EA037083B1 - Иммуномодулирующий конъюгат, включающий il-2 и водорастворимые полимеры - Google Patents
Иммуномодулирующий конъюгат, включающий il-2 и водорастворимые полимеры Download PDFInfo
- Publication number
- EA037083B1 EA037083B1 EA201390697A EA201390697A EA037083B1 EA 037083 B1 EA037083 B1 EA 037083B1 EA 201390697 A EA201390697 A EA 201390697A EA 201390697 A EA201390697 A EA 201390697A EA 037083 B1 EA037083 B1 EA 037083B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- component
- conjugate
- water
- ril
- polymer
- Prior art date
Links
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 81
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 345
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 343
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 135
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 29
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 26
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 14
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 9
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 claims description 8
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000002905 orthoesters Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 claims description 5
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229920000765 poly(2-oxazolines) Polymers 0.000 claims description 3
- 125000004191 (C1-C6) alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 claims 3
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 claims 1
- 101000893303 Homo sapiens Glycine amidinotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 claims 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 claims 1
- 229920001584 poly(acrylomorpholines) Polymers 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 97
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 131
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 74
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 47
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 34
- 108700025316 aldesleukin Proteins 0.000 description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 31
- 229960005310 aldesleukin Drugs 0.000 description 30
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 26
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 23
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 20
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 19
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 16
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 16
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 14
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 14
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 14
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 13
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 12
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 12
- -1 methoxy, ethoxy Chemical group 0.000 description 12
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 12
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 11
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 10
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 10
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ASUGWWOMVNVWAW-UHFFFAOYSA-N 1-(2-methoxyethyl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound COCCN1C(=O)C=CC1=O ASUGWWOMVNVWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 9
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 9
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 9
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 8
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 7
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 6
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 6
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 6
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 5
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 5
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 5
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 5
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 5
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 5
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 239000012039 electrophile Substances 0.000 description 4
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 4
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 4
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- FSQQTNAZHBEJLS-UPHRSURJSA-N maleamic acid Chemical group NC(=O)\C=C/C(O)=O FSQQTNAZHBEJLS-UPHRSURJSA-N 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 239000011547 Bouin solution Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N Phosgene Chemical compound ClC(Cl)=O YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 3
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 3
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 2-(cyclohexen-1-yl)cyclohexan-1-one Chemical compound O=C1CCCCC1C1=CCCCC1 GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutyric acid Chemical class CCC(C)C(O)=O WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N Butyraldehyde Chemical compound CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101150065749 Churc1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038239 Protein Churchill Human genes 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005041 acyloxyalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 208000019069 chronic childhood arthritis Diseases 0.000 description 2
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 125000002993 cycloalkylene group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 2
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229940087463 proleukin Drugs 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 2
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 2
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 2
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical class OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 125000000027 (C1-C10) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006552 (C3-C8) cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 1
- IJFVSSZAOYLHEE-SSEXGKCCSA-N 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCC IJFVSSZAOYLHEE-SSEXGKCCSA-N 0.000 description 1
- WPRAXAOJIODQJR-UHFFFAOYSA-N 1-(3,4-dimethylphenyl)ethanone Chemical compound CC(=O)C1=CC=C(C)C(C)=C1 WPRAXAOJIODQJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLPJNCYCZORXHG-UHFFFAOYSA-N 1-morpholin-4-ylprop-2-en-1-one Chemical compound C=CC(=O)N1CCOCC1 XLPJNCYCZORXHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005917 3-methylpentyl group Chemical group 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004255 Butylated hydroxyanisole Substances 0.000 description 1
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 1
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108700023863 Gene Components Proteins 0.000 description 1
- CTKINSOISVBQLD-UHFFFAOYSA-N Glycidol Chemical compound OCC1CO1 CTKINSOISVBQLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000243251 Hydra Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N L-ascorbyl-6-palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N 0.000 description 1
- 239000011786 L-ascorbyl-6-palmitate Substances 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 101710181812 Methionine aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017849 NH2—NH2 Inorganic materials 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007964 Organophosphate Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001389 Poly(hydroxyalkylmethacrylamide) Polymers 0.000 description 1
- 239000001747 Potassium fumarate Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010056342 Pulmonary mass Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 241001061127 Thione Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVLKLUKGPNLMMA-UHFFFAOYSA-N [Eu+3].[Eu+3].[O-][Cr]([O-])(=O)=O.[O-][Cr]([O-])(=O)=O.[O-][Cr]([O-])(=O)=O Chemical compound [Eu+3].[Eu+3].[O-][Cr]([O-])(=O)=O.[O-][Cr]([O-])(=O)=O.[O-][Cr]([O-])(=O)=O DVLKLUKGPNLMMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 235000016127 added sugars Nutrition 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005603 alternating copolymer Polymers 0.000 description 1
- 125000006295 amino methylene group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 235000010385 ascorbyl palmitate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008228 bacteriostatic water for injection Substances 0.000 description 1
- SGUXGJPBTNFBAD-UHFFFAOYSA-L barium iodide Chemical compound [I-].[I-].[Ba+2] SGUXGJPBTNFBAD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940075444 barium iodide Drugs 0.000 description 1
- 229910001638 barium iodide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 description 1
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 125000006367 bivalent amino carbonyl group Chemical group [H]N([*:1])C([*:2])=O 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 1
- 229940043253 butylated hydroxyanisole Drugs 0.000 description 1
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 1
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 1
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 1
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- FZFAMSAMCHXGEF-UHFFFAOYSA-N chloro formate Chemical compound ClOC=O FZFAMSAMCHXGEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000832 lactitol Substances 0.000 description 1
- VQHSOMBJVWLPSR-JVCRWLNRSA-N lactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-JVCRWLNRSA-N 0.000 description 1
- 235000010448 lactitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960003451 lactitol Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M lithium perchlorate Chemical compound [Li+].[O-]Cl(=O)(=O)=O MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001486 lithium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000845 maltitol Substances 0.000 description 1
- VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N maltitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N 0.000 description 1
- 235000010449 maltitol Nutrition 0.000 description 1
- 229940035436 maltitol Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- UCUUFSAXZMGPGH-UHFFFAOYSA-N penta-1,4-dien-3-one Chemical compound C=CC(=O)C=C UCUUFSAXZMGPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003538 pentan-3-yl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003186 pharmaceutical solution Substances 0.000 description 1
- 239000007971 pharmaceutical suspension Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067107 phenylethyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 229940067605 phosphatidylethanolamines Drugs 0.000 description 1
- ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-N phosphinic acid Chemical compound O[PH2]=O ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N phosphoramidous acid Chemical group NP(O)O SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001390 poly(hydroxyalkylmethacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 108700001787 polyethylene glycol-modified interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical group 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- SHPKCSFVQGSAJU-SEPHDYHBSA-L potassium fumarate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O SHPKCSFVQGSAJU-SEPHDYHBSA-L 0.000 description 1
- 235000019295 potassium fumarate Nutrition 0.000 description 1
- 235000011118 potassium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- XWGJFPHUCFXLBL-UHFFFAOYSA-M rongalite Chemical compound [Na+].OCS([O-])=O XWGJFPHUCFXLBL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003548 sec-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 125000005017 substituted alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004426 substituted alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- DKACXUFSLUYRFU-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-aminocarbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NN DKACXUFSLUYRFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000003673 urethanes Chemical class 0.000 description 1
- HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N valeric aldehyde Natural products CCCCC=O HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000000196 viscometry Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2013—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Hematology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к иммуномодулирующему конъюгату, который включает IL-2, соединенный посредством поддающейся разрыву связи с одним или несколькими водорастворимыми полимерами. Изобретение также относится к фармацевтической композиции для модуляции иммунного ответа у пациента с раковым заболеванием, содержащей заявленный конъюгат; к способу доставки заявленного конъюгата посредством введения индивидууму указанной композиции; к способу получения заявленного конъюгата.
Description
НЕКТАР ТЕРАПЬЮТИКС (US) (72) Изобретатель:
Боссард Мэри Дж., Али Шери Ф., Лю Сиаофен, Чарич Дебора X., Заппе Харольд, Ванг Юйцзюнь, Хуан Цзицай (US) (74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (56) US-A1-20040136952 US-A1-20050186174 US-A-4705848 US-A1-20090263382 US-A-6034072
037083 В1 (57) Изобретение относится к иммуномодулирующему конъюгату, который включает IL-2, соединенный посредством поддающейся разрыву связи с одним или несколькими водорастворимыми полимерами. Изобретение также относится к фармацевтической композиции для модуляции иммунного ответа у пациента с раковым заболеванием, содержащей заявленный конъюгат; к способу доставки заявленного конъюгата посредством введения индивидууму указанной композиции; к способу получения заявленного конъюгата.
037083 Bl
Перекрестные ссылки на родственные заявки
В соответствии с § 119 (е) Патентного закона США раздела 35 настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 61/413236, поданной 12 ноября 2010 года, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Область изобретения
Среди прочего, один или несколько вариантов осуществления настоящего изобретения, в целом, относятся к конъюгатам, содержащим компонент IL-2 (т.е. компонент, по меньшей мере, с некоторой активностью, подобной человеческому IL-2) и полимер. К тому же настоящее изобретение относится (среди прочего) к композициям, содержащим конъюгаты, способам синтеза конъюгатов и способам введения композиции.
Предпосылки изобретения
У здоровых людей иммунная система может различать здоровые клетки и раковые клетки. После идентификации данной клетки как раковой иммунная система, как правило, элиминирует ее. Таким образом, когда иммунная система разрушается или поражена, типы рака могут развиваться в результате неспособности поврежденной иммунной системы различать и затем элиминировать, раковые клетки. В случае пациента, страдающего от рака, введение пациенту иммуномодуляторного белка может помочь (по меньшей мере, частично) вернуть иммунную систему пациента в нормальное состояние, таким образом, что возвращается способность иммунной системы элиминировать раковые клетки. Следовательно, рак можно замедлить или даже элиминировать.
Одним таким иммуномодуляторным белком, применяемым в лечении пациентов, страдающих от конкретных типов рака, является интерлейкин-2. Интерлейкин-2 (IL-2) представляет собой естественный цитокин с активностью как стимулятора клеток натуральных киллеров (NK-клеток), так и индуктора пролиферации T-клеток. В негликозилированной форме IL-2 имеет молекулярную массу приблизительно 15300 Да (хотя IL-2 обнаруживается in vivo в различно гликозилированных формах).
Коммерчески доступный продукт негликозилированного человеческого рекомбинантного IL-2, альдеслейкин (доступен под торговой маркой PROLEUKIN® как дез-аланил-1, серин-125 человеческий интерлейкин-2 от Prometheus Laboratories Inc., Сан-Диего, Калифорния), был одобрен для введения пациентам, страдающим от метастатического рака почки и метастатической меланомы. IL-2 также был предложен для введения пациентам, страдающим или зараженных вирусом гепатита С (HCV), вирусом иммунодефицита человека (HIV), острым миелоидным лейкозом, неходжкинской лимфомой, Т-клеточной лимфомой кожи, ювенильным ревматоидным артритом, атопическим дерматитом, раком молочной железы и раком мочевого пузыря.
Однако даже рекомендованные дозы альдеслейкина могут вызывать тяжелые побочные эффекты, в том числе острый респираторный дистресс-синдром (CLS) и нарушение функции нейтрофилов. С учетом возможности этих тяжелых побочных эффектов, и поскольку рекомендованный цикл лечения включает внутривенную инфузию в течение пятнадцати минут каждые восемь часов в четырнадцати дозах, введение альдеслейкина происходит в условиях клиники. Более того, коммерческий состав альдеслейкина включает присутствие додецилсульфата натрия, вещества, которое, по-видимому, требуется для поддержания оптимальной активности путем конформационной стабильности. См. Arakawa et al. (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:583-587.
Были предприняты попытки устранения токсичности, связанной с IL-2. В одном подходе предпринимали подходы, связанные с составлением. См., например, патент США № 6706289 и публикацию международной заявки на патент WO 02/00243 и WO 99/60128. В других подходах были предложены конкретные конъюгаты IL-2. См., например, патенты США № 4766106, 5206344, 5089261 и 4902502.
Однако несмотря на эти подходы остается потребность в конъюгатах IL-2.
Среди прочего, один или несколько вариантов осуществления настоящего изобретения, вследствие этого, направлены на такие конъюгаты, а также композиции, содержащие конъюгаты, и связанные с ними способы, описываемые в данном документе, которые, как полагают, являются новыми и не вытекают полностью из уровня техники.
В соответствии с этим в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривается конъюгат, причем конъюгат содержит остаток компонента IL-2, ковалентно прикрепленного к водорастворимому полимеру.
Более конкретно, предусматривается иммуномодулирующий конъюгат, включающий IL-2, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-4 или последовательность, гомологичную на 95% любой из указанных последовательностей, причем IL-2 ковалентно соединен посредством поддающейся разрыву связи с одним или несколькими водорастворимыми полимерами, каждый из которых имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 20 кДа до приблизительно 85 кДа, при этом поддающаяся разрыву связь содержит сложноэфирную группу, выбранную из сложного эфира карбоновой кислоты, сложного эфира фосфорной кислоты, тиолового сложного эфира и сложного ортоэфира, или же представляет собой карбаматную связь, причем в условиях in vivo указанная связь поддается разрыву с высвобождением одного или нескольких водорастворимых полимеров.
Согласно настоящему изобретению конъюгат может содержать остаток компонента IL-2, ковалент
- 1 037083 но прикрепленного к водорастворимому полимеру, где компонент IL-2 является предшественником компонента IL-2.
Согласно настоящему изобретению конъюгат может содержать остаток компонента IL-2, ковалентно прикрепленного к водорастворимому полимеру, где компонент IL-2 не является предшественником компонента IL-2.
В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривается фармацевтическая композиция для модуляции иммунного ответа у пациента с раковым заболеванием, содержащая вышеуказанный конъюгат согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый наполнитель.
В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривается способ доставки конъюгата, содержащего остаток IL-2, нуждающемуся в этом индивидууму, причем способ включает этап введения пациенту вышеуказанной фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.
В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривается способ получения конъюгата по настоящему изобретению, включающий приведение в контакт IL-2 с водорастворимым полимером, имеющим среднюю молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 20 кДа до приблизительно 85 кДа, в условиях, подходящих для образования поддающейся разрыву связи, причем IL-2 представляет собой белок, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-4 или последовательность, гомологичную на 95% любой из указанных последовательностей.
При этом в вышеуказанном способе поддающаяся разрыву связь представляет собой связь, содержащую сложноэфирную группу, выбранную из сложного эфира карбоновой кислоты, сложного эфира фосфорной кислоты, тиолового сложного эфира и сложного ортоэфира, или же представляет собой карбаматную связь.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлена последовательность ДНК и получаемая аминокислотная последовательность гена, дополнительно описанного в примере 1;
фиг. 2.1 является изображением типичной хроматограммы после катионообменной хроматографии [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2], осуществленной после процедуры, изложенной в примере 2;
фиг. 2.2 - изображением хроматограммы после анализа обращенно-фазовой HPLC [mPEG2-C2fmoc-20K]-[rIL-2], как дополнительно описано в примере 2;
фиг. 2.3 представляет собой график профилей расщепления различных конъюгатов, полученных в соответствии с процедурой, изложенной в примере 2;
фиг. 3.1 является изображением типичной хроматограммы после катионообменной хроматографии [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2], осуществленной после процедур, изложенных в примере 3;
фиг. 3.2 - изображением хроматограммы после анализа обращенно-фазовой HPLC [mPEG2-CACfmoc-20K]-[rIL-2], как дополнительно описано в примере 3;
фиг. 3.3 - изображением результатов анализа MALDI-TOF различных конъюгатов, полученных в соответствии с процедурами, изложенными в примере 3;
фиг. 4.1 - изображением типичной хроматограммы после катионообменной хроматографии [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2], осуществленной после процедур, изложенных в примере 4;
фиг. 4.2 - изображением хроматограммы после анализа обращенно-фазовой HPLC [mPEG2-ru-20K][rIL-2], как дополнительно описано в примере 4;
фиг. 5 - изображением хроматограммы после катионообменной хроматографии [mPEG2-ru-40K][rIL-2], как дополнительно описано в примере 5;
фиг. 6 - изображением хроматограммы после катионообменной хроматографии [mPEG2-ru-4K][rIL-2], как дополнительно описано в примере 6;
на фиг. 7 показан график пролиферации клеток CTLL-2 в ответ на альдеслейкин и стабильный [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2], как дополнительно описано в примере 11. Точки на графике обозначают один эксперимент при определениях в трех повторностях. Усы представляют стандартную ошибку среднего;
на фиг. 8 - график пролиферации клеток CTLL-2 в ответ на альдеслейкин, высвобожденные и невысвобожденные [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] и [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2], как дополнительно описано в примере 11. Точки на графике обозначают один эксперимент при определениях в трех повторностях. Усы представляют стандартную ошибку среднего;
на фиг. 9 - график кривых концентрация-время после однократной инъекции у мышей, как дополнительно описано в примере 12;
на фиг. 10 - график общей площади поражения (мм2) для нескольких тестируемых соединений, как дополнительно описано в примере 13;
фиг. 11А и 11В представляют собой графики, показывающие кривые время-развитие опухоли для тестируемых продуктов при различных схемах введения, как дополнительно описано в примере 14.
Подробное описание изобретения
Перед подробным описанием одного или нескольких вариантов осуществления изобретения следу- 2 037083 ет понимать, что настоящее изобретение не ограничивается определенными полимерами, методиками синтеза, компонентами IL-2 и т.п., которые как таковые могут варьировать.
Следует отметить, что применяемые в настоящем описании и предусматриваемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, кроме тех случаев, когда контекст явно предписывает обратное. Таким образом, например, ссылка на полимер включает один полимер, а также два или более одинаковых или различных полимеров, ссылка на необязательный наполнитель относится к одному необязательному наполнителю, а также к двум или более одинаковым или различным необязательным наполнителям и т.п.
В описании и заявлении одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения будет применяться следующая терминология в соответствии с определениями, описанными ниже.
Применяемые в данном документе PEG, полиэтиленгликоль и поли(этиленгликоль) являются взаимозаменяемыми и охватывают любой непептидный водорастворимый поли(этиленоксид). Как правило, PEG для применения в соответствии с настоящим изобретением включают следующую структуру -(OCH2CH2)n-, где (n) составляет 2-4000. Применяемый в данном документе PEG также включает -СН2СН2-О(СН2СН2О)п-СН2СН2- и -(OCH2CH2)nO- в зависимости от того, были или не были замещены концевые кислороды, например, во время преобразования с помощью синтеза. Следует помнить, что во всем описании и формуле изобретения выражение PEG включает структуры с различными концевыми или блокирующими конец группами и т.д. Выражение PEG также означает полимер, который содержит большинство, а именно, более 50% повторяющихся субъединиц -ОСН2СН2-. Что касается конкретных форм, PEG может принимать любое число из множества молекулярных масс, а также структур или геометрий, таких как разветвленная, линейная, вильчатая, многофункциональная и т.п., что более подробно будет описано ниже.
Выражения с заблокированным концом и блокированный на конце взаимозаменяемо применяются в данном документе для обозначения границы или концевой точки полимера с концевым блокирующим компонентом. Обычно, хотя необязательно, концевой блокирующий компонент включает гидрокси или C1-20 алкоксигруппу, более предпочтительно C1-10 алкоксигруппу и еще более предпочтительно C1-5 алкоксигруппу. Таким образом, примеры концевых блокирующих компонентов включают алкокси (например, метокси, этокси и бензилокси), а также арил, гетероарил, цикло, гетероцикло и т.п. Следует помнить, что концевой блокирующий компонент может включать один или несколько атомов концевого мономера в полимере [например, концевой блокирующий компонент метокси в СН3О(СН2СН2О)п- и СН3(ОСН2СН2)п-]. К тому же предусматриваются насыщенные, ненасыщенные, замещенные и незамещенные формы каждого из вышеупомянутого. Более того, концевая блокирующая группа также может представлять собой силан. Концевая блокирующая группа также может преимущественно содержать обнаруживаемую метку. Если полимер имеет концевую блокирующую группу, содержащую обнаруживаемую метку, количество или локализацию полимера и/или компонента (например, активного средства), к которому присоединен полимер, можно определять с применением подходящего детектора. Такие метки включают, без ограничения, флуорофоры, хемилюминофоры, компоненты, применяемые в ферментном мечении, колориметрические вещества (например, красители), ионы металлов, радиоактивные компоненты и т.п. Подходящие детекторы включают фотометры, пленки, спектрометры и т.п. Концевая блокирующая группа также может преимущественно содержать фосфолипид. Если полимер имеет концевую блокирующую группу, содержащую фосфолипид, полимеру и полученному в результате конъюгату придаются особые свойства. Иллюстративные фосфолипиды включают, без ограничения, выбранные из класса фосфолипидов, называемых фосфатидилхолинами. Конкретные фосфолипиды включают, без ограничения, выбранные из группы, состоящей из дилауроилфосфатидилхолина, диолеилфосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина, дистероилфосфатидилхолина, бегеноилфосфатидилхолина, арахидоилфосфатидилхолина и лецитина. Концевая блокирующая группа также может включать нацеливающий компонент так, чтобы полимер - а также что-нибудь, например компонент IL-2, прикрепленный к нему - предпочтительно можно было локализовать в области, представляющей интерес.
Невстречающийся в природе в отношении полимера, описываемого в данном документе, означает полимер, который в целом не обнаруживается в природе. Невстречающийся в природе полимер может, однако, содержать один или несколько мономеров или сегментов мономеров, которые встречаются в природе, при условии, что полная полимерная структура не обнаруживается в природе.
Выражение водорастворимый, например, в водорастворимом полимере, полимер представляет собой любой полимер, который растворим в воде при комнатной температуре. Как правило, водорастворимый полимер будет пропускать по меньшей мере приблизительно 75%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% света, пропускаемого таким же раствором после фильтрации. По весу водорастворимый полимер предпочтительно будет растворим в воде по меньшей мере приблизительно на 35 вес.%, более предпочтительно растворим в воде по меньшей мере приблизительно на 50 вес.%, еще более предпочтительно растворим в воде приблизительно на 70 вес.% и еще более предпочтительно растворим в воде приблизительно на 85 вес.%. Наиболее предпочтительно, однако, чтобы водорастворимый полимер являлся растворимым в воде приблизительно на 95 вес.% или полностью растворимым в воде.
- 3 037083
Молекулярная масса в контексте водорастворимого полимера, такого как PEG, может выражаться либо как среднечисловая молекулярная масса, либо как средневесовая молекулярная масса. Если не указывается иное, все ссылки на молекулярную массу в данном документе относятся к средневесовой молекулярной массе. Оба определения молекулярной массы, среднечисловой и средневесовой, могут измеряться с применением гельпроникающей хроматографии или других методик жидкостной хроматографии. Также можно применять другие способы измерения значений молекулярной массы, такие как применение анализа концевых групп или измерение коллигативных свойств (например, понижение температуры замерзания, повышение температуры кипения или осмотическое давление) для определения среднечисловой молекулярной массы или применение методик рассеивания света, ультрацентрифугирования или вискозиметрии для определения средневесовой молекулярной массы. Полимеры настоящего изобретения, как правило, полидисперсны (т.е. среднечисловая молекулярная масса и средневесовая молекулярная масса полимеров не равны), обладают низкими значениями полидисперсности предпочтительно меньше приблизительно 1,2, более предпочтительно меньше приблизительно 1,15, еще более предпочтительно меньше приблизительно 1,10, все еще более предпочтительно меньше приблизительно 1,05 и наиболее предпочтительно меньше приблизительно 1,03.
Выражения активный, реакционноспособный или активированный при применении совместно с определенной функциональной группой относится к реакционноспособной функциональной группе, которая легко реагирует с электрофилом или нуклеофилом на другой молекуле. Это отличает их от групп, которым требуются сильные катализаторы или весьма нецелесообразные условия реакции, чтобы вступить в реакцию (т.е. нереакционноспособная или инертная группа).
Применяемое в данном документе выражение функциональная группа или ее любой синоним подразумевает охватывание ее защищенных форм, а также незащищенных форм.
Выражения спейсерный компонент, связь и линкер применяются в данном документе для обозначения связи или атома, или объединения атомов, необязательно применяемых для связывания взаимосоединяющихся компонентов, таких как конец полимерного сегмента и компонент IL-2 или электрофил или нуклеофил компонента IL-2. Спейсерный компонент может быть гидролитически устойчивым или может включать физиологически гидролизуемую или ферментативно разрушаемую связь. Кроме тех случаев, когда контекст явно предписывает иное, спейсерный компонент необязательно находится между любыми двумя элементами соединения (например, предусматриваемые конъюгаты, содержащие остаток компонента IL-2 и водорастворимый полимер, могут скрепляться напрямую или опосредованно через спейсерный компонент).
Алкил относится к углеводородной цепи, длина которой, как правило, находится в диапазоне от приблизительно 1 до 15 атомов. Такие углеводородные цепи предпочтительно, но не обязательно, насыщены и могут представлять собой разветвленную или прямую цепь, хотя, как правило, прямая цепь является предпочтительной. Иллюстративные алкильные группы включают метил, этил, пропил, бутил, пентил, 1-метилбутил, 1-этилпропил, 3-метилпентил и т.п. Применяемый в данном документе алкил включает циклоалкил, а также циклоалкилен-содержащий алкил.
Низший алкил относится к алкильной группе, содержащей от 1 до 6 атомов углерода и представляющей собой прямую цепь или разветвленную, например, метил, этил, н-бутил, изо-бутил и трет-бутил.
Циклоалкил относится к насыщенной или ненасыщенной циклической углеводородной цепи, включая соединенные мостиковой связью, конденсированные или спироциклические соединения, предпочтительно состоящие из от 3 до приблизительно 12 атомов углерода, более предпочтительно от 3 до приблизительно 8 атомов углерода. Циклоалкилен относится к циклоалкильной группе, которая вставлена в алкильную цепь посредством связывания цепи в любых двух атомах углерода в циклическую кольцевую систему.
Алкокси относится к -OR группе, где R представляет собой алкил или замещенный алкил, предпочтительно C1.6 алкил (например, метокси, этокси, пропилокси и т.д.).
Выражение замещенный, например в замещенном алкиле, относится к компоненту (например, алкильной группе), замещенному одним или несколькими неинтерферирующими заместителями, такими как, без ограничения: алкил, С3-8 циклоалкил, например циклопропил, циклобутил и т.п.; галоген, например фтор, хлор, бром и йод; циано; алкокси, низший фенил; замещенный фенил и т.п. Замещенный арил представляет собой арил с одним или несколькими неинтерферирующими группами в качестве заместителя. Что касается замещений на фенильном кольце, заместители могут находиться в любом положении (т.е. орто, мета или пара).
Неинтерферирующие заместители представляют собой группы, которые, если присутствуют в молекуле, являются, как правило, нереакционноспособными в отношении других функциональных групп, содержащихся в пределах молекулы.
Арил означает одно или несколько ароматических колец, каждое из 5 или 6 атомов углерода в ядре. Арил включает несколько арильных колец, которые могут быть конденсированными, как в нафтиле, или не конденсированными, как в бифениле. Арильные кольца также могут быть конденсированными или не конденсированными с одним или несколькими циклическими углеводородными, гетероарильными или гетероциклическими кольцами. Применяемый в данном документе арил включает гетероарил.
- 4 037083
Гетероарил представляет собой арильную группу, содержащую от одного до четырех гетероатомов, предпочтительно серу, кислород или азот или их комбинацию. Гетероарильные кольца также могут быть конденсированными с одним или несколькими циклическими углеводородными, гетероциклическими, арильными или гетероарильными кольцами.
Гетероцикл или гетероциклический означает одно или несколько колец из 5-12 атомов, предпочтительно 5-7 атомов, с ненасыщенными связями или ароматическими свойствами или без них, и по меньшей мере с одним атомом кольца, не являющимся углеродом. Предпочтительные гетероатомы включают серу, кислород и азот.
Замещенный гетероарил представляет собой гетероарил с одной или несколькими неинтерферирующими группами в качестве заместителей.
Замещенный гетероцикл представляет собой гетероцикл с одной или несколькими боковыми цепями, образованными из неинтерферирующих заместителей.
Применяемый в данном документе органический радикал должен включать алкил, замещенный алкил, арил и замещенный арил.
Электрофил и электрофильная группа относится к иону или атому, или объединению атомов, которые могут быть ионными с электрофильным центром, т.е. центром, который является электроноакцепторным, способному реагировать с нуклеофилом.
Нуклеофил и нуклеофильная группа относится к иону или атому, или объединению атомов, которые могут быть ионными с нуклеофильным центром, т.е. центром, который стремится к электрофильному центру или электрофилу.
Физиологически расщепляемая, или гидролизуемая, или разрушаемая связь представляет собой связь, которая реагирует с водой (т.е. гидролизуется) при физиологических условиях. Свойство связи гидролизоваться в воде будет зависеть не только от общего типа связи, соединяющей два центральных атома, но также от заместителей, прикрепленных к этим центральным атомам. Соответствующие гидролитически неустойчивые или слабые связи включают, но без ограничений, сложный эфир карбоновой кислоты, сложный эфир фосфорной кислоты, ангидриды, ацетали, кетали, ацилоксиалкиловые эфиры, имины, сложные ортоэфиры, пептиды и олигонуклеотиды.
Ферментативно разрушаемая связь означает связь, которая подвергается разрушению под влиянием одного или нескольких ферментов.
Гидролитически устойчивый мостик или связь относится к химической связи, как правило, ковалентной связи, которая практически устойчива в воде, а именно, не подвергается гидролизу при физиологических условиях до какой-либо заметной степени в течение длительного периода времени. Примеры гидролитически устойчивых мостиков включают, но без ограничений, следующие: углерод-углеродные связи (например, в алифатических цепях), простые эфиры, амиды, уретаны и т.п. В целом гидролитически устойчивый мостик представляет собой такой, который проявляет степень гидролиза меньше приблизительно 1-2% в день при физиологических условиях. Степени гидролиза типовых химических связей можно найти в большинстве справочников по химии.
Фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель относится к наполнителю, который необязательно может включаться в композиции настоящего изобретения и который не вызывает значительных неблагоприятных токсических эффектов у пациента. Фармакологически эффективное количество, физиологически эффективное количество и терапевтически эффективное количество применяются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения количества конъюгата полимеркомпонент (IL-2), которое необходимо для обеспечения требуемого уровня конъюгата (или соответствующего неконъюгированного компонента IL-2) в кровотоке или в целевой ткани. Точное количество будет зависеть от многочисленных факторов, например определенного компонента IL-2, ингредиентов и физических характеристик терапевтической композиции, предусматриваемой группы пациентов, соображений относительно отдельных пациентов и т.п., и может легко определяться специалистом в данной области, исходя из информации, обеспеченной в данном документе.
Многофункциональный означает, что полимер имеет три или более функциональных групп, содержащихся в нем, где функциональные группы могут быть одинаковыми или различными. Многофункциональные полимерные реагенты настоящего изобретения, как правило, будут содержать приблизительно 3-100 функциональных групп, или 3-50 функциональных групп, или 3-25 функциональных групп, или 3-15 функциональных групп, или от 3 до 10 функциональных групп, или будут содержать 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 функциональных групп в пределах главной цепи полимера.
Применяемое в данном документе выражение компонент IL-2 относится к компоненту с активностью человеческого IL-2. Компонент IL-2 также будет иметь по меньшей мере одну электрофильную группу или нуклеофильную группу, подходящие для реакции с полимерным реагентом. К тому же выражение компонент IL-2 охватывает как компонент IL-2 перед конъюгацией, так и остаток компонента IL-2 после конъюгации. Как будет объясняться более подробно ниже, рядовой специалист в данной области может определить, обладает ли какой-нибудь данный компонент активностью IL-2. Белок, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую любой из SEQ ID NO: 1-4, представляет собой компонент IL-2, а также любой белок или полипептид по существу гомологичный ему. Применяе
- 5 037083 мое в данном документе выражение компонент IL-2 включает такие белки, модифицированные преднамеренно, как например, посредством сайт-направленного мутагенеза, или случайно посредством мутаций. Эти выражения также включают аналоги с 1-6 дополнительными сайтами гликозилирования, аналоги по меньшей мере с одной дополнительной аминокислотой на карбокси-конце белка, где дополнительная аминокислота(ы) включает по меньшей мере один сайт гликозилирования, и аналоги с аминокислотной последовательностью, которая включает по меньшей мере один сайт гликозилирования. Выражение включает как естественные, так и рекомбинантно полученные компоненты.
Выражение по существу гомологичный означает, что определенная рассматриваемая последовательность, например мутантная последовательность, отличается от эталонной последовательности одним или несколькими замещениями, делециями или добавлениями, совокупный эффект которых не приводит в результате к неблагоприятному функциональному расхождению между эталонной и рассматриваемой последовательностями. Для целей настоящего изобретения последовательности с гомологией больше 80 % (более предпочтительно больше 85 %, еще более предпочтительно больше 90 %, наиболее предпочтительными являются таковые с гомологией более 95 %), эквивалентной биологической активностью (хотя не обязательно эквивалентной силы биологической активностью) и эквивалентными характеристиками экспрессии считают по существу гомологичными. Для целей определения гомологии усечением зрелой последовательности следует пренебрегать. Иллюстративные компоненты IL-2 для применения в данном документе включают последовательности, которые по существу гомологичны SEQ ID NO: 2.
Выражение фрагмент означает любой белок или полипептид с аминокислотной последовательностью части или фрагмента компонента IL-2, и который обладает биологической активностью IL-2. Фрагменты включают белки или полипептиды, образуемые при протеолитическом разрушении компонента IL-2, а также белки или полипептиды, образуемые с помощью химического синтеза посредством способов, общепринятых в данной области техники.
Выражение пациент относится к живому организму, страдающему или подверженному состоянию, которое можно предупреждать или лечить с помощью введения активного средства (например, конъюгата), и включает как людей, так и животных.
Необязательный или необязательно означает, что описываемое далее обстоятельство может встречаться или не встречаться, так что описание включает случаи, в которых обстоятельство встречается, и случаи, в которых оно не встречается.
По существу означает едва ли не абсолютно или полностью, например, удовлетворяет одному или нескольким из следующего: более 50, 51% или более, 75% или более, 80% или более, 90% или более и 95% или более из условий.
Применяемая в данном документе идентичность последовательности определяется сравнением последовательности эталонной последовательности ДНК с такой частью другой последовательности ДНК, выравниваемой таким образом, чтобы максимально увеличить перекрывание между двумя последовательностями, при этом снижая до минимума гэпы последовательностей, где любые выступающие последовательности между двумя последовательностями игнорируются. В отношении любой идентичности последовательности, описанной в данном документе, предпочтительна по меньшей мере 80%, более предпочтительна 85%, все более предпочтительна 90%, еще все более предпочтительна 95% идентичность последовательности с наиболее предпочтительными 96, 97, 98 и 99% идентичностями последовательности.
Аминокислотные остатки в пептидах сокращаются следующим образом: фенилаланин обозначается Phe или F; лейцин обозначается Leu или L; изолейцин обозначается Не или I; метионин обозначается Met или М; валин обозначается Val или V; серин обозначается Ser или S; пролин обозначается Pro или P; треонин обозначается Thr или Т; аланин обозначается Ala или А; тирозин обозначается Try или Y; гистидин обозначается His или Н; глутамин обозначается Gln или Q; аспарагин обозначается Asn или N; лизин обозначается Lys или K; аспарагиновая кислота обозначается Asp или D; глутаминовая кислота обозначается Glu или Е; цистеин обозначается Cys или С; триптофан обозначается Trp или W; аргинин обозначается Arg или R, и глицин обозначается Gly или G.
Возвращаясь к одному или нескольким вариантам осуществления настоящего изобретения, предусматривается конъюгат, причем конъюгат содержит остаток компонента IL-2, ковалентно прикрепленного (или напрямую, или через спейсерный компонент) к водорастворимому полимеру. Конъюгаты настоящего изобретения будут иметь один или несколько из следующих признаков.
Компонент IL-2.
Как отмечалось ранее, конъюгат в общем содержит остаток компонента IL-2, ковалентно прикрепленного, или напрямую, или через спейсерный компонент, к водорастворимому полимеру. Применяемое в данном документе выражение компонент IL-2 должно относиться к компоненту IL-2 перед конъюгацией, а также к компоненту IL-2 после прикрепления к непептидному водорастворимому полимеру. Будет понятно, однако, что если исходный компонент IL-2 присоединяется к непептидному водорастворимому полимеру, компонент IL-2 немного меняется из-за присутствия одной или нескольких ковалентных связей, обусловленных связыванием с полимером(ами). Зачастую, эту слегка измененную форму компонента IL-2, прикрепленную к другой молекуле, относят к остатку компонента IL-2.
- 6 037083
Компонент IL-2 можно получать нерекомбинантными способами и рекомбинантными способами, и настоящее изобретение не ограничивается в этом отношении. К тому же компонент IL-2 можно получать из человеческих источников, животных источников и растительных источников.
Компонент IL-2 можно получать нерекомбинантно. Например, возможно выделять IL-2 из биологических систем и, наоборот, получать IL-2 из культуральной среды. См., например, процедуры, описанные в патенте США № 4401756 и у Pauly et al. (1984)7. Immunol. Methods 75(1):73-84.
Компонент IL-2 можно получать рекомбинантными способами. См., например, патент США № 5614185, раскрытие и экспериментальную часть, предоставленные в данном документе.
Любой компонент IL-2, полученный с помощью нерекомбинантных или рекомбинантных подходов, может применяться в качестве компонента IL-2 при получении конъюгатов, описанных в документе.
Компонент IL-2 может экспрессироваться в бактериальной системе экспрессии [например, Е.coli, см., например, Fischer et al. (1995) Biotechnol. Appl. BioIL-2m. 21 (3):295-311], системе экспрессии млекопитающих [см., например, Kronman et al. (1992) Gene 121:295-304], дрожжевой [например, Pichia pastoris, см., например, Morel et al. (1991) Biochem. J. 328(1): 121-129] и растительной [см., например, Mor et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 75(3):259-266] системах экспрессии. Экспрессия может происходить путем экзогенной экспрессии (когда клетка-хозяин по природе содержит требуемый генетический код) или путем эндогенной экспрессии.
Хотя основанные на рекомбинантах способы получения белков могут отличаться, рекомбинантные способы, как правило, включают конструирование нуклеиновой кислоты, кодирующей требуемый полипептид или фрагмент, клонирование нуклеиновой кислоты в вектор экспрессии, трансформацию клеткихозяина (например, растительной, бактериальной, дрожжевой, трансгенной животной клетки или клетки млекопитающего, такой как клетка яичников китайского хомячка или клетка почки детеныша хомячка) и экспрессию нуклеиновой кислоты с получением требуемого полипептида или фрагмента. Способы получения и экспрессии рекомбинантных полипептидов in vitro и в прокариотических и в эукариотических клетках-хозяевах известны специалистам в данной области.
Чтобы облегчить идентификацию и очистку рекомбинантного полипептида, в рамку с кодирующей последовательностью можно вставлять или добавлять последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие эпитопную метку, или другую последовательность для аффинного связывания, что, таким образом, дает белок слияния, содержащий требуемый полипептид и полипептид, пригодный для связывания. Белки слияния можно идентифицировать и очищать с помощью, прежде всего, прогона смеси, содержащей белок слияния, через колонку для аффинной хроматографии, несущую компоненты связывания (например, антитела), направленные на эпитопную метку или другую последовательность связывания в белках слияния, таким образом, связывая белок слияния в колонке. После этого белок слияния можно выделить посредством промывки колонки подходящим раствором (например, кислотой) для высвобождения связанного белка слияния. Рекомбинантный полипептид также можно очищать путем лизирования клеток-хозяев, отделения полипептида, например, с помощью ионообменной хроматографии, подходов с аффинным связыванием, подходов с гидрофобным взаимодействием и, после этого, идентифицирования с помощью MALDI или вестерн-блоттинга и сбора полипептида. Эти и другие способы идентификации и очистки рекомбинантных полипептидов известны специалистам в данной области. В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения, однако, компонент IL-2 не находится в форме белка слияния.
В зависимости от системы, применяемой для экспрессии белков с активностью IL-2, компонент IL2 может быть негликозилированным или гликозилированным, и может применяться тот и другой. Т.е. компонент IL-2 может быть негликозилированным или компонент IL-2 может быть гликозилированным. В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения компонент IL-2 является негликозилированным.
Компонент IL-2 преимущественно можно модифицировать с включением и/или замещением одного или нескольких аминокислотных остатков, таких как, например, лизин, цистеин и/или аргинин, для обеспечения свободного прикрепления полимера к атому в боковой цепи аминокислоты. Пример замещения компонента IL-2 описывается в патенте США № 5206344. К тому же компонент IL-2 можно модифицировать с включением невстречающегося в природе аминокислотного остатка. Методики добавления аминокислотных остатков и невстречающихся в природе аминокислотных остатков хорошо известны специалистам в данной области. Приводится ссылка на J. March, Advanced Organic IL-2mistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4thEd. (New York: Wiley-Interscience, 1992).
К тому же компонент IL-2 преимущественно можно модифицировать с включением прикрепления функциональной группы (иным образом, чем через добавление аминокислотного остатка, содержащего функциональную группу). Например, компонент IL-2 можно модифицировать с включением тиоловой группы. К тому же компонент IL-2 можно модифицировать с включением N-концевого α-углерода. К тому же компонент IL-2 можно модифицировать с включением одного или нескольких углеводных компонентов. К тому же компонент IL-2 можно модифицировать с включением альдегидной группы. К тому же компонент IL-2 можно модифицировать с включением кетоновой группы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительно, чтобы компонент IL-2 не модифицировался с
- 7 037083 включением одной или нескольких тиоловых групп, N-концевого α-углерода, углевода, альдегидной группы и кетоновой группы.
Иллюстративные компоненты IL-2 описаны в литературе и, например, в патентах США № 5116943, 5153310, 5635597, 7101965 и 7567215 и публикациях заявок на патент США № 2010/0036097 и 2004/0175337. Предпочтительные компоненты IL-2 включают таковые с аминокислотной последовательностью, включающей последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-4, и последовательностей по существу гомологичных им. Предпочтительный компонент IL-2 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 3.
В некоторых случаях компонент IL-2 будет находиться в мономерной форме, где один продукт экспрессии соответствующего пептида организован в дискретную единицу. В других случаях компонент IL-2 будет находиться в форме димера (например, димера рекомбинантного IL-2), где две мономерные формы белка ассоциированы (например, с помощью дисульфидной связи) друг с другом. Например, в контексте димера рекомбинантного человеческого IL-2, димер может находиться в форме двух мономеров, ассоциированных друг с другом с помощью дисульфидной связи, образованной из остатка Cys125 каждого мономера.
К тому же в качестве компонента IL-2 могут применяться формы-предшественники IL-2. Иллюстративная форма-предшественник IL-2 имеет последовательность SEQ ID NO: 1.
Усеченные виды, гибридные варианты и пептидные миметики любой из вышеуказанных последовательностей также могут служить в качестве компонента IL-2. Биологически активные фрагменты, варианты с делецией, варианты с замещением или варианты с добавлением любого из вышеуказанного, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторую степень активности IL-2, также могут служить в качестве компонента IL-2.
Для любого указанного пептида или белкового компонента можно определить, имеет ли данный компонент активность IL-2. Различные способы определения активности IL-2 in vitro описаны в уровне техники. Иллюстративный подход представляет собой анализ пролиферации клеток CTTL-2, описанный в экспериментальной части ниже. Иллюстративный подход описан у Moreau et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1047-1056). Кратко, в анализе неспецифичного связывания обеспечивают предварительное инкубирование предлагаемого компонента IL-2 в течение одного часа при 4°С в присутствии клеточной линии, несущей рецептор IL-2. После этого обеспечивают инкубирование 125I-меченного IL-2 в системе в течение трех часов при 4°С. Данные выражают как % ингибиторной способности активности предлагаемого компонента IL-2 в сравнении с IL-2 дикого типа. Другие методики, известные в уровне техники, также можно применять для оценки функции IL-2, в том числе электрометрические, спектрофотометрические, хроматографические и радиометрические методики.
Водорастворимый полимер.
Как уже указано, каждый конъюгат содержит компонент IL-2, прикрепленный к водорастворимому полимеру. Что касается водорастворимого полимера, то водорастворимый полимер является непептидным, нетоксичным, не встречающимся в природе и биосовместимым. Что касается биосовместимости, вещество считается биосовместимым, если благоприятные эффекты, ассоциированные с применением вещества самого или с другим веществом (например, активным средством, таким как компонент IL-2), по отношению к живым тканям (например, введение пациенту) превосходят любые губительные эффекты, как оценивает клиницист, например терапевт. Что касается неиммуногенности, вещество считается неиммуногенным, если предусматриваемое применение вещества in vivo не приводит к нежелательному иммунному ответу (например, к образованию антител) или, если иммунный ответ происходит, то такой ответ не воспринимается как клинически значимый или важный, как оценивает клиницист. Особенно предпочтительно, чтобы непептидный водорастворимый полимер являлся биосовместимым и неиммуногенным.
Кроме того, полимер, как правило, отличается тем, что имеет от 2 до приблизительно 300 концевых элементов. Примеры таких полимеров включают, но без ограничений, поли(алкиленгликоли), такие как полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля и т.п., поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(а-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ) (которые описаны в WO 2008/106186), поли(N-акрилоилморфолин) и комбинации любого из вышеуказанного.
Водорастворимый полимер не ограничивается определенной структурой и может быть линейным (например, с концевой блокирующей группой, например, алкокси-PEG или бифункциональным PEG), разветвленным или многоплечим (например, вильчатым PEG или PEG, прикрепленным к полиольному ядру), древовидного (или звездчатого) строения, каждый с одной или несколькими разрушаемыми связями или без них. Более того, внутренняя структура водорастворимого полимера может быть организована в любое количество различных повторяющихся паттернов и может быть выбрана из группы, состоящей из гомополимера, чередующегося сополимера, случайного сополимера, блок-сополимера, чередующегося триполимера, случайного триполимера и блок-триполимера.
- 8 037083
Как правило, активированный PEG и другие активированные водорастворимые полимеры (т.е. полимерные реагенты) активируют с помощью подходящей активирующей группы, которая пригодна для связывания с требуемым сайтом на компоненте IL-2. Таким образом, полимерный реагент будет обладать реакционноспособной группой для реакции с компонентом IL-2. Типичные полимерные реагенты и способы конъюгирования этих полимеров с активным компонентом известны из уровня техники и дополнительно описаны у Zalipsky S. et al., Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides в Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J.M. Harris, Plenus Press, New York (1992) и у Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182. Иллюстративные активирующие группы, подходящие для связывания с компонентом IL-2, включают, наряду с прочими, гидроксил, малеимид, сложный эфир, ацеталь, кеталь, амин, карбоксил, альдегид, альдегидгидрат, кетон, винилкетон, тион, тиол, винилсульфон, гидразин.
Предпочтительно, полимерный реагент, применяемый для получения конъюгатов, описанных в данном документе, получают без применения фосгена. Такой подход отличается, например, от раскрытия, изложенного в патенте США № 4902502, в котором, в частности, описывается образование хлорформиата и его последующее применение для образования активного сложного эфира PEG, который затем вводят в реакцию с IL-2. Применение фосгена приводит к образованию хлороводорода, который может привести к расщеплению цепи в полимере, таким образом, повышая количество примесей, которые нельзя удалить с применением традиционных методик. Таким образом, не желая быть связанным теорией, конъюгаты компонента IL-2, получаемые из полимерных реагентов, образованных без применения фосгена, предусматривают композиции более высокого качества, в которых по существу отсутствуют продукты распада полимерной цепи. Также, в одном или нескольких вариантах осуществления спейсерный компонент между водорастворимым полимером и компонентом IL-2 представляет собой спейсерный компонент, не содержащий карбамат.
Как правило, средневесовая молекулярная масса водорастворимого полимера в конъюгате составляет от приблизительно 100 Да до приблизительно 150000 Да. Иллюстративные диапазоны, однако, включают средневесовые молекулярные массы в диапазоне от больше 5000 Да до приблизительно 100000 Да, в диапазоне от приблизительно 6000 Да до приблизительно 90000 Да, в диапазоне от приблизительно 10000 Да до приблизительно 85000 Да, в диапазоне от больше 10000 Да до приблизительно 85000 Да, в диапазоне от приблизительно 20000 Да до приблизительно 85000 Да, в диапазоне от приблизительно 53000 Да до приблизительно 85000 Да, в диапазоне от приблизительно 25000 Да до приблизительно 120000 Да, в диапазоне от приблизительно 29000 Да до приблизительно 120000 Да, в диапазоне от приблизительно 35000 Да до приблизительно 120000 Да и в диапазоне от приблизительно 40000 Да до приблизительно 120000 Да. Для любого указанного водорастворимого полимера предпочтительны PEG с молекулярной массой в одном или нескольких из этих диапазонов.
Иллюстративные средневесовые молекулярные массы для водорастворимого полимера включают приблизительно 100 Да, приблизительно 200 Да, приблизительно 300 Да, приблизительно 400 Да, приблизительно 500 Да, приблизительно 600 Да, приблизительно 700 Да, приблизительно 750 Да, приблизительно 800 Да, приблизительно 900 Да, приблизительно 1000 Да, приблизительно 1500 Да, приблизительно 2000 Да, приблизительно 2200 Да, приблизительно 2500 Да, приблизительно 3000 Да, приблизительно 4000 Да, приблизительно 4400 Да, приблизительно 4500 Да, приблизительно 5000 Да, приблизительно 5500 Да, приблизительно 6000 Да, приблизительно 7000 Да, приблизительно 7500 Да, приблизительно 8000 Да, приблизительно 9000 Да, приблизительно 10000 Да, приблизительно 11000 Да, приблизительно 12000 Да, приблизительно 13000 Да, приблизительно 14000 Да, приблизительно 15000 Да, приблизительно 20000 Да, приблизительно 22500 Да, приблизительно 25000 Да, приблизительно 30000 Да, приблизительно 35000 Да, приблизительно 40000 Да, приблизительно 45000 Да, приблизительно 50000 Да, приблизительно 55000 Да, приблизительно 60000 Да, приблизительно 65000 Да, приблизительно 70000 Да и приблизительно 75000 Да. Также можно применять разветвленные виды водорастворимого полимера (например, разветвленный водорастворимый полимер 40000 Да состоит из двух полимеров 20000 Да) с любой общей молекулярной массой из вышеуказанных. В одном или нескольких вариантах осуществления конъюгат не будет иметь каких-либо прикрепленных компонентов PEG, либо напрямую, либо опосредованно, в случае PEG со средневесовой молекулярной массой меньше приблизительно 6000 Да.
При применении в качестве полимера PEG, как правило, будут содержать ряд мономеров (ОСН2СН2) [или мономеров (СН2СН2О), в зависимости от того, как определяют PEG]. Как применяется на протяжении всего описания, число повторяющихся элементарных звеньев указывается с помощью нижнего индекса n в (OCH2CH2)n. Таким образом, значение (n), как правило, находится в пределах одного или нескольких из следующих диапазонов: от 2 до приблизительно 3400, от приблизительно 100 до приблизительно 2300, от приблизительно 100 до приблизительно 2270, от приблизительно 136 до приблизительно 2050, от приблизительно 225 до приблизительно 1930, от приблизительно 450 до приблизительно 1930, от приблизительно 1200 до приблизительно 1930, от приблизительно 568 до приблизительно 2727, от приблизительно 660 до приблизительно 2730, от приблизительно 795 до приблизительно 2730, от приблизительно 795 до приблизительно 2730, от приблизительно 909 до приблизительно 2730 и от приблизительно 1200 до приблизительно 1900. Для любого указанного полимера, у которого
- 9 037083 молекулярная масса известна, можно определить количество повторяющихся звеньев (т.е. n) с помощью деления общей средневесовой молекулярной массы полимера на молекулярную массу повторяющегося мономера.
Одним особенно предпочтительным полимером для применения в настоящем изобретении является полимер с заблокированным концом, т.е. полимер по меньшей мере с одним концевым элементом, блокированным относительно инертной группой, такой как низшая C1-6 алкоксигруппа, хотя гидроксильная группа также может применяться. Если полимер представляет собой PEG, например, предпочтительно применять метокси-PEG (обычно называемый как mPEG), который представляет собой линейную форму PEG, где один концевой элемент полимера представляет собой метоксильную группу (-ОСН3), в то время как другой концевой элемент представляет собой гидроксил или другую функциональную группу, которую необязательно можно химически модифицировать.
В одной форме, применимой в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения, свободный или несвязанный PEG представляет собой линейный полимер, заканчивающийся на каждом конце гидроксильными группами:
НО-СН2СН2О-(СН2СН2О)п-СН2СН2-ОН, где (n), как правило, находится в диапазоне от нуля до приблизительно 4000.
Вышеуказанный полимер, α-, ω-дигидроксилполи(этиленгликоль), можно представить в краткой форме как HO-PEG-OH, где понимается, что символ -PEG-может представлять следующую структурную единицу:
-СН2СН2О-(СН2СН2О)п-СН2СН2-, где (n) является таким, как определено выше.
Другим типом PEG, применимым в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения, является метокси-PEG-OH, или коротко mPEG, в котором один концевой элемент представляет собой относительно инертную метоксильную группу, в то время как другой концевой элемент представляет собой гидроксильную группу. Структура mPEG указана ниже:
СНзО-СН2СН2О-(СН2СН2О)п-СН2СН2-ОН, где (n) является таким, как определено выше.
Многоплечие или разветвленные молекулы PEG, такие как описываемые в патенте США № 5932462, также можно применять в качестве полимера PEG. Например, PEG может иметь структуру:
Р°!Уа—Р
R—С-I polyb—Q , где polya и polyb представляют собой главные цепи PEG (либо одинаковые, либо различные), такие как метоксиполи(этиленгликоль);
R представляет собой нереакционноспособный компонент, такой как Н, метил или главная цепь PEG; и
Р и Q представляют собой нереакционноспособные связи. В предпочтительном варианте осуществления разветвленный PEG полимер представляет собой двузамещенный метоксиполи(этиленгликолем) лизин. В зависимости от применяемого конкретного компонента IL-2 реакционноспособная сложноэфирная функциональная группа двузамещенного лизина может дополнительно модифицироваться с образованием функциональной группы, подходящей для реакции с целевой группой в пределах компонента IL-2.
К тому же PEG может включать вильчатый PEG. Пример вильчатого PEG представлен следующей структурой:
Z /
PEG-X-CH \
Z, где X представляет собой спейсерный компонент из одного или нескольких атомов, и каждый Z представляет собой активированную концевую группу, связанную с СН посредством цепочки из атомов определенной длины. В публикации международной заявки на патент WO 99/45964 раскрываются различные вильчатые структуры PEG, которые можно применять в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения. Цепь из атомов, связывающая функциональные группы Z с разветвляющим атомом углерода, служит в качестве привязывающей группы и может включать, например, алкильные цепи, эфирные цепи, сложноэфирные цепи, амидные цепи и их комбинации.
Полимер PEG может включать боковую цепь молекулы PEG с реакционноспособными группами, такими как карбоксильная, ковалентно прикрепленными скорее по длине PEG, а не на конце цепи PEG. Реакционноспособные группы боковых цепей могут прикрепляться к PEG напрямую или через спейсерный компонент, такой как алкиленовая группа.
- 10 037083
Кроме вышеописанных форм PEG, полимер также можно получать с одной или несколькими слабыми или разрушаемыми связями в полимере, включая любой из вышеописанных полимеров. Например, PEG можно получать со сложноэфирными связями в полимере, которые подвергаются гидролизу. Как показано ниже, этот гидролиз приводит в результате к расщеплению полимера на фрагменты с более низкой молекулярной массой:
-PEG-CO2-PEG- + Н2О ----► -PEG-CO2H + HO-PEG-.
Другие гидролитически разрушаемые связи, применимые в качестве разрушаемой связи в пределах главной цепи полимера и/или в качестве разрушаемой связи с компонентом IL-2, включают: карбонатные связи; иминовые связи, образующиеся в результате, например, реакции амина и альдегида (см., например, Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3); связи на основе сложного эфира фосфорной кислоты, образованные, например, с помощью реакции спирта с фосфатной группой; гидразоновые связи, которые, как правило, образуются с помощью реакции гидразида и альдегида; ацетальные связи, которые, как правило, образуются с помощью реакции между альдегидом и спиртом; ортоэфирные связи, которые, например, образуются с помощью реакции между формиатом и спиртом; амидные связи, образованные с помощью аминогруппы, например, на конце полимера, такого как PEG, и карбоксильной группы другой цепи PEG; уретановые связи, образованные в результате реакции, например, PEG с концевой изоцианатной группой и PEG-спиртом; пептидные связи, образованные с помощью аминогруппы, например, на конце полимера, такого как PEG, и карбоксильной группы пептида, и олигонуклеотидные связи, образованные с помощью, например, фосфорамидитной группы, например, на конце полимера, и 5'-гидроксильной группы олигонуклеотида.
Такие необязательные признаки конъюгата, т.е. введение одной или нескольких разрушаемых связей в полимерную цепь или в компонент IL-2, можно предусматривать для дополнительного контроля за конечными требуемыми фармакологическими свойствами конъюгата при введении. Например, можно вводить крупный и относительно инертный конъюгат (т.е. с одной или несколькими высокомолекулярными цепями PEG, прикрепленными к нему, например, одной или несколькими цепями PEG с молекулярной массой больше приблизительно 10000, где конъюгат по сути не обладает биоактивностью), который разрывается с образованием биоактивного конъюгата, обладающего частью исходной цепи PEG. Следовательно, свойства конъюгата можно более эффективно адаптировать для оптимизации биоактивности конъюгата с течением времени.
Водорастворимый полимер, ассоциированный с конъюгатом, также может быть поддающимся разрыву. Т.е. водорастворимый полимер разрывается (или посредством гидролиза, ферментативных процессов, каталитических процессов, или иным способом), таким образом, что приводит в результате к неконъюгированному компоненту IL-2. В некоторых случаях поддающиеся разрыву полимеры отделяются от компонента IL-2 in vivo, не оставляя какого-либо фрагмента водорастворимого полимера. В других случаях поддающиеся разрыву полимеры отделяются от компонента IL-2 in vivo, оставляя относительно небольшой фрагмент (например, сукцинатную метку) из водорастворимого полимера. Иллюстративный расщепляемый полимер включает таковой, присоединяемый к компоненту IL-2 посредством карбонатной связи.
Специалисты в данной области будут понимать, что вышеизложенное обсуждение, касающееся непептидного и водорастворимого полимера, далеко не исчерпывающее и имеет лишь иллюстративный характер, и что предусматриваются все полимерные материалы, обладающие качествами, описанными выше. Применяемое в данном документе выражение полимерный реагент в целом относится ко всей молекуле, которая может содержать сегмент водорастворимого полимера и функциональную группу.
Как описано выше, конъюгат настоящего изобретения содержит водорастворимый полимер, ковалентно прикрепленный к компоненту IL-2. Как правило, для любого указанного конъюгата будет существовать от одного до трех водорастворимых полимеров, ковалентно прикрепленных к одному или нескольким компонентам с активностью IL-2. В некоторых случаях, однако, конъюгат может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более водорастворимых полимеров, самостоятельно прикрепленных к компоненту IL-2. Любой указанный водорастворимый полимер может ковалентно присоединяться или к аминокислоте компонента IL-2, или, если компонент IL-2 представляет собой (например) гликопротеин, к углеводу компонента IL-2. Прикрепление к углеводу можно выполнять, например, с применением метаболической функцианализации с использованием химии сиаловой кислоты-азида [Luchansky et al. (2004) Biochemistry 43(38): 12358-12366] или других подходящих подходов, таких как применение глицидола для облегчения введения альдегидных групп [Heldt et al. (2007) European Journal of Organic Chemistry 32:54295433].
Определенная связь в пределах компонента с активностью IL-2 и полимера зависит от ряда факторов. Такие факторы включают, например, химию определенной используемой связи, определенный компонент IL-2, доступные функциональные группы в пределах компонента IL-2 (или для прикрепления к полимеру, или превращения в подходящий сайт прикрепления), присутствие дополнительных реакционноспособных функциональных групп в пределах компонента IL-2 и т.п.
Конъюгаты настоящего изобретения могут представлять собой, хотя не обязательно, пролекарства, а это означает, что связь между полимером и компонентом IL-2 поддается разрыву, что обеспечивает
- 11 037083 возможность высвобождения исходного компонента. Иллюстративные поддающиеся разрыву связи включают сложный эфир карбоновой кислоты, сложный эфир фосфорной кислоты, тиоловый сложный эфир, ангидриды, ацетали, кетали, ацилоксиалкиловые сложные эфиры, имины, ортоэфиры, пептиды и олигонуклеотиды. Такие связи можно легко получать с помощью подходящей модификации или компонента IL-2 (например, карбоксильной группы С-конца белка или гидроксильной группы боковой цепи аминокислоты, такой как серин или треонин, содержащейся в белке, или подобной функциональности в углеводе), и/или полимерного реагента с применением способов связывания, широко используемых в области техники. Наиболее предпочтительными, однако, являются поддающиеся разрыву связи, которые легко образуются с помощью реакции активированного подходящим образом полимера с немодифицированной функциональной группой, содержащейся в пределах компонента с активностью IL-2.
Кроме того, в качестве связи для соединения компонента IL-2 также может использоваться гидролитически устойчивая связь, такая как амидная, уретановая (также известная как карбаматная), аминная, через простой тиоэфир (также известная как сульфидная) или мочевинная (также известная как карбамидная). К тому же предпочтительной гидролитически устойчивой связью является амид. В одном подходе водорастворимый полимер, несущий активированный сложный эфир, можно вводить в реакцию с аминогруппой на компоненте IL-2, что, таким образом, приводит к амидной связи.
Конъюгаты (в отличие от неконъюгированного компонента IL-2) могут обладать или могут не обладать измеримой степенью активности IL-2. Другими словами, конъюгат полимер-компонент IL-2 в соответствии с настоящим изобретением будет в любом случае обладать биоактивностью в пределах от приблизительно 0,1% до приблизительно 100% биоактивности немодифицированного исходного компонента IL-2. В некоторых случаях конъюгаты полимер-компонент IL-2 могут иметь биоактивность более 100% биоактивности немодифицированного исходного компонента IL-2. Предпочтительно, конъюгаты, обладающие небольшой или с отсутствием активности IL-2, содержат гидролизуемую связь, соединяющую полимер с компонентом, так что независимо от отсутствия (или относительного отсутствия) активности у конъюгата активная исходная молекула (или ее производное) высвобождается при индуцированном водой расщеплении гидролизуемой связи. Такую активность можно определить с применением подходящей in-vivo или in-vitro модели в зависимости от известной активности определенного используемого компонента с активностью IL-2.
Для конъюгатов, обладающих гидролитически устойчивой связью, которая связывает компонент с активностью IL-2 с полимером, конъюгат, как правило, будет обладать измеримой степенью биоактивности. Например, такие конъюгаты, как правило, отличаются тем, что имеют биоактивность, отвечающую одной или нескольким из следующих процентных долей относительно биоактивности неконъюгированного компонента IL-2: по меньшей мере приблизительно 2%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 100% и более 105% (при измерении на подходящей модели, такой как те, что хорошо известные в области техники). Предпочтительно, конъюгаты с гидролитически устойчивой связью (например, амидной связью) будут обладать по меньшей мере некоторой степенью биоактивности немодифицированного исходного компонента с активностью IL-2.
Теперь будут описаны иллюстративные конъюгаты в соответствии с настоящим изобретением. Как правило, ожидается, что такой компонент IL-2 имеет (по меньшей мере, частично) аминокислотную последовательность, подобную последовательности, обеспечиваемой по меньшей мере в одной из SEQ ID NO: 1-4. Таким образом, несмотря на то что будет делаться ссылка на определенные положения или атомы в пределах SEQ ID NO: 1-4, такая ссылка приводится только для удобства и специалист в данной области сможет легко определить соответствующее положение или атом в других компонентах с активностью IL-2. В частности, описание, предусматриваемое в данном документе, для нативного человеческого IL-2 часто применимо к фрагментам, вариантам с делецией, вариантам с замещением или вариантам с добавлением любого из вышеуказанного.
Аминогруппы на компонентах IL-2 предусматривают точку прикрепления компонента IL-2 к водорастворимому полимеру. При применении аминокислотной последовательности, обеспеченной в SEQ ID NO: 1-4, очевидно, что в каждой имеется несколько лизиновых остатков с ε-аминокислотой, которая может быть доступна для конъюгации. Более того, N-концевая аминогруппа любого белка также может служить точкой прикрепления.
Имеется ряд примеров подходящих полимерных реагентов, применимых для образования ковалентных связей с доступными аминогруппами компонента IL-2. Конкретные примеры вместе с соответствующим конъюгатом представлены в табл. 1 ниже. В таблице переменная (n) представляет количество повторяющихся мономерных звеньев, и -NH-(IL-2) представляет остаток компонента IL-2 после конъюгации с полимерным реагентом. Хотя каждая полимерная часть [например, (OCH2CH2)n или (СН2СН2О)п], представленная в табл. 1, оканчивается группой СН3, она может быть замещена другими
- 12 037083 группами (такими как Н и бензил).
Т аблица 1. Полимерные реагенты, селективные в отношении амина, и образованный из них конъюгат с компонентом IL-2
Н3СО—(CH2CH2O)n-C'N
Н3СО—(СН2СН2О)П-С-О
N-O-C-CH2CH2—(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-C-O-N
Амидные связи
CH2)4-NH-CH2CH2-(OCH2CH2)n-OCH2CH2C-O-N
Амидная связь
H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-C-O-N
Амидная связь
Амидная связь
Н3СО—(CH2CH2O)n-CH2CH2SH-CH2CH2-C-O-N
Амидная связь
H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2CH2-C-O-N
Н3С-(ОСН2СН2)П-О-СН2СН2СН2-С---NH-(IL-2
Амидная связь
H3C-(OCH2CH2)n-O-C-O-N сукцинимидильные реагенты сукцинимидильные реагенты
Н3со—(CH2CH2O)n-C-NH-(IL-2
Н3СО—(СН2СН2О n-C-NH-(IL-2
Н3со-(CH2CH2O)n-C-NH-UL-2)
Н3С-(ОСН2СН2)п-О-С----NH—(IL-2)
H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2-C-N-(IL-2
Амидная связь
Полимерный реагент
Соответствующий конъюгат mPEG-оксикарбонилимидазольные реагенты mPEG-нитрофенильные реагенты mPEG-трихлорфенил-карбонатные реагенты mPEG-сукцинимидильные реагенты
Гомобифункциональные PEGГ етеробифункциональные PEG mPEG-сукцинимидильные реагенты mPEG-сукцинимидильные реагенты mPEG-сукцинимидильные реагенты mPEG-сукцинимидильные реагенты mPEG-бензотриазол-карбонатные реагенты mPEG-сукцинимидильные реагенты
Карбаматная связь
Карбаматная связь
Карбаматная связь
Карбаматная связь
Карбаматная связь
- 13 037083
Н3СО-(СН2СН2О),
O-C-O-N
НзСО-ССНгСНгО),
O-C-NH-(IL-2)
О mPEG-сукцинимидильные реагенты
Амидная связь
H3CO-(CH2CH2O)n-C-O-N о
mPEG-сукцинимидильные реагенты о
H3CO-(CH2CH2O)n-C-O-NH-(IL-2)
Амидная связь
НзС-(ОСН2СН2)п-О-С-МН-СН2-СН2-СН2-СН2 о (
II /
H3C-(OCH2CH2)n-O-C-NH ; о Яз
Я и >
CH-C-O-N о II
H3C-(OCH2CH2)n-O-C-NH-CH2-CH2-CH2-CH2 о ' II /
H3C-(OCH2CH2)n-O-C-NH > О
Ή II С—С--ΝΗ (IL-2)
Разветвленные mPEG2-NАмидная связь гидроксисукцинимидные реагенты о
II
H3C-(OCH2CH2)n-O-C-NH сн2 сн2 сн2 сн2 о о сн—c-nh-ch2ch
II /
H3C-(OCH2CH2)„-O-C-NH о
II
H3C-(OCH2CH2)„-O-C-NH сн2 сн2 сн2 сн2 о
I и
О С--С-NH-CH2CH2—NH-(IL-2)
II /н
H3C-(OCH2CH2)n-O-C-NH
Разветвленные тРЕО2-альдегидные реагенты
Связь через вторичный амин
H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2<-O-CHCH2-C-O-N сн3 о' mPEG-сукцинимидильные реагенты
H3CO-(CH2CH2O)n-C-CH2CH2-C-O-N
NH (IL-2)
Н3С-(ОСН2СН2)п-О-СН2С-О-СНСН2-С — I
СНз( ___________Амидная связь__________
ОО
IIII
H3CO-(CH2CH2O)n-C-CH2CH2-C-NH—(IL-2)
Амидная связь
О mPEG-сукцинимидильные реагенты
N-O-C-CH2CH-O-C-(OCH2CH2)n-OCO-CHCH2-CO-N онCH;
Гомобифункциональные PEGсукцинимидильные реагенты о
о' (IL-2)—NH-C-CH2CH-O-C-(OCH2CH2)„-O С O-CHCH2-C-NH-(IL-2)
СН3
СНз
Амидные связи
H3CO-(CH2CH2O)n-CH2-CH—C-O-N сн3 о' mPEG-сукцинимидильные реагенты
H3CO-(CH2CH2O)n-CH2-CH-C-NH-(IL-2) СН3
Амидная связь
- 14 037083
x « ϊ К 1 N-O-C-CH2CH2-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-C-O-N 1 О GH3 ch3 o' Гомобифункциональные PEG-сукцинимидилпропионатные реагенты | о О II II (IL-2)—NH-C-CH2CH2-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-C-NH—(IL-2) 1 1 СН3 СН3 Амидные связи |
°' А H3CO-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-CH-C-O-N 1 СНз ο< mPEG-сукцинимидильные реагенты | О II Н3СО-(СН2СН2О)п-СН2'СН2-СН-С-МН-(1Е2) СНз Амидная связь |
о H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2 Q θ 1 и /η hc-och2-ch2-ch-c-o-n i? 1 A3 H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2 0 о Разветвленные mPEG2-Nгидроксисукцинимидные реагенты | о H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2 0 1 и НС-ОСН2СН2 CH-C-NH-(IL-2) II 1 сн3 H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2 2 Амидная связь |
о H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2 Q °x 1 и /% hc-och2-ch2-ch2-c-o-n^J H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2 Ό Разветвленные mPEG2-Nгидроксисукцинимидные реагенты | о H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2 о 1 и НС-ОСН2СН2 CH2-C-NH-(IL-2) II 1 H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2 Амидная связь |
О и /=\ H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2-CH2-C-S-<\ Λ Ν— Реагенты mPEG-сложные тиоэфиры | о II Н3С-(ОСН2СН2)П-О-СН2 СН2 с—NH—(IL-2) Амидная связь (как правило, с компонентом IL-2 с N-концевым цистеином или гистидином) |
О О II II НС-СН2СН2-(ОСН2СН2)П-О-СН2СН2-СН Гомобифункциональные PEGпропиональдегидные реагенты | NH — СН2СН2СН2-(ОСН2СН2)П-О-СН2СН2-СН2 — NH (IL-2) (IL-2) Связи через вторичный амин |
О II Н3С-(ОСН2СН2)п-О-СН2СН2-СН mPEG-пропиональдегидные реагенты | НзС-(ОСН2СН2)п-О-СН2СН2-СН2—NH—(IL-2) Связь через вторичный амин |
О о II II НССН2СН2СН2-(ОСН2СН2)п-О-СН2СН2СН2-СН Гомобифункциональные PEGбутиральдегидные реагенты | HN-CH2CH2CH2CH2-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2CH2-CH2-NH (IL-2) (IL-2) Связи через вторичный амин |
- 15 037083
о H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2CH2-CH mPEG-бутиральдегидные реагенты | Н3С-(ОСН2СН2)П-О-СН2СН2СН2-СН2 NH—(IL-2) Связь через вторичный амина |
о о II II НзС-(ОСН2СН2)п-О-С-ЫН—(СН2СН2О)4—сн2сн2сн2сн mPEG-бутиральдегидные реагенты | 0 Н3С-(ОСН2СН2)„-О-С NH-(CH2CH2O)4—СН2СН2СН2СН2—NH (IL-2) Связь через вторичный амин |
о о о II II II С—(OCH2CH2)n-O-C-NH-(CH2CH2O)4—СН2СН2СН2СН HN о \ II (СН2СН2О)4—СН2СН2СН2СН Гомобифункциональные PEGбутиральдегидные реагенты | о о II и С—(OCH2CH2)n-O-C NH-(CH2CH2O)4—CH2CH2CH2CH2-NH-(IL-2) HN \сн2сн2о)4—С Н2С Н2С Н2С Η2-Ν Η - (1L-2) Связи через вторичный амин |
0 II „ H3C-(OCH2CH2)n-O-C-NH-CH2-CH2-CH2-CH2 0 0 о CH-C-NH-(CH2CH2O)4-CH2CH2CH2CH H3C-(OCH2CH2)n-O-C-NH Разветвленные шРЕО2-бутиральдегидные реагенты | 0 II НзС^ОСНгСН^-О-С-ЫН-СНг-СНг-С^ 0 0 С—С—NH—(CH2CH2O)4-CH2CH2CH2CH2-NH H3C-(OCH2CH2)i1-O-C-NH/ I (IL-2) Связь через вторичный амин |
О H3C-(OCH2CH2)n-nh-c-o-ch2 о о 1 и и HC-OCH2-CH2-CH2 _C-NH—(СН2СН2О)4—СН2СН2СН2СН II 1 H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2 Разветвленные шРЕО2-бутиральдегидные реагенты | О H3C-(OCH2CH2)n--NH-C-O-CH2 0 1 и HC-OCH2CH2CH2-C-NH-(CH2CH2O)4—CH2CH2CH2CH2-NH-(IL-2) Η 1 H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2 Связь через вторичный амин |
осн2сн3 н3с-(осн2сн2)п—о-сн2-сн—осн2сн3 mPEG-ацетальные реагенты | Н3С-(ОСН2СН2)П-О-СН2СН2---NH-(IL-2) Связь через вторичный амин |
О 11 H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-C—N 2=0 mPEG-пиперидоновые реагенты | О И H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-C-N 2“ΝΗ-(ΙΕ2) Связь через вторичный амин (с вторичным углеродом) |
О II Н3С—(ОСН2СН2)П-О-(СН2)2.5—с—сн3 mPEG-метилкетоновые реагенты | ΝΗ—(IL-2) Н3С-(ОСН2СН2)П-О-(СН2)2.5—СН-СН3 Связь через вторичный амин (с вторичным углеродом) |
О II Н3со—(CH2CH2O)n—S_CH2—CF3 о mPEG-трезилатные реагенты | Н3СО-(СН2СН2О)П-СН2СН2—NH—(IL-2) Связь через вторичный амин |
- 16 037083 о,
H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2—N |
О mPEG-малеимидные реагенты (при определенных условиях реакции, таких как рН>8) о,
Н3С-(ОСН2СН2)П-О-СН2СН2—
NH-(IL-2)
Связь через вторичный амин о /Ю
НзС-(ОСН2СН2)п-О-СН2СН2-МН-С-СН2СН2-М |
Н3С-(ОСН2СН2)П-
—(IL-2)
О mPEG-малеимидные реагенты (при определенных условиях реакции, таких как _________________рН>8)_________________
S S X
H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-C-NH-CH2CH2-NH-C-CH2CH2-N | mPEG-малеимидные реагенты (при определенных условиях реакции, таких как рН>8)
Связь через вторичный амин
H3C“(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-C-NH-CH2CH2-NH-C-CH2CH2-N
Связь через вторичный амин
Разветвленные шРЕС2-малеимидные 11 I
H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-C-NH-| mPEG вильчатые малеимидные реагенты (при определенных условиях реакции, таких как реагенты (при определенных условиях реакции, таких как рН>8)
Н3С-(ОСН2СН2)П-О-СН2СНСН2 он I Н3С—(OCH2CH2)n-O-CH2CHCH2—NH-(IL-2) mPEG-эпоксидные реагенты (при определенных условиях реакции, таких как pH >8)
Связь через вторичный амин
- 17 037083
СНзОДСНгСНгО^-СНгСНг-О
Разветвленное mPEG производное п-ОСНз
СНзСЦСНгСНгО^-СНгСНг-О
Разветвленное mPEG производное
СНзСНСНзСНзО^-СНзСНз-
О-СН2СН2-(ОСН2СН2)п-ОСНз
Разветвленное mPEG производное
Поддающаяся разрыву связь
СН3О-(СН2СН2О)П-СН2СН2-О
О-СН2СН2-(ОСН2СН2)П-ОСН3
Поддающаяся разрыву связь
Разветвленное mPEG производное
Разветвленное mPEG производное
ОЮН2СН2-(ОСН2СН2)П-ОСН3
Поддающаяся разрыву связь
О-СН2СН2-(ОСН2СН2)П-ОСН3
СН3О-(СН2СН2О)П-СН2СН2-О
СН3О-(СН2СН2О)П-СН2СН2-О
Разветвленное mPEG производное
СНзО-(СН2СН2О)п-СН2СН2-(
Разветвленное mPEG производное
2-(ОСН2СН2)п-ОСНз
Поддающаяся разрыву связь
СН3О-(СН2СН2О)Г1-СН2СН2-О
-О-СНгСНг-^СНгСН^.-ОСНз
Поддающаяся разрыву связь
Конъюгация полимерного реагента с аминогруппой компонента IL-2 может выполняться с помощью ряда методик. В одном подходе компонент IL-2 можно конъюгировать с полимерным реагентом, функционализированным сукцинимидильным производным (или другой активированной сложноэфир ной группой, причем можно применять подходы, аналогичные описанным для этих альтернативных полимерных реагентов, содержащих активированную сложноэфирную группу). В этом подходе полимер, несущий сукцинимидильное производное, можно присоединять к компоненту IL-2 в водной среде при рН 7-9,0, хотя применении отличающихся условий реакции (например, более низкого рН, такого как 6-7, или различных температур и/или меньше 15°С) может приводить к прикреплению полимера к отличающемуся положению на компоненте IL-2. К тому же амидная связь может образоваться при вступлении непептидного водорастворимого полимера с концевой аминогруппой в реакцию с компонентом IL-2, несущим активирующую группу карбоновой кислоты.
Иллюстративные конъюгаты охватываются следующей структурой:
О II H3CO-(CH2CH2O)n—X—CH-C-NH—(IL-2)
R1 где n представляет собой целое число со значением от 2 до 4000;
X представляет собой спейсерный компонент;
R1 представляет собой органический радикал; и
IL-2 представляет собой остаток компонента IL-2.
Иллюстративные конъюгаты охватываются следующей структурой:
О
II
Н3СО-(СН2СН2О)п-СН2-СН-C-NH-(IL-2)
СН3 где n представляет собой целое число со значением от 2 до 4000 и IL-2 представляет собой остаток компонента IL-2.
Типичным другим подходом, применимым для конъюгирования компонента IL-2 с полимерным ре агентом, является применение восстановительного аминирования для конъюгирования первичного амина компонента IL-2 с полимерным реагентом, функцианализированным кетоном, альдегидом или их гидра
- 18 037083 тированной формой (например, гидратом кетона, гидратом альдегида). В этом подходе первичный амин из компонента IL-2 реагирует с карбонильной группой альдегида или кетона (или соответствующей гидроксил-содержащей группой гидратированного альдегида или кетона), при этом образуя Шиффово основание. Шиффово основание затем, в свою очередь, может восстановлением превращаться в устойчивый конъюгат посредством применения восстанавливающего средства, такого как борогидрид натрия. Возможны селективные реакции (например, на N-конце), в частности с полимером, функцианализированным кетоном или разветвленным α-метил альдегидом и/или при специфических условиях реакции (например, пониженном pH).
Иллюстративные конъюгаты настоящего изобретения, где водорастворимый полимер представлен в разветвленной форме, включают таковые, в которых водорастворимый полимер охватывается следующей структурой:
О
H3CO-(CH2CH2O)n—ch2ch2-nh-c-oо -о—
H3CO-(CH2CH2O)n—ch2ch2-nh—с-огде каждый n независимо представляет собой целое число со значением от 2 до 4000.
Иллюстративные конъюгаты настоящего изобретения охватываются следующей структурой:
H3CO-(CH2CH2O)n—CH2CH2-NH-C-O-i r2
I
О II
-O-X-(CH2CH2O)b-C—NH-(IL-2)
H3CO-(CH2CH2O)n-ch2ch2-nh-c-o-1 где каждый (n) независимо представляет собой целое число со значением от 2 до 4000;
X представляет собой спейсерный компонент;
b представляет собой целое число со значением 2-6;
c представляет собой целое число со значением 2-6;
R2 в каждом случае независимо представляет собой H или низший алкил; и
IL-2 представляет собой остаток компонента IL-2.
Иллюстративные конъюгаты настоящего изобретения охватываются следующей структурой: О
H3CO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-C-O-i о
II о —OCH2CH2CH2-C-NH-(CH2CH2O)4-CH2CH2CH2CH2-NH-(IL-2)
H3CO-(CH2CH2O)n—ch2ch2-nh-с-огде каждый (n) независимо представляет собой целое число со значением от 2 до 4000; и IL-2 представляет собой остаток компонента IL-2.
Другие иллюстративные конъюгаты настоящего изобретения охватываются следующей структурой:
О
H3CO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-C-O-i
H3CO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-C-O-О-(Х)а-(СН2СН2О)ь.-
NH-(IL-2) где каждый n независимо представляет собой целое число со значением от 2 до 4000;
а равняется или нулю, или единице;
X, если присутствует, представляет собой спейсерный компонент, включающий один или несколько атомов;
b' равняется нулю или представляет собой целое число со значением от одного до десяти;
с представляет собой целое число со значением от одного до десяти;
R2 в каждом случае независимо представляет собой H или органический радикал;
R3 в каждом случае независимо представляет собой H или органический радикал; и
IL-2 представляет собой остаток компонента IL-2.
Еще дополнительные иллюстративные конъюгаты настоящего изобретения охватываются следующей структурой:
О
H3CO-(CH2CH2O)n—CH2CH2-NH—C-O-ι о о -O-CH2CH2CH2C-NH-(IL-2)
H3CO-(CH2CH2O)n-ch2ch2-nh-с-огде каждый n независимо представляет собой целое число со значением от 2 до 4000; и
- 19 037083
IL-2 представляет собой остаток компонента IL-2.
Иллюстративные конъюгаты, которые содержат поддающуюся разрыву связь, включают те, у которых компонент IL-2 конъюгирован с полимерным реагентом, охваченным следующей формулой:
POLY-—X1
R1
С---(FG)
R2
POLY-где POLY1 представляет собой первый водорастворимый полимер;
POLY2 представляет собой второй водорастворимый полимер;
X1 представляет собой первый спейсерный компонент;
X2 представляет собой второй спейсерный компонент;
На представляет собой ионизируемый атом водорода;
R1 представляет собой H или органический радикал;
R2 представляет собой H или органический радикал;
a равняется или нулю, или единице;
b равняется или нулю, или единице;
Re1, если присутствует, представляет собой первую группу, меняющую электронную плотность;
Re2, если присутствует, представляет собой вторую группу, меняющую электронную плотность; и (FG) представляет собой функциональную группу, способную реагировать с аминогруппой активного средства с образованием поддающейся разрыву связи, такой как карбаматная связь. В пределах этой формулы предусматриваются полимерные реагенты с более определенной структурой:
x1-poly1
Re1
Re2
R1
C---(FG)
R2 где каждый из POLY1, POLY2, X1, X2, R1, R2, Ha и (FG) представляет собой такой, как определено ранее, и Re1 представляет собой первую группу, меняющую электронную плотность; и Re2 представляет собой вторую группу, меняющую электронную плотность.
Еще дополнительные иллюстративные полимерные реагенты подпадают под следующие формулы:
о О-СН2СН2-(ОСН2СН2)п-ОСНз
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O
о
- 20 037083
где для каждой структуры и в каждом случае n независимо представляет собой целое число от 4 до 1500.
Эти полимерные реагенты, обеспечивающие поддающуюся разрыву связь, можно получать в соответствии с процедурами, изложенными в публикации заявки на патент США № 2006/0293499.
- 21 037083
Иллюстративные конъюгаты, образованные при применении полимерных реагентов, обеспечивающих поддающуюся разрыву связь, включают таковые следующей формулы:
где POLY1 представляет собой первый водорастворимый полимер;
POLY2 представляет собой второй водорастворимый полимер;
X1 представляет собой первый спейсерный компонент;
X2 представляет собой второй спейсерный компонент;
На представляет собой ионизируемый атом водорода;
R1 представляет собой H или органический радикал;
R2 представляет собой H или органический радикал;
a равняется или нулю, или единице;
b равняется или нулю, или единице;
Re1, если присутствует, представляет собой первую группу, меняющую электронную плотность;
Re2, если присутствует, представляет собой вторую группу, меняющую электронную плотность;
Y1 представляет собой О или S;
Y2 представляет собой О или S; и (IL-2) представляет собой остаток компонента IL-2.
Иллюстративные конъюгаты имеют следующую структуру:
- 22 037083
- 23 037083
где для каждой структуры и в каждом случае n независимо представляет собой целое число от 4 до 1500, и (IL-2) представляет собой остаток компонента IL-2.
Карбоксильные группы представляют другую функциональную группу, которая может служить в качестве точки прикрепления на компоненте IL-2. Структурно, конъюгат будет содержать следующее:
О
II (IL-2)-C-X-POLY , где (IL-2) и смежная карбонильная группа соответствуют карбоксилсодержащему компоненту IL-2, X представляет собой связь, предпочтительно гетероатом, выбранный из О, N(H) и S, и POLY представляет собой водорастворимый полимер, такой как PEG, необязательно оканчивающийся концевым блокирующим компонентом.
Связь С(О)-Х образуется в результате реакции между полимерным производным, несущим концевую функциональную группу, и карбоксилсодержащим компонентом IL-2. Как отмечалось выше, конкретная связь будет зависеть от типа использованной функциональной группы. Если полимер является функционализированным на конце или активированным гидроксильной группой, образующаяся в результате связь будет представлять собой сложноэфирную связь карбоновой кислоты и X будет O. Если полимерная главная цепь функционализированна тиольной группой, образующаяся в результате связь будет представлять собой связь через сложный тиоэфир и X будет S. При использовании определенных многоплечих, разветвленных или вильчатых полимеров компонент С(О)Х и, в частности, компонент X может быть относительно более сложным и может включать более длинную структуру связи.
Водорастворимые производные, содержащие гидразидный компонент, также применимы для конъюгации на карбониле и карбоновой кислоте. В случае если компонент IL-2 не содержит карбонильный компонент или карбоновую кислоту, его можно добавить с применением методик, известных специалисту в данной области. Например, карбонильный компонент можно вводить с помощью восстановления карбоновой кислоты (например, С-концевой карбоновой кислоты) и/или с помощью обеспечения гликозилированных или гликированных (где добавленные сахара имеют карбонильный компонент) видов компонента IL-2. Что касается компонентов IL-2, содержащих карбоновую кислоту, PEGгидразиновый реагент может, в присутствии связывающего средства (например, DCC), ковалентно присоединяться к компоненту IL-2 [например, mPEG-OCH2C(O)NHNH2 + HOC(O)-(IL-2) приводит в результате к mPEG-OCH2C(O)NHNHC(O)-IL-2]. Конкретные примеры водорастворимых производных, содержащих гидразидный компонент, вместе с соответствующими конъюгатами представлены в табл. 2 ниже. К тому же любое водорастворимое производное, содержащее активированный сложный эфир (например, сукцинимидильную группу), чтобы содержать гидразидный компонент может превращаться с помощью реакции содержащего активированный сложный эфир производного водорастворимого полимера с гидразином (NH2-NH2) или трет-бутилкарбазатом [NH2NHCO2C(CH3)3]. В таблице переменная n представляет количество повторяющихся мономерных единиц, и -С(О)-(IL-2) представляет остаток компонента IL-2 после конъюгации с полимерным реагентом. Необязательно, гидразоновая связь может восстанавливаться при применении подходящего восстанавливающего средства. Несмотря на то что каждая полимерная часть [например, (OCH2CH2)n или (СН2СН2О)п], представленная в табл. 2, оканчивается группой
- 24 037083
СН3, она может быть замещена другими группами (такими как H и бензил).
Таблица 2. Полимерные реагенты, специфические в отношении карбоксила, и образованный из них конъюгат с компонентом IL-2
Полимерный реагент | Соответствующий конъюгат |
0 II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-C-NH-NH2 mPEG-гидразиновые реагенты | О II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-C-NH-NH-C(O)-(IL-2) Гидразоновая связь |
0 II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-O-CH2-C--NH-NH2 mPEG-гидразиновые реагенты | О II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-O-CH2'C~NH-NH-C(O)-(IL-2) Гидразоновая связь |
0 II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-NH<-NH-NH2 mPEG-гидразиновые реагенты | 0 II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-NH'C-NH-NH-C(O)-(IL-2) Гидразоновая связь |
О II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-NH-NH-C-NH-NH2 mPEG-гидразиновые реагенты | О Н II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-N-NH-C-NH-NH-C(0)-(IL-2) Гидразоновая связь |
S H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-NH-C-NH-NH2 mPEG-гидразиновые реагенты | S II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-NH-C-NH-NH-C(O)-(IL-2) Гидразоновая связь |
S H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-NH-NH-C-NH-NH2 mPEG-гидразиновые реагенты | S Н II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-N-NH~C-NH-NH-C(0)-(IL-2) Гидразоновая связь |
о О II II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-NH-C-NH-NH-C-NH-NH2 mPEG-гидразиновые реагенты | о о II II Н3СО-(СН2СН2О)пСН2СН2-NH-с-NH-NH-C-NH-NH-C(0)-(IL-2) Гидразоновая связь |
О II H3CO-(CH2CH2O)nCH2CH2-O—c-nh-nh2 mPEG-гидразиновые реагенты | О II Н3СО-(СН2СН2О)ПСН2СН2-о-с-NH-NH-C(0)-(IL-2) Гидразоновая связь |
0 II H3CO-(CH2CH2O)nCH2-C-NH-NH2 mPEG-гидразиновые реагенты | О О II II H3CO-(CH2CH2O)nCH2-C-NH-NH-с-(IL-2) Связь C(O)NHNHC(O) |
Тиоловые группы, содержащиеся в пределах компонента IL-2, могут служить эффективными сайтами прикрепления для водорастворимого полимера. В частности, цистеиновые остатки обеспечивают тиоловые группы, когда компонент IL-2 представляет собой белок. Тиоловые группы в таких цистеиновых остатках затем могут реагировать с активированным PEG, что является специфичным для реакции с тиоловыми группами, например N-малеимидильный полимер или другие производные, описываемые в патенте США № 5739208 и в WO 01/62827. К тому же защищенный тиол можно вводить в олигосахаридную боковую цепь активированного гликопротеина с последующим снятием защиты с помощью тиол-реакционноспособного водорастворимого полимера.
Конкретные примеры реагентов вместе с соответствующим конъюгатом представлены в табл. 3 ниже. В таблице переменная n представляет количество повторяющихся мономерных единиц, и -S-(IL-2) представляет остаток компонента IL-2 после конъюгации с водорастворимым полимером. Несмотря на
- 25 037083 то что каждая полимерная часть [например, (OCH2CH2)n или (СН2СН2О)П], представленная в табл. 3, оканчивается группой СН3, она может быть замещена другими группами (такими как H и бензил).
В отношении SEQ ID NO: 1 и 2, соответствующих иллюстративным компонентам IL-2, можно видеть, что имеется цистеиновый остаток в положении 125. Таким образом, иллюстративным тиоловым сайтом прикрепления является цистеин, расположенный в положении 125. Хотя предпочтительно не нарушать никакие дисульфидные связи, ассоциированные с указанным компонентом IL-2, можно присоединить полимер в пределах боковой цепи одного или нескольких из этих цистеиновых остатков и сохранить степень активности. К тому же возможно добавить цистеиновый остаток к компоненту IL-2 с применением традиционных методик синтеза. См., например, процедуру, описанную в WO 90/12874 относительно добавления цистеиновых остатков, при этом такая процедура может адаптироваться для компонента IL-2. К тому же традиционные способы генетической инженерии также могут применяться для введения цистеинового остатка в компонент IL-2. В некоторых вариантах осуществления, однако, предпочтительно не вводить дополнительный цистеиновый остаток и/или тиоловую группу.
Таблица 3. Полимерные реагенты, селективные в отношении тиола, и образованный из них конъюгат с компонентом IL-2
S-(IL-2
Н3СО- CH2CH2O)„-C-NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH-C CH2CH2CH2-N
Полимерный реагент
Соответствующий конъюгат mPEG-малеимидныи реагент mPEG-малеимидныи реагент
Связь через простой тиоэфир
Связь через простой тиоэфир
II II / I
-(CH2CH2O)n-C-NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH-C-CH2CH2CH2-N I mPEG-малеимидныи реагент
Связь через простой тиоэфир
Гомобифункциональный mPEGСвязь через простой тиоэфир малеимидныи реагент mPEG-малеимидныи реагент mPEG-малеимидныи реагент mPEG-малеимидныи реагент
Связь через простой тиоэфир
Связь через простой тиоэфир
Связь через простой тиоэфир
Связь через простой тиоэфир
- 26 037083
Н,С-(ОСН,СН, n-NH-C-O-CH;
Разветвленный mPEG2 вильчатый
HoC-fOCHoCHoln-O-CHoCHo-S—сн=сн2
H3C-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-C-NH-CH2-CH2-SH
HsCO-iCHoCHoOk-CHoCHoCHoCHo-S-S-ilL-Z
НоСО—(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2CH2-S-S (IL-2)-S-S-CH2CH2—(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2CH2-S-S-(IL-2)
S-S-CH2CH2— СН2СН2О n-CH2CH2CH2CH2-S-S дисульфидные реагент
Разветвленный mPEG2 вильчатый реагент реагент
H?C-(OCH,CH,)n-NH-C-O-CH;
Разветвленный шРЕО2-малеимидныи
Разветвленный шРЕО2-малеимидныи малеимидныи реагент mPEG-винилсульфоновый реагент mPEG-тиоловыи реагент
Г омобифункциональный PEGтиоловыи реагент mPEG-дисульфидный реагент
Г омобифункциональные
Связь через простой тиоэфир
Связь через простой тиоэфир
Связи через простой тиоэфир
Связь через простой тиоэфир
Н3С- ОСН2СН2 n-O-CHoCHo-C-NH-CHo'CHo-S-S- IL-2
Дисульфидная связь
Дисульфидные связи
Дисульфидная связь
Дисульфидные связи
В отношении конъюгатов, образованных из водорастворимых полимеров, несущих одну или несколько малеимидных функциональных групп (независимо от того реагирует ли малеимид с аминогруппой или тиоловой группой на компоненте IL-2), соответствующая форма(ы) моноамида малеиновой ки слоты водорастворимого полимера также может реагировать с компонентом IL-2. При конкретных условиях (например, pH приблизительно 7-9 и в присутствии воды) малеимидное кольцо будет раскрываться с образованием соответствующего моноамида малеиновой кислоты. Моноамид малеиновой кислоты, в свою очередь, может реагировать с амином или тиоловой группой компонента IL-2. Иллюстративные реакции на основе моноамида малеиновой кислоты схематически показаны ниже. POLY представляет водорастворимый полимер, и (IL-2) представляет компонент IL-2.
- 27 037083
Типичный конъюгат в соответствии с изобретением может иметь следующую структуру: POLY-L0,i-C(O)Z-Y-S-S-(IL-2), где POLY представляет собой водорастворимый полимер, L представляет собой необязательный линкер, Z представляет собой гетероатом, выбранный из группы, включающей O, NH и S, и Y выбирают из группы, включающей C2-10 алкил, C2-10 замещенный алкил, арил и замещенный арил, и (IL-2) представляет собой компонент IL-2. Полимерные реагенты, которые могут реагировать с компонентом IL-2 и приводить в результате к этому типу конъюгата, описаны в публикации заявки на патент США № 2005/0014903.
Как отмечалось ранее, иллюстративные конъюгаты настоящего изобретения, где водорастворимый полимер находится в разветвленной форме, будут иметь разветвленную форму водорастворимого полимера, образующего следующую структуру:
О
H3CO-(CH2CH2O)n—CH2CH2-NH-C-O-i
H3CO-(CH2CH2O)n—CH2CH2-NH—С-Огде каждый n независимо представляет собой целое число со значением от 2 до 4000.
Иллюстративные конъюгаты с водорастворимым полимером в разветвленной форме получают с применением следующего реагента:
О
H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2
HC-OCH2-CH2-CH2-C-NH'CH2CH2-NH-C-CH2-CH2
НзСДОСНгСНг^-МН-С-О-СНг таким образом, образуется конъюгат со следующей структурой:
о
H3C'(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2 о II нс-осн2сн2 CH2-C-NH-CH2CH2-NH-C сн2 сн2
H3C-(OCH2CH2)n-NH-C-O-CH2
S-(IL-2) где (для каждой структуры) каждый n независимо представляет собой целое число со значением от 2 до 4000; и
IL-2 представляет собой остаток компонента IL-2.
Дополнительный иллюстративный конъюгат можно образовать с применением реагента
- 28 037083
О таким образом, образуется конъюгат со следующей структурой:
О где (для каждой структуры) n независимо представляет собой целое число со значением от 2 до 4000; и IL-2 представляет собой остаток компонента IL-2.
Конъюгаты можно образовать с применением полимерных реагентов, селективных в отношении тиола, рядом способов, и настоящее изобретение не ограничивается в этом отношении. Например, компонент IL-2, необязательно в подходящем буфере (в том числе амин-содержащих буферах, при необходимости), помещают в водную среду при pH приблизительно 7-8 и добавляют полимерный реагент, селективный в отношении тиола, в молярном избытке. Реакцию проводят в течение приблизительно 0,5-2 ч, хотя время реакции может составлять больше 2 ч (например, 5, 10, 12 и 24 ч), если определяют, что выходы продуктов ПЭГилирования относительно низкие. Иллюстративные полимерные реагенты, которые могут применяться в этом подходе, представляют собой полимерные реагенты, несущие реакционноспособную группу, выбранную из группы, включающей мелаимид, сульфон (например, винилсульфон) и тиол (например, функционализированные тиолы, такие как ортопиридинил или OPSS).
Что касается полимерных реагентов, то описываемые в данном документе или где-либо еще можно приобрести у коммерческих источников или получить из коммерчески доступных исходных материалов. К тому же способы получения полимерных реагентов описаны в литературе.
Прикрепление компонента IL-2 и непептидного водорастворимого полимера может быть прямым, при котором никаких промежуточных атомов не расположено между компонентом IL-2 и полимером, или непрямым, при котором один или несколько атомов расположены между компонентом IL-2 и полимером. Что касается непрямого прикрепления, спейсерный компонент служит в качестве линкера между остатком компонента IL-2 и водорастворимым полимером. Один или несколько атомов, составляющих спейсерный компонент, могут включать один или несколько из атомов углерода, атомов азота, атомов серы, атомов кислорода и их комбинации. Спейсерный компонент может содержать амидную, вторичную аминную, карбаматную группу, группу простого тиоэфира и/или дисульфидную группу. Неограничивающие примеры конкретных спейсерных компонентов включают такие, которые выбирают из группы, состоящей из -O-, -S-, -S-S-, -С(О)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -СН2-СН2-СН2-, -СН2-СН2-СН2-СН2-, -О-СН2-, -СН2-О-, -О-СН2-СН2-, -СН2-О-СН2-, -СН2-СН2-О-, -О-СН2-СН2-СН2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -О-СН2-СН2-СН2-СН2-, -СН2О-СН2-СН2-СН2-, -СН2-СН2-О-СН2-СН2-, -СН2-СН2-СН2-О-СН2-, -СН2-СН2-СН2-СН2-О-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NHCH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-QO)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]h(OCH2CH2)j-, двухвалентной циклоалкильной группы, -O-, -S-, аминокислоты, -N(R6)- и комбинаций двух или больше из любого из вышеперечисленного, где R6 представляет собой H или органический радикал, выбранный из группы, включающей алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил и замещенный арил, (h) равняется от нуля до шести, и (j) равняется от нуля до 20. Другие конкретные спейсерные компоненты имеют следующие структуры: -C(O)-NH-(CH2)1-6-NHC(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)- и -O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, где значения нижнего индекса, следующие за каждым метиленом, указывают на количество метиленов, содержащихся в структуре, например, (CH2)1-6 означает, что структура может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 метиленов. В дополнение, любой из вышеприведенных спейсерных компонентов может дополнительно включать олигомерную цепь из этиленоксида, содержащую 1-20 мономерных единиц этиленоксида [т.е. -(CH2CH2O)1-20]. Т.е. олигомерная цепь из этиленоксида может находиться перед или после спейсерного компонента и необязательно между любыми двумя атомами спейсерного компонента, содержащего два или более атомов. Также, олигомерную цепь не следует считать частью спейсерного компонента, если олигомер смежный с
- 29 037083 полимерным сегментом и просто представляет продолжение полимерного сегмента.
Композиции.
Конъюгаты, как правило, представляют собой часть композиции. В целом, композиция содержит несколько конъюгатов, предпочтительно, хотя не обязательно, каждый конъюгат содержит одинаковый компонент IL-2 (т.е. во всей композиции обнаруживается только один тип компонента IL-2). К тому же композиция может содержать несколько конъюгатов, где любой указанный конъюгат содержит компонент, выбранный из группы, включающей два или более различных компонентов IL-2 (т.е. во всей композиции обнаруживаются два или более различных компонентов IL-2). Однако оптимально, чтобы большинство конъюгатов в композиции (например, 85% или более из совокупности конъюгатов в композиции) включали одинаковый компонент IL-2.
Композиция может содержать единственный вид конъюгата (например, моноПЭГилированный конъюгат, где отдельный полимер прикрепляется в одинаковом положении касательно большинства конъюгатов в композиции) или смесь из видов конъюгатов (например, смесь из моноПЭГилированных конъюгатов, где прикрепление полимера происходит в различных сайтах, и/или смесь моноПЭГилированных, диПЭГилированных и триПЭГилированных конъюгатов). Композиции также могут содержать другие конъюгаты с четырьмя, пятью, шестью, семью, восьмью или более полимерами, прикрепленными к любому указанному компоненту с активностью IL-2. К тому же настоящее изобретение включает случаи, когда композиция содержит несколько конъюгатов, причем каждый конъюгат содержит один водорастворимый полимер, ковалентно прикрепленный к одному компоненту IL-2, а также композиции, содержащие два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или более водорастворимых полимеров, ковалентно прикрепленных к одному компоненту IL-2.
Что касается конъюгатов в композиции, композиция будет отвечать требованиям одной или нескольким из следующих характеристик: по меньшей мере приблизительно 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до четырех полимеров, прикрепленных к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до трех полимеров, прикрепленных к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до двух полимеров, прикрепленных к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 85% конъюгатов в композиции будут иметь один полимер, прикрепленный к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до пяти полимеров, прикрепленных к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до четырех полимеров, прикрепленных к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до трех полимеров, прикрепленных к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до двух полимеров, прикрепленных к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 95% конъюгатов в композиции будут иметь один полимер, прикрепленный к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до пяти полимеров, прикрепленных к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до четырех полимеров, прикрепленных к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до трех полимеров, прикрепленных к компоненту IL-2; по меньшей мере приблизительно 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до двух полимеров, прикрепленных к компоненту IL-2; и по меньшей мере приблизительно 99% конъюгатов в композиции будут иметь один полимер, прикрепленный к компоненту IL-2. Понятно, что ссылка на диапазон полимеров, например от х до у полимеров, подразумевает количество полимеров от х до у включительно (т.е., например, от одного до трех полимеров подразумевает один полимер, два полимера и три полимера, от одного до двух полимеров подразумевает один полимер и два полимера и т.д.).
В одном или нескольких вариантах осуществления, предпочтительно, чтобы композиция, содержащая конъюгат, не содержала или по существу не содержала альбумин. Также предпочтительно, чтобы композиция не содержала или по существу не содержала белков, не обладающих активностью IL-2. Таким образом, предпочтительно, чтобы 85%, более предпочтительно 95% и наиболее предпочтительно 99% композиции не содержало альбумин. В дополнение, предпочтительно, чтобы 85%, более предпочтительно 95% и наиболее предпочтительно 99% композиции не содержало какого-либо белка, не обладающего активностью IL-2. В тех случаях, когда альбумин присутствует в композиции, иллюстративные композиции настоящего изобретения по существу не содержат конъюгаты, содержащие поли(этиленгликолевый) полимер, соединяющий остаток компонента IL-2 с альбумином.
В торговой марке PROLEUKIN® альдеслейкина (доступен от Prometheus Laboratories Inc., СанДиего, Калифорния) IL-2 предусматривается в комбинации с додецилсульфатом натрия (SDS). В отличие от этого для композиций настоящего изобретения преимущественно может не требоваться SDS и, следовательно, они не содержат (или по существу) не содержат SDS, а также в большинстве случаев детергенты (например, Tween 20 и Tween 80). Вследствие этого композиции и конъюгаты настоящего изобретения можно получать без проведения этапа добавления SDS, Tween 20 и Tween 80. К тому же композиции и конъюгаты настоящего изобретения можно получать без проведения этапа добавления детергента или другого наполнителя. Кроме того, композиции настоящего изобретения не содержат или по суще
- 30 037083 ству не содержат (например, меньше приблизительно 20%, более предпочтительно меньше приблизительно 15%, еще более предпочтительно меньше приблизительно 10%, все еще более предпочтительно меньше приблизительно 9%, все еще более предпочтительно меньше приблизительно 8%, все еще более предпочтительно меньше приблизительно 7%, все еще более предпочтительно меньше приблизительно 6%, все еще более предпочтительно меньше приблизительно 5%, все еще более предпочтительно меньше приблизительно 4%, все еще более предпочтительно меньше приблизительно 3%, все еще более предпочтительно меньше приблизительно 2%, все еще более предпочтительно меньше приблизительно 1%, все еще более предпочтительно меньше приблизительно 0,5%, с наиболее предпочтительным меньше 0,001%) детергентов, таких как SDS, Tween 20 и Tween 80. К тому же композиции и конъюгаты настоящего изобретения можно получать без проведения этапа удаления (с помощью, например, ультрафильтрации) детергентов, таких как SDS, Tween 20 и Tween 80. Кроме того, композиции и конъюгаты настоящего изобретения можно получать без проведения этапа удаления (с помощью, например, ультрафильтрации) детергента.
Контроль требуемого количества полимеров в отношении любого указанного компонента может достигаться с помощью выбора подходящего полимерного реагента, соотношения полимерного реагента к компоненту IL-2, температуры, условий pH и других аспектов реакции конъюгации. К тому же с помощью способов очистки можно достигнуть уменьшения или исключения нежелательных конъюгатов (например, конъюгатов, которые имеют четыре или больше прикрепленных полимеров).
Например, конъюгаты полимер-компонент IL-2 можно очищать для получения/выделения различных конъюгированных видов. В частности, смесь продуктов можно очищать с получением среднего в переделах одного, двух, трех, четырех, пяти или более PEG на компонент IL-2, как правило, один, два или три PEG на компонент IL-2. Алгоритм очистки конечной реакционной смеси конъюгата будет зависеть от ряда факторов, в том числе, например, молекулярной массы использованного полимерного реагента, определенного компонента IL-2, требуемого режима дозирования и остаточной активности и in vivo свойств отдельного конъюгата(ов).
При необходимости, конъюгаты с различными молекулярными массами можно выделять с применением гельфильтрационной хроматографии и/или ионообменной хроматографии. А именно, гельфильтрационную хроматографию применяют для фракционирования соотношений с различным числом полимеров на компонент IL-2 (например, 1-mer, 2-mer, 3-mer и т. д., где 1-mer указывает на 1 полимер на компонент IL-2, 2-mer указывает на два полимера на компонент IL-2 и так далее) на основании их отличающихся молекулярных масс (где отличие, по сути, соответствует средней молекулярной массе части водорастворимого полимера). Например, в иллюстративной реакции, где белок с массой 35000 Да случайным образом конъюгируют с полимерным реагентом молекулярной массы приблизительно 20000 Да, образующаяся в результате реакционная смесь может содержать немодифицированный белок (с молекулярной массой приблизительно 35000 Да), моноПЭГилированный белок (с молекулярной массой приблизительно 55000 Да), диПЭГилированный белок (с молекулярной массой приблизительно 75000 Да) и т.д.
Хотя этот подход можно применять для разделения PEG и других конъюгатов полимер-компонент IL-2 с отличающимися молекулярными массами, этот подход в целом неэффективен для разделения позиционных изоформ с различными сайтами прикрепления полимеров в пределах компонента IL-2. Например, гельфильтрационную хроматографию можно применять для отделения друг от друга смесей из 1-mers, 2-mers, 3-mers PEG и т.д., хотя каждая из получаемых композиций конъюгата может содержать PEG, прикрепленные к различным реакционноспособным группам (например, лизиновым остатками) в пределах компонента IL-2.
Гельфильтрационные колонки, подходящие для проведения разделения этого типа, включают колонки Superdex™ и Sephadex™, доступные от Amersham Biosciences (Пискатауэй, Нью-Джерси). Выбор конкретной колонки будет зависеть от требуемого диапазона требуемого фракционирования. Элюирование в целом проводят с применением подходящего буфера, такого как фосфатный, ацетатный или подобный. Собранные фракции можно анализировать с помощью ряда различных способов, например, (i) поглощения при 280 нм на содержание белка, (ii) анализа белка, основанного на красителе, с применением бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта, (iii) тестирования с йодом на содержание PEG (Sims et al. (1980) Anal. BioIL-2m, 107:60-63), (iv) электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS PAGE) с последующим окрашиванием йодидом бария и (v) высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
Разделение позиционных изоформ проводят с помощью обращенно-фазовой хроматографии с применением обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) с применением подходящей колонки (например, колонки С18 или колонки C3, коммерчески доступных от компаний, таких как Amersham Biosciences или Vydac) или с помощью ионообменной хроматографии с применением ионообменной колонки, например, ионообменной колонки Sepharose™, доступной от Amersham Biosciences. Тот или иной подход можно применять для разделения изомеров полимер-активное средство с одинаковой молекулярной массой (т.е. позиционных изоформ).
Композиции предпочтительно по существу не содержат белки, не обладающие активностью IL-2. К
- 31 037083 тому же композиции предпочтительно по существу не содержат всех иных нековалентно прикрепленных водорастворимых полимеров. При некоторых обстоятельствах, однако, композиция может содержать смесь из конъюгатов полимер-компонент IL-2 и неконъюгированного компонента IL-2.
Необязательно, композиция настоящего изобретения дополнительно содержит фармацевтически приемлемый наполнитель. При необходимости фармацевтически приемлемый наполнитель можно добавлять к конъюгату для образования композиции.
Иллюстративные наполнители включают, без ограничения, выбираемые из группы, состоящей из углеводов, неорганических солей, противомикробных средств, антиоксидантов, поверхностно-активных веществ, буферов, кислот, оснований, аминокислот и их комбинаций.
В качестве наполнителя может присутствовать углевод, такой как сахар, полученное производное сахара, такое как альдит, альдоновая кислота, этерифицированный сахар и/или полимер сахаров. Конкретные углеводные наполнители включают, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как рафиноза, мелицитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцит), пиранозилсорбит, миоинозит, циклодекстрины и т.п.
Наполнитель также могут включать неорганическую соль или буфер, такие как лимонная кислота, хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия, нитрат калия, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия и их комбинации.
Композиция также может включать противомикробное средство для предупреждения или замедления роста микроорганизмов. Неограничивающие примеры противомикробных средств, подходящих для одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения, включают хлорид бензалкония, хлорид бензетония, бензиловый спирт, хлорид цетилпиридиния, хлорбутанол, фенол, фенилэтиловый спирт, нитрат фенилртути, тимеросал и их комбинации.
Также в композиции может присутствовать антиоксидант. Антиоксиданты применяются для предотвращения окисления, таким образом, предупреждая разложение конъюгата или других компонентов препарата. Подходящие антиоксиданты для применения в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения включают, например, аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, фосфорноватистую кислоту, монотиоглицерин, пропилгаллат, бисульфит натрия, формальдегидсульфоксилат натрия, метабисульфит натрия и их комбинации.
В качестве наполнителя может присутствовать поверхностно-активное вещество. Иллюстративные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты, такие как Tween 20 и Tween 80, и плюроники, такие как F68 и F88 (оба из которых доступны от BASF, Маунт Олив, Нью-Джерси); сложные эфиры сорбитана; липиды, такие как фосфолипиды, такие как лецитин и другие фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины (хотя предпочтительно в нелипосомальной форме), жирные кислоты и сложный эфиры жирных кислот; стероиды, такие как холестерин; и ГЬ-2ирующие средства, такие как EDTA, цинк и другие такие подходящие катионы.
В качестве наполнителя в композиции могут присутствовать кислоты или основания. Неограничивающие примеры кислот, которые можно применять, включают кислоты, выбранные из группы, состоящей из соляной кислоты, уксусной кислота, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, молочной кислоты, муравьиной кислоты, трихлоруксусной кислоты, азотной кислоты, хлорной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, фумаровой кислоты и их комбинаций. Примеры подходящих оснований включают, без ограничения, основания, выбранные из группы, состоящей из гидроксида натрия, ацетата натрия, гидроксида аммония, гидроксида калия, ацетата аммония, ацетата калия, фосфата натрия, фосфата калия, цитрата натрия, формиата натрия, сульфата натрия, сульфата калия, фумарата калия и их комбинации.
В качестве наполнителя в композициях, описанных в данном документе, может присутствовать одна или несколько аминокислот. Иллюстративные аминокислоты при этом включают аргинин, лизин и глицин.
Количество конъюгата (т.е. конъюгата, образованного активным средством и полимерным реагентом) в композиции будет варьировать в зависимости от ряда факторов, но оптимально будет представлять собой терапевтически эффективную дозу, если композиция сохраняется в контейнере со стандартной дозой (например, в ампуле). К тому же фармацевтический препарат можно помещать в шприц. Терапевтически эффективную дозу можно определять экспериментально с помощью повторных введений возрастающих количеств конъюгата для определения того, какое количество дает клинически требуемый ожидаемый результат.
Количество любого отдельного наполнителя в композиции будет варьировать в зависимости от активности наполнителя и определенных требований композиции. Как правило, оптимальное количество любого отдельного наполнителя определяют посредством обычного экспериментирования, т.е. с помощью получения композиций, содержащих варьирующие количества наполнителя (в диапазоне от низких до высоких), проверки устойчивости и других параметров и затем определения диапазона, при котором достигается оптимальная эффективность при отсутствии существенных неблагоприятных эффектов.
- 32 037083
В целом, однако, наполнитель будет присутствовать в композиции в количестве от приблизительно 1% до приблизительно 99 вес.%, предпочтительно от приблизительно 5% до приблизительно 98 вес.%, более предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 95 вес.% наполнителя, с наиболее предпочтительными концентрациями меньше 30 вес.%.
Эти вышеуказанные фармацевтические наполнители вместе с прочими наполнителями описаны в Remington: The Science & Practice of Pharmacy, 19th ed., Williams & Williams, (1995), Physician's Desk Reference, 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), и Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
Композиции охватывают все типы составов и, в частности, подходящие для инъекций, например, порошки или лиофилизаты, которые можно восстанавливать, а также жидкости. Примеры подходящих разбавителей для восстановления твердых композиций перед инъекцией включают бактериостатическую воду для инъекций, 5% декстрозу в воде, фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера, физиологический раствор, стерильную воду, деионизированную воду и их комбинации. Что касается жидких фармацевтических композиций, предусматриваются растворы и суспензии.
Композиции одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения, как правило, хотя не обязательно, вводятся путем инъекции и, следовательно, в целом непосредственно перед введением представляют собой жидкие растворы или суспензии. Фармацевтический препарат также может принимать другие формы, такие как сиропы, крема, мази, таблетки, порошки и т.п. Другие способы введения также включаются, такие как легочное, ректальное, трансдермальное, трансмукозальное, пероральное, интратекальное, внутриопухолевое, перитуморальное, внутрибрюшинное, подкожное, внутриартериальное и т.д.
Настоящее изобретение также предусматривает способ введения конъюгата, обеспечиваемого в данном документе, пациенту, страдающему от состояния, что реагирует на лечение с помощью конъюгата. Способ включает введение пациенту, как правило путем инъекции, терапевтически эффективного количества конъюгата (предпочтительно предусматриваемого как часть фармацевтической композиции). Как описано ранее, конъюгаты можно инъецировать (например, внутримышечно, подкожно и парентерально). Подходящие типы составов для парентерального введения, среди прочего, включают растворы, готовые для инъекции, сухие порошки для комбинации с растворителем перед применением, суспензии, готовые для инъекции, сухие нерастворимые композиции для комбинации со средой перед применением и эмульсии и жидкие концентраты для разбавления перед введением.
Способ введения конъюгата (предпочтительно предусматривается как часть фармацевтической композиции) необязательно может проводиться так, чтобы ограничить локализацию конъюгата конкретной областью. Например, жидкие, гелевые и твердые составы, содержащие конъюгат, могут быть хирургически имплантированы в пораженную область (как например, в опухоль, около опухоли, в область воспаления и около области воспаления). Целесообразно, чтобы органы и ткань также можно было визуализировать с целью убеждения в том, что требуемое местоположение лучше подвергается воздействию конъюгата.
Способ введения можно применять для лечения любого состояния, которое можно вылечить или предупредить с помощью введения конъюгата. Специалисты в данной области понимают, какие состояния может эффективно вылечить конкретный конъюгат. Например, конъюгаты могут применяться либо отдельно, либо в комбинации с иной фармакотерапией для лечения пациентов, страдающих от заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака почки, метастатической меленомы, вируса гепатита С (HCV), вируса иммунодефицита человека (HIV), острого миелоидного лейкоза, неходжкинской лимфомы, Т-клеточной лимфомы кожи, ювенильного ревматоидного артрита, атопического дерматита, рака молочной железы и рака мочевого пузыря. Преимущественно, конъюгат можно вводить пациенту перед, одновременно с или после введения другого активного средства.
Фактическая доза, которую следует вводить, будет варьировать в зависимости от возраста, веса и общего состояния субъекта, а также тяжести состояния, подлежащего лечению, решения лечащего врача и конъюгата, подлежащего введению. Терапевтически эффективные количества известны специалистам в данной области техники и/или описаны в текстах ссылок и литературе по данной теме. В целом, терапевтически эффективное количество будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,001 до 100 мг, предпочтительно в дозах от 0,01 до 75 мг/день и более предпочтительно в дозах от 0,10 до 50 мг/день. Указанная доза может вводиться периодически вплоть до того, например, когда симптомы отравления органофосфатами облегчаться или полностью устранятся.
Единицу дозирования любого указанного конъюгата (в этом случае также предпочтительно предусматриваемого в качестве части фармацевтического препарата) можно вводить в целом ряде режимов дозирования в зависимости от решения клинициста, потребностей пациента и т.д. Конкретный режим дозирования будет известен специалисту в данной области или может определяться экспериментально с применением обычных способов. Иллюстративные режимы дозирования включают, без ограничения, введение один раз в день, три раза в неделю, два раза в неделю, один раз в неделю, два раза в месяц, один раз в месяц и любую их комбинацию. Как только клинический ожидаемый результат достигнут, дозирование композиции прекращают.
- 33 037083
Следует понимать, что хотя настоящее изобретение было описано вместе с его предпочтительными конкретными вариантами осуществления, вышеизложенное описание, а также примеры, которые следуют, предусмотрены для иллюстрирования, а не ограничения объема настоящего изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации в пределах объема настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области, к которой относится настоящее изобретение.
Все статьи, книги, патенты и другие публикации, на которые ссылаются в данном документе, этим включаются посредством ссылки во всей их полноте.
Экспериментальная часть.
При осуществлении настоящего изобретения на практике будут использоваться, если не указано иначе, традиционные методики органического синтеза, биохимии, очистки белка и т.п., которые находятся в компетенции специалиста в данной области. Такие методики в полной мере объясняются в литературе. См., например, J. March, Advanced Organical Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992), выше.
В следующих примерах были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении применяемых чисел (например, количеств, температур и т.д.), но следует принимать во внимание некоторую экспериментальную ошибку и отклонение. Если не указано иначе, температура выражается с градусах Цельсия, и давление представляет собой атмосферное давление на уровне моря или примерно таковое. Считается, что каждый из следующих примеров будет полезен специалисту в данной области для выполнения одного или нескольких вариантов осуществления, описанных в данном документе.
Водный раствор (маточный раствор), содержащий рекомбинантный IL-2 (rIL-2), соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, при этом последовательность зрелого белка получили от Myoderm (Норристаун, Пенсильвания) для применения в примерах или приготовили в соответствии с примером 1. Концентрация маточного раствора варьировала от 1 до 100 мг/мл.
Анализ SDS-PAGE.
Образцы анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с применением системы Invitrogen NuPAGE и предварительно составленных 4-10% Bis-Tris гелей Novex (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Образцы подготовили, загрузили на гель и осуществили электрофорез, как описано производителем.
Катионообменная хроматография.
Катионообменную колонку SP-HP Sepharose (GE Healthcare) с объемом слоя приблизительно 100 мл подготовили с применением стандартных способов. Колонку присоединили к АКТА Explorer 100 GE Healthcare (Чалфонт Сейнт Джайлс, Великобритания) для очистки приготовленных конъюгатов PEG-rIL2. Подробности способа очистки описываются ниже.
Анализ RP-HPLC.
Анализ обращенно-фазовой хроматографии (RP-HPLC) проводили на системе HPLC Agilent 1100 (Санта Клара, Калифорния). Образцы анализировали с применением колонки Intrada WP-RP Silverton (Япония) (размер частиц 3 мкм, 2,1x150 мм). Скорость потока колонки составляла 0,5 мл/мин. Подвижные фазы представляли собой 0,09% TFA в воде (растворитель А) и 0,04% TFA в ацетонитриле (растворитель В).
Пример 1. Клонирование гена IL-2 и экспрессия rIL-2.
Последовательность к ДНК человеческого IL-2 может неоптимально экспрессироваться в прокариотах, подобных Е.coli, из-за значительных различий в частоте использования кодонов различными организмами. Вместо того чтобы производить множество точечных мутаций в существующей последовательности к ДНК происходящей от человека, для максимального увеличения частоты использования кодонов Е.coli, использовали методику ПЦР для полного синтеза гена.
Способ синтеза гена из перекрывающихся праймеров по сути представлял собой комбинацию двух способов с минимальными модификациями. Основное обсуждение каждого отдельного способа представлено в Young et al. (2004) Nucleic Acids Research 32(7):e59, и Devlin et al. (1988) Gene 65:13-22. Вкратце, последовательность ДНК разделили на прямые и обратные олигонуклеотиды меньше 35 п.о. с несколькими исключениями и между олигонуклеотидами не было гэпов. Каждый олигонуклеотид перекрывался с двумя смежными олигонуклеотидами на противоположной нити со стороны 3'-концов по меньшей мере на 10 нуклеотидов и со стороны 5'-концов по меньшей мере на 15 нуклеотидов. Двойную асимметричную ПЦР применяли для сборки субфрагментов гена и для сборки целого гена их объединяли с применением перекрывающейся ПЦР. Затем применили этап отбора с помощью Т7 эндонуклеазы I для удаления несоответствующих двойных спиралей, как описывается у Young et. al. См. Young et al. (2004) Nucleic Acids Research 32(7):e59. Сайты для рестрикционнных ферментов включили в концевые элементы гена и конечный генный компонент клонировали в коммерчески доступный вектор экспрессии для Е.coli. Секвенирование ДНК применили для подтверждения полученной последовательности, показанной на фиг. 1 и SEQ ID NO: 5.
При применении этого подхода, как показано, аминокислотная последовательность не включает аминокислотное положение #1 (аланин) по сравнению с нативной зрелой человеческой последовательно- 34 037083 стью и включает аминокислотную мутацию С ^ S в аминокислотном положении #125 касательно последовательности. Первая аминокислота в этой последовательности представляет собой метионин для прямой бактериальной экспрессии (не кодируется сигнальный пептид). После экспрессии, однако, начальный метионин удаляется с помощью метионин-аминопептидазы хозяина.
Ген клонировали в один из векторов экспрессии рЕТ (Т7). Белок экспрессировался в штамме BL21(DE3) E.coli, одном из штаммов, как правило, применяемых для экспрессионной системы Т7. Эта экспрессионная система доступна коммерчески и способы для экспрессии доступны от EMD Biosciences, Merck KGaA, Дармштадт, Германия. Применение этой системы проводили на основании разрешения на исследование от Brookhaven National Laboratory. Вектор обусловил экспрессию белка в виде телецвключений в Е.coli. Типичные предписания, применяемые для экспрессии, можно найти в литературе и в Protein Production by Auto-Induction in High-Density Shaking Cultures, F. William Studier, Biology Department, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY 11973 (December 20, 2007).
После ферментации клетки собирали центрифугированием. Осадок клеточной массы хранили при -80°С для гомогенизации в будущем. Замороженный осадок клеточной массы ресуспендировали в буфере для отмывки клеток (50 мМ Tris, 5 мМ EDTA, pH 8,0) до концентрации 10% (вес./об.) и центрифугировали при 13860xg в течение 30 мин. Супернатант отбросили. Промытый осадок ресуспендировали в буфере для гомогенизации (50 мМ Tris, 5 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, pH 8,0) и гомогенизировали с помощью Microfluidizer (М-110Р от Microfluidics, Ньютон, Массачусетс, США) при 4-15°С за один проход. Гомогенат развели в 2 раза с применением буфера для отмывки клеток (50 мМ Tris, 5 мМ EDTA, pH 8,0) и центрифугировали при 13860xg в течение 60 мин. Супернатант отбросили. Осадок телец-включений трижды промыли с последовательным применением буферов 50 мМ Tris, 5 мМ EDTA, 2% Triton Х-100, pH 8,0; 50 мМ Tris, 5 мМ EDTA, 1% деоксихолат натрия, pH 8,0, и 50 мМ Tris, 5 мМ EDTA, 1M NaCl, pH 8,0. После промывки получили неочищенные тельца-включения IL-2.
Неочищенные тельца-включения IL-2 растворили в буфере с 6М гуанидина, 100 мМ Tris, pH 8. Добавили EDTA до конечной концентрации 2 мМ. Затем добавили дитиотреитол (DTT) до конечной концентрации 50 мМ. Смесь инкубировали при 50°С в течение 30 мин. После восстановления для снижения концентрации гуанидина до 4,8 к смеси добавили воду. После центрифугирования в течение одного часа при 13860 xg образующийся в результате гелеобразный осадок отбросили. Концентрацию гуанидина в супернатанте дополнительно снизили до 3,5М с помощью добавления воды. pH довели до 5 посредством титрации 100% уксусной кислотой. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин и центрифугировали при 13860xg в течение одного часа. Образующийся осадок суспендировали в буфере с 3,5М гуанидина, 20 мМ ацетата, 5 мМ DTT, pH 5, и центрифугировали при 13860xg в течение одного часа. Этот этап отмывки повторили еще раз.
Чистые и восстановленные тельца-включения IL-2 растворили в буфере с 6М гуанидина, 100 мМ Tris, pH 8. Добавили маточный раствор 100 мМ CuCl2 для достижения конечной концентрации Cu2+ 0,1 мМ. Смесь инкубировали при 4°С в течение ночи.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения направлен на усовершенствованный способ обеспечения возможности белкам получить третичную структуру. В этом отношении предыдущие способы часто зависели от ступенчатого разведения, которое часто было агрессивным в отношении белков. Таким образом, в усовершенствованном подходе обеспечения возможности фолдинга белков при более щадящих условиях предусматривается способ, где способ включает этап помещения экспрессированного белка (например, компонента IL-2, такого как IL-2, полученного в соответствии с этим примером) внутрь диализного мешка с меньшим размером пор от размера экспрессированного белка и добавления (предпочтительно на протяжении нескольких часов, например, на протяжении 6 ч, более предпочтительно на протяжении 10 ч и еще более предпочтительно на протяжении 15 ч) раствора, не содержащего средств, денатурирующих белок (например, воду). Иллюстративные растворы, не содержащие средств, денатурирующих белок, известны специалистам в данной области и включают, например, растворы (например, буферы и воду), которые не содержат (или по существу не содержат) гуанидин, мочевину, перхлорат лития, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол и детергенты. Таким образом, в соответствии с этим способом раствор экспрессированного IL-2 поместили в диализные мешки (с размером пор для молекулярной массы 3,5 кДа). Диализные мешки поместили в емкость, содержащую буфер с 4,8М гуанидина, 0,1М Tris, pH 8. После трех часов уравновешивания концентрацию гуанидина в емкости медленно снизили до 2М с помощью подачи воды в емкость за период 15 ч. Весь процесс рефолдинга совершался при 4°С. IL-2 после рефолдинга проверяли посредством SEC-HPLC.
IL-2 после рефолдинга центрифугировали при 13860xg в течение 60 мин для удаления осадков. Супернатант концентрировали с помощью мембранной системы Pellicon XL TFF (Millipore Corporation, США).
IL-2 после рефолдинга и концентрирования загрузили на колонку BPG (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Уппсала, Швеция), заполненную смолой Sephacryl S-100 HR. Подвижный буфер представлял собой 2 М гуанидин, 20 мМ Tris, pH 8, и скорость потока составляла 25 мл/мин. Фракции, соответствующие пику мономера IL-2, объединяли. Следует отметить, что также можно использовать другие подходящие спо
- 35 037083 собы очистки, такие как ионообменная хроматография и хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC-хроматография).
Совокупность фракций мономера IL-2 концентрировали до приблизительно 1-2 мг/мл с применением мембранной системы Pellicon XL TFF (Millipore Corporation, США) при 4°С и рабочем давлении 30-40 psi. Концентрированный раствор мономера IL-2 подвергали диализу в буфере конечного состава (10 мМ ацетат-Na, 5% трегалоза, pH 4,5), чтобы снизить концентрацию гуанидина ниже 0,1 мМ посредством смены буфера состава несколько раз (в норме 4-5 раз). Составленный раствор IL-2 простерилизовали с помощью пропускания через 0,22 мкм фильтр и хранили при -80°С для дальнейшего применения.
Пример 2. ПЭГилирование rIL-2 с помощью mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS
mPEG2-С2-fomc-20K-N-гидроксисукцинимидное производное, 20 кДа, (mPEG2-C2-fmoc-20KNHS)
Нагрели mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS, который хранили при -80°С под аргоном, до температуры внешней среды с продувкой азотом. Маточный раствор (200 мг/мл) mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS приготовили в 2 мМ HCl и mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS добавили к rIL-2 в количестве, достаточном для достижения молярного соотношения mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS к rIL-2 100:1. Конечная концентрация rIL-2 в смеси составила 0,5 мг/мл (0,035 мМ). В смесь добавили буферный раствор бикарбоната натрия (1М, pH 9,0) с достижением конечной концентрации 20 мМ и обеспечили возможность протекания конъюгации в течение тридцати минут для образования конъюгатов [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]. По истечении тридцати минут обеспечили остановку реакции посредством добавления к реакционной смеси 1М глицина (pH 6,0) с достижением конечной концентрации 100 мМ. Следующим шагом после остановки реакции реакционную смесь развели Н2О с обеспечением электропроводности ниже 0,5 мСм/см (25°С). Довели pH до 4,0 с помощью ледяной уксусной кислоты перед очисткой с применением колоночной хроматографии.
Типичный профиль очистки катионообменной хроматографией [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] представлен на фиг. 2.1. Указаны [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] и непрореагировавший PEG, и линии соответствуют поглощению при разных длинах волн (например, 280 и 225 нм). С помощью анализа чистоты [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] путем анализа обращенно-фазовой HPLC обнаружили 100% чистоту очищенного конъюгата при 280 нм. См. фиг. 2.2. Чистота составляла не менее 95%, как определили с помощью 4-12% Bis-Tris геля SDS-PAGE NuPage при окрашивании кумасси голубым (гель не показан) при использовании 20 мкг очищенного [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2].
Наблюдаемая большая молекулярная масса конъюгата, выше 200 кДа, как предполагали, являлась результатом медленного перемещения конъюгата через гель из-за высокой степени гидратации PEG, и приводящей в результате к относительно большому гидродинамическому радиусу. При помощи этих тестов было подтверждено, что образовались три конъюгата: 4-mer, 3-mer, 2-mer и 1-mer, т.е. [mPEG2C2-fmoc-20K]-[rIL-2], в котором четыре [mPEG2-C2-fmoc-20K] прикреплены к одному [rIL-2] касательно 4-mer, три [mPEG2-C2-fmoc-20K] прикреплены к одному [rIL-2] касательно 3-mer, два [mPEG2-C2-fmoc-20K] прикреплены к одному [rIL-2] касательно 2-mer и один [mPEG2-C2-fmoc-20K] прикреплен к одному [rIL-2] касательно 1-mer.
Свойство подвержения разрыву [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] с выделением rIL-2 показано с помощью обнаружения изменения видов с помощью обращенно-фазовой HPLC. Вкратце, очищеный [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] инкубировали в 100 мМ растворе NaHCO3 при pH 9,0, 37°С, в течение нескольких часов. Периодически отбирали аликвоты системы и тестировали для обнаружения исчезновения конъюгата [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] и присутствия освобожденного rIL-2. Отмечали выход на плато rIL-2 около десяти часов после инкубации с постепенным снижением, возможно, из-за осаждения. Данные представлены на фиг. 2.3.
Пример 3. ПЭГилирование rIL-2 посредством mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS
- 36 037083
mPEG2-САС-fomc-20K-N-гидроксисукцинимидное производное, 20 кДа, (mPEG2-CAC-fmoc-20KNHS).
Нагрели mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS, который хранили при -80°С под аргоном, до температуры внешней среды с продувкой азотом. Маточный раствор (200 мг/мл) mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS приготовили в 2 мМ HCl и добавили mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS к rIL-2 в количестве, достаточном для достижения молярного соотношения mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS к rIL-2 100:1. Конечная концентрация rIL2 в смеси составила 0,5 мг/мл (0,035 мМ). В смесь добавили буферный раствор бикарбоната натрия (1М, pH 9,0) с достижением конечной концентрации 20 мМ и обеспечили возможность протекания конъюгации в течение тридцати минут для образования конъюгатов [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]. По истечении тридцати минут обеспечили остановку реакции посредством добавления к реакционной смеси 1М глицина (pH 6,0) с достижением конечной концентрации 100 мМ. Следующим шагом после остановки реакции реакционную смесь развели Н2О с обеспечением электропроводности ниже 0,5 мСм/см (25°С). Довели pH до 4,0 с помощью ледяной уксусной кислоты перед очисткой с применением колоночной хроматографии.
Типичный профиль очистки катионообменной хроматографией [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] представлен на фиг. 3.1. Указан [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2], и линии соответствуют поглощению при разных длинах волн. С помощью анализа чистоты [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] путем анализа обращенно-фазовой HPLC обнаружили 98,5% чистоту очищенного конъюгата при 280 нм. Пик в 19,6 мин представляет непрореагировавший mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS (который составил <0,1%). См. фиг. 3.2. Чистота составляла не менее 95%, как определили с помощью 4-12% Bis-Tris геля SDS-PAGE NuPage при окрашивании кумасси голубым (гель не показан) при использовании 20 мкг очищенного [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]. Наблюдаемая большая молекулярная масса конъюгата, выше 200 кДа, как предполагалось, являлась результатом медленного перемещения конъюгата через гель из-за высокой степени гидратации PEG. Молекулярную массу очищенных конъюгатов [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] также определили с помощью спектрофотометрии MALDI-TOF. Как видно на фиг. 3.3, главный пик с 79,6 кДа находится в пределах ожидаемого диапазона для молекулярной массы конъюгата 3-mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]. Пик 100,8 кДа находится в пределах ожидаемого диапазона молекулярной массы 4-mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]. Пики с MW 40 и 58,7 кДа могут представлять двухзарядный конъюгат 3-mer IL-2 и конъюгаты 4-mer IL-2.
Пример 4. ПЭГилирование rIL-2 с помощью разветвленного mPEG-N-гидроксисукцинимидильного производного, 20 кДа / х ° О
Н3С-(-ОСН2СН2)— NH-C-O— о А п о —OCH2CH2CH2-C-O-N J н3с-(-осн2сн2)—nh-c-o—// η о mPEG2-ru-20K-N-гидроксилсукцинимидильное производное, 20 кДа, (mPEG2-ru-20K-NHS).
Нагрели mPEG2-ru-20K-NHS, который хранили при -80°С под аргоном, до температуры внешней среды с продувкой азотом. Маточный раствор (200 мг/мл) mPEG2-ru-20K-NHS приготовили в 2 мМ HCl и добавили mPEG2-ru-20K-NHS к rIL-2 в количестве, достаточном для достижения молярного соотношения mPEG2-ru-20K-NHS к rIL-2 100:1. Конечная концентрация rIL-2 в смеси составила 0,5 мг/мл (0,035 мМ). В смесь добавили буферный раствор бикарбоната натрия (1М, pH 9,0) с достижением конечной концентрации 20 мМ и обеспечили возможность протекания конъюгации в течение тридцати минут для образования конъюгатов [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]. По истечении тридцати минут обеспечили остановку реакции посредством добавления к реакционной смеси 1М глицина (pH 6,0) с достижением конечной концентрации 100 мМ. Следующим шагом после остановки реакции реакционную смесь развели H2O с обеспечением электропроводности ниже 0,5 мСм/см (25°С). Довели pH до 4,0 с помощью ледяной уксусной кислоты перед очисткой с применением колоночной хроматографии.
Типичный профиль очистки катионообменной хроматографией [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] представлен на фиг. 4.1 Указаны [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] и непрореагировавший mPEG2-ru-20K-NHS, и линии соответствуют поглощению при разных длинах волн (например, 280 и 225 нм). С помощью анализа чистоты [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] путем анализа обращенно-фазовой HPLC обнаружили 100% чистоту очи
- 37 037083 щенного конъюгата при 280 нм. См. фиг. 4.2. Чистота составляла не менее 95%, как определили с помощью 4-12% Bis-Tris геля SDS-PAGE NuPage при окрашивании кумасси голубым (гель не показан) при использовании 20 мкг очищенного [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]. Наблюдаемая большая молекулярная масса конъюгата, выше 200 кДа, была результатом медленного перемещения конъюгата через гель из-за высокой степени гидратации PEG.
Пример 5. ПЭГилирование rIL-2 с помощью разветвленного mPEG-N-гидроксисукцинимидильного производного, 40 кДа
mPEG2-ru-40K-N-гидроксилсукцинимидильное производное, 40 кДа (mPEG2-ru-40K-NHS).
Нагрели mPEG2-ru-40K-NHS, который хранили при -80°С под аргоном, до температуры внешней среды с продувкой азотом. Маточный раствор (200 мг/мл) mPEG2-ru-40K-NHS приготовили в 2 мМ HCl и mPEG2-ru-40K-NHS и добавили к rIL-2 в количестве, достаточном для достижения молярного соотношения mPEG2-ru-40K-NHS к rIL-2 100:1. Конечная концентрация rIL-2 в смеси составила 0,5 мг/мл (0,035 мМ). В смесь добавили буферный раствор бикарбоната натрия (1М, pH 9,0) с достижением конечной концентрации 20 мМ и обеспечили возможность протекания конъюгации в течение тридцати минут для образования конъюгатов [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]. По истечении тридцати минут обеспечили остановку реакции посредством добавления к реакционной смеси 1М глицина (pH 4,0) с достижением конечной концентрации 100 мМ. Следующим шагом после остановки реакции реакционную смесь развели Н2О с обеспечением электропроводности ниже 0,5 мСм/см (25°С). Довели pH до 4,0 с помощью ледяной уксусной кислоты перед очисткой с применением колоночной хроматографии.
Типичный профиль очистки катионообменной хроматографией [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] представлен на фиг. 5. Указаны [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] и непрореагировавший PEG, и линии соответствуют поглощению при 280 нм. С помощью анализа чистоты [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] путем анализа обращеннофазовой HPLC обнаружили 100% чистоту очищенного конъюгата при 280 нм. Чистота составляла не менее 95%, как определили с помощью 4-12% Bis-Tris геля SDS-PAGE NuPage при окрашивании кумасси голубым (гель не показан) при использовании 20 мкг очищенного [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]. Наблюдаемая большая молекулярная масса конъюгата (вероятно вида 3-mer [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]), выше 200 кДа, была результатом медленного перемещения конъюгата через гель из-за высокой степени гидратации PEG. Сперва через колонку элюировался непрореагироваший mPEG2-ru-40K-NHS, за ним следовали конъюгаты [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2].
Пример 6. ПЭГилирование rIL-2 с помощью разветвленного mPEG-N-гидроксисукцинимидильного производного, 4 кДа
mPEG2-ru-20K-N-гидроксилсукцинимидильное производное, 4 кДа, (mPEG2-ru-4K-NHS).
Нагрели mPEG2-ru-4K-NHS, который хранили при -80°С под аргоном, до температуры внешней среды с продувкой азотом. Маточный раствор (200 мг/мл) mPEG2-ru-4K-NHS приготовили в 2 мМ HCl и mPEG2-ru-4K-NHS добавили к rIL-2 в количестве, достаточном для достижения молярного соотношения mPEG2-ru-4K-NHS к rIL-2 100:1. Конечная концентрация rIL-2 в смеси составила 0,5 мг/мл (0,035 мМ), солюбилизируемого с помощью 0,015% SDS. В смесь добавили буферный раствор бикарбоната натрия (1М, pH 9,0) с достижением конечной концентрации 100 мМ и обеспечили возможность протекания конъюгации в течение тридцати минут для образования конъюгатов [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2]. По истечении тридцати минут обеспечили остановку реакции посредством добавления к реакционной смеси 1М глицина (pH 4,0) с достижением конечной концентрации 100 мМ. Следующим шагом после остановки реакции реакционную смесь развели Н2О с обеспечением электропроводности ниже 0,5 мСм/см (25°С). Довели pH до 4,0 с помощью ледяной уксусной кислоты перед очисткой с применением колоночной хроматографии.
Типичный профиль очистки катионообменной хроматографией [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] представлен на фиг. 6. Элюированные конъюгаты [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] показали смесь из конъюгатов 3-mer, 2-mer и 1-mer [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] во фракциях элюирования. Фракции, содержащие смесь 3-/2-mer [mPEG2ru-4K]-[rIL2], а также фракции, содержащие смесь 2-/1-mer [mPEG2-ru-4K]-[rIL2], объединили отдельно, как показано на фиг. 6.
Пример 7. ПЭГилирование rIL-2 с помощью линейного mPEG-бутиральдегидного производного, 30 кДа
- 38 037083
О
CH3O-^CH2CH2oj— С-ЫН^СНгСНгО^СНгСНгСНгСНО
Линейное mPEG-бутиральдегидное производное, 30 кДа (mPEG-ButyrALD).
Реакции ПЭГилирования разработали таким образом, чтобы после добавления всех ингредиентов и буферов реакции конечная концентрация rIL-2 составила 2,5 мг/мл. mPEG-ButyrALD, 30 кДа, который хранили при -20°С под аргоном, нагрели до температуры внешней среды. Количество реагента PEG, равное 10-50 моль эквивалентов rIL-2, подлежащего ПЭГилированию, взвесили и растворили в 20 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 7,5) и 1 мМ EDTA с образованием 12% раствора реагента. 12% раствор реагента PEG добавили к аликвоте маточного раствора rIL-2 и перемешивали в течение 15-30 мин. Затем добавили восстанавливающее средство, цианоборгидрид натрия (NaCNBH3), в 10-100 молярном избытке относительно реагента PEG и реакцию перемешивали в течение 5-18 ч при комнатной температуре, чтобы удостовериться в соединении путем связи через вторичный амин с образованием, таким образом, раствора конъюгата.
Обнаружили, что альдегидная группа mPEG-ButyrALD реагирует с первичными аминами, ассоциированными с rIL-2, и ковалентно связывается с ним через вторичный амин после восстановления с помощью восстанавливающего реагента, такого как цианоборгидрид натрия. Селективность в отношении того, какой амин(ы) прикрепляется к полимеру, можно модулировать с помощью регулирования pH условий конъюгации. Условия с относительно низким pH (например, около pH 5,5) будут направлять конъюгацию к N-концу. При условиях с относительно нейтральным pH (например, около 7,5 и немного выше) ковалентное прикрепление становится более частым в других положениях (т.е. при аминах боковых цепей лизиновых остатков, содержащихся в пределах белка). Регуляция pH условий конъюгации будет обеспечивать некоторую степень контроля в отношении того, в каких положениях будет происходить конъюгация, таким образом, добиваясь лучшей возможности получать требуемые позиционные изомеры.
С применением того же самого подхода получили другие конъюгаты, применяя mPEG-BuryrALD с другими средневесовыми молекулярными массами.
Пример 8. ПЭГилирование rIL-2 с помощью разветвленного mPEG-бутиральдегидного производного, 40 кДа
Разветвленное mPEG-бутиральдегидное производное, 40 кДа (mPEG2-ButyrALD).
Реакции ПЭГилирования разработали таким образом, чтобы после добавления всех ингредиентов и буферов реакции конечная концентрация rIL-2 составила 2,5 мг/мл. mPEG2-ButyrALD, 40 кДа, который хранили при -20°С под аргоном, нагрели до температуры внешней среды. Количество реагента PEG, равное 10-50 моль эквивалентов rIL-2, подлежащего ПЭГилированию, взвесили и растворили в 20 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 7,5) и 1 мМ EDTA с образованием 12% раствора реагента. 12% раствор реагента PEG добавили к аликвоте маточного раствора rIL-2 и перемешивали в течение 15-30 мин. Затем добавили восстанавливающее средство, цианоборгидрид натрия (NaCNBH3), в 10-100 молярном избытке относительно реагента PEG и реакцию перемешивали в течение 5-18 ч при комнатной температуре, чтобы удостовериться в соединении путем связи через вторичный амин с образованием, таким образом, раствора конъюгата.
Обнаружили, что альдегидная группа mPEG2-ButyrALD реагирует с первичными аминами, ассоциированными с rIL-2, и ковалентно связывается с ними через вторичный амин после восстановления с помощью восстанавливающего реагента, такого как цианоборгидрид натрия.
С применением того же самого подхода получили другие конъюгаты, применяя mPEG-BuryrALD с другими средневесовыми молекулярными массами.
Пример 9. ПЭГилирование rIL-2 с помощью линейного mPEG-сукцинимидильного αметилбутаноатного производного, 30 кДа
Линейное mPEG-сукцинимидильное α-метилбутаноатное производное, 30 кДа (mPEG-SMB).
Реакции ПЭГилирования разработали таким образом, чтобы после добавления всех ингредиентов и буферов реакции конечная концентрация rIL-2 составила 2,5 мг/мл. mPEG-SMB, 30 кДа, который хранили при -20°С под аргоном, нагрели до температуры внешней среды. Количество реагента PEG, равное 1050 моль эквивалентов rIL-2, подлежащего ПЭГилированию, взвесили и растворили в 20 мМ натрий
- 39 037083 фосфатном буфере (pH 7,5) и 1 мМ EDTA с образованием 12% раствора реагента. 12% раствор реагента PEG добавили к аликвоте маточного раствора rIL-2 и перемешивали в течение 5-18 ч при комнатной температуре, таким образом, получая в результате раствор конъюгата. Реакцию раствора конъюгата остановили с помощью раствора лизина (pH 7,5) так, чтобы конечная молярная концентрация лизина составила 10-100-кратную молярную концентрацию реагента PEG.
Обнаружили, что производное mPEG-SMB обеспечивает стерически затрудненный активный сложный эфир NHS, который селективно реагирует с лизином и концевыми аминами.
С применением того же самого подхода получили другие конъюгаты, применяя mPEG-SMB с другими средневесовыми молекулярными массами.
Пример 10. ПЭГилирование rIL-2 с помощью mPEG-PIP, 20 кДа.
Основная структура полимерного реагента приведена ниже:
О у---1
CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2-C-N \о о /—\ CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2-C-N )<он '---' ОН (гидратированная форма)
Реакции ПЭГилирования разрабаотали таким образом, чтобы после добавления всех ингредиентов и буферов реакции конечная концентрация rIL-2 составила 2,5 мг/мл. mPEG-PIP, 20 кДа, который хранили при -20°С под аргоном, нагрели до температуры внешней среды. Количество реагента PEG, равное 1050 моль эквивалентов rIL-2, подлежащего ПЭГилированию, взвесили и растворили в 20 мМ натрийфосфатном буфере (pH 7,5) и 1 мМ EDTA с образованием 12% раствора реагента. 12% раствор реагента PEG добавили к аликвоте маточного раствора rIL-2 и перемешивали в течение 15-30 мин. Затем добавили восстанавливающее средство, цианоборгидрид натрия (NaCNBH3), в 10-100 молярном избытке относительно реагента PEG и реакцию перемешивали в течение 5-18 ч при комнатной температуре, чтобы удостовериться в соединении путем связи через вторичный амин (с вторичным углеродом) с образованием, таким образом, раствора конъюгата. Реакцию раствора конъюгата остановили с помощью раствора лизина (pH 7,5) так, чтобы конечная молярная концентрация лизина составила 10-100-кратную молярную концентрацию реагента PEG.
Обнаружили, что кетоновая группа mPEG-PIP реагирует с первичными аминами, ассоциированными с rIL-2, и ковалентно связывается с ними через вторичный амин после восстановления с помощью восстанавливающего реагента, такого как цианоборгидрид натрия.
С применением того же самого подхода получали другие конъюгаты, применяя mPEG-PIP с другими средневесовыми молекулярными массами.
Пример 11. Активность иллюстративных конъюгатов (rIL-2)-PEG.
Оценили активность альдеслейкина (контроль), [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] из примера 2, [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] из примера 3 и [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] из примера 4 в анализе клеточной пролиферации с применением клеток CTLL-2.
Клетки CTLL-2 (клеточная линия цитотоксических Т-лимфоцитов мыши) поддерживали в полной среде RPMI 1640, дополненной 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10% фетальной бычьей сывороткой и 10% культуральной добавкой для IL-2 (Т-STIM™ с СопА (конканавалин-А)), при 37°С в атмосфере 5% СО2. Эти клетки культивировали в суспензии, пока они не достигли плотности клеток 2-3x105 клеток/мл перед разделением.
Для анализа на активность на 3-4 день после последнего разделения клетки трижды промыли в фосфатно-солевом буфере Дульбекко. Затем клетки ресуспендировали в дополненной среде без TSTIM™ при плотности клеток ~2x105 клеток/мл и высеяли на 96-луночные микропланшеты с белыми стенками и прозрачным дном при 90 мкл/лунку. Эксперименты также проводили с применением дополненной среды (без T-STIM™), доведенной до pH 6,7-7, чтобы свести к минимуму разрыв конъюгатов во время инкубации. Затем добавили 10 мкл 10-кратной концентрации тестируемого соединения, разведенного в дополненной среде без T-STIM™. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 24 ч. После 24 ч инкубации в каждую лунку добавили по 100 мкл реагента CellTiter-Glo® от Promega. Содержимое планшетов перемешивали в течение двух минут на орбитальном встряхивателе, затем инкубировали при комнатной температуре в течение десяти минут. Следующим шагом регистрировали люминесценцию с помощью прибора TopCount® от Perkin Elmer при времени интеграции одна секунда/лунка.
Касательно поддающихся разрыву конъюгатов [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] из примера 2 и поддающихся разрыву конъюгатов [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] из примера 3 тестировали активность конъюгатов как с высвобожденым IL-2, так и невысвобожденым. Тестируемые соединения хранили при кислых условиях (10 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 4) для стабилизации конъюгации. Для тестирования активности конъюгатов образец из буфера для хранения развели в дополненной среде ~ за один час
- 40 037083 до анализа. Для тестирования активности высвобожденного IL-2 поддающиеся разрыву конъюгаты {т.е. конъюгаты [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] из примера 2 и конъюгаты [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] из примера 3} десятикратно развели в 100 мМ (конечная концентрация) буфере бикарбоната натрия, pH 9, и предварительно инкубировали при 37°С в течение восьми часов перед началом анализа.
Значения EC50 (концентрация тестируемого соединения, требуемая для проявления 50% максимального ответа) для клеточной пролиферации получили из анализа нелинейной регрессии кривых зависимости доза-эффект с применением программного обеспечения Prism 5.01 от GraphPad.
Активности альдеслейкина и конъюгатов измеряли с применением анализа клеточной пролиферации, и обобщение результатов показано в табл. 4. Все тестируемые продукты индуцировали рост клеток CTLL-2 дозозависимым образом. Поскольку поддающиеся разрыву конъюгаты предварительно инкубировали при условиях для усиления высвобождения белка, альдеслейкин также предварительно инкубировали в качестве контроля, чтобы протестировать в отношении устойчивости белка самого по себе в условиях обработки, усиливающей высвобождение. Как показано в табл. 4, альдеслейкин оставался устойчивым после предварительной инкубации при условиях высвобождения (8 ч при 37°С, pH 9) и проявлял сравнимую эффективность с альдеслейкином, который хранили при рекомендованных условиях. После предварительной инкубации [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] из примера 2 и [mPEG2-CAC-fmoc-20K][rIL-2] из примера 3 при условиях с индуцированием высвобождения IL-2, активность восстанавливалась, как показано на фиг. 8; IL-2, высвобожденный из этих конъюгатов, проявлял сравнимую эффективность с контрольным альдеслейкином, тогда как некоторые неразорванные конъюгаты были менее эффективны в сравнении с альдеслейкином. Устойчивые конъюгаты 3-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] проявляли наименьшую эффективность (фиг. 7) и составляли 0,04% по сравнению с альдеслейкином, но 1-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] показал эквивалентную альдеслейкину эффективность, принимая во внимание известное стандартное отклонение анализа.
Таблица 4. Краткое описание клеточной пролиферации CTLL-2 в ответ на альдеслейкин и конъюгаты PEG-IL-2
Тестируемое соединение | ЕС50 (нг/мл) | Эффективность относительно альдеслейкина (%) |
альдеслейкин | 0,111 | 102 |
альдеслейкин (контроль высвобождения) | 0,113 | 100 |
3-mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] (подданный условиям высвобождения) | 0,076 | 149 |
1-mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] (подданный условиям высвобождения) | 0,105 | 108 |
3 -mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K] - [rIL-2] (подданный условиям высвобождения) | 0,246 | 46 |
1 -mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K] - [rIL-2] (подданный условиям высвобождения) | 0,056 | 202 |
3-mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] (не подданный условиям высвобождения) | 0,497 | 23 |
1-mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] (не подданный условиям высвобождения) | 0,074 | 153 |
3 -mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K] - [rIL-2] (не подданный условиям высвобождения) | 5,163 | 2 |
1 -mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K] - [rIL-2] (не подданный условиям высвобождения) | 0,143 | 79 |
3-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] | 194,400 | 0,04 |
1-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] | 0,168 | 67 |
Пример 12. Фармакокинетика иллюстративных конъюгатов (rIL-2)-PEG.
Фармакокинетические профили альдеслейкина (контроль), [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] из примера 2, [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] из примера 3 и [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] из примера 4 оценивали в ELISA после однократной инъекции у мышей.
Концентрации альдеслейкина измерили с помощью гетерогенного сэндвич ELISA. Вкратце, 96луночные титрационные микропланшеты покрыли с помощью мышиного моноклонального антитела к IL-2 и блокировали. Образцы и стандарты приготовили в чистой плазме и затем разбавили до 10% плазмы с помощью буфера, содержащего биотинилированнные поликлональные антитела кролика к IL-2, перед тем как инкубировать на планшетах для анализа. Для выявления IL-2 применяли стрептавидинпероксидазу хрена с последующим добавлением субстрата для колориметрии, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ). Добавили стоп-раствор и считывали поглощение при 450 нм с вычитанием фона при 650 нм. Стандартную кривую составляли с помощью взвешенного 4-параметрического алгоритма и определяли концентрации образцов с помощью интерполяции относительно стандартной кривой. Нижняя
- 41 037083 граница количественного определения составила 0,05 нг/мл.
Концентрации объединенных 1-mer/2-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] измерили с помощью гомогенного анализа HTRF® (Cisbio US, Бэдфорд, Массачусетс). Реакционную смесь (15 мкл, конъюгированное с хроматом европия моноклональное антитело мыши к IL-2, стрептавидин-d2, и биотинилированное моноклональное антитело кролика к PEG) внесли в белые, малого объема, 384-луночные титрационные микропланшеты. Добавили образцы и стандарты (5 мкл), разбавленные в чистой плазме, и планшеты инкубировали. Планшеты считывали на флуоресцентном планшет-ридере при 615 и 665 нм и рассчитывали показатель Delta F. Стандартную кривую построили с помощью взвешенного 5-параметрического алгоритма и определили концентрации образцов с помощью интерполяции относительно стандартной кривой. Нижняя граница количественного определения составила 0,05 нг/мл.
В анализе общего IL-2 измерили 3-mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] и 3-mer [mPEG2-CAC-fmoc20K]-[rIL-2]. Поскольку конъюгаты [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] и [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] представляют собой поддающиеся разрыву конъюгаты, в образце будут присутствовать различные виды молекул, делая отдельное количественное определение сложным; следовательно, измеряли общие уровни IL-2. Полимерсодержащий компонент конъюгатов заставляли высвобождаться из конъюгатов с помощью разбавления образцов и стандартного маточного раствора, приготовленного в чистой плазме, 1: 1 с помощью буфера для высвобождения (100 мМ HEPES/100 мМ Tris-HCL, pH 9) и инкубирования при 37°С в течение 30-36 ч. После инкубации добавили 25 об.% 0,1М уксусной кислоты для нейтрализации высокого pH. Высвобожденный IL-2 измерили с помощью ELISA, описанного выше.
На фиг. 9а показан график концентрация-время протестированных продуктов у мышей C57BL/6 после однократной внутримышечной инъекции (1 мг/кг). Образцы плазмы с гепарином натрия собирали в 10 мин и в 1, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 168 и 336 ч. Геометрические средние концентраций рассчитывали от 3 мышей на момент времени. Как показано на фиг. 9, альдеслейкин обладал короткой 1/2-жизнью и не обнаруживался после 6 ч (<0,05 нг/мл), в то время как конъюгаты обладали продолженной 1/2-жизнью и все еще обнаруживались через 336 ч.
Пример 13. Исследования эффективности в отношении метастатической меланомы легкого.
Для оценки эффективности соединений с предполагаемой активностью IL-2 широко применяли модель метастатической меланомы легкого и ее разработали на мышах C57BL/6. В этой модели мышам сперва внутривенно ввели клетки меланомы В16F10, которые вызывают развитие различного числа узлов в легких и различных размеров. Число узлов в легких, а также общая площадь поверхности этих поражений варьирует в зависимости от концентрации имплантируемых клеток. Затем тестируемое соединение, представляющее интерес, ввели группе мышей, подлежащей обработке, а другую группу мышей оставили необработанной, чтобы она служила в качестве контроля. Эффективность тестируемого соединения можно определять как процент уменьшения числа и размера узлов в легких, а также общей площади поражения для каждого легкого между обработанной и необработанной группами.
В этом исследовании 100000 клеток В16F10 (пассаж, не превышающий Р8) имплантировали посредством инъекций в хвостовую вену. На третий день от даты имплантации клеток ввели тестируемые соединения, представляющие интерес (или среду), как указано в табл. 5, в результате либо IP (внутрибрюшинного), либо IV (внутривенного) пути введения.
Таблица 5. Распределение групп для примера 13
№ групп ы | Тестируемый продукт | Клетки B16F10 | Путь введения | № живот ого | Доза |
А | Альдеслейкин (Prometheus Laboratories Inc.) | 100000 | IP | 1-12 | b.i.d х5 |
В | Компонент IL-2 из примера 1 | 100000 | IP | 1-12 | b.i.d х5 |
С | Среда | 100000 | IP | 1-12 | b.i.d х5 |
D | NKT-11135-A-OO1 | 100000 | IV | 1-12 | q2dx3 |
Е | Объединенные 3-mer/4-mer [mPEG2-CAC-fmoc- 20K]-[rIL-2] | 100000 | IV | 1-12 | q2dx3 |
F | Объединенные l-mer/2-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] | 100000 | IV | 1-12 | q2dx3 |
G | Объединенные 3-mer/4-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] | 100000 | IV | 1-12 | q2dx3 |
Примечание: b.i.d х 5 означает дважды в день в течение пяти дней; q2dx3 означает каждый второй день в рамках 3 доз.
На 14-й день после дня имплантации клеток мышей забили, при этом выделили и зафиксировали легкие в растворе Буэна, содержащем формальдегид, на день или два. Легкие (которые зафиксировали в растворе Буэна) просмотрели под стереоскопическим микроскопом и определили число и размер поражений для каждого легкого.
Как показано на фиг. 10, на 14-й день после дня имплантации клеток мышей забили и их выделенные легкие зафиксировали в растворе Буэна. Опухолевые узлы и их размеры подсчитали для каждого из альдеслейкина (Prometheus Laboratories Inc., Сан-Диего, Калифорния), компонента IL-2 примера 1, объединенных 3-mer/4-mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2], объединенных 3-mer/4-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL2] и объединенных 1-mer/2-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2].
- 42 037083
Пример 14. Исследования эффективности в отношении подкожной меланомы B16F10.
Для оценки эффективности соединений с предполагаемой активностью IL-2 применили весьма надежную модель подкожной меланомы у сингенных мышей, т.е. мышей C57BL/6. Вкратце, один миллион клеток B16F10 имплантировали подкожно в районе середины спины каждой мыши C57BL/6 в возрасте 5-6 недель. Перед рандомизацией и распределением на группы, как показано в табл. 6, опухолям дали возможность вырасти до прощупываемого размера, т.е. 70-120 мм3. Мышам ввели тестируемые соединения, т.е. альдеслейкин (Prometheus Laboratories Inc., Сан-Диего, Калифорния), конъюгаты rIL-2-полимер или среду при различных концентрациях дозы и схемах дозирования. Вес тела и объем опухоли измеряли через день. Конечной точкой для этого исследования был момент достижения среднего объема опухоли 1500 мм3 для указанной группы или 45 дней, в зависимости от того, что наступит ранее.
Таблица 6. Распределение групп для примера 14
Тестируемое соединение | Подгруппа (п=9) | Концентрация дозы (мг/кг) | Путь введения | Доза |
Объединенные 3-mer/4-mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] | А1 | 2 | IV | qld |
А2 | 4 | |||
Объединенные l-mer/2mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] | Е1 | 6 | IV | qld |
Е2 | 8 | |||
Альдеслейкин (Prometheus Laboratories Inc.) | С | 3 | IP | b.i.dx5 |
Н (п=6) | ||||
Объединенные 3-mer/4-mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] | В1 | 2 | IV | qld |
В2 | 4 | |||
Объединенные l-mer/2-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] | F1 | 6 | IV | qld |
F2 | 9 | |||
Объединенные l-mer/2-mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] | G1 | 2 | IV | qld |
G2 | 4 | |||
Среда: 10 мМ ацетат натрия; 150 мМ NaCl, pH 4,5; 2% сахароза | D | В соответствии с весом тела | IV | qld |
I |
На фиг. 11А и 11В представлены кривые доза-эффект касательно ингибирования роста опухоли после введения альдеслейкина (Prometheus Laboratories Inc.) и конъюгатов rIL-2-полимер при различных схемах введения. Эти результаты указывают, что протестированные конъюгаты rIL-2-полимер доказали лучшую эффективность при однократной дозе по сравнению с альдеслейкином (Prometheus Laboratories Inc.), что дозировали при 3 мг/кг дважды в день в течение пяти дней.
На фиг. 11А показана зависимость развития опухоли от времени после введения однократной дозы конъюгатов rIL-2-полимер до достижения среднего объема опухоли 1500 мм3. Обнаружили, что задержка роста опухоли (TGD) с кривых развития опухоли составляет 4,6 и 6,2 дней, соответственно, для объединенных 3-mer/4-mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] при концентрациях дозы 2 и 4 мг/кг. Для объединенных 3-mer/4-mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] обнаружили, что TGD составляет 6,4 и 7,6 дней, соответственно, при концентрациях дозы 2 и 4 мг/кг.
На фиг. 11В показана зависимость развития опухоли от времени после введения однократной дозы конъюгатов rIL-2-полимер до достижения среднего объема опухоли 1500 мм3. Обнаружили, что TGD с кривых развития опухоли составляет 3,6 и 4,6 дней, соответственно, для объединенных 1-mer/2-mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] при концентрациях дозы 6 и 8 мг/кг. Для объединенных 1-mer/2-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] обнаружили, что TGD составляет 3,8 при 2 мг/кг, вместе с тем обнаружили, что концентрация дозы 4 мг/кг по природе является токсической. Обнаружили, что TGD с кривых развития опухоли составляет 2,2 и 3,6 дней, соответственно, для объединенных 1-mer/2-mer [mPEG2-CAC-fmoc20K]-[rIL-2] при концентрациях дозы 2 и 4 мг/кг.
Одним словом, как в модели метастатического поражения легкого (пример 13), так и в модели подкожной мышиной меланомы (пример 14) эффективность обеспечивалась с помощью конъюгатов rIL-2полимер при значительно более низкой частоте дозирования и более низком общем количестве белка по сравнению с альдеслейкином (Prometheus Laboratories Inc.).
Claims (14)
1. Иммуномодулирующий конъюгат, включающий IL-2, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-4 или последовательность, гомологичную на 95% любой из указанных последовательностей, причем IL-2 ковалентно соединен посредством поддающейся разрыву связи с одним или несколькими водорастворимыми полимерами, каждый из которых имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 20 кДа до приблизительно 85 кДа, при этом поддающаяся разрыву связь содержит сложноэфирную группу, выбранную из сложного эфира карбоновой кислоты, сложного эфира фосфорной кислоты, тиолового сложного эфира и сложного ортоэфира, причем в условиях in vivo указанная связь поддается разрыву с высвобождением одного или нескольких водорастворимых полимеров.
2. Иммуномодулирующий конъюгат, включающий IL-2, содержащий любую из аминокислотных
- 43 037083 последовательностей SEQ ID NO: 1-4 или последовательность, гомологичную на 95% любой из указанных последовательностей, причем IL-2 ковалентно соединен посредством поддающейся разрыву карбаматной связи с одним или несколькими водорастворимыми полимерами, каждый из которых имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 20 кДа до приблизительно 85 кДа, при этом поддающаяся разрыву связь представляет собой карбаматную связь, причем в условиях in vivo указанная связь поддается разрыву с высвобождением одного или нескольких водорастворимых полимеров.
3. Конъюгат по любому из пп.1 и 2, где водорастворимый полимер представляет собой разветвленный водорастворимый полимер.
4. Конъюгат по любому из пп.1-3, где водорастворимый полимер представляет собой полимер, выбранный из поли(алкиленоксида), поли(винилпирролидона), поли(винилового спирта), полиоксазолина и поли(акрилоилморфолина).
5. Конъюгат по п.4, где водорастворимый полимер представляет собой поли(алкиленоксид).
6. Конъюгат по п.5, где поли(алкиленоксид) представляет собой поли(этиленгликоль).
7. Конъюгат по п.6, где поли(этиленгликоль) содержит концевую функциональную группу, выбранную из групп гидрокси и (С1-С6)алкокси.
8. Конъюгат по любому из пп.1-7, где один, два, три, четыре, пять, шесть или семь водорастворимых полимеров присоединены к IL-2.
9. Конъюгат по любому из пп.1-8, где один, два или три водорастворимых полимера присоединены к IL-2.
10. Конъюгат по любому из пп.1-8, где один или два водорастворимых полимера присоединены к IL-2.
11. Конъюгат по любому из пп.1-8, где один водорастворимый полимер присоединен к IL-2.
12. Фармацевтическая композиция для модуляции иммунного ответа у пациента с раковым заболеванием, содержащая конъюгат по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый наполнитель.
13. Способ доставки конъюгата, содержащего IL-2, нуждающемуся в этом индивидууму, включающий введение ему фармацевтической композиции по п.12.
14. Способ получения конъюгата по п.1 или 2, включающий приведение в контакт IL-2 с водорастворимым полимером, имеющим среднюю молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 20 кДа до приблизительно 85 кДа, в условиях, подходящих для образования поддающейся разрыву связи, выбранной из связи, содержащей сложноэфирную группу, выбранную из сложного эфира карбоновой кислоты, сложного эфира фосфорной кислоты, тиолового сложного эфира и сложного ортоэфира, и карбаматной связи, причем IL-2 представляет собой белок, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-4 или последовательность, гомологичную на 95% любой из указанных последовательностей.
1 CATATGCCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAGCTGGAACATCTGCTGCTG 1MPTSSSTKKTQLQLEHLLL
61 GAT С Т GC AGAT GAT С С Т GAAC GG Т АТ С ААС ААС Т АС АААААС С С GAAAC Т GAC С С G ТАТ G 22DLQMILNGINNYKNPKLTRM
121 CTGACCTTCAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAACTGAAACATCTGCAGTGCCTG 40LTFKFYMPKKATELKHLQCL
181 GAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAAGTGCTGAACCTGGCACAGAGCAAAAACTTCCAT 60EEELKPLEEVLNLAQSKNFH
241 CTGCGTCCGCGTGATCTGATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAACTGAAAGGMETKAC 80LRPRDLISNINVIVLELKGS
301 GAAACCACCTTCATGTGCGAATACGCAGATGAAACCGCAACCATCGTGGAATTTCTGAAC
100 ETTFMCEYADETATIVEFLN
3 61 CGTTGGATCACCTTCAGCCAGAGCATCATCAGCACCCTGACCTAAGAATTC
120 RWITFSQSIISTLT*
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US41323610P | 2010-11-12 | 2010-11-12 | |
PCT/US2011/060408 WO2012065086A1 (en) | 2010-11-12 | 2011-11-11 | Conjugates of an il-2 moiety and a polymer |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201390697A1 EA201390697A1 (ru) | 2013-08-30 |
EA037083B1 true EA037083B1 (ru) | 2021-02-03 |
Family
ID=46051324
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201390697A EA037083B1 (ru) | 2010-11-12 | 2011-11-11 | Иммуномодулирующий конъюгат, включающий il-2 и водорастворимые полимеры |
EA202092025A EA202092025A1 (ru) | 2010-11-12 | 2011-11-11 | Конъюгаты компонента il-2 и полимера |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA202092025A EA202092025A1 (ru) | 2010-11-12 | 2011-11-11 | Конъюгаты компонента il-2 и полимера |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US9861705B2 (ru) |
EP (2) | EP3895735A1 (ru) |
JP (6) | JP2014506116A (ru) |
KR (5) | KR102349549B1 (ru) |
CN (2) | CN110812488A (ru) |
AU (6) | AU2011325990C1 (ru) |
CA (2) | CA3144697A1 (ru) |
CY (1) | CY1124659T1 (ru) |
DK (1) | DK2637694T3 (ru) |
EA (2) | EA037083B1 (ru) |
ES (1) | ES2866674T3 (ru) |
HR (1) | HRP20210642T1 (ru) |
HU (1) | HUE054318T2 (ru) |
IL (2) | IL295201A (ru) |
LT (1) | LT2637694T (ru) |
MX (1) | MX358399B (ru) |
PL (1) | PL2637694T3 (ru) |
PT (1) | PT2637694T (ru) |
RS (1) | RS61854B1 (ru) |
SI (1) | SI2637694T1 (ru) |
WO (1) | WO2012065086A1 (ru) |
Families Citing this family (170)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3144697A1 (en) * | 2010-11-12 | 2012-05-18 | Nektar Therapeutics | Conjugates of an il-2 moiety and a polymer |
BR102013017626A2 (pt) * | 2013-06-14 | 2015-02-10 | Univ Rio De Janeiro | Bioconjugados não aglomerantes de amilinomiméticos com polietilenoglicol, uso de bioconjugados não aglomerantes de amilinomiméticos com polietilenoglicol, composições farmacêuticas de baixa toxicidade, adjuvante para a prevenção ou tratamento das doenças, medicamento, método de tratamento ou prevenção de doenças. |
PL3041854T3 (pl) | 2013-08-08 | 2020-06-29 | The Scripps Research Institute | Sposób miejscowo specyficznego oznakowania enzymatycznego kwasów nukleinowych in vitro przez inkorporację niewystępujących naturalnie nukleotydów |
PL3134123T3 (pl) * | 2014-02-21 | 2021-07-12 | Nektar Therapeutics (India) Pvt. Ltd. | Agoniści selektywni względem IL-2Rbeta w kombinacji z przeciwciałem anty-CTLA-4 lub z przeciwciałem anty-PD-1 |
MA39711A (fr) * | 2014-04-03 | 2015-10-08 | Nektar Therapeutics | Conjugués d'une fraction d'il-15 et d'un polymère |
EP3129493B1 (en) | 2014-04-09 | 2021-07-07 | The Scripps Research Institute | Import of unnatural or modified nucleoside triphosphates into cells via nucleic acid triphosphate transporters |
ES2980788T3 (es) | 2014-04-10 | 2024-10-03 | H Lee Moffitt Cancer Center And Res Institute Inc | Expansión mejorada de linfocitos infiltrantes de tumores para terapia celular adoptiva |
EA034925B1 (ru) | 2014-08-11 | 2020-04-07 | Делиниа, Инк. | Модифицированные варианты il-2, которые селективно активируют регуляторные т-клетки, для лечения аутоиммунных заболеваний |
IL254389B2 (en) * | 2015-03-11 | 2023-03-01 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates and the il–7 group |
US20180296645A1 (en) * | 2015-10-08 | 2018-10-18 | Nektar Therapeutics | Combination of an il-2rbeta-selective agonist and a long-acting il-15 agonist |
WO2017106767A1 (en) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | The Scripps Research Institute | Production of unnatural nucleotides using a crispr/cas9 system |
US20170204154A1 (en) | 2016-01-20 | 2017-07-20 | Delinia, Inc. | Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases |
DK3475295T3 (da) | 2016-06-24 | 2022-10-24 | Scripps Research Inst | Hidtil ukendt nukleosidtriphosphat-transportør og anvendelser deraf |
NZ750005A (en) | 2016-07-07 | 2023-06-30 | Iovance Biotherapeutics Inc | Programmed death 1 ligand 1 (pd-l1) binding proteins and methods of use thereof |
KR20190057113A (ko) | 2016-09-28 | 2019-05-27 | 조마 (유에스) 엘엘씨 | 인터루킨-2에 결합하는 항체 및 그 용도 |
IL266209B1 (en) | 2016-10-26 | 2024-10-01 | Iovance Biotherapeutics Inc | Restimulation of cryopreserved sputum infiltrates lymphocytes |
TWI788307B (zh) | 2016-10-31 | 2023-01-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞 |
CN110167957A (zh) | 2016-11-08 | 2019-08-23 | 德里尼亚公司 | 用于治疗自身免疫疾病的il-2变体 |
CN109890406A (zh) * | 2016-11-10 | 2019-06-14 | 尼克塔治疗公司 | 肿瘤免疫治疗性治疗方法 |
MX2019005617A (es) | 2016-11-17 | 2019-08-14 | Iovance Biotherapeutics Inc | Linfocitos infiltrantes de tumores remanentes y metodos de preparacion y uso de los mismos. |
AU2018205234B2 (en) | 2017-01-06 | 2024-09-19 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (TILs) with tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF) agonists and therapeutic combinations of TILs and TNFRSF agonists |
EP3565586A1 (en) | 2017-01-06 | 2019-11-13 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof |
IL297655A (en) | 2017-01-10 | 2022-12-01 | Nektar Therapeutics | Multi-arm polymer bracelets of tlr agonist compounds and related immunotherapeutic methods |
CN110366421A (zh) * | 2017-03-01 | 2019-10-22 | 尼克塔治疗公司 | 使用白介素-2受体α,β选择性激动剂与过继性细胞转移疗法的组合的免疫治疗肿瘤治疗方法 |
EP3596108A4 (en) | 2017-03-15 | 2020-12-23 | Pandion Operations, Inc. | TARGETED IMMUNOTOLERANCE |
US11254913B1 (en) | 2017-03-29 | 2022-02-22 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
JOP20190224A1 (ar) | 2017-03-29 | 2019-09-26 | Iovance Biotherapeutics Inc | عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي |
TWI788340B (zh) | 2017-04-07 | 2023-01-01 | 美商必治妥美雅史谷比公司 | 抗icos促效劑抗體及其用途 |
CN110582300B (zh) | 2017-05-02 | 2024-08-02 | 尼克塔治疗公司 | 肿瘤免疫治疗性治疗方法 |
US20200224161A1 (en) | 2017-05-10 | 2020-07-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof |
CN111093688A (zh) | 2017-05-15 | 2020-05-01 | 尼克塔治疗公司 | 长效白细胞介素-15受体激动剂以及相关免疫治疗组合物和方法 |
BR112019024127A2 (pt) | 2017-05-24 | 2020-06-23 | Pandion Therapeutics, Inc. | Imunotolerância alvejada |
TW201919662A (zh) | 2017-06-05 | 2019-06-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 對雙重難治性黑色素瘤使用腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法 |
AU2018300069A1 (en) | 2017-07-11 | 2020-02-27 | Synthorx, Inc. | Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof |
CA3071013A1 (en) | 2017-08-03 | 2019-02-07 | Synthorx, Inc. | Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases |
EP3668548A2 (en) | 2017-08-17 | 2020-06-24 | Nektar Therapeutics | Immunotherapeutic tumor treatment method |
CN111511762A (zh) | 2017-08-21 | 2020-08-07 | 天演药业公司 | 抗cd137分子及其用途 |
EP3706778A1 (en) | 2017-11-06 | 2020-09-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of treating a tumor |
JP7404252B2 (ja) * | 2017-11-08 | 2023-12-25 | ヤフェイ シャンハイ バイオロジー メディスン サイエンス アンド テクノロジー カンパニー リミテッド | 生体分子のコンジュゲートおよびその使用 |
CR20200251A (es) | 2017-11-17 | 2020-07-17 | Iovance Biotherapeutics Inc | Expansión de til de aspirados con aguja fina y biopsias por punción |
KR20200086722A (ko) | 2017-11-21 | 2020-07-17 | 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 | 인터루킨-2의 부분 효능제 |
JP2021503885A (ja) | 2017-11-22 | 2021-02-15 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | 末梢血からの末梢血リンパ球(pbl)の拡大培養 |
US10946068B2 (en) | 2017-12-06 | 2021-03-16 | Pandion Operations, Inc. | IL-2 muteins and uses thereof |
US10174092B1 (en) | 2017-12-06 | 2019-01-08 | Pandion Therapeutics, Inc. | IL-2 muteins |
CA3085765A1 (en) | 2017-12-15 | 2019-06-20 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Systems and methods for determining the beneficial administration of tumor infiltrating lymphocytes, and methods of use thereof and beneficial administration of tumor infiltrating lymphocytes, and methods of use thereof |
US20210060169A1 (en) * | 2017-12-27 | 2021-03-04 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Il-2 variant |
EP3737743A1 (en) | 2018-01-08 | 2020-11-18 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells |
US11713446B2 (en) | 2018-01-08 | 2023-08-01 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells |
WO2019136459A1 (en) | 2018-01-08 | 2019-07-11 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells |
WO2019148445A1 (en) | 2018-02-02 | 2019-08-08 | Adagene Inc. | Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same |
EP3752600A1 (en) | 2018-02-13 | 2020-12-23 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with adenosine a2a receptor antagonists and therapeutic combinations of tils and adenosine a2a receptor antagonists |
US11534479B2 (en) | 2018-02-16 | 2022-12-27 | Iltoo Pharma | Use of interleukin 2 for treating Sjögren's syndrome |
JP7515412B2 (ja) | 2018-03-09 | 2024-07-12 | アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド | 新規のサイトカインプロドラッグ |
TW202003565A (zh) | 2018-03-23 | 2020-01-16 | 美商必治妥美雅史谷比公司 | 抗mica及/或micb抗體及其用途 |
EP3773680A1 (en) * | 2018-03-28 | 2021-02-17 | Ascendis Pharma Oncology Division A/S | Il-2 conjugates |
EA202092319A1 (ru) | 2018-03-29 | 2021-03-04 | Айовэнс Байотерапьютикс, Инк. | Способы получения опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов и применения их в иммунотерапии |
SG11202010319RA (en) | 2018-04-27 | 2020-11-27 | Iovance Biotherapeutics Inc | Closed process for expansion and gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
WO2019217753A1 (en) | 2018-05-10 | 2019-11-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
WO2019222294A1 (en) | 2018-05-14 | 2019-11-21 | Werewolf Therapeutics, Inc. | Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof |
CN113840832A (zh) | 2018-05-14 | 2021-12-24 | 狼人治疗公司 | 可活化白介素-2多肽及其使用方法 |
CR20200546A (es) * | 2018-05-21 | 2021-05-18 | Nektar Therapeutics | ESTIMULADOR SELECTIVO TREG RUR20kD-IL-2 Y COMPOSICIONES RELACIONADAS |
WO2020007937A1 (en) | 2018-07-03 | 2020-01-09 | Iltoo Pharma | Use of interleukin-2 for treating systemic sclerosis |
BR112021002250A2 (pt) | 2018-08-06 | 2021-07-20 | Medikine, Inc. | compostos de ligação ao receptor de il-2 |
US20210236599A1 (en) | 2018-08-13 | 2021-08-05 | Iltoo Pharma | Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof |
TW202031273A (zh) | 2018-08-31 | 2020-09-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 抗pd-1抗體難治療性之非小細胞肺癌(nsclc)病患的治療 |
PL3849614T3 (pl) | 2018-09-11 | 2024-04-22 | Ambrx, Inc. | Koniugaty polipeptydu interleukiny-2 i ich zastosowania |
WO2020061429A1 (en) | 2018-09-20 | 2020-03-26 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tils from cryopreserved tumor samples |
EP3876940A1 (en) | 2018-11-05 | 2021-09-15 | Pfizer Inc. | Combinations for treating cancer |
MX2021005216A (es) | 2018-11-05 | 2021-06-18 | Iovance Biotherapeutics Inc | Procesos para la produccion de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de los mismos en inmunoterapia. |
JP2022512899A (ja) | 2018-11-05 | 2022-02-07 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | 抗pd-1抗体に対して不応性のnsclc患者の治療 |
TW202039829A (zh) | 2018-11-05 | 2020-11-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 改善之腫瘤反應性t細胞的選擇 |
CA3118493A1 (en) | 2018-11-05 | 2020-05-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors |
EP3876929A1 (en) | 2018-11-05 | 2021-09-15 | Pfizer Inc. | Combination for treating cancer |
WO2020102501A1 (en) | 2018-11-16 | 2020-05-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Anti-nkg2a antibodies and uses thereof |
EP3898949A1 (en) | 2018-12-19 | 2021-10-27 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof |
BR112021014415A2 (pt) * | 2019-02-06 | 2021-09-21 | Synthorx, Inc. | Conjugados de il-2 e métodos de uso dos mesmos |
US20220133795A1 (en) | 2019-03-01 | 2022-05-05 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of Tumor Infiltrating Lymphocytes From Liquid Tumors and Therapeutic Uses Thereof |
US20220249559A1 (en) | 2019-05-13 | 2022-08-11 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy |
SG11202112541RA (en) | 2019-05-14 | 2021-12-30 | Werewolf Therapeutics Inc | Separation moieties and methods and use thereof |
CA3136241A1 (en) | 2019-05-20 | 2020-11-26 | Ulrich Moebius | Il-2/il-15r.beta.y agonist dosing regimens for treating cancer or infectious diseases |
EP3972992A4 (en) | 2019-05-20 | 2023-07-19 | Pandion Operations, Inc. | ANTI-MADCAM IMMUNE TOLERANCE |
US20220305124A1 (en) * | 2019-06-05 | 2022-09-29 | Emory University | Photolysis to Unlock Caged Protein Therapeutics |
WO2020252264A1 (en) | 2019-06-12 | 2020-12-17 | AskGene Pharma, Inc. | Novel il-15 prodrugs and methods of use thereof |
WO2020252262A1 (en) | 2019-06-14 | 2020-12-17 | The Scripps Research Institute | Reagents and methods for replication, transcription, and translation in semi-synthetic organisms |
GB201911066D0 (en) | 2019-08-02 | 2019-09-18 | Achilles Therapeutics Ltd | T cell therapy |
EP4034551A1 (en) | 2019-09-28 | 2022-08-03 | AskGene Pharma, Inc. | Cytokine prodrugs and dual-prodrugs |
CA3155727A1 (en) | 2019-10-25 | 2021-04-29 | Cecile Chartier-Courtaud | Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
CA3160133A1 (en) | 2019-11-05 | 2021-05-14 | Medikine, Inc. | Il-2rbyc binding compounds |
CA3160466A1 (en) | 2019-11-05 | 2021-05-14 | Medikine, Inc. | Dual il-2r and il-7r binding compounds |
KR20220101147A (ko) | 2019-11-14 | 2022-07-19 | 웨어울프 세라퓨틱스, 인크. | 활성화가능한 사이토카인 폴리펩티드 및 이의 사용 방법 |
WO2021118990A1 (en) | 2019-12-11 | 2021-06-17 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (tils) and methods of using the same |
CA3164986A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Instil Bio (Uk) Limited | Devices and methods for isolating tumor infiltrating lymphocytes and uses thereof |
CA3162406A1 (en) * | 2020-01-10 | 2021-07-15 | Vijaya Raghavan PATTABIRAMAN | Modified il-2 polypeptides and uses thereof |
AU2021207901A1 (en) | 2020-01-14 | 2022-09-08 | Synthekine, Inc. | IL2 orthologs and methods of use |
KR102653906B1 (ko) | 2020-01-14 | 2024-04-03 | 신테카인, 인크. | 편향된 il2 뮤테인 방법 및 조성물 |
CN113121670B (zh) * | 2020-01-15 | 2022-11-22 | 天津键凯科技有限公司 | 二取代peg化白细胞介素2及其制备方法、应用 |
US20230102464A1 (en) * | 2020-01-15 | 2023-03-30 | Jenkem Technology Co., Ltd. (Tianjin) | Method for preparing pegylated biomolecule with controllable binding sites |
CN115297886A (zh) | 2020-02-03 | 2022-11-04 | 麦地金公司 | IL-7Rα结合化合物 |
BR112022015002A2 (pt) | 2020-02-03 | 2022-12-06 | Medikine Inc | Ligante de il-7r-alfa/gama/c, composto, composição farmacêutica, método para tratar uma doença em um paciente e ácido nucleico |
US11981715B2 (en) | 2020-02-21 | 2024-05-14 | Pandion Operations, Inc. | Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector |
TWI839476B (zh) * | 2020-02-26 | 2024-04-21 | 大陸商北京泰德製藥股份有限公司 | 介白素-2多肽共軛物及其用途 |
WO2021202923A1 (en) | 2020-04-02 | 2021-10-07 | Nektar Therapeutics | Immunomodulator for the prevention and treatment of coronovirus infection and other conditions |
CA3176356A1 (en) | 2020-04-22 | 2021-10-28 | Anne BROOKS | Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy |
CR20220530A (es) | 2020-04-22 | 2022-12-15 | Merck Sharp & Dohme Llc | CONJUGADOS DE INTERLEUCINA 2 HUMANA SESGADOS AL DÍMERO DEL RECEPTOR DE INTERLEUCINA 2 ß¿c Y CONJUGADOS CON UN POLÍMERO HIDROSOLUBLE NO PEPTÍDICO. |
CN111499746B (zh) * | 2020-04-28 | 2020-11-24 | 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 | 一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用 |
CN115461062A (zh) | 2020-04-28 | 2022-12-09 | 阿基里斯治疗英国有限公司 | T细胞疗法 |
EP4146793A1 (en) | 2020-05-04 | 2023-03-15 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Selection of improved tumor reactive t-cells |
EP4146794A1 (en) | 2020-05-04 | 2023-03-15 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy |
KR20230019889A (ko) | 2020-06-03 | 2023-02-09 | 아센디스 파마 온콜로지 디비전 에이/에스 | Il-2 서열 및 이의 용도 |
US20230372397A1 (en) | 2020-10-06 | 2023-11-23 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
WO2022076606A1 (en) | 2020-10-06 | 2022-04-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
IL302313A (en) | 2020-10-26 | 2023-06-01 | Cytune Pharma | IL-2/IL-15RBY agonist for the treatment of non-melanoma skin cancer |
JP2023550685A (ja) | 2020-10-26 | 2023-12-05 | サイチューン ファーマ | 扁平上皮癌を治療するためのIL-2/IL-15Rβγアゴニスト |
EP4259164A1 (en) | 2020-12-11 | 2023-10-18 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors |
JP2023554395A (ja) | 2020-12-17 | 2023-12-27 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | Ctla-4及びpd-1阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法による治療 |
JP2024500403A (ja) | 2020-12-17 | 2024-01-09 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | 腫瘍浸潤リンパ球によるがんの治療 |
WO2022130016A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Instil Bio (Uk) Limited | Tumor infiltrating lymphocytes and anti-cd47 therapeutics |
CA3205464A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Instil Bio (Uk) Limited | Processing of tumor infiltrating lymphocytes |
EP4263807A2 (en) | 2020-12-18 | 2023-10-25 | Instil Bio (Uk) Limited | Processing of tumor infiltrating lymphocytes |
WO2022146947A1 (en) | 2020-12-28 | 2022-07-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibody compositions and methods of use thereof |
WO2022146948A1 (en) | 2020-12-28 | 2022-07-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies |
CA3203382A1 (en) | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Adrian Emanual Wells | Devices and processes for automated production of tumor infiltrating lymphocytes |
TW202241508A (zh) | 2021-01-29 | 2022-11-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法 |
US20240299540A1 (en) | 2021-02-05 | 2024-09-12 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Adjuvant therapy for cancer |
EP4301138A2 (en) | 2021-03-05 | 2024-01-10 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Tumor storage and cell culture compositions |
WO2022198141A1 (en) | 2021-03-19 | 2022-09-22 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils |
TW202305118A (zh) | 2021-03-23 | 2023-02-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 腫瘤浸潤淋巴球之cish基因編輯及其在免疫療法中之用途 |
EP4314253A2 (en) | 2021-03-25 | 2024-02-07 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products |
WO2022212876A1 (en) | 2021-04-02 | 2022-10-06 | The Regents Of The University Of California | Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof |
EP4326287A2 (en) | 2021-04-19 | 2024-02-28 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies |
JP2024519029A (ja) | 2021-05-17 | 2024-05-08 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | Pd-1遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用 |
KR20240023426A (ko) | 2021-06-22 | 2024-02-21 | 아킬레스 테라퓨틱스 유케이 리미티드 | 항원-특이적 t 세포를 생산하는 방법 |
US20230201365A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-06-29 | Bright Peak Therapeutics Ag | Modified cd20 antibodies and uses thereof |
US20230181754A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-06-15 | Bright Peak Therapeutics Ag | Modified checkpoint inhibitors and uses thereof |
US20240158537A1 (en) | 2021-07-09 | 2024-05-16 | Bright Peak Therapeutics Ag | Synthetic il-7 and il-7 immunocytokines |
AU2022306145A1 (en) | 2021-07-09 | 2024-02-01 | Bright Peak Therapeutics Ag | Antibody conjugates and manufacture thereof |
WO2023004074A2 (en) | 2021-07-22 | 2023-01-26 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Method for cryopreservation of solid tumor fragments |
TW202327631A (zh) | 2021-07-28 | 2023-07-16 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 利用腫瘤浸潤性淋巴球療法與kras抑制劑組合治療癌症患者 |
EP4384204A1 (en) | 2021-08-13 | 2024-06-19 | Cytune Pharma | Il-2/il-15rbetagamma agonist combination with antibody-drug conjugates for treating cancer |
JP2024535002A (ja) | 2021-09-09 | 2024-09-26 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | Pd-1 talenノックダウンを使用したtil製品を生成するためのプロセス |
JP2024534581A (ja) | 2021-09-24 | 2024-09-20 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | 腫瘍浸潤リンパ球のための拡張プロセス及び薬剤 |
AR127482A1 (es) | 2021-10-27 | 2024-01-31 | Iovance Biotherapeutics Inc | Sistemas y métodos para coordinar la fabricación de células para inmunoterapia específica de paciente |
AU2022388729A1 (en) | 2021-11-10 | 2024-05-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes |
IL313567A (en) | 2021-12-14 | 2024-08-01 | Lilly Co Eli | Dose transmitters for selective TREG stimulator RUR20KD-IL-2 and related preparations |
WO2023133595A2 (en) | 2022-01-10 | 2023-07-13 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
WO2023147488A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods |
WO2023147486A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads |
WO2023150562A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Alaunos Therapeutics, Inc. | Methods for activation and expansion of t cells |
CN118302435A (zh) * | 2022-02-18 | 2024-07-05 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种实现生物活性分子其活性控释和缓释的方法及药物应用 |
US20240132563A1 (en) | 2022-02-23 | 2024-04-25 | Bright Peak Therapeutics Ag | Bifunctional cytokine compositions |
WO2023193015A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Sana Biotechnology, Inc. | Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies |
WO2023196877A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
US11999771B2 (en) | 2022-04-07 | 2024-06-04 | Medikine, Inc. | IL-7Rαγc ligand immunoglobulin fusion proteins |
WO2023201369A1 (en) | 2022-04-15 | 2023-10-19 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment |
WO2023220608A1 (en) | 2022-05-10 | 2023-11-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist |
WO2023235847A1 (en) | 2022-06-02 | 2023-12-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibody compositions and methods of use thereof |
WO2024011114A1 (en) | 2022-07-06 | 2024-01-11 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Devices and processes for automated production of tumor infiltrating lymphocytes |
WO2024030758A1 (en) | 2022-08-01 | 2024-02-08 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies |
WO2024055017A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown |
WO2024055018A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown |
WO2024056154A1 (en) | 2022-09-12 | 2024-03-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Interleukin-2 for use in treating autism spectrum disorder |
WO2024098027A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection |
WO2024098024A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof |
WO2024112571A2 (en) | 2022-11-21 | 2024-05-30 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom |
WO2024118836A1 (en) | 2022-11-30 | 2024-06-06 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step |
WO2024119193A2 (en) | 2022-12-02 | 2024-06-06 | AskGene Pharma, Inc. | Mutant il-2 polypeptides and il-2 prodrugs |
WO2024150174A1 (en) | 2023-01-11 | 2024-07-18 | Bright Peak Therapeutics Ag | Conditionally activated immunocytokines and methods of use |
WO2024150175A1 (en) | 2023-01-11 | 2024-07-18 | Bright Peak Therapeutics Ag | Conditionally activated proteins and methods of use |
WO2024151885A1 (en) | 2023-01-13 | 2024-07-18 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Use of til as maintenance therapy for nsclc patients who achieved pr/cr after prior therapy |
GB202307096D0 (en) | 2023-05-12 | 2023-06-28 | Achilles Therapeutics Uk Ltd | Method |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4705848A (en) * | 1986-06-02 | 1987-11-10 | International Minerals & Chemical Corp. | Isolation of bioactive, monomeric growth hormone |
US6034072A (en) * | 1997-02-10 | 2000-03-07 | Genemedicine, Inc. | IL-2 gene expression and delivery systems and uses |
US20040136952A1 (en) * | 2002-12-26 | 2004-07-15 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity |
US20050186174A1 (en) * | 2003-12-10 | 2005-08-25 | Bossard Mary J. | Compositions comprising two different populations of polymer-active agent conjugates |
US20090263382A1 (en) * | 2005-06-07 | 2009-10-22 | Esbatech | Stable and soluble antibodies inhibiting tnf alpha |
Family Cites Families (48)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4401756A (en) | 1981-04-14 | 1983-08-30 | Immunex Corporation | Process for preparing human interleukin 2 |
US4518584A (en) * | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
JPS60502136A (ja) * | 1983-08-10 | 1985-12-12 | アムジエン インコーポレイテツド | 微生物によるインタ−ル−キン2の形質発現 |
JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―2蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
US4569790A (en) | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
US5116943A (en) | 1985-01-18 | 1992-05-26 | Cetus Corporation | Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein |
US5206344A (en) | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
US4766106A (en) | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
EP0229108B1 (en) | 1985-06-26 | 1990-12-27 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US5078997A (en) | 1988-07-13 | 1992-01-07 | Cetus Corporation | Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers |
US5089261A (en) | 1989-01-23 | 1992-02-18 | Cetus Corporation | Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate |
US4902502A (en) | 1989-01-23 | 1990-02-20 | Cetus Corporation | Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate |
US5153310A (en) | 1989-02-28 | 1992-10-06 | Du Pont Merck Pharmaceutical Company | Il-2 analogs containing n-linked glycosylation sites |
US5166322A (en) | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
IE912365A1 (en) | 1990-07-23 | 1992-01-29 | Zeneca Ltd | Continuous release pharmaceutical compositions |
US5595732A (en) * | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
US5446090A (en) | 1993-11-12 | 1995-08-29 | Shearwater Polymers, Inc. | Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules |
US5635597A (en) | 1994-05-27 | 1997-06-03 | Affymax Technologies, N.V. | Peptides that bind IL-2 receptors |
US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
US6180095B1 (en) * | 1997-12-17 | 2001-01-30 | Enzon, Inc. | Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents |
DK1061954T3 (da) | 1998-03-12 | 2004-10-18 | Nektar Therapeutics Al Corp | Polyethylenglycolderivater med proximale reaktive grupper |
DZ2788A1 (fr) | 1998-05-15 | 2003-12-01 | Bayer Ag | Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2. |
US6168785B1 (en) | 1998-07-16 | 2001-01-02 | Institut Pasteur | Biological applications of new peptides of IL-2 and derivatives and use as therapeutic agents |
AU2001238595A1 (en) | 2000-02-22 | 2001-09-03 | Shearwater Corporation | N-maleimidyl polymer derivatives |
US6689353B1 (en) | 2000-06-28 | 2004-02-10 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Stabilized interleukin 2 |
EP1353701B1 (en) | 2000-10-31 | 2011-12-21 | PR Pharmaceuticals, Inc. | Methods for producing compositions for enhanced delivery of bioactive molecules |
FR2826365B1 (fr) | 2001-06-20 | 2003-09-26 | Oreal | Compositions cosmetiques photoprotectrices contenant des derives amides, sulfonamides ou carbamates aromatiques d'acrylonitrile et nouveaux derives amides, sulfonamides ou carbamates d'acrylonitrile |
RS20050202A (en) * | 2002-09-09 | 2007-08-03 | Nektar Therapeuticals Al.Corporation, | Water-soluble polymer alkanals |
CN1852732A (zh) * | 2002-12-26 | 2006-10-25 | 山景医药公司 | 具有增强的生物学效用的干扰素-β的聚合物缀合物 |
US7910661B2 (en) | 2003-01-06 | 2011-03-22 | Nektar Therapeutics | Thiol-selective water-soluble polymer derivatives |
CA2521784C (en) | 2003-04-08 | 2012-03-27 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Reversible pegylated drugs |
PT2644206T (pt) * | 2003-05-23 | 2019-07-10 | Nektar Therapeutics | Derivados de peg contendo duas cadeias de peg |
US7569215B2 (en) | 2003-07-18 | 2009-08-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides |
ES2289663T3 (es) * | 2005-02-07 | 2008-02-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Preparacion de aldesleucina para uso farmaceutico. |
AU2006259225B2 (en) * | 2005-06-16 | 2012-05-31 | Nektar Therapeutics | Conjugates having a degradable linkage and polymeric reagents useful in preparing such conjugates |
WO2007019331A2 (en) * | 2005-08-04 | 2007-02-15 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of a g-csf moiety and a polymer |
CA2882445A1 (en) * | 2005-12-14 | 2007-06-21 | Ambrx, Inc. | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
WO2007075534A2 (en) | 2005-12-16 | 2007-07-05 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Polymer conjugates of glp-1 |
JP2009533347A (ja) | 2006-04-07 | 2009-09-17 | ネクター セラピューティックス エイエル,コーポレイション | 抗TNFα抗体の複合体 |
CN101104077A (zh) | 2006-07-12 | 2008-01-16 | 北京紫辰医药生物技术研究所 | 重组人白介素-2与聚乙二醇的偶合物 |
EP2114458B1 (en) | 2006-12-27 | 2014-02-26 | Nektar Therapeutics | Von willebrand factor- and factor viii-polymer conjugates having a releasable linkage |
KR101508617B1 (ko) | 2007-02-28 | 2015-04-06 | 세리나 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 | 활성화된 폴리옥사졸린 및 이를 포함하는 조성물 |
US7567215B1 (en) | 2007-10-23 | 2009-07-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Portable and inflatable antenna device |
KR20090103209A (ko) * | 2008-03-27 | 2009-10-01 | (주)한국비엠아이 | 사람 인터루킨-2 동종체 |
JP2011520447A (ja) | 2008-05-16 | 2011-07-21 | ネクター セラピューティックス | コリンエステラーゼ部分とポリマーとのコンジュゲート |
WO2010014258A2 (en) * | 2008-08-01 | 2010-02-04 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates having a releasable linkage |
WO2010033240A2 (en) * | 2008-09-19 | 2010-03-25 | Nektar Therapeutics | Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof |
CA3144697A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | Nektar Therapeutics | Conjugates of an il-2 moiety and a polymer |
-
2011
- 2011-11-11 CA CA3144697A patent/CA3144697A1/en active Pending
- 2011-11-11 EA EA201390697A patent/EA037083B1/ru unknown
- 2011-11-11 ES ES11840401T patent/ES2866674T3/es active Active
- 2011-11-11 MX MX2013005363A patent/MX358399B/es active IP Right Grant
- 2011-11-11 DK DK11840401.1T patent/DK2637694T3/da active
- 2011-11-11 KR KR1020137014805A patent/KR102349549B1/ko active IP Right Grant
- 2011-11-11 JP JP2013538940A patent/JP2014506116A/ja not_active Withdrawn
- 2011-11-11 IL IL295201A patent/IL295201A/en unknown
- 2011-11-11 SI SI201131969T patent/SI2637694T1/sl unknown
- 2011-11-11 CN CN201911003096.6A patent/CN110812488A/zh active Pending
- 2011-11-11 KR KR1020227000398A patent/KR102472497B1/ko active IP Right Grant
- 2011-11-11 WO PCT/US2011/060408 patent/WO2012065086A1/en active Application Filing
- 2011-11-11 US US13/884,901 patent/US9861705B2/en active Active
- 2011-11-11 EP EP21159654.9A patent/EP3895735A1/en not_active Withdrawn
- 2011-11-11 IL IL226267A patent/IL226267B/en unknown
- 2011-11-11 KR KR1020227041345A patent/KR102591732B1/ko active IP Right Grant
- 2011-11-11 EA EA202092025A patent/EA202092025A1/ru unknown
- 2011-11-11 CN CN201180064511.4A patent/CN103517718A/zh active Pending
- 2011-11-11 KR KR1020237035358A patent/KR20230148396A/ko active Application Filing
- 2011-11-11 AU AU2011325990A patent/AU2011325990C1/en active Active
- 2011-11-11 HU HUE11840401A patent/HUE054318T2/hu unknown
- 2011-11-11 CA CA2816722A patent/CA2816722C/en active Active
- 2011-11-11 PL PL11840401T patent/PL2637694T3/pl unknown
- 2011-11-11 PT PT118404011T patent/PT2637694T/pt unknown
- 2011-11-11 LT LTEP11840401.1T patent/LT2637694T/lt unknown
- 2011-11-11 KR KR1020207015862A patent/KR20200070407A/ko not_active Application Discontinuation
- 2011-11-11 EP EP11840401.1A patent/EP2637694B1/en active Active
- 2011-11-11 RS RS20210612A patent/RS61854B1/sr unknown
-
2016
- 2016-09-02 JP JP2016171437A patent/JP2016202187A/ja active Pending
-
2017
- 2017-02-10 AU AU2017200931A patent/AU2017200931A1/en not_active Abandoned
- 2017-12-07 US US15/835,125 patent/US10960079B2/en active Active
-
2018
- 2018-06-01 JP JP2018106375A patent/JP2018154644A/ja not_active Withdrawn
- 2018-09-24 US US16/139,957 patent/US11091525B2/en active Active
- 2018-10-23 AU AU2018253463A patent/AU2018253463A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-02-25 JP JP2020029690A patent/JP7104735B2/ja active Active
- 2020-04-21 AU AU2020202673A patent/AU2020202673A1/en not_active Abandoned
- 2020-08-26 US US17/003,847 patent/US20210023230A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-04-23 HR HRP20210642TT patent/HRP20210642T1/hr unknown
- 2021-07-06 CY CY20211100605T patent/CY1124659T1/el unknown
- 2021-07-12 US US17/373,665 patent/US20210340210A1/en active Pending
- 2021-08-30 AU AU2021225133A patent/AU2021225133A1/en not_active Ceased
- 2021-09-22 JP JP2021154205A patent/JP2022000043A/ja active Pending
-
2022
- 2022-11-11 AU AU2022268401A patent/AU2022268401B2/en active Active
-
2023
- 2023-11-01 JP JP2023187679A patent/JP2024001309A/ja active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4705848A (en) * | 1986-06-02 | 1987-11-10 | International Minerals & Chemical Corp. | Isolation of bioactive, monomeric growth hormone |
US6034072A (en) * | 1997-02-10 | 2000-03-07 | Genemedicine, Inc. | IL-2 gene expression and delivery systems and uses |
US20040136952A1 (en) * | 2002-12-26 | 2004-07-15 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity |
US20050186174A1 (en) * | 2003-12-10 | 2005-08-25 | Bossard Mary J. | Compositions comprising two different populations of polymer-active agent conjugates |
US20090263382A1 (en) * | 2005-06-07 | 2009-10-22 | Esbatech | Stable and soluble antibodies inhibiting tnf alpha |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2022268401B2 (en) | Conjugates of an IL-2 moiety and a polymer | |
EP3139947B1 (en) | Conjugates of il-15 and branched polyethylene glycol | |
AU2016228555B2 (en) | Conjugates of an IL-7 moiety and a polymer | |
WO2013020079A2 (en) | Conjugates of an il-11 moiety and a polymer |