ES2289663T3

ES2289663T3 - Preparacion de aldesleucina para uso farmaceutico.

Info

Publication number: ES2289663T3
Application number: ES05250680T
Authority: ES
Inventors: Maninder C/O Chiron Corporation Hora
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2005-02-07
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2025-02-07
Also published as: PL1688146T3; DE602005001688T2; CY1108521T1; DE602005001688D1; ATE367167T1; PT1688146E; EP1688146A1; SI1688146T1; DK1688146T3; EP1688146B1; HRP20070487T3

Abstract

Un procedimiento para preparar interleucina-2 para uso farmacéutico, que comprende las etapas de: (a) añadir dodecilsulfato de sodio (SDS) a una composición que comprende IL-2 con puentes disulfuro intramoleculares, para dar una concentración final de SDS de al menos 500 mig de SDS por mg de IL-2; (b) eliminar cualquier multímero de IL-2 unido covalentemente precipitado mediante filtración en gel; y (c) reducir la concentración de SDS para eliminar algo pero no todo el SDS de la composición, para dar una composición que contiene entre 95-250 mig de SDS por mg de IL-2.

Description

Preparación de aldesleucina para uso farmacéutico.

Campo técnico

Esta invención está en el campo de la preparación y formulación de interleucina-2 para uso farmacéutico.

Técnica anterior

La interleucina-2 (IL-2) es una citocina que promueve el crecimiento y la diferenciación de células T in vivo y que también potencia la citotoxicidad de las células T CD8+ y los linfocitos citolíticos naturales. Su administración a los pacientes produce múltiples efectos inmunológicos de una manera dependiente de la dosis, incluyendo activación de la inmunidad celular con linfocitosis, eosinofilia y trombocitopenia profundas y la producción de citocinas que incluyen TNF, IL-1 e interferón \gamma. Pueden encontrarse detalles adicionales de la IL-2 en su "GeneCard" bajo el número de acceso GC04M123831.

Se ha aprobado la IL-2 para uso farmacéutico humano en varios países. La marca no registrada internacional recomendadas es ALDESLEUKIN y Chiron Corporation comercializa una formulación con el nombre comercial PROLEUKIN^{TM}. La FDA de los Estados Unidos ha aprobado la IL-2 PROLEUKIN^{TM} para su uso en el tratamiento de adultos con carcinoma de células renales metastásico (RCC (renal cell carcinoma) metastásico) o melanoma metastásico.

Tal como se declara en su información de prescripción para los EE.UU., PROLEUKIN^{TM} existe como microagregados biológicamente activos, no unidos covalentemente con un tamaño promedio de 27 moléculas de IL-2 recombinantes. Se suministra como una torta liofilizada estéril, de blanca a blanquecina en viales de uso único destinados a administración intravenosa (i.v.). Cuando se reconstituyen con 1,2 ml de agua estéril para inyección, cada ml contiene 18 millones de UI (1,1 mg) de IL-2 PROLEUKIN^{TM}, 50 mg de manitol y 0,18 mg de dodecilsulfato de sodio (SDS), tamponado con aproximadamente 0,17 mg de fosfato de sodio monobásico y 0,89 mg de fosfato de sodio dibásico hasta pH 7,5. Sin embargo, el simple mezclado de estos componentes no proporciona la misma forma microagregada de la IL-2 tal como se encuentra en el producto PROLEUKIN^{TM}.

La microagregación de la IL-2 en el producto PROLEUKIN^{TM} es importante para la eficacia in vivo. Las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la IL-2 no agregada (monomérica libre) son muy diferentes de las de la IL-2 microagregada, y las dos formas tienen índices terapéuticos diferentes: los agregados que son demasiado pequeños se eliminan del organismo demasiado rápidamente; los agregados que son demasiado grandes pueden ser insolubles y menos activos. Por tanto, la microagregación es una característica clave del producto PROLEUKIN^{TM}.

El procedimiento mediante el cual se forman los microagregados de PROLEUKIN^{TM} biológicamente activos no han estado disponibles previamente de manera pública, incluso aunque se han descrito varios procedimientos para preparar formulaciones farmacéuticas de IL-2 en la técnica anterior [véanse por ejemplo las referencias 1 a 30]. Por ejemplo, la referencia 4 describe un procedimiento en el que se mezcla IL-2 con un vehículo soluble en agua, y una cantidad suficiente de SDS para garantizar la solubilidad de la IL-2 en agua. La composición está liofilizada. La referencia 9 en particular pretende describir el procedimiento de fabricación de PROLEUKIN^{TM}, incluyendo detalles de la expresión, recuperación, purificación, formulación y finalización, pero esta descripción es incompleta en varios aspectos.

Conocer cómo lograr la misma forma microagregada activa de IL-2 tal como se encuentra en el producto
PROLEUKIN^{TM} sería útil para cualquiera que desee fabricar un producto de IL-2 similar a PROLEUKIN^{TM}. Por tanto, es un objeto de la invención proporcionar un procedimiento para preparar IL-2 en forma microagregada tal como se encuentra en el producto PROLEUKIN^{TM} y también proporcionar tal IL-2 microagregada. Es un objeto adicional de la invención proporcionar un procedimiento para preparar IL-2 para complementar la descripción de la referencia 9.

Descripción de la invención

El procedimiento mediante el cual se prepara el producto PROLEUKIN^{TM} incluye las siguientes etapas clave: (i) purificación de la IL-2 expresada a partir de cultivo celular; (ii) solubilización de IL-2 usando detergente SDS; (iii) reducción de la IL-2 hasta forma monomérica; (iv) purificación, oxidación y precipitación de la IL-2; (v) solubilización de nuevo de la IL-2 usando un nivel alto de detergente SDS; (vi) purificación para eliminar la IL-2 oligomérica; (vii) diafiltración para reducir los niveles de detergente SDS, sin eliminación completa, hasta un intervalo óptimo para obtener una preparación de IL-2 apropiadamente microagregada; (viii) formulación con manitol y tampón; y (ix) liofilización y envasado.

Las etapas (i), (iv), (vi), (viii) y (ix) de este procedimiento se describen en la referencia 9, pero las etapas (ii), (iii), (v) y (vii) no, aunque se describe el uso de un detergente no especificado para volver a solubilizar la IL-2 antes de la etapa (vi). Además, la referencia 9 sugiere que se añade SDS a la IL-2 tras la purificación en la etapa (vi), cuando se elimina de hecho.

De las nueve etapas, las más críticas mediante las cuales se forman los microagregados son la (v) y la (vii). Ninguna de las etapas posteriores (viii) o (ix) tiene ningún efecto significativo sobre la microagregación, y los procedimientos de purificación en las etapas (i), (ii), (iii), (iv) y (vi) tienen poco efecto. Sin embargo, una vez que se añade SDS en la etapa (v), se solubiliza la IL-2, y es la reducción posterior de los niveles de SDS en la etapa (vii) la que provoca la formación de los microagregados presentes en el producto PROLEUKIN^{TM} final. Debe añadirse suficiente SDS para volver a solubilizar la IL-2 precipitada en una forma soluble sustancialmente monomérica, y entonces debe eliminarse (pero no completamente) para dar los microagregados deseados.

Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para preparar interleucina-2 para uso farmacéutico, que comprende las etapas de: (a) añadir dodecilsulfato de sodio (SDS) a una composición que comprende interleucina-2, para dar una concentración final de SDS de al menos 500 \mug de SDS por mg de IL-2; (b) eliminar algo pero no todo el SDS de la composición, para dar una composición que contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de interleucina-2. Este procedimiento de adición de SDS y después eliminación parcial produce condiciones óptimas para la interacción estrecha de las moléculas de SDS e IL-2 para formar microagregados de IL-2 y SDS tal como se encuentra en el producto PROLEUKIN^{TM} y, para una proporción de IL-2/SDS dada, produce un producto diferente al obtenido mediante el mezclado sencillo de SDS e IL-2.

La composición acuosa que surge del procedimiento puede liofilizarse para su distribución, y el material liofilizado puede reconstituirse finalmente con un vehículo acuoso para su administración a los pacientes. Tras la reconstitución, la composición tiene preferiblemente una turbidez específica (\tau) inferior a 1,1 cm^{2}/g y/o contiene agregados de SDS/IL-2 con un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm. Por tanto, el procedimiento puede comprender además las etapas de liofilizar la composición y después, opcionalmente, reconstituir la composición con un medio acuoso. La composición también puede tener estas características hidrodinámicas y/o de \tau antes de la etapa de liofilización.

La invención proporciona una composición que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecilsulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que los agregados pueden obtenerse mediante los procedimientos de la invención. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico, tal como se muestra por el producto PROLEUKIN^{TM}.

La invención también proporciona una composición que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecilsulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que la composición tiene un turbidez específica (\tau) inferior a 1,1 cm^{2}/g. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico, tal como se muestra por el producto PROLEUKIN^{TM}.

La invención también proporciona una composición que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecilsulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que los agregados tienen un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico, tal como se muestra por el producto PROLEUKIN^{TM}.

La invención también proporciona una composición que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecilsulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que el número promedio de moléculas de interleucina-2 por agregado está entre 10 y 50. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico, tal como se muestra por el producto PROLEUKIN^{TM}.

La invención proporciona una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio, en la que la composición puede reconstituirse para dar una disolución acuosa en la que la interleucina-2 y el dodecilsulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y que tiene una turbidez específica (\tau) inferior a 1,1 cm^{2}/g. En lugar de, o así como, considerar \tau, los agregados pueden tener un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 y 20 nm. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico, tal como se muestra por el producto PROLEUKIN^{TM}.

La invención proporciona un procedimiento para preparar una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio, en el que: (i) la composición liofilizada puede reconstituirse para dar una composición acuosa en la que la interleucina-2 y el dodecilsulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y que tiene una turbidez específica (\tau) inferior a 1,1 cm^{2}/g; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) añadir dodecilsulfato de sodio a una composición que comprende interleucina-2, en la que se añade dodecilsulfato de sodio suficiente para dar interleucina-2 solubilizada monomérica, (b) reducir la concentración de dodecilsulfato de sodio hasta un nivel en el que la interleucina-2 forma agregados con el dodecilsulfato de sodio, y (c) liofilizar la composición.

La invención proporciona un procedimiento para preparar una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio, en el que: (i) la composición liofilizada puede reconstituirse para dar una composición acuosa en la que la interleucina-2 y el dodecilsulfato de sodio están presentes en forma de agregados con un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) añadir dodecilsulfato de sodio a una composición que comprende interleucina-2, en la que se añade dodecilsulfato de sodio suficiente para dar interleucina-2 solubilizada monomérica, (b) reducir la concentración de dodecilsulfato de sodio hasta un nivel en el que la interleucina-2 forma agregados con el dodecilsulfato de sodio y (c) liofilizar la composición.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio, en el que: (i) la composición liofilizada puede reconstituirse para dar una composición acuosa en la que la interleucina-2 y el dodecilsulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y que tiene una turbidez específica (\tau) inferior a 1,1 cm^{2}/g; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) mezclar dodecilsulfato de sodio e interleucina-2 para dar una mezcla en la que está presente dodecilsulfato de sodio a una primera concentración, (b) eliminar dodecilsulfato de sodio de la mezcla para reducir su concentración hasta una segunda concentración y (c) liofilizar la composición, proporcionando de ese modo dicha composición. La segunda concentración es inferior a la primera concentración. La primera concentración será generalmente de al menos 500 \mug de SDS por mg de IL-2 en la mezcla, y la segunda concentración estará generalmente entre 95-250 \mug de SDS por mg de IL-2.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio, en el que: (i) la composición liofilizada puede reconstituirse para dar una composición acuosa en la que la interleucina-2 y el dodecilsulfato de sodio están presentes en forma de agregados con un diámetro hidrodinámico intermedio de entre 8 nm y 20 nm; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) mezclar dodecilsulfato de sodio y interleucina-2 para dar una mezcla en la que está presente dodecilsulfato de sodio a una primera concentración, (b) eliminar dodecilsulfato de sodio de la mezcla para reducir su concentración hasta una segunda concentración, y (c) liofilizar la composición, proporcionando de ese modo dicha composición. La segunda concentración es inferior a la primera concentración. La primera concentración será generalmente al menos de 500 \mug de SDS por mg de IL-2 en la mezcla y la segunda concentración estará generalmente entre 95-250 \mug de SDS por mg de IL-2.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio (SDS), en el que: (i) la composición liofilizada puede reconstituirse para dar una composición acuosa en la que la interleucina-2 y el SDS están presentes en forma de agregados, y que tiene una turbidez específica (\tau) inferior a 1,1 cm^{2}/g, y en el que la concentración de SDS es "x" \mug de SDS por mg de IL-2, en la que x está entre 95 y 250; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) mezclar SDS e interleucina-2 para dar una mezcla en la que la concentración de SDS es al menos 4 veces superior a "x", (b) eliminar algo pero no todo el SDS de la mezcla, para dar una composición en la que la concentración de SDS es "x" y (c) liofilizar la composición. La concentración es preferiblemente al menos 5 veces superior a "x", más preferiblemente al menos 8 veces superior, 10 veces superior, 15 veces superior o incluso 20 veces superior.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio (SDS), en el que: (i) la interleucina-2 y el SDS en la composición están presentes en forma de agregados, en la que los agregados tiene un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm, y en la que la concentración de SDS es de "x" \mug de SDS por mg de la IL-2, estando x entre 95 y 250; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) mezclar SDS e interleucina-2 para dar una mezcla en la que la concentración de SDS es al menos 4 veces superior a "x", (b) eliminar algo pero no todo el SDS de la mezcla, para dar una composición en la que la concentración de SDS es "x" y (c) liofilizar la composición. La concentración es preferiblemente al menos 5 veces superior a "x", más preferiblemente al menos 8 veces superior, 10 veces superior, 15 veces superior o incluso 20 veces superior.

Cuando un procedimiento de la invención implica reducir la concentración de SDS hasta dentro del intervalo de 95-250 \mug de SDS por mg de IL-2, es posible en algunas realizaciones reducir la concentración hasta menos de 95 \mug/mg (por ejemplo, hasta entre 50 y 95 \mug/mg) y entonces aumentar de nuevo la concentración para que esté dentro del intervalo de 95-250 \mug/mg. Este aumento hasta dentro del intervalo de 95-250 \mug/mg puede tener lugar de manera conveniente durante la reconstitución del material liofilizado, por ejemplo el procedimiento puede implicar la eliminación de SDS hasta <95 \mug/mg, seguido de liofilización, seguido de reconstitución con una disolución de SDS acuosa de modo que la concentración de SDS se encuentre dentro del intervalo de 95-250 \mug/mg.

El detergente

Los procedimientos de la invención implican el uso de dodecilsulfato de sodio (SDS), que se conoce también como laurilsulfato de sodio. La fórmula de este detergente aniónico es CH_{3}(CH_{2})_{11}OSO_{3}^{-}Na^{+}, y tiene el número CAS 151-21-3 y el número EC 205-788-1.

El SDS es un reactivo convencional usado para solubilizar proteínas y si está presente IL-2 en forma precipitada antes de que se añada el SDS, se usa entonces para este fin en la etapa (a) del procedimiento de la invención. Comenzando con una composición que comprende IL-2 precipitada, se añadirá suficiente SDS para garantizar que sustancialmente toda la IL-2 precipitada se solubiliza (excepto para cualquier multímero de IL-2 unido covalentemente en el precipitado, que se mantendrá predominantemente precipitado incluso en presencia de SDS). La microagregación de IL-2 está sustancialmente ausente a una concentración de 1 mg/ml cuando está presente SDS a más de aproximadamente 500 \mug/mg, y así es típico añadir SDS para dar una concentración final de SDS de al menos 500 \mug de SDS por mg de IL-2 (por ejemplo al menos 550, al menos 600, al menos 700, al menos 800, al menos 900, al menos 1000, al menos 1200, al menos 1400, al menos 1600, al menos 1800 o al menos 2000 \mug de SDS por mg de IL-2). Se prefiere usar aproximadamente 910 \mug de SDS por mg de IL-2.

La concentración de partida del SDS en una muestra generalmente será conocida, porque el SDS no está presente de manera natural en las células y la cantidad de SDS que se añadió durante el procesamiento del material derivado de células se habrá controlado. Sin embargo, en el caso de que no se conozca la concentración de SDS, puede medirse usando técnicas de ensayo convencionales, realizadas sobre el material como un todo o bien sobre una muestra del material. Por ejemplo: la referencia 31 describe un procedimiento de electroforesis de capilaridad para la separación y determinación de tensioactivos, incluyendo SDS; la referencia 32 describe un procedimiento de gota única para la determinación del ion dodecilsulfato en el intervalo de 0,2-100 \muM usando un cristal de cuarzo piezoeléctrico sin electrodo; la referencia 33 compara tres procedimientos para la determinación conveniente de SDS en disoluciones acuosas, concretamente valoración mediante bromuro de cetiltrimetilamonio usando un electrodo selectivo de ion o bien turbidez para medir el punto final, o medición de la turbidez en presencia de bromuro de miristiltrimetilamonio; la referencia 34 describe un procedimiento para la determinación del SDS, basado en su interacción con colorantes fluorescentes tales como bromuro de etidio; etc. El procedimiento de ensayo preferido para medir los niveles de SDS es un ensayo espectrofotométrico basado en la reacción con naranja de acridina, tal como se describe en más detalle en los ejemplos y en la referencia 35.

Como una alternativa para medir el contenido en SDS en relación con la masa de IL-2, puede medirse en relación con la actividad de la IL-2. Basándose en una actividad de IL-2 de 18 x 10^{6} UI en 1,1 mg de IL-2 (tal como se encuentra en PROLEUKIN^{TM}), 100 \mug de SDS por mg de IL-2 es equivalente a 6,111 \mug de SDS por MUI de IL-2.

En lugar de usar SDS en los productos y procedimientos de la invención, también es posible usar laurethsulfato de sodio (SLS) o laurilsulfato de amonio (ALS). También pueden usarse mezclas de SLS, ALS y/o SDS. Sin embargo, en realizaciones preferidas de la invención se usa SDS.

Eliminación del detergente

Después de que se haya añadido SDS a la composición de IL-2, el procedimiento de la invención implica la eliminación de algo (pero no todo) del SDS, proporcionando de ese modo una forma microagregada de IL-2 y SDS.

Puede eliminarse el SDS por diversas técnicas. La cromatografía de intercambio iónico puede eliminar SDS cargado negativamente, y también puede usarse filtración en gel. Sin embargo, lo más preferiblemente, el SDS se elimina por diafiltración. En la diafiltración, se sustituyen el disolvente y/o microsolutos (por ejemplo sales) por un disolvente y/o microsolutos diferentes. En general, la eliminación y sustitución se produce a la misma velocidad y por tanto el volumen de la disolución puede mantenerse sustancialmente constante, y así el efecto global es la sustitución de los disolventes/microsolutos originales por disolventes/microsolutos nuevos.

La diafiltración frente a un tampón libre de SDS es la forma preferida de eliminación del SDS, por ejemplo frente a un tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7,5.

La eliminación del SDS continúa hasta que la composición contiene entre 95 \mug y 250 \mug de SDS por cada mg de interleucina-2, por ejemplo entre 118-210 \mug/mg, entre 135-180 \mug/mg o aproximadamente 160 \mug/mg. Las propiedades farmacocinéticas de la IL-2 son sustancialmente constantes durante este intervalo, y el nivel de SDS no es tan alto como para dar lugar a problemas de toxicidad. Sin embargo, a medida que la concentración de SDS cae por debajo de aproximadamente 95 \mug/mg, el tamaño de los microagregados se eleva bruscamente (figura 1), elevándose desde un promedio de \sim60 moléculas de IL-2 por agregado a 95 \mug/mg hasta un promedio de \sim180 a 75 \mug/mg.

La adición y luego la eliminación incompleta del SDS dan como resultado los microagregados de IL-2 biológicamente activos que se encuentran en el producto PROLEUKIN^{TM}. El simple mezclado del SDS y la IL-2 a las concentraciones encontradas en el producto PROLEUKIN^{TM} no da los microagregados. La referencia 36 describe un estudio en el que se añadió SDS a preparaciones de IL-2 que contienen, tal como el producto PROLEUKIN^{TM}, 1,1 mg de IL-2. Se encontró que el SDS precipita la IL-2 a concentraciones de detergente de entre el 0,02%-0,05%. En cambio, la IL-2 no precipita a estas concentraciones de SDS durante la eliminación del SDS según la invención (incluso cuando el SDS desciende desde 1200 \mug/ml (aproximadamente SDS al 0,1% basado en 1,1 mg de IL-2) hasta 70 \mug (<0,01%), no se observa precipitación de la IL-2).

Durante su eliminación, puede determinarse la concentración de SDS tal como se describió anteriormente. Cuando el procedimiento de eliminación está estandarizado y es reproducible, entonces puede no ser necesario controlar los niveles de SDS durante la eliminación del SDS, puesto que puede esperarse generalmente el mismo resultado cada vez que se realice el procedimiento (aunque puedan realizarse mediciones finales de confirmación). Sin embargo, cuando un procedimiento de eliminación es variable, o cuando se requiera un control regular por otras razones, pueden realizarse mediciones continuas o regulares de los niveles de SDS hasta que se alcance la concentración final deseada.

Etapas adicionales del procedimiento

Tal como se mencionó anteriormente, las etapas claves del procedimiento para la formación de microagregados de IL-2/SDS son (a) la adición y después (b) la eliminación posterior del SDS. Aunque estas dos etapas dan una IL-2 en una forma adecuada para su uso como un principio activo en un producto farmacéutico, ellas solas no son adecuadas para preparar una composición farmacéutica final, y se requieres otras etapas. Estas etapas pueden producirse antes de las etapas (a) y (b), tras las etapas (a) y (b), y/o entre las etapas (a) y (b).

La primera etapa en un procedimiento para preparar IL-2 para uso farmacéutico será generalmente la expresión de la proteína. Esto implicará generalmente el uso de una célula huésped que contiene un gen que codifica la IL-2 de interés, tal como una célula huésped bacteriana, una célula huésped de levadura o una célula huésped de mamíferos. Sin embargo, como alternativa a la vía recombinante, también es posible activar o regular por incremento la expresión de un gen de IL-2 endógeno en un genoma de la célula huésped (por ejemplo mediante activación del promotor), o purificar la hormona a partir de una fuente natural (por ejemplo, a partir de la sangre).

La expresión de IL-2 en una célula de E. coli recombinante es una vía preferida para obtener IL-2, formando la IL-2 cuerpos de inclusión. Se depositaron células de E. coli adecuadas según las disposiciones del tratado de Budapest en la ATCC en 1984 con los número de acceso 39452 y 39626.

Se conocen en la técnica procedimientos para hacer crecer, recoger, romper o extraer IL-2 de diversos tipos de células, véanse por ejemplo las referencias 19-30 y 37-41.

Tras la expresión, o cuando se empieza con el material expresado, se usará una etapa inicial de purificación de la IL-2. Si la IL-2 está presente dentro de las células, entonces la etapa de purificación implicará la ruptura de la célula (por ejemplo por choque osmótico, homogenización, sonicación, etc.) con el fin de liberar la proteína; si la IL-2 está ya presente en disolución (por ejemplo se secretó tras la expresión), entonces no se refiere la ruptura. También puede realizarse la inactivación de células vivientes, así como centrifugación. Al final de la etapa de purificación inicial, la IL-2 estará normalmente en forma precipitada, particularmente si se purifica a partir de cuerpos de inclusión, pero se habrá separado de los restos celulares para dar una pasta rica en IL-2 para el tratamiento posterior.

Tras la preparación de IL-2 purificada precipitada, o cuando se comienza con el material de partida, la IL-2 puede solubilizarse con el fin de separarla de otras proteínas del huésped, etc. Puede lograrse la solubilización añadiendo un detergente tal como SDS, preferiblemente para dar una concentración final de entre el 4% y el 4,5%. Esto puede lograrse de manera conveniente añadiendo una disolución de SDS al 5%.

Tras la solubilización, o cuando se comienza con el material solubilizado, puede reducirse la IL-2, con el fin de romper cualquier puente disulfuro en la proteína, y en particular para romper cualquier puente disulfuro intermolecular. Cualquier agregado de IL-2 covalente formado por puentes disulfuro intermoleculares se convierten por tanto en forma monomérica. Los agentes reductores usados comúnmente para reducir puentes disulfuro incluyen \beta-mercaptoetanol y ditiotreitol (DTT). Se mantendrá generalmente la presencia del detergente con el fin de garantizar la solubilidad de la IL-2.

Tras la reducción, o cuando se comienza con el material reducido, la IL-2 puede entonces reoxidarse para dar IL-2 monomérica con puentes disulfuro intramoleculares.

Tras la reoxidación, o cuando se comienza con el material reoxidado, la IL-2 puede purificarse entonces adicionalmente con el fin de eliminar reactivos tales como el agente oxidante, para eliminar endotoxinas, para eliminar ADN y/o proteínas de la célula huésped, para eliminar isoformas o confórmeros de la IL-2 (por ejemplo, formas oxidadas de la IL-2), etc. Esta purificación puede lograrse de manera conveniente usando HPLC en fase inversa.

Tras la purificación por RP-HPLC, o cuando se comienza con el material purificado por RP-HPLC, puede precipitarse la IL-2 por ejemplo añadiendo hidróxido de sodio 0,8 N. Así como la precipitación de la IL-2, esto permite a la proteína separarse de cualquier disolvente orgánico usado durante la RP-HPLC. El material precipitado puede recogerse de manera conveniente por centrifugación.

El material obtenido tras la expresión, purificación, solubilización, reducción, oxidación, RP-HPLC y precipitación (tal como se describió anteriormente) es ideal para solubilizar de nuevo y la diafiltración según el procedimiento de la invención, aunque también puede usarse IL-2 preparada mediante otras vías de purificación. Sin embargo, normalmente, la IL-2 estará en forma precipitada antes de que se añada SDS en la etapa (a) del procedimiento de la invención.

Tal como se mencionó anteriormente, los multímeros de IL-2 unidos covalentemente se mantienen precipitados incluso en presencia de SDS. Dado que estos multímeros son mucho más grandes que las proteínas de IL-2 solubilizadas mediante SDS (porque son no disociables), pueden eliminarse de manera conveniente entre las etapas (a) y (b) (es decir, tras la adición de SDS pero antes de la diafiltración) mediante filtración en gel. La presencia de SDS debe mantenerse durante toda la filtración en gel con el fin de impedir la precipitación de la IL-2.

Tras la diafiltración para eliminar el SDS y formar microagregados, puede someterse una disolución de IL-2 a una o más de las siguientes etapas: dilución hasta dar una dosis final deseada; esterilización, normalmente mediante filtración estéril por ejemplo a través de un filtro de 0,22 \mum; formulación farmacéutica (véase más adelante); liofilización; envasado; etc.

Microagregados

El resultado de la solubilización mediante SDS y diafiltración mediante el procedimiento de la invención es la formación de microagregados biológicamente activos de SDS e IL-2, tal como se observa en el producto PROLEUKIN^{TM}.

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No se ha determinado la estructura molecular exacta de los microagregados de SDS/IL-2, pero se cree que son estructuras micelares o de tipo micelar. A una concentración de SDS de \sim160 \mug/mg, una micela típica contiene \sim30 moléculas de IL-2 y \sim150 moléculas de SDS. El SDS y la IL-2 en los microagregados interactúan de manera no covalente, y la cola hidrófoba de la IL-2 (residuos 121-133) puede interactuar con la estructura principal de alquilo del SDS para formar las micelas. Puede mantenerse libre algo de SDS en disolución.

Los microagregados pueden detectarse mediante dispersión de luz, y esta técnica también permite medir su tamaño (véase más adelante). La relación entre la concentración de SDS y el tamaño promedio del microagregado, tal como se
mide mediante dispersión de luz clásica, se ha sometido a ensayo empíricamente, tal como se muestra en la figura 1.

A medida que avanza la eliminación del SDS, se alcanza una concentración por debajo de la cual el tamaño de los agregados comienza a aumentar exponencialmente (véase la figura 1). Según la invención, se elimina SDS hasta que su concentración está entre 95 \mug y 250 \mug por mg de IL-2. En este intervalo, la turbidez específica (\tau) está entre \sim0,05 cm^{2}/g y \sim1,00 cm^{2}/g, lo que implica un promedio de menos de 50 moléculas de IL-2 por agregado. A 160 \mug de SDS por mg de IL-2, la turbidez específica (\tau) es de aproximadamente 0,48 (aproximadamente 27 moléculas de IL-2).

El experto entenderá que una composición dada de SDS/IL-2 según la invención contendrá en pocas ocasiones, si acaso, una única especie de microagregado. En su lugar, las mediciones de dispersión de luz revelan que los microagregados tienen una variedad de tamaños que se encuentran dentro de una distribución, y las mediciones pueden revelar un tamaño medio. Por tanto, cuando una composición comprende microagregados con un tamaño promedio establecido, habrá generalmente algunos microagregados más pequeños y algunos microagregados más grandes.

Las composiciones preferidas de la invención incluyen microagregados de SDS/IL-2 de modo que la composición tiene una turbidez específica (\tau) de entre 0,3 y 0,6, por ejemplo entre 0,4 y 0,5, o aproximadamente 0,45. Estas composiciones se aplican en particular a composiciones que se han reconstituido tras la liofilización, y el valor de \tau puede ser inferior antes de la liofilización y reconstitución (figura 14).

Las composiciones preferidas de la invención incluyen microagregados de SDS/IL-2 con un diámetro hidrodinámico entre 11 nm y 13 nm.

Los microagregados preferidos de la invención contienen entre 10 y 50 moléculas de IL-2, por ejemplo entre 20 y 35, y preferiblemente de manera aproximada 27.

En las composiciones preferidas, sustancialmente toda la IL-2 está presente en forma de microagregados. Las composiciones pueden estar sustancialmente libres de IL-2 monomérica.

Turbidez específica (\tau)

Debido a que los microagregados de SDS/IL-2 de la invención están afectados por las condiciones prevalentes, no pueden usarse técnicas tales como cromatografía de exclusión por tamaño y centrifugación analítica para evaluar su tamaño. En su lugar, puede usarse dispersión de luz clásica (o estática) (CLS) para detectar y analizar los microagregados midiendo su turbidez. También puede usarse dispersión de luz dinámica (DLS). Las mediciones pueden realizarse con instrumentación específica, o pueden realizarse en un fluorímetro con monocrómetros de excitación y emisión ajustados a la misma longitud de onda (por ejemplo 467 nm a partir de una lámpara de xenón, o 488 nm a partir de una lámpara de argón, estando ambas alejadas de las longitudes de onda que son absorbidas por el analito) y/o usando filtros adecuados (por ejemplo, filtros amarillos), de modo que el fluorímetro actúa como un fotómetro de CLS a 90º.

Cuando se mide la dispersión de luz, un parámetro espectroscópico convencional es la "proporción Rayleigh" (R_{\Theta}). Cuando se mide la luz dispersada a 90º en relación con la luz incidente (es decir, cuando \Theta = 90º), la proporción Rayleigh se conoce como R_{90} [véase por ejemplo la referencia 42], y se usa la dispersión a 90º para las mediciones de turbidez.

Las mediciones de turbidez (intensidad dispersada a 90º) pueden normalizarse en relación con el tolueno de calidad óptica, es decir, la medición de turbidez para una muestra patrón de tolueno se divide por el R_{90} del tolueno. Normalizando de esta forma, puede determinarse entonces el valor absoluto de la intensidad de luz dispersada.

Para los microagregados de IL-2 de la invención, puede medirse la turbidez a 467 nm o 488 nm, 25ºC. Antes de evaluar la turbidez, pueden centrifugarse o filtrarse las composiciones para eliminar partículas grandes (por ejemplo, proteína precipitada) que de otra forma distorsionaría los datos. Cuando se centrifugan, las composiciones de IL-2 de la invención conservan preferiblemente al menos el 97% (por ejemplo \geq98%, \geq99% o más) de la IL-2 total en el sobrenadante.

Las mediciones de turbidez para las mezclas de SDS/IL-2 pueden convertirse en valores de turbidez específica absoluta (\tau) tal como sigue:

\tau = \frac{T_{t} - 0,98T_{i}}{T_{i}} \times \frac{3,2 \times 10^{-2}}{C}

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en la que:

T_{i} es la intensidad de turbidez de la composición de IL-2

T_{t} es la intensidad de turbidez de un control de tolueno,

C es la concentración de la IL-2 en la composición de IL-2.

Cuando T_{i} o T_{t} se miden en cm^{-1} y C se mide en g/ml (es decir, g/cm^{3}), entonces las unidades de \tau son cm^{2}/g. Esta es la medida preferida para evaluar la turbidez de las composiciones de IL-2 de la invención.

Las composiciones de la invención pueden tener una turbidez específica (\tau) inferior a 1,1 cm^{2}/g, pero preferiblemente superior a 0,1 cm^{2}/g. Las composiciones preferidas tienen una \tau inferior a 0,7 cm^{2}/g. Las composiciones de la invención tienen preferiblemente una \tau en el intervalo de 0,3-0,6 cm^{2}/g.

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Dispersión de luz dinámica

Tal como se describe en la referencia 43, en particular en el capítulo 10, puede usarse la dispersión de luz dinámica (DLS) para determinar el diámetro hidrodinámico (o radio) de las partículas dentro de una disolución. Los agregados de SDS/IL-2 de la invención pueden detectarse mediante dispersión de luz dinámica (DLS). Usando DLS, los agregados preferidos tienen un diámetro hidrodinámico medio numérico de entre 8 nm y 20 nm, preferiblemente entre 10 nm y 15 nm, más preferiblemente entre 11 nm y 13 nm y lo más preferiblemente aproximadamente 12 nm. Tal como se muestra en la figura 17, los agregados tendrán diámetros distribuidos alrededor de esta media.

En la práctica, pueden detectarse algunas partículas más grandes mediante DLS (por ejemplo el pico de 54 nm en la figura 17), pero el diámetro hidrodinámico citado anteriormente es el del pico de DLS principal, que representará normalmente al menos el 90% en número (por ejemplo al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 99%, al menos el 99,5% o más) en el espectro de DLS. Por tanto, al menos el 90% en número de las partículas detectadas mediante DLS tendrán la media numérica específica.

La interpretación de los datos de DLS puede ser complicada por la presencia de componentes que varían lentamente, tales como partículas de polvo o fenómenos de mezcla. Para evitar estas complicaciones, las composiciones de IL-2 de la invención para la medición por DLS están preferiblemente libres de partículas con un diámetro mayor de aproximadamente 1 \mum (por ejemplo, libres de polvo), y esto puede lograrse mediante el uso de filtros adecuados, por ejemplo filtros de 0,22 \mum. Las composiciones también deben mezclarse bien antes de la medición por DLS. Si la medición por DLS revela un componente que varía lentamente en la composición, los resultados deben rechazarse y la medición debe repetirse sobre una nueva muestra.

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La interleucina-2

La IL-2 es una proteína bien conocida, y los procedimientos y productos de la invención pueden usar cualquier forma adecuada de IL-2. La IL-2 será normalmente IL-2 humana, o será un derivado de IL-2 que conserve la actividad biológica en seres humanos.

La IL-2 se traduce de manera natural en seres humanos como una proteína precursora (por ejemplo el 153-mero en GenBank con el número de registro NP_000577.2). El precursor se rompe (por ejemplo tras la Ser-20 en NP_000577.2) para dar un producto maduro con una alanina N-terminal (SEQ ID NO: 4).

Cuando se expresa en E.coli, es normal sustituir el péptido señal natural por un residuo de metionina N-terminal único (por ejemplo SEQ ID NOS: 3 y 4). Cuando se expresa, esta metionina se rompe sin intervención, dejando el residuo N-terminal humano natural de alanina (por ejemplo SEQ ID NO: 3 se convierte en SEQ ID NO: 1).

La IL-2 en PROLEUKIN^{TM} carece del residuo de Ala-1 natural. La ausencia de la alanina N-terminal normal significa que la IL-2 en PROLEUKIN^{TM} se denomina formalmente forma "des-alanil-1". Las formas des-alanil-1 de la IL-2 se prefieren para su uso con la invención.

La IL-2 en PROLEUKIN^{TM} se diseña también para que tenga dos residuos de cisteína internos, en lugar de los tres naturales. Esto reduce el número de posibles apareamientos de los residuos de cisteína (y por tanto los puentes disulfuro intramoleculares) de tres a uno [46], y mejora el resultado del replegamiento de la proteína y la estabilidad de almacenamiento. La sustitución del residuo de Cys-125 natural por un residuo de serina [44] significa que la IL-2 en PROLEUKIN^{TM} se denomina formalmente una forma de "serina-125" de la IL-2. La formas de serina 125 de la IL-2 se prefieren para su uso con la invención. La estructura cristalina tridimensional de una forma de ser-125 de la IL-2 humana expresada en E. coli está disponible en las bases de datos de estructura con el número de registro
"3INK".

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Pueden realizarse otras sustituciones dentro de una secuencia de aminoácidos de la IL-2, particularmente aquellas en las que la sustitución es conservativa, es decir, aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos pueden dividirse en cuatro familias: (1) ácidos (aspartato, glutamato); (2) básicos (lisina, arginina, histidina); (3) no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; (4) polares no cargados (glicina, asparragina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, triptófano y tirosina se clasifican algunas veces como la familia de aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que una sustitución aislada de leucina por isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. El experto puede determinar fácilmente las regiones de la IL-2 que pueden tolerar cambios, basándose en la variación natural, alineamientos de formas activas de proteínas, etc., y pueden someterse a prueba las proteínas sustituidas para determinar la actividad biológica, por ejemplo mediante 86/504 convencional.

También puede encontrarse en la técnica orientación sobre las regiones de la proteína IL-2 que pueden alterarse mediante sustituciones, deleciones o inserciones de residuos (por ejemplo, relaciones de estructura/función y/o estudios de unión), tales como las referencias 45 a 52, etc. La referencia 53 describe una variedad de mutantes de IL-2, incluyendo: Asn-26-Gln; Trp-121-Phe; deleción de todos los residuos tras la Arg-120; y formas de Met-1 de las mismas. La referencia 44 describe IL-2 con deleción o sustitución de la Cys-125, con o sin Ala N-terminal. La referencia 54 describe la sustitución o deleción de residuos que incluyen los 2, 3, 4, 5, 6, 104 y 125. Met-104 es propensa a la oxidación, de modo que la mutación de este residuo (por ejemplo, sustitución por Glu, Val, Ala, etc) puede mejorar la estabilidad [55]. La referencia 56 describe sustituciones de IL-20 en Asp-20 (por His o Ile), en Asn-88 (por Arg, Gly o Ile) y/o en Gln126 (por Leu o Glu), que según se informa tienen toxicidad reducida y selectividad por receptores de IL-2 de alta afinidad. La referencia 57 describe sustituciones de Arg28-Ala y Phe-42-Lys con el fin de reducir la toxicidad para su uso en inmunoterapia. La referencia 58 describe la mutación de una secuencia tripeptídica Xaa^{1}-Asp-Xaa^{2} nativa, en la que Xaa^{1} es Leu, Ile, Gly o Val y Xaa^{2} es Val, Leu o Ser, con el fin de reducir la extravasación vascular. La referencia 59 describe péptidos con una metionina N-terminal fusionada con los primeros 30 residuos de la IL-2, opcionalmente con una sustitución de Asp-20-Lys, que se dice que conserva una actividad similar a la
IL-2.

Otras sustituciones conocidas incluyen: T7A, T7D, T7R, KSL, K9A, K9D, K9R, K9S, K9V, K9W, T10K, T10N, Q11A,Q11R, Q11T, E15A, H16D, H16E, L19D, L19E, D20E, I24L, K32A, K32W, N33E, P34E, P34R, P34S, P34T, P34V,K35D, K351, K35L, K35M, K35N, K35P, K35Q, K35T, L36A, L36D, L36E, L36F, L36G, L36H, L361, L36K, L36M, L36N,L36P, L36R, L36S, L36W, L36Y, R38D, R38G, R38N, R38P, R38S, L40D, L40G, L40N, L40S, T41E, T41G, F42A,F42E, F42R, F42T, F42V, K43H, F44K, M461, E61K, E61M, E61R, E62T, E62Y, K64D, K64E, K64G, K64L, K64Q,K64R, P65D, P65E, P65F, P65G, P65H, P651, P65K, P65L, P65N, P65Q, P65R, P65S, P65T, P65V, P65W, P65Y,L66A, L66F, E67A, L72G, L72N, L72T, F78S, F78W, H79F, H79M, H79N, H79P, H79Q, H79S, H79V, L80E, L80F,L80G, L80K, L80N, L80R, L80T, L80V, L80W, L80Y, R81E, R81K, R81L, R81M, R81N, R81P, R81T, D84R, S87T,N88D, N88H, N88T, V91A, V91D, V91E, V91F, V91G, V91N, V91Q, V91W, L94A, L94I, L94T, L94V, L94Y, E95D,E95G, E95M, T102S, T102V, M104G, E106K, Y107H, Y107K, Y107L, Y107Q, Y107R, Y107T, E116G, N119Q, T123S, T123C, Q126I, y Q126V.

Las variantes biológicamente activas de la IL-2 tendrán generalmente al menos aproximadamente el 70%, (por ejemplo \geq80%, \geq90%, \geq95%, \geq98%, \geq99%) de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la molécula polipeptídica de IL-2 de referencia, tal como la IL-2 humana tratada anteriormente. Una variante puede diferir, por ejemplo, en solo de 1 a 15 residuos de aminoácidos, en sólo de 1 a 10 residuos de aminoácidos, tal como 6-10, en sólo 5, en sólo 4, 3, 2 o incluso en sólo 1 residuo de aminoácidos.

Se ha notificado la extensión C-terminal de IL-2 [60]. La IL-2 usada con la invención preferiblemente no tiene ninguna extensión C-terminal de este tipo.

Otras formas de IL-2 que pueden usarse incluyen secuencias no humanas. Por ejemplo, la IL-2 puede ser de: mono rhesus (Macaca mulatta; acceso GenBank P51498); papión oliva (Papio anubis; GenBank Q865Y1); mono mangabey (Cercocebus torquatus atys; P46649); macaco cangrejero (Macaca fascicularis; Q29615); gibón común (Hylobates lar; ICGI2); mono ardilla común (Saimiri sciureus; Q8MKH2); vaca (Bos taurus; P05016 o NP-851340; secuencia madura representada por los residuos 24-158 de número de acceso GenBank NP-851340); búfalo de agua (Bubalus bubalis; Q95KP3); caballo (Equus caballus; P37997); cabra (Capra hircus; P36835); oveja (Ovis aries; P19114); cerdo (Sus scrofu; P26891); ciervo rojo (Cervus elaphus; P51747); perro (Canis familiaris; Q29416); gato (Felis catus; 407885); conejo (Oryctolagus cuniculus; 077620); orca (Orcinus orca; 097513); elefante marino del norte (Mirounga angustirostris; 062641); ratón doméstico (Mus musculus; NP-032392); ratón moruno (Mus spretus; 408867); rata común (Rattus norvegicus; P17108); jerbo de Mongolia (Meriones unguiculatus; Q08081). También puede usarse cualquiera de las formas variantes dadas a conocer en estas entradas de GenBank. Estas entradas de GenBank generalmente dan a conocer las secuencias precursoras que, tal como se describió anteriormente para la secuencia humana, se tratan para dar una forma biológicamente activa final por ejemplo mediante la rotura de los primeros 20 aminoácido.

Las formas des-alanil-1, serina-125 de la IL-2 humana se prefieren particularmente para su uso con la invención. La forma más preferida de IL-2 tiene la secuencia de aminoácidos de 132 mero mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 1), tal como se encuentra en PROLEUKIN^{TM}. Las composiciones están preferiblemente libres de IL-2 que no tienen una Ala N-terminal. La proteína de la figura 2 puede expresarse usando la secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura 4 (SEQ ID NO: 2), tras la rotura de la metionina N-terminal traducida.

La IL-2 en el producto PROLEUKIN^{TM} está no glicosilada, como consecuencia del huésped de expresión E. coli. Se prefiere la IL-2 no glicosilada para su uso con la invención.

Se conocen en la técnica procedimientos para detectar la presencia de IL-2 en una composición y para cuantificarla. La detección inmunológica usando anticuerpos anti-IL-2 (por ejemplo ELISA) es el procedimiento de detección más común, y estos procedimientos pueden usarse también cuantitativamente. Otros procedimientos cuantitativos incluyen análisis de aminoácidos, ensayo de proteínas de Lowry con un patrón proteico aprobado legalmente, ensayos de HPLC y mediciones de absorbancia ultravioleta intrínseca.

La medida cuantitativa convencional para la IL-2 es la unidad internacional (UI) que no se basa en la masa de proteína sino en la actividad en un ensayo biológico. Según la norma 86/504, 1 UI es la cantidad de IL-2 que produce el 50% de proliferación máxima de una línea celular dependiente de IL-2 establecida [61] CTLL-2. La cuantificación de la actividad IL-2 en otras preparaciones se consigue comparando las curvas dosis-respuesta de la preparación con patrones disponibles (por ejemplo la ampolla de patrón WHOIL-2, que contiene 100 UI/ml tras la reconstitución) usando un análisis de líneas paralelas, o mediante software computerizados tal como el programa ALLFIT [62, 63]. En la práctica, cuando la fabricación está normalizada entonces es posible una conversión entre el peso de fármaco y IU. Para el producto PROLEUKIN^{TM}, por ejemplo, la conversión es 1,1 mg de IL-2 equivale a 18x10^{6} UI.

La actividad puede convertirse en una actividad específica (es decir actividad por masa unitaria de IL-2 por ejemplo UI/mg) dividiéndola entre la masa de IL-2 presente. Una composición preferida de la invención tiene una actividad específica de entre16 y 17 MUI/mg.

Composiciones farmacéuticas

Los procedimientos de la invención proporcionan microagregados de IL-2/SDS que son adecuados para uso farmacéutico en seres humanos, y así la invención da una composición farmacéutica que comprende microagregados de IL-2/SDS de la invención. Sin embargo, en vez de usar simplemente microagregados directamente de la diafiltración, normalmente estarán formulados antes de la administración a pacientes.

Por ejemplo, los microagregados pueden estar diluidos con el fin de dar una concentración convencional, mientras se mantiene la proporción IL-2/SDS. La dilución para dar una concentración de IL-2 de aproximadamente 1,1 mg/ml es típica.

Los microagregados (por ejemplo tras la dilución) pueden mezclarse con estabilizadores, particularmente si han de liofilizarse. La adición de azúcares (por ejemplo sacarosa, trehalosa) es típica para dar estabilidad durante la liofilización, y un estabilizador preferido es manitol. Este alcohol de azúcar puede añadirse para dar una concentración final de entre 40 y 50 (por ejemplo aproximadamente 45,5) mg de manitol por mg de IL-2 (50 mg para 1,1 mg de IL-2). La albúmina sérica humana (preferiblemente recombinante) puede añadirse también como estabilizador. Las mezclas de azúcares también pueden usarse por ejemplo sacarosa y manitol, trehalosa y manitol, etc.

Puede añadirse un tampón a la composición de microagregado por ejemplo un tampón Tris, un tampón histidina, un tampón glicina o, preferiblemente, un tampón fosfato (por ejemplo que contiene dihidrogenofosfato de sodio y hidrogenofosfato de disodio). Se prefiere la adición de tampón para dar un pH entre 7,2 y 7,8, y en particular un pH de aproximadamente 7,5.

Las composiciones que comprenden los microagregados pueden esterilizarse, normalmente mediante esterilización por filtración por ejemplo a través de un filtro de 0,22 \mum. Esto puede ir precedido de filtración a través de un filtro con poros mayores.

Las composiciones acuosas que comprenden los microagregados pueden envasarse directamente en jeringas, listas para la inyección. También pueden envasarse en nebulizadores, listos para la inhalación.

Las composiciones acuosas que comprenden los microagregados pueden liofilizarse antes de la distribución. El material acuoso o liofilizado puede envasarse en recipientes (por ejemplo viales), que pueden sellarse entonces herméticamente. La liofilización tendrá lugar normalmente dentro de los viales, con sellado tras la liofilización. El material liofilizado equivalente a 22x10^{6} UI de IL-2 puede envasarse en un único vial como una dosis unitaria, para la reconstitución en un volumen acuoso final de aproximadamente 1,1 ml, para dar aproximadamente 18x10^{6} UI/ml. Las cantidades fraccionales (por ejemplo 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/8) de las mismas pueden envasarse también como dosis unitarias. En particular, pueden usarse las dosis unitarias de aproximadamente 9x10^{6} UI, aproximadamente 4,5x10^{6} UI y aproximadamente 14x10^{6} UI.

Para la reconstitución tras la liofilización, puede usarse agua estéril para la inyección. También es posible reconstituir una torta liofilizada con una composición acuosa que comprende albúmina sérica humana (preferiblemente recombinante). Se prefiere la reconstitución en un volumen acuoso de entre 1,0 ml y 1,2 ml (es decir la IL-2 puede diluirse para dar la misma concentración que antes de la liofilización). Este material reconstituido puede diluirse entonces de manera aséptica en un volumen mayor de líquido para la infusión intravenosa por ejemplo en aproximadamente 50 ml de una disolución de D5W (5% de inyección de dextrosa). La turbidez específica sigue siendo sustancialmente constante durante la dilución en D5W, hasta que la concentración de IL-2 cae por debajo de aproximadamente 0,1 mg/ml. La dilución puede tener lugar en diversos recipientes por ejemplo botellas de vidrio, bolsas de plástico (por ejemplo poli(cloruro de vinilo), etc. La dilución para dar una concentración final de IL-2 fuera del intervalo de 30-70 \mug/ml debería evitarse. Las condiciones que pueden provocar cambios en la microagregación deben evitarse por ejemplo la reconstitución con agua bacteriostática para inyección o con inyección de cloruro de sodio al 0,9%.

Una primera composición farmacéutica preferida es por tanto una composición acuosa con un pH de aproximadamente 7,5, que comprende 1,1 mg/ml de IL-2, 0,18 mg de SDS, 50 mg/ml de manitol y tampón fosfato, formando la IL-2 y SDS microagregados en los que el número promedio de moléculas de IL-2 por agregado está entre 10 y 50. Estas composiciones pueden reconstituirse a partir de material liofilizado.

Una segunda composición farmacéutica preferida es el producto de diluir la primera composición farmacéutica preferida en una disolución de D5W.

Las composiciones preferidas están libres de conservante, libres de antibióticos y libres de proteínas distintas de IL-2 (incluyendo libres de HSA) es decir estos materiales son indetectables.

Procedimientos y usos farmacéuticos

La invención proporciona un procedimiento para tratar a un paciente, que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al paciente. El paciente es preferiblemente un ser humano, y puede ser un niño (por ejemplo un niño pequeño o un infante), un adolescente o un adulto, pero será generalmente un adulto.

La invención también proporciona microagregados de SDS/IL-2 de la invención para su uso como medicamento.

La invención también proporciona el uso de microagregados de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente.

Estos usos, procedimientos y medicamentos son preferiblemente para el tratamiento de un cáncer, particularmente aquellos tumores consolidados, tales como carcinoma de células renales o melanoma, cáncer que puede ser metastásico. Los usos, procedimientos y medicamentos pueden usarse también para el tratamiento de pacientes que han recibido un trasplante de tejido o de órgano, o que están listos para recibir uno. Los usos, procedimientos y medicamentos también pueden usarse para el tratamiento de pacientes que están infectados por VIH, incluyendo aquellos con y sin SIDA.

Por tanto, a los pacientes para el tratamiento con la invención se les habrá diagnosticado un cáncer. Sin embargo, los pacientes que no deben tratarse según la invención, pueden incluir: (1) pacientes con hipersensibilidad a IL-2 o cualquier otro componente de la composición farmacéutica; (2) pacientes con un estado general de ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) \geq2; (3) pacientes con una presencia simultánea de un estado general de ECOG >1 y más de un órgano con puntos de enfermedad metastásica y un periodo de < 24 meses entre el diagnóstico inicial del tumor primario y la fecha en la que se evalúa el paciente para el tratamiento con IL-2; (4) pacientes con un historial significativo o pruebas actuales de enfermedad cardíaca grave; (5) pacientes con pruebas de infección activa que requiere tratamiento con antibióticos; (6) pacientes con un PaO_{2} < 60 mm Hg durante el reposo; (7) pacientes con disfunción de órgano principal grave preexistente; y (8) pacientes con metástasis en el sistema nervioso central o trastornos con convulsiones, con la excepción de pacientes con metástasis cerebrales tratadas satisfactoriamente.

Se conocen en la técnica procedimientos para comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico con IL-2.

Las curvas de semivida del suero de IL-2 en seres humanos tras infusión o administración de bolo intravenoso pueden describirse como biexponenciales. Para un bolo, el T_{1/2}\alpha es 8 minutos y el T_{1/2}\beta es 88 minutos; para una infusión, el T_{1/2}\alpha es 15 minutos y el T_{1/2}\beta es 96 minutos. Los niveles de suero observados son proporcionales a la dosis de IL-2.

Las características de medicamentos adecuados se aportan anteriormente en la sección titulada "Composiciones farmacéuticas". Estas composiciones se administrarán generalmente de manera directa a un paciente. La administración directa puede llevarse a cabo mediante inyección parenteral (por ejemplo por vía intravenosa, vía subcutánea, vía intraperitoneal, vía intramuscular o al espacio intersticial de un tejido), o mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración. En general, sin embargo, la IL-2 se administra mediante inyección intravenosa (por ejemplo bolo o infusión continua) o mediante inyección subcutánea (por ejemplo bolo o infusión continua).

La dosificación de IL-2 se aumenta en escala normalmente hasta el tamaño corporal de un paciente, medido en peso corporal (kg) o bien área de superficie corporal (BSA; medida en m^{2}, medida, o estimada mediante una combinación de la altura y el peso de un paciente). Aunque no hay una conversión exacta entre el peso y la dosificación de BSA, hay una buena aproximación: para una persona de una altura y peso promedio (50º percentil para cada uno), 25000 UI/kg = 1 MUI/m^{2}.

El tratamiento puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples. Las dosis pueden administrarse mediante un bolo o mediante infusión. Un régimen de tratamiento típico para IL-2 es administrar 18 x 10^{6} UI por m^{2} por 24 horas como una infusión continua durante 5 días, seguido de 2-6 días sin recibir IL-2, entonces otros 5 días de IL-2 intravenosa como infusión continua tal como anteriormente, y entonces 3 semanas sin recibir IL-2. Esto es un "ciclo de inducción" sencillo para IL-2. Tras el periodo de reposo de 3 semanas del primer ciclo, puede empezar un segundo ciclo de inducción. Pueden administrarse hasta cuatro ciclos de mantenimiento con intervalos de 4 semanas a pacientes que responden o que tienen una estabilización de la enfermedad. Sin embargo, si un paciente no puede tolerar este régimen de dosificación, debe reducirse la dosis o interrumpirse la administración hasta que la toxicidad se haya moderado. Otro régimen de tratamiento para IL-2 es administrar 6 x 10^{5} UI por kg mediante bolo intravenoso cada 8 horas, durante 14 dosis a lo largo de 5 días, administrándose un segundo tratamiento tras un periodo de reposo de 9 días.

Las administraciones preferidas incluyen: infusión intravenosa para el tratamiento de carcinoma de células renales metastásico; infusión intravenosa para el tratamiento de melanoma metastásico; bolo subcutáneo para el tratamiento de carcinoma de células renales metastásico; infusión subcutánea para el tratamiento de carcinoma de células renales metastático; administración pulmonar mediante inhalación para el tratamiento de carcinoma de células renales metastásico con metástasis pulmonar.

Politerapias

Los microagregados de IL-2 de la invención pueden usarse como el principio activo de fármacos. Tales fármacos pueden usarse por sí mismos para tratar a pacientes, o pueden usarse junto con otros principios activos. Normalmente, la IL-2 no se mezclará con el otro principio activo antes de la administración; más bien, la IL-2 y el otro principio activo se administrarán como medicinas independientes por separado en un protocolo combinado. La politerapia es particularmente adecuada para tratar cánceres, incluyendo cánceres malignos y metastásicos.

Por tanto la invención proporciona (a) microagregados de IL-2 de la invención, y (b) un segundo agente farmacéutico, para la administración secuencial o por separado de manera simultánea.

La invención también proporciona una preparación o sistema farmacéutico, que comprende (a) un primer agente farmacéutico, que comprende microagregados de IL-2 de la invención; y (b) un segundo agente farmacéutico, estando dichos primer y segundo agentes en mezcla o bien siendo composiciones individuales por ejemplo para la administración secuencial o por separado de manera simultánea.

La invención también proporciona un kit que comprende (a) un primer agente farmacéutico, que comprende microagregados de IL-2 de la invención; y (b) un segundo agente farmacéutico.

La invención también proporciona el uso de (a) microagregados de IL-2 de la invención y (b) un segundo agente farmacéutico, en la fabricación de un medicamento de combinación.

La invención también proporciona el uso de microagregados de IL-2 de la invención en la fabricación de un medicamento, siendo el medicamento para la administración a un paciente que se ha tratado previamente con un segundo agente farmacéutico. De manera similar, la invención proporciona el uso de un segundo agente farmacéutico en la fabricación de un medicamento, siendo el medicamento para la administración a un paciente que se ha tratado previamente con microagregados de IL-2 de la invención. El tratamiento previo puede ser reciente (por ejemplo en el plazo de 24 horas antes de la administración de dicho medicamento), intermedio (por ejemplo más de 24 horas antes, pero no más de 4 semanas), más lejano (por ejemplo al menos 4 semanas antes), o muy lejano (por ejemplo al menos 6 meses antes), haciendo referencia estos periodos de tiempo a la dosis de tratamiento previo más reciente. El paciente puede no responder al tratamiento mediante el agente farmacéutico que se administró en el tratamiento previo.

La invención también proporciona el uso de microagregados de IL-2 de la invención en la fabricación de un medicamento, administrándose conjuntamente el medicamento con un segundo agente farmacéutico. De manera similar, la invención proporciona el uso de un segundo agente farmacéutico en la fabricación de un medicamento, administrándose conjuntamente el medicamento con microagregados de IL-2 de la invención. Los dos agentes se administran preferiblemente en el plazo de 4 horas entre sí.

Los segundos agentes farmacéuticos se seleccionan de la tabla siguiente, que incluye también detalles de los estados a tratar para los que puede usarse la politerapia (y, cuando sea apropiado, detalles básicos de cómo puede administrarse la politerapia):

1

2

3

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Cuando el segundo agente es un anticuerpo, es preferiblemente un anticuerpo monoclonal, más preferiblemente un anticuerpo humano o humanizado. Los anticuerpos se administrarán generalmente mediante inyección, por ejemplo subcutánea o intravenosa. Los anticuerpos pueden estar conjugados con otros principios activos por ejemplo tiuxetano, ozogamicina, radionúclidos, ^{131}I, etc., preferiblemente para el tratamiento de cáncer.

En general, el segundo agente puede ser cualquier anticuerpo que proporcione ADCC ("antibody-dependent cellular cytotoxicity", citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). La politerapia basada en IL-2 es más útil con anticuerpos que median ADCC para tratar el cáncer que con agentes que tratan el cáncer inhibiendo la vascularización o alterando la transducción de señales del ciclo celular.

Definiciones

El término "que comprende" engloba "que incluye" así como "que está compuesto" por ejemplo una composición "que comprende" X puede estar compuesta exclusivamente por X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y.

El término "aproximadamente" con respecto a un valor numérico x significa, por ejemplo, x \pm 10%. En caso necesario, el término aproximadamente puede omitirse.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. En caso necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

El porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse usando el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con una penalización de apertura de hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman se enseña en la bibliografía 64.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el aumento en la turbidez específica (\tau) a medida que se elimina SDS durante la diafiltración.

Las figuras 2 y 3 muestran la secuencia de aminoácidos de IL-2 en el producto PROLEUKIN^{TM} (SEC ID NO: 1). Esta secuencia (i) carece de metionina en el extremo N-terminal de SEC ID NO: 3, (ii) carece del residuo de alanina encontrado en el extremo N-terminal de la IL-2 humana madura natural tal como se observa en SEC ID NO: 4, y (iii) tiene una sustitución por serina en el residuo Cys-125 observado en SEC ID NO: 4.

La figura 4 muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de la figura 2 (SEC ID NO: 2, que incluye los codones de inicio y de terminación, y se expresa como SEC ID NO: 3 antes de la rotura de la metionina en el extremo N-terminal). Los números a la izquierda indican el número de la primera base en cada fila, tal como se cuentan desde el extremo 5' de la cadena de ADN (+) del gen de IL-2. Los números por debajo de la secuencia de aminoácidos indican los números de residuos, tal como se cuentan desde el extremo N-terminal de la IL-2 humana. Las flechas indican diferencias de nucleótidos con respecto a la IL-2 humana (es decir, las diferencias entre SEC ID NOS: 2 y 5).

La figura 5 muestra la turbidez específica (\tau, cm^{2}/g) de siete muestras usadas para pruebas farmacocinéticas, con diferentes concentraciones de SDS (\mug de SDS por mg de IL-2), y la figura 6 muestra la proporción de IL-2 total que puede sedimentarse mediante centrifugación en las sietes muestras.

La figura 7 muestra la bioactividad plasmática para seis de las siete muestras. La figura 8 compara las muestras de 160 \mug/mg y 25 \mug/mg, y la figura 9 es una combinación de las figuras 7 y 8. Los ejes X muestran el tiempo (horas) tras la inyección; los ejes Y muestran la bioactividad plasmática (ng/ml).

La figura 10 muestra \tau (cm^{2}/g) frente a la concentración de SDS (mg/\mug) durante la diafiltración, y la figura 11 convierte \tau en MW (kDa).

La figura 12 muestra la caída en la concentración de SDS durante la diafiltración.

La figura 13 superpone los resultados de la turbidez de la figura 10 sobre el perfil de eliminación de SDS de la figura 12.

La figura 14 muestra el efecto de la liofilización sobre \tau (cm^{2}/g). Los cuadrados muestran los valores antes de la liofilización, y los círculos muestran los valores tras la liofilización. El eje X muestra la concentración de SDS de las muestras (\mug/mg).

La figura 15 muestra la bioactividad de los microagregados de IL-2, antes y tras la dilución con suero, y una comparación con IL-2 monomérica.

Las figuras 16 y 17 muestran espectros de dispersión de luz dinámica para microagregados de IL-2. La figura 16 está distribuida en masa de los componentes de la disolución, y la figura 17 está distribuida en número.

Modos de llevar a cabo la invención 1/ Preparación de microagregados de IL-2

Se cultivaron en condiciones habituales células E. coli transformadas con un plásmido que alberga la secuencia de nucleótidos de la figura 4, de modo que se expresó la proteína IL-2 que tenía la secuencia de la figura 2. Tras el cultivo, la IL-2 estaba predominantemente en forma de cuerpos de inclusión.

La recuperación primaria de IL-2 incluyó la concentración, la ruptura celular, la diafiltración, la inactivación, la ruptura de nuevo y la suspensión con sacarosa. Se realizó la concentración de las células cultivadas usando filtros de flujo transversal ("crossflow") con el fin de disminuir el volumen de trabajo aproximadamente hasta cinco veces. Se rompieron las células mediante homogeneización para facilitar el aislamiento de los cuerpos de inclusión de IL-2. Se eliminaron las sales del medio de fermentación mediante diafiltración y se destruyeron las bacterias huésped en la disolución diafiltrada mediante la adición de un alcohol. Tras el tratamiento con alcohol, se rompieron las células mediante homogeneización. Se añadió sacarosa para obtener una mezcla de densidad superior, con el fin de permitir la separación de los cuerpos de inclusión de IL-2 de los restos celulares durante la centrifugación. Se recogió la pasta de partículas de IL-2 mediante centrifugación, se tomaron alícuotas y se conservaron a -70ºC o inferior, hasta el procesamiento adicional.

Se solubilizó la pasta de partículas de IL-2 con SDS y se redujo con ditiotreitol (DTT) con el fin de obtener una forma monomérica de IL-2 soluble sin ningún enlace disulfuro. Se realizó esta etapa de procedimiento para aumentar el rendimiento cuando la IL-2 se someta a cromatografía en la etapa siguiente.

Se purificó la forma soluble monomérica de IL-2 mediante un procedimiento que incluía las etapas de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, "size exclusion chromatography"), oxidación, concentración, RP-HPLC, precipitación y centrifugación. Se realizó la primera etapa cromatográfica de SEC para separar la IL-2 de los ácidos nucleicos y las proteínas del huésped. Se recogieron las fracciones que contenían IL-2 y se combinaron. Se oxidó la IL-2 con el fin de obtener el enlace disulfuro intramolecular. Se realizó la concentración de la disolución de IL-2 usando ultrafiltración con el fin de disminuir el volumen de trabajo. Se realizó la segunda etapa cromatográfica, RP-HPLC preparativa, para separar la IL-2 de endotoxinas bacterianas, ácidos nucleicos y proteínas del huésped, y para eliminar las isoformas de IL-2, incluyendo las formas oxidadas. Se recogieron las fracciones que contenían IL-2 y se combinaron. Se precipitó la IL-2 mediante la adición de hidróxido de sodio (NaOH) y se recogió mediante centrifugación. Se realizó esta etapa de procedimiento para eliminar los disolventes usados en la purificación por RP-HPLC. El material en esta fase se denomina como la "pasta de HPLC".

Entonces se volvió a solubilizar la pasta de HPLC añadiendo una disolución de Na_{2}HPO_{4} 0,05 M + SDS al 1%. Cuando se añade SDS a un concentración suficiente, entonces la composición contiene principalmente IL-2 solubilizada monomérica, pero puede haberse formado durante la purificación una pequeña cantidad de IL-2 oligomerizada (es decir, moléculas de IL-2 unidas covalentemente en forma de oligómeros). Se eliminaron estos oligómeros mediante filtración en gel, que además elimina cualquier disolvente orgánico residual de las etapas ante-
riores.

Puesto que el SDS puede ser tóxico para las células, éste se elimina de la IL-2 solubilizada. Se diafiltró la disolución frente a tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7,5, hasta que el nivel de SDS alcanzó aproximadamente 160 \mug/mg de IL-2. Los microagregados de IL-2 y SDS empiezan a formarse a aproximadamente 500-600 \mug/mg, y su tamaño aumenta gradualmente a medida que el nivel de SDS disminuye además hasta el nivel diana de 160 \mug/mg (figura 1). Esta eliminación de SDS, que es la clave para la formación de microagregados, es la última etapa en el procedimiento de purificación de la IL-2, antes de la formulación.

2/ Formulación de los microagregados de IL-2 para uso farmacéutico

Se sometió a prueba la mezcla de SDS/IL-2 diafiltrada, que contenía microagregados, para determinar la concentración de proteína (mg/ml) dividiendo su absorbancia a 280 nm por el coeficiente de extinción de la IL-2 (0,79). También se midió (ml) el volumen de la disolución de IL-2 diafiltrada. Se calculó la cantidad total de la proteína IL-2 (mg) multiplicando el volumen de la disolución de IL-2 diafiltrada por la concentración de proteína. Se calculó el volumen de trabajo final (ml) para la formulación multiplicando los mg totales de proteína por el factor 0,909. Este factor tiene en cuenta la pérdida de IL-2 durante la filtración.

Para estabilizar la IL-2 durante la liofilización se añadió ¼ del volumen de una disolución de manitol al 20%, para dar una concentración final de manitol del 5% (es decir 50 mg/ml). También se añadió un tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7,5 hasta el volumen de trabajo final. Tras añadir manitol y el tampón, se determinó la concentración de IL-2 en la disolución formulada, midiendo la absorbancia a 280 nm.

El resultado final tras la formulación fue una disolución a granel a pH 7,5, que contenía: IL-2 a una concentración final de 1,1 \pm 0,05 mg/ml; SDS 0,18 mg/ml; manitol 50 mg/ml; fosfato de sodio monobásico 0,17 mg/ml; y fosfato de sodio dibásico 0,89 mg/ml.

Se esterilizó por filtración la disolución a granel de IL-2 formulada en un tanque de carga a granel estéril. Se transfiere material de este tanque a viales estériles. Se introdujeron en cada vial 1,2 ml de disolución a granel. Se colocaron entonces los viales en un liofilizador y se secaron por congelación. Se aplicaron entonces tapones y se sobresellaron los tapones. Después se etiquetaron los viales y se envasaron.

3/ Efecto de la concentración de SDS sobre la turbidez

Antes de llegar al intervalo de concentración preferido de SDS, se preparó IL-2 mediante el procedimiento descrito anteriormente, excepto que se retiraron muestras grandes (\sim300 mg de IL-2) en diversos puntos durante la diafiltración para la investigación de la turbidez, con el fin de establecer el efecto de SDS sobre la agregación de IL-2.

La figura 12 muestra la concentración de SDS durante la diafiltración del material de partida. La concentración disminuye como una línea recta sobre el eje logarítmico. Se retiraron muestras a las concentraciones de SDS siguientes (\mug por mg de IL-2): 1195, 536, 351, 217, 173, 137, 123, 104 y 72.

La pureza de la IL-2 era la misma en cada muestra (el 100% mediante SDS-PAGE, \geq 98,5% mediante HPLC). Se midió la turbidez a 488 nm y se convirtió en una turbidez específica absoluta (\tau) tal como se describió anteriormente, basándose en la concentración de IL-2 en las muestras. Los resultados se muestran en la figura 10, y la figura 13 superpone los resultados de la turbidez sobre los perfiles de eliminación de SDS de la figura 12.

Por debajo de aproximadamente 300 \mug/mg, la turbidez aumenta gradualmente, y el aumento se vuelve muy pronunciado por debajo de aproximadamente 95 \mug/mg.

Los valores de \tau pueden convertirse en pesos moleculares deducidos mediante la siguiente fórmula:

PM = \frac{\tau \ \times \ 10^{7}}{8.1 + 2\tau}

Los resultados de esta conversión para las muestras antes de la liofilización se muestran en la figura 11. Estos y otros datos muestran que se observa un PM (peso molecular) correspondiente a IL-2 monomérica por encima de aproximadamente 600 \mug/mg, y el PM empieza a aumentar significativamente cuando el SDS está por debajo de aproximadamente 300 \mug/mg, volviéndose el aumento muy pronunciado cuando el SDS cae por debajo de aproximadamente 100 \mug/mg.

Basándose en el PM de la IL-2 monomérica (15,3 kDa para IL-2 nativa), puede convertirse el peso molecular de un agregado en un número deducido de monómeros de IL-2 por agregado.

4/ Liofilización y turbidez específica

Durante la diafiltración para eliminar SDS, se retiraron muestras de 15 ml a las siguientes concentraciones de SDS: 1155; 840; 585; 400; 190; y 155 \mug/mg de IL-2. Se determinó la turbidez de estas muestras tanto antes como después de la formulación (es decir, tras la adición de manitol, tampón fosfato, liofilización y reconstitución). En ambos casos las mediciones de turbidez estuvieron precedidas por filtración a través de un filtro de 0,2 \mum con el fin de eliminar cualquier agregado grande.

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La figura 14 muestra el efecto de la liofilización sobre \tau (escala logarítmica) para estas muestras. La gráfica muestra que la liofilización no destruye los microagregados, pero que puede aumentar a menudo ligeramente la turbidez específica (es decir, los agregados aumentan en tamaño), sin afectar la dependencia de la concentración de SDS. El efecto es generalmente menor en el intervalo de SDS preferido.

5/ Dispersión de luz dinámica

Se prepararon los microagregados de IL-2 tal como se describió anteriormente, con una concentración de SDS de 160 \mug/mg, y se analizaron mediante DLS ("Dynamic Light Scattering", dispersión de luz dinámica). Los resultados se muestran en las figuras 16 y 17. La figura 16 muestra los resultados de DLS distribuidos en masa de los componentes de la disolución, y la figura 17 los muestra en número.

En la figura 16, el pico principal tiene un diámetro hidrodinámico medio de 12,7 nm, representando el 99,02% de la masa total. Existe también un pico posterior con un diámetro medio de 55,6 nm, representando el 0,98% restante de la masa. En la figura 17, el pico principal tiene un diámetro hidrodinámico medio de 11,7 nm, representando el 99,99% del número total. También existe un pico posterior con un diámetro medio de 53,7 nm, representando el 0,01% restante de partículas.

6/ Comparación de microagregados frente a IL-2 monomérica

Se comparó IL-2 microagregada frente a IL-2 monomérica en diversas pruebas. Se prepararon los microagregados de IL-2 tal como se describió anteriormente. Para fines comparativos, se preparó IL-2 en forma monomérica, en los que se usó Tween 80 como el detergente en vez de SDS. Este detergente no forma microagregados con IL-2, sino que el detergente solubiliza la IL-2 y da un producto monomérico bioactivo.

Ambas formas de IL-2 confirmaron ser bioactivas. La IL-2 agregada tenía una actividad de aproximadamente 20 MUI/mg. Cuando se diluyó con suero ex vivo, la actividad cayó ligeramente. En ambos casos, la actividad era ligeramente superior que la de la IL-2 monomérica (figura 15). Por tanto, los microagregados de IL-2 de la invención pueden disociarse para dar un producto bioactivo, y la bioactividad es equivalente a la de la IL-2 que no se ha agregado.

Se comparó la distribución in vivo de IL-2 radiomarcada tras la administración intravenosa de la proteína en forma microagregada con SDS o bien en forma monomérica. La forma microagregada se distribuyó preferentemente en el pulmón, hígado y riñón, mientras que el producto monomérico se distribuyó casi al 100% en el riñón. Por tanto, la microagregación tiene un impacto sobre la distribución in vivo.

También se compararon IL-2 monomérica y microagregada en un modelo de metástasis tumoral. Se inyectaron por vía intravenosa células tumorales B16F10 en las colas de ratones, y 14 días más tarde, se inspeccionaron los pulmones para detectar tumores. Los animales tratados recibieron IL-2 diariamente de los días 3-10. Los números promedio de metástasis de pulmón en el día 14 fueron tal como sigue:

4

La forma microagregada de IL-2 es por tanto más eficaz en el modelo tumoral que la forma monomérica, por que la metástasis puede prevenirse usando dosis mucho menores de IL-2. Sin embargo, debido a que IL-2 puede ser tóxica por sí misma, los datos no pueden compararse directamente, por ejemplo 10 mg/kg de microagregados de IL-2 pueden matar aproximadamente a ½ de una población de prueba. La comparación más significativa es por tanto a la dosis no letal más alta, concretamente a la dosis de 7,5 mg/kg. A esta dosis equitóxica, el número promedio de metástasis observado con los microagregados era 4,5 (intervalo 1-18), en comparación a 16 (intervalo 4-57) con la IL-2 monomérica, siendo la diferencia estadísticamente significativa. Esta diferencia representa un índice terapéutico de 3 a 5 veces mejor para la forma microagregada de IL-2.

Otros estudios con este modelo de metástasis artificial B16 revelaron que los niveles de SDS en el producto final no parecen tener impacto sobre la eficacia. Por ejemplo, una composición con 160 \mug/mg de SDS actuó de la misma manera que una con 181 \mug/mg. Por tanto, con SDS en el intervalo de 95-250 \mug/mg, la actividad antitumoral sigue siendo óptima mientras que se evita la toxicidad relacionada con SDS.

7/ Efectos farmacocinéticas de la concentración final de SDS

Tal como se mostró anteriormente, la turbidez de las mezclas de IL-2/SDS aumenta a medida que disminuyen los niveles de SDS durante la diafiltración. En una prueba farmacocinética, se continuó la diafiltración si bien más allá del objetivo típico de 160 \mug/mg, justo por debajo de 25 \mug/mg. Se tomaron muestras durante el procedimiento de diafiltración en diversas fases: 1090 \mug/mg; 200 \mug/mg; 160 \mug/mg; 125 \mug/mg; 95 \mug/mg; 65 \mug/mg; y
25 \mug/mg.

Todas las muestras excepto la más diluida (25 \mug/mg) eran visiblemente transparentes, y la figura 5 muestra la turbidez específica (\tau) de las siete muestras. La caída en \tau a la concentración más baja refleja un enorme aumento en la precipitación de proteína a 25 \mug/mg, que pudo visualizarse a simple vista La figura 6 muestra la proporción de IL-2 total que podía sedimentarse mediante centrifugación en las siete muestras, y se observa un gran aumento a la concentración más baja de SDS mientras que las concentraciones superiores son esencialmente constantes. Este material precipitado se depositó y no provocó así turbidez, explicando el bajo valor de \tau en la figura 5.

A diferencia de la precipitación y turbidez variable, la bioactividad (UI) era esencialmente constante para las siete muestras (aproximadamente 19 UI/mg).

Para los estudios farmacocinéticas, se inyectaron como un bolo todas las muestras excepto la más diluida en la vena de la cola de las ratas (triplicado por dosis de SDS, 18 ratas en total) a 0,2 mg de IL-2 por kg de peso corporal, basándose en una extrapolación alométrica de una dosis humana. Se tomaron muestras de sangre a los 1, 3, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 y 60 minutos tras la inyección y se sometieron a ensayo para determinar la bioactividad de la IL-2. La figura 7 muestra la bioactividad plasmática (ng/ml) de estas muestras. Entre 0,5 horas y 1 hora, la línea superior es la dosis de 160 \mug/mg (\sqbullet), y la línea más baja es de 65 \mug/mg (\Delta), aunque todas las líneas son muy
similares.

En un segundo estudio, se comparó la muestra con la línea más alta del primer experimento (160 \mug/mg) con la muestra más diluida (25 \mug/mg). Los parámetros farmacocinéticas de la muestra de 160 \mug/mg en el segundo estudio correspondían a los del primer estudio. Mientras que las líneas en la figura 7 son todas de formas similares entre sí, sin embargo, la muestra más diluida dio resultados muy diferentes (figura 8). La tasa de aclaramiento calculada a partir de las curvas fueron diferentes en \sim 30 veces: 12,7 ml/min/kg para la dosis de 160 \mug/mg, y 362 ml/min/kg para la dosis de 25 \mug/mg.

Cuando se comparan los resultados de los dos experimentos, la muestra más diluida se distingue claramente de las otras seis muestras (figura 9).

Por tanto, el estado de agregación de IL-2 tiene un claro efecto sobre su farmacocinética in vivo.

8/ SDS libre

Los experimentos anteriores miden la concentración total de SDS en mezclas de SDS/IL-2. Se realizaron experimentos para determinar cuanto del SDS total se asoció con IL-2 y cuanto permaneció libre en la disolución.

Se reconstituyeron viales de producto PROLEUKIN^{TM} según la prescripción facultativa y se ultrafiltraron a través de membranas Centricon 10 (corte de 10 kDa) en dos centrifugaciones a 3000 rpm durante 30 minutos cada una. Se sometieron a prueba la muestra inicial y el filtrado para determinar los niveles de SDS e IL-2. Se midió SDS mediante el ensayo de naranja de acridina [35]. Brevemente, este ensayo implica: tomar 0,5 ml de muestra; añadir 0,1 ml de disolución de NaHSO_{4} 1,75 M; añadir 0,1 ml de disolución de naranja de acridina al 1% (p/v); añadir 1,5 ml de tolueno; sellar; someter a vortex durante 3 minutos; separar las fases orgánica y acuosa por ejemplo mediante centrifugación durante 5 minutos a 3000 rpm y temperatura ambiente; medir la absorbancia de la fase orgánica superior a 499 nm. Pueden diluirse las muestras (por ejemplo con agua pura) antes del ensayo para llevarlas dentro del intervalo de un curva patrón, por ejemplo si la curva patrón se basa en concentraciones de SDS conocidas hasta 25 \mug/ml, entonces debe diluirse la muestra para llevar su concentración de SDS dentro de este intervalo. El blanco para la etapa espectrofotométrica debe ser un patrón que contiene cero de SDS que se ha tratado de la misma manera que la muestra experimental.

Los resultados mostraron que la IL-2 se retenía totalmente mediante las membranas de ultrafiltración (no puede detectarse en el filtrado) mientras que aproximadamente el 35% de SDS pudo pasar a través de la membrana.

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[61] Gearing & Thorpe (1988) J Immunol Methods 114: 3-9.

[62] Rossio (1997) Cytokines and immune cell products. Páginas 348-356 de Manual of Clinical and Laboratory Immunology, 5ª edición (eds. Rose, deMacario, Folds, Lane, Nakamura).

[63] Wadhwa et al. (2000) Quantitative biological assays for individual cytokines. Páginas 207-239 de Cytokine Cell Biology: A Practical Approach (ed. Balkwill). ISBN 0-19-963860-8.

[64] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-9.

<110> CHIRON CORPORATION

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<120> PREPARACIÓN DE ALDESLEUCINA PARA USO FARMACÉUTICO

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<130> P039597EP

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<160> 5

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<170> SeqWin99, versión 1.02

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<210> 1

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Variante des-alanil-1 serina-125 madura de la interleucina-2 humana

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<400> 1

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5

6

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<210> 2

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<211> 402

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Variante des-alanil-1serina-125 madura de la interleucina-2 humana

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<400> 2

7

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<210> 3

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<211> 133

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Variante des-alanil-1 serina-125 naciente de la interleucina-2 humana

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<400> 3

8

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<210> 4

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<211> 133

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

9

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<210> 5

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<211> 405

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de IL-2 humana con Met en lugar de la señal

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<400> 5

10

Claims

1. Un procedimiento para preparar interleucina-2 para uso farmacéutico, que comprende las etapas de: (a) añadir dodecilsulfato de sodio (SDS) a una composición que comprende IL-2 con puentes disulfuro intramoleculares, para dar una concentración final de SDS de al menos 500 \mug de SDS por mg de IL-2; (b) eliminar cualquier multímero de IL-2 unido covalentemente precipitado mediante filtración en gel; y (c) reducir la concentración de SDS para eliminar algo pero no todo el SDS de la composición, para dar una composición que contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de IL-2.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende las etapas de: purificar IL-2 mediante RP-HPLC; precipitar la IL-2; añadir SDS a la IL-2 precipitada para dar una concentración final de SDS de al menos 500 \mug de SDS por mg de IL-2; eliminar cualquier multímero covalente de IL-2 precipitado mediante filtración en gel; y reducir la concentración de SDS para eliminar algo pero no todo el SDS de la composición, para dar una composición que contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de IL-2.

3. El procedimiento según cualquier reivindicación anterior, siendo la concentración final de SDS en la etapa (a) al menos de 900 \mug/mg.

4. El procedimiento según cualquier reivindicación anterior, teniendo el producto de la etapa (c) una concentración de SDS entre 135-180 \mug/mg.

5. Un procedimiento para preparar una composición que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio: (i) estando presente la interleucina-2 y el dodecilsulfato de sodio en la composición en forma de agregados; y (ii) comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) añadir dodecilsulfato de sodio a una composición que comprende interleucina-2 con puentes disulfuro intramoleculares, añadiéndose suficiente dodecilsulfato de sodio para dar interleucina-2 solubilizada monomérica, (b) eliminar cualquier multímero de IL-2 unido covalentemente precipitado mediante filtración en gel, y (c) reducir la concentración de dodecilsulfato de sodio hasta un nivel en el que la interleucina-2 forma agregados con dodecilsulfato de sodio, de modo que la composición, tras liofilización y reconstitución, tiene una turbidez específica (\tau) inferior a 1,1 cm^{2}/g.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, teniendo los agregados un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm.

7. El procedimiento según cualquier reivindicación anterior, reduciéndose la concentración de SDS mediante diafiltración.

8. El procedimiento según cualquier reivindicación anterior, que comprende además una etapa de: adición de manitol.

9. El procedimiento según cualquier reivindicación anterior, que comprende además una etapa de: liofilización.

10. Una composición que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio, estando presente la IL-2 y el dodecilsulfato de sodio en forma de agregados, y teniendo la composición una o varias de las características siguientes:

(i) la composición tiene una turbidez específica (\tau) inferior a 1,1 cm^{2}/g;

(ii) la composición contiene agregados de SDS/IL-2 con un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm;

(iii) la composición contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de IL-2; y/o

(iv) los agregados pueden obtenerse mediante el procedimiento según cualquier reivindicación anterior.

11. Una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio, pudiendo reconstituirse la composición con un medio acuoso para dar la composición según la reivindicación 10.

12. La composición según la reivindicación 10, siendo la turbidez específica de la composición inferior a 0,7 cm^{2}/g.

13. La composición según la reivindicación 12, estando la turbidez específica de la composición entre 0,3 cm^{2}/g y 0,6 cm^{2}/g.

14. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, comprendiendo la composición microagregados de SDS/IL-2 con un diámetro hidrodinámico entre 11 nm y 13 nm.

15. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, incluyendo la composición manitol a una concentración entre 40 mg y 50 mg de manitol por mg de IL-2.

16. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, siendo la IL-2 una IL-2 humana.

17. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, siendo la IL-2 una IL-2 des-alanil-1.

18. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, siendo la IL-2 una IL-2 serina-125.

19. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, siendo la IL-2, IL-2 humana des-alanil-1, serina-125.

20. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19, teniendo la IL-2 la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 1.

21. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 20, siendo la IL-2 no-glicosilada.

22. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 21, habiéndose purificado la IL-2 tras la expresión en un huésped procariota recombinante.

23. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 22, con una concentración de IL-2 de aproximadamente 1,1 mg/ml.

24. La composición liofilizada según la reivindicación 11 que, cuando está reconstituida con 1,2 ml de agua estéril para inyección, contiene en cada mililitro: 1,1 mg de IL-2 humana des-alanil-1, serina-125 no glicosilada; 50 mg de manitol; 0,18 mg de dodecilsulfato de sodio (SDS); 0,17 mg de fosfato de sodio monobásico; y 0,89 mg de fosfato de sodio dibásico a pH 7,5, estando la IL-2 y el SDS en forma de agregados de modo que la composición reconstituida tiene una turbidez específica (\tau) inferior a 1,1 cm^{2}/g.

25. Una composición farmacéutica acuosa que puede obtenerse reconstituyendo la composición liofilizada según la reivindicación 24 con 1,2 ml de agua estéril para inyección.

26. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 25, y un segundo agente farmacéutico, para la administración secuencial o por separado de manera simultánea.

27. Un kit que comprende (a) la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 25; y (b) un segundo agente farmacéutico.

28. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 25, para su uso en medicina.

29. El uso de una composición que comprende tanto interleucina-2 como dodecilsulfato de sodio en la fabricación de un medicamento para la administración a un paciente, estando presente la IL-2 y el dodecilsulfato de sodio en forma de agregados, y teniendo la composición una o varias de las características siguientes:

(iii) la composición contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de IL-2; y/o

(iv) los agregados pueden obtenerse mediante el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

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30. El uso según la reivindicación 29, siendo el medicamento para tratar cáncer.

31. El uso según la reivindicación 30, siendo el cáncer, carcinoma de células renales.

32. El uso según la reivindicación 31, siendo el cáncer melanoma.

33. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, habiéndose tratado previamente al paciente con un segundo agente farmacéutico.

34. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, administrándose conjuntamente el medicamento con un segundo agente farmacéutico.

35. El uso de un segundo agente farmacéutico en la fabricación de un medicamento de combinación para la administración a un paciente, habiéndose tratado previamente al paciente con la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 25.

36. El uso de un segundo agente farmacéutico en la fabricación de un medicamento de combinación para la administración a un paciente, administrándose conjuntamente el medicamento con la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 25.

37. El uso de (a) microagregados de interleucina-2 y dodecilsulfato de sodio según la reivindicación 10, y (b) un segundo agente farmacéutico, en la fabricación de un medicamento de combinación, teniendo los microagregados un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm.

38. La composición según la reivindicación 26, siendo el segundo agente farmacéutico un anticuerpo monoclonal.

39. La composición según la reivindicación 26, siendo el segundo agente farmacéutico un anticuerpo que proporciona ADCC.

40. La composición según la reivindicación 26, seleccionándose el segundo agente farmacéutico del grupo que constituido por: un anticuerpo anti-CD20; un anticuerpo anti-CD40; un anticuerpo anti-Her2; un anticuerpo anti-EGFR; y anticuerpo anti-VEGF; un anticuerpo anti-CD52; un anticuerpo anti-CD33; un agonista del receptor H2; bacilo de Calmette-Guerin; talidomida; lenalidomida; un inhibidor de proteasoma; una combinación de ciclofosfamida, vincristina y prednisona; una combinación de ciclofosfamida, hidroxidoxorubicina, vincristina y prednisona; una citocina; interferón \alpha; interferón \gamma; 5-fluorouracilo; un compuesto anti-retroviral; un inhibidor de la tirosina quinasa; y decitabina.

41. La composición según la reivindicación 40, siendo el agonista del receptor H2 histamina o una sal farmacéuticamente aceptable de histamina, tal como diclorhidrato de histamina.

42. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, siendo el segundo agente farmacéutico un anticuerpo monoclonal.

43. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, siendo el segundo agente farmacéutico un anticuerpo que proporciona ADCC.

44. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, seleccionándose el segundo agente farmacéutico del grupo constituido por: un anticuerpo anti-CD20; un anticuerpo anti-CD40; un anticuerpo anti-Her2; un anticuerpo anti-EGFR; y anticuerpo anti-VEGF; un anticuerpo anti-CD52; un anticuerpo anti-CD33; un agonista del receptor H2; bacilo de Calmette-Guerin; talidomida; lenalidomida; un inhibidor de proteasoma; una combinación de ciclofosfamida, vincristina y prednisona; una combinación de ciclofosfamida, hidroxidoxorubicina, vincristina y prednisona; una citocina; interferón \alpha; interferón \gamma; 5-fluorouracilo; un compuesto anti-retroviral; un inhibidor de la tirosina quinasa; y decitabina.

45. El uso según la reivindicación 44, siendo el agonista del receptor H2 histamina o una sal farmacéuticamente aceptable de histamina, tal como diclorhidrato de histamina.