vial.
Figure imgf000029_0001
En ningún caso tratado se observó Ia formación de queloide, por el contrario todos los casos tuvieron una buena cicatrización de Ia lesión con sensibilidad normal, elasticidad normal o ligeramente disminuida y ausencia de sequedad, fragilidad y aspereza. Con respecto al color, en Ia mayoría de los pacientes tratados con Ia formulación (0.5 x 106 Ul de IFN gamma y 3.0 x 106 Ul de IFN alfa 2b por vial) se observó una coloración normal en el sitio tratado (47.4%), resultando en el doble que Io observado para el grupo con IFNα (28.6%). Al concluir el tratamiento, en el grupo tratado con Ia formulación se observó un porcentaje mayor de lesiones planas (63.2%) con respecto al grupo tratado con IFN alfa 2b solo (52.4%) Io cual se muestra en Ia Tabla 11. Tabla 11. Evaluación estética al final del tratamiento. Tratamiento con Ia formulación liofilizada: 0.5 MUI IFN gamma/vial y 3.0 MUI IFN alfa 2b/vial.
Figure imgf000029_0002
La combinación de interferones no potenció los eventos adversos pues no se detectaron diferencias significativas entre los grupos de tratamientos, respecto a Ia producción o intensidad de los mismos. En general fueron leves (71.2%) o moderados y bien tolerados. No se presentaron eventos adversos graves ni muy graves. (Tabla 12).
Tabla 12. Frecuencia de eventos adversos (% con respecto al número total de ocurridas). Tratamiento con Ia formulación liofilizada: 0.5 MUI IFN gamma/vial y 3.0 MUI IFN alfa 2b/vial.
Figure imgf000030_0001
Como puede observarse en esta tabla los eventos adversos más frecuentes en cada grupo de tratamiento fueron: fiebre (38.5%; 60.8% y 26.2%), mialgias (38.5%; 3.9% y 31%) y escalofríos (12.8%; 19.6% y 21.4%) con IFN alfa, IFN gamma y Ia combinación, respectivamente. El total de eventos adversos presentados fue ligeramente superior en el grupo de pacientes tratados con IFN gamma. En general, el tratamiento combinado logró un 32% de superioridad de respuestas completas, con un 25% menos de inyecciones con respecto al tratamiento con IFN alfa y aproximadamente 4 semanas antes. No potenció los eventos adversos y no se encontró ninguna recidiva en el seguimiento al año de finalizado el tratamiento en los pacientes que obtuvieron respuesta completa. Desde el punto de vista cosmético, el resultado fue muy bueno resultando en lesiones planas y normocrómicas en su mayoría.
Ejemplo 8: Resultados del uso compasional de Ia mezcla de IFNs gamma y alfa 2b recombinantes en pacientes afectos de tumores de piel no susceptibles de tratamientos estándares. Reporte de casos. Paciente 1
Iniciales: EPR HC: 302396 Edad: 82 años Sexo: Masculino APP: n/r Remitido al Instituto nacional de Oncología y Radiobiología (INOR) el 17/10/01 por lesión tumoral de Ia piel de Ia región anterior del Tórax, había recibido tratamiento por electrofulguración que luego de esto creció en forma ulcerosa, habiendo sido operado el 03/07/01. Resultado: carcinoma espinocelular incompletamente resecado. Llega con persistencia tumoral en el sitio de origen de 3 cm en forma de úlcera con bordes elevados. Al examen físico no presentó ganglios metastásicos regionales. Se indicó radioterapia sobre el tumor, terminándola el 29/01/02: 60Co 50 Gy + Rayos X 12 Gy. Dosis total tumor 62Gy. Un mes después mostraba tumor fijo a Ia clavícula y al tercio inferior del músculo estemocleidomastoideo que en poco tiempo continuó creciendo rápidamente, mostrando el 04/03/02 gran lesión ulcerada de 10 x 8 cm sobre el tercio interno de Ia clavícula derecha, base del cuello y parte del esternón, todo hacia Ia parte anterior del tórax. Le fue propuesto tratamiento quirúrgico. Por los 82 años de edad y tener elevado riesgo quirúrgico, el familiar se niega a que sea operado. Luego, Ie fue propuesto tratamiento con IFN intralesional. Por el tamaño del tumor 12.5 x 9 cm fijo a hueso y músculo y 1-1.5 cm de espesor, (figura 7a) se planificó en tres sectores de perímetro, infiltrando 1.5 mL de solución en aproximadamente 5 cm3 de tejido (1.5 x 1.5 x 1.5) a una dosis de 0.5 x 106 Ul de IFN gamma + 6 x 106 Ul de IFN alfa 2b en 6 mL de agua para inyección, tres veces por semana por tres semanas, cada sector.
En Ia quinta aplicación del producto (segunda semana) se decide aumentar Ia dosis de IFN gamma al doble (1 x 106 Ul) por ausencia de efectos adversos limitantes y tratando de obtener mayor resultado de un tumor tan grande basado en Ia información previa del estudio clínico donde se evidenció Ia potenciación del efecto de ambos interferones a dichas dosis. En total el paciente recibió 27 aplicaciones para una dosis total de 25 x 106 Ul de IFN gamma + 162 x 106 Ul de IFN alfa 2b en dos meses de tratamiento. En Ia quinta aplicación apreciamos un aplanamiento del borde de Ia lesión hasta el nivel de Ia piel normal, (figura 7b). Un mes después de comenzar el tratamiento, el paciente refiere intenso dolor del miembro superior derecho observándose infiltración del plexo nervioso braquial, exposición, necrosis y fractura de Ia clavícula. Hasta Ia aplicación #20 se observó que en los sitios inyectados paró el crecimiento tumoral, no así en el centro donde creció en forma lobulada, (figura 7c). Condición mantenida en Ia aplicación 24, además de aparecer sepsis y necrosis en el centro de Ia úlcera tumoral. Exactamente dos meses después de comenzado el tratamiento (aplicación #27) sufrió intenso sangramiento arterial por infiltración de Ia arteria subclavia; Ia hemoglobina del paciente disminuyó hasta 80 g/L por Io cual decidimos interrumpir el tratamiento por 15 días, al cabo de los cuales regresó por continuar sangrando y tener astenia progresiva. Falleció dos meses después por rotura arterial y los sitios inyectados se mantuvieron sin crecimiento. En las primeras ocho aplicaciones se registraron algunos eventos adversos como fiebre (390C), escalofríos, eritema perilesional y astenia pero todos de intensidades leves y corta duración.
Conclusiones: Se obtuvo respuesta clínica en los sitios inyectados, duradera por al menos dos meses, efectos adversos sin importancia.
Paciente 2
Iniciales: LGR HC: 158390 Edad: 65 años Sexo: Femenino APP: n/r. Paciente que padece de múltiples carcinomas básales en toda Ia cara. Reintervenida e irradiada varias veces del párpado inferior del ojo izquierdo con injertos, donde ahora muestra recidiva tumoral de 5mm de diámetro en el borde del párpado y otra lesión plana cicatricial por debajo del párpado hacia el pómulo, (figura 8a). La alternativa de tratamiento sería nueva cirugía con los inconvenientes de ser un caso ya multitratado. En el párpado superior de ese mismo ojo tiene otro carcinoma basal de 7 mm que no ha sido tratado anteriormente. El 08/05/02 se propone tratamiento con IFN intralesional (0.5 x 106 Ul de IFN gamma + 3 x 106 Ul de IFN alfa 2b en 4 mL, tres veces por semana por tres semanas). En total el paciente recibió 10 aplicaciones para una dosis total de 35 x 106 Ul de ¡nterferón (5 x 106 Ul de IFN gamma + 30 x 106 Ul de IFN alfa 2b). En Ia cuarta infiltración, Ia lesión plana cicatricial había desaparecido y en el párpado tenía una úlcera necrosada en el sitio del tumor, (figura 8b). Dos meses después del tratamiento no se observa tumor en el párpado, y desaparición de Ia lesión plana cicatricial del pómulo (figura 8c). Como efecto a distancia, observamos reducción del 50% del carcinoma basal del párpado superior del ojo izquierdo que no fue tratado directamente con IFN y fue operado. Tres años después Ia paciente permanece aún controlada de las lesiones infiltradas con IFN. Se registraron algunos eventos adversos de intensidades leves y de corta duración como fiebre (390C), escalofríos y quemosis en el ojo tratado que se alivió con fomentos fríos.
Conclusiones: Paciente con respuesta clínica completa hasta agosto del 2005 (último control), con efectos adversos mínimos.
Ejemplo 9. Formulación liofilizada (0.5 x 106 Ul de IFN gamma y 10 x 106 Ul de IFN alfa 2b a por vial).
Composición: IFN gamma 1.0 x 108 Ul1 IFN alfa 2b 20 x 108 Ul, di-hidrógeno fosfato de mono-potasio 0.0802 g, hidrógeno fosfato de di-sodio di-hidratado 0.249 g, sacarosa 4 g, glicina 0.8 g, Tween 20 0.03 g, polietilenglicol 6000 1 g, agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL. El método de preparación fue el mismo que se describió en Ia formulación liofilizada del ejemplo 5.
A determinados intervalos de tiempo se tomaron muestras y se analizó el contenido de humedad residual del producto, de IFN gamma y de IFN alfa 2b por ELISA, Ia actividad biológica, Ia pureza por RP-HPLC y Ia apariencia tanto del producto liofilizado como del reconstituido. Los resultados son presentados en Ia tabla 13.
Tabla 13. Datos de humedad residual del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, Ia actividad biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 5°C. FORMULACIÓN LIOFILIZADA: 0.5 MUI IFN gamma/vial y 10.0 MUI IFN alfa 2b/vial.
Figure imgf000033_0001
*EI volumen de llenado fue de 0.5 mL/vial; STI: Liofilizado blanco uniforme; después de Ia reconstitución, una solución transparente incolora, esencialmente libre de partículas visibles. Ejemplo 10. Empleo de Ia formulación liofilizada estable compuesta por 0.5 MUI IFN gamma/vial y 10.0 MUI IFN alfa 2b/vial en combinación con Cisplatino. Reporte de caso. Paciente 4 Iniciales: JGA HC: Edad: 33 años Sexo: Masculino APP: n/r
Paciente inscrito en el INOR por carcinoma de células básales que penetra por el ángulo interno del ojo izquierdo varias veces operado e irradiado. Ahora tiene tumor ulcerado que llega hasta los huesos de Ia base del cráneo (figura 9a) comprobado por tomografía axial computarizada (TAC) se observa cavidad en los huesos propios de Ia nariz y de Ia pared interna de Ia órbita, fetidez insoportable que sale por Ia fosa nasal izquierda y secreción amarilla purulenta por el mismo sitio. Por Ia extensión de Ia lesión se decidió hacer tratamiento combinado de quimioterapia sistémica con cisplatino a dosis de 6 ciclos con intervalos de 21 días y al mismo tiempo Ia formulación (0.5 MUI IFN gamma/vial y 10.0 MUI IFN alfa 2b/vial) infiltrada localmente 3 veces por semana por tres semanas.
Al cabo de Ia tercera aplicación, ya se observaba respuesta parcial importante al punto de permitir Ia abertura de Ia hedidita palpebral y Ia disminución de Ia fetidez. Presentaba a Ia vez quemosis de moderada intensidad. Al mes se aprecia respuesta clínica completa. Esta respuesta se mantiene al terminar Ia quimioterapia. Los eventos adversos fueron pocos, algo de fiebre y escalofríos y dolor referido en el sitio de Ia cicatriz de Ia lesión. Un año después el paciente mantiene Ia respuesta clínica completa (figura 9b).
Ejemplo 11. Formulación líquida (1.4 x 106 Ul de IFN gamma y 1.7 x 106 Ul de IFN alfa 2b por vial).
Composición: IFN gamma 2.8 x 108 Ul, IFN alfa 2b 3.4 x 108UI1 acetato de sodio 0.708 g, ácido acético 0.079 ml_, Tween 20 0.01 g, manitol 5 g, agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL
Todos los componentes excepto los interferones fueron medidos y disueltos con agua para inyección. El pH de Ia solución es chequeado y, si es necesario, ajustado al valor de 5.5 ± 0.2 con ácido acético diluido (1:2) o con 1 M de NaOH. Los ingredientes farmacéuticos activos de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes fueron adicionados y diluidos hasta Ia concentración apropiada. La solución fue filtrada de forma estéril. La formulación fue dispensada en contenedores que son tapados y sellados en un área clase 100. Finalmente el producto es almacenado entre 2 y 8°C.
Después de fabricada Ia formulación, se almacenaron las muestras por un período de seis meses a 2 y 8 0C. A determinados intervalos de tiempo se tomaron muestras y se analizó el pH, el contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b por ELISA, Ia actividad biológica, Ia pureza por RP-HPLC y Ia claridad de Ia solución. Los resultados son presentados en Ia tabla 14.
Tabla 14. Datos de pH del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, Ia actividad biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 50C. FORMULACIÓN
LÍQUIDA: 1.4 MUI IFN gamma/vial y 1.7 MUI IFN alfa 2b/vial.
Figure imgf000035_0001
*EI volumen de llenado fue de 0.5 mL/vial; Antiv.: Antiviral, STI: Una solución transparente incolora, esencialmente libre de partículas visibles.
Ejemplo 12. Formulación líquida (0.5 x 106 Ul de IFN gamma y 3.0 x 106 Ul de IFN alfa 2b por vial).
Composición: IFN gamma 2.0 x 108 Ul, IFN alfa 2b 12.0 x 108 Ul, acetato de sodio 0.708 g, ácido acético 0.079 mL, Tween 20 0.01 g, manitol 5 g, agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL. El método de preparación fue el mismo que se describió en Ia Formulación líquida del ejemplo 11.
A determinados intervalos de tiempo se tomaron muestras y se analizó por ELISA el contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, Ia actividad biológica, Ia pureza por RP- HPLC y Ia claridad de Ia solución. Los resultados son presentados en Ia tabla 15. Tabla 15. Datos de pH del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, Ia actividad biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 5°C. FORMULACIÓN LÍQUIDA: 0.5 MUI IFN gamma/vial y 3.0 MUI IFN alfa 2b/vial.
Figure imgf000036_0001
*EI volumen de llenado fue de 0.5 mL/vial.; STI: Una solución transparente incolora, esencialmente libre de partículas visibles.
Ejemplo 13. Formulación líquida (0.5 x 106 Ul de IFN gamma y 10 x 106 Ul de IFN alfa 2b por vial).
Composición: IFN gamma 2.0 x 108 Ul, IFN alfa 2b 40 x 108 Ul, acetato de sodio 0.708 g, ácido acético 0.079 mL, Tween 20 0.01 g, manitol 5 g, agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL. El método de preparación fue el mismo que se describió en Ia Formulación líquida del ejemplo 11.
A determinados intervalos de tiempo se tomaron muestras y se analizó el contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b por ELISA, Ia actividad biológica, Ia pureza por RP- HPLC y Ia claridad de Ia solución. Los resultados son presentados en Ia tabla 6.
Tabla 16. Datos de pH del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, Ia actividad biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 50C. FORMULACIÓN LÍQUIDA: 0.5 MUI IFN gamma/vial y 10.0 MUI IFN alfa 2b/vial.
Figure imgf000036_0002
*EI volumen de llenado fue de 0.5 mL/vial; STI: Una solución transparente incolora, esencialmente libre de partículas visibles. Ejemplo 14. Formulación semisólida (0.16 x 106 Ul de IFN gamma y 1.0 x 106 Ul de IFN alfa 2b por gramo de semisólido).
Formulación farmacéutica para Ia aplicación tópica, preferiblemente en forma de crema, ungüento o jalea. La preparación farmacéutica contiene interferón gamma e interferón alfa 2 recombinante como principio activo.
La composición es de 1.6 x 107 Ul de IFN gamma y de 1 x 108 Ul de IFN alfa 2b, cantidad suficiente para 100 gramos de semisólido. Preparación de crema:
Para preparar Ia crema se funde Ia vaselina sólida y el alcohol cetílico a 750C y se mezclan con constante agitación Ia misma es mantenida hasta el final del proceso, una vez homogeneizada Ia mezcla se Ie incorpora el tween 60. Por otro lado se disuelve el metil y el propil parabeno en agua a 9O0C y se Ie incorpora a Ia mezcla anterior cuando Ia temperatura haya disminuido hasta 750C. Posteriormente Ia emulsión es enfriada lentamente hasta 370C y se Ie incorpora Ia solución acuosa que contiene el IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes. La crema resultante es almacenada a 40C en tubos de 15g (ver tabla 17).
Tabla 17. Ingredientes de Ia formulación de Ia crema.
Figure imgf000037_0001
Preparación de ungüento:
En un recipiente se disuelven los parabenos en el agua a 9O0C y se deja enfriar hasta 370C. En otro recipiente se mezcla el petrolato líquido y el Span 20 con constante agitación. Posteriormente, se mezcla el contenido de ambos recipientes y cuando Ia temperatura haya disminuido por debajo de los 370C se Ie incorpora el IFN gamma y el IFN alfa 2b recombinantes, manteniendo Ia agitación constante. Luego se Ie incorpora el petrolato blanco hasta lograr homogeneización. El ungüento resultante es almacenado a 4o C en tubos de 15 g (ver tabla 18). Tabla 18. Ingredientes de Ia formulación del ungüento.
Figure imgf000038_0001
Preparación de jalea:
En un recipiente se disuelve el EDTA y en otro se disuelve los parabenos en alcohol y se Ie añade el propilénglicol. Luego se mezclan estas soluciones con agitación constante y se Ie incorpora lentamente el carbopol 940 con agitación rápida y vigorosa hasta obtener una dispersión turbia sin presencia de grumos. Se prepara aparte, en un recipiente adecuado una solución de hidróxido de sodio 1N con los gramos de sosa y se adiciona lentamente con agitación a Ia dispersión que contiene el resto de los componentes de Ia formulación. Posteriormente se incorpora el IFN gamma y el IFN alfa 2b con agitación suave. Una vez formada Ia jalea se envasa en tubos de 15 g a 40C (ver tabla 19). Tabla 19. Ingredientes de Ia formulación de Ia jalea.
Figure imgf000038_0002

Claims

REIVINDICACIONES
1. Formulaciones farmacéuticas estables para ser aplicadas por vía parenteral (líquidas o liofilizadas), o tópica (gel, ungüento o crema) que comprenden diferentes cantidades de los interferones recombinantes gamma y alfa en proporciones potenciadoras para el tratamiento de eventos patológicos que contemplan el crecimiento celular no fisiológico benigno o maligno de tejidos u órganos y que comprende además excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
2. Formulaciones farmacéuticas estables liofilizadas según Ia reivindicación 1 , que comprende una solución tampón y al menos un componente seleccionado de compuestos de azúcares no reductores, aminoácidos, surfactantes y polímeros estabilizantes.
3. Formulaciones farmacéuticas estables liofilizadas según Ia reivindicación 2, donde se emplea una solución tampón capaz de mantener el pH entre 4.9 y
7.5 tales como acetato de amonio o de sodio, succinato de sodio, fosfato de sodio y/o potasio y citrato/fosfato de sodio donde se emplean como azúcares no reductores Ia sacarosa o Ia trehalosa; como aminoácidos Ia glicina, histidina o leucina; como surfactantes el polisorbato 20 o el polisorbato 80 y como polímero estabilizante el polietilenglicol, Ia dextrana o el almidón hidroxietilo.
4. Formulaciones farmacéuticas estables liofilizadas según Ia reivindicación 3, donde se emplea una solución tampón en un rango de concentración entre 10 y 20 mM; donde Ia sacarosa o Ia trehalosa se emplean en un rango de concentración entre 5 y 100 mg/mL; donde Ia glicina, histidina o leucina se emplean en un rango de concentración entre 1 y 20 mg/mL; donde el polisorbato se emplea en un rango de concentración entre 0,01 y 1 mg/mL y donde el polietilen glicol, Ia dextrana, o el almidón hidroxietilo, se emplean en un rango de concentración entre 5 y 50 mg/mL. 5. Formulación farmacéutica estable liofilizada según Ia reivindicación 2, compuesta por IFN gamma en un rango de concentración entre 5.6 x 108 Ul y 1.4 x 108 Ul e IFN alfa 2 en un rango de concentración entre 6.8 x 108 Ul y 1.7 x 108 Ul, 0.0802 g de di-hidrógeno fosfato de mono-potasio, 0.249 g de hidrógeno fosfato de di-sodio di-hidratado, 4 g de sacarosa, 0.8 g de glicina,
0.03 g de Tween 20, 1 g de polietilenglicol 6000, y agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL y para 0.5 ml_, 1 ml_,
5 ml_ y 10 mL en las respectivas proporciones equivalentes.
6. Formulación farmacéutica estable liofilizada según Ia reivindicación 2, compuesta por IFN gamma en un rango de concentración entre 2.0 x 108 Ul y
0.5 x 108 Ul e IFN alfa 2 en un rango de concentración entre 12.0 x 108 Ul y 3.0 x 108 Ul, 0.0802 g de di-hidrógeno fosfato de mono-potasio, 0.249 g de hidrógeno fosfato de di-sodio di-hidratado, 4 g de sacarosa, 0.8 g de glicina, 0.03 g de Tween 20, 1 g de polietilenglicol 6000, y agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL y para 0.5 mL, 1 mL, 5 mL y 10 mL en las respectivas proporciones equivalentes.
7. Formulación farmacéutica estable liofilizada según Ia reivindicación 2, compuesta por IFN gamma en un rango de concentración entre 4.0 x 108 Ul y 1.0 x 108 Ul e IFN alfa 2 en un rango de concentración entre 80 x 108 Ul y 20 x 108 Ul, 0.0802 g de di-hidrógeno fosfato de mono-potasio, 0.249 g de hidrógeno fosfato de di-sodio di-hidratado, 4 g de sacarosa, 0.8 g de glicina, 0.03 g de Tween 20, 1 g de polietilenglicol 6000, y agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL y para 0.5 mL, 1 mL, 5 mL y 10 mL en las respectivas proporciones equivalentes.
8. Formulaciones farmacéuticas estables líquidas según Ia reivindicación 1 , que comprende una solución tampón y al menos un componente seleccionado de compuestos de azúcares no reductores, aminoácidos, surfactantes, polímeros estabilizantes, compuestos antioxidantes/quelantes y agentes ¡sotonizaήtes. Esta formulación líquida emplea un solvente acuoso que puede contener o no agentes preservantes tal como Ia mezcla de metilo- y propilo- parabeno.
9. Formulaciones farmacéuticas estables líquidas según Ia reivindicación 8, donde se emplea una solución tampón capaz de mantener el pH entre 4.9 y 6.5 tales como acetato de amonio o de sodio, succinato de sodio, fosfato de sodio y/o potasio, citrato/fosfato y donde se emplean como surfactantes el polisorbato 20 o polisorbato 80; como antioxidante/quelante el EDTA o Ia cisterna-acetilo; cómo aminoácidos Ia histidina, L-arginina, L-alanina, glicina o Ia lisina; como polímero estabilizante el almidón hidroxietilo o Ia dextrana y como agente ¡sotonizante el cloruro de sodio, el cloruro de potasio, el propilenglicol, el manitol, el glicerol, Ia sacarosa o Ia trehalosa.
10. Formulaciones farmacéuticas estables líquidas según Ia reivindicación 9, donde se emplea una solución tampón en un rango de concentración entre 10 y 100 mM; donde el polisorbato se emplea en un rango de concentración entre 0,01 y 1 mg/mL; donde el EDTA o Ia cisteina-acetilo se emplean en un rango de concentración entre 0,01 y 1 mg/mL; Ia histidina, L-arginina, L- alanina, glicina o Ia lisina se emplean en un rango de concentración entre 1 y 20 mg/mL; el almidón hidroxietilo y Ia dextrana se emplean en un rango de concentración entre 5 y 50 mg/mL y donde los agentes isotonizantes se encuentran en cantidad suficiente para hacer isotónica Ia solución.
11. Formulación farmacéutica estable líquida según Ia reivindicación 9, compuesta por IFN gamma en un rango de concentración entre 5.6 x 108 Ul y 1.4 x 108 Ul e IFN alfa 2 en un rango de concentración entre 6.8 x 108 Ul y 1.7 x 108 Ul1 0.708 g de acetato de sodio, 0.079 mL de ácido acético, 0.01 g de Tween 20, 5 g de manitol, y agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL y para 0.5 mL, 1 mL, 5 mL y 10 mL en las respectivas proporciones equivalentes.
12. Formulación farmacéutica estable líquida según Ia reivindicación 9, compuesta por IFN gamma en un rango de concentración entre 2.0 x 108 Ul y
0.5 x 108 Ul e IFN alfa 2 en un rango de concentración entre 12.0 x 108 Ul y 3.0 x 108 Ul, 0.708 g de acetato de sodio, 0.079 mL de ácido acético, 0.01 g de Tween 20, 5 g de manitol, y agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL y para 0.5 mL, 1 mL, 5 mL y 10 mL en las respectivas proporciones equivalentes.
13. Formulación farmacéutica estable líquida según Ia reivindicación 9, compuesta por IFN gamma en un rango de concentración entre 4.0 x 108 Ul y 1.0 x 108 Ul e IFN alfa 2 en un rango de concentración entre 80 x 108 Ul y 20 x 108 Ul 0.708 g de acetato de sodio, 0.079 mL de ácido acético, 0.01 g de Tween 20, 5 g de manitol, y agua para inyección cantidad suficiente para 100 mL y para 0.5 mL, 1 mL, 5 mL y 10 mL en las respectivas proporciones equivalentes.
14. Formulaciones farmacéuticas estables según las reivindicaciones de Ia 1 a Ia 13, para el tratamiento de tumores sólidos benignos o malignos utilizadas de formas independientes o combinadas con quimioterapia, radioterapia o Ia combinación de estas.
15. Formulaciones farmacéuticas estables según Ia reivindicación 14, para el tratamiento de carcinomas de laringe, papilomatosis laríngea, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemias de células T, leucemias de células B, linfoma del sistema nervioso central, lipoma, cyst epidermoide, cyst intradérmica, liposarcoma, neurofibroma, hiperplasia sebácea, hemangioma cavernoso, adenoma hepatocelular, hiperplasia nodular focal, astrocitomas, glioblastomas multiformes, ependimomas, ganglioneuromas, astrocitomas pilocíticos juveniles, gliomas mezclados, oligodendrogliomas, gliomas del nervio óptico, cordomas, craniofaringiomas, meduloblastomas, meningiomas, tumores pineales, adenomas pituitarios, tumores neuroectodermal primitivos, neuromas acústicos, tumores vasculares, carcinomatosis meningeal, neurofibromatosis, pseudotumores de cerebro, esclerosis tuberosa, tumores cerebrales metastáticos, angiomas en forma de cereza, hiperplasia de las glándulas sebáceas, carcinoma basocelular, carcinoma de células escamosas, dermatofibroma, granuloma piogénico, nevus dérmico, queratosis seborreica y queratosis actínicas.
16. Formulaciones farmacéuticas estables según las reivindicaciones de Ia 1 a Ia
13, para el tratamiento de eventos proliferativos tales como fibrosis, displasias e hiperplasias.
17. Formulaciones farmacéuticas estables según las reivindicaciones de Ia 1 a Ia 13, para ser administradas intramuscular, intratumoral, y perilesionar.
18. Formulaciones farmacéuticas estables tópicas según Ia reivindicación 1 , que comprenden al IFN gamma recombinante en un rango de concentraciones entre 0.32 Ul x 106 Ul y 0.08 Ul x 106 e IFN alfa 2 recombinante en un rango de concentraciones entre 2.0 x 106 Ul y 0.5 x 106 Ul por gramo de semisólido.
19. Crema según Ia reivindicación 18, que comprende 2.2% IFN gamma, 0.58% IFN alfa 2b, 4% de alcohol cetílico, 10% Vaselina, 2% Tween 60, 0.2% metilparabeno, propilparabeno y 81.2% de agua purificada, csp.
20. Ungüento según Ia reivindicación 18, que comprende 2.2% IFN gamma, 0.58% IFN alfa 2, 60% de petrolato sólido blanco, 10% de petrolato líquido pesado, 3% de Span 20, 0.2% metilparabeno y propilparabeno y 24.02% de agua purificada, csp.
21. Jalea según Ia reivindicación 18, que comprende 2.2% IFN gamma, 0.58% IFN alfa 2, 0.5% de Carbopol 940, 0.2% de metilparabeno y propilparabeno, 0.2% de Hidróxido de sodio, 0.01% de Etilendiaminotetraacetato de calcio disódico, 2% etanol y 84.31 %de agua purificada, csp.
22. Formulaciones farmacéuticas estables tópicas según Ia reivindicación de Ia 18 a Ia 21 , para el tratamiento de tumores sólidos benignos o malignos de Ia piel o mucosas utilizadas de formas independientes o combinadas con quimioterapia, radioterapia o Ia combinación de estas.
23. Formulaciones farmacéuticas estables tópicas según Ia reivindicación 22, para el tratamiento de lipoma, cyst epidermoide, cyst intradérmica, liposarcoma, neurofibroma, hiperplasia sebácea, hemangiomas, hiperplasia nodular focal, ependimomas, ganglioneuromas, astrocitomas pilocíticos juveniles, meningiomas, tumores pineales, adenomas pituitarios, tumores vasculares, carcinomatosis meningeal, neurofibromatosis, angiomas en forma de cereza, hiperplasia de las glándulas sebáceas, carcinoma basocelular, carcinoma de células escamosas, dermatofibroma, granuloma piogénico, nevus dérmico, queratosis seborreica, queratosis actínicas, y condilomas.
24. Una presentación farmacéutica según las reivindicaciones de Ia 5 a Ia 7 y de
Ia 11 a Ia 13, que contiene uno o mas viales de IFN gamma recombinante con los correspondientes viales de IFN alfa 2 recombinante, en Ia cual se proceda a mezclar el contenido de los viales con los IFNs de forma tal que se mantengan las concentraciones de IFNs gamma y alfa 2 recombinantes definidas en las reivindicaciones mencionadas y donde además Ia presentación farmacéutica contiene viales de agua para inyección, jeringuillas y agujas suficientes para realizar Ia mezcla de los IFNs y Ia aplicación de Ia misma a las personas tributarias de esta.
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