ES2344729T3 - Interleuquina 2 estabilizada. - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica liofilizada estable que comprende una muteína de interleuquina-2 (IL-2) humana estabilizada con histidina, en la que la muteína de IL-2 posee una única sustitución de aminoácido: N88R.
Description
Interleuquina 2 estabilizada.
La invención en general se refiere al campo de
las formulaciones farmacéuticas. Más específicamente, la invención
se refiere a una formulación de interleuquina-2
terapéuticamente activa estabilizada capaz de activar
selectivamente células T (blastos PHA) y que incluye, muy
preferentemente, una luteína de IL-2 que exhibe una
reducida activación de las células Citolíticas Naturales
("NK"). Las composiciones estabilizadas que poseen las
propiedades preferentes incluyen variantes de la
IL-2 descritas más abajo.
Según se trata en una solicitud relacionada, la
PCT/US 99/10643 publicada el 25 de noviembre de 1999, la
Interleuquina 2 (IL-2) es un potente estimulador
inmunitario, que activa diversas células del sistema inmunitario,
incluyendo células T, B y monocitos. IL-2 es también
un potente y crítico factor de crecimiento de células T. Fue en
virtud de estas actividades que se ensayó IL-2 en
cuanto a su capacidad para tratar el cáncer. La
IL-2 humana es un fármaco aprobado por la FDA para
el tratamiento de carcinoma renal metastásico y melanoma
metastásico. El uso de IL-2 en pacientes que reúnen
los requisitos necesarios está restringido debido a la grave
toxicidad asociada con la terapia con IL-2; se
estima que como mucho sólo el 20% de los pacientes que reúnen los
requisitos necesarios reciben en realidad la terapia. Las
toxicidades asociadas con la terapia con IL-2
incluyen fiebre severa, náuseas, vómitos, extravasación vascular y
grave hipotensión. A pesar de estas toxicidades, sin embargo,
IL-2 es efectiva para las indicaciones aprobadas.
Las variantes de IL-2 que poseen toxicidad reducida
son el objeto de la solicitud WO 99/60128.
Se dispone de información importante sobre la
estabilización de IL-2 y otras formulaciones
terapéuticas proteicas. La preparación de IL-2
humana actualmente aprobada (Proleukin® IL-2, Chiron
Corporation) es una preparación liofilizada que incluye manitol,
dodecil sulfato de sodio (SDS) y un tampón de fosfato. Otras
proteínas terapéuticas formuladas, que incluyen a
IL-2, se describen en las siguientes
referencias.
Fernandes et al., 1986, Pharmaceutical
compositions of microbially produced
interleukin-2 (Patente Estadounidense Núm.
4.604.377) describe una formulación liofilizada que contiene un
estabilizador (manitol) y un agente solubilizante tal como dodecil
sulfato de sodio o desoxicolato sulfato de sodio a razón de
aproximadamente 100 a aproximadamente 250 ug por mg de
IL-2. Se cree que en esta referencia se describe la
formulación para el producto actualmente disponible Proleukin®
IL-2.
Patel, 1994 Stabilization of protein
formulations (Patente Estadounidense Núm. 5.358.708) describe
formulaciones acuosas de un interferón, un factor estimulante de
colonias de macrófagos y granulocitos o una interleuquina que
poseen vidas útiles extendidas incorporando metionina, histidina o
mezclas de las mismas. Aunque se hace referencia a varias
interleuquinas, incluyendo IL-2, en el trabajo
realizado con una formulación de IL-4 los
patentadores descubrieron que la histidina es menos efectiva como
estabilizador que la metionina, en las condiciones del ensayo de
estabilizador utilizado.
Shaked, et al., 1991, Pharmaceutical
compositions of recombinant interleukin-2 and
formulation processes (Patente Estadounidense Núm. 5.037.644)
describe formulaciones que están en forma liofilizada o líquida. Los
excipientes de la formulación incluyen un detergente polimérico no
iónico tal como Triton X405, Triton X305, monoestearato de PEG
(4000), Tween 80 y Tween 20 en concentraciones de aproximadamente
0,001% a aproximadamente 5%, un agente expansor de
volumen/estabilizante tal como sacarosa, fructosa, dextrosa,
maltosa, glucosa, dextrano, manitol, sorbitol, inositol,
galactitol, xilitol, lactosa, trehalosa, albúmina de suero humano y
albúmina de suero bovino, y un agente tampón tal como glicina,
citrato o fosfato en un intervalo de concentración de
aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM con un pH que varía
de aproximadamente 3 a aproximadamente 7. La concentración
(peso/vol) del agente expansor de volumen
azúcar-poliol varía de aproximadamente 0,025% a
aproximadamente 10%.
Roskam et al., 1995, Drugs containing a
glycosylated interleukin-2 (Patente
Estadounidense Núm. 5.417.970) describe una formulación liofilizada
que contiene gelatina (o albúmina de suero humano) hidrolizada y
alanina con un pH 6,5.
Hora et al., 1992, Pharmaceutical composition
for interleukin-2 containing physiologically
compatible stabilizers (Patente Estadounidense Núm. 5.078.997)
describe formulaciones que son líquidas o liofilizadas. Las
formulaciones pueden contener uno o una combinación de
estabilizadores tales como arginina, carnitina, betaína, piridoxina,
polivinilpirrolidona, sales del ácido cáprico, azúcares,
azúcar-alcoholes, albúmina de suero y citrato en
tampón de pH 5,0-8,5. La concentración de los
estabilizadores está entre 0,2 y 3,0% (p/v) para arginina, entre
0,2 y 3,0% (p/v) para carnitina, entre 2 y 6% (p/v) para sacarosa y
entre 0,01 y 0,3 M para citrato.
Yasushi et al., 1987 Stable composition of
interleukin-2 and albumin (Patente
Estadounidense Núm. 4.645.830) describe una formulación acuosa
estable que contiene albúmina de suero humano
(0,1-50 mg/ml) con o sin un excipiente reductor tal
como glutatión, ácido tióctico, N-acetilcisteína o
ácido ascórbico (concentración de 0,05-20 mg/ml) a
pH entre 3 y 5,5. La formulación de albúmina puede contener un
aminoácido monoaminoalifático, un aminoácido cíclico, un
monosacárido, un azúcar-alcohol o un aminoácido
monoaminoalifático (concentración de 5 a 50 mg/ml).
Lee et al., 1989 Pharmaceutical plasma
protein formulations in low ionic strength media; sodium chloride
and/or potassium chloride, lysine hydrochloride, and histidine
(Patente Estadounidense Núm. 4.877.608) describe el factor VIII
estable y otras formulaciones de proteínas plasmáticas en medios de
baja fuerza iónica que comprenden: cloruro de sodio, cloruro de
potasio o mezclas de los mismos, clorhidrato de lisina, e histidina
como agente tampón.
Nayar, 1998 stabilized
albumin-free recombinant Factor VIII preparation
having a low sugar content (Patente Estadounidense Núm.
5.763.401 y 5.874.408) describe una formulación FVIII estabilizada
libre de albúmina que incluye glicina, histidina, sacarosa y
NaCl.
Thatcher, 1987 interleukin-2
compositions (Solicitud de patente EP Núm. 0 229 016) desvela
composiciones que contienen IL-2 natural o su
equivalente recombinante estabilizada por albúmina sérica.
Lihsyng, 1999 stabilized monomeric protein
compositions (Patente Estadounidense Núm. 5.917.021) se refiere
a una composición de proteína en un estado acuoso congelado.
En el intento por descubrir una formulación de
IL-2 estable (especialmente para la muteína de
IL-2 preferente (N88R) del documento WO 99/60128),
ahora hemos descubierto una formulación farmacéuticamente aceptable
y muy estable para la IL-2 humana útil y
biológicamente activa. Nuestro descubrimiento se basa en abordar lo
que creemos es el mecanismo básico responsable de la estabilidad,
según se describe más abajo.
La Figura 1 es un gráfico que ilustra el
intervalo de pH óptimo para una solución acuosa de
IL-2.
La Figura 2 compara el efecto estabilizador de
la histidina respecto de acetato y citrato sobre la agregación de
IL-2 inducida por calentamiento de la solución de
proteína a razón de 1ºC/min desde 25ºC hasta 95ºC.
La presente invención es una composición o
formulación farmacéutica de una muteína de IL-2
estabilizada con histidina. Preferentemente, la composición
comprende una mezcla que da como resultado una solución de baja
fuerza iónica (por ejemplo <0,1) e incluye otros estabilizadores
tales como azúcares y aminoácidos, preferentemente sacarosa y
glicina. La formulación puede incluir de 0 a 0,9% en peso de NaCl.
La composición es libre de albúmina y la formulación en forma
liofilizada puede reconstituirse rápidamente (< 1 minuto) con
agua. La composición se solubiliza en condiciones fisiológicamente
aceptables de pH, preferentemente en un pH que varía de
aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5, sin utilizar
tensioactivos tales como dodecil sulfato de sodio. La solución
reconstituida está ceca de la isotonicidad y puede administrarse
por vía subcutánea y por vía intravenosa. La IL-2 de
la composición es la muteína que posee una única sustitución de
aminoácido, a saber la variante N88R descrita en el documento WO
99/60128.
Finalmente, se deseaba la formulación en una
forma de dosificación liofilizada con estabilidad aceptable que
pudiera liofilizarse fácilmente en los liofilizadores de
producción.
Los estudios de estabilidad acuosa llevados a
cabo durante las investigaciones de preformulación indicaron que la
IL-2(N88R) se agrega fácilmente en el estado
líquido y la agregación era dependiente del pH. Se realizaron dos
estudios de estabilidad de la preformulación: un perfil de pH de
IL-2(N88R) y estabilidad en presencia de
diferentes excipientes de tampón. Los objetivos de estos estudios
fueron identificar un intervalo apropiado de pH para
IL-2(N88R) y un excipiente tampón apropiado
para la estabilidad acuosa (potencial reducción de la agregación).
Para generar el perfil de pH, se prepararon soluciones de
IL-2 con diferentes condiciones de pH y se
almacenaron en condiciones aceleradas de temperatura (40ºC). Se
analizaron las muestras en diferentes intervalos de tiempo y se
calcularon las velocidades de agregación. Según se muestra en la
Figura 1, se identificó el intervalo de pH óptimo para bajas
velocidades de agregación entre pH 5,0 y 6,5. Se identificaron la
histidina, acetato y citrato como agentes tampón farmacéuticos para
IL-2(N88R) en este intervalo de pH y se
evaluaron a una concentración de 20 mM en soluciones de
IL-2 (N88R) que contenían 1 mg/ml de
IL-2 (N88R) y NaCl 150 mM (0,9% en peso). Estas
muestras se calentaron desde 25ºC hasta 95ºC a razón de 1ºC por
minuto y se monitoreó la precipitación mediante espectrofotometría
UV a 350 nm. Tal como se muestra en la figura 2, para sorpresa
nuestra, la histidina estabilizó significativamente la
IL-2(N88R) por encima de los otros
excipientes tampones a pH 5,5 según lo indicado por un incremento
en las temperatura de inicio de la precipitación. Las temperaturas
de inicio en presencia de citrato, acetato e histidina fueron 62ºC,
64ºC y 70ºC, respectivamente. Estudios tales como estos demostraron
que la histidina podría utilizarse no sólo como agente tampón sino
también como estabilizador para IL-2 en condiciones
acuosas.
Para el desarrollo de una forma de dosificación
liofilizada, se investigaron otros excipientes que son utilizados
por aquellos familiarizados con la técnica. Estos incluyeron agentes
expansores de volumen y crioprotectores tales como glicina,
sacarosa y manitol. También se evaluaron dos tensioactivos como
estabilizadores para IL-2(N88R), ya que la
agregación fue uno de los mecanismos de inestabilidad para la
molécula durante los estudios de estabilidad acuosa. Los resultados
de estos estudios se resumen en los ejemplos a continuación. Estos
muestran que, para nuestra sorpresa, la histidina posee efectos
estabilizantes selectivos sobre IL-2 por encima de
otros excipientes, tales como, por ejemplo, citrato.
Se examinó la estabilidad de
IL-2(N88R) líquida a diferentes valores de pH
a 40ºC. Los resultados mostraron que la velocidad de precipitación
de IL-2(N88R) fue la más baja entre pH 5,0 a
6,5 (Figura 1). Por ello, se eligió el pH 5,5 como el pH de
formulación óptimo en estado líquido y para la preparación de
formulaciones liofilizadas.
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Examinamos el efecto potencial de diferentes
agentes tampón sobre la estabilidad de
IL-2(N88R). Los agentes tampón que
examinamos incluyeron citrato, acetato e histidina. Estos agentes
tampón se utilizaron a la concentración 20 mM en soluciones de
IL-2(N88R) que contenían 1 mg/ml de
IL-2(N88R) y NaCl 150 mM (0,9% en peso).
Estas muestras de estabilidad se calentaron desde 25ºC hasta 95ºC a
razón de 1ºC por minuto mientras se monitoreaban mediante
espectrofotometría UV/VIS. La histidina estabilizó
significativamente la IL-2(N88R)
incrementando la temperatura de precipitación y reduciendo la
velocidad de precipitación en comparación con el acetato y citrato
(Figura 2). La Tabla 1 muestra las temperaturas de inicio de la
precipitación de IL-2(N88R) en presencia de
estos tres agentes tampón. Se definió arbitrariamente la temperatura
de inicio de la precipitación como la temperatura en la que la
densidad óptica a 350 nm (DO_{350}) alcanza un cierto nivel (0,2 y
1,0 en el caso de DO_{350}). La temperatura de precipitación de
IL-2(N88R) en presencia de histidina fue
varios grados superior a aquellas en presencia de los otros dos
agente tampón. Este ejemplo demostró que la histidina puede ser un
estabilizador específico además de ser utilizado como agente tampón
para IL-2(N88R) en estado líquido.
En un esfuerzo por evaluar adicionalmente el
efecto estabilizante de la histidina, se preparó
IL-2(N88R) liofilizada a partir de
diferentes formulaciones acuosas (véase la Tabla 2). La mayoría de
las formulaciones contenían 2% en peso de glicina como agente
expansor de volumen y 1% en peso de sacarosa como estabilizador. Se
utilizó manitol al 5% en peso en una formulación como comparador
frente a Proleukin®, un producto comercializado de
IL-2. Se evaluaron dos tensioactivos, Tween 80 y
Pluronic F68 ambos al 0,1% en peso, en cuanto a la prevención de la
adsorción superficial y la agregación de la proteína. Todas las
formulaciones contenían histidina o citrato como agente tampón con
un pH ajustado en 5,5. Se incluyó citrato para distinguir el efecto
estabilizante de la histidina del propio del citrato a pH 5,5.
Estas formulaciones liofilizadas se almacenaron a 40ºC y se
analizaron mediante una cantidad de procedimientos analíticos que
incluyeron espectrofotometría UV/VIS, SEC-HPLC y
RP-HPLC.
La Tabla 3 muestra la estabilidad de
IL-2(N88R) en un número de formulaciones
evaluadas mediante espectrofotometría UV/VIS en cuanto a la
agregación, cantidad de agregados solubles mediante HPLC de
exclusión por tamaño (SEC-HPLC) y recuperación
porcentual de la proteína mediante HPLC de fase reversa
(RP-HPLC). Se analizaron las muestras después de la
liofilización y se almacenaron a una temperatura de almacenamiento
acelerada de 40ºC durante cuatro meses. El proceso de liofilización
no cambió el índice neto de agregación de
IL-2(N88R) desde el estado previo a la
liofilización, sugiriendo que IL-2(N88R)
toleró el proceso de liofilización con respecto a la
agregación/precipitación de la proteína. Después del almacenamiento
a 40ºC durante cuatro meses, se observó un importante incremento en
el índice neto de agregación para la formulación que contenía
citrato (B), Pluronic F-68 (D) o manitol (E). Estos
resultados indicaron que la inclusión de citrato o manitol,
Tween-80 o Pluronic F-68 no ofreció
ninguna protección de la agregación de
IL-2(N88R) en el estado sólido durante el
almacenamiento. Las formulaciones A y F no mostraron un cambio
importante en el índice de agregación, sugiriendo que la inclusión
de histidina, glicina y sacarosa a razón de 1 o 5 mg/ml de
IL-2(N88R) dio como resultado un producto
estable.
Sin embargo, se encontraron cantidades
considerables de agregados solubles en la formulación que contenía
Tween-80 aún antes de la liofilización (Tabla 3),
indicando que Tween-80 promueve la formación de
agregados solubles de IL-2(N88R), aunque
puede inhibirse la formación de agregados insolubles. Debido a que
Pluronic F-68 (formulación D) también causó
formación considerable de agregados solubles, los tensioactivos
pueden no ser compatibles con IL-2(N88R).
Solamente las formulaciones que contenían 2% de glicina, 1% de
sacarosa e histidina 20 mM (0,31% en peso) (A, F) no mostraron
ninguna formación detectable de agregados solubles después del
almacenamiento de la formulación liofilizada a 40ºC durante cuatro
meses, sugiriendo nuevamente que IL-2 (N88R) fue
estabilizada por la histidina.
Se determinó la recuperación total de
IL-2(N88R) soluble después de la
liofilización y almacenamiento mediante RP-HPLC
(Tabla 3). La recuperación de IL-2(N88R)
después de la liofilización fue mayor que aproximadamente 96% para
todas las formulaciones excepto para la formulación que contenía
manitol. Después del almacenamiento de estas formulaciones a 40ºC
durante 4 meses, se recuperó aproximadamente el 92% de
IL-2(N88R) en las formulaciones A y F que
contenían 2% de glicina, 1% de sacarosa e histidina 20 mM (0,31% en
peso) que contenían 1 y 5 mg/ml de
IL-2(N88R). Estos datos (más del 90% de
recuperación de IL-2(N88R) para las
formulaciones A y F) nuevamente sugieren que la histidina
estabiliza a IL-2(N88R) mientras que los
tensioactivos desestabilizan la proteína.
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Ejemplo de referencia
4
También se liofilizó IL-2 de
tipo salvaje a partir de una formulación acuosa de la misma
composición que la formulación A. Los datos de estabilidad para la
IL-2 de tipo salvaje a 40ºC fueron comparables con
los de IL-2(N88R) (Tabla 4).
La IL-2 humana posee 133
aminoácidos que forman seis estructuras helicoidales (A- F). Cuatro
de estas hélices forman lo que se denomina un motivo
tetrahelicoidal en manojo. La unión disulfuro intramolecular entre
cys^{58} y cys^{105} está ubicada sobre los bucles extendidos
entre las hélices. La cys^{125} libre está ubicada sobre la
hélice F que incorpora los aminoácidos 117-133.
El hallazgo sorprendente de que la histidina es
un estabilizador específico de IL-2 sugiere que la
histidina puede interactuar con IL-2 en una forma
específica que da como resultado la estabilización de la molécula
en ambos estados acuoso y liofilizado. Uno de los mecanismos
importantes de inestabilidad de IL-2 es la
agregación que resulta de la formación de oligómeros debido a las
reacciones de intercambio tiol-disulfuro. Por lo
tanto, puede llegarse a la hipótesis de que la histidina en
realidad puede inhibir o reducir las reacciones de intercambio
tiol-disulfuro en IL-2. Debido a que
la IL-2 de tipo salvaje,
IL-2(N88R) y posiblemente otras moléculas
variantes de IL-2 poseen una unión disulfuro y una
cisteína libre (Cys^{125}), el grupo SH libre sobre la Cys^{125}
podría reaccionar fácilmente con la unión disulfuro a través del
mecanismo de intercambio tiol/disulfuro dando como resultado de ese
modo los eventos de agregación/precipitación.
El mecanismo de intercambio tiol/disulfuro ha
sido descrito recientemente por Bulaj et al.
(Ionization-reactivity relationships for cysteine
thiols in polypeptides. Biochemistry 23 de junio de 1998;
37(25):8965-72). En estudios de péptidos y
proteínas modelo, la velocidad de reacción ha demostrado ser
sensible a las fuerzas electrostáticas así como a la estructura
secundaria de las proteínas. La distribución de electrones alrededor
de un átomo de azufre en un tiol puede estar influenciada por la
presencia de las cargas cercanas y los efectos inductivos a través
del enlace que pueden alterar el pK_{a} del tiol. Por ejemplo, la
reactividad incrementada de los tioles en el intercambio
tiol/disulfuro puede atribuirse a la reducción de su pK_{a} debido
a la presencia de cargas cercanas positivas o contribuciones
dipolares de péptido desde una estructura
alfa-helicoidal cercana. En oposición, las cargas
negativas cerca del grupo tiol pueden incrementar el pK_{a} del
tiol y llevar a velocidades de reacción tiol/disulfuro inferiores.
Este mecanismo propuesto también está respaldado por otros
estudios, donde se ha demostrado la estabilización de los iones
tiolato altamente reactivos por los residuos circundantes cargados
positivamente para la proteína tirosina fosfatasa (Zhang y Dixon,
1993 Active site labeling of the Yersinia protein tyrosine
phosphatase: the determination of the pKa of the active site
cysteine and the function of the conserved histidine 402.
Biochemistry 14 de septiembre de 1993;
32(36):9340-5) y la proteína disulfuro
isomerasa (Kortemme et al., Electrostatic interactions in the
active site of the N-terminal
thioredoxin-like domain of protein disulfide
isomerase. Biochemistry 19 de noviembre de 1996;
35(46):14503-11).
En base a estas propiedades de la reacción de
intercambio tiol/disulfuro, puede preverse un mecanismo de
estabilización donde la histidina desempeñe un papel cinético o
termodinámico en la estabilización de
IL-2(N88R). Existen cinco residuos de ácido
glutámico (57, 60, 61, 62 y 106) cerca del puente disulfuro
Cys^{58}-Cys^{105}. La unión específica de la
histidina con estos residuos con carga negativa podría llevar a una
barrera cinética para la reacción de intercambio tiol/disulfuro o
la unión de la histidina cerca del puente disulfuro podría
estabilizar termodinámicamente la molécula de IL-2
en una conformación que es menos propensa a reacciones de
agregación. Además, las interacciones iónicas
His-Glu también puede crear impedimento estérico que
además reduciría la etapa determinante de la velocidad en el
intercambio tiol/disulfuro que es la formación de un estado de
transición intermedio entre los tres átomos de azufre involucrados.
La accesibilidad de la histidina a los residuos de ácido glutámico
se debe muy probablemente a que la unión disulfuro esta ubicada
sobre un bucle extendido sobre la superficie de la proteína.
Claims (6)
1. Una composición farmacéutica liofilizada
estable que comprende una muteína de interleuquina-2
(IL-2) humana estabilizada con histidina, en la que
la muteína de IL-2 posee una única sustitución de
aminoácido: N88R.
2. Una composición farmacéutica en forma acuosa
estable que comprende una muteína de interleuquina-2
humana estabilizada con histidina, en la que la muteína de
IL-2 posee una única sustitución de aminoácido N88R,
que posee un pH que varía desde aproximadamente 5,0 a
aproximadamente 6,5.
3. La composición de la reivindicación 1 o 2 que
incluye glicina.
4. La composición de la reivindicación 1 o 2 que
incluye sacarosa.
5. La composición de la reivindicación 1 o 2 que
incluye glicina y sacarosa.
6. Una composición liofilizada estable que, tras
la reconstitución acuosa, comprende lo siguiente:
- IL-2
- 0,1-5 mg/ml
- Histidina
- 0,08-1,6% en peso
- NaCl
- 0-0,9% en peso
- Sacarosa
- 1-10% en peso y
- Glicina
- 0-3% en peso a un
- pH de
- 5 a 6,5,
en la que IL-2 es
una muteína que posee una única sustitución de aminoácido:
N88R.
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|---|---|---|---|
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| US09/605,577 US6689353B1 (en) | 2000-06-28 | 2000-06-28 | Stabilized interleukin 2 |
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