KR20100014530A - 인간 ｉｌ-１８ 조합물을 투여하여 암을 치료하는 방법 - Google Patents

인간 ｉｌ-１８ 조합물을 투여하여 암을 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로, 각종 형태의 고형 종양 및 림프종을 치료하는 데에 있어서 인간 IL-18 조합물을 사용하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 (1) 인간 IL-18과 암 세포 표면 상에 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체와의 조합물; 및 (2) 인간 IL-18과 화학요법제와의 조합물에 관한 것이다.
인간 인터루킨 (IL)-18과 모노클로날 항체의 병용 요법, 인간 IL-18과 화학요법제의 병용 요법, 고형 종양, 림프종

Description

인간 ＩＬ-１８ 조합물을 투여하여 암을 치료하는 방법 {METHODS OF TREATING CANCER BY ADMINISTERING HUMAN IL-18 COMBINATIONS}
관련 출원에 대한 참고
본 출원은 2007년 7월 26일자로 출원된 미국 가특허원 제60/952,002호, 및 2007년 3월 23일자로 출원된 미국 가특허원 제60/896,855호에 대한 우선권을 청구하고 있다.
본 발명은 일반적으로, 인터페론-γ-유도성 인자 (IGIF)로서 공지되기도 한 IL-18을, 암 세포의 표면 상에 발현되는 모노클로날 항체와 조합하여 사용하거나 또는 암을 치료하기 위한 화학요법제와 조합하여 사용하는 것에 관한 것이다.
인터루킨-18 (IL-18)은 선천 면역 반응과 후천 면역 반응 둘 다에서 일정 역할을 하는 강력한 사이토킨이다. 전임상 연구에서, IL-18은 T-세포 및 천연 킬러 (NK) 세포에 의한 IFN-γ의 합성을 유도시키고, NK 세포와 세포독성 T 림프구 (CTL)의 세포용해 활성을 증대시키며, 활성화 CD4 T 세포가 조력 (helper) 효과기 세포로 분화되는 것을 증진시켜 주고 면역학적 기억을 유도시킨다. 광범위한 스펙트럼의 면역 자극 특성에 근거하여, IL-18은 각종 전임상 종양 모델에서 연구되어 왔다. 단일 요법으로서 사용된 IL-18의 항종양 활성은 면역원성인 종양에서 관찰되었다. MOPC-315 형질세포종 (고도로 면역원성인 종양)의 진행성 종양 (>100 ㎣) 모델에서 가장 강력한 항종양 효과가 관찰되었다. 종양은 통상적으로 비-면역원성이기 때문에, 전임상 연구는 IL-18과 모노클로날 항체 또는 화학요법제의 병용 요법에 집중되었다. 이들 연구 결과, 각각 상이한 종양 사멸 기전을 수반한 2가지 상이한 작용제를 병용해서 생기는 이득으로 인해 상승적 항종양 활성이 발생하는 것이 밝혀졌다.
활성 인간 IL-18은 157개 아미노산 잔기를 함유하고 있다. 이는 T 세포 및 비장 세포에 의한 인터페론-γ-생성 유도, NK 세포의 사멸 활성 증강 및 타고난 본래의 CD4+ T 세포의 Th1 세포로의 분화 증진을 포함한, 강력한 생물학적 활성을 갖고 있다. 또한, 인간 IL-18은 GM-CSF의 생성을 증대시키고 IL-1O의 생성은 저하시킨다. CD4+ T 세포는 모든 면역 반응에 있어 중추적인 조절 요소이다. 이는 2가지 서브세트, 즉 Th1 및 Th2로 나눠진다. 각 서브세트는 상이한 사이토킨을 분비할 수 있는 능력으로써 규정된다. 흥미롭게도, 분화를 위한 가장 강력한 유도인자는 사이토킨 그 자체이다. 타고난 본래의 전구체로부터의 Th2 세포의 발생은 IL-4에 의해 유도된다. IL-18을 발견하기 이전에는, IL-12가 주요 Th1 유도성 사이토킨으로서 여겨졌다.
Th1 세포는 IL-2, 인터페론-γ, 및 TNF-β를 분비한다. Th1 사이토킨의 기호인 인터페론-γ는 대식 세포에 직접적으로 작용하여 그들의 살미생물 활성과 포 식 활성을 증강시킨다. 그 결과, 활성화된 대식 세포는 세포내 병원체와 종양 세포를 효율적으로 파괴시킬 수 있다. Th2 세포는 B 세포가 항체-생산 세포로 되는 것을 도와줌으로써 작용하는, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13을 생성시킨다. 취합해 보면, Th1 세포는 주로 세포-매개형 면역에 대해 책임이 있는 반면, Th2 세포는 체액성 면역에 대해 책임이 있다.
광범위한 스펙트럼의 면역 자극 특성에 근거하여, IL-18은 각종 전임상 종양 모델에서 연구되어 왔다. 단일 요법으로서 사용된 IL-18의 항종양 활성은 면역원성인 종양에서 관찰되었다. MOPC-315 형질세포종 (고도로 면역원성인 종양)의 진행성 종양 (>100 ㎣) 모델에서 가장 강력한 항종양 효과가 관찰되었다. 이 모델에서는, 뮤린 IL-18 (5 mg/Kg)을 대략 30일 동안 매일 투여하면 재현 가능한 종양 퇴행과 치유가 야기되었다. 모 종양으로 다시 시험감염시키면 종양 거부가 발생하였는데, 이는 면역학적 기억이 유도되었다는 것을 제안하고 있다. 이러한 모델에서 세포성 면역이 연루되었다는 부가의 명백한 증거는 IL-18을 유사한 스케줄로 사용하는 경우에 퇴행되지 못하였던 진행성 MOPC-315 종양이 있는 중증 복합 면역결핍증 마우스 (SCID)에서 수행된 실험으로부터 비롯된다. IL-18 매개된 세포성 면역에 대해 추가로 뒷받침해주는 것은 또한, 대조군 및 IL-18 처리된 마우스 내에 정립된 MOPC-315 종양에 대해 수행된 면역조직화학으로부터이다. 이로써, 대조군과 비교해서 IL-18 처리된 동물에서는 CD8+ T 림프구, NK 세포, 활성화 대식 세포 및 수지상 세포로 이루어진 세포성 침윤물이 증가하였다는 것이 입증되었다. 시험관 내에서는, IL-18로 처리된 동물로부터의 PBMC 또는 비장 세포가 종양에 대항하여 NK 및 CTL 세포독성을 나타내었다. 또한, 본래의 Fas/Fas 리간드 경로가 항종양 반응에 유익한 것으로 여겨진다.
리툭시마브 (Rituximab)는 인간 IgG1 불변 영역과 융합된 인간 CD20 항원을 인식하는 뮤린 항원 결합 부위로 이루어지는 키메라 모노클로날 항체이다. 단일 작용제로서의 리툭시마브는 무통성 NHL에 있어서 상당한 활성을 나타내었다. 재발되었거나 난치성인 무통성 NHL 환자 166명을 대상으로 한 중추적 단일 지류 (arm) 임상 연구에서는, 전반적인 반응 비율이 48%였고 완전 반응 (CR) 비율은 6%였다 [참고: McLaughlin, et al., J. Clin. Oncol. 16:2825-2833 (1998)]. 기존에 처리되지 않은 무통성 NHL 환자에게서는, 리툭시마브 요법의 전반적인 반응 비율이 64 내지 73%였고 CR 비율은 15 내지 26%였다 [참고: Hainsworth, et al., Blood 95:3052-3056 (2000); Colombat, et al., Blood 97:101-106 (2001)]. 더우기, 다중 무작위화 제3상 연구 결과, 리툭시마브를 통상적인 화학요법에 부가하면 NHL 환자의 생존율이 개선된 것으로 밝혀졌다 [참고; Marcus, et al., Blood 105:1417-1423 (2005); Marcus, et al., Blood 104:3064-3071 (2004); Hiddemann, et al., Blood 106:3725-3732 (2005); Feugier, et al., J. Clin. Oncol. 23:4117-4126 (2005)]. 그러나, 화학요법에 따른 보다 높은 독성으로 인해, 리툭시마브를 이용한 단일 요법은 무통성 림프종 환자에게 여전히 선택 사항으로 간주되고 있다.
리툭시마브의 효능을 개선시키고 항종양 활성을 증강시키는 방식을 결정하기기 위한 연구가 진행중이다. 몇 가지 기전이 생체 내에서 리툭시마브의 효능에 기 여할 수 있다. 리툭시마브를 림프종 세포 표면 상의 CD20와 결합시키면 세포내 신호 전달 경로가 촉발되어 세포소멸 (apoptosis) 또는 프로그램된 세포 사멸이 유발될 수 있다 [참고: Shan, et al., Blood 91:1644-1652 (1998); Pedersen, et al., Blood 99:1314-1319 (2002)]. 더우기, 리툭시마브는 보체-의존성 세포용해를 유발시키는 보체 종을 활성화시킬 수 있다 [참고: Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003); Manches, et al., Blood 101:949-954 (2003)]. 그러나, 축적되는 명백한 증거는 ADCC가 리툭시마브의 투여 후에 종양 세포 제거에 있어서 가장 유력한 역할을 한다는 것을 제안하고 있다 [참고: Manches, et al., 상기 참고; Golay, et al., Haematologica 88:1002-1012 (2003); Clynes, et al., Nat. Med. 6:443-446 (2000)]. ADCC는 항체의 불변 (Fc) 영역이 효과기 세포, 예를 들어 NK 세포 또는 단구/대식 세포 계통의 세포 표면 상의 Fc 수용체와 결합하는 경우에 촉발된다.
인간 B 세포 림프종의 뮤린 모델에서는, 활성화 Fc 수용체가 결여된 마우스에서 리툭시마브의 효능이 폐기되었다. 이와는 달리, 모노클로날 항체 요법은 억제성 Fc 수용체가 결여된 마우스에서 증강되었다. Fc 수용체를 보유하고 있는 효과기 세포는 상기 모델에서 리툭시마브의 효능에 있어 결정적이었다. 인간에서의 주요 활성화 Fc 수용체는 CD16 (FcγRIIIA)인데, 이는 NK 세포 및 단구에 의해 발현된다. 위치 158에서 인간 FcγRIIIA 유전자 내의 다형증 (페닐알라닌 대 발린)은 리툭시마브에 대한 반응과 상관이 있는 것으로 밝혀졌다. 158VV 동형접합성 유전자형은 보다 강력한 IgG 결합성과 시험관 내에서 인간 NK 세포에 의한 ADCC의 촉발과 연관이 있고 [참고: Koene, et al., Blood 90:1109-1114 (1997); Dall'Ozzo, et al., Cancer Res. 64:4664-4669 (2004)], 또한 리툭시마브 요법 후의 보다 높은 반응 비율과 연관이 있다 [참고: Weng, et al., J. Clin. Oncol. 21:3940-3947 (2003); Cartron, et al., Blood 104:2635-2642 (2004)]. 이들 데이터는 NK 세포-매개된 ADCC가 림프종 환자에게서 리툭시마브 요법의 유효성을 위해 중요하다는 가설을 뒷받침해준다.
리툭시마브의 효능을 개선시키기 위한 한 가지 전략은 Fc 수용체-보유 효과기 세포, 예를 들어 NK 세포 및 단구/대식 세포 계통의 세포의 확장 및/또는 활성화를 유발시킬 수 있는 사이토킨을 투여하는 것이다. 제1상 임상 시험 결과, 리툭시마브를 IL-2, IL-12, 또는 GM-CSF와 병용해서 림프종 환자에게 안전하게 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다 [참고: Rossi, et al., Blood 106:2760 (abst 2432) (2005); McLaughlin, et al., Ann. Oncol. 16 (Suppl 5):v68 (abstr 104) (2005); Ansell, et al., Blood 99:67-74 (2002); Eisenbeis, et al., Clin. Cancer Res. 10:6101-6110 (2004); Gluck, et al., Clin. Cancer Res. 10:2253-2264 (2004); Friedberg, et al., Br. J. Haematol. 117:828-834 (2002)]. 이들 연구에서 전반적인 객관적 반응 비율 22 내지 79%와 완전 반응 비율 5 내지 45%가 관찰되었다. 또한, 바이오마커, 예를 들어 절대 NK 계수치 및 생체외 ADCC 활성이 반응 비율과 상관이 있었다. 대부분의 이들 연구는 주로 재발 및 난치성 질환 환자와 침습성이 강한 림프종 아유형 (DLBCL 및 외투 세포 림프종) 환자가 시험 대상이었다. 상황이 좋지 않은 이들 환자 집단에게서의 비교적 높은 객관적 반응 비율은 사이토킨과 리툭시마브의 조합물이 B 세포 림프종을 추가로 연구 조사하는 데에 있어 가치가 있다는 것을 나타낸다.
발명의 요약
한 국면에서, 본 발명은 (i) 담체와 함께 사용된 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1); 및 (ii) 암 세포 표면 상에 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 항체가 항체-의존성-세포-매개형 세포독성 (ADCC) 효과기 기능을 갖고 있고, 또한 상기 항체가 항-CD20 항체는 아닌 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 동시에 또는 순차적으로, 개별적으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
이러한 제1 방법은 CD22, CD19, HER2, HER3, EGFR [에르비툭스 (Erbitux)], 및 IGF-1R, AXL-1, FGFR, 인테그린 (integrin) 수용체, CEA, CD44, VEGFR의 군 중에서 선택된 항원에 대한 모노클로날 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 국면에서, 항원은 HER-2이고, 모노클로날 항체는 HERCEPTIN®이다. 부가적으로, 상기 방법은 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma), B-세포 비호지킨 림프종, 버킷 (Burkitt) 림프종, T-세포 비호지킨 림프종, AML, CLL, MM, 기타 백혈병, 난소암, 유방암, 폐암, 육종, 방광암, 췌장암, 갑상선암, 간세포암, 위암, 윌름 종양 (Wilms' tumor), 신경모세포종, 교모세포종 및 기타 뇌 종양, 결장암, 직장암, 전립선암, 흑색종, 신 세포 암종, 및 피부암의 군 중에서 선택되는 암을 치료하는 것을 포함한다.
제2 국면에서, 본 발명은 (i) 담체와 함께 사용된 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1); 및 (ii) 화학요법제를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 동시에 또는 순차적으로, 개별적으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에서의 화학요법제는 독실 (doxil), 토포테칸 (topotecan), DNA-변경 약물 [예: 카보플라틴 (carboplatin)], 항대사제 [예: 젬시타빈 (gemcitabine)], 세포 분열을 방지시키는 약물 [예: 빈크리스틴 (vincristine)] 및 항혈관형성제 [예: 파조파니브 (pazopanib)]의 군 중에서 선택될 수 있다. 상기 방법에서, 치료하고자 하는 암은 호지킨 림프종, B-세포 비호지킨 림프종, T-세포 비호지킨 림프종, 유방암, 폐암, 육종, 방광암, 갑상선암, 간세포암, 위암, 윌름 종양, 신경모세포종, 결장암, 결장직장암, 전립선암, 흑색종, 및 신 세포 암종의 군 중에서 선택된다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 암을 치료하는 데에 사용하기 위한, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1) 및 암 세포 표면 상에 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 항체가 항체-의존성-세포-매개형 세포독성 (ADCC) 효과기 기능을 갖고 있고, 또한 상기 항체가 항-CD20 항체는 아닌 조성물을 제공한다. hIL-18 폴리펩티드 (서열 1)와 상기 항체를 포함하는 조성물은 환자에게 개별적으로, 임의로 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 환자에게서 암을 치료하기 위한 의약을 제조하는 데에 있어서의, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1), 및 암 세포 표면 상에 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 모노클로날 항체가 항체-의존성-세포-매개형 세포독성 (ADCC) 효과기 기능을 갖고 있고, 또한 상기 항체가 항- CD20 항체는 아닌 조성물의 용도를 제공한다. hIL-18 폴리펩티드와 상기 항체는 환자에게 개별적으로, 임의로 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 환자에게서 암을 치료하기 위하여 암 세포 표면 상에 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체 (상기 모노클로날 항체가 항체-의존성-세포-매개형 세포독성 (ADCC) 효과기 기능을 갖고 있고, 또한 상기 항체가 항-CD20 항체는 아님)와 조합하여 사용하기 위한 의약을 제조하는 데에 있어서의, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1)를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 환자에게서 암을 치료하기 위한 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1)와의 조합물을 포함하는 조성물에 사용하기 위한 의약 제조에 있어서의, 암 세포 표면 상에 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체 (상기 모노클로날 항체가 항체-의존성-세포-매개형 세포독성 (ADCC) 효과기 기능을 갖고 있고, 항-CD20 항체는 아님)의 용도를 제공한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 (i) 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1); 및 (ii)암을 치료하는 데에 사용하기 위한 화학요법제를 포함하는 조성물을 제공한다. hIL-18 폴리펩티드 (서열 1)와 상기 화학요법제를 포함하는 조성물은 환자에게 개별적으로, 임의로 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 암 치료용 의약을 제조하는 데에 있어서의, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1) 및 화학요법제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. hIL-18 폴리펩티드 (서열 1)와 화학요법제는 환자에게 개별적으로, 임의로 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 암을 치료하기 위한 조성물에 대한 화학요법제와 조합하여 사용하기 위한 의약을 제조하는 데에 있어서의, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1)의 용도를 제공한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 암 치료에 있어서 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1)와의 조합물을 포함하는 조성물에 사용하기 위한 의약을 제조하는 데에 있어서의 화학요법제의 용도를 제공한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 인간 IL-18 (서열 1)을 화학요법제 또는 암 세포 표면 상에 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체와 조합하여 포함하며, 상기 항체가 항체-의존성-세포-매개형 세포독성 (ADCC) 효과기 기능을 갖고 있고 또한 상기 항체가 항-CD20 항체는 아닌 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 이에 의해 상기 환자에게서 장기간 생존 및/또는 암 재발 방지 및 면역학적 기억 유도가 발생하게 되는, 상기 환자에게서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
도 1은 천연 인간 IL-18 (서열 1)의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 2는 뮤린 IL-18 (서열 2)의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 3은 인간 B-세포 림프종 뮤린 모델에서 RITUXAN®과 병용한 mIL-18 (서열 2)의 항종양 활성을 도시한 것이다.
도 4는 도 3으로부터의 데이터를 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism®)을 사용하여 그래프화하고 분석한 경우에 통계적 유의성을 도시한 것이다. 구체적으로 언급하면, 본 도면은 이식 후 19일째에 종양 용적을 비교한 것이다.
도 5는 인간 B-세포 림프종 모델에서 뮤린 IL-18 (서열 2)/RITUXAN® 조합물의 이식 후 25일째의 종양 용적을 도시한 것이다.
도 6A 및 6B는 인간 B-세포 림프종 모델에서 뮤린 IL-18 (서열 2)/RITUXAN® 조합물의 중앙값 및 평균 종양 성장 용적을 도시한 것이다.
도 7 및 8은 작용제 단독과 비교한, 인간 B-세포 림프종 모델에서 뮤린 IL-18 (서열 2)/RITUXAN® 조합물의 이식 후 27일째의 종양 용적을 도시한 것이다.
도 9는 독소루비신 단독 및 IL-18 단독과 비교한, mIL-18 (서열 2)을 독소루비신과 조합하여 처리한 후의 EL-4 T-세포 생존율을 도시한 것이다.
도 10은 EL-4 T-세포 림프종 모델에서 제공된 약물의 용량과 항종양 활성 간의 관계를 나타내는, 도 9에서 입증된 데이터의 생존자 확률 플롯을 도시한 것이다.
도 11A 및 11B는 EL-4 T-세포 림프종 모델에서 mIL-18 (서열 2) 단독 및 독소루비신 단독과 비교한, 독소루비신/IL-18 조합물의 이식 후 13일째에 PBL (도 11A) 및 비장 세포 (도 11B)의 Facs 분석을 도시한 것이다.
도 12는 EL-4 T-세포 림프종 모델에서 IL-18 단독 및 독소루비신 단독과 비교한, 독소루비신/mIL-18 (서열 2) 조합물로 처리한 후 21시간째의 NK 세포독성 검정을 나타낸 것이다.
도 13은 MOPC315.D3j005 연구에서 SCID 마우스 내에서의 MOPC315 뮤린 형질세포종의 성장에 대한 mIL-18 (서열 2)과 HERCEPTIN®의 병용 요법 효과를 도시한 것이다 (데이터는 평균±SD로서 표현되었다).
도 14는 MOPC315.D3j005 연구에서 SCID 마우스 내에서의 MOPC315 뮤린 형질세포종의 성장에 대한 mIL-18 (서열 2)과 HERCEPTIN®의 병용 요법 효과를 도시한 것이다 (데이터는 중앙값±SD로서 표현되었다).
도 15는 SCID 마우스 내에서의 MOPC315 뮤린 형질세포종의 성장에 대한 mIL-18 (서열 2)과 HERCEPTIN®의 병용 요법을 이용한 경우에 이식 후 24일째의 종양 용적 상의 통계적 차이를 도시한 것이다 (데이터는 평균±SD로서 표현되었다).
도 16은 SCID 마우스 내에서의 MOPC315.D3j005 뮤린 형질세포종의 성장에 대한 mIL-18 (서열 2)과 HERCEPTIN®의 병용 요법을 이용한 경우에 이식 후 24일째의 종양 용적을 도시한 것이다 (데이터는 중앙값±SD로서 표현되었다).
도 17은 MOPC315.D3j03 연구에서 SCID 마우스 내에서의 MOPC315 뮤린 형질세포종의 성장에 대한 mIL-18 (서열 2)과 HERCEPTIN®의 병용 요법 효과를 도시한 것이다 (데이터는 평균±SD로서 표현되었다).
도 18은 MOPC315.D3j03 연구에서 SCID 마우스 내에서의 MOPC315 뮤린 형질세포종의 성장에 대한 mIL-18 (서열 2)과 HERCEPTIN®의 병용 요법 효과를 도시한 것 이다 (데이터는 중앙값±SD로서 표현되었다).
도 19는 MOPC315.D3j03 연구에서 mIL-18 (서열 2)과 HERCEPTIN®의 병용 요법으로부터 SCID 마우스 내에서의 이식 후 24일째의 MOPC315 형질세포종 용적을 도시한 것이다 (데이터는 평균±SD로서 표현되었다).
도 20은 MOPC315.D3j03 연구에서 mIL-18 (서열 2)과 HERCEPTIN®의 병용 요법으로부터 SCID 마우스 내에서의 이식 후 24일째의 MOPC315 형질세포종 용적을 도시한 것이다 (데이터는 중앙값±SD로서 표현되었다).
도 21은 접종 후 24일째에 동계 뮤린 Colo26 결장암 모델에서 mIL-18 (서열 2)과 5-플루오로우라실 (5-FU)의 병용 요법 효과를 도시한 것이다 (데이터는 평균±SD로서 표현되었다).
도 22는 접종 후 24일째에 동계 뮤린 Colo26 결장암 모델에서 mIL-18 (서열 2)과 5-FU의 병용 요법 효과를 도시한 것이다 (데이터는 중앙값±SD로서 표현되었다).
도 23은 접종 후 24일째에 동계 뮤린 Colo26 결장암 모델에서 mIL-18 (서열 2)과 5-FU의 병용 요법 효과를 도시한 것인데, IL-18 단독과 5-FU와의 조합물 간의 통계적 유의성을 보다 잘 관찰하기 위해 대조군은 제거하였다 (데이터는 평균±SD로서 표현되었다).
도 24는 동계 뮤린 Colo26 결장암 모델에서 mIL-18 (서열 2)과 5-FU의 병용 요법 효과를 도시한 것이다 (데이터는 중앙값±SD로서 표현되었다).
도 25는 동계 뮤린 Colo26 결장암 모델에서 mIL-18 (서열 2)과 5-FU의 병용 요법 효과를 도시한 것이다 (데이터는 평균±SD로서 표현되었다).
도 26은 접종 후 24일째에 동계 뮤린 Colo26 결장암 모델에서 mIL-18 (서열 2)과 5-FU의 병용 요법 효과를 도시한 것이다 [데이터는 카플란-마이어 (Kaplan-Meyer) 생존 곡선으로서 표현되었다].
도 27은 마우스 신 암종의 진행성 동계 모델에서 이식 후 32일째의 종양 성장에 대한, VEGFR 및 PDGFR 및 c-kit 티로신 키나제의 억제제인 파조파니브 (pazopanib) (GW786034)와 mIL-18 (서열 2)의 병용 요법 효과를 도시한 것이다 (c-Kit 수용체는 세포외 리간드 결합성 도메인과 세포내 키나제 도메인으로 이루어진 유형 III 티로신 키나제 수용체에 속한다. c-Kit 수용체는 광범위한 정상 조직과 종양 조직에서 발현된다).
도 28은 마우스 신 암종의 진행성 동계 모델에서 이식 후 32일째의 종양 성장에 대한 mIL-18 (서열 2)과 파조파니브 (GW786034)의 병용 요법 효과를 도시한 것이다 (단, 대조군은 제외된다). 본 그래프는 IL-18 또는 파조파니브 단독을 이용한 경우의 단일 요법에 대한 병용 요법의 통계적 유의성을 비교한 것이다.
도 29는 EL-4 종양 생존자 또는 타고난 본래의 대조군으로부터 세포의 양자 면역전달을 받은 IL-2-처리된 면역결핍증 마우스의 체중 증가를 도시한 것이다.
도 30은 EL-4 종양 접종 후 IL-2 요법을 이용한 Pfp/Rag2 수용자 마우스의 생존율을 도시한 것이다.
종양은 통상적으로 비-면역원성이기 때문에, 전임상 연구는 IL-18과 화학요법제 또는 모노클로날 항체와의 병용 요법에 집중되고 있다. 각각 상이한 종양 사멸 기전을 갖는 2가지 상이한 작용제를 조성물 중에서 조합한 경우에는 상승적 항종양 활성이 발생한다. IL-18 병용 요법의 4가지 실시예가 다음에 제시된다.
실시예 1은 IL-18을 인간 B-세포 림프종에서 RITUXAN®과 조합하여 사용하는 것에 초점을 맞추고 있다. 이러한 연구의 목표는 인간 B 세포 림프종 모델에서 IL-18과 RITUXAN®의 병용 요법이 IL-18 또는 RITUXAN® 단독을 이용하는 단일 요법에 비해 이득을 제공하는 지를 연구 조사하는 것이다. 리툭시마브는 인간 CD20 항원을 인식하는 뮤린 항원 결합 부위와 인간 IgG1 불변 영역으로 이루어진 승인된 키메라 모노클로날 항체이다. 생체 내에서 리툭시마브의 효능에 기여하는 작용 기전으로는 CD20-양성, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 및 항체-의존성 세포-매개형 세포독성 (ADCC)인, 림프종 세포와의 결합시 세포소멸을 유도시키는 것이 있다. 축적되는 명백한 증거는 ADCC가 리툭시마브의 투여 후에 종양 세포 제거에 있어서 가장 유력한 역할을 한다는 것을 제안하고 있다. ADCC는 항체의 불변 (Fc) 영역이 효과기 세포, 예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, T-세포, 또는 단구/대식 세포 계통의 세포 표면 상의 Fc 수용체와 결합하는 경우에 촉발된다. IL-18은 ADCC 효과기 세포를 증대시키고 활성화시키기 때문에, 이들 두 시약을 병용하면 상승 작용을 나타내어 탁월한 항종양 활성이 야기될 것으로 예상된다.
리툭시마브 (RITUXAN®)는 인간 IgG1 불변 영역과 융합된 인간 CD20 항원을 인식하는 뮤린 항원 결합 부위로 이루어지는 키메라 모노클로날 항체이다. CD20 항원은 악성 및 비악성 B 림프구 상에서 발현된다. 단일 작용제로서의 RITUXAN®은 NHL에 있어서 상당한 활성을 나타내고 있다. RITUXAN®는 시판되고 있다.
독소루비신 (아드리아마이신)은 시판되고 있는 화학요법제이고, 유방암, 림프종, 육종, 폐암, 방광암, 갑상선암, 간세포암, 위암, 윌름 종양, 신경모세포종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 난소암을 치료하기 위해 사용된다.
실시예 2는 EL-4 T-세포 림프종 모델에서 IL-18을 독소루비신과 병용하는 것을 나타낸다. 이러한 연구의 목표는 동계 EL-4 T-세포 림프종 종양 모델에서 IL-18과 독소루비신과의 병용 요법을 연구 조사하고, IL-18 또는 독소루비신 단독을 이용하는 단일 요법에 비해 상기 병용 요법의 이득을 입증하기 위한 것이다. 이러한 동계 모델에서는 숙주의 면역 세포에 대한 IL-18 면역자극 활성의 완전한 이득이 나타났다. 두 가지 시약은 극히 상이한 작용 기전을 갖고 있기 때문에, 이들은 서로 상보적일 수 있어 항종양 활성이 증가될 수 있다. 이는 상기 화학요법제는 종양 항원의 직접적인 세포독성, 단편화 및 조정을 제공하는 반면, IL-18은 효과기 세포를 증대시키고 활성화시켜 탁월한 항원 제시와 상승적 항종양 활성을 발생시킨다는 것을 제안하고 있다.
IL-18을 조성물 중에 모노클로날 항체와 조합하면, 예를 들어 IL-18을 리툭시마브 (RITUXAN®)와 병용하면, 말기 종양 모델 (SCID 마우스 이종이식편)에서 상승적 항종양 활성이 나타났다. 리툭시마브는 인간 CD20 항원을 인식하는 뮤린 항원 결합 부위와 인간 IgG1 불변 영역으로 이루어진 승인된 키메라 모노클로날 항체이다. 단일 작용제로서의 리툭시마브는 무통성 비호지킨 림프종에서 상당한 활성을 나타낸다. 생체 내에서 리툭시마브의 효능에 기여하는 작용 기전으로는 CD20-양성, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 및 항체-의존성 세포-매개형 세포독성 (ADCC)인, 림프종 세포와의 결합시 세포소멸을 유도시키는 것이 있다. 실시예 1에 제시된 전임상 데이터는 IL-18을 리툭시마브와 병용하면 상승적 항종양 활성이 발생한다는 것을 입증하고 있다. 리툭시마브는 CD20을 발현하는 인간 종양 세포와만 결합하기 때문에, 항종양 활성의 평가는 SCID 마우스 이종이식편 모델로 제한되었다. IL-18과 리툭시마브의 항종양 활성과 상승 작용은 IL-18 및 뮤린 CDC에 반응하여 SCID 마우스에서 활성화되는 NK 세포 때문인 것으로 여겨진다. SCID는 T 세포를 활성화시킬 수 있는 능력이 없기 때문에, 잠재적 CTL 증대와 기억 발생의 지류는 본 모델에서 시험할 수 없다.
IL-18을 조성물 중에 화학요법제와 조합하면 각종 형태의 암을 치료하는 데에 유리한 치료 효과를 나타낼 것으로 예상된다. 예를 들어, 실시예 2는 IL-18을 독소루비신과 병용하면 동계 진행성 EL4 T-세포 림프종 종양 모델에서 상승적 항종양 활성이 유발된다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 IL-18의 작용 기전에 항종양 활성에 있어 중요한 역할을 하는 항종양 CTL 및 NK 세포의 탁월한 항원 제시, 확장이 포함된다는 것을 제안하고 있다. 이들 결과를 근거로 하여, IL-18을 기타 화학요법제와 병용하면 종양 퇴행, 종양 치유 및 면역학적 기억 유도가 발생할 것으로 예상된다.
임상 시험에서는, IL-18 단일 요법이 바이오마커 변화로써 측정된 바와 같이 안전하고, 널리 관용되며 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌다. 전임상적으로, IL-18 단일 요법은 면역-민감성 종양 모델에서만 작용하였다. 비면역원성 모델은 IL-18을 기타 항암제와 병용한 경우에만 항종양 활성을 나타내었다.
재조합 뮤린 IL-18 (서열 2)은 CD4+, CD8+, 및 NK 세포 뿐만 아니라 Fas/FasL 경로 및 사이토킨/케모카인, 예를 들어 INFγ, GM-CSF, IP-1O, MCP-1의 활성화, 및 종양 내의 효과기 세포의 침윤 및 면역학적 기억 유도를 포함한 각종 기전을 통하여 전임상 항종양 활성을 갖고 있는 것으로 입증되었다. IL-18의 이점, 예를 들어, 세포독성 T 세포의 유도, NK 세포 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 있어서 중요한 역할을 하는 세포의 확장이 본 발명자들의 전임상 모델에서 입증되었다.
다음 실시예는 IL-18를 기타 임상적으로 관련된 암 치료와 병용하면 인간 IL-18 단일 요법 단독에 비해 탁월한 증강된 항종양 활성이 유발될 수 있는지를 알아보기 위해 연구 조사하였다. 본원에는 IL-18 병용 요법의 5가지 예가 예시되어 있다: (1) 인간 B 세포 림프종 이종이식편 모델에서 IL-18과 RITUXAN®의 병용 요법; (2) 동계 T-세포 림프종 모델에서 IL-18과 독소루비신의 병용 요법; (3) 뮤린 형질세포종 모델에서 IL-18과 HERCEPTIN®의 병용 요법; (4) 뮤린 결장 종양 모델에서 IL-18과 5-FU의 병용 요법; 및 (5) 신 암종의 뮤린 모델에서 IL-18과 VEGFR, PDGFR, 및 c-kit 티로신 키나제의 억제제인 파조파니브의 병용 요법. 이들 병용 요법 모두는 IL-18, RITUXAN®, 독소루비신, HERCEPTIN®, 5-FU, 또는 파조파니브 단독을 이용한 단일 요법에 비해 이점을 제공하였다.
모노클로날 항체와의 병용 요법은 ADCC의 종양 세포 사멸 기전을 증강시킬 수 있는 잠재력을 제공해준다. 본원에 기재된 전임상 데이터는 이러한 기전을 뒷받침해주고, mIL-18 (서열 2)과 병용한 RITUXAN®의 항종양 활성 증강을 보여주었다. 몇 가지 기전이 RITUXAN®의 효능에 기여할 수 있지만, 축적되는 명백한 증거는 ADCC가 RITUXAN®의 투여 후에 종양 세포 제거에 있어서 가장 유력한 역할을 한다는 것을 제안하고 있다. ADCC는 항체의 불변 (Fc) 영역이 효과기 세포, 예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포 또는 단구/대식 세포 계통의 세포 표면 상의 Fc 수용체와 결합하는 경우에 촉발된다. 인간 B 세포 림프종의 뮤린 모델에서는, 활성화 Fc 수용체가 결여된 마우스에서 RITUXAN®의 효능이 폐기되었다 [참고: Cartron, et al., Blood 99:754-758 (2002); Dall'Ozzo, et al. Cancer Res 64:4664-4669 (2004); Koene, et al. Blood 90:1109-1114 (1997); Weng, et al. J Clin Oncol 21:3940-3947 (2003)]. 따라서, Fc 수용체를 보유하고 있는 효과기 세포는 RITUXAN®의 효능에 있어 결정적이었다. CD16 (FcγRIIIA)은 인간에게 있어서 중요한 Fc 수용체는 인데, 이는 NK 세포 및 대식 세포에 의해 발현된다. 실시예 1에서의 데이터는 NK 세포-매개된 ADCC가 림프종 환자에 있어서 RITUXAN® 요법의 유효성에 있어 중요하다는 가설을 뒷받침하고 있다.
RITUXAN®의 효능을 개선시키기 위한 본 발명자들의 두드러진 전략은 Fc 수용체를 보유하고 있는 효과기 세포, 예를 들어 NK 세포 및 단구/대식 세포 계통의 세포의 확장 및/또는 활성화를 유발시킬 수 있는 IL-18과 같은 사이토킨을 투여하는 것이다. 실시예 1에서 IL-18을 RITUXAN®과 조합하여 사용한 전임상 마우스 종양 모델 연구는 단일 요법에 비해 이점을 나타내었다. 이 모델에서, IL-18의 완전한 이점은 시험될 수 없었는데, 이는 NK 작용성 세포 만을 갖는 SCID 면역 기능저하 마우스 내의 인간 이종이식편을 획득하였기 때문이다. 그러나, 실시예 1의 데이터는 이들 ADCC NK 유효기 세포의 확장이 IL-18과 RITUXAN®의 병용 요법에 있어 유익하였다는 것을 뒷받침해준다. RITUXAN®은 시험된 가장 높은 용량에서 단일 요법으로서 활성이었다. 그러나, 보다 낮은 용량의 RITUXAN®을 mIL-18 (서열 2)와 조합하여 사용한 경우에도 유사한 수준의 활성이 관찰될 수 있었는데, 이는 상기 모델이 RITUXAN®의 기전에 민감하였다는 사실과, 해당 반응이 IL-18에 의해 증강될 수 있었다는 사실을 나타낸다. IL-18을 CD22, CD19, HER2, HER3, EGFR (에르비툭스), IGF-1R, AXL-1, FGFR, 인테그린 수용체, CEA, CD44 및 VEGFR 등의 항원에 대한 기타 모노클로날 항체, 및 기타 항혈관형성제와 병용하면 동일한 상승 효과가 나타난 것으로 여겨진다. 사실상, 그에 대한 모노클로날 항체를 생성시키는 수용체를 발현하는 종양 세포의 표면 상에 발견되는 항원에 대한 기타 모노클로날 항체를 IL-18과 유사하게 병용하면 동일한 방식으로 작동되는 것으로 추가로 고려된다. 이상적으로는, 이러한 수용체가 NK 세포, 단구, 대식 세포, B-세포, T-세포, 및 Fc 수용체를 함유하고 ADCC 효과기 활성에 참여하는 기타 모든 세포와 결합할 것이다.
실시예 1 및 2의 데이터는 항암제를 IL-18과 병용하면 임상적으로 유익할 수 있는데, 이는 이들 병용 요법이 2가지 상이한 작용 기전을 제공하기 때문인데, 즉 한 가지는 종양 세포에 대한 직접적인 효과인 반면, IL-18은 환자의 면역 세포를 증대시킬 수 있다는 것을 제안하고 있다. 이들 두 기전은 서로 상보적일 수 있으므로, 잠재적으로는 면역학적 기억을 생성시킬 수 있는 IL-18의 능력으로 인해 오래 지속되고 탁월한 항종양 활성이 발생할 수 있었다. 전반적으로, 실시예 1 및 2는 IL-18을 모노클로날 항체 또는 화학요법제인 항종양제와 병용하면 상승적이면서 탁월한 활성이 발생한다는 것을 입증하고 있다.
IL-18을 화학요법제 독소루비신과 병용하면 IL-18 또는 독소루비신 단독에 비해 탁월한 항종양 활성이 나타났다. 특히, 실시예 2는 IL-18을 독소루비신과 병용하면 IL-18 처리에 반응하여 확장되는 활성화된 면역 세포를 파괴시키지 못하였다는 것을 보여준다. 놀랍게도 이와는 달리, 실시예 2는 상기 병용 요법이 활성화된 T 및 NK 세포를 증대시키고, 그들의 세포용해 기능을 유지한다는 것을 입증하고 있다.
실시예 3은 CD20+ B 세포 비호지킨 림프종 (NHL) 환자에게서 리툭시마브와 병용한 IL-18의 안전성과 생물학적 활성을 평가하기 위한 연구가 현재 진행되고 있는 제1상 임상 프로토콜이다. 이러한 연구는 선별된 바이오마커 (예를 들어, 활성화 NK 세포)에 의해 입증된 바와 같이, 안전하고 면역관용되며 최대 생물학적 효과를 제공해주는 용량을 확인하기 위해 증가 용량의 IL-18과 병용하는 리툭시마브의 표준 치료 섭생을 이용한다. 본 연구로부터 선별된 용량이 재발된 소포 림프종 환자에게서 IL-18/리툭시마브 병용 요법의 효능을 평가하는 추가의 제2상 연구에 사용될 것이다. 전이성 흑색종 환자에 대한 단일 요법으로서 투여되는 경우의 IL-18의 우수한 안전성과 면역관용성 프로파일이 제공된다면, 상기 병용 요법의 최대 면역관용 용량 (MTD)이 현 연구에서 도달할 것으로 예상되지 않지만, 상기 연구는 비호지킨 림프종 환자에게서 용량-제한성 독성이 확인되는 경우에는 MTD를 규정하도록 설계된다.
실시예 4는 뮤린 형질세포종 [ErbB2 (HER2)로 형질감염된 MoPC315 세포]의 성장에 대한 인간 IL-18과 HERCEPTIN®의 병용 요법에 대한 분석 및 데이터를 제공한다. 데이터를 상세히 분석한 결과, IL-18과 HERCEPTIN®의 병용 요법은 HERCEPTIN® 단독을 이용한 단일 요법을 능가하는 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터에 근거하여, 인간 IL-18을 종양 세포 상에서 발현되는 항원의 기타 항체와 병용하는 것이 치료적으로 유효할 것으로 여겨진다.
실시예 5는 5-플루오로우라실 (5-FU), 또는 mIL-18 단독을 이용한 단일 요법과 비교해서 IL-18과 5-FU의 병용 요법의 효능을 평가한다. 5-FU는 결장직장암과 췌장암을 치료하기 위한 1차 화학요법 중의 하나로서 현재 임상에서 사용되고 있는 피리미딘 유사체이다. 그러나, 이러한 화학요법은 여러 가지 심각한 부작용을 갖고 있고, 기타 작용제와의 병용 요법을 이용하여 그의 용량을 낮출 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 연구는 BALB/c 마우스 중의 널리 확립된 뮤린 결장 암종 Colo26의 동계 피하 모델에서 수행되었다. 실시예 5에서 종양 용적 데이터를 상세히 분석한 결과, 10 ㎍의 IL-18과 75 ㎍의 5-FU의 병용 요법이 대조군과 비교해서 종양 성장에 대해 상당한 효과를 나타내는 유일한 치료군인 것으로 밝혀졌다. 이는 상기 병용 요법 (75 ㎍/10 ㎍)이 5-FU 단독을 이용한 단일 요법 군, 또는 mIL-18 단독을 이용한 단일 요법 군을 능가하였다는 것을 의미하는데, 이는 단일 요법이 대조군 보다 우수한 치료 효과를 나타내지 못했기 때문이다. 기타 화학요법제, 예를 들어 독실, 토포테칸, DNA-변경 약물 (예: 카보플라틴), 항대사제 (예: 젬시타빈), 세포 분열을 방지시키는 약물 (예: 빈크리스틴) 및 항혈관형성제 (예: 파조파니브)를 IL-18과 병용한다.
실시예 6은 마우스 신 세포 암종 모델에서 IL-18과 VEGFR, PDGFR, 및 c-kit 티로신 키나제의 억제제인 파조파니브 (GW786034)의 병용 요법의 효능에 관한 연구를 제공한다. c-Kit 수용체는 세포외 리간드 결합성 도메인과 세포내 키나제 도메인으로 이루어진 유형 III 티로신 키나제 수용체에 속한다. c-Kit 수용체는 광범위한 정상 조직과 종양 조직에서 발현된다. 이들 데이터는 파조파니브를 IL-18과 병용하면 각 단일 요법 단독과 비교해서 통계상 유의적인 항종양 활성 (상승 작용)이 발생한다는 것을 나타낸다.
실시예 7은 장기간 생존과 종양 재발 방지를 가져다 주는 기억 유도인자로서의 IL-18의 역할에 역점을 둔 연구이다. 본 실시예는 EL-4 종양 모델에서의 효능을 시험하는데, 뮤린 IL-18 (서열 2)을 독소루비신과 병용함으로써 마우스를 처리하였다. 생존자 림프관 세포를 투여한 EL-4 수용자 마우스는 정상적인 타고난 본래의 공여자로부터의 림프관 세포를 투여한 대조군 마우스 보다 상당히 장기간 생존하였다. 이러한 데이터는 생존자 마우스로부터의 양자 면역전달이 EL-4 종양 수용자에 대한 보호 효과를 나타내었다는 것을 암시한다. 이들 데이터는 EL-4 종양 생존자에서 기억 T 세포의 간접적인 입증을 제공해준다 (도 29 및 30). 이는 화학요법제 또는 mAb와 IL-18을 병용하는 것이 어떠한 단일 요법에 비해 탁월한 암 치료를 제공해줄 수 있었다는 중요한 발견이다. 종양을 "외래"로서 인식하고 재발을 방지시켜 줄 수 있는 기억 T 세포의 유도가 고도로 유리할 것이며, 모든 잠재적 병용 요법에 대한 약물인 IL-18은 그의 안전성 프로파일이 우수하다.
인간 IL-18 폴리펩티드는 EP 0692536A2, EP 0712931A2, EP0767178A1, 및 WO 97/2441에 기재되어 있다. 천연 인간 IL-18 ("hIL-18")의 아미노산 서열이 서열 1에 제시된다. 인간 IL-18 폴리펩티드는 인터페론-γ-유도성 폴리펩티드이다. 이는 T 세포 및 비장 세포에 의한 인터페론-γ-생성 유도, NK 세포의 사멸 활성 증강 및 타고난 본래의 CD4+ T 세포의 Th1 세포로의 분화 증진을 포함한, 세포-매개형 면역 유도에 있어서 중요한 역할을 한다.
본 발명의 폴리펩티드는 널리 공지된 방법, 예를 들어 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 단백질을 리폴딩하는 것으로 널리 공지된 기술을 이용하여 해당 폴리펩티드가 세포내 합성, 분리 및/또는 정제 동안 변성되는 경우에 활성 입체 형태를 재생시킬 수 있다. 활성 인간 IL-18을 정제 및 생성시키는 방법이 WO 01/098455에 제시된다.
본 발명은 또한, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1) 및 그의 조합물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 치료적 유효량의 화합물을 포함하고, 제약상 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 제약 담체는 멸균성 액체, 예를 들어 물 및 오일, 예를 들면 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원 (예: 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등)일 수 있다. 물은 제약 조성물을 정맥내 투여하는 경우에 담체로서 사용될 수 있다. 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을, 예를 들어 주사 용제용 액상 담체로서 이용할 수 있다. 적합한 제약 부형제에는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 쵸크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 경우에 따라, 조성물은 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 이들 조성물은 용제, 현탁제, 에멀션, 정제, 환제, 캅셀제, 산제, 지속-방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예를 들어 트리글리세라이드를 수반한 좌제로서 제형화할 수 있다. 경구 제형에는 표준 담체, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등이 포함될 수 있다. 적합한 제약 담체의 예가 문헌 [참고: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES by E. W. Martin]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 종종 정제된 형태의 치료적 유효량의 화합물을, 환자에게 적당히 투여하기 위한 형태를 제공하는 데에 적합한 양의 담체와 함께 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
본 발명의 한 양태에서, 조성물은 인간에게 정맥내 투여하도록 적응시킨 제약 조성물로서 통상적인 과정에 따라서 제형화한다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균성 등장성 수성 완충제 중의 용제이다. 적합한 경우, 조성물에는 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 국소 마취제 (예: 리그노카인) 및 가용화제가 포함될 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 기밀 용기, 예를 들어 활성 작용제의 양을 표시하는 앰풀 또는 작은 봉지 내에 무수 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 개별적으로 또는 함께 혼합되어 단위 투여 형태로 제공된다. 조성물을 주입에 의해 투여하는 경우에는, 멸균성 제약 등급 수 또는 식염수를 함유하는 주입 병을 이용하여 투약할 수 있다. 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우에는, 주사용 멸균수 또는 식염수 앰풀을 제공하여 성분들이 투여에 앞서 혼합될 수 있도록 한다.
따라서, 폴리펩티드를 의약 제조에 사용할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 비경구 투여용 용제 또는 동결건조된 분말로서 제형화할 수 있다. 분말은 사용에 앞서 적합한 희석제 또는 기타 제약상 허용 가능한 담체를 부가함으로써 재구성할 수 있다. 액상 제형은 완충된 등장성 수성 용제일 수 있다. 적합한 희석제의 예는 정상 등장성 식염수, 수중 표준 5% 덱스트로스, 또는 완충 나트륨 또는 암모늄 아세테이트 용액이다. 이러한 제형은 비경구 투여용으로 특히 적합하지만, 경구 투여용으로 사용할 수 있거나 또는 계량식 흡입기 또는 흡입용 분무기에 함유될 수도 있다. 이러한 제약 조성물에 부형제, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 히드록시 셀룰로스, 아카시아, 폴리에틸렌 글리콜, 만니콜, 염화나트륨 또는 나트륨 시트레이트를 부가하는 것이 요망될 수 있다.
또 다른 한편, 폴리펩티드를 피막화하거나, 정제화하거나 또는 경구 투여를 위해 에멀션 또는 시럽 내에 제조할 수 있다. 제약상 허용 가능한 고형 또는 액상 담체를 가하여 조성물을 증강 또는 안정화시킬 수 있거나, 또는 조성물의 제조를 촉진시킬 수 있다. 고형 담체에는 전분, 락토스, 황산칼슘 이수화물, 백토 (terra alba), 마그네슘 스테아레이트 또는 스테아르산, 탈크, 펙틴, 아카시아, 한천 또는 젤라틴이 포함된다. 액상 담체에는 시럽, 땅콩유, 올리브유, 식염수 및 물이 포함된다. 담체에는 또한, 지속 방출 물질, 예를 들어 단독으로 사용되거나 왁스와 함께 사용되는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 포함될 수 있다. 고형 담체의 양은 다양하지만, 투여 단위당 약 20 mg 내지 약 1 g일 것이다. 제약 제제는 조제학 분야의 통상적인 기술, 예를 들어 정제 형태의 경우에는 분쇄, 혼합, 과립화 및 경우에 따라 압착시키는 기술; 또는 경질 젤라틴 캅셀제 형태의 경우에는 분쇄, 혼합 및 충전 기술에 따라서 만든다. 액상 담체를 사용하는 경우에는, 제제가 시럽, 엘릭서제, 에멀션, 또는 수성 또는 비수성 현탁제의 형태일 것이다. 이러한 액상 제형은 구강 내로 직접 투여하거나 또는 연질 젤라틴 캡슐 내로 충전시킬 수 있다.
인간 IL-18 폴리펩티드는 제약상 허용 가능한 담체 중의 활성 성분으로서 유효량의 폴리펩티드를 함유하는 제약 조성물로서 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물에서는, 생리적 pH로 완충된, 즉시 주사 가능한 형태의 상기 폴리펩티드를 함유하는 수성 현탁제 또는 용제를 이용할 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 제약상 허용 가능한 담체, 예를 들어 수성 담체에 용해된 본 발명의 폴리펩티드의 용제 또는 그의 칵테일을 통상 포함할 것이다. 각종 수성 담체, 예를 들어 0.4% 식염수, 0.3% 글리세린 등을 이용할 수 있다. 이들 용제는 멸균성이고, 일반적으로 미립형 물질이 없다. 이들 용제는 통상적이고 널리 공지된 멸균 기술 (예: 여과)에 의해 멸균시킬 수 있다. 조성물은 생리적 조건에 근사하도록 요구되는 바와 같은 제약상 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 pH 조정제 및 완충제 등을 함유할 수 있다. 이러한 제약 제형 중의 본 발명의 폴리펩티드의 농도는 광범위할 수 있는데, 즉 약 0.5% 미만, 통상적으로 약 1% 이상 내지 15 또는 20 중량% 정도일 수 있고, 선택된 특별한 투여 방식에 따라서 주로 유체 용적, 점도 등을 기준으로 하여 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주사용 본 발명의 제약 조성물은 1 ml의 멸균성 완충수와, 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 폴리펩티드를 함유하도록 제조할 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입용 본 발명의 제약 조성물은 약 250 ml의 멸균성 링거액과, 약 1 mg 내지 약 30 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 폴리펩티드를 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구적으로 투여 가능한 조성물을 제조하기 위한 실제적 방법은 널리 공지되어 있거나 또는 당업자에게 명백하고, 예를 들어 다음 문헌에 보다 상세히 기재되어 있다 [참고: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania].
본 발명의 폴리펩티드는 제약 제제로 제조하는 경우에, 단위 용량 형태로 제시될 수 있다. 적당한 치료적 유효 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 이러한 용량은 적합한 경우, 반응 기간 동안 의사에 의해 적당한 수준으로 선택된 적당한 시간 간격으로 반복 투여할 수 있다. 또한, 시험관내 검정을 임의로 이용하여 최적의 투여량 범위를 확인하는 것을 도와줄 수 있다. 제형 내에 이용될 정확한 용량은 또한, 투여 방식, 및 질병 또는 장애의 중증도에 좌우될 것이며, 실행자의 판단과 각 환자의 상황에 따라서 결정해야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽할 수 있다.
폴리펩티드의 경우, 환자에게 투여되는 투여량은 전형적으로, 환자 체중 1 kg당 0.1 mg 내지 100 mg이다. 환자에게 투여된 투여량은 환자의 체중 1 kg당 0.1 mg 내지 20 mg, 또는 또 다른 한편, 환자의 체중 1 kg당 1 mg 내지 10 mg일 수 있다. 일반적으로, 인간 폴리펩티드는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해 기타 종으로부터의 폴리펩티드 보다 인체 내에서 보다 긴 반감기를 갖고 있다. 따라서, 인간 폴리펩티드의 보다 낮은 투여량과 보다 적은 투여 횟수가 종종 가능하다. 추가로, 본 발명의 폴리펩티드의 투여량과 투여 횟수는 변형, 예를 들어 지질화에 의해 폴리펩티드의 흡수와 조직 침투 (예를 들어, 뇌로의 침투)를 증강시킴으로써 감소시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 제약 조성물의 한 가지 이상 성분들로 충전된 1개 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 또는 키트를 제공한다. 임의로, 상기 용기(들)에는 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 지정된 형태의 통지서가 부착될 수 있는데, 이러한 통지서는 인간 투여용으로 제조, 사용 또는 판매되었다는 정부 기관의 승인을 반영하고 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 키트에는 특별한 적응증을 치료하기 위해 요구되는 투여량을 충족시키기 위해 요구되는 적당한 수의 용기가 제공될 수 있다.
또 다른 양태에서, 화합물 또는 조성물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 [참고: Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat, et al., in LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; 및 동일 책자].
또 다른 양태에서, 화합물 또는 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달할 수 있다. 한 양태에서는, 펌프를 사용할 수 있다 [참고: Langer, 상기 참고; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald, et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek, et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)]. 또 다른 양태에서, 중합체성 물질을 사용할 수 있다 [참고: MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger, et al., J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); Levy, et al., Science 228:190 (1985); During, et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard, et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)]. 또 다른 양태에서, 제어 방출 시스템을 치료 표적, 즉 뇌에 근접하여 위치시킴으로써, 단지 적은 양의 전신 용량 만이 요구될 수 있다 [참고: 예를 들어, Goodson, in MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)]. 기타 제어 방출 시스템이 다음 문헌에 고찰되어 논의되어 있다 [참고: Langer, Science 249:1527-1533 (1990)].
인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1)는 적당한 모든 내부 경로에 의해 투여할 수 있고, 필요에 따라 반복해서 투여할 수 있는데, 예를 들어 1일 내지 약 3주 동안 1일 1회 내지 3회 정도로 자주 내지는 매주 1회 또는 2주에 1회 정도 투여할 수 있다. 또 다른 한편, 펩티드는 전하 밀도를 감소시키도록 변경시킴으로써, 경구 생체내 이용 효율을 인정할 수 있다. 치료 용량 및 기간은 인간 신체 순환시의 본 발명의 분자의 상대적 기간에 관한 것이고, 치료하고자 하는 질환 및 환자의 일반적인 건강 상태에 따라서 당업자에 의해 조정될 수 있다.
본 발명은 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1)를 포함하는 본 발명의 제약 조성물 또는 화합물의 유효량을 인간 환자에게 투여함으로써 치료, 억제 및 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 양태에서, 화합물은 실질적으로 정제된다 (예를 들어, 그의 효과를 제한하거나 바람직하지 못한 부작용을 야기시키는 물질이 실질적으로 없다). 제형 및 투여 방법은 해당 화합물이 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 경우에 이용할 수 있고; 부가의 적당한 제형 및 투여 방식은 다음에 기재된 것 중에서 선택될 수 있다.
각종 전달 시스템이 공지되어 있고, 이를 사용하여 본 발명의 화합물을 투여할 수 있는데, 예를 들면 리포솜, 미립자, 미소캡슐, 상기 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포 내에서의 피막화, 수용체-매개된 세포내 이입 [참고: 예를 들어, Wu, et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)], 레트로바이러스성 또는 기타 벡터의 일부로서의 핵산 구축 등이 있다. 도입 방법에는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막 및 경구 경로가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 화합물 또는 조성물은 통상적인 모든 경로, 예를 들어 주입 또는 거환 주사, 상피 또는 피부점막 내층 (예: 경구 점막, 직장 및 내장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있고, 기타 생물학적 활성제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신 또는 국소적일 수 있다. 또한, 본 발명의 제약 화합물 또는 조성물을 적합한 모든 경로, 예를 들어 심실내 및 수막강내 주사에 의해 중추 신경계 내로 도입하는 것이 요망될 수 있고; 심실내 주사는, 예를 들어 저장고 [예: 옴마야 (Ommaya) 저장고]에 부착된 심실내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 예를 들어 흡입기 또는 분무기를 사용하고 에어로솔화제를 수반한 제형을 사용함으로서, 폐 투여를 이용할 수도 있다.
본 발명은 본 발명의 요지 또는 본질적 특징으로부터 벗어나지 않고서도 기타 구체적 형태를 실시할 수 있으므로, 본 발명의 범위를 표시하는 것으로, 전술된 명세서 또는 다음 실시예가 아닌 첨부된 청구의 범위를 기준으로 해야 한다.
용어집
지금까지 자주 사용되어 온 특정의 용어들을 잘 이해하기 위해 다음 정의가 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체-의존성 세포-매개형 세포독성 (ADCC)" 및 "항체-의존성 세포-매개형 세포독성 (ADCC) 효과기 기능"은 둘 다 세포 매개형 면역 기전에 관한 것으로, 이로써 면역계의 효과기 세포가 특이적 항체에 의해 결합된 표적 세포를 활발히 용해시킨다. ADCC는 체액성 면역 반응의 일부로서의 항체가 감염을 제한하고 억제하는 작용을 할 수 있는 기전 중의 하나이다. 전통적인 ADCC는 천연 킬러 (NK) 세포에 의해 매개되지만, 또 다른 ADCC는 연충 (helminth)으로서 공지된 특정의 기생충을 사멸시키기 위한 호산구에 의해 사용된다. ADCC는 선행 항체 반응에 대한 그의 의존성으로 인해 양자 면역 반응의 일부이다.
전형적인 ADCC는 NK 세포의 활성화를 포함하고, NK 세포의 표면 상의 Fc 수용체에 의한 항체-피복된 감염 세포의 인식에 의존적이다. Fc 수용체는 병원체-감염된 표적 세포의 표면과 결합하는 항체 (예: IgG)의 Fc (불변) 부분을 인식한다. NK 세포의 표면 상에 존재하는 Fc 수용체는 CD16 또는 FcγRIII로 지칭된다. IgG의 Fc 수용체와 일단 결합하면, 천연 킬러 세포는 사이토킨, 예를 들어 IFN-γ, 및 표적 세포 내로 유입되어 세포소멸을 촉발시킴으로써 세포 사멸을 증진시키는 세포독성 과립, 예를 들어 페르포린 (perforin) 및 그랜자임 (granzyme)을 방출시킨다. 이러한 ADCC 효과기 기능은 세포독성 T 세포 (CTL)에 의한 반응과 유사하지만, 그와는 별개이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "완전 반응"은 치료에 반응하여 암의 모든 징후가 사라지는 것을 의미한다. 당업자는 "완전 반응"을 "완전 차도"로 지칭하기도 한다. 다음 실시예에 이용된 모델에서, "완전 반응"을 달성한 동물은 측정 가능한 종양이 측정할 수 없는 단계로 퇴행되었다는 것을 의미한다. 달리 말하면, 이는 동물이 "치유"되었고 건강한 모습이라는 것을 의미한다.
"단리된"이란 "수동에 의해" 그의 천연 상태로부터 변경된 것을 의미하는데, 즉 천연적으로 존재하는 경우, 이는 그의 본래의 환경으로부터 변화 또는 제거되었거나, 또는 변화되고 제거되었다는 것을 의미한다. 예를 들어, 생체 유기체 내에 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 천연 상태에서 공존하였던 한 가지 이상의 세포성 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이고, 이 용어가 본원에 이용된다. 더우기, 형질전환, 유전자 조작 또는 기타 모든 재조합 방법에 의해 유기체 내로 도입되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 이것이 여전히 상기 유기체 (이러한 유기체는 생체이거나 생체가 아닐 수 있다) 내에 존재하는 경우일지라도 "단리된" 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약"에는 본 발명의 수의학적 적용이 포함된다. 용어 "치료적 유효량"은 선택된 질환을 경감시키는 데에 유용한 치료제의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용 가능한"이란 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나, 또는 미국 약전 또는 동물, 및 보다 특히 인간에게 사용하는 것으로 일반적으로 인식된 기타 약전에 열거된 것을 의미한다.
"폴리펩티드"는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합, 즉 펩티드 동배체에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 모든 폴리펩티드를 지칭한다. "폴리펩티드"는 통상적으로 펩티드, 올리고펩티드 또는 올리고머로서 지칭되는 단쇄와, 일반적으로 단백질로서 지칭되는 장쇄 둘 다를 지칭한다. 폴리펩티드는 20개 유전자 암호화 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. "폴리펩티드"에는 천연 프로세스, 예를 들어 해독 후 프로세싱에 의해 변형되었거나 또는 당해 분야에 널리 공지되어 있는 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열이 포함된다. 이러한 변형은 기본 교과서 및 보다 상세한 단행본 뿐만 아니라 여러 권의 조사 문헌에 잘 기재되어 있다. 변형은 펩티드 주쇄, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카복실 말단을 포함한, 폴리펩티드 내의 어느 곳에서도 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형이 소정의 폴리펩티드 내의 몇 가지 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 또한, 소정의 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 유비퀴틴화의 결과로서 분지될 수 있고, 분지를 수반하거나 수반하지 않으면서 사이클릭일 수 있다. 사이클릭 폴리펩티드, 분지된 폴리펩티드, 및 분지된 사이클릭 폴리펩티드는 해독 후 천연 프로세스로부터 비롯될 수 있거나 합성 방법에 의해 만들 수 있다. 변형에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 바이오티닐화, 플라빈의 공유 부착, 헴 (heme) 부분의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교 결합, 폐환, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교 결합물의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포밀화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 (anchor) 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해적 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 아미노산을 전이-RNA 매개하여 단백질에 부가함, 예를 들어 아르기닐화, 및 유비퀴틴화가 포함된다 [참고: 예를 들어, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12, in POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990; Rattan, et al., Ann. NY Acad. Sci., 663: 48-62 (1992)].
본원에 사용된 바와 같은 용어 "생존 동물(들)"은 자발적인 종양 관련 사망으로 죽지 않았거나, 예정된 인도적으로 거대한 크기에 도달한 종양 용적으로 인해 안락사시키지 않았거나, 또는 약물 독성 관련 이유로 인해 안락사시키지 않은 동물(들)을 의미한다.
생물학적 방법/실시예
실시예 1: 뮤린 인간 B-세포 림프종 모델에서 IL-18과 RITUXAN ® 의 병용 요법에 관한 실험적 프로토콜
인간 IL-18 (서열 1)은 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli)의 비-병원성 균주에서 발현된, 인간 인터루킨-18의 재조합 성숙 형태이다. IL-18은 IL-1β 및 IL-1 트레포일 (trefoil) 아계열과 가장 밀접하게 관계된 일차 구조를 지닌 18 Kd의 비-글리코실화 단량체이다. 뮤린 및 인간 IL-18 cDNA는 192개 및 193개 아미노산 (각각 서열 2 및 1)으로 이루어진 전구체 단백질을 암호화한다. 프로-IL-18은 그의 생물학적 활성을 매개하기 위해서는 카스파제에 의해 생체 활성 성숙 단백질 (157개 아미노산)로 프로세싱해야 한다. 인간 IL-18과 뮤린 IL-18 간의 상동율은 65%이다. 다음에 열거된 전임상 연구에서는, 생체내 동계 시스템을 제공하기 위하여 뮤린 IL-18 (서열 2)을 사용하였는데, 이러한 시스템에서는 IL-18의 완전한 면역학적 능력을 분석할 수 있었다.
본 연구는 T 세포와 B 세포 둘 다가 결여된 비근친계 암컷 동형접합성 SCID 마우스 (ICR-Prkdc scld )에서 수행하였다. 근친계 균주에 비해 비근친계 스톡을 사용하는 경우의 이점은 비근친계 ICR SCID 균주가 (심지어 10 내지 12개월생 마우스에서도) (혈관) 누출을 나타내지 않았다는 것이다.
마우스에게 3세 버킷 림프종 환자로부터 최초로 유래된 인간 라모스 (Ramos) B-세포 림프종 주 (ATCC 카탈로그, CRL 1596)를 주사하였다. 종양 1:10 균등질을 마우스당 0.5 ml의 용량으로 6 내지 8주생 마우스에게 접종하였다. 종양 용적을 매주 2 내지 3회 측정하고, 마우스를 처리군에 무작위로 분배하여 해당 군이 동등한 종양 용적 분포도를 갖게 하였다. 군당 중앙값 종양 용적이 80 내지 150 ㎣에 도달한 시점 (종양 접종 후 12일째)에 치료를 개시하였다. 또한, 설정 한계치를 벗어난 용적을 갖는 종양이 성장하고 있는 마우스는 본 연구로부터 배제시켰다.
제1 연구에서는, 처리군 (n=6)에 대조군 (치료를 받지 않음), 3개의 RITUXAN® 정맥내 단일 요법 군 (각각 12.5, 25, 및 50 ㎍/마우스, BIW), mIL-18 피하 단일 요법 군 (100 ㎍/마우스, 1일 1회), 및 각각 100 ㎍/마우스 IL-18 (피하, 1일 1회) + 12.5, 25, 또는 50 ㎍/마우스 RITUXAN® (정맥내)를 투여한 3개의 병용 요법 군이 포함되었다.
제2 연구에서는, mIL-18 (서열 2)를 100 ㎍/마우스로 SID 스케줄에 따라 투약하고, RITUXAN® 25 및 12.5 ㎍을 qd4/3 스케줄에 따라서 투약하였다. 통계적 유의성을 측정하기 위한 보다 우수한 영역을 갖기 위하여, 동물의 수를 12마리까지 증가시켰다 (n=12). 비에너 (viener) 캘리퍼를 사용하여 종양 용적을 매주 2 내지 3회 측정하였다.
인간 B-세포 림프종 모델에서 IL-18과 RITUXAN®의 병용 요법은 IL-18, 또는 RITUXAN® 단독을 이용한 단일 요법에 비해 이득을 제공해준다. 다음에 상세된 2가지 실험은 본 모델에서의 병용 요법의 통계상 유의적 이득을 보여준다.
도 3에 포착된 제1 실험에서는, 고 용량의 RITUXAN® (lOO ㎍/1회분)은 단일 작용제 요법으로서 강력한 항종양 활성을 나타낸 반면, 보다 저 용량 (12.5 g/1회분)의 RITUXAN®은 활성을 나타내지 않았다. 뮤린 IL-18 (서열 2)은 단일 작용제 (100 ㎍/1회분)로서 활성을 나타내지 않았다. 그러나, 보다 저 용량의 RITUXAN®과 병용한 경우에는, mIL-18 (서열 2)이 부가적/상승적 활성을 나타내었다 [12.5 ㎍/1회분의 RITUXAN®을 1OO ㎍의 mIL-18 (서열 2)과 병용함].
그래프패드 프리즘®을 이용하여 데이터를 그래프화하고 분석한 경우에, 통계적 유의성이 다음 도 4 및 5에서 입증되었다. 이들 그래프 중의 첫 번째 그래프 (도 4)에서는, 이식 후 19일째에 종양 용적을 비교하였다. 통계적 분석 결과, 처리되지 않은 대조군과 비교해서 모든 처리군에서 종양 용적이 상당히 감소된 것으로 밝혀졌다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). 두 번째 그래프 (도 5)는 병용 요법이 단일 요법 단독 보다 더 유효하였다는 것을 나타낸다 (통계상 유의적임, *p<0.05, **p<0.01).
제2 실험에서는, 동물 수를 증가시킨 것이 (n=12) 병용 요법에 반응하여 부가적/상승적 항종양 활성의 보다 우수한 통계적 유의성을 제공해주었다. 도 6A 및 6B의 그래프는 중앙값 및 평균 종양 성장 용적을 나타낸다. 이 연구는 종양 이식 후 27일째에 분석하였다. 이러한 연구는 진행중이며, 중앙값 종양 용적이 2000 cu mm에 도달한 경우에 종결될 것이다 (ACUC 프로토콜). 그러나, 이식 후 27일째의 데이터 분석 (도 7 및 8)은 RITUXAN® 단독 (25 ㎍/마우스) 또는 mIL-18 (서열 2) 단일 요법 단독 (100 ㎍/마우스)과 비교해서, 병용 요법 (25/100 ㎍/마우스)으로 처리된 마우스에서 종양 용적이 통계상 유의적으로 감소하였다는 것을 입증해준다.
이러한 전임상 데이터는 IL-18을 리툭시마브와 병용하면 상승적 항종양 활성이 발생한다는 것을 입증하고 있다. 리툭시마브는 시험된 가장 높은 용량에서 단일 요법으로서 활성이었다. 그러나, 보다 낮은 용량의 리툭시마브를 뮤린 IL-18 ("mIL-18")과 조합하여 사용한 경우에도 유사한 수준의 활성이 관찰될 수 있었는데, 이는 상기 모델이 리툭시마브에 민감하였다는 사실과, 해당 반응이 IL-18에 의해 증강될 수 있었다는 사실을 나타낸다. 뮤린 IL-18은 아마도 NK 세포에서 ADCC 활성을 증대시킴으로써 리툭시마브의 활성을 증강시켰다. SCID 마우스에게 B 세포 반응과 T-세포 반응 둘 다가 결여되었기 때문에, IL-18은 NK 세포 활성화를 통하여 항종양 반응을 증대시키고 있다.
또한, IL-18을 비-인간 영장류에게 투여하면 생체 내에서 NK 세포 및 단구의 활성화가 발생하고 단구 상의 Fc 수용체 (FcγRI)가 상향 조절되었다 [참고: Herzyk, et al., Cytokine 20:38-48 (2002)]. IL-18을 SCID 마우스 모델에서 HERCEPTIN™과 조합하여 사용하는 경우에도 상승적 항종양 활성이 또한 관찰되었는데, 이는 IL-18이 NK 세포 활성화를 통하여 ADCC 활성을 증가시키고 있다는 가설을 뒷받침 해준다.
실시예 2: EL-4 T 세포 림프종에서 IL-18과 독소루비신의 병용 요법에 관한 실험적 프로토콜
암컷 C57/BL/6 마우스에서 연구를 수행하였다. 일반적인 프로토콜로서, C57/BL 마우스에게 0.2 cc의 스톡 EL-4 세포를 복강내 주사하였다. EL-4 뮤린 T-림프종 세포를 10% FCS를 수반한 RPMI에서 확장시켰다. 모든 동물을 대상으로 하여 연구 군당 6마리 또는 7마리 마우스로 무작위 할당하고, 음식물과 물을 임의로 제공하였다. EL-4 세포를 0일째에 수거하고, 계수한 다음, 5 x 105개 EL-4 림프종 세포를 복강내 이식하였다. 3일째에 6/7 마리 동물을 무작위로 처리군으로 할당하였다. 이식 후 3일 및 10일째에 독소루비신을 정맥내 투여하였다. 3일 내지 16일째에 mIL-18 (서열 2)을 피하 투여하였다. 독성과 사망률을 알아보기 위해 동물을 매일 관찰하였다.
모든 동물을 대상으로 하여 육안으로 관찰한 결과, 투약 스케줄과 수준을 잘 견뎌냈다. 16일째에, 모든 투약을 종결하였는데, 중앙값 비히클 사망은 17.5일째에 일어났다. 모든 비히클 마우스는 이식 후 16일 내지 18일 사이에 숨을 거두었다. 수명 증가는 연구 군/비히클 군 - 1 x 100%에 의해 계산하였다. EL-4 T 세포 림프종에서 mIL-18 (서열 2)과 독소루비신의 병용 요법의 경우에는, 중앙값 생존 시간과 수명 증가와 관련한 데이터를 분석하였다.
mIL-18 (서열 2)과 독소루비신의 병용 요법에 반응하여 수명이 연장하는 것은 EL-4 T 세포 림프종을 보유하고 있는 암컷 C57B1/6 마우스의 동계 종양 모델에서 평가하였다. mIL-18 (서열 2) 단독 또는 독소루비신 단독을 이용하는 단일 요 법에 비해 병용 요법의 이점은 다음에 상세된 몇 가지 실험에서 입증되었다. 항종양 활성과 수명 연장의 예가 도 9에서 입증된다. 다음에 기재되는 바와 같이, 비히클 동물이 숨을 거둔 경우 (16일째), 모든 투약을 종결하였다. 중앙값 비히클 사망은 17.5일째에 일어났고, 모든 비히클 마우스는 이식 후 16 내지 18일 사이에 숨을 거두었다.
이들 결과는 EL-4 T 세포 림프종에서 독소루비신을 mIL-18 (서열 2)과 병용하면 생존율을 증가시킨 상승적 항종양 활성이 발생한 것으로 나타났다. 독소루비신 단일 요법은 12 mg/kg 용량에서 최소한의 수명 증가를 나타내었다. 1, 5 및 25 ㎍/1회분의 IL-18 단일 요법은 수명 증가를 전혀 나타내지 않았다. 12 mg/kg의 독소루비신을 25 ㎍/1회분의 IL-18과 병용하는 경우에는, 생존율이 증가하였고 치유가 증가되었다. 이들 동물을 종양으로 다시 시험감염시키면, 이들은 보호를 나타내었다.
이어서, 본 발명자들은 IL-18과 독소루비신의 병용 요법에 대한 생존 예측 가능성을 조사하였는데, 이로써 상승적 항종양 활성을 가져다 주는 양 시약에 대한 가장 우수한 용량을 확인하는 것이 유리하다는 사실을 인식하였다. 도 9에 도시된 데이터의 생존자 확률 플롯이 도 10에 도시되어 있다.
이러한 분석을 위해, 본 발명자들은 독소루비신을 0, 4.2, 7.2, 12 mg/kg의 용량으로 사용하고/하거나 mIL-18 (서열 2)을 0, 1, 5, 25 ㎍/마우스의 용량으로 사용하는 병용 요법 또는 단일 요법 연구로부터의 데이터를 사용하였다. 플롯은 사망 위험을 최소화시켜 주는 병용 치료에 상응하는 표면 확률의 최대 값을 사용하 고 있다. 이러한 표면은 각 병용 처리에서 30일 이상 동안의 예측 생존 확률을 제공해준다.
IL-18과 독소루비신의 병용 요법에 반응한 면역 세포에 대한 효과는 림프구의 생육도, 확장, 활성화 및 기능성을 분석한 일련의 실험에 역점을 두었다. 독소루비신 (12 mg/kg) 또는 mIL-18 (서열 2) (25 ㎍/1회분)로 처리하였거나 또는 이들 둘 다 조합하여 처리한 동물에게서 림프구의 표현형별 프로파일을 측정하였다. 활성화 CD8-양성 T-세포, NK 및 활성화 NK의 프로파일을 시험하였고, 그 데이터가 도 11A 및 11B에 도시되었다.
mIL-18 (서열 2)과 독소루비신을 병용하면 독소루비신 단독을 이용한 경우와 동일한 수의 활성화 CD8-양성 T-세포 (CTL), NK 및 활성화 NK 세포가 유지되고/증가되었다. 이들 세포는 세포-매개형 세포독성에 있어 중요한 역할을 할 수 있다 (특이적 종양 사멸). 독소루비신/IL-18 병용 요법에 반응하여, 활성화 CD8-양성 T-세포 및 NK 세포가 증강하는 것은 비장 세포와 비교해서 PBL을 순환시키는 데에 있어서 보다 증강되었다.
독소루비신이 IL-18 증강된 NK 세포 활성 (비-특이적 종양 사멸)을 저하시키지 않는다는 것을 보여주는 실험을 수행하는 것이 중요하였다. 도 12는 단지 독소루비신으로만 처리된 동물에게서는 NK 세포독성이 손상되었지만, mIL-18 (서열 2) 단독을 투여하였거나 이를 독소루비신과 병용해서 투여한 동물은 둘 다 강력한 NK 세포독성을 나타내었다는 것을 입증해준다.
실시예 3: IL-18을 리툭시마브와 병용한 제1상 임상 시험에 관한 프로토콜
본 실시예에서 제1상은 CD20+ B 세포 NHL 대상체에게서 인간 IL-18 (서열 1)의 용량을 12주간 매주 상승시키는 (1 내지 100 ㎍/kg) 것의 안전성과 면역관용을 연구조사하는, 인간 IL-18을 표준 리툭시마브 요법과 병용한 개방 표지, 단계적 상승 용량 연구이다.
리툭시마브와 인간 IL-18 (서열 1)은 시차를 두고 투약하였다. 따라서, 대상체에게 1주 내지 4주의 1일째에 리툭시마브 (375 mg/㎡)를 매주 정맥내 주입하였다. 인간 IL-18 (서열 1)은 1주 내지 4주의 2일째 및 5주 내지 12주의 2일째 (±1일)에 매주 정맥내 주입 투여하였다. 인간 IL-18 (서열 1)의 출발 용량은 1 ㎍/kg이고, 공칭 최대 용량 100 ㎍/kg이 되도록 용량의 단계적 상승을 계획하였다.
각 코호트 (cohort) 내에서의 투약은 시차를 두었는데, 1명의 대상체에게 1일째는 리툭시마브의 제1 용량을 투여하고 2일째에는 인간 IL-18 (서열 1)을 투여한 다음, 24시간 이상 동안 자가 모니터링하였다. 안전성이나 면역관용 상의 우려가 없는 경우에는, 코호트 내의 그 다음 대상체에게 적어도 24시간 후에 투여하였고, 또한 이를 대상으로 하여, 인간 IL-18 (서열 1)의 제1 용량을 투여한 후 24시간 동안 자가 모니터링할 것이다. 그 후의 여러 주 동안에는 (2주 내지 12주), 인간 IL-18를 투여한 후 6시간 동안 대상체를 모니터링한 다음, 임상 시험으로부터 놓아주었다. 모든 대상체에게 적어도 2시간 간격을 두고 투약하였다. 모든 코호트 내에서 매일 2명 이하의 대상체에게만 투약할 수 있다.
3명의 대상체는 제1 용량 수준 (매주 1 ㎍/kg)으로 처리하였다. 코호트 내에서의 투약을 완료한 후 (즉, 3명 모든 대상체가 연구 1 내지 6주를 완료하였다) 약물을 연구하기 위해 "의심되거나" 또는 "예상 가능한" 관계를 나타내는 등급 2 초과의 독성에 관한 명백한 증거가 없는 경우에는, 각각의 그 다음 코호트 내의 3명 대상체를 다음 용량 수준으로 처리하였다: 3 ㎍/kg/주, 10 ㎍/kg/주, 20 ㎍/kg/주, 30 ㎍/kg/주, 및 100 ㎍/kg/주.
리툭시마브를 모두 주입하는 경우에는, 해당 용량을 주입 초기부터 주입 말기까지 완전히 전달하기 위해서는 4시간 이상이 걸려야만 한다. 인간 IL-18의 주입은 2시간에 걸쳐 일어난다.
본 연구의 목표는 CD20+ B 세포 림프종 대상체에게서 표준 리툭시마브 처리와 조합하여 사용하는 경우에 안전한 인간 IL-18의 최대 생물학적 유효량을 결정하는 것이다. 기존의 제1상 연구에서 벨 (bell) 모양인 것으로 밝혀진 인간 IL-18 (서열 1)에 대한 용량-반응 관계를 평가하기 위해서는, 1 내지 100 ㎍/kg의 용량 범위를 사용하여 CD20+ B 세포 림프종 대상체에게서 생물학적 활성 범위의 하단 말단 (저 용량) 및 상단 말단 (중간 범위 또는 고 용량)을 조사할 것이다.
리툭시마브의 용량은 CD20+ B 세포 NHL 환자에 대해 승인된 표지에서 권장된 표준 섭생이다. 인간 IL-18 (서열 1)의 용량은 신 세포 암종 및 전이성 흑색종 환자가 관여한 연구로부터의 기존의 제1상 안전성, 약동학적 및 약력학적 데이터를 기준으로 하여 선택하였다. 본 연구에 사용될 리툭시마브의 용량은 CD20+ B 세포 NHL 환자에 대해 승인된 표지에서 권장된 표준 섭생이다.
인간 IL-18 (서열 1)의 용량은 신 세포 암종 및 전이성 흑색종 환자가 관여한 연구로부터의 기존의 제1상 안전성, 약동학적 및 약력학적 데이터를 기준으로 하여 선택하였다 [참고: Robertson, et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:178 (abstract 713) (2003); Robertson, et al., J. Clin. Oncol. 22:176s (abstract 2553) (2004); Robertson, et al., J. Clin. Oncol. 23:169s (abstract 2513) (2005); Koch, et al., J. Clin. Oncol. 23:174s (abstract 2535) (2005); Koch, et al., Eur. J. Cancer 4(12):86 (270) (2006)]. 시험된 가장 고 용량, 24주 동안 매주 투여된 2000 ㎍/kg은 상당한 독성을 생성시키지 않아 최대 면역관용 용량이 확인되지 않았으므로, 약력학적 데이터를 사용하여 본 연구에 대한 용량 범위의 상단치를 선택하였다.
시험된 가장 고 용량, 24주 동안 매주 투여된 2000 ㎍/kg은 상당한 독성을 생성시키지 않아 최대 면역관용 용량이 확인되지 않았으므로, 약력학적 데이터를 사용하여 본 연구에 대한 용량 범위의 상단치를 선택하였다.
실시예 4: 마우스 형질세포종 모델에서 IL-18과 HERCEPTIN ® 의 병용
MOPC315.D3j005 및 MOPC.D3j03 연구 둘 다를 분석하여 뮤린 형질세포종의 성장에 대한 뮤린 IL-18 (서열 2)과 HERCEPTIN®의 병용 요법 효과를 평가하였다. 이러한 실험을 위해, 본 발명자들은 MoPC315 세포를 ErbB2 (HER2)로 형질감염시켰다. 형질감염시키기 위해, 본 발명자들은 리포펙타민 (Lipofectamine™) 및 옵티멤 (Optimem™) 배지 (공급처: Gibco)를 이용한 리포솜성 형질감염을 사용하여 기재된 바와 같이, 6-웰 디쉬 중의 1.5 ㎍ ErbB2 발현 벡터 (BioCat - 108912 - pcdna3.1(-) ErbB2)를 사용하였다. 선택적 압력 네오마이신 (450 ㎍/ml G418 Sigma G6816)을 2일 후에 배양물에 가하였다. 알렉사플루오르 (Alexafluor) 488 표지된 HERCEPTIN® 모노클로날 항체로 염색시킨 계내 배양물을 형광 현미경으로 검사함으로써 초기 양성 집단을 선별하고, 제한 희석에 의해 클로닝하였다 (206434 p 70-72). D3 ErbB2 발현은 엘렉사플루오르488 표지된 HERCEPTIN® 유동 세포계수법으로 시험하였다. MOPC.D3 세포주를 선별하고, HERCEPTIN® 및 IL-18 항종양 효능을 평가하기 위하여 사용하였다.
항종양 활성을 측정하고, 그 데이터를 상세히 분석한 결과, IL-18과 HERCEPTIN®의 병용 요법이 HERCEPTIN® 단독을 이용한 단일 요법을 능가한 것으로 밝혀졌다. 특히, 이러한 차이는 통계상 유의적이고 강력하며; 이는 통계적 차이를 결정하는 데에 있어서 덜 민감하고 덜 강력한 비-파라미터 시험을 사용하여 결정하였다.
이러한 데이터를 상세히 분석한 결과, IL-18과 HERCEPTIN®의 병용 요법이 HERCEPTIN® 단독을 이용한 단일 요법을 능가한 것으로 밝혀졌다. 특히, 이러한 차이는 통계상 유의적이고 강력하며; 이는 통계적 차이를 결정하는 데에 있어서 덜 민감하고 덜 강력한 비-파라미터 시험을 사용하여 결정하였다.
a. 연구 # MOPC315.D3j005
본 연구는 임상 시험에 있어서 유방암 중에 본 요법을 사용하기 위한 목표를 갖고, 항-Her2/neu 수용체 항체인 HERCEPTIN®과 mIL-18 (서열 2)를 병용해서 이용하였다. 병용 요법은 널리 정립된 뮤린 형질세포종 세포주 MOPC315에서 시험하였다. 종양 주는 ATCC로부터 획득하였고 자가 Her2 수용체로 형질도입시켰다. 이러한 종양 주는 BALB/c 동계 세포주이다. 투여는 다음과 같이 수행하였다: 뮤린 IL-18 (서열 2) (100 ㎍/마우스, 1일 1회, 피하), HERCEPTIN® (200, 100 또는 50 ㎍/마우스, 1주 2회, 정맥내). MOPC315.D3j005 연구에서의 처리는 종양이 성장하기 시작한 후에 개시하였는데, 이는 이식 후 14일째였다.
본 연구의 결과가 도 13 및 14에 도시되었는데, 이는 평균±SD (도 13) 및 중앙값±범위 (도 14)로서 표현하였다. 본 발명자들은 먼저, 데이터가 정상적인 분포도 [가우시안 (Gaussian) 근사]를 따르는 지를 확인하기 위해 검사하였고, 본 발명자들은 등가의 변동이 있다는 것을 확인하기 위해 표준 편차 값을 비교하였다 (도 14 및 15). 본 발명자들은 원 데이터는 정상적으로 분포되어 있지만, 처리군 간의 표준 편차는 고도로 가변적이므로 (>3x), 본 발명자들은 분석을 위해 파라미터 시험 (예: ANOVA)을 사용할 수 없다. 본 발명자들은 변환된 데이터가 표준 및 등가 변동 시험을 통과하였는 지를 알아보기 위해 log10 및 ln을 사용하여 데이터를 변환시켰다 (샘플 분석은 24일째 선별 군에 대해 - 아래를 표시하였다). 변환된 데이터는 표준 시험을 통과하지 못하였다. 따라서, 본 발명자들은 통계적 평가를 위해 비-파라미터 시험 [크루스칼-발리스 (Kruskal-Wallis) 분석]을 선택하였다. 상세 데이터 및 p 값이 도 13 및 14에 표시되었다.
통계적 분석 결과, mIL-18 (서열 2)과 HERCEPTIN®의 병용 요법이 HERCEPTIN® 단독을 이용한 단일 요법 보다 우수한 것으로 밝혀졌다. 도 15는 HERCEPTIN® 200 ㎍/마우스 단독이 투약된 군과, HERCEPTIN® 200 ㎍/마우스와 인간 IL-18 100 ㎍/마우스 둘다가 투약된 군 간의 통계적 차이 (크루스칼-발리스 분석, p<0.05)를 도시하고 있다. 도 16은 HERCEPTIN®과 IL-18의 병용 요법이 HERCEPTIN® 및 IL-18 단독과 비교해서 가장 우수한 항종양 활성 영역을 나타내었다는 것을 도시하고 있다.
b. 연구 # MOPC.D3J03
본 연구는 해당 요법을 이식 후 7일째에 종양이 육안으로 가시적이 되기 전에 출발한 것을 제외하고는, 상기 MOPC315.D3J005 연구 (실시예 4.a.)와 동일하였다. 또한, 본 연구에서 HERCEPTIN®의 최대 용량은 100 ㎍/마우스이고, 최소 용량은 25 ㎍/마우스였다.
데이터는 평균±SD (도 17) 및 중앙값±범위 (도 18)로서 표현되었다. 본 발명자들은 먼저, 데이터가 정상적인 분포도 (가우시안 근사)를 따르는 지를 확인하기 위해 검사하였고, 본 발명자들은 등가의 변동 시험이 통과된다는 것을 보장하기 위해 표준 편차 값을 비교하였다. 본 발명자들은 원 데이터가 정상 분포도를 따르지 않고; 또한 변환된 데이터 (log10 또는 ln)가 가우시안 분포도를 따르지 않았으며; 등가 변동 시험을 통과하지 못하였다는 사실을 밝혀내었다. 따라서, 본 발명자들은 파라미터 시험 (예: ANOVA)을 사용할 수 없었고, 통계적 평가를 위해 비-파라미터 시험 [크루스칼-발리스 분석]을 선택하였다. 상세 데이터 및 p 값이 도 19 및 20에 표시되었다.
결론적으로 언급하면, 본 연구의 통계적 분석 결과, mIL-18 (서열 2)과 HERCEPTIN®의 병용 요법이 HERCEPTIN® 단독을 이용한 단일 요법 보다 우수한 것으로 밝혀졌다. 도 19 및 20의 그래프는 HERCEPTIN® 단독 (100 ㎍/마우스)을 이용한 단일 요법과 비교해서, 병용 요법 군 [mIL-18 (서열 2) 100 ㎍/마우스와 HERCEPTIN® 100 ㎍/마우스]에서 상당히 우수한 종양 퇴행을 나타내고 있다. 단일 요법으로서의 HERCEPTIN®은 최소 활성을 갖고 있지만, 이는 IL-18 병용 요법에 의해 증대된다. HER2는 세포 내로 형질감염되기 때문에, HERCEPTIN®은 단지 HER2와의 결합 만을 제공해줄 수 있지만, 세포소멸 (종양 세포 사멸)을 유도시키지는 못한다. 따라서, 항종양 활성은 병용 요법의 결과이고, IL-18은 ADCC 및 CDC 활성에 있어서 중요한 역할을 하는 세포 (IL-18 처리에 의해 증대되는 세포)를 증대시키며, HERCEPTIN®은 HER2와의 특이적 결합을 제공하고 ADCC/CDC 표적으로서 제공된다.
실시예 5: 뮤린 결장암, Colo26의 동계 모델에서 IL-18과 5-플루오로우라실 (5-FU) 병용 요법의 분석
본 연구는 5-플루오로우라실 (5-FU), 또는 mIL-18 (서열 2) 단독을 이용한 단일 요법과 비교해서, mIL-18 (서열 2)과 5-FU의 병용 요법 효능을 평가하고자 하였다. 본 발명자들의 연구는 BALB/c 마우스에서 뮤린 결장 암종 Colo 26의 널리 확립된 동계 피하 모델에서 수행하였다. mIL-18 (서열 2)을 이용한 투약은 종양 접종 후 10 내지 30일째에 10 ㎍/마우스로 매일 피하 수행하였다. 5-FU를 이용한 투약은 용량을 27, 45 및 74 ㎍/마우스로 상승시키면서 매주 2회 복강내 수행하였다.
종양 용적 데이터를 상세히 분석한 결과, 10 ㎍의 mIL-18 (서열 2)과 75 ㎍의 5-FU의 병용 요법이 대조군과 비교해서 종양 성장에 대한 상당한 효과를 지닌 유일한 치료군이란 사실이 밝혀졌다. 이는 병용 요법 (75 ㎍/10 ㎍)이 5-FU 단독을 이용한 단일 요법 군, 또는 mIL-18 (서열 2) 단독을 이용한 단일 요법 군을 능가하였다는 것을 의미하는데, 이는 단일 요법이 대조군 보다 우수한 치료 효과를 나타내지 못하였기 때문이다. 이러한 차이는 통계상 유의적이고 강력하다는 것을 이해하는 것이 중요하며; 이는 통계적 차이를 결정하는 데에 있어서 덜 민감하고 덜 강력한 비-파라미터 시험을 사용하여 결정하였다. 또한, 생존율 분석은 병용 요법 (75 ㎍/10 ㎍)이 단일 요법 군 (75 ㎍) 보다 상당히 더 우수하였다는 사실을 입증하였다. 이러한 유의성은 p<0.0001로 극도로 강력하였다.
상이한 처리군에서의 종양 용적을 비교한 데이터는 선택된 대표적 시점에서 평가하였고, 평균±SD (도 21), 및 중앙값±범위 (도 22)로서 표현되었다. 데이터를 대상으로 하여 먼저, 정상적인 분포도 (가우시안 근사)에 대해 검사하였고, 등가의 변동이 존재한다는 것을 보장하기 위해 표준 편차 값을 비교하였다. 그러나, 몇몇 원 데이터의 분포도가 가우시안 곡선을 따르지 않았고; 처리군 간의 표준 편차는 고도로 가변적이므로 (>3x), 분석을 위해 파라미터 시험을 사용할 수 없었다. log10을 사용하여 데이터를 변환시켰고, 이는 표준 및 등가의 변동 시험 (샘플 분석은 선별 군에 대해 - 아래를 표시하였다)을 여전히 통과하지 못하였다. 따라서, 통계적 평가를 위해 비-파라미터 시험 [크루스칼-발리스 분석 및 던스 (Dunn's) 비교 시험]을 사용하였다. 상세 데이터 및 p 값이 도 23 아래 그래프에 표시되었다. 도 24 (중앙값±SD) 및 도 25 (평균±SD)는 동일한 Colo26 동계 결장 종양 모델에서 IL-18과 5-FU 병용 요법의 효과를 도시한 것이다. 종양 용적이 80 내지 100 cu mm 크기에 도달한 경우에, 동물을 IL-18 단독으로 처리하거나, 5-FU 단독으로 처리하거나, 또는 두 약물을 조합하여 처리하였다는 것이 명백하다. 병용 요법에 대한 항종양 활성 및 상승 작용에 관한 보다 우수한 고찰이 도 26에 제시되었다.
상이한 처리군에서 Colo26을 보유하고 있는 마우스의 생존율은 카플란-마이어 생존 곡선 분석으로 플롯하고, 로그랭크 (Logrank) 시험에 의해 평가하였으며, 도 26에 도시하였다. 처리군 간에는 생존율 상의 통계적 차이가 존재하였는데, 가장 우수한 군은 10 ㎍의 mIL-18 (서열 2)과 75 ㎍의 5-FU를 이용한 병용 요법이었다.
실시예 6: 마우스 신 세포 암종 모델에서 IL -18과 파조파니브 ( GW786034 )의 병용 요법의 효능
본 연구인 RENJ02 연구는 마우스 신 암종의 진행성 동계 모델에서 VEGFR 및 PDGFR 및 c-kit 티로신 키나제의 억제제인 파조파니브와 mIL-18 (서열 2)의 병용 요법 효능을 시험하였다. 이러한 동물 모델은 뮤린 피하 고형 신 암종 모델이다. BALB/c 마우스와 동계인 뮤린 RENCA 세포주를 BALB/c 수용자에게 이식하였다. 이용된 투약 스케줄이 다음 표 1에 제시되어 있다. IL-18은 14일 내지 42일째에 1일 1회 피하 투여하였다. 파조파니브는 14일 내지 42일째에 1일 1회 경구 투여하였다.
먼저, 통계적 분석을 위해 군들 간의 비교를 위한 우수한 시점을 결정하였다. 이어서, 데이터를 대상으로 하여 분석에 적합한 통계 시험을 결정하기 위한 표준 시험을 수행하였다. 대표적 시점으로서 32일을 선택하였다 (몇몇 마우스는 이러한 시점까지 독성 또는 종양 크기로 인해 안락사시켰어야 하므로, 원래는 각 군이 7마리 마우스로 시작하였지만, 5 내지 7마리 마우스를 나타내기도 한다). 데이터는 가우시안 (표준) 분포도를 나타내지 않았으므로, 비-파라미터 시험을 사용하였다. 심지어 비-파라미터 시험을 사용해야만 했지만 (이러한 시험은 파라미터 시험 보다 차이를 탐지하는 데에 있어서 덜 강력하다), 단일 요법과 병용 요법 간의 통계적 차이를 결정하였고, 이를 도 28에 도시하였다. 평가를 위해 사용된 통계 소프트웨어에는 프리즘 그래프패드 및 시그마스태트 (SigmaStat)가 포함된다.
Figure 112009058140854-PCT00001
도 28은 도 27과 동일한 데이터를 분석한 것이다. 그러나, 도 28에서는 대조군이 포함되지 않았다. 이러한 부가의 그래프는 단일 요법 군과 병용 요법 군을 비교함으로써 "클리너 (cleaner)" 분석을 수행하기 위해서였다. 이들 데이터는 파조파니브 (GW786034)와 IL-18의 병용 요법으로 인해 통계상 유의적인 항종양 활성이 생성된다는 것을 보여준다.
실시예 7: 장기간 생존과 종양 재발 방지를 가져다 주는 기억 유도인자로서의 IL-18의 역할에 역점을 둔다
본 발명자들은 뮤린 IL-18 (서열 2)을 독소루비신과 병용해서 마우스를 처리하여 EL-4 종양 모델에서 그 효능을 시험함으로써 상기 문제에 역점을 두었다. 해당 종양으로 재시험감염시킨 경우에 치유된 마우스는 종양 침범/성장에 대해 저항성이었는데, 이는 이들 마우스가 IL-18과 독소루비신의 처리에 의해 유도된 기억 기전을 갖고 있다는 것을 제안한다. 생존하였고, 그의 종양이 IL-18과 독소루비신 처리에 의해 치유된 EL-4 종양 마우스 내에 T-기억 세포가 존재한다는 것이 다음 실험에 제시된다 (도 29 및 도 30).
이러한 실험적 설계는 다음과 같다: Pfp/Rag2 마우스 (NK 세포 및 CTL 활성이 심각하게 고갈된 H2b 일배체형)에게 IL-2 (마우스당 3000 U, 1일 1회 피하) 처리된 생존자, 또는 대조군 C57BL/6 마우스 (생존자와 대조군 둘 다에게 IL-2를 투여하였다)로부터의 2.5 x 107개 비장 및 림프절 세포를 양자 면역전달시켰다. 양자 면역전달시킨지 2주 후에, 모든 마우스를 EL-4 종양 세포로 시험감염시켰다 [EL-4는 C57BL/6 (H2b) 기원의 발암 물질 유도된 마우스 림프종이다]. 양자 면역전달시킨 후 3일 동안 (양자 면역전달 당일에 시작함) 모든 수용자를 IL-2 (마우스당 3000 U, 1일 1회 피하)로 처리하였다. 수용자 균주는 접종된 종양과 동일한 유전적 배경을 갖도록 의도적으로 선별하였다. 마우스의 체중과 생존율을 기록하여 체중 손실/증가 시간대를 확립시키고, 복강을 촉진하여 EL-4 접종 후 수 주 동안 촉진 가능한 종양 덩어리의 존재를 결정하였다.
Pfp/Rag2 마우스는 입수 가능한 최대 양으로 구입하였다 (4마리 숫컷과 4마리 암컷). 본 발명자들은 또한, 기존의 연구로부터 남겨진 연령이 더 많은 2마리 마우스를 갖고 있었다. 군당 샘플 수를 가능한 한 많이 증가시키기 위해, 본 발명자들은 이들 마우스 모두를 활용하기로 결정하였는데, 성별과 연령이 결과에 미치는 영향을 없애기 위해, 성별과 연령을 두 군 간에 균등하게 분포시켰으며; 1개 군에는 EL-4 생존자로부터의 림프관 세포를 투여하였고, 다른 군에는 정상 대조군 B6 마우스로부터의 세포를 투여하였다.
그 결과, EL-4 시험감염 후 첫 번째 주 동안에는 마우스 두 군 간에 체중 상의 상당한 차이가 없었으며, 모든 마우스에서 체중 증가가 정체되었다는 것을 나타내었다 (도 29). 이러한 결과는 처음 3일 동안 그들의 면역 반응을 증폭시키기 위해 모든 마우스에게 IL-2를 피하 투여하였다는 사실에 기인할 수 있다. EL-4 시험감염 후 두 번째 주와 세 번째 주 동안에, 본 발명자들은 대조군에서 신속한 체중 증가 및 촉진 가능한 종양 및/또는 복수 형성을 관찰하였다. 모든 대조군 마우스는 2주 내에 사망하였지만, 모든 생존자-세포 수용자는 생존하였는데, 그 중 2마리 (5마리 중의 2마리)는 복부 내에 촉진 가능한 종양을 갖고 있긴 하였다. 1마리 마우스는 종양이 신속하게 성장하기 때문에 윤리적인 이유로 안락사시켜야만 했었다.
Figure 112009058140854-PCT00002
표 2는 정상 대조군 동물과 비교하여 IL-18/독소루비신 처리된 마우스에서 종양 시험감염에 대항한 보호와 관련하여 발견한 내용을 요악한 것이다. IL-18/독소루비신 처리된 동물로부터의 림프관 세포를 투여한 마우스는 보호된 반면, 대조군 동물로부터의 림프관 세포가 투여된 마우스는 종양 침범/성장을 나타내었다.
생존자 림프관 세포를 투여한 EL-4 수용자 마우스는 정상적인 타고난 본래의 공여자로부터의 림프관 세포를 투여한 대조군 마우스 보다 상당히 더 오래 생존하였다. 이러한 데이터는 생존자 마우스로부터의 양자 면역전달이 EL-4 종양 수용자에 대해 보호 효과를 갖고 있었다는 것을 암시한다. 이들 데이터는 EL-4 종양 생존자에서 기억 T 세포의 간접적인 입증을 제공해준다 (도 29 및 30).
이는 화학요법제 또는 mAb를 IL-18와 병용하는 것이 어떠한 단일 요법에 비해 탁월한 암 치료를 제공해줄 수 있었다는 중요한 발견이다. 종양을 "외래"로서 인식하고 재발을 방지시켜 줄 수 있는 기억 T 세포의 유도가 고도로 유리할 것이며, 임의의 잠재적 병용 요법에 대한 약물인 IL-18은 그의 안전성 프로파일이 우수하다.

Claims (20)

  1. (i) 담체와 함께 사용된 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1); 및 (ii) 암 세포 표면 상에 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 항체가 항체-의존성-세포-매개형 세포독성 (ADCC) 효과기 기능을 갖고 있고, 또한 상기 항체가 항-CD20 항체는 아닌 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 개별적으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 암을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1) 및 모노클로날 항체를 포함하는 조성물의 투여가 동시에 이루어지는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1) 및 모노클로날 항체를 포함하는 조성물의 투여가 순차적으로 이루어지는데, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1)가 먼저 투여되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1) 및 모노클로날 항체를 포함하는 조성물의 투여가 순차적으로 이루어지는데, 모노클로날 항체가 먼저 투여되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 항원이 CD22, CD19, HER2, HER3, EGFR, IGF-1R, AXL-1, FGFR, 인테그린 (integrin) 수용체, CEA, CD44 및 VEGFR의 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  6. 누락
  7. 제5항에 있어서, 항원이 HER-2이고, 모노클로날 항체가 HERCEPTIN®인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 암이 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma), B-세포 비호지킨 림프종, 버킷 (Burkitt) 림프종, T-세포 비호지킨 림프종, AML, CLL, MM, 기타 백혈병, 난소암, 유방암, 폐암, 육종, 방광암, 췌장암, 갑상선암, 간세포암, 위암, 윌름 종양 (Wilms' tumor), 신경모세포종, 교모세포종 및 기타 뇌 종양, 결장암, 직장암, 전립선암, 흑색종, 신 세포 암종, 및 피부암의 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  9. (i) 담체와 함께 사용된 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1); 및 (ii) 화학요법제를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 개별적으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 암을 치료하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1) 및 화학요법제를 포함하는 조성물의 투여가 동시에 이루어지는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1) 및 화학요법제를 포함하는 조성물의 투여가 순차적으로 이루어지는데, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1)가 먼저 투여되는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 인간 IL-18 폴리펩티드 (서열 1) 및 화학요법제를 포함하는 조성물의 투여가 순차적으로 이루어지는데, 화학요법제가 먼저 투여되는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 화학요법제가 독실 (doxil), 토포테칸 (topotecan), DNA-변경 약물, 카보플라틴, 항대사제, 젬시타빈 (gemcitabine), 세포 분열을 방지시키는 약물, 빈크리스틴 (vincristine), 항혈관형성제 및 파조파니브 (pazopanib)의 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  14. 제9항에 있어서, 암이 호지킨 림프종, B-세포 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, T-세포 비호지킨 림프종, AML, CLL, MM, 기타 백혈병, 난소암, 유방암, 폐암, 육종, 방광암, 췌장암, 갑상선암, 간세포암, 위암, 윌름 종양, 신경모세포종, 교모세포종 및 기타 뇌 종양, 결장암, 직장암, 전립선암, 흑색종, 신 세포 암종, 및 피부암의 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  15. 인간 IL-18 (서열 1)을 화학요법제와 조합하여 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 이에 의해 상기 환자에게서 장기간 생존 및/또는 암 재발 방지 및 면역학적 기억 유도가 발생하는, 상기 환자에게서 암을 치료하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 화학요법제가 독실, 토포테칸, DNA-변경 약물, 카보플라틴, 항대사제, 젬시타빈, 세포 분열을 방지시키는 약물, 빈크리스틴, 항혈관형성제 및 파조파니브의 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 암이 호지킨 림프종, B-세포 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, T-세포 비호지킨 림프종, AML, CLL, MM, 기타 백혈병, 난소암, 유방암, 폐암, 육종, 방광암, 췌장암, 갑상선암, 간세포암, 위암, 윌름 종양, 신경모세포종, 교모세포종 및 기타 뇌 종양, 결장암, 직장암, 전립선암, 흑색종, 신 세포 암종, 및 피부암의 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  18. 인간 IL-18 (서열 1)을 암 세포 표면 상에 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체와 조합하여 포함하며, 상기 항체가 항체-의존성-세포-매개형 세포독성 (ADCC) 효과기 기능을 갖고 있고 또한 상기 항체가 항-CD20 항체는 아닌 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 이에 의해 상기 환자에게서 장기간 생존 및/또는 암 재발 방지 및 면역학적 기억 유도가 발생하게 되는, 상기 환자에 게서 암을 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 항원이 CD22, CD19, HER2, HER3, EGFR, IGF-1R, AXL-1, FGFR, 인테그린 수용체, CEA, CD44 및 VEGFR의 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 암이 호지킨 림프종, B-세포 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, T-세포 비호지킨 림프종, AML, CLL, MM, 기타 백혈병, 난소암, 유방암, 폐암, 육종, 방광암, 췌장암, 갑상선암, 간세포암, 위암, 윌름 종양, 신경모세포종, 교모세포종 및 기타 뇌 종양, 결장암, 직장암, 전립선암, 흑색종, 신 세포 암종, 및 피부암의 군 중에서 선택되는 것인 방법.
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