JP2007528728A

JP2007528728A - 改善されたインターロイキン−２ムテイン

Info

Publication number: JP2007528728A
Application number: JP2007502104A
Authority: JP
Inventors: キンバリーデニス−マイズ，; カーラヘイズ，; ダニエルメネゼス，; スーザンイー．ウィルソン，
Original assignee: カイロンコーポレーション
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2005-03-04
Publication date: 2007-10-18
Also published as: CA2557677A1; US20060234205A1; AU2005220822A1; RU2006135112A; JP2007527242A; AU2005220872A1; BRPI0508455A; WO2005086798A2; US20060269515A1; KR20070003934A; EP1723251A2; MXPA06010021A; EP1817332A2; JP2008509651A; WO2005086751A3; WO2005086798A3; CA2558632A1; BRPI0508470A; US20060160187A1; CA2564614A1

Abstract

新規のヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）ムテインまたはその改変体、なりびに核酸分子およびその改変体が、提供される。これらのムテインを作製するための方法、ならびに動物の免疫系を刺激するための方法もまた、開示される。さらに、本発明は、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクターおよびその発現ベクターが導入されている宿主細胞も提供する。治療有効量の本発明のヒトＩＬ−２ムテインおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物が、包含される。上記ＩＬ−２ムテインは、天然のＩＬ−２またはプロロイキン＆ｒｅｇ；ＩＬ−２よりも低毒性である一方で、ＮＫ細胞媒介性効果を維持または増強し、そして上記ＩＬ−２ムテインは、癌を処置する際、および免疫系を刺激する際に使用するため薬学的組成物において使用され得る。

Description

（発明の分野）
本発明は、向上された治療効能を有するヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインに関する。また、癌を処置するため、および哺乳動物の免疫系を刺激するために利用され得る新規の分子および薬学的処方物の製造方法が提供される。

（発明の背景）
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞の増殖および機能の強力な刺激物質である（非特許文献１）。この天然に存在するリンホカインは、単独でか、またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞もしくは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と組み合わせた場合の何れも、種々の悪性疾患に対して抗腫瘍活性を有することが示されている（例えば、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６を参照のこと）。しかしながら、腫瘍成長に関して明確な治療結果を達成するために使用される高用量のＩＬ−２は、重度の副作用（例えば、発熱および悪寒、低血圧および毛細管漏出（血管漏出症候群（ｖａｓｃｕｌａｒｌｅａｋｓｙｎｄｒｏｍｅ）、すなわちＶＬＳ）および神経学的変化）を誘発する場合が多い（例えば、非特許文献７；非特許文献８；および非特許文献９を参照のこと）。

ＩＬ−２誘導性毒性およびＶＬＳの根拠となる正確な機構は明らかではないが、蓄積されたデータによれば、ＩＬ−２誘導性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６を含む炎症誘発性サイトカインの過剰生産の結果としての用量制限性の毒性（ＤＬＴ）を誘発することが示唆されている。これらのサイトカインは、単球／マクロファージを活性化し、一酸化窒素生産を誘導し、その後の内皮細胞の損傷をもたらす（非特許文献１０；非特許文献１１）。これらの観察により、高親和性ＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）がＴ細胞上で選択的に発現されるという仮説に基づいてＮＫ細胞ではなくＴ細胞に対して優先的な選択性を示すＩＬ−２ムテインの開発に導かれる人々が存在する（例えば、ＢＡＹ５０−４７９８、特許文献１に開示される成熟ヒトＩＬ−２のＮ８８ＲＩＬ−２ムテインおよび非特許文献１２を参照のこと）。

天然（ＮＫ）、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ細胞溶解殺傷、サイトカイン生産および増殖のような多様なＮＫ機能は、異なるＮＫ細胞内シグナル伝達経路における特定の中間体の活性化に依存している。重要なことに、ＩＬ−２−ＩＬ−２Ｒ相互作用の選択的モジュレーションが、多様な下流のＮＫ細胞媒介性およびＴ細胞媒介性のエフェクター機能（例えば、増殖、サイトカイン生産および細胞溶解殺傷）に影響し得るという証拠が存在する（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。

プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標）ＩＬ−２（組換えヒトＩＬ−２ムテインアルデスロイキンを含む；ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、黒色腫および腎臓癌の処置のためにＦＤＡに認可されており、非ホジキンリンパ腫、ＨＩＶおよび乳癌を含む他の臨床適応に関して研究中である。しかしながら、ＩＬ−２に関連する毒性の副作用に起因して、このインターロイキンのより多くの治療用途を可能にするより毒性の低いＩＬ−２ムテインについての必要が存在する。低減された毒性および／または増強されたＩＬ−２媒介性のＮＫ細胞またはＴ細胞のエフェクター機能を有するＩＬ−２ムテインは、より広範な用途を有しており、そして癌治療のため、および、免疫応答を調節するために特に有益である。
国際公開第９９／６０１２８号パンフレットＭｏｒｇａｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９７６年、第１９３巻：１００７−１０１１Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」１９８７年、第３１６巻：８８９−８９７Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、「Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．」１９８８年、第２０８巻：１２１−１３５Ｔｏｐａｌｉａｎら、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．」１９８８年、第６巻：８３９−８５３Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」１９８８年、第３１９巻：１６７６−１６８０Ｗｅｂｅｒら、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．」１９９２年、第１０巻：３３−４０Ｄｕｇｇａｎら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」１９９２年、第１２巻：１１５−１２２Ｇｉｓｓｅｌｂｒｅｃｈｔら、「Ｂｌｏｏｄ」１９９４年、第８３巻：２０８１−２０８５ＳｚｎｏｌおよびＰａｒｋｉｎｓｏｎ、「Ｂｌｏｏｄ」１９９４年、第８３巻：２０２０−２０２２Ｄｕｂｉｎｅｔｔら、「ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ．」１９９４年、第１５７巻：１７０−１８０Ｓａｍｌｏｗｓｋｉら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．ＥｍｐｈａｓｉｓＴｕｍｏｒＩｍｍｕｎｏｌ．」１９９５年、第１８巻：１６６−１７８Ｓｈａｎａｆｅｌｔら、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」２０００年、第１８巻：１１９７−２０２Ｓａｕｖｅら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」１９９１年、第８８巻：４６３６−４６４０Ｈｅａｔｏｎら、「ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．」１９９３年、第５３巻：２５９７−２６０２Ｅｃｋｅｎｂｅｒｇら、「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．」２０００年、第１９１巻：５２９−５４０

（発明の要旨）
本発明は、低減された毒性であることが予測される改善された機能プロファイルを有するヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインに関する。このムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２のムテインと比較して、ＮＫ細胞の増殖を維持または増大させ、ＮＫ媒介性ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ細胞溶解機能を維持しながらＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産をより低いレベルで誘導し、そしてＴ細胞増殖機能を維持する。ヒトＩＬ−２のムテインをコードする単離された核酸分子およびこれらのムテインを含む単離されたポリペプチドが、提供される。癌を処置する際および免疫応答を調節する際のこれらの改善されたヒトＩＬ−２ムテインの臨床使用もまた、記載される。

１つの局面において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。特定の実施形態において、上記核酸分子は、配列番号：

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヒトＩＬ−２のムテインをコードする。

特定の実施形態において、本発明は、配列番号：

からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ヒトＩＬ−２のムテインをコードする単離された核酸分子を包含する。

特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を包含し、このムテインは、配列番号：

からなる群より選択される配列の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列を有する。

特定の実施形態において、本発明は、配列番号：

からなる群より選択される配列のヌクレオチド４〜３９９を含むヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を包含する。

特定の実施形態において、本明細書に記載される核酸分子は、さらに置換を含み得、ここで配列番号：

のヌクレオチド３７３〜３７５は、アラニンをコードするトリプレットコドンで置き換えられている。

のヌクレオチド３７３〜３７５は、システインをコードするトリプレットコドンで置き換えられている。

特定の実施形態において、本明細書に記載された核酸分子は、発現を最適化するためにさらに改変される。このような核酸は、ムテインをコードする１つまたは複数のコドンが目的の宿主細胞内での発現に関して最適化されているヌクレオチド配列を含む。最適化コドンを含有する例示的な核酸としては、配列番号３４５、配列番号３４５のヌクレオチド４〜３９９、配列番号３４６および配列番号３４６のヌクレオチド４〜３９９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明は、選択された宿主細胞における使用のための発現ベクターをさらに包含し、ここで発現ベクターは本発明の１以上の核酸を含む。このような発現ベクターにおいて、上記核酸配列は、選択された宿主細胞内での発現と適合性のある制御エレメントに作動可能に連結される。多くの発現制御エレメントが当該分野で公知であり、これらとしては、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳開始の最適化のための配列および翻訳終止配列が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な転写プロモーターとしては、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

別の局面において、本発明は、本発明の発現ベクターを含む細胞を提供し、ここで核酸配列（例えば、ヒトＩＬ−２のムテインをコードする配列）は、選択された細胞内の発現と適合性のある制御エレメントに作動可能に連結される。１つの実施形態において、そのような細胞は、哺乳動物細胞である。例示的な哺乳動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施において有用であり得る他の細胞、細胞型、組織型などとしては、以下にから得られるものが挙げられるが、これらに限定されない：昆虫（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ（Ｔｎ５）およびＳｆ９）、細菌、酵母、植物、抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞およびその先祖細胞）、初代細胞、不死化細胞、腫瘍誘導細胞。

別の局面において、本発明は、ヒトＩＬ−２ムテインの組換え生産のための本発明の発現ベクターおよび宿主細胞のいずれ含む組成物を提供する。このような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。

さらなる局面において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、本発明は、配列番号：

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを包含する。

特定の実施形態において、本発明は、配列番号：

からなる群より選択されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２〜１３３を含む単離されたポリペプチドを包含する。

特定の実施形態において、本明細書中に記載されるポリペプチドは、さらに置換を含み得、ここでアラニン残基は、配列番号：

の１２５位のセリン残基に対して置換される。

特定の実施形態において、本明細書中に記載されるポリペプチドは、さらに置換を含み得、ここでシステイン残基は、配列番号：

の１２５位のセリン残基に対して置換される。

特定の実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンおよび配列番号４内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸の置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を含み、ここで上記ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較して、１）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を維持または増強し、そして２）ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産の低減されたレベルを誘導する。例示的な置換としては、以下：

が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号４の１位のアラニンの欠失をさらに含む。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増加した増殖およびＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産の低減したレベルは、ＮＫ−９２バイオアッセイにより検出され得る。ＮＫ細胞の増殖およびＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産に対する本明細書中に記載されたポリペプチドの作用は、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量の作用と比較される。特定の実施形態において、ＮＫ−９２バイオアッセイを使用して、本明細書中に記載されるポリペプチドが、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察されるレベルと比較して炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αの低減されたレベルを誘導することを示す。

特定の実施形態において、ＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイを使用して、本明細書中に記載されるポリペプチドが、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察される細胞毒性と比較して、ヒトＮＫ細胞媒介性ナチュラルキラー細胞毒性、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞毒性またはＡＤＣＣ媒介細胞毒性を維持または改善することを示す。

特定の実施形態において、本明細書中に記載されたポリペプチドは、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察されるものと比較して、ＮＫ３．３細胞株においてリン酸化ＡＫＴの誘導を維持または改善する。

特定の実施形態において、ムテインにより誘導されたＮＫ細胞増殖は、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される増殖の１５０％超である。

特定の実施形態において、ムテインにより誘導されたＮＫ細胞増殖は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖の１７０％超である。

特定の実施形態において、ムテインにより誘導されたＮＫ細胞の増殖は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖の約２００％〜約２１０％である。

特定の実施形態において、上記ムテインにより誘導されたＮＫ細胞の増殖は、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される増殖よりも少なくとも１０％増大している。

特定の実施形態において、上記ムテインにより誘導されたＮＫ細胞の増殖は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖よりも少なくとも１５％増大している。

特定の実施形態において、上記ムテインにより誘導された炎症誘発性サイトカイン生産は、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される産生の１００％未満である。

特定の実施形態において、上記ムテインにより誘導された炎症誘発性サイトカイン生産は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される産生の７０％未満である。

特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドを提供し、上記ムテインは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンおよび配列番号４内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸の置換を有する配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ここで上記ムテインのＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産に対するＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞の増殖の比は、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察されるものよりも少なくとも１．５倍高く、ここで０．１ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞増殖および１．０ｎＭムテインにおけるＴＮＦ−α生産は、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる。特定の実施形態において、上記比は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものよりも少なくとも２．５倍高い。他の実施形態において、上記比は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものよりも少なくとも３．０倍高い。

特定の実施形態において、本発明は、単離されたポリペプチドを提供し、ここで上記ムテインは、被験体に投与された場合、その被験体においてインビボ温度チップを用いた体温の測定、血管漏出の測定または最大許容用量の測定により調べたときに、改善された耐容性を示す。

特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドを提供し、ここで上記ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察される用量と比較してより高い最大許容用量を有し、ここで上記最大許容用量は、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫動物モデルを用いて測定される。

特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドを提供し、ここで上記ムテインは、類似の処置条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２での処置と比較して同等または改善された抗腫瘍活性および低減された副作用を示し、ここで上記抗腫瘍活性は、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫動物モデルを用いて評価される。

特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドを提供し、ここで上記ムテインは、類似の処置条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２での処置と比較して同等または改善された抗腫瘍活性および低減された副作用を示し、ここで上記抗腫瘍活性は、高悪性度非ホジキンリンパ腫Ｎａｍａｌｗａ動物モデルまたは低悪性度非ホジキンリンパ腫Ｄａｕｄｉ動物モデルを用いて評価される。

特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドを提供し、ここで上記ムテインは、リツキシマブと同時投与された場合に、類似の処置条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２での処置と比較して同等または改善された抗腫瘍活性および低減された副作用を示し、ここで上記抗腫瘍活性は、高悪性度非ホジキンリンパ腫Ｎａｍａｌｗａ動物モデルまたは低悪性度非ホジキンリンパ腫Ｄａｕｄｉ動物モデルを用いて評価される。

特定の実施形態において、本発明は、単離されたポリペプチドを提供し、ここで上記ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較して改善された免疫エフェクター細胞活性化を示す。活性化免疫細胞はとしては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージおよび好中球が挙げられ得るが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、本発明は、単離されたポリペプチドを提供し、ここで上記ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較して改善された抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）媒介性細胞溶解殺傷を示す。

特定の実施形態において、本発明は、単離されたポリペプチドを提供し、ここで上記ムテインは、血管漏出症候群の動物モデルにおいてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較して血管漏出の低下をもたらす。

特定の実施形態において、本発明は、単離されたポリペプチドを提供し、ここで上記ムテインは、動物モデルにおいてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較して、より少ない体温変化をもたらし、ここで体温は、温度チップにより動物内でモニタリングされる。

特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインについてのアミノ酸を含む単離されたポリペプチドを含み、上記ムテインは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンおよび１６位、３６位、４０位、４２位、６１位、６５位、６７位、７２位、９１位、９４位、９５位および１０７位からなる群より選択される配列番号４の位置における少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を有する、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号４の１位にアラニンの欠失をさらに含む。

別の局面において、本発明は、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインを産生する方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載される任意の核酸分子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、およびポリペプチドとしてのその核酸分子の発現を可能にする条件下で細胞培養培地において上記宿主細胞を培養する工程、およびそのポリペプチドを単離する工程を包含する。特定の実施形態において、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ヒトＩＬ−２から選択される参照ヒトＩＬ−２ムテインの同様の量と比較して、ＮＫ細胞の増殖を維持または増強し得、そしてまたＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、ここでＮＫ細胞の増殖および炎症誘発性サイトカイン生産は、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いた同様のアッセイ条件下でアッセイされる。

別の局面において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインを含む本明細書中に記載される１以上のポリペプチドの治療有効量を含む組成物を提供する。そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。

別の局面において、本発明は、哺乳動物において免疫系を刺激するための方法を提供する。この方法は、哺乳動物に治療有効量のヒトＩＬ−２ムテインを投与する工程を包含し、この投与は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２分子の同様の量と比較して、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増強し、ここでＮＫ細胞の増殖および炎症誘発性サイトカイン生産は、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いた同様のアッセイ条件下でアッセイされる。特定の実施形態において、上記哺乳動物はヒトである。

特定の実施形態において、免疫系を刺激するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、配列番号：

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

からなる群より選択されるアミノ酸配列の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、免疫系を刺激するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、さらに置換を含み得、ここでアラニン残基は、配列番号：

の１２５位のセリン残基に対して置換されている。

特定の実施形態において、免疫系を刺激するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、置換をさらに含み得、ここでシステイン残基は、配列番号：

の１２５位のセリン残基に対して置換される。

別の局面において、本発明は、哺乳動物において癌を処置するための方法を提供し、この方法は、上記哺乳動物に治療有効量のヒトＩＬ−２ムテインを投与する工程を包含し、ここで上記ムテインは、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２分子の同様の濃度と比較してＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増強し、ここで上記ＮＫ細胞の増殖および上記炎症誘発性サイトカイン生産は、ＮＫ−９２バイオアッセイを使用してアッセイされる。特定の実施形態において、上記哺乳動物はヒトである。

特定の実施形態において、癌を処置するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、配列番号：

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。

の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列を含み得る。

特定の実施形態において、癌を処置するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、置換をさらに含み得、ここでアラニン残基は、配列番号：

の１２５位のセリン残基に対して置換される。

特定の実施形態において、癌を処置するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、置換をさらに含み得、ここでシステイン残基は、配列番号：

の１２５位のセリン残基に対して置換される。

別の局面において、本発明は、処置プロトコルとしてインターロイキン−２（ＩＬ−２）投与を受けている被験体においてＩＬ−２誘導性毒性症状を低減するための方法を提供する。この方法は、ＩＬ−２ムテインとしてＩＬ−２を投与する工程を包含する。

特定の実施形態において、処置に使用されるＩＬ−２ムテインは、配列番号：

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

からなる群より選択されるアミノ酸配列の残基２〜１３３を含む。

特定の実施形態において、処置に使用されるＩＬ−２ムテインは、置換をさらに含み、ここでアラニン残基は、配列番号：

の１２５位のセリン残基に対して置換される。

特定の実施形態において、処置に使用されるＩＬ−２ムテインは、置換をさらに含み、ここでシステイン残基は、配列番号：

の１２５位のセリン残基に対して置換される。

（発明の詳細な説明）
本発明は、低減した毒性および／または改善されたＮＫ細胞またはＴ細胞のエフェクター機能に起因して、改善された治療効能を有するヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）のムテインに関する。本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインおよび生物学的に活性なその改変体は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を維持または増大させながら低減した炎症誘発性サイトカイン生産を誘発する。「炎症誘発性サイトカイン」によって、免疫系を刺激し得るサイトカインが意図される。このようなサイトカインとしては、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６が挙げられるが、これらに限定されない。

用語「ムテイン」は、アミノ酸の欠失、置換または両方により、天然に存在するタンパク質についてのアミノ酸配列とは異なる変異アミノ酸配列を含むタンパク質をいう。本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、成熟ヒトＩＬ−２配列の１２５位のシステイン残基に対して置換されたセリン残基（すなわち、Ｃ１２５Ｓ）および少なくとも１つの他のアミノ酸置換を有することによって成熟ヒトＩＬ−２配列とは異なるアミノ酸配列を含み、そして、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の１位におけるＮ末端アラニン（Ａｌａ）の欠失のような成熟ヒトＩＬ−２配列と比較して１以上のアミノ酸欠失をさらに含み得る。代替的な実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、成熟ヒトＩＬ−２配列の１２５位のシステイン残基を保持しているが、少なくとも１つの他のアミノ酸置換を有しており、そして、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の１位におけるＮ末端アラニン（Ａｌａ）の欠失のような成熟ヒトＩＬ−２配列と比較して１以上のアミノ酸欠失をさらに含み得る。これらのヒトＩＬ−２ムテインは、その製造において使用される宿主発現系に応じて、グリコシル化または非グリコシル化され得る。本明細書中で開示される特定の置換は、本明細書中に記載されるＮＫ−９２細胞アッセイを使用して、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較した場合に、低減した炎症誘発性サイトカイン生産を誘発する所望の活性を保持する一方でＮＫ細胞の増殖を維持または増強するヒトＩＬ−２の改変体を生じる。低減した毒性および／または改善されたＮＫ細胞増殖を有するＩＬ−２改変体を生じるヒトＩＬ−２配列内の位置およびそれらの位置における関連する置換を同定すると、ヒトＩＬ−２配列内の他の残基を変化させることによりこれらの所望の活性もまた保持する、本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインの改変体を得ることは当業者の知るとおりである。本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインのこのような改変体もまた、本発明により包含されることが意図され、そして以下にさらに規定される。

ヒトＩＬ−２は、配列番号２に示される前駆体ポリペプチドとしてまず翻訳される。この前駆体ポリペプチドは、例えば、配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされる。この前駆体ポリペプチドは、配列番号２の残基１〜２０におけるシグナル配列を含む。用語「成熟ヒトＩＬ−２」は、例えば、配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされる配列番号４に示されるアミノ酸配列を指す。用語「Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン」または「Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２」は、成熟ヒトＩＬ−２配列の１位に存在するＮ末端アラニンを保持し、そして成熟ヒトＩＬ−２配列の１２５位のシステインに対するセリンの置換を有する成熟ヒトＩＬ−２のムテインを指す。Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインは、配列番号５に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされる配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する。用語「デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２」および「デス−アラニル−１，セリン−１２５ヒトＩＬ−２」は、成熟ヒトＩＬ−２配列のアミノ酸１２５位のシステインに対するセリンの置換を有し、そして成熟ヒトＩＬ−２配列の１位（すなわち、配列番号４の１位）に存在するＮ末端アラニンを欠いている成熟ヒトＩＬ−２のムテインを指す。デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２は、配列番号７に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされる配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する。「アルデスロイキン」と称されているＥ．ｃｏｌｉ組換え生産デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインは、商標プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標）ＩＬ−２（ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の下に市販されている処方物として利用可能である。本発明の目的のためには、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインは、本発明のヒトＩＬ−２ムテインにより示されるべき所望の活性を決定するための参照ＩＬ−２ムテインとして機能する。すなわち、本発明の適切なヒトＩＬ−２ムテインにおけるＮＫ細胞による低減したＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産（特に、ＴＮＦ−α生産）の所望の活性は、同様のアッセイ条件下におけるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインの等しい量により誘導されるＮＫ細胞の炎症誘発性サイトカイン生産の量と比較して測定される。同様に、本発明の適切なヒトＩＬ−２ムテインにおいてＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を維持または増大する所望の活性は、同様のアッセイ条件下におけるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインの等しい量により誘導されるＮＫ細胞増殖の量と比較して測定される。

少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含み、これらの２種の参照ＩＬ−２ムテインと比較した場合にＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導する一方でＮＫ細胞増殖を維持または増大させるような、ヒトＩＬ−２ムテインをコードする単離された核酸分子およびその生物学的に活性な改変体が、提供される。本発明の核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドもまた、提供される。

本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、本明細書中においては、「偶数の配列番号１０〜３４４に示される配列」とも称される、配列番号：

に示されるムテインを包含する。本発明はまた、これらのムテインをコードする任意のヌクレオチド配列（例えば、それぞれ、配列番号：

に示されるコード配列）を提供する。これらのコード配列はまた、本明細書において「奇数の配列番号９〜３４３に示される配列」とも称される。これらの前述のアミノ酸配列に示されるムテインは、以下の表１に示されるさらなる置換のうちの１つを有するＣ１２５ＳヒトＩＬ−２アミノ酸を含む。

代替的な実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、欠失されたこれらのアミノ酸の１位の元のアラニン残基を有し、以下の表１に示される１つのさらなる置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２アミノ酸配列を含む。従って、これらのムテインは、配列番号：

に示される配列の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列を有する。本発明はまた、これらのムテインをコードする任意のヌクレオチド配列（例えば、配列番号：

に示される配列のヌクレオチド４〜３９９に示されるコード配列を提供する。

本明細書中に記載される所望のヒトＩＬ−２ムテイン機能プロファイルを有する、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体、そのフラグメントおよび切断型もまた、提供される。例えば、開示されるヒトＩＬ−２ムテインのフラグメントまたは切断型は、当該分野で周知であり、本明細書中の他の箇所で記載される組換えＤＮＡ技術を用いて、完全長ヒトＩＬ−２ムテインアミノ酸配列からアミノ酸残基を除去することによって作製され得る。本発明のヒトＩＬ−２ムテインの適切な改変体は、新しいヒトＩＬ−２ムテイン自身により示される活性と同様の生物学的活性を有しており、すなわち、これらは、本明細書中の他の箇所に開示されるバイオアッセイを用いて参照のＩＬ−２分子（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２）と比較した場合に、新規のヒトＩＬ−２ムテインの低い毒性（すなわち、低いかまたは低減した炎症誘発性サイトカイン生産）、ならびにＮＫ細胞増殖を維持または増大させる能力を有する。本明細書において同定される任意の所定の新規のヒトＩＬ−２ムテインの改変体は、それが低減された毒性を有するという所望の生物学的プロファイルを保持している限り、すなわち、参照ヒトＩＬ−２ムテインと比較してＮＫ細胞による低いレベルの炎症誘発性サイトカイン生産および／または増大したＮＫ細胞増殖を誘導する限り、本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較してある特定の生物学的活性の異なる絶対レベルを有し得ることが認識される。

（表１．以下に示される群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）またはデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）のアミノ酸配列を含む、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの例）

本発明の組成物は、本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたはその生物学的に活性な改変体の組換え生産のためのベクターおよび宿主細胞をさらに含む。さらに、本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインまたはその生物学的に活性な改変体の治療有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物もまた、提供される。

参照ＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較してより低いレベルのＮＫ細胞による炎症誘発性生産を誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増大させるヒトＩＬ−２のムテインの製造方法は、本発明によって包含される。これらの方法は、本発明の新しいヒトＩＬ−２ムテインをコードするか、またはその生物学的に活性な改変体をコードする核酸分子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、コードされたポリペプチドの発現を可能にする条件下において細胞培養用の培地中で宿主細胞を培養する工程、およびこのポリペプチド産物を単離する工程を包含する。

また、本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたはその生物学的に活性な改変体の治療有効量を動物に投与する工程を包含する、動物の免疫系を刺激するため、または、哺乳動物における癌を処置するための方法も提供され、ここでＩＬ−２ムテインまたはその改変体は、以下に開示されるバイオアッセイを用いて決定した場合、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較して、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞増殖を維持または増大させる。

本発明はまた、処置プロトコルとしてＩＬ−２投与を受けている被験体におけるインターロイキン−２（ＩＬ−２）誘導性毒性症状を低減するための方法を提供する。この方法は、本発明のＩＬ−２ムテイン（すなわち、本明細書中の以下に開示されるバイオアッセイを用いて決定した場合、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較して、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増大させるムテイン）を投与する工程を包含する。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）およびヌクレオチドアナログを用いて作製される上記ＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを包含することが意図される。核酸分子は、１本鎖であっても２本鎖であってもよいが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。本発明は、単離された核酸もしくはタンパク質組成物、または実質的に精製された核酸もしくはタンパク質組成物を包含する。「単離された」もしくは「精製された」核酸分子またはタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境中で見出される場合に、その核酸分子もしくはタンパク質に通常伴っているか、またはそれらと相互作用する成分を、実質的または本質的に含有しない。従って、単離もしくは精製された核酸分子またはタンパク質は、組換え技術により製造された場合、他の細胞物質または培地を実質的に含有しないか、あるいは化学合成された場合、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含有しない。好ましくは、「単離された」核酸分子は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ内の核酸に天然に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）（好ましくは、タンパク質コード配列）を含有しない。例えば、種々の実施形態において、単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ内の核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、約４ｋｂ、約３ｋｂ、約２ｋｂ、約１ｋｂ、約０．５ｋｂまたは約０．１ｋｂ未満を含み得る。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、夾雑タンパク質の約３０％、２０％、１０％、５％または１％（乾燥重量による）未満を有するタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な改変体が組換え生産される場合、好ましくは培地は、化学前駆体または目的の非タンパク質化学物質の約３０％、２０％、１０％、５％または１％未満を表す。

（新規のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的活性）
本発明の新しいヒトＩＬ−２ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較して、またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較して、高値の治療指数を有する。本発明のムテインを分類するために、同様のタンパク質濃度および類似のアッセイ条件を用いて、いずれかの所定の比較がなされる場合、後者の２つのムテインは、本発明の新しいムテインの生物学的プロファイルがこれら２つの前もって特徴付けられたムテインの生物学的プロファイルと比較されることから、本明細書において「参照ＩＬ−２ムテイン」と称される。本発明のムテインの高値の治療指数は、これら２つの参照ＩＬ−２ムテインの何れかの毒性プロファイルおよびＮＫ細胞および／またはＴ細胞のエフェクター機能と比較される場合、これらのムテインの改善された毒性プロファイル（すなわち、ムテインはＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカインの生産をより低いレベルで誘導する）、毒性の上昇を伴わない増大したＮＫ細胞および／またはＴ細胞のエフェクター機能、または改善された毒性プロファイルおよび増大したＮＫ細胞および／またはＴ細胞のエフェクター機能の両方において反映される。

３つの機能的終点を使用して、上昇した治療指数を有するムテインを選択した：（１）デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産を低減する能力；（２）デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産の増大を伴うことなく、ＮＫ細胞およびＴ細胞のＩＬ−２誘導性増殖を維持または増大させる能力；ならびに（３）デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＮＫ媒介性細胞溶解細胞殺傷を維持または改善（すなわち、増大）する能力。ＮＫ媒介性細胞溶解細胞殺傷は、ＮＫ媒介性、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）媒介性および抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）媒介性の細胞溶解殺傷を包含する。

治療指数において最大の改善を示す本明細書中に開示される新しいヒトＩＬ−２ムテインは、改善された臨床的利益を予測する３種の機能的なクラスに属する。特記すべきは、これらのムテインの全てが、維持または増大されたＴ細胞増殖活性およびＮＫ媒介性細胞溶解活性を示すことである。ムテインの第１の機能クラスは、ＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を維持しつつ、参照ＩＬ−２ムテイン（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産を低減する有益な変異を有することによって特徴付けられる。ムテインの第２の機能クラスは、参照ＩＬ−２ムテインの何れかにより誘導されるものと比較して、炎症誘発性サイトカイン生産にマイナスの影響を与える（すなわち、増大する）ことなく、参照ＩＬ−２ムテインの何れかにより誘導されるものと比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増大させる。ムテインの第３の機能クラスは、これら２つの参照ＩＬ−２ムテインの何れにより誘導されるこれらの活性のレベルと比較した場合、それらがＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増大させながら、ＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産を低減することができるという点において「二官能性」であるムテインを含む。

新しく単離されたＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖および炎症誘発性サイトカイン生産を測定するためのアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｐｅｒｕｓｓｉａ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ９：３７０およびＢａｕｍｅら（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１−６を参照のこと。ＮＫ−９２細胞株は、ＩＬ−２の存在下での増殖を含む、ＮＫ細胞の表現型および機能的特性を有する（Ｇｏｎｇら（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ８：６５２）が、ＩＬ−２の存在下のＴＮＦ−αの生産が殆どまたは全く無いことが以前に報告されている（Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ９１：３８５０）。ヒトＮＫ細胞およびＴ細胞の機能的活性化をスクリーニングするために開発されたＩＬ−２バイオアッセイは、本明細書中および以下の実験の節において開示される。他のアッセイを使用してＮＫ細胞増殖およびＮＫ細胞の炎症誘発性サイトカイン生産、およびＴ細胞エフェクター機能を測定し得るが、好ましくは、本明細書中に開示されるＩＬ−２バイオアッセイを用いて目的のＩＬ−２ムテインをスクリーニングし、それらが本明細書中に開示されるムテインの所望の特性を保持しているか否かを決定する。特に興味深いものは、ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産の低減した誘導である。すなわち、１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖およびＴＮＦ−α生産は、ヒトＮＫ−９２細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ−２４０７、ＣＭＣＣＩＤ＃１１９２５）に関して以下に記載されるＩＬ−２バイオアッセイを使用して測定される。ＮＫ−９２細胞株に関する説明については、Ｇｏｎｇら（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ８（４）：６５２−６５８を参照のこと。本発明の目的のために、このバイオアッセイは、「ＮＫ−９２バイオアッセイ」と称される。

「低減する」または「低減された」炎症誘発性サイトカイン産生は、特にＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産の誘導に関して、本発明のヒトＩＬ−２ムテインが、参照ＩＬ−２ムテイン（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）により誘導されるものと比較して低減した、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のレベルを誘導することが意図される。本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、類似のアッセイ条件下においてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導されるものの少なくとも２０％であるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産の最小レベルを誘導するが、本発明のムテインにより誘導され得るＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産の最大レベルは、ムテインが分類される機能クラスに依存する。

従って、例えば、いくつかの実施形態において、上記ムテインは、ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産に対する負の影響を有することなくＮＫ細胞増殖の大きく増強された誘導のために選択されている（すなわち、ムテインの第２の機能クラス）。これらの実施態様において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、参照ＩＬ−２ムテインにより誘導されるものと同様（すなわち、±１０％）、または好ましくは参照ＩＬ−２ムテインにより誘導されるものの９０％未満のＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導し、ここでＴＮＦ−α生産は、ヒトＮＫ−９２細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ−２４０７、ＣＭＣＣＩＤ＃１１９２５）を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）、そしてそれぞれのヒトＩＬ−２ムテインの１．０ｎＭまたは１００ｐＭ（すなわち、０．１ｎＭ）濃度を用いてアッセイされる。本発明の他の実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導されるＴＮＦ−α生産の９０％未満、好ましくは８５％未満、更に好ましくは８０％未満であるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導し、ここでＴＮＦ−α生産は、ヒトＮＫ−９２細胞株を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）、そしてそれぞれのヒトＩＬ−２ムテインの１．０ｎＭ濃度を用いてアッセイされる。いくつかの実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるＴＮＦ−α生産の少なくとも２０％であるが６０％未満を誘導し、ここでＴＮＦ−α生産は、ヒトＮＫ−９２細胞株を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）、そしてそれぞれのヒトＩＬ−２ムテインの１．０ｎＭ濃度を用いてアッセイされる。参照ＩＬ−２ムテインと比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖も維持または増大するこのようなムテインは、ＩＬ−２ムテインの第１の機能クラスに属する。

「維持する」によって、本発明のヒトＩＬ−２ムテインが、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察される活性のレベルに対して、所望の生物学的活性の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも８５％〜１００％まで（すなわち、同等の値）を誘導することが意図される。従って、所望の生物学的活性がＮＫ細胞増殖の誘導である場合は、本発明の適切なＩＬ−２ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導されるＮＫ細胞増殖活性の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％〜１００％まで（±５％）のＮＫ細胞増殖のレベルを誘導し、ここでＮＫ細胞増殖は、同じバイオアッセイ（すなわち、本明細書中で開示されるＮＫ−９２バイオアッセイ）および同様の量のこれらＩＬ−２ムテインを用いる類似の条件下でアッセイされる。

「増強する」または「増大させる」または「改善する」によって、ヒトＩＬ−２ムテインが、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察されるものと比較して増大しているレベルの所望の生物学的活性を誘導することが意図される。従って、所望の生物学的活性がＮＫ細胞増殖の誘導である場合は、本発明の適切なＩＬ−２ムテインは、同じＮＫ細胞増殖アッセイ（例えば、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイ）を使用してデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察されるＮＫ細胞増殖活性の少なくとも１０５％、１１０％、１１５％、より好ましくは少なくとも１２０％、更により好ましくは少なくとも１２５％、そして最も好ましくは少なくとも１３０％、１４０％または１５０％であるＮＫ細胞増殖のレベルを誘導する。

ＮＫ細胞増殖を測定するアッセイは、当該分野で周知である（例えば、Ｂａｕｍｅら（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．２２：１−６、Ｇｏｎｇら（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ８（４）：６５２−６５８および本明細書中で記載されるＮＫ−９２バイオアッセイを参照のこと）。好ましくは、ＮＫ−９２細胞を用いて、ＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産（特に、ＴＮＦ−α生産）およびＮＫ細胞増殖を測定する（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイ）。ＮＫ細胞増殖アッセイにおいて使用するのに適切なヒトＩＬ−２ムテイン濃度は、約０．００５ｎＭ（５ｐＭ）〜約１．０ｎＭ（１０００ｐＭ）、（０．００５ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭおよび他の約０．００５ｎＭと約１．０ｎＭの間のこのような値が挙げられる）を包含する。本明細書中の以下に記載される好ましい実施形態において、ＮＫ細胞増殖アッセイは、ＮＫ−９２細胞および約０．１ｎＭまたは約１．０ｎＭのヒトＩＬ−２ムテインの濃度を用いて実施される。

炎症誘発性サイトカイン生産の低減された誘導および維持または増強されたＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖の結果として、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の何れかよりも、より好ましいＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖：ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産の比を有し、ここでこれらの活性は、各ムテインについて類似のタンパク質濃度およびバイオアッセイ条件を用いて測定される。測定される炎症誘発性サイトカインがＴＮＦ−αである場合、本発明の適切なヒトＩＬ−２ムテインは、同様のバイオアッセイ条件およびタンパク質濃度の下でのデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で得られるものの少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも１．７５倍、２．０倍、２．２５倍、更に好ましくは参照ＩＬ−２ムテインで得られるものの少なくとも２．７５倍、３．０倍または３．２５倍である、０．１ｎＭムテインにおけるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖：１．０ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産の比を有する。いくつかの実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、同様のバイオアッセイ条件およびタンパク質濃度の下でのデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で得られるものの少なくとも３．５倍、４．０倍、４．５倍、または更には５．０倍である、０．１ｎＭムテインにおけるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖：１．０ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産の比を有する。

本発明のムテインはまた、同様のバイオアッセイ条件およびタンパク質濃度の下でのデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものと比較して、ＮＫ細胞生存を増強（すなわち、増大）する。ＮＫ細胞生存は、本明細書中に記載されるアッセイを含む当該分野で公知の任意のアッセイを用いて決定され得る。従って、例えば、目的のＩＬ−２ムテインの存在下のＮＫ細胞の生存は、ＮＫ細胞においてグルココルチコステロイドのプログラムされた細胞死をブロックし、そしてＢＣＬ−２発現を誘導するＩＬ−２ムテインの能力を測定することによって、決定され得る（例えば、Ａｒｍａｎｔら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８５：３３１を参照のこと）。

本発明は、ＮＫ細胞生存に対するＩＬ−２の効果をモニタリングするためのアッセイを提供する。従って、１つの実施形態において、目的のヒトＩＬ−２ムテインの存在下でのＮＫ細胞の生存は、ｐＡＫＴＥＬＩＳＡを用いたＮＫ３．３細胞（ＣＭＣＣＩＤ＃１２０２２；Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９（６）：２８３１−２８３７を参照のこと）における細胞生存シグナル伝達カスケードを誘導するムテインの能力を測定することによって決定される。この様式において、目的のＩＬ−２ムテインによるＮＫ細胞におけるＡＫＴのリン酸化のアップレギュレーションは、ＮＫ細胞生存の指標として使用される。

本発明の方法において使用するためのＩＬ−２ムテインは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化および／または増やして、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）活性および抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する。休止（非活性化）ＮＫ細胞は、ヒト赤白血病Ｋ５６２細胞株のような「ＮＫ細胞感受性」標的と称される特定の細胞標的に対する、自発的または天然の細胞毒性を媒介する。ＩＬ−２による活性化の後、ＮＫ細胞は、ＬＡＫ活性を獲得する。このようなＬＡＫ活性は、例えば、種々の腫瘍細胞および他の「ＮＫ非感受性」標的（例えば、休止（すなわち、非活性化）ＮＫ細胞による溶解に通常は耐性であるＤａｕｄｉＢ細胞リンパ腫株）を殺傷するＩＬ−２活性化ＮＫ細胞の能力を測定することによりアッセイされ得る。同様に、ＡＤＣＣ活性は、「ＬＡＫ感受性／ＮＫ非感受性」の標的細胞（例えば、ＤａｕｄｉＢ細胞リンパ腫株）、または関連する腫瘍細胞に特異的な抗体の最適濃度の存在下で休止（すなわち、非活性化）ＮＫ細胞により容易に溶解されない他の標的細胞を溶解する、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞の能力を測定することによってアッセイされ得る。ＮＫ／ＬＡＫ細胞の細胞毒性活性およびＡＤＣＣを発生させて測定するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃＳｔｕｄｉｅｓｉｎＨｕｍａｎｓ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１７，Ｕｎｉｔ７．７，７．１８および７．２７（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９６）を参照のこと。１つの実施形態において、本発明のＩＬ−２ムテインのＡＤＣＣ活性は、末梢血ＮＫ細胞の表現型および機能的特徴を示すＮＫ３．３細胞株を用いて測定される。本発明の目的のために、このアッセイは、本明細書において「ＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイ」と称される。

本発明のヒトＩＬ−２ムテインはまた、同様のバイオアッセイ条件およびタンパク質濃度の下でデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものと比較して、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞増殖を維持または増強し得る。Ｔ細胞増殖アッセイは、当該分野で周知である。１つの実施形態において、ヒトＴ細胞株Ｋｉｔ２２５（ＣＭＣＣＩＤ＃１１２３４；Ｈｏｒｉら（１９８７）Ｂｌｏｏｄ７０（４）：１０６９−１０７２）を使用して、本明細書の以下に記載されるアッセイに従ってＴ細胞増殖を測定する。

上記した通り、本明細書において同定された主要なヒトＩＬ−２ムテイン候補（すなわち、最も改善された治療指数を有する新規のムテイン）は、３つの機能クラスに分類される。第１の機能クラスは、１．０ｎＭのタンパク質濃度において同様の条件下で全ムテインをアッセイした場合に、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるものの約６０％以下のＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のより低値のレベルを誘導し、そしてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＮＫ細胞の増殖を維持または増強するムテインを含む。これらのムテインは、以下の２つのサブクラスにさらに分けられる：（１）これらのムテインが約１．０ｎＭのタンパク質濃度において同様の条件下でアッセイされる場合に参照ヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増強（すなわち、１００％超）するが、約０．１ｎＭ以下の濃度の参照ヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較して低減された（すなわち、１００％未満の）ＮＫ細胞増殖活性を有するヒトＩＬ−２ムテイン；および（２）これらのムテインが約１．０ｎＭ〜約０．０５ｎＭ（すなわち約５０ｐＭ）のタンパク質濃度において同様の条件下でアッセイされる場合に参照ヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増強（すなわち、１００％超）または維持（すなわち、少なくとも約７０％〜約１００％）するヒトＩＬ−２ムテイン。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＮＫ増殖およびＴＮＦ−α生産は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）測定され、この測定において、ＮＫ細胞増殖は、市販のＭＴＴ色素還元キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）非放射活性細胞増殖アッセイキット；ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎより入手可能））を用いて決定され、そして刺激指数は、比色読み取り値に基づいて計算され、そしてＴＮＦ−αは、市販のＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅＣｙｔｏｓｃｒｅｅｎ^ＴＭヒトＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット；Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて定量される。この第１の機能クラスに属するヒトＩＬ−２ムテインとしては、Ｆ４２Ｅ、Ｖ９１ＤおよびＬ７２Ｎからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含むムテインが挙げられ、ここで残基の位置（すなわち、４２、９１または７２）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。Ｃ１２５Ｓ置換に加えてＦ４２ＥまたはＶ９１Ｄの置換を含むヒトＩＬ−２のムテインは、ヒトＩＬ−２の１位にＮ末端アラニンを含んでいてもいなくてもよく、この第１の機能クラスのムテインのサブクラス（１）に属する。本明細書中の以下の実施例８および表１３を参照のこと。Ｃ１２５Ｓ置換に加えてＬ７２Ｎ置換を含むヒトＩＬ−２のムテインは、ヒトＩＬ−２の１位にＮ末端アラニンを含んでいてもいなくてもよく、この第１の機能クラスのムテインのサブクラス（２）に属する。本明細書中の以下の実施例８および表１４を参照のこと。

第２の機能クラスのヒトＩＬ−２ムテインとしては、ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産に対して有害な影響を及ぼすことなくＮＫ細胞増殖を強力に増大させるムテインが挙げられる。この機能グループに属するムテインは、以下の３つの選択基準を満たす：（１）０．００５ｎＭ（すなわち、５ｐＭ）、０．０２ｎＭ（すなわち、２０ｐＭ）、０．０５ｎＭ（すなわち、５０ｐＭ）、０．１ｎＭ（すなわち、１００ｐＭ）または１．０ｎＭ（すなわち、１０００ｐＭ）からなる群より選択されるヒトＩＬ−２ムテインの１以上の濃度において、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるレベルの約２００％超であるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖のレベル；（２）０．００５ｎＭ（すなわち、５ｐＭ）、０．０２ｎＭ（すなわち、２０ｐＭ）、０．０５ｎＭ（すなわち、５０ｐＭ）、０．１ｎＭ（すなわち、１００ｐＭ）または１．０ｎＭ（すなわち、１０００ｐＭ）からなる群より選択されるヒトＩＬ−２ムテインの少なくとも２つの濃度について測定される場合に、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるレベルの約１５０％超であるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖のレベル；ならびに（３）ＴＮＦ−α生産が１．０ｎＭ（すなわち、１０００ｐＭ）または０．１ｎＭ（すなわち、１００ｐＭ）のムテイン濃度でアッセイされる場合に、参照ＩＬ−２ムテインにより誘導されるものと同様（すなわち、±１０％）、または好ましくは参照ＩＬ−２ムテインにより誘導されるものの９０％未満であるＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産のレベル。１つの実施形態において、ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中で開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）決定され、ここでＴＮＦ−α生産はＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＮＫ細胞増殖は上記したＭＴＴアッセイにより測定される。この第２の機能クラスに属するヒトＩＬ−２ムテインとしては、Ｌ３６ＤおよびＬ４０Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含むムテインが挙げられ、ここで残基の位置（すなわち、３６または４０）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。本明細書中の以下の実施例８および表１５を参照のこと。

第３の機能クラスのヒトＩＬ−２ムテインとしては、それらが、参照ＩＬ−２ムテインと比較して増大したＮＫ細胞増殖およびＮＫ細胞により低減したＴＮＦ−α生産を誘導する点において「二官能性」であるムテインが挙げられる。この第３の機能クラスに属するムテインは、以下の基準を満たす：（１）０．００５ｎＭ（すなわち、５ｐＭ）、０．０２ｎＭ（すなわち、２０ｐＭ）、０．０５ｎＭ（すなわち、５０ｐＭ）、０．１ｎＭ（すなわち、１００ｐＭ）または１．０ｎＭ（すなわち、１０００ｐＭ）からなる群より選択されるいずれか１つのムテイン濃度についてアッセイされる場合に、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察されるレベルの少なくとも約１５０％であるＮＫ細胞増殖のレベルを誘導すること；および（２）約１．０ｎＭのムテイン濃度においてアッセイされる場合にデス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるレベルの約７５％未満であるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導すること。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）決定され、ここでＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産は、ＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、上記したＭＴＴ試験によって測定される。この第３の機能クラスに属するヒトＩＬ−２ムテインとしては、Ｌ１９Ｄ、Ｆ４２ＲおよびＥ６１Ｒからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含むムテインが挙げられ、ここで残基の位置（すなわち、１９、４２または６１）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。本明細書中の以下の実施例８および表１６を参照のこと。

本発明はまた、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２に関して観察されるものと比較して改善された治療指数に寄与する他の選択基準を満たすヒトＩＬ−２ムテインを提供する。従って、例えば、別の実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、１．０ｎＭのムテイン濃度においてアッセイされる場合にデス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルの約１００％未満、好ましくは約９５％または９０％未満、より好ましくは約８５％未満であるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導し、そして、０．１ｎＭのムテイン濃度においてアッセイされる場合にデス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるものと比較して約１３０％超までＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増大させる。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）決定され、ここでＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産は、ＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＩＬ−２誘導ＮＫ細胞増殖は上記したＭＴＴ試験により測定される。これらの機能基準を有するヒトＩＬ−２ムテインは、Ｈ１６Ｄ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ３６Ｄ、Ｌ３６Ｐ、Ｌ４０Ｄ、Ｌ４０Ｇ、Ｐ６５Ｌ、Ｐ６５Ｙ、Ｅ６７Ａ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ８０Ｋ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｇ、Ｙ１０７ＨおよびＹ１０７Ｒからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含み、ここで残基の位置（すなわち、１６、１９、３６、４０、６５、６７、７２、８０、９４、９５および１０７）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。これらの機能基準を満たすムテインはまた、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものより少なくとも１．２５倍高く、好ましくは少なくとも１．５倍、１．７５倍または２．０倍高く、そして約２．５倍〜約２．７５倍までの高い、０．１ｎＭムテインにおけるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖：１．０ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産の比を示す。本明細書の以下の実施例２および表３もまた参照のこと。そこではデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン内のさらなる適切な置換が列挙される。

別の実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、１．０ｎＭのムテイン濃度においてアッセイされる場合、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルの約１００％以下である、ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導し、そして０．１ｎＭのムテイン濃度においてアッセイされる場合、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるものと比較して約１５０％超までＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増大させる。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）決定され、ここでＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産は、ＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、上記したＭＴＴ試験によって測定される。これらの機能基準を有するヒトＩＬ−２ムテインは、Ｌ３６Ｇ、Ｌ３６Ｈ、Ｌ４０ＧおよびＰ６５Ｆからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含み、ここで残基の位置（すなわち、３６、４０および６５）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。これらの機能基準を満たすムテインはまた、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものより少なくとも１．５倍高く、好ましくは少なくとも２．０倍高く、そして約２．５倍までの高い、０．１ｎＭムテインにおけるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖：１．０ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産の比を示す。本明細書中の以下の実施例２および表４を参照のこと。

本発明の他のヒトＩＬ−２ムテインは、１．０ｎＭの濃度でアッセイされる場合、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルより高く、約１１０％以下であるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導し、そして０．１ｎＭでアッセイされる場合、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるものと比較して１５０％超までＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増大させる。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）決定され、ここでＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産は、ＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、上記したＭＴＴ試験によって測定される。これらの機能基準を有するヒトＩＬ−２ムテインは、Ｌ３６Ｒ、Ｋ６４Ｇ、Ｋ６４Ｌ、Ｐ６５Ｅ、Ｐ６５Ｇ、Ｐ６５ＴおよびＰ６５Ｖからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含み、ここで残基の位置（すなわち、３６、６４および６５）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。これらの機能基準を満たすムテインはまた、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものより少なくとも１．５倍高く、好ましくは少なくとも１．７５倍高く、そして約２．０倍〜約２．５倍高い、０．１ｎＭムテインにおけるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖：１．０ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産の比を示す。本明細書中の以下の実施例２および表４を参照のこと。

他の実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、１．０ｎＭ濃度でアッセイされる場合、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルの約９０％未満、好ましくは約８０％未満のＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導し、そして０．１ｎＭおよび１．０ｎＭでアッセイされる場合、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるものの少なくとも９５％、好ましくは少なくとも１０５％、より好ましくは少なくとも１２０％〜約２００％のＮＫ細胞増殖を誘導するか、または、０．１ｎＭにおけるＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインにより誘導されるものと比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を維持する（すなわち、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％または８５％、より好ましくは少なくとも９０％〜約１００％）。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）決定され、ここでＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産は、ＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、上記したＭＴＴ試験によって測定される。これらの機能基準を有するヒトＩＬ−２ムテインは、Ｈ１６Ｄ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ３６Ｄ、Ｌ３６Ｐ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｒ、Ｅ６１Ｒ、Ｐ６５Ｌ、Ｐ６５Ｙ、Ｅ６７Ａ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｋ、Ｎ８８Ｄ、Ｖ９１Ｄ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｇ、Ｙ１０７ＨおよびＹ１０７Ｒからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含み、ここで残基の位置（すなわち、１６、１９、３６、４２、６１、６５、６７、７２、８０、８１、８８、９１、９４、９５および１０７）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。このカテゴリーに属する他の適切なムテインは、以下の表５に示される。これらの機能基準を満たすムテインはまた、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものより少なくとも１．２５倍高く、好ましくは少なくとも１．５倍高く、１．７５倍高く、２．０倍高く、そして約２．５倍〜約２．７５倍の高い、０．１ｎＭムテインにおけるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖：１．０ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産の比を示す。本明細書中の以下の実施例３および表５を参照のこと。

代替的な実施形態において、本発明のＩＬ−２ムテインは、１．０ｎＭの濃度でアッセイされる場合、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルの約８０％未満、好ましくは約７０％未満のＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導し、そして１．０ｎＭでアッセイされる場合、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるものの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、１００％または１０５％、より好ましくは少なくとも１１０％〜約１５０％のＮＫ細胞増殖を誘導する。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）決定され、ここでＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産は、ＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は上記したＭＴＴアッセイによって測定される。これらの機能基準を有するヒトＩＬ−２ムテインは、Ｆ７８Ｓ、Ｆ７８Ｗ、Ｈ７９Ｆ、Ｈ７９Ｍ、Ｈ７９Ｎ、Ｈ７９Ｐ、Ｈ７９Ｑ、Ｈ７９Ｓ、Ｈ７９Ｖ、Ｌ８０Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｙ、Ｒ８１Ｅ、Ｒ８１Ｌ、Ｒ８１Ｎ、Ｒ８１Ｐ、Ｒ８１Ｔ、Ｎ８８ＨおよびＱ１２６Ｉからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換、またはＥ６１Ｍ、Ｅ６２Ｔ、Ｅ６２Ｙ、Ｌ８０Ｇ、Ｌ８０Ｎ、Ｌ８０Ｒ、Ｌ８０Ｗ、Ｄ８４Ｒ、Ｎ８８Ｔ、Ｅ９５Ｍ、Ｙ１０７Ｌ、Ｙ１０７ＱおよびＹ１０７Ｔからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含み、ここで残基の位置（すなわち、６１、６２、７８、７９、８０、８１、８４、８８、９５または１０７）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。本明細書中の以下の実施例３、ならびに表６および表７を参照のこと。

さらに別の実施形態において、本発明のＩＬ−２ムテインは、以下の機能基準を満たす：（１）１．０ｎＭ濃度でアッセイされる場合、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルの約１００％未満、好ましくは約９５％、９０％または８５％未満、より好ましくは約８０％未満または約７５％未満であるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導すること、（２）０．１ｎＭおよび１．０ｎＭでアッセイされる場合、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を維持（約１００％）または増大（約１０５％〜約１２０％）すること；そして（３）Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものの約１４０％超〜約１６０％まで、そして、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものの約１１５％超〜約１３０％までＮＫ媒介性細胞毒性活性を向上させること。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）決定され、ここでＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産は、ＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、上記したＭＴＴアッセイによって測定される；そしてＫ５６２細胞に対するＮＫ媒介性細胞毒性活性は、例えば、本明細書中に開示されるＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイにおいてＮＫ３．３細胞株を用いて測定される。これらの機能基準を有するヒトＩＬ−２ムテインは、Ｐ３４Ｒ、Ｐ３４Ｔ、Ｌ３６Ａ、Ｌ３６Ｄ、Ｌ３６Ｐ、Ｒ３８Ｐ、Ｆ４２ＡおよびＬ８０Ｒからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含み、ここで残基の位置（すなわち、３４、３６、３８、４２または８０）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。本明細書中の以下の実施例４および表８を参照のこと。

別の実施形態において、本発明のＩＬ−２ムテインは、改善された毒性を予測する炎症誘発性サイトカインのより低いレベル、並びに、改善されたＮＫ細胞増殖活性および改善されたＬＡＫ媒介性細胞毒性活性を誘導するその能力に関して選択される。これらのムテインは以下の機能基準を満たす：（１）１．０ｎＭ濃度でアッセイされる場合、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるものの約１００％未満、好ましくは約９５％、９０％、８５％または８０％未満であるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導すること；（２）１．０ｎＭおよび０．１ｎＭでアッセイされる場合、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を維持（約１００％）または増大（約１０５％〜約１４０％）すること；そして（３）デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるものの約１０５％超、好ましくは約１１０％、１１５％または１２０％超〜約１４０％までＬＡＫ媒介細胞毒性活性を改善すること。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）決定され、ここでＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産は、ＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、上記したＭＴＴアッセイによって測定される；そしてＤａｕｄｉ細胞に対するＬＡＫ媒介性細胞毒性活性は、本明細書中に開示されるＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイにおいてＮＫ３．３細胞株を使用して測定される。これらの機能基準を有するヒトＩＬ−２ムテインは、Ｌ３６Ｐ、Ｌ３６Ｒ、Ｆ４２Ａ、Ｌ８０ＲおよびＶ９１Ｑからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含み、ここで残基の位置（すなわち、３６、４２、８０または９１）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。本明細書中の以下の実施例５および表９を参照のこと。

他の実施形態において、本発明のＩＬ−２ムテインは、その改善された毒性、改善されたＮＫ細胞増殖活性および改善されたＡＤＣＣ媒介性細胞毒性活性に関して選択される。これらのムテインは、以下の機能基準を満たす：（１）１．０ｎＭ濃度でアッセイされる場合、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるものの約１００％未満、好ましくは約９５％、９０％、８５％または８０％未満であるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導すること；（２）１．０ｎＭまたは０．１ｎＭでアッセイされる場合、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を維持（少なくとも９０％）または増大（約１０５％〜約１１５％）すること；そして（３）デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるものの約１０５％超、好ましくは約１１０％または１１５％〜１２０％超までＡＤＣＣ媒介性細胞毒性活性を向上させること。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）測定され、ここでＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産は、ＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、上記したＭＴＴアッセイによって測定される；そして抗体、例えばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ；ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８；ＩＤＥＣＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の存在下におけるＤａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ媒介性細胞毒性活性は、本明細書中に開示されるＮＫ３．３細胞株およびＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイを使用して測定される。これらの機能基準を有するヒトＩＬ−２ムテインは、Ｄ２０ＥまたはＥ６７Ａからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含み、ここで残基の位置（すなわち、２０または６７）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。本明細書中の以下の実施例６および表１０を参照のこと。

別の実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、ＮＫ３．３細胞を使用するｐＡＫＴＥＬＩＳＡアッセイによって測定される場合、参照ＩＬ−２ムテインに関して観察されるものと比較してＮＫ細胞生存を維持または増強する。これらの機能的特性を有するヒトＩＬ−２ムテインは、Ｌ４０Ｄ、Ｌ４０Ｇ、Ｌ８０Ｋ、Ｒ８１Ｋ、Ｌ９４ＹおよびＥ９５Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含み、ここで残基の位置（すなわち、４０、８０、８１、９４または９５）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。これらの機能基準を満たす他の適切なムテインを示す、本明細書中の以下の実施例７および表１１を参照のこと。

（新規のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体）
本発明はまた、参照ＩＬ−２分子と比較してこれらの改善された特性もまた有する本明細書中に開示される新規のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体を提供する。すなわち、この生物学的に活性な改変体は、本明細書中の他の箇所に開示される標準的なバイオアッセイを使用して、参照ＩＬ−２分子（すなわち、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２）を比較した場合、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカインの低い生産または低減された産生を誘導し、そしてＮＫ細胞増殖を維持または増大させる。前述の通り、本明細書において同定される何れかの所定の新規のヒトＩＬ−２ムテインの改変体は、それが参照ＩＬ−２分子と比較して所望の特性（すなわち、参照ヒトＩＬ−２ムテインと比較した場合に、炎症誘発性サイトカイン生産が低減し、そして／またはＮＫ細胞増殖が増大するという、低減された毒性）を有する限り、本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較して特定の生物学的活性の異なる絶対的レベルを有し得る。

「改変体」によって、実質的に同様の配列が意図される。本明細書中に記載される新規のヒトＩＬ−２ムテインの改変体は、天然に存在する核酸配列またはアミノ酸配列に由来してもよいし（例えば、ＩＬ−２遺伝子座に存在する対立遺伝子改変体）、組換え生産された核酸配列またはアミノ酸配列に由来してもよい（例えば、ムテイン）。ポリペプチド改変体は、本明細書中に開示される新規のヒトＩＬ−２ムテインのフラグメントであってもよいし、または、それらは、上記改変体ポリペプチドが本明細書中に開示される新規のヒトＩＬ−２ムテイン内に存在する目的の特定のアミノ酸置換を保持している限り、１以上のアミノ酸の置換もしくは欠失、またはアミノ酸挿入を有することによって新規のヒトＩＬ−２ムテインと異なっていてもよい。従って、適切なポリペプチド改変体としては、成熟ヒトＩＬ−２配列（すなわち、配列番号４）の１２５位に対応するＣ１２５Ｓ置換、本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインの改善された治療指数に寄与するものとして本明細書中で同定された第２のアミノ酸置換（すなわち、上記表１に示される置換、好ましくは以下の表１２に示される置換）を有し、そして１以上のさらなるアミノ酸の置換もしくは欠失、またはアミノ酸挿入を有するものが挙げられる。従って、例えば、上記新規のヒトＩＬ−２ムテインが、表１に示される群から選択される少なくとも１つの他の置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含む場合、これらの新規のヒトＩＬ−２ムテインの適切な生物学的に活性な改変体はまた、Ｃ１２５Ｓ置換ならびに表１に示される変異により表される他の置換を含むが、上記改変体ポリペプチドが参照ＩＬ−２分子（すなわち、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２）と比較して所望の特性を有し、従って、参照ヒトＩＬ−２ムテインと比較した場合に炎症誘発性サイトカイン生産が低減し、そして／またはＮＫ細胞増殖が増大するという、低減された毒性を有する限り、上記の生物学的に活性な改変体は、１以上のさらなる置換、挿入または欠失を有する点においてそれぞれの新規のヒトＩＬ−２ムテインとは異なり得る。このような改変体は、それぞれの新規のヒトＩＬ−２ムテイン（例えば、配列番号：

に示されるヒトＩＬ−２ムテイン）のアミノ酸配列と少なくとも７０％、一般的に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％同一であり、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで配列同一性の割合は、本明細書中の以下で記述するとおりに決定される。他の実施形態において、上記生物学的に活性な改変体は、配列番号：

の残基２〜１３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、一般的に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％同一であり、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで配列同一性の割合は、本明細書中の以下で記述するとおりに決定される。

本発明のいくつかの実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体は、ヒトＩＬ−２ムテインの所望の機能特性に影響しない、アラニンのような別の中性のアミノ酸で置き換えられたＣ１２５Ｓ置換を有する。従って、例えば、このような改変体は、配列番号：

の１２５位におけるセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含むアミノ酸配列を有する。さらに他の実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテイン生物学的に活性な改変体は、配列番号：

の残基２〜１３３を含むが、例外として、これらの配列の１２５位においてセリン残基に対して置換されたアラニン残基を有する。

本発明の代替的な実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体は、配列番号：

のアミノ酸配列を含むが、例外として、これらの配列の１２５位においてセリン残基に対して置換されたシステイン残基を有する。さらに他の実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体は、配列番号：

の残基２〜１３３を含むが、例外として、これらの配列の１２５位においてセリン残基に対して置換されたシステイン残基を有する。

核酸「改変体」によって、本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインをコードするが、そのヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重に起因して本明細書中に開示される新規のムテイン配列とは異なるポリヌクレオチドが意図される。天然に存在するアミノ酸についてのコドンは当該分野で周知であり、これらとしては、組換えタンパク質を発現するために使用される特定の宿主生物において最も頻繁に使用されているコドンが挙げられる。本明細書中に開示されるＩＬ−２ムテインをコードするヌクレオチド配列は、添付する配列表に示されるもの、ならびに遺伝子コードの縮重により開示される配列とは異なるヌクレオチド配列を包含する。

従って、例えば、本発明のＩＬ−２ムテインがアラニン残基（すなわち、Ａ）の置換を含む場合（例えば、Ｔ７Ａ、Ｋ９Ａ、Ｑ１１Ａ、Ｅ１５Ａ、Ｋ３２Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｌ６６Ａ、Ｅ６７Ａ、Ｖ９１ＡまたはＬ９４Ａの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニル−１Ｃ１２５Ｓムテイン）、置換されたアラニン残基をコードするヌクレオチド配列は、アラニンについての４つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＴ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがアスパラギン酸残基（すなわち、Ｄ）の置換を含む場合（例えば、Ｔ７Ｄ、Ｋ９Ｄ、Ｈ１６Ｄ、Ｌ１９Ｄ、Ｋ３５Ｄ、Ｌ３６Ｄ、Ｒ３８Ｄ、Ｌ４０Ｄ、Ｋ６４Ｄ、Ｐ６５Ｄ、Ｎ８８Ｄ、Ｖ９１ＤまたはＥ９５Ｄの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたアスパラギン酸残基をコードするヌクレオチド配列は、アスパラギン酸についての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＧＡＣおよびＧＡＴ）から選択され得る。本発明のＩＬ−２ムテインがアルギニン（すなわち、Ｒ）の置換を含む場合（例えば、Ｔ７Ｒ、Ｋ９Ｒ、Ｑ１１Ｒ、Ｐ３４Ｒ、Ｌ３６Ｒ、Ｆ４２Ｒ、Ｅ６１Ｒ、Ｋ６４Ｒ、Ｐ６５Ｒ、Ｌ８０Ｒ、Ｄ８４ＲまたはＹ１０７Ｒの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたアルギニン残基をコードするヌクレオチド配列は、アルギニンについての４つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡおよびＣＧＧ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがロイシン残基（すなわち、Ｌ）の置換を含む場合（例えば、Ｋ８Ｌ、Ｉ２４Ｌ、Ｋ３５Ｌ、Ｋ６４Ｌ、Ｐ６５Ｌ、Ｒ８１ＬまたはＹ１０７Ｌの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたロイシン残基をコードするヌクレオチド配列は、ロイシンについての６つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧ）から選択され得る。

本発明のＩＬ−２ムテインがセリン（すなわち、Ｓ）の置換を含む場合（例えば、Ｋ９Ｓ、Ｐ３４Ｓ、Ｌ３６Ｓ、Ｒ３８Ｓ、Ｌ４０Ｓ、Ｐ６５Ｓ、Ｆ７８Ｓ、Ｈ７９Ｓ、Ｔ１０２ＳまたはＴ１２３Ｓの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたセリン残基をコードするヌクレオチド配列は、セリンについての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＡＧＴおよびＡＧＣ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがバリン（すなわち、Ｖ）の置換を含む場合（例えば、Ｋ９Ｖ、Ｐ３４Ｖ、Ｆ４２Ｖ、Ｐ６５Ｖ、Ｈ７９Ｖ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ９４Ｖ、Ｔ１０２ＶまたはＱ１２６Ｖの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたバリン残基をコードするヌクレオチド配列は、バリンについての４つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡおよびＧＴＧ）から選択され得る。本発明のＩＬ−２ムテインがリジン（すなわち、Ｋ）の置換を含む場合（例えば、Ｔ１０Ｋ、Ｌ３６Ｋ、Ｆ４４Ｋ、Ｅ６１Ｋ、Ｐ６５Ｋ、Ｌ８０Ｋ、Ｒ８１Ｋ、Ｅ１０６ＫまたはＹ１０７Ｋの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたリジン残基をコードするヌクレオチド配列は、リジンについての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＡＡＡおよびＡＡＧ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがアスパラギン（すなわち、Ｎ）の置換を含む場合（例えば、Ｔ１０Ｎ、Ｋ３５Ｎ、Ｌ３６Ｎ、Ｌ３８Ｎ、Ｌ４０Ｎ、Ｐ６５Ｎ、Ｌ７２Ｎ、Ｈ７９Ｎ、Ｌ８０Ｎ、Ｒ８１ＮまたはＶ９１Ｎの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたアスパラギン残基をコードするヌクレオチド配列は、アスパラギンについての一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＧＡＴおよびＧＡＣ）から選択され得る。

本発明のＩＬ−２ムテインがスレオニン（すなわち、Ｔ）の置換を含む場合（例えば、Ｑ１１Ｔ、Ｐ３４Ｔ、Ｋ３５Ｔ、Ｆ４２Ｔ、Ｅ６２Ｔ、Ｐ６５Ｔ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ８０Ｔ、Ｒ８１Ｔ、Ｓ８７Ｔ、Ｎ８８Ｔ、Ｌ９４ＴまたはＹ１０７Ｔの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたスレオニン残基をコードするヌクレオチド配列は、スレオニンについての４つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＡＣＴ、ＡＣＣおよびＡＣＡ、ＡＣＧ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがグルタミン酸（すなわち、Ｅ）の置換を含む場合（例えば、Ｈ１６Ｅ、Ｌ１９Ｅ、Ｄ２０Ｅ、Ｎ３３Ｅ、Ｐ３４Ｅ、Ｌ３６Ｅ、Ｔ４１Ｅ、Ｆ４２Ｅ、Ｋ６４Ｅ、Ｐ６５Ｅ、Ｌ８０Ｅ、Ｒ８１ＥまたはＶ９１Ｅの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたグルタミン酸残基をコードするヌクレオチド配列は、グルタミン酸についての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＧＡＡおよびＧＡＧ）から選択され得る。本発明のＩＬ−２ムテインがイソロイシン（すなわち、Ｉ）の置換を含む場合（例えば、Ｋ３５Ｉ、Ｌ３６Ｉ、Ｍ４６Ｉ、Ｐ６５Ｉ、Ｌ９４ＩまたはＱ１２６Ｉの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたイソロイシン残基をコードするヌクレオチド配列は、イソロイシンについての３つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＡＴＴ、ＡＴＣおよびＡＴＡ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがプロリン（すなわち、Ｐ）の置換を含む場合（例えば、Ｋ３５Ｐ、Ｌ３６Ｐ、Ｒ３８Ｐ、Ｈ７９ＰまたはＲ８１Ｐの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたプロリン残基をコードするヌクレオチド配列は、プロリンについての４つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡおよびＣＣＧ）から選択され得る。

本発明のＩＬ−２ムテインがグルタミン（すなわち、Ｑ）の置換を含む場合（例えば、Ｋ３５Ｑ、Ｋ６４Ｑ、Ｐ６５Ｑ、Ｈ７９Ｑ、Ｖ９１Ｑ、Ｙ１０７ＱまたはＮ１１９Ｑの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたグルタミン残基をコードするヌクレオチド配列は、グルタミンについての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＣＡＡおよびＣＡＧ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがフェニルアラニン（すなわち、Ｆ）の置換を含む場合（例えば、Ｌ３６Ｆ、Ｐ６５Ｆ、Ｌ６６Ｆ、Ｈ７９Ｆ、Ｌ８０ＦまたはＶ９１Ｆの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたフェニルアラニン残基をコードするヌクレオチド配列は、フェニルアラニンについての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＴＴＴおよびＴＴＣ）から選択され得る。本発明のＩＬ−２ムテインがグリシン（すなわち、Ｇ）の置換を含む場合（例えば、Ｌ３６Ｇ、Ｒ３８Ｇ、Ｌ４０Ｇ、Ｔ４１Ｇ、Ｋ６４Ｇ、Ｐ６５Ｇ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ８０Ｇ、Ｖ９１Ｇ、Ｅ９５Ｇ、Ｍ１０４ＧまたはＥ１１６Ｇの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたグリシン残基をコードするヌクレオチド配列は、グリシンについての４つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡおよびＧＧＧ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがヒスチジン（すなわち、Ｈ）の置換を含む場合（例えば、Ｌ３６Ｈ、Ｋ４３Ｈ、Ｐ６５Ｈ、Ｎ８８ＨまたはＹ１０７Ｈの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたヒスチジン残基をコードするヌクレオチド配列は、ヒスチジンについての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＣＡＴおよびＣＡＣ）から選択され得る。

本発明のＩＬ−２ムテインがチロシン（すなわち、Ｙ）の置換を含む場合（例えば、Ｌ３６Ｙ、Ｅ６２Ｙ、Ｐ６５Ｙ、Ｌ８０ＹまたはＬ９４Ｙの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたチロシン残基をコードするヌクレオチド配列は、チロシンについての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＴＡＴおよびＴＡＣ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがシステイン（すなわち、Ｃ）の置換を含む場合（例えば、Ｔ１２３Ｃの置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニルＣ１２５Ｓムテイン）、置換されたシステイン残基をコードするヌクレオチド配列は、システインについての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＴＧＴおよびＴＧＣ）から選択され得る。

前述の核酸改変体のリストは、本明細書において同定される特定の残基の置換をコードするために利用され得る一般的なコドンを列挙しているが、本発明が、遺伝子コードにおける縮重の結果として、本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインをコードする全ての核酸改変体を包含することが認識される。

天然のヒトＩＬ−２の天然に存在する対立遺伝子改変体は、周知の分子生物学の技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術）を用いて同定され得、そしてこれらの新規のヒトＩＬ−２ムテインの所望の治療指数に影響することなく本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテイン内に導入され得るさらなる変異への指針として機能し得る。改変体ヌクレオチド配列はまた、例えば部位特異的変異誘発によって作製されているが、以下に議論するように、なお本明細書に開示される新規ＩＬ−２ムテインをコードする合成誘導されたヌクレオチド配列に由来するムテインも包含する。一般的に、本発明のヌクレオチド配列改変体は、例えば、配列番号：

に示される新規のヒトＩＬ−２ムテインコード配列に関して、そのそれぞれの新規のヒトＩＬ−２ムテインヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、一般的に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、ここで配列同一性の割合は、本明細書中の以下に注記するように決定される。他の実施形態において、本発明のヌクレオチド配列改変体体は、例えば、配列番号：

に示されるコード配列のヌクレオチド４〜３９９と少なくとも７０％、一般的に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、ここで配列同一性の割合は、本明細書中の以下に注記するように決定される。

本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、本発明のＩＬ−２ムテインをコードするオープンレーディングフレームを含む核酸分子を指す。本明細書中で使用される場合、語句「対立遺伝子改変体」は、ＩＬ−２遺伝子座に存在するヌクレオチド配列、またはそのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを指す。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的にはＩＬ−２遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変化をもたらす。各々このようなヌクレオチドのバリエーションの任意のものおよび全てと、天然の対立遺伝子変異の結果であり、そして本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインの機能活性を変更しないＩＬ−２配列において結果として生じるアミノ酸の多形またはバリエーションとは、本発明に従って変異され得る配列であることが意図され、そして結果として生じる配列の全てが、本発明の範囲内に包含されることが意図される。

例えば、本明細書中に開示される新規のヒトＩＬ−２ムテインのアミノ酸配列改変体は、変異が表１に同定されるさらなる置換を変更しない限り、新規のＩＬ−２ムテインをコードするクローニングされたＤＮＡ配列内において変異を作製することによって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野で周知である。例えば、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ（編）（１９８３）ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号およびそこに引用されている参考文献を参照のこと。ＩＬ−２ムテインの所望の生物学的活性（すなわち、毒性の低減、およびＮＫ細胞増殖の維持または増大を予測するＮＫ細胞による炎症誘発性生産の低減）に影響し得ない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）ＡｔｌａｓｏｆＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出される。

本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体を設計する場合、保存的な置換（例えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸に交換すること）が好ましくあり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられている置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。例えば、Ｂｏｗｉｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６を参照のこと。保存的置換の例としては、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔ＧｌｎおよびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、このような置換は、アミノ末端連続システイン残基のような保存されたシステイン残基に対しては行われない。

本明細書中で同定される所望の置換以外の残基の置換、欠失または挿入のいずれかを介して改変され得るヒトＩＬ−２タンパク質の領域に関する指針は、当該分野で見出されている。例えば、Ｂａｚａｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：４１０−４１２；ＭｃＫａｙ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：４１２；Ｔｈｅｚｅら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１７：４８１−４８６；ＢｕｃｈｌｉおよびＣｉａｒｄｅｌｌｉ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ３０７：４１１−４１５；Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：７７０９−７７１３；Ｋｕｚｉｅｌら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５７３１；Ｅｃｋｅｎｂｅｒｇら（１９９７）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ９：４８８−４９８で考察されている構造／機能の関連および／または結合研究を参照のこと。

本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインの改変体の構築において、その改変体をコードするヌクレオチド配列の改変は、その改変体ポリペプチドが所望の活性を保有し続けるようになされる。明らかに、改変体ポリペプチドをコードするＤＮＡ内に作製されるいずれの変異も、リーディングフレームの範囲外にその配列を配置してはならず、そして好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を形成する相補領域を作製しない。ポリペプチドの改変体は、わずか１〜１５個のアミノ酸残基（例えば、６〜１０個、わずか５個、わずか４個、３個、２個または更には１個のアミノ酸残基）だけ異なり得る。ヌクレオチド配列の改変体は、わずか１〜３０個のヌクレオチド（例えば、６〜２５個、わずか５個、わずか４個、３個、２個または更には１個のヌクレオチド）だけ異なり得る。

本発明のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体は、これらのムテインのフラグメントを含む。「フラグメント」によって、コードヌクレオチド配列の部分またはアミノ酸配列の部分が意図される。コード配列に関して、ヒトＩＬ−２ムテインヌクレオチド配列のフラグメントは、新規のヒトＩＬ−２ムテインの所望の生物学的活性を保持するムテインフラグメントをコードし得る。本明細書中に開示される新規のヒトＩＬ−２ムテインのフラグメントは、新規のヒトＩＬ−２ポリペプチドの１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸、５０アミノ酸、５５アミノ酸、６０アミノ酸、６５アミノ酸、７０アミノ酸、７５アミノ酸、８０アミノ酸、８５アミノ酸、９０アミノ酸、９５アミノ酸、１００アミノ酸、１０５アミノ酸、１１０アミノ酸、１１５アミノ酸、１２０アミノ酸、１２５アミノ酸、１３０アミノ酸であっても、完全長までのものであってもよい。コードヌクレオチド配列のフラグメントは、新規のヒトＩＬ−２ムテインをコードするヌクレオチド配列の少なくとも４５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１６５ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１９５ヌクレオチド、２１０ヌクレオチド、２２５ヌクレオチド、２４０ヌクレオチド、２５５ヌクレオチド、２７０ヌクレオチド、２８５ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３１５ヌクレオチド、３３０ヌクレオチド、３４５ヌクレオチド、３６０ヌクレオチド、３７５ヌクレオチド、３９０ヌクレオチドから全ヌクレオチド配列までの範囲であってよい。

本明細書中で開示されるヒトＩＬ−２ムテインおよびその生物学的に活性な改変体は、それらが参照ＩＬ−２分子と比較して所望の特性を有する限り（すなわち、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較して低減した毒性および／または増大したＮＫ細胞増殖を有する限り）、さらに改変され得る。さらなる改変としては、リン酸化、非天然アミノ酸アナログの置換などが挙げられるが、これらに限定されない。延長されたインビボ曝露をもたらし得、そしてそれによりＩＬ−２ムテインの薬学的処方物の効能を増大させ得るＩＬ−２ムテインの改変としては、タンパク質分子のグリコシル化またはＰＥＧ化が挙げられる。本来グリコシル化されていないタンパク質のグリコシル化は、その分子へＮ連結型グリコシル化部位を挿入することによって通常は行われる。このアプローチは、ＩＬ−２ムテインのようなタンパク質の半減期を延長するために使用され得る。さらに、このアプローチは、免疫原性エピトープを遮蔽し、タンパク質溶解度を上昇させ、凝集を低減し、そして発現および精製の収率を増大させるために使用され得る。

本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインの改変体が一旦得られれば、ヒトＩＬ−２ムテイン配列の欠失、挿入および置換が、特定のヒトＩＬ−２ムテインの特徴の劇的な変化を生じることは予測されない。しかしながら、置換、欠失または挿入の正確な効果をそれを実施するよりも前に予測することが困難である場合、当業者は、その効果が慣用的なスクリーニングアッセイによって評価されることを理解する。すなわち、ＩＬ−２誘導性のＮＫ細胞増殖またはＴ細胞増殖の活性は、本明細書中に記載されるアッセイを含む当該分野で公知の標準的な細胞増殖アッセイによって評価され得る。ＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産は、サイトカイン特異的ＥＬＩＳＡ（例えば、本明細書中の他の箇所に記載されるＴＮＦ−α特異的ＥＬＩＳＡ）を用いて測定され得る。ＮＫ細胞生存シグナル伝達は、ｐＡＫＴＥＬＩＳＡ（例えば、本明細書中の以下の記載されるアッセイを参照のこと）によって測定され得る。ＮＫ細胞媒介性細胞溶解活性（すなわち、細胞毒性）は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、本明細書中の他の箇所で記載されるＮＫ媒介性、ＬＡＫ媒介性またはＡＤＣＣ媒介性の細胞溶解活性の測定）によって測定され得る。

本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインおよびその生物学的に活性な改変体は、投薬頻度を低減するか、またはＩＬ−２耐容性をさらに向上させるために、第２のタンパク質に融合されたか、またはポリプロリンもしくは水溶性重合体に共有結合で結合体化されたＩＬ−２ムテイン（または本明細書に定義される、その生物学的に活性な改変体）を含むＩＬ−２融合体または結合体として構築され得る。例えば、ヒトＩＬ−２ムテイン（または本明細書に定義される、その生物学的に活性な改変体）は、当該分野で公知の方法を使用してヒトアルブミンまたはアルブミンフラグメントに融合され得る（例えば、ＷＯ０１／７９２５８を参照のこと）。あるいは、ヒトＩＬ−２（または本明細書に定義される、その生物学的に活性な改変体）は、当該分野で公知の方法を使用して、ポリプロリンまたはポリエチレングリコールのホモポリマーおよびポリオキシエチル化ポリオールに共有結合で結合体化され得、その場合ホモポリマーは、未置換であるか、または一端においてアルキル基で置換されており、そしてポリオールは未置換である（例えば、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号および同第４，８９４，２２６号を参照のこと）。

「配列同一性」によって、上記改変体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特定の連続するセグメントが、参照配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と整列されて比較される場合に、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基が、改変体配列および参照配列内に見出されることが意図される。配列アライメントおよび配列間の同一性の決定のための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）（１９９５）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１９（ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ）；およびＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８），ＡｔｌａｓｏｆＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ５：補遺３（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照のこと。２つのヌクレオチド配列の最適なアライメントに関して、改変体ヌクレオチド配列の連続セグメントは、参照ヌクレオチド配列に関して付加されたヌクレオチドまたは欠失したヌクレオチドを有し得る。同様に、２つのアミノ酸配列の最適アライメントの目的のために、改変体アミノ酸配列の連続セグメントは、参照アミノ酸配列に関して付加されたアミノ酸残基または欠失したアミノ酸残基を有し得る。参照ヌクレオチド配列または参照アミノ酸配列との比較のために使用される連続セグメントは、少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、またはアミノ酸残基を含み、そして３０個、４０個、５０個、１００個またはそれより多いヌクレオチドまたはアミノ酸の残基であり得る。改変体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列にギャップが含まれていることに伴って配列同一性が上昇することに対する補正は、ギャップペナルティーを割り当てることによって行われ得る。配列アライメントの方法は、当該分野で周知である。

２つの配列間の同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。本発明の目的のために、アミノ酸配列の配列同一性の割合は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムを使用して（ギャップオープンペナルティー１２およびギャップエクステンションペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２でのアファイン６ギャップサーチを使用）決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９に教示される。あるいは、ヌクレオチド配列の同一性の割合は、ギャップオープンペナルティー２５およびギャップエクステンションペナルティー５を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムを使用して決定される。配列同一性のこのような決定は、例えば、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃのＤｅＣｙｐｈｅｒＨａｒｄｗａｒｅＡｃｃｅｌｅｒａｔｏｒを用いて実施され得る。

アミノ酸同一性の割合を考慮する際には、一部のアミノ酸の位置は、ポリヌクレオチド機能の特性に影響しない保存的アミノ酸置換の結果として異なっていてよいことが更に認識される。これらの例において、配列同一性の割合は、保存的に置換されたアミノ酸における類似性を説明するために上方に調節され得る。このような調節は当該分野で周知である。例えば、Ｍｅｙｅｒｓら（１９８８）ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７を参照のこと。

（組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
一般的に、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、ベクター、好ましくは発現ベクターから発現される。ベクターは、宿主細胞内の自律複製のために有用であるか、または、宿主細胞内への導入によりその宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得、そしてこれにより、宿主ゲノムとともに複製される（例えば非エピソーム性哺乳動物ベクター）。発現ベクターは、それらが作動可能に連結されているコード配列の発現を指向することができる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において利用できる発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態である場合が多い。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターの別の形態も包含することを意図している。

本発明の発現構築物またはベクターは、宿主細胞内における核酸分子の発現に適する形態の本発明のヒトＩＬ−２ムテインをコードする核酸分子を含む。目的のコード配列は、例えば、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０２：３０５−３１０およびＤｅｖｏｓ（１９８３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１１：４３０７−４３２３により記載されている組換えＤＮＡ手法によるか、またはＷａｎｇら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：１４３１−１４３３に記載されている通り変異で変更されたＩＬ−２を用いて、作製できる。奇数配列番号９〜３４３に示すコード配列は、一般的にはメッセンジャーＲＮＡにおける翻訳開始コドンＡＴＧであるメチオニンに対するコドンではなく、配列番号４の成熟ヒトＩＬ−２配列の第１の残基に対するコドン（すなわち、１位のアラニンに対するコドン）で開始する。これらの開示されたヌクレオチド配列はまた、奇数配列番号９〜３４３の３９９位のヌクレオチドの後の翻訳終止コドンを欠いている。これらの配列または奇数配列番号９〜３４３のヌクレオチド４〜３９９を含む配列が本発明のヒトＩＬ−２ムテインを発現するために使用される場合は、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列を含む発現構築物は、さらに翻訳開始コドン、例えばＡＴＧコドンを、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列の上流および適切なリーディングフレーム内に含むと考えられる。翻訳開始コドンは、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列を含む配列内に既に存在する、例えばＡＴＧのような翻訳開始コドンを利用することにより、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列の開始コドンから上流の位置に提供することができ、またはその他の態様において、発現に使用されるべきプラスミドのような外来の原料から提供され得る（ただし、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列における開始コドンの前に最初に現れる翻訳開始コドンは、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列の開始コドンの適切なリーディングフレーム内にある）。同様に、本明細書に開示するヒトＩＬ−２ムテインコード配列は、偶数配列番号１０〜３４４に示す配列の最後のアミノ酸で終了するヒトＩＬ−２ムテインの産生を可能にするためには、例えばＴＧＡのような、１つまたは複数の翻訳終止コドンを後続させている。

組換え発現ベクターは、発現すべき核酸配列に作動可能に連結した発現のために使用すべき宿主細胞に基づいて選択される１つまたは複数の調節配列を含む。「作動可能に連結」とは、目的のヌクレオチド配列（すなわち、本発明のヒトＩＬ−２ムテインをコードする配列）がヌクレオチド配列の発現を可能にする態様で（すなわち、インビトロの転写／翻訳系において、または宿主細胞内にベクターを導入する場合は宿主細胞において）調節配列に連結されていることを意味する。「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を包含する。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０），ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を参照のこと。調節配列は、宿主細胞の多くの型におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指向するもの、および特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチドの発現を指向するものを包含する。当業者の理解するように、発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような要因に依存し得る。本発明の発現構築物を宿主細胞に導入することにより、本明細書に開示したヒトＩＬ−２ムテインを産生すること、または生物学的に活性なその改変体を産生することができる。

本発明の発現構築物またはベクターは、原核生物または真核生物の宿主細胞内でヒトＩＬ−２ムテインまたはその改変体を発現させるために設計することができる。原核細胞におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、構成プロモーターまたは誘導プロモーターを含有するベクターを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉで行われる。Ｅ．ｃｏｌｉ内の組換えタンパク質発現を最大限にするための方策は、例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ（１９９０），ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ），ｐｐ．１１９−１２８およびＷａｄａら（１９９２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：２１１１−２１１８に見出され得る。ヒトＩＬ−２ムテインまたはその改変体を増殖させるため、回収するため、破壊するため、または細胞から抽出するための処理は、実質的に、例えば、米国特許第４，６０４，３７７号；同第４，７３８，９２７号；同第４，６５６，１３２号；同第４，５６９，７９０号；同第４，７４８，２３４号；同第４，５３０，７８７号；同第４，５７２，７９８号；同第４，７４８，２３４号および同第４，９３１，５４３号に記載されている。

組換えヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体は、酵母またはヒトの細胞のような真核細胞中でも行うことができる。適切な真核生物宿主細胞には、以下が挙げられる：昆虫細胞（培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）中でタンパク質を発現するために使用できるバキュロウイルスベクターの例としては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１−３９）が挙げられる）；酵母細胞（酵母Ｓ．ｓｅｒｅｎｖｉｓｉａｅでの発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら，（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）およびｐＰｉｃＺ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる）；または哺乳動物細胞（哺乳動物発現ベクターとしては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯＪ６：１８７；１９５）が挙げられる）。適当な哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞を包含する。哺乳動物細胞においては、発現ベクターの制御機能は、ウイルスの調節エレメントにより与えられる場合が多い。例えば、一般的に使用されているプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方のための他の適当な発現系は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ）の第１６および１７章を参照のこと。Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０），ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を参照のこと。

本発明のヒトＩＬ−２ムテインをコードする配列は目的の宿主細胞内での発現のために最適化することができる。配列のＧ−Ｃ含量は所定の宿主細胞内で発現される既知遺伝子を参照に計算されるように、その細胞宿主に対して平均的なレベルに調節され得る。コドン最適化の方法は当該分野で周知である。個々のコドンは、最適化され得る(例えば、残基の置換（例えばＣ１２５Ｓ置換、Ｃ１２５Ａ置換および／または表１に示す別の置換）がなされているコドン）。あるいは、コード配列内のコドンの１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％までが特定の宿主細胞における発現のために最適化されているように、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列内の他のコドンを最適化して、宿主細胞内の発現を増強することができる。例えば、Ｅ６１ＲおよびＹ１０７Ｒ置換に関するコドンが、それぞれＥ．ｃｏｌｉでの発現のために最適化されている、配列番号３４５および３４６に開示したヒトＩＬ−２ムテイン配列を参照のこと。

「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は本明細書においては、交換可能に使用する。このような用語は、特定の被験体細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すものとする。変異または環境の影響により特定の改変は後続する世代でも起こりえるため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではなくてよく、しかしなお、本明細書において使用される用語の範囲に包含される。

ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞内に導入できる。本明細書においては、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、宿主細胞内に外来性核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための種々の当該分野で知られた技術（リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、粒子銃またはエレクトロポレーションが挙げられる）を意図する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ）および他の標準的な分子生物学の実験マニュアルに記載されている。

本発明のＩＬ−２ムテインおよび生物学的に活性なその改変体を作製するために使用される原核細胞および真核細胞は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ）に一般的に記載されているもののような、適切な培地中で培養される。

（薬学的組成物）
ヒトＩＬ−２ムテインまたはその改変体を作製し、精製した後、これらをヒト治療および獣医学的治療における用途（例えば癌の治療または予防、免疫療法および感染症の治療または予防）のための薬学的組成物中に処方し得る。したがって、ヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体は、種々の治療用途のための薬学的処方物として処方することができる。組成物として、ヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体は当該分野で公知の方法により、被験体に非経口投与される。被験体は哺乳動物、例えば霊長類、ヒト、イヌ、ウシ、ウマなどを包含する。これらの薬学的組成物は、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの有効性を増大させるか所望の性質を増強する別の化合物を含有してよい。薬学的組成物は選択された経路を介した投与に関して安全でなければならず、滅菌されていなければならず、生物活性を保持していなければならず、そしてヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体を安定に可溶化させなければならない。製剤過程に応じて、本発明のＩＬ−２ムテイン薬学的組成物は、液体形態において、常温、冷蔵または冷凍して保存することができ、または、経口または非経口投与経路を含む種々の方法のいずれかにより投与される前に、溶液、懸濁液または乳液に再構成できる凍結乾燥粉末のような乾燥形態で調製できる。

このような薬学的組成物は、典型的には、少なくとも１つのヒトＩＬ−２ムテイン、生物学的に活性なその改変体、またはその組み合わせ、および、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的投与のために本発明のヒトＩＬ−２ムテインを処方するための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）（１９９５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ（第１９版，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）を参照のこと。

本明細書においては、「薬学的に受容可能なキャリア」という用語は、薬学的投与と適合性のある任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野で周知である。いずれかの従来の培地または薬剤が活性化合物と適合性を有さない場合を除き、このような媒体はヒトＩＬ−２ムテインにおいて使用できる。補助的な活性化合物もまた組成物に組み込まれ得る。

ヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体を含むＩＬ−２ムテイン薬学的組成物は、意図される投与経路に適合するように処方される。投与経路は、所望の結果により変動する。ＩＬ−２ムテイン薬学的組成物は、ボーラス投薬、連続注入または持続注入（短時間、すなわち、１〜６時間の注入）により投与できる。ＩＬ−２ムテイン薬学的組成物は、経口、鼻内、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内投与など）で、皮内投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与および直腸投与により、または肺吸入により投与され得る。

非経口、皮内または経皮的な適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分：滅菌希釈液、例えば注射用水、生理食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤（例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート形成剤（例えばＥＤＴＡ）；界面活性剤（例えばポリソルベート８０）；ＳＤＳ；緩衝剤（例えば酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩）、および浸透圧調節剤（例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース）、を含有できる。ｐＨは、酸または塩基（例えば塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調節できる。非経口調製物はガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアルに充填できる。

注射用途に適する薬学的組成物は滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、または、滅菌注射用溶液もしくは分散液の要時調製のための滅菌粉末を包含する。製剤過程においてタンパク質の凝集物の形成を最小限にする場合、静脈内投与用の適当なキャリアは生理食塩水、静菌性の水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ^ＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を包含する。全ての場合において、組成物は滅菌されねばならず、容易にシリンジ使用できる程度の流体性を有すべきである。これは、製造および保存の条件下に安定であるべきであり、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流体性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合は、所望の粒径を維持することにより、そして、界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の予防は種々の静菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合において、等張性剤、例えば糖類、ポリアルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含有させることが好ましい。注射用組成物の長時間の吸収は吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含有させることにより実現できる。

滅菌注射用溶液は必要に応じて上記した成分の１つまたは組み合わせを用いて適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えばタンパク質または抗体）を組み込み、その後、濾過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散液は基剤となる分散媒および上記列挙したものより選ばれる他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクル内に活性化合物を組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液の製造のための滅菌粉末の場合は、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分と予め滅菌濾過された溶液に由来する任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる。

経口用組成物は一般的に不活性希釈財または可食キャリアを含有する。これらはゼラチンカプセルに封入するか、圧縮整形して錠剤とする。経口投与のためには、薬剤は胃内を通り抜ける腸溶性形態中に含有され得るか、または、既知の方法によりさらにコーティングまたは混合して消化管の特定の領域で放出され得る。経口治療用投与の目的のためには、活性化合物は、賦形剤と共に組込まれ、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用することができる。経口用組成物はまた、マウスウォッシュとして使用するための液体キャリアを用いて調製することができ、その場合、液体キャリア中の化合物は口内に適用され、含嗽され、そして吐瀉されるか、嚥下される。薬学的に適合性のある結合剤および／またはアジュバント物質を組成物の部分として含有することができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどはいずれかの以下の成分、または同様の性質の化合物、すなわち、結合剤（例えば微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば澱粉または乳糖、錠剤崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；滑剤（例えばコロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えばスクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバー）を含有することができる。

全身投与は、経粘膜または経皮的な手段により行うこともできる。経粘膜または経皮的な投与のために、透過すべき障壁に対して適切な浸透剤を製剤中で使用する。このような浸透剤は、一般的に当該分野で公知であり、そして例えば経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸、フシジン酸誘導体を包含する。

１つの実施形態において、活性化合物は身体からの急速な排出に対抗して化合物を保護するキャリアを用いて調製される（例えば、制御放出処方物（インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる）。生分解性、生体適合性の重合体、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。このような処方物の調製方法は当業者に明らかある。材料はＡｌｚａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌから購入できる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的化されたリポソームを含む）も薬学的に受容可能なキャリアとして使用できる。これらは米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当該分野公知の方法に従って調製できる。

投与を容易にし、そして投薬量を均一にするために、経口用または非経口組成物を投薬単位形態に処方することが特に有利である。投薬単位形態とは、本明細書においては、処置すべき被験体に対する単位投薬量として適切な、物理的に個別の単位を指し；各単位は所望の薬学的キャリアと共に所望の治療効果をもたらすために計算された活性化合物の所定量を含有する。本発明の。投薬単位形態の詳細は、活性化合物の固有の性質および達成すべき特定の治療効果、ならびにそのような個体の処置のための活性化合物の配合の、当該分野において固有の制限により影響され、そしてこれに直接左右される。

本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体は、ヒトＩＬ−２の分野で公知の、任意の公知の処方プロセスを用いて処方できる。本発明の方法において有用である適当な処方は、種々の特許および刊行物に記載されている。例えば、米国特許第４，６０４，３７７号は、非ＩＬ−２タンパク質および内毒素を実質的に含有しない治療量のＩＬ−２、生理学的に許容される水溶性キャリア、およびＩＬ−２を可溶化するための十分な量の界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）を有する、好ましいＩＬ−２製剤を示している。糖類のような他の成分も含有できる。米国特許第４，７６６，１０６号は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾ＩＬ−２を含む処方物を示している。欧州特許出願公開２６８，１１０はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ−８０）、ポリエチレングリコールモノステアレートおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物（ＴｒｉｔｏｎＸ４０５）からなる群より選択される種々の非イオン系界面活性剤を用いて処方したＩＬ−２を示している。米国特許第４，９９２，２７１号は、ヒト血清アルブミンを含むＩＬ−２処方物を開示しており、そして米国特許第５，０７８，９９７号は、ヒト血清アルブミンおよびアミノ酸を含む処方物を開示している。米国特許第６，５２５，１０２号は、ポリペプチドの主要な安定化剤として作用するアミノ酸塩基、および、ポリペプチドの安定性に対して許容できるｐＨ範囲内で溶液を緩衝するための酸および／またはその塩形態を含むＩＬ−２処方物を開示している。同時係属中の米国特許出願１０／４０８，６４８は、肺送達のために適するＩＬ−２処方物を開示している。

（治療用途）
本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたはこれらのヒトＩＬ−２ムテインから得られた生物学的に活性な改変体を含む薬学的処方物は、免疫系の刺激および癌（例えば、ネイティブのヒトＩＬ−２またはプロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標）ＩＬ−２を用いて現在治療されているもの）の処置において有用である。本発明のヒトＩＬ−２ムテインおよび適当な生物学的に活性なその改変体は、炎症誘発性サイトカイン産生が低減しており、より低い毒性を有すると予測されるという利点を有する一方で、ＮＫ細胞の増殖、生存、ＮＫ媒介性細胞毒性（ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ）ならびにＴ細胞増殖のような、所望の機能的活性を維持または増強する。

その予測される低毒性のため、高用量のＩＬ−２が要求される臨床適応において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインおよび生物学的に活性なその改変体は、毒性作用を最低限にしながら、ネイティブのＩＬ−２またはプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２の投与され得る用量と同等以上の用量で投与され得る。したがって、本発明は、処置プロトコルとしてインターロイキン−２（ＩＬ−２）投与を受けている被験体においてＩＬ−２誘導性毒性症状を低減するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示するＩＬ−２ムテインとして、ＩＬ−２を投与する工程を含む。さらに、本発明のヒトＩＬ−２ムテインおよび適切な生物学的に活性なその改変体は、より大きい治療効果というさらなる利点を有し、より低用量のこれらのヒトＩＬ−２ムテインは、ネイティブＩＬ−２またはプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２の同等の用量の治療効果よりも高い治療効果を与えることができる。

本発明のＩＬ−２ムテイン薬学的組成物の薬学的有効量が、被験体に投与される。「薬学的有効量」とは、疾患または状態の処置、予防または診断において有用である量を意図する。「被験体」とは動物、例えば霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどを意図する。好ましくは、本発明の薬学的処方物による処置を受けている被験体は、ヒトである。

投与が治療目的の場合は、投与は予防または治療の目的のいずれかであってよい。予防的に行う場合は、物質はいずれかの症状よりも先行して与えられる。物質の予防的投与はいずれかの後の症状を防止または減衰させるように働く。治療的に行う場合は、物質は症状の出現のとき（またはその直後）に与えられる。物質の治療的投与は、いずれかの実際の症状を減衰させるために働く。

したがって、例えば、本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体を含む本発明の薬学的組成物の有効量を含む処方物は、ＩＬ−２を用いた治療に応答する多くの臨床適用症の治療、予防および診断の目的のために使用することができる。本発明のヒトＩＬ−２ムテインおよび生物学的に活性なその改変体を処方して、ネイティブ配列ＩＬ−２またはプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２と同じ治療において使用できる。従って、ヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体を含む本発明の処方物は、以下のために有用である：細菌、ウイルス、寄生虫、原虫および真菌の感染症の診断、予防および処置（局所または全身）のため；細胞媒介細胞毒性の増強のため；リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性を刺激するため；リンパ球の免疫機能の回復を媒介するため；同種抗原応答性を増強するため；放射線療法後、または化学療法単独もしくは化学療法と他の抗癌剤との併用の後もしくはそれと並行して、または、骨髄または自己幹細胞移植の後またはそれと並行して、癌患者における免疫回復を促進するため；後天性免疫不全の状態における免疫機能の回復を促進するため；高齢のヒトおよび動物における正常な免疫機能の回復のため；酵素増幅、放射標識、放射線画像化および疾患状態におけるＩＬ−２のレベルをモニタリングするための他の当該分野で公知の方法を用いる方法のような診断アッセイの開発において；治療および診断目的のためのインビトロのＴ細胞成長の促進のため；リンホカインに対するレセプター部位をブロックするため；および種々の他の治療、診断および研究用途において、有用である。ヒトＩＬ−２またはその改変体（例えばＩＬ−２ムテイン）の種々の治療および診断用途が、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６：８８９−８９７；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８８）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２０８：１２１−１３５；Ｔｏｐａｌｉａｎら（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：８３９−８５３；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８８）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：１６７６−１６８０；Ｗｅｂｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３３−４０；Ｇｒｉｍｍら（１９８２）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７０（２）：２４８−２５９；Ｍａｚｕｍｄｅｒ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．３（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ３７−４２；ＭａｚｕｍｄｅｒおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９（２）：４９５−５０７：およびＭａｚｕｍｄｅｒら（１９８３）ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５（１）：１−１０において検討され、報告されている。本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体を含む本発明の処方物は、単一の治療活性薬剤として使用してよく、または、他の免疫学的に関連する細胞または他の治療薬と組み合わせて使用してよい。関連する細胞の例はＢまたはＴ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞などであり、そしてＩＬ−２またはその改変体と組み合わせて使用し得る例示的治療薬は、種々のインターフェロン（特にガンマインターフェロン）、Ｂ細胞成長因子、ＩＬ−１、および抗体（抗ＨＥＲ２抗体（例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））、または抗ＣＤ２０抗体（例えばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ；ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８；ＩＤＥＣＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））が挙げられるが、これらに限定されない。

投与されるヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体の量は、約０．１〜約１５ｍＩＵ／ｍ^２の間の範囲であり得る。抗癌モノクローナル抗体と組み合わせたＩＬ−２免疫療法のための治療有効量および特定の治療プロトコルは、当該分野で公知である。例えば、同時係属中の、米国特許出願２００３−０１８５７９６（発明の名称「ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＮｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓＬｙｍｐｈｏｍａ」）に記載の用量および治療プロトコル、および２００３０２３５５５６（発明の名称「ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＩＬ−２／Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２ＡｎｔｉｂｏｄｙＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＣａｎｃｅｒｓＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＨＥＲ２ＲｅｃｅｐｔｅｒＰｒｏｔｅｉｎ」）、および２００３年７月３１日出願の代理人事件番号５９５１６−２７８、発明の名称「ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＣｈｒｏｎｉｃＬｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃＬｅｕｋｅｍｉａ」である、同時係属中の米国特許出願６０／４９１，３７１を参照のこと。腎細胞癌および転移性黒色腫のような適応症に関しては、ヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体は、３００，０００〜８００，０００ＩＵ／ｋｇ／８時間の高用量静脈内ボーラスとして投与してよい。Ｂ細胞リンパ腫、ＨＥＲ２^＋癌（例えば乳癌およびＣＬＬ）のＩＬ−２免疫療法のための推奨用量については、前述の米国特許出願を参照のこと。

ＨＩＶ感染の治療のためのＩＬ−２免疫療法の使用もまた、当該分野で公知である。この臨床適応症に関する推奨される用量およびプロトコルについては、例えば、米国特許第６，５７９，５２１号を参照できる。

したがって、本発明は、被験体における癌を処置するため、または被験体における免疫応答を調節するための方法を提供する。この方法は、本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体の治療有効量を投与する工程を含む。「治療有効量」とは、許容できない毒性作用を誘導することなく所望の生物学的結果を誘導するために十分な用量レベルを指す。投与量は、薬学的組成物中のヒトＩＬ−２ムテインまたはその改変体の濃度、所望の活性、処置すべき哺乳動物の疾患状態、投薬形態、投与方法、投与頻度および患者の要因（例えば、年齢、性別および疾患の重症度）により変動し得る。治療有効量は、広範な濃度において提供され、そして被験体は、問題となる障害の兆候、症状または原因を低減および／または軽減するためか、または生物学的系の任意の他の所望の変化をもたらすために必要とされる回数の、治療有効量を投与され得る。一般的に、本発明のＩＬ−２ムテイン薬学的組成物は、プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２について使用されるよりも高い濃度範囲で、ヒトＩＬ−２ムテインまたはその改変体を含む。プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２に対して用量が増大するに従い、被験体は、毒性副作用が出現するかどうかを判定するために緊密にモニタリングされるべきである。このような臨床的実験的分析は、当業者に周知であり、そして例えば、免疫調節および癌治療において使用するためのプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２の現在の用量を確立するために使用されている。

（ヒトＩＬ−２ムテインの機能的活性をモニタリングするためのバイオアッセイ）
本発明はまた、ＩＬ−２誘導ＮＫ細胞増殖およびＴＮＦ−α産生、ＩＬ−２誘導ＮＫ細胞媒介性細胞毒性、ＩＬ−２誘導Ｔ細胞増殖、ならびにＩＬ−２誘導ＮＫ細胞生存をモニタリングするための、新規バイオアッセイを提供する。これらのアッセイは、耐容性を向上させるための低減した炎症誘発性サイトカイン産生（特にＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γ）、ならびに改善したＮＫ細胞媒介機能（増大したＮＫ細胞および／またはＴ細胞増殖を維持し、ＮＫ媒介性細胞毒性（ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ）を維持または増大させ、そしてＮＫ細胞生存を維持または増大させるムテインの能力に反映される）という所望の機能的プロフィールに関して、候補ＩＬ−２ムテインをスクリーニングするために開発されている。

これらのアッセイの最初のものは、本明細書においては、「ＮＫ−９２バイオアッセイ」と称され、ＴＮＦ−α産生のＩＬ−２誘導およびＩＬ−２誘導ＮＫ細胞増殖をモニタリングする。このバイオアッセイはヒトＮＫ−９２細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ−２４０７、ＣＭＣＣＩＤ＃１１９２５）を利用している。ＮＫ−９２細胞株（最初にＧｏｎｇら（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ８（４）：６５２−６５８により記載された）は、活性化ＮＫ細胞の表現型および機能的プロフィールを示す。ＮＫ−９２の増殖は、ＩＬ−２依存性であり；細胞は７２時間ＩＬ−２非存在下で培養されれば死滅する。細胞株はまた、ＩＬ−２への曝露後４８〜７２時間以内に、検出可能な濃度のＴＮＦ−αを産生する。

本発明の方法によれば、候補ＩＬ−２ムテインは、このＮＫ−９２バイオアッセイを用いて、ＴＮＦ−α産生を誘導し、ＮＫ細胞増殖を誘導する相対的な能力についてスクリーニングされ得る。この場合、ＮＫ−９２細胞は、α−ＭＥＭ、１２％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ），８％熱不活性化ウマ血清、０．０２ｍＭ葉酸、０．２ｍＭイノシトール、２ｍＭＬ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールよりなる完全培地（ＮＫ−９２培地）中で培養される。培養物を最小細胞密度１〜３ｘ１０^５細胞／ｍＬで播種し、参照組換えヒトＩＬ−２ムテイン（例えばデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと称される参照ＩＬ−２ムテイン）１０００ＩＵ／ｍＬを補充する。アッセイの調製においては、細胞を新しいＮＫ−９２培地中で最低４８時間維持した後にアッセイに使用する。アッセイの１日前、ＮＫ−９２を３回洗浄し、２４時間ＩＬ−２を補充しないＮＫ−９２培地中に維持する。細胞を遠心分離し、ＮＫ−９２培地（ＩＬ−２無添加）中に懸濁し、９６穴平底プレートに、種々の濃度の参照ＩＬ−２ムテイン（例えば、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２）、またはＮＫ−９２培地中に希釈した目的の機能プロフィールについてスクリーニングされる種々の濃度の候補ＩＬ−２ムテインとともに、２００μＬ中４ｘ１０^４細胞／ウェルの密度でプレーティングする。３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした後、培養上清の１００μＬアリコートを取り出し、後に行う、市販のＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット（例えばＢｉｏＳｏｕｒｃｅＣｙｔｏｓｃｒｅｅｎ^ＴＭヒトＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット；Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いたＴＮＦ−αの定量のために凍結する。培地中に残存する細胞については、市販のＭＴＴ染料還元キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイキット（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて増殖を測定し、そして次に比色読み取りに基づいて刺激指数を計算する。

本明細書に開示する第２のＩＬ−２バイオアッセイは、候補ＩＬ−２ムテインを、それらがナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性細胞毒性を誘導する能力についてスクリーニングするための方法を提供する。このバイオアッセイは、「ＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイ」と称され、ヒトＮＫ３．３細胞株を利用している。ＮＫ３．３細胞株は、末梢血ＮＫ細胞の表現型および機能特性を示し（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９（６）：２８３１−２８３７）、そして、Ｆｃレセプター（ＣＤ１６、ＦｃγＲＩＩＩＡ）を介して、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介することができる。後記する実験のセクションの表２は、このＩＬ−２バイオアッセイで調べたＮＫ３．３細胞の生物学的活性をまとめたものである。

本発明の方法によれば、候補ＩＬ−２ムテインは、このＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイを用いて、その細胞毒性活性に関してスクリーニングされ得る。この方法によれば、ＮＫ３．３細胞を増殖させ、１５％熱不活性化ウシ胎仔血清、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、およびＩＬ−２原料として２０％ヒトＴ−Ｓｔｉｍ^ＴＭｗ／ＰＨＡを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持する。アッセイの調製においては、ＮＫ３．３を、２４時間、ＩＬ−２非存在下（「飢餓状態」）において培養する。アッセイは、総容量２００μＬの、種々の濃度の参照ＩＬ−２ムテイン（例えば、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２）、または種々の濃度の目的の候補ＩＬ−２ムテインに曝露した、Ｕ底９６穴プレートにプレーティングされた５ｘ１０^４「飢餓状態」ＮＫ３．３細胞から構成される。１８時間のインキュベートの後、ＩＬ−２刺激ＮＫ３．３エフェクター細胞を、５ｘ１０^３カルセインＡＭ標識標的細胞（Ｋ５６２またはＤａｕｄｉ）または抗体コーティングカルセインＡＭ標識標的（終濃度２μｇ／ｍＬのリツキシマブでコーティングされたＤａｕｄｉ）と共インキュベートすることにより、最終的なエフェクター対標的の比、１０：１を達成する。エフェクターと標的細胞とを４時間共インキュベートした後、９６穴プレートを短時間遠心分離し；培養上清１００μＬを取り出して、黒色で清浄な平底９６穴プレートに入れ、蛍光計によりカルセインＡＭの放出の定量に付す。定量は、パーセント特異的溶解として表し、以下の式：％特異的溶解＝１００ｘ［（平均実験値−平均自発的放出）／（平均最大放出−平均自発的放出）］により計算される。ここで、自発的放出は、標識標的を含有し、エフェクターを含有しないウェルから決定され、そして最大放出は、標識標的および１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するウェルから決定される。

本明細書に開示した第３のＩＬ−２バイオアッセイは、候補ＩＬ−２ムテインを、それらがＴ細胞増殖を誘導する能力についてスクリーニングするための方法を提供する。この態様においては、Ｔ細胞増殖に関するこのＩＬ−２バイオアッセイは、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病の患者に由来するヒトＴ細胞株Ｋｉｔ２２５（ＣＭＣＣＩＤ＃１１２３４）を利用する（Ｈｏｒｉら（１９８７）Ｂｌｏｏｄ７０（４）：１０６９−１０７２）。Ｋｉｔ２２５細胞は、ＩＬ−２レセプター複合体のα、β、γサブユニットを構成的に発現する。Ｋｉｔ２２５の増殖は、ＩＬ−２依存性であり；細胞は長期間ＩＬ−２非存在下で培養すれば死滅する。

本発明によれば、アッセイは、２４時間ＩＬ−２の非存在下でＫｉｔ２２５細胞を培養し、その後、種々の濃度の参照ＩＬ−２ムテイン（例えば、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）、または種々の濃度の目的の候補ＩＬ−２ムテインと共に特定数の細胞をプレーティングすることから構成される。４８時間のインキュベーションの後、増殖は、標準的な市販のＭＴＴ染料還元キットを用いて判定され、そして刺激指数は、比色読み取り値に基づいて計算される。

本発明の第４のＩＬ−２バイオアッセイは、候補ＩＬ−２ムテインをそれらがＮＫ細胞生存を促進する能力についてスクリーニングするための方法を提供する。この場合、候補ムテインは、それらがＮＫ細胞生存シグナル伝達を誘導する能力についてスクリーニングされる。プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２（すなわち、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインを含む処方物）は、ＩＬ−２を予め枯渇させたＮＫ３．３においてＡＫＴのホスホリル化（「生存シグナル」と考えられる）を誘導する。このバイオアッセイにおいては、ＮＫ３．３細胞を増殖させ、１５％熱不活性化ウシ胎仔血清、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭＬ−グルタミンおよびＩＬ−２原料として２０％ヒトＴ−Ｓｔｉｍ^ＴＭｗ／ＰＨＡを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持する。アッセイの調製においては、ＮＫ３．３を、２４時間、ＩＬ−２非存在下において培養する。細胞生存シグナル伝達の指標として、「飢餓状態」ＮＫ３．３細胞（２ｘ１０^６）を、３０分間、２ｎＭの参照ＩＬ−２ムテイン（例えば、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２）、または２ｎＭの目的の候補ＩＬ−２ムテインを添加することにより刺激する。細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する細胞抽出緩衝液５０μＬ中で溶解し、１回の凍結−解凍サイクルに供する。抽出液を、４℃で１０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離する。透明な溶解液のアリコートを、ＡＫＴ［ｐＳ４７３］＊イムノアッセイキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のウェルに１：１０希釈で添加する。製造元のプロトコルに従って、ホスホリル化されたＡＫＴのレベルを定量的ＥＬＩＳＡにより検出する。

本発明はまた、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いてＩＬ−２ムテインの機能特性についてそれらをスクリーニングする場合に使用するための、バイオアッセイを提供する。これらのバイオアッセイの第１のものは、増殖／炎症誘発性サイトカイン産生複合バイオアッセイである。ＩＬ−２に曝露されると、ヒトＰＢＭＣは増殖し、用量依存性の態様でサイトカインを分泌する。この複合アッセイは、参照ＩＬ−２ムテイン（例えばデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳムテインまたはＣ１２５Ｓムテイン）または目的の候補ＩＬ−２ムテインで７２時間刺激した後に、増殖およびサイトカイン産生のレベルを評価するように設計されている。ＰＢＭＣは、正常ヒトドナー１人以上から、密度勾配分離（例えばＡＣＤＡＶａｃｕｔａｉｎｅｒＣＰＴチューブを使用する）により単離される。９６穴組織培養処理プレート中、ウェル当たり２００，０００細胞を、３７℃、７％ＣＯ_２において、完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン／フンジゾン）中で、種々の濃度のＩＬ−２（０．０３９ｎＭ〜１０ｎＭ）と共に、または陰性対照としてＩＬ−２非存在下で、インキュベートする。６６時間のインキュベーションの後、細胞培養上清のアリコートを取り出し、後のサイトカイン検出のために凍結する。細胞を１μＣｉ^３Ｈ−チミジンで６時間パルスし、次に回収して、細胞増殖の尺度としてヌクレオチド取り込みのレベルを測定する（例えばＷａｌｌａｃＴｒｉｌｕｘＭｉｃｒｏｂｅｔａＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒを用いる）。次に市販のＥＬＩＳＡキット（例えばＢｉｏＳｃｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）を用いて製造元のガイドラインに従って、細胞培養上清中のＴＮＦ−αの濃度を検出できる。個別のドナーの完全なパネル（例えば６、８または１０ドナー）についてアッセイを繰り返すことにより、「正常集団」におけるＩＬ−２への代表的な増殖応答およびサイトカイン応答の特徴付けが可能となる。次にデータを図１および後述する実施例１０にさらに記載するように分析することができる。

第２のＰＢＭＣ系バイオアッセイは、エフェクター細胞の細胞毒性を媒介する候補ＩＬ−２ムテインの能力についてスクリーニングするために使用できる。このアッセイにおいては、ヒトＰＢＭＣを密度勾配遠心分離を用いて全血から分離する。ＰＢＭＣを１０ｎＭのＩＬ−２対照または目的のＩＬ−２ムテインの存在下で３日間刺激することにより、現在の技術レベルで一般的に実施されているとおりＬＡＫ活性を発生させる（例えばＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＮＫＣｅｌｌｓａｎｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＬＡＫａｃｔｉｖｉｔｙ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１９９６ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ参照）。得られた細胞集団は、「エフェクター」細胞を含有する。これはＮＫまたはＬＡＫに分類してよく、そしてそれぞれＫ５６２およびＤａｕｄｉの腫瘍細胞標的を殺傷することができる。これらのエフェクター細胞はまた、ＡＤＣＣを媒介し、これによりエフェクター細胞は、Ｄａｕｄｉ標的細胞に結合している特定の抗体のＦｃ部分を認識する。１つの実施形態において、Ｄａｕｄｉ標的に結合している抗体は、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）である。

本発明の方法によれば、目的の候補ＩＬ−２ムテインまたは参照ＩＬ−２対照により刺激されているヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞）を、４時間、種々のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で、カルセインＡＭ標識標的細胞と共インキュベートする。細胞毒性活性の量は、培養上清中のカルセインＡＭの検出に関係している。定量は、自発的および最大放出対照の測定に基づいて、各Ｅ：Ｔ比におけるパーセント特異的溶解として表示される。このバイオアッセイは以下の生物学的活性を調べる：標的がＫ５６２細胞である場合、天然／自発的細胞毒性（ＮＫ）；標的がＤａｕｄｉ細胞である場合、リンホカイン活性化殺傷（ＬＡＫ）；および標的が抗体コーティングＤａｕｄｉ細胞（例えばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）コーティングＤａｕｄｉ細胞）である場合、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）。

データは蛍光計から得られ、そして相対蛍光単位（ｒｆｕ）として表示される。このバイオアッセイの対照は標識標的細胞単独（最小）および１００％溶解（最大）の尺度としての標識標的細胞＋終濃度１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を包含する。パーセント最小対最大比は、アッセイの有効性（＞３０％であればアッセイは無効）の尺度として以下の式を用いて計算する。

％最小対最大＝１００ｘ［（平均自発的放出ｒｆｕ）／（平均最大放出ｒｆｕ）］
アッセイが有効であることがわかれば、３つのサンプル点の平均および標準偏差を計算し、その後、以下の式を用いて３つの点の平均からパーセント特異的溶解を求める。

％溶解＝１００ｘ［（平均実験ｒｆｕ−平均自発的放出ｒｆｕ）／（平均最大放出ｒｆｕ−平均自発的放出ｒｆｕ）］
次にデータを％特異的溶解として報告し；さらに、候補ＩＬ−２ムテイン対関連するＩＬ−２参照対照（例えば、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）を用いて、ヒトＰＢＭＣドナーの混合集団において、ＩＬ−２参照対照に対して細胞毒性活性が維持されているかどうかを判定し得る。

上記したアッセイは、所望の機能的プロフィールに関して候補ＩＬ−２ムテインライブラリをスクリーニングするために利用することができ、ここで、目的の機能的活性としては、以下の１つまたは複数が挙げられる：ＩＬ−２誘導炎症誘発性サイトカイン産生（特にＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２誘導ＮＫ細胞増殖および／またはＴ細胞増殖、ＩＬ−２誘導ＮＫ媒介性細胞毒性（ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ）、ならびにＩＬ−２誘導ＮＫ細胞生存。

以下の実施例は説明のために提供され、限定するためではない。

（実験）
ＩＬ−２の治療上の有用性は、発熱、悪寒、低血圧および血管漏出症候群を含むその投与に関連する毒性により妨害される。向上した耐容性およびＩＬ−２媒介性ＮＫおよびＴエフェクター機能を有するＩＬ−２ムテインは、より高い治療用量で、同様に良好な耐容性を示す治療用量の投与を可能にし、これにより、このタンパク質のより高値の治療効力という潜在能力を増大させる。本明細書に記載した作業の全体的戦略は、特殊化された、中等度スループットの、ヒトＮＫ細胞ベースの免疫アッセイスクリーニング系の包括的パネルを用いて、以下の機能的プロフィールを示す新規のヒトＩＬ−２ムテインを選択することであった：耐容性を向上させるための低減した炎症誘発性サイトカイン産生（特にＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γ）、ならびに向上したＮＫ細胞媒介機能（ＮＫ細胞増殖および／またはＴ細胞増殖を維持または増大させ、ＮＫ媒介性細胞毒性（ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ）を維持または増大させ、そしてＮＫ細胞生存を維持または増大させるムテインの能力において反映される）。

所望の治療プロフィールを有する適当なＩＬ−２ムテインを同定する目的のために、候補組換えヒトＩＬ−２ムテインの生物学的活性を、参照ＩＬ−２ムテインと称されるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（以下の実施例においては「Ｐｒｏ」と略記する）およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（以下の実施例においては「Ａｌａ−Ｐｒｏ」と略記する）により示されるこれらの生物学的活性と比較した。アルデスロイキンである組換え的にＥ．ｃｏｌｉにより産生されたデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインは、商品名プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２（ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）として、処方物として市販されている。プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生されたムテインの非グリコシル化形態を使用した、特異的な凍結乾燥された処方物であり、後述するバイオアッセイで使用するために、蒸留水中で再構成した。特定の実験においては、プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２と同じヒトＩＬ−２ムテイン（アルデスロイオキン）を含むがその処方前の最終精製工程が異なる液体製剤である、商品名Ｌ２−７００１（登録商標）ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ）として販売されている、アルデスロイキンの単量体処方物を使用する。米国特許第４，９３１，５４３号および米国特許第６，５２５，１０２号を参照。最初のスクリーニング実験において使用したＣ１２５ＳヒトＩＬ−２は、ＡＭＥ哺乳動物系において産生され、専用のＡＭＥ緩衝液中に処方した。

以下に記載するヒトＩＬ−２ムテインを宿主哺乳動物２９３Ｔ細胞中で発現させた。参照ＩＬ−２ムテインがＣ１２５ＳヒトＩＬ−２である場合は、宿主細胞を、Ｐｒｏ−１プロモーターに作動可能に連結したＣ１２５Ｓ変異を有するネイティブのヒトＩＬ−２コード配列を含む発現構築物で形質転換した。コード配列は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（すなわち、配列番号７）に対するコード配列において融合した、真性（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＩＬ−２シグナル配列およびヒトＩＬ−２のＮ末端アラニンに対するコドン（すなわち、配列番号１のヌクレオチド１〜６３）を含んだ。タンパク質を、２９３Ｔ細胞哺乳動物発現系においてＧＳＨｉｓタグ化タンパク質として発現させ、ＮＩ−ＮＴＡビーズで精製した。

（実施例１ヒトＩＬ−２ムテインの初期スクリーニング）
Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２分子（本明細書においては実施例中「Ａｌａ−Ｐｒｏ」と記載する）の全２，５０８個の考えられる単一アミノ酸ムテイン改変体を含むライブラリを、コドンベースの変異誘発技術プラットホーム（ＡｐｐｌｉｅｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて構築した。Ａｌａ−Ｐｒｏは、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインにおいて保持されているネイティブのヒトＩＬ−２の１位におけるＮ末端Ａｌａ残基を有することにおいて、市販のプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２製品において利用されているデス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインとは異なる。ＡＭＥ哺乳動物発現系ＤｉｒｅｃｔＡＭＥ^ＴＭおよびＥｘｐｒｅｓｓＡＭＥ^ＴＭ（ＡｐｐｌｉｅｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、Ａｌａ−Ｐｒｏムテインの組換え産生において利用した。

一次スクリーニングを、炎症誘発性サイトカイン産生（ＴＮＦ−α）、ＮＫ細胞増殖およびＮＫ細胞溶解殺傷（ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ）および細胞生存（ｐＡＫＴ；ＮＫ３．３細胞株）をアッセイする、ヒトＮＫ−９２細胞株ベースの機能的イムノアッセイを用いて実施した。選択された一次機能の指標としては、以下が挙げられる：（１）Ａｌａ−ＰｒｏＩＬ−２（すなわち、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）またはプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）で観察されるものと比較してヒトＮＫ−９２細胞株により低減した炎症誘発性ＴＮＦ−α産生；（２）これらの２つの参照ＩＬ−２ムテインのいずれかで観察されるものと比較して維持または向上した、ヒトＮＫ−９２細胞株増殖；および３）これらの２つの参照ＩＬ−２ムテインのいずれかで観察されるものと比較して維持または向上した、ヒトＮＫ３．３細胞株媒介性のＮＫ−、ＬＡＫ−およびＡＤＣＣ媒介性細胞溶解殺傷。二次的な機能の指標は、以下であった：これらの２つの参照ＩＬ−２ムテインのいずれかで観察されるものと比較して維持または向上した、ＮＫ３．３におけるホスホリル化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）の誘導、およびＡｌａ−ＰｒｏＩＬ−２（すなわち、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）またはプロロイキン（登録商標）（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）で観察されるものと比較して維持または向上した、ヒトＫｉｔ２２５Ｔ細胞株によるＴ細胞増殖。

ヒトＣ１２５ＳＩＬ−２分子の全２，５０８個の考えられる単一アミノ酸ムテイン改変体のうち、１６８個をさらに試験するものとして同定した（上記表１参照）。向上した機能プロフィールを有する高度に望ましいＩＬ−２ムテインの３クラスを、このアプローチを用いて同定した。選択された全ＩＬ−２ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５Ｓ（すなわち、プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２に存在するもの）またはＣ１２５Ｓ（すなわち、Ａｌａ−Ｐｒｏ）ヒトＩＬ−２ムテインと比較した場合、ＮＫ細胞溶解機能（ＮＫ／ＬＡＫ／ＡＤＣＣ）を維持している。

ムテインの第１のクラスは、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較して、ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生の低減された誘導により証拠付けられる、向上した耐容性を有すると予測される。このクラス内のムテインは、以下の２つのカテゴリーに分類される：（１）５０ｐＭ〜１０００ｐＭの濃度において低いＴＮＦ−α産生を誘導し、ＮＫ細胞増殖を維持するもの、これは、さらにＬ７２Ｎ置換を含むデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインを包含する；および（２）高濃度（１ｎＭ）でのみ低いＴＮＦ−αを誘導し、増殖を維持するもの、これは、さらにＶ９１ＤまたはＦ４２Ｅ置換を含むデス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインを包含する。後述する実施例８および表１３および１４を参照。

ムテインの第２のクラスは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（すなわち、プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（本明細書においてはＡｌａ−ＰｒｏＩＬ−２と称する）で観察されるものと比較して、増大したＮＫ細胞機能（特にＮＫ細胞増殖）を有するものとして同定されたものを包含する。この機能クラス内に同定されたムテインは、Ｌ３６ＤおよびＬ４０Ｄ置換をさらに含むデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインを包含する。後述する実施例８および表１５を参照。

第３のクラスのムテインは、プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２中に存在するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（本明細書においては、Ａｌａ−ＰｒｏＩＬ−２と称する）で観察されるものと比較して、ＴＮＦ−αの低減した誘導に基づく向上した耐容性を有しながらＮＫ増殖も増大させることが予測される、「二機能性」のムテインを包含する。これらの「二機能性」ムテインは、１．５より高値のＮＫ増殖：ＴＮＦ−α産生の向上した比を示す。この機能クラス内で同定されるムテインは、Ｌ１９Ｄ、Ｆ４２ＲまたはＥ６１Ｒ置換を含むデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインを包含する。後述する実施例８および表１６を参照。

これらの３つの機能クラスに当てはまる代表的な候補を同定するためのスクリーニングプロセスは、後述する実施例においてさらに説明される。以下のプロトコルをスクリーニングプロセスにおいて使用した。

（ＮＫ細胞増殖／ＴＮＦ−α産生）
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞増殖およびＴＮＦ−α産生に関するＩＬ−２バイオアッセイは、ヒトＮＫ−９２細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ−２４０７、ＣＭＣＣＩＤ＃１１９２５）を利用する。ＮＫ−９２細胞株（最初にＧｏｎｇら（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ８（４）：６５２−６５８に記載された）は、活性化ＮＫ細胞の表現型および機能的プロフィールを示す。ＮＫ−９２の増殖は、ＩＬ−２依存性であり；細胞は、７２時間ＩＬ−２の非存在下で培養すれば死滅する。細胞株はまた、ＩＬ−２への曝露後４８〜７２時間以内に検出可能なレベルのＴＮＦ−αを産生する。

ＮＫ−９２細胞を、α−ＭＥＭ、１２％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、８％熱不活性化ウマ血清、０．０２ｍＭ葉酸、０．２ｍＭイノシトール、２ｍＭＬ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールよりなる完全培地（ＮＫ−９２培地）中で培養した。培養物を、最小細胞密度１〜３ｘ１０^５細胞／ｍＬで播種し、組換えヒトＩＬ−２ムテイン（デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（すなわち、アルデスロイキンまたはプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２；ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（上記ＡＭＥの哺乳動物発現系中で組換え産生）、１０００ＩＵ／ｍＬを補充した。アッセイの調製においては、細胞を、新しいＮＫ−９２培地中で最低４８時間維持した後にアッセイに使用した。アッセイの１日前、ＮＫ−９２を３回洗浄し、２４時間、ＩＬ−２を添加しないＮＫ−９２培地中に維持した。細胞を遠心分離し、ＮＫ−９２培地（ＩＬ−２無添加）中に懸濁し、９６穴平底プレートに、ＮＫ−９２培地中に希釈した、参照ＩＬ−２分子としてのデス−アラニル−１Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２、または種々の濃度の本発明のＩＬ−２ムテインと共に、２００μＬ中４ｘ１０^４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした後、培養上清の１００μＬアリコートを取り出し、後に行う、市販のＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅＣｙｔｏｓｃｒｅｅｎ^ＴＭヒトＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット；Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いたＴＮＦ−αの定量のために冷凍した。培地中に残存する細胞については、市販のＭＴＴ染料還元キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイキット（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて増殖を判定し、そして次に比色読み取りに基づいて刺激指数を計算した。

（ＮＫ細胞媒介性細胞毒性）
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性細胞毒性に関するＩＬ−２バイオアッセイは、ヒトＮＫ３．３細胞株を利用している。ＮＫ３．３細胞株は末梢血ＮＫ細胞の表現型および機能的特徴を示し（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９（６）：２８３１−２８３７）、そして、Ｆｃレセプター（ＣＤ１６、ＦｃγＲＩＩＩＡ）を介して抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介することができる。細胞株は、セントルイス大学の限定的使用許可の合意の下にＪａｃｋｉｅＫｏｒｎｂｌｕｔｈ博士より入手し、ＣＭＣＣ（ＩＤ１２０２２）に寄託されているものである。

表２はこのＩＬ−２バイオアッセイにより調べたＮＫ３．３細胞の生物学的活性を総括したものである。

（表２ＩＬ−２バイオアッセイにより調べたＮＫ３．３細胞の生物学的活性）

ＮＫ３．３細胞を増殖させ、１５％熱不活性化ウシ胎仔血清、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭＬ−グルタミンおよびＩＬ−２原料として２０％ヒトＴ−Ｓｔｉｍ^ＴＭｗ／ＰＨＡを補充した、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持した。アッセイの調製においては、ＮＫ３．３を、２４時間ＩＬ−２非存在下（「飢餓状態」）において培養した。アッセイは、総容量２００μＬの、参照ＩＬ−２分子としてのデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２、または、種々の濃度の本発明のＩＬ−２ムテインに曝露した、Ｕ底９６穴プレートにプレーティングした５ｘ１０^４「飢餓状態」ＮＫ３．３細胞を用いた。１８時間のインキュベートの後、ＩＬ−２刺激ＮＫ３．３エフェクター細胞を、５ｘ１０^３カルセインＡＭ標識標的細胞（Ｋ５６２またはＤａｕｄｉ）または抗体コーティングカルセインＡＭ標識標的（終濃度２μｇ／ｍＬのリツキシマブでコーティングされたＤａｕｄｉ）と共インキュベートすることにより、最終的なエフェクター対標的比、１０：１を達成した。エフェクターと標的細胞を４時間共インキュベートした後、９６穴プレートを短時間遠心分離し；培養上清１００μＬを取り出し、黒色清浄平底９６穴プレートに入れ、蛍光計によりカルセインＡＭの放出の定量に供した。定量は、パーセント特異的溶解として表示し、以下の式：％特異的溶解＝１００ｘ［（平均実験値−平均自発的放出）／（平均最大放出−平均自発的放出）］により計算した。ここで自発的放出は、標識標的を含有しエフェクターを含有しないウェルから求め、そして最大放出は、標識標的および１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するウェルから求めた。

（Ｔ細胞増殖）
Ｔ細胞増殖に関するＩＬ−２バイオアッセイは、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病の患者に由来するヒトＴ細胞株Ｋｉｔ２２５（ＣＭＣＣＩＤ＃１１２３４）を利用する（Ｈｏｒｉら（１９８７）Ｂｌｏｏｄ７０（４）：１０６９−１０７２）。Ｋｉｔ２２５細胞は、ＩＬ−２レセプター複合体のα、β、γサブユニットを構成的に発現する。Ｋｉｔ２２５の増殖はＩＬ−２依存性であり；細胞は長期間ＩＬ−２非存在下で培養すれば死滅する。アッセイは、２４時間ＩＬ−２の非存在下でＫｉｔ２２５細胞を培養し、その後、参照ＩＬ−２分子としての種々の濃度のデス−アラニル−１Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２、または、種々の濃度の本発明のＩＬ−２ムテインと共に、特定数の細胞をプレーティングすることより構成される。４８時間のインキュベーションの後、増殖を、標準的な市販のＭＴＴ染料還元キットを用いて判定し、そして、刺激指数を、比色読み取り値に基づいて計算した。

（ＮＫ細胞生存シグナル伝達）
ヒトＩＬ−２ムテインライブラリのサブセットがＮＫ細胞生存シグナル伝達を誘導する能力についてこれらをスクリーニングした。プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２（すなわち、アルデスロイキン、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）はＩＬ−２を予め枯渇させたＮＫ３．３においてＡＫＴのホスホリル化を誘導する（「生存シグナル」と考えられる）。ＮＫ３．３細胞を増殖させ、１５％熱不活性化ウシ胎仔児血清、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭＬ−グルタミンおよびＩＬ−２原料として２０％ヒトＴ−Ｓｔｉｍ^ＴＭｗ／ＰＨＡを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持した。アッセイの調製においては、ＮＫ３．３を２４時間ＩＬ−２非存在下において培養した。細胞生存シグナル伝達の指標として、「飢餓状態」ＮＫ３．３細胞（２ｘ１０^６）を、３０分間、２ｎＭの参照ＩＬ−２分子としてのデス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２もしくはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２、または２ｎＭの目的の本発明のＩＬ−２ムテインを添加することにより刺激した。細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する細胞抽出緩衝液５０μＬ中で溶解し、１回の凍結−解凍サイクルに供した。抽出液を、４℃で１０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離した。透明な溶解液のアリコートを、ＡＫＴ［ｐＳ４７３］^＊イムノアッセイキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のウェルに１：１０希釈で添加した。製造元のプロトコルに従って、ホスホリル化されたＡＫＴのレベルを、定量的ＥＬＩＳＡにより検出した。

（実施例２増強されたＮＫ細胞増殖に基づくＩＬ−２ムテインの同定）
さらなるスクリーニングのために同定された１６８個のムテイン（表１）のうち、合計９７個が、ＮＫ細胞増殖を、０．１ｎＭの濃度でデス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（すなわち、プロロイキンＩＬ−２中のムテイン）により示される増殖の１３０％超に強化し、ＴＮＦ−α産生を同時に増大させることのない（すなわち、１ｎＭにおいてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインにより示されるＴＮＦ−α産生の１００±８％未満である）、有利な変異であった。これらのムテインを表３に列挙する。

（表３．一次的選択基準としてのＮＫ−９２細胞増殖アッセイ（ＣＰＡ）を用いて同定されたＩＬ−２ムテイン。１．０ｎＭタンパク質における総ＴＮＦ−α産生（ｐｇ／ｍＬ）、およびデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察された産生のパーセントとしてのＴＮＦ−α産生（％Ｐｒｏ）を示す。ＣＰＡ値は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察された値のパーセント（％Ｐｒｏ）として表示する。１．０ｎＭタンパク質における％ＴＮＦ−α産生と比較した０．１ｎＭタンパク質における％ＮＫ細胞増殖の比を示す（％ＣＰＡ０．１：ＴＮＦ−α）。細胞毒性アッセイの値は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察された値の比（：Ｐｒｏ）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察された値の比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表示する）

二次的な分析は、≦０．０６６ｎｇ／μＬにおいて定量されたＩＬ−２ムテイン調製物について実施した。この分析では４つのさらなる変異が同定され、全てが重要な位置である３６、４０および６５で生じていた。これらにおいて、ムテインは０．１ｎＭにおいてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（すなわち、プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２中に存在するもの）により媒介される増殖の１５０％超のＮＫ細胞増殖を誘導しており、そして１ｎＭにおいて、デス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインの同様の量（すなわち、１ｎＭ）により媒介される産生の≦１００％で、ＴＮＦ−α産生を誘導した。この二次的な分析ではまた、７つのさらなる変異が同定され、全てが重要な位置である３６、６４および６５で生じており、１ｎＭにおいて僅かに増大したＴＮＦ−α（デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２比較対照分子の同様の量で観察される値の約１０１〜１０９％）を誘起したが、０．１ｎＭにおけるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインにより媒介される増殖の１５０％超のＮＫ細胞増殖をなお誘導した。ＴＮＦ−α産生。表４参照。

（表４．一次的選択基準としてのＮＫ−９２細胞増殖アッセイ（ＣＰＡ）を用いて同定されたさらなるＩＬ−２ムテイン。１．０ｎＭにおける総ＴＮＦ−α産生（ｐｇ／ｍＬ）およびデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察された値のパーセントとしてのＴＮＦ−α産生（％Ｐｒｏ）を示す。ＣＰＡ値は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察された値のパーセント（％Ｐｒｏ）として表示する。１．０ｎＭタンパク質における％ＴＮＦ−α産生と比較した０．１ｎＭタンパク質における％ＮＫ細胞増殖の比を示す（％ＣＰＡ０．１：ＴＮＦ−α）。細胞毒性アッセイの値は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察された値の比（：Ｐｒｏ）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察された値の比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表示する）

（実施例３低減したＴＮＦ−α産生に基づくＩＬ−２ムテインの同定）
各々１ｎＭにおけるデス−アラニル−１，Ｃ１２５Ｓ（すなわち、プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２中に存在するムテイン）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（Ａｌａ−ＰｒｏＩＬ−２と称する）のＴＮＦ−α産生の８７％未満を引き起こし、そして０．１ｎＭおよび１ｎＭの両方におけるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較して維持（少なくとも９６．４％）、または増強されたＮＫ細胞増殖を示し、そして、０．１ｎＭにおけるＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較してＮＫ細胞増殖を維持（少なくとも７９．２％）したムテインを選択した。表５を参照のこと。

（表５．以下の選択基準を用いて同定されたＩＬ−２ムテイン：１．０ｎＭにおける、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（Ｐｒｏ）で観察された値の＜８７％のＴＮＦ−α産生、およびデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（Ｐｒｏ）で観察された値と比較して維持または向上した、２つの濃度（０．１および１．０ｎＭ）におけるＮＫ細胞増殖。１．０ｎＭにおける総ＴＮＦ−α産生（ｐｇ／ｍＬ）、およびデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察された値のパーセントとしてのＴＮＦ−α産生（％Ｐｒｏ）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察された値のパーセントとしてのＴＮＦ−α産生（％Ａｌａ−Ｐｒｏ）を示す。ＣＰＡ値は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されたもののパーセント（％Ｐｒｏ）として表示する。１．０ｎＭタンパク質における％ＴＮＦ−α産生に対する０．１ｎＭタンパク質における％ＮＫ細胞増殖の比を示す（％ＣＰＡ０．１：ＴＮＦ−α）。細胞毒性アッセイの値は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察された値の比（：Ｐｒｏ）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察された値の比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表示する）

これらのスクリーニング基準を、各々１ｎＭにおけるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により刺激された産生の８１％未満のＴＮＦ−α産生、および１ｎＭにおけるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（すなわち、単一濃度のみの参照ＩＬ−２ムテイン）と比較したＮＫ細胞増殖の維持または増強（少なくとも９５％）対する基準を満たすムテインを捕らえるために、調節した。これらのスクリーニング基準により、さらに２０位、７８位、７９位、８０位、８１位、８８位および１２６位において残基の変化を含むさらなるムテインが同定された。表６参照。

（表６．以下の選択基準を用いて同定されたＩＬ−２ムテイン：デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（Ｐｒｏ）で観察された値の＜８１％のＴＮＦ−α産生（各々１．０ｎＭ）、およびデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（Ｐｒｏ）で観察された値に対して維持または向上した、１．０ｎＭにおけるＮＫ細胞増殖。１．０ｎＭにおける総ＴＮＦ−α産生（ｐｇ／ｍＬ）、およびデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察された値のパーセントとしてのＴＮＦ−α産生（％Ｐｒｏ）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察された値のパーセントとしてのＴＮＦ−α産生（％Ａｌａ−Ｐｒｏ）を示す。ＣＰＡ値は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されたもののパーセント（％Ｐｒｏ）として表示する。１．０ｎＭタンパク質における％ＴＮＦ−α産生と比較した０．１ｎＭタンパク質における％ＮＫ細胞増殖の比を示す（％ＣＰＡ０．１：ＴＮＦ−α）。細胞毒性アッセイの値は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察された値の比（：Ｐｒｏ）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察された値の比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表示する）

二次的な分析は、≦０．０６６ｎｇ／μＬにおいて定量されたＩＬ−２ムテイン調製物について実施した。この分析では、おのおの１ｎＭにおけるデス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインにより示される値の９６．２％未満のＴＮＦ−α産生をまた示し、そして１ｎＭ濃度におけるこの参照ＩＬ−２ムテインにより誘導される値の少なくとも１００％のＮＫ細部増殖を維持した、さらなるＩＬ−２ムテインが同定された。表７参照。

（表７．以下の選択基準を用いて同定されたＩＬ−２ムテイン：デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（Ｐｒｏ）で観察された値の＜９６．２％のＴＮＦ−α産生（各々１．０ｎＭ）、およびデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（Ｐｒｏ）で観察された値に対して維持または向上した、１．０ｎＭにおけるＮＫ細胞増殖。１．０ｎＭにおける総ＴＮＦ−α産生（ｐｇ／ｍＬ）、およびデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されたもののパーセントとしてのＴＮＦ−α産生（％Ｐｒｏ）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されたもののパーセントとしてのＴＮＦ−α産生（％Ａｌａ−Ｐｒｏ）を示す。ＣＰＡ値は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されたもののパーセント（％Ｐｒｏ）として表示する。１．０ｎＭタンパク質における％ＴＮＦ−α産生と相対比較した０．１ｎＭタンパク質における％ＮＫ細胞増殖の比を示す（％ＣＰＡ０．１：ＴＮＦ−α）。細胞毒性アッセイの値は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察された値の比（：Ｐｒｏ）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察された値の比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表示する）

（実施例４増強されたＮＫ媒介性細胞毒性を有するＩＬ−２ムテインの同定）
０．１ｎＭまたは１．０ｎＭのいずれかでアッセイした場合に、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（すなわち、Ａｌａ−Ｐｒｏ）より少なくとも１４０％高く、かつデス−アラニル−１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（すなわち、プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２中に存在するムテイン）より少なくとも１１５％高く、Ｋ５６２に対するＮＫ媒介性細胞毒性を増強し、ならびに１ｎＭでアッセイした場合に、これら２つの参照ＩＬ−２ムテインのいずれかにより示されるＴＮＦ−α産生の１００％未満を示し、そして０．１ｎＭまたは１ｎＭでアッセイした場合に、これら２つの参照ＩＬ−２ムテインと比較してＮＫ細胞増殖を維持する（少なくとも１００％）、ムテインを選択した。表８を参照。

（実施例５増強されたＬＡＫ活性を有するＩＬ−２ムテインの同定）
次に、以下の基準に基づいてムテインを選択した：Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（すなわち、Ａｌａ−Ｐｒｏ）より１２０％超まで増強されたＮＫ細胞媒介性ＬＡＫ活性、およびプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２中に存在するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較して維持された（少なくとも１００％）ＮＫ細胞媒介性ＬＡＫ活性、ならびに１ｎＭにおいてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインおよびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインの両方のＴＮＦ−αの１００％未満を示すこと、そして０．１ｎＭおよび１．０ｎＭの両方においてこれらの比較参照ＩＬ−２ムテインと比較してＮＫ細胞増殖を維持（少なくとも１００％）すること。表９を参照。

（実施例６増強されたＡＤＣＣ活性を有するＩＬ−２ムテインの同定）
次に、以下の基準に基づいて、ムテインを選択した：Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（Ａｌａ−Ｐｒｏ）の少なくとも１１５％、およびデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（Ｐｒｏ）の少なくとも１０５％に増強されたＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ活性を有すること、そして、各々１ｎＭにおいて、参照ＩＬ−２ムテインの両方のＴＮＦ−αの１００％未満を示すこと、そして各々０．１ｎＭにおいて参照ＩＬ−２ムテインの両方と比較してＮＫ細胞増殖を維持した（少なくとも１００％）こと。表１０を参照。

（実施例７増強されたＮＫ細胞生存を支持するムテインの選択）
デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較してＮＫ細胞生存を増強させる能力についてムテインをスクリーニングした。表１１を参照。

(表１１．ＮＫ３．３ｐＡＫＴ誘導アッセイを用いて同定されたＩＬ−２ムテイン細胞生存陽性ヒット）

（実施例８最も向上した治療プロフィールを有するヒトＩＬ−２ムテインの選択）
上記選択基準を用いて２５個のヒトＩＬ−２ムテインを特に関心があるものとして同定した。これらのムテインを表１２に示す。

上記基準に基づいてムテインを選択した後、これらのムテインを、以下の選択基準を満足するグループにさらに分割した：
１）Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインについて観察される値の＜８０％のＴＮＦ−α産生を示し、そして以下であるムテイン：
ａ）１ｎＭにおける増殖を維持するが、参照ＩＬ−２ムテインと比較して、より低濃度において増殖活性が低下するもの（Ｆ４２ＥまたはＶ９１Ｄ変異をさらに含むデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２を包含する）（表１３参照）；あるいは、
ｂ）１ｎＭにおいてＴＮＦ−α産生の顕著な低下を示し、５０ｐＭまでは増殖活性が維持されるもの（Ｌ７２Ｎ変異をさらに含むデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２を包含する）（表１４参照）；
２）ＴＮＦ−α産生に悪影響を与えることなく（１００ｐＭまたは１ｎＭの濃度において、参照ＩＬ−２ムテインで観察される値と比較して＜１００％のＴＮＦ−α産生）、１つ以上複数の試験濃度（５ｐＭ、２０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭおよび１０００ｐＭ）において、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較して＞２００％にＮＫ−９２増殖を強化するムテイン。さらに、選択基準として、少なくとも２つの試験濃度について、参照ＩＬ−２ムテイン（すなわちＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（Ａｌａ−Ｐｒｏ））で観察された値の１５０％超の増殖指数が含まれる；この群は、Ｌ３６ＤまたはＬ４０Ｄ変異をさらに含むデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインを包含する（表１５参照）；そして、
３）増大した増殖活性および低減したＴＮＦ−α産生を示すムテイン、これらにおいて、ＴＮＦ−α産生は、１ｎＭで試験した場合にＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインで観察された値の＜７５％であり、そしてＮＫ細胞の増殖が試験したいずれか１つの濃度（５ｐＭ、２０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭおよび１０００ｐＭ）においてＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインで観察された値の＞１５０％である；この群は、Ｌ１９Ｄ、Ｆ４２ＲまたはＥ６１Ｒ変異をさらに含むデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインを包含する（表１６参照）。

（表１３．１．０ｎＭにおいてＴＮＦ−α産生が大きく低減され、ＮＫ増殖が維持されるＩＬ−２ムテイン）

（実施例９：ヒトＩＬ−２ムテインはＴ細胞増殖を維持する）
有益な変異を選択する根拠として働く二次的機能の指標は、Ａｌａ−ＰｒｏＩＬ−２（すなわち、Ｃ２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）またはプロロイキン（登録商標）（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）で観察されるＴ細胞増殖に対して維持または向上した、ヒトＫｉｔ２２５Ｔ細胞株によるＴ細胞増殖とした。上記表１に示す１６８個のムテインのサブセットを、この機能的指標に関する試験のために選択した。結果は以下の表１７に示すとおりである。）

（実施例１０正常ヒト末梢血単核細胞における増殖および細胞毒性のレベルを維持または増大しながら炎症誘発性サイトカイン産生を低減する、有益なＩＬ−２ムテインの同定）
上記単一アミノ酸置換シリーズから、表１８に示すように、小規模発現／精製のために２５個のＩＬ−２ムテインを選択した。これらのＩＬ−２ムテインを、数人の健常ヒト血液ドナーより単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における増大した耐容性および維持された活性という同様の機能プロフィールを生じるその能力について、関連するＩＬ−２対照（デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（プロロイキン（登録商標）中に存在）および酵母発現Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（本明細書においては、データ中Ｙ−Ｐｒｏと記載）と比較して、試験した。具体的には、正常ヒトドナーのパネルから誘導したヒトＰＢＭＣを、目的のＩＬ−２ムテインで刺激し、増殖および炎症誘発性サイトカイン産生（ＴＮＦ−α）、ならびに天然／自発的細胞毒性（ＮＫ）、リンホカイン活性化殺傷（ＬＡＫ）または抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）により腫瘍細胞標的を殺傷する能力について、アッセイした。

（表１８．以下のさらなる置換を有するＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）またはデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−２ムテインを、ヒトＰＢＭＣにおける活性についてスクリーニングした^１）

^１ＩＬ−２ムテインの同定は以下による：配列番号４の成熟ヒトＩＬ−２に対するアミノ酸位置、およびその位置におけるアミノ酸置換。

以下の一次的な機能の指標を用いた：
１）ＩＬ−２ムテインで刺激されたヒトＰＢＭＣによる、関連するヒトＩＬ−２ムテイン対照と比較して低減した、炎症誘発性サイトカイン産生（ＴＮＦ−α）。

２）ヒトＰＢＭＣにおける、炎症誘発性サイトカイン産生の増大を伴わない、関連するヒトＩＬ−２ムテイン対照と比較して維持されるかまたは向上した、ＩＬ−２誘導増殖。

３）ＩＬ−２ムテインによりインビトロ刺激されたヒトＰＢＭＣによる、関連するヒトＩＬ−２ムテイン対照と比較して維持されるかまたは向上した、ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ媒介性細胞毒性殺傷。

（アッセイの説明）
（増殖／炎症誘発性サイトカイン産生複合アッセイの手順）
ＩＬ−２への曝露により、ヒトＰＢＭＣは用量依存的に増殖してサイトカインを分泌する。データアウトプットおよび効力を最大限にするために、参照ＩＬ−２ムテインまたは目的のヒトＩＬ−２ムテインで７２時間刺激した後で増殖およびサイトカインの産生のレベルを評価するための複合アッセイを設計した。アッセイの設定は、正常ヒトドナー１人以上からの密度勾配分離（ＡＣＤＡＶａｃｕｔａｉｎｅｒＣＰＴチューブ）によるＰＢＭＣの単離を包含する。９６穴組織培養処理プレート中、ウェル当たり２００，０００細胞を、３７℃、７％ＣＯ_２において、完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン／フンジゾン）中で、種々の濃度のＩＬ−２（０．０３９ｎＭ〜１０ｎＭ）とともに、または陰性対照としてＩＬ−２非存在下で、インキュベートする。６６時間のインキュベーションの後、細胞培養上清のアリコートを取り出し、後のサイトカイン検出のために凍結する。細胞を１μＣｉ^３Ｈ−チミジンで６時間パルスし、次に回収して、細胞増殖の尺度としてヌクレオチド取り込みのレベルを決定する（ＷａｌｌａｃＴｒｉｌｕｘＭｉｃｒｏｂｅｔａＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒを用いる）。市販のＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｃｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）を用いて、製造元のガイドラインに従って、細胞培養上清中のＴＮＦ−αのレベルを検出した。個別の６ドナーの完全なパネルについてアッセイを繰り返すことにより、「正常集団」におけるＩＬ−２への代表的な増殖応答およびサイトカイン応答の特徴付けが可能となる。

（データ分析）
ＰＢＭＣ試料を、再現性評価のために個別の試験プレートに２連でプレーティングした。増殖データは、バックグラウンド増殖（ＰＢＭＣ＋ＩＬ−２なし）を差し引くことにより分析し、そして２連の試料の平均を計算した。サイトカインデータを、ＰＢＭＣを含有するアッセイウェルから採取した細胞培養上清から得、プールして２連の設定における平均のサイトカインレベルを得た。ＴＮＦ−αレベルを、ＥＬＩＳＡキットに含まれる精製されたＴＮＦ−αの標準曲線に基づいて、ｐｇ／ｍＬで定量した。データを、図１に示す模式図において概説するように、６人の正常ヒトドナーのパネルについてさらに編集した。

（細胞毒性アッセイ（ＮＫ／ＬＡＫ／ＡＤＣＣ））
このアッセイにおいては、ＰＢＭＣを密度勾配遠心分離を用いて全血から分離する。ＰＢＭＣを、１０ｎＭのＩＬ−２対照または目的のＩＬ−２ムテインの存在下で３日間刺激し、現在の技術レベルで一般的に実施されているようにＬＡＫ活性を発生させる（例えばＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＮＫＣｅｌｌｓａｎｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＬＡＫａｃｔｉｖｉｔｙ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１９９６ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ参照）。得られた細胞集団は「エフェクター」細胞を含有し、これはＮＫまたはＬＡＫに分類してよく、そしてそれぞれＫ５６２およびＤａｕｄｉの腫瘍細胞標的を殺傷することができる。これらのエフェクター細胞はまたＡＤＣＣを媒介し、これによりエフェクター細胞はＤａｕｄｉ標的細胞に結合している特定の抗体（この場合はＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））のＦｃ部分を認識する。このアッセイでは、４時間、種々のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比での、カルセインＡＭ標識標的細胞とのエフェクター細胞の共インキュベーションを包含する。細胞毒性活性の量は、培養上清中のカルセインＡＭの検出に関係している。定量は、自発的および最大放出対照の決定に基づいて、各Ｅ：Ｔ比におけるパーセント特異的溶解として表示される。まとめると、アッセイは以下の生物学的活性を試験する。

（データ分析）
データは蛍光計から得られ、そして相対的蛍光単位（ｒｆｕ）として表示される。対照は、標識標的細胞単独（最小）、および１００％溶解（最大）の尺度としての標識標的細胞＋終濃度１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む。パーセント最小対最大比は、アッセイの有効性（＞３０％であればアッセイは無効）の尺度として以下の式を用いて計算する：
％最小対最大＝１００ｘ［（平均自発的放出ｒｆｕ）／（平均最大放出ｒｆｕ）］
アッセイが有効であることがわかれば、３連のサンプル点の平均および標準偏差を計算し、その後、以下の式を用いて３連の点の平均からパーセント特異的溶解を求める：
％溶解＝１００ｘ［（平均実験ｒｆｕ−平均自発的放出ｒｆｕ）／（平均最大放出ｒｆｕ−平均自発的放出ｒｆｕ）］
データは％特異的溶解として報告し；さらに、ＩＬ−２ムテインの関連ＩＬ−２参照に対する比を用いて、ヒトＰＢＭＣドナーの混合集団における対照ＩＬ−２に対して細胞毒性活性が維持されたかどうかを決定した。

（結果）
正常ヒトＰＢＭＣにおける増殖および細胞毒性のレベルを維持または増大させながら炎症誘発性サイトカイン産生を低減する、５種の有益なＩＬ−２変異を同定した。以下に示すデータセットについては、ＩＬ−２ムテインは関連する対照（すなわち、同じ酵母系において発現され精製されたデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（Ｙ−Ｐｒｏと称する））と共に試験した。まずＩＬ−２ムテインを、２連で試験した３つの正常血液ドナーＰＢＭＣを各々用いた２つの独立したアッセイ設定において用量応答曲線（３９ｐＭ〜１０ｎＭ）にわたって増殖／炎症誘発性サイトカイン産生複合アッセイにおいて試験した。データ分析は、個々のドナーのプロフィール、平均±標準偏差、内部ＩＬ−２対照との差の分析、および、細胞当たり産生されたサイトカインの相対レベルを得るための増殖（ｃｐｍ）に対するサイトカイン産生（ｐｇ／ｍＬ）の正規化を含んだ。最後に、ＩＬ−２対照からのＴＮＦ−α産生の％減少を計算した。１００００ｐＭにおいて２５％超のＴＮＦ−α産生の減少を示したＩＬ−２ムテインは、増殖のレベルが維持されていれば有益であるとみなされた。表１９は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン骨格においてさらなるアミノ酸置換を有していた５種の有益なＩＬ−２ムテインに関して観察された、ＴＮＦ−α産生のパーセント減少をまとめるものである。図２〜６はヒトＰＢＭＣにおける、それぞれＦ４２Ｅ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５ＧおよびＹ１０７Ｒムテインにより媒介される、増殖およびＴＮＦ−α産生を示す。

(表１９．ＩＬ−２対照からのＴＮＦ−α産生のパーセント減少^１）

^１値は、６人の正常ヒトＰＢＭＣドナーのパネル由来のＹ−Ｐｒｏ対照からの平均パーセント減少を示す。サイトカインデータは、増殖に対して正規化した。

一旦、５種の有益なＩＬ−２ムテインが同定されれば、ＩＬ−２ムテインで刺激されたＰＢＭＣがＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ活性による腫瘍細胞標的を溶解する能力を保持しているかどうかを決定することが重要であった。図７に示す通り、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ活性による腫瘍標的を溶解する能力においては、ＩＬ−２ムテインと関連ＩＬ−２対照との間に差は観察されなかった。

（実施例１１Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルを用いたＩＬ−２ムテインの効力の評価）
（実験設計）
Ｙ１０７Ｒ、Ｆ４２ＥおよびＥ９５ＤＩＬ−２ムテインを、ＩＬ−２感受性Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルにおいて試験した。目的は、用量応答を評価し、最小有効用量（ＭＥＤ）を決定し、そして、肺転移の阻害についての効力を明らかにすることであった。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、試験第１日に、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（５０，０００個／マウス）を静脈内移植した。マウスは、４〜６週齢であり、体重に基づいて１０群に無作為に分けた。全群は、相互に２０％以内の平均体重を有していた。処置は、第２日に、マウスに以下から構成されるものを投与した：プロロイキン（登録商標）の形態のＩＬ−２、ＲＬ−２（研究等級のＥ．ｃｏｌｉ由来ＩＬ−２）、Ｌ２−７００１（登録商標）（ＩＬ−２の単量体処方物）、またはＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５ＤまたはＹ１０７Ｒのいずれか）。２種の異なる投薬レジメンを試験した：１）改変Ｓｌｅｉｊｆｅｒレジメン（Ｓｌｅｉｊｆｅｒら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０（７）：１１１９−１１２３，１９９２）により記載されたプロトコルに基づく）、これは、２週間の、週５日、１日１回のＩＬ−２皮下投与による処置から構成される（５日投薬／２日休薬／５日投薬、用量が増大する設計）、および２）ＩＬ−２を週３回投与するレジメン。処置の効力および耐容性を、肺転移数（第１８〜２１日、盲検）、臨床観察、および薬剤耐容性の指標としの体重測定に基づいて評価した。

（結果）
プロロイキン（登録商標）、ＲＬ−２、Ｌ２−７００１（登録商標）およびＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５ＤおよびＹ１０７Ｒ）をＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＢ１６Ｆ１０黒色腫肺転移モデルにおいて週３回静脈内投与した（図８および９）。ＩＬ−２試験因子の最小有効用量（ＭＥＤ）（製薬用ビヒクルと比較して統計学的に有意な用量）は以下のとおり、すなわち、プロロイキン（登録商標）（３．３ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ２−７００１（登録商標）（３．３ｍｇ／ｋｇ）、ＲＬ−２（３．３ｍｇ／ｋｇ）、Ｅ９５Ｄ（５．７ｍｇ／ｋｇ）およびＹ１０７Ｒ（５．７ｍｇ／ｋｇ）、であった。試験薬剤のＥＤ５０（製薬用ビヒクルと比較して５０％の転移阻害）は、Ｌ２−７００１（登録商標）で２．４ｍｇ／ｋｇ、Ｅ９５Ｄで４．８ｍｇ／ｋｇ、そしてＹ１０７Ｒで６．１ｍｇ／ｋｇであった。５．７ｍｇ／ｋｇ（３ｘ／ｗｋ）で投与したＹ１０７ＲおよびＥ９５Ｄは、ＩＬ−２ベンチマーク（プロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１）と比較して同等の転移阻害をもたらした。最大耐容用量（ＭＴＤ）は、ムテインおよびＬ２−７００１（登録商標）に関しては到達されなかった。試験薬剤の全用量は十分耐容性であり、マウスは、試験期間中を通じて正常な体重を示した（図９）。効力の結果のまとめを提供する以下の表２０を参照のこと。

(表２０．マウスＢ１６Ｆ１０黒色腫肺転移モデルにおいて週３回投与したプロロイキン、ＲＬ−２、Ｌ２−７００１およびＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５ＤおよびＹ１０７Ｒ）の効力）

＊ＡＮＯＶＡ／Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎｓ−Ｋｅｕｌｓ検定
次にＩＬ−２因子を、「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」投薬レジメン（５日投与／２日休薬／５日投薬）を用いて試験した。全用量（３．３、５．７および８．１ｍｇ／ｋｇ）において、Ｅ９５ＤおよびＹ１０７Ｒは、ビヒクル処置または未処置のマウスと比較して肺転移の平均数の有意な減少（ｐ＜０．００１ＡＮＯＶＡ／Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎｓ−Ｋｅｕｌｓ検定）を示し、そして効力は、ＩＬ−２ベンチマーク（プロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標））と同等であった（図１０および１１）。３．３および８．１ｍｇ／ｋｇのＹ１０７Ｒは、それぞれ完全応答（ＣＲ）の２／１０および１／１０を示した（表２１）。ここでＣＲは、マウス肺における腫瘍（顕微鏡的病変を含む）の完全な消失として定義される。５．７ｍｇ／ｋｇのプロロイキン（登録商標）、ならびに８．１ｍｇ／ｋｇのＲＬ−２、ならびに３．３、５．７および８．１ｍｇ／ｋｇのＬ２−７００１（登録商標）は、ビヒクル処置または未処置のマウスと比較して、肺転移を有意に減少させた（ｐ＜０．００１ＡＮＯＶＡ／Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎｓ−Ｋｅｕｌｓ検定）。最小有効用量は、Ｌ２−７００１、Ｅ９５ＤおよびＹ１０７Ｒについては３．３ｍｇ／ｋｇであり、Ｅ９５Ｄ、Ｙ１０７ＲおよびＬ２−７００１の計算上のＥＤ５０は、＜３．３ｍｇ／ｋｇであった。８．１ｍｇ／ｋｇまでの試験因子の全用量は、十分耐容性を示し、マウスは正常な体重を示した。ＭＴＤは達成されなかった（図１１）。効力の結果のまとめを提供する以下の表２１を参照できる。

(表２１．マウスＢ１６Ｆ１０黒色腫肺転移モデルにおいて「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」プロトコル（５日投与／２日休薬／５日投薬）に従って投与した、プロロイキン、ＲＬ−２、Ｌ２−７００１、ならびにＩＬ−２ムテインＥ９５ＤおよびＹ１０７Ｒの効力）

ＡＮＯＶＡ／Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎｓ−Ｋｅｕｌｓ検定。

反復研究において、プロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）、Ｙ１０７ＲおよびさらにはＦ４２Ｅの効力を、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫肺転移モデルにおいて「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」投薬レジメン（５日投与／２日休薬／５日投薬）を用いて評価した。５．７ｍｇ／ｋｇおよび１０．５ｍｇ／ｋｇのＹ１０７Ｒ、Ｆ４２Ｅ、Ｌ２−７００１、ならびに５．７ｍｇ／ｋｇのプロロイキン（登録商標）は、ビヒクル処置または未処置のマウスと比較して、肺転移数の有意な減少（ｐ＜０．０５ＡＮＯＶＡ／Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎｓ−Ｋｅｕｌｓ検定）を示した（図１２および１３）。最小有効用量は、Ｌ２−７００１、Ｅ４２ＤおよびＹ１０７Ｒについては５．７ｍｇ／ｋｇであり、計算上のＥＤ５０は、Ｆ４２Ｅで６．４７ｍｇ／ｋｇ、Ｙ１０７Ｒで６．３３ｍｇ／ｋｇ、そしてＬ２−７００１で５．３７ｍｇ／ｋｇであった。同じ用量において、試験因子（プロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）、Ｆ４２ＥおよびＹ１０７Ｒ）の間に効力の差はなく、ＩＬ−２ムテインがベンチマークのプロロイキン（登録商標）およびＬ２−７００１（登録商標）と比較して同等の活性を示したことがわかった。５．７ｍｇ／ｋｇプロロイキン（登録商標）および１０．５ｍｇ／ｋｇＬ２−７００１（登録商標）の用量は、マウス体重減少を示し、それぞれ各薬剤のＭＴＤ用量とされた（図１３）。全ての用量におけるムテインＹ１０７ＲおよびＦ４２Ｅでは、体重減少は観察されなかった（すなわち、ＩＬ−２ムテインのＭＴＤは得られなかった）ことから、このムテインはＩＬ−２ベンチマークよりも良好な耐容性があることが示された（図１３）。効力の結果のまとめを提供する以下の表２２を参照。

(表２２．反復研究におけるマウスＢ１６Ｆ１０黒色腫肺転移モデルにおいて、「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」プロトコル（５日投与／２日休薬／５日投薬）に従って投与したプロロイキン、ＲＬ−２、Ｌ２−７００１およびＩＬ−２ムテインＥ９５ＤおよびＹ１０７Ｒの効力）

（結論）
１．Ｅ９５Ｄ、Ｙ１０７ＲおよびＦ４２ＥＩＬ−２ムテインは、インビボでの抗腫瘍活性を保持している。
２．古典的なＢ１６黒色腫転移モデルにおけるＥ９５Ｄ、Ｙ１０７ＲおよびＦ４２ＥＩＬ−２ムテインの効力は、週３回または「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」レジメンに従って投与した場合、同様の用量のベンチマークプロロイキン（登録商標）またはＬ２−７００１（登録商標）と同等である。
３．Ｙ１０７ＲおよびＦ４２ＥＩＬ−２ムテインはＩＬ−２ベンチマークプロロイキン（登録商標）およびＬ２−７００１（登録商標）よりも良好な耐容性があり、ＩＬ−２活性を保持しており、そして優れた治療指数を示す。
４．より高い最大許容用量（ＭＴＤ）がＹ１０７ＲおよびＦ４２ＥのＩＬ−２ムテインで達成され得、そしてこれは臨床レジメンにおいてより高い用量増大を可能とする、このことは、効力の向上と解釈できる。

（実施例１２非ホジキンリンパ腫の異種移植片モデルにおけるムテインの抗腫瘍活性）
（実験設計）
これらの研究の目的は、ＮＫ（または免疫エフェクター細胞）／ＡＤＣＣ媒介性効力モデルにおける、単剤として、または、モノクローナル抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）；ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８；ＩＤＥＣＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と組み合わせての、プロロイキン（登録商標）（ＩＬ−２）、Ｌ２−７００１（登録商標）、Ｅ９５ＤおよびＹ１０７Ｒの活性を評価することであった（図１４〜２０）。ＩＬ−２ムテインの効力を、２つの異なる非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）モデル、すなわち、ＩＬ−２に感受性のＮａｍａｌｗａ（高度ＮＨＬ）およびＩＬ−２に対して最低限の活性を示すがリツキシマブに対して反応するＤａｕｄｉモデル（低度ＮＨＬ、ＣＤ２０＋）において評価した。

（結果）
無胸腺ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスをＮａｍａｌｗａまたはＤａｕｄｉ細胞のいずれかを接種する前に１週間馴化させた。ＮａｍａｌｗａまたはＤａｕｄｉ細胞（５ｘ１０^６細胞／マウス）を、０．１ｍＬの容量で５０％マトリゲルと共に、放射線照射幼若ヌードマウス（３Ｇｙ、約３．２分）の右脇腹に皮下移植した。処置は、平均腫瘍容量が１００〜２００ｍｍ^３となった時点で開始した。これを試験の第１日とした。腫瘍体積および体重の測定は週２回評価した。臨床観察記録を行った。３０００ｍｍ^３より大きい腫瘍体積を有する個々のマウス、または、平均腫瘍体積が２０００ｍｍ^３超である群は、安楽死させた。２０％より高値の体重減少を有するマウスも屠殺した。目的は、腫瘍体積の測定、体重および臨床観察であった。

プロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）、ムテインＹ１０７ＲまたはＥ９５Ｄの週３回のレジメンの効力は、放射線照射Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるステージ化攻撃的ヒトＮＨＬモデル（Ｎａｍａｌｗａ）において評価した（図１４〜１６）。単剤のＬ２−７００１（登録商標）は、良好な用量応答効果を示し、計算上のＥＤ５０は、２ｍｇ／ｋｇであった（図１６）。ビヒクル単独処置と比較して、Ｌ２−７００１（登録商標）の活性は、１ｍｇ／ｋｇ、週３日（ｐ＝０．０３８）と３ｍｇ／ｋｇ、週３回（ｐ＝０．００９）で有意に異なった。しかしながら、１ｍｇ／ｋｇ、週３回のＬ２−７００１の処置と１ｍｇ／ｋｇ、週３回のプロロイキン（登録商標）の処置との間には統計学的な差はなかった（ｐ＞０．０５）（図１６）。

ＩＬ−２ムテインＹ１０７ＲおよびＥ９５Ｄは、Ｎａｍａｌｗａ腫瘍モデルにおいて用量応答効果を示した（図１５および１６）。１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ、週３回でのＥ９５Ｄによる処置は、ビヒクル投与と比較して有意差があった（ｐ＜０．００１）が、Ｙ１０７Ｒの最小有効用量は、このモデルでは僅かに高値（３ｍｇ／ｋｇ）であった。Ｎａｍａｌｗａモデルにおいて、Ｙ１０７ＲおよびＥ９５Ｄにより、１ｍｇ／ｋｇ、週３回で処置した場合、ベンチマークのプロロイキン（登録商標）およびＬ２−７００１（登録商標）の１ｍｇ／ｋｇ、週３回と同等の活性が示された（ｐ＞０．０５）。これらのムテインは３ｍｇ／ｋｇまで試験し、ＭＴＤには到達しなかった。

Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて、ＣＤ２０＋低度ヒトＮＨＬＤａｕｄｉ異種移植片におけるリツキシマブとプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）またはＩＬ−２ムテインＹ１０７Ｒとの、週３回レジメンでの組み合わせ療法の効力を評価した（図１７〜２０）。この実験の目的は、ＩＬ−２と治療用抗体（リツキシマブ）の併用療法の効力に対する、エフェクター細胞（ＮＫ、単球、マクロファージ、好中球）のインビボの活性化の役割を評価することであった。３ｍｇ／ｋｇでの単剤のプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）またはＹ１０７Ｒでの処置による腫瘍成長の阻害は、ビヒクルによる処置と統計学的な差はなかった（ｐ＞０．０５、ＡＮＯＶＡ、第２６日）（図１７）。しかしながら、腫瘍成長の遅延（すなわち、１０００ｍｍ^３までの腫瘍進行のための日数）に基づいて分析した場合、ビヒクル処置と比較して統計学的差が観察された（ｐ＜０．０５、Ｌｏｎ順位検定）。腫瘍効力の有意な増強が、対応する単剤と比較した場合にリツキシマブと組み合わせたプロロイキン（登録商標）またはＬ２−７００１（登録商標）による処置で観察された（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、第２６日）（図１８および１９）。Ｙ１０７Ｒムテインは、Ｂ細胞リンパ腫のＤａｕｄｉヒト異種移植片モデルにおいて、リツキシマブと組み合わせて投与した場合、プロロイキン／Ｌ２−７００１と同様の腫瘍効力の増強を誘導する。Ｙ１０７Ｒとリツキシマブの組み合わせによる処置は、プロロイキン（登録商標）投与と比較して、持続性応答数の増大（５ＣＲ）および条件付き生存の向上をもたらした（図１８および１９）。単剤ＩＬ−２ムテインおよびリツキシマブとの組み合わせの全用量が、十分な耐容性を示した（図２０）。

（結論）
１．ムテインＥ９５ＤおよびＹ１０７Ｒは、攻撃的Ｂ細胞ＮＨＬ（ＮＨＬのＮａｍａｌｗａモデル）の腫瘍成長の有意な阻害を示す。
２．ＩＬ−２ムテインは、黒色腫、ＮＨＬを含む癌集団のサブセットにおいて、単剤として有効である。
３．ＩＬ−２ムテインＹ１０７Ｒの活性は、低度Ｂ細胞ＮＨＬＤａｕｄｉモデルに対しては最低レベルであったが、リツキシマブと組み合わせれば、免疫エフェクター細胞（すなわち、ＮＫ、単球、マクロファージ、好中球）を活性化してＡＤＣＣを強力に媒介することができる。
４．併用療法におけるＩＬ−２ムテインＹ１０７Ｒおよびリツキシマブは、単剤のＩＬ−２またはリツキシマブ単独と比較して、優れた効力を示す。
５．ＩＬ−２ムテインの活性は、ＡＤＣＣまたは同様の免疫細胞エフェクター機序を介して効果を媒介する他の抗体との組み合わせに適用され得る。
６．これらの所見の内容は、他の療法または疾患適応症に適用できるエフェクター細胞応答を媒介するためにＩＬ−２（またはムテイン）と同様の機序効果を有する、他のサイトカイン分子に適用され得る。

（実施例１３ＩＬ−２誘発性血管漏出症候群モデルにおける耐容性の評価）
（実験設計）
雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、研究開始前１週間馴化させた。マウスは、８〜１０週齢であり、体重に基づいて５群に無作為に分けた。プロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）またはＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５ＤおよびＹ１０７Ｒ）を、１日３回、６ｍｇ／ｋｇ（約２，０００，０００ＩＵ）で腹腔内（ｉｐ）注射した。注射は、１０投薬繰り返した。１％マウス血清含有０．１ｍＬＰＢＳ中の^１２５Ｉ−アルブミン（１μＣｉ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を、第４日に、プロロイキン（登録商標）投与後４時間において注射した。マウスを、^１２５Ｉ−アルブミン注射の６０分後に安楽死させた。肺を摘出し、ガンマカウンター用のバイアルに入れた。

（結果）
ＩＬ−２またはＬ２−７００１（登録商標）の高用量（６ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、３ｘ／日、１０投薬）での処置により、マウス肺の^１２５Ｉ−アルブミン貯留の統計学的増大がもたらされ、これは、増大した血管漏出に起因し、ヒトで見られるものと同様の血管漏出症候群（ＶＬＳ）の病理学的モデルを模倣している（図２１）。実験的ＶＬＳのこの「急性」のモデルにおいて、Ｅ９５ＤおよびＹ１０７ＲＩＬ−２ムテインの両方が^１２５Ｉ−アルブミン貯留の増大をもたらした。しかし、Ｙ１０７Ｒは、プロロイキン（登録商標）処置と比較して、ＶＬＳ誘導の程度の１６％減少を示していた（図２１）。

（実施例１４温度チップを用いた体温変化のモニタリングによるＩＬ−２ムテインの耐容性の評価）
（序論）
ＩＬ−２誘導毒性およびＶＬＳの根拠となる正確な機序は不明であるが、蓄積したデータによれば、ＩＬ−２誘導ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）は、単球／マクロファージを活性化し、一酸化窒素（ＮＯ）産生を誘導して後に内皮細胞の損傷をもたらす、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６を含む炎症誘発性サイトカインの過剰生産の結果として起こる、用量制限性の毒性を誘発することが示唆されている（Ｄｕｂｉｎｅｔｔら（１９９４）ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ．１５７（１）：１７０−１８０；およびＳａｍｌｏｗｓｋｉら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．ＥｍｐｈａｓｉｓＴｕｍｏｒＩｍｍｕｎｏｌ．１８（３）：１６６−７８）。

発熱および悪寒は、ＩＬ−２療法の間の一般的なグレード３の副作用である。発熱は、ＴＮＦ−α誘導性プロスタグランジンＥ２への生理学的反応であり、そして発熱の発症は、コア温度の実際の変化に先立って、血管収縮および寒気を誘発する。ＩＬ−２は、インビトロにおいてプロスタグランジンＥ２合成を直接誘導しない；従って、ＩＬ−２そのものは非発熱性サイトカインに分類されている。しかしながら、外因性投与の後、ＩＬ−２は、発熱性サイトカイン、特に、ＩＬ−２療法の間の発熱および急性期の応答の他の特徴の主因である、ＴＮＦ−αの放出を誘導する（Ｍｉｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：４２６）。ＴＮＦ−αの血漿中濃度は、ＩＬ−２処置患者では、６００ｎｇ／ｍＬ超に達し得ることが報告されている（Ｇｅｍｌｏら（１９８８）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８（２０）：５８６４−５８６７）。

ヒトにおける用量制限性の毒性（例えば発熱／悪寒、ＶＬＳおよび低血圧）は、全て炎症誘発性サイトカインおよびＮＯ産生と派生的相関を有している。炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の産生と生理学的体温の変化の誘導との間には直接の関係があるため、温度変化を、ＩＬ−２免疫療法後の耐容性の前兆としてモニタリングすることができる。

副作用のプロフィールをモデル化するためには、温度変化と炎症誘発性サイトカイン産生との間の関係をヒトからマウスに当てはめることが重要である。両方の種において、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βなど）の産生は、プロスタグランジンＥ２の視床下部誘導により媒介される体温変化の原因である。マウスのような一般的に使用されている実験動物は、多くの薬剤に急性に曝露されると低体温および低代謝を示す。これは毒性の侵襲の致死性を低下させるための固有の保護応答と推定されている（ＧｏｒｄｏｎおよびＹａｎｇｅ（１９９７）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１３：８３５）。

マウスモデルにおけるＩＬ−２投与後のコア体温の上昇が予測されるが、実際は、このモデルでは低下が観察される。炎症の外因性のメディエーター（例えばＬＰＳ）は、マウスモデルにおいてＴＮＦ−αを誘導し、コア体温を一過性に低下させることが当該分野で公知である（Ｋｏｚａｋら（１９９７）Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１３：８３５）。他のモデルにおいては、低体温の遠隔計測的評価は、ＳＥＢ内臓ショックのマウスモデルにおける死亡率の早期の明らかな指標であることを証明した（Ｖｌａｃｈら（２０００）Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５０：１６０）。

（実験設計）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに温度チップを皮下移植し、ＰＯＣＫＥＴＳＣＡＮＮＥＲシステム（ＢｉｏＭｅｄｉｃＤａｔａＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｓｅａｆｏｒｄ，ＤＥ）を用いて体温の変化をモニタリングした。プロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）またはＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５Ｄ、Ｙ１０７Ｒ、Ｌ９４ＹまたはＦ４２Ｅ）を、「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」投薬レジメン（５日投与／２日休薬／５日投薬）を用いて皮下投与した。マウスの体温を、ＩＬ−２投与の前後の所定の時点においてモニタリングし、緩衝液対照（ビヒクル）を注射したマウスと比較した。指標はコア体温、臨床観察、体重および炎症誘発性サイトカイン（例えばＴＮＦ−α）レベルとした。

（結果）
プロロイキン（登録商標）またはＬ２−７００１（登録商標）投与（５．７ｍｇ／ｋｇまたは８．１ｍｇ／ｋｇ、５日間毎日皮下注射）の後、温度の有意な低下が第４日および５日の投与後４時間で観察された。体温低下もあった（ヒトで観察されるような上昇ではない）が、効果は再現性があり、ビヒクル処置動物には効果は観察されなかった。図２２は、２週間の期間に渡る１０投与に対する投与後９時間までの温度モニタリングを含むように実施した、長時間の経過を示す。最も一貫した顕著な変化は、第５日の投与後４時間で起こった。さらに、マウスモデルにおけるＩＬ−２誘導温度変化と血漿中ＴＮＦ−αレベルとの間には有意な相関があった。モデルは再現性があり、表２３にまとめるとおり、ＩＬ−２投与に応じて体温の有意な低下がもたらされた。

（表２３．投与後４時間での温度変化のまとめ）

^１数値は、平均体温（°Ｆ）±ＳＤとして表した、統計学的検定（ＡＮＯＶＡ＋Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）、ｐ＞０．０５で有意差なし。
^＊群内の動物は、第２週に１０．５ｍｐｋを投与。
^２ＢＡＬＢ／ｃマウスを研究において使用。
^３研究した動物は腫瘍を保持し、効力研究では全群に５．７ｍｐｋを投与。
^４１匹のマウスが、重度の低体温のために最後の注射後３０分に死亡。
^５ＮＳ＝有意差なし（Ｐ＞０．０５）。

特記すべきことに、Ｌ２−７００１製剤がマウスモデルにおいてより良好な耐容性を示している。なぜなら、８．１ｍｇ／ｋｇ以上の用量で有意な温度低下が一貫して観察されたのに対し、５．７ｍｇ／ｋｇのプロロイキン（登録商標）は、このモデルにおいては最大耐容用量であるためである。これらの観察結果は、腫瘍保持動物において長期間（一般的には２週間の投与サイクル）投与された、他の前臨床モデルと合致している。

ＩＬ−２ムテインのうちの２つ、Ｙ１０７ＲおよびＦ４２Ｅは、ＴＮＦ−αの誘導の低減に相関する、温度変化の有意な低減を示しており、プロロイキン（登録商標）およびＬ２−７００１（登録商標）と比較して向上した耐容性が予測された。図２３〜２５を参照。

本明細書に示される本発明の多くの変更および他の実施形態は、上記の説明および添付する図面に示した教示の利益を有する本発明が関係する分野の当業者に理解される。したがって、本発明が開示した特定の実施形態に限定されるべきではなく、変更および他の実施形態が本明細書に開示される実施形態の範囲内に包含されることが意図されることが理解されるべきである。本明細書において特定の用語が使用されたが、これらは、一般的かつ説明的な意味においてのみ使用されており、限定する目的で使用されていない。

図１は、正常ヒトドナーから単離されたＩＬ−２ムテイン刺激のヒトＰＢＭＣと共に使用される、組み合わせの増殖／炎症誘発性サイトカイン生産アッセイ手順の複雑な状況についての概略図の概略を述べる。図２は、ヒトＰＢＭＣにおけるＦ４２ＥＩＬ−２ムテインにより媒介される増殖およびＴＮＦ−α生産を示す。図３は、ヒトＰＢＭＣにおけるＬ９４ＹＩＬ−２ムテインにより媒介される増殖およびＴＮＦ−α生産を示す。図４は、ヒトＰＢＭＣにおけるＥ９５ＤＩＬ−２ムテインにより媒介される増殖およびＴＮＦ−α生産を示す。図５は、ヒトＰＢＭＣにおけるＥ９５ＧＩＬ−２ムテインにより媒介される増殖およびＴＮＦ−α生産を示す。図６は、ヒトＰＢＭＣにおけるＹ１０７ＲＩＬ−２ムテインにより媒介される増殖およびＴＮＦ−α生産を示す。図７は、正常ヒトドナーから単離されたＩＬ−２ムテイン刺激のヒトＰＢＭＣに関する、ヒトＮＫ媒介性ＬＡＫおよびＡＤＣＣ活性の維持を示す。図８は、実施例１１に記載される、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢ１６Ｆ１０黒色腫肺転移モデルにおいて週３回投与されたプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）、ＲＬ−２およびＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５ＤおよびＹ１０７Ｒ）の効能を比較した棒グラフである。図９は、実施例１１に記載される、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢ１６Ｆ１０黒色腫肺転移モデルにおいて週３回投与のプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）、ＲＬ−２またはＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５ＤおよびＹ１０７Ｒ）で処置されたマウスの平均体重を比較したものである。図１０は、実施例１１に記載される、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢ１６Ｆ１０黒色腫肺転移モデルにおいて、「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」プロトコル（５日投与／２日投与なし／５日投与）に従って投与されたプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）、ＲＬ−２およびＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５ＤおよびＹ１０７Ｒ）の効能を比較した棒グラフを示す。図１１は、実施例１１に記載される、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢ１６Ｆ１０黒色腫肺転移モデルにおいて、「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」プロトコル（５日投与／２日投与なし／５日投与）に従って投与されたプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）、ＲＬ−２またはＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５ＤおよびＹ１０７Ｒ）で処置されたマウスの平均体重を比較したものである。図１２は、実施例１１に記載される反復研究において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢ１６Ｆ１０黒色腫肺転移モデルにおいて「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」プロトコル（５日投与／２日投与なし／５日投与）に従って投与されたプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）、ＲＬ−２およびＩＬ−２ムテイン（Ｆ４２ＥおよびＹ１０７Ｒ）の効能を比較した棒グラフを示す。図１３は、実施例１１に記載される反復研究において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢ１６Ｆ１０黒色腫肺転移モデルにおいて「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」プロトコル（５日投与／２日投与なし／５日投与）に従って投与されたプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）、ＲＬ−２またはＩＬ−２ムテイン（Ｆ４２ＥおよびＹ１０７Ｒ）で処置されたマウスの平均体重を比較したものである。図１４は、実施例１２に記載される照射Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける攻撃的ヒト非ホジキンリンパ腫モデル（Ｎａｍａｌｗａ）に週３回投与されたプロロイキン（登録商標）およびＬ２−７００１（登録商標）の効能を比較したものである。図１４は、時間（病期分類後の日数）に対する平均腫瘍容量（ｍｍ^３）のプロットを示す。図１５は、実施例１２に記載される照射Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける攻撃的ヒト非ホジキンリンパ腫モデル（Ｎａｍａｌｗａ）に週３回投与されたプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）およびＹ１０７ＲＩＬ−２ムテインの効能を比較したものである。図１５は、時間（病期分類後の日数）に対する平均腫瘍容量（ｍｍ^３）のプロットを示す。図１６は、実施例１２に記載される照射Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける攻撃的ヒト非ホジキンリンパ腫モデル（Ｎａｍａｌｗａ）において週３回投与されたプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）およびＥ９５ＤＩＬ−２ムテインの効能を比較したものである。図１６は、時間（病期分類後の日数）に対する平均腫瘍容量（ｍｍ^３）のプロットを示す。図１７は、実施例１２に記載される照射Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける悪性度の低いＤａｕｄｉヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫モデルにおいて週３回投与されたプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）およびＹ１０７ＲＩＬ−２ムテインによる単一薬剤療法の効能を比較したものである。図１７は、時間（病期分類後の日数）に対する平均腫瘍容量（ｍｍ^３）のプロット、および統計学的結果の要約：％腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）、部分応答／完全応答（ＰＲ／ＣＲ）、Ｐ値、％体重（ＢＷ）変化、および臨床観察結果を示す。図１８は、実施例１２に記載される照射Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける悪性度の低いＤａｕｄｉヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫モデルにおいて週３回投与されたリツキシマブと組み合わせて投与されたプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）およびＹ１０７ＲＩＬ−２ムテインの効力を比較したものである。図１８は、時間（病期分類後の日数）に対する平均腫瘍容量（ｍｍ^３）のプロット、および統計学的結果の要約：％腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）、部分応答／完全応答（ＰＲ／ＣＲ）、Ｐ値、％体重（ＢＷ）変化、および臨床観察結果を示す。図１９は、実施例１２に記載される照射Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける悪性度の低いＤａｕｄｉヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫モデルにおいて週３回投与されたリツキシマブと組み合わせて投与されたプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）またはＹ１０７ＲＩＬ−２ムテインで処置されたマウスについての条件付き生存（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｓｕｒｖｉｖａｌ）および腫瘍成長阻害のレベルを比較したものである。図１９は、時間（１０００ｍｍ^３まで腫瘍が進行する日数）に対する条件付け生存（％）のプロットおよび完全応答（ＣＲ）の統計値をまとめた表を示す。図２０は、実施例１２に記載される照射Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける悪性度の低いＤａｕｄｉヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫モデルにおいて週３回投与されたリツキシマブの存在下または非存在下でプロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）またはＹ１０７ＲＩＬ−２ムテインで処置されたマウスの平均体重を比較したものである。図２１は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの実験的な急性ＩＬ−２誘導性血管漏出症候群モデルにおいて評価された、プロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）およびＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５ＤおよびＹ１０７Ｒ）の薬物耐容性を比較した棒グラフを示す。ＩＬ−２での処置により誘発された血管の漏出の増加から生じるマウス肺内の^１２５Ｉ−アルブミンの停留が、実施例１３に記載されるように測定された。図２２は、ＩＬ−２による処置に応答したマウスのコア体温の変化を示すプロットを示す。ＩＬ−２投与後の温度をモニタリングするための温度チップを皮下移植したＣ５７ＢＬ／６マウスは、「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」プロトコル（５日投与／２日投与なし／５日投与）に従って、プロロイキン（登録商標）およびＬ２−７００１（登録商標）を投与された。温度は、２週間の期間にわたって１０回の投薬に対して投与後９時間モニタリングされた。大部分の一貫した顕著な温度変化は、処置の５日目の投薬の４時間後に起こった。図２３は、プロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）またはＩＬ−２ムテイン（Ｌ９４Ｙ、Ｆ４２ＥまたはＥ９５Ｇ）で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスのコア体温を比較したプロットを示す。温度チップを皮下移植されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、実施例１４に記載されるように、２週間にわたって１０回の投薬について投与後９時間モニタリングされた。図２４は、プロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）またはＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５Ｄ、Ｌ９４Ｙ、Ｙ１０７ＲまたはＦ４２Ｅ）の投与後４時間の５日目におけるＣ５７ＢＬ／６マウスのコア体温を比較した棒グラフを示す。ＩＬ−２は、実施例１４に記載されるように「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」プロトコル（５日投与／２日投与なし／５日投与）に従って、温度チップを皮下移植されたＣ５７ＢＬ／６マウスに投与された。図２５は、プロロイキン（登録商標）、Ｌ２−７００１（登録商標）またはＩＬ−２ムテイン（Ｅ９５Ｄ、Ｌ９４Ｙ、Ｙ１０７ＲまたはＦ４２Ｅ）で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける体温低下とＴＮＦ−α血漿レベルとの間の相関を示す。棒グラフは、実施例１４に記載の通り「Ｓｌｅｉｊｆｅｒ」プロトコルに従ってＩＬ−２投与後４時間における５日目のマウスの体温および血漿ＴＮＦ−αレベルの変化を比較したものである。ＴＮＦ−α濃度に対する温度変化のプロットは、温度低下およびＴＮＦ−α血漿レベルの上昇が直線的に相関していることを示す。

Claims

単離された核酸分子であって、以下：
ａ）ヒトＩＬ−２のムテインをコードするヌクレオチド配列であって、該ムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２および３４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、３７５、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１または３４３に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）ヒトＩＬ−２のムテインをコードするヌクレオチド配列であって、該ムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４に示される配列の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列を含む、ヌクレオチド配列；
ｄ）配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、３７５、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１または３４３に示される配列のヌクレオチド４〜３９９を含むヌクレオチド配列；
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列であって、ここで該配列は、アラニンをコードするトリプレットコドンによる、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、３７５、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１または３４３のヌクレオチド３７３〜３７５の置換を含む、ヌクレオチド配列；
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列であって、ここで該配列は、システインをコードするトリプレットコドンによる、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、３７５、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１または３４３のヌクレオチド３７３〜３７５の置換を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヌクレオチド配列であって、ここで該ムテインをコードする１以上のコドンは、目的の宿主細胞における発現について最適化されている、ヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
前記ｇ）のヌクレオチド配列が、配列番号３４５に示される配列、配列番号３４５のヌクレオチド４〜３９９、配列番号３４６に示される配列および配列番号３４６のヌクレオチド４〜３９９からなる群より選択される、請求項に１記載の単離された核酸分子。
請求項１に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
請求項１に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
単離されたポリペプチドであって、以下：
ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列；
ｃ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の１２５位のセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含む、アミノ酸配列；および
ｄ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の１２５位のセリン残基に対して置換されたシステイン残基を含む、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ムテインは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンおよび配列番号４内の少なくとも１つのさらなるのアミノ酸の置換を有する配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ここで該ムテインは、類似のアッセイ条件下においてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較した場合、１）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を維持または増大させ、そして２）ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産の低減されたレベルを誘導し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産は、ＮＫ−９２バイオアッセイによりアッセイされる、単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、配列番号４の１位のアラニンの欠失をさらに含む、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記さらなる置換が、Ｔ７Ａ、Ｔ７Ｄ、Ｔ７Ｒ、Ｋ８Ｌ、Ｋ９Ａ、Ｋ９Ｄ、Ｋ９Ｒ、Ｋ９Ｓ、Ｋ９Ｖ、Ｋ９Ｗ、Ｔ１０Ｋ、Ｔ１０Ｎ、Ｑ１１Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｑ１１Ｔ、Ｅ１５Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｅ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｄ２０Ｅ、Ｉ２４Ｌ、Ｋ３２Ａ、Ｋ３２Ｗ、Ｎ３３Ｅ、Ｐ３４Ｅ、Ｐ３４Ｒ、Ｐ３４Ｓ、Ｐ３４Ｔ、Ｐ３４Ｖ、Ｋ３５Ｄ、Ｋ３５Ｉ、Ｋ３５Ｌ、Ｋ３５Ｍ、Ｋ３５Ｎ、Ｋ３５Ｐ、Ｋ３５Ｑ、Ｋ３５Ｔ、Ｌ３６Ａ、Ｌ３６Ｄ、Ｌ３６Ｅ、Ｌ３６Ｆ、Ｌ３６Ｇ、Ｌ３６Ｈ、Ｌ３６Ｉ、Ｌ３６Ｋ、Ｌ３６Ｍ、Ｌ３６Ｎ、Ｌ３６Ｐ、Ｌ３６Ｒ、Ｌ３６Ｓ、Ｌ３６Ｗ、Ｌ３６Ｙ、Ｒ３８Ｄ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｎ、Ｒ３８Ｐ、Ｒ３８Ｓ、Ｌ４０Ｄ、Ｌ４０Ｇ、Ｌ４０Ｎ、Ｌ４０Ｓ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｇ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｖ、Ｋ４３Ｈ、Ｆ４４Ｋ、Ｍ４６Ｉ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６１Ｍ、Ｅ６１Ｒ、Ｅ６２Ｔ、Ｅ６２Ｙ、Ｋ６４Ｄ、Ｋ６４Ｅ、Ｋ６４Ｇ、Ｋ６４Ｌ、Ｋ６４Ｑ、Ｋ６４Ｒ、Ｐ６５Ｄ、Ｐ６５Ｅ、Ｐ６５Ｆ、Ｐ６５Ｇ、Ｐ６５Ｈ、Ｐ６５Ｉ、Ｐ６５Ｋ、Ｐ６５Ｌ、Ｐ６５Ｎ、Ｐ６５Ｑ、Ｐ６５Ｒ、Ｐ６５Ｓ、Ｐ６５Ｔ、Ｐ６５Ｖ、Ｐ６５Ｗ、Ｐ６５Ｙ、Ｌ６６Ａ、Ｌ６６Ｆ、Ｅ６７Ａ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｔ、Ｆ７８Ｓ、Ｆ７８Ｗ、Ｈ７９Ｆ、Ｈ７９Ｍ、Ｈ７９Ｎ、Ｈ７９Ｐ、Ｈ７９Ｑ、Ｈ７９Ｓ、Ｈ７９Ｖ、Ｌ８０Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｇ、Ｌ８０Ｋ、Ｌ８０Ｎ、Ｌ８０Ｒ、Ｌ８０Ｔ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｗ、Ｌ８０Ｙ、Ｒ８１Ｅ、Ｒ８１Ｋ、Ｒ８１Ｌ、Ｒ８１Ｍ、Ｒ８１Ｎ、Ｒ８１Ｐ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ｒ、Ｓ８７Ｔ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｈ、Ｎ８８Ｔ、Ｖ９１Ａ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｆ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｎ、Ｖ９１Ｑ、Ｖ９１Ｗ、Ｌ９４Ａ、Ｌ９４Ｉ、Ｌ９４Ｔ、Ｌ９４Ｖ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｇ、Ｅ９５Ｍ、Ｔ１０２Ｓ、Ｔ１０２Ｖ、Ｍ１０４Ｇ、Ｅ１０６Ｋ、Ｙ１０７Ｈ、Ｙ１０７Ｋ、Ｙ１０７Ｌ、Ｙ１０７Ｑ、Ｙ１０７Ｒ、Ｙ１０７Ｔ、Ｅ１１６Ｇ、Ｎ１１９Ｑ、Ｔ１２３Ｓ、Ｔ１２３Ｃ、Ｑ１２６ＩおよびＱ１２６Ｖからなる群より選択される、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記置換が、Ｈ１６Ｄ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ３６Ｄ、Ｌ３６Ｐ、Ｌ４０Ｄ、Ｌ４０Ｇ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｒ、Ｅ６１Ｒ、Ｐ６５Ｙ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ８０Ｋ、Ｒ８１Ｋ、Ｎ８８Ｄ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｎ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｇ、Ｙ１０７ＨまたはＹ１０７Ｒである、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、配列番号４の１位のアラニンの欠失をさらに含む、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
前記炎症誘発性サイトカインがＴＮＦ−αである、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、類似のアッセイ条件下におけるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量について観察されるものと比較して、維持または改善されたヒトＮＫ細胞媒介性ナチュラルキラー細胞毒性、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞毒性、またはＡＤＣＣ媒介性細胞毒性を提供し、ここで該ＮＫ細胞媒介性細胞毒性は、ＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイを用いてアッセイされる、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル１Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量について観察されるものと比較して、ＮＫ３．３細胞株においてリン酸化ＡＫＴの維持または向上された誘導を提供する、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインにより誘導された前記ＮＫ細胞の増殖が、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される増殖の１５０％超である、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインにより誘導された前記ＮＫ細胞の増殖が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖の１７０％超である、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインにより誘導された前記ＮＫ細胞の増殖が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖の約２００％〜約２１０％である、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインにより誘導された前記ＮＫ細胞の増殖が、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される増殖より少なくとも１０％増大している、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインにより誘導された前記ＮＫ細胞の増殖が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖より少なくとも１５％増大している、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインにより誘導された前記炎症誘発性サイトカイン生産が、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される産生の１００％未満である、請求項１８に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインにより誘導された前記炎症誘発性サイトカイン生産が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される産生の７０％未満である、請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ムテインは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンおよび配列番号４内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を有する配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ムテインのＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産に対するＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞の増殖の比は、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察される比より少なくとも１．５倍高く、ここで０．１ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞増殖および１．０ｎＭムテインにおけるＴＮＦ−α生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる、ポリペプチド。
前記比が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察される比より少なくとも２．５倍高い、請求項２１に記載の単離されたポリペプチド。
前記比が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察される比より少なくとも３．０倍高い、請求項２１に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、配列番号４の１位にアラニンの欠失をさらに含む、請求項２１に記載の単離されたポリペプチド。
ヒトＩＬ−２のムテインに対するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ムテインは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンならびに１６位、３６位、４０位、４２位、６１位、６５位、６７位、７２位、９１位、９４位、９５位および１０７位からなる群より選択される配列番号４の位置における少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を有する配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
前記ムテインが、配列番号４の１位にアラニンの欠失をさらに含む、請求項２５に記載の単離されたポリペプチド。
ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインを産生する方法であって、該ムテインは、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ヒトＩＬ−２から選択される参照ヒトＩＬ−２ムテインの同様の量と比較した場合、ＮＫ細胞の増殖を維持または増強することが可能であり、そしてまたＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程；
ｂ）ポリペプチドとしての該核酸分子の発現を可能にする条件下で細胞培養培地において該宿主細胞を培養する工程；および
ｃ）該ポリペプチドを単離する工程
を包含する、方法。
ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインを産生する方法であって、該ムテインは、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ヒトＩＬ−２ムテインの同様の量と比較した場合、ＮＫ細胞の増殖を維持または増強することが可能であり、そしてまたＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項２５に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程；
ｂ）ポリペプチドとしての該核酸分子の発現を可能にする条件下で細胞培養培地において該宿主細胞を培養する工程；および
ｃ）該ポリペプチドを単離する工程
を包含する、方法。
請求項２に記載のヒトＩＬ−２ムテインの治療有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
哺乳動物の免疫系を刺激するための方法であって、該方法は、ヒトＩＬ−２ムテインの治療有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで該ムテインは、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２分子の同様の量と比較した場合、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増強し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを使用してアッセイされる、方法。
前記哺乳動物がヒトである、請求項３０に記載の方法。
前記ヒトＩＬ−２ムテインが、以下：
ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列；
ｃ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の１２５位のセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含む、アミノ酸配列；および
ｄ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の１２５位のセリン残基に対して置換されたシステイン残基を含む、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
哺乳動物において癌を処置するための方法であって、該方法は、ヒトＩＬ−２ムテインの治療有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで該ムテインは、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２分子の同様の量と比較した場合、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増強し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる、方法。
前記哺乳動物がヒトである、請求項３３に記載の方法。
前記ヒトＩＬ−２ムテインが、以下：
ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列；
ｃ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の１２５位のセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含む、アミノ酸配列；および
ｄ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の１２５位のセリン残基に対して置換されたシステイン残基を含む、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の方法。
処置プロトコルとしてインターロイキン−２（ＩＬ−２）投与を受けている被験体においてＩＬ−２誘導性毒性症状を低減するための方法であって、該方法は、ＩＬ−２ムテインとして該ＩＬ−２を投与する工程を含み、ここで該ＩＬ−２ムテインは、以下：
ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列；
ｃ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の１２５位のセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含む、アミノ酸配列；および
ｄ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の１２５位のセリン残基に対して置換されたシステイン残基を含む、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
前記ムテインが、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察される用量と比較して、より高い最大許容用量を有し、ここで該最大許容用量は、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫動物モデルを用いて決定される、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、類似の処置条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２での処置と比較した場合、類似または改善された抗腫瘍活性および低減された副作用を示し、ここで該抗腫瘍活性は、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫動物モデルを用いて評価される、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、類似の処置条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２での処置と比較した場合、類似または改善された抗腫瘍活性および低減された副作用を示し、ここで該抗腫瘍活性は、高悪性度非ホジキンリンパ腫Ｎａｍａｌｗａ動物モデルまたは低悪性度非ホジキンリンパ腫Ｄａｕｄｉ動物モデルを用いて評価される、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、リツキシマブと同時投与された場合に、類似の処置条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２での処置と比較して類似または改善された抗腫瘍活性および低減された副作用を示し、ここで該抗腫瘍活性は、高悪性度非ホジキンリンパ腫Ｎａｍａｌｗａ動物モデルまたは低悪性度非ホジキンリンパ腫Ｄａｕｄｉ動物モデルを用いて評価される、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較して、改善された免疫エフェクター細胞活性化を示す、請求項３９または４０に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージおよび好中球からなる群より選択される細胞の改善された免疫エフェクター細胞活性化を示す、請求項４１に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較して改善された抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）媒介性細胞溶解殺傷を示す、請求項４０に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、血管漏出症候群の動物モデルにおいてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較して低下した血管漏出を引き起こす、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、動物モデルにおいてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較して体温のより少ない変化を引き起こし、ここで体温は、温度チップにより該動物内でモニタリングされる、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
前記ムテインが、被験体へ投与された場合、インビボ温度チップを用いた体温測定、血管漏出の測定、または該被験体における最大許容用量の測定によって決定されるとき、改善された耐容性を示す、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
哺乳動物の免疫系を刺激するための方法におけるヒトＩＬ−１２ムテインの使用であって、該方法は、該哺乳動物に治療有効量のヒトＩＬ−１２ムテインを投与する工程を包含し、ここで該ムテインは、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２分子の同様の量と比較してＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増大し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを使用してアッセイされる、使用。
哺乳動物において癌を処置するための方法におけるヒトＩＬ−２の使用であって、該方法は、該哺乳動物に治療有効量のヒトＩＬ−２ムテインを投与する工程を包含し、該ムテインは、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２分子の同様の濃度と比較して、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増強し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる、使用。
処置プロトコルとしてインターロイキン−２（ＩＬ−２）投与を受けている被験体においてＩＬ−２誘導性毒性症状を低減するための方法におけるヒトＩＬ−２ムテインの使用であって、該方法は、ＩＬ−２ムテインとして該ＩＬ−２を投与する工程を包含し、ここで該ＩＬ−２ムテインは、以下：
ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列；
ｃ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の１２５位のセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含む、アミノ酸配列；および
ｄ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２または３４４の１２５位のセリン残基に対して置換されたシステイン残基を含む、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、使用。