ES2344729T3 - Interleuquina 2 estabilizada. - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica liofilizada estable que comprende una muteína de interleuquina-2 (IL-2) humana estabilizada con histidina, en la que la muteína de IL-2 posee una única sustitución de aminoácido: N88R.

Description

Interleuquina 2 estabilizada.
Antecedentes de la invención Campo
La invención en general se refiere al campo de las formulaciones farmacéuticas. Más específicamente, la invención se refiere a una formulación de interleuquina-2 terapéuticamente activa estabilizada capaz de activar selectivamente células T (blastos PHA) y que incluye, muy preferentemente, una luteína de IL-2 que exhibe una reducida activación de las células Citolíticas Naturales ("NK"). Las composiciones estabilizadas que poseen las propiedades preferentes incluyen variantes de la IL-2 descritas más abajo.
Antecedentes
Según se trata en una solicitud relacionada, la PCT/US 99/10643 publicada el 25 de noviembre de 1999, la Interleuquina 2 (IL-2) es un potente estimulador inmunitario, que activa diversas células del sistema inmunitario, incluyendo células T, B y monocitos. IL-2 es también un potente y crítico factor de crecimiento de células T. Fue en virtud de estas actividades que se ensayó IL-2 en cuanto a su capacidad para tratar el cáncer. La IL-2 humana es un fármaco aprobado por la FDA para el tratamiento de carcinoma renal metastásico y melanoma metastásico. El uso de IL-2 en pacientes que reúnen los requisitos necesarios está restringido debido a la grave toxicidad asociada con la terapia con IL-2; se estima que como mucho sólo el 20% de los pacientes que reúnen los requisitos necesarios reciben en realidad la terapia. Las toxicidades asociadas con la terapia con IL-2 incluyen fiebre severa, náuseas, vómitos, extravasación vascular y grave hipotensión. A pesar de estas toxicidades, sin embargo, IL-2 es efectiva para las indicaciones aprobadas. Las variantes de IL-2 que poseen toxicidad reducida son el objeto de la solicitud WO 99/60128.
Se dispone de información importante sobre la estabilización de IL-2 y otras formulaciones terapéuticas proteicas. La preparación de IL-2 humana actualmente aprobada (Proleukin® IL-2, Chiron Corporation) es una preparación liofilizada que incluye manitol, dodecil sulfato de sodio (SDS) y un tampón de fosfato. Otras proteínas terapéuticas formuladas, que incluyen a IL-2, se describen en las siguientes referencias.
Fernandes et al., 1986, Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 (Patente Estadounidense Núm. 4.604.377) describe una formulación liofilizada que contiene un estabilizador (manitol) y un agente solubilizante tal como dodecil sulfato de sodio o desoxicolato sulfato de sodio a razón de aproximadamente 100 a aproximadamente 250 ug por mg de IL-2. Se cree que en esta referencia se describe la formulación para el producto actualmente disponible Proleukin® IL-2.
Patel, 1994 Stabilization of protein formulations (Patente Estadounidense Núm. 5.358.708) describe formulaciones acuosas de un interferón, un factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos o una interleuquina que poseen vidas útiles extendidas incorporando metionina, histidina o mezclas de las mismas. Aunque se hace referencia a varias interleuquinas, incluyendo IL-2, en el trabajo realizado con una formulación de IL-4 los patentadores descubrieron que la histidina es menos efectiva como estabilizador que la metionina, en las condiciones del ensayo de estabilizador utilizado.
Shaked, et al., 1991, Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation processes (Patente Estadounidense Núm. 5.037.644) describe formulaciones que están en forma liofilizada o líquida. Los excipientes de la formulación incluyen un detergente polimérico no iónico tal como Triton X405, Triton X305, monoestearato de PEG (4000), Tween 80 y Tween 20 en concentraciones de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 5%, un agente expansor de volumen/estabilizante tal como sacarosa, fructosa, dextrosa, maltosa, glucosa, dextrano, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, xilitol, lactosa, trehalosa, albúmina de suero humano y albúmina de suero bovino, y un agente tampón tal como glicina, citrato o fosfato en un intervalo de concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM con un pH que varía de aproximadamente 3 a aproximadamente 7. La concentración (peso/vol) del agente expansor de volumen azúcar-poliol varía de aproximadamente 0,025% a aproximadamente 10%.
Roskam et al., 1995, Drugs containing a glycosylated interleukin-2 (Patente Estadounidense Núm. 5.417.970) describe una formulación liofilizada que contiene gelatina (o albúmina de suero humano) hidrolizada y alanina con un pH 6,5.
Hora et al., 1992, Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers (Patente Estadounidense Núm. 5.078.997) describe formulaciones que son líquidas o liofilizadas. Las formulaciones pueden contener uno o una combinación de estabilizadores tales como arginina, carnitina, betaína, piridoxina, polivinilpirrolidona, sales del ácido cáprico, azúcares, azúcar-alcoholes, albúmina de suero y citrato en tampón de pH 5,0-8,5. La concentración de los estabilizadores está entre 0,2 y 3,0% (p/v) para arginina, entre 0,2 y 3,0% (p/v) para carnitina, entre 2 y 6% (p/v) para sacarosa y entre 0,01 y 0,3 M para citrato.
Yasushi et al., 1987 Stable composition of interleukin-2 and albumin (Patente Estadounidense Núm. 4.645.830) describe una formulación acuosa estable que contiene albúmina de suero humano (0,1-50 mg/ml) con o sin un excipiente reductor tal como glutatión, ácido tióctico, N-acetilcisteína o ácido ascórbico (concentración de 0,05-20 mg/ml) a pH entre 3 y 5,5. La formulación de albúmina puede contener un aminoácido monoaminoalifático, un aminoácido cíclico, un monosacárido, un azúcar-alcohol o un aminoácido monoaminoalifático (concentración de 5 a 50 mg/ml).
Lee et al., 1989 Pharmaceutical plasma protein formulations in low ionic strength media; sodium chloride and/or potassium chloride, lysine hydrochloride, and histidine (Patente Estadounidense Núm. 4.877.608) describe el factor VIII estable y otras formulaciones de proteínas plasmáticas en medios de baja fuerza iónica que comprenden: cloruro de sodio, cloruro de potasio o mezclas de los mismos, clorhidrato de lisina, e histidina como agente tampón.
Nayar, 1998 stabilized albumin-free recombinant Factor VIII preparation having a low sugar content (Patente Estadounidense Núm. 5.763.401 y 5.874.408) describe una formulación FVIII estabilizada libre de albúmina que incluye glicina, histidina, sacarosa y NaCl.
Thatcher, 1987 interleukin-2 compositions (Solicitud de patente EP Núm. 0 229 016) desvela composiciones que contienen IL-2 natural o su equivalente recombinante estabilizada por albúmina sérica.
Lihsyng, 1999 stabilized monomeric protein compositions (Patente Estadounidense Núm. 5.917.021) se refiere a una composición de proteína en un estado acuoso congelado.
En el intento por descubrir una formulación de IL-2 estable (especialmente para la muteína de IL-2 preferente (N88R) del documento WO 99/60128), ahora hemos descubierto una formulación farmacéuticamente aceptable y muy estable para la IL-2 humana útil y biológicamente activa. Nuestro descubrimiento se basa en abordar lo que creemos es el mecanismo básico responsable de la estabilidad, según se describe más abajo.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un gráfico que ilustra el intervalo de pH óptimo para una solución acuosa de IL-2.
La Figura 2 compara el efecto estabilizador de la histidina respecto de acetato y citrato sobre la agregación de IL-2 inducida por calentamiento de la solución de proteína a razón de 1ºC/min desde 25ºC hasta 95ºC.
Sumario de la invención
La presente invención es una composición o formulación farmacéutica de una muteína de IL-2 estabilizada con histidina. Preferentemente, la composición comprende una mezcla que da como resultado una solución de baja fuerza iónica (por ejemplo <0,1) e incluye otros estabilizadores tales como azúcares y aminoácidos, preferentemente sacarosa y glicina. La formulación puede incluir de 0 a 0,9% en peso de NaCl. La composición es libre de albúmina y la formulación en forma liofilizada puede reconstituirse rápidamente (< 1 minuto) con agua. La composición se solubiliza en condiciones fisiológicamente aceptables de pH, preferentemente en un pH que varía de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5, sin utilizar tensioactivos tales como dodecil sulfato de sodio. La solución reconstituida está ceca de la isotonicidad y puede administrarse por vía subcutánea y por vía intravenosa. La IL-2 de la composición es la muteína que posee una única sustitución de aminoácido, a saber la variante N88R descrita en el documento WO 99/60128.
Finalmente, se deseaba la formulación en una forma de dosificación liofilizada con estabilidad aceptable que pudiera liofilizarse fácilmente en los liofilizadores de producción.
Los estudios de estabilidad acuosa llevados a cabo durante las investigaciones de preformulación indicaron que la IL-2(N88R) se agrega fácilmente en el estado líquido y la agregación era dependiente del pH. Se realizaron dos estudios de estabilidad de la preformulación: un perfil de pH de IL-2(N88R) y estabilidad en presencia de diferentes excipientes de tampón. Los objetivos de estos estudios fueron identificar un intervalo apropiado de pH para IL-2(N88R) y un excipiente tampón apropiado para la estabilidad acuosa (potencial reducción de la agregación). Para generar el perfil de pH, se prepararon soluciones de IL-2 con diferentes condiciones de pH y se almacenaron en condiciones aceleradas de temperatura (40ºC). Se analizaron las muestras en diferentes intervalos de tiempo y se calcularon las velocidades de agregación. Según se muestra en la Figura 1, se identificó el intervalo de pH óptimo para bajas velocidades de agregación entre pH 5,0 y 6,5. Se identificaron la histidina, acetato y citrato como agentes tampón farmacéuticos para IL-2(N88R) en este intervalo de pH y se evaluaron a una concentración de 20 mM en soluciones de IL-2 (N88R) que contenían 1 mg/ml de IL-2 (N88R) y NaCl 150 mM (0,9% en peso). Estas muestras se calentaron desde 25ºC hasta 95ºC a razón de 1ºC por minuto y se monitoreó la precipitación mediante espectrofotometría UV a 350 nm. Tal como se muestra en la figura 2, para sorpresa nuestra, la histidina estabilizó significativamente la IL-2(N88R) por encima de los otros excipientes tampones a pH 5,5 según lo indicado por un incremento en las temperatura de inicio de la precipitación. Las temperaturas de inicio en presencia de citrato, acetato e histidina fueron 62ºC, 64ºC y 70ºC, respectivamente. Estudios tales como estos demostraron que la histidina podría utilizarse no sólo como agente tampón sino también como estabilizador para IL-2 en condiciones acuosas.
Para el desarrollo de una forma de dosificación liofilizada, se investigaron otros excipientes que son utilizados por aquellos familiarizados con la técnica. Estos incluyeron agentes expansores de volumen y crioprotectores tales como glicina, sacarosa y manitol. También se evaluaron dos tensioactivos como estabilizadores para IL-2(N88R), ya que la agregación fue uno de los mecanismos de inestabilidad para la molécula durante los estudios de estabilidad acuosa. Los resultados de estos estudios se resumen en los ejemplos a continuación. Estos muestran que, para nuestra sorpresa, la histidina posee efectos estabilizantes selectivos sobre IL-2 por encima de otros excipientes, tales como, por ejemplo, citrato.
Ejemplo 1
Se examinó la estabilidad de IL-2(N88R) líquida a diferentes valores de pH a 40ºC. Los resultados mostraron que la velocidad de precipitación de IL-2(N88R) fue la más baja entre pH 5,0 a 6,5 (Figura 1). Por ello, se eligió el pH 5,5 como el pH de formulación óptimo en estado líquido y para la preparación de formulaciones liofilizadas.
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Ejemplo 2
Examinamos el efecto potencial de diferentes agentes tampón sobre la estabilidad de IL-2(N88R). Los agentes tampón que examinamos incluyeron citrato, acetato e histidina. Estos agentes tampón se utilizaron a la concentración 20 mM en soluciones de IL-2(N88R) que contenían 1 mg/ml de IL-2(N88R) y NaCl 150 mM (0,9% en peso). Estas muestras de estabilidad se calentaron desde 25ºC hasta 95ºC a razón de 1ºC por minuto mientras se monitoreaban mediante espectrofotometría UV/VIS. La histidina estabilizó significativamente la IL-2(N88R) incrementando la temperatura de precipitación y reduciendo la velocidad de precipitación en comparación con el acetato y citrato (Figura 2). La Tabla 1 muestra las temperaturas de inicio de la precipitación de IL-2(N88R) en presencia de estos tres agentes tampón. Se definió arbitrariamente la temperatura de inicio de la precipitación como la temperatura en la que la densidad óptica a 350 nm (DO_{350}) alcanza un cierto nivel (0,2 y 1,0 en el caso de DO_{350}). La temperatura de precipitación de IL-2(N88R) en presencia de histidina fue varios grados superior a aquellas en presencia de los otros dos agente tampón. Este ejemplo demostró que la histidina puede ser un estabilizador específico además de ser utilizado como agente tampón para IL-2(N88R) en estado líquido.
TABLA 1 Temperatura de precipitación (DO_{350}=0,2 y DO_{350}=1,0) de IL-2(N88R) en Diferentes Tampones
1
Ejemplo 3
En un esfuerzo por evaluar adicionalmente el efecto estabilizante de la histidina, se preparó IL-2(N88R) liofilizada a partir de diferentes formulaciones acuosas (véase la Tabla 2). La mayoría de las formulaciones contenían 2% en peso de glicina como agente expansor de volumen y 1% en peso de sacarosa como estabilizador. Se utilizó manitol al 5% en peso en una formulación como comparador frente a Proleukin®, un producto comercializado de IL-2. Se evaluaron dos tensioactivos, Tween 80 y Pluronic F68 ambos al 0,1% en peso, en cuanto a la prevención de la adsorción superficial y la agregación de la proteína. Todas las formulaciones contenían histidina o citrato como agente tampón con un pH ajustado en 5,5. Se incluyó citrato para distinguir el efecto estabilizante de la histidina del propio del citrato a pH 5,5. Estas formulaciones liofilizadas se almacenaron a 40ºC y se analizaron mediante una cantidad de procedimientos analíticos que incluyeron espectrofotometría UV/VIS, SEC-HPLC y RP-HPLC.
La Tabla 3 muestra la estabilidad de IL-2(N88R) en un número de formulaciones evaluadas mediante espectrofotometría UV/VIS en cuanto a la agregación, cantidad de agregados solubles mediante HPLC de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) y recuperación porcentual de la proteína mediante HPLC de fase reversa (RP-HPLC). Se analizaron las muestras después de la liofilización y se almacenaron a una temperatura de almacenamiento acelerada de 40ºC durante cuatro meses. El proceso de liofilización no cambió el índice neto de agregación de IL-2(N88R) desde el estado previo a la liofilización, sugiriendo que IL-2(N88R) toleró el proceso de liofilización con respecto a la agregación/precipitación de la proteína. Después del almacenamiento a 40ºC durante cuatro meses, se observó un importante incremento en el índice neto de agregación para la formulación que contenía citrato (B), Pluronic F-68 (D) o manitol (E). Estos resultados indicaron que la inclusión de citrato o manitol, Tween-80 o Pluronic F-68 no ofreció ninguna protección de la agregación de IL-2(N88R) en el estado sólido durante el almacenamiento. Las formulaciones A y F no mostraron un cambio importante en el índice de agregación, sugiriendo que la inclusión de histidina, glicina y sacarosa a razón de 1 o 5 mg/ml de IL-2(N88R) dio como resultado un producto estable.
Sin embargo, se encontraron cantidades considerables de agregados solubles en la formulación que contenía Tween-80 aún antes de la liofilización (Tabla 3), indicando que Tween-80 promueve la formación de agregados solubles de IL-2(N88R), aunque puede inhibirse la formación de agregados insolubles. Debido a que Pluronic F-68 (formulación D) también causó formación considerable de agregados solubles, los tensioactivos pueden no ser compatibles con IL-2(N88R). Solamente las formulaciones que contenían 2% de glicina, 1% de sacarosa e histidina 20 mM (0,31% en peso) (A, F) no mostraron ninguna formación detectable de agregados solubles después del almacenamiento de la formulación liofilizada a 40ºC durante cuatro meses, sugiriendo nuevamente que IL-2 (N88R) fue estabilizada por la histidina.
Se determinó la recuperación total de IL-2(N88R) soluble después de la liofilización y almacenamiento mediante RP-HPLC (Tabla 3). La recuperación de IL-2(N88R) después de la liofilización fue mayor que aproximadamente 96% para todas las formulaciones excepto para la formulación que contenía manitol. Después del almacenamiento de estas formulaciones a 40ºC durante 4 meses, se recuperó aproximadamente el 92% de IL-2(N88R) en las formulaciones A y F que contenían 2% de glicina, 1% de sacarosa e histidina 20 mM (0,31% en peso) que contenían 1 y 5 mg/ml de IL-2(N88R). Estos datos (más del 90% de recuperación de IL-2(N88R) para las formulaciones A y F) nuevamente sugieren que la histidina estabiliza a IL-2(N88R) mientras que los tensioactivos desestabilizan la proteína.
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TABLA 2 Composición de la Formulación Liofilizada de IL-2(N88R)
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TABLA 3 Estabilidad de IL-2 (N88R) durante la Liofilización y Almacenamiento de la Formulación Liofilizada a 40ºC durante 4 meses
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Ejemplo de referencia 4
También se liofilizó IL-2 de tipo salvaje a partir de una formulación acuosa de la misma composición que la formulación A. Los datos de estabilidad para la IL-2 de tipo salvaje a 40ºC fueron comparables con los de IL-2(N88R) (Tabla 4).
TABLA 4 Estabilidad de la formulación de IL-2 (N88R) de tipo salvaje durante la liofilización y almacenamiento de la Formulación Liofilizada
4
Discusión
La IL-2 humana posee 133 aminoácidos que forman seis estructuras helicoidales (A- F). Cuatro de estas hélices forman lo que se denomina un motivo tetrahelicoidal en manojo. La unión disulfuro intramolecular entre cys^{58} y cys^{105} está ubicada sobre los bucles extendidos entre las hélices. La cys^{125} libre está ubicada sobre la hélice F que incorpora los aminoácidos 117-133.
El hallazgo sorprendente de que la histidina es un estabilizador específico de IL-2 sugiere que la histidina puede interactuar con IL-2 en una forma específica que da como resultado la estabilización de la molécula en ambos estados acuoso y liofilizado. Uno de los mecanismos importantes de inestabilidad de IL-2 es la agregación que resulta de la formación de oligómeros debido a las reacciones de intercambio tiol-disulfuro. Por lo tanto, puede llegarse a la hipótesis de que la histidina en realidad puede inhibir o reducir las reacciones de intercambio tiol-disulfuro en IL-2. Debido a que la IL-2 de tipo salvaje, IL-2(N88R) y posiblemente otras moléculas variantes de IL-2 poseen una unión disulfuro y una cisteína libre (Cys^{125}), el grupo SH libre sobre la Cys^{125} podría reaccionar fácilmente con la unión disulfuro a través del mecanismo de intercambio tiol/disulfuro dando como resultado de ese modo los eventos de agregación/precipitación.
El mecanismo de intercambio tiol/disulfuro ha sido descrito recientemente por Bulaj et al. (Ionization-reactivity relationships for cysteine thiols in polypeptides. Biochemistry 23 de junio de 1998; 37(25):8965-72). En estudios de péptidos y proteínas modelo, la velocidad de reacción ha demostrado ser sensible a las fuerzas electrostáticas así como a la estructura secundaria de las proteínas. La distribución de electrones alrededor de un átomo de azufre en un tiol puede estar influenciada por la presencia de las cargas cercanas y los efectos inductivos a través del enlace que pueden alterar el pK_{a} del tiol. Por ejemplo, la reactividad incrementada de los tioles en el intercambio tiol/disulfuro puede atribuirse a la reducción de su pK_{a} debido a la presencia de cargas cercanas positivas o contribuciones dipolares de péptido desde una estructura alfa-helicoidal cercana. En oposición, las cargas negativas cerca del grupo tiol pueden incrementar el pK_{a} del tiol y llevar a velocidades de reacción tiol/disulfuro inferiores. Este mecanismo propuesto también está respaldado por otros estudios, donde se ha demostrado la estabilización de los iones tiolato altamente reactivos por los residuos circundantes cargados positivamente para la proteína tirosina fosfatasa (Zhang y Dixon, 1993 Active site labeling of the Yersinia protein tyrosine phosphatase: the determination of the pKa of the active site cysteine and the function of the conserved histidine 402. Biochemistry 14 de septiembre de 1993; 32(36):9340-5) y la proteína disulfuro isomerasa (Kortemme et al., Electrostatic interactions in the active site of the N-terminal thioredoxin-like domain of protein disulfide isomerase. Biochemistry 19 de noviembre de 1996; 35(46):14503-11).
En base a estas propiedades de la reacción de intercambio tiol/disulfuro, puede preverse un mecanismo de estabilización donde la histidina desempeñe un papel cinético o termodinámico en la estabilización de IL-2(N88R). Existen cinco residuos de ácido glutámico (57, 60, 61, 62 y 106) cerca del puente disulfuro Cys^{58}-Cys^{105}. La unión específica de la histidina con estos residuos con carga negativa podría llevar a una barrera cinética para la reacción de intercambio tiol/disulfuro o la unión de la histidina cerca del puente disulfuro podría estabilizar termodinámicamente la molécula de IL-2 en una conformación que es menos propensa a reacciones de agregación. Además, las interacciones iónicas His-Glu también puede crear impedimento estérico que además reduciría la etapa determinante de la velocidad en el intercambio tiol/disulfuro que es la formación de un estado de transición intermedio entre los tres átomos de azufre involucrados. La accesibilidad de la histidina a los residuos de ácido glutámico se debe muy probablemente a que la unión disulfuro esta ubicada sobre un bucle extendido sobre la superficie de la proteína.

Claims (6)

1. Una composición farmacéutica liofilizada estable que comprende una muteína de interleuquina-2 (IL-2) humana estabilizada con histidina, en la que la muteína de IL-2 posee una única sustitución de aminoácido: N88R.
2. Una composición farmacéutica en forma acuosa estable que comprende una muteína de interleuquina-2 humana estabilizada con histidina, en la que la muteína de IL-2 posee una única sustitución de aminoácido N88R, que posee un pH que varía desde aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5.
3. La composición de la reivindicación 1 o 2 que incluye glicina.
4. La composición de la reivindicación 1 o 2 que incluye sacarosa.
5. La composición de la reivindicación 1 o 2 que incluye glicina y sacarosa.
6. Una composición liofilizada estable que, tras la reconstitución acuosa, comprende lo siguiente:
IL-2
0,1-5 mg/ml
Histidina
0,08-1,6% en peso
NaCl
0-0,9% en peso
Sacarosa
1-10% en peso y
Glicina
0-3% en peso a un
pH de
5 a 6,5,
en la que IL-2 es una muteína que posee una única sustitución de aminoácido: N88R.
ES01952296T 2000-06-28 2001-06-27 Interleuquina 2 estabilizada. Expired - Lifetime ES2344729T3 (es)

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US605577 2000-06-28
US09/605,577 US6689353B1 (en) 2000-06-28 2000-06-28 Stabilized interleukin 2

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