JP2023548311A - 疾患の治療のための融合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

インターロイキン－２（ＩＬ２）融合タンパク質の１つまたは複数の用量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法であって、用量は約０．１ｍｇ～約９ｍｇである方法が、本明細書中に開示される。ＩＬ２融合タンパク質の用量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法であって、用量は約９ｍｇ超である方法もまた、本明細書中に開示される。本明細書中に開示される方法において用いられるＩＬ２融合タンパク質は、（ａ）ＩＬ２ポリペプチドを含む第１のポリペプチド；および（ｂ）ＩＬ２受容体α（ＩＬ２Ｒ）ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のポリペプチドを含む。一部の態様では、疾患または障害は、全身性エリテマトーデスなどの免疫媒介疾患である。一部の態様では、方法は、対象にコルチコステロイドを投与することをさらに含む。【選択図】なし

Description

関連出願に対する相互参照
本ＰＣＴ出願は、それらの両方がその全体で参照により本明細書中に組み入れられる、２０２０年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６３／１９８，６１５号および２０２０年１２月１０日出願の同第６３／１２３，９９１号の利益を主張する。
電子的に提出された配列表に対する参照
本出願と共に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルにおいて電子的に提出された配列表（名称：３３３８．２３４ＰＣ０２＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：４９，５４０バイト；作成日：２０２１年１０月２９日）の内容は、その全体で参照により本明細書中に組み入れられる。
本開示の分野
本開示は、インターロイキン－２（ＩＬ２）／ＩＬ２受容体α融合タンパク質の１つまたは複数の用量を投与することによる、対象において疾患または障害を治療するための方法を提供する。
インターロイキン－２（ＩＬ２またはＩＬ－２）は、免疫系の主要な側面を調節する生物学的サイトカインである。ＩＬ－２は、炎症性疾患または自己免疫疾患を有する患者において免疫応答を促進するための試みにおいて用いられてきた。ＩＬ－２は、抗原活性化型Ｔ細胞のクローン拡大増殖をはじめとする免疫応答を促進し、ＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）１およびＴｈ２細胞の発達を駆動し、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を最終分化させ、かつＣＤ４＋Ｔｈ１７およびＴ濾胞性ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞の発達を妨げる、強力なＴ細胞増殖因子である。ＩＬ－２はまた、Ｔ細胞メモリーリコール応答も形成する。
Ｔｒｅｇに対するＩＬ－２シグナル伝達経路の重要性は、ＩＬ－２シグナル伝達経路の構成要素を欠失するマウスまたはヒトにおける全身性自己免疫の出現により実証されてきた。調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）数および／または機能の調節異常は、多数の免疫媒介状態に関連付けられてきた。例えば、Bluestone, J.A., et al., J Clin Invest. 125:2250-60 (2015)；およびDominguez-Villar, M and Hafler, D.A., Nat Immunol. 19:665-73 (2018)を参照されたい。ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒα、およびＩＬ－２Ｒβ遺伝子座における自己免疫リスク変異体が、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を通して特定され、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、１型自己免疫性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および関節リウマチ（ＲＡ）をはじめとする免疫媒介疾患に関連付けられてきた。例えば、Abbas, A.K., et al., Sci Immunol. 3, eaat1482 (2018)を参照されたい。主要なＴｒｅｇ系統転写因子ＦｏｘＰ３に影響する突然変異は、機能的Ｔｒｅｇの喪失から生じる自己免疫性リンパ増殖性疾患である免疫調節異常多腺性内分泌障害腸疾患Ｘ連鎖（ＩＰＥＸ）症候群を引き起こす。加えて、ＩＬ－２ＲＡにおける突然変異から生じるＣＤ２５欠損を有する患者は、ＩＰＥＸ症候群に類似する免疫調節異常に見舞われる。例えば、Verbsky, J.W. and Chatila, T., Curr Opin Pediatr. 25(6):708-14 (2013)を参照されたい。遺伝学的データは、マウスおよびヒトの両方において、Ｔｒｅｇ機能および自己免疫の抑制におけるＩＬ－２の中心的役割に合致する。
Ｔｒｅｇに対するＩＬ－２の作用の重要性に起因して、低用量組み換えＩＬ－２が、免疫媒介疾患でのＴｒｅｇに基づく免疫抑制戦略のために用いられてきた。例えば、Saadoun, D., et al., N Engl J Med. 365:2067-77 (2011)；He, J., et al., Arthritis Rheumatol. 67(suppl 10) (2015)；Koreth, J., et al., N Engl J Med. 365:2055-66 (2011)；およびHumrich, J.Y., et al. Ann Rheum Dis. 74:791-2 (2015)を参照されたい。例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、Ｔｒｅｇが減少した免疫調節能を示す、ＩＬ－２欠損状態により特徴付けられる。低用量のＩＬ－２は、ＳＬＥ患者において楽観視できる臨床的利益を示したが；しかしながら、その臨床的有用性は、毎日の注入の必要性ならびに炎症促進性サイトカインおよび非Ｔｒｅｇ細胞の増加の観察に起因して、限定される。対照的に、高用量ＩＬ－２は、Ｔエフェクター細胞を介して抗腫瘍免疫応答を刺激するために用いられてきた。例えば、Rosenberg, S.A., J Immunol. 192:5451-8 (2014)を参照されたい。
これらの臨床的研究からの有望な結果にもかかわらず、低用量組み換えＩＬ－２療法は、頻繁な投薬を余儀なくさせる非常に短い半減期（数分間）、および有効性を強力に制限する非Ｔｒｅｇ作用の活性化に対する小さなウインドウにより限定される。したがって、例えば、感染性疾患およびＳＬＥなどの免疫媒介疾患の治療における使用のための、改善された薬物動態および応答の持続性を有する新規ＩＬ２生物製剤に対する必要性が残っている。
本開示の概要
本開示の特定の態様は、インターロイキン－２（ＩＬ２）融合タンパク質の１つまたは複数の用量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法を目的とし、ここで、融合タンパク質は、（ａ）ＩＬ２ポリペプチドを含む第１のポリペプチド、および（ｂ）インターロイキン－２受容体α（ＩＬ２Ｒα）ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のポリペプチドを含み；（ｉ）ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、ネイティブＩＬ２Ｒα（配列番号１）の細胞外ドメインと比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有し；かつ／または（ｉｉ）ＩＬ２ポリペプチドは、ネイティブＩＬ２（配列番号２）と比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有し；用量のうちの１つまたは複数は、約０．１ｍｇ～約９ｍｇである。
一部の態様では、融合タンパク質は、局所、表皮、粘膜、鼻内、経口、膣内、直腸、舌下、局所、静脈内、腹腔内、筋内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外または胸骨内経路を介して、対象に投与される。
一部の態様では、融合タンパク質は、静脈内経路を介して対象に投与される。一部の態様では、融合タンパク質は、約０．３ｍｇ～約９ｍｇの用量で、静脈内経路を介して投与される。
一部の態様では、融合タンパク質は、約１ｍｇ～約９ｍｇ、約２ｍｇ～約９ｍｇ、約３ｍｇ～約９ｍｇ、約４ｍｇ～約９ｍｇ、約５ｍｇ～約９ｍｇ、約６ｍｇ～約９ｍｇ、約７ｍｇ～約９ｍｇ、約８ｍｇ～約９ｍｇ、約１ｍｇ～約８ｍｇ、約２ｍｇ～約８ｍｇ、約３ｍｇ～約８ｍｇ、約４ｍｇ～約８ｍｇ、約５ｍｇ～約８ｍｇ、約６ｍｇ～約８ｍｇ、約７ｍｇ～約８ｍｇ、約１ｍｇ～約７ｍｇ、約２ｍｇ～約７ｍｇ、約３ｍｇ～約７ｍｇ、約４ｍｇ～約７ｍｇ、約５ｍｇ～約７ｍｇ、約６ｍｇ～約７ｍｇの用量で、静脈内経路を介して対象に投与される。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約３ｍｇ～約９ｍｇである。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約６ｍｇ～約９ｍｇである。
一部の態様では、融合タンパク質は、約０．１ｍｇ～約６ｍｇ、約１ｍｇ～約６ｍｇ、約２ｍｇ～約６ｍｇ、約３ｍｇ～約６ｍｇ、約４ｍｇ～約６ｍｇ、または約５ｍｇ～約６ｍｇ、約１ｍｇ～約５ｍｇ、約２ｍｇ～約５ｍｇ、約３ｍｇ～約５ｍｇ、約４ｍｇ～約５ｍｇ、約１ｍｇ～約４ｍｇ、約２ｍｇ～約４ｍｇ、約３ｍｇ～約４ｍｇ、約１ｍｇ～約３ｍｇ、または約２ｍｇ～約３ｍｇの用量で、静脈内経路を介して対象に投与される。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約０．１ｍｇ～約３ｍｇである。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約０．１ｍｇ～約１ｍｇである。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約０．１ｍｇ～約０．３ｍｇである。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約０．３ｍｇ～約６ｍｇである。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約１ｍｇ～約３ｍｇである。
一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約０．１ｍｇ、約０．３ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、または約９ｍｇである。
一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約９ｍｇ超である。
一部の態様では、融合タンパク質は、皮下経路を介して対象に投与される。一部の態様では、融合タンパク質は、約１ｍｇ～約８ｍｇ、約２ｍｇ～約８ｍｇ、約３ｍｇ～約８ｍｇ、約４ｍｇ～約８ｍｇ、約５ｍｇ～約８ｍｇ、約６ｍｇ～約８ｍｇ、約７ｍｇ～約８ｍｇ、約１ｍｇ～約７ｍｇ、約２ｍｇ～約７ｍｇ、約３ｍｇ～約７ｍｇ、約４ｍｇ～約７ｍｇ、約５ｍｇ～約７ｍｇ、約６ｍｇ～約７ｍｇ、約１ｍｇ～約６ｍｇ、約２ｍｇ～約６ｍｇ、約３ｍｇ～約６ｍｇ、約４ｍｇ～約６ｍｇ、または約５ｍｇ～約６ｍｇ、約１ｍｇ～約５ｍｇ、約２ｍｇ～約５ｍｇ、約３ｍｇ～約５ｍｇ、約４ｍｇ～約５ｍｇ、約１ｍｇ～約４ｍｇ、約２ｍｇ～約４ｍｇ、約３ｍｇ～約４ｍｇ、約１ｍｇ～約３ｍｇ、または約２ｍｇ～約３ｍｇの用量で、皮下経路を介して対象に投与される。一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約３ｍｇ～約８ｍｇである。一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約６ｍｇ～約８ｍｇである。一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約１ｍｇ～約６ｍｇである。一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約１ｍｇ～約３ｍｇである。一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約３ｍｇ～約６ｍｇである。
一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約１ｍｇ、約３ｍｇ、約６ｍｇ、または約８ｍｇである。
一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約８ｍｇ超である。
一部の態様では、方法は、融合タンパク質の２つの用量の間に投薬間隔を置いて、融合タンパク質の用量の２つ以上を投与することを含む。一部の態様では、融合タンパク質の投薬間隔は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、または少なくとも約６日間である。一部の態様では、融合タンパク質の投薬間隔は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約１ヵ月間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約２ヵ月間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、または少なくとも約３ヵ月間である。一部の態様では、投薬間隔は、少なくとも約３週間である。一部の態様では、融合タンパク質の投薬間隔は、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、または約６日間である。一部の態様では、融合タンパク質の投薬間隔（ｉｎｔｅｒｎａｌ）は、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヵ月間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約２ヵ月間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、または約３ヵ月間である。一部の態様では、融合タンパク質の投薬間隔は、約３週間である。一部の態様では、融合タンパク質の投薬間隔は、用量全体を通して同じである。一部の態様では、融合タンパク質の投薬間隔は、用量全体を通して異なる。一部の態様では、融合タンパク質の２つ以上の用量のうちの少なくとも１つは静脈内投与され、融合タンパク質の２つ以上の用量のうちの少なくとも１つは皮下投与される。一部の態様では、静脈内投与される用量は、皮下投与される用量の前に与えられる。一部の態様では、融合タンパク質の第１用量は静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｅｏｕｓｌｙ）投与され、かつ融合タンパク質の第２（いずれかの後続または最後の）用量は皮下投与される。
一部の態様では、疾患または障害は、感染性疾患、免疫媒介疾患である。一部の態様では、免疫媒介疾患は、炎症性疾患または自己免疫疾患である。一部の態様では、免疫媒介疾患は、１型糖尿病；多発性硬化症；関節リウマチ；セリアック病；全身性エリテマトーデス；ループス腎炎；皮膚ループス；若年性特発性関節炎；クローン病；潰瘍性大腸炎；全身性硬化症；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；乾癬；円形脱毛症；ＨＣＶ誘導型血管炎；シェーグレン症候群；天疱瘡；強直性脊椎炎；ベーチェット病；ウェゲナー肉芽腫症；高安病；自己免疫性肝炎；硬化性胆管炎；グジェロー・シェーグレン；炎症性腸疾患；免疫調節異常多腺性内分泌障害腸疾患Ｘ連鎖（ＩＰＥＸ）症候群；およびマクロファージ活性化症候群からなる群より選択される。一部の態様では、免疫媒介疾患は、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、または皮膚ループスである。一部の態様では、免疫媒介疾患は、全身性エリテマトーデスである。
一部の態様では、方法は、コルチコステロイドを対象に投与することをさらに含む。一部の態様では、コルチコステロイドは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、コルチゾン、デスオキシコルチコステロン、フルドロコルチゾン、およびパラメタゾンからなる群より選択される。一部の態様では、コルチコステロイドは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、またはプレドニゾンである。一部の態様では、コルチコステロイドは、プレドニゾロンである。
一部の態様では、コルチコステロイドは、局所、表皮、粘膜、鼻内、経口、膣内、直腸、舌下、局所、静脈内、腹腔内、筋内、動脈内（ｉｎａａｒｔｅｒｉａｌ）、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、または胸骨内経路を介して、対象に投与される。一部の態様では、コルチコステロイドは、局所、経口、静脈内、または筋内経路を介して、対象に投与される。
一部の態様では、コルチコステロイドは、融合タンパク質（ｔｈｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の各用量の前、それと同時、または後に投与される。一部の態様では、コルチコステロイドは、融合タンパク質の各用量の前に投与される。一部の態様では、コルチコステロイドは、融合タンパク質の各用量と同時に投与される。一部の態様では、コルチコステロイドの２つ以上の用量が、各用量の間に投薬間隔を置いて、対象に投与される。一部の態様では、コルチコステロイドの投薬間隔は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約１ヵ月間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約２ヵ月間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、または少なくとも約３ヵ月間である。一部の態様では、コルチコステロイドはプレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｉｎｅ）であり、融合タンパク質は、週２回皮下的に対象に投与され、かつプレドニゾロンは、週３回経口的に対象に投与される。
一部の態様では、ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、ネイティブＩＬ２Ｒα（配列番号１）の細胞外ドメインと比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化、少なくとも２箇所少ないグリコシル化、少なくとも３箇所少ないグリコシル化、少なくとも４箇所少ないグリコシル化、少なくとも５箇所少ないグリコシル化、少なくとも６箇所少ないグリコシル化、少なくとも７箇所少ないグリコシル化、少なくとも８箇所少ないグリコシル化、または少なくとも９箇所少ないグリコシル化を有する。
一部の態様では、ＩＬ２ポリペプチドは、ネイティブＩＬ２（配列番号２）と比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有する。
一部の態様では、第１のポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、第２のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有するＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、グリコシル化を除去する突然変異を含む。一部の態様では、突然変異は、Ｏ－グリコシル化および／またはＮ－グリコシル化を除去する。一部の態様では、突然変異は、Ｏ－グリコシル化を除去する。一部の態様では、突然変異は、Ｎ－グリコシル化を除去する。一部の態様では、突然変異は、配列番号１に対応する、アミノ酸１６７～２１９、アミノ酸１６８～２１９、アミノ酸１６９～２１９、アミノ酸１７０～２１９、アミノ酸１７１～２１９、アミノ酸１７２～２１９、アミノ酸１７３～２１９、アミノ酸１７４～２１９、アミノ酸１７５～２１９、アミノ酸１７６～２１９、アミノ酸１７７～２１９、アミノ酸１７８～２１９、アミノ酸１７９～２１９、アミノ酸１８０～２１９、アミノ酸１８１～２１９、アミノ酸１８２～２１９、アミノ酸１８３～２１９、アミノ酸１８４～２１９、アミノ酸１８５～２１９、アミノ酸１８６～２１９、アミノ酸１８７～２１９、アミノ酸１８８～２１９、アミノ酸１８９～２１９、アミノ酸１９０～２１９、アミノ酸１９１～２１９、またはアミノ酸１９２～２１９の欠失である。
一部の態様では、第２のポリペプチドは、配列番号４である。一部の態様では、第２のポリペプチドは、配列番号３である。
一部の態様では、突然変異は、グリコシル化されないアミノ酸による、グリコシル化されるアミノ酸の１つまたは複数の置換である。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、アミノ酸Ｎ４９、アミノ酸Ｎ６８、アミノ酸Ｔ７４、アミノ酸Ｔ８５、アミノ酸Ｔ１９７、アミノ酸Ｔ２０３、アミノ酸Ｔ２０８、およびアミノ酸Ｔ２１６、またはそれらのいずれかの組み合わせでのものであり、ここで、アミノ酸位置は、配列番号１に対応する。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、トレオニンから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へのものである。
一部の態様では、置換のうちの１つは、アミノ酸Ｔ８５である。一部の態様では、Ｔ８５は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される（ｓｅｌｅｔｅｄ）アミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換のうちの１つは、アミノ酸Ｔ１９７である。一部の態様では、Ｔ１９７は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換のうちの１つは、アミノ酸Ｔ２０３である。一部の態様では、Ｔ２０３は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換のうちの１つは、アミノ酸Ｔ２０８である。一部の態様では、Ｔ２０８は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換のうちの１つは、アミノ酸Ｔ２１６である。一部の態様では、Ｔ２１６は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、突然変異は、近傍のアミノ酸でのグリコシル化を可能にしないアミノ酸による、近傍のアミノ酸でのグリコシル化を可能にするアミノ酸の１つまたは複数の置換である。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、アミノ酸Ｓ５０、アミノ酸Ｓ５１、アミノ酸Ｔ６９、アミノ酸Ｔ７０、アミノ酸Ｃ１９２、またはそれらのいずれかの組み合わせでのものであり、ここで、アミノ酸位置は、配列番号１に対応する。
一部の態様では、置換のうちの１つは、アミノ酸Ｓ５０でのものである。一部の態様では、Ｓ５０は、プロリンへと突然変異される。
一部の態様では、置換のうちの１つは、アミノ酸Ｓ５１でのものである。一部の態様では、Ｓ５１は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換のうちの１つは、アミノ酸Ｔ６９でのものである。一部の態様では、Ｔ６９は、プロリンへと突然変異される。
一部の態様では、置換のうちの１つは、アミノ酸Ｔ７０でのものである。一部の態様では、Ｔ７０は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換のうちの１つは、アミノ酸Ｃ１９２でのものである。一部の態様では、Ｃ１９２は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有するＩＬ２ポリペプチドは、グリコシル化を除去する突然変異を含む。一部の態様では、突然変異は、グリコシル化されないアミノ酸による、グリコシル化されるアミノ酸の１つまたは複数の置換である。一部の態様では、突然変異は、近傍のアミノ酸でのグリコシル化を可能にしないアミノ酸による、近傍のアミノ酸でのグリコシル化を可能にするアミノ酸の１つまたは複数の置換である。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、アラニンから、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へのものである。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、トレオニンから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へのものである。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、システインから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へのものである。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、システインからセリンへのものである。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、システインからアラニンへのものである。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、システインからバリンへのものである。一部の態様では、置換のうちの１つは、対応する配列番号２と比較して、アミノ酸Ｔ３でのものである。一部の態様では、置換のうちの１つは、アミノ酸Ｃ１２５でのものであり、アミノ酸Ｃ１２５での置換は、Ｃ１２５Ｓ、Ｃ１２５Ａ、およびＣ１２５Ｖからなる群より選択される。一部の態様では、突然変異は、欠失である。一部の態様では、欠失は、アミノ酸Ａ１でのものである。
一部の態様では、融合タンパク質は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間にインフレームで融合されたリンカーをさらに含む。一部の態様では、リンカーは、グリシン／セリンリンカーである。一部の態様では、グリシン／セリンリンカーは、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、または（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列を含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の整数である。一部の態様では、グリシン／セリンリンカーは、（ＧＧＧＳ）３のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｎ）は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、融合タンパク質は、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドに融合された異種部分をさらに含む。一部の態様では、異種部分は、半減期延長部分である。一部の態様では、異種部分は、アルブミン、免疫グロブリン定常領域またはその一部分、免疫グロブリン結合性ポリペプチド、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、アルブミン結合性ポリペプチド（ＡＢＰ）、ＰＡＳ化部分、ＨＥＳ化部分、ＸＴＥＮ、ＰＥＧ化部分、Ｆｃ領域、およびそれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の態様では、融合タンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。
一部の態様では、融合タンパク質は、酵素的または化学的に脱グリコシル化される。一部の態様では、融合タンパク質は、アルカリ、ヒドラジン分解、ＰＮＧアーゼＦ、エンドＨ、Ｏ－グリコシダーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせにより脱グリコシル化される。
一部の態様では、融合タンパク質は、単量体である。一部の態様では、融合タンパク質は、二量体である。
一部の態様では、融合タンパク質は、融合タンパク質および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の一部として対象に投与される。
図１Ａおよび図１Ｂは、実施例１に記載される第１相無作為化二重盲検プラセボ対照単回漸増用量（「ＳＡＤ」）研究設計（図１Ａ）および単回漸増投薬レジメン（図１Ｂ）の模式図を示す。すべてのコホートにおいて、センチネル投薬（１：１ ＢＭＳ－９８６３２６またはプラセボ）が用いられる。用量レベルは、先行コホートからの新たに得られたデータに応じて変更される場合がある。最大用量上昇工程は、前の用量レベルの約３倍以下であろう。「ＩＶ ＮＯＡＥＬａ」は、単回用量サル毒性研究に関する、ＮＯＡＥＬ（ＡＵＣ［０～３３６時間］≦７５７μ・ｈ／ｍｌ）に対する平均曝露（ｅｘｐｏｓｕｅ）（時間ゼロから無限までの濃度－時間曲線下面積；「ＡＵＣ［ＩＮＦ］」）を与えることが予測される最大静脈内（ＩＶ）用量を意味する。コホートＡ６は、先行コホートからの薬力学（ＰＤ）結果に応じて、適宜設けられる。「ＳＣｂ」は、１２週間（３週間毎に１回）ＳＣサル毒性研究に関して、ＮＯＡＥＬ（ＡＵＣ［０～５０４時間］≦３０６μ・ｈ／ｍｌ）を超過しないであろう平均曝露（ＡＵＣ［ＩＮＦ］）を与えることが予測される最大皮下（ＳＣ）用量を意味する。 図２Ａ～図２Ｂは、ＮＺＢ×ＮＺＱマウス対ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴｒｅｇ ＣＤ２５発現を示す。ＮＺＢ×ＮＺＷ（ｎ＝５、２６週齢）マウスまたはＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝６、９～１０週齢）マウス由来の脾細胞を、ＣＤ４、Ｆｏｘｐ３、およびＣＤ２５に対する抗体を用いて染色した。図２Ａは、各群の代表的マウス由来のＣＤ４＋ゲートにおけるＦｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージおよびＣＤ４＋Ｆｏｘ３＋ゲートにおけるＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを示す。図２Ｂは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す（平均±ＳＥＭ）。一元配置分散分析により、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図３Ａ～図３Ｅは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴｒｅｇおよび非Ｔｒｅｇ細胞に対するｍＩＬ－２／ＣＤ２５投与の作用を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５、８～１０週齢）を、０日目、３日目、および６日目にｍＩＬ－２／ＣＤ２５を用いて、０日目、２日目、４日目、および６日目にＦｃ－ＩＬ２を用いて、または０日目、３日目、および６日目にＰＢＳを用いて治療した。７日目にマウスを屠殺し、フローサイトメトリーによる分析のために脾臓を回収した。図３Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを示す。図３Ｂは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の総数を示す。図３Ｃは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－Ｔ細胞の総数を示す。図３Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数を示す。図３Ｅは、ＣＤ３３５＋ＣＤ４９ｄ＋ＮＫ細胞の総数を示す。一元配置分散分析により、ＰＢＳ対照群に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図４Ａ～図４Ｄは、ＮＺＢ×ＮＺＷマウス（早期疾患）におけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５投与によるループスの阻害を示す。３０ｍｇ／ｄＬのタンパク尿レベルを有する雌性ＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１マウス（２２～２４週齢）を、群当たりｎ＝１０として、ＰＢＳまたは０．１、０．２、もしくは０．４ｍｇ／ｋｇにおいてｍＩＬ－２／ＣＤ２５（ｓ．ｃ．２×／週）を用いて、あるいはプレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．３×／週）を用いて、１４週間にわたって治療した。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５投与は、タンパク尿のレベル（図４Ａ）、高タンパク尿（３以上のスコア）を有するマウスのパーセンテージ（図４Ｂ）、抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ力価（図４Ｃ）、および腎臓組織学スコア（図４Ｄ）の用量依存的低減を示した。一元配置分散分析により、研究の終了時に、ＰＢＳ群に対して、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図５Ａ～図５Ｄは、ＮＺＢ×ＮＺＷマウスにおける、Ｔｒｅｇに対するｍＩＬ－２／ＣＤ２５投与の作用を示す。３０ｍｇ／ｄＬのタンパク尿レベルを有する雌性ＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１マウス（２２～２４週齢）を、群当たりｎ＝４として、ＰＢＳまたは０．１、０．２もしくは０．４ｍｇ／ｋｇにおいてｍＩＬ－２／ＣＤ２５（ｓ．ｃ．２×／週）を用いて、あるいはプレドニゾロン（ｐ．ｏ．３×／週）を用いて、４週間にわたって治療した。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５（８回目の用量の４８時間後）は、血液（図５Ａ）および脾臓（図５Ｂ）において、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）のパーセンテージの用量依存的増加を示した。Ｔｒｅｇゲート（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）におけるＫｉ６７＋細胞（図５Ｃ）およびＣＤ２５ ＭＦＩ（図５Ｄ）のパーセンテージもまた、脾臓において用量依存的形式で増加した。一元配置分散分析により、ＰＢＳ群に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図６Ａ～図６Ｅは、ＮＺＢ×ＮＺＷマウス（進行疾患）におけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５投与によるループスの阻害を示す。１００ｍｇ／ｄＬのタンパク尿レベルを有する雌性ＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１マウス（約２７週齢）を、群当たりｎ＝１２～１４として、ＰＢＳまたは０．１もしくは０．３ｍｇ／ｋｇにおいてｍＩＬ－２／ＣＤ２５（ｓ．ｃ．２×／週）を用いて、１０週間にわたって治療した。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５を用いる治療は、研究の完了時での、タンパク尿のレベルの用量依存的低減（図６Ａ）、抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ力価の低減に向かう傾向（図６Ｂ）、血清ＩＬ－１２のレベルの低減（図６Ｃ）、腎臓組織学スコアの低減（図６Ｄ）、および脾臓におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋細胞のパーセンテージの増加（図６Ｅ）をもたらした。一元配置分散分析により、ＰＢＳ群に対して、＊ｐ＜０．０５。両側ｔ検定により、ＰＢＳ群に対して、＃ｐ＜０．０５。 図７Ａ～図７Ｅは、ＮＺＢ×ＮＺＷマウスにおけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５およびプレドニゾロン併用治療の作用を示す。３０ｍｇ／ｄＬのタンパク尿レベルを有する雌性ＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１マウス（２１～２３週齢）を、ＰＢＳ、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５（０．１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．２×／週）、プレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．３×／週）のいずれかを用いて、またはｍＩＬ－２／ＣＤ２５（０．１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．２×／週）およびプレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．３×／週）の組み合わせを用いて、１４週間にわたって治療した。高用量のプレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．３×／週）およびｍＩＬ－２／ＣＤ２５（０．２ｕｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．２×／週）群を、群当たりｎ＝１２として、対照として含めた。タンパク尿のレベル（図７Ａ）、抗ｄｓＤＮＡ抗体力価（図７Ｂ）、および組織学スコア（図７Ｃ）に対する作用が示される。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５治療は、プレドニゾロンの存在下または非存在下での、脾臓におけるＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）のパーセンテージ（図７Ｄ）およびＴｒｅｇゲート（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）中のＣＤ２５ ＭＦＩ（図７Ｅ）の増加を示した。図７Ｄおよび図７Ｅに関して、群当たりｎ＝５。一元配置分散分析により、研究の終了時に、ＰＢＳ群に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図８Ａ～図８Ｆは、ＮＺＢ×ＮＺＷマウスにおけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５およびプレドニゾロン併用治療の作用を示す。図７に記載される通りのｍＩＬ－２／ＣＤ２５およびプレドニゾロン組み合わせ研究の完了時に、ＲＴ－ＰＣＲ分析のために腎臓を回収した。１型インターフェロン遺伝子発現［ＩＦＩＴ１（図８Ａ）、ＩＦＩＴ３（図８Ｂ）、ＭＸ１（図８Ｃ）、ＩＲＦ７（図８Ｄ）、ＧＢＰ２（図８Ｅ）およびＬＩＧＰ１（図８Ｆ）］のさらなる低減が、いずれかの単剤療法単独と比較して、併用治療を用いて観察された。 図９Ａ～図９Ｆは、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５投与によるループスの阻害を示す。３０ｍｇ／ｄＬのタンパク尿レベルを有する雄性ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（１２～１４週齢）を、群当たりｎ＝１０として、ＰＢＳまたは０．１、０．２もしくは０．４ｍｇ／ｋｇにおいてｍＩＬ－２／ＣＤ２５（ｓ．ｃ．２×／週）を用いて、あるいはプレドニゾロン（ＰＯ ３×／週）を用いて、１２週間にわたって治療した。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５を用いる治療は、タンパク尿のレベル（図９Ａ）、抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ力価（図９Ｂ）、および腎臓組織学スコア（図９Ｃ）の用量依存的低減、ならびに血液（図９Ｄ）および脾臓（図９Ｅ）中のＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）のパーセンテージの用量依存的増加、ならびに脾臓におけるＴｒｅｇゲート（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）でのＣＤ２５ ＭＦＩの増加（図９Ｆ）をもたらした。一元配置分散分析により、１２週目において、ＰＢＳ群に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
本開示の特定の態様は、インターロイキン－２（ＩＬ２）融合タンパク質の用量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療する方法を目的とし、ここで、融合タンパク質は、（ａ）ＩＬ２ポリペプチドを含む第１のポリペプチド；および（ｂ）インターロイキン－２受容体α（ＩＬ２Ｒα）ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のポリペプチドを含み、（ｉ）ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、ネイティブＩＬ２Ｒα（配列番号１）の細胞外ドメインと比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有し；かつ／または（ｉｉ）ＩＬ２ポリペプチドは、ネイティブＩＬ２（配列番号２）と比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有する。一部の態様では、用量は、約０．１ｍｇ～約９ｍｇである。一部の態様では、用量は、約９ｍｇ超である。一部の態様では、融合タンパク質は静脈内経路を介して対象に投与され、かつ用量は約０．１ｍｇ～約９ｍｇである。一部の態様では、融合タンパク質は静脈内経路を介して対象に投与され、かつ用量は約９ｍｇ超である。一部の態様では、融合タンパク質は皮下経路を介して対象に投与され、かつ用量は約１ｍｇ～約８ｍｇである。一部の態様では、融合タンパク質は皮下経路を介して対象に投与され、かつ用量は約８ｍｇ超である。
一部の態様では、方法は、コルチコステロイド、例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、コルチゾン、デスオキシコルチコステロン、フルドロコルチゾン、またはパラメタゾンを投与することをさらに含む。
本開示をより容易に理解できるように、特定の用語が最初に定義される。本出願において用いる場合、本明細書中に明白に別途与えられるものを除いて、以下の用語のうちのそれぞれは、以下に示される意味を有するであろう。追加の定義が、本明細書全体を通して示される。
Ｉ．定義
本開示をより容易に理解できるように、特定の用語が最初に定義される。本出願において用いる場合、本明細書中に明白に別途与えられるものを除いて、以下の用語のうちのそれぞれは、以下に示される意味を有するであろう。追加の定義が、本出願全体を通して示される。
用語「ａ」または「ａｎ」実体とは、その実体のうちの１つまたは複数を意味することが注記されるべきであり；例えば、「ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は、１つまたは複数のヌクレオチド配列を表すものと理解される。そのようにして、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」は、本明細書中で相互に交換可能に用いることができる。
さらに、本明細書中で用いる場合の「および／または」は、他方を伴うかまたは伴わない、２つの明記される特徴または構成要素のうちのそれぞれの具体的開示として理解されるべきである。つまり、本明細書中で「Ａおよび／またはＢ」などの語句中で用いる場合、用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句中で用いる場合、用語「および／または」は、以下の態様のうちのそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
同様に、単語「または」は、そうでないことを文脈が明らかに示さない限り、「および」を含むことが意図される。核酸またはポリペプチドに関して与えられる、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値は近似値であり、かつ説明のために提供されることが、さらに理解されるべきである。
単語「含むこと」を用いて本明細書中で態様が説明されるいずれの箇所においても、「からなること」および／または「本質的に～からなること」に関して説明される他の類似の態様もまた提供されることが理解される。
用語「約」は、概ね、おおよそ、付近、または数値域中を意味するために、本明細書中で用いられる。用語「約」が数値範囲と共に用いられる場合、この用語は、示される数値の上下の境界を延長することによって、範囲を修飾する。つまり、「約１０～２０」は、「約１０～約２０」を意味する。一般的に、用語「約」は、上下（より高いかまたはより低い）の、例えば、１０パーセントの変動により、明記される値の上下の数値を修飾することができる。
本明細書中で用いる場合、用語「組み換え」は、遺伝子操作により、またはそれ以外の実験操作により作製される遺伝子からの発現を含む。
本明細書中で用いる場合、「インターロイキン－２」、「ＩＬ２」、または「ＩＬ－２」とは、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ならびに家畜化哺乳動物または農業用哺乳動物などの哺乳動物をはじめとする、いずれかの脊椎動物供給源由来のいずれかのネイティブまたは組み換えＩＬ２を意味する。この用語は、未プロセシングＩＬ２、ならびに、細胞中でのプロセシングから生じるＩＬ２のいずれかの形態（すなわち、ＩＬ２の成熟形態）を包含する。この用語はまた、ＩＬ２の天然に存在する変異体および断片、例えば、スプライシング変異体または対立遺伝子変異体、および天然に存在するＩＬ２のＩＬ２活性を有する天然に存在しない変異体も包含する。
ＩＬ２の追加の核酸およびアミノ酸配列が公知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｑ７ＪＦＭ２［アオトゥス・レムリヌス（Ａｏｔｕｓ ｌｅｍｕｒｉｎｕｓ）（グレイベリードナイトモンキー（Ｇｒａｙ－ｂｅｌｌｉｅｄ ｎｉｇｈｔ ｍｏｎｋｅｙ））］；Ｑ７ＪＦＭ５［アオトゥス・ナンシマエ（Ａｏｔｕｓ ｎａｎｃｙｍａａｅ）（マーズナイトモンキー（Ｍａ’ｓ ｎｉｇｈｔ ｍｏｎｋｅｙ））］；Ｐ０５０１６［バス・タウルス（Ｂａｓ ｔａｕｒｕｓ）（ウシ）］；Ｑ２９４１６［カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（イヌ）（カニス・ルプス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））］；Ｐ３６８３５［カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）（ヤギ）］；およびＰ３７９９７［エクウス・カバルス（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）（ウマ）］を参照されたい。
ＩＬ２の生物学的に活性な断片および変異体は、ＩＬ２活性を保持する。語句「ＩＬ２の生物学的活性」または「ＩＬ２活性」とは、限定するものではないが、ＩＬ２受容体を担持するリンパ球を刺激する能力をはじめとする、ＩＬ２の生物学的活性のうちの１つまたは複数を意味する。そのような活性は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の両方で測定することができる。ＩＬ２は、免疫活性の包括的な調節因子であり、ここで見られる作用は、そのような活性の合計である。例えば、ＩＬ２は、生存活性を調節し（Ｂｃｌ－２）、Ｔエフェクター活性を誘導し（ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、およびパーフォリン）、かつ／またはＴ調節活性を促進する（ＦｏｘＰ３）。
ＩＬ２の生物学的に活性な変異体が公知である。例えば、米国特許出願公開第２００６０２６９５１５号および同第２００６０１６０１８７号ならびにＷＯ９９／６０１２８を参照されたい。
用語「分泌シグナル配列」は、より大きなポリペプチドの構成要素として、より大きなポリペプチドを、それがその中で合成される細胞の分泌経路を通過するように仕向けるポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。より大きなポリペプチドは、一般的に、分泌経路を通過する間に切断されて、分泌ペプチドが除去される。
本明細書中で用いる場合、融合タンパク質またはポリペプチドの「成熟」形態は、分泌ペプチドが除去されているポリペプチドのプロセシングされた形態を含む。
本明細書中で用いる場合、融合タンパク質の「未プロセシング」形態は、分泌ペプチド配列を保持する。
用語「ＣＤ２５」、「ＩＬ２受容体α」、「ＩＬ２Ｒα」、または「ＩＬ２Ｒａ」とは、本明細書中で用いる場合、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ならびに家畜化哺乳動物または農業用哺乳動物などの哺乳動物をはじめとする、いずれかの脊椎動物供給源由来のいずれかのネイティブまたは組み換えＩＬ２Ｒαを意味する。この用語はまた、ＩＬ２Ｒαの天然に存在する変異体、例えば、スプライシング変異体もしくは対立遺伝子変異体、またはＩＬ２Ｒα活性を有する天然に存在しない変異体も包含する。ヒトＩＬ２は、その受容体システムであるＩＬ２Ｒを通したシグナル伝達を介してその生物学的作用を発揮する。ＩＬ２およびその受容体（ＩＬ２Ｒ）は、Ｔ細胞増殖および免疫応答に関して極めて重要である他の基本的な機能に必要とされる。ＩＬ２Ｒは、α（ｐ５５）、β（ｐ７５）、およびγ（ｐ６５）鎖である３つの非共有的に連結されたＩ型膜貫通タンパク質からなる。ヒトＩＬ２Ｒα鎖は、２１９アミノ酸の細胞外ドメイン、１９アミノ酸の膜貫通ドメイン、および１３アミノ酸の細胞内ドメインを含む。ＩＬ２Ｒα（ＩＬ２Ｒ－α）の分泌される細胞外ドメインは、本明細書中に記載される融合タンパク質において利用することができる。
ＩＬ２Ｒαに関する核酸およびアミノ酸配列が公知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１０３０５９７．１［ナミチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）］；ＮＰ＿００１０２８０８９．１［アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）］；ＮＭ＿００１００３２１１．１［オオカミ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ）］；ＮＰ＿７７６７８３．１［家畜ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）］；ＮＰ＿０３２３９３．３［ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）］；およびＮＰ＿０３７２９５．１［ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）］を参照されたい。
ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインの生物学的に活性な断片および変異体もまた提供される。そのようなＩＬ２Ｒα細胞外ドメイン活性変異体または断片は、ＩＬ２Ｒα細胞外ドメイン活性を保持するであろう。語句「ＩＬ２Ｒα細胞外ドメインの生物学的活性」とは、限定するものではないが、ＩＬ２に結合しかつ／またはＩＬ２受容体応答性細胞における細胞内シグナル伝達を促進する能力をはじめとする、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインの生物学的活性のうちの１つまたは複数を意味する。ＩＬ２Ｒαの生物学的に活性な断片および変異体の非限定的な例は、例えば、Robb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5654-8 (1988)に開示される。一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２Ｒαの生物学的に活性な断片および変異体は、ネイティブＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインと比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を含む。
対象物に適用される場合、用語「天然に存在する」とは、本明細書中で用いる場合、対象物を天然に見出すことができるという事実を意味する。例えば、天然の供給源から単離することができ、かつ実験室において人により意図的に改変させていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
「ポリペプチド」とは、少なくとも２個の連続的に連結されたアミノ酸残基を含む鎖を意味し、鎖の長さに対して上限はない。タンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸残基は、限定するものではないが、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成などの修飾を含むことができる。「タンパク質」または「融合タンパク質」は、１つまたは複数のポリペプチドを含むことができる。
ポリペプチドの断片または変異体、およびそのいずれかの組み合わせもまた、本開示に含められる。本開示のポリペプチド結合性ドメインまたは結合性分子を参照する場合、用語「断片」または「変異体」は、参照ポリペプチドの特性（例えば、ＩＬ２Ｒαに関してＩＬ２結合活性）のうちの少なくとも一部を保持するいずれかのポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片を含むが、天然に存在する全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）は含まない。本開示のポリペプチド結合性ドメインまたは結合性分子の変異体は、上記の通りの断片、およびまたアミノ酸置換、欠失、または挿入に起因して変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。変異体は、天然に存在するかまたは天然に存在しないことができる。天然に存在しない変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を用いて、作製することができる。変異体ポリペプチドは、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。
上記の通り、ポリペプチド変異体は、例えば、修飾型ポリペプチドを含む。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有的架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化［Mei et al., Blood 116:270-79 (2010)］、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。
本明細書中で用いる場合、タンパク質またはヌクレオチド配列中の用語「～に対応するアミノ酸」、「～に対応する部位」、または「等価アミノ酸」は、第１のタンパク質配列、例えば、ＩＬ２配列と、第２のタンパク質配列、例えば、第２のＩＬ２配列との間の同一性または類似性を最大化するためのアライメントにより特定される。第２のタンパク質配列中の等価アミノ酸を特定するために用いる数字は、第１のタンパク質配列中の対応するアミノ酸を特定するために用いられる数字に基づく。一部の態様では、用語「に対応する」とは、ポリペプチド中の１つもしくは複数のアミノ酸またはポリヌクレオチド中の１つもしくは複数のヌクレオチドにおける突然変異の関係を意味する。非限定的な例のために、本明細書中に開示される通りのポリヌクレオチド（例えば、配列番号１）の具体的なアミノ酸（例えば、Ｓ５０）とは、配列番号１における５０番目のアミノ酸、セリンを意味する。
本明細書中で用いる場合、用語「会合した」とは、第１のアミノ酸鎖と第２のアミノ酸鎖との間に形成される共有結合または非共有結合を意味する。一態様では、用語「会合した」とは、共有的非ペプチド結合または非共有結合を意味する。この会合は、コロン、すなわち、（：）により示すことができる。別の態様では、会合は、ペプチド結合を除く共有結合を意味する。例えば、アミノ酸システインは、第２のシステイン残基上のチオール基とのジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。大多数の天然に存在するＩｇＧ分子においては、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合により会合され、２つの重鎖が、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いて２３９および２４２に対応する位置（２２６位または２２９位、ＥＵナンバリングシステム）での２箇所にジスルフィド結合により会合される。共有結合の例としては、限定するものではないが、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、σ結合、π結合、δ結合、グリコシド結合、アゴスティック結合（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｏｎｄ）、ベント結合、双極子結合、π骨格、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役、超共役、芳香性、ハプト数、または反結合性が挙げられる。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（例えば、カチオン－π結合または塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素錯体、低障壁水素結合、または対称性水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金原子間結合、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力、または化学極性が挙げられる。
用語「同等な」とは、本明細書中で用いる場合、例えば、融合タンパク質を用いて生じる比較された比率またはレベルが、参照比率またはレベルと等しいか、実質的に等しいか、または類似することを意味する。用語「類似する」とは、本明細書中で用いる場合、比較される比率またはレベルが、参照比率またはレベルからの１０％以下または１５％以下の差異を有することを意味する。用語「実質的に等しい」とは、比較される比率またはレベルが、参照比率またはレベルからの０．０１％、０．５％または１％以下の差異を有することを意味する。
用語「発現」とは、本明細書中で用いる場合、それによりポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを生成するプロセスを意味する。
「融合体」または「融合タンパク質」は、第１のアミノ酸配列とは自然界では天然に連結されない第２のアミノ酸配列にインフレームで連結された第１のアミノ酸配列を含む。別個のタンパク質中に通常存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド中で一緒にすることができるか、または同じタンパク質中に通常存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド、例えば、ＩＬ２タンパク質とＩＬ２－Ｒαタンパク質との融合体において新たな配置に置くことができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成により、またはペプチド領域同士が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作製および翻訳することにより、作製される。融合タンパク質は、共有的非ペプチド結合または非共有結合により第１のアミノ酸配列に会合した第２のアミノ酸配列をさらに含むことができる。転写／翻訳時に、単一のタンパク質が作られる。このようにして、複数のタンパク質、またはその断片を、単一ポリペプチドへと組み込むことができる。「作動可能に連結された」とは、２つ以上のエレメントの間の機能的連結を意味することが意図される。例えば、２つのポリペプチド間の作動可能な連結は、両方のポリペプチドをインフレームで一緒に融合し、単一のポリペプチド融合タンパク質を生成する。一態様では、融合タンパク質は、以下でさらに詳細に議論される通り、リンカー配列を含むことができる第３のポリペプチドをさらに含む。
本明細書中で用いる場合、用語「ＢＭＳ－９８６３２６」または「ＢＭＳ－９８６３２６－０１」とは、約８３キロダルトン（ｋＤａ）の質量を有する非共有的自己遮断性ホモ二量体構造を形成する、ヒトインターロイキン－２（ＩＬ２）とヒトＩＬ２受容体のαサブユニット（ＣＤ２５）の細胞外ドメイン部分との組み換え融合タンパク質を意味する。ＩＬ２およびＣＤ２５部分は、（ＧＧＧＳ）３の小さなペプチドリンカー配列により互いに連結される。ＢＭＳ－９８６３２６は、長期的薬物動態（ＰＫ）および調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）選択性に関して最適化され、かつ低用量ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒ）アゴニズムを提供する。不活性ホモ二量体として、ＢＭＳ－９８６３２６は、単量体放出までＩＬ２Ｒ結合性を立体的に阻害し、標的媒介性薬物生体内挙動（ＴＭＤＤ）および腎クリアランスを回避するためのメカニズムを提供し、かつ活性単量体の緩やかな放出を介してＴｒｅｇ選択的インビボ活性を増大させる。単量体放出は、分子がＩＬ２Ｒとエンゲージして、Ｔｒｅｇなどの高レベルのＣＤ２５を発現する細胞に対するより大きな効力および選択性を伴って、シグナル伝達を開始させることを可能にする。ラットおよびサルでの毒性研究は、ＢＭＳ－９８６３２６に関して許容可能な忍容性プロファイルを実証している。一部の態様では、ＢＭＳ－９８６３２６は、米国特許出願公開第２００９－０３５９６７２号における配列番号１６に対応する、配列番号５に示される通りのアミノ酸配列を含む。米国特許出願公開第２００９－０３５９６７２号は、その全体で参照により本明細書中に組み入れられる。
「Ｆｃ領域」（断片結晶化可能領域）、「Ｆｃドメイン」、または「Ｆｃ」とは、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）上に局在するＦｃ受容体への、または古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への結合性をはじめとする、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合性を媒介する、抗体の重鎖のＣ末端領域を意味する。つまり、Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１またはＣＬ）を除いて、抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいては、Ｆｃ領域は、抗体の２本の重鎖の第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の定常ドメインに由来する２つの同一のタンパク質断片を含み；ＩｇＭおよびＩｇＥ Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖中に３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２～４）を含む。ＩｇＧアイソタイプは、特定の生物種においてはサブクラスに分けられる：ヒトにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ならびにマウスにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。ＩｇＧに関して、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３ならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界の定義は変わり得るが、本明細書中で定義される場合、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１についてアミノ酸残基Ｄ２２１、ＩｇＧ２についてＶ２２２、ＩｇＧ３についてＬ２２１およびＩｇＧ４についてＰ２２４から、重鎖のカルボキシ末端まで伸びると定義され、ここで、ナンバリングはＫａｂａｔにおける通りのＥＵインデックスに従う。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、アミノ酸２３７からアミノ酸３４０まで伸び、かつＣＨ３ドメインはＦｃ領域中のＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、ＩｇＧのアミノ酸３４１からアミノ酸４４７もしくは４４６（Ｃ末端リジン残基が非存在である場合）または４４５（Ｃ末端グリシンおよびリジン残基が非存在である場合）まで伸びる。本明細書中で用いる場合、Ｆｃ領域は、いずれかのアロタイプ変異体を含むネイティブ配列Ｆｃ、または変異体Ｆｃ（例えば、天然に存在しないＦｃ）であり得る。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、これらの受容体の対立遺伝子変異体およびオルタナティブスプライシングされた形態を含む、ＦｃγＲファミリーの受容体を含む。ＦｃγＲファミリーは、３種類の活性化受容体（マウスにおいてはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶ；ヒトにおいてはＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＡ）および１つの阻害性受容体（ＦｃγＲＩＩＢ）からなる。ヒトＦｃγＲの様々な特性が、当技術分野で公知である。生得的エフェクター細胞タイプの大多数は、１つまたは複数の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲＩＩＢを共発現する一方で、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、１種類の活性化Ｆｃ受容体（マウスにおいてはＦｃγＲＩＩＩおよびヒトにおいてはＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現するが、マウスおよびヒトにおいては阻害性ＦｃγＲＩＩＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は、大多数のヒトＦｃ受容体に結合し、かつそれが結合する活性化Ｆｃ受容体のタイプに関して、ネズミＩｇＧ２ａと等価であると考えられる。
用語「挿入された」、「挿入されている」、「～へと挿入された」、または文法的に関連する用語は、本明細書中で用いる場合、明記されるタンパク質中の類似の位置に対する融合ポリペプチド中の異種部分（例えば、半減期延長部分）の位置を意味する。本明細書中で用いる場合、この用語は、本明細書中に開示される組み換えポリペプチドの特徴を意味し、かつ融合ポリペプチドが作製されるいかなる方法またはプロセスも指示、含意または暗示するものではない。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して「異種」および「異種部分」は、異なるタンパク質またはポリヌクレオチドに由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。融合タンパク質の追加の構成要素は、融合タンパク質の他のポリペプチド構成要素と同じ生物に由来することができるか、または追加の構成要素は、融合タンパク質の他のポリペプチド構成要素とは異なる生物に由来することができる。例えば、異種ポリペプチドは、合成されるか、あるいは異なる生物種、個体の異なる細胞タイプ、または異なる個体の細胞の同じかもしくは異なるタイプから誘導することができる。一態様では、異種部分は、融合ポリペプチドまたはタンパク質を生成するために、別のポリペプチドに融合されたポリペプチドである。別の態様では、異種部分は、ポリペプチドまたはタンパク質にコンジュゲート化されたＰＥＧなどの非ポリペプチドである。本明細書中に開示される異種部分の非限定的な例は、グリシン／セリンリンカー［例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号６）（（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３とも記載される）］である。
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」または「ネイティブ配列Ｆｃ」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む。ネイティブ配列ヒトＦｃ領域は、ネイティブ配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域；ネイティブ配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；ネイティブ配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；およびネイティブ配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ならびに天然に存在するそれらの変異体を含む。ネイティブ配列Ｆｃは、Ｆｃの様々なアロタイプを含む［例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1: 1を参照されたい］。
融合タンパク質を用いるインビトロまたはインビボアッセイの文脈において、用語「ＥＣ５０」とは、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインとの間の中間である応答を誘導する融合タンパク質の濃度を意味する。
「保存的アミノ酸置換」とは、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。一部の態様では、ＩＬ２融合タンパク質中に予測される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基を用いて置き換えられる。抗原結合性を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を特定する方法は、当技術分野で周知である［例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-7 (1993)；Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-84 (1999)；およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-17 (1997)を参照されたい］。
遺伝子産物、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数のコード領域に作動可能に会合したプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含むことができる。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルもまた、遺伝子産物発現へと向かわせるためにコード領域と作動可能に会合させることができる。
用語「パーセント配列同一性」、「パーセント同一性」、「配列同一性」、または「同一性」は、相互に交換可能に用いられ、かつ２つの配列の最適アライメントのために導入しなければならない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮して、比較ウインドウにわたって２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間で共有される同一のマッチする位置の個数を意味する。マッチする位置は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が標的および参照配列の両方において存在するいずれかの位置である。ギャップはヌクレオチドまたはアミノ酸でないので、標的配列中に存在するギャップは計数されない。同様に、標的配列ヌクレオチドまたはアミノ酸が計数され、参照配列からのヌクレオチドまたはアミノ酸は計数されないので、参照配列中に存在するギャップは計数されない。
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例に記載される通り、数学的アルゴリズムを用いて遂行することができる。
配列同一性のパーセンテージは、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両方の配列中に存在する位置の個数を決定し、マッチする位置の個数を得て、マッチする位置の個数を比較ウインドウ中の位置の総数を用いて除算し、かつ結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることにより、算出される。配列の比較および２つの配列間のパーセント配列同一性の決定は、オンライン使用およびダウンロードの両方のための容易に利用可能なソフトウェアを用いて遂行することができる。好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給源から、かつタンパク質およびヌクレオチド配列の両方のアライメントに対して、利用可能である。パーセント配列同一性を決定するための１つの好適なプログラムはｂｌ２ｓｅｑであり、これは米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴスイートの一部分である。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを用いて２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために用いられ、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために用いられる。他の好適なプログラムは、例えば、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳスイートの一部分であり、かつｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａにおいて欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）からも入手可能であるＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒである。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアライメントされる単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域はそれぞれ、それらの固有のパーセント配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性値は、最も近い１０分の１へと四捨五入されることが注記される。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、および８０．１４は８０．１へと切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、および８０．１９は８０．２へと切り上げられる。長さ値は常に整数であろうこともまた注記される。
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）を用いて決定することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、ＰＡＭ１２０重み残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム［CABIOS, 4: 11-17 (1989)］を用いて決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）中のＧＡＰプログラムへと組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ［J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)］アルゴリズムを用いて決定することができる。
本明細書中に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連する配列を特定するために公共データベースに対する検索を行うための「クエリ配列」としてさらに用いることができる。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書中に記載される核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書中に記載されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的のためにギャップ付きアライメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴを、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-402 (1997)に記載される通りに利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
本明細書中で用いる場合、「投与すること」とは、当業者に公知の様々な方法およびデリバリーシステムのうちのいずれかを用いる、対象への治療剤を含む組成物の物理的導入を意味する。本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質に関する異なる投与経路は、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば、注入または点滴によるものを含む。語句「非経口投与」とは、本明細書中で用いる場合、通常は注入による、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、かつ限定するものではないが、静脈内、腹腔内、筋内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注入および点滴、ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。あるいは、本明細書中に記載される抗体は、局所、表皮または粘膜投与経路などの、非経口でない経路を介して、例えば、鼻内的、経口的、膣内的、直腸的、舌下的または局所的に投与することができる。投与はまた、例えば、１回、複数回、および／または１つもしくは複数の長期間にわたって、行うこともできる。
「投薬間隔」とは、本明細書中で用いる場合、対象に投与されている複数用量（２以上の用量）の間に経過する時間の量を意味する。投薬間隔の比較は、単一対象においてまたは対象の集団において行うことができ、続いて、集団において得られる平均を算出することができる。投薬間隔は、１つの経路（静脈内）により与えられる用量と、別の経路（皮下）により与えられる用量との間の時間の量であり得る。本明細書中で用いる場合の投薬間隔とは、時間的に互いに隣接する２つの用量を意味する。
「免疫応答」は、当技術分野で理解される通りであり、かつ一般的に、その応答が生物を物質およびそれにより引き起こされる疾患から保護する、外来性物質または異常細胞に対する脊椎動物体内での生物学的応答を意味する。免疫応答は、免疫系の１つまたは複数の細胞［例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞または好中球］およびこれらの細胞のうちのいずれかまたは肝臓により産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の作用により媒介され、これらが、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織または異常細胞、あるいは自己免疫または病的炎症の場合には正常ヒト細胞もしくは組織の選択的標的化、それに対する結合性、それに対する損傷、その破壊、および／または脊椎動物身体からの除去をもたらす。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、もしくはＴｒｅｇ細胞の活性化または阻害、あるいは免疫系のいずれかの他の細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性化または阻害を含む。
「免疫修飾因子」または「免疫調節因子」とは、物質、例えば、免疫応答の修飾、調節、または変更に関与することができるシグナル伝達経路の構成要素を標的化する物質を意味する。免疫応答を「修飾すること」、「調節すること」、または「変更すること」とは、免疫系の細胞またはそのような細胞（例えば、エフェクターＴ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞）の活性でのいずれかの変化を意味する。より詳細には、本明細書中で用いる場合、用語「修飾すること」は、所与の活性もしくは応答を誘導、阻害、増強、上昇、増加、または減少させることを含む。そのような修飾は、様々な細胞タイプの個数の増加もしくは減少、これらの細胞の活性の増加もしくは減少、または免疫系内で生じ得るいずれかの他の変化により現れ得る、免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性の両方の免疫修飾因子が特定されている。一部の態様では、免疫修飾因子は、Ｔ細胞の表面上の分子を標的とする。「免疫修飾標的」または「免疫調節標的」は、物質、薬剤、部分、化合物または分子による結合に対して標的とされ、かつその活性がそれらの結合により変化する分子、例えば、細胞表面分子である。免疫修飾標的は、例えば、細胞の表面上の受容体（「免疫修飾受容体」）および受容体リガンド（「免疫修飾リガンド」）を含む。
「免疫療法」とは、免疫系もしくは免疫応答を誘導、促進、抑制またはそれ以外に変更することを含む方法による、疾患を患っているか、または罹患するリスクもしくは疾患の再発を患うリスクを有する対象の治療を意味する。
「免疫刺激性療法」または「免疫刺激療法」とは、対象における免疫応答の増加（誘導または促進）をもたらす療法を意味する。
「内因性免疫応答を増強すること」とは、対象における既存の免疫応答の有効性または効力を増加させることを意味する。有効性および効力におけるこの増加は、例えば、内因性の宿主免疫応答を抑制するメカニズムを克服することにより、または内因性の宿主免疫応答を促進するメカニズムを刺激することにより、達成することができる。
「Ｔエフェクター」（「Ｔｅｆｆ」）細胞とは、細胞溶解活性を有するＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）ならびにサイトカインを分泌し、かつ他の免疫細胞を活性化および誘導するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔｈ１細胞を意味するが、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を含まない。本明細書中に記載される特定のＩＬ２融合タンパク質は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞ならびにＴｈ１細胞を活性化する。
免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、Ｔ細胞共刺激受容体の強化されたアゴニスト活性および／または阻害受容体の強化されたアンタゴニスト活性から生じ得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解活性（標的細胞に対して直接的にまたはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムを検出することを介して間接的に決定される）および増殖の変化を測定するアッセイにおけるＥＣ５０または活性の最大レベルの増加倍率に反映されることができる。免疫応答または免疫系活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上強化することができる。
用語「連結された」および「融合された」とは、本明細書中で用いる場合、それぞれ、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に共有的または非共有的に連結された第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列は、第２のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列に直接的に連結されるかまたは並置されることができるか、あるいは介在配列が第１の配列を第２の配列に共有的に連結することができる。用語「連結された」とは、Ｃ末端またはＮ末端での第２のアミノ酸配列への第１のアミノ酸配列の融合のみを意味するのではなく、第２のアミノ酸配列（または、それぞれ、第１のアミノ酸配列）中のいずれかの２つのアミノ酸への第１のアミノ酸配列（または第２のアミノ酸配列）全体の挿入も含む。一態様では、第１のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーにより第２のアミノ酸配列に連結される。第１のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーにより第２のヌクレオチド配列に連結され得る。リンカーは、ペプチドもしくはポリペプチド（ポリペプチド鎖に関して）またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖に関して）あるいはいずれかの化学的部分（ポリペプチド鎖およびポリヌクレオチド鎖の両方に関して）であり得る。用語「連結された」はまた、ハイフン（－）によっても示される。
本明細書中で用いる場合、用語「Ｔ細胞媒介応答」とは、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞）およびヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞）をはじめとするＴ細胞により媒介される応答を意味する。Ｔ細胞媒介応答としては、例えば、Ｔ細胞の細胞傷害性および増殖が挙げられる。
本明細書中で用いる場合、用語「細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答」とは、細胞傷害性Ｔ細胞により誘導される免疫応答を意味する。ＣＴＬ応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞により主に媒介される。
本明細書中で用いる場合、用語「阻害する」または「遮断する」（例えば、細胞上のＩＬ２Ｒαに対するＩＬ２の結合の阻害／遮断に関して）は、相互に交換可能に用いられ、かつ部分的および完全阻害／遮断の両方を包含する。一部の態様では、ＩＬ２融合タンパク質は、例えば、本明細書中にさらに説明される通りに決定されるＩＬ２Ｒαに対するＩＬ２の結合を、少なくとも約５０％、例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％まで阻害する。一部の態様では、ＩＬ２融合タンパク質は、例えば、本明細書中にさらに説明される通りに決定されるＩＬ２Ｒαに対するＩＬ２の結合を、５０％以下、例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％まで阻害する。
用語「治療する」、「治療すること」、および「治療」とは、本明細書中で用いる場合、疾患に関連する症状、合併症、状態もしくは生化学的徴候の進行、発達、重症度または再発を反転させ、軽減させ、改善し、阻害し、または減速させるかもしくは予防するか、あるいは全生存期間を強化する目的で、対象に対して行われるいずれかのタイプの介入もしくはプロセス、または対象への活性薬剤の投与を意味する。治療は、疾患を有する対象または疾患を有しない対象（例えば、予防に関して）のものであり得る。予防的に与えられる場合、本明細書中に開示される融合タンパク質は、いかなる症状にも先立って与えられる。物質の予防的投与は、いずれかの後続の症状を予防または減弱させるために機能する。
融合タンパク質、医薬組成物、またはワクチンに関して、「有効性を強化すること」または「免疫原性を強化すること」とは、例えば、保護免疫に関連する融合タンパク質、医薬組成物、またはワクチンの活性の特定のパラメータにおける増加または減少などの、具体的な値における変化により測定される通りの転帰を改善することが意図される。一態様では、強化とは、特定のパラメータにおける少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％超の増加を意味する。別の態様では、強化は、特定のパラメータにおける少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％超の減少を意味する。一例では、ワクチンの有効性／免疫原性の強化とは、その目的に関するワクチンの有効性における少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％超の増加などの、疾患進行を阻害または治療するワクチンの能力における増加を意味する。
同様に、融合タンパク質、医薬組成物、またはワクチンに関して、「抑制された免疫応答を克服すること」とは、例えば、保護免疫に関連するワクチンの活性の特定のパラメータにおいて以前には陽性であった値への復帰などの、具体的な値における変化により測定される通りの転帰を改善することが意図される。一態様では、克服することとは、特定のパラメータにおける少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％超の増加を意味する。一例では、融合タンパク質、医薬組成物、またはワクチンに対する抑制された免疫応答を克服することとは、その目的に関するワクチンの有効性における少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％、または１００％超の再生などの、疾患進行を阻害または治療する融合タンパク質、医薬組成物、またはワクチンの再生された能力を意味する。
「治療用量」、「用量」、または「投薬量」とは、本明細書中で（相互に交換可能に）用いる場合、本明細書中に記載される通りの治療上のゴールを達成する用量を意味する。一部の態様では、「治療用量」は、対象において免疫寛容を誘導する用量を意味する。特定の態様では、「治療用量」とは、寛容期間までの明記される時間内、例えば、第１用量の投与の１２週間以内に、対象において免疫寛容を誘導する用量を意味する。ＩＬ２融合タンパク質の「用量」とは、所望の生物学的応答を生起するために十分なＩＬ２融合タンパク質の量を意味する。当業者により理解されるであろう通り、有効である特定のＩＬ２融合タンパク質の絶対量は、所望の生物学的エンドポイント、送達されるＩＬ２融合タンパク質、標的細胞または組織等などの因子に応じて変わり得る。当業者は、有効量が単回用量で投与できるか、または複数用量（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の用量）の投与により達成することができることをさらに理解するであろう。疾患退行を促進するかまたは疾患の発達もしくは再発を阻害する治療剤の能力は、臨床試験中のヒト対象におけるか、ヒトでの有効性を予測する動物モデル系におけるか、またはインビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによるなどの、技能を有する実務者に公知の多様な方法を用いて、評価することができる。
「治療する」、「治療」、または「治療すること」とは、本明細書中で用いる場合、例えば、必ずしも疾患または状態を治癒させることを伴わない、疾患または状態の重症度の低減；状態経過の持続期間の低減；疾患または状態に関連する１つもしくは複数の症状の改善または除去；疾患または状態を有する対象への有益な作用の提供を意味する。
「医薬製剤」または「医薬組成物」とは、本明細書中で用いる場合、有効成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態にあり、かつ医薬製剤（ｐｈａｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）または組成物が投与される対象に対して容認できない程度に毒性である追加の成分を含有しない調製物を意味する。医薬製剤または組成物は、無菌であり得る。一部の態様では、医薬製剤または組成物は、ヒト対象における治療的使用に対して好適である。
用語「患者」は、予防的治療または治療処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
本明細書中で用いる場合、用語「対象」は、いずれかのヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、本明細書中に記載される方法および組成物は、免疫疾患を有する対象を治療するために用いることができる。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等を含む。
用語「体重基準」用量または投薬とは、本明細書中で参照される場合、患者に投与される用量が、患者の体重に基づいて算出されることを意味する。例えば、６０ｋｇの体重を有する患者が３ｍｇ／ｋｇの抗ＩＬ２抗体を必要とする場合、投与のためのＩＬ２融合タンパク質の適切な量（すなわち、１８０ｍｇ）を算出および使用することができる。
本明細書中に記載される方法および投与量に関する用語「平坦用量」の使用は、患者の体重または体表面積（ＢＳＡ）とは関わりなく、患者に投与される用量を意味する。したがって、平坦用量は、ｍｇ／ｋｇ用量としてではなく、むしろ薬剤（例えば、ＩＬ２融合タンパク質）の絶対量として与えられる。例えば、６０ｋｇの人物と１００ｋｇの人物が、同じ用量の抗体（例えば、４８０ｍｇのＩＬ２融合タンパク質）を投与されるであろう。
本明細書中で用いる場合、用語「ｕｇ」および「ｕＭ」は、それぞれ、「μｇ」および「μＭ」と相互に交換可能に用いられる。
本明細書中で用いる場合、用語「治験薬」または「ＩＰ」は、ＢＭＳ－９８６３２６ならびにプラセボ（０．９％塩化ナトリウム）を含む。一部の例では、治験薬は、例えば、静脈内的または皮下的など、当技術分野で公知のいずれかの手段により、対象に投与することができる。
本明細書中に提供されるいかなる組成物または方法も、本明細書中に提供される他の組成物および方法のいずれかのうちの１つまたは複数と（ｗｉｒｈ）組み合わせることができる。
免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン断片、または領域のアミノ酸ナンバリングに対してなされる参照は、すべてKabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MDに基づく。［ＦｃＲｎ受容体は、ヒトをはじめとする数種類の哺乳動物種から単離されてきた。ヒトＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎの配列は公知である（Story et al., J. Exp. Med. 180: 2377 (1994)）。］Ｆｃは、免疫グロブリンのヒンジ領域を伴うかまたは伴わずに、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むことができる。例示的なＦｃ変異体は、ＷＯ２００４／１０１７４０およびＷＯ２００６／０７４１９９において提供される。
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）により許容される形態で表示される。数値範囲は、範囲を規定する数字に関して包含的である。別途示されない限り、アミノ酸配列は、左から右に向かって、アミノからカルボキシの方向で記載される。本明細書中に提供される見出しは、本開示の様々な態様の限定ではなく、全体として本明細書を参照して設けることができる。したがって、直下に定義される用語は、その全体で本明細書を参照してより完全に定義される。
別途定義されない限り、本明細書中で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本開示が関連する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press；およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示で用いられる用語のうちの多数の一般的辞書を当業者に提供する。
本明細書中に記載される様々な態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明される。
ＩＩ．対象において疾患または障害を治療する方法
本開示は、インターロイキン－２（ＩＬ２）融合タンパク質の１つまたは複数の用量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法を提供し、ここで、融合タンパク質は、（ａ）ＩＬ２ポリペプチドを含む第１のポリペプチド、および（ｂ）インターロイキン－２受容体α（ＩＬ２Ｒα）ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のポリペプチドを含み、（ｉ）ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、ネイティブＩＬ２Ｒα（配列番号１）の細胞外ドメインと比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有し；かつ／または（ｉｉ）ＩＬ２ポリペプチドは、ネイティブＩＬ２（配列番号２）と比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有する。一部の態様では、本方法は、コルチコステロイドを対象（ｓｕｂｅｊｃｔ）に投与することをさらに含む。一部の態様では、コルチコステロイドは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、コルチゾン、デスオキシコルチコステロン、フルドロコルチゾン、またはパラメタゾンである。
Ｔｒｅｇに対するＩＬ－２シグナル伝達経路の重要性は、ＩＬ－２シグナル伝達経路の構成要素を欠失するマウスまたはヒトにおける全身性自己免疫の出現により実証されてきた。Ｔｒｅｇ細胞数および／または機能の調節異常は、多数の免疫媒介状態に関連付けられてきた。例えば、Bluestone, J.A., et al., J Clin Invest. 125:2250-60 (2015)；およびDominguez-Villar, M and Hafler, D.A., Nat Immunol. 19:665-73 (2018)を参照されたい。ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒα、およびＩＬ－２Ｒβ遺伝子座における自己免疫リスク変異体が、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を通して特定され、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、１型自己免疫性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および関節リウマチ（ＲＡ）をはじめとする免疫媒介疾患に関連付けられてきた。例えば、Abbas, A.K., et al., Sci Immunol. 3, eaat1482 (2018)を参照されたい。主要なＴｒｅｇ系統転写因子ＦｏｘＰ３に影響する突然変異は、機能的Ｔｒｅｇの喪失から生じる自己免疫性リンパ増殖性疾患である免疫調節異常多腺性内分泌障害腸疾患Ｘ連鎖（ＩＰＥＸ）症候群を引き起こす。加えて、ＩＬ－２ＲＡにおける突然変異から生じるＣＤ２５欠損を有する患者は、ＩＰＥＸ症候群に類似する免疫調節異常に見舞われる。例えば、Verbsky, J.W. and Chatila, T., Curr Opin Pediatr. 25(6):708-14 (2013)を参照されたい。遺伝学的データは、マウスおよびヒトの両方において、Ｔｒｅｇ機能および自己免疫の抑制におけるＩＬ－２の中心的役割に合致する。
ＩＬ－２欠損がＳＬＥ患者における寛容の欠如および免疫病理学に寄与する主要なメカニズムは、Ｔｒｅｇ恒常性を破壊することによると一般的に推測される。例えば、Klatzmann, D., and Abbas, A.K., Nat Rev Immunol. 15:283-94 (2015)；およびBallesteros-Tato, A. and Papillion, A., Curr Opin Immunol. 61:39-45 (2019)を参照されたい。一部の研究は活動性ＳＬＥ疾患を有する患者においてＴｒｅｇの頻度の相対的増加が見られることを示唆してきたが、これらのＴｒｅｇは、機能障害を示唆する比較的低いＣＤ２５発現を有することが報告されている。例えば、Von Spee-Mayer, C., et al., Ann Rheum Dis. 75:1407-15 (2016)を参照されたい。ＳＬＥ患者におけるＴｒｅｇの機能障害ははっきりとは理解されていないが、ＳＬＥにおける３つの独立した臨床研究が、低用量ＩＬ－２治療後の増加したＴｒｅｇおよび低下した疾患活動性および増加したＴｒｅｇを実証してきた。例えば、He, J., et al., Arthritis Rheumatol. 67(suppl 10) (2015)；Humrich, J.Y., et al. Ann Rheum Dis. 74:791-92 (2015)；およびVon Spee-Mayer, C., et al., Ann Rheum Dis. 75:1407-15 (2016)を参照されたい。低用量ＩＬ－２投与、Ｔｒｅｇ拡大増殖、および低減した免疫病理学の間の関連が、Ｉ型糖尿病［例えば、Dwyer, C.J., et al., Curr Diab Rep. 16:46 (2016)を参照されたい］、ＨＣＶ誘導型血管炎［例えば、Dupont, G., et al., Cytokine. 69:146-9 (2014)を参照されたい］、円形脱毛症［例えば、Castela, E., et al., JAMA Dermatol. 150:748-51 (2014)を参照されたい］、およびＧｖＨＤ［例えば、Koreth, J., et al., N Engl J Med. 365:2055-66 (2011)を参照されたい］をはじめとする他の形態の免疫媒介障害において示されてきた。これらの研究は、ＴｒｅｇのＩＬ－２依存的拡大増殖と低用量ＩＬ－２治療後に観察される臨床的利益との間の因果関係を示す。
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）はＩＬ２欠損状態として記載されてきており、かつＩＬ－２欠損は、ＳＬＥ進行と関連付けられている。例えば、Mizui, M. and Tsokos, G.C., Front Immunol. 9: Article 786 (2018)を参照されたい。ＳＬＥを有する患者由来の培養末梢血単核細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、欠損したエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）ＩＬ－２産生を示す。例えば、Comte, D., et al., Arthritis & Rheumatology 69:808-13 (2017)を参照されたい。
したがって、本開示は、疾患または状態、例えば、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、例えば、ＳＬＥの治療のための、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質に関する安全かつ有効な投与量を提供する。
ＩＩ．Ａ．用量および投与経路
一部の態様では、ＩＬ２融合タンパク質の用量は、約０．１ｍｇ～約９ｍｇである。他の態様では、ＩＬ２融合タンパク質の用量は、約９ｍｇ超である。
ＩＬ２融合タンパク質の用量は、局所、表皮、粘膜、鼻内、経口、膣内、直腸、舌下、局所、静脈内、腹腔内、筋内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外または胸骨内経路を介して、対象に投与することができる。
一部の態様では、融合タンパク質は、静脈内経路を介して対象に投与される。一部の態様では、ｉ．ｖ．投与される用量のＡＵＣ［０～３３６時間（ｈ）］は、平均曝露（ＡＵＣ［ＩＮＦ］）が制限されるように制御される。一部の態様では、用量のＡＵＣ［０～３３６時間（ｈ）］は、約７５７μｇ・ｈ／ｍｌよりも低い。
一部の態様では、用量のＡＵＣ［０～３３６時間（ｈ）］は、約７５０μｇ・ｈ／ｍｌ、約７４０μｇ・ｈ／ｍｌ、約７３０μｇ・ｈ／ｍｌ、約７２０μｇ・ｈ／ｍｌ、約７１０μｇ・ｈ／ｍｌ、約７００μｇ・ｈ／ｍｌ、約６９０μｇ・ｈ／ｍｌ、約６８０μｇ・ｈ／ｍｌ、約６７０μｇ・ｈ／ｍｌ、約６６０μｇ・ｈ／ｍｌ、約６５０μｇ・ｈ／ｍｌ、約６４０μｇ・ｈ／ｍｌ、約６３０μｇ・ｈ／ｍｌ、約６２０μｇ・ｈ／ｍｌ、約６１０μｇ・ｈ／ｍｌ、約６００μｇ・ｈ／ｍｌ、約５９０μｇ・ｈ／ｍｌ、約５８０μｇ・ｈ／ｍｌ、約５７０μｇ・ｈ／ｍｌ、約５６０μｇ・ｈ／ｍｌ、または約５５０μｇ・ｈ／ｍｌよりも低い。
一部の態様では、融合タンパク質は、約０．３ｍｇ～約９ｍｇの用量で、静脈内経路を介して投与される。一部の態様では、融合タンパク質は、約１ｍｇ～約９ｍｇ、約２ｍｇ～約９ｍｇ、約３ｍｇ～約９ｍｇ、約４ｍｇ～約９ｍｇ、約５ｍｇ～約９ｍｇ、約６ｍｇ～約９ｍｇ、約７ｍｇ～約９ｍｇ、約８ｍｇ～約９ｍｇ、約１ｍｇ～約８ｍｇ、約２ｍｇ～約８ｍｇ、約３ｍｇ～約８ｍｇ、約４ｍｇ～約８ｍｇ、約５ｍｇ～約８ｍｇ、約６ｍｇ～約８ｍｇ、約７ｍｇ～約８ｍｇ、約１ｍｇ～約７ｍｇ、約２ｍｇ～約７ｍｇ、約３ｍｇ～約７ｍｇ、約４ｍｇ～約７ｍｇ、約５ｍｇ～約７ｍｇ、約６ｍｇ～約７ｍｇの用量で、静脈内経路を介して対象に投与される。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約３ｍｇ～約９ｍｇである。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約６ｍｇ～約９ｍｇである。
一部の態様では、融合タンパク質は、約０．１ｍｇ～約６ｍｇ、約１ｍｇ～約６ｍｇ、約２ｍｇ～約６ｍｇ、約３ｍｇ～約６ｍｇ、約４ｍｇ～約６ｍｇ、または約５ｍｇ～約６ｍｇ、約１ｍｇ～約５ｍｇ、約２ｍｇ～約５ｍｇ、約３ｍｇ～約５ｍｇ、約４ｍｇ～約５ｍｇ、約１ｍｇ～約４ｍｇ、約２ｍｇ～約４ｍｇ、約３ｍｇ～約４ｍｇ、約１ｍｇ～約３ｍｇ、または約２ｍｇ～約３ｍｇの用量で、静脈内経路を介して対象に投与される。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約０．１ｍｇ～約３ｍｇである。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約０．１ｍｇ～約１ｍｇである。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約０．１ｍｇ～約０．３ｍｇである。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約０．３ｍｇ～約６ｍｇである。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約１ｍｇ～約３ｍｇである。
一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約０．１ｍｇ、約０．３ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、または約９ｍｇである。一部の態様では、静脈内経路を介して投与される用量は、約９ｍｇ超である。
一部の態様では、融合タンパク質は、皮下経路を介して対象に投与される。一部の態様では、ｓ．ｃ．投与される用量のＡＵＣ［０～３３６時間（ｈ）］は、平均曝露（ＡＵＣ［ＩＮＦ］）が制限されるように制御される。一部の態様では、用量のＡＵＣ（０～５０４ｈ）は、約３０６μｇ・ｈ／ｍｌよりも低い。
一部の態様では、用量のＡＵＣ（０～５０４ｈ）は、約３００μｇ・ｈ／ｍｌ、約２９０μｇ・ｈ／ｍｌ、約２８０μｇ・ｈ／ｍｌ、約２７０μｇ・ｈ／ｍｌ、約２６０μｇ・ｈ／ｍｌ、約２５０μｇ・ｈ／ｍｌ、約２４０μｇ・ｈ／ｍｌ、約２３０μｇ・ｈ／ｍｌ、約２２０μｇ・ｈ／ｍｌ、約２１０μｇ・ｈ／ｍｌ、約２００μｇ・ｈ／ｍｌ、約１９０μｇ・ｈ／ｍｌ、約１８０μｇ・ｈ／ｍｌ、約１７０μｇ・ｈ／ｍｌ、約１６０μｇ・ｈ／ｍｌ、または約１５０μｇ・ｈ／ｍｌよりも低い。
一部の態様では、融合タンパク質は、約１ｍｇ～約８ｍｇ、約２ｍｇ～約８ｍｇ、約３ｍｇ～約８ｍｇ、約４ｍｇ～約８ｍｇ、約５ｍｇ～約８ｍｇ、約６ｍｇ～約８ｍｇ、約７ｍｇ～約８ｍｇ、約１ｍｇ～約７ｍｇ、約２ｍｇ～約７ｍｇ、約３ｍｇ～約７ｍｇ、約４ｍｇ～約７ｍｇ、約５ｍｇ～約７ｍｇ、約６ｍｇ～約７ｍｇ、約１ｍｇ～約６ｍｇ、約２ｍｇ～約６ｍｇ、約３ｍｇ～約６ｍｇ、約４ｍｇ～約６ｍｇ、または約５ｍｇ～約６ｍｇ、約１ｍｇ～約５ｍｇ、約２ｍｇ～約５ｍｇ、約３ｍｇ～約５ｍｇ、約４ｍｇ～約５ｍｇ、約１ｍｇ～約４ｍｇ、約２ｍｇ～約４ｍｇ、約３ｍｇ～約４ｍｇ、約１ｍｇ～約３ｍｇ、または約２ｍｇ～約３ｍｇの用量で、皮下経路を介して対象に投与される。一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約３ｍｇ～約８ｍｇである。一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約６ｍｇ～約８ｍｇである。一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約１ｍｇ～約６ｍｇである。一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約１ｍｇ～約３ｍｇである。一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約３ｍｇ～約６ｍｇである。
一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約１ｍｇ、約３ｍｇ、約６ｍｇ、または約８ｍｇである。一部の態様では、皮下経路を介して投与される用量は、約８ｍｇ超である。
一部の態様では、本方法は、２つの用量間に投薬間隔を置いて、それを必要とする対象に複数用量（すなわち、２つ以上の用量）を投与することを含む。一部の態様では、投薬間隔（例えば、皮下または静脈内）は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、または少なくとも約６日間である。一部の態様では、投薬間隔（例えば、皮下または静脈内）は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約１ヵ月間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約２ヵ月間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、または少なくとも約３ヵ月間である。一部の態様では、投薬間隔は、少なくとも約３週間である。一部の態様では、投薬間隔は、少なくとも約２週間である。一部の態様では、投薬間隔は、少なくとも約４週間である。一部の態様では、投薬間隔は、少なくとも約１ヵ月間である。一部の態様では、投薬は静脈内的に与えられ、かつ投薬間隔は、少なくとも約３週間である。一部の態様では、投薬は静脈内的に与えられ、かつ投薬間隔は、少なくとも約２週間である。一部の態様では、投薬は静脈内的に与えられ、かつ投薬間隔は、少なくとも約４週間または約１ヵ月間である。一部の態様では、投薬は皮下的に与えられ、かつ投薬間隔は、少なくとも約３週間である。一部の態様では、投薬は皮下的に与えられ、かつ投薬間隔は、少なくとも約２週間である。一部の態様では、投薬は皮下的に与えられ、かつ投薬間隔は、少なくとも約４週間または約１ヵ月間である。
一部の態様では、投薬間隔（例えば、皮下または静脈内）は、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、または約６日間である。一部の態様では、投薬間隔（例えば、皮下または静脈内）は、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヵ月間、約５週間、約６週間、約７週間、約８（ｅｉｇｔｈｔ）週間、約２ヵ月間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、または約３ヵ月間である。一部の態様では、投薬間隔は、約３週間である。一部の態様では、投薬間隔は、約２週間である。一部の態様では、投薬間隔は、約４週間である。一部の態様では、投薬間隔は、約１ヵ月間である。一部の態様では、投薬は静脈内的に与えられ、かつ投薬間隔は、約３週間である。一部の態様では、投薬は静脈内的に与えられ、かつ投薬間隔は、約２週間である。一部の態様では、投薬は静脈内的に与えられ、かつ投薬間隔は、約４週間または１ヵ月間である。一部の態様では、投薬は皮下的に与えられ、かつ投薬間隔は、約３週間である。一部の態様では、投薬は皮下的に与えられ、かつ投薬間隔は、約２週間である。一部の態様では、投薬は皮下的に与えられ、かつ投薬間隔は、約４週間または約１ヵ月間である。
一部の態様では、本方法は、それを必要とする対象に本明細書中に記載される融合タンパク質の複数用量を投与することを含み、ここで、複数用量は、２種類以上の異なる経路を介して投与され、例えば、１つの用量が静脈内投与され、かつ別の用量が皮下投与される。一部の態様では、本方法は、（ｉ）それを必要とする対象に融合タンパク質の第１用量を静脈内投与することおよび（ｉｉ）それを必要とする対象に融合タンパク質の第２（または最終）用量を皮下投与することを提供する。一部の態様では、本方法は、（ｉ）それを必要とする対象に融合タンパク質の１つまたは複数の用量を静脈内投与することおよび（ｉｉ）対象に融合タンパク質の１つまたは複数の用量を皮下投与することを提供する。一部の態様では、投薬間隔および／または投与量は、静脈内投与と皮下投与との間で調整することができる。
一部の態様では、本方法は、コルチコステロイドを対象に投与することをさらに含む。一部の態様では、コルチコステロイドは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、コルチゾン、デスオキシコルチコステロン、フルドロコルチゾン、およびパラメタゾンからなる群より選択される。一部の態様では、コルチコステロイドは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、またはプレドニゾンである。一部の態様では、コルチコステロイドは、プレドニゾロンである。
一部の態様では、コルチコステロイドは、局所、表皮、粘膜、鼻内、経口、膣内、直腸、舌下、局所、静脈内、腹腔内、筋内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、または胸骨内経路を介して、対象に投与される。一部の態様では、コルチコステロイドは、局所、経口、静脈内、または筋内経路を介して対象に投与される。
一部の態様では、コルチコステロイドは、融合タンパク質の各用量の前、それと同時、または後に投与される。一部の態様では、コルチコステロイドの２つ以上の用量が、各用量の間に投薬間隔を置いて、対象に投与される。一部の態様では、コルチコステロイドの投薬間隔は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約１ヵ月間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約２ヵ月間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、または少なくとも約３ヵ月間である。一部の態様では、コルチコステロイドはプレドニゾロンであり、融合タンパク質は、週２回皮下的に対象に投与され、かつプレドニゾロンは、週３回経口的に対象に投与される。
ＩＩ．Ｂ．疾患および障害
本方法に対して好適な対象は、免疫応答の強化が望ましいであろうヒト患者を含む。方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を増強することにより治療することができる疾患または障害を有するヒト患者を治療するために特に好適である。一部の態様では、対象にＩＬ２融合タンパク質の量を投与することは、対象における免疫応答を変更する。一部の態様では、免疫応答は、対象において強化、刺激、またはアップレギュレートされる。
ＩＬ２またはＩＬ２Ｒαの負の作用を阻害することなどにより、Ｔ細胞応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激または共刺激する本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質の能力を考慮して、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激、強化またはアップレギュレートするために、本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質を用いるインビトロおよびインビボ方法が、本明細書中に提供される。一部の態様では、ＣＤ３刺激もまた提供され（例えば、膜ＣＤ３を発現する細胞との共インキュベーションにより）、この刺激は、本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質を用いる刺激と同時に、その前、または後に、提供することができる。
抗原特異的Ｔ細胞応答のいずれかの好適なインジケーターを、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定するために用いることができる。そのような好適なインジケーターの非限定的な例としては、抗体の存在下での増加したＴ細胞増殖および／または抗体の存在下での増加したサイトカイン産生が挙げられる。一部の態様では、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン－２および／またはインターフェロン－γ産生が刺激される。
本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質を用いて強化または共刺激することができるＴ細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられる。Ｔ細胞は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞、Ｔｈｅｌｐｅｒ（Ｔｈ）細胞（例えば、Ｔｈ１細胞）またはＴ細胞傷害性（Ｔｃ）細胞であり得る。
一部の態様では、疾患または障害は、感染性疾患または免疫媒介疾患である。本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質を用いる疾患または障害を有する対象の治療は、例えば、安定疾患、部分奏効、増加した全生存期間、増加した無病生存期間、または強化された無増悪生存期間をもたらし得る。
一部の態様では、免疫媒介疾患は、炎症性疾患または自己免疫疾患である。望ましくない免疫応答を阻害するためにＴｒｅｇの抑制力を利用することには多大な関心が持たれる。マウスおよびヒトでのデータは、低用量のＩＬ２を用いてＩＬ２Ｒシグナル伝達を強化することが、Ｔｒｅｇを選択的に促進し、かつ免疫寛容原性メカニズムを強化することを示す。本明細書中に提供されるＩＬ２融合タンパク質は、より高い可能性でＴｒｅｇを強化するＩＬ２の新規かつ改善された形態を代表する。つまり、ＩＬ２融合タンパク質は、自己免疫疾患、慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応、および自己反応性を抑制することがゴールである他の状態を有する患者に投与することができる。
一部の態様では、免疫媒介疾患は、１型糖尿病；多発性硬化症；関節リウマチ；セリアック病；全身性エリテマトーデス；ループス腎炎；皮膚ループス；若年性特発性関節炎；クローン病；潰瘍性大腸炎；全身性硬化症；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；乾癬；円形脱毛症；ＨＣＶ誘導型血管炎；シェーグレン症候群；天疱瘡；強直性脊椎炎；ベーチェット病；ウェゲナー肉芽腫症；高安病；自己免疫性肝炎；硬化性胆管炎；グジェロー・シェーグレン；炎症性腸疾患；免疫調節異常多腺性内分泌障害腸疾患Ｘ連鎖（ＩＰＥＸ）症候群；およびマクロファージ活性化症候群からなる群より選択される。一部の態様では、免疫媒介疾患は、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、または皮膚ループスである。一部の態様では、免疫媒介疾患は、全身性エリテマトーデスである。
一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質は、先行する治療に対して不適切な応答を示したか、または先行する治療時に進行した、炎症性疾患または自己免疫疾患を有する患者に投与される。一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質は、炎症性疾患または自己免疫疾患に対する治療を以前に受けて（すなわち、それを用いて治療されて）いない患者に投与される。
一部の態様（ａｐｅｃｔｓ）では、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質は、炎症性疾患または自己免疫疾患に対する標準治療と共に投与される。一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質は、炎症性疾患または自己免疫疾患に対する維持療法、例えば、炎症の発生または再発を予防することが意図される療法として投与される。
一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質は、炎症性疾患もしくは自己免疫疾患の治療のための単剤療法として、または炎症性疾患もしくは自己免疫疾患の治療のための唯一の免疫刺激性療法として、投与される。一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質は、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療のためのワクチン接種プロトコールと組み合わせられる。一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質は、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療のために用いられる抗体と組み合わせられる。
一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質は、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療のために用いられるコルチコステロイドと組み合わせられる。
一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質は、全身性エリテマトーデスの治療のために用いられるコルチコステロイドと組み合わせられる。一部の態様では、全身性エリテマトーデスの治療のために用いられるコルチコステロイドは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、コルチゾン、デスオキシコルチコステロン、フルドロコルチゾン、またはパラメタゾンである。一部の態様では、全身性エリテマトーデスの治療のために用いられるコルチコステロイドは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、またはプレドニゾンである。一部の態様では、全身性エリテマトーデスの治療のために用いられるコルチコステロイドは、プレドニゾロンである。
一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質は、ループス腎炎の治療のために用いられるコルチコステロイドと組み合わせられる。一部の態様では、全身性ループス腎炎の治療のために用いられるコルチコステロイドは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、コルチゾン、デスオキシコルチコステロン、フルドロコルチゾン、またはパラメタゾンである。一部の態様では、ループス腎炎の治療のために用いられるコルチコステロイドは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、またはプレドニゾンである。一部の態様では、ループス腎炎の治療のために用いられるコルチコステロイドは、プレドニゾロンである。
一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質は、皮膚ループスの治療のために用いられるコルチコステロイドと組み合わせられる。一部の態様では、皮膚ループスの治療のために用いられるコルチコステロイドは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、コルチゾン、デスオキシコルチコステロン、フルドロコルチゾン、またはパラメタゾンである。
一部の態様では、本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質は、顕著に毒性でない。例えば、本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質は、例えば、臨床試験において決定される場合、ヒトの臓器、例えば、肝臓、腎臓、脳、肺、および心臓のうちの１つまたは複数に対して顕著に毒性でない。一部の態様では、本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質は、望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫または炎症を顕著に引き起こさない。
一部の態様では、本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質を用いる対象の治療は、それにより対象の免疫系が対象自身を攻撃する（例えば、自己免疫応答）か、または、例えば、アナフィラキシーを生じる程度まで、免疫系の過剰刺激をもたらさない。つまり、一部の態様では、本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質は、アナフィラキシーを引き起こさない。
一部の態様では、本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質を用いる対象の治療は、顕著な炎症性反応、例えば、免疫媒介肺炎、免疫媒介大腸炎、免疫媒介肝炎、免疫媒介腎炎もしくは腎機能障害、免疫媒介下垂体炎、免疫媒介甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症、または他の免疫媒介有害反応を引き起こさない。一部の態様では、本明細書中に記載されるＩＬ２融合タンパク質を用いる対象の治療は、顕著な心臓障害、例えば、心室性不整脈；目障害、例えば、虹彩毛様体炎；輸液関連反応；アミラーゼ増加、リパーゼ増加；神経系障害、例えば、めまい、末梢感覚性ニューロパチー；皮膚および皮下組織障害、例えば、発疹、掻痒症、剥脱性皮膚炎、多形性紅斑、白斑または乾癬；呼吸器、胸部および縦隔障害、例えば、咳；疲労；吐き気；食欲減退；便秘；関節痛；または下痢を引き起こさない。
本開示は、本明細書中に開示されるいずれかの方法に従う使用のための組成物をさらに提供する。
ＩＩ．Ｃ．ＩＬ２融合タンパク質
本方法において投与されるＩＬ２融合タンパク質は、少なくとも２つの構成要素：（ａ）インターロイキン－２（ＩＬ２）ポリペプチドを含む第１のポリペプチド；および（ｂ）インターロイキン－２受容体α（ＩＬ２Ｒα）ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のポリペプチドを含み；ここで、ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、ネイティブＩＬ２Ｒα（配列番号１）の細胞外ドメインと比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有し；かつ／または（ｉｉ）ＩＬ２ポリペプチドは、ネイティブＩＬ２（配列番号２）と比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有する。一部の態様では、融合タンパク質は、ＩＬ２活性を有する。
本明細書中に記載される融合タンパク質は、ヒトＩＬ２Ｒ、より具体的には、ヒトＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン内の特定のドメイン（例えば、機能的ドメイン）に特異的に結合する。一部の態様では、ＩＬ２を含む融合タンパク質は、アンタゴニストである。一部の態様では、ＩＬ２を含む融合タンパク質は、高親和性を有してヒトＩＬ２Ｒαに結合する。
複数の受容体サブユニットが、効果的なＩＬ－２受容体シグナル伝達に寄与する。ＩＬ－２Ｒβおよび共通γ鎖受容体（ＩＬ－２Ｒγ）が受容体のシグナル伝達構成要素を形成し、両方ともＩＬ－２シグナル伝達に対して必須かつ十分である。ＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体受容体の活性化は、ＪＡＫ１およびＪＡＫ３の動員、ＰＩ３Ｋの活性化ならびに最終的にＳＴＡＴ５のリン酸化をもたらす。例えば、Malek, T.R., Annu Rev Immunol. 26:453-79 (2008)を参照されたい。ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγは、すべてのＩＬ－２感受性免疫細胞：Ｔｒｅｇ、Ｔｃｏｎｖ、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞および２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）上で発現されるが、αサブユニットＩＬ－２ＲαまたはＣＤ２５は、より限定された発現を有する。ＣＤ２５はＴｒｅｇ上で構成的に発現され、ＩＬＣ２上で報告されており、かつ活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞上で一時的にのみ発現される。例えば、Simoni, Y., et al., Immunity 46(1):148-61 (2017)を参照されたい。ＣＤ２５は、ＩＬ－２に対して中程度（約２５ｎＭ）の親和性を有し、かつシグナル伝達に直接的に参加しない。例えば、Rickert, M., et al., Science 308:1477-80 (2005)を参照されたい。
ＩＬ－２と全３種類の受容体構成要素の細胞外ドメインとの４成分複合体の結晶構造に基づいて、ＣＤ２５は、ＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒγと直接的に接触しないようである。例えば、Nelson, B.H., et al., Nature 369:333-6 (1994)；およびStauber, D.J.., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:2788-93 (2006)を参照されたい。代わりに、ＣＤ２５は、ＣＤ２５がＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγサブユニットと同じ細胞上に高レベルで発現される細胞に対するＩＬ－２の見かけの効力を増加させる、ＩＬ－２に対する細胞表面の受け取り部として機能するように見える。例えば、Pillet, A.H., et al., J Mol Biol. 403:671-92 (2010)を参照されたい。Ｔｒｅｇ上での構成的な高いＣＤ２５発現は、他の非調節Ｔ細胞と比較して、Ｔｒｅｇ上でのＩＬ－２の顕著に高い効力を伴って、ＩＬ－２に対する非常に高い感受性を付与する。例えば、Dupont, G., et al., Cytokine 69:146-9 (2014)を参照されたい。ＴｒｅｇのＩＬ－２処理は、ロバストな増殖ならびにＣＤ２５およびＦｏｘＰ３、ならびにＴｒｅｇ抑制性活性に関連する他の遺伝子のアップレギュレーションを含む活性化をもたらす。例えば、Sakaguchi, S., et al., J Immunol. 155(3):1151-64 (1995)を参照されたい。Ｔｒｅｇとは異なり、エフェクターＴ細胞および大多数のＮＫ細胞は、高い構成的ＣＤ２５発現を欠き、かつ活性化時に一時的にのみＣＤ２５をアップレギュレートするので、活性化のためにより高いＩＬ－２レベルを必要とする。例えば、Letourneau, S., et al., J Allergy Clin Immunol. 123(4):758-62 (2009)を参照されたい。
ＩＩ．Ｃ．１ ＩＬ２融合タンパク質のＩＬ２ポリペプチド
ＩＬ２融合体は、インターロイキン－２（ＩＬ２）ポリペプチドを含む第１のポリペプチドを含む。
一部の態様では、ＩＬ２融合タンパク質のＩＬ２ポリペプチドは、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ならびに家畜化哺乳動物または農業用哺乳動物などの哺乳動物をはじめとする、いずれかの脊椎動物供給源由来のネイティブまたは組み換えＩＬ２である。
用語ＩＬ２は、未プロセシングＩＬ２、ならびに、細胞中でのプロセシングから生じるＩＬ２のいずれかの形態（すなわち、ＩＬ２の成熟形態）を包含する。この用語はまた、ＩＬ２の天然に存在する変異体および断片、例えば、スプライシング変異体または対立遺伝子変異体、および天然に存在しない変異体も包含する。ヒトＩＬ２の例示的な成熟形態のアミノ酸配列（２０アミノ酸シグナル配列を有する）は、配列番号２に示される。未プロセシングヒトＩＬ２は、成熟ＩＬ２分子においては非存在であるＮ末端２０アミノ酸シグナルペプチドを追加的に含む（配列番号７）。マウスＩＬ２（２０アミノ酸シグナル配列を有する）の例示的な成熟形態のアミノ酸配列は、配列番号８に示される。未プロセシングマウスＩＬ２は、成熟ＩＬ２分子においては非存在であるＮ末端２０アミノ酸シグナルペプチドを追加的に含む（配列番号９）。「野生型ＩＬ２」とも称される「ネイティブＩＬ２」とは、天然に存在するＩＬ２または組み換えＩＬ２を意味する。
ＩＬ２の追加の核酸およびアミノ酸配列が公知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｑ７ＪＦＭ２［アオトゥス・レムリヌス（グレイベリードナイトモンキー）］；Ｑ７ＪＦＭ５［アオトゥス・ナンシマエ（マーズナイトモンキー）］；Ｐ０５０１６［バス・タウルス（ウシ）］；Ｑ２９４１６［カニス・ファミリアリス（イヌ）（カニス・ルプス・ファミリアリス）］；Ｐ３６８３５［カプラ・ヒルクス（ヤギ）］；およびＰ３７９９７［エクウス・カバルス（ウマ）］を参照されたい。
一部の態様では、融合タンパク質の第１のポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。
ＩＬ２の生物学的に活性な断片および変異体もまた提供される。そのようなＩＬ２の活性変異体または断片は、ＩＬ２活性を保持するであろう。ＩＬ２の生物学的活性とは、ＩＬ２受容体を担持するリンパ球を刺激する能力を意味することができる。そのような活性は、インビトロおよびインビボの両方で測定することができる。ＩＬ２は、免疫活性の包括的な調節因子であり、ここで見られる作用は、そのような活性の合計である。例えば、ＩＬ２は、生存活性を調節（ｉｔ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ）し（Ｂｃｌ－２）、Ｔエフェクター活性を誘導し（ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、およびパーフォリン）、かつＴ調節活性を促進する（ＦｏｘＰ３）。例えば、Malek et al., Immunity 33(2):153-65 (2010)を参照されたい。
ＩＬ２の生物学的に活性な変異体が公知である。例えば、米国特許出願公開第２００６／０２６９５１５号および同第２００６／０１６０１８７号ならびにＷＯ／１９９９／０６０１２８を参照されたい。
ＩＬ２の生物学的に活性な断片および変異体を、本明細書中に開示される融合タンパク質において利用することができる。そのような機能的断片は、配列番号２の少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むことができる。あるいは、機能的変異体は、配列番号２に示される配列に対する少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むことができる。
ＩＬ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの活性な変異体および断片がさらに提供される。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号２をコードするポリペプチドの少なくとも１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個の連続するヌクレオチドを含み、かつ引き続き、ＩＬ２活性を有するタンパク質をコードすることができる。あるいは、機能的ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ配列をコードするポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含み、かつ引き続き、機能的ＩＬ２ポリペプチドをコードすることができる。
ＩＬ２の例示的なポリペプチド配列が、以下の表１に列挙される。
一部の態様では、ＩＬ２ポリペプチドは、ネイティブＩＬ２（配列番号２）と比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化部位を有する。一部の態様では、少なくとも１箇所少ないグリコシル化部位は、グリコシル化を除去する１つまたは複数の突然変異に起因する。
一部の態様では、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有しないアミノ酸によるグリコシル化部位を有するアミノ酸の置換である突然変異を含む。一部の態様では、突然変異は、Ｏ－グリコシル化および／またはＮ－グリコシル化を除去する。一態様では、突然変異は、Ｏ－グリコシル化、例えば、配列番号２のアミノ酸３におけるトレオニンを除去する。別の態様では、突然変異は、Ｎ－グリコシル化を除去する。
一部の態様では、突然変異は、グリコシル化されないアミノ酸による、グリコシル化されるＩＬ２のアミノ酸の１つまたは複数の置換である。一部の態様では、突然変異は、近傍のアミノ酸でのグリコシル化を可能にしないアミノ酸による、近傍のアミノ酸でのグリコシル化を可能にするＩＬ２のアミノ酸の１つまたは複数の置換である。
一部の態様では、ＩＬ２のアミノ酸の１つまたは複数の置換は、アラニンから、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へのものである。
一部の態様では、ＩＬ２のアミノ酸の１つまたは複数の置換は、トレオニンから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へのものである。
一部の態様では、ＩＬ２のアミノ酸の１つまたは複数の置換は、反応性アミノ酸、例えば、システインから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へのものである。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、システインからセリンへのものである。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、システインからアラニンへのものである。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、システインからバリンへのものである。
一部の態様では、１つまたは複数の置換は、対応する配列番号２と比較して、ＩＬ２のアミノ酸Ｔ３でのものである。
一部の態様では、置換のうちの１つは、配列番号２のアミノ酸Ｃ１２５でのものである。一態様では、アミノ酸Ｃ１２５での置換は、Ｃ１２５Ｓ、Ｃ１２５Ａ、およびＣ１２５Ｖからなる群より選択される。
一部の態様では、突然変異は、欠失である。一部の態様では、欠失は、配列番号２のアミノ酸Ａ１でのものである。
本開示はまた、ＩＬ２ポリペプチドに対するいずれかの他の突然変異も含む。他の態様では、突然変異はまた、ＩＬ２の特性を改善する、例えば、ＩＬ２活性を改善する、ＩＬ２の半減期を改善する、安定性を改善する等の１つまたは複数の置換も含む。
本セクションにおいて以下に開示される通り、本明細書中に列挙される突然変異は、配列番号２のアミノ酸位置と比較した突然変異である。本発明に従えば、以下の突然変異のうちのいずれかを、単独で、または他の開示される突然変異もしくは当技術分野で公知のいずれかと組み合わせて、本明細書中に記載される通りのＩＬ２融合タンパク質のうちの１つまたは複数において用いることができるであろう。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｑ２２、Ｑ１２６、Ｉ１２９、Ｓ１３０、またはそれらのいずれかの組み合わせ、例えば、Ｑ２２Ｖ、Ｑ１２６Ａ、Ｉ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｇ、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、Carmenate et al., J Immunol, 200(10):3475-84 (2018)および／またはＵＳ８，７５９，４８６に開示される１つまたは複数の突然変異を含む。一部の態様では、ＩＬ２は、米国特許第８，７５９，４８６号Ｂ２に開示される通りのＬ１８Ｎ、Ｑ１２６Ｙ、およびＳ１３０Ｒのうちの１つまたは複数の突然変異を含む。一部の態様では、ＩＬ２は、米国特許第８，７５９，４８６号Ｂ２に開示される通りのＱ１３Ｙ、Ｑ１２６Ｙ、Ｉ１２９Ｄ、およびＳ１３０Ｒのうちの１つまたは複数の突然変異を含む。一部の態様では、ＩＬ２は、ＷＯ２０１８／０９１００３Ａ１に開示される通りのＫ３５Ｅ、Ｋ３５Ｄ、およびＫ３５Ｑのうちの１つまたは複数の突然変異を含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｒ３８における、Epstein et al. Blood, 101(12):4853-61 (2003)および／またはＵＳ７，３７１，３７１に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｒ３８Ｗを含む。一部の態様では、ＩＬ２は、Ｒ３８Ｗの突然変異および米国特許第７，３７１，３７１号Ｂ２に開示される通りのＩＬ２のアミノ酸位置２２～５８の外側の１つまたは複数の突然変異を含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)および／またはＵＳ８，９０６，３５６に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、アミノ酸残基９１、１２６、またはその両方、例えば、Ｖ９１Ｒ、Ｑ１２６Ｔ、またはその両方を含む。一部の態様では、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)およびまたＵＳ８，９０６，３５６に開示される通りのＥ１５Ｗの突然変異を含む。一部の態様では、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)およびまたＵＳ８，９０６，３５６に開示される通りのＮ８８ＲおよびＶ９１Ｒの一方または両方の突然変異を含む。一部の態様では、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)および／または米国特許第８，９０６，３５６号に開示される通りのＱ１２６ＴまたはＱ１２６Ｉの突然変異を含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸６９、７４、９１、１２６、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、米国特許第８，９０６，３５６号Ｂ２に開示される１つまたは複数の突然変異を含む。一部の態様では、突然変異は、米国特許第８，９０６，３５６号Ｂ２に開示される通りのＶ９１Ｒ、Ｑ１２６Ｔ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２７Ｔ、またはそれらのいずれかの組み合わせである。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｅ１５、Ｎ３０、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｓ７５、Ｎ９０、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、Wittrup et al., J Immunother 32(9):887-94 (2009)および／またはＵＳ７，５６９，２１５Ｂ２に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｎ３０Ｓ、Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ａ、Ｓ７５Ｐ、Ｎ９０Ｈ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の態様では、ＩＬ２は、Wittrup et al., Biochemistry 44(31) (2005)に開示される通りのＥ１５Ｗの突然変異を含む。一部の態様では、突然変異は、米国特許第７，５６９，２１５号Ｂ２に開示される通りのＶ６９Ａである。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｎ２９、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｎ８８、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、Wittrup et al., J Immunother. 32(9):887-94 (2009)および／または米国特許第７，９５１，３６０号Ｂ２に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｎ８８Ｄ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の態様では、ＩＬ２は、Wittrup et al., Biochemistry 44(31) (2005)に開示される通りのＥ１５Ｗの突然変異を含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸６９、７４、１２８、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、Wittrup et al., J Immunother. 32(9):887-94 (2009)および／または米国特許第８，３４９，３１１号Ｂ２に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｖ６９Ａ、Ｉ１２８Ｐ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｓ４、Ｔ１０、Ｑ１１、Ｖ６９、Ｎ８８、Ｔ１３３、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、Wittrup et al., J Immunother. 32(9):887-94 (2009)に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｓ４Ｐ、Ｔ１０Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｔ１３３Ａ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｎ３０、Ｖ６９、Ｉ１２８、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、Wittrup et al., J Immunother. 32(9):887-94 (2009)に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｉ１２８Ｔ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｋ８、Ｑ１３、Ｎ２６、Ｎ３０、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｖ６９、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、Wittrup et al., J Immunother. 32(9):887-94 (2009)に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｋ８Ｒ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ２６Ｄ、Ｎ３０Ｔ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ｒ、Ｖ６９Ａ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｎ８８における、Shanafelt et al., Nat Biotechnol. 18(11):1197-202 (2000)に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｎ８８Ｒを含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、米国特許第９，６１６，１０５号Ｂ２に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、アミノ酸２０、８８、１２６、またはそれらのいずれかの組み合わせ、例えば、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｇ、またはＮ８８Ｉを含む。一部の態様では、ＩＬ２は、米国特許第９，６１６，１０５号Ｂ２に開示される通りのＮ８８Ｒ、Ｎ８８Ｇ、またはＮ８８Ｉの突然変異を含む。一部の態様では、ＩＬ２は、米国特許第９，６１６，１０５号Ｂ２に開示される通りのＤ２０Ｈ、Ｄ２０Ｉ、またはＤ２０Ｙの突然変異を含む。一部の態様では、ＩＬ２は、米国特許第９，６１６，１０５号Ｂ２に開示される通りのＱ１２６Ｌの突然変異を含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、米国特許出願公開第２０１８／０１２５９４１号Ａ１に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｄ２０Ｈ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｒ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｆ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の態様では、ＩＬ２は、米国特許出願公開第２０１８／００３７６２４号Ａ１に開示される通りのＴ３Ａ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｒ、Ｄ２０Ｈ、Ｃ１２５Ｓ、Ｑ１２６Ｌ、およびＱ１２６Ｆの１つまたは複数の突然変異を含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｎ８８、Ｄ２０、Ｃ１２５、Ｑ１２６、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、米国特許出願公開第２０１７／０３２７５５５号Ａ１に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｒ、Ｄ２０Ｈ、Ｃ１２５Ｓ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｆ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｄ１０９、Ｃ１２５、またはその両方における、ＷＯ２０１６／０２５３８５Ａ１に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｄ１０９Ｃ、Ｃ１２５Ｓ、またはその両方を含む。一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｄ２０、Ｎ８８、Ｑ１２６、Ｃ１２５、Ｑ１２６、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、ＷＯ２０１６／０２５３８５Ａ１に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｄ２０Ｈ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｒ、Ｑ１２６Ｌ、Ｃ１２５Ｓ、Ｑ１２６Ｆ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｌ１２、Ｑ１３、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｍ２３、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｅ９５、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、ＷＯ２０１６／１６４９３７Ａ１に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｅ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｅ９５Ｇ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸残基Ｖ９１における、米国特許第９，９３２，３８０号Ｂ２または同第９，５８０，４８６号に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｖ９１Ｋを含む。一部の態様では、ＩＬ２は、Ｃ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓの突然変異をさらに含む。一部の態様では、ＩＬ２は、Ｔ３での突然変異をさらに含む。一部の態様では、Ｔ３での突然変異は、Ｔ３ＡまたはＴ３Ｎのうちの一方である。一部の態様では、ＩＬ２は、Ｓ５での突然変異を含む。一部の態様では、突然変異は、Ｓ５Ｔである。
一部の態様では、ＩＬ２は、米国特許第９，７３２，１３４号Ｂ２に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｑ２２、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２６０号Ａ１に開示される１つまたは複数の突然変異、例えば、Ｎ８８Ｄを含む。一部の態様では、ＩＬ２は、例えば、アミノ酸４２、４５、７２、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける、米国特許第９，２６６，９３８号Ｂ２に開示される突然変異、例えば、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、またはＬ７２Ｋを含む。一部の態様では、ＩＬ２は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、およびＦ４２Ｋの突然変異を含む。一部の態様では、ＩＬ２は、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、およびＹ４５Ｋの突然変異を含む。
一部の態様では、ＩＬ２は、１～４箇所の突然変異を含む：Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、またはＬ７２Ｋの第１の突然変異、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、またはＦ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、またはＹ４５Ｋの第２の突然変異、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ、またはＴ３Ｐの第３の突然変異、および／またはＣ１２５Ａ、Ｃ１２５Ｓ、Ｃ１２５ＴまたはＣ１２５Ｖの第４の突然変異。本明細書中に列記されるかまたは本明細書中に引用される特許、特許公報もしくはいずれかの他の参考文献中に開示される突然変異は、それらの全体で参照により本明細書中に組み入れられる。
ＩＩ．Ｃ．２．ＩＬ２融合タンパク質のＩＬＲ２αポリペプチド
融合タンパク質は、インターロイキン－２受容体α（ＩＬ２Ｒα）の細胞外ドメインを含む第２のポリペプチドを含む。
一部の態様では、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、第２のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、第２のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。
用語「ＣＤ２５」または「ＩＬ２受容体ａ」、「ＩＬ２Ｒα」、「ＩＬ２Ｒａ」、「ＩＬ２－Ｒα」、および「ＩＬ２－Ｒａ」とは、本明細書中で用いる場合、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ならびに家畜化哺乳動物または農業用哺乳動物などの哺乳動物をはじめとする、いずれかの脊椎動物供給源由来のいずれかのネイティブまたは組み換えＩＬ２Ｒαを意味する。この用語はまた、ＩＬ２Ｒαの天然に存在する変異体、例えば、スプライシング変異体もしくは対立遺伝子変異体、または天然に存在しない変異体も包含する。ヒトＩＬ２は、その受容体システムであるＩＬ２Ｒを通したシグナル伝達を介してその生物学的作用を発揮する。ＩＬ２およびその受容体（ＩＬ２Ｒ）は、Ｔ細胞増殖および免疫応答に関して極めて重要である他の基本的な機能に必要とされる。ＩＬ２Ｒは、α（ｐ５５）、β（ｐ７５）、およびγ（ｐ６５）鎖である３つの非共有的に連結されたＩ型膜貫通タンパク質からなる。ヒトＩＬ２Ｒα鎖は、２１９アミノ酸の細胞外ドメイン、１９アミノ酸の膜貫通ドメイン、および１３アミノ酸の細胞内ドメインを含む。ＩＬ２Ｒアルファ（ＩＬ２Ｒα）の分泌される細胞外ドメインは、本明細書中に記載される融合タンパク質において利用することができる。
ヒトＩＬ２Ｒαの例示的な成熟形態のアミノ酸配列は、配列番号１０に示される。未プロセシングヒトＩＬ２Ｒαは、配列番号１１に示される。配列番号１１および／または配列番号１０の細胞外ドメインは、配列番号１に示される。マウスＩＬ２Ｒαの例示的な成熟形態のアミノ酸配列は、配列番号１２に示される。未プロセシングマウスＩＬ２Ｒαは、配列番号１３に示される。配列番号１３および／または配列番号１２の細胞外ドメインは、配列番号１４に示される。「野生型ＩＬ２Ｒα」とも称される「ネイティブＩＬ２Ｒα」とは、天然に存在するＩＬ２Ｒαまたは組み換えＩＬ２Ｒαを意味する。
ＩＬ２Ｒαに関する核酸およびアミノ酸配列が公知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１０３０５９７．１［ナミチンパンジー（Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）］；ＮＰ＿００１０２８０８９．１［アカゲザル（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ）］；ＮＭ＿００１００３２１１．１［オオカミ（Ｃ．ｌｕｐｕｓ）］；ＮＰ＿７７６７８３．１［家畜ウシ（Ｂ．ｔａｕｒｕｓ）］；ＮＰ＿０３２３９３．３［ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）］；およびＮＰ＿０３７２９５．１［ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）］を参照されたい。
ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインとは、本明細書中で用いる場合、別途明記されない限り、ＩＬ２に対する結合性における正常な役割において機能的なＩＬ２Ｒα細胞外（ＥＣ）ドメインを意味する。用語「ＩＬ２ＲαＥＣドメイン」は、ＩＬ２結合性における全長野生型ＩＬ２ＲαＥＣの機能を保持するその機能的断片、変異体、アナログ、または誘導体を含む。ＩＬ２ＲαＥＣドメインは、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはネズミＩＬ２ＲαＥＣドメインであり得る。語句「ＩＬ２ＲαＥＣドメインの生物学的活性」とは、ＩＬ２ＲαのＥＣドメインの生物学的活性のうちの１つまたは複数を意味し、限定するものではないが、ＩＬ２受容体応答性細胞における細胞内シグナル伝達を強化する能力を含む。ＩＬ２ＲαＥＣドメインの生物学的に活性な断片および変異体の非限定的な例は、例えば、Robb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5654-8 (1988)に開示される。一部の態様では、本明細書中に開示されるＩＬ２ＲαＥＣドメインの生物学的に活性な断片および変異体は、ネイティブＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインと比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を含む。
ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインの生物学的に活性な断片および変異体を、本明細書中に開示される融合タンパク質において利用することができる。そのような機能的断片は、配列番号１のうちのいずれか１つの細胞外ドメインの少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２１５個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むことができる。あるいは、機能的変異体は、配列番号１に示される配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むことができる。
ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの活性な変異体および断片が、さらに提供される。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１をコードするポリペプチドの少なくとも１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含み、かつ引き続き、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン活性を有するタンパク質をコードすることができる。あるいは、機能的ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ配列をコードするポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含み、かつ引き続き、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン活性を有するタンパク質をコードすることができる。
ＩＬ２Ｒαの例示的なポリペプチド配列が、表２に列挙される。
一部の態様では、本明細書中に提供される融合タンパク質は、ＩＬ２ＲαのＥＣドメイン内に少なくとも１箇所の突然変異を含むことができる。
一部の態様では、ＩＬ２ＲαポリペプチドのＥＣドメインは、ネイティブＩＬ２Ｒα（配列番号１）の細胞外ドメインと比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化、少なくとも２箇所少ないグリコシル化、少なくとも３箇所少ないグリコシル化、少なくとも４箇所少ないグリコシル化、少なくとも５箇所少ないグリコシル化、少なくとも６箇所少ないグリコシル化、少なくとも７箇所少ないグリコシル化、少なくとも８箇所少ないグリコシル化、または少なくとも９箇所少ないグリコシル化を有する。
一部の態様では、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有するＩＬ２ＲαポリペプチドのＥＣドメインは、グリコシル化を除去する突然変異を含む。他の態様では、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有しないアミノ酸によるグリコシル化部位を有するアミノ酸の置換である突然変異を含む。一部の態様では、突然変異は、Ｏ－グリコシル化および／またはＮ－グリコシル化を除去する。一態様では、突然変異は、Ｏ－グリコシル化を除去する。別の態様では、突然変異は、Ｎ－グリコシル化を除去する。
一部の態様では、融合タンパク質中の突然変異は、ＩＬ２ＲαのＣ末端端部の欠失を含む。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１６７～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１６８～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１６９～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１７０～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１７１～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１７２～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１７３～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１７４～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１７５～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１７６～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１７７～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１７８～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１７９～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１８０～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１８１～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１８２～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１８３～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１８４～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１８５～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１８６～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１８７～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１８８～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１８９～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１９０～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１９１～２１９の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１のアミノ酸１９２～２１９の欠失である。
一部の態様では、突然変異は、配列番号１に対応する、１６７、１６８、１６９または１７１から１９２～２１９までのアミノ酸の欠失である。一部の態様では、突然変異は、配列番号１に対応する、１７０～２１９の欠失を含まない。
一部の態様では、第２のポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなる。他の態様では、第２のポリペプチドは、配列番号４および＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８、＋１９、＋２０、＋２１、＋２２、＋２３、＋２４、または＋２５個のアミノ酸を含むか、本質的にからなるか、またはからなる。一部の態様では、第２のポリペプチドは、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個以下のアミノ酸を含む配列番号４を含むか、本質的にからなるか、またはからなる。一部の態様では、第２のポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなる。
一部の態様では、融合タンパク質は、１つまたは複数の突然変異を含む。一部の態様では、１つまたは複数の突然変異は、グリコシル化されないアミノ酸によるグリコシル化されるＩＬ２Ｒαのアミノ酸の１つまたは複数の置換である。
一部の態様では、ＩＬ２Ｒαのアミノ酸の１つまたは複数の置換は、アミノ酸Ｎ４９、アミノ酸Ｎ６８、アミノ酸Ｔ７４、アミノ酸Ｔ８５、アミノ酸Ｔ１９７、アミノ酸Ｔ２０３、アミノ酸Ｔ２０８、およびアミノ酸Ｔ２１６、またはそれらのいずれかの組み合わせでのものであり、ここで、アミノ酸位置は、配列番号１に対応する。
一部の態様では、１つまたは複数の置換は、アスパラギンから別のアミノ酸へのものである。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、アスパラギンから、アラニン、トレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へのものである。
一部の態様では、１つまたは複数の置換は、トレオニンから別のアミノ酸へのものである。一部の態様では、１つまたは複数の置換は、トレオニンから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へのものである。
一部の態様では、置換は、配列番号１のアミノ酸Ｎ４９である。一部の態様では、配列番号１のアミノ酸Ｎ４９は、アラニン、トレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換は、配列番号１のアミノ酸Ｎ６８である。一部の態様では、配列番号１のアミノ酸Ｎ６８は、アラニン、トレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換は、配列番号１のアミノ酸Ｔ７４である。一部の態様では、配列番号１のアミノ酸Ｔ７４は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換は、配列番号１のアミノ酸Ｔ８５である。一部の態様では、配列番号１のアミノ酸Ｔ８５は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換は、配列番号１のアミノ酸Ｔ１９７である。一部の態様では、配列番号１のアミノ酸Ｔ１９７は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換は、配列番号１のアミノ酸Ｔ２０３である。一部の態様では、配列番号１のアミノ酸Ｔ２０３は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換は、配列番号１のアミノ酸Ｔ２０８である。一部の態様では、配列番号１のアミノ酸Ｔ２０８は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換は、配列番号１のアミノ酸Ｔ２１６である。一部の態様では、配列番号１のアミノ酸Ｔ２１６は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、融合タンパク質は、１つまたは複数の突然変異を含む。一部の態様では、１つまたは複数の突然変異は、近傍のアミノ酸でのグリコシル化を可能にしないアミノ酸による、近傍のアミノ酸でのグリコシル化を可能にするＩＬ２Ｒαのアミノ酸の１つまたは複数の置換である。
一部の態様では、置換は、アミノ酸Ｓ５０、アミノ酸Ｓ５１、アミノ酸Ｔ６９、アミノ酸Ｔ７０、アミノ酸Ｃ１９２、またはそれらのいずれかの組み合わせでのものであり、ここで、アミノ酸位置は、配列番号１に対応する。
一部の態様では、置換は、配列番号１に対応するアミノ酸Ｓ５０である。一部の態様では、配列番号１に対応するアミノ酸Ｓ５０は、プロリンへと突然変異される。
一部の態様では、置換は、配列番号１に対応するアミノ酸Ｓ５１である。一部の態様では、配列番号１に対応するアミノ酸Ｓ５１は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換は、配列番号１に対応するアミノ酸Ｔ６９である。一部の態様では、配列番号１に対応するアミノ酸Ｔ６９は、プロリンへと突然変異される。
一部の態様では、置換は、配列番号１に対応するアミノ酸Ｔ７０である。一部の態様では、配列番号１に対応するアミノ酸Ｔ７０は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
一部の態様では、置換は、配列番号１に対応するアミノ酸Ｃ１９２である。一部の態様では、配列番号１に対応するアミノ酸Ｃ１９２は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸へと突然変異される。
ＩＩ．Ｃ．３．ＩＬ２融合タンパク質のリンカー
本開示の融合タンパク質は、リンカーをさらに含むことができる。一部の態様では、リンカーは、Ｎ末端からＣ末端へと、第１のポリペプチドを第２のポリペプチドに連結することができ、例えば、Ｎ－ＩＬ２－リンカー－ＩＬ２ＲαＥＣ－Ｃである。他の態様では、リンカーは、Ｎ末端からＣ末端へと、第２のポリペプチドを第１のポリペプチドに連結することができ、例えば、Ｎ－ＩＬ２ＲαＥＣ－リンカー－ＩＬ２－Ｃである。
一態様では、ＩＬ２融合タンパク質は、ＩＬ２ポリペプチドとＩＬ２Ｒαポリペプチドとの間に位置するリンカー配列を含む。リンカーは、いずれかの長さであり得、かつ少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、５０個、もしくは６０個またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。他の態様では、本開示のために有用なリンカーは、少なくとも１個のアミノ酸かつ１００個未満のアミノ酸、９０個未満のアミノ酸、８０個未満のアミノ酸、７０個未満のアミノ酸、６０個未満のアミノ酸、５０個未満のアミノ酸、４０個未満のアミノ酸、３０個未満のアミノ酸、２０個未満のアミノ酸、１９個未満のアミノ酸、１８個未満のアミノ酸、１７個未満のアミノ酸、１６個未満のアミノ酸、１５個未満のアミノ酸、１４個未満のアミノ酸、１３個未満のアミノ酸、または１２個未満のアミノ酸を有する。一態様では、リンカー配列は、グリシンアミノ酸残基を含む。他の例では、リンカー配列は、グリシンおよびセリンアミノ酸残基の組み合わせを含む。
一部の態様では、融合タンパク質は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間にインフレームで融合されたリンカーを含む。一部の態様では、融合タンパク質は、グリシン／セリンリンカーであるリンカーを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ａ ｌｉｎｋｅｒ ｉｓ ａ ｇｌｙｃｉｎｅ／ｓｅｒｉｎｅ ｌｉｎｋｅｒ）。そのようなグリシン／セリンリンカーは、限定するものではないが、ペプチドＧＧＧＳ（配列番号１５）もしくはＧＧＧＧＳ（配列番号１６）またはこれらの所与のペプチドの１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回もしくはそれ以上の反復を含むその反復をはじめとする、アミノ酸残基のいずれかの組み合わせを含むことができる。本明細書中に開示されるグリシン／セリンリンカーは、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、または（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列を含み、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の整数である。一態様では、リンカー配列は、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号６）［（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３とも記載される］を含む。別の態様では、リンカー配列は、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１７）［（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４とも記載される］を含む。他の態様では、リンカー配列は、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）（配列番号１８）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）（配列番号１９）、または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）７（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）（配列番号２０）のうちの１つを含む。他の態様では、リンカー配列は、配列番号２１に示される通りの（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む。追加の態様では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２２）［（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４とも記載される］；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）［（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５とも記載される］；（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２４）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２５）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２６）；（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２７）；または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２８）を含む。
ＩＩ．Ｃ．４．ＩＬ２融合タンパク質の異種部分
本開示の融合タンパク質は、追加のエレメント、例えば、異種部分をさらに含むことができる。そのようなエレメントは、融合タンパク質の発現を助け、融合タンパク質の分泌を助け、融合タンパク質の安定性を改善し、タンパク質のより効率的な精製を可能にし、かつ／または融合タンパク質の活性を修飾することができる。一部の態様では、異種部分は、ポリペプチド部分である。他の態様では、異種部分は、非ポリペプチド部分である。
一部の態様では、融合タンパク質は、第１のポリペプチドに融合された異種部分を含む。一部の態様では、融合タンパク質は、第２のポリペプチドに融合された異種部分を含む。一部の態様では、融合タンパク質は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドに融合された異種部分を含む。
一部の態様では、本明細書中に開示される融合タンパク質は、１つまたは複数の追加の異種部分を含む。一部の態様では、異種部分は、半減期延長部分である。一部の態様では、異種部分は、アルブミン、免疫グロブリン定常領域またはその一部分、免疫グロブリン結合性ポリペプチド、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、アルブミン結合性ポリペプチド（ＡＢＰ）、ＰＡＳ化部分、ＨＥＳ化部分、ＸＴＥＮ、ＰＥＧ化部分、Ｆｃ領域、およびそれらのいずれかの組み合わせを含む。
本開示に従って用いることができる異種部分の例は、それらのそれぞれが参照により本明細書中に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１９／０３５９６７２号Ａ１および同第２０１９／０３００５９２号Ａ１に開示される。
ＩＩ．Ｃ．５．例示的なＩＬ２融合タンパク質
一部の態様では、融合タンパク質は、配列番号２９；配列番号５；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；および配列番号３４のうちのいずれか１つ、または米国特許出願公開第２０１９／０３５９６７２号Ａ１および同第２０１９／０３００５９２号Ａ１の表３に列挙される通りの配列のうちのいずれか１つを含む。
一部の態様では、融合タンパク質は、以下の表３に列挙される通りの配列番号２９；配列番号５；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４のうちのいずれか１つを含み、かつ／または融合タンパク質は、米国特許出願公開第２０１９／０３５９６７２号Ａ１および同第２０１９／０３００５９２号Ａ１の表３に列挙される通りの配列のうちのいずれか１つを含む。
Figure 2023548311000004
ＩＬ２／ＩＬ－Ｒａ ＥＣドメイン融合タンパク質の成熟形態および未プロセシング形態の生物学的に活性な断片および変異体、ならびにそれをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。そのような機能的ポリペプチド断片は、配列番号：配列番号２９；配列番号５；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；および配列番号３４のうちのいずれか１つの少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むことができる。あるいは、機能的ポリペプチド変異体は、配列番号：配列番号２９；配列番号５；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；および配列番号３４に示される配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むことができる。
ＩＬ２／ＩＬ－Ｒａ細胞外ドメイン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの活性な変異体および断片が、さらに提供される。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号：配列番号２９；配列番号５；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；および配列番号３４に示されるポリペプチドをコードする少なくとも１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、１０００個、１１００個、１２００個、１３００個、１５００個、１８００個、２０００個の連続するヌクレオチドを含み、かつ引き続き、機能的ＩＬ２／ＩＬ－Ｒａ細胞外ドメイン融合タンパク質をコードすることができる。
一部の態様では、本開示の融合タンパク質は、配列番号２９；配列番号５；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；および配列番号３４のうちのいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。
本開示のＩＬ２融合タンパク質は、１つまたは複数の以下の特性／活性を有することができる：（１）調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を増加させることおよび／または低用量ＩＬ２に基づく療法において免疫寛容を増加させること；（２）比較的高用量の療法において免疫応答およびメモリーを増加させること；（３）組み換えＩＬ２と比較した場合にＩＬ２利用可能性を増加させること；ならびに／または（４）インビボにおいてＩＬ２Ｒ担持リンパ球の持続性ＩＬ２刺激を増加させること。
一態様では、本明細書中に開示される融合タンパク質は、ＩＬ２（配列番号２）または配列番号２９（切断を伴わずに１２ｍｅｒリンカーを含むｗｔＩＬ２－ＣＤ２５配列）からなるポリペプチドの薬物動態特性と比較して、増加した半減期、増加したＣｍａｘ、増加した濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）、増加したＣｍｉｎ、減少したクリアランス、改善したバイオアベイラビリティ、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の薬物動態特性を含む。
一態様では、本明細書中に開示される融合タンパク質は、ＩＬ２（配列番号２）または配列番号２９（切断を伴わずに１２ｍｅｒリンカーを含むｗｔＩＬ２－ＣＤ２５配列）と比較して延長した半減期を有する。一部の態様では、延長した半減期は、ＩＬ２（配列番号２）または配列番号２９（いかなる切断も伴わずに１２ｍｅｒリンカーを含むｗｔＩＬ２－ＣＤ２５配列）からなるポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、または少なくとも約２２倍である。
一部の態様では、ＩＬ２融合タンパク質からもたらされるＴｒｅｇの増加した活性は、例えば、（１）ＣＤ４＋Ｔ細胞区画におけるＴｒｅｇの増加した提示および個数；（２）ＩＬ２依存性ＣＤ２５のアップレギュレーション；（３）増殖マーカーＫｉ６７の発現により評価される場合の増加した増殖；および（４）ＩＬ２依存性最終分化型Ｋｌｒｇ１＋Ｔｒｅｇサブセットの増加した画分をはじめとする、様々な方法においてアッセイすることができる。Ｔｒｅｇに対するそのような作用は、例えば、脾臓および／または炎症膵臓において、見ることができる。
一部の態様では、本開示のＩＬ２融合タンパク質は、Ｔエフェクター／メモリー応答を増加させることを通して寛容原性および免疫抑制性Ｔｒｅｇおよび免疫を増加させ、かつ、さらなる態様では、（１）ネイティブもしくは組み換えＩＬ２と比較してＩＬ２活性の低い有効レベル；および／または（２）ネイティブもしくは組み換えＩＬ２よりも多くの持続性生物学的応答を提示することにおいて、そのような応答を送達することにより、改善された薬物動態を示す。
一部の態様では、融合タンパク質は、ネイティブまたは組み換えＩＬ２よりも改善された活性を有する。例えば、ＩＬ２融合タンパク質の作用は、ネイティブまたは組み換えＩＬ２と比較して、約２分の１、５分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１、１５０分の１、２００分の１またはそれより低いレベルのＩＬ２活性において寛容原性Ｔｒｅｇを増加させることができる。他の態様では、ＩＬ２融合タンパク質は、Ｔｒｅｇの持続的増強および関連する特性の誘導において、ネイティブまたは組み換えＩＬ２よりも効果的である。
本明細書中に開示されるＩＬ２融合タンパク質の構成要素はいかなる順序でも見出すことができることがさらに認識される。一態様では、ＩＬ２ポリペプチドはＮ末端にあり、かつＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインは融合タンパク質のＣ末端にある。
一部の態様では、融合タンパク質は、二量体を形成する。他の態様では、融合タンパク質は、単量体である。さらに、一部の態様では、二量体は２つの単量体を含み、かつ単量体は、共有結合を介して互いに会合される。一部の態様では、二量体は２つの単量体を含み、かつ単量体は、非共有結合を介して会合される。
本開示の一部の態様では、融合タンパク質は、ＩＬ２（配列番号２）または配列番号２９（切断を伴わずに１２ｍｅｒリンカーを含むｗｔＩＬ２－ＣＤ２５配列）からなるポリペプチドよりも安定である。一部の態様では、融合タンパク質は、（ｉ）参照タンパク質と比較して増加した熱力学安定性；（ｉｉ）参照タンパク質と比較して増加したＴＭ；（ｉｉｉ）参照タンパク質と比較して増加した分解に対する耐性：（ｉｖ）参照タンパク質と比較して増加した修飾に対する耐性；（ｖ）参照タンパク質と比較して増加したインビボでの安定性；および（ｖｉ）それらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の特性を有し、ここで、参照タンパク質は、（ｉ）インターロイキン－２（ＩＬ２）ポリペプチドを含む第１のポリペプチド；および（ｂ）インターロイキン－２受容体α（ＩＬ２Ｒα）ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のポリペプチドを含み；かつ融合タンパク質と比較して少なくとも１箇所多くのグリコシル化を有する。
本明細書中に開示される融合タンパク質のグリコシル化部位のうちのいずれかを、他のメカニズムにより除去することができる。一部の態様では、融合タンパク質は、酵素的または化学的に脱グリコシル化される。一部の態様では、融合タンパク質は、アルカリ、ヒドラジン分解、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＨ（エンドＨ）、Ｏ－グリコシダーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせにより脱グリコシル化される。
一部の態様では、融合タンパク質の１つまたは複数のグリコシル化部位の除去は、アルカリを用いる融合タンパク質の処理により達成される。一部の態様では、グリカンが、アルカリ水素化ホウ素処理により、グリコシル化されたポリペプチドから除去される。他の態様では、本明細書中に開示される融合タンパク質のグリコシル化部位は、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウムなどのアルカリ金属炭酸塩を用いて除去することができる。一部の態様では、アルカリは、β脱離処理のために用いられる。
一部の態様では、融合タンパク質の１つまたは複数のグリコシル化部位の除去は、ヒドラジン分解を用いる融合タンパク質の化学的処理により達成される。一態様では、グリコシル化は、融合タンパク質をヒドラジン分解に供することにより、本明細書中に開示される融合タンパク質から放出され、かつ放出された糖鎖は、２－アミノピリジンを用いる蛍光標識に供される。Hase et al. J. Biochem. 95:197 (1984)を参照されたい。一部の態様では、ヒドラジン分解は、Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｙｓｔｅｍｓにより供給される機器（ＧｌｙｃｏＰｒｅｐ１０００）を用いて行われる。
別の態様では、融合タンパク質の１つまたは複数のグリコシル化部位の除去は、融合タンパク質をトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）へと供することにより達成される。
一部の態様では、融合タンパク質の１つまたは複数のグリコシル化部位の除去は、酵素を用いる融合タンパク質の処理により達成される。一部の態様では、酵素はグリコシダーゼである。一部の態様では、融合タンパク質の１つまたは複数のグリコシル化部位の除去は、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）を用いて達成される。ＰＮＧアーゼＦの濃度は変えることができ、実験的に決定されるべきである。一部の態様では、グリコシダーゼは、ＰＮＧアーゼＦである。ＰＮＧアーゼＦは、市販の酵素である（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ、カタログ番号Ｐ０７０４またはＰ０７１０）。一部の態様では、ＰＮＧアーゼＦは、融合タンパク質である。例えば、ＰＮＧアーゼＦは、キチン結合性ドメイン（ＣＢＤ）によってタグ付けされたＰＮＧアーゼＦまたはＰＮＧアーゼＦ－ＳＮＡＰ融合タンパク質であり得る。一部の態様では、グリコシダーゼは、凍結乾燥される。一部の態様では、グリコシダーゼは、凍結乾燥されたＰＮＧアーゼＦである。一部の態様では、グリコシダーゼは、動物由来試薬を実質的に含まない。
一部の態様では、融合タンパク質の１つまたは複数のグリコシル化部位の除去は、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＨ（エンドＨ）を用いる融合タンパク質の処理により達成される。エンドＨは、ストレプトマイセス・プリカツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌｉｃａｔｕｓ）および少数の他のストレプトマイセス属菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｅｃｉｅｓ）により分泌されるグリコヒドロラーゼである（Tarentino et al., 1976）。エンドＨは、オリゴ糖のＮ－アセチルグルコサミンコアのβ－１，４－グリコシド結合を切断し、１個のＮ－アセチルキトビオースが糖タンパク質のアスパラギン残基に連結されたままにする（Trimble et al., 1978；Muramatsu 1971）。Ｓ．プリカツスのエンドＨ遺伝子は９３９ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ２６７３８．１）であり、２８．９ｋＤａタンパク質をコードする。Ｓ．プリカツス由来のエンドＨが、近年ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現され、Ｐ．パストリス産生エンドＨの脱グリコシル化活性が、共発酵および発酵後処理の両方を介して、インビトロで実証された（Wang et al., 2015）。
一部の態様では、融合タンパク質の１つまたは複数のグリコシル化部位の除去は、Ｏ－グリコシダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ）を用いる融合タンパク質の処理により達成される。エンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼとも称されるＯ－グリコシダーゼ（Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）は、糖タンパク質からのコア１およびコア３ Ｏ連結二糖の除去を触媒する。一部の態様では、Ｏ－グリコシダーゼは、糖タンパク質から未置換Ｓｅｒ－およびＴｈｒ－連結を放出する。
融合タンパク質の１つまたは複数のグリコシル化部位の除去は、ＩＬ２タンパク質が細胞培養（例えば、バイオリアクター）において産生された後、ＩＬ２融合タンパク質が細胞培養において産生される間、融合タンパク質が回収された後、および／または融合タンパク質が精製されている間に、達成することができる。一部の態様では、１つまたは複数のグリコシル化部位の除去は、融合タンパク質が発現されている間、細胞培養中に１つまたは複数の除去剤を添加することにより、達成することができる。他の態様では、１つまたは複数のグリコシル化部位の除去は、グリコシル化を除去するかまたは低減されたグリコシル化を有する宿主細胞としての特定の細胞タイプ［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはストレプトマイセス属菌種］を選択することにより、達成することができる。特定の態様では、１つまたは複数のグリコシル化部位の除去は、融合タンパク質をコードする遺伝子を、１つまたは複数のグリコシル化を除去する酵素をコードする遺伝子と共に共発現させることにより、達成される。
ＩＩ．Ｄ．ＩＬ２融合タンパク質を含む医薬組成物
一部の態様では、ＩＬ２融合タンパク質は、ＩＬ２融合タンパク質ならびに１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または安定化剤を含む医薬組成物の一部分として対象に投与される。
本明細書中で用いる場合、単語「薬学的に許容される担体」は、薬剤投与に適合する、いずれかおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。いずれかの慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物中のその使用が考慮される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。
本開示の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合性であるように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、および経粘膜が挙げられる。加えて、治療を必要とする領域へと局所的に医薬組成物の治療用量を投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、外科手術中の限局性もしくは局所注入もしくは灌流、局所適用、注入、カテーテル、坐剤、またはインプラント［例えば、シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）メンブレンまたはファイバーなどのメンブレンをはじめとする、多孔性、非多孔性、またはゲル状材料から形成されるインプラント］などにより、達成することができる。別の態様では、医薬組成物の治療用量は、リポソームなどの媒体中で送達される［例えば、Langer, Science 249:1527-33 (1990)およびTreat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., pp. 353-65, 1989を参照されたい］。
また別の態様では、医薬組成物の治療用量は、制御放出システムにおいて送達することができる。一例では、ポンプを用いることができる［例えば、Langer, Science 249:1527-33 (1990)；Sefton, Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-40 (1987)；Buchwald et al., Surgery 88:507-16 (1980)；Saudek et al., N Engl. J Med. 321:574-79 (1989)を参照されたい］。別の例では、ポリマー材料を用いることができる［例えば、Levy et al., Science 228:190-92 (1985)；During et al., Ann. Neural. 25:351-56 (1989)；Howard et al., J Neurosurg. 71:105-12 (1989)を参照されたい］。Ｌａｎｇｅｒ［Science 249:1527-33 (1990)］により議論されるものなどの他の制御放出システムもまた、用いることができる。
許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、利用される投与量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、かつ緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンをはじめとする抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウム塩化物、ベンゼトニウム塩化物；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノース、またはデキストリンをはじめとする単糖、二糖、および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
非経口調製物において用いられる薬学的に許容される担体は、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張化剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔薬、懸濁化剤および分散化剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート剤および他の薬学的に許容される物質を含む。水性媒体の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、無菌水注射液、デキストロースおよび乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。非水性非経口媒体としては、植物起源の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油およびラッカセイ油が挙げられる。静菌性または静真菌性濃度における抗微生物剤を、複数用量容器中に包装される非経口調製物に添加することができ、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、ベンザルコニウム塩化物およびベンゼトニウム塩化物を含む。等張化剤としては、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。緩衝剤としては、リン酸塩およびクエン酸塩が挙げられる。抗酸化剤としては、硫酸水素ナトリウムが挙げられる。局所麻酔薬としては、塩酸プロカインが挙げられる。懸濁化剤および分散化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤としては、ポリソルベート８０［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］が挙げられる。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤としては、ＥＤＴＡが挙げられる。医薬担体としては、水混和性媒体に関してエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール；ならびにｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸もまた挙げられる。
非経口、皮内、または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁物は、以下の成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ）、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および等張性の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジ、または複数用量バイアル中に封入することができる。
注入可能な用途のために好適な医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性である場合）または分散液および無菌注入可能溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。静脈内投与に関して、好適な担体としては、生理食塩水、静菌性水、クレモホールＥＬＳ（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合で、組成物は無菌でなければならず、かつ容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール［例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）グリコールなど］、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することにより、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適正な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより、達成することができる。多くの場合に、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましいであろう。注入可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることにより、もたらすことができる。
無菌注入可能溶液は、上記に列挙された成分のうちの１つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒中に、必要とされる量で活性化合物を組み込み、必要な場合、続いて、ろ過滅菌することにより、調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒および上記に列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する無菌媒体へと活性化合物を組み込むことにより、調製される。無菌注入可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、以前に滅菌ろ過されたその溶液から有効成分およびいずれかの追加的な望ましい成分の粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。
吸入による投与に関して、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などの気体が入った加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。全身性投与はまた、経粘膜または経皮手段によるものでもあり得る。
経粘膜または経皮投与に関して、浸透させようとしている障壁に対して適切な浸透剤が、製剤中に用いられる。そのような浸透剤は、当技術分野で一般的に公知であり、かつ、例えば、経粘膜投与に関して、デタージェント、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与に関して、活性化合物は、当技術分野で一般的に公知である通り、軟膏剤、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤へと製剤化される。化合物はまた、坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの慣用の坐剤基剤を用いて）または直腸デリバリーのための停留浣腸の形態でも調製することができる。
一態様では、活性化合物は、身体からの迅速な排出に対して化合物を保護するであろう担体を用いて調製され、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化デリバリーシステムをはじめとする制御放出製剤である。生分解性生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを用いることができる。そのような製剤の調製のための方法は、当業者に明らかであろう。材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃから商業的に入手することができる。リポソーム懸濁物もまた、薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される通り、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位投与剤型において経口または非経口組成物を製剤化することが、特に有利である。単位投与剤型とは、本明細書中で用いる場合、必要な薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるために算出される活性化合物の予め決定された量を各単位が含有する、治療しようとしている対象への単位的投与量として適した物理的に分離した単位を意味する。本開示の単位投与剤型に関する仕様は、活性化合物の固有の特性および達成しようとしている特定の治療効果、ならびに個体の治療のためにそのような機能的化合物を配合する技術に内在する制限により決定付けられ、かつそれらに直接的に依存する。医薬組成物は、投与のための説明書と共に、容器、包装、またはディスペンサー中に含められることができる。
本開示の実施は、別途示されない限り、当技術分野の技能の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の慣用の技術を利用するであろう。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II；Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation；Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)；Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155；Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)；Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV；Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); )；Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications, 2nd Ed. CRC Press (2007)およびAusubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)を参照されたい。
上記で引用された参考文献のうちのすべて、ならびに本明細書中で引用されるすべての参考文献およびアミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号および／またはＵｎｉｐｒｏｔ番号）は、それらの全体で参照により本明細書中に組み入れられる。
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されるのではない。
ＩＩＩ．実施例
ＩＩＩ．Ａ．ＢＭＳ－９８６３２６の非臨床研究
非臨床的薬理学
ＢＭＳ－９８６３２６の生化学的および生物物理学的特性決定は、ＢＭＳ－９８６３２６が、主に自己遮断性ホモ二量体として存在し、３７℃においてインビトロで約３日間の解離半減期および１ｐＭの推定上の解離定数（Ｋｄ）を有することを示した。ヒト、カニクイザル、マウス、およびラットＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）に対するＢＭＳ－９８６３２６の結合親和性は、それぞれ、２，４１０ｎＭ、２，０００ｎＭ、４，２００ｎＭおよび７，５００ｎＭであり、ＩＬ－２Ｒβγ（組み立て済みのヘテロ二量体として）に関しては、それぞれ、１１１ｎＭ、１０５ｎＭ、４，０００ｎＭ超および４，０００ｎＭ超であった。これらの親和性値に基づいて、ＢＭＳ－９８６３２６薬理学を評価するために、サルが好適な生物種であるが、げっ歯類は、ヒトと比較して変化した薬理学を示す可能性がある。活性単量体の低いレベルに起因して、ＢＭＳ－９８６３２６のインビトロ効力は、組み換えＩＬ－２と比較して、１００分の１未満まで減少した。ＢＭＳ－９８６３２６は、組み換えＩＬ－２での０．０２７ｎＭ±０．０１４と比較して、Ｋｉｔ２２５インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ１）駆動レポーター細胞株において、３．４ｎＭ±１．８の平均最大半値有効濃度（ＥＣ５０）を示した。ＩＬ－２シグナル伝達の近接マーカーであるＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５のリン酸化（ｐＳＴＡＴ５）を測定するための全血アッセイにおいて、ＢＭＳ－９８６３２６は、ヒト血液において０．２３ｎＭ±０．１４およびサル血液において０．０７８ｎＭ±０．０４０のＥＣ５０を示した。ＢＭＳ－９８６３２６は、全血アッセイにおいてＴｒｅｇに対する選択性を示し、Ｔｒｅｇにおいて略最大シグナルが検出され（薬物の最高濃度において９０％超のＴｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５＋）、通常ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、ＣＤ８細胞、およびＮＫ細胞において部分的シグナルのみが検出された（７１ｎＭの薬物の最高濃度において５０％未満のｐＳＴＡＴ５＋細胞）。
マウスＩＬ－２Ｒβγ二量体に結合するヒトＩＬ－２の親和性における顕著な差異に起因して、ならびに慢性有効性研究において潜在的な抗薬物抗体（ＡＤＡ）を回避するために、マウス代理分子（ｍＩＬ２－ＣＤ２５）を用いて、マウス疾患モデルにおける同種二量体融合タンパク質の活性を調査した。ＢＡＬＢ／ｃ野生型マウスにおいて、ｍＩＬ２－ＣＤ２５は、断片結晶化可能（Ｆｃ）およびｍＩＬ－２の融合タンパク質（Ｆｃ－ｍＩＬ２）、またはネズミＩＬ２（ｍＩＬ２）の毎日用量と比較して、長期的な薬物動態（ＰＫ）、ならびにロバストなＴｒｅｇ拡大増殖およびＣＤ８細胞およびＮＫ細胞と比較して強化されたＴｒｅｇ選択性を示した。ｍＩＬ２－ＣＤ２５分子を、２種類のループスマウスモデル：ＮＺＢ／ＷおよびＭＲＬ／ｌｐｒにおいて試験し、これらは、ヒトにおいて観察されるループス様症状の古典的徴候を示す。両方のマウスモデルにおいて、早期疾患でのｍＩＬ２－ＣＤ２５治療は、ロバストかつ用量依存的な薬力学（「ＰＤ」；Ｔｒｅｇ増殖および拡大増殖ならびにＴｒｅｇ上のＩＬ－２シグナル伝達に関するバイオマーカー）、ならびに高用量ステロイド治療と類似する疾患エンドポイントにおけるロバストな改善：自己抗体および腎臓損傷における低減、ならびに腎機能の改善を実証した。０．２ｍｇ／ｋｇの用量は、これらの研究において最大有効性を提供する最小用量であった。加えて、ｍＩＬ２－ＣＤ２５の最適未満の用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）は、低用量ステロイド治療（０．１ｍｇ／ｋｇプレドニゾロン）と組み合わせた場合、相加的な有効性を示した。Ｔｒｅｇパーセンテージ（ＣＤ４＋Ｔ細胞ゲート内）を、マウス研究における主要ＰＤ読み出し値として測定した。ＣＤ４＋Ｔ細胞ゲートにおける％Ｔｒｅｇでの変化を、媒体群におけるＣＤ４＋Ｔ細胞ゲート中の％Ｔｒｅｇを治療群におけるＣＤ４＋Ｔ細胞ゲート中の％Ｔｒｅｇから差し引くことにより算出し、ΔＴｒｅｇ％と表した。週２回（ＢＩＷ）投薬を用いる数回の研究を通して、Ｔｒｅｇパーセンテージは、最大有効性をもたらした用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）において、研究およびＴｒｅｇに対するゲート定義に依存して、ＣＤ４＋集団においてΔ１２％～Δ１８％まで、媒体対照レベルを超えて増加した。ＮＺＢ／Ｗモデルにおいて、ＴｒｅｇレベルがＱ５Ｄ研究に関してＰＫ底値で穏やかに低下したという事実にもかかわらず、ＢＩＷおよび５日間に１回（Ｑ５Ｄ）投薬頻度を用いて同様の有効性が達成された。ＮＺＢ／Ｗ疾患モデルからのデータを用いて、ヒト用量予測を助けるために、有効性に対する標的ＰＤ応答を決定した。
広範囲の用量（０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇ、それぞれ、約４８、１５７、４０７、および１０４６μｇ・ｈ／ｍＬのＡＵＣに対応する）にわたるＢＭＳ－９８６３２６のＰＫ、ＰＤ、および忍容性を、サルにおける単回皮下（ＳＣ）注入後に評価した。本研究では、すべての用量を通して、頻度、絶対数、およびパーセント増殖Ｔｒｅｇでの明らかな用量依存的増加が見られた。すべての用量でのＴｒｅｇ上の、フローサイトメトリー分析により測定される、ＳＴＡＴ５のリン酸化ならびにＣＤ２５の発現をはじめとするＩＬ－２Ｒシグナル伝達を示すマーカーにおける増加もまた見られた。任意の用量におけるＴｃｏｎｖまたはＣＤ８＋Ｔ細胞でのｐＳＴＡＴ５レベルまたは細胞表面ＣＤ２５発現での変化に関する最小限の証拠にもかかわらず、試験された２種類の最も高い用量において、ＴｃｏｎｖおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の用量依存的拡大増殖および増殖に関する証拠が見られた。加えて、２．５ｍｇ／ｋｇの最高用量レベルで、サルにおいて乏しい忍容性が観察された。十分な忍容性が認められたＴｒｅｇ選択的用量である０．２５ｍｇ／ｋｇでは、ＣＤ４ Ｔ細胞中のＴｒｅｇのピークパーセンテージにおけるベースラインからの変化は、マウスモデルにおける最大有効性のために必要とされる％Ｔｒｅｇレベル（媒体対照を超えるΔ１２％～１８％）を十分に超えるレベル（ピークにおいて用量前を超えるΔ２３％、ピークにおいて用量前を超える４．８倍増加）に達した。加えて、ＣＤ４＋Ｔ細胞ゲート中の％Ｔｒｅｇにおけるベースラインを超えるΔ１０％までの増加は、２１日目投与を通してこの用量で維持された。まとめると、これらのデータは、ＢＭＳ－９８６３２６が、予期される有効用量においてＴｒｅｇ選択的である、ロバストかつ長期的なＰＤ応答を生じることを実証する。
非臨床的薬物動態
非臨床的設定においてＢＭＳ－９８６３２６のＰＫを特性決定するために、様々なインビトロおよびインビボ研究を行った。ＢＭＳ－９８６３２６またはｍＩＬ２－ＣＤ２５の血清曝露を測定するためのリガンド結合性アッセイは、活性な単量体形態および不活性な二量体形態を含む合計濃度を測定した。静脈内（ＩＶ）投与後、ＢＭＳ－９８６３２６の定常状態分布容量（Ｖｓｓ）は、マウスおよびサルにおいて、それぞれ、０．０９５４および０．０７３４Ｌ／ｋｇであった。ＢＭＳ－９８６３２６の合計血清クリアランス（ＣＴＬ）は、マウスおよびサルにおいて、それぞれ、３．２５および０．７６９ｍＬ／ｈ／ｋｇであり、かつ皮下（ＳＣ）投薬後の見かけの排出半減期（Ｔ－ＨＡＬＦ）は、１．１８日間および３．３０日間であった。ＳＣ投薬後の最大濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は、マウスおよびサルにおいて、それぞれ、７時間および２４時間であった。ＳＣ投薬後の絶対的バイオアベイラビリティは、マウスにおいて５８％およびサルにおいて４６％であった。ヒト血清におけるインビトロ研究（最大７２時間）およびＢＭＳ－９８６３２６のＳＣ投与後のサル血清サンプルにおけるエクスビボ研究（最大１６８時間）は、ＩＬ－２を介する免疫捕捉後のＩＬ－２およびＣＤ２５の液体クロマトグラフタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）に基づく面積比の測定により評価される場合、リンカー切断の徴候を示さなかった。
ヒトＰＫは、サルＰＫパラメータの相対成長スケーリングを用いて予想され、サルにおけるものと同様のＳＣバイオアベイラビリティを有することが推定された。６日間の半減期が、ヒトにおいて予想された。ＢＭＳ－９８６３２６はサルおよびヒトＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２Ｒβγに対する同等の結合親和性、ならびにサルおよびヒト全血アッセイにおいてインビトロで同等の効力を有することが示されているので、ヒトＰＤ応答（ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、および％ｐＳＴＡＴ５＋Ｔｒｅｇの細胞カウントにおける変化を含む）が、サルＰＫ／ＰＤモデルパラメータを用いて予想された。
ヒトにおけるＢＭＳ－９８６３２６の有効用量は、２種類のアプローチを用いて予想された。第１のアプローチは、ｍＩＬ２－ＣＤ２５を投与されたマウスモデルにおける最大前臨床的有効性に基づいた。ｍＩＬ２－ＣＤ２５（０．２ｍｇ／ｋｇ ＢＩＷ）を用いるＮＺＢ／Ｗマウスモデルにおける最大有効性は、底値でのベースラインに対してＣＤ４＋Ｔ細胞中のΔ１４％Ｔｒｅｇを伴ったので、底値における同様のＰＤ応答を、ＢＭＳ－９８６３２６のヒト有効用量を予想するための目標とした。底値でのＣＤ４＋Ｔ細胞中のΔ１４％Ｔｒｅｇを目標とするヒトにおけるＢＭＳ－９８６３２６の有効用量は、２週間毎に１回（Ｑ２Ｗ）投与される６ｍｇＳＣである。この用量では、ＢＭＳ－９８６３２６の予想される定常状態最大血清濃度（Ｃｍａｘ，ｓｓ）は１．５μｇ／ｍＬであり、予想されるＡＵＣ（ＴＡＵ）は２１７μｇ・ｈ／ｍＬであり、かつ予想される定常状態最小濃度（Ｃｔｒｏｕｇｈ，ｓｓ）は０．３μｇ／ｍＬである。
後続の研究では、ＮＺＢ／ＷマウスモデルにおけるｍＩＬ２－ＣＤ２５（０．２ｍｇ／ｋｇ Ｑ５Ｄ）の低減した投薬頻度もまた、１０分の１の底値曝露を伴って、最大有効性を示した。したがって、６ｍｇＳＣ Ｑ２Ｗ用量と比較して１０分の１のＣｔｒｏｕｇｈ，ｓｓ（０．０３μｇ／ｍＬ）を達成するであろう月１回（Ｑ１Ｍ）投与される６ｍｇＳＣの予想されるヒト用量が、同様の有効性を有することが予想される。６ｍｇ Ｑ１Ｍ投薬レジメンは、ピークにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞中のΔ１２％Ｔｒｅｇおよび底値においてＣＤ４＋Ｔ細胞中のΔ４％Ｔｒｅｇを実現することが予測される。
ＢＭＳ－９８６３２６のヒト有効用量を予想するための第２のアプローチは、ＳＬＥ患者における組み換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）を用いる有効性の臨床的実証に基づくものであった。ＳＬＥを有する患者における臨床研究では、２週間にわたる隔日の１ＭＩＵ（百万国際単位）ＳＣで投与されるｒｈＩＬ－２、およびそれに続く２週間の無治療期間は、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のΔ５％ＴｒｅｇのピークおよびＣＤ４＋Ｔ細胞中のΔ１％Ｔｒｅｇの底値を伴うＴｒｅｇプロファイルを生じた。この治療がプラセボと比較してＳＬＥレスポンダー指数－４（ＳＲＩ－４）を改善することが示されたので、同様のＴｒｅｇプロファイルを、ＢＭＳ－９８６３２６の有効用量を推定するための目標とした。臨床データに基づいて、同様のＴｒｅｇプロファイルを達成するためのヒトにおけるＢＭＳ－９８６３２６の予想される有効用量は、２ｍｇＳＣ Ｑ１Ｍである。この用量では、ＢＭＳ－９８６３２６の予想されるＣｍａｘ，ｓｓは０．４μｇ／ｍＬであり、予想されるＡＵＣ（ＴＡＵ）は７１μｇ・ｈ／ｍＬであり、かつ予想されるＣｔｒｏｕｇｈ，ｓｓは０．０１μｇ／ｍＬである。考え合わせると、ヒトにおけるＢＭＳ－９８６３２６に対する有効用量範囲は、２～６ｍｇＳＣ Ｑ１Ｍであると予想される。
非臨床的毒物学
ラットおよびサルは、インビトロ受容体サブユニット結合性データに基づいて関連のある毒物学的生物種であることが実証され、インビボで薬理学（選択的Ｔｒｅｇ拡大増殖）を示し、ならびにＩＬ－２Ｒアゴニスト分子に関して歴史的に用いられてきた。ＢＭＳ－９８６３２６の単回および反復用量毒性を、選択された投薬頻度を用いて、ラットにおいて最大２週間にわたって、およびサルにおいて最大１２週間にわたって、一連の研究で特性決定した。両方の生物種におけるピボタル優良試験所基準（ＧＬＰ）反復用量研究は、ＢＭＳ－９８６３２６のＳＣ投与を利用し、かつ異なる用量頻度（週１回［ＱＷ］対週２回［２ＱＷ］）を用いるラットにおける２種類の２週間研究、サルにおける２週間の週１回投薬研究、およびサルにおける１２週間（３週間毎に１回、Ｑ３Ｗ）投薬研究からなった。加えて、単回用量予備的研究が、ＢＭＳ－９８６３２６の忍容性を調査するためにラットおよびサルの両方で最初に完了され、かつ単回用量ＧＬＰ ＩＶ毒性および心血管安全性研究もまた、ヒト初回（ＦＩＨ）単回漸増用量（ＳＡＤ）研究（ＩＭ０３４００１）におけるＩＶ投与を支持するために、ＩＶ投薬を用いて遠隔計測装置を装着したサルにおいて完了された。
ラットでは、ＢＭＳ－９８６３２６は、高度に免疫原性であることが報告され、ＡＤＡ形成がＢＭＳ－９８６３２６治療ラットのうちの８４％で生じた。一般的に、ＡＤＡの存在は、低減された曝露およびＰＤ活性の喪失に関連付けられたが、毒性には関連付けられなかった。サルでは、ＡＤＡは、一般的に、ピボタル毒性研究においてＢＭＳ－９８６３２６に対する曝露後に形成されず、かつ予備的研究における発生率が低かった。
意図されたＰＤ作用および意図されないＰＤ作用が、各毒性研究のすべての用量を通して用量依存的様式で生じ、かつ一般的に、ラットにおけるよりもサルにおいてより顕著であった。ＩＬ－２Ｒアゴニストとして、ＢＭＳ－９８６３２６は、ラットおよびサルにおいてすべての用量を通してＴｒｅｇ細胞中のＳＴＡＴ５の最大リン酸化（７２％～９５％）を誘導し、Ｔｒｅｇ細胞（サルでは最大６３倍）および／またはＣＤ４ Ｔｒｅｇ上でのＣＤ２５発現（ラットにおいて最大４．５倍）を増加させ、かつＩＬ－１０の血清レベルを上昇させた（ラットにおいて最大２倍およびサルにおいて最大８７倍）。Ｔｒｅｇに対する所望の薬理学的作用に加えて、ＢＭＳ－９８６３２６はまた、血清ＩＬ－５、ＭＣＰ－１、およびパーフォリンの同時上昇を伴う通常ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞集団ならびにＮＫ細胞の用量依存的活性化を含む意図されない作用ももたらした。サルにおいて週１回投与される場合、ＢＭＳ－９８６３２６の比較的高い用量では、Ｂ細胞（１．６倍）ならびにＩＦＮ－γ（７．９倍）、ＩＬ－１Ｒａ（４９倍）、およびＩＬ－６（５．１倍）などの他の炎症性サイトカインの増加もまた記録された。これらの炎症性サイトカインは、ＢＭＳ－９８６３２６の比較的低い用量が１２週間サル毒性研究において比較的低頻度（Ｑ３Ｗ）で投与された場合には上昇しなかった。
すべてのＰＤ作用（意図されるものおよび意図されないもの）は、一般的に、用量後回復期間の後に元に戻ることができた。薬理学的応答のピークは、一般的に、投薬後の４～１２日間で観察され、より高頻度（すなわち、ラットにおいて週２回またはサルにおいて週１回であって、ＰＤ応答のピークで後続の用量が投与された）であった投薬レジメンの場合、これは、より大きな発生率および毒性の重症度と相関した（下記を参照されたい）。用量が比較的低頻度（３週間毎）で投与された１２週間サル研究では、各後続の用量の直前（投薬３週間後）のＴｒｅｇおよび非Ｔｒｅｇの両方におけるＰＤ応答は、用量の４～１２日間でそのピーク応答から減少しており、したがって、すべての用量において、ターゲットエンゲージメントの証拠および好ましい免疫修飾に関する傾向が見られ、大部分の動物における意図されない免疫応答の最小刺激を伴った。考え合わせると、意図されるものおよび一部の意図されないものの両方の用量関連薬理学的作用がＱ３Ｗ投薬を用いる１２週間サル研究において観察されたが、Ｔｒｅｇでの増加の大きさは、用量範囲全体にわたって、通常Ｔ細胞における増加よりも最大で約２倍高かった。
５、２５、７５、または２００ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量が投与されたラットにおける単回用量予備的研究では、ＢＭＳ－９８６３２６は、２５ｍｇ／ｋｇ／日以上（平均ＡＵＣ［０～９６ｈ］≧２，０８０μｇ・ｈ／ｍＬ）において雄性ラットによる忍容性が認められず、５日目での有病または死亡を生じ、出血、肝胆道傷害、および機能的胆汁鬱滞を示す臨床病理学変化を伴い、これらはすべて、ＩＬ－２の高用量作用と合致した。５ｍｇ／ｋｇ（平均ＡＵＣ［０～９６ｈ］＝５０１μｇ・ｈ／ｍＬ）では、有害作用は観察されなかった。
０．０７５、０．２５、０．７５、または２．５ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量でのサルにおける単回用量予備的忍容性ＰＫ／ＰＤ研究では、最大０．７５ｍｇ／ｋｇ（ＡＵＣ［ＩＮＦ］４０７μｇ・ｈ／ｍＬ）の用量は、十分な忍容性が認められ、所望の（Ｔｒｅｇ拡大増殖を伴うＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５のリン酸化ならびにＴｒｅｇ上での増加したＣＤ２５発現およびＩＬ－１０）および意図されない（ＴｃｏｎｖおよびＣＤ８＋Ｔ細胞のわずかな拡大増殖、ＩＬ－５、ＭＣＰ－１、パーフォリン、およびＧＭ－ＣＳＦをはじめとする増加した炎症促進性サイトカイン）、ＰＤエンドポイントにおける変化ならびに好酸球増加および減少した赤血球量を伴った。ＢＭＳ－９８６３２６は、２．５ｍｇ／ｋｇ（ＡＵＣ［ＩＮＦ］１０４０μｇ・ｈ／ｍＬ）において忍容性が認められず、数頭のサルが、液状便、減少した活動性、異常な／鱗状／赤色皮膚、および重症脱水、およびサイトカイン放出を示す臨床病理学プロファイル、肝臓毒性、ならびに下痢および脱水に関連する可能性がある腎障害を示した。
サルにおけるピボタル単回用量ＩＶ毒性および心血管安全性研究では、ＢＭＳ－９８６３２６は、すべての用量（０．０５、０．１５、または０．５ｍｇ／ｋｇ；平均ＡＵＣ［０～３３６ｈ］≦７５７μｇ・ｈ／ｍＬ）において臨床的に十分な忍容性が認められた。高用量において低血圧作用および毛細血管漏出症候群（ＣＬＳ）を引き起こす組み換えｈＩＬ－２とは異なり、血圧の減少、ＣＬＳ様作用、または血液動態もしくは心電図パラメータに対する他の作用は、投与されたＢＭＳ－９８６３２６用量では観察されなかった。すべての用量での特筆すべき毒物学的知見は、骨髄中の好酸球の最小から中等度の骨髄過形成、および脾臓における好酸球細胞性の最小から軽度の増加（脾臓肥大および増加した重量に相関する）に関連付けられる好酸球の最小から顕著な増加（最大９１．６倍）を含んだ。０．５ｍｇ／ｋｇの高用量では、追加の特筆すべき知見は、炎症促進性サイトカインの増加に関連する可能性がある平均体温の一時的上昇（最大１．１℃）、補正ＱＴ間隔の一時的減少および最小限に増加した心拍数（ベースラインと比較して４％）、および一時的な軽度炎症応答を広く反映する臨床病理学プロファイルを含んだ。顕微鏡的には、一部の組織において、用量依存的な好酸球および単核細胞の多臓器浸潤物が見られた。すべての知見は、変化の低い大きさおよび性質、検査したすべての組織／臓器における組織損傷および炎症性変化の欠如、および関連する機能的結果の非存在に基づいて有害でないと考えられ、かつサルでの単回ＩＶ用量後の無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、０．５ｍｇ／ｋｇ ＩＶ（平均ＡＵＣ［０～３３６ｈ］＝７５７μｇ・ｈ／ｍＬ）の高用量であると考えられた。
異なる投薬頻度を用いるラットにおける２つの分離した２週間毒性研究では、ＢＭＳ－９８６３２６を、０．５、１、もしくは２．５ｍｇ／ｋｇ ＳＣの週２回用量または０．２５、０．５、もしくは１ｍｇ／ｋｇ ＳＣの週１回用量で投与し、すべての用量（２．５ｍｇ／ｋｇ以下、平均ＡＵＣ［０～３３６ｈ］≦６００μｇ・ｈ／ｍＬ）において臨床的に忍容性が認められた。最大曝露は、各研究の第１週の間に記録され、ＡＤＡの影響に起因して、第２週の間に大幅に減少した。有害知見は、週２回研究の間にのみ生じ、すべての用量（≧０．５ｍｇ／ｋｇ ２ＱＷ、１日目に平均ＡＵＣ≧１８９μｇ・ｈ／ｍＬ）における脾膜線維増殖および脾臓の炎症ならびに２．５ｍｇ／ｋｇにおける血小板数の減少（０．８倍～０．４倍）からなった。炎症を伴う脾膜線維増殖は、中等度から顕著な重症度に起因して、すべての週２回用量において有害であると考えられ、腸間膜（胃および膵臓に隣接する）における最小から軽度の炎症も伴い、これは、さらに知見の有害性の原因となった。結果として、ＮＯＡＥＬは週２回投薬研究では特定されなかった。すべての用量（週２回０．５ｍｇ／ｋｇ以上）における他の顕著な非有害知見は、ＩＬ－２アゴニストの薬理学的活性の反映であり、ＩＬ－５増加と関連付けられる好酸球の増加（対照の３倍～２２倍）；ならびに数種類の臓器への好酸球浸潤の増加した発生率および／または重症度を含んだ。全体として、第２の２週間ラット研究に対して選択された低減された用量レベルおよび頻度（週１回）は、ターゲットエンゲージメントの維持および週２回投薬を用いて実証されたものと比較した場合の意図されない薬理学の低減において上首尾であった。主要なＢＭＳ－９８６３２６関連作用は、すべての週１回用量（０．２５、０．５、または１ｍｇ／ｋｇ）で、大部分が重症度において最小限であり、増加した好酸球（１．９倍～６．７倍）；隣接する腸間膜の炎症または障害を伴わない最小限の脾膜線維増殖／脾臓の線維症；および少数の組織への好酸球の薬理学的に媒介される浸潤を含み、これらのいずれも、変化の低い大きさおよび含められる臓器の機能的完全性でのいずれかの障害の証拠の欠如に起因して、有害であると考えられなかった。２週間にわたる週１回投薬後のラットにおけるＮＯＡＥＬは、１ｍｇ／ｋｇ（平均ＡＵＣ １６２μｇ・ｈ／ｍＬ）であった。
０．１２５、０．２５、または０．７５ｍｇ／ｋｇ ＳＣの週１回用量でのサルにおける２週間毒性研究では、ＢＭＳ－９８６３２６は、０．２５ｍｇ／ｋｇ以下では臨床的に忍容性が認められたが、減少した活動性、脱水、紅斑、点状出血、および上昇した体温を含む、０．７５ｍｇ／ｋｇでのＩＬ－２Ｒアゴニズムおよび免疫刺激と合致する毒性の有害な臨床的徴候をもたらした。すべての用量において、特筆すべきＢＭＳ－９８６３２６関連毒物学的知見は、一般的に用量に関連し、主に、白血球に対する作用（すなわち、好酸球増加［４倍～４０倍］、関連する組織炎症／浸潤を伴う）；減少した赤血球量（試験前の０．９倍～０．６倍）および血小板（０．９倍～０．６倍）；脾臓の赤髄の充満；増加した細胞性、類洞白血球増加およびクッパー細胞肥大に相関する、増加した肝臓重量（１６％～７５％）；ならびに好酸球増加に対する再生応答であり得る骨髄の最小から中等度の骨髄過形成を含んだ。最小から軽度の一般的に多発性の混合細胞型炎症が、脳の脈絡叢および目の脈絡膜をはじめとする複数の組織および臓器（約１６～２８種類の罹患組織の用量関連数）において起こった。０．２５ｍｇ／ｋｇ／週以上の目の脈絡膜および脳の脈絡叢における混合細胞型炎症ならびに０．７５ｍｇ／ｋｇ／週での減少したＲＢＣ量が、知見の重症度および性質に起因して有害であると考えられたが、最小限の重症度および低い発生率に起因して、０．１２５ｍｇ／ｋｇ／週では有害でないと考えられた。０．７５ｍｇ／ｋｇ／週の高用量において、追加の特筆すべき知見は、サイトカイン放出に対して二次的であると思われ、かつ有害でないと考えられた、関連するＲ－Ｒ間隔の減少を伴う増加した心拍数（２５％～２８％）；最小から中等度の肝臓の肝細胞空胞化；最小から軽度の腎臓における皮質管再生、および回収屠殺時のみでの、２頭の雄性動物における最小から軽度の座骨神経の軸索変性を含んだ。０．２５ｍｇ／ｋｇ／週以上（平均ＡＵＣ［０～１６８ｈ］≧２３４μｇ・ｈ／ｍＬ）での目の脈絡膜および脳の脈絡叢における有害炎症に基づき、かつ０．７５ｍｇ／ｋｇ／週（平均ＡＵＣ［０～１６８ｈ］≧６０１μｇ・ｈ／ｍＬ）での臨床的徴候および赤血球量における有害減少を伴って、ＮＯＡＥＬは、０．１２５ｍｇ／ｋｇ／週（平均ＡＵＣ［０～１６８ｈ］１３２μｇ・ｈ／ｍＬ）であると考えられた。
１２週間サル研究では、用量範囲および頻度は、０．０６２５、０．１２５、または０．２５ｍｇ／ｋｇ ＳＣ Ｑ３Ｗ（１日目、２２日目、４３日目、および６４日目）においてＢＭＳ－９８６３２６が投与される２週間研究と比較して低減された。すべての用量において、ＢＭＳ－９８６３２６関連知見は有害でなく、かつ最小から軽度の好酸球数の有害でない増加（対照の３倍～８倍）、増加した脾臓サイズおよび重量（２６～６５％）、ならびに最小限の骨髄における好酸球性骨髄過形成を含んだ。重要なことに、他の組織への好酸球または単核細胞浸潤は報告されなかった。臨床的作用の非存在ならびに臨床病理学および病理学知見の有害でない性質に基づいて、ＮＯＡＥＬは、０．２５ｍｇ／ｋｇ／用量（平均ＡＵＣ ３０６μｇ・ｈ／ｍＬ）の試験された最高用量であると考えられた。
ＢＭＳ－９８６３２６およびｒｈＩＬ－２非臨床研究間での用量比較は、ＢＭＳ－９８６３２６の異なる構造、不活性な二量体として循環する大部分のＢＭＳ－９８６３２６の傾向、ＢＭＳ－９８６３２６対ｒｈＩＬ－２の大幅に異なるＰＫ、ならびに生物種および研究間での大きく異なる用量レジメンを考慮すると、困難である。定量的には、ＢＭＳ－９８６３２６の毒性プロファイルは、ｒｈＩＬ－２に対する幾分かの類似性を示唆するが、著しい差異も有する。類似性としては、好酸球増加および主に好酸球でありときには単核細胞を含む組織への白血球浸潤が挙げられる。これらの知見は、すべてのＢＭＳ－９８６３２６毒物学研究において見られ、かつ様々な投薬パラダイム下で可変的な重症度を伴って、多様な生物種においてｒｈＩＬ－２を用いて報告される。低用量および高用量ｒｈＩＬ－２［Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．］の両方を用いて臨床的にも観察される好酸球増加は、ＩＬ－２により刺激されるＩＬＣ２によるＩＬ－５産生に対して二次的であり得［Van Gool et al., Blood 124:3572-6 (2014)；Anderson et al., Int Rev Exp Pathol. 34 Pt A:57-77 (1993)］、ＢＭＳ－９８６３２６研究においては有害でなかった。組織中での白血球浸潤に関して、肝臓は、ｒｈＩＬ－２に関する主要な標的臓器であったが、ピボタル毒性研究において試験された用量ではＢＭＳ－９８６３２６に関する顕著な標的ではなかった［Anderson et al., Int Rev Exp Pathol. 34 Pt A:57-77 (1993)；Harada et al., Int Rev Exp Pathol. 34 Pt A:37-55 (1993)］。肝機能障害は、腫瘍学適応における高用量ｒｈＩＬ－２の高頻度な副作用であるが、肝機能障害は、ＧｖＨＤ、１型糖尿病、円形脱毛症、およびＳＬＥを含む複数の適応において低用量ｒｈＩＬ－２の臨床試験では特徴となっていない［Castela et al., JAMA Dermatol. 150:748-51 (2014)；He et al., Nat Med. 22:991-93 (2016)；Klatmann et al., Nat Rev Immunol. 15:283-94 (2015)；Koreth et al., Blood 128:130-37 (2016)］。肝機能障害に加えて、ＣＬＳは、高用量ＩＬ－２腫瘍学レジメン下ではヒトにおいて療法を限定する。ＣＬＳは、ＧＬＰピボタル非臨床研究においてＢＭＳ－９８６３２６を用いて観察されていない。
全体としては、ピボタルＢＭＳ－９８６３２６研究におけるＮＯＡＥＬ用量は、正常健康参加者における単回用量ヒト初回（ＦＩＨ）研究に関して提案される用量開始および用量増加に対する好適な曝露マージンを提供する。
ＩＩＩ．Ｂ．ＢＭＳ－９８６３２６の第１相臨床評価
一般的概要
ＢＭＳ－９８６３２６は、健康成人参加者においてＢＭＳ－９８６３２６の単回用量の安全性、忍容性、薬物動態（ＰＫ）、および薬力学（ＰＤ）を評価するために、第１相無作為化二重盲検プラセボ対照単回漸増用量（ＳＡＤ）研究において評価される。
研究の主要目的は、健康参加者におけるＢＭＳ－９８６３２６の単回漸増静脈内（ＩＶ）および皮下（ＳＣ）用量の安全性および忍容性を評価することである。
研究の二次目的は、以下のものを含む：
・健康参加者におけるＩＶおよびＳＣ ＢＭＳ－９８６３２６の単回用量ＰＫを決定すること；
・ＩＶ投与と比較した場合にＳＣ投与後のＢＭＳ－９８６３２６の絶対的バイオアベイラビリティを決定すること；
・ＢＭＳ－９８６３２６のＳＣおよびＩＶ投与後のＰＤを見積もること；ならびに
・ＢＭＳ－９８６３２６のＳＣおよびＩＶ投与後の免疫原性に関する潜在能力を評価すること。
標的対象集団
健康成人参加者は、研究に対して適格である。研究に対する適格性基準は、研究参加者の安全性および研究の結果を用いることができることを確実にするために注意深く考慮される。患者ではなく健康参加者の登録は、疾患状態の変化、併発臓器機能障害、および／または併用薬物療法から生じる交絡因子がないので、安全性結果の明白な解釈を可能にする。加えて、健康参加者における新規分子実体の評価は、患者において行われる場合の潜在的な疾患増悪のリスクを回避する。
研究の各コホート中のプラセボ治療参加者の包含は、すべての研究手順に対する研究中に評価されるベースラインパラメータからのいずれかの変化の評価を促進し、かつこれらの変化がＢＭＳ－９８６３２６の投与または研究手順に関連するか否かを決定することを助ける。
研究の一般的設計
研究の参加者は、８コホート（ＩＶコホートＡ１～Ａ５；ＳＣコホートＢ１～Ｂ３）および１つの適宜のＩＶ（Ａ６）コホートを含む約９つの合計用量レベルコホートへと無作為化される。
各参加者に関する研究の合計持続期間は、最大２８日間のスクリーニング期間、臨床現場における２１日間の組織内観察期間および約３４日間の外来／追跡期間を含む、最大１２週間である。
最大約６コホート（コホートＡ１～Ａ６）が、以下に提供される治験薬投与手順に従って、ＢＭＳ－９８６３２６の単回ＩＶ点滴を投与される。約３コホート（コホートＢ１～Ｂ３）が、以下に提供される治験薬投与手順に従って、ＢＭＳ－９８６３２６のＳＣ注入を介して与えられる単回用量を投与される。これはヒト初回（ＦＩＨ）研究であるので、研究設計は、安全性、忍容性、ＰＫ、およびＰＤデータが段階的様式で積み重ねられることを可能にする。ＢＭＳ－９８６３２６のＳＣ投与は、許容可能な安全性を求めて行われ、忍容性は、ＩＶで投与される同様の用量を投与されている参加者のコホートにおいて実証される。
２名の健康参加者のセンチネル群が、すべてのコホートで評価される。このセンチネル群は、プラセボまたはＢＭＳ－９８６３２６へと１：１に無作為化される。各用量レベル内の残りの６名の参加者は、プラセボまたはＢＭＳ－９８６３２６へとそれぞれ１：５に無作為化される。センチネル群の投薬の少なくとも１２０時間後、安全性プロファイルが許容可能な安全性プロファイルである場合［最低でも、有害事象（ＡＥ）、併用薬物療法および手順、ならびにいずれかの他の重要な安全性に関連する臨床的観察に基づいて］、コホートの残りは、無作為化スケジュールに従って投与を受ける。ＩＶコホートに関して、残りの６名の参加者は、１日当たり最大２名の参加者を伴って逐次的に投与を受ける。一部の態様では、参加者は、参加者間で少なくとも２時間の間隔を置いて、投与を受ける。
ＳＣ用量レベルコホートは、ＩＶ投与される同様の用量を投与された参加者のコホートにおいて許容可能な安全性および忍容性が実証されるまで開始されず、かつＰＤ（ＴｒｅｇカウントおよびＴｒｅｇ：通常ＣＤ４細胞［Ｔｃｏｎｖ］比率）データが評価される。
研究の経過中、各参加者は、図１Ａに示される通り、スクリーニング期間および治療期間（ベースラインおよび外来通院を含む）を完了する。参加者は、適格性に関してスクリーニングされる。適格参加者は、－２日目または－１日目から２１日目まで、臨床現場に居住する。治験薬（プラセボまたはＢＭＳ－９８６３２６のいずれか）が、無作為化スケジュールに従って１日目に投与される。参加者は、満足な安全性審査および必要な研究手順の完了に際して、２１日目に臨床現場から退院する。参加者は、１０～１８日目の間の予測されるピークＰＤ応答および潜在的なＡＤＡの発生後、Ｔｒｅｇ拡大増殖の持続性を評価するために、２８日目、３６日目、４５日目、および５５日目に外来通院のために戻る。参加者が早期に研究を中断する場合、早期終了通院が行われる。
各コホートが投薬を完了した後、限定するものではないが、ＡＥ、身体検査（ＰＥ）、バイタルサイン、１２誘導安全性ＥＣＧ、注入部位評価、臨床検査安全性試験結果（好酸球カウントを含む）、併用薬物療法／手順、およびＰＤデータ（ＴｒｅｇカウントおよびＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖ比率を含む）を含む安全性データが、用量上昇に先立って審査される。完了したコホートからのＰＫデータが、継続的な曝露を予測するために用いられる。
予定される用量レベルが、図１Ｂに示される。最高用量を含む予定される用量レベルは、以下に提供される用量上昇手順に記載される通り、先行コホートからの新たに得られたＰＤおよびＰＫデータ（ＳＣコホートからのバイオアベイラビリティデータを含む）に応じて調整することができる。予定される用量上昇工程に対する変更が必要である場合、最大用量上昇工程は、前の用量レベルの約３倍以下である。約７５７μｇ・ｈ／ｍｌのＡＵＣ［０～３３６時間（ｈ）］を超過しない、無限時間（ＡＵＣ［ＩＮＦ］）へと外挿された平均曝露血清濃度－時間曲線下面積を有すると予測されるＩＶ用量のみが投与される。ＡＵＣ（０～５０４ｈ）≦３０６μｇ・ｈ／ｍｌを超過しない平均曝露（ＡＵＣ［ＩＮＦ］）を有すると予測されるＳＣ用量のみが投与される。
次の用量レベルへの上昇は、以下に提供される用量改変／停止基準に記載される通り、対象が重篤有害事象を経験した場合に、中断することができる。重篤有害事象は、研究治療を投与された臨床調査参加者における、かつこの治療との因果関係を必ずしも有しない、いずれかの新規の有害な医療事件または既存の医学的状態の悪化を含む。
主要および副次評価項目
健康参加者におけるＢＭＳ－９８６３２６の単回漸増ＩＶおよびＳＣ用量の安全性および忍容性を評価する一次目的を評価するために用いられる本研究の主要評価項目は、有害事象、臨床検査値、バイタルサイン、心電図、および身体検査の評価を含む。これらの評価は、以下でさらに議論される。
健康参加者においてＩＶおよびＳＣ ＢＭＳ－９８６３２６の単回用量薬物動態（「ＰＫ」）を決定する二次目的に関連する研究のエンドポイントは、以下のものなどの血清ＰＫパラメータを含む：
・Ｃｍａｘ：最大観測血清濃度；
・Ｔｍａｘ：最大観測血清濃度到達時間；
・ＡＵＣ（０～Ｔ）：ゼロ時点から最後の定量化可能な濃度の時点までの血清濃度－時間曲線下面積；
・ＡＵＣ（ＩＮＦ）：無限時間へと外挿されたゼロ時点からの血清濃度－時間曲線下面積；
・ＣＬＴ／ＦまたはＣＬＴ：ＩＶに関する見かけの総身体クリアランスまたは総身体クリアランス；
・Ｖｚ／ＦまたはＶｚ：ＩＶに関する終末相での見かけの分布容量または終末相での分布容量；
・Ｔ－ＨＡＬＦ：終末相半減期；および
・Ｆ：絶対的バイオアベイラビリティ。
ＩＶ投与と比較した場合のＳＣ投与後のＢＭＳ－９８６３２６の絶対的バイオアベイラビリティを決定する二次目的に関連する研究のエンドポイントは、用量により補正された、ＳＣ（試験）のＩＶ（参照）に対する以下の幾何平均比率を含む：Ｃｍａｘ、ＡＵＣ（０～Ｔ）、およびＡＵＣ（ＩＮＦ）。
ＢＭＳ－９８６３２６のＳＣおよびＩＶ投与後の薬力学を評価する二次目的に関連する研究のエンドポイントは、ＴｒｅｇカウントおよびＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖ比率におけるベースラインからの変化を測定することを含む。
ＢＭＳ－９８６３２６のＳＣおよびＩＶ投与後の免疫原性に関する潜在能力を評価する二次目的に関連する研究のエンドポイントは、中和性であるかまたはないことができる抗薬物抗体の出現率を測定することである。
センチネル投薬に関する原理
センチネル投薬戦略は、予期せぬ急性安全性事象が生じるリスクを最小化するために、研究において利用される。２名の健康参加者（１名は活性および１名はプラセボ）が、研究のすべての用量コホートにおいて評価される。各センチネル群は、同じコホートの残りの参加者が投与を受ける前に、最小でも１２０時間観察される。ピーク薬理学応答が一般的に投薬の４日間後から観察され始めたことを示したサルでの毒性研究に基づいて、少なくとも５日間にわたる臨床的安全性のモニタリングは、毛細血管漏出症候群（ＣＬＳ）または免疫活性化（例えば、サイトカイン放出症候群）などの急性発症の潜在的な安全性の懸念をカバーする。センチネル参加者と同じコホート中の残りの参加者の投薬に進む決定は、利用可能な安全性データ［例えば、有害事象（ＡＥ）、バイタルサイン、身体検査（ＰＥ）、心電図（ＥＣＧ）、および臨床検査］に基づいてなされる。
用量範囲に関する原理
研究のために選択される用量範囲は、適切な段階に適した安全性データを提供し、かつＰＫ／ＰＤ関係の特性決定を可能にする、曝露および薬理学的活性の範囲を提供することが予期される。
０．１ｍｇＩＶの開始用量の選択は、利用可能な前臨床ＰＫ、毒物学、および薬理学データに基づく。ＰＫ／ＰＤモデリングおよびシミュレーションが、非臨床データからの予測されるヒトＰＫおよびＰＤプロファイルを生成するために行われた。実際の用量上昇（約３倍以下の用量上昇増分）および試験される実際の用量は、研究から新たに得られたＰＫ、ＰＤ、および安全性データにより決定される。これは、安全性、忍容性、ＰＫ、およびＰＤデータを可能にするために設計されるＦＩＨ研究である。
表４は、提案される用量から生じる予想されるＰＤ変化および曝露を列記する：
治験薬［注入用ＢＭＳ－９８６３２６－０１、３０ｍｇ／バイアル（２５ｍｇ／ｍＬ）］の医薬特性および製剤化
注入用ＢＭＳ－９８６３２６－０１（３０ｍｇ／バイアル；２５ｍｇ／ｍＬ）は、第１相臨床試験に対してＩＶ点滴またはＳＣ注入として用いるために開発された。薬物製品は、１３ｍｍ栓を用いて封鎖され、かつ１３ｍｍアルミニウムシールを用いて密封された３ｃｃ Ｉ型ガラスバイアル中に入れられた、白色からオフホワイトのパイロジェン不含凍結乾燥全体または分割ケーキである。薬物製品の各バイアルは、ラベルされた量のＢＭＳ－９８６３２６原薬、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、スクロース、ペンテト酸、およびポリソルベート８０、ならびに塩酸および水酸化ナトリウム（ｐＨ調整用）を７．０のｐＨで含む。ＶＮＳ（バイアル、針、シリンジ）ホールドアップを考慮するために、０．３１ｍＬの過充填が各バイアル中に含められる。薬物製品は、投与前に復元される。
投与に先立って、注入用ＢＭＳ－９８６３２６－０１（３０ｍｇ／バイアル；２５ｍｇ／ｍＬ）の各バイアルが、２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで、０．９％塩化ナトリウム注射液（生理食塩水）を用いて復元される。ＳＣ使用に関して、薬物製品は、２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で未希釈であるか、または０．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで０．９％塩化ナトリウム注射液を用いて希釈されるかのいずれかで、ボーラスＳＣ注入としてインラインフィルターを通して投与することができる。ＩＶ使用に関して、薬物製品は、インラインフィルターを通して点滴され；薬物製品は、点滴前に０．２ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度範囲内まで０．９％塩化ナトリウム注射液を用いて希釈される。
ＢＭＳ－９８６３２６注入とジ（２－エチルヘキシル）フタレート（ＤＥＨＰ）不含ポリオレフィンまたはＰＶＣ（ＤＥＨＰ可塑化）バッグ、ＤＥＨＰ不含またはＰＶＣ（ＤＥＨＰ可塑化）ＩＶセット、および０．２μｍポリエーテルスルホンまたはナイロンフィルターとの間には、不適合性は観察されていない。
注入用のＢＭＳ－９８６３２６－０１に対するプラセボは、市販の０．９％塩化ナトリウム注射液である。
注入用のＢＭＳ－９８６３２６－０１のバイアル（３０ｍｇ／バイアル；２５ｍｇ／ｍＬ）は、２℃～８℃（３６°～４６°Ｆ）で冷蔵保存され、かつ光および凍結から保護される。
注入用のＢＭＳ－９８６３２６－０１の復元および希釈溶液は、最大２４時間にわたって２℃～８℃（３６°～４６°Ｆ）で冷蔵下において保存することができ、合計２４時間のうちの最大４時間は、室内光の曝露を伴い１５℃～２５℃（５９°～７７°Ｆ）の室温にあることができる。室温および室内光条件下での最大４時間の時間は、生成物の投与時間を含む。
治験薬を投与するための手順
ＩＶコホート（Ａ１～Ａ６）中の参加者は、１日目にＩＶ点滴を介して投与される単回用量を投与される。ＳＣコホート（Ｂ１～Ｂ３）中の参加者は、１日目にＳＣ注入を介して投与される単回用量を投与される。各コホートに対する予定される用量レベルは、以下の表５に含められる。以下に提供される用量上昇手順に記載される通り、最大用量を含む予定される用量レベルは、ＳＣコホートからのバイオアベイラビリティデータをはじめとする、先行コホートからの新たに得られたＰＤおよびＰＫデータに応じて変更することができる。予定される用量上昇工程に対する変更が必要とされる場合、最大用量上昇工程は、前の用量レベルの約３倍以下であろう。
各参加者は、ＢＭＳ－９８６３２６の用量コホートに応じて、ＳＣまたはＩＶ用量を投与される。ＳＣ注入は、折り畳まれた腹部皮膚（臍孔周囲５ｃｍを除く）へとゆっくりと途切れずに投与される。各注入は、最大で２ｍＬの容量である。注入部位反応を、以下に記載される通りの反応に関してモニタリングする。ＢＭＳ－９８６３２６は、約３０～６０分間にわたって点滴される。当初用量コホートに対しては比較的短い点滴時間を用いることができ、かつより高用量のコホートに対しては比較的長い点滴時間を用いることができる。輸液関連反応（ＩＲＲ）がモニタリングされる。
用量上昇手順：ＩＶコホートＡ１～Ａ６
用量上昇決定は、安全性、忍容性、およびＰＤ（ＴｒｅｇカウントおよびＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖ比率）により情報を得る。各用量上昇に先立って審査される安全性データの評価は、ＡＥ、ＰＥ、バイタルサイン、１２誘導安全性ＥＣＧ、臨床検査、および併用薬物療法／手順を含む。先行する用量レベルコホートからの最低２１日間の安全性データが、次の用量レベルコホートへの上昇に先立って審査される。次の用量レベルでの投与は、先行する（ＩＶまたはＳＣ）用量レベルコホートの安全性および忍容性が評価され、かつ許容可能であると見なされるまで、開始されない。
安全性および忍容性に加えて、ＰＤデータ（ＴｒｅｇカウントおよびＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖ比率）が、各ＩＶ用量レベルコホートが投薬を完了した後に審査され、かつ用量上昇決定を通知するために用いられる。新たに得られるＰＤデータが、３つ以内の連続するＩＶ用量レベルコホートにおいてＰＤ応答（すなわち、ピークＴｒｅｇ増加倍率）がプラトーに達するだけでなく、選択性の欠如を示唆するＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ細胞における概ね等しいピーク増加倍率（少なくとも２倍）が見られることを示す場合、より高いＩＶ用量レベルは調査されない。いかなる中断もＢＭＳ－９８６３２６に関連すると疑われないことを条件として、コホート内の８名の評価可能な参加者のうち、少なくとも６名からの安全性およびＰＤデータが、用量上昇前の安全性審査に必要とされる。用量上昇の目的のために、評価可能な参加者は、治験薬（ＢＭＳ－９８６３２６またはプラセボ）の１つの用量を投与された参加者であると定義される。
比較的早期のコホートからのＰＫデータは、利用可能になる場合、継続的に平均曝露を予測するために用いられる。コホートＡ５を含む先行コホートからのＰＫデータは、安全性およびＰＤデータに加えて、コホートＡ５から適宜のコホートＡ６へと移るための用量上昇決定のために用いられる。
予定される用量レベルは、先行コホートから取得されるデータに基づいて、改変または除外することができる。調査される最大ＩＶ用量は、いかなる個別の参加者においてもＮＯＡＥＬ曝露（ＡＵＣ［０～３３６ｈ］≦７５７μｇ・ｈ／ｍＬ）を超えない平均曝露ＡＵＣ（ＩＮＦ）を提供することが予測される用量である。予定される用量上昇工程に対する変更が必要とされる場合、最大用量上昇工程は、前の用量レベルの約３倍以下である。
ＳＣコホートＢ１～Ｂ３に関する用量上昇手順
第１のＳＣ用量レベルコホート（１ｍｇ）中の参加者に対するＢＭＳ－９８６３２６のＳＣ投与は、１ｍｇＩＶ用量レベルコホートからの２１日間の安全性データが審査された後に開始される。次のＳＣ用量レベルコホートに対する用量上昇は、先行するＳＣ用量レベルコホート（より低い用量）および先行するＩＶ用量レベルコホート（同様の用量）の両方における安全性、忍容性、およびＰＤ（ＴｒｅｇカウントおよびＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖ比率）データの審査後に行われる。各用量上昇に先立って審査される安全性データの評価は、ＡＥ、ＰＥ、バイタルサイン、１２誘導安全性ＥＣＧ、臨床検査、および併用薬物療法／手順を含む。両方の先行する用量レベルコホートからの最低２１日間の安全性データが、用量上昇に先立って審査される。
いかなる中断もＢＭＳ－９８６３２６に関連すると疑われないことを条件として、各ＳＣコホート内の８名の評価可能な参加者のうちの少なくとも６名からの安全性データが、用量上昇前に審査される。用量上昇の目的のために、評価可能な参加者は、治験薬（ＢＭＳ－９８６３２６またはプラセボ）の１つの用量を投与された参加者であると定義される。
比較的早期のコホートからのＰＫデータは、利用可能になる場合、継続的に平均曝露を予測するために用いられる。いかなる個別の参加者においても定常状態曝露（約３０６μｇ・ｈｒ／ｍＬのＡＵＣ［０～ＩＮＦ］）を超えないと予測されるＳＣ用量のみが投与される。
予定される用量レベルは、先行コホートから取得されるデータに基づいて、改変または除外することができる。予定される用量上昇工程に対する変更が必要とされる場合、最大用量上昇工程は、前の用量レベルの約３倍以下である。
用量改変／停止基準
先行するコホートからの以下の（ｆｌｏｗｉｎｇ）条件のうちのいずれかが満たされる場合、予定される通り、次の用量レベルへの上昇は継続することができない：
ａ．重篤ＡＥ（ＳＡＥ）が１名または複数のＢＭＳ－９８６３２６治療参加者において起こり、かつＢＭＳ－９８６３２６に関連すると考えられる；
ｂ．２名以上のＢＭＳ－９８６３２６治療参加者が、ＢＭＳ－９８６３２６に関連すると考えられる重篤ＡＥを経験する；
ｃ．同じコホート中の２名の参加者における研究薬投与に関連すると考えられる重症好酸球増加の発生。重症好酸球増加は、以下の通りに定義される：
ｉ．好酸球増加：５日間超にわたって継続する５０００細胞／μＬ超；
ｉｉ．症候性好酸球増加（好酸球増加≧１５００細胞／μＬ）：皮膚炎、粘膜炎、またはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）／アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）における２倍超の上昇を伴う好酸球増加；
ｄ．新たに得られたＰＤデータが、３つ以内の連続するＩＶ用量レベルコホートにおいてＰＤ応答（すなわち、ピークＴｒｅｇ増加倍率）のプラトー到達を示し、かつ新たに得られたＰＤデータが、ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ細胞において概ね等しいピーク増加倍率（少なくとも２倍）を示す；
ｅ．治験担当医または治験依頼者の医学的監視により、用量上昇の結果として参加者に許容できないリスクをもたらすと見なされるいずれかの他の事象。
上記のうちのいずれかが満たされる場合、利用可能な安全性、ＰＤ（ＴｒｅｇカウントおよびＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖ比率）、および曝露データの審査が行われる（ｐｅｒｆｏｍｅｄ）。データの評価が行われると、以下のことが行われる：
ａ．元来予定される通りに、用量上昇を継続することができる。これは、審査後、停止基準を満たすＡＥがＢＭＳ－９８６３２６に関連すると考えられないと判断される場合にのみ容認される；
ｂ．安全性および忍容性審査の結果に基づいて、または安全性シグナルのさらなる特性決定が適切である場合、停止基準を満たすＡＥが起こった用量レベルの反復を含めるように、予定される用量上昇を改変することができる。これは、審査後、停止基準を満たすＡＥがＢＭＳ－９８６３２６に関連すると考えられないと判断される場合にのみ容認される；
ｉ．中間用量（停止基準を満たす用量よりも低い）コホートを追加することができる；
ｃ．用量上昇を停止することができる。
安全性および忍容性を評価するためのプロトコール
スクリーニング時、安全性評価は、全身外観およびバイタルサインの評価、ならびに目、耳、鼻、口、喉、首、呼吸器、心血管、呼吸器、胃腸／腹部、リンパ系、筋骨格、皮膚、および神経系検査を含む完全な身体検査を含む。スクリーニング評価は、連続的ホルターモニタリング、１２誘導ＥＣＧ、ならびに先行するものおよび併用薬物療法使用の審査をさらに含む。バイタルサインモニタリングは、体温、呼吸数、血圧および心拍数を含む。
研究の経過中、追加の身体検査が、安全性評価の一部分として様々な異なる時点で行われる。これらの後続の身体検査は、頭部、耳、目、首、および喉；心血管系、神経系、および呼吸器系；腹部；皮膚（注入部位評価を含む）；および四肢の検査を目的とし、かつこれらを含む。
研究の経過中、様々な異なる時点で行われるさらなる安全性および忍容性評価はまた、バイタルサインモニタリング；心電図；連続的ホルターモニタリング；結核検査；注入部位モニタリング；ＣＯＶＩＤ－１９スクリーニング；ならびに臨床化学、凝固、および尿検査を含む安全性臨床検査評価も含む。
加えて、研究の経過中、有害事象および重篤有害事象評価が、安全性を評価するために用いられる。有害事象は、一般的に、研究治療を投与された臨床調査参加者における、かつこの治療との因果関係を必ずしも有しない、いずれかの新規の有害な医療事件または既存の医学的状態の悪化を含む。この評価は、部分的には、研究の経過中に得られる検査結果ならびに他の上述の安全性評価の結果に基づき、この評価は、研究の経過全体を通して行われる。重篤有害事象は、一般的に、いずれかの用量において、死亡をもたらすかまたは生命を脅かすかのいずれかであるいずれかの有害な医療事件として定義される。すべての有害事象および重篤有害事象の強度および因果関係は、起こった場合に評価される。
ＢＭＳ－９８６３２６の薬物動態（ＰＫ）および免疫原性を評価するためのプロトコール
別個の血清サンプルが、ＰＫおよび抗薬物抗体（ＡＤＡ）評価のために回収され、１日目にＢＭＳ－９８６３２６の最大１時間前に採取される投与前血清サンプル、１日目に採取される点滴終了時（ＥＯＩ）血清サンプル、および研究の全体を通して（例えば、２～２１日目の居住中ならびに２８日目、３６日目、４５日目、および５５日目の外来通院中）採取される追加の血清サンプルを含む。
適格参加者は、－２日目または－１日目から２１日目まで、臨床現場に居住する。治験薬（プラセボまたはＢＭＳ－９８６３２６のいずれか）が、無作為化スケジュールに従って１日目に投与される。参加者は、満足な安全性審査および必要な研究手順の完了に際して、２１日目に臨床現場から退院する。参加者は、２８日目、３６日目、４５日目、および５５日目に外来通院のために戻る。
ＢＭＳ－９８６３２６の薬物動態は、時間に対する血清濃度から誘導される。評価されるＰＫパラメータは、Ｃｍａｘ；Ｔｍａｘ；ＡＵＣ（０～Ｔ）；ＡＵＣ（ＩＮＦ）；ＣＬＴ／ＦまたはＣＬＴ；Ｖｚ／ＦまたはＶｚ；Ｔ－ＨＡＬＦ；およびＦを含む。
個別の参加者ＰＫパラメータ値は、検証されたＰＫ解析プログラムによる非コンパートメント法により誘導される。実際の時間が、解析のために用いられる。
血清サンプルは、二量体および単量体の両方のレベルを含む合計薬物を測定する、検証されたリガンド結合性アッセイにより、ＢＭＳ－９８６３２６に関して分析される。プラセボを投与された参加者から回収されたＰＫサンプルは分析されない。加えて、血清サンプルは、潜在的な単量体分析のために保管される。単量体レベルは、検証されていない予備的リガンド結合性アッセイを用いて測定することができる。
免疫原性サンプルは、検証された免疫原性アッセイにより、抗ＢＭＳ－９８６３２６抗体に関して分析される。投与前サンプルが、投薬に先立って１日目に回収され；後続のサンプル採取は、１５日目、２８日目、および５５日目に行うことができる。陽性であると確認されるサンプルを力価決定し、検証されたアッセイを用いる内因性ＩＬ－２に対する中和抗体の考えられる偶発的な（ｃｏｎｔｉｇｅｎｔ）将来の分析のためにバンクされる。
ＢＭＳ－９８６３２６の薬力学（ＰＤ）を評価するためのプロトコール
血液サンプルが回収され、限定するものではないが、細胞系統および活性化マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２５、ＣＤ３９、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ１２７、Ｆｏｘｐ３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ７、およびＫｉ６７を含むことができる表面マーカーにより、Ｔｒｅｇ、Ｔｃｏｎｖ、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞などの免疫細胞を定量化するために、フローサイトメトリーにより測定される。血液サンプルがまた回収され、ｐＳＴＡＴ５により特定されるＴｒｅｇ、Ｔｃｏｎｖ、ＣＤ８ Ｔ細胞、およびＮＫ細胞へのＢＭＳ－９８６３２６エンゲージメントを決定するために、フローサイトメトリーにより測定される。
エクスビボＴｒｅｇ抑制アッセイが、選択されたＳＣ投薬コホートにおいて行われる。血液サンプルが回収され、限定するものではないが、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン分泌の測定を含むことができるアッセイにおいて、活性化Ｔｃｏｎｖ細胞に対するエクスビボ抑制活性に関してＴｒｅｇ細胞が試験される。
ＢＭＳ－９８６３２６コホートＡ４（３ｍｇ単回静脈内点滴）からの予備的結果
プラセボを投与された対象と比較して、ＢＭＳ－９８６３２６を投与された対象において、Ｔｒｅｇはベースラインレベルから増加した。
ＩＩＩ．Ｃ．ｍＩＬ－２／ＣＤ２５融合タンパク質は全身性エリテマトーデスの前臨床モデルにおいてＴｒｅｇ拡大増殖および免疫抑制を誘導する
一般的概要
Ｔｒｅｇは、免疫応答の抑制および自己免疫の制御において、十分に確立された役割を有する［Bluestone et al., J Clin Invest. 125: 2250-60 (2015)；Dominguez-Villar et al., Nat Immunol. 19: 665-73 (2018)］。その通りに、Ｔｒｅｇは、自己寛容の誘導および維持を決定的に担う。Ｔｒｅｇ機能の調節異常は、多数の自己免疫状態に関連付けられてきた［Castela et al., JAMA Dermatol. 150: 748-51 (2014)；Koreth et al., N Engl J Med. 365: 2055-66 (2011)；Saadoun et al., N Engl J Med. 365: 2067-77 (2011)］。寛容誘導状態の促進は、薬物を用いない寛解を目的とする次世代免疫学療法の主要なゴールであり、Ｔｒｅｇの誘導および活性化は、このゴールに向けた魅力的な標的を代表する。
ＩＬ－２は、当初、強力なＴ細胞増殖因子として発見され［Gillis et al., J Exp Med. 146: 468-82 (1977)］、多数の研究が、炎症促進性免疫応答の促進におけるその役割に焦点を当ててきた。例えば、高用量ＩＬ－２（典型的には、反復される５００，０００Ｕ／ｋｇ）は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞機能を促進するための癌患者の治療に対する承認された療法であるが；しかしながら、奏効率は典型的には低く、かつ療法はまた、重度の毒性も伴う［Fraenkel et al., J Immunother. 25: 373-8 (2002)］。ＩＬ－２の追加の役割が、ＩＬ－２またはＩＬ－２Ｒを欠損するマウスにおける、障害された免疫応答ではなく、迅速な自己免疫の観察に起因して発見された［Sadlack et al., Cell 75: 253-61 (1993)；Suzuki et al., Science 268: 1472-76 (1995)；Willerford et al., Immunity 3: 521-30 (1995)］。この表現型は、ＩＬ－２がＴｒｅｇ発達および恒常性において果たす必須の役割の欠如から生じる［Cheng et al., J Immunol. 109: 1567-75 (2013)；Fontenot et al., Nat Immunol. 6: 1142-51 (2005)；Yao et al., Blood 109: 4368-75 (2007)］。マウスデータに合致して、ヒトＩＬ－２シグナル伝達経路における突然変異は、自己免疫疾患に関連付けられることが見出されており；ＩＬ－２、ＩＬ－２ＲＡ、およびＩＬ－２ＲＢ遺伝子座における自己免疫リスク変異体が、ゲノムワイド関連解析を通して特定されてきた［Abbas et al., Sci Immunol. 3 (2018)］。具体的には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）が、Ｔｒｅｇ機能障害に関連する自己免疫疾患として特定され、ＩＬ－２欠損状態が原因であるとされている［von Spee-Mayer et al., Ann Rheum Dis. 75: 1407-15 (2016)］。
前臨床的に、低いＩＬ－２Ｒシグナル伝達は、Ｔｒｅｇの主要な活性を選択的に強化するが、Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞の活性は強化しないことが示されてきた。低レベルのＩＬ－２を用いるマウスの治療は、非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいて糖尿病の発達を予防した［Grinberg-Bleyer et al., J Exp Med. 207: 1871-8 (2010)；Tang et al., Immunity 28: 687-97 (2008)；Yu et al., Immunity 30: 204-17 (2009)］。低用量ＩＬ－２を用いる数回の小規模な臨床試験が、ＳＬＥにおける有望な結果を伴って報告された［He et al., Nat Med. 22: 991-3 (2016)；Klatzmann et al., Nat Rev Immunol 15: 283-94 (2015)］。しかしながら、組み換えＩＬ－２治療は、毎日の注入を必要とする。さらに、炎症促進性サイトカインおよび非Ｔｒｅｇ細胞における望ましくない増加もまた観察された。
切断不可能リンカーにより連結されたマウスＩＬ－２（ｍＩＬ－２）とマウスＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）との融合タンパク質（ＦＰ）は、Ｔｒｅｇ拡大増殖およびＮＯＤマウスでの糖尿病の制御において、組み換えＩＬ－２よりも大きなインビボ有効性を示してきた［Ward et al., J Immunol. 201: 2579-92 (2018)］。インビボでは、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５は長寿命であり、持続的かつ選択的にＴｒｅｇを刺激する（Ward et al.）。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５融合タンパク質は、Ｔｒｅｇ拡大増殖の誘導ならびにタンパク尿のレベル、血清自己抗体力価、および炎症および損傷の腎臓組織学スコアに基づくＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１マウスおよびＭＲＬ／ｌｐｒマウスでのループス腎炎の阻害において有効であることが、本明細書中で実証される。その有効用量では、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて炎症促進性サイトカインまたは非Ｔｒｅｇ細胞のいかなる増加ももたらさない。考え合わせると、これらのデータは、ＳＬＥ患者の治療におけるＩＬ－２／ＣＤ２５融合タンパク質（ｐｒｏｔｉｅｎ）の使用を支持する。
ＮＺＢ×ＮＺＷマウスにおけるＴｒｅｇ ＣＤ２５発現
Ｔｒｅｇは、ＳＬＥ患者において異常調節される。高いパーセンテージのＴｒｅｇ（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）が、ＩＬ－２欠損状態を反映する比較的低いＣＤ２５発現レベルを示すことが報告された［Humrich et al., Expert Rev Clin Immunol. 12: 1153-60 (2016)］。ＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１は特発性ループスの古典的なモデルであり、ループス患者のものと同等の重度のループス様表現型を発症する［Xie et al., J Immunol. 192: 4083-92 (2014)］。ＮＺＢ×ＮＺＷループスモデルがＳＬＥ患者において観察される通りの比較的低いＣＤ２５発現のＴｒｅｇ異常性もまた獲得するか否かを評価するために、ＮＺＢ×ＮＺＷマウス（ｎ＝５、２６週齢）および対照ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６、９～１０週齢）由来の脾細胞を、ＣＤ４、ＦｏｘＰ３およびＣＤ２５について染色した。代表的なドットプロットを、図２Ａに示す。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞が、Ｔｒｅｇを表す。代表的なＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、Ｔｒｅｇのうちの７３％がＣＤ２５ｈｉであり；一方で、代表的ＮＺＢ×ＮＺＷマウスにおいて、Ｔｒｅｇのうちの３５％のみがＣＤ２５ｈｉであった。ＣＤ２５発現のレベルは、Ｔｒｅｇゲート（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）中のＣＤ２５蛍光強度中央値（ＭＦＩ）により決定した。図２Ｂに示される通り、ＢＡＬＢ／ｃ群に関して、ＣＤ２５ ＭＦＩは１７４４．８±９８．９（平均±ＳＥＭ）であり、ＮＺＢ×ＮＺＷマウスに関して、たった３６４．２±３４．５であった。したがって、ＳＬＥ患者において観察される低いＣＤ２５発現のＴｒｅｇ異常性は、ＮＺＢ×ＮＺＷマウスにおいて同様に観察される。
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｍＩＬ２－ＣＤ２５の短期的治療
ＮＺＢ×ＮＺＷループスマウスにおいてｍＩＬ－２／ＣＤ２５の慢性的作用を試験する前に、３回用量にわたって週２回投与されるＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、短期的研究（７日間）を行った。比較基準として、Ｆｃ－ｍＩＬ２を、４回用量にわたって隔日で投与した。脾臓を回収し、フローサイトメトリーにより分析し、血漿を、サイトカイン産生について評価した。０．２５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇでのｍＩＬ－２／ＣＤ２５投与は、Ｆｃ－ｍＩＬ２と比較して、ＣＤ４＋ゲート中のＴｒｅｇのパーセンテージにおける大きな増加をもたらした（図３Ａ）。単一細胞ゲート中のＣＤ８＋細胞のパーセンテージは、Ｔｒｅｇの増加に起因して低減し、いずれの分子もＮＫ細胞のパーセンテージを統計学的に変化させなかった（データは示していない）。潜在的な非Ｔｒｅｇエンゲージメントの高感度な尺度を与えるために、脾臓中の様々な細胞タイプの絶対数を、総脾臓カウントに基づいて算出した。同様に、０．２５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇでのｍＩＬ－２／ＣＤ２５投与は、Ｆｃ－ｍＩＬ２と比較して、Ｔｒｅｇの個数での大きな増加を示した（図３Ｂ）。ＣＤ８＋、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－、およびＮＫ細胞における最小限の変化がｍＩＬ２－ＣＤ２５に関して観察され、一方で、Ｆｃ－ｍＩＬ２は、これらの集団を顕著に増加させた（図３Ｃ～図Ｅ）。循環サイトカインの測定は、Ｔｒｅｇ選択性を支持する。これらの用量でのｍＩＬ－２／ＣＤ２５投与に関して、サイトカインは上昇せず、ＩＬ－５のみが、０．５ｍｇ／ｋｇ用量において若干上昇した（データは示していない）。これらの結果により、ｍＩＬ２－ＣＤ２５が、より大きなＴｒｅｇ増加を伴い、かつ非Ｔｒｅｇエンゲージメントの証拠を伴わずに、Ｆｃ－ｍＩＬ２と比較して、改善されたＴｒｅｇエンゲージメントおよび選択性プロファイルを与えることが確認された。これらの結果に基づいて、週２回の０．１～０．４ｍｇ／ｋｇの用量範囲が、ループスの動物モデルにおけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５有効性のさらなる試験のために選択された。
ＮＺＢ×ＮＺＷマウスでの早期ループスにおけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５
ＳＬＥの動物モデルにおけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５の作用を評価するために、３０ｍｇ／ｄＬでのタンパク尿レベル（１のスコア）を有する２２～２４週齢のＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１マウスを、研究に対して登録した。マウスに、０．１、０．２、および０．４ｍｇ／ｋｇにおいて週２回、ＰＢＳもしくはｍＩＬ－２／ＣＤ２５のｓ．ｃ．注入または陽性対照として機能するための週３回１０ｍｇ／ｋｇにおけるプレドニゾロンのｐ．ｏ．投薬のいずれかを投与した（群当たりｎ＝１０）。第１用量後に決定されるｍＩＬ２－ＣＤ２５の血清曝露（ＡＵＣおよびＣｍａｘ）は、０．１ｍｇ／ｋｇ用量と０．４ｍｇ／ｋｇ用量との間において、用量依存的様式で増加し、２０．６時間の平均終末半減期を伴った。ＰＫパラメータが、表６に提示される。１４週間の実験の経過にわたって、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５投与は十分な忍容性を示し、体重減少は観察されなかった（データは示していない）。タンパク尿スコアにより判断される通りの疾患進行は、用量依存的様式でｍＩＬ－２／ＣＤ２５投与により顕著に低減された（図４Ａ）。３以上のスコアを有する重症タンパク尿を発症する動物のパーセンテージもまた低減された（図４Ｂ）。マウスを採血もして、２～３週間毎に血清自己抗体の存在について調べた。抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ力価は、用量依存的様式でＰＢＳ治療マウスと比較してｍＩＬ－２／ＣＤ２５治療により顕著に低減され、プレドニゾロン対照において観察されるものと同等の最大作用（０．２ｍｇ／ｋｇ用量および０．４ｍｇ／ｋｇ用量の両方により達成された）を伴った（図４Ｃ）。顕微鏡的評価により、ＰＢＳ治療対照マウスの腎臓において顕著な糸球体腎炎が明らかになった。これは、様々な程度の糸球体における細胞過多およびマトリックス沈着、尿細管内腔におけるタンパク質円柱、ならびに間質および血管周囲組織における炎症性細胞浸潤により特徴付けられる。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５を用いる治療は、糸球体、尿細管および間質性腎炎に対する組織学スコアを顕著に低減させた（図４Ｄ）。結論として、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５は、ＮＺＢ×ＮＺＷループスモデルにおいて、用量依存的様式で、タンパク尿のレベル、ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ力価、および腎臓組織学スコアの低減における有効性を示し；最大有効性は、０．２ｍｇ／ｋｇおよび０．４ｍｇ／ｋｇ用量（２×／週）において観察され、高用量プレドニゾロンを用いて観察されるものと同等であった。
有効性をＴｒｅｇ拡大増殖の程度と関連付けるために、血液および脾臓（群当たりｎ＝４）を、投薬の４週間後（８回目の用量の４８時間後）にフローサイトメトリーのために回収した。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５治療は、血液および脾臓の両方において、ＣＤ４＋ゲート中のＴｒｅｇ（ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）のパーセンテージを用量依存的に増加させた。血液中では、Ｔｒｅｇのパーセンテージは、ＰＢＳ群での２．３±０．１％（平均±ＳＥＭ）から、それぞれ０．１、０．２、および０．４ｍｇ／ｋｇ用量群での１１．７±２．３％、２１．９±１．９％、２４．２±０．５％へと顕著に増加した（図５Ａ）。同様に、すべての用量において、脾臓Ｔｒｅｇのパーセンテージの増加が見られた（図５Ｂ）。脾細胞をまた、Ｔｒｅｇの増殖状態を実証するために、Ｋｉ６７についても染色した。図５Ｃに示される通り、Ｔｒｅｇゲート（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）中のＫｉ６７＋細胞のパーセンテージは、ＰＢＳ群での２７．０±６．４％から、それぞれ０．１、０．２、および０．４ｍｇ／ｋｇ ｍＩＬ－２／ＣＤ２５治療群での４９．５±５．９％、５６．６±２．４％、および６９．８±８．０％へと、用量依存的様式で増加した。Ｂａｌｂ／ｃマウスと比較してＮＺＢ×ＮＺＷでは低かったＴｒｅｇ上のＣＤ２５発現（ＣＤ２５ ＭＦＩ）（図２Ｂ）もまた、媒体群での１７４５±９６ ＭＦＩから、それぞれ０．１、０．２、および０．４ｍｇ／ｋｇ ｍＩＬ－２／ＣＤ２５治療群での４３６１±４０８、５３４０±３９０、および５０５７±３３５（±ＳＥＭ）ＭＦＩへと、用量依存的様式で増加した（図５Ｄ）。血液および脾臓Ｔｒｅｇはまた、投薬の１４週間後にも分析され、結果は、４週目で得られたものと同等であった（データは示していない）。結論として、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５治療は、Ｔｒｅｇの個数およびＴｒｅｇ上のＣＤ２５発現の両方を増加させ、これが結果として、ＮＺＢ×ＮＺＷループスマウスにおける疾患進行を阻害した。
ｍＩＬ－２／ＣＤ２５の０．１、０．２または０．４ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．用量後のｍＩＬ－２／ＣＤ２５の血清レベルは、用量依存的様式で増加した。０．１、０．２または０．４ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．用量後の薬物動態パラメータは、それぞれ３６８．９、８７７．２または２０４５．９ｎＭ・ｈ（ＡＵＣ０～８０ｈ）およびそれぞれ９．５、２６．５または５６．９ｎＭ（Ｃｍａｘ）であった。Ｔｍａｘは２４時間であった。平均終末半減期は２０．６時間であった。
ＮＺＢ×ＮＺＷマウスでの進行ループスにおけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５
ｍＩＬ－２／ＣＤ２５を、有効性に対するより高い障壁である後期疾患の徴候を改善するその能力について、さらに試験した。進行タンパク尿を有するマウス（１００ｍｇ／ｄＬ以上；約２７週齢）を、１０週間治療研究に対して登録した。０．３ｍｇ／ｋｇ ２×／週におけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５は、タンパク尿のレベル（図６Ａ）、抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ力価（図６Ｂ）、血漿ＩＬ－１２ｐ４０のレベル（図６Ｃ）、ならびに炎症および損傷に関する腎臓組織学スコア（図６Ｄ）の顕著な低減を示した。研究の完了時、脾細胞を用いてフローサイトメトリーを行った。ＣＤ４＋ゲート中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージは、ＰＢＳ群での５．５±０．６％（平均±ＳＥＭ）から、それぞれ０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇ ｍＩＬ－２／ＣＤ２５治療群での１８．９±４．８％および２２．４±６．３％へと増加した（図６Ｅ）。このデータは、より進行したループス患者の治療におけるＩＬ－２／ＣＤ２５に関する治療潜在能力を支持する。
ＮＺＢ×ＮＺＷマウスにおけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５およびプレドニゾンの組み合わせの作用
ループスにおける現行の標準治療であるコルチコステロイドに対する依存を低減するｍＩＬ－２／ＣＤ２５療法の潜在的な有用性を評価するために、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５（０．１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．２×／週）およびプレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．３×／週）の部分的有効用量を用いる組み合わせ研究を、３０ｍｇ／ｄＬのタンパク尿を有するＮＺＢ×ＮＺＷ早期ループスマウス（２１～２３週齢）において試験した。高用量のプレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．３×／週）群およびｍＩＬ－２／ＣＤ２５（０．２ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．２×／週）群は、最大有効性単剤療法対照として含められた。図７に示される通り、１ｍｇ／ｋｇプレドニゾロンまたは０．１ｍｇ／ｋｇ ｍＩＬ－２／ＣＤ２５のいずれかの単剤療法がタンパク尿レベルおよび抗ｄｓＤＮＡ力価の低減における部分的保護を示した一方で、両者の組み合わせは、高用量プレドニゾロンまたはｍＩＬ－２／ＣＤ２５対照と同等の有効性を示し、いずれかの療法単独よりも優れていた（図７Ａおよび図７Ｂ）。併用治療に伴う優れた作用はまた、ＲＴ－ＰＣＲに基づく、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３、ＭＸ１、ＩＲＦ７、ＧＢＰ２およびＬＩＧＰ１などの腎臓での１型インターフェロン遺伝子発現のさらなる低減によっても実証された（それぞれ、図８Ａ～図８Ｆ）。組織学スコアの高レベルの低減が、半定量的組織学スコアに基づいて０．１ｍｇ／ｋｇ ｍＩＬ－２／ＣＤ２５単剤療法を用いて既に達成されたので、併用治療の利点は、組織学スコアに基づいては比較的明らかでなかった（図７Ｃ）。
Ｔｒｅｇに対するｍＩＬ－２／ＣＤ２５の作用もまた、本研究の完了時（治療の１４週間後）に脾臓において評価した。予期される通り、プレドニゾロン単剤療法（１ｍｇ／ｋｇ群および１０ｍｇ／ｋｇ群の両方）が、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）のパーセンテージおよびＴｒｅｇ上のＣＤ２５ ＭＦＩを変化させなかった。以前の研究と合致して、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５単剤療法は、ＴｒｅｇのパーセンテージおよびＴｒｅｇ上のＣＤ２５ ＭＦＩを増加させた（図７Ｄおよび図７Ｅ）。重要なことに、プレドニゾロンの同時治療は、ＴｒｅｇのパーセンテージまたはＴｒｅｇ上のＣＤ２５ ＭＦＩの増加におけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５の作用に干渉しなかった（図６Ｄおよび図６Ｅ）。これらのデータは、ＩＬ－２／ＣＤ２５療法は、Ｔｒｅｇの個数の増加、およびＳＬＥ患者における疾患進行の潜在的な阻害におけるその有効性を失うことなく、標準治療ステロイド療法と効果的に組み合わせることができることを示唆する。
ＭＲＬ／ｌｐｒループスモデルにおけるｍＩＬ－２／ＣＤ２５
ｍＩＬ－２／ＣＤ２５を、ループスの別のネズミモデルであるＭＲＬ／ｌｐｒにおいても評価した。このモデルでは、抑制が効かない免疫細胞の異常増殖が、特発性自己免疫ループス様症候群を引き起こす。０．１、０．２、または０．４ｍｇ／ｋｇ ２×／週で１２週間にわたってｓ．ｃ．投与されたｍＩＬ－２／ＣＤ２５（群当たりｎ＝１０）は、タンパク尿（図９Ａ）、自己抗体産生（図９Ｂ）、および腎臓炎症および損傷（図９Ｃ）の悪化を防止した。ＮＺＢ×ＮＺＷ研究におけるデータと同様に、０．２ｍｇ／ｋｇ～０．４ｍｇ／ｋｇの用量範囲が、上記の３つのエンドポイントのすべてにおいて最大有効性を達成した。ここでもまた、血液および脾臓（各群からｎ＝４）を、研究の完了時（最初の投薬の１２週間後、最後の用量の４８時間後）にフローサイトメトリーのために回収した。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５治療は、血液および脾臓の両方において、ＣＤ４＋ゲート中のＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）のパーセンテージを用量依存的に増加させた。血液では、パーセントＴｒｅｇは、ＰＢＳ群での４．０±０．８％（平均±ＳＥＭ）から、それぞれ０．１、０．２、および０．４ｍｇ／ｋｇ用量群での１４．３±２．３％、２１．９±６．２％、および２８．１±５．５％へと顕著に増加した（図９Ｄ）。同様に、すべての用量で、脾臓Ｔｒｅｇにおける増加が見られた（図９Ｅ）。図９Ｆに示される通り、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ゲート中のＣＤ２５ ＭＦＩは、ＰＢＳ群での１８４２±１１８（平均±ＳＥＭ）から、それぞれ０．１、０．２、および０．４ｍｇ／ｋｇ ｍＩＬ－２／ＣＤ２５治療群での３３０１±４７０、６１８５±７１３、および６８６３±６８０へと顕著に増加した。結論として、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇの個数およびＴｒｅｇ上のＣＤ２５発現を増加させることにより、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて疾患進行を阻害する。
考察
活動性ＳＬＥの管理は、疾患の不均一な性質に起因して、困難である［Franklyn, et al., Nat Rev Rheumatol. 10: 567-71 (2014)；Tsokos, N Engl J Med. 365: 2110-21 (2011)］。活動性ＳＬＥの現行の療法は、主に、疾患活動性を低減させるためのコルチコステロイドおよび免疫抑制剤に依存する。しかしながら、これらの薬物は完全に効果的ではなく、したがって、転帰は、顕著な副作用、特に、治療関連感染によりさらに相殺される［Goldblatt, et al., Lupus 18: 682-89 (2009)；Kang et al., Curr Opin Rheumatol. 15: 528-34 (2003)；Bruce, et al., Lupus 25: 699-709 (2016)］。Ｔｒｅｇは、ＳＬＥ発症機序において多数の重要な細胞タイプおよび経路の広範な上流制御を提供し、このことが、Ｔｒｅｇ修飾を他のＳＬＥ臨床パイプライン資産から区別する。Ｔｒｅｇの主要標的はエフェクターＴ細胞活性であるが、免疫応答のＴｒｅｇ制御は、ＮＫおよびＮＫ Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージ／抗原提示細胞に影響を及ぼし、かつ組織修復をさらに促進する潜在能力をはじめとして、Ｔエフェクター細胞を越えて働く［Abbas, et al., Sci Immunol. 3 (2018)；Dutcher et al., J Immunother Cancer. 2:26 (2014)；Li et al., Front Immunol. 9: 585 (2018)；Tiemessen et al., Proc Natl Acad Sci USA 104: 19446-51 (2007)；Williams et al., Nature 441: 890-3 (2007)］。炎症および自己免疫を抑制するＴ調節機能を強化するための低用量ＩＬ－２療法の使用が、ＳＬＥ研究を含む複数の臨床試験における有望な予備的結果に基づいて、注目を集めてきている［Castela et al., JAMA Dermatol. 150: 748-51 (2014)；Saadoun et al., N Engl J Med. 365: 2067-77 (2011)、Abbas et al., Sci Immunol. 3 (2018)；von Spee-Mayer et al., Ann Rheum Dis. 75: 1407-15 (2016)；He et al., Nat Med. 22: 991-3 (2016)；Churlaud et al., J Allergy Clin Immunol 142: 1344-6 (2018)；Rosenzwajg et al., J Autoimmun. 58: 48-58 (2015)；Rosenzwajg et al., Ann Rheum Dis. 78: 209-17 (2019)］。１１種類の自己免疫疾患を通した低用量ＩＬ－２の予備的結果は、このアプローチによる広範な有用性に対する潜在能力を実証している［Rosenzwajg et al., Ann Rheum Dis. 78: 209-17 (2019)］。
切断不可能リンカーを用いてＣＤ２５に融合されたＩＬ－２からなる長期作用性ＩＬ－２受容体アゴニストは、マウスにおいてインビボで血清半減期およびＴｒｅｇ選択性に関して組み換えＩＬ－２を超える改善を示している［Ward et al., J Immunol. 201: 2579-92 (2018)］。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５融合タンパク質は、固有の作用機序（ＭＯＡ）を有し、溶液中では自己遮断性不活性ホモ二量体分子として優勢に存在する。解離を介する活性単量体の緩慢な放出およびＣＤ２５発現Ｔｒｅｇによる捕捉が、細胞活性化および増殖につながる［Ward et al., J Immunol. 201: 2579-92 (2018)］。このＭＯＡは、不活性な二量体形態で循環するので標的媒介クリアランス（ＴＭＤＤ）を回避するこの分子の能力に部分的に起因して、この分子が、ＩＬ－２受容体アゴニズムを送達する他のメカニズムによって達成されていない薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）延長を達成することを可能にする。本明細書中で示される通り、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５は、延長したＰＫ（Ｔ１／２：２０．６時間）ならびにループスおよびループス腎炎の２種類の一般的なモデルであるＮＺＢ×ＮＺＷおよびＭＲＬ／ｌｐｒマウスの両方におけるＴｒｅｇに対する望ましいＴｒｅｇ拡大増殖／ＣＤ２５アップレギュレーションを有する。さらに、ＮＺＢ×ＮＺＷモデル由来のＴｒｅｇの分析は、ＳＬＥ患者からの観察に類似する、ＩＬ－２欠損のマーカーである低減したＴｒｅｇ ＣＤ２５レベルを実証した。結果は、ＮＺＢ×ＮＺＷモデルが、ヒト疾患において観察されるＴｒｅｇ機能障害の要素を反復することを示唆する。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５は、このモデルにおける見かけの（ｔｈ ａｐｐａｒｅｎｔ）ＩＬ－２欠損を反転させ、それにより、Ｔｒｅｇ数およびＣＤ２５発現の両方における増加を引き起こした。
ｍＩＬ－２／ＣＤ２５を用いて観察されるＴｒｅｇ誘導および活性化は、ＮＺＢ×ＮＺＷマウスが進行疾患の徴候を示した時点で治療が開始された場合でさえも、低減されたタンパク尿レベル、自己抗体力価および腎臓組織学スコアにより判断される通り、疾患進行の顕著な低減をもたらした。本明細書中で試験された用量は、非Ｔｒｅｇ細胞または炎症促進性サイトカイン産生を活性化しない。重要なことに、用量応答関係は、顕著かつ持続的なＴｒｅｇ増加がこのモデルにおける最大有効性のために必要とされることを示唆し、ロバストかつ持続性であるが選択的なＴｒｅｇ増加は、ヒト疾患における最大有効性のために必要とされるであろうことを示唆する。
コルチコステロイドは未だ、特に再燃を治療するための、ループス治療の主力である。コルチコステロイドは、Ｔ細胞応答を阻害することが公知であるが；しかしながら、Ｔｒｅｇは、Ｔエフェクター細胞よりもステロイド治療に対して感受性が低い場合がある［Prenek, et al., Apoptosis 25: 715-29 (2020)］。本明細書中で実証される通り、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５治療は、低用量ステロイドと組み合わせる場合でさえ、Ｔｒｅｇを増加させ、かつ疾患を改善することができる。併用治療は、いずれかの単剤療法と比較して、有効性読み出し値の大部分における改善をもたらす。これらの結果は、ｍＩＬ２／ＣＤ２５治療により提供されるものなどの、長期的かつ選択的なＩＬ－２Ｒ ＴｒｅｇアゴニズムをＳＬＥ標準治療と組み合わせる潜在的な臨床的有用性が、改善された有効性を達成することを示唆する。
現在まで、開発されてきたヒトＩＬ－２／ＣＤ２５融合タンパク質は、規定された用量でカニクイザルにおいて長期的かつ選択的なＴｒｅｇ活性化を示す（未公開結果）。ヒトＩＬ－２／ＣＤ２５は、ＰＫ、ＰＤ（Ｔｒｅｇ）、安全性および忍容性の評価のために臨床試験において試験されるであろう。Ｔｒｅｇ集団におけるＩＬ－２欠損を有するＳＬＥ患者を選択的に標的化するという仮説が、臨床において調査されるであろう。臨床的有効性ならびにステロイド回避および長期的寛解を提供するこのメカニズムに関する潜在能力を明らかにすることは、将来の研究における課題である。
材料および方法
試薬：
ｍＩＬ－２／ＣＤ２５は、ＩＬ－２のＣ末端とＣＤ２５の細胞外領域のＮ末端との間の１２アミノ酸からなるリンカーを用いてネズミＩＬ－２をネズミＩＬ－２受容体αサブユニット（ＣＤ２５）へと組み合わせる融合タンパク質である。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５融合タンパク質は、非共有的自己遮断性二量体を形成する。生化学的評価は、二量体が受容体に結合せず、したがって、標的媒介薬物生体内挙動から保護されることを支持する。緩慢な解離は、ＩＬ－２Ｒの活性化を生じる低用量の活性単量体をもたらす［Ward et al., J Immunol. 201: 2579-92 (2018)］。プレドニゾロン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、対照化合物として用いられる抗炎症性ステロイド薬物療法である。
マウス研究におけるフローサイトメトリーのための抗体パネルは、以下の抗体を含む：ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＣＤ４－Ｖ５００（クローンＲＭ４－５）、ｐＳＴＡＴ５－ＡＦ４８８（クローン４７／Ｓｔａｔ５ ｐＹ６９４）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローン５３－６．７）、ＣＤ２５－ＰＥ（クローンＰＣ６１．５）、Ｆｏｘｐ３－ｅｆ４５０（クローンＦＪＫ－１６ｓ）、およびＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのＣＤ３３５－ＢＶ６０５（クローン２９Ａ１．４）、Ｋｉ６７－ＡＰＣ（クローン１６Ａ８）。
マウス：
雌性ＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１、雌性ＢＡＬＢ／ｃ、および雄性ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）からのものであった。すべての手順は、ＢＭＳ動物ケアおよび使用委員会により承認されたプロトコールに従って行った。
タンパク尿モニタリング：
治療群への無作為化に先立って、Ａｌｂｕｓｔｉｘ試験紙上にマウスの排尿を誘導することにより、Ａｌｂｕｓｔｉｘ（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてタンパク尿についてマウスを評価した。微量～３０ｍｇ／ｄＬに対応するタンパク尿レベル読み出し値を有するマウスを、早期疾患における有効性の評価のための研究に含めた。早期疾患研究に登録されたマウスの典型的な週齢は、ＮＺＢ×ＮＺＷマウスに関して２１～２３週齢およびＭＬＲ／ｌｐｒマウスに関して１２～１４週齢である。１００ｍｇ／ｄＬ超のタンパク尿レベルを有するＮＺＢ×ＮＺＷマウス（２７週齢付近）を、進行疾患における有効性の評価のための研究に含めた。研究の持続期間にわたって２～３週間毎に、タンパク尿の存在についてマウスをモニタリングし続けた。タンパク尿は、以下の通りに製造業者の説明書に従ってスコア付けした：微量：０．５；３０ｍｇ／ｄＬ以上：１；１００ｍｇ／ｄＬ以上：２；３００ｍｇ／ｄＬ以上：３；２０００ｍｇ／ｄＬ以上：４。
マウス投薬
マウスに、ＰＢＳ媒体中の注入当たり２００μＬの投薬容量を用いて、週２回、皮下的（ｓ．ｃ．）にｍＩＬ－２／ＣＤ２５を注入した。プレドニゾロンを投与されるマウスは、水中に溶解された１０ｍＬ／ｋｇの投薬容量を用いて、週３回、経口的（ｐ．ｏ．）に１０ｍｇ／ｋｇを投与された。
血清抗体力価
研究中、２～３週間毎に、イソフルランを用いてマウスを麻酔し、採血した。研究の完了時、血清を、ＥＬＩＳＡにより抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の存在に関して試験した。進行ループスを有するＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来のプール血清を、各アッセイにおける陽性比較基準として用いた。自己抗体レベルを、陽性対照血清を用いて作成された標準曲線（ｓｔａｎｄ ｃｕｒｖｅ）に基づいて、任意単位において定量化した。ＩＬ－１２ｐ４０血清タンパク質レベルは、製造業者の説明書に従って、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＩＬ－１２ｐ４０ ＥＬＩＳＡキットを用いて、１０週間のｍＩＬ－２／ＣＤ２５投薬の終了時に採取した血清から測定した。
組織学
研究の終了時、各動物由来の一方の腎臓を剖出し、１０％ＮＢＦ中で７２時間浸漬固定し、完全に固定されたら、横方向に切り出し、慣用の通りに加工およびパラフィン包埋（ＲＰＰＥ）し、Ｈ＆Ｅ染色に関して４μｍおよびＰＡＳＨ染色に関して３μｍで薄切した。スライドは、腎炎の顕微鏡分析のために、単盲検様式で訓練された組織学者により評価した。糸球体腎炎（ＧＮ）および尿細管間質性腎炎（ＴＩＮ）を、関連する病理学を個別に評価する半定量的０～４スケールを用いてスコア付けした。ＧＮは、メサンギウムに対する変化、細胞性円柱形成、糸球体係蹄における単核細胞浸潤、およびボーマン嚢の線維硬化に関してスコア付けした。ＴＩＮは、尿細管内腔浸潤物に対する変化、尿細管上皮細胞再生、タンパク質円柱、間質線維化、および単核細胞浸潤に関してスコア付けした。理論的最大合計腎炎スコアは３６であった。
血液および脾臓調製および染色
血液サンプルをヘパリン管に回収し、続いて、３７℃において１０分間、１×ＢＤ ＦＡＣＳ溶解溶液を用いて直ちに溶解および固定した。細胞を、ＰＢＳを用いて１回洗浄し、続いて、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳを用いて二度目に洗浄し、その後、４℃で３０分間、氷冷メタノールを用いて透過化した。続いて、サンプルを、染色に対して過剰のメタノールを除去するために、２回洗浄した。
ＰＢＳ中に回収された脾臓サンプルを、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）を用いて粉砕して単一細胞懸濁物を調製し、続いて、７０μＭストレイナーを用いてろ過した。ＡＣＫ溶解バッファーを用いて、赤血球を溶解させ、かつ細胞懸濁物を、４０μＭストレイナーを用いてもう一度ろ過した。細胞を、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中に再懸濁し、かつ１×１０６個の細胞を、３７℃で１０分間、１．５％パラホルムアルデヒドを用いて直接的に固定した。細胞を、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳを用いて洗浄し、その後、４℃で３０分間、氷冷メタノールを用いて透過化した。続いて、サンプルを、染色前に過剰のメタノールを除去するために２回洗浄した。
調製された血液または脾臓サンプルを、ＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてブロッキングし、続いて、４℃で４５分間、細胞表面（ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ２５／ＣＤ３３５）および細胞内（Ｆｏｘｐ３／Ｋｉ６７／ｐＳＴＡＴ５）マーカーによって同時染色した。サンプルを、ＢＤ ＣａｎｔｏＸフローサイトメーターを用いて取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いてデータを解析した。
腎臓ＲＴ－ＰＣＲ
研究の完了時、各マウス由来の一方の腎臓を、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ中に回収し、続いて、Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒを含むｍＲＮＡ Ｃａｔｃｈｅｒ溶解バッファー中でホモジナイズした。ｍＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、ｍＲＮＡ Ｃａｔｃｈｅｒ ＰＬＵＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製した。ｃＤＮＡを、ランダムヘキサマープライマーと共にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩを用いて合成した。ＰＣＲを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。相対的定量化分析を、ハウスキーピング遺伝子としてシクロフィリン（ＰＰＩＡ）を用いる２－ΔΔＣＴ法を用いて決定した。炎症性サイトカインおよび白血球表面受容体の発現を分析した。プライマーペア：
Ｉｆｉｔ１：5'-AGAGCAGAGAGTCAAGGCAGGT-3'（配列番号３５）；5'-TGGTCACCATCAGCATTCTCTCCCA-3'（配列番号３６）
Ｉｆｉｔ３：5'-GCTCAGCCCACACCCAGCTTT-3'（配列番号３７）；5'-AGATTCCCGGTTGACCTCACTCAT-3'（配列番号３８）
Ｍｘ１：5'-ACTACCAGGAGTGCAGACGGAA-3'（配列番号３９）；5'-TCCTCCAGGAACCAGCTGCACTTA-3'（配列番号４０）
Ｉｒｆ７：5'-GAGTCTGGGGCAGACCCCGT-3'（配列番号４１）；5'-CTGCGCTCGGTGAGAGCTGG-3'（配列番号４２）
Ｇｂｐ２：5'-AGCTGCTAAACTTCGGGAACAGGA-3'（配列番号４３）；5'-AGAGGTTTGGGCCTTGGGCCT-3'（配列番号４４）
Ｌｉｇｐ１：5'-GGACACAGGAGTTTCTGTGCCTTT-3'（配列番号４５）；5'-AGGTGAAGAGAACAGCTGACCCA-3'（配列番号４６）
薬物動態
ｍＩＬ－２／ＣＤ２５の血清レベルを、第１用量（０．１、０．２または０．４ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）後のＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１マウスにおいて決定した。血液サンプル（０．１ｍＬ）を、複合サンプル採取（時点当たり４マウス）を用いて、用量の２４時間、４８時間、および８０時間後に、顎下採血により取得した。血液サンプルを凝固させ、４℃で遠心分離（１５００～２０００×ｇ）して、血清を得た。血清サンプルを、化学発光プラットフォーム上でのリガンド結合性アッセイによる分析まで、－８０℃で保存した。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５の薬物動態パラメータ（ＡＵＣ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘおよび半減期）は、血清濃度対時間データの非コンパートメント解析により取得した（Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ、バージョン６．４、Ｃｅｒｔａｒａ ＵＳＡ、Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）。
血清中のｍＩＬ－２／ＣＤ２５の定量化のためのリガンド結合性アッセイ
サンプル、標準、および品質対照は、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の３３％マウス血清の最終マトリックス濃度とした。簡潔には、９６ウェル黒色プレートを、４℃で一晩、ＰＢＳ中１．０μｇ／ｍＬにおいてラット抗マウスＣＤ２５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ－クローン：ＰＣ６１．５）を用いてコーティングした。プレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／２０％カゼインを用いて１時間ブロッキングし、続いて、室温で２時間、血清と共にインキュベーションした。ｍＩＬ－２／ＣＤ２５を、ビオチン化ラット抗マウスＩＬ－２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ－クローン：ＪＥＳ６－ＳＨ４）、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ－西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＰｉｃｏ化学発光基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に逐次的にインキュベーションすることにより検出した。プレートを、発光モードにおいてＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー中で読み取った。マウス血清中のｍＩＬ－２／ＣＤ２５の濃度は、ｍＩＬ－２／ＣＤ２５キャリブレーターから作成した対数－対数線形較正曲線（Ｓｏｆｔｍａｘ解析プログラム、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、発光強度から算出した。アッセイＬＬＯＱは２５ｐｇ／ｍＬであった。
概要および要約セクションでなく、詳細な説明セクションは、特許請求の範囲を解釈するために用いることが意図されることが理解されるべきである。概要および要約セクションは、本発明者（ら）により考慮される通りの１つまたは複数であるがすべてではない本発明の例示的な態様または実施形態を説明することができ、したがって、いかようにも本発明の範囲および添付の特許請求の範囲を限定することは意図されない。
本発明が、明記される機能およびその関係の遂行を例示する機能的構成要素を用いて上記で説明されてきた。これらの機能的構成要素の境界は、説明の便宜のために本明細書中で任意的に定義されている。明記される機能およびその関係が適切に果たされる限り、代替的な境界を定義することができる。
具体的態様および実施形態の上記の説明は、過度の実験を伴わずに、本発明の一般的概念から逸脱することなく、そのような具体的な態様または実施形態を、当技術分野の技能の範囲内の知識を適用することにより、他者が容易に改変および／または様々な応用に適合させることができるように、本発明の一般的性質を完全に明らかにするであろう。したがって、そのような適合化および改変が、本明細書中に提示される教示および案内に基づいて、開示される態様または実施形態の意味および均等物の範囲内に入ることが意図される。本明細書中の言い回しおよび用語は、説明の目的のためのものであり、限定の目的のためのものではなく、したがって、本明細書の用語および言い回しは、教示および案内に照らして当業者により解釈されるはずであることが理解されるべきである。
本発明の広がりおよび範囲は、上記の例示的な態様または実施形態のうちのいずれによっても限定されるべきではないが、以下の特許請求の範囲およびその均等物に従ってのみ定義されるべきである。
本出願の特許請求の範囲は、親出願または他の関連出願のものとは異なる。したがって、本出願人は、本出願との関連における親出願またはいずれかの先行出願においてなされる特許請求の範囲のいかなる放棄も撤回する。したがって、審査官は、いずれかのそのような以前の放棄および無効にするために引用された参考文献を再検討する必要があることを助言される。さらに、審査官はまた、本出願においてなされるいかなる放棄も、親出願へと、または親出願に対すると理解されるべきではないことも想起させられる。

Claims (46)

  1. インターロイキン－２（ＩＬ２）融合タンパク質の用量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法であって、融合タンパク質は、
    （ａ）ＩＬ２ポリペプチドを含む第１のポリペプチド；および
    （ｂ）インターロイキン－２受容体α（ＩＬ２Ｒα）ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第２のポリペプチド
    を含み；
    （ｉ）ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、ネイティブＩＬ２Ｒα（配列番号１）の細胞外ドメインと比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有し；かつ／または（ｉｉ）ＩＬ２ポリペプチドは、ネイティブＩＬ２（配列番号２）と比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有し；
    用量は、約０．１ｍｇ～約９ｍｇである、
    方法。
  2. 融合タンパク質が、局所、表皮、粘膜、鼻内、経口、膣内、直腸、舌下、静脈内、腹腔内、筋内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外または胸骨内経路を介して対象に投与される、請求項１に記載の方法。
  3. 融合タンパク質が、静脈内経路を介して対象に投与される、請求項１に記載の方法。
  4. 用量が、約０．３ｍｇ～約９ｍｇである、請求項３に記載の方法。
  5. 用量が、約３ｍｇ～約９ｍｇである、請求項３に記載の方法。
  6. 用量が、約６ｍｇ～約９ｍｇである、請求項５に記載の方法。
  7. 用量が、約０．１ｍｇ～約３ｍｇである、請求項３に記載の方法。
  8. 用量が、約０．１ｍｇ～約１ｍｇである、請求項７に記載の方法。
  9. 用量が、約０．１ｍｇ～約０．３ｍｇである、請求項８に記載の方法。
  10. 用量が、約０．３ｍｇ～約６ｍｇである、請求項３に記載の方法。
  11. 用量が、約１ｍｇ～約３ｍｇである、請求項１０に記載の方法。
  12. 用量が、約９ｍｇ超である、請求項３に記載の方法。
  13. 融合タンパク質が、皮下経路を介して対象に投与される、請求項１に記載の方法。
  14. 用量が、約１ｍｇ～約８ｍｇである、請求項１３に記載の方法。
  15. 用量が、約３ｍｇ～約８ｍｇである、請求項１４に記載の方法。
  16. 用量が、約６ｍｇ～約８ｍｇである、請求項１５に記載の方法。
  17. 用量が、約１ｍｇ～約６ｍｇである、請求項１４に記載の方法。
  18. 用量が、約１ｍｇ～約３ｍｇである、請求項１７に記載の方法。
  19. 用量が、約３ｍｇ～約６ｍｇである、請求項１４に記載の方法。
  20. 用量が、約１ｍｇ、約３ｍｇ、約６ｍｇ、または約８ｍｇである、請求項１３に記載の方法。
  21. 用量が、約８ｍｇ超である、請求項１３に記載の方法。
  22. 用量のうちの２つ以上が、２つの用量間に投薬間隔を置いて投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 投薬間隔が、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約１ヵ月間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約２ヵ月間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、または少なくとも約３ヵ月間である、請求項２２に記載の方法。
  24. 投薬間隔が少なくとも約３週間である、請求項２３に記載の方法。
  25. 投薬間隔が約３週間である、請求項２２に記載の方法。
  26. 投薬間隔が、用量全体を通して同じである、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 投薬間隔が、用量全体を通して異なる、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
  28. ２つ以上の用量のうちの少なくとも１つが静脈内投与され、かつ２つ以上の用量のうちの少なくとも１つが皮下投与される、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
  29. 静脈内投与される用量が、皮下投与される用量の前に与えられる、請求項２８に記載の方法。
  30. 最初の用量が静脈内投与され、かつ最後の用量が皮下投与される、請求項２２から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 疾患または障害が、感染性疾患または免疫媒介疾患である、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 免疫媒介疾患が、炎症性疾患または自己免疫疾患である、請求項３１に記載の方法。
  33. 免疫媒介疾患が、１型糖尿病；多発性硬化症；関節リウマチ；セリアック病；全身性エリテマトーデス；ループス腎炎；皮膚ループス；若年性特発性関節炎；クローン病；潰瘍性大腸炎；全身性硬化症；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；乾癬；円形脱毛症；ＨＣＶ誘導型血管炎；シェーグレン症候群；天疱瘡；強直性脊椎炎；ベーチェット病；ウェゲナー肉芽腫症；高安病；自己免疫性肝炎；硬化性胆管炎；グジェロー・シェーグレン；炎症性腸疾患；免疫調節異常多腺性内分泌障害腸疾患Ｘ連鎖（ＩＰＥＸ）症候群；およびマクロファージ活性化症候群からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
  34. 免疫媒介疾患が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、または皮膚ループスである、請求項３３に記載の方法。
  35. 免疫媒介疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項３４に記載の方法。
  36. コルチコステロイドを対象に投与する工程をさらに含む、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. コルチコステロイドがプレドニゾロンである、請求項３６に記載の方法。
  38. コルチコステロイドが、局所、経口、静脈内、または筋内経路を介して対象に投与される、請求項３６または３７に記載の方法。
  39. コルチコステロイドが、融合タンパク質の各用量の前、それと同時、または後に投与される、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. コルチコステロイドの２つ以上の用量が、各用量の間に投薬間隔を置いて、対象に投与される、請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインが、ネイティブＩＬ２Ｒα（配列番号１）の細胞外ドメインと比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化、少なくとも２箇所少ないグリコシル化、少なくとも３箇所少ないグリコシル化、少なくとも４箇所少ないグリコシル化、少なくとも５箇所少ないグリコシル化、少なくとも６箇所少ないグリコシル化、少なくとも７箇所少ないグリコシル化、少なくとも８箇所少ないグリコシル化、または少なくとも９箇所少ないグリコシル化を有する、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. ＩＬ２ポリペプチドが、ネイティブＩＬ２（配列番号２）と比較して、少なくとも１箇所少ないグリコシル化を有する、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 第１のポリペプチドが、配列番号２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 第２のポリペプチドが、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 第２のポリペプチドが配列番号４である、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 第２のポリペプチドが配列番号３である、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
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