KR20230097094A - 질환의 치료를 위한 융합 단백질 - Google Patents

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KR20230097094A
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앨리스 엘. 왕
메리 스트루더스
킴벌리 맥고먼
닐란자나 레이
카렌 디. 프라이스
니디 샤르다
은 미 허
프리얀카 아푸르바 마디아
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 인터류킨-2 (IL2) 융합 단백질의 1회 이상의 용량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 용량은 약 0.1 mg 내지 약 9 mg인, 상기 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 또한, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 IL2 융합 단백질의 용량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 용량은 약 9 mg 초과인, 상기 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 방법에 사용되는 IL2 융합 단백질은 (a) IL2 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (b) IL2 수용체 알파 (IL2Rα) 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애는 면역-매개 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스이다. 일부 측면에서, 방법은 대상체에게 코르티코스테로이드를 추가로 투여한다.

Description

질환의 치료를 위한 융합 단백질
관련 출원에 대한 상호 참조
본 PCT 출원은 2020년 10월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 63/198,615 및 2020년 12월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 63/123,991을 우선권 주장하며, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
전자 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원과 함께 출원된 ASCII 텍스트 파일 (명칭: 3338.234PC02_SL_ST25.txt; 크기: 49,540 바이트; 및 생성일: 2021년 10월 29일)의 전자 제출된 서열 목록의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 분야
본 개시내용은 인터류킨-2 (IL2)/IL2 수용체 α 융합 단백질의 1회 이상의 용량을 투여함으로써 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 배경기술
인터류킨-2 (IL2 또는 IL-2)는 면역계의 주요 측면을 조절하는 생물학적 시토카인이다. IL-2는 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 갖는 환자에서 면역 반응을 부스팅하기 위한 시도에서 사용되어 왔다. IL-2는 항원-활성화된 T 세포의 클론 확장을 포함한 면역 반응을 촉진하고, CD4+ T-헬퍼 (Th)1 및 Th2 세포의 발생을 유도하고, CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL)를 최종적으로 분화시키고, CD4+ Th17 및 T-여포성 헬퍼 (Tfh) 세포의 발생에 대항하는 강력한 T 세포 성장 인자이다. IL-2는 또한 T 세포 기억 회상 반응을 형성한다.
Treg에 대한 IL-2 신호전달 경로의 중요성은 IL-2 신호전달 경로의 성분이 결여된 마우스 또는 인간에서 전신 자가면역의 출현에 의해 입증되었다. 조절 T 세포 (Treg) 수 및/또는 기능의 조절이상은 수많은 면역-매개 상태에 연루되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Bluestone, J.A., et al., J Clin Invest. 125:2250-60 (2015); 및 Dominguez-Villar, M and Hafler, D.A., Nat Immunol. 19:665-73 (2018)]을 참조한다. IL-2, IL-2Rα 및 IL-2Rβ 유전자좌에서의 자가면역 위험 변이체는 게놈전반 연관 연구 (GWAS)를 통해 확인되었고, 염증성 장 질환 (IBD), 제1형 자가면역 당뇨병 (T1DM), 다발성 경화증 (MS) 및 류마티스 관절염 (RA)을 포함한 면역-매개 질환과 연관되었다. 예를 들어, 문헌 [Abbas, A.K., et al., Sci Immunol. 3, eaat1482 (2018)]을 참조한다. 주요 Treg 계통 전사 인자 FoxP3에 영향을 미치는 돌연변이는 자가면역 림프증식성 질환, 면역 조절이상, 다발내분비병증, 장병증, X-연관 (IPEX) 증후군을 유발하며, 이는 기능적 Treg의 상실로부터 발생한다. 또한, IL-2RA에서의 돌연변이로 인한 CD25 결핍을 갖는 환자는 IPEX 증후군과 유사한 면역 조절이상을 앓는다. 예를 들어, 문헌 [Verbsky, J.W. and Chatila, T., Curr Opin Pediatr. 25(6):708-14 (2013)]을 참조한다. 유전자 데이터는 마우스 및 인간 둘 다에서 Treg 기능 및 자가면역 억제에서의 IL-2에 대한 중추적 역할과 일치한다.
Treg에 대한 IL-2의 효과의 중요성 때문에, 저용량 재조합 IL-2는 면역-매개 질환에서 Treg-기반 면역억제 전략에 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Saadoun, D., et al., N Engl J Med. 365:2067-77 (2011); He, J., et al., Arthritis Rheumatol. 67(suppl 10) (2015); Koreth, J., et al., N Engl J Med. 365:2055-66 (2011); 및 Humrich, J.Y., et al. Ann Rheum Dis. 74:791-2 (2015)]을 참조한다. 예를 들어, 전신 홍반성 루푸스 (SLE)는 IL-2 결핍 상태를 특징으로 하며, Treg는 감소된 면역 조절 능력을 나타낸다. 저용량의 IL-2는 SLE 환자에서 고무적인 임상 이익을 보여주었지만; 그의 임상 유용성은 매일 주사의 요구 및 염증유발 시토카인 및 비-Treg 세포에서의 증가의 관찰로 인해 제한된다. 대조적으로, 고용량 IL-2는 T 이펙터 세포를 통해 항종양 면역 반응을 자극하는 데 사용되었다. 예를 들어, 문헌 [Rosenberg, S.A., J Immunol. 192:5451-8 (2014)]을 참조한다.
이들 임상 연구로부터의 유망한 결과에도 불구하고, 저용량 재조합 IL-2 요법은 빈번한 투여를 필요로 하는 매우 짧은 반감기 (수분), 및 잠재적으로 효능을 제한하는 비-Treg 효과의 활성화에 대한 작은 윈도우에 의해 제한된다. 따라서, 예를 들어 감염성 질환 및 면역-매개 질환, 예컨대 SLE의 치료에 사용하기 위한 개선된 약동학 및 반응의 지속성을 갖는 새로운 IL2 생물제제에 대한 필요가 남아있다.
본 개시내용의 개요
본 개시내용의 특정 측면은 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 인터류킨-2 (IL2) 융합 단백질의 1회 이상의 용량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 (a) IL2 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 (b) 인터류킨-2 수용체 알파 (IL2Rα) 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 (i) IL2Rα 폴리펩티드의 세포외 도메인은 천연 IL2Rα의 세포외 도메인 (서열식별번호: 1)과 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖고/거나; (ii) IL2 폴리펩티드는 천연 IL2 (서열식별번호: 2)와 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖고; 여기서 용량 중 1회 이상은 약 0.1 mg 내지 약 9 mg인, 상기 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 국소, 표피, 점막, 비강내, 경구, 질, 직장, 설하, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 또는 흉골내 경로를 통해 대상체에게 투여된다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 정맥내 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 약 0.3 mg 내지 약 9 mg의 용량으로 정맥내 경로를 통해 투여된다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 약 1 mg 내지 약 9 mg, 약 2 mg 내지 약 9 mg, 약 3 mg 내지 약 9 mg, 약 4 mg 내지 약 9 mg, 약 5 mg 내지 약 9 mg, 약 6 mg 내지 약 9 mg, 약 7 mg 내지 약 9 mg, 약 8 mg 내지 약 9 mg, 약 1 mg 내지 약 8 mg, 약 2 mg 내지 약 8 mg, 약 3 mg 내지 약 8 mg, 약 4 mg 내지 약 8 mg, 약 5 mg 내지 약 8 mg, 약 6 mg 내지 약 8 mg, 약 7 mg 내지 약 8 mg, 약 1 mg 내지 약 7 mg, 약 2 mg 내지 약 7 mg, 약 3 mg 내지 약 7 mg, 약 4 mg 내지 약 7 mg, 약 5 mg 내지 약 7 mg, 약 6 mg 내지 약 7 mg의 용량으로 정맥내 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 3 mg 내지 약 9 mg이다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 6 mg 내지 약 9 mg이다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 약 0.1 mg 내지 약 6 mg, 약 1 mg 내지 약 6 mg, 약 2 mg 내지 약 6 mg, 약 3 mg 내지 약 6 mg, 약 4 mg 내지 약 6 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 6 mg, 약 1 mg 내지 약 5 mg, 약 2 mg 내지 약 5 mg, 약 3 mg 내지 약 5 mg, 약 4 mg 내지 약 5 mg, 약 1 mg 내지 약 4 mg, 약 2 mg 내지 약 4 mg, 약 3 mg 내지 약 4 mg, 약 1 mg 내지 약 3 mg, 또는 약 2 mg 내지 약 3 mg의 용량으로 정맥내 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 0.1 mg 내지 약 3 mg이다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 0.1 mg 내지 약 1 mg이다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 0.1 mg 내지 약 0.3 mg이다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 0.3 mg 내지 약 6 mg이다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 1 mg 내지 약 3 mg이다.
일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 0.1 mg, 약 0.3 mg, 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 4 mg, 약 5 mg, 약 6 mg, 약 7 mg, 약 8 mg 또는 약 9 mg이다.
일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 9 mg 초과이다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 피하 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 약 1 mg 내지 약 8 mg, 약 2 mg 내지 약 8 mg, 약 3 mg 내지 약 8 mg, 약 4 mg 내지 약 8 mg, 약 5 mg 내지 약 8 mg, 약 6 mg 내지 약 8 mg, 약 7 mg 내지 약 8 mg, 약 1 mg 내지 약 7 mg, 약 2 mg 내지 약 7 mg, 약 3 mg 내지 약 7 mg, 약 4 mg 내지 약 7 mg, 약 5 mg 내지 약 7 mg, 약 6 mg 내지 약 7 mg, 약 1 mg 내지 약 6 mg, 약 2 mg 내지 약 6 mg, 약 3 mg 내지 약 6 mg, 약 4 mg 내지 약 6 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 6 mg, 약 1 mg 내지 약 5 mg, 약 2 mg 내지 약 5 mg, 약 3 mg 내지 약 5 mg, 약 4 mg 내지 약 5 mg, 약 1 mg 내지 약 4 mg, 약 2 mg 내지 약 4 mg, 약 3 mg 내지 약 4 mg, 약 1 mg 내지 약 3 mg, 또는 약 2 mg 내지 약 3 mg의 용량으로 피하 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 3 mg 내지 약 8 mg이다. 일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 6 mg 내지 약 8 mg이다. 일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 1 mg 내지 약 6 mg이다. 일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 1 mg 내지 약 3 mg이다. 일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 3 mg 내지 약 6 mg이다.
일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 1 mg, 약 3 mg, 약 6 mg 또는 약 8 mg이다.
일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 8 mg 초과이다.
일부 측면에서, 방법은 융합 단백질의 2회 용량 사이의 투여 간격으로 융합 단백질의 2회 이상의 용량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 투여 간격은 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 또는 적어도 약 6일이다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 투여 간격은 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주, 적어도 약 8주, 적어도 약 2개월, 적어도 약 9주, 적어도 약 10주, 적어도 약 11주, 적어도 약 12주, 또는 적어도 약 3개월이다. 일부 측면에서, 투여 간격은 적어도 약 3주이다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 투여 간격은 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 또는 약 6일이다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 투여 간격은 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1개월, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 2개월, 약 9주, 약 10주, 약 11주, 약 12주, 또는 약 3개월이다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 투여 간격은 약 3주이다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 투여 간격은 용량 전반에 걸쳐 동일하다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 투여 간격은 용량 전반에 걸쳐 상이하다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 2회 이상의 용량 중 적어도 하나는 정맥내로 투여되고, 융합 단백질의 2회 이상의 용량 중 적어도 하나는 피하로 투여된다. 일부 측면에서, 정맥내로 투여되는 용량은 피하로 투여되는 용량 전에 제공된다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 제1 용량은 정맥내로 투여되고, 융합 단백질의 제2 (임의의 후속 또는 최종) 용량은 피하로 투여된다.
일부 측면에서, 질환 또는 장애는 감염성 질환, 면역-매개 질환이다. 일부 측면에서, 면역-매개 질환은 염증성 질환 또는 자가면역 질환이다. 일부 측면에서, 면역-매개 질환은 제1형 당뇨병; 다발성 경화증; 류마티스 관절염; 복강 질환; 전신 홍반성 루푸스; 루푸스 신염; 피부 루푸스; 소아 특발성 관절염; 크론병; 궤양성 결장염; 전신 경화증; 이식편 대 숙주 질환 (GvHD); 건선; 원형 탈모증; HCV-유발 혈관염; 쇼그렌 증후군; 천포창; 강직성 척추염; 베체트병; 베게너 육아종증; 다카야스병; 자가면역 간염; 경화성 담관염; 고제로트-쇼그렌(Gougerot-sjoegren); 염증성 장 질환; 면역 조절이상, 다발내분비병증, 장병증, X-연관 (IPEX) 증후군; 및 대식세포 활성화 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 면역-매개 질환은 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 또는 피부 루푸스이다. 일부 측면에서, 면역-매개 질환은 전신 홍반성 루푸스이다.
일부 측면에서, 방법은 대상체에게 코르티코스테로이드를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 히드로코르티손, 덱사메타손, 베타메타손, 부데소니드, 트리암시놀론, 코르티손, 데스옥시코르티코스테론, 플루드로코르티손 및 파라메타손으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 또는 프레드니손이다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론이다.
일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 국소, 표피, 점막, 비강내, 경구, 질, 직장, 설하, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 또는 흉골내 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 국소, 경구, 정맥내 또는 근육내 경로를 통해 대상체에게 투여된다.
일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 융합 단백질의 각각의 용량 전에, 그와 공동으로, 또는 그 후에 투여된다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 융합 단백질의 각각의 용량 전에 투여된다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 융합 단백질의 각각의 용량과 공동으로 투여된다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드의 2회 이상의 용량은 각각의 용량 사이의 투여 간격으로 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드의 투여 간격은 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주, 적어도 약 8주, 적어도 약 2개월, 적어도 약 9주, 적어도 약 10주, 적어도 약 11주, 적어도 약 12주, 또는 적어도 약 3개월이다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론이며, 여기서 융합 단백질은 대상체에게 1주 2회 피하 투여되고, 프레드니솔론은 대상체에게 1주 3회 경구 투여된다.
일부 측면에서, IL2Rα 폴리펩티드의 세포외 도메인은 천연 IL2Rα의 세포외 도메인 (서열식별번호: 1)과 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화, 적어도 2개 더 적은 글리코실화, 적어도 3개 더 적은 글리코실화, 적어도 4개 더 적은 글리코실화, 적어도 5개 더 적은 글리코실화, 적어도 6개 더 적은 글리코실화, 적어도 7개 더 적은 글리코실화, 적어도 8개 더 적은 글리코실화, 또는 적어도 9개 더 적은 글리코실화를 갖는다.
일부 측면에서, IL2 폴리펩티드는 천연 IL2 (서열식별번호: 2)와 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖는다.
일부 측면에서, 제1 폴리펩티드는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 3에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖는 IL2Rα 폴리펩티드의 세포외 도메인은 글리코실화를 제거하는 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이는 O-글리코실화 및/또는 N-글리코실화를 제거한다. 일부 측면에서, 돌연변이는 O-글리코실화를 제거한다. 일부 측면에서, 돌연변이는 N-글리코실화를 제거한다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1에 상응하는 아미노산 167 내지 219, 아미노산 168 내지 219, 아미노산 169 내지 219, 아미노산 170 내지 219, 아미노산 171 내지 219, 아미노산 172 내지 219, 아미노산 173 내지 219, 아미노산 174 내지 219, 아미노산 175 내지 219, 아미노산 176 내지 219, 아미노산 177 내지 219, 아미노산 178 내지 219, 아미노산 179 내지 219, 아미노산 180 내지 219, 아미노산 181 내지 219, 아미노산 182 내지 219, 아미노산 183 내지 219, 아미노산 184 내지 219, 아미노산 185 내지 219, 아미노산 186 내지 219, 아미노산 187 내지 219, 아미노산 188 내지 219, 아미노산 189 내지 219, 아미노산 190 내지 219, 아미노산 191 내지 219, 또는 아미노산 192 내지 219의 결실이다.
일부 측면에서, 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 4이다. 일부 측면에서, 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 3이다.
일부 측면에서, 돌연변이는 글리코실화된 아미노산의 글리코실화되지 않은 아미노산으로의 1개 이상의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 아미노산 N49, 아미노산 N68, 아미노산 T74, 아미노산 T85, 아미노산 T197, 아미노산 T203, 아미노산 T208, 및 아미노산 T216, 또는 그의 임의의 조합에서 이루어지고, 여기서 아미노산 위치는 서열식별번호: 1에 상응한다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 트레오닌으로부터 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로의 치환이다.
일부 측면에서, 치환 중 1개는 아미노산 T85이다. 일부 측면에서, T85는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환 중 1개는 아미노산 T197이다. 일부 측면에서, T197은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환 중 1개는 아미노산 T203이다. 일부 측면에서, T203은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환 중 1개는 아미노산 T208이다. 일부 측면에서, T208은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환 중 1개는 아미노산 T216이다. 일부 측면에서, T216은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 돌연변이는 인근 아미노산에서의 글리코실화를 허용하는 아미노산의 인근 아미노산에서의 글리코실화를 허용하지 않는 아미노산으로의 1개 이상의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 아미노산 S50, 아미노산 S51, 아미노산 T69, 아미노산 T70, 아미노산 C192, 또는 그의 임의의 조합에서 이루어지고, 여기서 아미노산 위치는 서열식별번호: 1에 상응한다.
일부 측면에서, 치환 중 1개는 아미노산 S50에서 이루어진다. 일부 측면에서, S50은 프롤린으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환 중 1개는 아미노산 S51에서 이루어진다. 일부 측면에서, S51은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환 중 1개는 아미노산 T69에서 이루어진다. 일부 측면에서, T69는 프롤린으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환 중 1개는 아미노산 T70에서 이루어진다. 일부 측면에서, T70은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환 중 1개는 아미노산 C192에서 이루어진다. 일부 측면에서, C192는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖는 IL2 폴리펩티드는 글리코실화를 제거하는 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이는 글리코실화된 아미노산의 글리코실화되지 않은 아미노산으로의 1개 이상의 치환이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 인근 아미노산에서의 글리코실화를 허용하는 아미노산의 인근 아미노산에서의 글리코실화를 허용하지 않는 아미노산으로의 1개 이상의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 알라닌으로부터 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 트레오닌으로부터 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 시스테인으로부터 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 시스테인으로부터 세린으로의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 시스테인으로부터 알라닌으로의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 시스테인에서 발린으로의 치환이다. 일부 측면에서, 치환 중 1개는 서열식별번호: 2에 상응하는 것과 비교하여 아미노산 T3에서 이루어진다. 일부 측면에서, 치환 중 1개는 아미노산 C125에서 이루어지고, 여기서 아미노산 C125에서의 치환은 C125S, C125A 및 C125V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 돌연변이는 결실이다. 일부 측면에서, 결실은 아미노산 A1에서 이루어진다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 사이에 인 프레임으로 융합된 링커를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 링커는 글리신/세린 링커이다. 일부 측면에서, 글리신/세린 링커는 (GS)n, (GGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n, 또는 (GGGGS)n의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10의 정수이다. 일부 측면에서, 글리신/세린 링커는 (GGGS)3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드에 융합된 이종 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 이종 모이어티는 반감기 연장 모이어티이다. 일부 측면에서, 이종 모이어티는 알부민, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 부분, 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 G (IgG), 알부민-결합 폴리펩티드 (ABP), PAS화 모이어티, HES화 모이어티, XTEN, PEG화 모이어티, Fc 영역, 및 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 효소적으로 또는 화학적으로 탈글리코실화된다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 알칼리, 히드라진분해, PNGase F, 엔도 H, O-글리코시다제, 또는 그의 임의의 조합에 의해 탈글리코실화된다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 단량체이다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 이량체이다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 융합 단백질 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물의 일부로서 대상체에게 투여된다.
도 1A 및 1B는 실시예 1에 기재된 1상, 무작위, 이중-맹검, 위약-대조, 단일 상승 용량 ("SAD") 연구 설계 (도 1A) 및 단일 상승 투여 요법 (도 1B)의 개략적 다이어그램을 보여준다. 감시 투여 (1:1 BMS-986326 또는 위약)가 모든 코호트에서 사용된다. 용량 수준은 이전 코호트로부터의 신생 데이터에 따라 변할 수 있다. 최대 용량-증량 단계는 이전 용량 수준의 대략 ≤ 3배일 것이다. "IV NOAELa"는 단일-용량 원숭이 독성학 연구에 대해 NOAEL (AUC[0-336시간] ≤ 757 μ·h/ml)까지 평균 노출 (제0 시점에서부터 무한대까지의 농도-시간 곡선하 면적; "AUC[INF]")을 제공할 것으로 예상되는 최대 정맥내 (IV) 용량을 나타낸다. 코호트 A6은 선행 코호트로부터의 약역학적 (PD) 결과에 따라 임의적이다. "SCb"는 12-주 (3주마다 1회) 피하 (SC) 원숭이 독성학 연구에 대해 NOAEL (AUC[0-504시간] ≤ 306 μ·h/ml)을 초과하지 않을 평균 노출 (AUC[INF])을 제공할 것으로 예상되는 최대 SC 용량을 나타낸다.
도 2A-2B는 NZB x NZQ 대 BALB/c 마우스에서의 Treg CD25 발현을 보여준다. NZB x NZW (n = 5, 26주령) 또는 BALB/c (n = 6, 9-10주령) 마우스로부터의 비장세포를 CD4, Foxp3 및 CD25에 대한 항체로 염색하였다. 도 2A는 각 군의 대표적인 마우스로부터의 CD4+ 게이트에서의 Foxp3+ 세포의 백분율 및 CD4+Fox3+ 게이트에서의 CD25+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2B는 CD4+Foxp3+ T 세포의 평균 형광 강도 (MFI)를 보여준다 (평균 ± SEM). 일원 ANOVA에 의해 ***p<0.001.
도 3A-3E는 BALB/c 마우스에서 Treg 및 비-Treg 세포에 대한 mIL-2/CD25 투여의 효과를 보여준다. BALB/c 마우스 (n = 5, 8-10주령)를 제0일, 제3일 및 제6일에 mIL-2/CD25로, 제0일, 제2일, 제4일 및 제6일에 Fc-IL2로, 또는 제0일, 제3일 및 제6일에 PBS로 처리하였다. 마우스를 제7일에 희생시키고, 유동 세포측정법에 의한 분석을 위해 비장을 수거하였다. 도 3A는 CD4+ T 세포 중 Foxp3+CD25+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 3B는 CD4+Foxp3+CD25+ T 세포의 총 수를 보여준다. 도 3C는 CD4+Foxp3- T 세포의 총 수를 보여준다. 도 3D는 CD8+ T 세포의 총 수를 보여준다. 도 3E는 CD335+CD49d+ NK 세포의 총 수를 보여준다. 일원 ANOVA에 의해 PBS 대조군에 대해 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 4A-4D는 NZB x NZW 마우스 (초기 질환)에서의 mIL-2/CD25 투여에 의한 루푸스의 억제를 보여준다. 30 mg/dL의 단백뇨 수준을 갖는 암컷 NZB x NZW F1 마우스 (22-24주령)를 14주 동안 PBS 또는 0.1, 0.2, 또는 0.4 mg/kg의 mIL-2/CD25 (s.c. 2x/주), 또는 프레드니솔론 (10 mg/kg p.o. 3x/주) (군당 n = 10)으로 처리하였다. mIL-2/CD25 투여는 단백뇨의 수준의 용량 의존성 감소 (도 4A), 높은 단백뇨를 갖는 마우스의 백분율 (점수 3 이상) (도 4B), 항-dsDNA IgG 역가 (도 4C), 및 신장 조직학 점수 (도 4D)를 나타냈다. 일원 ANOVA에 의한 연구 종료시 PBS 군에 대해 **p<0.01, ****p<0.0001.
도 5A-5D는 NZB x NZW 마우스에서 Treg에 대한 mIL-2/CD25 투여의 효과를 보여준다. 30 mg/dL의 단백뇨 수준을 갖는 암컷 NZB x NZW F1 마우스 (22-24주령)를 4주 동안 PBS 또는 0.1, 0.2, 또는 0.4 mg/kg의 mIL-2/CD25 (s.c. 2x/주), 또는 프레드니솔론 (p.o. 3x/주) (군당 n = 4)으로 처리하였다. mIL-2/CD25 (제8 용량 후 48시간)는 혈액 (도 5A) 및 비장 (도 5B) 내 Treg (CD4+CD25+Foxp3+)의 백분율의 용량 의존성 증가를 나타냈다. Treg 게이트 (CD4+CD25+Foxp3+)에서의 Ki67+ 세포 (도 5C) 및 CD25 MFI (도 5D)의 백분율이 비장에서 용량 의존적 방식으로 또한 증가되었다. 일원 ANOVA에 의해 PBS 군에 대해 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 6A-6E는 NZB x NZW 마우스 (진행성 질환)에서의 mIL-2/CD25 투여에 의한 루푸스의 억제를 보여준다. 100 mg/dL의 단백뇨 수준을 갖는 암컷 NZB x NZW F1 마우스 (~27주령)를 10주 동안 PBS 또는 0.1 또는 0.3 mg/kg의 mIL-2/CD25 (s.c. 2x/주) (군당 n = 12-14)로 처리하였다. mIL-2/CD25로의 처리는 연구의 완료 시 단백뇨의 수준의 용량 의존성 감소 (도 6A), 항-dsDNA IgG 역가의 감소 경향 (도 6B), 혈청 IL-12의 수준의 감소 (도 6C), 신장 조직학 점수의 감소 (도 6D), 및 비장 내 CD4+Foxp3+CD25+ 세포의 백분율의 증가 (도 6E)를 발생시켰다. 일원 ANOVA에 의해 PBS 군에 대해 *p<0.05. 양측 t-검정에 의해 PBS 군에 대해 #p<0.05.
도 7A-7E는 NZB x NZW 마우스에서의 mIL-2/CD25 및 프레드니솔론 조합 치료의 효과를 보여준다. 30 mg/dL의 단백뇨 수준을 갖는 암컷 NZB x NZW F1 마우스 (21-23주령)를 14주 동안 PBS, mIL-2/CD25 (0.1 mg/kg s.c. 2x/주), 프레드니솔론 (1 mg/kg p.o. 3x/주), 또는 mIL-2/CD25 (0.1 mg/kg s.c. 2x/주) 및 프레드니솔론 (1 mg/kg p.o. 3x/주)의 조합물로 처리하였다. 고용량의 프레드니솔론 (10 mg/kg, p.o. 3x/주) 및 mIL-2/CD25 (0.2 ug/kg s.c. 2x/주) 군을 대조군으로서 포함시켰다 (군당 n = 12). 단백뇨의 수준 (도 7A), 항-dsDNA 항체 역가 (도 7B), 및 조직학 점수 (도 7C)에 대한 효과가 제시된다. mIL-2/CD25 처리는 프레드니솔론의 존재 또는 부재 하에 비장 내 Treg (CD4+CD25+Foxp3+)의 백분율의 증가 (도 7D) 및 Treg 게이트 (CD4+CD25+Foxp3+)에서의 CD25 MFI (도 7E)를 나타냈다 (도 7D 및 도 7E에 대해 군당 n = 5). 일원 ANOVA에 의한 연구 종료시 PBS 군에 대해 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 8A-8F는 NZB x NZW 마우스에서의 mIL-2/CD25 및 프레드니솔론 조합 치료의 효과를 보여준다. 도 7에 기재된 바와 같은 mIL-2/CD25 및 프레드니솔론 조합 연구의 완료 시, RT-PCR 분석을 위해 신장을 수집하였다. 제1형 인터페론 유전자 발현 (IFIT1 (도 8A), IFIT3 (도 8B), MX1 (도 8C), IRF7 (도 8D), GBP2 (도 8E) 및 LIGP1 (도 8F))의 추가의 감소가 어느 하나의 단독요법과 비교하여 조합 치료에 의해 관찰되었다.
도 9A-9F는 MRL/lpr 마우스에서 mIL-2/CD25 투여에 의한 루푸스의 억제를 보여준다. 30 mg/dL의 단백뇨 수준을 갖는 수컷 MRL/lpr 마우스 (12-14주령)를 12주 동안 PBS 또는 0.1, 0.2 또는 0.4 mg/kg의 mIL-2/CD25 (s.c. 2x/주), 또는 프레드니솔론 (PO 3x/주) (군당 n = 10)으로 처리하였다. mIL-2/CD25로의 처리는 단백뇨의 수준 (도 9A), 항-dsDNA IgG 역가 (도 9B) 및 신장 조직학 점수 (도 9C)의 용량 의존성 감소, 및 혈액 (도 9D) 및 비장 (도 9E) 내 Treg (CD4+CD25+Foxp3+)의 백분율의 용량 의존성 증가, 및 비장 내 Treg 게이트 (CD4+CD25+Foxp3+)에서의 CD25 MFI의 증가 (도 9F)를 발생시켰다. 일원 ANOVA에 의해 제12주에 PBS 군에 대해 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
본 개시내용의 상세한 설명
본 개시내용의 특정 측면은 질환 또는 장애, 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환, 예를 들어 전신 홍반성 루푸스 (SLE)의 치료를 필요로 하는 대상체에게 인터류킨-2 (IL2) 융합 단백질의 용량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 (a) IL2 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (b) 인터류킨-2 수용체 알파 (IL2Rα) 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 (i) IL2Rα 폴리펩티드의 세포외 도메인은 천연 IL2Rα의 세포외 도메인 (서열식별번호: 1)과 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖고/거나; (ii) IL2 폴리펩티드는 천연 IL2 (서열식별번호: 2)와 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖는 것인, 상기 대상체에서 질환 또는 장애, 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환, 예를 들어 전신 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 용량은 약 0.1 mg 내지 약 9 mg이다. 일부 측면에서, 용량은 약 9 mg 초과이다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 정맥내 경로를 통해 대상체에게 투여되고, 용량은 약 0.1 mg 내지 약 9 mg이다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 정맥내 경로를 통해 대상체에게 투여되고, 용량은 약 9 mg 초과이다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 피하 경로를 통해 대상체에게 투여되고, 용량은 약 1 mg 내지 약 8 mg이다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 피하 경로를 통해 대상체에게 투여되고, 용량은 약 8 mg 초과이다.
일부 측면에서, 방법은 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 히드로코르티손, 덱사메타손, 베타메타손, 부데소니드, 트리암시놀론, 코르티손, 데스옥시코르티코스테론, 플루드로코르티손 또는 파라메타손을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본원에 달리 명백하게 제공된 경우를 제외하고는, 본 출원에 사용된 각각의 하기 용어는 하기 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐 제시된다.
I. 정의
본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본원에 달리 명백하게 제공된 경우를 제외하고는, 본 출원에 사용된 각각의 하기 용어는 하기 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 제시된다.
단수 개체의 용어가 1개 이상의 그러한 개체를 지칭한다는 것에 유의해야 하며; 예를 들어, "뉴클레오티드 서열"은 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 이에 따라, 단수 용어, "1개 이상" 및 "적어도 1개"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
게다가, 본원에서 사용된 경우의 "및/또는"은 2개의 특정 특색 또는 성분 각각을 함께 또는 따로 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포괄하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
유사하게, 단어 "또는"은 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 제공된 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이고, 설명을 위해 제공된다는 것을 추가로 이해하여야 한다.
측면이 언어 "포함하는"을 사용하여 본원에 기재된 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
용어 "약"은 대략적으로, 대략, 부근 또는 영역 내의 것을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우에, 이는 경계를 제시된 수치 값 초과 및 미만으로 확장함으로써 범위를 변경한다. 따라서, "약 10-20"은 "약 10 내지 약 20"을 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 수치 값을 기재된 값 초과 및 미만으로, 예를 들어 10 퍼센트 위 또는 아래 (더 높거나 또는 더 낮은)의 변동치만큼 변경할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재조합"은 유전 공학 또는 다르게는 실험실 조작에 의해 제조된 유전자로부터의 발현을 포함한다.
본원에서 사용된 "인터루킨-2", "IL2" 또는 "IL-2"는 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물 및 달리 나타내지 않는 한 가축 또는 농업 포유동물을 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 또는 재조합 IL2를 지칭한다. 상기 용어는 프로세싱되지 않은 IL2뿐만 아니라, 세포에서의 프로세싱에 의해 생성된 임의의 형태의 IL2 (즉, 성숙한 형태의 IL2)를 포괄한다. 상기 용어는 또한 IL2의 자연 발생 변이체 및 단편, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체, 및 자연 발생 IL2의 IL2 활성을 갖는 비-자연 발생 변이체를 포괄한다.
IL2에 대한 추가의 핵산 및 아미노산 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, 진뱅크(GenBank) 수탁 번호: Q7JFM2 (아오투스 레무리누스(Aotus lemurinus) (회색배 올빼미 원숭이)); Q7JFM5 (아오투스 낸시마아에(Aotus nancymaae) (마 올빼미 원숭이)); P05016 (보스 타우루스(Bos taurus) (소)); Q29416 (카니스 파밀리아리스(Canis familiaris) (개) (카니스 루푸스 파밀리아리스(Canis lupus familiaris))); P36835 (카프라 히르쿠스(Capra hircus) (염소)); 및 P37997 (에쿠스 카발루스(Equus caballus) (말))을 참조한다.
IL2의 생물학적 활성 단편 및 변이체는 IL2 활성을 보유한다. 어구 "IL2의 생물학적 활성" 또는 "IL2 활성"은 IL-2 수용체 보유 림프구를 자극하는 능력을 포함하나 이에 제한되지는 않는 IL2의 하나 이상의 생물학적 활성을 지칭한다. 이러한 활성은 시험관내에서 및 생체내에서 둘 다 측정될 수 있다. IL2는 면역 활성의 전반적인 조절자이고, 본원에서 제시된 효과는 이러한 활성의 총합이다. 예를 들어, 이것은 생존 활성 (Bcl-2)을 조절하고/거나, T 이펙터 활성 (IFN-감마, 그랜자임 B 및 퍼포린)을 유도하고/거나, T 조절 활성 (FoxP3)을 촉진한다.
IL2의 생물학적 활성 변이체는 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 출원 공개 20060269515 및 20060160187 및 WO 99/60128을 참조한다.
용어 "분비 신호 서열"은 보다 큰 폴리펩티드의 성분으로서 보다 큰 폴리펩티드가 합성되는 세포의 분비 경로를 통과하도록 지시하는 폴리펩티드 ("분비 펩티드")를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 보다 큰 폴리펩티드는 일반적으로 분비 경로를 통한 수송 동안 분비 펩티드를 제거하기 위해 절단된다.
본원에 사용된 "성숙" 형태의 융합 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 펩티드가 제거된 폴리펩티드의 프로세싱된 형태를 포함한다.
본원에 사용된 "프로세싱되지 않은" 형태의 융합 단백질은 분비 펩티드 서열을 보유한다.
본원에서 사용된 용어 "CD25", "IL2 수용체 α", "IL2Rα" 또는 "IL2Ra"는 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물 및 달리 나타내지 않는 한 가축 또는 농업 포유동물을 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 또는 재조합 IL2Rα를 지칭한다. 상기 용어는 또한 IL2Rα의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체, 또는 IL2Rα 활성을 갖는 비-자연 발생 변이체를 포괄한다. 인간 IL2는 그의 수용체 시스템인 IL2R을 통한 신호전달을 통해 그의 생물학적 효과를 발휘한다. IL2 및 그의 수용체 (IL2R)는 면역 반응에 중요한 T-세포 증식 및 다른 기본적인 기능에 필요하다. IL2R은 알파 (p55), 베타 (p75) 및 감마 (p65) 쇄인 3개의 비-공유 연결된 타입 I 막횡단 단백질로 이루어진다. 인간 IL2R 알파 쇄는 219개 아미노산의 세포외 도메인, 19개 아미노산의 막횡단 도메인 및 13개 아미노산의 세포내 도메인을 함유한다. IL2R 알파 (IL2R-α)의 분비된 세포외 도메인은 본원에 기재된 융합 단백질에 사용될 수 있다.
IL2Rα에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 NP_001030597.1 (판 트로글로디테스(Pan troglodytes)); NP_001028089.1 (마카카 물라타(Macaca mulatta)); NM_001003211.1 (카니스 루푸스(Canis lupus)); NP_776783.1 (보스 타우루스(Bos taurus)); NP_032393.3 (무스 무스쿨루스(Mus musculus)); 및 NP_037295.1 (라투스 노르베기쿠스)을 참조한다.
또한, IL2Rα의 세포외 도메인의 생물학적 활성 단편 및 변이체가 제공된다. 그러한 IL2Rα 세포외 도메인 활성 변이체 또는 단편은 IL2Rα 세포외 도메인 활성을 보유할 것이다. 어구 "IL2Rα 세포외 도메인의 생물학적 활성"은 IL2에 결합하고/거나 IL2 수용체 반응성 세포에서 세포내 신호전달을 증진시키는 능력을 포함하나 이에 제한되지는 않는 IL2Rα의 세포외 도메인의 하나 이상의 생물학적 활성을 지칭한다. IL2Rα의 생물학적 활성 단편 및 변이체의 비-제한적인 예는 예를 들어 문헌 [Robb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5654-8 (1988)]에 개시되어 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2Rα의 생물학적 활성 단편 및 변이체는 천연 IL2Rα의 세포외 도메인과 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 포함한다.
대상에 적용되는 바와 같은 본원에 사용된 용어 "자연 발생"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생이다.
"폴리펩티드"는 쇄의 길이에 대한 상한치 없이, 적어도 2개의 연속적으로 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 쇄를 지칭한다. 단백질 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 변형, 예컨대, 비제한적으로, 글리코실화, 인산화 또는 디술피드 결합 형성을 함유할 수 있다. "단백질" 또는 "융합 단백질"은 1개 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드의 단편 또는 변이체 및 그의 임의의 조합이 또한 본 개시내용에 포함된다. 본 개시내용의 폴리펩티드 결합 도메인 또는 결합 분자에 관해 언급할 때 용어 "단편" 또는 "변이체"는 참조 폴리펩티드의 특성의 적어도 일부 (예를 들어, IL2Rα에 대한 IL2 결합 활성)를 보유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 단편은 단백질분해성 단편뿐만 아니라 결실 단편을 포함하지만, 자연 발생 전장 폴리펩티드 (또는 성숙 폴리펩티드)를 포함하지 않는다. 본 개시내용의 폴리펩티드 결합 도메인 또는 결합 분자의 변이체는 상기 기재된 바와 같은 단편, 및 또한 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 자연적으로 또는 비-자연적으로 발생할 수 있다. 비-자연 발생 변이체는 관련 기술분야에 공지된 돌연변이유발 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 변형은 예를 들어 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교결합, 고리화, 디술피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 아이오딘화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, PEG화 (Mei et al., Blood 116:270-79 (2010)), 단백질분해 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개 부가 예컨대 아르기닐화, 및 유비퀴틴화를 포함한다.
단백질 또는 뉴클레오티드 서열 내에서 본원에 사용된 용어 "에 상응하는 아미노산", "에 상응하는 부위", 또는 "등가의 아미노산"은 제1 단백질 서열, 예를 들어, IL2 서열과 제2 단백질 서열, 예를 들어, 제2 IL2 서열 사이의 동일성 또는 유사성을 최대화하기 위한 정렬에 의해 확인된다. 제2 단백질 서열 내의 등가의 아미노산을 확인하기 위해 사용된 숫자는 제1 단백질 서열 내의 상응하는 아미노산을 확인하기 위해 사용된 숫자에 기초한다. 일부 측면에서, 용어 "에 상응하는"은 폴리펩티드 내의 1개 이상의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 내의 1개 이상의 뉴클레오티드에서의 돌연변이에 대한 관계를 지칭한다. 비제한적 예로서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열식별번호: 1)의 특정 아미노산 (예를 들어, S50)은 서열식별번호: 1에서 50번째 아미노산-세린-을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "와 회합된"은 제1 아미노산 쇄와 제2 아미노산 쇄 사이에 형성된 공유 또는 비-공유 결합을 지칭한다. 한 측면에서, 용어 "와 회합된"은 공유, 비-펩티드 결합 또는 비-공유 결합을 의미한다. 이러한 회합은 콜론, 즉 (:)에 의해 표시될 수 있다. 또 다른 측면에서, 이는 펩티드 결합을 제외한 공유 결합을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 시스테인은 제2 시스테인 잔기 상의 티올 기와 디술피드 결합 또는 브릿지를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 디술피드 결합에 의해 회합되고, 2개의 중쇄는 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242에 상응하는 위치 (위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에서 2개의 디술피드 결합에 의해 회합된다. 공유 결합의 예는 펩티드 결합, 금속 결합, 수소 결합, 디술피드 결합, 시그마 결합, 파이 결합, 델타 결합, 글리코시드 결합, 애그노스틱 결합, 벤트 결합, 쌍극자 결합, Pi 백본, 이중 결합, 삼중 결합, 사중 결합, 오중 결합, 육중 결합, 접합, 과접합, 방향족성, 합틱성 또는 항결합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비-공유 결합의 비제한적 예는 이온 결합 (예를 들어, 양이온-파이 결합 또는 염 결합), 금속 결합, 수소 결합 (예를 들어, 이수소 결합, 이수소 착물, 저-장벽 수소 결합 또는 대칭 수소 결합), 반 데르 발스 힘, 런던 분산 힘, 기계적 결합, 할로겐 결합, 친금성, 삽입, 적층, 엔트로피 힘 또는 화학적 극성을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "필적하는"은, 예를 들어 융합 단백질을 사용하여 생성된 비교된 비율 또는 수준이 참조 비율 또는 수준과 동일하거나, 실질적으로 동일하거나 또는 유사하다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "유사한"은 비교된 비율 또는 수준이 참조 비율 또는 수준과 10% 이하 또는 15% 이하의 차이를 갖는다는 것을 의미한다. 용어 "실질적으로 동등한"은 비교된 비율 또는 수준이 참조 비율 또는 수준과 0.01%, 0.5% 또는 1% 이하의 차이를 갖는다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 유전자 산물, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 과정을 지칭한다.
"융합" 또는 "융합 단백질"은 제1 아미노산 서열이 자연에서 자연적으로 연결되지 않는 제2 아미노산 서열에 인 프레임으로 연결된 것을 포함한다. 통상적으로 별개의 단백질 내에 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드 내에 합쳐질 수 있거나 또는 통상적으로 동일한 단백질 내에 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드 내에 새로운 배열로, 예를 들어, IL2 단백질과 IL2-Rα 단백질의 융합체로 배치될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어 화학적 합성에 의해 또는 펩티드 영역이 목적하는 관계로 코딩되는 폴리뉴클레오티드를 생성 및 번역함으로써 생성된다. 융합 단백질은 공유, 비-펩티드 결합 또는 비-공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 회합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 전사/번역시, 단일 단백질이 만들어진다. 이러한 방식으로, 다수의 단백질 또는 그의 단편이 단일 폴리펩티드로 통합될 수 있다. "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 요소들 사이에서의 기능적 연결을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 두 폴리펩티드 사이의 작동가능한 연결은 단일 폴리펩티드 융합 단백질을 생성하기 위해 두 폴리펩티드를 인 프레임으로 함께 융합시킨다. 한 측면에서, 상기 융합 단백질은 추가로 아래에서 상세히 논의되는 바와 같이 링커 서열을 포함할 수 있는 제3 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 용어 "BMS-986326" 또는 "BMS-986326-01"은 대략 83 킬로달톤 (kDa)의 질량을 갖는 비-공유 자기-차단 동종이량체 구조를 형성하는, 인간 인터류킨-2 (IL2) 및 인간 IL2 수용체 (CD25)의 알파 서브유닛의 세포외 도메인 부분의 재조합 융합 단백질을 지칭한다. IL2 및 CD25 모이어티는 (GGGS)3의 소형 펩티드 링커 서열에 의해 서로 연결된다. BMS-986326은 연장된 약동학 (PK) 및 조절 T 세포 (Treg) 선택성에 대해 최적화되고, 저용량 IL2 수용체 (IL2R) 효능작용을 제공한다. 불활성 동종이량체로서, BMS-986326은 단량체 방출까지 IL2R 결합을 입체적으로 억제하여, 표적-매개 약물 배치 (TMDD) 및 신장 클리어런스를 회피하고 활성 단량체의 느린 방출을 통해 Treg-선택적 생체내 활성을 증대시키는 메카니즘을 제공한다. 단량체 방출은 분자가 IL2R과 결속하여 높은 수준의 CD25, 예컨대 Treg를 발현하는 세포에 대해 보다 큰 효력 및 선택성으로 신호전달을 개시하는 것을 가능하게 한다. 래트 및 원숭이에서의 독성학 연구는 BMS-986326에 대한 허용되는 내약성 프로파일을 입증하였다. 일부 측면에서, BMS-986326은 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 이는 미국 공개 번호 2009-0359672의 서열식별번호: 16에 상응한다. 미국 공개 번호 2009-0359672는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
"Fc 영역" (단편 결정화가능한 영역), "Fc 도메인" 또는 "Fc"는 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 상에 위치된 Fc 수용체에 대한 결합 또는 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)에 대한 결합을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 따라서, Fc 영역은 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인 (예를 들어, CH1 또는 CL)을 제외한 항체의 불변 영역을 포함한다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 제2 (CH2) 및 제3 (CH3) 불변 도메인으로부터 유래된, 2개의 동일한 단백질 단편을 포함하고; IgM 및 IgE Fc 영역은 각각의 폴리펩티드 쇄에 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH 도메인 2-4)을 포함한다. IgG 이소형은 특정 종에서 하위부류로 분류된다: 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 마우스에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3. IgG의 경우, Fc 영역은 이뮤노글로불린 도메인 CH2 및 CH3 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 힌지를 포함한다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계의 정의가 본원에 정의된 바와 같이 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 IgG1의 경우 아미노산 잔기 D221, IgG2의 경우 V222, IgG3의 경우 L221 및 IgG4의 경우 P224로부터 중쇄의 카르복시-말단까지의 스트레치로 정의되며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따른다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 아미노산 237로부터 아미노산 340까지에 이르고, CH3 도메인은 Fc 영역에서 CH2 도메인의 C-말단에 위치하며, 즉 그것은 IgG의 아미노산 341로부터 아미노산 447 또는 446 (C-말단 리신 잔기가 부재하는 경우) 또는 445 (C-말단 글리신 및 리신 잔기가 부재하는 경우)까지에 이른다. 본원에 사용된 Fc 영역은 임의의 동종이형 변이체를 포함한 천연 서열 Fc, 또는 변이체 Fc (예를 들어, 비-자연 발생 Fc)일 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한, FcγR 패밀리의 수용체를 포함한다. FcγR 패밀리는 3종의 활성화 (마우스에서 FcγRI, FcγRIII 및 FcγRIV; 인간에서 FcγRIA, FcγRIIA 및 FcγRIIIA) 및 1종의 억제 (FcγRIIB) 수용체로 이루어진다. 인간 FcγR의 다양한 특성은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 대부분의 선천성 이펙터 세포 유형은 1종 이상의 활성화 FcγR 및 억제 FcγRIIB를 공-발현하는 반면에, 자연 킬러 (NK) 세포는 1종의 활성화 Fc 수용체 (마우스에서 FcγRIII 및 인간에서 FcγRIIIA)를 선택적으로 발현하지만, 마우스 및 인간에서 억제 FcγRIIB는 발현하지 않는다. 인간 IgG1은 대부분의 인간 Fc 수용체에 결합하고, 그것이 결합하는 활성화 Fc 수용체의 유형과 관련하여 뮤린 IgG2a와 동등한 것으로 간주된다.
본원에 사용된 용어 "삽입된", "삽입된다", "내에 삽입된다", 또는 문법적으로 관련된 용어는 명시된 단백질 내의 유사한 위치 대비 융합 폴리펩티드 내의 이종 모이어티 (예를 들어, 반감기 연장 모이어티)의 위치를 지칭한다. 본원에 사용된 상기 용어는 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드의 특징을 지칭하고, 융합 폴리펩티드가 제조되는 임의의 방법 또는 과정을 나타내거나 암시하거나 추론하지 않는다.
폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 "이종" 및 "이종 모이어티"는 상이한 단백질 또는 폴리뉴클레오티드로부터 유래되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 융합 단백질의 추가의 성분은 융합 단백질의 다른 폴리펩티드 성분과 동일한 유기체로부터 유래될 수 있거나, 또는 추가의 성분은 융합 단백질의 다른 폴리펩티드 성분과 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 이종 폴리펩티드는 합성이거나, 또는 상이한 종, 개체의 상이한 세포 유형, 또는 별개의 개체의 동일하거나 상이한 유형의 세포로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, 이종 모이어티는 또 다른 폴리펩티드에 융합되어 융합 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 폴리펩티드이다. 또 다른 측면에서, 이종 모이어티는 폴리펩티드 또는 단백질에 접합된 비-폴리펩티드, 예컨대 PEG이다. 본원에 개시된 이종 모이어티의 비제한적 예는 글리신/세린 링커 (예를 들어, GGGSGGGSGGGS (서열식별번호: 6) (또한 (Gly3Ser)3으로 표시됨))이다.
"천연 서열 Fc 영역" 또는 "천연 서열 Fc"는 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역, 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다. 천연 서열 Fc는 Fc의 다양한 동종이형을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Jefferis et al. (2009) mAbs 1: 1] 참조).
융합 단백질을 사용하는 시험관내 또는 생체내 검정의 맥락에서의 용어 "EC50"은 최대 반응의 50%, 즉 최대 반응과 기준선의 절반인 반응을 유도하는 융합 단백질의 농도를 지칭한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환시키는 것을 지칭한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, IL2 융합 단백질에서의 예측되는 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Brummell et al., Biochem. 32: 1180-7 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-84 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-17 (1997)] 참조)
유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 코딩 영역과 작동가능하게 회합된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소를 포함할 수 있다. 또한, 프로모터외에, 다른 전사 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호가 유전자 산물 발현을 지시하는 코딩 영역과 작동가능하게 회합될 수 있다.
용어 "퍼센트 서열 동일성", "퍼센트 동일성", "서열 동일성", 또는 "동일성"은 상호교환가능하게 사용되고, 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 고려하여, 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이에 공유되는 동일한 매칭되는 위치의 수를 지칭한다. 매칭된 위치는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 표적 및 참조 서열 모두에 존재하는 임의의 위치이다. 표적 서열에 존재하는 갭은 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니기 때문에 계수되지 않는다. 마찬가지로, 참조 서열로부터의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니라 표적 서열 뉴클레오티드 또는 아미노산이 계수되기 때문에 참조 서열에 존재하는 갭은 계수되지 않는다.
2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
서열 동일성의 백분율은 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 둘 다의 서열에서 나타나는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 전체 위치의 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 2개 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 서열 동일성의 결정은 온라인 사용 및 다운로드 둘 다를 위해 용이하게 입수가능한 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 적합한 소프트웨어 프로그램이 다양한 공급원으로부터, 및 단백질 및 뉴클레오티드 서열 둘 다의 정렬을 위해 이용가능하다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하는 데 적합한 하나의 프로그램은 bl2seq로, 이는 미국 정부의 국립 생물 정보 센터 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 이용가능한 BLAST 스위트 프로그램의 일부이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 2개의 서열 사이의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되고, 반면에 BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은, 예를 들어 생물정보학 프로그램의 EMBOSS 스위트의 일부이자 또한 유럽 생물정보학 연구소 (EBI)로부터 www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 이용가능한 Needle, Stretcher, Water, 또는 Matcher이다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 정렬되는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 그 자체의 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 값은 소수 첫째자리까지 반올림되는 것에 유의한다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 버림되고, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 올림된다. 또한 길이 값은 항상 정수일 것임을 유의한다.
2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 (worldwideweb.gcg.com에서 이용가능)을 사용하여 결정될 수 있다. PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 캡 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)]의 알고리즘을 사용하여 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 동일성 백분율이 또한 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능) 내로 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
추가로 본원에 기재된 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공중 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 워드 길이 = 12로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여 본원에 기재된 핵산 분자에 상동인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 워드 길이 = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본원에 기재된 단백질 분자에 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭드 BLAST를 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-402 (1997)]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 사용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. [worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov]를 참조한다.
본원에 사용된 "투여"는 치료제를 포함하는 조성물을, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 기재된 IL2 융합 단백질에 대한 다양한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의하는, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 대안적으로, 본원에 기재된 항체는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어, 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다. 또한, 투여는 예를 들어 1회, 복수회, 및/또는 1 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
본원에 사용된 "투여 간격"은 대상체에게 투여되는 다중 용량 (2회 이상의 용량) 사이에 경과하는 시간의 양을 의미한다. 투여 간격의 비교는 단일 대상체에서 또는 대상체의 집단에서 수행될 수 있고, 이어서 집단에서 수득된 평균이 계산될 수 있다. 투여 간격은 한 경로에 의해 제공되는 용량 (정맥내)과 또 다른 경로에 의해 제공되는 용량 (피하) 사이의 시간의 양일 수 있다. 본원에 사용된 투여 간격은 시간상 서로 인접한 2회 용량에 적용된다.
"면역 반응"은 관련 기술분야에서 이해되는 바와 같고, 일반적으로 외래 작용제 또는 비정상적 세포에 대한 척추동물 내에서의 생물학적 반응을 지칭하며, 이 반응은 이들 작용제 및 그에 의해 유발되는 질환에 대해 유기체를 보호한다. 면역 반응은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 또는 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에는 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적 표적화, 그에 대한 결합, 그에 대한 손상, 그의 파괴, 및/또는 그의 척추동물 신체로부터의 제거를 발생시키는, 면역계의 1종 이상의 세포 (예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 또는 호중구) 및 이들 세포 중 임의의 것 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (항체, 시토카인 및 보체 포함)의 작용에 의해 매개된다. 면역 반응은, 예를 들어 T 세포, 예를 들어 이펙터 T 세포, Th 세포, CD4+ 세포, CD8+ T 세포 또는 Treg 세포의 활성화 또는 억제, 또는 면역계의 임의의 다른 세포, 예를 들어 NK 세포의 활성화 또는 억제를 포함한다.
"면역조정제" 또는 "면역조절제"는 작용제, 예를 들어 면역 반응의 조정, 조절 또는 변형에 수반될 수 있는 신호전달 경로의 성분을 표적화하는 작용제를 지칭한다. 면역 반응의 "조정", "조절" 또는 "변형"은 면역계 세포에서의 또는 이러한 세포 (예를 들어, 이펙터 T 세포, 예컨대 Th1 세포)의 활성에서의 임의의 변경을 지칭한다. 보다 특히, 본원에 사용된 용어 "조정"은 제시된 활성 또는 반응의 유도, 억제, 강화, 상승, 증가 또는 감소를 포함한다. 이러한 조정은 다양한 세포 유형의 수의 증가 또는 감소, 이들 세포의 활성의 증가 또는 감소, 또는 면역계 내에서 발생할 수 있는 임의의 다른 변화에 의해 나타날 수 있는 면역계의 자극 또는 억제를 포함한다. 억제 및 자극 면역조정제 둘 다가 확인되었다. 일부 측면에서, 면역조정제는 T 세포의 표면 상의 분자를 표적화한다. "면역조정 표적" 또는 "면역조절 표적"은 물질, 작용제, 모이어티, 화합물 또는 분자에 의한 결합에 대해 표적화되고, 그러한 결합에 의해 활성이 변경되는 분자, 예를 들어 세포 표면 분자이다. 면역조정 표적은 예를 들어, 세포 표면 상의 수용체 ("면역조정 수용체") 및 수용체 리간드 ("면역조정 리간드")를 포함한다.
"면역요법"은 면역계 또는 면역 반응을 유도, 증진, 억제, 또는 달리 변형시키는 것을 포함하는 방법에 의해 질환을 앓거나, 질환에 걸릴 위험이 있거나, 질환의 재발을 겪는 대상체를 치료하는 것을 지칭한다.
"면역자극 요법" 또는 "면역자극성 요법"은 대상체에서 면역 반응의 증가 (유도 또는 증진)를 발생시키는 요법을 지칭한다.
"내인성 면역 반응을 강화시키는 것"은 대상체에서 기존의 면역 반응의 유효성 또는 효력을 증가시키는 것을 의미한다. 유효성 및 효력의 이러한 증가는, 예를 들어 내인성 숙주 면역 반응을 억제하는 메카니즘을 극복함으로써 또는 내인성 숙주 면역 반응을 증진시키는 메카니즘을 자극함으로써 달성될 수 있다.
"T 이펙터" ("Teff") 세포는 세포용해 활성을 갖는 T 세포 (예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포), 뿐만 아니라 시토카인을 분비하여 다른 면역 세포를 활성화시키고 지시하는 T 헬퍼 (Th) 세포, 예를 들어 Th1 세포를 지칭하지만, 조절 T 세포 (Treg 세포)는 포함하지 않는다. 본원에 기재된 특정 IL2 융합 단백질은 Teff 세포, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ Teff 세포 및 Th1 세포를 활성화시킨다.
면역 반응 또는 면역계를 자극하는 증가된 능력은 T 세포 공동-자극 수용체의 증진된 효능제 활성 및/또는 억제 수용체의 증진된 길항제 활성으로부터 발생될 수 있다. 면역 반응 또는 면역계를 자극하는 증가된 능력은 면역 반응을 측정하는 검정, 예를 들어 시토카인 또는 케모카인 방출, 세포용해 활성 (표적 세포 상에서 직접적으로 또는 CD107a 또는 그랜자임을 검출하는 것을 통해 간접적으로 결정됨) 및 증식에서의 변화를 측정하는 검정에서 EC50 또는 활성의 최대 수준의 배수 증가에 의해 반영될 수 있다. 면역 반응 또는 면역계 활성을 자극하는 능력은 적어도 10%, 30%, 50%, 75%, 2배, 3배, 5배 또는 그 초과로 증진될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결된" 및 "융합된"은 각각 제2 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 공유 또는 비-공유 연결된 제1 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 직접 연결되거나 병치될 수 있거나, 또는 대안적으로 개재 서열은 제1 서열을 제2 서열에 공유 연결시킬 수 있다. 용어 "연결된"은 C-말단 또는 N-말단에서 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 융합을 의미할 뿐만 아니라, 전체 제1 아미노산 서열 (또는 제2 아미노산 서열)을 제2 아미노산 서열 (또는 각각 제1 아미노산 서열) 내의 임의의 2개의 아미노산 내로 삽입하는 것을 또한 포함한다. 한 측면에서, 제1 아미노산 서열은 펩티드 결합 또는 링커에 의해 제2 아미노산 서열에 연결된다. 제1 뉴클레오티드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 펩티드 또는 폴리펩티드 (폴리펩티드 쇄의 경우) 또는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쇄 (뉴클레오티드 쇄의 경우) 또는 임의의 화학적 모이어티 (폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 쇄 둘 다의 경우)일 수 있다. 용어 "연결된"은 또한 하이픈(-)으로 표시된다.
본원에 사용된 용어 "T 세포-매개 반응"은 이펙터 T 세포 (예를 들어, CD8+ 세포) 및 헬퍼 T 세포 (예를 들어, CD4+ 세포)를 포함한 T 세포에 의해 매개되는 반응을 지칭한다. T 세포 매개 반응은, 예를 들어, T 세포 세포독성 및 증식을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "세포독성 T 림프구 (CTL) 반응"은 세포독성 T 세포에 의해 유도되는 면역 반응을 지칭한다. CTL 반응은 주로 CD8+ T 세포에 의해 매개된다.
본원에 사용된 용어 "억제하다" 또는 "차단하다" (예를 들어, 세포 상의 IL2Rα에 대한 IL2의 결합의 억제/차단을 지칭함)는 상호교환가능하게 사용되고, 부분 및 완전 억제/차단 둘 다를 포괄한다. 일부 측면에서, IL2 융합 단백질은 IL2Rα에 대한 IL2의 결합을, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 바와 같이 결정 시, 적어도 약 50%, 예를 들어 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 억제한다. 일부 측면에서, IL2 융합 단백질은 IL2Rα에 대한 IL2의 결합을, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 바와 같이 결정 시, 50% 이하, 예를 들어 약 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 억제한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질환과 연관된 증상, 합병증, 상태 또는 생화학적 징후의 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전, 완화, 호전, 억제 또는 저속화 또는 예방하거나 또는 전체 생존을 증진시킬 목적으로 대상체에 대해 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정, 또는 대상체에게 활성제를 투여하는 것을 지칭한다. 치료는 질환을 갖는 대상체 또는 질환을 갖지 않는 대상체 (예를 들어, 예방용)에 대한 것일 수 있다. 예방 차원에서 제공될 경우, 본원에 개시된 융합 단백질은 임의의 증상 전에 미리 제공된다. 물질의 예방 차원의 투여는 임의의 후속 증상을 예방하거나 약화시키는 역할을 한다.
융합 단백질, 제약 조성물 또는 백신과 관련하여 "효능 증진" 또는 "면역원성 증진"은 예를 들어 보호 면역과 연관된 융합 단백질, 제약 조성물 또는 백신의 활성의 특정 파라미터의 증가 또는 감소와 같은 특정 값의 변화에 의해 측정된 결과의 개선을 의도한다. 한 측면에서, 증진은 특정 파라미터에서 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 100% 또는 100% 초과의 증가를 지칭한다. 또 다른 측면에서, 증진은 특정 파라미터에서 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 100% 또는 100% 초과의 감소를 지칭한다. 한 예에서, 백신의 효능/면역원성의 증진은 질환 진행을 억제 또는 치료하는 백신 능력의 증가, 예컨대 상기 목적을 위한 백신 효능의 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 또는 100% 초과의 증가를 지칭한다.
유사하게, 융합 단백질, 제약 조성물 또는 백신과 관련하여 "억제된 면역 반응의 극복"은 예를 들어 보호 면역과 관련된 백신 활성의 특정 파라미터에서 이전에 양의 값으로 되돌아가는 것과 같은 특정 값의 변화에 의해 측정된, 결과의 개선을 의도한다. 한 측면에서, 극복은 특정 파라미터에서 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 100% 또는 100% 초과의 증가를 지칭한다. 한 예에서, 융합 단백질, 제약 조성물 또는 백신에 대한 억제된 면역 반응을 극복하는 것은 질환 진행을 억제 또는 치료하는 융합 단백질, 제약 조성물 또는 백신의 능력 회복, 예컨대 상기 목적을 위한 백신 효과의 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 100% 또는 100% 초과의 회복을 의미한다.
본원에 (상호교환가능하게) 사용된 "치료 용량", "용량", 또는 "투여량"은 본원에 기재된 바와 같은 치료 목표를 달성하는 용량을 의미한다. 일부 측면에서, "치료 용량"은 대상체에서 면역 관용을 유도하는 용량을 의미한다. 특정 측면에서, "치료 용량"은 관용 기간까지의 명시된 시간 내에 예를 들어, 제1 용량을 투여하고 12주 내에, 대상체에서 면역 관용을 유도하는 용량을 의미한다. IL2 융합 단백질의 "용량"은 목적하는 생물학적 반응을 도출하기에 충분한 IL2 융합 단백질의 양을 지칭한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 효과적인 특정한 IL2 융합 단백질의 절대량은 목적하는 생물학적 종점, 전달되는 IL2 융합 단백질, 표적 세포 또는 조직 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 유효량이 단일 용량으로 투여될 수 있거나 또는 다중 용량 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과의 용량)의 투여에 의해 달성될 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 질환 퇴행을 촉진하거나 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 치료제의 능력은 숙련된 진료의에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측해주는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 치료제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
본원에 사용된 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 예를 들어 질환 또는 상태의 중증도의 감소; 상태 경과의 지속시간의 감소; 질환 또는 상태와 연관된 1종 이상의 증상의 호전 또는 제거; 질환 또는 상태를 반드시 치유하지 않으면서 질환 또는 상태를 갖는 대상체에게의 유익한 효과의 제공을 지칭한다.
본원에 사용된 "제약 제제" 또는 "제약 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하고, 제약 제제 또는 조성물이 투여될 대상체에게 허용되지 않게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 제약 제제 또는 조성물은 멸균성일 수 있다. 일부 측면에서, 제약 제제 또는 조성물은 인간 대상체에서의 치료 용도에 적합하다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치유적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 면역 질환을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에 지칭된 용어 "체중 기준" 용량 또는 투여는 환자에게 투여되는 용량이 환자의 체중을 기준으로 하여 계산된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 60 kg 체중을 갖는 환자가 3 mg/kg의 항-IL2 항체를 필요로 하는 경우에, 투여를 위해 IL2 융합 단백질의 적절한 양 (즉, 180 mg)을 계산하고 사용할 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 투여량과 관련하여 용어 "균일 용량"의 사용은 환자의 체중 또는 체표면적 (BSA)과 무관하게 환자에게 투여되는 용량을 의미한다. 따라서 균일 용량은 mg/kg 용량으로 제공되지 않고, 오히려 작용제 (예를 들어, IL2 융합 단백질)의 절대량으로서 제공된다. 예를 들어, 60 kg 인간 및 100 kg 인간은 동일한 용량의 항체 (예를 들어, 480 mg의 IL2 융합 단백질)를 받을 것이다.
본원에 사용된 용어 "ug" 및 "uM"은 각각 "μg" 및 "μM"과 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 용어 "임상시험용 제품" 또는 "IP"는 BMS-986326 뿐만 아니라 위약 (0.9% 염화나트륨)을 포함한다. 일부 경우에, 임상시험용 제품은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해, 예컨대 예를 들어 정맥내로 또는 피하로 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에 제공된 임의의 다른 조성물 및 방법 중 하나 이상과 조합될 수 있다.
이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린 단편 또는 영역의 아미노산 넘버링에 대해 이루어진 참조는 모두 문헌 [Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD]에 기초한다. FcRn 수용체는 인간을 비롯한 여러 포유동물 종으로부터 단리되었다. 인간 FcRn, 래트 FcRn 및 마우스 FcRn의 서열은 공지되어 있다 (Story et al., J. Exp. Med. 180: 2377 (1994)). Fc는 이뮤노글로불린의 힌지 영역을 갖거나 갖지 않는 이뮤노글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 Fc 변이체는 WO 2004/101740 및 WO 2006/074199에 제공된다.
단위, 접두어, 및 기호는 국제 단위계 (SI) 허용 형태로 나타내어진다. 수치 범위는 범위를 규정하는 수를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 좌측에서 우측으로 표기된다. 본원에 제공된 표제는 본 개시내용의 다양한 측면을 제한하는 것이 아니며, 이는 본 명세서를 전체로서 참조할 수 있다. 따라서, 바로 아래에서 정의되는 용어는 본 명세서를 그 전문을 참조하여 보다 충분히 정의된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press는 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어에 대한 일반 사전을 제공한다.
본원에 기재된 다양한 측면이 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.
II. 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법
본 개시내용은 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 1개 이상의 용량의 인터류킨-2 (IL2) 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 (a) IL2 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 (b) 인터류킨-2 수용체 알파 (IL2Rα) 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 (i) IL2Rα 폴리펩티드의 세포외 도메인은 천연 IL2Rα의 세포외 도메인 (서열식별번호: 1)과 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖고/거나; (ii) IL2 폴리펩티드는 천연 IL2 (서열식별번호: 2)와 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖는 것인, 상기 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 방법은 대상체에게 코르티코스테로이드를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 히드로코르티손, 덱사메타손, 베타메타손, 부데소니드, 트리암시놀론, 코르티손, 데스옥시코르티코스테론, 플루드로코르티손 또는 파라메타손이다.
Treg에 대한 IL-2 신호전달 경로의 중요성은 IL-2 신호전달 경로의 성분이 결여된 마우스 또는 인간에서 전신 자가면역의 출현에 의해 입증되었다. Treg 세포 수 및/또는 기능의 조절이상은 수많은 면역-매개 상태에 연루되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Bluestone, J.A., et al., J Clin Invest. 125:2250-60 (2015); 및 Dominguez-Villar, M and Hafler, D.A., Nat Immunol. 19:665-73 (2018)]을 참조한다. IL-2, IL-2Rα 및 IL-2Rβ 유전자좌에서의 자가면역 위험 변이체는 게놈전반 연관 연구 (GWAS)를 통해 확인되었고, 염증성 장 질환 (IBD), 제1형 자가면역 당뇨병 (T1DM), 다발성 경화증 (MS) 및 류마티스 관절염 (RA)을 포함한 면역-매개 질환과 연관되었다. 예를 들어, 문헌 [Abbas, A.K., et al., Sci Immunol. 3, eaat1482 (2018)]을 참조한다. 주요 Treg 계통 전사 인자 FoxP3에 영향을 미치는 돌연변이는 자가면역 림프증식성 질환, 면역 조절이상, 다발내분비병증, 장병증, X-연관 (IPEX) 증후군을 유발하며, 이는 기능적 Treg의 상실로부터 발생한다. 또한, IL-2RA에서의 돌연변이로 인한 CD25 결핍을 갖는 환자는 IPEX 증후군과 유사한 면역 조절이상을 앓는다. 예를 들어, 문헌 [Verbsky, J.W. and Chatila, T., Curr Opin Pediatr. 25(6):708-14 (2013)]을 참조한다. 유전자 데이터는 마우스 및 인간 둘 다에서 Treg 기능 및 자가면역 억제에서의 IL-2에 대한 중추적 역할과 일치한다.
일반적으로, IL-2 결핍이 SLE 환자에서 관용의 상실 및 면역병리상태에 기여하는 1차 메카니즘은 Treg 항상성을 파괴하는 것에 의한 것으로 가정된다. 예를 들어, 문헌 [Klatzmann, D., and Abbas, A.K., Nat Rev Immunol. 15:283-94 (2015); 및 Ballesteros-Tato, A. and Papillion, A., Curr Opin Immunol. 61:39-45 (2019)]을 참조한다. 일부 연구는 활성 SLE 질환을 갖는 환자에서 Treg의 빈도의 상대적 증가가 존재함을 시사하였지만, 이들 Treg는 보다 낮은 CD25 발현을 갖는 것으로 보고되었으며, 이는 기능적 손상을 시사한다. 예를 들어, 문헌 [Von Spee-Mayer, C., et al., Ann Rheum Dis. 75:1407-15 (2016)]을 참조한다. SLE 환자에서의 Treg의 기능적 손상이 명백하게 이해되지는 않지만, SLE에서의 3가지 독립적인 임상 연구는 저용량 IL-2 치료 후에 증가된 Treg 및 감소된 질환 활성 및 증가된 Treg를 입증하였다. 예를 들어, 문헌 [He, J., et al., Arthritis Rheumatol. 67(suppl 10) (2015); Humrich, J.Y., et al. Ann Rheum Dis. 74:791-92 (2015); 및 Von Spee-Mayer, C., et al., Ann Rheum Dis. 75:1407-15 (2016)]을 참조한다. 저용량 IL-2 투여, Treg 확장, 및 감소된 면역병리상태 사이의 연관성은 제I형 당뇨병 (예를 들어, 문헌 [Dwyer, C.J., et al., Curr Diab Rep. 16:46 (2016)] 참조), HCV-유발 혈관염 (예를 들어, 문헌 [Dupont, G., et al., Cytokine. 69:146-9 (2014)] 참조), 원형 탈모증 (예를 들어, 문헌 [Castela, E., et al., JAMA Dermatol. 150:748-51 (2014)] 참조), 및 GvHD (예를 들어, 문헌 [Koreth, J., et al., N Engl J Med. 365:2055-66 (2011)] 참조)를 포함한 다른 형태의 면역-매개 장애에서 밝혀졌다. 이들 연구는 Treg의 IL-2-의존성 확장과 저-용량 IL-2 처리 후에 관찰된 임상 이익 사이의 인과의 상관관계를 나타낸다.
전신 홍반성 루푸스 (SLE)는 IL2-결핍 상태로서 설명되었고, IL-2 결핍은 SLE 진행과 연관된다. 예를 들어, 문헌 [Mizui, M. and Tsokos, G.C., Front Immunol. 9: Article 786 (2018)]을 참조한다. SLE를 갖는 환자로부터의 배양된 말초 혈액 단핵 세포 및 CD4+ T 세포는 결핍된 생체외 IL-2 생산을 입증한다. 예를 들어, 문헌 [Comte, D., et al., Arthritis & Rheumatology 69:808-13 (2017)]을 참조한다.
따라서, 본 개시내용은 질환 또는 상태, 예를 들어 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환, 예를 들어 SLE의 치료를 위한 본원에 개시된 IL2 융합 단백질에 대한 안전하고 효과적인 투여량을 제공한다.
II.A. 용량 및 투여 경로
일부 측면에서, IL2 융합 단백질의 용량은 약 0.1 mg 내지 약 9 mg이다. 다른 측면에서, IL2 융합 단백질의 용량은 약 9 mg 초과이다.
IL2 융합 단백질의 용량은 국소, 표피, 점막, 비강내, 경구, 질, 직장, 설하, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 또는 흉골내 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 정맥내 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, i.v. 투여된 용량의 AUC[0-336시간 (h)]은 평균 노출 (AUC[INF])이 제한되도록 제어된다. 일부 측면에서, 용량의 AUC[0-336시간 (h)]은 약 757 μg·h/ml 미만이다.
일부 측면에서, 용량의 AUC[0-336시간 (h)]은 약 750 μg·h/ml, 약 740 μg·h/ml, 약 730 μg·h/ml, 약 720 μg·h/ml, 약 710 μg·h/ml, 약 700 μg·h/ml, 약 690 μg·h/ml, 약 680 μg·h/ml, 약 670 μg·h/ml, 약 660 μg·h/ml, 약 650 μg·h/ml, 약 640 μg·h/ml, 약 630 μg·h/ml, 약 620 μg·h/ml, 약 610 μg·h/ml, 약 600 μg·h/ml, 약 590 μg·h/ml, 약 580 μg·h/ml, 약 570 μg·h/ml, 약 560 μg·h/ml, 또는 약 550 μg·h/ml 미만이다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 약 0.3 mg 내지 약 9 mg의 용량으로 정맥내 경로를 통해 투여된다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 약 1 mg 내지 약 9 mg, 약 2 mg 내지 약 9 mg, 약 3 mg 내지 약 9 mg, 약 4 mg 내지 약 9 mg, 약 5 mg 내지 약 9 mg, 약 6 mg 내지 약 9 mg, 약 7 mg 내지 약 9 mg, 약 8 mg 내지 약 9 mg, 약 1 mg 내지 약 8 mg, 약 2 mg 내지 약 8 mg, 약 3 mg 내지 약 8 mg, 약 4 mg 내지 약 8 mg, 약 5 mg 내지 약 8 mg, 약 6 mg 내지 약 8 mg, 약 7 mg 내지 약 8 mg, 약 1 mg 내지 약 7 mg, 약 2 mg 내지 약 7 mg, 약 3 mg 내지 약 7 mg, 약 4 mg 내지 약 7 mg, 약 5 mg 내지 약 7 mg, 약 6 mg 내지 약 7 mg의 용량으로 정맥내 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 3 mg 내지 약 9 mg이다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 6 mg 내지 약 9 mg이다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 약 0.1 mg 내지 약 6 mg, 약 1 mg 내지 약 6 mg, 약 2 mg 내지 약 6 mg, 약 3 mg 내지 약 6 mg, 약 4 mg 내지 약 6 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 6 mg, 약 1 mg 내지 약 5 mg, 약 2 mg 내지 약 5 mg, 약 3 mg 내지 약 5 mg, 약 4 mg 내지 약 5 mg, 약 1 mg 내지 약 4 mg, 약 2 mg 내지 약 4 mg, 약 3 mg 내지 약 4 mg, 약 1 mg 내지 약 3 mg, 또는 약 2 mg 내지 약 3 mg의 용량으로 정맥내 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 0.1 mg 내지 약 3 mg이다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 0.1 mg 내지 약 1 mg이다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 0.1 mg 내지 약 0.3 mg이다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 0.3 mg 내지 약 6 mg이다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 1 mg 내지 약 3 mg이다.
일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 0.1 mg, 약 0.3 mg, 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 4 mg, 약 5 mg, 약 6 mg, 약 7 mg, 약 8 mg 또는 약 9 mg이다. 일부 측면에서, 정맥내 경로를 통해 투여되는 용량은 약 9 mg 초과이다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 피하 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, s.c. 투여된 용량의 AUC[0-336시간 (h)]은 평균 노출 (AUC[INF])이 제한되도록 제어된다. 일부 측면에서, 용량의 AUC(0-504h)는 약 306 μg·h/ml 미만이다.
일부 측면에서, 용량의 AUC(0-504h)는 약 300 μg·h/ml, 약 290 μg·h/ml, 약 280 μg·h/ml, 약 270 μg·h/ml, 약 260 μg·h/ml, 약 250 μg·h/ml, 약 240 μg·h/ml, 약 230 μg·h/ml, 약 220 μg·h/ml, 약 210 μg·h/ml, 약 200 μg·h/ml, 약 190 μg·h/ml, 약 180 μg·h/ml, 약 170 μg·h/ml, 약 160 μg·h/ml, 또는 약 150 μg·h/ml 미만이다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 약 1 mg 내지 약 8 mg, 약 2 mg 내지 약 8 mg, 약 3 mg 내지 약 8 mg, 약 4 mg 내지 약 8 mg, 약 5 mg 내지 약 8 mg, 약 6 mg 내지 약 8 mg, 약 7 mg 내지 약 8 mg, 약 1 mg 내지 약 7 mg, 약 2 mg 내지 약 7 mg, 약 3 mg 내지 약 7 mg, 약 4 mg 내지 약 7 mg, 약 5 mg 내지 약 7 mg, 약 6 mg 내지 약 7 mg, 약 1 mg 내지 약 6 mg, 약 2 mg 내지 약 6 mg, 약 3 mg 내지 약 6 mg, 약 4 mg 내지 약 6 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 6 mg, 약 1 mg 내지 약 5 mg, 약 2 mg 내지 약 5 mg, 약 3 mg 내지 약 5 mg, 약 4 mg 내지 약 5 mg, 약 1 mg 내지 약 4 mg, 약 2 mg 내지 약 4 mg, 약 3 mg 내지 약 4 mg, 약 1 mg 내지 약 3 mg, 또는 약 2 mg 내지 약 3 mg의 용량으로 피하 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 3 mg 내지 약 8 mg이다. 일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 6 mg 내지 약 8 mg이다. 일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 1 mg 내지 약 6 mg이다. 일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 1 mg 내지 약 3 mg이다. 일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 3 mg 내지 약 6 mg이다.
일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 1 mg, 약 3 mg, 약 6 mg 또는 약 8 mg이다. 일부 측면에서, 피하 경로를 통해 투여되는 용량은 약 8 mg 초과이다.
일부 측면에서, 본 방법은 다중 용량 (즉, 2회 이상의 용량)을 그를 필요로 하는 대상체에게 2회 용량 사이의 투여 간격으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 투여 간격 (예를 들어, 피하 또는 정맥내)은 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 또는 적어도 약 6일이다. 일부 측면에서, 투여 간격 (예를 들어, 피하 또는 정맥내)은 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주, 적어도 약 8주, 적어도 약 2개월, 적어도 약 9주, 적어도 약 10주, 적어도 약 11주, 적어도 약 12주, 또는 적어도 약 3개월이다. 일부 측면에서, 투여 간격은 적어도 약 3주이다. 일부 측면에서, 투여 간격은 적어도 약 2주이다. 일부 측면에서, 투여 간격은 적어도 약 4주이다. 일부 측면에서, 투여 간격은 적어도 약 1개월이다. 일부 측면에서, 투여는 정맥내로 제공되고, 투여 간격은 적어도 약 3주이다. 일부 측면에서, 투여는 정맥내로 제공되고, 투여 간격은 적어도 약 2주이다. 일부 측면에서, 투여는 정맥내로 제공되고, 투여 간격은 적어도 약 4주 또는 약 1개월이다. 일부 측면에서, 투여는 피하로 제공되고, 투여 간격은 적어도 약 3주이다. 일부 측면에서, 투여는 피하로 제공되고, 투여 간격은 적어도 약 2주이다. 일부 측면에서, 투여는 피하로 제공되고, 투여 간격은 적어도 약 4주 또는 약 1개월이다.
일부 측면에서, 투여 간격 (예를 들어, 피하 또는 정맥내)은 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 또는 약 6일이다. 일부 측면에서, 투여 간격 (예를 들어, 피하 또는 정맥내)은 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1개월, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 2개월, 약 9주, 약 10주, 약 11주, 약 12주, 또는 약 3개월이다. 일부 측면에서, 투여 간격은 약 3주이다. 일부 측면에서, 투여 간격은 약 2주이다. 일부 측면에서, 투여 간격은 약 4주이다. 일부 측면에서, 투여 간격은 약 1개월이다. 일부 측면에서, 투여는 정맥내로 제공되고, 투여 간격은 약 3주이다. 일부 측면에서, 투여는 정맥내로 제공되고, 투여 간격은 약 2주이다. 일부 측면에서, 투여는 정맥내로 제공되고, 투여 간격은 약 4주 또는 1개월이다. 일부 측면에서, 투여는 피하로 제공되고, 투여 간격은 약 3주이다. 일부 측면에서, 투여는 피하로 제공되고, 투여 간격은 약 2주이다. 일부 측면에서, 투여는 피하로 제공되고, 투여 간격은 약 4주 또는 약 1개월이다.
일부 측면에서, 본 방법은 다중 용량의 본원에 기재된 융합 단백질을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 다중 용량은 2개 이상의 상이한 경로를 통해 투여되고, 예를 들어 하나의 용량은 정맥내로 투여되고, 또 다른 용량은 피하로 투여된다. 일부 측면에서, 본 방법은 (i) 융합 단백질의 제1 용량을 그를 필요로 하는 대상체에게 정맥내 투여하고, (ii) 융합 단백질의 제2 (또는 최종) 용량을 그를 필요로 하는 대상체에게 피하 투여하는 것을 제공한다. 일부 측면에서, 본 방법은 (i) 융합 단백질의 1개 이상의 용량을 그를 필요로 하는 대상체에게 정맥내 투여하고, (ii) 융합 단백질의 1개 이상의 용량을 대상체에게 피하 투여하는 것을 제공한다. 일부 측면에서, 투여 간격 및/또는 투여량은 정맥내 투여와 피하 투여 사이에 조정될 수 있다.
일부 측면에서, 본 방법은 대상체에게 코르티코스테로이드를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 히드로코르티손, 덱사메타손, 베타메타손, 부데소니드, 트리암시놀론, 코르티손, 데스옥시코르티코스테론, 플루드로코르티손 및 파라메타손으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 또는 프레드니손이다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론이다.
일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 국소, 표피, 점막, 비강내, 경구, 질, 직장, 설하, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 또는 흉골내 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 국소, 경구, 정맥내 또는 근육내 경로를 통해 대상체에게 투여된다.
일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 융합 단백질의 각각의 용량 전에, 그와 공동으로, 또는 그 후에 투여된다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드의 2회 이상의 용량은 각각의 용량 사이의 투여 간격으로 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드의 투여 간격은 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주, 적어도 약 8주, 적어도 약 2개월, 적어도 약 9주, 적어도 약 10주, 적어도 약 11주, 적어도 약 12주, 또는 적어도 약 3개월이다. 일부 측면에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론이며, 여기서 융합 단백질은 대상체에게 1주 2회 피하 투여되고, 프레드니솔론은 대상체에게 1주 3회 경구 투여된다.
II.B. 질환 및 장애
본 방법에 적합한 대상체는 면역 반응의 증진이 바람직할 인간 환자를 포함한다. 방법은 면역 반응 (예를 들어, T-세포 매개 면역 반응, 예를 들어 항원 특이적 T 세포 반응)을 증대시킴으로써 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는 인간 환자를 치료하는 데 특히 적합하다. 일부 측면에서, IL2 융합 단백질의 양을 대상체에게 투여하는 것은 대상체에서 면역 반응을 변형시킨다. 일부 측면에서, 면역 반응은 대상체에서 증진, 자극 또는 상향조절된다.
본원에 기재된 IL2 융합 단백질이 T 세포 반응을 자극 또는 공동-자극하는 능력, 예를 들어 예컨대 IL2 또는 IL2Rα의 음성 효과를 억제하는 것에 의한 항원-특이적 T 세포 반응을 고려하면, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극, 증진 또는 상향조절하기 위해 본원에 기재된 IL2 융합 단백질을 시험관내 및 생체내 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, CD3 자극이 또한 제공되며 (예를 들어, 막 CD3을 발현하는 세포와의 공동인큐베이션에 의함), 이 자극은 본원에 기재된 IL2 융합 단백질로의 자극과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 제공될 수 있다.
항원-특이적 T 세포 반응의 임의의 적합한 지시자가 항원-특이적 T 세포 반응을 측정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 적합한 지시자의 비제한적 예는 항체의 존재 하에 증가된 T 세포 증식 및/또는 항체의 존재 하에 증가된 시토카인 생산을 포함한다. 일부 측면에서, 항원-특이적 T 세포에 의한 인터류킨-2 및/또는 인터페론-γ 생산이 자극된다.
본원에 기재된 IL2 융합 단백질로 증진 또는 공동-자극될 수 있는 T 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. T 세포는 Teff 세포, 예를 들어 CD4+ Teff 세포, CD8+ Teff 세포, T헬퍼 (Th) 세포 (예를 들어, Th1 세포) 또는 T 세포독성 (Tc) 세포일 수 있다.
일부 측면에서, 질환 또는 장애는 감염성 질환 또는 면역-매개 질환이다. 본원에 기재된 IL2 융합 단백질을 사용한 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료는, 예를 들어 안정 질환, 부분 반응, 증가된 전체 생존, 증가된 무질환 생존, 또는 증진된 무진행 생존을 유발할 수 있다.
일부 측면에서, 면역-매개 질환은 염증성 질환 또는 자가면역 질환이다. 원치 않는 면역 반응을 억제하기 위해 Treg의 억제력을 활용하는 것에 대한 많은 관심이 있다. 마우스 및 인간에서의 데이터는 저용량의 IL2로 IL2R 신호전달을 증진시키는 것이 Treg를 선택적으로 부스팅하고 면역 관용성 메카니즘을 증진시킨다는 것을 보여준다. 본원에 제공된 IL2 융합 단백질은 Treg를 보다 잠재적으로 증진시키는 IL2의 새롭고 개선된 형태를 나타낸다. 따라서, IL2 융합 단백질은 자가면역 질환, 만성 이식편 대 숙주 질환, 이식 거부 반응, 및 자가-반응성을 억제하는 것이 목표인 다른 상태를 갖는 환자에게 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 면역-매개 질환은 제1형 당뇨병; 다발성 경화증; 류마티스 관절염; 복강 질환; 전신 홍반성 루푸스; 루푸스 신염; 피부 루푸스; 소아 특발성 관절염; 크론병; 궤양성 결장염; 전신 경화증; 이식편 대 숙주 질환 (GvHD); 건선; 원형 탈모증; HCV-유발 혈관염; 쇼그렌 증후군; 천포창; 강직성 척추염; 베체트병; 베게너 육아종증; 다카야스병; 자가면역 간염; 경화성 담관염; 고제로트-쇼그렌; 염증성 장 질환; 면역 조절이상, 다발내분비병증, 장병증, X-연관 (IPEX) 증후군; 및 대식세포 활성화 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 면역-매개 질환은 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 또는 피부 루푸스이다. 일부 측면에서, 면역-매개 질환은 전신 홍반성 루푸스이다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2 융합 단백질은 선행 치료에 대해 부적절한 반응을 나타내거나 또는 선행 치료 하에 진행된 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 갖는 환자에게 투여된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2 융합 단백질은 염증성 질환 또는 자가면역 질환에 대한 치료를 이전에 받지 (즉, 그로 치료되지) 않은 환자에게 투여된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2 융합 단백질은 염증성 질환 또는 자가면역 질환에 대한 표준 관리 치료와 함께 투여된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2 융합 단백질은 염증성 질환 또는 자가면역 질환에 대한 유지 요법, 예를 들어 염증의 발생 또는 재발을 예방하도록 의도된 요법으로서 투여된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2 융합 단백질은 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 단독요법으로서, 또는 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 유일한 면역-자극 요법으로서 투여된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2 융합 단백질은 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 백신접종 프로토콜과 조합된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2 융합 단백질은 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 치료에 사용되는 항체와 조합된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2 융합 단백질은 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 치료에 사용되는 코르티코스테로이드와 조합된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2 융합 단백질은 전신 홍반성 루푸스의 치료에 사용되는 코르티코스테로이드와 조합된다. 일부 측면에서, 전신 홍반성 루푸스의 치료에 사용되는 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 히드로코르티손, 덱사메타손, 베타메타손, 부데소니드, 트리암시놀론, 코르티손, 데스옥시코르티코스테론, 플루드로코르티손 또는 파라메타손이다. 일부 측면에서, 전신 홍반성 루푸스의 치료에 사용되는 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 또는 프레드니손이다. 일부 측면에서, 전신 홍반성 루푸스의 치료에 사용되는 코르티코스테로이드는 프레드니솔론이다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2 융합 단백질은 루푸스 신염의 치료에 사용되는 코르티코스테로이드와 조합된다. 일부 측면에서, 전신 루푸스 신염의 치료에 사용되는 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 히드로코르티손, 덱사메타손, 베타메타손, 부데소니드, 트리암시놀론, 코르티손, 데스옥시코르티코스테론, 플루드로코르티손 또는 파라메타손이다. 일부 측면에서, 루푸스 신염의 치료에 사용되는 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 또는 프레드니손이다. 일부 측면에서, 루푸스 신염의 치료에 사용되는 코르티코스테로이드는 프레드니솔론이다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2 융합 단백질은 피부 루푸스의 치료에 사용되는 코르티코스테로이드와 조합된다. 일부 측면에서, 피부 루푸스의 치료에 사용되는 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 히드로코르티손, 덱사메타손, 베타메타손, 부데소니드, 트리암시놀론, 코르티손, 데스옥시코르티코스테론, 플루드로코르티손 또는 파라메타손이다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 IL2 융합 단백질은 유의하게 독성이 아니다. 예를 들어, 본원에 기재된 IL2 융합 단백질은, 예를 들어 임상 시험에서 결정된 바와 같이, 인간의 기관, 예를 들어 간, 신장, 뇌, 폐 및 심장 중 하나 이상에 대해 유의하게 독성이 아니다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 IL2 융합 단백질은 바람직하지 않은 면역 반응, 예를 들어 자가면역 또는 염증을 유의하게 촉발하지 않는다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 IL2 융합 단백질로의 대상체의 치료는 대상체의 면역계가 이어서 대상체 자체를 공격하거나 (예를 들어, 자가면역 반응) 또는 예를 들어 아나필락시스를 발생시키는 정도로 면역계의 과다자극을 발생시키지 않는다. 따라서, 일부 측면에서, 본원에 기재된 IL2 융합 단백질은 아나필락시스를 유발하지 않는다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 IL2 융합 단백질로의 대상체의 치료는 유의한 염증 반응, 예를 들어 면역-매개 폐장염, 면역-매개 결장염, 면역-매개 간염, 면역-매개 신염 또는 신장 기능장애, 면역-매개 뇌하수체염, 면역-매개 갑상선기능저하증 및 갑상선기능항진증, 또는 다른 면역-매개 유해 반응을 유발하지 않는다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 IL2 융합 단백질로의 대상체의 치료는 유의한 심장 장애, 예를 들어 심실성 부정맥; 안장애, 예를 들어 홍채모양체염; 주입-관련 반응; 증가된 아밀라제, 증가된 리파제; 신경계 장애, 예를 들어 어지럼증, 말초 및 감각 신경병증; 피부 및 피하 조직 장애, 예를 들어 발진, 소양증, 낙설성 피부염, 다형성 홍반, 백반증 또는 건선; 호흡기, 흉부 및 종격 장애, 예를 들어 기침; 피로; 오심; 감소된 식욕; 변비; 관절통; 또는 설사를 유발하지 않는다.
본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 조성물을 추가로 제공한다.
II.C. IL2 융합 단백질
본 방법에서 투여되는 IL2 융합 단백질은 적어도 2개의 성분: (a) 인터류킨-2 (IL2) 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (b) 인터류킨-2 수용체 알파 (IL2Rα) 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며; 여기서 IL2Rα 폴리펩티드의 세포외 도메인은 천연 IL2Rα의 세포외 도메인 (서열식별번호: 1)과 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖고/거나; (ii) IL2 폴리펩티드는 천연 IL2 (서열식별번호: 2)와 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖는다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 IL2 활성을 갖는다.
본원에 기재된 융합 단백질은 인간 IL2R, 보다 구체적으로 인간 IL2Rα의 세포외 도메인 내의 특정한 도메인 (예를 들어, 기능적 도메인)에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, IL2를 포함하는 융합 단백질은 길항제이다. 일부 측면에서, IL2를 포함하는 융합 단백질은 인간 IL2Rα에 높은 친화도로 결합한다.
다중 수용체 서브유닛은 효과적인 IL-2 수용체 신호전달에 기여한다. IL-2Rβ 및 공통 감마 쇄 수용체 (IL-2Rγ)는 수용체의 신호전달 성분을 구성하고, IL-2 신호전달에 필요하고 충분하다. IL-2Rβγ 이종이량체 수용체의 활성화는 JAK1 및 JAK3의 동원, PI3K의 활성화 및 궁극적으로 STAT5의 인산화로 이어진다. 예를 들어, 문헌 [Malek, T.R., Annu Rev Immunol. 26:453-79 (2008)]을 참조한다. IL-2Rβ 및 IL-2Rγ는 모든 IL-2 감수성 면역 세포: Treg, Tconv, CD8 T 세포, NK 세포 및 선천성 림프성 세포 유형 2 (ILC2) 상에서 발현되는 반면, 알파 서브유닛, IL-2Rα 또는 CD25는 보다 제한된 발현을 갖는다. CD25는 Treg 상에서 구성적으로 발현되고, ILC2 상에서 보고되었고, 오직 활성화된 T 세포, B 세포, 및 NK 세포 상에서만 일시적으로 발현된다. 예를 들어, 문헌 [Simoni, Y., et al., Immunity 46(1):148-61 (2017)]을 참조한다. CD25는 IL-2에 대해 중간 정도의 (~25 nM) 친화도를 갖고, 신호전달에 직접적으로 참여하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Rickert, M., et al., Science 308:1477-80 (2005)]을 참조한다.
IL-2의 4원 복합체 및 모든 3종의 수용체 성분의 세포외 도메인의 결정 구조에 기초하여, CD25는 IL-2Rβ 또는 IL-2Rγ와 직접 접촉하는 것으로 보이지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Nelson, B.H., et al., Nature 369:333-6 (1994); 및 Stauber, D.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:2788-93 (2006)]을 참조한다. 대신에, CD25는 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ 서브유닛과 동일한 세포 상에서 CD25가 높은 수준으로 발현되는 세포에 대한 IL-2의 겉보기 효력을 증가시키는 IL-2에 대한 세포 표면 싱크로서 작용하는 것으로 보인다. 예를 들어, 문헌 [Pillet, A.H., et al., J Mol Biol. 403:671-92 (2010)]을 참조한다. Treg 상에서의 구성적으로 높은 CD25 발현은 IL-2에 대한 매우 높은 감수성을 부여하고, 다른 비-조절 T 세포에 비해 Treg 상에서의 IL-2의 효력이 유의하게 더 크다. 예를 들어, 문헌 [Dupont, G., et al., Cytokine 69:146-9 (2014)]을 참조한다. Treg의 IL-2 처리는 CD25 및 FoxP3, 뿐만 아니라 Treg 억제 활성과 연관된 다른 유전자의 상향-조절을 포함한 강건한 증식 및 활성화로 이어진다. 예를 들어, 문헌 [Sakaguchi, S., et al., J Immunol. 155(3):1151-64 (1995)]을 참조한다. Treg와 대조적으로, 이펙터 T 세포 및 대부분의 NK 세포는 높은 구성적 CD25 발현이 결여되고 활성화 시 CD25를 오직 일시적으로 상향조절하기 때문에 활성화를 위해 보다 높은 IL-2 수준을 필요로 한다. 예를 들어, 문헌 [Letourneau, S., et al., J Allergy Clin Immunol. 123(4):758-62 (2009)]을 참조한다.
II.C.1. IL2 융합 단백질의 IL2 폴리펩티드
IL2 융합체는 인터류킨-2 (IL2) 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함한다.
일부 측면에서, IL2 융합 단백질의 IL2 폴리펩티드는 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트), 및 가축 또는 농업 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 천연 또는 재조합 IL2이다.
용어 IL2는 프로세싱되지 않은 IL2, 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 IL2의 임의의 형태 (즉, IL2의 성숙 형태)를 포괄한다. 상기 용어는 또한 IL2의 자연 발생 변이체 및 단편, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체, 및 비-자연 발생 변이체를 포괄한다. 인간 IL2의 예시적인 성숙 형태의 아미노산 서열 (20개의 아미노산 신호 서열을 가짐)은 서열식별번호: 2에 제시된다. 프로세싱되지 않은 인간 IL2는 성숙 IL2 분자에는 부재하는 N-말단 20개 아미노산 신호 펩티드 (서열식별번호: 7)를 추가로 포함한다. 마우스 IL2의 예시적인 성숙 형태의 아미노산 서열 (20개의 아미노산 신호 서열을 가짐)은 서열식별번호: 8에 제시된다. 프로세싱되지 않은 마우스 IL2는 성숙 IL2 분자에는 부재하는 N-말단 20개 아미노산 신호 펩티드 (서열식별번호: 9)를 추가로 포함한다. "야생형 IL2"로도 지칭되는 "천연 IL2"는 자연 발생 또는 재조합 IL2를 의미한다.
IL2에 대한 추가의 핵산 및 아미노산 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호: Q7JFM2 (아오투스 레무리누스 (회색배 올빼미 원숭이)); Q7JFM5 (아오투스 낸시마아에 (마 올빼미 원숭이)); P05016 (보스 타우루스 (소)); Q29416 (카니스 파밀리아리스 (개) (카니스 루푸스 파밀리아리스)); P36835 (카프라 히르쿠스 (염소)); 및 P37997 (에쿠우스 카발루스 (말))을 참조한다.
일부 측면에서, 융합 단백질의 제1 폴리펩티드는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
IL2의 생물학적 활성 단편 및 변이체가 또한 제공된다. 이러한 IL2 활성 변이체 또는 단편은 IL2 활성을 보유할 것이다. IL2의 생물학적 활성은 IL2 수용체 보유 림프구를 자극하는 능력을 지칭할 수 있다. 이러한 활성은 시험관내에서 및 생체내에서 둘 다 측정될 수 있다. IL2는 면역 활성의 전반적인 조절자이고, 본원에서 제시된 효과는 이러한 활성의 총합이다. 예를 들어, 이것은 생존 활성 (Bcl-2)을 조절하고, T 이펙터 활성 (IFN-감마, 그랜자임 B 및 퍼포린)을 유도하고, T 조절 활성 (FoxP3)을 촉진한다. 예를 들어, 문헌 [Malek et al., Immunity 33(2):153-65 (2010)]을 참조한다.
IL2의 생물학적 활성 변이체는 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 공개 번호 2006/0269515 및 2006/0160187 및 WO/1999/060128을 참조한다.
IL2의 생물학적 활성 단편 및 변이체는 본원에 개시된 융합 단백질에 사용될 수 있다. 이러한 기능적 단편은 서열식별번호: 2의 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150개 또는 그 초과의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기능적 변이체는 서열식별번호: 2에 제시된 서열 세트에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 포함할 수 있다.
IL2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 활성 변이체 및 단편이 추가로 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 2를 코딩하는 폴리펩티드의 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, IL2 활성을 갖는 단백질을 계속 코딩할 수 있다. 대안적으로, 기능적 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리펩티드에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 포함할 수 있고, 기능적 IL2 폴리펩티드를 계속 코딩할 수 있다.
IL2의 예시적인 폴리펩티드 서열은 하기 표 1에 언급된다.
표 1
Figure pct00001
일부 측면에서, IL2 폴리펩티드는 천연 IL2 (서열식별번호: 2)와 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화 부위를 갖는다. 일부 측면에서, 적어도 1개 더 적은 글리코실화 부위는 글리코실화를 제거하는 1개 이상의 돌연변이에 기인한다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 글리코실화 부위를 갖는 아미노산의 글리코실화 부위를 갖지 않는 아미노산으로의 치환인 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이는 O-글리코실화 및/또는 N-글리코실화를 제거한다. 한 측면에서, 돌연변이는 O-글리코실화, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 아미노산 3에서 트레오닌을 제거한다. 또 다른 측면에서, 돌연변이는 N-글리코실화를 제거한다.
일부 측면에서, 돌연변이는 글리코실화된 IL2의 아미노산의 글리코실화되지 않은 아미노산으로의 1개 이상의 치환이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 근처 아미노산에서의 글리코실화를 허용하는 IL2의 아미노산의 근처 아미노산에서의 글리코실화를 허용하지 않는 아미노산으로의 1개 이상의 치환이다.
일부 측면에서, IL2의 아미노산의 1개 이상의 치환은 알라닌으로부터 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로의 치환이다.
일부 측면에서, IL2의 아미노산의 1개 이상의 치환은 트레오닌으로부터 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로의 치환이다.
일부 측면에서, IL2의 아미노산의 1개 이상의 치환은 반응성 아미노산, 예를 들어, 시스테인으로부터 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 시스테인으로부터 세린으로의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 시스테인으로부터 알라닌으로의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 시스테인으로부터 발린으로의 치환이다.
일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 서열식별번호: 2에 상응하는 것과 비교하여 IL2의 아미노산 T3에서 이루어진다.
일부 측면에서, 치환 중 1개는 서열식별번호: 2의 아미노산 C125에서 이루어진다. 한 측면에서, 아미노산 C125에서의 치환은 C125S, C125A 및 C125V로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 돌연변이는 결실이다. 일부 측면에서, 결실은 서열식별번호: 2의 아미노산 A1에서 이루어진다.
본 개시내용은 또한 IL2 폴리펩티드에 대한 임의의 다른 돌연변이를 포함한다. 다른 측면에서, 돌연변이는 또한 예를 들어, IL2 활성을 개선하고, IL2의 반감기를 개선하고, 안정성을 개선하는 등, IL2의 특성을 개선하는 1개 이상의 치환을 포함한다.
본 섹션에서 하기 개시되는 바와 같이, 본원에 언급된 돌연변이는 서열식별번호: 2의 아미노산 위치 대비 돌연변이이다. 본 발명에 따르면, 하기 돌연변이 중 임의의 것이 단독으로 또는 다른 개시된 돌연변이 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 것과 조합되어 본원에 개시된 바와 같은 IL2 융합 단백질 중 1종 이상에서 사용될 수 있다.
일부 측면에서, IL2는 문헌 [Carmenate et al., J Immunol, 200(10):3475-84 (2018)] 및/또는 US 8,759,486에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 Q22, Q126, I129, S130 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, Q22V, Q126A, I129D, S130G, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 미국 특허 번호 8,759,486 B2에 개시된 바와 같이 L18N, Q126Y 및 S130R 중 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 미국 특허 번호 8,759,486 B2에 개시된 바와 같이 Q13Y, Q126Y, I129D 및 S130R 중 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 WO 2018/091003 A1에 개시된 바와 같이 K35E, K35D 및 K35Q 중 1개 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 문헌 [Epstein et al. Blood, 101(12):4853-61 (2003)] 및/또는 US 7,371,371에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 R38에서의, 예를 들어, R38W를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 미국 특허 번호 7,371,371 B2에 개시된 바와 같이 IL2의 아미노산 위치 22 내지 58의 밖의 1개 이상의 돌연변이 및 R38W의 돌연변이를 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)] 및/또는 US 8,906,356에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 91, 126, 또는 둘 다에서의, 예를 들어, V91R, Q126T 또는 둘 다를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)] 및 또한 US 8,906,356에 개시된 바와 같이 E15W의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)] 및 또한 US 8,906,356에 개시된 바와 같이 N88R 및 V91R 중 하나 또는 둘 다의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)] 및/또는 미국 특허 번호 8,906,356에 개시된 바와 같이 Q126T 또는 Q126I의 돌연변이를 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 미국 특허 번호 8,906,356 B2에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어 아미노산 69, 74, 91, 126 또는 그의 임의의 조합에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이는 미국 특허 번호 8,906,356 B2에 개시된 바와 같이 V91R, Q126T, Q126L, Q127T 또는 그의 임의의 조합이다.
일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al., J Immunother 32(9):887-94 (2009)] 및/또는 US 7,569,215 B2에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 E15, N30, E68, V69, N71, S75, N90, 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, N30S, E68D, V69A, N71A, S75P, N90H, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al., Biochemistry 44(31) (2005)]에 개시된 바와 같이 E15W의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이는 미국 특허 번호 7,569,215 B2에 개시된 바와 같이 V69A이다.
일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al., J Immunother. 32(9):887-94 (2009)] 및/또는 미국 특허 번호 7,951,360 B2에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 N29, Y31, K35, T37, K48, V69, N71, N88, 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, N88D, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al., Biochemistry 44(31) (2005)]에 개시된 바와 같이 E15W의 돌연변이를 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al., J Immunother. 32(9):887-94 (2009)] 및/또는 미국 특허 번호 8,349,311 B2에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 69, 74, 128, 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, V69A, I128P 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al., J Immunother. 32(9):887-94 (2009)]에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 S4, T10, Q11, V69, N88, T133, 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, S4P, T10A, Q11R, V69A, N88D, T133A, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al., J Immunother. 32(9):887-94 (2009)]에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 N30, V69, I128 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, N30S, V69A, I128T 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 문헌 [Wittrup et al., J Immunother. 32(9):887-94 (2009)]에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 K8, Q13, N26, N30, K35, T37, V69, 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, K8R, Q13R, N26D, N30T, K35R, T37R, V69A, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 문헌 [Shanafelt et al., Nat Biotechnol. 18(11):1197-202 (2000)]에 개시된 1개 이상의 돌연변이, 예를 들어, 아미노산 잔기 N88에서의, 예를 들어, N88R을 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 미국 특허 번호 9,616,105 B2에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 20, 88, 126 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, N88R, N88G 또는 N88I를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 미국 특허 번호 9,616,105 B2에 개시된 바와 같이 N88R, N88G 또는 N88I의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 미국 특허 번호 9,616,105 B2에 개시된 바와 같이 D20H, D20I 또는 D20Y의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 미국 특허 번호 9,616,105 B2에 개시된 바와 같이 Q126L의 돌연변이를 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 미국 공개 번호 2018/0125941 A1에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, D20H, N88I, N88G, N88R, Q126L, Q126F 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 미국 공개 번호 2018/0037624 A1에 개시된 바와 같이 T3A, N88G, N88R, D20H, C125S, Q126L 및 Q126F 중 1개 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 미국 공개 번호 2017/0327555 A1에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 N88, D20, C125, Q126 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, N88G, N88R, D20H, C125S, Q126L, Q126F, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 WO 2016/025385 A1에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 D109, C125, 또는 둘 다에서의, 예를 들어, D109C, C125S 또는 둘 다를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 WO 2016/025385 A1에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어; 아미노산 잔기 D20, N88, Q126, C125, Q126, 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, D20H, N88I, N88G, N88R, Q126L, C125S, Q126F, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 WO 2016/164937 A1에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 L12, Q13, E15, H16, L19, D20, M23, D84, S87, N88, V91, E95, 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, L12G, L12K, L12Q, L12S, Q13G, E15A, E15G, E15S, H16A, H16D, H16G, H16K, H16M, H16N, H16R, H16S, H16T, H16V, H16Y, L19A, L19D, L19E, L19G, L19N, L19S, L19T, L19V, D20A, D20E, D20F, D20G, D20T, D20W, M23R, D84A, D84E, D84G, D84I, D84M, D84Q, D84R, D84S, D84T, S87E, N88A, N88D, N88E, N88F, N88G, N88M, N88R, N88S, N88V, N88W, V91D, V91E, V91G, V91S, E95G, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 미국 특허 번호 9,932,380 B2 또는 9,580,486에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 잔기 V91에서의, 예를 들어, V91K를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 C125A 또는 C125S의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 T3에서의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, T3에서의 돌연변이는 T3A 또는 T3N 중 하나이다. 일부 측면에서, IL2는 S5에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이는 S5T이다.
일부 측면에서, IL2는 미국 특허 번호 9,732,134 B2에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, E15, H16, Q22, D84, N88, E95 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 미국 공개 번호 2015/0218260 A1에 개시된 1개 이상의 돌연변이: 예를 들어, N88D를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 미국 특허 번호 9,266,938 B2에 개시된 돌연변이: 예를 들어, 아미노산 42, 45, 72, 또는 그의 임의의 조합에서의, 예를 들어, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 또는 L72K를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R 및 F42K의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, IL2는 Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R 및 Y45K의 돌연변이를 포함한다.
일부 측면에서, IL2는 1 내지 4개의 돌연변이: L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R, 또는 L72K의 제1 돌연변이, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, 또는 F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, 또는 Y45K의 제2 돌연변이, T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K, 또는 T3P의 제3 돌연변이, 및/또는 C125A, C125S, C125T 또는 C125V의 제4 돌연변이를 포함한다. 본원에 열거되거나 본원에 인용된 특허, 특허 공개 또는 임의의 다른 참고문헌에 개시된 돌연변이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
II.C.2. IL2 융합 단백질의 ILR2α 폴리펩티드
융합 단백질은 인터류킨-2 수용체 알파 (IL2Rα)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 측면에서, IL2Rα의 세포외 도메인은 서열식별번호: 1로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 3에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "CD25" 또는 "IL2 수용체 a", "IL2Rα", "IL2Ra", "IL2-Rα", 및 "IL2-Ra"는 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물 및 달리 나타내지 않는 한 가축 또는 농업 포유동물을 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 또는 재조합 IL2Rα를 지칭한다. 상기 용어는 또한 IL2Rα의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체, 또는 비-자연 발생 변이체를 포괄한다. 인간 IL2는 그의 수용체 시스템인 IL2R을 통한 신호전달을 통해 그의 생물학적 효과를 발휘한다. IL2 및 그의 수용체 (IL2R)는 면역 반응에 중요한 T-세포 증식 및 다른 기본적인 기능에 필요하다. IL2R은 알파 (p55), 베타 (p75) 및 감마 (p65) 쇄인 3개의 비-공유 연결된 타입 I 막횡단 단백질로 이루어진다. 인간 IL2R 알파 쇄는 219개 아미노산의 세포외 도메인, 19개 아미노산의 막횡단 도메인 및 13개 아미노산의 세포내 도메인을 함유한다. IL2R 알파 (IL2Rα)의 분비된 세포외 도메인은 본원에 기재된 융합 단백질에 사용될 수 있다.
인간 IL2Rα의 예시적인 성숙 형태의 아미노산 서열은 서열식별번호: 10에 제시된다. 프로세싱되지 않은 인간 IL2Rα는 서열식별번호: 11에 제시되어 있다. 서열식별번호: 11 및/또는 서열식별번호: 10의 세포외 도메인이 서열식별번호: 1에 제시되어 있다. 마우스 IL2Rα의 예시적인 성숙 형태의 아미노산 서열은 서열식별번호: 12에 제시된다. 프로세싱되지 않은 마우스 IL2Rα는 서열식별번호: 13에 제시된다. 서열식별번호: 13 및/또는 서열식별번호: 12의 세포외 도메인은 서열식별번호: 14에 제시되어 있다. "야생형 IL2Rα"로도 명명되는 "천연 IL2Rα"는 자연 발생 또는 재조합 IL2Rα를 의미한다.
IL2Rα에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 NP_001030597.1 (피. 트로글로디테스); NP_001028089.1 (엠. 물라타); NM_001003211.1 (씨. 루푸스); NP_776783.1 (비. 타우루스); NP_032393.3 (엠. 무스쿨루스); 및 NP_037295.1 (알. 노르베기쿠스)을 참조한다.
본원에 사용된 IL2Rα의 세포외 도메인은 달리 명시되지 않는 한 IL2에 대한 결합에서 그의 정상 역할을 하는 기능적 IL2Rα 세포외 (EC) 도메인을 의미한다. 용어 "IL2Rα EC 도메인"은 IL2 결합에 있어서 전장 야생형 IL2Rα EC의 기능을 보유하는 그의 기능적 단편, 변이체, 유사체 또는 유도체를 포함한다. IL2Rα EC 도메인은 인간, 돼지, 개, 래트 또는 뮤린 IL2Rα EC 도메인일 수 있다. 어구 "IL2Rα EC 도메인의 생물학적 활성"은 IL2 수용체 반응성 세포에서 세포내 신호전달을 증진시키는 능력을 포함하나 이에 제한되지는 않는 IL2Rα의 EC 도메인의 하나 이상의 생물학적 활성을 지칭한다. IL2Rα EC 도메인의 생물학적 활성 단편 및 변이체의 비-제한적인 예는 예를 들어 문헌 [Robb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5654-8 (1988)]에 개시되어 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 IL2Rα EC 도메인의 생물학적 활성 단편 및 변이체는 천연 IL2Rα의 세포외 도메인과 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 포함한다.
IL2Rα의 세포외 도메인의 생물학적 활성 단편 및 변이체는 본원에 개시된 융합 단백질에서 사용될 수 있다. 이러한 기능적 단편은 서열식별번호: 1 중 어느 하나의 세포외 도메인의 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 215개 또는 그 초과의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기능적 변이체는 서열식별번호: 1에 제시된 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함할 수 있다.
IL2Rα의 세포외 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 활성 변이체 및 단편이 추가로 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1을 코딩하는 폴리펩티드의 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600개 또는 그 초과의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, IL2Rα의 세포외 도메인 활성을 갖는 단백질을 계속 코딩할 수 있다. 대안적으로, 기능적 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리펩티드에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함할 수 있고, IL2Rα의 세포외 도메인 활성을 갖는 단백질을 계속 코딩할 수 있다.
IL2Rα의 예시적인 폴리펩티드 서열은 표 2에 언급된다.
표 2.
Figure pct00002
Figure pct00003
일부 측면에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 IL2Rα의 EC 도메인 내에 적어도 1개의 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, IL2Rα 폴리펩티드의 EC 도메인은 천연 IL2Rα의 세포외 도메인 (서열식별번호: 1)과 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화, 적어도 2개 더 적은 글리코실화, 적어도 3개 더 적은 글리코실화, 적어도 4개 더 적은 글리코실화, 적어도 5개 더 적은 글리코실화, 적어도 6개 더 적은 글리코실화, 적어도 7개 더 적은 글리코실화, 적어도 8개 더 적은 글리코실화 또는 적어도 9개 더 적은 글리코실화를 갖는다.
일부 측면에서, 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖는 IL2Rα 폴리펩티드의 EC 도메인은 글리코실화를 제거하는 돌연변이를 포함한다. 다른 측면에서, 융합 단백질은 글리코실화 부위를 갖는 아미노산의 글리코실화 부위를 갖지 않는 아미노산으로의 치환인 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이는 O-글리코실화 및/또는 N-글리코실화를 제거한다. 한 측면에서, 돌연변이는 O-글리코실화를 제거한다. 또 다른 측면에서, 돌연변이는 N-글리코실화를 제거한다.
일부 측면에서, 융합 단백질에서의 돌연변이는 IL2Rα의 C-말단의 결실을 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 167 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 168 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 169 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 170 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 171 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 172 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 173 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 174 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 175 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 176 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 177 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 178 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 179 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 180 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 181 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 182 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 183 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 184 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 185 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 186 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 187 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 188 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 189 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 190 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 191 내지 219의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1의 아미노산 192 내지 219의 결실이다.
일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1에 상응하는 167, 168, 169 또는 171 내지 192로부터 219까지의 아미노산의 결실이다. 일부 측면에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1에 상응하는 170 내지 219의 결실을 포함하지 않는다.
일부 측면에서, 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로써 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로써 이루어진다. 다른 측면에서, 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 4 및 +1, +2, +3, +4, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15, +16, +17, +18, +19, +20, +21, +22, +23, +24 또는 +25개 아미노산을 포함하거나, 이로써 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로써 이루어진다. 일부 측면에서, 제2 폴리펩티드는 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산을 갖는 서열식별번호: 4을 포함하거나, 이로써 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로써 이루어진다. 일부 측면에서, 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로써 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로써 이루어진다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, 1개 이상의 돌연변이는 글리코실화된 IL2Rα의 아미노산의 글리코실화되지 않은 아미노산으로의 1개 이상의 치환이다.
일부 측면에서, IL2Rα의 1개 이상의 치환 아미노산은 아미노산 N49, 아미노산 N68, 아미노산 T74, 아미노산 T85, 아미노산 T197, 아미노산 T203, 아미노산 T208 및 아미노산 T216 또는 그의 임의의 조합에서 이루어지며, 여기서 아미노산 위치는 서열식별번호: 1에 상응한다.
일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 아스파라긴으로부터 또 다른 아미노산으로의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 아스파라긴으로부터 알라닌, 트레오닌, 세린, 아르기닌, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로의 치환이다.
일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 트레오닌으로부터 또 다른 아미노산으로의 치환이다. 일부 측면에서, 1개 이상의 치환은 트레오닌으로부터 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로의 치환이다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1의 아미노산 N49이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 N49는 알라닌, 트레오닌, 세린, 아르기닌, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1의 아미노산 N68이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 N68은 알라닌, 트레오닌, 세린, 아르기닌, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1의 아미노산 T74이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 T74는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1의 아미노산 T85이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 T85는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1의 아미노산 T197이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 T197은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1의 아미노산 T203이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 T203은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1의 아미노산 T208이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 T208은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1의 아미노산 T216이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 T216은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, 1개 이상의 돌연변이는 인근 아미노산에서의 글리코실화를 허용하는 IL2Rα의 아미노산의 인근 아미노산에서의 글리코실화를 허용하지 않는 아미노산으로의 1개 이상의 치환이다.
일부 측면에서, 치환은 아미노산 S50, 아미노산 S51, 아미노산 T69, 아미노산 T70, 아미노산 C192, 또는 그의 임의의 조합에서 이루어지고, 여기서 아미노산 위치는 서열식별번호: 1에 상응한다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1에 상응하는 아미노산 S50이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1에 상응하는 아미노산 S50은 프롤린으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1에 상응하는 아미노산 S51이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1에 상응하는 아미노산 S51은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1에 상응하는 아미노산 T69이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1에 상응하는 아미노산 T69는 프롤린으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1에 상응하는 아미노산 T70이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1에 상응하는 아미노산 T70은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
일부 측면에서, 치환은 서열식별번호: 1에 상응하는 아미노산 C192이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 1에 상응하는 아미노산 C192는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 돌연변이된다.
II.C.3. IL2 융합 단백질의 링커
본 개시내용의 융합 단백질은 링커를 추가로 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 링커는 제1 폴리펩티드를 제2 폴리펩티드에 N-말단에서 C-말단으로 연결시킬 수 있다 (예를 들어, N-IL2-링커-IL2Rα EC-C). 다른 측면에서, 링커는 제2 폴리펩티드를 제1 폴리펩티드에 N-말단에서 C-말단으로 연결시킬 수 있다 (예를 들어, N-IL2Rα EC-링커-IL2-C).
한 측면에서, IL2 융합 단백질은 IL2 폴리펩티드와 IL2Rα 폴리펩티드 사이에 위치한 링커 서열을 포함한다. 링커는 임의의 길이일 수 있고, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 또는 60개 또는 그 초과의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 본 개시내용에 유용한 링커는 적어도 1개의 아미노산 및 100개 미만의 아미노산, 90개 미만의 아미노산, 80개 미만의 아미노산, 70개 미만의 아미노산, 60개 미만의 아미노산, 50개 미만의 아미노산, 40개 미만의 아미노산, 30개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산, 19개 미만의 아미노산, 18개 미만의 아미노산, 17개 미만의 아미노산, 16개 미만의 아미노산, 15개 미만의 아미노산, 14개 미만의 아미노산, 13개 미만의 아미노산, 또는 12개 미만의 아미노산을 갖는다. 한 측면에서, 링커 서열은 글리신 아미노산 잔기를 포함한다. 다른 경우에, 링커 서열은 글리신 및 세린 아미노산 잔기의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 사이에 인 프레임으로 융합된 링커를 포함한다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 글리신/세린 링커인 링커를 포함한다. 이러한 글리신/세린 링커는 펩티드 GGGS (서열식별번호: 15) 또는 GGGGS 서열식별번호: 16) 또는 그의 반복부 (이들 주어진 펩티드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 반복부 포함)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 아미노산 잔기의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 글리신/세린 링커는 (GS)n, (GGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n, 또는 (GGGGS)n의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10의 정수이다. 한 측면에서, 링커 서열은 GGGSGGGSGGGS (서열식별번호: 6) ((Gly3Ser)3로도 언급됨)를 포함한다. 또 다른 측면에서, 링커 서열은 GGGSGGGSGGGSGGGS (서열식별번호: 17) ((Gly3Ser)4로도 언급됨)를 포함한다. 다른 측면에서, 링커 서열은 (Gly3Ser)5 (GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS) (서열식별번호: 18), (Gly3Ser)6 (GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS) (서열식별번호: 19), 또는 (Gly3Ser)7 (GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS) (서열식별번호: 20) 중 하나를 포함한다. 다른 측면에서, 링커 서열은 서열식별번호: 21에 제시된 (Gly4Ser)3 (GGGGSGGGGSGGGGS)를 포함한다. 추가의 측면에서, 링커 서열은 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 22) ((Gly4Ser)4로도 언급됨); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 23) ((Gly4Ser)5로도 언급됨); (Gly4Ser)2 (GGGGSGGGGS) (서열식별번호: 24), (Gly4Ser)1 (GGGGS) (서열식별번호: 25), (Gly4Ser)6 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS) (서열식별번호: 26); (Gly4Ser)7 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS) (서열식별번호: 27); 또는 (Gly4Ser)5 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS) (서열식별번호: 28)를 포함한다.
II.C.4. IL2 융합 단백질의 이종 모이어티
본 개시내용의 융합 단백질은 추가의 요소, 예를 들어 이종 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 요소는 융합 단백질의 발현을 보조하고/거나, 융합 단백질의 분비를 보조하고/거나, 융합 단백질의 안정성을 개선시키고/거나, 단백질의 보다 효율적인 정제를 가능하게 하고/거나, 융합 단백질의 활성을 조정할 수 있다. 일부 측면에서, 이종 모이어티는 폴리펩티드 모이어티이다. 다른 측면에서, 이종 모이어티는 비-폴리펩티드 모이어티이다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 제1 폴리펩티드에 융합된 이종 모이어티를 포함한다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 제2 폴리펩티드에 융합된 이종 모이어티를 포함한다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드에 융합된 이종 모이어티를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 융합 단백질은 1개 이상의 추가의 이종 모이어티를 포함한다. 일부 측면에서, 이종 모이어티는 반감기 연장 모이어티이다. 일부 측면에서, 이종 모이어티는 알부민, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 부분, 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 G (IgG), 알부민-결합 폴리펩티드 (ABP), PAS화 모이어티, HES화 모이어티, XTEN, PEG화 모이어티, Fc 영역, 및 그의 임의의 조합을 포함한다.
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 이종 모이어티의 예는 미국 공개 번호 2019/0359672 A1 및 2019/0300592 A1에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
II.C.5. 예시적인 IL2 융합 단백질
일부 측면에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 29; 서열식별번호: 5; 서열식별번호: 30; 서열식별번호: 31; 서열식별번호: 32; 서열식별번호: 33; 및 서열식별번호: 34 중 어느 하나, 또는 미국 특허 공개 번호 2019/0359672 A1 및 2019/0300592 A1의 표 3에 언급된 바와 같은 서열 중 어느 하나를 포함한다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 하기 표 3에 언급된 바와 같은 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34 중 어느 하나를 포함하고/거나, 융합 단백질은 미국 특허 공개 번호 2019/0359672 A1 및 2019/0300592 A1의 표 3에 언급된 바와 같은 서열 중 어느 하나를 포함한다.
표 3:
Figure pct00004
IL2/IL-Ra EC 도메인 융합 단백질의 성숙 및 프로세싱되지 않은 형태의 생물학적 활성 단편 및 변이체, 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 이러한 기능적 폴리펩티드 단편은 하기 서열식별번호: 서열식별번호: 29; 서열식별번호: 5; 서열식별번호: 30; 서열식별번호: 31; 서열식별번호: 32; 서열식별번호: 33; 및 서열식별번호: 34 중 어느 하나의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 또는 그 초과의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기능적 폴리펩티드 변이체는 하기 서열식별번호: 서열식별번호: 29; 서열식별번호: 5; 서열식별번호: 30; 서열식별번호: 31; 서열식별번호: 32; 서열식별번호: 33; 및 서열식별번호: 34에 제시된 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함할 수 있다.
IL2/IL-Ra 세포외 도메인 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 활성 변이체 및 단편이 추가로 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 하기 서열식별번호: 서열식별번호: 29; 서열식별번호: 5; 서열식별번호: 30; 서열식별번호: 31; 서열식별번호: 32; 서열식별번호: 33; 및 서열식별번호: 34에 제시된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1100, 1200, 1300, 1500, 1800, 2000개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 기능적 IL2/IL-Ra 세포외 도메인 융합 단백질을 계속 코딩할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 서열식별번호: 29; 서열식별번호: 5; 서열식별번호: 30; 서열식별번호: 31; 서열식별번호: 32; 서열식별번호: 33; 및 서열식별번호: 34 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 IL2 융합 단백질은 1개 이상의 하기 특성/활성을 가질 수 있다: (1) 저용량 IL2 기반 요법에서 조절 T 세포 (Treg)의 활성을 증가시키고/거나 면역 관용을 증가시킴; (2) 보다 고용량 요법에서 면역 반응 및 기억을 증가시킴; (3) 재조합 IL2와 비교하여 IL2 이용가능성을 증가시킴; 및/또는 (4) 생체내에서 IL2R 보유 림프구의 지속적인 IL2 자극을 증가시킴.
한 측면에서, 본원에 개시된 융합 단백질은 IL2 (서열식별번호: 2) 또는 서열식별번호: 29 (말단절단이 없는 12량체 링커를 갖는 wt IL2-CD25 서열)로 이루어진 폴리펩티드의 약동학적 특성과 비교하여 증가된 반감기, 증가된 Cmax, 증가된 농도-시간 곡선하 면적 (AUC), 증가된 Cmin, 감소된 클리어런스, 개선된 생체이용률, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 약동학적 특성을 포함한다.
한 측면에서, 본원에 개시된 융합 단백질은 IL2 (서열식별번호: 2) 또는 서열식별번호: 29 (말단절단이 없는 12량체 링커를 갖는 wt IL2-CD25 서열)와 비교하여 연장된 반감기를 갖는다. 일부 측면에서, 연장된 반감기는 IL2 (서열식별번호: 2) 또는 서열식별번호: 29 (임의의 말단절단이 없는 12량체 링커를 갖는 wt IL2-CD25 서열)로 이루어진 폴리펩티드의 반감기와 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 16배, 적어도 약 17배, 적어도 약 18배, 적어도 약 19배, 적어도 약 20배, 적어도 약 21배, 또는 적어도 약 22배이다.
일부 측면에서, IL2 융합 단백질로부터 생성된 Treg의 증가된 활성은, 예를 들어 (1) CD4+ T 세포 구획에서의 Treg의 증가된 제시 및 수; (2) IL2-의존성 CD25의 상향조절; (3) 증식성 마커 Ki67의 발현에 의해 평가된 바와 같은 증가된 증식; 및 (4) IL2-의존성 말단 분화 Klrg1 + Treg 하위세트의 증가된 분획을 포함한 다양한 방식으로 검정될 수 있다. Treg에 대한 이러한 효과는, 예를 들어 비장 및/또는 염증발생 췌장에서 볼 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 IL2 융합 단백질은 T 이펙터/기억 반응을 증가시키는 것을 통해 관용원성 및 면역 억제성 Treg 및 면역을 증가시키고, 추가 측면에서, 이는 (1) 천연 또는 재조합 IL2와 비교하여 IL2 활성의 보다 낮은 유효 수준에서 이러한 반응을 전달함으로써 개선된 약동학을 나타내고/거나; (2) 천연 또는 재조합 IL2보다 더 지속적인 생물학적 반응을 나타낸다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 천연 또는 재조합 IL2에 비해 개선된 활성을 갖는다. 예를 들어, IL2 융합 단백질의 효과는 천연 또는 재조합 IL2와 비교하여 약 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 150배, 200배 또는 더 낮은 수준의 IL2 활성에서 관용원성 Treg를 증가시킬 수 있다. 다른 측면에서, IL2 융합 단백질은 Treg의 지속적인 증대 및 관련 특성을 유도하는 데 있어서 천연 또는 재조합 IL2보다 더 효과적이다.
본원에 개시된 IL2 융합 단백질의 성분은 임의의 순서로 발견될 수 있는 것으로 추가로 인식된다. 한 측면에서, IL2 폴리펩티드는 융합 단백질의 N-말단에 존재하고, IL2Rα의 세포외 도메인은 C-말단에 존재한다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 이량체를 형성한다. 다른 측면에서, 융합 단백질은 단량체이다. 또한, 일부 측면에서, 이량체는 2개의 단량체를 포함하고, 단량체는 공유 결합을 통해 서로 회합된다. 일부 측면에서, 이량체는 2개의 단량체를 포함하고, 단량체는 비-공유 결합을 통해 회합된다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 융합 단백질은 IL2 (서열식별번호: 2) 또는 서열식별번호: 29 (말단절단이 없는 12량체 링커를 갖는 wt IL2-CD25 서열)로 이루어진 폴리펩티드보다 더 안정하다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 (i) 참조 단백질과 비교하여 증가된 열역학적 안정성; (ii) 참조 단백질과 비교하여 증가된 TM; (iii) 참조 단백질과 비교하여 분해에 대한 증가된 저항성; (iv) 참조 단백질과 비교하여 변형에 대한 증가된 저항성; (v) 참조 단백질과 비교하여 증가된 생체내 안정성; 및 (vi) 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 가지며, 여기서 참조 단백질은 (i) 인터류킨-2 (IL2) 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드; (b) 인터류킨-2 수용체 알파 (IL2Rα) 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고; 융합 단백질과 비교하여 적어도 1개 더 많은 글리코실화를 갖는다.
본원에 개시된 융합 단백질의 임의의 글리코실화 부위는 다른 메카니즘에 의해 제거될 수 있다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 효소적으로 또는 화학적으로 탈글리코실화된다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 알칼리, 히드라진분해, 펩티드-N-글리코시다제 F (PNGase F), 엔도-β-N- 아세틸글루코사미니다제 H (엔도 H), O-글리코시다제 또는 그의 임의의 조합에 의해 탈글리코실화된다.
일부 측면에서, 융합 단백질의 1개 이상의 글리코실화 부위의 제거는 융합 단백질을 알칼리로 처리함으로써 달성된다. 일부 측면에서, 글리칸은 알칼리 보로히드라이드 처리에 의해 글리코실화 폴리펩티드로부터 제거된다. 다른 측면에서, 본원에 개시된 융합 단백질의 글리코실화 부위는 알칼리 금속 탄산염, 예컨대 탄산나트륨 및 탄산칼륨을 사용하여 제거될 수 있다. 일부 측면에서, 알칼리가 β-제거 처리에 사용된다.
일부 측면에서, 융합 단백질의 1개 이상의 글리코실화 부위의 제거는 히드라진분해에 의한 융합 단백질의 화학적 처리에 의해 달성된다. 한 측면에서, 본원에 개시된 융합 단백질로부터 융합 단백질을 히드라진분해로 처리함으로써 글리코실화가 방출되고, 방출된 당 쇄는 2-아미노피리딘으로의 형광 표지화된다. 문헌 [Hase et al. J. Biochem., 95:197 (1984)]을 참조한다. 일부 측면에서, 히드라진분해는 옥스포드 글리코시스템즈(Oxford GlycoSystems) (글리코프렙(GlycoPrep) 1000)에 의해 공급된 기기를 사용하여 수행된다.
또 다른 측면에서, 융합 단백질의 1개 이상의 글리코실화 부위의 제거는 융합 단백질을 트리플루오로메탄술폰산 (TFMS)으로 처리함으로써 달성된다.
일부 측면에서, 융합 단백질의 1개 이상의 글리코실화 부위의 제거는 융합 단백질을 효소로 처리함으로써 달성된다. 일부 측면에서, 효소는 글리코시다제이다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 1개 이상의 글리코실화 부위의 제거는 펩티드-N-글리코시다제 F (PNGase F)를 사용하여 달성된다. PNGase F의 농도는 다양할 수 있고, 실험적으로 결정될 것이다. 일부 측면에서, 글리코시다제는 PNGase F이다. PNGase F는 상업적으로 입수가능한 효소이다 (예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 입스위치, Cat. #P0704 또는 #P0710). 일부 측면에서, PNGase F는 융합 단백질이다. 예를 들어, PNGase F는 키틴 결합 도메인 (CBD) 또는 PNGase F-SNAP 융합 단백질로 태그부착된 PNGase F일 수 있다. 일부 측면에서, 글리코시다제는 동결건조된다. 일부 측면에서, 글리코시다제는 동결건조된 PNGase F이다. 일부 측면에서, 글리코시다제는 실질적으로 동물-유래 시약을 함유하지 않는다.
일부 측면에서, 융합 단백질의 1개 이상의 글리코실화 부위의 제거는 융합 단백질을 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 H (엔도 H)로 처리함으로써 달성된다. 엔도-H는 스트렙토미세스 플리카투스 및 몇몇 다른 스트렙토미세스 종에 의해 분비되는 글리코히드롤라제이다 (Tarentino et al., 1976). 이는 올리고사카라이드의 N-아세틸 글루코사민 코어의 β-1,4-글리코시드 결합을 절단하고, 당단백질의 아스파라긴 잔기에 부착된 1개의 N-아세틸키토비오스를 남긴다 (Trimble et al., 1978; Muramatsu 1971). 에스. 플리카투스의 엔도 H 유전자는 939 bp이고 (진뱅크 수탁 AAA26738.1), 이는 28.9-kDa 단백질을 코딩한다. 에스. 플리카투스로부터의 엔도 H는 최근 피키아 파스토리스에서 발현되었고, 피. 파스토리스 생산된 엔도 H의 탈글리코실화 활성은 공동-발효 및 발효 후 처리 둘 다를 통해 시험관내에서 입증되었다 (Wang et al., 2015).
일부 측면에서, 융합 단백질의 1개 이상의 글리코실화 부위의 제거는 융합 단백질을 O-글리코시다제로 처리함으로써 달성된다 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 매사추세츠주 입스위치). 엔도-알파-N-아세틸갈락토사미니다제로도 불리는 O-글리코시드는 당단백질로부터 코어 1 및 코어 3 O-연결된 디사카라이드의 제거를 촉매한다. 일부 측면에서, 이는 당단백질로부터 비치환된 Ser- 및 Thr-연결된 것을 방출한다.
융합 단백질의 1개 이상의 글리코실화 부위의 제거는 IL2 융합 단백질이 세포 배양 (예를 들어, 생물반응기)에서 생산된 후, IL2 융합 단백질이 세포 배양에서 생산되는 동안, 융합 단백질이 수거된 후, 및/또는 융합 단백질이 정제되는 동안 달성될 수 있다. 일부 측면에서, 1개 이상의 글리코실화 부위의 제거는 융합 단백질이 발현되는 세포 배양 동안 1개 이상의 제거제를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 다른 측면에서, 1개 이상의 글리코실화 부위의 제거는 글리코실화를 제거하거나 감소된 글리코실화를 갖는 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 스트렙토미세스 종)로서 특정한 세포 유형을 선택함으로써 달성될 수 있다. 특정 측면에서, 1개 이상의 글리코실화 부위의 제거는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 1개 이상의 글리코실화를 제거하는 효소를 코딩하는 유전자와 공동-발현시킴으로써 달성된다.
II.D. IL2 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물
일부 측면에서, IL2 융합 단백질은 IL2 융합 단백질 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 안정화제를 포함하는 제약 조성물의 일부로서 대상체에게 투여된다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여에 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 제약 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 상용성이 아닌 경우를 제외하고, 조성물에서 그의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 상용가능하도록 제제화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소) 및 경점막을 포함한다. 또한, 치료 용량의 제약 조성물을 치료가 필요한 영역에 국부로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예를 들어, 수술 동안 국부 또는 국소 주입 또는 관류, 국소 적용, 주사, 카테터, 좌제 또는 임플란트 (예를 들어, 막, 예컨대 실라스틱 막 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질로 형성된 임플란트) 등에 의해 달성될 수 있다. 또 다른 측면에서, 치료 용량의 제약 조성물은 소포, 예를 들어 리포솜으로 전달된다 (문헌 [Langer, Science 249:1527-33 (1990) 및 Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein 및 Fidler (eds.), Liss, N.Y., pp. 353-65, 1989] 참조).
또 다른 측면에서, 치료 용량의 제약 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 예에서, 펌프가 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Langer, Science 249:1527-33 (1990); Sefton, Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-40 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507-16 (1980); Saudek et al., N Engl. J Med. 321:574-79 (1989)] 참조). 또 다른 예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Levy et al., Science 228:190-92 (1985); During et al., Ann. Neural. 25:351-56 (1989); Howard et al., J Neurosurg. 71:105-12 (1989)] 참조). 문헌 [Langer (Science 249:1527-33 (1990))]에 의해 논의된 것과 같은 다른 제어 방출 시스템이 또한 사용될 수 있다.
허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
비경구 제제에 사용된 제약상 허용되는 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충제, 항산화제, 국부 마취제, 현탁화제 및 분산제, 유화제, 격리제 또는 킬레이트화제 및 다른 제약상 허용되는 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예는 염화나트륨 주사, 링거 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 덱스트로스 및 락테이트화 링거 주사를 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 식물성 기원의 고정유, 목화씨 오일, 옥수수 오일, 참깨 오일 및 땅콩 오일을 포함한다. 정박테리아 또는 정진균 농도의 항미생물제가 다중-용량 용기 내에 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있으며, 이는 페놀 또는 크레졸, 수은제, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 등장화제는 염화나트륨 및 덱스트로스를 포함한다. 완충제는 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제는 중황산나트륨을 포함한다. 국부 마취제는 프로카인 히드로클로라이드를 포함한다. 현탁화제 및 분산제는 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리소르베이트 80 (트윈® 80)을 포함한다. 금속 이온의 격리제 또는 킬레이트화제는 EDTA를 포함한다. 제약 담체는 또한 수혼화성 비히클을 위한 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜; 및 pH 조정을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함한다.
비경구, 피내, 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조정제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨에 의해 조절될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 시린지, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알에 밀봉될 수 있다.
주사가능한 용도에 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 염수, 정박테리아수, 크레모포르(Cremophor) ELS (바스프(BASF), 뉴저지주 파시파니), 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에서 조성물은 멸균되어야 하고, 용이하게 주사가능한 범위의 유체이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴을 사용하고, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우에서, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 유도될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 활성 화합물을 필요한 양으로 적절한 용매 중에 상기 열거된 성분 중 1종 또는 그의 조합과 함께 혼입시키고, 필요에 따라, 이어서 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을, 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 분산액을 제조한다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이고, 이는 활성 성분 + 그의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성한다.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 기체를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다.
경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과될 장벽에 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여의 경우, 세제, 담즙 염, 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 연고, 살브, 겔, 또는 크림 내로 제제화된다. 화합물은 또한 좌제 (예를 들어, 통상적인 좌제 베이스, 예컨대 코코아 버터 및 다른 글리세리드 함유) 또는 직장 전달을 위한 정체 관장제의 형태로 제조될 수 있다.
한 측면에서, 활성 화합물은, 예컨대 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제와 같이, 신체로부터의 빠른 제거에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조된다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 또한 리포솜 현탁액이 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이, 관련 기술 분야의 기술자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
경구 또는 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위한 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 대상체를 치료하기 위한 단일 용량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 필요한 제약 담체와 함께 함유한다. 본 개시내용의 투여 단위 형태에 대한 상세사항은 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성될 특정한 치료 효과, 및 이러한 기능성 화합물을 개체의 치료를 위해 배합하는 분야에 고유한 제한사항에 의해 좌우되고, 이에 직접적으로 의존적이다. 제약 조성물은 투여를 위한 지침서와 함께 용기, 팩, 또는 분배기에 포함될 수 있다.
본 개시내용의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 통상의 기술 내인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. 미국 특허 번호 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) 및 Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)]을 참조한다.
상기 인용된 모든 참고문헌, 뿐만 아니라 본원에 인용된 모든 참고문헌 및 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 진뱅크 번호 및/또는 유니프롯 번호)은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
하기 실시예는 예시로서 및 비제한적으로 제공된다.
III. 실시예
III.A. BMS-986326의 비임상 연구
비임상 약리학
BMS-986326의 생화학적 및 생물물리학적 특징화는 이것이 37℃에서 시험관내 대략 3일의 해리 반감기 및 1 pM의 추정 해리 상수 (Kd)로, 주로 자기-차단 동종이량체로서 존재한다는 것을 나타냈다. 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 및 래트 CD25 (IL-2Rα)에 대한 BMS-986326의 결합 친화도는 각각 2,410 nM, 2,000 nM, 4,200 nM 및 7,500 nM이었고, IL-2Rβγ (사전-어셈블리된 이종이량체로서)에 대해서는 각각 111 nM, 105 nM, > 4,000 nM 및 > 4,000 nM이었다. 이들 친화도 값에 기초하여, 원숭이는 BMS-986326 약리학을 평가하는 데 적합한 종인 반면, 설치류는 인간에 비해 변경된 약리학을 나타낼 수 있다. 낮은 수준의 활성 단량체로 인해, BMS-986326의 시험관내 효력은 재조합 IL-2와 비교하여 >100배만큼 감소하였다. BMS-986326은 재조합 IL-2에 대한 0.027 nM ± 0.014와 비교하여, Kit225 인터페론 조절 인자 1 (IRF1)-구동 리포터 세포주에서 3.4 nM ± 1.8의 평균 반수-최대 유효 농도 (EC50)를 나타냈다. IL-2 신호전달의 근위 마커인 Treg에서의 STAT5의 인산화 (pSTAT5)를 측정하기 위한 전혈 검정에서, BMS-986326은 인간 혈액에서 0.23 nM ± 0.14, 및 원숭이 혈액에서 0.078 nM ± 0.040의 EC50을 나타냈다. BMS-986326은 전혈 검정에서 Treg에 대한 선택성을 입증하였고, Treg에서 거의 최대 신호가 검출되었고 (약물의 최고 농도에서의 Treg pSTAT5+의 >90%), 통상적인 CD4+FoxP3- T 세포 (Tconv), CD8 세포, 및 NK 세포에서 단지 부분적인 신호 (71 nM에서 약물의 최고 농도에서의 pSTAT5+ 세포의 <50%)가 검출되었다.
마우스 IL-2Rβγ 이량체에 결합하는 인간 IL-2의 친화도의 유의한 차이로 인해, 뿐만 아니라 만성 효능 연구에서 잠재적 항-약물 항체 (ADA)를 피하기 위해, 마우스 대용물 (mIL2-CD25)을 사용하여 마우스 질환 모델에서 상동 이량체 융합 단백질의 활성을 조사하였다. BALB/c 야생형 마우스에서, mIL2-CD25는 결정화가능 단편 (Fc) 및 mIL-2 융합 단백질 (Fc-mIL2), 또는 1일 용량의 뮤린 IL2 (mIL2)에 비해 연장된 약동학 (PK)을 나타냈을 뿐만 아니라, CD8 세포 및 NK 세포에 비해 강건한 Treg 확장 및 증진된 Treg 선택성을 나타냈다. mIL2-CD25 분자를 2가지 루푸스 마우스 모델에서 시험하였다: NZB/W 및 MRL/lpr (이는 인간에서 관찰된 루푸스-유사 증상의 전형적 징후를 나타냄). 마우스 모델 둘 다에서, 초기 질환에서의 mIL2-CD25 처리는 강건하고 용량-의존성인 약역학 ("PD"; Treg 증식 및 확장 뿐만 아니라 Treg 상의 IL-2 신호전달에 대한 바이오마커)을 입증하였을 뿐만 아니라, 고-용량 스테로이드 처리와 유사한 질환 종점에서의 강건한 개선: 자가항체 및 신장 손상의 감소, 및 신장 기능의 개선을 입증하였다. 0.2 mg/kg의 용량은 이들 연구에서 최대 효능을 제공하는 최소 용량이었다. 또한, 준최적 용량의 mIL2-CD25 (0.1 mg/kg)는 저용량 스테로이드 치료 (0.1 mg/kg 프레드니솔론)와 조합되었을 때 상가적 효능을 나타냈다. Treg 백분율 (CD4+ T 세포 게이트 내)을 마우스 연구에서 1차 PD 판독치로서 측정하였다. CD4+ T 세포 게이트 내 % Treg의 변화는 처리 군에서의 CD4+ T 세포 게이트 내 % Treg로부터 비히클 군에서의 CD4+ T 세포 게이트 내 % Treg를 차감함으로써 계산하였으며, Δ Treg %로서 나타냈다. 매주 2회 (BIW) 투여의 여러 연구에 걸쳐, Treg 백분율은 최대 효능에 이른 용량 (0.2 mg/kg)에서, 연구 및 Treg에 대한 게이팅 정의에 따라, CD4+ 집단에서 비히클 대조군 수준에 비해 Δ12% 내지 Δ18%만큼 증가하였다. NZB/W 모델에서, Treg 수준이 Q5D 연구에 대해 PK 최저점에서 소폭 떨어졌다는 사실에도 불구하고, BIW 및 5일마다-1회 (Q5D) 투여 빈도로 유사한 효능이 달성되었다. NZB/W 질환 모델로부터의 데이터를 사용하여 인간 용량 예측을 보조하는 효능에 대한 표적 PD 반응을 결정하였다.
광범위한 용량 (각각 대략 48, 157, 407 및 1046 μg·h/mL의 AUC에 상응하는 0.075 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.75 mg/kg 및 2.5 mg/kg)에 걸친 BMS-986326의 PK, PD 및 내약성을 원숭이에서의 단일 피하 (SC) 주사 후에 평가하였다. 이 연구에서, 모든 용량에 걸쳐 빈도, 절대 수, 및 퍼센트 증식 Treg의 명백한 용량-의존성 증가가 있었다. 또한, 모든 용량에서 Treg에 대해 유동 세포측정법 분석에 의해 측정된, STAT5의 인산화 뿐만 아니라 CD25의 발현을 포함한, IL-2R 신호전달을 표시하는 마커에서의 증가가 있었다. 임의의 용량에서 Tconv 또는 CD8+ T 세포에서의 pSTAT5 수준 또는 세포 표면 CD25 발현의 변화에 대한 최소의 증거에도 불구하고, 시험된 2개의 최고 용량에서 Tconv 및 CD8+ T 세포의 용량-의존성 확장 및 증식에 대한 증거가 존재하였다. 또한, 원숭이에서 2.5 mg/kg의 최고 용량 수준에서 불량한 내약성이 관찰되었다. 0.25 mg/kg의 내약성이 우수한 Treg-선택적 용량에서, CD4 T 세포에서의 Treg의 피크 백분율의 기준선으로부터의 변화는 마우스 모델에서의 최대 효능에 요구되는 %Treg 수준 (비히클 대조군의 Δ12%-18%)에 비해 훨씬 높은 수준 (피크에서 투여전에 비해 Δ23%, 피크에서 투여전에 비해 4.8배 증가)에 도달하였다. 또한, CD4+ T 세포 게이트에서의 % Treg의 기준선에 비해 Δ10%만큼의 증가는 제21일 투여까지 이 용량에서 지속되었다. 집합적으로, 이들 데이터는 BMS-986326이 예상된 유효 용량에서 Treg 선택적인 강건하고 연장된 PD 반응을 도출한다는 것을 입증한다.
비임상 약동학
비임상 환경에서 BMS-986326의 PK를 특징화하기 위해 다양한 시험관내 및 생체내 연구를 수행하였다. BMS-986326 또는 mIL2-CD25의 혈청 노출을 결정하기 위한 리간드 결합 검정은 활성 단량체 및 불활성 이량체 형태를 포함한 총 농도를 측정하였다. 정맥내 (IV) 투여 후, BMS-986326의 정상-상태 분포 부피 (Vss)는 마우스 및 원숭이에서 각각 0.0954 및 0.0734 L/kg이었다. BMS-986326의 총 혈청 클리어런스 (CLT)는 3.25 및 0.769 mL/h/kg이었고, 피하 (SC) 투여 후 겉보기 제거 반감기 (T-HALF)는 마우스 및 원숭이에서 각각 1.18 및 3.30일이었다. SC 투여 후 최대 농도의 시간 (Tmax)은 마우스 및 원숭이에서 각각 7 및 24시간이었다. SC 투여 후 절대 생체이용률은 마우스에서 58% 및 원숭이에서 46%였다. BMS-986326의 SC 투여 후 인간 혈청에서의 시험관내 연구 (최대 72시간) 및 원숭이 혈청 샘플에서의 생체외 연구 (최대 168시간)는 IL-2를 통한 면역-포획 후 IL-2 및 CD25의 액체-크로마토그래프 탠덤 질량 분광측정법 (LC-MS/MS)-기반 면적 비의 측정에 의해 평가하였을 때 링커-절단의 징후를 나타내지 않았다.
인간 PK를 원숭이 PK 파라미터의 알로메트릭 스케일링을 사용하여 추정하고, 원숭이에서와 유사한 SC 생체이용률을 갖는 것으로 가정하였다. 인간에서 6일의 반감기가 추정되었다. 인간 PD 반응 (CD4+ Treg의 세포 계수, CD8+ T 세포, 및 %pSTAT5+ Treg의 변화 포함)을 원숭이 PK/PD 모델 파라미터를 사용하여 추정하였는데, 이는 BMS-986326이 원숭이 및 인간 전혈 검정에서 원숭이 및 인간 IL-2Rα 및 IL-2Rβγ에 대해 필적하는 결합 친화도, 뿐만 아니라 시험관내에서 필적하는 효력을 갖는 것으로 나타났기 때문이다.
인간에서의 BMS-986326의 효과적인 용량을 2가지 접근법을 사용하여 추정하였다. 제1 접근법은 mIL2-CD25가 투여된 마우스 모델에서의 최대 전임상 효능에 기초하였다. mIL2-CD25 (0.2 mg/kg BIW)를 사용한 NZB/W 마우스 모델에서의 최대 효능은 최저점에서 기준선에 비해 CD4+ T 세포에서의 Δ14% Treg와 연관되었기 때문에, 최저점에서의 유사한 PD 반응을 BMS-986326의 인간 유효 용량을 추정하기 위해 표적화하였다. 최저점에서 CD4+ T 세포에서의 Δ14% Treg를 표적화하는 인간에서의 BMS-986326의 유효 용량은 2주마다-1회 (Q2W) 제공되는 6 mg SC이다. 이 용량에서, BMS-986326의 추정 정상-상태 최대 혈청 농도 (Cmax,ss)는 1.5 μg/mL이고, 추정 AUC(TAU)는 217 μg·h/mL이고, 추정 정상-상태 최소 농도 (C최저,ss)는 0.3 μg/mL이다.
후속 연구에서, NZB/W 마우스 모델에서 mIL2-CD25 (0.2 mg/kg Q5D)의 감소된 투여 빈도는 또한 10배 더 낮은 최저 노출로 최대 효능을 입증하였다. 따라서, 6 mg SC Q2W 용량과 비교하여 10배 더 낮은 C최저,ss (0.03 μg/mL)를 달성할, 1개월-1회 (Q1M) 제공되는 6 mg SC의 추정 인간 용량이 유사한 효능을 가질 것으로 예측된다. 6 mg Q1M 투여 요법은 피크에서 CD4+ T 세포에서의 Δ12% Treg 및 최저점에서 CD4+ T 세포에서의 Δ4% Treg를 달성하는 것으로 예측된다.
BMS-986326의 인간 유효 용량을 추정하기 위한 제2 접근법은 SLE 환자에서 재조합 인간 IL-2 (rhIL-2)에 의한 효능의 임상 입증에 기초하였다. SLE를 갖는 환자에서의 임상 연구에서, rhIL-2를 2주 동안 격일로 1 MIU (백만 국제 단위) SC로 투여한 후 2-주 무치료 기간을 거친 결과, CD4+ T 세포에서의 피크 Δ5% Treg 및 CD4+ T 세포에서의 최저 Δ1% Treg를 갖는 Treg 프로파일을 생성하였다. 이러한 치료가 위약과 비교하여 SLE 반응자 지수-4 (SRI-4)를 개선시키는 것으로 나타났기 때문에, 유사한 Treg 프로파일을 BMS-986326의 유효 용량을 추정하기 위해 표적화하였다. 임상 데이터에 기초하여, 유사한 Treg 프로파일을 달성하기 위한 인간에서의 BMS-986326의 추정 유효 용량은 2 mg SC Q1M이다. 이 용량에서, BMS-986326의 추정 Cmax,ss는 0.4 μg/mL이고, 추정 AUC(TAU)는 71 μg·h/mL이고, 추정 C최저,ss는 0.01 μg/mL이다. 종합하면, 인간에서 BMS-986326에 대한 유효 용량 범위는 2 내지 6 mg SC Q1M인 것으로 추정된다.
비임상 독성학
래트 및 원숭이는 시험관내 수용체 서브유닛 결합 데이터에 기초하여 관련 독성학적 종인 것으로 입증되었고, 생체내에서 약리학 (선택적 Treg 확장)을 입증하였을 뿐만 아니라, 역사적으로 IL-2R 효능제 분자에 대해 사용되어 왔다. BMS-986326의 단일- 및 반복-용량 독성을 선택된 투여 빈도를 사용하여 최대 2주 동안 래트 및 최대 12주 동안 원숭이에서의 일련의 연구에서 특징화하였다. 두 종에서의 중추적 우수 실험실 관리기준 (GLP) 반복-용량 연구는 BMS-986326의 SC 투여를 사용하였고, 상이한 용량 빈도 (매주 1회 [QW] 대 매주 2회 [2QW])를 사용한 래트에서의 2회의 2-주 연구, 원숭이에서의 2-주 매주 1회 투여 연구, 및 원숭이에서의 12-주 (3주마다 1회, Q3W) 투여 연구로 이루어졌다. 또한, BMS-986326의 내약성을 조사하기 위해 래트 및 원숭이 둘 다에서 단일-용량 탐색적 연구를 초기에 완료하였고, 최초-인간 (FIH) 단일-상승 용량 (SAD) 연구 (IM034001)에서 IV 투여를 뒷받침하기 위해 IV 투여를 사용하는 원격측정된 원숭이에서 단일-용량 GLP IV 독성 및 심혈관 안전성 연구를 또한 완료하였다.
래트에서, BMS-986326은 고도로 면역원성인 것으로 주목되었고, ADA 형성은 BMS-986326-처리된 래트의 84%에서 발생하였다. 일반적으로, ADA의 존재는 감소된 노출 및 PD 활성의 상실과 연관되었지만, 독성과는 연관되지 않았다. 원숭이에서, ADA는 일반적으로 중추적 독성 연구에서 BMS-986326에 대한 노출 후에 발생하지 않았고, 탐색적 연구에서 낮은 발생률을 가졌다.
의도한 및 의도하지 않은 PD 효과는 각각의 독성 연구의 모든 용량에 걸쳐 용량-의존성 방식으로 발생하였고, 일반적으로 래트에서보다 원숭이에서 더 현저하였다. IL-2R 효능제로서, BMS-986326은 래트 및 원숭이에서 모든 용량에 걸쳐 Treg 세포에서 STAT5의 최대 인산화 (72% 내지 95%)를 유도하였고, Treg 세포 (원숭이에서 최대 63x) 및/또는 CD4 Treg 상에서의 CD25 발현 (래트에서 최대 4.5x)을 증가시켰고, IL-10의 혈청 수준 (래트에서 최대 2x 및 원숭이에서 최대 87x)을 상승시켰다. BMS-986326은 또한 Treg에 대한 목적 약리학적 효과에 추가로, 혈청 IL-5, MCP-1, 및 퍼포린의 공동 상승과 함께, 통상적인 CD4 및 CD8 T 세포 집단 및 NK 세포의 용량-의존적 활성화를 포함하는 의도하지 않은 효과를 초래하였다. 원숭이에게 매주 투여되는 경우에 BMS-986326의 보다 높은 용량에서, B 세포 (1.6x) 및 다른 염증성 시토카인, 예컨대 IFN-γ (7.9x), IL-1Ra (49x), 및 IL-6 (5.1x)의 증가가 또한 주목되었다. 이들 염증성 시토카인은 보다 낮은 용량의 BMS-986326이 12-주 원숭이 독성 연구에서 덜 빈번하게 (Q3W) 제공되었을 때 상승되지 않았다.
모든 (의도한 및 의도하지 않은) PD 효과는 일반적으로 투여후 회복 기간 후에 가역적이었다. 약리학 반응의 피크는 일반적으로 투여 4-12일 후에 관찰되었고, 보다 빈번한 (즉, PD 반응의 피크에서 연속 용량이 투여된 래트에서 매주 2회 또는 원숭이에서 매주) 투여 요법의 경우에, 이는 독성의 보다 큰 발생률 및 중증도와 상관관계가 있었다 (하기 참조). 용량을 덜 빈번하게 (3주마다) 투여한 12-주 원숭이 연구에서, 각각의 연속 용량 직전 (투여 후 3주)의 Treg 및 비-Treg 둘 다에서의 PD 반응은 투여 후 4-12일에 그의 피크 반응으로부터 감소하였고, 이처럼, 표적 결속의 증거 및 유리한 면역조정의 성향이 모든 용량에서 존재하였으며, 대다수의 동물에서 의도하지 않은 면역 반응의 최소 자극을 가졌다. 종합하면, 의도한 및 일부 의도하지 않은 용량-관련 약리학적 효과 둘 다가 Q3W 투여에 의한 12-주 원숭이 연구에서 관찰되었지만, Treg의 증가 규모는 용량 범위에 걸쳐 통상적인 T 세포의 증가보다 최대 대략 2배 더 높았다.
5, 25, 75, 또는 200 mg/kg의 SC 용량을 제공받은 래트에서의 단일-용량 탐색적 연구에서, BMS-986326은 ≥ 25 mg/kg/일 (평균 AUC [0-96h] ≥ 2,080 μg·h/mL)에서 제5일에 이환 또는 사망을 유발하고, 출혈, 간담즙성 손상, 및 기능적 담즙정체 (모두 IL-2의 고용량 효과와 일치함)를 나타내는 임상 병리상태 변화가 있어 수컷 래트에게 허용되지 않았다. 5 mg/kg (평균 AUC [0-96h] = 501 μg·h/mL)에서 유해 효과는 관찰되지 않았다.
0.075, 0.25, 0.75, 또는 2.5 mg/kg의 SC 용량에서의 원숭이에서의 단일-용량 탐색적 내약성 PK/PD 연구에서, 0.75 mg/kg (AUC[INF] 407 μg·h/mL)까지의 용량은 PD 종점에서의 목적하는 변화 (Treg 확장 및 Treg 및 IL-10 상에서의 증가된 CD25 발현과 함께 T-reg에서의 STAT5의 인산화) 및 의도하지 않은 변화 (Tconv 및 CD8+ T 세포의 소폭 확장, IL-5, MCP-1, 퍼포린, 및 GM-CSF를 포함한 증가된 염증유발 시토카인) 뿐만 아니라 호산구증가증 및 감소된 적혈구 질량으로 잘 허용되었다. BMS-986326은 2.5 mg/kg (AUC[INF] 1040 μg·h/mL)에서 여러 원숭이가 액체 분변, 감소된 활성, 비정상적/비늘형/적색 피부, 및 중증 탈수, 및 시토카인 방출, 간 독성, 및 설사 및 탈수와 관련될 가능성이 있는 신장 침범을 나타내는 임상 병리상태 프로파일을 나타내어 허용되지 않았다.
원숭이에서의 중추적 단일-용량 IV 독성 및 심혈관 안전성 연구에서, BMS-986326은 모든 용량 (0.05, 0.15, 또는 0.5 mg/kg; 평균 AUC [0-336h] ≤ 757 μg·h/mL)에서 임상적으로 잘 허용되었다. 고용량에서 혈압 강하 효과 및 모세혈관 누출 증후군 (CLS)을 유발하는 재조합 hIL-2와 달리, 투여된 BMS-986326 용량에서 혈압 감소, CLS-유사 효과, 또는 혈류역학 또는 심전도 파라미터에 대한 다른 효과는 관찰되지 않았다. 모든 용량에서의 주목할 만한 독성학적 소견은 골수에서의 호산구의 최소 내지 중등도 골수 증식증과 연관된 호산구의 최소 내지 현저한 증가 (최대 91.6x), 및 비장에서의 호산구성 세포충실성의 최소 내지 경도의 증가 (확대된 비장 및 증가된 중량과 상관관계가 있음)를 포함하였다. 0.5 mg/kg의 고용량에서, 추가의 주목할 만한 소견은 염증유발 시토카인의 상승과 관련이 있을 수 있는 평균 체온의 일시적 증가 (최대 1.1℃), 보정된 QT 간격의 일시적 감소 및 최소로 증가된 심박수 (기준선에 비해 4%), 및 일시적, 저등급 염증 반응을 광범위하게 반영하는 임상 병리상태 프로파일을 포함하였다. 현미경에 의해, 일부 조직에서 호산구 및 단핵 세포의 용량-의존성 전신 침윤물이 존재하였다. 모든 소견은 낮은 크기 및 성질의 변화, 검사된 모든 조직/기관에서의 조직 손상 및 염증성 변화의 결여, 및 연관된 기능적 결과의 부재에 기초하여 비-유해한 것으로 간주되었고, 원숭이에서 단일 IV 용량 후의 무-관찰-유해-효과 수준 (NOAEL)은 0.5 mg/kg IV (평균 AUC [0-336h] = 757 μg·h/mL)의 고용량인 것으로 간주되었다.
별개의 투여 빈도를 사용한 래트에서의 2개의 개별 2-주 독성 연구에서, BMS-986326을 0.5, 1, 또는 2.5 mg/kg SC의 매주 2회 용량으로 또는 0.25, 0.5, 또는 1 mg/kg SC의 매주 1회 용량으로 투여하였고, 모든 용량 (≤ 2.5 mg/kg, 평균 AUC [0-336h] ≤ 600 μg·h/mL)에서 임상적으로 허용되었다. 최고 노출은 각각의 연구의 제1주 동안 주목되었고, ADA 영향으로 인해 제2주 동안 상당히 감소하였다. 유해 소견은 매주 2회 연구 동안에만 발생하였고, 모든 용량 (≥ 0.5 mg/kg 2QW, 제1일에 평균 AUC ≥ 189 μg·h/mL)에서 피막 섬유증식증 및 비장의 염증 및 2.5 mg/kg에서의 혈소판 계수의 감소 (0.8x에서 0.4x로)로 이루어졌다. 염증을 동반한 비장 피막 섬유증식증은 중등도 내지 현저한 중증도로 인해 매주 2회 용량 모두에서 유해한 것으로 간주되었고, 또한 장간막 (위 및 췌장에 인접함)에서의 최소 내지 경도 염증과 연관되었으며, 이는 추가로 유해성 소견에 기여하였다. 그 결과, NOAEL은 매주 2회 투여 연구에서 확인되지 않았다. 모든 용량 (≥ 0.5 mg/kg 매주 2회)에서의 다른 주목할 만한 비-유해 소견은 호산구의 증가 (3x 내지 22x 대조군), IL-2 효능제의 및 IL-5 증가와 연관된 약리학적 활성의 반영; 및 여러 기관으로의 호산구 침윤의 증가된 발생률 및/또는 중증도를 포함하였다. 전체적으로, 제2의 2-주 래트 연구에 대해 선택된 감소된 용량 수준 및 빈도 (매주 1회)는 2x 매주 투여로 입증된 것과 비교하여 표적 결속을 유지하고 의도하지 않은 약리학을 감소시키는 데 성공적이었다. 1차 BMS-986326-관련 효과는 모든 매주 1회 용량 (0.25, 0.5, 또는 1 mg/kg)에서 중증도에 있어서 대부분 최소였고, 증가된 호산구 (1.9x 내지 6.7x); 인접 장간막의 염증 또는 침범이 없는 비장의 최소 피막 섬유증식증/섬유증; 및 몇몇 조직 내로의 호산구의 약리학적으로 매개된 침윤을 포함하였으며, 이들 중 어느 것도 낮은 정도의 변화 및 연루된 기관의 기능적 완전성에서의 임의의 손상에 대한 증거 결여로 인해 유해한 것으로 간주되지 않았다. 2주 동안 매주 1회 투여 후 래트에서의 NOAEL은 1 mg/kg (평균 AUC 162 μg·h/mL)이었다.
0.125, 0.25, 또는 0.75 mg/kg SC의 매주 용량에서의 원숭이에서의 2-주 독성 연구에서, BMS-986326은 ≤ 0.25 mg/kg에서 임상적으로 허용되었지만, 0.75 mg/kg에서는 감소된 활성, 탈수, 홍반, 점상출혈, 및 상승된 체온을 포함한 IL-2R 효능작용 및 면역자극과 일치하는 독성의 유해 임상 징후를 유발하였다. 모든 용량에서, 주목할 만한 BMS-986326-관련 독성학적 소견은 일반적으로 용량과 관련되었고, 주로 백혈구 (즉, 연관된 조직 염증/침윤을 동반한 호산구증가증 [4x 내지 40x]); 감소된 적혈구 질량 (시험전의 0.9x 내지 0.6x) 및 혈소판 (0.9x 내지 0.6x); 비장 내 적색 속질의 울혈; 증가된 세포충실성, 동모양 백혈구증가증 및 쿠퍼 세포 비대와 상관관계가 있는 증가된 간 중량 (16% 내지 75%); 및 호산구증가증에 대한 재생 반응일 가능성이 있는 골수의 최소 내지 중등도 골수 증식증에 대한 효과를 수반하였다. 최소 내지 경도의, 일반적으로 다초점성 혼합 세포 염증은 뇌에서의 맥락막총 및 눈의 맥락막을 포함한, 다수의 조직 및 기관에서 발생하였다 (용량 관련하여 ~16 내지 28개의 조직이 영향을 받음). ≥ 0.25 mg/kg/주에서의 눈 맥락막 및 뇌의 맥락막총에서의 혼합 세포 염증 및 0.75 mg/kg/주에서의 감소된 RBC 질량은 소견의 중증도 및 성질로 인해 유해한 것으로 간주되었지만, 0.125 mg/kg/주에서는 최소 중증도 및 낮은 발생률로 인해 유해하지 않은 것으로 간주되었다. 0.75 mg/kg/주의 고용량에서, 추가의 주목할 만한 소견은 증가된 심박수 (25% 내지 28%)와 함께, R-R 간격의 연관된 감소 (시토카인 방출에 속발성인 것으로 생각되고, 비-유해한 것으로 간주됨); 간의 최소 내지 중등도 간세포 공포형성; 신장에서의 최소 내지 경도 피질 세관 재생, 및 회복 희생 시에만, 2마리의 수컷에서의 좌골 신경의 최소 내지 경도 축삭 변성을 포함하였다. ≥ 0.25 mg/kg/주 (평균 AUC[0-168h] ≥ 234 μg·h/mL)에서의 눈 맥락막 및 뇌의 맥락막총에서의 유해 염증 및 0.75 mg/kg/주 (평균 AUC[0-168h] ≥ 601 μg·h/mL)에서의 임상 징후 및 적혈구 질량의 유해 감소를 동반하는 것에 기초하여, NOAEL은 0.125 mg/kg/주 (평균 AUC[0-168h] 132 μg·h/mL)인 것으로 간주되었다.
12-주 원숭이 연구에서, 용량 범위 및 빈도는 0.0625, 0.125, 또는 0.25 mg/kg SC Q3W (제1일, 제22일, 제43일, 및 제64일)로 투여된 BMS-986326을 사용한 2-주 연구와 비교하여 감소되었다. 모든 용량에서, BMS-986326-관련 소견은 유해하지 않았고, 호산구 계수의 최소 내지 경도의 비-유해 증가 (3x 내지 8x 대조군), 비장의 증가된 크기 및 중량 (26 내지 65%), 및 골수에서의 최소 호산구성 골수 증식증을 포함하였다. 중요하게는, 다른 조직으로의 호산구성 또는 단핵 세포 침윤이 나타나지 않았다. 임상 효과의 부재 및 임상 병리상태 및 병리상태 소견의 비-유해 특성에 기초하여, NOAEL은 시험된 최고 용량인 0.25 mg/kg/용량 (평균 AUC 306 μg·h/mL)인 것으로 간주되었다.
BMS-986326의 상이한 구조, 대부분의 BMS-986326이 불활성 이량체로서 순환하는 경향, BMS-986326 대 rhIL-2의 매우 상이한 PK, 및 종 및 연구에 걸쳐 광범위하게 상이한 용량 요법을 고려하여 BMS-986326과 rhIL-2 비임상 연구 사이의 용량을 비교하는 것은 도전과제이다. 정성적으로, BMS-986326의 독성 프로파일은 rhIL-2에 대한 일부 유사성을 시사하지만, 또한 현저한 차이를 갖기도 한다. 유사성은 조직 내로의 호산구증가증 및 백혈구 침윤, 주로 호산구성 및 때때로 단핵 세포를 포함하는 것을 포함한다. 이들 소견은 모든 BMS-986326 독성학 연구에서 관찰되고, 다양한 투여 패러다임 하에 다양한 종에서 rhIL-2로 및 다양한 중증도로 보고된다. 저용량 및 고용량 rhIL-2 (프로류킨(Proleukin)® (알데스류킨), 노파르티스 파마슈티칼스 캐나다 인크.(Novartis Pharmaceuticals Canada Inc.)) 둘 다에 의해 또한 임상적으로 관찰되는 호산구증가증은 IL-2에 의해 자극된 ILC2에 의한 IL-5 생산에 속발성일 가능성이 있고 (Van Gool et al., Blood 124:3572-6 (2014); Anderson et al., Int Rev Exp Pathol. 34 Pt A:57-77 (1993)), BMS-986326 연구에서 유해하지 않았다. 조직에서의 백혈구 침윤과 관련하여, 간은 rhIL-2에 대한 1차 표적 기관이었지만, 중추적 독성 연구에서 연구된 용량에서 BMS-986326에 대한 유의한 표적은 아니었다 (Anderson et al., Int Rev Exp Pathol. 34 Pt A:57-77 (1993); Harada et al., Int Rev Exp Pathol. 34 Pt A:37-55 (1993)). 간 기능장애는 종양학 적응증에서의 고용량 rhIL-2의 빈번한 부작용이지만, GvHD, 제1형 당뇨병, 원형 탈모증 및 SLE를 포함한 다수의 적응증에서의 저용량 rhIL-2의 임상 시험에서는 간 기능장애가 특색은 아니었다 (Castela et al., JAMA Dermatol. 150:748-51 (2014); He et al., Nat Med. 22:991-93 (2016); Klatmann et al., Nat Rev Immunol. 15:283-94 (2015); Koreth et al., Blood 128:130-37 (2016)). 간 기능장애 이외에도, 고-용량 IL-2 종양학 요법 하에 CLS가 인간에서 요법을 제한한다. CLS는 GLP 중추적 비임상 연구에서 BMS-986326으로 관찰되지 않았다.
전반적으로, 중추적 BMS-986326 연구에서의 NOAEL 용량은 보통의 건강한 참가자에서 단일-용량 최초-인간 (FIH) 연구에 대해 제안된 용량 개시 및 용량 증량에 적합한 노출 한계를 제공한다.
III.B. BMS-986326의 1상 임상 평가
일반적 개요
BMS-986326을 1상 무작위 이중-맹검 위약-대조 단일 상승 용량 (SAD) 연구에서 평가하여 건강한 성인 참가자에서 BMS-986326의 단일 용량의 안전성, 내약성, 약동학 (PK), 및 약역학 (PD)을 평가한다.
연구의 1차 목적은 건강한 참가자에서 BMS-986326의 단일 상승 정맥내 (IV) 및 피하 (SC) 용량의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다.
연구의 2차 목적은 하기를 포함한다:
· 건강한 참가자에서 IV 및 SC BMS-986326의 단일-용량 PK를 결정하는 것;
· IV 투여와 비교하여 SC 투여 후 BMS-986326의 절대 생체이용률을 결정하는 것;
· BMS-986326의 SC 및 IV 투여 후에 PD를 평가하는 것; 및
· BMS-986326의 SC 및 IV 투여 후 면역원성에 대한 잠재력을 평가하는 것.
표적 대상체 집단
건강한 성인 참가자는 연구에 적격이다. 연구에 대한 적격성 기준은 연구 참가자의 안전성 및 연구의 결과가 사용될 수 있음을 보장하기 위해 주의깊게 고려된다. 환자 대신에 건강한 참가자를 등록하는 것은, 질환 상태의 변화, 동시 기관 기능장애 및/또는 병용 의약으로부터 유발되는 혼동 인자가 없기 때문에, 안전성 결과의 명백한 해석을 가능하게 한다. 또한, 건강한 참가자에서 새로운 분자 실체를 평가하는 것은, 환자에서 수행되는 경우에서의 잠재적 질환 악화의 위험을 회피한다.
연구의 각각의 코호트에 위약-치료 참가자를 포함시키는 것은 모든 연구 절차에 대해 연구에서 평가된 기준선 파라미터로부터의 임의의 변화의 평가를 용이하게 하고, 이들 변화가 BMS-986326의 투여 또는 연구 절차와 연관되는지 여부를 결정하는 것을 돕는다.
일반적인 연구 설계
연구 참여자를 8개의 코호트 (IV 코호트 A1-A5; SC 코호트 B1-B3) 및 1개의 임의적인 IV (A6) 코호트를 포함하는 대략 9개의 총 용량-수준 코호트로 무작위화한다.
각각의 참가자에 대한 연구의 총 지속기간은 최대 28-일 스크리닝 기간, 임상 현장에서의 21-일 인-하우스 관찰 기간 및 대략 34-일 외래환자/추적 기간을 포함하여, 최대 12주이다.
최대 대략 6개의 코호트 (코호트 A1-A6)는 하기 제공된 임상시험용 제품의 투여 절차에 따라 BMS-986326의 단일 IV 주입을 받는다. 대략 3개의 코호트 (코호트 B1-B3)는 하기 제공된 임상시험용 제품의 투여 절차에 따라 BMS-986326의 SC 주사(들)를 통해 제공되는 단일 용량을 받는다. 이는 최초-인간 (FIH) 연구이기 때문에, 연구 설계는 안전성, 내약성, PK 및 PD 데이터가 단계적 방식으로 수집되도록 한다. BMS-986326의 SC 투여는 허용되는 안전성 및 내약성이 IV 제공된 유사한 용량을 받은 참가자의 코호트에서 입증된 후에 일어난다.
2명의 건강한 참가자의 감시 군을 모든 코호트에서 평가한다. 이 감시 군은 위약 또는 BMS-986326으로 1:1 무작위화된다. 각각의 용량 수준 내의 나머지 6명의 참가자는 각각 위약 또는 BMS-986326으로 1:5 무작위화된다. 감시 군의 투여 적어도 120시간 후에, 안전성 프로파일이 허용되는 안전성 프로파일 (최소한, 유해 사건 (AE), 병용 의약 및 절차, 및 임의의 다른 중요한 안전성-관련 임상 관찰에 기초함)인 경우에, 코호트의 나머지는 무작위화 스케줄에 따라 투여된다. IV 코호트의 경우, 나머지 6명의 참가자는 1일에 최대 2명의 참가자로 순차적으로 투여된다. 일부 측면에서, 참가자는 참가자 사이에 적어도 2시간의 간격으로 투여된다.
SC 용량-수준 코호트는 허용되는 안전성 및 내약성이 IV 제공된 유사한 용량을 받은 참가자의 코호트에서 입증되고, PD (Treg 계수 및 Treg-대-통상적인 CD4 세포 [Tconv] 비) 데이터가 평가될 때까지 시작되지 않는다.
연구 과정 동안, 각각의 참가자는 도 1A에 제시된 바와 같이 스크리닝 기간 및 치료 기간 (기준선 및 외래환자 방문 포함)을 완료한다. 참가자는 적격성에 대해 스크리닝된다. 적격 참가자는 제-2일 또는 제-1일부터 제21일까지 임상 장소에 거주한다. 임상시험용 제품 (위약 또는 BMS-986326)을 무작위화 스케줄에 따라 제1일에 투여한다. 참가자는 만족스러운 안전성 검토 및 요구되는 연구 절차의 완료 시 제21일에 임상 현장으로부터 퇴원한다. 참가자는 제10일 내지 제18일 사이의 예상된 피크 PD 반응 및 잠재적 ADA의 발생 후에 Treg 확장의 지속성을 평가하기 위해 제28일, 제36일, 제45일 및 제55일에 외래환자 방문을 위해 복귀한다. 참가자가 조기에 연구를 중단하는 경우에, 조기 종결 방문이 수행된다.
각각의 코호트에서 투여를 완료한 후, AE, 신체 검사 (PE), 활력 징후, 12-리드 안전성 ECG, 주사-부위 평가, 임상 실험실 안전성 시험 결과 (호산구 계수 포함), 병용 의약/절차, 및 PD 데이터 (Treg 계수 및 Treg-대-Tconv 비 포함)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 안전성 데이터가 용량 증량 전에 검토된다. 완료된 코호트로부터의 PK 데이터를 사용하여 진행 기준으로 노출을 예측하였다.
계획된 용량 수준은 도 1B에 제시된다. 최고 용량을 포함한 계획된 용량 수준은 하기 제공된 용량-증량 절차에 기재된 바와 같이, 이전 코호트로부터의 신생 PD 및 PK 데이터 (SC 코호트로부터의 생체이용률 데이터 포함)에 따라 조정될 수 있다. 계획된 용량-증량 단계에 대한 변화가 요구되는 경우에, 최대 용량-증량 단계는 이전 용량 수준의 대략 ≤ 3배이다. 대략 757 μg·h/ml의 AUC[0-336시간 (h)]를 초과하지 않는 무한 시간으로 외삽된 혈청 농도-시간 곡선하 평균 노출 면적 (AUC[INF])을 갖는 것으로 예측된 IV 용량만이 투여된다. ≤ 306 μg·h/ml의 AUC(0-504h)를 초과하지 않는 평균 노출 (AUC[INF])을 갖는 것으로 예측되는 SC 용량만이 투여된다.
하기 제공된 용량 변형/중단 기준에 기재된 바와 같이, 대상체가 심각한 유해 사건을 경험하는 경우에 다음 용량 수준으로의 증량은 중단될 수 있다. 심각한 유해 사건은 연구 치료가 투여된 임상 조사 참가자의 임의의 새로운 부적절한 의학적 발생 또는 기존 의학적 상태의 악화를 포함하며, 이는 반드시 이 치료와 인과 관계를 갖는 것은 아니다.
1차 및 2차 종점
건강한 참가자에서 BMS-986326의 단일 상승 IV 및 SC 용량의 안전성 및 내약성을 평가하는 1차 목적을 평가하는 데 사용되는 본 연구의 1차 종점은 유해 사건, 임상 실험실 값, 활력 징후, 심전도 및 신체 검사의 평가를 포함한다. 이들 평가는 하기에서 추가로 논의된다.
건강한 참가자에서 IV 및 SC BMS-986326의 단일-용량 약동학 ("PK")을 결정하는 2차 목적과 관련된 연구의 종점은 하기와 같은 혈청 PK 파라미터를 포함한다:
· Cmax: 최대 관찰 혈청 농도;
· Tmax: 최대 관찰 혈청 농도의 시간;
· AUC(0-T): 제0 시점으로부터 마지막 정량화가능한 농도의 시간까지의 혈청 농도-시간 곡선하 면적;
· AUC(INF): 제0 시점으로부터 무한 시간까지 외삽된 혈청 농도-시간 곡선하 면적;
· CLT/F 또는 CLT: IV에 대한 겉보기 전신 클리어런스 또는 전신 클리어런스;
· Vz/F 또는 Vz: IV에 대한 말기에서의 겉보기 분포 부피 또는 말기에서의 분포 부피;
· T-HALF: 말기 반감기; 및
· F: 절대 생체이용률.
IV 투여와 비교하여 SC 투여 후 BMS-986326의 절대 생체이용률을 결정하는 2차 목적과 관련된 연구의 종점은 SC (시험) 대 IV (참조)의 하기 기하 평균 비를 포함한다: 용량에 의해 보정된 Cmax, AUC(0-T) 및 AUC(INF).
BMS-986326의 SC 및 IV 투여 후 약역학을 평가하는 2차 목적과 관련된 연구의 종점은 Treg 계수 및 Treg-대-Tconv 비의 기준선으로부터의 변화를 측정하는 것을 포함한다.
BMS-986326의 SC 및 IV 투여 후에 면역원성에 대한 잠재력을 평가하는 2차 목적과 관련된 연구의 종점은 항-약물 항체 (중화 항체일 수 있거나 아닐 수 있음)의 발생률을 측정하는 것을 포함한다.
감시 투여에 대한 근거
예기치 못한 급성 안전성 사례가 존재하는 경우의 위험을 최소화하기 위해 감시 투여 전략이 연구에 이용된다. 연구의 모든 용량 코호트에서 2명의 건강한 참가자 (활성제 1명 및 위약 1명)가 평가된다. 각각의 감시 군을 최소 120시간 동안 관찰한 후, 동일한 코호트의 나머지 참가자에게 투여된다. 피크 약리학 반응이 일반적으로 투여 4일 후에 시작하여 관찰된 것으로 나타난 원숭이에서의 독성 연구에 기초하여, 적어도 5일 동안의 임상 안전성의 모니터링은 급성 발병의 잠재적 안전성 우려 예컨대 모세혈관 누출 증후군 (CLS) 또는 면역 활성화 (예를 들어, 시토카인 방출 증후군)를 포괄한다. 감시 참가자와 동일한 코호트 내의 나머지 참가자의 투여를 진행하기 위한 결정은 이용가능한 안전성 데이터 (예를 들어, 유해 사건 (AE), 활력 징후, 신체 검사 (PE), 심전도 (ECG), 및 임상 실험실 시험)에 기초하여 이루어진다.
용량 범위에 대한 근거
연구를 위해 선택된 용량 범위는 적절한, 단계-적절한 안전성 데이터를 제공하고 PK/PD 관계의 특징화를 허용하는 노출 및 약리학적 활성의 범위를 제공할 것으로 예상된다.
0.1 mg IV의 출발 용량의 선택은 이용가능한 전임상 PK, 독성학 및 약리학 데이터에 기초한다. PK/PD 모델링 및 시뮬레이션을 수행하여 비임상 데이터로부터 예측된 인간 PK 및 PD 프로파일을 생성하였다. 실제 용량 증량 (대략 3배 이하의 용량-증량 증분) 및 시험된 실제 용량은 연구로부터 신생 PK, PD 및 안전성 데이터에 의해 결정된다. 이는 안전성, 내약성, PK, 및 PD 데이터를 허용하도록 설계된 FIH 연구이다.
표 4는 제안된 용량으로부터 생성된 추정 PD 변화 및 노출을 열거한다:
Figure pct00005
임상시험용 제품 (주사용 BMS-986326-01, 30 mg/바이알 (25 mg/mL))의 제약 특성 및 제제
주사용 BMS-986326-01 (30 mg/바이알; 25 mg/mL)은 1상 임상 연구를 위한 IV 주입 또는 SC 주사(들)로서 사용되도록 개발되었다. 약물 제품은 비-발열성 동결건조물이며, 이는 3-cc 유형 I 유리 바이알에 든, 13-mm 마개로 폐쇄되고 13-mm 알루미늄 밀봉재로 밀봉된 백색 내지 회백색의 덩어리로 된 또는 단편화된 케이크이다. 약물 제품의 각각의 바이알은 pH 7.0에서 표지된 양의 BMS-986326 약물 물질, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 수크로스, 펜테트산, 및 폴리소르베이트 80, 및 염산 및 수산화나트륨 (pH 조정을 위함)을 함유한다. VNS (바이알, 바늘, 시린지) 잔류를 충당하기 위해 각각의 바이알에 0.31-mL 과다충전이 포함된다. 약물 제품은 투여 전에 재구성된다.
투여 전에, 주사용 BMS-986326-01의 각각의 바이알 (30 mg/바이알; 25 mg/mL)은 0.9% 염화나트륨 주사 (생리 염수)에 의해 25 mg/mL의 단백질 농도로 재구성된다. SC 사용의 경우, 약물 제품은 25 mg/mL의 단백질 농도로 희석되지 않거나 또는 0.9% 염화나트륨 주사로 0.2 mg/mL의 단백질 농도까지 희석된 볼루스 SC 주사로서 인-라인 필터를 통해 투여될 수 있다. IV 사용의 경우, 약물 제품은 인-라인 필터를 통해 주입되고; 약물 제품은 0.9% 염화나트륨 주사로 주입 전에 0.2 mg/mL 내지 5 mg/mL의 단백질 농도 범위 내로 희석된다.
BMS-986326 주사와 디(2-에틸헥실)프탈레이트 (DEHP)-무함유 폴리올레핀 또는 PVC (DEHP-가소화) 백, DEHP-무함유 또는 PVC (DEHP-가소화) IV 세트, 및 0.2 μm 폴리에테르술폰 또는 나일론 필터 사이에 비상용성은 관찰되지 않았다.
주사용 BMS-986326-01에 대한 위약은 상업적으로 입수가능한 0.9% 염화나트륨 주사이다.
주사용 BMS-986326-01의 바이알 (30 mg/바이알; 25 mg/mL)은 2℃-8℃ (36℉-46℉)에서 냉장 저장되고, 빛 및 동결로부터 보호된다.
주사용 BMS-986326-01의 재구성된 및 희석된 용액은 냉장 하에 2℃-8℃ (36℉-46℉)에서 최대 24시간 동안 저장될 수 있고, 총 24시간 중 최대 4시간은 실온인 15℃-25℃ (59℉-77℉)에서 실내 광에 노출될 수 있다. 실온 및 실내 광 조건 하에서의 최대 4-시간 기간은 제품 투여 기간을 포함한다.
임상시험용 제품의 투여 절차
IV 코호트 (A1-A6)의 참가자는 제1일에 단일 용량을 IV 주입을 통해 투여받는다. SC 코호트 (B1-B3)의 참가자는 제1일에 단일 용량을 SC 주사(들)를 통해 투여받는다. 각각의 코호트에 대한 계획된 용량 수준은 하기 표 5에 포함된다. 하기 제공된 용량-증량 절차에 기재된 바와 같이, 최고 용량을 포함한 계획된 용량 수준은 SC 코호트로부터의 생체이용률 데이터를 포함한 이전 코호트로부터의 신생 PD 및 PK 데이터에 따라 변할 수 있다. 계획된 용량-증량 단계(들)에 대한 변화가 요구되는 경우, 최대 용량-증량 단계는 이전 용량 수준의 대략 ≤ 3배일 것이다.
각각의 참가자는 BMS-986326의 용량 코호트에 의존적인 SC 또는 IV 용량을 받는다. SC 주사(들)는 복부 피지층 (배꼽 주위의 5 cm 제외) 내로 천천히 지속적으로 투여된다. 각각의 주사 부피는 최대로 2 mL이다. 주입-부위 반응은 하기 기재된 바와 같은 반응에 대해 모니터링된다. BMS-986326을 대략 30 내지 60분에 걸쳐 주입한다. 보다 짧은 주입 시간이 초기-용량 코호트에 사용될 수 있고, 보다 긴 주입 시간이 보다 높은-용량 코호트에 사용될 수 있다. 주입-관련 반응 (IRR)을 모니터링한다.
표 5
Figure pct00006
약어: AUC(0-T) = 제0 시점으로부터 마지막 정량화가능한 농도의 시간까지의 혈청 농도-시간 곡선하 면적; AUC(INF) = 제0 시점으로부터 무한 시간까지 외삽된 농도-시간 곡선하 면적; IV = 정맥내; NOAEL = 관찰된-유해-효과-수준-없음; PD = 약역학; PK = 약동학; Q3W = 3주마다 1회; SC = 피하.
a 이들은 제안된 용량이지만; 실제 용량은 안전성, PK, 및 PD 데이터에 따라 변할 수 있다.
b 최대 IV 용량은 IV 단일-용량 원숭이 독성학 연구에 대해 NOAEL (AUC[0-336h] ≤ 757 μg·h/mL) 이하의 평균 노출 (AUC[INF])을 제공할 것으로 예상되는 용량일 것이다.
c 6 mg SC 초과의 용량은 12-주 Q3W SC 원숭이 독성학 연구에 대해 NOAEL (AUC[0-504h] ≤ 306 μg·h/mL)을 초과하지 않을 평균 노출 (AUC[INF])을 제공할 것으로 예상되는 용량까지 시험될 수 있다.
용량-증량 절차: IV 코호트 A1-A6
용량-증량 결정은 안전성, 내약성 및 PD (Treg 계수 및 Treg-대-Tconv 비)에 의해 통지된다. 각각의 용량 증량 전에 검토된 안전성 데이터의 평가는 AE, PE, 활력 징후, 12-리드 안전성 ECG, 임상 실험실 시험, 및 병용 의약/절차를 포함한다. 선행 용량-수준 코호트로부터의 최소 21일의 안전성 데이터가 다음 용량-수준 코호트로의 증량 전에 검토된다. 다음 용량 수준에서의 투여는 선행 (IV 또는 SC) 용량-수준 코호트의 안전성 및 내약성이 평가되고 허용되는 것으로 간주될 때까지 시작되지 않는다.
안전성 및 내약성에 추가로, PD 데이터 (Treg 계수 및 Treg-대-Tconv 비)가 각각의 IV 용량-수준 코호트에서 투여를 완료한 후에 검토되고 용량 증량 결정을 통지하는 데 사용된다. 신생 PD 데이터가, 3개의 연속적인 IV 용량-수준 코호트 내에서 PD 반응 (즉, 피크 Treg 배수 증가)이 정체상태에 있을 뿐만 아니라 Treg 및 Tconv 세포에서 대략 동일한 피크 배수 증가 (적어도 2배)가 있음 (이는 선택성의 상실을 시사함)을 나타내면, 보다 높은 IV 용량 수준은 조사되지 않는다. 임의의 중단이 BMS-986326과 관련된 것으로 의심되지 않는 한, 코호트 내의 8명의 평가가능한 참가자 중 적어도 6명으로부터의 안전성 및 PD 데이터가 용량 증량 전에 안전성 검토에 요구된다. 용량 증량의 목적을 위해, 평가가능한 참가자는 1회 용량의 임상시험용 제품 (BMS-986326 또는 위약)을 받은 참가자로서 정의된다.
이전의 코호트로부터의 PK 데이터를 사용하여 평균 노출을 (이용가능하게 되면) 진행 기준으로 예측하였다. 코호트 A5를 포함한 이전 코호트로부터의 PK 데이터는, 안전성 및 PD 데이터에 추가로, 코호트 A5로부터 임의적인 코호트 A6으로 이동하기 위한 용량 증량 결정에 사용된다.
계획된 용량 수준은 이전 코호트로부터 수득된 데이터에 기초하여 변형 또는 생략될 수 있다. 조사된 최대 IV 용량은 임의의 개별 참여자에서 NOAEL 노출 (AUC[0-336h] ≤ 757 μg·h/mL)을 초과하지 않는 평균 노출 AUC(INF)를 제공할 것으로 예상되는 용량이다. 계획된 용량-증량 단계(들)에 대한 변화가 요구되는 경우, 최대 용량-증량 단계는 이전 용량 수준의 대략 ≤ 3배이다.
SC 코호트 B1-B3에 대한 용량-증량 절차
제1 SC 용량-수준 코호트 (1 mg)의 참가자에게 BMS-986326의 SC 투여는 1-mg IV 용량-수준 코호트로부터의 21일의 안전성 데이터가 검토된 후에 개시된다. 다음 SC 용량-수준 코호트로의 용량 증량은 선행 SC 용량-수준 코호트 (보다 낮은 용량) 및 선행 IV 용량-수준 코호트 (유사한 용량) 둘 다에서 안전성, 내약성 및 PD (Treg 계수 및 Treg-대-Tconv 비) 데이터의 검토 후에 일어난다. 각각의 용량 증량 전에 검토된 안전성 데이터의 평가는 AE, PE, 활력 징후, 12-리드 안전성 ECG, 임상 실험실 시험, 및 병용 의약/절차를 포함한다. 선행 용량-수준 코호트 둘 다로부터의 최소 21일의 안전성 데이터가 용량 증량 전에 검토된다.
임의의 중단이 BMS-986326과 관련된 것으로 의심되지 않는 한, 각각의 SC 코호트 내의 8명의 평가가능한 참가자 중 적어도 6명으로부터의 안전성 데이터가 용량 증량 전에 검토된다. 용량 증량의 목적을 위해, 평가가능한 참가자는 1회 용량의 임상시험용 제품 (BMS-986326 또는 위약)을 받은 참가자로서 정의된다.
이전의 코호트로부터의 PK 데이터를 사용하여 평균 노출을 (이용가능하게 되면) 진행 기준으로 예측하였다. 임의의 개별 참여자에서 정상-상태 노출 (대략 306 μg·hr/mL의 AUC[0-INF])을 초과하지 않을 것으로 예측되는 SC 용량만이 투여된다.
계획된 용량 수준은 이전 코호트로부터 수득된 데이터에 기초하여 변형 또는 생략될 수 있다. 계획된 용량-증량 단계(들)에 대한 변화가 요구되는 경우, 최대 용량-증량 단계는 이전 용량 수준의 대략 ≤ 3배이다.
용량 변형/중단 기준
이전 코호트로부터 하기 조건 중 어느 것이든 충족되면 다음 용량 수준으로의 증량은 계획된 대로 계속되지 않을 수 있다:
a. 중증 AE (SAE)가 1명 이상의 BMS-986326-치료된 참가자에서 발생하고, BMS-986326과 관련된 것으로 간주됨;
b. 2명 이상의 BMS-986326-치료된 참가자가 BMS-986326과 관련된 것으로 간주되는 중증 AE를 경험함;
c. 동일한 코호트 내의 2명의 참가자에서 연구 약물 투여와 관련된 것으로 간주되는 중증 호산구증가증이 발생함. 중증 호산구증가증은 하기와 같이 정의된다:
i. 호산구증가증: > 5000개 세포/μL가 5일 초과 동안 지속되는 것;
ii. 증후성 호산구증가증 (≥ 1500개 세포/μL의 호산구증가증): 피부염, 점막염, 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)/아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)에서의 > 2배 상승과 연관된 호산구증가증;
d. 신생 PD 데이터가 3개의 연속적인 IV 용량-수준 코호트 내에서 PD 반응 (즉, 피크 Treg 배수 증가)의 정체상태를 나타내고, 신생 PD 데이터는 Treg 및 Tconv 세포에서의 대략 동일한 피크 배수 증가 (적어도 2배)를 나타냄;
e. 연구자 또는 스폰서의 의료 모니터에 의해 용량 증량의 결과로서 참가자에게 허용되지 않는 위험을 제기하는 것으로 간주되는 임의의 다른 사건.
상기 중 어느 것이든 충족되면, 이용가능한 안전성, PD (Treg 계수 및 Treg-대-Tconv 비), 및 노출 데이터의 검토가 수행된다. 데이터의 평가가 일어나면, 하기가 일어날 수 있다:
a. 용량 증량은 원래 계획된 바와 같이 계속될 수 있음. 이는 중단 기준을 충족하는 AE(들)가 검토 후에 BMS-986326에 관련된 것으로 간주되지 않는 것으로 판단되는 경우에만 허용가능함;
b. 계획된 용량 증량은 안전성 및 내약성 검토의 결과에 기초하여 또는 안전성 신호의 추가의 특징화가 적절한 경우에, 중단 기준을 충족하는 AE(들)가 발생한 용량 수준의 반복을 포함하도록 변형될 수 있다. 이는 중단 기준을 충족하는 AE(들)가 검토 후에 BMS-986326에 관련된 것으로 간주되지 않는 것으로 판단되는 경우에만 허용가능함;
i. 중간-용량 (중단 기준을 충족하는 용량 미만임) 코호트가 추가될 수 있음;
c. 용량 증량이 중단될 수 있음.
안전성 및 내약성을 평가하기 위한 프로토콜
스크리닝에서, 안전성 평가는 전반적 외관 및 활력 징후 뿐만 아니라 눈, 귀, 코, 입, 인후, 목, 호흡기, 심혈관, 호흡기, 위장/복부, 림프, 근골격, 피부 및 신경계 검사의 평가를 포함하는 완전한 신체 검사를 포함한다. 스크리닝 평가는 연속 홀터 모니터링, 12-리드 ECG, 및 선행 및 병용 의약 사용의 검토를 추가로 포함한다. 활력 징후 모니터링은 체온, 호흡률, 혈압 및 심박수를 포함한다.
연구 과정 동안, 안전성 평가의 일부로서 다양한 상이한 시점에서 추가의 신체 검사가 수행된다. 이들 후속 신체 검사는 표적화되며, 두부, 귀, 눈, 목 및 인후; 심혈관계, 신경계 및 호흡계; 복부; 피부 (주사 부위 평가 포함); 및 사지의 검사를 포함한다.
연구 과정 동안, 다양한 상이한 시점에 수행되는 추가의 안전성 및 내약성 평가는 또한 활력 징후 모니터링; 심전도; 연속 홀터 모니터링; 결핵 시험; 주사 부위 모니터링; COVID-19 스크리닝; 및 임상 화학, 응고 및 요분석을 포함하는 임상 안전성 실험실 평가를 포함한다.
추가로, 연구 과정 동안 유해 사건 및 심각한 유해 사건 평가를 사용하여 안전성을 평가한다. 유해 사건은 일반적으로 연구 치료가 투여된 임상 조사 참가자의 임의의 새로운 부적절한 의학적 발생 또는 기존 의학적 상태의 악화를 포함하며, 이는 반드시 이 치료와 인과 관계를 갖는 것은 아니다. 이 평가는 부분적으로 연구 과정 동안 수득된 실험실 결과 뿐만 아니라 연구 과정 전반에 걸쳐 수행된 다른 상기 언급된 안전성 평가의 결과에 기초한다. 심각한 유해 사건은 일반적으로 임의의 용량에서 사망을 초래하거나 생명을 위협하는 임의의 부적절한 의학적 발생으로서 정의된다. 모든 유해 사건 및 심각한 유해 사건의 강도 및 인과관계는 임의의 사건이 발생하면 평가된다.
BMS-986326의 약동학 (PK) 및 면역원성을 평가하기 위한 프로토콜
별개의 혈청 샘플을 PK 및 항-약물 항체 (ADA) 평가를 위해 수집하고, 제1일에 BMS-986326 최대 1시간 전에 채취한 투여전 혈청 샘플, 제1일에 채취한 주입 종료 (EOI) 혈청 샘플, 및 연구 전반에 걸쳐 (예를 들어, 제2-21일에서의 거주 동안 및 제28, 36, 45, 및 55일에서의 외래환자 방문 동안) 채취한 추가의 혈청 샘플을 포함한다.
적격 참가자는 제-2일 또는 제-1일부터 제21일까지 임상 장소에 거주한다. 임상시험용 제품 (위약 또는 BMS-986326)을 무작위화 스케줄에 따라 제1일에 투여한다. 참가자는 만족스러운 안전성 검토 및 요구되는 연구 절차의 완료 시 제21일에 임상 현장으로부터 퇴원한다. 참가자는 제28일, 제36일, 제45일 및 제55일에 외래환자 방문을 위해 복귀한다.
BMS-986326의 약동학은 혈청 농도 대 시간으로부터 유래된다. 평가된 PK 파라미터는 Cmax; Tmax; AUC(0-T); AUC(INF); CLT/F 또는 CLT; Vz/F 또는 Vz; T-HALF; 및 F를 포함한다.
개별 참가자 PK 파라미터 값은 검증된 PK 분석 프로그램에 의한 비-구획 방법에 의해 유도된다. 실제 시간이 분석에 사용된다.
혈청 샘플을 이량체 및 단량체 둘 다의 수준을 포함한 총 약물을 측정하는 검증된 리간드-결합 검정에 의해 BMS-986326에 대해 분석한다. 위약을 받은 참가자로부터 수집된 PK 샘플은 분석되지 않는다. 또한, 혈청 샘플은 잠재적인 단량체 분석을 위해 보관된다. 단량체 수준은 비검증된 탐색적 리간드-결합 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
면역원성 샘플은 검증된 면역원성 검정에 의해 항-BMS-986326 항체에 대해 분석된다. 투여 전에 투여전 샘플을 제1일에 수집하고; 후속 샘플링을 제15일, 제28일 및 제55일에 수행할 수 있다. 양성으로 확인된 샘플을 적정하고, 검증된 검정을 사용하여 내인성 IL-2에 대한 중화 항체의 가능한 부수적 향후 분석을 위해 보관한다.
BMS-986326의 약역학 (PD)을 평가하기 위한 프로토콜
세포 계통 및 활성화 마커 CD3, CD4, CD8, CD14, CD25, CD39, CD45, CD45RA, CD56, CD127, Foxp3, 헬리오스, CXCR5, CCR7, 및 Ki67을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 표면 마커에 의해 면역 세포, 예컨대 Treg, Tconv, 여포성 헬퍼 T 세포 (Tfh), B 세포, 및 NK 세포를 정량화하기 위해 혈액 샘플을 수집하고 유동 세포측정법에 의해 측정한다. pSTAT5에 의해 확인된 Treg, Tconv, CD8 T 세포 및 NK 세포에 대한 BMS-986326 결속을 결정하기 위해 혈액 샘플을 또한 수집하고 유동 세포측정법에 의해 측정한다.
생체외 Treg 억제 검정을 선택된 SC 투여 코호트에서 수행한다. T 세포 증식 및 시토카인 분비의 측정을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 검정에서 활성화된 Tconv 세포에 대한 생체외 억제 활성에 대해 혈액 샘플을 수집하고, Treg 세포를 시험한다.
BMS-986326 코호트 A4 (3 mg 단일 정맥내 주입)로부터의 예비 결과
Treg는 위약을 받은 대상체에 비해 BMS-986326을 받은 대상체에서 기준선 수준으로부터 증가하였다.
III.C. mIL-2/CD25 융합 단백질은 전신 홍반성 루푸스의 전임상 모델에서 Treg 확장 및 면역 억제를 유도한다
일반적 개요
Treg는 면역 반응을 억제하고 자가면역을 제어하는 데 널리 확립된 역할을 갖는다 (Bluestone et al., J Clin Invest. 125: 2250-60 (2015); Dominguez-Villar et al., Nat Immunol. 19: 665-73 (2018)). 따라서, Treg는 결정적으로 자기-관용의 유도 및 유지를 담당한다. Treg 기능의 조절이상은 수많은 자가면역 상태에 연루되어 왔다 (Castela et al., JAMA Dermatol. 150: 748-51 (2014); Koreth et al., N Engl J Med. 365: 2055-66 (2011); Saadoun et al., N Engl J Med. 365: 2067-77 (2011)). 관용-유도 상태의 촉진은 무약물 완화를 표적화하는 차세대 면역학 요법의 주요 목표이고, Treg의 유도 및 활성화는 이러한 목표를 향한 매력적인 표적에 해당한다.
IL-2는 처음에는 강력한 T 세포 성장 인자로서 발견되었고 (Gillis et al., J Exp Med. 146: 468-82 (1977)), 많은 연구는 염증유발 면역 반응을 촉진하는 데 있어서의 그의 역할에 초점을 맞추었다. 예를 들어, 고용량 IL-2 (전형적으로 500,000 U/kg, 반복적으로)는 T 세포 및 NK 세포 기능을 부스팅하기 위해 암 환자를 치료하기 위한 승인된 요법이지만; 반응률은 전형적으로 낮고, 요법은 또한 심각한 독성을 동반한다 (Fraenkel et al., J Immunother. 25: 373-8 (2002)). IL-2의 추가의 역할은 IL-2 또는 IL-2R이 결핍된 마우스에서 손상된 면역 반응보다는 신속한 자가면역의 관찰로 인해 발견되었다 (Sadlack et al., Cell 75: 253-61 (1993); Suzuki et al., Science 268: 1472-76 (1995); Willerford et al., Immunity 3: 521-30 (1995)). 이러한 표현형은 Treg 발달 및 항상성에서 IL-2가 하는 필수 역할의 상실로부터 초래된다 (Cheng et al., J Immunol. 109: 1567-75 (2013); Fontenot et al., Nat Immunol. 6: 1142-51 (2005); Yao et al., Blood 109: 4368-75 (2007)). 마우스 데이터와 일치하게, 인간 IL-2 신호전달 경로에서의 돌연변이는 자가면역 질환과 연관된 것으로 밝혀졌고; IL-2, IL-2RA 및 IL-2RB 유전자좌에서의 자가면역 위험 변이체는 게놈-전반 연관 연구를 통해 확인되었다 (Abbas et al., Sci Immunol. 3 (2018)). 전신 홍반성 루푸스 (SLE)는 구체적으로 IL-2 결핍 상태에 기인한 Treg 기능장애와 연관된 자가면역 질환으로서 확인되었다 (von Spee-Mayer et al., Ann Rheum Dis. 75: 1407-15 (2016)).
전임상적으로, 낮은 IL-2R 신호전달은 Treg의 주요 활성을 선택적으로 촉진하지만 T 이펙터 (Teff) 세포는 그렇지 않은 것으로 나타났다. 낮은 수준의 IL-2로의 마우스의 처리는 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스에서 당뇨병의 발생을 예방하였다 (Grinberg-Bleyer et al., J Exp Med. 207: 1871-8 (2010); Tang et al., Immunity 28: 687-97 (2008); Yu et al., Immunity 30: 204-17 (2009)). 저용량 IL-2를 사용한 여러 소규모 임상 시험이 SLE에서 고무적인 결과로 보고되었다 (He et al., Nat Med. 22: 991-3 (2016); Klatzmann et al., Nat Rev Immunol 15: 283-94 (2015)). 그러나, 재조합 IL-2 처리는 매일 주사를 필요로 한다. 또한, 염증유발 시토카인 및 비-Treg 세포에서의 바람직하지 않은 증가가 또한 관찰되었다.
절단불가능한 링커에 의해 연결된 마우스 IL-2 (mIL-2) 및 마우스 IL-2Rα (CD25)의 융합 단백질 (FP)은 NOD 마우스에서 Treg 확장 및 당뇨병의 제어에서 재조합 IL-2보다 더 큰 생체내 효능을 나타냈다 (Ward et al., J Immunol. 201: 2579-92 (2018)). 생체내에서, mIL-2/CD25는 장기-생존하여 지속적으로 및 선택적으로 Treg를 자극한다 (Ward et al.). mIL-2/CD25 융합 단백질은 단백뇨의 수준, 혈청 자가항체 역가, 및 염증 및 손상의 신장 조직학 점수에 기초하여 NZB x NZW F1 및 MRL/lpr 마우스에서 Treg 확장을 유도하고 루푸스 신염을 억제하는 데 효과적인 것으로 본원에서 입증된다. 그의 유효 용량에서, mIL-2/CD25는 BALB/c 마우스에서 염증유발 시토카인 또는 비-Treg 세포의 어떠한 증가도 유도하지 않는다. 종합하면, 이들 데이터는 SLE 환자를 치료하는 데 있어서 IL-2/CD25 융합 단백질의 사용을 뒷받침한다.
NZB x NZW 마우스에서의 Treg CD25 발현
Treg는 SLE 환자에서 이상조절된다. 높은 백분율의 Treg (CD4+Foxp3+)가 IL-2 결핍 상태를 반영하는, 보다 낮은 수준의 CD25 발현을 나타낸다는 것이 보고되었다 (Humrich et al., Expert Rev Clin Immunol. 12: 1153-60 (2016)). NZB x NZW F1은 자발적 루푸스의 전형적 모델이며, 이는 루푸스 환자의 것에 필적하는 중증 루푸스-유사 표현형을 발생시킨다 (Xie et al., J Immunol. 192: 4083-92 (2014)). NZB x NZW 루푸스 모델이 또한 SLE 환자에서 관찰된 바와 같은 보다 낮은 CD25 발현의 Treg 이상을 포착하는지 여부를 평가하기 위해, NZB x NZW 마우스 (n = 5, 26주령) 및 대조군 BALB/c 마우스 (n = 6, 9-10주령)로부터의 비장세포를 CD4, FoxP3 및 CD25에 대해 염색하였다. 대표적인 도트 플롯은 도 2A에 제시된다. CD4+Foxp3+ 세포는 Treg를 나타낸다. 대표적인 BALB/c 마우스에서, Treg의 73%는 CD25hi인 반면; 대표적인 NZB x NZW 마우스에서, Treg의 단지 35%만이 CD25hi였다. CD25 발현의 수준은 Treg 게이트 (CD4+Foxp3+)에서의 CD25 중앙 형광 강도 (MFI)에 의해 결정되었다. 도 2B에 나타낸 바와 같이, CD25 MFI는 BALB/c 군에 대해 1744.8 ± 98.9 (평균 ± SEM)인 반면, NZB x NZW 마우스에 대해서는 단지 364.2 ± 34.5였다. 따라서, SLE 환자에서 관찰된 낮은 CD25 발현의 Treg 이상은 NZB x NZW 마우스에서 유사하게 관찰된다.
BALB/c 마우스에서의 mIL2-CD25의 단기 처리
NZB x NZW 루푸스 마우스에서 mIL-2/CD25의 만성 효과를 시험하기 전에, 3회 용량에 대해 1주 2회 투여된 BALB/c 마우스에서 단기 연구 (7일)를 수행하였다. 비교자로서, Fc-mIL2를 4회 용량에 대해 격일로 투여하였다. 비장을 수집하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하고, 혈장을 시토카인 생산에 대해 평가하였다. 0.25 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 mIL-2/CD25 투여는 Fc-mIL2와 비교하여 CD4+ 게이트에서의 Treg의 백분율의 보다 큰 증가를 발생시켰다 (도 3A). 단일 세포 게이트에서의 CD8+ 세포의 백분율은 Treg의 증가로 인해 감소된 반면, 어떠한 분자도 NK 세포의 백분율을 통계적으로 변화시키지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 비장 내의 다양한 세포 유형의 절대 수를 총 비장 계수를 기초로 계산하여, 잠재적인 비-Treg 결속의 민감한 척도를 제공하였다. 유사하게, 0.25 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 mIL-2/CD25 투여는 Fc-mIL2와 비교하여 Treg 수의 보다 큰 증가를 나타냈다 (도 3B). CD8+, CD4+Foxp3-, 및 NK 세포의 최소 변화가 mIL2-CD25에 대해 관찰된 반면, Fc-mIL2는 이들 집단을 유의하게 증가시켰다 (도 3C-E). 순환 시토카인의 측정은 Treg 선택성을 뒷받침한다. 이들 용량에서의 mIL-2/CD25 투여의 경우에, 시토카인은 상승되지 않았고, 단지 IL-5만이 0.5 mg/kg 용량에서 약간 상승되었다 (데이터는 제시되지 않음). 이들 결과는 mIL2-CD25가 Fc-mIL2에 비해 개선된 Treg 결속 및 선택성 프로파일을 제공하며, 보다 큰 Treg 증가가 있고 비-Treg 결속의 증거가 없다는 것을 확인시켜 주었다. 이들 결과에 기초하여, 루푸스의 동물 모델에서 mIL-2/CD25 효능의 추가의 시험을 위해 1주 2회 0.1-0.4 mg/kg의 용량 범위를 선택하였다.
NZB x NZW 마우스에서의 초기 루푸스에서의 mIL-2/CD25
SLE의 동물 모델에서 mIL-2/CD25의 효과를 평가하기 위해, 22-24주령의, 30 mg/dL의 단백뇨 수준 (1의 점수)을 갖는 NZB x NZW F1 마우스를 연구에 등록하였다. 마우스에게 PBS 또는 mIL-2/CD25를 매주 2회 0.1, 0.2 및 0.4 mg/kg으로 s.c. 주사하거나, 또는 프레드니솔론을 매주 3회 10 mg/kg으로 p.o. 투여하여 양성 대조군으로서 제공하였다 (군당 n = 10). 제1 용량 후에 결정된 mIL2-CD25의 혈청 노출 (AUC 및 Cmax)은 0.1 내지 0.4 mg/kg 용량에서 용량-의존성 방식으로 20.6시간의 평균 최종 반감기로 증가하였다. PK 파라미터는 표 6에 제시된다. 14주 실험의 과정에 걸쳐, mIL-2/CD25 투여는 잘 허용되었고, 관찰된 체중 감소는 없었다 (데이터는 제시되지 않음). 단백뇨 점수에 의해 판단된 바와 같은 질환 진행은 mIL-2/CD25 투여에 의해 용량-의존성 방식으로 유의하게 감소되었다 (도 4A). 3 이상의 점수를 갖는 중증 단백뇨가 발생한 동물의 백분율이 또한 감소되었다 (도 4B). 마우스를 또한 채혈하고, 2-3주마다 혈청 자가항체의 존재에 대해 체크하였다. 항-dsDNA IgG 역가는 PBS 처리된 마우스에 비해 용량-의존성 방식으로 mIL-2/CD25 처리에 의해 유의하게 감소하였고, 최대 효과 (0.2 및 0.4 mg/kg 용량 둘 다에 의해 달성됨)는 프레드니솔론 대조군에서 관찰된 것에 필적하였다 (도 4C). 현미경 평가는 PBS-처리된 대조군 마우스의 신장에서 유의한 사구체신염을 밝혀내었다. 이는 다양한 정도의 사구체에서의 과다세포충실성 및 매트릭스 침착, 세뇨관강에서의 단백질 캐스트, 및 간질성 및 혈관주위 조직에서의 염증성 세포 침윤을 특징으로 하였다. mIL-2/CD25로의 처리는 사구체, 세뇨관 및 간질성 신염에 대한 조직학 점수를 유의하게 감소시켰다 (도 4D). 결론적으로, mIL-2/CD25는 NZB x NZW 루푸스 모델에서 단백뇨의 수준, dsDNA IgG 역가, 및 신장 조직학 점수를 용량-의존성 방식으로 감소시키는 데 있어서 효능을 입증하였고; 최대 효능은 0.2 mg/kg 및 0.4 mg/kg 용량 (2x/주)에서 관찰되었고 이는 고-용량 프레드니솔론에서 관찰된 것에 필적하였다.
효능을 Treg 확장의 정도와 상관시키기 위해, 혈액 및 비장 (군당 n = 4)을 투여 4주 (제8 용량 48시간 후) 후에 유동 세포측정법을 위해 수집하였다. mIL-2/CD25 처리는 혈액 및 비장 둘 다에서 CD4+ 게이트에서의 Treg (CD25+Foxp3+)의 백분율을 용량 의존적으로 증가시켰다. 혈액에서, Treg의 백분율은 PBS 군에서 2.3 ± 0.1% (평균 ± SEM)로부터 각각 0.1, 0.2, 및 0.4 mg/kg 용량 군에서 11.7 ± 2.3%, 21.9 ± 1.9%, 24.2 ± 0.5%로 유의하게 증가하였다 (도 5A). 유사하게, 모든 용량에서 비장 Treg의 백분율이 증가하였다 (도 5B). 비장세포를 또한 Ki67에 대해 염색하여 Treg의 증식 상태를 입증하였다. 도 5C에 나타낸 바와 같이, Treg 게이트 (CD4+CD25+Foxp3+)에서의 Ki67+ 세포의 백분율은 PBS 군에서 27.0 ± 6.4%로부터 각각 0.1, 0.2 및 0.4 mg/kg mIL-2/CD25 처리 군에서 49.5 ± 5.9%, 56.6 ± 2.4% 및 69.8 ± 8.0%로 용량 의존성 방식으로 증가하였다. Balb/c 마우스에 비해 NZB x NZW에서 더 낮은 Treg 상에서의 CD25 발현 (CD25 MFI) (도 2B)은 또한 비히클 군에서 1745 ± 96 MFI로부터 각각 0.1, 0.2 및 0.4 mg/kg mIL-2/CD25 처리 군에서 4361 ± 408, 5340 ± 390, 및 5057 ± 335 (±SEM) MFI로 용량 의존성 방식으로 증가하였다 (도 5D). 혈액 및 비장 Treg를 또한 투여 14주 후에 분석하였고, 결과는 제4주에 수득된 것에 필적하였다 (데이터는 제시되지 않음). 결론적으로, mIL-2/CD25 처리는 Treg의 수 및 Treg 상에서의 CD25 발현 둘 다를 증가시켰고, 그 결과 NZB x NZW 루푸스 마우스에서 질환 진행을 억제하였다.
표 6. NZB x NZW 마우스에서의 mIL-2/CD25의 혈청 노출.
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mIL-2/CD25의 0.1, 0.2 또는 0.4 mg/kg s.c. 용량 후 mIL-2/CD25의 혈청 수준은 용량-의존성 방식으로 증가하였다. 0.1, 0.2 또는 0.4 mg/kg s.c. 용량 후의 약동학적 파라미터는 각각 368.9, 877.2 또는 2045.9 nM·h (AUC0-80h) 및 각각 9.5, 26.5 또는 56.9 nM (Cmax)이었다. Tmax는 24시간이었다. 평균 말기 반감기는 20.6시간이었다.
NZB x NZW 마우스에서의 진행성 루푸스에서의 mIL-2/CD25
mIL-2/CD25를 후기 단계 질환의 징후를 호전시키는 그의 능력에 대해 추가로 시험하였으며, 이는 효능에 대한 보다 높은 기준이다. 진행성 단백뇨 (≥ 100 mg/dL; ~27주령)를 갖는 마우스를 10-주 치료 연구에 등록하였다. 0.3 mg/kg 2x/주의 mIL-2/CD25는 단백뇨의 수준 (도 6A), 항-dsDNA IgG 역가 (도 6B), 혈장 IL-12p40의 수준 (도 6C), 및 염증 및 손상에 대한 신장 조직학 점수 (도 6D)에서 유의한 감소를 나타냈다. 연구 완료시, 비장세포를 사용하여 유동 세포측정법을 수행하였다. CD4+ 게이트에서의 CD4+CD25+Foxp3+ Treg의 백분율은 PBS 군에서 5.5 ± 0.6% (평균 ± SEM)로부터 각각 0.1 mg/kg 및 0.3 mg/kg mIL-2/CD25 처리 군에서 18.9 ± 4.8% 및 22.4 ± 6.3%로 증가하였다 (도 6E). 이 데이터는 보다 진행된 루푸스 환자를 치료하는 데 있어서 IL-2/CD25에 대한 치료 잠재력을 뒷받침한다.
NZB x NZW 마우스에서의 mIL-2/CD25 및 프레드니손 조합물의 효과
코르티코스테로이드에 대한 의존성을 감소시키기 위한 mIL-2/CD25 요법의 잠재적 유용성을 평가하기 위해, 루푸스에서의 현행 표준 관리, 부분 유효 용량의 mIL-2/CD25 (0.1 mg/kg s.c. 2x/주) 및 프레드니솔론 (1 mg/kg p.o. 3x/주)을 사용한 조합 연구를 30 mg/dL (21-23주령)의 단백뇨를 갖는 NZB x NZW 초기 루푸스 마우스에서 시험하였다. 고용량의 프레드니솔론 (10 mg/kg, p.o. 3x/주) 및 mIL-2/CD25 (0.2 mg/kg s.c. 2x/주) 군이 최대 효능 단독요법 대조군으로서 포함되었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 1 mg/kg 프레드니솔론 또는 0.1 mg/kg mIL-2/CD25의 단독요법은 단백뇨 수준 및 항-dsDNA 역가를 감소시키는 데 있어서 부분적 보호를 나타낸 반면, 둘 다의 조합은 고용량 프레드니솔론 또는 mIL-2/CD25 대조군에 필적하는 효능을 입증하였으며, 이는 어느 하나의 요법 단독보다 우수하였다 (도 7A 및 7B). 조합 치료에 의한 우수한 효과는 또한 RT-PCR에 기초한 신장에서의 제1형 인터페론 유전자 발현, 예컨대 IFIT1, IFIT3, MX1, IRF7, GBP2 및 LIGP1의 추가의 감소에서 입증되었다 (각각 도 8A-8F). 조합 치료의 이점은 조직학 점수에 기초해서는 덜 명백하였는데 (도 7C), 이는 반-정량적 조직학 점수에 기초하여 0.1 mg/kg mIL-2/CD25 단독요법에 의해 조직학 점수의 높은 수준의 감소가 이미 달성되었기 때문이다.
Treg에 대한 mIL-2/CD25의 효과를 또한 이 연구의 완료 시 (14주의 처리 후) 비장에서 평가하였다. 예상된 바와 같이, 프레드니솔론 단독요법 (1 및 10 mg/kg 군 둘 다)은 Treg (CD4+CD25+Foxp3+) 또는 Treg 상의 CD25 MFI의 백분율을 변경시키지 않았다. 이전 연구와 일치하게, mIL-2/CD25 단독요법은 Treg 및 Treg 상의 CD25 MFI의 백분율을 증가시켰다 (도 7D 및 7E). 중요하게는, 프레드니솔론의 공동-처리는 Treg 또는 Treg 상의 CD25 MFI의 백분율을 증가시키는 데 있어서 mIL-2/CD25의 효과를 방해하지 않았다 (도 6D 및 6E). 이들 데이터는 IL-2/CD25 요법이 Treg의 수를 증가시키고 SLE 환자에서 질환 진행을 잠재적으로 억제하는 데 있어서 그의 효능을 상실하지 않으면서 표준 관리 스테로이드 요법과 효과적으로 조합될 수 있음을 시사한다.
MRL/lpr 루푸스 모델에서의 mIL-2/CD25
mIL-2/CD25를 또한 루푸스의 또 다른 뮤린 모델인 MRL/lpr에서 평가하였다. 이 모델에서, 면역 세포의 체크되지 않은 이상 증식은 자발적 자가면역 루푸스-유사 증후군으로 이어진다. 12주 동안 0.1, 0.2, 또는 0.4 mg/kg 2x/주로 s.c. 투여된 mIL-2/CD25 (군당 n = 10)는 단백뇨의 악화 (도 9A), 자가-항체 생산 (도 9B), 및 신장 염증 및 손상 (도 9C)을 예방하였다. NZB x NZW 연구에서의 데이터와 유사하게, 0.2 mg/kg 내지 0.4 mg/kg의 용량 범위는 상기 3가지 종점 모두에서 최대 효능을 달성하였다. 다시, 혈액 및 비장 (각각의 군으로부터 n = 4)을 연구의 완료 시 (제1 투여 12주 후, 마지막 투여 48시간 후) 유동 세포측정법을 위해 수집하였다. mIL-2/CD25 처리는 혈액 및 비장 둘 다에서 CD4+ 게이트에서의 Treg (CD4+CD25+Foxp3+)의 백분율을 용량 의존적으로 증가시켰다. 혈액에서, 퍼센트 Treg는 PBS 군에서 4.0 ± 0.8% (평균 ± SEM)로부터 각각 0.1, 0.2, 및 0.4 mg/kg 용량 군에서 14.3 ± 2.3%, 21.9 ± 6.2%, 및 28.1 ± 5.5%로 유의하게 증가하였다 (도 9D). 유사하게, 모든 용량에서 비장 Treg의 증가가 있었다 (도 9E). 도 9F에 나타낸 바와 같이, CD4+CD25+Foxp3+ 게이트에서의 CD25 MFI는 PBS 군에서 1842 ± 118 (평균 ± SEM)로부터 각각 0.1, 0.2, 및 0.4 mg/kg mIL-2/CD25 처리 군에서 3301 ± 470, 6185 ± 713, 및 6863 ± 680으로 유의하게 증가하였다. 결론적으로, mIL-2/CD25는 Treg의 수 및 Treg 상의 CD25 발현을 증가시킴으로써 MRL/lpr 마우스에서 질환 진행을 억제한다.
논의
활성 SLE의 관리는 질환의 이종 성질로 인해 도전과제이다 (Franklyn, et al., Nat Rev Rheumatol. 10: 567-71 (2014); Tsokos, N Engl J Med. 365: 2110-21 (2011)). 활성 SLE의 현행 요법은 주로 질환 활성을 감소시키기 위해 코르티코스테로이드 및 면역억제제에 의존한다. 그러나, 이들 약물은 완전히 효과적이지는 않고, 따라서 결과는 유의한 유해 효과, 특히 치료-관련 감염에 의해 추가로 상쇄된다 (Goldblatt, et al., Lupus 18: 682-89 (2009); Kang et al., Curr Opin Rheumatol. 15: 528-34 (2003); Bruce, et al., Lupus 25: 699-709 (2016)). Treg는 SLE 발병기전에서 다수의 중요한 세포 유형 및 경로의 광범위한 상류 제어를 제공하고, 이는 Treg 조정을 다른 SLE 임상 파이프라인 애셋과 구별짓는다. Treg의 주요 표적이 이펙터 T 세포 활성인 한편, 면역 반응의 Treg 제어는 NK 및 NK T 세포, B 세포 및 대식세포/항원 제시 세포에 영향을 미치고 조직 복구를 추가로 촉진하는 잠재력을 포함하여 T 이펙터 세포를 넘어선다 (Abbas, et al., Sci Immunol. 3 (2018); Dutcher et al., J Immunother Cancer. 2:26 (2014); Li et al., Front Immunol. 9: 585 (2018); Tiemessen et al., Proc Natl Acad Sci USA 104: 19446-51 (2007); Williams et al., Nature 441: 890-3 (2007)). SLE 연구를 포함한 다수의 임상 시험에서의 유망한 예비 결과에 기초하여, 염증 및 자가면역을 억제하기 위해 T 조절 기능을 촉진하기 위한 저용량 IL-2 요법의 사용이 주목을 받아왔다 (Castela et al., JAMA Dermatol. 150: 748-51 (2014); Saadoun et al., N Engl J Med. 365: 2067-77 (2011), Abbas et al., Sci Immunol. 3 (2018); von Spee-Mayer et al., Ann Rheum Dis. 75: 1407-15 (2016); He et al., Nat Med. 22: 991-3 (2016); Churlaud et al., J Allergy Clin Immunol 142: 1344-6 (2018); Rosenzwajg et al., J Autoimmun. 58: 48-58 (2015); Rosenzwajg et al., Ann Rheum Dis. 78: 209-17 (2019)). 11종의 자가면역 질환에 걸친 저용량 IL-2의 예비 결과는 이러한 접근법에 의한 광범위한 유용성에 대한 잠재력을 입증하였다 (Rosenzwajg et al., Ann Rheum Dis. 78: 209-17 (2019)).
절단불가능한 링커를 갖는 CD25에 융합된 IL-2로 이루어진 장기 작용 IL-2 수용체 효능제는 마우스에서 생체내 혈청 반감기 및 Treg 선택성과 관련하여 재조합 IL-2에 비해 개선을 입증하였다 (Ward et al., J Immunol. 201: 2579-92 (2018)). mIL-2/CD25 융합 단백질은 용액 중 자기-차단 불활성 동종-이량체 분자로서 우세하게 존재하는 독특한 작용 메카니즘 (MOA)을 갖는다. CD25-발현 Treg에 의한 해리 및 포획을 통한 활성 단량체의 느린 방출은 세포 활성화 및 증식으로 이어진다 (Ward et al., J Immunol. 201: 2579-92 (2018)). 이 MOA는 부분적으로는 분자가 불활성 이량체 형태로 순환함에 따라 표적 매개 클리어런스 (TMDD)를 회피하는 분자의 능력으로 인해, 분자가 IL-2 수용체 효능작용을 전달하는 다른 메카니즘으로 달성되지 않은 약동학적 (PK) 및 약역학적 (PD) 연장을 달성할 수 있게 한다. 본원에 제시된 바와 같이, mIL-2/CD25는 루푸스 및 루푸스 신염의 2가지의 흔한 모델인 NZB x NZW 및 MRL/lpr 마우스 둘 다에서 장기간 PK (T1/2: 20.6시간) 및 Treg에 대한 바람직한 Treg 확장/CD25 상향조절을 갖는다. 또한, NZB x NZW 모델로부터의 Treg의 분석은 IL-2 결핍의 마커인 SLE 환자로부터의 관찰과 유사하게 감소된 Treg CD25 수준을 입증하였다. 결과는 NZB x NZW 모델이 인간 질환에서 관찰된 Treg 기능장애의 요소를 재현함을 시사한다. mIL-2/CD25는 이 모델에서 명백한 IL-2 결핍을 역전시켜 Treg 수 및 CD25 발현 둘 다의 증가를 유도하였다.
mIL-2/CD25로 관찰된 Treg 유도 및 활성화는, 심지어 NZB x NZW 마우스가 진행성 질환의 징후를 나타냈을 때 치료가 개시된 경우에도, 감소된 단백뇨 수준, 자가항체 역가 및 신장 조직학 점수에 의해 판단된 바와 같은 질환 진행의 유의한 감소를 유도한다. 본원에서 시험된 용량은 비-Treg 세포 또는 염증유발 시토카인 생산을 활성화시키지 않는다. 중요하게는, 용량 반응 관계는 유의하고 지속적인 Treg 증가가 이 모델에서 최대 효능에 요구됨을 시사하고, 강건하고 지속적이지만 선택적인 Treg 증가가 인간 질환에서 최대 효능에 요구될 것임을 시사한다.
코르티코스테로이드는, 특히 갑작스런 재발을 치료하기 위해, 여전히 루푸스 치료의 중심이다. 코르티코스테로이드는 T 세포 반응을 억제하는 것으로 공지되어 있지만; Treg는 T 이펙터 세포보다 스테로이드 치료에 덜 감수성일 수 있다 (Prenek, et al., Apoptosis 25: 715-29 (2020)). 본원에서 입증된 바와 같이, mIL-2/CD25 처리는 저용량 스테로이드와 조합되는 경우에도 Treg를 증가시키고 질환을 개선시킬 수 있다. 조합 치료는 어느 하나의 단독요법에 비해 대부분의 효능 판독치에서 개선을 가져온다. 이들 결과는 개선된 효능을 달성하는 SLE 표준 관리와 예컨대 mIL2/CD25 처리에 의해 제공되는 지속적이고 선택적인 IL-2R Treg 효능작용의 조합의 잠재적 임상 유용성을 시사한다.
지금까지, 개발된 인간 IL-2/CD25 융합 단백질은 규정된 용량에서 시노몰구스 원숭이에서 장기간 및 선택적 Treg 활성화를 나타낸다 (결과는 미공개). 인간 IL-2/CD25는 PK, PD (Treg), 안전성 및 내약성의 평가를 위해 임상 시험에서 시험될 것이다. Treg 집단에서 IL-2 결핍을 갖는 SLE 환자를 선택적으로 표적화하는 가설은 임상에서 조사될 것이다. 임상 효능 뿐만 아니라 스테로이드 절약 및 장기간 완화를 제공하는 이러한 메카니즘에 대한 잠재력은 향후 연구에서 여전히 나타나고 있다.
물질 및 방법
시약:
mIL-2/CD25는 IL-2의 C 말단과 CD25의 세포외 영역의 N 말단 사이에 12개의 아미노산으로 이루어진 링커로 뮤린 IL-2를 뮤린 IL-2 수용체 알파 서브유닛 (CD25)과 조합한 융합 단백질이다. mIL-2/CD25 융합 단백질은 비공유 자기-차단 이량체를 형성한다. 생화학적 평가는 이량체가 수용체에 결합하지 않고, 따라서 표적-매개 약물 배치로부터 보호된다는 것을 뒷받침한다. 느린 해리는 IL-2R의 활성화를 유발하는 저용량의 활성 단량체를 생성한다 (Ward et al., J Immunol. 201: 2579-92 (2018)). 프레드니솔론 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스)은 대조군 화합물로서 사용되는 항염증 스테로이드 의약이다.
마우스 연구에서 유동 세포측정법을 위한 항체 패널은 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)로부터의 CD4-V500 (클론 RM4-5), pSTAT5-AF488 (클론 47/Stat5 pY694), 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)으로부터의 CD8-PerCP-Cy5.5 (클론 53-6.7), CD25-PE (클론 PC61.5), Foxp3-ef450 (클론 FJK-16s), 및 바이오레전드로부터의 CD335-BV605 (클론 29A1.4), Ki67-APC (클론 16A8)를 포함한다.
마우스:
암컷 NZB x NZW F1, 암컷 BALB/c, 및 수컷 MRL/lpr 마우스는 잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories) (메인주 바 하버)로부터의 것이었다. 모든 절차는 BMS 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다.
단백뇨 모니터링:
처리 군으로의 무작위화 전에, 알부스틱스(Albustix) (지멘스(Siemens), 독일 뮌헨)를 사용하여 마우스를 알부스틱스 스트립 상에서 방뇨하도록 유도함으로써 단백뇨에 대해 마우스를 평가하였다. 미량-30 mg/dL에 상응하는 단백뇨 수준 판독치를 갖는 마우스를 초기 질환에서의 효능의 평가를 위한 연구에 포함시켰다. 초기 질환 연구에 등록된 마우스의 전형적인 연령은 NZB x NZW 마우스의 경우 21-23주 및 MLR/lpr 마우스의 경우 12-14주이다. 100 mg/dL 초과의 단백뇨 수준을 갖는 NZB x NZW 마우스 (약 27주령)를 진행성 질환에서의 효능의 평가를 위한 연구에 포함시켰다. 마우스를 연구 지속기간 동안 2-3주마다 단백뇨의 존재에 대해 계속 모니터링하였다. 단백뇨를 제조업체의 지침에 따라 하기와 같이 점수화하였다: 미량: 0.5; ≥30 mg/dL: 1; ≥100 mg/dL: 2; ≥300 mg/dL: 3; ≥2000 mg/dL: 4.
마우스 투여
마우스에게 PBS 비히클 중 주사당 200 μL의 투여 부피로 1주 2회 mIL-2/CD25를 피하로 (s.c.) 주사하였다. 프레드니솔론이 제공된 마우스에게 물 중에 용해된 10 mL/kg의 투여 부피로 10 mg/kg을 1주 3회 경구로 (p.o.) 투여하였다.
혈청 항체 역가
마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 연구 동안 2-3주마다 채혈하였다. 연구의 완료 시, 혈청을 ELISA에 의해 항-dsDNA 자가항체의 존재에 대해 시험하였다. 진행성 루푸스를 갖는 MRL/lpr 마우스로부터 풀링한 혈청을 각각의 검정에서 양성 비교자로서 사용하였다. 자가항체 수준을 양성 대조군 혈청으로 생성된 표준 곡선에 기초하여 임의의 단위로 정량화하였다. IL-12p40 혈청 단백질 수준을 제조업체의 지침에 따라 비디 바이오사이언시스로부터의 IL-12p40 ELISA 키트를 사용하여, 10주의 mIL-2/CD25 투여의 종료 시에 취한 혈청으로부터 측정하였다.
조직학
연구의 종결 시, 각각의 동물로부터의 1개의 신장을 절제하고, 72시간 동안 10% NBF 중에 침지 고정시키고, 완전 고정 시, 횡방향으로 트리밍하고, 상용적으로 파라핀 포매 가공하고 (RPPE), H&E 염색을 위해 4 μm로 및 PASH 염색을 위해 3 μm로 절편화하였다. 신염의 현미경 분석을 위해 단일-맹검 방식으로 훈련된 조직병리학자에 의해 슬라이드를 평가하였다. 사구체 신염 (GN) 및 세뇨관-간질성 신염 (TIN)을 관련 병리상태를 개별적으로 평가하는 반-정량적 0-4 척도를 사용하여 점수화하였다. GN을 메산지움에 대한 변화, 세포 캐스트 형성, 사구체 다발에서의 단핵 세포 침윤, 및 보우만 주머니의 섬유경화증에 대해 점수화하였다. TIN을 세뇨관내강 침윤, 세뇨관 상피 세포 재생, 단백질 캐스트, 간질성 섬유증, 및 단핵 세포 침윤에 대한 변화에 대해 점수화하였다. 이론적 최대 총 신염 점수는 36이었다.
혈액 및 비장 제조 및 염색
혈액 샘플을 헤파린 튜브에 수집한 다음, 즉시 용해시키고, 37℃에서 10분 동안 1X BD FACS 용해 용액으로 고정시켰다. 세포를 PBS로 1회, 이어서 2% FBS를 함유하는 PBS로 2회 세척한 후, 빙냉 메탄올을 사용하여 4℃에서 30분 동안 투과화하였다. 이어서, 샘플을 2회 세척하여 염색을 위해 과량의 메탄올을 제거하였다.
PBS 중에 수집된 비장 샘플을 젠틀맥스(gentleMACS)™를 사용하여 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 제조한 다음, 70 μM 스트레이너로 여과하였다. ACK 용해 완충제를 사용하여, 적혈구를 용해시키고, 세포 현탁액을 40 μM 스트레이너로 1회 더 여과하였다. 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS 중에 재현탁시키고, 1 x 106개 세포를 37℃에서 10분 동안 1.5% 파라포름알데히드를 사용하여 직접 고정시켰다. 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS로 세척한 후, 4℃에서 30분 동안 빙냉 메탄올을 사용하여 투과화하였다. 이어서, 샘플을 2회 세척하여 과량의 메탄올을 제거한 후에 염색하였다.
제조된 혈액 또는 비장 샘플을 CD16/CD32 모노클로날 항체 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 차단한 후, 세포 표면 (CD4/CD8/CD25/CD335) 및 세포내 (Foxp3/Ki67/pSTAT5) 마커로 4℃에서 45분 동안 동시에 염색하였다. BD 칸토 X 유동 세포측정기를 사용하여 샘플을 획득하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리스타(TreeStar))를 사용하여 데이터를 분석하였다.
신장 RT-PCR
연구의 완료 시, 각각의 마우스로부터의 1개의 신장을 RNA 레이터(Later) 중에 수집한 후, 조직 용해기가 있는 mRNA 캐처(Catcher) 용해 완충제 중에 균질화하였다. mRNA를 mRNA 캐쳐 플러스(Catcher PLUS)를 사용하여 제조업체의 프로토콜 (인비트로젠(Invitrogen))에 따라 정제하였다. cDNA를 랜덤 육량체 프라이머와 함께 슈퍼스크립트(SuperScript) II를 사용하여 합성하였다. PCR을 SYBR 그린 마스터 믹스 (인비트로젠)로 수행하였다. 하우스키핑 유전자로서 시클로필린 (PPIA)을 사용하는 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 상대 정량화 분석을 결정하였다. 염증성 시토카인 및 백혈구 표면 수용체의 발현을 분석하였다.
프라이머 쌍:
Ifit1: 5'-AGAGCAGAGAGTCAAGGCAGGT-3' (서열식별번호: 35); 5'-TGGTCACCATCAGCATTCTCTCCCA-3' (서열식별번호: 36)
Ifit3: 5'-GCTCAGCCCACACCCAGCTTT-3' (서열식별번호: 37); 5'-AGATTCCCGGTTGACCTCACTCAT-3' (서열식별번호: 38)
Mx1: 5'-ACTACCAGGAGTGCAGACGGAA-3' (서열식별번호: 39); 5'-TCCTCCAGGAACCAGCTGCACTTA-3' (서열식별번호: 40)
Irf7: 5'-GAGTCTGGGGCAGACCCCGT-3' (서열식별번호: 41); 5'-CTGCGCTCGGTGAGAGCTGG-3' (서열식별번호: 42)
Gbp2: 5'-AGCTGCTAAACTTCGGGAACAGGA-3' (서열식별번호: 43); 5'-AGAGGTTTGGGCCTTGGGCCT-3' (서열식별번호: 44)
Ligp1: 5'-GGACACAGGAGTTTCTGTGCCTTT-3' (서열식별번호: 45); 5'-AGGTGAAGAGAACAGCTGACCCA-3' (서열식별번호: 46)
약동학
mIL-2/CD25의 혈청 수준을 제1 용량 (0.1, 0.2 또는 0.4 mg/kg s.c.) 후에 NZB x NZW F1 마우스에서 결정하였다. 혈액 샘플 (0.1 mL)을 복합 샘플링 (시점당 4마리의 마우스)을 사용하여 용량 24, 48 및 80시간 후에 피하 채혈에 의해 수득하였다. 혈액 샘플을 응고시키고, 4℃ (1500 내지 2000 x g)에서 원심분리하여 혈청을 수득하였다. 화학발광 플랫폼 상에서 리간드 결합 검정에 의해 분석할 때까지 혈청 샘플을 -80℃에서 저장하였다. mIL-2/CD25의 약동학적 파라미터 (AUC, Cmax, Tmax 및 반감기)를 혈청 농도 대 시간 데이터의 비-구획 분석에 의해 수득하였다 (피닉스 윈논린(Phoenix WinNonlin), 버전 6.4, 세르타라 유에스에이, 인크.(Certara USA, Inc.), 뉴저지주 프린스턴).
혈청 중 mIL-2/CD25의 정량화를 위한 리간드 결합 검정
샘플, 표준물 및 품질 대조군을 1% BSA를 함유하는 PBS 중 33% 마우스 혈청의 최종 매트릭스 농도로 만들었다. 간략하게, 96 웰 흑색 플레이트를 PBS 중 1.0 μg/mL의 래트 항마우스 CD25 (이바이오사이언스(eBioscience) - 클론: PC61.5)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 1시간 동안 PBS/트윈/20% 카세인으로 차단한 후, 혈청과 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. mIL-2/CD25를 비오티닐화 래트 항-마우스 IL-2 (이바이오사이언스 - 클론: JES6-SH4), 뉴트라비딘(NeutrAvidin) -양고추냉이 퍼옥시다제 (써모 사이언티픽) 및 피코 화학발광 기질 용액 (써모 사이언티픽)과의 순차적 인큐베이션에 의해 검출하였다. 플레이트를 스펙트라맥스(SpectraMax) 플레이트 판독기에서 발광 모드로 판독하였다. 마우스 혈청 중 mIL-2/CD25의 농도를 mIL-2/CD25 보정물로부터 생성된 로그-로그 선형 보정 곡선 (소프트맥스 분석 프로그램, 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))을 사용하여 발광 강도로부터 계산하였다. 검정 LLOQ는 25 pg/mL였다.
개요 및 요약서 섹션이 아닌 상세한 설명 섹션은 청구범위를 해석하는 데 사용되는 것으로 의도됨이 인지되어야 한다. 개요 및 요약서 섹션은 본 발명자(들)에 의해 고려된 바와 같은 본 발명의 1개 이상의 예시적인 측면 또는 실시양태를 제시하지만 본 발명의 모든 예시적인 측면을 제시할 수 있는 것은 아니므로, 본 발명 및 첨부된 청구범위를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명은 명시된 기능 및 그의 관계의 구현을 예시하는 기능적 빌딩 블록의 도움으로 상기 기재되었다. 이들 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본원에서 임의로 정의되었다. 명시된 기능 및 그의 관계가 적절하게 수행되는 한, 대안적 경계가 정의될 수 있다.
구체적 측면 또는 실시양태의 상기 설명은 본 발명의 일반적 성질을 충분히 밝힐 것이며, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야의 기술 내의 지식을 적용함으로써 본 발명의 일반적 개념에서 벗어나지 않으면서 과도한 실험 없이도 이러한 구체적 측면 또는 실시양태를 다양한 적용에 용이하게 변형 및/또는 적합화할 수 있다. 따라서, 이러한 적합화 및 변형은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여, 개시된 측면 또는 실시양태의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원의 어구 또는 용어는 설명을 위한 것이며 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 하며, 그에 따라 본 명세서의 용어 또는 어구는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 교시 및 지침에 비추어 해석되어야 한다.
본 발명의 폭 및 범주는 상기 기재된 예시적인 측면 또는 실시양태 중 어떠한 것에 의해서도 제한되어서는 안되며, 단지 하기 청구범위 및 그의 등가물에 따라 정의되어야 한다.
본 출원의 청구범위는 모 출원 또는 다른 관련 출원의 것들과 상이하다. 따라서, 본 출원인은 본 출원과 관련하여 모 출원 또는 임의의 선행 출원에서 이루어진 청구항 범위의 임의의 부인을 철회한다. 따라서, 임의의 이러한 이전의 부인 및 취소되었던 인용된 참고문헌을 재고할 필요가 있을 수 있음을 심사관에게 알리는 바이다. 추가로, 본 출원에서 이루어진 임의의 부인이 모 출원으로 또는 그에 반하여 해석되어서는 안된다는 것을 또한 심사관에게 상기시키는 바이다.
서열 목록 표
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY <120> FUSION PROTEINS FOR THE TREATMENT OF DISEASE <130> 3338.234PC02 <150> US 63/123,991 <151> 2020-12-10 <150> US 63/198,615 <151> 2020-10-29 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2Ralpha (human, mature form of IL2Ralpha extracellular domain) <400> 1 Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys 1 5 10 15 Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg 20 25 30 Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly 35 40 45 Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser 50 55 60 Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln 65 70 75 80 Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp 85 90 95 Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn 100 105 110 Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr 115 120 125 Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala 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Gln Ser Met 100 105 110 His Gln Glu Asn Leu Thr Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Lys 115 120 125 His Glu Asp Ser Lys Arg Ile Tyr His Phe Val Glu Gly Gln Ser Val 130 135 140 His Tyr Glu Cys Ile Pro Gly Tyr Lys Ala Leu Gln Arg Gly Pro Ala 145 150 155 160 Ile Ser Ile Cys Lys Met Lys Cys Gly Lys Thr Gly Trp Thr Gln Pro 165 170 175 Gln Leu Thr Cys Val Asp Glu Arg Glu His His Arg Phe Leu Ala Ser 180 185 190 Glu Glu Ser Gln Gly Ser Arg Asn Ser Ser Pro Glu Ser Glu Thr Ser 195 200 205 Cys Pro Ile Thr Thr Thr Asp Phe Pro Gln Pro Thr Glu Thr Thr Ala 210 215 220 Met Thr Glu Thr Phe Val Leu Thr Met Glu Tyr Lys Val Ala Val Ala 225 230 235 240 Ser Cys Leu Phe Leu Leu Ile Ser Ile Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr 245 250 255 Trp Gln His Arg Trp Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile 260 265 <210> 14 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2Ralpha (mouse, mature form of IL2Ralpha extracellular domain) <400> 14 Glu Leu Cys Leu Tyr Asp Pro Pro Glu Val Pro Asn Ala Thr Phe Lys 1 5 10 15 Ala Leu Ser 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<220> <223> Linker sequence <400> 15 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> glycine linker <400> 16 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> glycine linker <400> 17 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine Linker <400> 18 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine Linker <400> 19 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 <210> 20 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine Linker <400> 20 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine Linker <400> 21 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine Linker <400> 22 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 23 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine Linker <400> 23 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine Linker <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine Linker <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine Linker <400> 26 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 27 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine Linker <400> 27 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 28 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine Linker <400> 28 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 29 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2(21-153)-(G3S)3-CD25(22-240) <400> 29 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe 145 150 155 160 Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr 180 185 190 Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser 195 200 205 Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu 210 215 220 Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val 225 230 235 240 Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu 245 250 255 Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val 260 265 270 Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala 275 280 285 Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro 290 295 300 Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu 305 310 315 320 Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser 325 330 335 Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala 340 345 350 Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln 355 360 <210> 30 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2-CD25(22-187) <400> 30 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe 145 150 155 160 Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr 180 185 190 Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser 195 200 205 Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu 210 215 220 Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val 225 230 235 240 Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu 245 250 255 Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val 260 265 270 Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala 275 280 285 Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro 290 295 300 Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu 305 310 <210> 31 <211> 331 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NativeSigPep-IL2-CD25(22-187) <400> 31 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro 165 170 175 His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn 180 185 190 Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr 195 200 205 Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys 210 215 220 Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro 225 230 235 240 Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro 245 250 255 Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro 260 265 270 Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val 275 280 285 Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His 290 295 300 Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg 305 310 315 320 Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu 325 330 <210> 32 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NativeSigPep-HuIL2-CD25(22-212)-PP <400> 32 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro 165 170 175 His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn 180 185 190 Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr 195 200 205 Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys 210 215 220 Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro 225 230 235 240 Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro 245 250 255 Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro 260 265 270 Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val 275 280 285 Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His 290 295 300 Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg 305 310 315 320 Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln 325 330 335 Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu 340 345 350 Ser Glu Thr Ser Pro Pro 355 <210> 33 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2-CD25(22-187) <400> 33 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe 145 150 155 160 Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr 180 185 190 Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser 195 200 205 Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu 210 215 220 Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val 225 230 235 240 Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu 245 250 255 Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val 260 265 270 Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala 275 280 285 Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro 290 295 300 Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu 305 310 <210> 34 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2-T23A-C145S-CD25(22-187) <400> 34 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe 145 150 155 160 Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr 180 185 190 Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser 195 200 205 Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu 210 215 220 Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val 225 230 235 240 Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu 245 250 255 Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val 260 265 270 Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala 275 280 285 Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro 290 295 300 Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu 305 310 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ifit1 <400> 35 agagcagaga gtcaaggcag gt 22 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ifit1 <400> 36 tggtcaccat cagcattctc tccca 25 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ifit3 <400> 37 gctcagccca cacccagctt t 21 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ifit3 <400> 38 agattcccgg ttgacctcac tcat 24 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mx1 <400> 39 actaccagga gtgcagacgg aa 22 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mx1 <400> 40 tcctccagga accagctgca ctta 24 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Irf7 <400> 41 gagtctgggg cagaccccgt 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Irf7 <400> 42 ctgcgctcgg tgagagctgg 20 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gbp2 <400> 43 agctgctaaa cttcgggaac agga 24 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Gbp2 <400> 44 agaggtttgg gccttgggcc t 21 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ligp1 <400> 45 ggacacagga gtttctgtgc cttt 24 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ligp1 <400> 46 aggtgaagag aacagctgac cca 23

Claims (46)

  1. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 인터류킨-2 (IL2) 융합 단백질의 용량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 여기서 융합 단백질은:
    (a) IL2 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (b) 인터류킨-2 수용체 알파 (IL2Rα) 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드
    를 포함하며,
    여기서 (i) IL2Rα 폴리펩티드의 세포외 도메인은 천연 IL2Rα의 세포외 도메인 (서열식별번호: 1)과 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖고/거나; (ii) IL2 폴리펩티드는 천연 IL2 (서열식별번호: 2)와 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖고;
    여기서 용량은 약 0.1 mg 내지 약 9 mg인
    방법.
  2. 제1항에 있어서, 융합 단백질이 국소, 표피, 점막, 비강내, 경구, 질, 직장, 설하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 또는 흉골내 경로를 통해 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 융합 단백질이 정맥내 경로를 통해 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 용량이 약 0.3 mg 내지 약 9 mg인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 용량이 약 3 mg 내지 약 9 mg인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 용량이 약 6 mg 내지 약 9 mg인 방법.
  7. 제3항에 있어서, 용량이 약 0.1 mg 내지 약 3 mg인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 용량이 약 0.1 mg 내지 약 1 mg인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 용량이 약 0.1 mg 내지 약 0.3 mg인 방법.
  10. 제3항에 있어서, 용량이 약 0.3 mg 내지 약 6 mg인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 용량이 약 1 mg 내지 약 3 mg인 방법.
  12. 제3항에 있어서, 용량이 약 9 mg 초과인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 융합 단백질이 피하 경로를 통해 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 용량이 약 1 mg 내지 약 8 mg인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 용량이 약 3 mg 내지 약 8 mg인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 용량이 약 6 mg 내지 약 8 mg인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 용량이 약 1 mg 내지 약 6 mg인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 용량이 약 1 mg 내지 약 3 mg인 방법.
  19. 제14항에 있어서, 용량이 약 3 mg 내지 약 6 mg인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 용량이 약 1 mg, 약 3 mg, 약 6 mg 또는 약 8 mg인 방법.
  21. 제13항에 있어서, 용량이 약 8 mg 초과인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 용량 중 2회 이상이 2회 용량 사이의 투여 간격으로 투여되는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 투여 간격이 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주, 적어도 약 8주, 적어도 약 2개월, 적어도 약 9주, 적어도 약 10주, 적어도 약 11주, 적어도 약 12주, 또는 적어도 약 3개월인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 투여 간격이 적어도 약 3주인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 투여 간격이 약 3주인 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 간격이 용량 전반에 걸쳐 동일한 것인 방법.
  27. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 간격이 용량 전반에 걸쳐 상이한 것인 방법.
  28. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 2회 이상의 용량 중 적어도 1회가 정맥내로 투여되고, 2회 이상의 용량 중 적어도 1회가 피하로 투여되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 정맥내로 투여되는 용량이 피하로 투여되는 용량 전에 제공되는 것인 방법.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용량이 정맥내로 투여되고, 최종 용량이 피하로 투여되는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애가 감염성 질환 또는 면역-매개 질환인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 면역-매개 질환이 염증성 질환 또는 자가면역 질환인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 면역-매개 질환이 제1형 당뇨병; 다발성 경화증; 류마티스 관절염; 복강 질환; 전신 홍반성 루푸스; 루푸스 신염; 피부 루푸스; 소아 특발성 관절염; 크론병; 궤양성 결장염; 전신 경화증; 이식편 대 숙주 질환 (GvHD); 건선; 원형 탈모증; HCV-유발 혈관염; 쇼그렌 증후군; 천포창; 강직성 척추염; 베체트병; 베게너 육아종증; 다카야스병; 자가면역 간염; 경화성 담관염; 고제로트-쇼그렌(Gougerot-sjoegren); 염증성 장 질환; 면역 조절이상, 다발내분비병증, 장병증, X-연관 (IPEX) 증후군; 및 대식세포 활성화 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 면역-매개 질환이 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 또는 피부 루푸스인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 면역-매개 질환이 전신 홍반성 루푸스인 방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 코르티코스테로이드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 코르티코스테로이드가 프레드니솔론인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 코르티코스테로이드가 국소, 경구, 정맥내 또는 근육내 경로를 통해 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 코르티코스테로이드가 융합 단백질의 각각의 용량 전에, 그와 공동으로, 또는 그 후에 투여되는 것인 방법.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 코르티코스테로이드의 2회 이상의 용량이 대상체에게 각각의 용량 사이의 투여 간격으로 투여되는 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, IL2Rα 폴리펩티드의 세포외 도메인이 천연 IL2Rα의 세포외 도메인 (서열식별번호: 1)과 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화, 적어도 2개 더 적은 글리코실화, 적어도 3개 더 적은 글리코실화, 적어도 4개 더 적은 글리코실화, 적어도 5개 더 적은 글리코실화, 적어도 6개 더 적은 글리코실화, 적어도 7개 더 적은 글리코실화, 적어도 8개 더 적은 글리코실화, 또는 적어도 9개 더 적은 글리코실화를 갖는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, IL2 폴리펩티드가 천연 IL2 (서열식별번호: 2)와 비교하여 적어도 1개 더 적은 글리코실화를 갖는 것인 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 서열식별번호: 2에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 서열식별번호: 3에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 서열식별번호: 4인 방법.
  46. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 서열식별번호: 3인 방법.
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