ES2619632T3 - Formulaciones estables que contienen interferones gamma y alfa en proporciones potenciadoras - Google Patents

Abstract

La presente invención está relacionada con formulaciones farmacéuticas estables para ser aplicadas por vía parenteral (líquidas oliofilizadas), o tópica (gel, ungüento o crema) que comprenden diferentes cantidades de los interferones recombinantes gamma y alfa en proporciones potenciadoras para el tratamiento de eventos patológicos que contemplan el crecimiento celular no fisiológico benigno o maligno de tejidos u órganos.

Description

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DESCRIPCION

Formulaciones estables que contienen interferones gamma y alfa en proporciones potenciadoras

La presente invencion se relaciona con la biotecnologfa y las ciencias medicas, en particular con formulaciones farmaceuticas estabilizadas que contienen a los interferones recombinantes gamma y alfa en proporciones sinergicas para la inhibicion del crecimiento celular en diferentes tejidos u organos de los seres humanos.

Estado de la tecnica

La variedad de efectos de los interferones tipo I (en ingles "Interferons", abreviado IFNs) crea un gran potencial terapeutico de aplicaciones. La aplicacion de IFNs es beneficioso en el tratamiento de diversos tipos de cancer, entre los que se incluyen las leucemias (US 5830455), carcinomas baso celulares (US 5028422), carcinoma de celulas escamosas (Us 5256410), cancer de mama (US 5024833), tumores gastrointestinales (uS 5444064; 5814640), y queratosis actmica (US 5002764). Diferentes tipos celulares muestran una sensibilidad diferenciada a los IFNs, y las concentraciones para inhibir su crecimiento pueden variar en un rango amplio (Borden E., et al. (1981) Progress in Hematology. vol XII, Brown EB., editor, 299-339), el cual ejemplifica las diferencias en cuanto a su capacidad para inhibir el crecimiento celular (Dahl H. (1983). Human interferon and cell growth inhibition. VII. Reversibility of interferon activities. J Interferon Res, 3:327-332; WiIIson J.K.V., Bittner G., et al. (1984) Antiproliferative activity of human interferons against ovarian cancer cells grown in human tumor stem cell assay. J Interteron Animal, 4:441-447; Hu R., Gan Y., et al. (1993) Evidence for multiple binding sites for several components of human Iymphoblastoid interferon-alfa. J Biol Chem, 268:12591-12595), y a la actividad antitumoral (Quesada JR., Talpaz M., et al. (1986) Clinical toxicity of interferons in cancer patients: to review. J Clin Oncol, 4:234-243).

El uso de los IFNs en la terapia del cancer no ha satisfecho las expectativas que los ensayos in vitro y las propiedades de estas potentes moleculas biologicas poseen. Diferentes regfmenes han sido probados sin efectos beneficiosos claros y de impacto (Strander H., y Oberg K., (1992) Clinical use of interferons. Solid tumors INTERFERON. Principles and Medical Applications. Publishing Baron S., Coppenhaver DH., Dianzani F., Fleischmann WR., Jr. Hughes TK., Jr. Klimpel GR., Niesel DW., Staton GJ., and Tyring SK., 533-561).

En un esfuerzo por alcanzar mejores efectos en las terapias, los IFNs se han empleado en dosis altas, pero no aparece la respuesta potencial beneficiosa esperada debido a diversos factores, entre ellos las reacciones adversas que se producen con dichas dosis (Lane H. C. (1990) Interferon-alfa in patients with asymptomatic human immunodeficiency virus (HIV) infection. A randomized, placebo-controlled trial. Annals of internal Medicine, 112:805-811).

Ademas, los IFNs han sido usados en forma combinada explotando sus efectos sinergicos. La combinacion de IFN alfa e IFN gamma se ha descrito en estudios in vitro con cultivos de fibroblastos de queloides (Tredget EE., Wang R, et al. (2000) Transforming growth factor-beta mRNA and protein in hypertrophic scar tissues and fibroblasts: antagonism by IFN-alfa and IFN-gamma in vitro and in vivo. J Inferferon Cytokine Animal, 20:143-151). En este trabajo se menciona la utilizacion combinada de los IFNs alfa y gamma, pero los estudios se hacen in vitro y en celulas provenientes de queloides en ninos. Estos autores no realizaron ningun ensayo clmico y no evaluaron el efecto de la combinacion de IFNs en celulas de queloides de adultos, que responden menos a los interferones.

La patente EP 0107498 muestra la combinacion de los interferones alfa y gamma en la lmea celular de melanoma Hs294T, pero no se describe este efecto en otros tipos de celulas como cultivos primarios de carcinoma baso celular, o de un glioblastoma (GL-5), o de un carcinoma de laringe (HEp-2).

La utilizacion alternada de IFN alfa natural e IFN gamma recombinante tambien se ha descrito para el tratamiento para la metastasis renal y de pulmon (Fujii A., Yui-In K., et al. (1999) Preliminary results of the alternating administration of natural interferon-alfa and recombinant interferon-gamma for metastatic renal cell carcinoma BJU Int.; 84:399-404). La combinacion de IFN alfa 2, o alfa 4 o el hnbrido delta 4 alfa 2 Bglll alfa 1 con IFN gamma fue descrita en las lmeas celulares RT4 (carcinoma de vejiga) y en A2182 (adenocarcinoma de pulmon) y posee un efecto antiproliferativo superior a las de tipo I de IFNs o al IFN gamma solo, (Hubbell H. R, Craft J.TO., et al. (1987) Synergistic antiproliferative effect of recombinant alfa-interferons with recombinant gamma-interferon. J Biol Response Mod, 6:141-153). Un efecto sinergico entre el IFN gamma (1000 UI/mL) y el lFN alfa 2 (1000 Ul/mL) se mostro en la lmea celular A459 (tumor alveolar), (Martyre M. C., Beaupain R., et al. (1987) Potentiation of antiproliferative activity by mix of human recombinant IFN-alfa 2 and -gamma on growth of human cancer nodules maintained in continuous organotypic culture. Eur J Caneer Clin Oncol, 23:917-920), asf como en lmeas celulares establecidas de carcinoma anaplasico de celulas grandes (Hand A., Pelin K., et al. (1993) Interferon-alfa and interferon-gamma combined with chemotherapy: in vitro sensitivity studies in non-small cell lung cancer celllines. Anticancer Drugs, 4:365-368).

La combinacion de IFN alfa e IFN gamma se ha descrito en estudios con la lmea celular HepG2, (Mizukoshi E., Kaneko S., et al. (1999) Up-regulation of type I interferon receptor by IFN-gamma. J Inferteron Cytokine Animal, 19:1019-1023) y en la lmea celular AVA5 (Okuse C., Rinaudo J. A., et al. (2005) Enhancement of antiviral activity against hepatitis C virus in vitro by interferon combination therapy. Antiviral Animal, 65:23-34). Estos autores no determinan el efecto antiproliferativo, ni las proporciones mas efectivas en la combinacion de los interferones alfa y gamma en la lmea celular

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HepG2. Ademas, se ha explorado el efecto sinergico para TNF alfa e IFN gamma en la lmea celular Hepa1-6, un hepatoma de murino (Sasagawa T., Hlaing M., et al. (2000) Synergistic induction of apoptosis in murine hepatoma Hepa1-6 cells by IFN-gamma and TNF-alfa. Biochem Biophys Res Comun, 272:674-680).

En la patente estadounidense 5190751 se describe la inhibicion del crecimiento de lmeas celulares de leucemias de tipo B y de tipo T por la combinacion de IFN alfa y gamma. En ninguna de las lmeas de celulas T evaluadas se observo la potenciacion del efecto inhibitorio de crecimiento, y en ciertas condiciones experimentales los efectos de las combinaciones fueron antagonicos. En la patente EP 010749 y en una publicacion (Czarniecki C. W., Fennie C. W., et al. (1984) Synergistic antiviral and antiproliferative activities of Escherichia coli-derived human alfa, beta, and gamma interferons. J Virol. 49:490-496), se muestra tambien que la combinacion de los IFNs alfa y gamma no siempre es sinergica y puede ser antagonica. Se describe la eficacia de las combinaciones en un intervalo muy amplio, pero no se muestra.

Estos datos indican que el empleo de combinaciones de IFN alfa y gamma debe ser evaluado para una definicion experimental que permita identificar que condicion es la favorable para establecer una combinacion optima para el tratamiento de un crecimiento celular inadecuado en tejidos u organos dados. Por tal motivo, para sustentar una terapia y dosis adecuadas estas deben ser evaluadas en experimentos in vitro y en ensayos clmicos controlados.

En un estudio con lmeas celulares de Gliomas, el IFN gamma afecto las caractensticas de malignidad tales como la proliferacion y la migracion de las celulas tumorales estudiadas (Knupfer M. M., Knupfer H., et al. (2001) Interteron- gamma inhibits growth and migration of A172 human glioblastoma cells. Anticancer Animal, 21 :3989-3994). De otra manera, se han reportado resultados negativos con el empleo de IFN gamma para tratar los gliomas (Mahaley M. S., Bertsch L., Jr. et al. (1988) Systemic gamma-interferon therapy for recurrent gliomas. J Neurosurg, 69:826-829). El empleo de forma simultanea de IFN gamma e IFN beta ha resultado ser eficiente en la inhibicion del crecimiento de la lmea celular GBM-18, un astrocitoma multifarmaco-resistente (Reddy P. G., et al. (1991) Systemic gamma-interteron therapy for recurrent gliomas. J Natl Cancer Inst, 83:1307-1315). Se ha descrito ademas, la combinacion de IFN gamma con alfa-difluorometilornitina (DFMO) para el tratamiento de estos tumores (US 4499072). La patente US 5002879, describe una terapia similar que utiliza DFMO junto a celulas asesinas activadas por linfocinas e IL-2. Con respecto a lFN alfa, su combinacion con otros farmacos no ha tenido efectos favorables en el tratamiento de los gliomas, y ha mostrado toxicidad (Buckner J. C., Burch P. A., et al (1998) Phase II trial of recombinant interferon-alfa-2a and eflornithine in patients with recurrent glioma. J Neurooncol. 36:65-70; Chang S. M., Barker F. G., et al. (1998) High dose oral tamoxifen and subcutaneous interteron alfa-2a for recurrent glioma. J Neuroonco/, 37:169-176). Entonces, el tratamiento de este tipo de tumor puede ser favorecido por el uso combinado del IFN alfa y el IFN gamma, sobre la base de una adecuada seleccion de las proporciones de su combinacion basado en experimentos in vitro y en ensayos clmicos.

La laringe es el segundo sitio mas frecuente de cancer del tracto aero-digestivo superior despues de la cavidad oral. El carcinoma de laringe es el tumor mas frecuente de cabeza y cuello y el cancer de laringe mas comun es el carcinoma de celulas escamosas (95 % de todos los casos). La supervivencia en los casos de tumores T3 y T4 de laringe es de solo 5 anos en aproximadamente el 30 % de los pacientes sometidos a laringectoirna (Djordjevic V., Milovanovic J., et al. (2004) Radical surgery of the malignant laryngeal tumors. Actas de Chir Lugosl, 51:31-35). Se ha mostrado que la radioterapia y la quimioterapia no son efectivas para el tratamiento de este carcinoma (Chen W., Guo X., et al. (2004) Long-term follow-up observation of clinical therapy for laryngeal carcinoma recurrence and cervical metastasis Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi. 18:536-537).

Sin embargo, la poliquimioterapia junto al empleo de IFN alfa ha resultado beneficiosa en el tratamiento del cancer de laringe (Mantz C. A., Vokes E. E., (2001) Sequential induction chemotherapy and concomitant chemoradiotherapy in the management of locoregionally advanced laryngeal cancer Ann Oncol, 12:343-347). La combinacion de IL-2 e iFn alfa fue evaluada en un ensayo fase II como terapia para el carcinoma de laringe, pero los resultados no fueron satisfactorios (Clayman G. L., Young G., et al. (1992) Detection of regulatory factors of lymphokine-activated killer cell activity in head and neck cancer patients treated with interleukin-2 and interferon alfa. Ann Otol Rhinol Laryngol, 101:909-915). Pocos avances existen en la terapeutica de los tumores de laringe. El uso combinado de los IFNs alfa y gamma podna contribuir a mejorar las terapias existentes para combatir este tipo de tumores.

La patente estadounidense No. 5503828 describe una composicion de interferones caracterizada por contener al menos 50% de los alelos de IFN alfa 2 e IFN alfa 8 y uno o mas especies adicionales de IFNs de un grupo formado por IFN alfa 4, alfa 7, alfa 10, alfa 16, alfa 17, y alfa 21. Mientras, la patente estadounidense No. 4503035 muestra una preparacion de algunas especies de IFN alfa, pero que no incluye al alfa 1, alfa 5, alfa 14, y al IFN omega. Estas patentes no describen una formulacion formada por la combinacion de IFN gamma e IFN alfa 2 recombinantes.

La patente estadounidense No. 5762923 detalla una composicion lfquida de interferon diluida en agua con un detergente no ionico y alcohol bendlico en cantidades suficientes para estabilizar al IFN alfa que contiene, ademas, un regulador acido de pH. Por otra parte, la patente estadounidense No. 4847079 describe una composicion farmaceutica de interferon y timerosal, mientras que la patente estadounidense No. 4675184 muestra una formulacion de interferon con alcohol poliddrico y un regulador organico de pH como estabilizador y un portador o diluyentes convencionales de pH 3-6. La composicion puede tener adicionalmente un surfactante anionico y/o albumina como estabilizador. En las

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patentes estadounidenses Nos. 5236707 y 5431909 se describen aminas como estabilizantes (aminas primarias alifaticas) y sales organicas de litio, que protegen al interferon de la degradacion y lo estabilizan.

La patente estadounidense No. 4496537 se refiere a formulaciones lfquidas estables de interferon-alfa que incluyen composicion de albumina de suero humana, y alanina o glicina, agua y un sistema regulador de pH capaz de mantener el pH entre 6.5 y 8.0.

La patente estadounidense No. 5935566 describe formulaciones estables de interferon-alfa que incluyen en su composicion un sistema regulador de pH capaz de mantener el pH en el intervalo de 4.5 a 7.1, polisorbato 80 como estabilizador, EDTA como agente quelante, cloruro de sodio como agente isotonizante, y m-cresol como preservativo antimicrobiano. La patente US 0170207 describe formulaciones acuosas estables de interferon-alfa que incluyen en su composicion un sistema regulador de pH capaz de mantener el pH en el rango de 4.5 a 9.0, un agente estabilizador, un surfactante no ionico y un regulador de la presion osmotica.

El documento US 20030170207 describe formulaciones estables de interferon-alfa que incluyen en su composicion un sistema regulador de pH capaz de mantener el pH en el intervalo de 4.5 a 9.0, un agente estabilizante, un surfactante no ionico y un regulador de la presion osmotica.

En la solicitud WO 89/04177 se describen formulaciones farmaceuticas lfquidas de interferon-gamma que contienen una solucion reguladora de pH que mantiene el pH en el intervalo de 4.0 a 6.0, un azucar polihidroxilada como estabilizador y un detergente no ionico. La patente estadounidense No. 4895716 se refiere a composiciones y metodos para la estabilizacion del interferon-gamma con acido lactobionico en una solucion reguladora de acetato/glicina.

La patente estadounidense No. 5676942 describe composiciones farmaceuticas formadas por subtipos de interferones del tipo I obtenidos de fuentes naturales, pero no combinados con el interferon gamma y no define las proporciones de esas combinaciones, solo describe esas combinaciones para infecciones virales y no para el tratamiento de tumores. En ninguno de los reportes descritos anteriormente se ha utilizado, caracterizado o mencionado una formulacion farmaceutica que contenga los IFNs recombinantes gamma y alfa 2 juntos en combinaciones sinergicas. Existen potencialidades en la utilizacion combinada para IFN gamma e IFNs tipo I cuando se mezclan en proporciones definidas para el tratamiento del crecimiento celular que tiene grados variables de resistencia a terapias establecidas y/o sus combinaciones.

Teniendo en cuenta estas premisas, se hace necesario el desarrollo de formulaciones farmaceuticas estables que contengan estos IFNs en proporciones que permitan su uso de forma amplia, sencilla, eficiente y segura, en individuos con formaciones tisulares benignas o malignas que asf lo necesiten. Esto permitira un manejo mas optimo de las combinaciones y proporciona un uso de la terapeutica en pacientes necesitados de este tratamiento.

Explicacion de la invencion

La presente invencion resuelve el problema antes mencionado, proporcionando formulaciones farmaceuticas estables de acuerdo con la reivindicacion 1. En la presente se describen formulaciones para ser aplicadas por via parenteral (formulaciones liofilizadas). Estas contienen diferentes cantidades de los interferones recombinantes gamma y alfa en proporciones sinergicas para el tratamiento de eventos patologicos que contemplan el crecimiento no fisiologico benigno o maligno de tejido o de organos y que contiene ademas excipientes o vefnculos farmaceuticamente aceptables.

Estas formulaciones son el resultado de los ensayos in vitro con lmeas celulares de diferente sensibilidad a IFNs y de ensayos clmicos en diferentes entidades oncologicas, asf como de la evaluacion de estabilidad ffsico-qmmica y biologica de los IFNs gamma y alfa 2 recombinantes en presencia de los diferentes excipientes o vehfculos farmaceuticamente aceptables.

Las formulaciones farmaceuticas estables liofilizadas se componen de los IFN gamma y alfa 2 recombinantes mezclados en una solucion reguladora de pH capaz de mantener el pH entre 4.9 y 7.5, la cual puede ser el acetato de amonio o de sodio, el succinato de sodio, el fosfato de sodio y/o potasio o el citrato/fosfato de sodio.

Estas formulaciones tambien estan compuestas de al menos un componente seleccionado de compuestos de azucares no reductores, aminoacidos, surfactantes y polfmeros estabilizantes. Los azucares no reductores pueden ser la sacarosa o la trehalosa; los aminoacidos pueden ser la glicina, la histidina o la leucina; mientras que como surfactantes se describen al polisorbato 20 o el polisorbato 80 y como polfmero estabilizante al polietilenglicol, el dextrano o el almidon de hidroxietilo.

Como una materializacion de la invencion se define que la solucion reguladora de pH debe ser empleada en un intervalo de concentracion entre 10 y 20 mM; la sacarosa o la trehalosa entre 5 y 100 mg/mL; la glicina, la histidina o la leucina deben emplearse en un intervalo de concentracion entre 1 y 20 mg/mL. El polisorbato debe emplearse entre 0,01 y 1 mg/mL, mientras que el polietilenglicol, el dextrano, o el almidon de hidroxietilo se emplean en un intervalo de concentracion entre 5 y 50 mg/mL

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Varias materializaciones de la invencion describen formulaciones farmaceuticas estables liofilizadas que contienen IFN gamma recombinante en un intervalo de concentracion entre 5.6 x 108 UI y 1.4 x 108 UI e IFN alfa 2 recombinante en un intervalo de concentracion entre 6.8 x 108 UI y 1.7 x 108 UI. O IFN gamma recombinante en un intervalo de concentracion entre 2.0 x 108 UI y 0.5 x 108 UI e iFn alfa 2 recombinante en un intervalo de concentracion entre 12.0 x 108 UI y 3.0 x 108 UI. O IFN gamma recombinante en un intervalo de concentracion entre 4.0 x 108 UI y 1.0 x 108 UI e IFN alfa 2 recombinante en un intervalo de concentracion entre 80 x 108 UI y 20 x 108 UI. Las formulaciones contienen adicionalmente 0.0802 g de di-hidrofosfato de potasio, 0.249 g hidrofosfato disodico hidratado, 4 g de sacarosa, 0.8 g de glicina, 0.03 g de Tween 20, 1 g de polietilenglicol 6000, y agua para suficiente cantidad de inyeccion para 100 mL y para 0.5 mL, 1 mL, 5 mL y 10 mL en las respectivas proporciones equivalentes.

La definicion para mezclar IFN gamma recombinante e IFN alfa recombinante en un intervalo de combinacion definida fue obtenida despues de un analisis de isobolograma. La concentracion de IFN gamma recombinante entre 5.6 x 108 UI y 1.4 x 108 UI e IFN alfa 2 recombinante en un intervalo de concentracion entre 6.8 x 108 UI y 1.7 x 108 UI, en una de las formulaciones farmaceuticas estables liofilizadas se logro a partir del analisis de los estudios de la inhibicion del crecimiento del cultivo primario provenientes de queloides (Kel 5a, Kel 17a) y del BCC III. Despues de un analisis de isobologramas se identifico la combinacion de 100 Ul/mL (10 ng/mL) para IFN gamma recombinante con 100 Ul/mL (0.5 ng/mL) de IFN alfa 2b recombinante que reduce el crecimiento celular in vitro en un 21%, 43% y 47%, respectivamente (ver ejemplos 1, 2 y 3, figuras 1, tabla 1).

La mezcla de IFN gamma recombinante en un intervalo de concentracion entre 2.0 x 108 UI y 0.5 x 108 UI e IFN alfa 2 recombinante en un intervalo de concentracion entre 12.0 x 108 UI y 3.0 x 108 UI para la formulacion se definio utilizando un ensayo clmico y reporte de casos tratados por compasion. El ensayo clmico aleatorizado, controlado y triple a ciegas evaluo la eficacia del tratamiento intralesional (I.L.) en pacientes con carcinoma baso celular utilizando la formulacion liofilizada estable definida antes (ver ejemplo 7, tablas 9, 10, 11 y 12).

En el reporte de casos tratados por compasion, que tambien contribuyo a definir estas proporciones, fueron tratados casos de carcinoma epidermoide (paciente 1) y un paciente con multiples carcinomas baso celulares recidivantes y con injertos previos (paciente 2), (ver ejemplo 8 figuras 5 a, b, c, d; paciente 1, y figuras 6 a, b, c; paciente 2, respectivamente).

La formulacion que contiene IFN gamma recombinante en un intervalo de concentracion entre 4.0 x 108 UI y 1.0 x 108 UI e lFN alfa 2 recombinante en un intervalo de concentracion entre 80 x 108 UI y 20 x 108 UI se definio con el analisis de los resultados del estudio de la inhibicion del crecimiento de las celulas del glioblastoma (GL-5) por la combinacion de 50 Ul/mL (5 ng/mL) de IFN gamma recombinante con 100 Ul/mL (0.5 ng/mL) de IFN alfa 2b recombinante. De esta manera se logra una inhibicion del crecimiento del 55% (ejemplo 3). Adicionalmente, se tomo en cuenta el analisis del estudio con la lmea celular HEp-2. En este caso las cantidades de IFNs son de 5 Ul/mL (0.5 ng/mL) de IFN gamma recombinante con 75 Ul/mL (0.375 ng/mL) de IFN alfa 2b recombinante. Con con esto, se logra una combinacion optima para reducir el crecimiento celular in vitro en un 76% (ver ejemplos 1, 2 y 3).

Adicionalmente fueron desarrolladas formulaciones farmaceuticas lfquidas estables. En estas formulaciones se mantuvieron las proporciones de los IFNs gamma y alfa recombinantes tal como se han descrito para las formulaciones liofilizadas, pero sus otros ingredientes farmaceuticos variaron para lograr una mayor estabilidad para estas mezclas de los IFNs.

Como resultado de este trabajo, en la presente se describen formulaciones farmaceuticas estables lfquidas que contienen una solucion reguladora de pH y al menos un componente seleccionado de azucares no reductores, aminoacidos, surfactantes, polfmeros estabilizantes, compuestos antioxidantes/quelantes y agentes isotonizantes. Estas formulaciones emplean un solvente a base de agua que puede contener o no agentes preservantes tal como la mezcla de metilo- y propilo-parabeno.

En la presente tambien se describen formulaciones farmaceuticas estables liquidas que emplean una solucion reguladora de pH capaz de mantener el pH entre 4.9 y 6.5. Este regulador de pH puede ser acetato de amonio o de sodio, succinato de sodio, fosfato de sodio y/o potasio, citrato/fosfato. Estas formulaciones pueden emplear como surfactantes el polisorbato 20 o polisorbato 80; como antioxidante/quelante el EDTA o la cisteina-acetilo; mientras que como aminoacidos pueden usarse la histidina, L-arginina, L-alanina, glicina o la lisina. Como polfmero estabilizante se define la utilizacion del almidon de hidroxietilo o el dextrano y como agente isotonizante el cloruro de sodio, el cloruro de potasio, el propilenglicol, el manitol, el glicerol, la sacarosa o la trehalosa.

En la presente tambien se describen formulaciones farmaceuticas estables lfquidas emplean una solucion reguladora de pH en un intervalo de concentracion entre 10 y 100 mM. En esta formulacion el polisorbato se emplea en un intervalo de concentracion entre 0,01 y 1 mg/mL; el EDTA o la cisteina-acetilo se emplean en un intervalo de concentracion entre 0,01 y 1 mg/mL. Los aminoacidos histidina, L-arginina, L-alanina, glicina o lisina se encuentran a una concentracion entre 1 y 20 mg/mL; el almidon de hidroxietilo y el dextrano se emplean en un intervalo de concentracion entre 5 y 50 mg/mL y los agentes isotonizantes se encuentran en cantidad suficiente para hacer isotonica la solucion.

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Otras materializaciones de la descripcion explican las cantidades de todos los ingredientes farmaceuticos de las formulaciones farmaceuticas Kquidas estables que son necesarias para la estabilidad ffsico qmmica y biologica de las mezclas de los IFNs gamma y alfa recombinantes, descritos previamente. Ademas de los IFNs, estas formulaciones Kquidas contienen 0.708 g de acetato de sodio, 0.079 mL de acido acetico, 0.01 g de Tween 20,5 g de manitol, y agua para suficiente cantidad de inyeccion para 100 mL y para 0.5 mL, 1 mL, 5 mL y 10 mL en las proporciones equivalentes respectivas.

Esta invencion define las proporciones de mezclas de IFNs gamma y alfa que pueden ser rentables para el tratamiento del crecimiento celular benigno o maligno. Esto permitira emplear dosis mas pequenas, menos tiempo de tratamiento y mantener los mismos efectos terapeuticos o lograr efectos superiores a los que se han alcanzado hasta hoy con el empleo de los interferones en el tratamiento de los tumores u otros eventos aberrantes de crecimiento celular. Disminuir las dosis permitira esperar menos efectos adversos o menor intensidad de los mismos, lo que dara una mejor calidad de vida a los pacientes y les permitira obtener los beneficios del uso de estas potentes drogas.

La invencion define las formulaciones de la mezcla de IFN gamma e IFN alfa 2 recombinantes que no han sido descritas previamente, que facilitan el manejo y el uso clmico de esta combinacion terapeutica y su comercializacion.

Las formulaciones farmaceuticas estables liofilizadas y lfquidas que contienen mezclas de los IFNs gamma y alfa 2 recombinantes en proporciones sinergicas para la inhibicion de la proliferacion descritas en la presente tiene un amplio espectro de uso clmico. Se muestra in vivo utilizando estas formulaciones que en enfermedades oncologicas importantes es efectiva la combinacion del IFN gamma y el IFN alfa 2 recombinantes cuando se utiliza simultaneamente y de forma intratumoral.

Esta combinacion es capaz de tener iguales efectos curativos sobre tumores en menor tiempo y con un resultado estetico superior comparado con el que se obtiene por sus componentes por separado. El uso de estas combinaciones permitira contar con mayores posibilidades terapeuticas para combatir el cancer. Esto se recoge en una materializacion de la invencion donde se expone que las formulaciones liofilizadas pueden emplearse en el tratamiento de tumores solidos benignos o malignos, cuando se utilizan de formas independientes o combinadas con quimioterapia, radioterapia o la combinacion de ambas.

La utilizacion de estas formulaciones en combinacion con otros agentes terapeuticos se sustenta en los resultados obtenidos con el tratamiento de un paciente con un tumor baso celular gigante con la combinacion de IFN gamma e IFN alfa 2 recombinantes junto con cisplatino (ver ejemplo 10 y figura 9).

Se describe en la invencion como el empleo combinado de los interferones gamma y alfa 2 permite reducir y/o curar tumores de muy mal pronostico y de efectos esteticos deformantes.

De acuerdo con las caractensticas de varias entidades oncologicas y benignas donde predomina un crecimiento no controlado de celulas, estas pueden ser susceptibles a ser tratadas con estas formulaciones. Entre estas estan: tumores del tejido hematopoyetico tales como la leucemia mieloide, aguda o cronica, leucemia linfocftica, aguda o cronica, asf como las leucemias de celulas T, de celulas B, y el linfoma del sistema nervioso central. Tambien pueden ser tratados los carcinomas de laringe, la papilomatosis larmgea, el lipoma, el quiste epidermoide e intradermico, el liposarcoma, el neurofibroma, y la hiperplasia sebacea. Pueden ser beneficiados con el uso de estas formulaciones tumores del sistema nervioso central y periferico como los astrocitomas, glioblastomas multiformes, ependimomas, ganglioneuromas, astrocitomas pilocfticos, gliomas mezclados, oligodendrogliomas, gliomas del nervio optico, tumores neuroectodermicos primitivos, neuromas acusticos, cordomas, craniofaringiomas, meduloblastomas, meningiomas, neurofibromatosis, pseudotumores de cerebro, esclerosis tuberosa, tumores cerebrales metastasicos. Otros tumores susceptibles a ser tratados son los hemangiomas cavernosos, adenomas hepatocelulares, las hiperplasias nodulares focales, tumores pineales, adenomas pituitarios, tumores vasculares, carcinomatosis meningeal, angiomas en forma de cereza, hiperplasia de las glandulas sebaceas. El tratamiento de tumores de piel como el carcinoma basocelular, el carcinoma de celulas escamosas, el dermatofibroma, el granuloma piogenico, el nevus dermico, asf como queratosis seborreica y queratosis actmica puede beneficiarse de la terapia con estas formulaciones.

Otra materializacion de la invencion describe que estas formulaciones tambien pueden emplearse para el tratamiento de eventos proliferativos como fibrosis, displasia e hiperplasia.

De acuerdo con los resultados de los ensayos clmicos realizados y descritos en los ejemplos 7, 8, y 10 como materializacion de la invencion estan definidas formas intramusculares, intratumorales, y perilesionales de aplicacion de las formulaciones.

En la presente tambien se describe la aplicacion de formulaciones farmaceuticas estables topicas que contienen IFN gamma en un intervalo de concentracion entre 0.32 x 106 UI y 0.08 x 106 UI e IFN alfa 2 en un intervalo de concentracion entre 2.0 x 106 UI y 0.5 x 106 UI por gramo de semisolido. Las formulaciones son crema compuesta por 2.2% de IFN gamma, 0.58% de IFN alfa, 4% de alcohol cetilico, 10% de vaselina (Vaseline®), 2% de Tween 60, y 0.2% de metilparabeno, propilparabeno. Ademas, la composicion de unguento se definio por 2.2% de IFN gamma, 0.58% de IFN alfa, 60% de petrolato solido blanco, 10% de petrolato lfquido pesado, 3% de span 20, y 0.2% metilparabeno y

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propilparabeno. Finalmente, la formulacion de gel esta compuesta por 2.2% de IFN gamma, 0.58% IFN alfa, 0.5% de Carbopol 940, 0.2% de metilparabeno y propilparabeno, 0.2% de hidroxido de sodio, 0.01 % de etilendiaminotetraacetato de calcio disodio, y 2% etanol.

Todas estas formulaciones son resistentes a las fluctuaciones de temperatura, lo cual es rentable para la fabricacion del producto, su transportacion y almacenamiento. Las mismas previenen la agregacion de los interferones y, por lo tanto, presentan menor riesgo de resultar inmunogenicas durante el uso prolongando del producto. Las formulaciones de semisolidos permiten el empleo por los propios pacientes de forma segura y no invasiva.

Como otra materializacion de la descripcion se definio el empleo de estas formulaciones estables topicas en el tratamiento de tumores solidos benignos o malignos de la piel o las membranas mucosas, que se utilizan de formas independientes o combinadas con quimioterapia, radioterapia o la combinacion de ambas.

Otra materializacion de la descripcion describe que las formulaciones farmaceuticas estables topicas pueden ser empleadas para el tratamiento de lipoma, quiste epidermoide, quiste intradermico, liposarcoma, neurofibroma, hiperplasia sebacea, hemangiomas, hiperplasia nodular focal, ependimomas, ganglioneuromas, astrocitomas pilocfticos, meningiomas, tumores pineales, adenomas pituitarios, tumores vasculares, carcinomatosis meningeal, neurofibromatosis, angiomas en forma de cereza, hiperplasia de las glandulas sebaceas, carcinoma basocelular, carcinoma de celulas escamosas, dermatofibroma, granuloma piogenico, nevus dermico, queratosis seborreica, queratosis actmicas, y condilomas.

Otra materializacion de la descripcion describe la conformacion de un kit de reactivos que contiene un vial de IFN gamma recombinante, un vial de IFN alfa recombinante a las concentraciones y relaciones descritas anteriormente, junto a una cantidad suficiente de viales con agua para viales de inyeccion, para la dilucion y/o disolucion de los IFNs. El kit contiene jeringuillas y agujas adecuadas para la administracion simultanea de los IFNs, previamente mezclados en uno de los viales que contiene a uno de los IFNs.

Breve descripcion de las Figuras:

Figura 1. Inhibicion del crecimiento de cultivo primario de celulas de fibroblastos procedentes de biopsias de pacientes adultos con queloides por 1000 Ul/mL de IFN gamma o IFN alfa 2 recombinantes.

Figura 2. Isobolograma de la inhibicion del crecimiento celular por la combinacion de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes sobre el cultivo celular primario de fibroblastos de queloides (KeI5a).

Figura 3. Isobolograma de la inhibicion del crecimiento celular por la combinacion de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes sobre el cultivo celular primario de fibroblastos de queloides (KeI17a).

Figura 4. Isobolograma de la inhibicion del crecimiento celular por la combinacion de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes sobre el cultivo celular primario de carcinoma basocelular (CBC III).

Figura 5. Isobolograma de la inhibicion del crecimiento celular por la combinacion de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes sobre la lmea celular del glioblastoma GL-5.

Figura 6. Isobolograma de la inhibicion del crecimiento celular por la combinacion de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes sobre la lmea celular del carcinoma de laringe HEp-2.

Figura 7. Paciente con carcinoma epidermoide tratado con la combinacion de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes.

Figura 8. Paciente con carcinoma basocelular recidivante tratado con la combinacion de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes.

Figura 9. Paciente con carcinoma basocelular recidivante tratado con la combinacion de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes y cisplatino. A: antes del tratamiento, B: despues de 1 ano de tratamiento

Exposicion detallada de modos de realizacion / Ejemplos 1-6 y 8-10 ejemplos de referencia 7 y 11-14 (que no forman parte de la invencion)

Ejemplo 1. Inhibicion del crecimiento celular por los IFNs gamma o alfa recombinantes sobre cultivos celulares primarios.

Las biopsias de piel se obtuvieron de piel normal y de pacientes que desarrollaron carcinoma basocelular o queloide, este ultimo debido a dano por cirugfa o quemaduras. La muestra de tejido fue colocada inmediatamente en medio DMEM y fue fragmentada para obtener cultivos primarios por el metodo de explantes. Para la evaluacion del efecto antiproliferativo de los IFNs gamma y alfa recombinantes se evaluaron los siguientes cultivos: Cultivo primario de fibroblastos (CPF) de queloides (1,2, 5, 7, 8, 15, 17, 19, 20, 24, 26, 27, 31, 32), CPF de un carcinoma basocelular (CBC

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111) y CPF de piel normal (FibN3 y FibN5). Los CPF se cultivaron en una mezcla de medios de cultivo RPMI- 1640/DMEM que conteman gentamicina (50 |jg/ml) y 12% de suero fetal bovino (SFB). Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una incubadora de CO2 con 5% de humedad. Para determinar el efecto antiproliferativo de los IFNs, las celulas se sembraron a 5 x 104 celulas/mL en placas de 96 pocillos. Se sincronizaron por cambio de medio fresco despues de 24 horas de ser sembradas. Al termino de 96 horas de incubacion en presencia de diferentes concentraciones de los IFNs se determino la viabilidad de 3 replicas de condiciones experimentales evaluadas utilizando el metodo de tincion por cristal violeta, midiendo la absorbancia a 580 nm y utilizando un lector de placas. Los resultados se definieron como el % de crecimiento basado en el conteo de celulas viables:

% de crecimiento = (AT72h-ACoh/AC72h-ACoh) x 100.

AT72h = Absorbancia de celulas tratadas 72h.

AC72h = Absorbancia de celulas tratadas de control 72h.

AC0h = Absorbancia de celulas antes de ser tratadas con IFN.

En la figura 1 se muestra la accion antiproliferativa de los IFNs gamma o alfa recombinante sobre el crecimiento de los CPF de queloide. Como puede observarse, IFN gamma o alfa 2b inhibe la proliferacion celular en diversos cultivos primarios, mientras que otros estimulan el crecimiento. Como controles fueron evaluados los cultivos primarios FibN3 y FibN5, como tambien los cultivos primarios de CBC III, y lmeas celulares como la HEp-2, U1752 y GL-5.

Ejemplo 2: Inhibicion del crecimiento celular mediante IFNs gamma o alfa recombinantes en lmeas celulares establecidas.

Se estudiaron las lmeas celulares humanas Jurkat (ATCC, TIB-152), GL-5 (Perea S.E., et al. (1993) Acta Cient Venez, 44:22-27), HEp-2 (ATCC, CCL23). Las celulas GL-5 fueron cultivadas en DMEM, y las HEp-2 en MEM-CANE que conteman gentamicina (50 jg/ml) y 10% SFB. Las celulas Jurkat fueron incubadas en medio RPMI con gentamicina y 10% SFB. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una incubadora de CO2 con 5% de humedad. Para evaluar el efecto antiproliferativo en celulas GL-5 y las HEp-2 fueron sembradas a 3 x104 celulas/mL. En el caso de las celulas Jurkat estas se sembraron a 105 celulas/mL. Despues de 72 horas de incubacion en presencia de diferentes concentraciones de los IFNs se determino la viabilidad de 3 replicas, utilizando el metodo de tincion por cristal violeta y midiendo la absorbancia a 580 nm y utilizando un lector de placas. Los resultados se definieron como el porcentaje (%) de crecimiento basado en el conteo de celulas viables segun se describe en el ejemplo 1. Como se observa en la tabla 1 y en la figura 1, las lmeas celulares HEp-2 (carcinoma de laringe) y el GL-5 (de un glioblastoma), son muy sensibles al lFN gamma y no al lFN alfa.

Tabla 1. Inhibicion del crecimiento celular por 1000 UI/mL de IFN gamma o IFN alfa 2b sobre lmeas celulares.

IFNs

Promedio Desviacion Estandar DS Coeficiente de Variacion CV Replicas Ensayos

IFN Alfa 2

HEp-2 65% 13.68% 0.211 6 2

IFN gamma

18% 6.26% 0.357 6 2

IFN Alfa 2

GL-5 71% 20.26% 0.287 6 2

IFN gamma

24% 10.21% 0.421 4 2

IFN Alfa 2

HepG2 103% 13.17% 0.128 6 1

IFN gamma

106% 21.67% 0.204 6 1

IFN Alfa 2

Jurkat 60% 5.28% 0.088 3 1

IFN gamma

107% 16.89% 0.157 3 1

En la tabla 1 se observa que la lmea HepG2 (Hepatoma) no es sensible a estos IFNs y que en la lmea celular Jurkat (Iinfoma T), el IFN alfa es el mas efectivo, resultado que coincide con el empleo exitoso del IFN alfa 2 en el tratamiento de tumores de tejido linfoide.

Ejemplo 3: Combinaciones de los IFNs gamma y alfa recombinantes con accion antiproliferativa mas efectiva sobre los cultivos primarios y lmeas celulares.

Utilizando los CPF del CBC-III y de los queloides Kel-5a y Kel-17a y las lmeas celulares HEp~2 y GL-5, se realizaron estudios de combinaciones con IFNs gamma y alfa 2b recombinantes, para definir mezclas optimas con actividad sinergicas de la inhibicion del crecimiento celular. Los datos obtenidos en los estudios fueron analizados construyendo

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isobologramas. De los estudios de isobologramas de los CPF provenientes de biopsias de queloides en adultos (kel 5a y kel 17a) se definio que la combinacion sinergica optima para la inhibicion del crecimiento debe estar compuesta de 100 Ul/mL (10 ng/mL) de IFN gamma y 100 Ul/mL (0.5 ng/mL) de IFN alfa 2b. Con esa combinacion se reduce el crecimiento celular in vitro en un 21 % (Kel 5a) y en un 43 % (kel 17a) (figuras 2 y 3).

En el isobolograma de la figura 4 se muestra que la combinacion de 100 Ul/mL (10 ng/mL) de IFN gamma con 100 Ul/mL (0.5 ng/mL) de IFN alfa 2b es sinergica y la mas eficiente para reducir el crecimiento celular in vitro del CBC III en un 47%.

Segun el isobolograma que se muestra en la figura 5, la combinacion sinergica optima para inhibir el crecimiento de las celulas del GL-5 es de 50 Ul/mL (3 ng/mL) de IFN gamma con 600 Ul/mL (5 ng/mL) de IFN alfa 2b. Con esa combinacion se reduce el crecimiento celular in vitro en un 55%.

En el isobolograma representado en la figura 6 se muestra la combinacion sinergica optima de IFN gamma y alfa para obtener el mejor efecto antiproliferativo sobre las celulas HEp-2. Las cantidades de IFNs son de 5 Ul/mL (0.5 ng/mL) de IFN gamma con 75 Ul/mL (0.375 ng/mL) de IFN alfa 2b. Con esa combinacion optima se logra una reduccion del crecimiento celular in vitro en un 76%.

Ejemplo 4: Efecto del pH, las especies ionicas y la concentracion de la solucion reguladora de pH en la estabilidad de la mezcla de los interferones alfa-2b y gamma en solucion acuosa.

Para estudiar la estabilidad de las formulaciones liofilizadas y liquidas de las composiciones sinergicas de los interferones gamma y alfa recombinantes, los IFNs se diluyeron de su correspondiente Ingrediente Farmaceutico Activo (lFA) en diferentes formulaciones de prueba: soluciones reguladoras de pH, mezcla de soluciones reguladoras de pH con excipientes individuales y mezcla de soluciones reguladoras de pH con diversos excipientes. Muestras representativas de los viales de las diferentes formulaciones fueron sometidas a diferentes tratamientos para evaluar la estabilidad de los interferones: Ciclos de congelacion-descongelacion, liofilizacion, agitacion a 37°C, efecto de la luz y de la temperatura. Despues de los diferentes tratamientos, la estabilidad ffsico-qmmica fue evaluada mediante diferentes ensayos: apariencia ffsica, electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), cromatograffa lfquida en fase inversa (RP-HPLC) y cromatograffa de exclusion molecular (ME-HPLC). La estabilidad biologica fue evaluada mediante ensayos inmuno-enzimaticos (ELlSA) espedficos para cada interferon y mediante ensayos biologicos de inhibicion del efecto citopatogenico. Todos estos estudios de diseno de formulacion se realizaron con la mezcla de concentraciones intermedias de los interferones (0.5 MUI de IFN gamma y 3.0 MUI de IFN alfa 2b). Con las variantes finales de formulacion obtenidas (preparadas por duplicado) se prepararon las composiciones sinergicas y se evaluo su estabilidad.

Caractensticas organolepticas: Se determino mediante analisis de la apariencia de la formulacion (si se mantema incolora, transparente y sin agregacion de protemas). En el caso de ser liofilizada la formulacion, tambien se analizo la apariencia del producto liofilizado.

La humedad: El contenido de humedad residual del producto liofilizado fue determinado mediante la tecnica de titulacion yodometrica de Karl Fischer, empleando un medidor de humedad Radiometer (Modelo TIM 550).

Estabilidad qrnmica: La pureza de las protemas y la magnitud de la degradacion se determino mediante cromatograffa lfquida de alta resolucion en fase inversa (RP-HpLC) en una columna C8 Vydac equipada con un guarda-columna C8 Vydac (Vydac, Hesperia, CA) usando un sistema HPLC Merck-Hitachi equipado con un sistema de liberacion de solventes, un detector de arreglo de diodo, un horno y un sistema de manejo de datos. La pureza de las protemas tambien se determino mediante SDS-PAGE.

Determinacion de agregados: La agregacion del IFN gamma y del IFN alfa 2b recombinantes fue medida por HPLC de exclusion molecular usando una columna Superdex-75 HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech AS, Suecia) y un sistema HPLC Merck-Hitachi equipado con un sistema de liberacion de solventes, un detector de arreglo de diodo, un horno y un sistema de manejo de datos. El contenido de agregados covalentes se determino mediante SDS-PAGE.

ELlSA de interferon alfa: Este ensayo ha sido desarrollado en nuestro laboratorio (H. Santana., Espino Y., et al. (1999) A sandwich-type enzyme-linked immunosorbent assay for the analysis of recombinant human interferon a-2b. Biotechnology Techniques, 13, 341-346). El ensayo emplea anticuerpos monoclonales y fue realizado siguiendo la metodologfa reportada. La medicion es reportada aqrn como porcentaje (%) de la actividad ELlSA residual del interferon alfa-2b en las diferentes muestras de cada variante de formulacion, tomando la actividad ELlSA en la muestra inicial igual al 100 %.

ELlSA de interferon gamma: Este ensayo ha sido desarrollado en nuestro laboratorio (Bouyon R., Santana H., et al. (2003) Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELlSA) for recombinant human gamma interferon. Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 24:1-10). El ensayo emplea anticuerpos monoclonales y fue realizado siguiendo la metodologfa reportada. La medicion es reportada aqrn como porcentaje (%) de la actividad ELlSA

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residual del interferon gamma en las diferentes muestras de cada variante de formulacion, tomando la actividad ELISA en la muestra inicial igual al 100 %.

Cuantificacion de actividad biologica antiviral: La medicion de la actividad biologica fue realizada segun describe Ferrero J., Ochagavia ME., et al. (1994, Titulacion de la actividad antiviral del interferon utilizando el sistema de equipos SUMA. Biotecnologfa Aplicada, 11:34-42). El calculo de la actividad biologica se realizo segun describe Ferrero J., Duany L., et al. (1997, Nuevo programa de calculo, cuantificacion de la actividad antiviral de interferones mediante la inhibicion del efecto citopatogenico utilizando el sistema de equipos SUMA. Biotecnologfa Aplicada, 14: 267-269). La actividad biologica es reportada aqrn como porcentaje de la actividad biologica residual, tomando la actividad biologica de la muestra inicial igual al 100%. Para conocer el efecto del pH en la estabilidad de los ingredientes activos, se prepararon diferentes formulaciones que conteman 0.5 MUI de IFN gamma y 3.0 MUI de IFN alfa 2b en diferentes soluciones reguladoras de pH; es decir, regulador de pH citrato/fosfato, regulador de pH fosfato, regulador de pH citrato y regulador de pH acetato.

Las formulaciones que conteman las mezclas de IFN gamma y de IFN alfa2b recombinantes con las soluciones reguladoras de pH fueron sometidas a ciclos de congelacion-descongelacion o almacenadas a 45°C y analizadas por ELlSA a determinados intervalos de tiempo. Las formulaciones fueron preparadas para tener el pH entre 4 y 8, y todas las soluciones reguladoras de pH se encontraban a una concentracion de 0.1 M. Las tablas 2, 3 y 4 reportaron los resultados de los ensayos realizados despues de 3 ciclos de congelacion-descongelacion y a determinados intervalos de tiempo, de 3 a 12 dfas a temperatura de 45°C.

Tabla 2. Estabilidad a 45°C y durante ciclos de congelacion-descongelacion de mezcla de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes (0.5 MUI IFN gamma y 3.0 MUI IFN alfa 2b) en solucion acuosa reguladora de pH citrato/fosfato 0.1 M a diferentes pH. Concentracion de IFN gamma e IFN alfa 2b en porcentaje (%).

CONGELACION- DESCONGELACiON

INCUBACiON A 45°C

ELlSA IFNy ELlSA IFNa ELlSA IFNy ELlSA IFNa

T=0

3D 6D 12D 3D 6D 12D

IFN/4 100 2690650 UI/ML

25.9 73.0 4.5 ND ND 78.5 69.9 36.9

IFN/5 100 3820902 UI/ML

82.1 86.5 5.4 ND ND 81.4 62.6 31.7

IFN/6 100 3532107UI/ML

63.3 82.7 36.5 5.5 3.6 79.8 61.0 38.5

IFNI7 100 3532100 UI/ML

63.0 82.4 44.4 26.4 14.0 78.0 63.1 32.0

IFN/8 100 3179500 UI/ML

55.1 76.7 37.6 21.6 11.5 82.5 60.3 34.2

D = Dfas; ND = no determinable. IFN/4 = formulacion en regulador de pH citrato/fosfato pH 4.0; IFN/5 = formulacion en regulador de pH citrato/fosfato pH 5.0; IFN/6 = formulacion en regulador de pH citrato/fosfato pH 6.0; IFN/7 = formulacion en regulador de pH citrato/fosfato pH 7.0; IFN/8 = formulacion en regulador de pH citrato/fosfato pH 8.0.

Tabla 3. Estabilidad a 45°C y durante ciclos de congelacion-descongelacion de mezcla de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes (0.5 MUI IFN gamma y 3.0 MUI IFN alfa 2b) en solucion acuosa en regulador de pH fosfato 0.1 M a diferentes valores pH. Concentracion de IFN gamma e IFN alfa 2b en porcentaje (%).

CONGELACION-DESCONGELACiON

INCUBACION A 45°C

ELlSA IFNy ELlSA IFNa ELlSA IFNy ELlSA IFNa

T=0

3D 6D 12D 3D 6D 12D

IFN/5 100 3549425 UI/ML

90.2 83.5 67.3 47.6 25.4 74.1 53.9 32,6

IFN/6 100 3459600 UI/ML

67.8 75.6 42.4 28.6 10.5 82.7 59.6 41.1

IFNI7 100 3523210UI/ML

57.9 80.4 40.5 21.5 8.1 73.6 52.9 33.0

CONGELACION-DESCONGELACiON

INCUBACION A 45°C

ELlSA IFNy ELlSA IFNa ELlSA IFNy ELlSA IFNa

IFN/8 100 3321090 UI/ML

57.2 78.5 26.1 10.7 6.5 74.9 59.0 37.3

D = Dfas; ND = no determinable. IFN/5 = formulacion en regulador de pH fosfato pH 5.0; IFN/6 = formulacion en regulador de pH fosfato pH 6.0; IFN/7 = formulacion en regulador de pH fosfato pH 7.0; IFN/8 = formulacion en regulador de pH fosfato pH 8.0

Los datos de estas tablas (2, 3, 4) indican que las formulaciones con valores de pH entre 5 y 8 mostraron una adecuada estabilidad durante los ciclos de congelacion-descongelacion, preferiblemente para los pH cercanos a 5 y a 7 y en los reguladores de pH de acetato, fosfato y citrato-fosfato. La estabilidad termica en solucion acuosa fue mayor a valores de 5 pH entre 5 y 5.6, preferiblemente en los reguladores de pH de acetato y fosfato.

Los datos de la tabla 5 indican que las formulaciones de mayor concentracion del regulador de pH mostraron mejor estabilidad durante los ciclos de congelacion-descongelacion que las de menor concentracion a pH 5.5, particularmente para el IFN gamma en los diferentes reguladores de pH ensayados. Sin embargo, los resultados de la estabilidad termica fueron mejores a pH 5.5 en los tampones acetato y despues en fosfato y no se observo dependencia de la 10 concentracion. La estabilidad termica en regulador de pH citrato-fosfato fue mayor a bajas concentraciones del regulador de pH.

Tabla 4. Estabilidad a 45°C y durante ciclos de congelacion-descongelacion de mezcla de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes (0.5 MUI IFN gamma y 3.0 MUI IFN alfa 2b) en solucion acuosa en regulador de pH citrato y regulador de pH acetato 0.1 M a diferentes valores pH. Concentracion de IFN gamma e IFN alfa 2b en porcentaje (%).

CONGELACION-DESCONGELACiON

INCUBACION A 45°C

ELlSA IFNy ELlSA IFNa ELlSA IFNy ELlSA IFNa

T=0

3D 6D 12D 3D 6D 12D

IFN/C4 100

11.9 77.0 1.3 ND ND 66.9 49.9 27.0

2690650 UI/ML

IFN/C5 100

64.6 78.1 2.7 ND ND 71.3 56.6 41.8

3820902 UI/M L

IFN/C6 100

65.8 66.9 12.0 5.9 ND 61.5 43.7 28.2

3532107 UI/ML

IFN/A4 100

87.1 82.3 65.9 46.4 27.9 64.5 46.6 29.0

3532100 UI/ML

IFN/A5 100

86.1 79.7 59.4 45.9 24.0 68.3 47.9 30.7

3179500 UI/ML

IFN/A5.6 100

74.8 75.0 50.8 31.3 18.9 67.7 48.3 27.6

3179500 UI/ML

D = Dfas; ND = no determinable; IFN/C4 = formulacion en regulador de pH citrato pH 4.0; IFN/C5 = formulacion en regulador de pH citrato pH 5.0; IFN/C6 = formulacion en regulador de pH citrato H 6.0; IFN/A4 = formulacion en regulador de pH acetato pH 4.0; IFN/A5 = formulacion en regulador de pH acetato pH 5.0; IFN/A5.6 = formulacion en regulador de pH acetato pH 5.6.

Tabla 5. Estabilidad a 45°C y durante ciclos de congelacion-descongelacion de mezcla de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes (0.5 MUI IFN gamma y 3.0 MUI IFN alfa 2b) en solucion acuosa a pH 5.5 en tampones citrato-fosfato, fosfato y acetato a 0.1 M a diferentes concentraciones de la solucion reguladora de pH. Concentracion de IFN gamma e IFN alfa 2b en porcentaje (%).

CONGELACION-DESCONGELACiON

INCUBACION A 45°C

ELISA IFNy ELISA IFNa ELISA IFNy ELISA IFNa

T=0

3D 6D 12D 3D 6D 12D

IFN/C-F25 100

59.2 77.2 62.8 21.7 27.9 67.2 59.9 38.7

CONGELACION-DESCONGELACiON

INCUBACION A 45°C

ELISA IFNy ELISA IFNa ELISA IFNy ELISA IFNa

2690650 UI/ML

IFN/C-F50 100

61.9 79.6 45.5 26.4 16.6 71.9 62.3 36.1

3820902 UI/ML

IFN/C-F100 100

63.3 82.7 36.5 5.5 3.6 79.8 61.0 38.5

3532107 UI/ML

IFN/Fk25 100

70.9 73.0 71.2 50.9 30.5 61.4 54.4 36.8

3532100 UI/ML

IFN/Fk50 100

79.7 75.9 69.1 48.7 28.7 63.6 52.9 31.6

3179500 UI/ML

IFN/Fk100 100

90.2 83.5 67.3 47.6 25.4 74.1 53.9 32.6

3179500 UI/ML

IFN/FNa 25 100

70.3 77.6 68.4 47.3 24.3 63.6 56.1 37.7

3532100 UI/ML

IFN/FNa 50 100

82.8 80.1 60.8 46.5 21.4 71.3 53.1 34.6

3179500 UI/ML

IFN/FNa100 100

87.9 86.5 73.9 42.0 32.5 74.7 52.9 35.0

3179500 UI/ML

IFN/A25 100

62.6 66.3 73.4 45.3 34.2 63.1 44.3 28.4

3532100 UI/ML

T=0

3D 6D 12D 3D 6D 12D

IFN/A50 100

69.3 69.0 67.3 42.9 29.7 65.6 51.9 33.2

3179500 IU/ML

IFN/A100 100

76.4 77.1 52.6 30.1 22.8 70.5 49.0 26.8

3179500 IU/ML

D: Dfas; ND: no determinable; IFN/C-F25: formulacion en regulador de pH citrato-fosfato pH 5.5, 25 mM; IFN/C-F50: formulacion en regulador de pH citrato-fosfato pH 5.5, 50 mM; IFN/C-F100: formulacion en regulador de pH citrato-fosfato pH 5.5, 100 mM; IFN/Fk25: formulacion en regulador de pH fosfato de potasio pH 5.5, 25 mM; IFN/Fk50: formulacion en regulador de pH fosfato de potasio pH 5.5, 50 mM; IFN/Fk100: formulacion en regulador de pH fosfato 5.5, 100 mM; IFN/FNA 25: formulacion en regulador de pH fosfato de sodio pH 5.5, 25 mM; IFN/FNA 50: formulacion en regulador de pH fosfato de sodio pH 5.5, 50 mM; IFN/FNA 100: formulacion en regulador de pH fosfato de sodio pH 5.5, 100 mM; IFN/A 25: formulacion en regulador de pH acetato pH 5.5, 25 mM; IFN/A 50: formulacion en regulador de pH acetato pH 5.5, 50 mM; IFN/A 100: formulacion en regulador de pH acetato pH 5.5,100 mM.

Ejemplo 5. Formulacion liofilizada (1.4 x 106 UI de IFN gamma y 1.7 x 106 UI de IFN alfa 2b por vial).

Composicion: IFN gamma 2.8 x 108 UI, IFN alfa 2b 3.4 x 108 UI, di-hidrogeno fosfato de mono-potasio 0.0802g, hidrogeno fosfato de di-sodio di-hidratado 0.249 g, sacarosa 4g, glicina 0.8 g, Tween 20 0.03g, polietilenglicol 6000 1 g, 5 agua para inyeccion cantidad suficiente para 100 mL.

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Todos los componentes excepto los interferones fueron medidos y diluidos con agua para inyeccion. El pH de la solucion es chequeado y si es necesario, ajustado a un valor de 7.2 ± 0.2 con acido acetico diluido (1 :2) o con 1 M de NaOH. Los ingredientes farmaceuticos activos de IFN gamma e IFN alfa 2b fueron adicionados y diluidos hasta la concentracion apropiada. La solucion fue filtrada de forma esteril y los viales se llenaron y se taparon con tapones para la liofilizacion en un area clase 100, en la cual se realizo el procedimiento. Finalmente los viales son tapados y sellados; y el producto es almacenado entre 2 y 8°C. La tabla 6 muestra los principales parametros del ciclo de liofilizacion empleado.

Tabla 6. Resumen de los parametros del ciclo de liofilizacion, cronograma de temperatura por etapas.

Etapas del ciclo

Temperatura Duracion

Congelacion

-45 °C 2 horas

-20 °C

2 horas

-45 °C

6 horas

Secado Primario

-35 °C 12 horas

Secado secundario

25 °C 12 horas

A intervalos establecidos de tiempo se tomaron muestras y se analizo el contenido de humedad residual del producto, el contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b (por ELlSA), la actividad biologica, la pureza por RP-HPLC y la apariencia tanto del producto liofilizado como del reconstituido. Los resultados son presentados en la tabla 7.

Tabla 7. Datos de humedad residual del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, la actividad biologica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 5°C. FORMULACiON LIOFILIZADA: 1.4 MUI IFN gamma/vial y 1.7 MUI IFN alfa 2b/vial.

Tiempo (mes)

Humedad residual (%) ELISA Actividad antiviral Pureza RP-HPLC Descripcion

IFNy (Mg/vial*)

IFNa (Mg/vial*) UI/vial* Total (%) IFNy (%) IFNa (%)

Inicial

1.4 315.8 21.9 2.51 97.8 90.6 7.2 STI

1

- 291.2 24.7 3.78 96.4 87.7 8.7 STI

3

- 307.5 23.5 3.17 97.7 87.9 9.8 STI

6

2.6 279.1 22.6 2.89 97.0 88.9 8.2 STI

* El volumen llenado fue de 0.5 mL/vial; STI: liofilizado blanco uniforme; despues de reconstitucion, una solucion transparente incolora, esencialmente libre de particulas._____________________________________________

Ejemplo 6. Formulacion liofilizada (0.5 x 106 UI de IFN gamma y 3.0 x 106 UI de IFN alfa 2b por vial).

Composicion: IFN gamma 1.0 x 108 UI, IFN alfa 2b 6.0 x 108 UI, di-hidrofosfato de potasio 0.0802 g, hidrofosfato di- sodico di-hidratado 0.249 g, sacarosa 4g, glicina 0.8 g, Tween 20 0.03 g, polietilenglicol 6000 1 g, agua para cantidad suficiente de inyeccion para 100 mL. El metodo de preparacion fue el mismo que se describio en la formulacion liofilizada del ejemplo 5.

A intervalos establecidos de tiempo se tomaron muestras y se analizo el contenido de humedad residual del producto, el contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b (por ELlSA), la actividad biologica, la pureza por RP-HPLC y la apariencia tanto del producto liofilizado como del reconstituido. Los resultados son presentados en la tabla 8.

Tabla 8. Datos de humedad residual del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, la actividad biologica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 5°C. FORMULACiON LIOFILIZADA: 0.5 MUI IFN gamma/vial y 3.0 MUI IFN alfa 2b/vial.

Tiempo (mes)

Humedad residual (%) ELISA Actividad antiviral Pureza RP-HPLC Descripcion

IFNy (Mg/vial*)

IFNa (Mg/vial*) UI/vial* Total (%) IFNy (%) IFNa (%)

Inicial

1.3 93.7 38.5 3.15 97.5 28.1 69.4 STI

1

- 104.5 43.9 4.41 96.8 29.5 67.3 STI

3

- 98.5 36.4 2.69 97.1 27.6 69.5 STI

6

1.9 108.2 44.0 3.91 96.9 28.8 68.1 STI

* El volumen llenado fue de 0.5 mL/vial; STI: liofilizado blanco uniforme; despues de reconstitucion, una solucion transparente incolora, esencialmente libre de particulas._____________________________________________

Ejemplo 7: Ensayo clmico con la formulacion farmaceutica liofilizada (0.5 x 106 UI de IFN gamma y 3.0 x 106 UI de IFN alfa 2b por vial). Aplicacion intralesional en el CBC.

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La formulacion farmaceutica liofilizada estable descrita en el ejemplo 6 fue empleada en la realizacion de un ensayo clmico aleatorizado, controlado y triple a ciegas que incluyo 59 pacientes con diagnostico clmico e histologico de cBc de cualquier localizacion y tipo de piel con lesiones de un diametro menor de cuatro centfmetros. Los pacientes fueron asignados de forma aleatorizada a tres grupos de tratamiento. Las lesiones fueron tratadas intralesionalmente con la mitad de las dosis de IFN alfa 2b recombinante (1,5 x106 Ul/mL); o IFN gamma recombinante (0,25 x106 Ul/mL) o la formulacion liofilizada estable (0.5 x 106 UI de iFn gamma y 3.0 x 106 UI de IFN alfa 2b por vial), grupo I, II y III, respectivamente. Los IFNs fueron aplicados, tres veces por semanas, durante tres semanas consecutivas, continuando durante 9 semanas, una vez por semana o hasta la desaparicion total de la lesion, momento en el que se determino la eficacia clmica del tratamiento. El 9.5%, 35,3% y 5,3% de las lesiones del grupo con IFN alfa 2b, IFN gamma y la formulacion (0.5 x 106 UI de IFN gamma y 3.0 x l06 UI de IFN alfa 2b por vial), respectivamente disminuyeron en menos de un 50% el tamano de la lesion. En el resto de las lesiones se observo un 90,5%; 57.9% y 94,7% (grupo I, II y III, respectivamente) de respuesta objetiva (desaparicion total o disminucion de mas del 50% del tamano inicial). Ninguna de las lesiones progreso (ver tabla 9). En el estrato de los "pacientes que no terminaron el tratamiento", se observa una ligera superioridad del tratamiento con la formulacion que contiene a los IFNs gamma y alfa 2b recombinantes con efecto antiproliferativo sinergico (17% de diferencia con respecto al tratamiento con IFN alfa 2b y 27% de diferencia con respecto al tratamiento con IFN gamma). En el estrato de los "pacientes con menos de 11 semanas de tratamiento", se observa superioridad de la formulacion (aproximadamente 30% de diferencia con respecto a IFN gamma y 27% con respecto al alfa 2b). La proporcion de respuesta completa es superior (> 40% de superioridad con respecto al IFN alfa 2b y >30% con respecto al tratamiento con IFN gamma). Pacientes con menos de 12 inyecciones, se logro un 100% de respuestas favorables (de ellas 50% de RC) en el grupo de la terapia con la formulacion. En los otros 2 grupos de tratamiento, el porcentaje de respuesta favorable fue de un 67% (de ellas el 33.3% de RC), es decir se logra aproximadamente un 33% de diferencia a favor de la terapia combinada. Ver tabla 9.

Tabla 9. Evaluacion de la respuesta clmica estratificando segun tiempo de tratamiento con la mitad de la dosis FORMULACiON LIOFILIZADA: 0.5 MUI IFN gamma y 3.0 MUI IFN alfa 2b/vial.

Variables

IFN alfa IFN gamma Formulacion P (Fisher)

Completo 7 (41.2%) 17 4 (33.3%) 8 (50%) 16 I - II p= 0.060 III - II p= 0.067

Tratamiento finalizado

10 (58.8%) (100%) 9 (75.0%) (100%)

Sin cambio

0 (0%) 3 (25.0%) 0 (0%)

Completo 0 (0%) 2 (50%) 0 (0%) 2 (40%) 0 (0%) 2 (66.7%) I - II p=

Tratamiento

2 (50%) 1.000

no finalizado

Sin cambio 2 (50%) 3 (60%) 1 (33.3%) III - p= 1.000

Tratamiento penodo >=11

Completo 6 (37.5%) 16 2 (20.0%) 3 (27.3%) 11 I - II p= 0.046* III - II p= 0.090

10 (62.5%)

(100%) 7 (70%) (100%)

semanas

Sin cambio 0 (0%) 3 (30%) 0 (0%)

Tratamiento penodo < 11 semanas

Completo 1 (20%) 3 (60%) 2 (28.6%) 4 (57.1%) 5 (62.5%) 7 (87.5%) I - II p= 0.689

2 (40%)

Sin cambio

2 (40%) 3 (42.9%) 1 (12.5%) III - p= 0.230

< 12

Completo 1 (33.3%) 2 (66.7%) 2 (33.3%) 4 (66.7%) 3 (50%) 6 (100%) I - II p= 1.000

1 (33.3%)

inyecciones recibidas

Sin cambio 1 (33.3%) 2 (33.3%) 0 (0%) III - p= 0.455

Completo 6 (33.3%) 17 2 (18.2%) 5 (38.5%) 12 I - II p= 0.054 III - p= 0.142

>12 inyecciones

11 (61.1%) (94.4%) 7 (63.6%) (92.3%)

recibidas

Sin cambio 1 (5.6%) 4 (36.4%) 1 (7.7%)

Como podemos observar en la Tabla 10, con la formulacion liofilizada estable que contiene a los IFNs gamma y alfa 2b recombinantes es posible obtener respuesta clmica completa en un penodo abreviado de tiempo que con los interferones por separado, con una diferencia de aproximadamente 4 semanas antes con respecto al lFN alfa.

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Tabla 10. Evaluacion del tiempo hasta la respuesta completa. Tratamiento con la formulacion liofilizada: 0.5 MUIIFN gamma/vial y 3.0 MUIIFN alfa 2b/vial.

Tiempo hasta RC (semanas)

IFN gamma (N = 17) IFN alfa (N = 21) Formulacion (N = 19) P (Kruskal- Wallis)

Mediana ± RQ

9.0 ±7.5 12.0±1.0 8.5 ± 5.8 0.507

En ningun caso tratado se observo la formacion de queloide; por el contrario, todos los casos tratados tuvieron una buena cicatrizacion de la lesion con sensibilidad normal, elasticidad normal o ligeramente disminuida y ausencia de sequedad, fragilidad y aspereza.

Con respecto al color, en la mayona de los pacientes tratados con la formulacion se observo una coloracion normal en el sitio tratado (47.4%), el doble de lo observado para el grupo con IFN alfa (28.6%). Al final del ensayo, en el grupo tratado con la formulacion se observo un porcentaje mayor de lesiones planas (63.2%) con respecto al grupo tratado con IFN alfa 2b solo (52.4%) lo cual se muestra en la Tabla 11.

Tabla 11. Evaluacion estetica al final del tratamiento. Tratamiento con la mitad de la dosis de la formulacion liofilizada: 0.5 MUI IFN gamma/vial y 3.0 MUI IFN alfa 2b/vial.

Variables

FN gamma (N=17) IFN alfa (N=21) Formulacion (N=19)

Color

Normocroirna 8(47.1%) 6 (28.6%) 9 (47.4%)

Ligera hipocromfa

1 (5.9%) 4 (19%) 6 (31.6%)

Hipocromfa

1 (5.9%) 2 (9.5%) 1 (5.3%)

Ligera hipercromfa

7(41.2%) 8(38.1%) 3 (15.8%)

Hipercromfa

-- 1 (4.8%) --

Volumen

Lesion plana 12(70.6%) 11(52.4%) 12(63.2%)

Ligera hipertrofia

5(29.4%) 10(47.6%) 7(36.8%)

La combinacion de interferones no potencio los eventos adversos pues no se detectaron diferencias estadfsticas entre los grupos de tratamientos, respecto a la produccion o intensidad de los mismos. En general fueron leves (71.2%) o moderados y bien tolerados. No se presentaron eventos adversos graves ni muy graves. (Tabla 12).

Tabla 12. Frecuencia de eventos adversos (% con respecto al numero total de eventos adversos detectados). Tratamiento con la mitad de la dosis de formulacion liofilizada: 0.5 MUI IFN gamma/vial y 3.0 MUI IFN alfa 2b/vial.

Eventos

IFN gamma IFN alfa Formulacion Total

Fiebre

31 (60.8%) 15 (38.5%) 11 (26.2%) 57 (43.2%)

Mialgias

2 (3.9%) 15 (38.5%) 13 (31.0%) 30 (22.7%)

Escalofnos

10 (19.6%) 5 (12.8%) 9 (21.4%) 24 (18.2%)

Astenia

4 (7.8%) 1 (2.6%) 5(11.9%) 10 (7.6%)

Artralgias

-- 1 (2.6%) 3 (7.1%) 4 (3.0%)

Prurito

3 (5.9%) -- 3 (2.3%)

Perdida de peso

-- 2(5.1%) -- 2 (1.5%)

Alergia

1 (2.0%) -- -- 1 (0.8%)

Trombocitopenia

-- -- 1 (2.4%) 1 (0.8%)

Leucopenia

-- -- 1 (2.4%) 1 (0.8%)

Total de eventos

39 (29.5%) 39 (29.5%) 43 (32.3%) 133 (100%)

Como puede observarse en esta tabla los eventos adversos mas frecuentes en cada grupo de tratamiento fueron: fiebre (38.5%; 60.8% y 26.2%), mialgias (38.5%; 3.9% y 31 %) y escalofrios (12.8%; 19.6% y 21.4%) con IFN alfa, IFN gamma y la combinacion, respectivamente. El total de eventos adversos presentados fue ligeramente superior en el grupo de pacientes tratados con IFN gamma.

En general, el tratamiento combinado logro un 32% de superioridad de respuestas completas, aproximadamente 4 semanas antes y con un 25% menos de inyecciones con respecto al tratamiento con IFN alfa. La combinacion no aumento los eventos adversos y no se encontro ninguna recidiva en el seguimiento al ano de finalizado el tratamiento en los pacientes que obtuvieron respuesta clmica completa. Desde el punto de vista cosmetico, el resultado fue muy bueno lo que dio lugar a lesiones planas y normocromicas en su mayona.

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Ejemplo 8: Resultados del uso compasional de la mezcla de IFNs gamma y alfa 2b recombinantes en pacientes con tumores de piel no susceptibles de tratamientos estandares. Reporte de casos. Paciente 1

Paciente EPR: HC: 302396 Edad: 82 anos, Sexo: Masculino, antecedente patologico personal (APP): n/r Remitido al Instituto nacional de Oncologfa y Radiobiologfa (INOR) el 17/10/01 con tumor de la piel de la region anterior del torax, habfa recibido tratamiento por electrofulguracion que luego de esto crecio en forma ulcerosa, habiendo sido operado el 03/07/01. Resultado: carcinoma espinocelular incompletamente extirpado. El paciente llega con lesion tumoral persistente de 3 cm en el sitio del tumor original con bordes elevados. A la observacion ffsica no presento ganglios metastasicos regionales. Se indico radioterapia sobre el tumor, y se termino el 29/01/02: 60C o 50 Gy + Rayos X 12 Gy. Dosis total por tumor fue de 62gy.

Un mes despues, el paciente mostraba tumor fijo a la clavmula y al tercio inferior del musculo esternocleidomastoideo. En poco tiempo continuo creciendo rapidamente, mostrando el 04/03/02 gran lesion ulcerada de 10 x 8 cm sobre el tercio interno de la clavmula derecha, base del cuello y parte del esternon, todo hacia la parte anterior del torax. Le fue propuesto tratamiento quirurgico. Por los 82 anos de edad y tener elevado riesgo quirurgico, se rechaza a hacerla. Luego, se recomendo un tratamiento con IFN intralesional.

El tumor de gran tamano (12.5 x 9 cm y 1-1.5 cm de espesor) estaba fijo a hueso y musculo. La aplicacion de IFN se planifico en tres sectores de penmetro. Cada sector fue infiltrado con 1.5 mL de solucion en aproximadamente 5 cm3 de tejido (1.5 x 1.5 x 1.5) a una dosis de 0.5 x 106 UI de IFN gamma + 6 x 106 UI de IFN alfa 2b en 6 mL de agua por inyeccion, tres veces por semana por tres semanas (figura 7a). Despues de la quinta aplicacion del producto (segunda semana) se decide aplicar una dosis mayor de IFN gamma (el doble, 1 x 106 UI). El aumento de dosis fue propuesto tratando de obtener un mejor resultado de un tumor tan grande debido a la ausencia de efectos adversos en la dosificacion previa a la informacion anterior del estudio clmico donde se mostraba el efecto sinergico de ambos interferones.

En total el paciente recibio 27 aplicaciones para una dosis total de 25 x 106 UI de IFN gamma + 162 x 106 UI de IFN alfa 2b en dos meses de tratamiento. En la quinta aplicacion fue apreciado un aplanamiento del borde de la lesion hasta el nivel de la piel normal, (figura 7b). Un mes despues de comenzar el tratamiento, el paciente refiere intenso dolor del miembro superior derecho y se observo infiltracion del plexo nervioso braquial, exposicion, necrosis y fractura de la clavmula. En la aplicacion #20 se observo que en los sitios inyectados paro el crecimiento tumoral, pero no asf en el centro donde crecio en forma lobulada, (figura 7c). Esta condicion se observo incluso en la aplicacion 24, ademas de aparecer sepsis y necrosis en el centro de la ulcera tumoral. Exactamente dos meses despues de comenzado el tratamiento (aplicacion #27), el paciente sufrio intenso sangramiento arterial por infiltracion de la arteria subclavia; la hemoglobina del paciente disminuyo hasta 80 gIL y el tratamiento fue interrumpido por 15 dfas, al cabo de los cuales regreso por continuar sangrando y tener astenia progresiva. El paciente murio dos meses despues por rotura arterial. Los sitios inyectados se mantuvieron sin crecimiento tumoral.

En las primeras ocho aplicaciones se registraron algunos eventos adversos como fiebre (39°C), escalofnos, eritema perilesional y astenia pero todos de intensidades leves y corta duracion. Conclusiones: Se logro respuesta clmica en los sitios inyectados, duradera por al menos dos meses, efectos adversos sin importancia.

Paciente 2

Paciente: LGR: HC: 158390 Edad: 65 anos Sexo: Femenino, APP: n/r. Paciente que padece de multiples carcinomas basales en toda la cara. La paciente fue intervenida quirurgicamente e irradiada varias veces en el parpado inferior del ojo izquierdo con injertos. Ahora muestra recidiva tumoral de 5 mm de diametro en el borde del parpado y otra lesion plana cicatricial por debajo del parpado hacia el pomulo, (figura 8a). La alternativa de tratamiento sena una nueva cirugfa con las objeciones de ser un caso ya multitratado. En el parpado superior de ese mismo ojo tiene otro carcinoma basal de 7 mm que no ha sido tratado anteriormente.

El 08/05/02 se propone tratamiento con IFN intralesional (0.5 x 106 UI de IFN gamma + 3 x 106 UI de IFN alfa 2b) en 4 mL, tres veces por semana por tres semanas. En total, la paciente recibio 10 aplicaciones para una dosis total de 35 x 106 UI de interferon (5 x 106 UI de IFN gamma + 30 x 106 UI de IFN alfa 2b). En la cuarta infiltracion, la lesion plana cicatricial habfa desaparecido y en el parpado tema una ulcera necrosada en el sitio del tumor, (figura 8b). Dos meses despues del tratamiento no se observa tumor en el parpado, y se observa desaparicion de la lesion plana cicatricial del pomulo (figura 8c). Se obtuvo un efecto local-regional. Se observo una reduccion del 50% del carcinoma basal del parpado superior del ojo izquierdo que no fue tratado directamente con IFN y luego fue extirpado quirurgicamente. Tres anos despues la paciente permanece aun controlada de las lesiones infiltradas con IFN. Se registraron algunos eventos adversos de intensidades leves y de corta duracion como fiebre (39°C), escalofnos y quemosis en el ojo tratado que se alivio con compresas fnas.

Conclusiones: Paciente con respuesta clmica completa hasta agosto del 2005 (ultimo control), efectos adversos mmimos.

Ejemplo 9. Formulacion liofilizada (0.5 x 106 UI de IFN gamma y 10 x 106 UI de IFN alfa 2b por vial).

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Composicion: IFN gamma 1.0 x 108 UI, IFN alfa 2b 20 x 108 UI, di-hidrofosfato de potasio 0.0802 g, hidrofosfato di- sodico di-hidratado 0.249 g, sacarosa 4 g, glicina 0.8 g, Tween 20 0.03 g, polietilenglicol 6000 1 g, agua para cantidad suficiente de inyeccion para 100 mL.

El metodo de preparacion fue el mismo que se describio en la formulacion liofilizada del ejemplo 5.

A determinados intervalos de tiempo se tomaron muestras y se analizo el contenido de humedad residual del producto, el contenido de IFN gamma y de IFN alfa 2b (por ELlSA), la actividad biologica, la pureza por RP-HPLC y la apariencia tanto del producto liofilizado como del reconstituido. Los resultados son presentados en la tabla 13.

Tabla 13. Datos de humedad residual del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, la actividad biologica, y pureza por RP-HPLC. Temperatura 5 °C. FORMULACiON LIOFILIZADA: 0.5 MUI IFN gamma y 10.0 MUI IFN alfa 2b/vial.

Tiempo (mes)

Humedad residual (%) ELISA Actividad antiviral Pureza RP-HPLC Descripcion

IFNy (Mg/vial*)

IFNa (Mg/vial*) Ul/vial* Total (%) IFNy (%) IFNa (%)

Inicial

0.9 94.0 142.2 12.90 98.8 43.7 55.1 STI

1

- 105.5 133.2 8.37 97.7 40.8 56.9 STI

3

- 102.1 129.4 11.55 97.6 43.0 54.5 STI

6

1.7 91.7 137.1 9.13 95.4 39.4 57.0 STI

* El volumen llenado fue de 0.5 mL/vial; STI: liofilizado blanco uniforme; despues de reconstitucion, una solucion transparente incolora, esencialmente libre de particulas._____________________________________________

Ejemplo 10. Empleo de la formulacion liofilizada estable compuesta por 0.5 MUI IFN gamma y 10.0 MUI IFN alfa 2b/vial en combinacion con cisplatino. Reporte de caso.

Paciente 3

Paciente JGA: HC: edad: 33 anos, sexo: varon, APP: paciente n/r registrado en el INOR con un carcinoma de celulas basales que penetra por el angulo interno del ojo izquierdo, con varias intervenciones quirurgicas e irradiado. Ahora el paciente tiene un tumor ulcerado que llega hasta los huesos de la base del craneo (figura 9a). Verificado por tomograffa axial computarizada (TAC) se observa cavidad en los huesos propios de la nariz y de la pared interna de la orbita, fetidez insoportable que sale por la fosa nasal izquierda y secrecion amarilla purulenta por el mismo sitio.

Debido a la extension de la lesion se decidio hacer un tratamiento combinado con quimioterapia sistemica con cisplatino a dosis de 6 ciclos con intervalos de 21 dfas y al mismo tiempo la formulacion (0.5 MUIIFN gamma y 10.0 MUI iFn alfa 2b/vial) infiltrada localmente 3 veces por semana por tres semanas.

Al cabo de la tercera aplicacion, ya se observaba respuesta parcial importante, que permitfa la abertura palpebral y la disminucion de la fetidez. Presentaba a la vez quemosis de moderada intensidad. Despues de un mes se aprecio respuesta clmica completa. Esta respuesta se mantiene hasta el fin de la quimioterapia. Los eventos adversos fueron pocos, algo de fiebre y escalofnos y dolor referido en el sitio de la cicatriz de la lesion. Un ano despues el paciente mantiene la respuesta clmica completa (figura 9b).

Ejemplo 11. Formulacion farmaceutica lfquida estable (1.4 x 106 UI de IFN gamma y 1.7 x 106 UI de IFN alfa 2b por vial).

Composicion: IFN gamma 2.8 x 108 UI, IFN alfa 2b 3.4 x 108 UI, acetato de sodio 0.708 g, acido acetico 0.079 mL, Tween 20 0.01 g, manitol 5 g, agua para cantidad suficiente de inyeccion para 100 mL.

Todos los componentes excepto los interferones fueron medidos y suspendidos con agua para inyeccion. El pH de la solucion es chequeado y, si es necesario, ajustado al valor de 5.5 ± 0.2 con acido acetico diluido (1:2) o con 1 M de NaOH. Los ingredientes farmaceuticos activos de IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes fueron adicionados y diluidos hasta la concentracion apropiada.

La solucion fue filtrada en condicion esteril. Los viales fueron llenados con la formulacion y cubiertos y sellados en un area clase 100. Finalmente el producto es almacenado entre 2 y 8°C. Se tomaron varias muestras de la formulacion fabricada y se almacenaron a 8 °C y 2 °C por un penodo de seis meses.

A determinados intervalos de tiempo se tomaron muestras y se analizo el contenido de humedad residual del producto, el contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b (por ELlSA), la actividad biologica, la pureza por RP-HPLC y la apariencia del producto liofilizado asf como reconstituido. Los resultados son presentados en la tabla 14.

Tabla 14. Datos de pH del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, la actividad biologica y pureza por RP- HPLC. Temperatura 5°C. FORMULACiON LfQUIDA: 1.4 MUI IFN gamma y 1.7 MUI IFN alfa 2b/vial.

Tiempo (mes)

pH ELISA Actividad Pureza RP-HPLC Descripcion

IFNy (Mg/vial*)

IFNa (Mg/vial*) Antiviral UI/vial* Total (%) IFNy (%) IFNa (%)

Inicial

5.58 305.2 24.9 3.66 96.9 88.1 8.8 STI

1

5.43 279.1 21.2 3.21 97.2 87.9 9.3 STI

3

5.56 285.4 20.7 2.47 95.8 89.7 7.1 STI

6

5.45 293.0 23.9 3.39 95.5 88.1 8.4 STI

* El volumen llenado fue de 0.5 mL/vial; STI: liofilizado blanco uniforme; despues de reconstitucion, una solucion transparente incolora, esencialmente libre de particulas._____________________________________________

Ejemplo 12. Formulacion Uquida (0.5 x 106 UI de IFN gamma y 3.0 x 106 UI de IFN alfa 2b por vial).

Composicion: IFN gamma 2.0 x 108 UI, IFN alfa 2b 12.0 x 108 UI, acetato de sodio 0.708 g, acido acetico 0.079 mL, Tween 20 0.01 g, manitol 5 g, agua para cantidad suficiente de inyeccion para 100 mL.

5 El metodo de preparacion fue el mismo que se describio en la Formulacion liofilizada del ejemplo 11.

A determinados intervalos de tiempo se tomaron muestras y se analizo el contenido de humedad residual del producto, el contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b (por ELlSA), la actividad biologica, la pureza por RPHPLC y la apariencia del producto liofilizado asf como del mismo reconstituido. Los resultados son presentados en la tabla 15.

Tabla 15. Datos de pH del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, la actividad biologica y pureza por RP- 10 HPLC. Temperatura 5°C. FORMULACiON LfQUIDA: 0.5 MUI IFN gamma y 3.0 MUI IFN alfa 2b/vial.

Tiempo (mes)

pH ELISA Actividad Pureza RP-HPLC Descripcion

IFNy (Mg/vial*)

IFNa (Mg/vial*) Antiviral UI/vial* Total (%) IFNy (%) IFNa (%)

Inicial

5.55 109.4 38.2 4.25 97.6 58.3 29.3 STI

1

5.37 103.7 39.5 2.73 97.1 59.8 27.3 STI

3

5.49 95.0 42.9 3.35 97.3 70.2 27.1 STI

6

5.58 94.9 36.2 3.91 96.8 58.5 28.3 STI

* El volumen llenado fue de 0.5 mL/vial; STI: liofilizado blanco uniforme; despues de reconstitucion, una solucion transparente incolora, esencialmente libre de particulas._____________________________________________

Ejemplo 13. Formulacion farmaceutica lfquida estable (0.5 x 106 UI de IFN gamma y 10 x 106 UI de IFN alfa 2b por vial).

Composicion: IFN gamma 2.0 x 108 UI, IFN alfa 2b 40 x 108 UI, acetato de sodio 0.708 g, acido acetico 0.079 mL, Tween 20 0.01 g, manitol 5 g, agua para cantidad suficiente de inyeccion para 100 mL.

15 El metodo de preparacion fue el mismo que se describio en la formulacion liofilizada del ejemplo 11.

A determinados intervalos de tiempo se tomaron muestras y se analizo el contenido de humedad residual del producto, el contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b (por ELlSA), la actividad biologica, la pureza por RP-HPLC y la apariencia del producto liofilizado asf como del mismo reconstituido. Los resultados son presentados en la tabla 6.

Tabla 16. Datos de pH del producto, contenido de IFN gamma e IFN alfa 2b, la actividad biologica y pureza por RP- 20 HPLC. Temperatura 5°C. FORMULACION LfQUIDA: 0.5 MUI IFN gamma y 10.0 MUI IFN alfa 2b/vial.

Tiempo (mes)

pH ELISA Actividad Pureza RP-HPLC Descripcion

IFNy (Mg/vial*)

IFNa (Mg/vial*) Antiviral UI/vial* Total (%) IFNy (%) IFNa (%)

Inicial

5.53 91.9 138.2 12.41 98.0 39.1 58.9 STI

1

5.57 93.7 121.5 8.73 97.5 41.7 55.9 STI

3

5.49 105.0 142.9 9.46 95.8 38.2 58.6 STI

6

5.51 99.8 134.7 10.93 97.5 42.5 42.5 STI

* El volumen llenado fue de 0.5 mL/vial; STI: liofilizado blanco uniforme; despues de reconstitucion, una solucion transparente incolora, esencialmente libre de particulas._____________________________________________

Ejemplo 14. Formulacion farmaceutica semisolida (0.16 x 106 UI de IFN gamma y 1.0 x 106 UI de IFN alfa 2b por gramo de semisolido.

5

10

15

20

25

Formulacion farmaceutica para la aplicacion topica, preferiblemente en forma de crema, unguento o jalea. La preparacion farmaceutica contiene interferon gamma e interferon alfa 2 recombinantes como principio activo. La composicion es de 1.6 x 107 UI de IFN gamma y de 1 x 108 UI de IFN alfa 2b, cantidad suficiente para 100 gramos de semisolido.

Preparacion de crema: Para preparar la crema se funde la vaselina solida y el alcohol cetflico a 75 °C y se mezclan con constante agitacion, se mantiene hasta el final del proceso. Una vez homogeneizada, a la mezcla se incorpora Tween 60. Por otro lado se disuelve el metil y el propil parabeno en agua a 90 °C y se incorpora a la mezcla anterior cuando la temperatura haya disminuido hasta 75 °C. A continuacion la emulsion es enfriada lentamente hasta 37 °C y se incorpora la solucion acuosa que contiene el IFN gamma e IFN alfa 2b recombinantes. La crema resultante es almacenada a 4 °C en tubos de 15 g (ver tabla 17).

Tabla 17. Ingredientes de la formulacion de la crema.

Ingredientes

%

IFNy

2.2

IFN-a 2b

0.58

Alcohol cetflico

4

Vaselina

10

Tween 60

2

Metil parabeno, propil parabeno

0,2

Agua destilada c.s.p

81.2

Preparacion de unguento: En un recipiente se disuelven los parabenos en el agua a 90 °C y se deja enfriar hasta 37 °C. En otro recipiente se mezcla el petrolato lfquido y el Span 20 con constante agitacion. A continuacion, se mezcla el contenido de ambos recipientes y cuando la temperatura haya disminuido por debajo de los 37°C se incorpora el IFN gamma y el IFN alfa 2b recombinantes, manteniendo la agitacion constante. Luego se incorpora el petrolato blanco hasta lograr una homogeneizacion. El unguento resultante es almacenado a 4° e en tubos de 15 g (ver tabla 18).

Tabla 18. Ingredientes de la formulacion del unguento.

Ingredientes

%

IFNy

2.2

IFN-a2b

0.58

Petrolato Solido Blanco

60

Petrolato lfquido pesado

10

Span 20

3

Metil y propil parabeno

0.2

Agua destilada c.s.p

24.02

Preparacion de gel: el EDTA, los para vinos y el alcohol se disuelven en recipientes separados y luego se anade el propilenglicol. Luego se mezclan estas soluciones con agitacion constante y se incorpora lentamente el carbopol 940 con agitacion vigorosa hasta obtener una dispersion turbia sin presencia de grumos. Se prepara aparte, en un recipiente adecuado una solucion de hidroxido de sodio de 1 N y se adiciona lentamente con agitacion a la dispersion que contiene el resto de los componentes de la formulacion. A continuacion se incorporan el IFN gamma y el lFN alfa 2b con agitacion suave. Una vez formado el gel se envasa en tubos de 15 g a 4°C (ver tabla 19).

Tabla 19. Ingredientes de la formulacion de gel.

Ingredientes

%

IFNy

2.2

IFNa 2b

0.58

Carbopol 940

0.5

Propilenglicol

10

Metilparabeno y Propilparabeno

0.2

Hidroxido de sodio

0.2

Etilendiaminotetraacetato calcico disodico (EDTA)

0.01

Etanol

2

Agua destilada c.s.p

84.31

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   Reivindicaciones

   1. Una formulacion farmaceutica estabilizada que comprende diferentes cantidades de interferones gamma y alfa recombinantes en proporciones sinergicas, en la cual dichas proporciones sinergicas comprenden IFN gamma recombinante en un intervalo de concentracion entre 5.6 x 106 Ul/ml y 1.4 x 106 Ul/ml e IFN alfa 2 recombinante en un intervalo de concentracion entre 6.8 x 106 Ul/ml y 1.7 x 106 Ul/ml, o IFN gamma recombinante en un intervalo de concentracion entre 2.0 x 106 Ul/ml y 0.5 x 106 Ul/ml e IFN alfa 2 recombinante en un intervalo de concentracion entre
2. 12.0 x 106 Ul/ml y 3.0 x 106 Ul/ml, o IFN gamma recombinante en un intervalo de concentracion entre 4.0 x 106 Ul/ml y

   1.0 x 106 Ul/ml e IFN alfa 2 recombinante en un intervalo de concentracion entre 80 x 106 Ul/ml y 20 x 106 Ul/ml, y dicha formulacion comprende ademas un compuesto de azucar no reductor seleccionado del grupo que consiste en sacarosa y trehalosa; y una solucion reguladora de pH que mantiene el pH de la formulacion entre 4.9 y 7.5, la solucion reguladora de pH se selecciona del grupo que consiste en acetato de amonio o de sodio, succinato de sodio, fosfato de sodio y/o de potasio y citrato/fosfato de sodio; y dicha formulacion comprende ademas excipientes o vehfculos farmaceuticamente aceptables, para uso en el tratamiento de eventos patologicos caracterizados por crecimiento celular benigno no fisiologico o maligno de tejidos u organos, y en cuyo caso dicha formulacion se encuentra en forma liofilizada y para administracion parenteral.
3. 2. Una formulacion farmaceutica estabilizada para uso segun la reivindicacion 1 y dicha formulacion comprende ademas, en calidad de aminoacidos, glicina, histidina o leucina; en calidad de surfactantes, polisorbato 20 o polisorbato 80 y en calidad de polfmero estabilizador, polietilenglicol o dextrano o almidon de hidroxietilo.
4. 3. La formulacion farmaceutica estabilizada para uso segun la reivindicacion 2, en la cual la solucion reguladora de pH se emplea en un intervalo de concentracion entre 10 y 20 mM; en la cual la sacarosa o trehalosa se emplea en un intervalo de concentracion entre 5 y 100 mg/mL; en la cual la glicina, histidina o leucina se emplean en un intervalo de concentracion entre 1 y 20 mg/mL; en la cual el polisorbato se emplea en un intervalo de concentracion entre 0.01 y 1 mg/mL y en la cual el polietilenglicol, el dextrano o el almidon de hidroxietilo se emplean en un intervalo de concentracion entre 5 y 50 mg/mL.
5. 4. La formulacion farmaceutica estabilizada para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la cual dicha formulacion es para uso en el tratamiento de tumores solidos malignos o benignos, y en cuyo caso la formulacion es para emplearse independientemente o en una combinacion con quimioterapia, radioterapia o las combinaciones de ambas.
6. 5. La formulacion farmaceutica estabilizada para uso segun la reivindicacion 4, en cuyo caso dicha formulaciones para uso en el tratamiento de carcinoma de laringe, papilomatosis de laringe, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide cronica, leucemia aguda linfodtica, leucemia linfodtica cronica, leucemia de celulas T, leucemia de celulas B, linfoma del sistema nervioso central, lipoma, quiste epidermoide, quiste intradermico, liposarcoma, neurofibroma, hiperplasia sebacea, hemangioma cavernosa, adenoma hepatocelular, hiperplasia nodular focal, astrocitoma, glioblastoma multiforme, ependimoma, ganglioneuroma, astrocitoma pilodtico juvenil, gliomas mezclados, oligodendrogliomas, glioma de nervio optico, craniofaringioma, meduloblastoma; meningioma, tumor pineal, adenoma pituitario, tumores neuroectodermicos primitivos, neuroma acustico, tumores vasculares, carcinomatosis menmgeo, neurofibromatosis, pseudotumores de cerebro, esclerosis tuberosa, tumores metastasicos de cerebro, angiomas conforma de cereza, hiperplasia de glandula sebacea, carcinoma basocelular, carcinoma de celulas escamosas, dermatofibroma, granuloma piogenica, nevus dermico, queratosis seborreica, queratosis actmica.
7. 6. La formulacion farmaceutica estabilizada para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en cuyo caso dicha formulaciones para uso en el tratamiento de eventos proliferativos como fibrosis, displasias, e hiperplasias.
8. 7. La formulacion farmaceutica estabilizada para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en cuyo caso dicha formulacion es para aplicacion intramuscular, intratumoral o perilesional.