CN116761613A - 用于治疗疾病的融合蛋白 - Google Patents

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CN116761613A CN202180087683.7A CN202180087683A CN116761613A CN 116761613 A CN116761613 A CN 116761613A CN 202180087683 A CN202180087683 A CN 202180087683A CN 116761613 A CN116761613 A CN 116761613A
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Abstract

本文公开了治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用一个或多个剂量的白介素‑2(IL2)融合蛋白，其中所述剂量为约0.1mg至约9mg。本文还公开了治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的IL2融合蛋白，其中所述剂量大于约9mg。用于本文公开的方法的所述IL2融合蛋白包含：(a)含有IL2多肽的第一多肽；和(b)含有IL2受体(IL2R)α多肽的胞外结构域的第二多肽。在一些方面，所述疾病或障碍是免疫介导的疾病，如系统性红斑狼疮。在一些方面，所述方法进一步向所述受试者施用皮质类固醇。

Description

用于治疗疾病的融合蛋白
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求2020年10月29日提交的美国临时申请号63/198,615和2020年12月10日提交的美国临时申请号63/123,991的权益，将所述临时申请都通过引用以其整体并入本文。
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将与本申请一起提交的ASCII文本文件的电子提交的序列表(名称：3338.234PC02_SL_ST25.txt；大小：49,540字节；创建日期：2021年10月29日)的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开文本提供了通过施用一个或多个剂量的白介素-2(IL2)/IL2受体α融合蛋白来治疗受试者的疾病或障碍的方法。
背景技术
白介素-2(IL2或IL-2)是一种调节免疫系统的关键方面的生物细胞因子。已经使用IL-2尝试增强患有炎性疾病或自身免疫性疾病的患者的免疫应答。IL-2是一种有效的T细胞生长因子，其促进免疫应答(包括抗原激活的T细胞的克隆扩增)，驱动CD4+T辅助(Th)1和Th2细胞的发育，最终使得CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分化，并且阻止CD4+Th17和T滤泡辅助(Tfh)细胞的发育。IL-2还影响T细胞记忆回忆应答。
已经通过缺乏IL-2信号传导途径组分的小鼠或人中系统性自身免疫的出现证明了IL-2信号传导途径对Treg的重要性。调节性T细胞(Treg)数目和/或功能的调节异常已经牵涉众多免疫介导的病症。参见例如，Bluestone,J.A.等人,J Clin Invest.125:2250-60(2015)；以及Dominguez-Villar,M和Hafler,D.A.,Nat Immunol.19:665-73(2018)。已经通过全基因组关联研究(GWAS)鉴定出IL-2、IL-2Rα和IL-2Rβ基因座中的自身免疫风险变体，并且将其与包括炎性肠病(IBD)、1型自身免疫性糖尿病(T1DM)、多发性硬化(MS)和类风湿性关节炎(RA)在内的免疫介导的疾病相关联。参见例如，Abbas,A.K.等人,Sci Immunol.3,eaat1482(2018)。影响关键Treg谱系转录因子FoxP3的突变导致自身免疫性淋巴增殖性疾病X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调(IPEX)综合征，其由功能性Treg的丧失引起。另外，患有由IL-2RA突变引起的CD25缺乏症的患者患有类似于IPEX综合征的免疫失调。参见例如，Verbsky,J.W.和Chatila,T.,Curr Opin Pediatr.25(6):708-14(2013)。遗传学数据与IL-2在小鼠和人两者中的Treg功能和自身免疫抑制方面的核心作用一致。
由于IL-2对Treg的作用的重要性，低剂量的重组IL-2已经用于免疫介导的疾病的基于Treg的免疫抑制策略。参见例如，Saadoun,D.等人,N Engl J Med.365:2067-77(2011)；He,J.等人,Arthritis Rheumatol.67(增刊10)(2015)；Koreth,J.等人,N Engl JMed.365:2055-66(2011)；和Humrich,J.Y.等人Ann Rheum Dis.74:791-2(2015)。例如，系统性红斑狼疮(SLE)的特征在于IL-2缺乏状态，Treg显示出减弱的免疫调节能力。低剂量的IL-2已经在SLE患者中显示出令人鼓舞的临床益处；然而，由于需要每天注射并且观察到促炎性细胞因子和非Treg细胞增加，其临床实用性受到限制。相反，已经使用高剂量IL-2刺激经由T效应细胞进行的抗肿瘤免疫应答。参见例如，Rosenberg,S.A.,J Immunol.192:5451-8(2014)。
尽管这些临床研究取得了有希望的结果，但低剂量重组IL-2疗法受限于非常短的半衰期(数分钟)，必须频繁给药；以及小的激活非Treg效应的窗口，潜在地限制功效。因此，仍然需要具有改进的药代动力学和反应耐久性以用于例如在治疗感染性疾病和免疫介导的疾病(如SLE)中使用的新的IL2生物制剂。
发明内容
本公开文本的某些方面涉及一种治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用一个或多个剂量的白介素-2(IL2)融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：(a)含有IL2多肽的第一多肽，和(b)含有白介素-2受体α(IL2Rα)多肽的胞外结构域的第二多肽；其中(i)与天然IL2Rα的胞外结构域(SEQ ID NO:1)相比，所述IL2Rα多肽的胞外结构域至少少一个糖基化；和/或(ii)与天然IL2(SEQ ID NO:2)相比，所述IL2多肽至少少一个糖基化；其中一个或多个所述剂量为约0.1mg至约9mg。
在一些方面，将所述融合蛋白经由外用、表皮、粘膜、鼻内、口服、阴道、直肠、舌下、外用、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外或胸骨内途径施用至所述受试者。
在一些方面，将所述融合蛋白经由静脉内途径施用至所述受试者。在一些方面，将所述融合蛋白以约0.3mg至约9mg之间的剂量经由静脉内途径施用。
在一些方面，将所述融合蛋白按以下剂量经由静脉内途径施用至所述受试者：约1mg与约9mg之间、约2mg与约9mg之间、约3mg与约9mg之间、约4mg与约9mg之间、约5mg与约9mg之间、约6mg与约9mg之间、约7mg与约9mg之间、约8mg与约9mg之间、约1mg与约8mg之间、约2mg与约8mg之间、约3mg与约8mg之间、约4mg与约8mg之间、约5mg与约8mg之间、约6mg与约8mg之间、约7mg与约8mg之间、约1mg与约7mg之间、约2mg与约7mg之间、约3mg与约7mg之间、约4mg与约7mg之间、约5mg与约7mg之间、约6mg与约7mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的所述剂量在约3mg与约9mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的所述剂量在约6mg与约9mg之间。
在一些方面，将所述融合蛋白按以下剂量经由静脉内途径施用至所述受试者：约0.1mg与约6mg之间、约1mg与约6mg之间、约2mg与约6mg之间、约3mg与约6mg之间、约4mg与约6mg之间、或约5mg与约6mg之间、约1mg与约5mg之间、约2mg与约5mg之间、约3mg与约5mg之间、约4mg与约5mg之间、约1mg与约4mg之间、约2mg与约4mg之间、约3mg与约4mg之间、约1mg与约3mg之间、或约2mg与约3mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的所述剂量在约0.1mg与约3mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的所述剂量在约0.1mg与约1mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的所述剂量在约0.1mg与约0.3mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的所述剂量在约0.3mg与约6mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的所述剂量在约1mg与约3mg之间。
在一些方面，经由静脉内途径施用的所述剂量为约0.1mg、约0.3mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg或约9mg。
在一些方面，经由静脉内途径施用的所述剂量大于约9mg。
在一些方面，将所述融合蛋白经由皮下途径施用至所述受试者。在一些方面，将所述融合蛋白按以下剂量经由皮下途径施用至所述受试者：约1mg与约8mg之间、约2mg与约8mg之间、约3mg与约8mg之间、约4mg与约8mg之间、约5mg与约8mg之间、约6mg与约8mg之间、约7mg与约8mg之间、约1mg与约7mg之间、约2mg与约7mg之间、约3mg与约7mg之间、约4mg与约7mg之间、约5mg与约7mg之间、约6mg与约7mg之间、约1mg与约6mg之间、约2mg与约6mg之间、约3mg与约6mg之间、约4mg与约6mg之间、或约5mg与约6mg之间、约1mg与约5mg之间、约2mg与约5mg之间、约3mg与约5mg之间、约4mg与约5mg之间、约1mg与约4mg之间、约2mg与约4mg之间、约3mg与约4mg之间、约1mg与约3mg之间、或约2mg与约3mg之间。在一些方面，经由皮下途径施用的所述剂量在约3mg与约8mg之间。在一些方面，经由皮下途径施用的所述剂量在约6mg与约8mg之间。在一些方面，经由皮下途径施用的所述剂量在约1mg至约6mg之间。在一些方面，经由皮下途径施用的所述剂量在约1mg至约3mg之间。在一些方面，经由皮下途径施用的所述剂量在约3mg至约6mg之间。
在一些方面，经由皮下途径施用的所述剂量为约1mg、约3mg、约6mg或约8mg。
在一些方面，经由皮下途径施用的所述剂量大于约8mg。
在一些方面，所述方法包括在所述融合蛋白的两个剂量之间以一定给药间隔施用两个或更多个所述剂量的融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白的给药间隔为至少约一天、至少约两天、至少约三天、至少约四天、至少约五天或至少约六天。在一些方面，所述融合蛋白的给药间隔为至少约一周、至少约两周、至少约三周、至少约四周、至少约一个月、至少约五周、至少约六周、至少约七周、至少约八周、至少约两个月、至少约九周、至少约十周、至少约十一周、至少约十二周或至少约三个月。在一些方面，所述给药间隔为至少约三周。在一些方面，所述融合蛋白的给药间隔为约一天、约两天、约三天、约四天、约五天或约六天。在一些方面，所述融合蛋白的给药间隔为约一周、约两周、约三周、约四周、约一个月、约五周、约六周、约七周、约八周、约两个月、约九周、约10周、约11周、约12周或约三个月。在一些方面，所述融合蛋白的给药间隔为约三周。在一些方面，所述融合蛋白的给药间隔遍及所述剂量是相同的。在一些方面，所述融合蛋白的给药间隔遍及所述剂量是不同的。在一些方面，将所述两个或更多个剂量的融合蛋白中的至少一个静脉内施用，并且将所述两个或更多个剂量的融合蛋白中的至少一个皮下施用。在一些方面，将静脉内施用的所述剂量在皮下施用的所述剂量之前给予。在一些方面，将所述融合蛋白的第一剂量静脉内施用，并且将所述融合蛋白的第二(任何后续或最后)剂量皮下施用。
在一些方面，所述疾病或障碍是感染性疾病、免疫介导的疾病。在一些方面，所述免疫介导的疾病是炎性疾病或自身免疫性疾病。在一些方面，所述免疫介导的疾病选自：1型糖尿病；多发性硬化；类风湿性关节炎；乳糜泻；系统性红斑狼疮；狼疮性肾炎；皮肤狼疮；幼年型特发性关节炎；克罗恩病；溃疡性结肠炎；系统性硬化病；移植物抗宿主病(GvHD)；银屑病；斑秃；HCV诱导的血管炎；舍格伦综合征；天疱疮；强直性脊柱炎；白塞病；韦氏肉芽肿病；高安病；自身免疫性肝炎；硬化性胆管炎；古-斯综合征(Gougerot-)；炎性肠病；X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调(IPEX)综合征；和巨噬细胞活化综合征。在一些方面，所述免疫介导的疾病是系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎或皮肤狼疮。在一些方面，所述免疫介导的疾病是系统性红斑狼疮。
在一些方面，所述方法进一步包括向所述受试者施用皮质类固醇。在一些方面，所述皮质类固醇选自：泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、布地奈德、曲安西龙、可的松、去氧皮质酮、氟氢可的松和帕拉米松。在一些方面，所述皮质类固醇是泼尼松龙、甲泼尼龙或泼尼松。在一些方面，所述皮质类固醇是泼尼松龙。
在一些方面，将所述皮质类固醇经由外用、表皮、粘膜、鼻内、口服、阴道、直肠、舌下、外用、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外或胸骨内途径施用至所述受试者。在一些方面，将所述皮质类固醇经由外用、口服、静脉内或肌内途径施用至所述受试者。
在一些方面，在所述融合蛋白的所述的每一个剂量之前、同时或之后施用所述皮质类固醇。在一些方面，在所述融合蛋白的所述的每一个剂量之前施用所述皮质类固醇。在一些方面，与所述融合蛋白的所述的每一个剂量同时施用所述皮质类固醇。在一些方面，在每个剂量之间以一定给药间隔将两个或更多个剂量的所述皮质类固醇施用至所述受试者。在一些方面，所述皮质类固醇的给药间隔为至少约一天、至少约两天、至少约三天、至少约四天、至少约五天、至少约六天、至少约一周、至少约两周、至少约三周、至少约四周、至少约一个月、至少约五周、至少约六周、至少约七周、至少约八周、至少约两个月、至少约九周、至少约十周、至少约十一周、至少约十二周或至少约三个月。在一些方面，所述皮质类固醇是泼尼松龙，其中将所述融合蛋白一周两次皮下施用至所述受试者，并且其中将所述泼尼松龙一周三次口服施用至所述受试者。
在一些方面，与天然IL2Rα的胞外结构域(SEQ ID NO:1)相比，所述IL2Rα多肽的胞外结构域至少少一个糖基化、至少少两个糖基化、至少少三个糖基化、至少少四个糖基化、至少少五个糖基化、至少少六个糖基化、至少少七个糖基化、至少少八个糖基化或至少少九个糖基化。
在一些方面，与天然IL2(SEQ ID NO:2)相比，所述IL2多肽至少少一个糖基化。
在一些方面，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些方面，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些方面，至少少一个糖基化的所述IL2Rα多肽的胞外结构域包含去除糖基化的突变。在一些方面，所述突变去除O-糖基化和/或N-糖基化。在一些方面，所述突变去除O-糖基化。在一些方面，所述突变去除N-糖基化。在一些方面，所述突变是对应于SEQ ID NO:1的氨基酸167至219、氨基酸168至219、氨基酸169至219、氨基酸170至219、氨基酸171至219、氨基酸172至219、氨基酸173至219、氨基酸174至219、氨基酸175至219、氨基酸176至219、氨基酸177至219、氨基酸178至219、氨基酸179至219、氨基酸180至219、氨基酸181至219、氨基酸182至219、氨基酸183至219、氨基酸184至219、氨基酸185至219、氨基酸186至219、氨基酸187至219、氨基酸188至219、氨基酸189至219、氨基酸190至219、氨基酸191至219或氨基酸192至219的缺失。
在一些方面，所述第二多肽是SEQ ID NO:4。在一些方面，所述第二多肽是SEQ IDNO:3。
在一些方面，所述突变是用未糖基化的氨基酸对糖基化的氨基酸的一个或多个取代。在一些方面，所述一个或多个取代是在氨基酸N49、氨基酸N68、氨基酸T74、氨基酸T85、氨基酸T197、氨基酸T203、氨基酸T208和氨基酸T216或其任何组合处，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1。在一些方面，所述一个或多个取代是从苏氨酸到选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，所述取代中的一个是氨基酸T85。在一些方面，使T85突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，所述取代中的一个是氨基酸T197。在一些方面，使T197突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，所述取代中的一个是氨基酸T203。在一些方面，使T203突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，所述取代中的一个是氨基酸T208。在一些方面，使T208突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，所述取代中的一个是氨基酸T216。在一些方面，使T216突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，所述突变是用在附近氨基酸处不允许糖基化的氨基酸对在附近氨基酸处允许糖基化的氨基酸的一个或多个取代。在一些方面，所述一个或多个取代是在氨基酸S50、氨基酸S51、氨基酸T69、氨基酸T70、氨基酸C192或其任何组合处，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1。
在一些方面，所述取代中的一个是在氨基酸S50处。在一些方面，使S50突变为脯氨酸。
在一些方面，所述取代中的一个是在氨基酸S51处。在一些方面，使S51突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，所述取代中的一个是在氨基酸T69处。在一些方面，使T69突变为脯氨酸。
在一些方面，所述取代中的一个是在氨基酸T70处。在一些方面，使T70突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，所述取代中的一个是在氨基酸C192处。在一些方面，使C192突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，至少少一个糖基化的所述IL2多肽包含去除糖基化的突变。在一些方面，所述突变是用未糖基化的氨基酸对糖基化的氨基酸的一个或多个取代。在一些方面，所述突变是用在附近氨基酸处不允许糖基化的氨基酸对在附近氨基酸处允许糖基化的氨基酸的一个或多个取代。在一些方面，所述一个或多个取代是从丙氨酸到选自以下的氨基酸：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些方面，所述一个或多个取代是从苏氨酸到选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些方面，所述一个或多个取代是从半胱氨酸到选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些方面，所述一个或多个取代是从半胱氨酸到丝氨酸。在一些方面，所述一个或多个取代是从半胱氨酸到丙氨酸。在一些方面，所述一个或多个取代是从半胱氨酸到缬氨酸。在一些方面，与对应于SEQ ID NO:2相比，所述取代中的一个是在氨基酸T3处。在一些方面，所述取代中的一个是在氨基酸C125处，其中在氨基酸C125处的所述取代选自C125S、C125A和C125V。在一些方面，所述突变是缺失。在一些方面，所述缺失是在氨基酸A1处。
在一些方面，所述融合蛋白进一步包含在所述第一多肽与所述第二多肽之间框内融合的接头。在一些方面，所述接头是甘氨酸/丝氨酸接头。在一些方面，所述甘氨酸/丝氨酸接头包含(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n或(GGGGS)n的氨基酸序列，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。在一些方面，所述甘氨酸/丝氨酸接头包含(GGGS)3的氨基酸序列。
在一些方面，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些方面，所述融合蛋白进一步包含与所述第一多肽和/或所述第二多肽融合的异源部分。在一些方面，所述异源部分是半衰期延长部分。在一些方面，所述异源部分包含白蛋白、免疫球蛋白恒定区或其部分、免疫球蛋白结合多肽、免疫球蛋白G(IgG)、白蛋白结合多肽(ABP)、PAS化部分、HES化部分、XTEN、PEG化部分、Fc区、及其任何组合。
在一些方面，所述融合蛋白由如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成。
在一些方面，将所述融合蛋白酶促地或化学地去糖基化。在一些方面，将所述融合蛋白通过碱、肼解、PNG酶F、Endo H、O-糖苷酶或其任何组合去糖基化。
在一些方面，所述融合蛋白是单体。在一些方面，所述融合蛋白是二聚体。
在一些方面，将所述融合蛋白作为药物组合物的一部分施用至所述受试者，所述药物组合物包含所述融合蛋白和药学上可接受的赋形剂。
附图说明
图1A和图1B示出了实施例1中描述的1期、随机、双盲、安慰剂对照、单次递增剂量(“SAD”)研究设计(图1A)和单次递增给药方案(图1B)的示意图。在所有队列中都使用哨兵给药(sentinel dosing)(1:1BMS-986326或安慰剂)。剂量水平可以根据来自先前队列的新出现的数据而改变。最大剂量递增步阶将大约≤上一剂量水平的3倍。“IV NOAELa”表示最大静脉内(IV)剂量，预期其提供与对于单剂量猴毒理学研究的NOAEL(AUC[0-336小时]≤757μ·h/ml)类似的平均暴露(由时间零至无穷的浓度-时间曲线下面积；“AUC[INF]”)。队列A6是任选的，取决于来自先前队列的药效学(PD)结果。“SCb”表示最大皮下(SC)剂量，预期其提供不超过对于为期12周(每3周一次)的SC猴毒理学研究的NOAEL(AUC[0-504小时]≤306μ·h/ml)的平均暴露(AUC[INF])。
图2A至图2B示出了NZB x NZQ相比于BALB/c小鼠中的Treg CD25表达。将来自NZBx NZW(n＝5，26周龄)或BALB/c(n＝6，9-10周龄)小鼠的脾细胞用针对CD4、Foxp3和CD25的抗体染色。图2A示出了来自每组的代表性小鼠的CD4+门中Foxp3+细胞的百分比和CD4+Fox3+门中CD25+细胞的百分比。图2B示出了CD4+Foxp3+T细胞的平均荧光强度(MFI)(平均值±SEM)。通过单因素方差分析，***p<0.001。
图3A至图3E示出了mIL-2/CD25施用对BALB/c小鼠中的Treg和非Treg细胞的作用。将BALB/c小鼠(n＝5，8-10周龄)在第0、3和6天用mIL-2/CD25治疗，在第0、2、4和6天用Fc-IL2治疗，或者在第0、3和6天用PBS治疗。在第7天处死小鼠，并且收获脾脏用于通过流式细胞术进行分析。图3A示出了在CD4+T细胞当中Foxp3+CD25+细胞的百分比。图3B示出了CD4+Foxp3+CD25+T细胞的总数。图3C示出了CD4+Foxp3-T细胞的总数。图3D示出了CD8+T细胞的总数。图3E示出了CD335+CD49d+NK细胞的总数。通过单因素方差分析，相比于PBS对照组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图4A至图4D示出了在NZB x NZW小鼠(早期疾病)中mIL-2/CD25施用对狼疮的抑制。将蛋白尿水平为30mg/dL的雌性NZB×NZW F1小鼠(22-24周龄)用PBS或者0.1、0.2或0.4mg/kg的mIL-2/CD25(皮下，2次/周)，或者用泼尼松龙(10mg/kg，口服，3次/周)治疗14周，其中每组n＝10。mIL-2/CD25施用显示出对以下方面的剂量依赖性降低：蛋白尿水平(图4A)、具有高蛋白尿(得分为3或更高)的小鼠百分比(图4B)、抗dsDNA IgG滴度(图4C)和肾脏组织学得分(图4D)。通过单因素方差分析，在研究结束时相比于PBS组，**p<0.01，****p<0.0001。
图5A至图5D示出了mIL-2/CD25施用对NZB x NZW小鼠中的Treg的作用。将蛋白尿水平为30mg/dL的雌性NZB×NZW F1小鼠(22-24周龄)用PBS或者0.1、0.2或0.4mg/kg的mIL-2/CD25(皮下，2次/周)，或者用泼尼松龙(口服，3次/周)治疗4周，其中每组n＝4。mIL-2/CD25(第8个剂量后48h)显示出对血液(图5A)和脾脏(图5B)中的Treg(CD4+CD25+Foxp3+)百分比的剂量依赖性增加。在脾脏中在Treg门(CD4+CD25+Foxp3+)中的Ki67+细胞百分比(图5C)和CD25 MFI(图5D)也以剂量依赖性方式增加。通过单因素方差分析，相比于PBS组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图6A至图6E示出了在NZB x NZW小鼠(晚期疾病)中mIL-2/CD25施用对狼疮的抑制。将蛋白尿水平为100mg/dL的雌性NZB×NZW F1小鼠(约27周龄)用PBS或者0.1或0.3mg/kg的mIL-2/CD25(皮下，2次/周)治疗10周，每组n＝12-14。用mIL-2/CD25治疗在研究完成时导致蛋白尿水平的剂量依赖性降低(图6A)、抗dsDNA IgG滴度有降低的趋势(图6B)、血清IL-12水平的降低(图6C)、肾脏组织学得分的降低(图6D)和脾脏中CD4+Foxp3+CD25+细胞百分比的增加(图6E)。通过单因素方差分析，相比于PBS组，*p<0.05。通过双尾t检验，相比于PBS组，#p<0.05。
图7A至图7E示出了mIL-2/CD25和泼尼松龙组合治疗在NZB x NZW小鼠中的效果。将蛋白尿水平为30mg/dL的雌性NZB×NZW F1小鼠(21-23周龄)用PBS、mIL-2/CD25(0.1mg/kg，皮下，2次/周)、泼尼松龙(1mg/kg，口服，3次/周)，或者用mIL-2/CD25(0.1mg/kg，皮下，2次/周)与泼尼松龙(1mg/kg，口服，3次/周)的组合治疗14周。高剂量的泼尼松龙(10mg/kg，口服，3次/周)和mIL-2/CD25(0.2ug/kg，皮下，2次/周)组作为对照被包括，每组n＝12。示出了对蛋白尿水平(图7A)、抗dsDNA抗体滴度(图7B)和组织学得分(图7C)的作用。在存在或不存在泼尼松龙的情况下，在脾脏中mIL-2/CD25治疗显示出对Treg(CD4+CD25+Foxp3+)的百分比(图7D)和Treg门(CD4+CD25+Foxp3+)中的CD25 MFI(图7E)的增加。对于图7D和图7E，每组n＝5。通过单因素方差分析，在研究结束时相比于PBS组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图8A至图8F示出了mIL-2/CD25和泼尼松龙组合治疗在NZB x NZW小鼠中的效果。在如图7所描述的mIL-2/CD25和泼尼松龙组合研究完成时，收集肾脏用于进行RT-PCR分析。与单独的任一单一疗法相比，在组合治疗的情况下观察到1型干扰素基因表达(IFIT1(图8A)、IFIT3(图8B)、MX1(图8C)、IRF7(图8D)、GBP2(图8E)和LIGP1(图8F))的进一步降低。
图9A至图9F示出了在MRL/lpr小鼠中mIL-2/CD25施用对狼疮的抑制。将蛋白尿水平为30mg/dL的雄性MRL/lpr小鼠(12-14周龄)用PBS或者0.1、0.2或0.4mg/kg的mIL-2/CD25(皮下，2次/周)，或者用泼尼松龙(口服，3次/周)治疗12周，其中每组n＝10。用mIL-2/CD25治疗导致对以下方面的剂量依赖性降低：蛋白尿水平(图9A)、抗dsDNA IgG滴度(图9B)和肾脏组织学得分(图9C)；以及对血液(图9D)和脾脏(图9E)中的Treg(CD4+CD25+Foxp3+)百分比的剂量依赖性增加和对脾脏中Treg门(CD4+CD25+Foxp3+)中的CD25 MFI的增加(图9F)。通过单因素方差分析，在第12周时相比于PBS组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
具体实施方式
本公开文本的某些方面涉及治疗有需要的受试者的疾病或障碍(自身免疫性疾病和/或炎性疾病，例如系统性红斑狼疮(SLE))的方法，所述方法包括向受试者施用一定剂量的白介素-2(IL2)融合蛋白，其中融合蛋白包含：(a)含有IL2多肽的第一多肽；和(b)含有白介素-2受体α(IL2Rα)多肽的胞外结构域的第二多肽，其中(i)与天然IL2Rα的胞外结构域(SEQ ID NO:1)相比，IL2Rα多肽的胞外结构域至少少一个糖基化；和/或(ii)与天然IL2(SEQ ID NO:2)相比，IL2多肽至少少一个糖基化。在一些方面，剂量为约0.1mg至约9mg。在一些方面，剂量大于约9mg。在一些方面，将融合蛋白经由静脉内途径施用至受试者，并且剂量为约0.1mg至约9mg。在一些方面，将融合蛋白经由静脉内途径施用至受试者，并且剂量大于约9mg。在一些方面，将融合蛋白经由皮下途径施用至受试者，并且剂量为约1mg至约8mg。在一些方面，将融合蛋白经由皮下途径施用至受试者，并且剂量大于约8mg。
在一些方面，所述方法进一步包括施用皮质类固醇，例如泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、布地奈德、曲安西龙、可的松、去氧皮质酮、氟氢可的松或帕拉米松。
为了可以更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个都应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本说明书进行阐述。
I.定义
为了可以更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个都应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本申请进行阐述。
应注意，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”实体是指一个/一种或多个/多种该实体；例如，“一个核苷酸序列”应理解为代表一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一个/一种(a)”(或“一个/一种(an)”)、“一个/一种或多个/多种”以及“至少一个/一种”在本文中可以可互换地使用。
此外，在本文中使用的情况下，将“和/或”视为对两个指定特征或组成部分中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，如在本文中以短语如“A和/或B”使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，如以短语如“A、B和/或C”使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
类似地，除非上下文另外明确指示，否则单词“或”旨在包括“和”。应进一步理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子重量或分子质量值都是近似值，并且为了描述而提供。
应理解，无论在哪里在本文中用语言“包括/包含(comprising)”描述方面，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”措辞描述的在其他方面类似的方面。
术语“约”在本文中用于意指大约、大致、大概或在……左右。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展所阐述数值上下的边界来修饰该范围。因此，“约10-20”意指“约10至约20”。通常，术语“约”可以向上或向下(较高或较低)以例如10％的差异修饰高于和低于所陈述值的数值。
如本文所用，术语“重组”包括从通过基因工程或以其他方式通过实验室操作制备的基因进行表达。
除非另外指示，否则如本文所用，“白介素-2”、“IL2”或“IL-2”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然或重组IL2，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)以及驯养或农业哺乳动物。所述术语涵盖未加工的IL2以及通过在细胞中加工产生的任何形式的IL2(即，IL2的成熟形式)。所述术语还涵盖IL2的天然存在的变体和片段(例如，剪接变体或等位基因变体)，以及具有天然存在的IL2的IL2活性的非天然存在的变体。
IL2的另外的核酸和氨基酸序列是已知的。参见例如，GenBank登录号：Q7JFM2(鬼夜猴(Aotus lemurinus)(灰腹夜猴))；Q7JFM5(秘鲁夜猴(Aotus nancymaae)(马夜猴))；P05016(家牛(Bas taurus)(牛))；Q29416(家犬(Canis familiaris)(犬)(中华田园犬(Canis lupus familiaris)))；P36835(山羊(Capra hircus)(山羊(Goat)))；和P37997(家马(Equus caballus)(马))。
IL2的生物学活性片段和变体保留IL2活性。短语“IL2的生物学活性”或“IL2活性”是指IL2的一种或多种生物学活性，包括但不限于刺激带有IL2受体的淋巴细胞的能力。既可以在体外又可以在体内测量这种活性。IL2是免疫活性的整体调节剂，并且这里看到的效果是此类活性的总和。例如，它调节存活活性(Bcl-2)，诱导T效应活性(IFN-γ、颗粒酶B和穿孔素)和/或促进T调节活性(FoxP3)。
IL2的生物学活性变体是已知的。参见例如，美国申请公开案20060269515和20060160187以及WO 99/60128。
术语“分泌信号序列”表示编码这样的多肽(“分泌肽”)的多核苷酸序列，所述多肽作为较大多肽的组分，引导较大多肽通过合成所述多肽的细胞的分泌途径。通常在通过分泌途径的转运期间切割较大多肽以去除分泌肽。
如本文所用，融合蛋白或多肽的“成熟”形式包括已经去除分泌肽的多肽的加工形式。
如本文所用，融合蛋白的“未加工”形式保留分泌肽序列。
除非另外指示，否则如本文所用，术语“CD25”、“IL2受体α”、“IL2Rα”或“IL2Ra”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然或重组IL2Rα，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)以及驯养或农业哺乳动物。所述术语还涵盖IL2Rα的天然存在的变体(例如，剪接变体或等位基因变体)，或具有IL2Rα活性的非天然存在的变体。人IL2经由通过其受体系统IL2R进行的信号传导发挥其生物学作用。IL2及其受体(IL2R)是T细胞增殖和其他对免疫应答至关重要的基本功能所需要的。IL2R由3个非共价连接的I型跨膜蛋白组成，它们是α(p55)、β(p75)和γ(p65)链。人IL2Rα链含有219个氨基酸的胞外结构域、19个氨基酸的跨膜结构域和13个氨基酸的胞内结构域。IL2Rα(IL2R-α)的分泌型胞外结构域可以用于本文所述的融合蛋白中。
IL2Rα的核酸和氨基酸序列是已知的。参见例如，GenBank登录号：NP_001030597.1(黑猩猩(Pan troglodytes))；NP_001028089.1(猕猴(Macaca mulatta))；NM_001003211.1(狼(Canis lupus))；NP_776783.1(家牛(Bos taurus))；NP_032393.3(小家鼠(Musmusculus))；和NP_037295.1(褐家鼠(Rattus norvegicus))。
还提供了IL2Rα的胞外结构域的生物学活性片段和变体。此类IL2Rα胞外结构域活性变体或片段将保留IL2Rα胞外结构域活性。短语“IL2Rα胞外结构域的生物学活性”是指IL2Rα的胞外结构域的一种或多种生物学活性，包括但不限于与IL2结合和/或增强IL2受体反应性细胞中细胞内信号传导的能力。IL2Rα的生物学活性片段和变体的非限制性例子披露于例如Robb等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5654-8(1988)中。在一些方面，与天然IL2Rα的胞外结构域相比，本文公开的IL2Rα的生物学活性片段和变体至少少一个糖基化。
如本文所用的如应用于对象的术语“天然存在的”是指对象可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可以从天然来源分离并且尚未经实验室的人员有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
“多肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可以含有修饰，诸如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键形成。“蛋白质”或“融合蛋白”可以包含一种或多种多肽。
本公开文本还包括多肽的片段或变体及其任何组合。当提及本公开文本的多肽结合结构域或结合分子时，术语“片段”或“变体”包括保留参考多肽的至少一些特性(例如，IL2Rα的IL2结合活性)的任何多肽。多肽片段包括蛋白质水解片段以及缺失片段，但是不包括天然存在的全长多肽(或成熟多肽)。本公开文本的多肽结合结构域或结合分子的变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可以包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。
如上所述，多肽变体包括例如修饰的多肽。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附接、血红素部分的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人,Blood 116:270-79(2010))、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(如精氨酰化)和泛素化。
如本文所用，术语蛋白质或核苷酸序列中的“对应于……的氨基酸”、“对应于……的位点”或“等效氨基酸”通过比对来鉴定，以最大化第一蛋白质序列(例如，IL2序列)与第二蛋白质序列(例如，第二IL2序列)之间的同一性或相似性。用于鉴定第二蛋白质序列中的等效氨基酸的编号基于用于鉴定第一蛋白质序列中的相应氨基酸的编号。在一些方面，术语“对应于”是指在多肽中一个或多个氨基酸或者在多核苷酸中一个或多个核苷酸处的突变的关系。通过非限制性例子的方式，如本文所公开的多核苷酸(例如，SEQ ID NO:1)的特定氨基酸(例如，S50)是指SEQ ID NO:1中的第50个氨基酸-丝氨酸。
如本文所用，术语“与……缔合”是指在第一氨基酸链与第二氨基酸链之间形成的共价或非共价键。在一个方面，术语“与……缔合”意指共价非肽键或非共价键。这种缔合可以通过冒号(即，(:))指示。在另一个方面，它意指除肽键外的共价键。例如，氨基酸半胱氨酸包含巯基，其可以与第二个半胱氨酸残基上的巯基形成二硫键或二硫桥。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1区和CL区通过二硫键缔合，并且这两条重链通过在对应于使用Kabat编号系统的239和242的位置(位置226或229，EU编号系统)处的两个二硫键缔合。共价键的例子包括但不限于肽键、金属键、氢键、二硫键、σ键、π键、δ键、糖苷键、抓氢键、弯键、偶极键、反馈π键、双键、三键、四键、五键、六键、共轭、超共轭、芳香度、扣数或反键作用。非共价键的非限制性例子包括离子键(例如，阳离子-π键或盐键)、金属键、氢键(例如，二氢键、双氢配合物、低势垒氢键或对称氢键)、范德华力、伦敦分散力、机械键、卤键、亲金作用、嵌入、堆积、熵力或化学极性。
如本文所用的术语“相当的”意指由使用例如融合蛋白得到的比较率或水平等于、基本上等于或类似于参考率或水平。如本文所用的术语“类似的”意指比较率或水平与参考率或水平的差异不超过10％或不超过15％。术语“基本上等于”意指比较率或水平与参考率或水平的差异不超过0.01％、0.5％或1％。
如本文所用的术语“表达”是指多核苷酸产生基因产物(例如，RNA或多肽)的过程。
“融合物”或“融合蛋白”包含与第二氨基酸序列框内连接的第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列在自然界中并非天然地与所述第二氨基酸序列连接。可以使通常存在于单独的蛋白质中的氨基酸序列在融合多肽中聚在一起，或者可以将通常存在于相同蛋白质中的氨基酸序列以新排列置于融合多肽(例如，IL2蛋白与IL2-Rα蛋白的融合物)中。例如通过化学合成或通过产生和翻译多核苷酸来产生融合蛋白，在所述多核苷酸中肽区以所需的关系被编码。融合蛋白可以进一步包含通过共价非肽键或非共价键与第一氨基酸序列缔合的第二氨基酸序列。在转录/翻译后，获得了单一蛋白质。以这种方式，可以将多种蛋白质或其片段掺入单一多肽中。“可操作地连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，两个多肽之间的可操作连接将两个多肽框内融合在一起以产生单一多肽融合蛋白。在一个方面，融合蛋白进一步包含第三多肽，如下文进一步详细讨论的，所述第三多肽可以包含接头序列。
如本文所用，术语“BMS-986326”或“BMS-986326-01”是指人白介素-2(IL2)和人IL2受体α亚基(CD25)的胞外结构域部分的重组融合蛋白，其形成质量为大约83千道尔顿(kDa)的非共价、自阻断的同二聚体结构。IL2和CD25部分通过小肽接头序列(GGGS)3互相连接。为了延长的药代动力学(PK)和调节性T细胞(Treg)选择性对BMS-986326进行优化，并且其提供了低剂量IL2受体(IL2R)激动作用。作为无活性同二聚体，BMS-986326在空间上抑制IL2R结合直至单体释放，从而提供避免靶标介导的药物处置(TMDD)和肾脏清除以及通过活性单体的缓慢释放增强Treg选择性体内活性的机制。单体释放使得分子能够与IL2R接合以启动信号传导，对表达高水平CD25的细胞(如Treg)具有更高的效力和选择性。在大鼠和猴中进行的毒理学研究已经展示了BMS-986326的可接受的耐受性特征。在一些方面，BMS-986326包含如SEQ ID NO:5(其对应于美国公开号2009-0359672中的SEQ ID NO:16)所示的氨基酸序列。将美国公开号2009-0359672通过引用以其整体并入本文。
“Fc区”(可结晶片段区)、“Fc结构域”或“Fc”是指抗体的重链的C末端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合或与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。因此，Fc区包含抗体的除了第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)之外的恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含两个相同的蛋白质片段，其衍生自抗体两条重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定结构域；IgM和IgE Fc区在每条多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。IgG同种型在某些物种中分为以下亚类：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3以及CH1与CH2结构域之间的铰链。如本文所定义的，尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界的定义可能会发生变化，但人IgG重链的Fc区被定义为从IgG1的氨基酸残基D221、IgG2的氨基酸残基V222、IgG3的氨基酸残基L221和IgG4的氨基酸残基P224延伸到重链的羧基末端，其中编号是根据如在Kabat中的EU索引。人IgG Fc区的CH2结构域从氨基酸237延伸至氨基酸340，并且CH3结构域位于Fc区中的CH2结构域的C末端侧，即，它从IgG的氨基酸341延伸至氨基酸447或446(如果不存在C末端赖氨酸残基)或445(如果不存在C末端甘氨酸和赖氨酸残基)。如本文所用，Fc区可以是天然序列Fc，包括任何同种异型变体或变体Fc(例如，非天然存在的Fc)。
“Fc受体”或“FcR”是与免疫球蛋白的Fc区结合的受体。与IgG抗体结合的FcR包括FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγR家族由三种激活性受体(小鼠中的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人中的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制性受体(FcγRIIB)组成。人FcγR的各种特性是本领域已知的。大多数先天性效应细胞类型共表达一种或多种激活性FcγR和抑制性FcγRIIB，而自然杀伤(NK)细胞选择性地表达一种激活性Fc受体(小鼠中的FcγRIII和人中的FcγRIIIA)，但是在小鼠和人中不表达抑制性FcγRIIB。人IgG1与大多数人Fc受体结合，并且就它所结合的激活性Fc受体的类型而言，被认为等同于鼠IgG2a。
如本文所用，术语“插入(inserted)”、“插入(is inserted)”、“插入(insertedinto)”或语法相关术语是指融合多肽中异源部分(例如，半衰期延长部分)相对于指定蛋白质中类似位置而言的位置。如本文所用，所述术语是指本文公开的重组多肽的特征，并且并非指示、暗示或暗指制备融合多肽的任何方法或过程。
涉及多肽或多核苷酸的“异源”和“异源部分”是源自不同蛋白质或多核苷酸的多肽或多核苷酸。融合蛋白的另外的组分可以源自与融合蛋白的其他多肽组分相同的生物体，或者另外的组分可以来自与融合蛋白的其他多肽组分不同的生物体。例如，异源多肽可以是合成的，或者衍生自不同物种、个体的不同细胞类型或者不同个体的相同或不同细胞类型。在一个方面，异源部分是与另一种多肽融合以产生融合多肽或蛋白质的多肽。在另一个方面，异源部分是与多肽或蛋白质缀合的非多肽，如PEG。本文公开的异源部分的非限制性例子是甘氨酸/丝氨酸接头(例如，GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:6)(也称为(Gly3Ser)3))。
“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区及其天然存在的变体。天然序列Fc包括Fc的各种同种异型(参见例如，Jefferis等人(2009)mAbs 1:1)。
在使用融合蛋白进行体外或体内测定的上下文中，术语“EC50”是指诱导最大反应的50％(即，最大反应与基线之间的一半)的反应时的融合蛋白浓度。
“保守氨基酸取代”是指将氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在一些方面，将IL2融合蛋白中的预测的非必需氨基酸残基用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替代。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见例如，Brummell等人,Biochem.32:1180-7(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-84(1999)；和Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-17(1997))。
编码基因产物(例如，多肽)的多核苷酸可以包括与一个或多个编码区可操作地缔合的启动子和/或其他转录或翻译控制元件。除启动子外，其他转录控制元件(例如，增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号)也可以与编码区可操作地缔合，以指导基因产物表达。
术语“序列同一性百分比”、“同一性百分比”、“序列同一性”或“同一性”可互换地使用，并且是指在比较窗口上两个多核苷酸或多肽序列之间共享的相同匹配位置的数目，考虑了为实现这两个序列的最佳比对必须引入的添加或缺失(即，空位)。匹配位置是在靶序列和参考序列两者中呈现相同核苷酸或氨基酸的任何位置。由于空位不是核苷酸或氨基酸，因此不对靶序列中呈现的空位计数。同样地，由于对靶序列核苷酸或氨基酸而不是对参考序列中的核苷酸或氨基酸计数，因此不对参考序列中呈现的空位计数。
序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成，如以下非限制性例子中所述的。
通过以下方式计算序列同一性百分比：确定在两个序列中出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间的序列同一性百分比的确定可以使用容易获得的软件(用于供在线使用和用于供下载)来完成。合适的软件程序可自各种来源获得，并且可用于比对蛋白质和核苷酸两种序列。确定序列同一性百分比的一种合适的程序是bl2seq，它是可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。使用BLASTN比较核酸序列，而使用BLASTP比较氨基酸序列。其他合适的程序是例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，它们是EMBOSS生物信息学程序套件的一部分并且也可从欧洲生物信息学研究所(EBI)网站www.ebi.ac.uk/Tools/psa获得。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可以各自具有其自身的序列同一性百分比。应注意，将序列同一性百分比值舍入至最接近的十分位。例如，将80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入至80.1，而将80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入至80.2。还应注意，长度值将总是整数。
可以使用GCG软件包(可在worldwideweb.gcg.com获得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。另外，可以使用已并入GCG软件包(可在http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
本文所述的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，以在公共数据库中进行搜索从而例如鉴定相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行此类搜索。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序来进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序来进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人,Nucleic AcidsRes.25(17):3389-402(1997)中所述的利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov。
如本文所用，“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将包含治疗剂的组合物物理引入受试者。本文所述的IL2融合蛋白的不同施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和外用施用外的施用方式(通常通过注射施用)，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。可替代地，本文所述的抗体可以经由非肠胃外途径(如外用、表皮或粘膜施用途径)施用，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或外用施用。施用还可以例如进行一次、多次和/或经一个或多个延长的时间段。
如本文所用，“给药间隔”意指在向受试者施用的多个剂量(两个或更多个剂量)之间经过的时间量。给药间隔的比较可以在单个受试者或受试者群体中进行，然后可以计算在群体中获得的平均值。给药间隔可以是通过一种途径(静脉内)给予的剂量与通过另一种途径(皮下)给予的剂量之间的时间量。如本文所用的给药间隔是指在时间上彼此相邻的两个剂量。
“免疫应答”是如本领域所理解的，并且通常是指脊椎动物内针对外来因子(agent)或异常细胞的生物学应答，所述应答保护生物体免受这些因子和由它们引起的疾病的侵害。免疫应答是由免疫系统的一种或多种细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)和通过这些细胞中的任一种或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导的，所述作用导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除脊椎动物体内侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织或者异常细胞，或者在自身免疫性或病理性炎症的情况下导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除正常的人细胞或组织。免疫反应包括例如T细胞(例如，效应T细胞、Th细胞、CD4+细胞、CD8+T细胞或Treg细胞)的激活或抑制，或免疫系统的任何其他细胞(例如，NK细胞)的激活或抑制。
“免疫调节剂(immunomodulator)”或“免疫调节剂(immunoregulator)”是指可以参与调节(modulating、regulating)或修饰免疫应答的药剂，例如靶向信号传导途径的组分的药剂。“调节(modulating)”、“调节(regulating)”或“修饰”免疫应答是指免疫系统的细胞或这种细胞(例如，效应T细胞，如Th1细胞)的活性的任何改变。更特别地，如本文所用，术语“调节”包括诱导、抑制、增强、升高、增加或降低给定的活性或应答。这种调节包括对免疫系统的刺激或抑制，这可以通过各种细胞类型数目的增加或减少、这些细胞的活性的增加或降低或者免疫系统内可能发生的任何其他变化来显示。已经鉴定出抑制性和刺激性两种免疫调节剂。在一些方面，免疫调节剂靶向T细胞表面上的分子。“免疫调节靶标(immunomodulatory target)”或“免疫调节靶标(immunoregulatory target)”是这样的分子(例如，细胞表面分子)，其被靶向用于与物质、药剂、部分、化合物或分子结合，并且其活性因物质、药剂、部分、化合物或分子的结合而改变。免疫调节靶标包括例如细胞表面上的受体(“免疫调节受体”)和受体配体(“免疫调节配体”)。
“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式修饰免疫系统或免疫应答的方法治疗患有疾病或者有感染疾病或遭受疾病复发风险的受试者。
“免疫刺激疗法”或“免疫刺激性疗法”是指导致增加(诱导或增强)受试者的免疫应答的疗法。
“增强内源性免疫应答”意指增加受试者的现有免疫应答的有效性或效力。有效性和效力的这种增加可以例如通过克服抑制内源性宿主免疫应答的机制或者通过刺激增强内源性宿主免疫应答的机制来实现。
“T效应”(“Teff”)细胞是指具有细胞溶解活性的T细胞(例如，CD4+和CD8+T细胞)以及T辅助(Th)细胞(例如，Th1细胞)，所述细胞分泌细胞因子并激活和引导其他免疫细胞；但是不包括调节性T细胞(Treg细胞)。本文所述的某些IL2融合蛋白激活Teff细胞，例如CD4+和CD8+Teff细胞以及Th1细胞。
增加的刺激免疫应答或免疫系统的能力可能是由于增强的T细胞共刺激受体的激动剂活性和/或增强的抑制性受体的拮抗剂活性导致的。增加的刺激免疫应答或免疫系统的能力可以在测量免疫应答的测定，例如测量细胞因子或趋化因子释放、细胞溶解活性(在靶细胞上直接测定或经由检测CD107a或颗粒酶间接测定)和增殖的变化的测定中通过EC50或最大活性水平的倍数增加来反映。刺激免疫应答或免疫系统活性的能力可以增强至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多。
如本文所用的术语“连接”和“融合”是指第一氨基酸序列或核苷酸序列分别与第二氨基酸序列或核苷酸序列共价或非共价连接。第一氨基酸或核苷酸序列可以与第二氨基酸或核苷酸序列直接连接或并置，或者可替代地，间插序列可以将第一序列与第二序列共价连接。术语“连接”不仅意指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列在C末端或N末端融合，还包括将完整的第一氨基酸序列(或第二氨基酸序列)插入第二氨基酸序列(或对应地，第一氨基酸序列)中的任何两个氨基酸之间。在一个方面，第一氨基酸序列通过肽键或接头与第二氨基酸序列连接。第一核苷酸序列可以通过磷酸二酯键或接头与第二核苷酸序列连接。接头可以是肽或多肽(对于多肽链)或者核苷酸或核苷酸链(对于核苷酸链)或任何化学部分(对于多肽和多核苷酸链两者)。术语“连接”还通过连字符(-)指示。
如本文所用，术语“T细胞介导的应答”是指由T细胞介导的应答，所述T细胞包括效应T细胞(例如，CD8+细胞)和辅助性T细胞(例如，CD4+细胞)。T细胞介导的应答包括例如T细胞的细胞毒性和增殖。
如本文所用，术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要是由CD8+T细胞介导的。
如本文所用，术语“抑制”或“阻断”(例如，指代对细胞上IL2与IL2Rα的结合的抑制/阻断)可互换地使用，并且既涵盖部分抑制/阻断又涵盖完全抑制/阻断。在一些方面，IL2融合蛋白将IL2与IL2Rα的结合抑制至少约50％，例如约60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％，例如如本文进一步描述所确定的。在一些方面，IL2融合蛋白将IL2与IL2Rα的结合抑制不超过50％，例如约40％、30％、20％、10％、5％或1％，例如如本文进一步描述所确定的。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指对受试者进行的任何类型的干预或处理，或者向受试者施用活性剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制或减缓或预防症状、并发症、病症的进展、发展、严重程度或复发或者与疾病相关的生化指标，或提高总存活期。治疗可以是对患有疾病的受试者或未患疾病的受试者(例如，用于预防)。当预防性地提供时，在任何症状之前提供本文公开的融合蛋白。物质的预防性施用用于预防或减轻任何后续症状。
关于融合蛋白、药物组合物或疫苗而言的“增强功效”或“增强免疫原性”旨在改善结果，例如如通过特定值的变化(如与保护性免疫相关的融合蛋白、药物组合物或疫苗的活性的特定参数的增加或降低)所测量的。在一个方面，增强是指特定参数增加至少5％、10％、25％、50％、100％或大于100％。在另一个方面，增强是指特定参数降低至少5％、10％、25％、50％、100％或大于100％。在一个例子中，疫苗功效/免疫原性的增强是指疫苗抑制或治疗疾病进展的能力增加，如出于此目的，疫苗的有效性增加至少5％、10％、25％、50％、100％或大于100％。
类似地，关于融合蛋白、药物组合物或疫苗而言的“克服受抑制的免疫应答”旨在改善结果，例如如通过特定值的变化(如与保护性免疫相关的疫苗的活性的特定参数恢复为先前的正值)所测量的。在一个方面，克服是指特定参数增加至少5％、10％、25％、50％、100％或大于100％。在一个例子中，克服对融合蛋白、药物组合物或疫苗的受抑制的免疫应答是指融合蛋白、药物组合物或疫苗抑制或治疗疾病进展的复兴能力，如出于此目的，疫苗有效性复兴至少5％、10％、25％、50％、100％或大于100％。
如本文所用(可互换地)，“治疗剂量”、“剂量”或“给药量”意指实现如本文所述的治疗目标的剂量。在一些方面，“治疗剂量”意指在受试者中诱导免疫耐受的剂量。在某些方面，“治疗剂量”意指在指定的耐受时间段内(例如，在施用第一剂量的12周内)在受试者中诱导免疫耐受的剂量。IL2融合蛋白的“剂量”是指足以引起期望的生物学应答的IL2融合蛋白量。如本领域普通技术人员将理解的，有效的特定IL2融合蛋白的绝对量可以根据诸如期望的生物学终点、待递送的IL2融合蛋白、靶细胞或组织等因素而变化。本领域普通技术人员将进一步理解，有效量可以以单剂量施用，或者可以通过施用多个剂量(即，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个剂量)来达到。可以使用熟练从业者已知的多种方法评价治疗剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力，如在临床试验期间的人受试者中、在预测在人中的功效的动物模型系统中或通过测定药剂在体外测定中的活性来评价。
如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指例如疾病或病症严重程度的降低；病程持续时间的减少；与疾病或病症相关的一种或多种症状的改善或消除；向患有疾病或病症的受试者提供有益作用，但不一定治愈疾病或病症。
如本文所用，“药物配制品”或“药物组合物”是指这样的制剂，其呈允许活性成分的生物学活性有效的形式，并且不含对药物配制品或组合物所施用的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。药物配制品或组合物可以是无菌的。在一些方面，药物配制品或组合物适合于人受试者的治疗用途。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本文所述的方法和组合物可以用于治疗患有免疫疾病的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
如本文所提及的术语“基于体重的”剂量或给药意指基于患者的体重计算向患者施用的剂量。例如，当60kg体重的患者需要3mg/kg的抗IL2抗体时，可以计算并且使用适当量(即，180mg)的IL2融合蛋白进行施用。
关于本文所述的方法和剂量而言的术语“平剂量”的使用意指不考虑患者的体重或体表面积(BSA)向患者施用的剂量。因此，平剂量不以mg/kg剂量提供，而是以药剂(例如，IL2融合蛋白)的绝对量提供。例如，60kg的人和100kg的人将接受相同剂量的抗体(例如，480mg的IL2融合蛋白)。
如本文所用，术语“ug”和“uM”分别可与“μg”和“μΜ”互换地使用。
如本文所用，术语“试验用药品”或“IP”包括BMS-986326以及安慰剂(0.9％氯化钠)。在一些情形下，试验用药品可以通过本领域已知的任何手段(例如像静脉内或皮下)施用至受试者。
本文提供的任何组合物或方法都可以与一种或多种本文提供的任何其他组合物和方法组合。
对免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号的参考都基于Kabat等人1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of PublicHealth,Bethesda；MD。(已经从包括人在内的若干哺乳动物物种中分离出FcRn受体。人FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列是已知的(Story等人,J.Exp.Med.180:2377(1994))。Fc可以包含免疫球蛋白的CH2和CH3结构域，含有或不含免疫球蛋白的铰链区。在WO 2004/101740和WO 2006/074199中提供了示例性Fc变体。
单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)认可的形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。除非另外指示，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考作为整体的说明书而获得。因此，通过从整体上参考说明书，更全面地定义下文紧接着定义的术语。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开文本所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,OxfordUniversity Press为技术人员提供了本公开文本所用的许多术语的通用词典。
在以下小节中进一步详细描述了本文所述的各个方面。
II.治疗受试者的疾病或障碍的方法
本公开文本提供了治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向受试者施用一个或多个剂量的白介素-2(IL2)融合蛋白，其中融合蛋白包含：(a)含有IL2多肽的第一多肽，和(b)含有白介素-2受体α(IL2Rα)多肽的胞外结构域的第二多肽；其中(i)与天然IL2Rα的胞外结构域(SEQ ID NO:1)相比，IL2Rα多肽的胞外结构域至少少一个糖基化；和/或(ii)与天然IL2(SEQ ID NO:2)相比，IL2多肽至少少一个糖基化。在一些方面，本发明方法进一步包括向受试者施用皮质类固醇。在一些方面，皮质类固醇是泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、布地奈德、曲安西龙、可的松、去氧皮质酮、氟氢可的松或帕拉米松。
已经通过缺乏IL-2信号传导途径组分的小鼠或人中系统性自身免疫的出现证明了IL-2信号传导途径对Treg的重要性。Treg细胞数目和/或功能的调节异常已经牵涉众多免疫介导的病症。参见例如，Bluestone,J.A.等人,J Clin Invest.125:2250-60(2015)；以及Dominguez-Villar,M和Hafler,D.A.,Nat Immunol.19:665-73(2018)。已经通过全基因组关联研究(GWAS)鉴定出IL-2、IL-2Rα和IL-2Rβ基因座中的自身免疫风险变体，并且将其与包括炎性肠病(IBD)、1型自身免疫性糖尿病(T1DM)、多发性硬化(MS)和类风湿性关节炎(RA)在内的免疫介导的疾病相关联。参见例如，Abbas,A.K.等人,Sci Immunol.3,eaat1482(2018)。影响关键Treg谱系转录因子FoxP3的突变导致自身免疫性淋巴增殖性疾病X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调(IPEX)综合征，其由功能性Treg的丧失引起。另外，患有由IL-2RA突变引起的CD25缺乏症的患者患有类似于IPEX综合征的免疫失调。参见例如，Verbsky,J.W.和Chatila,T.,Curr Opin Pediatr.25(6):708-14(2013)。遗传学数据与IL-2在小鼠和人两者中的Treg功能和自身免疫抑制方面的核心作用一致。
通常假定，IL-2缺乏导致SLE患者的耐受性丧失和免疫病理的主要机制是通过破坏Treg稳态。参见例如，Klatzmann,D.和Abbas,A.K.,Nat Rev Immunol.15:283-94(2015)；以及Ballesteros-Tato,A.和Papillion,A.,Curr Opin Immunol.61:39-45(2019)。虽然一些研究已经表明，患有活动性SLE疾病的患者中Treg的频率相对增加，但据报道这些Treg具有较低的CD25表达，暗示功能性损伤。参见例如，Von Spee-Mayer,C.等人,Ann RheumDis.75:1407-15(2016)。尽管尚未清楚理解SLE患者中Treg的功能性损伤，但SLE的三项独立临床研究已经证明，低剂量IL-2治疗后Treg增加并且疾病活动性降低并且Treg增加。参见例如，He,J.等人,Arthritis Rheumatol.67(增刊10)(2015)；Humrich,J.Y.等人AnnRheum Dis.74:791-92(2015)；以及Von Spee-Mayer,C.等人,Ann Rheum Dis.75:1407-15(2016)。低剂量IL-2施用、Treg扩增和免疫病理减少之间的关联已经在其他形式的免疫介导的障碍中有显示，所述其他形式的免疫介导的障碍包括I型糖尿病(参见例如，Dwyer,C.J.等人,Curr Diab Rep.16:46(2016))、HCV诱导的血管炎(参见例如，Dupont,G.等人,Cytokine.69:146-9(2014))、斑秃(参见例如，Castela,E.等人,JAMA Dermatol.150:748-51(2014))以及GvHD(参见例如，Koreth,J.等人,N Engl J Med.365:2055-66(2011))。这些研究指示了Treg的IL-2依赖性扩增与低剂量IL-2治疗后观察到的临床益处之间的因果关联。
系统性红斑狼疮(SLE)已经被描述为IL2缺乏状态，并且IL-2缺乏与SLE进展相关联。参见例如，Mizui,M.和Tsokos,G.C.,Front Immunol.9:Article 786(2018)。所培养的来自SLE患者的外周血单个核细胞和CD4+T细胞展示出不足的离体IL-2产生。参见例如，Comte,D.等人,Arthritis&Rheumatology 69:808-13(2017)。
因此，本公开文本提供了用于治疗疾病或障碍(例如，自身免疫性疾病和/或炎性疾病，例如SLE)的本文公开的IL2融合蛋白的安全且有效的剂量。
II.A.施用的剂量和途径
在一些方面，IL2融合蛋白的剂量为约0.1mg至约9mg。在其他方面，IL2融合蛋白的剂量大于约9mg。
可以将所述剂量的IL2融合蛋白通过外用、表皮、粘膜、鼻内、口服、阴道、直肠、舌下、外用、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外或胸骨内途径施用至受试者。
在一些方面，将融合蛋白经由静脉内途径施用至受试者。在一些方面，这样控制静脉内施用的剂量的AUC[0-336小时(h)]，使得平均暴露(AUC[INF])受到限制。在一些方面，所述剂量的AUC[0-336小时(h)]低于约757μg·h/ml。
在一些方面，所述剂量的AUC[0-336小时(h)]低于约750μg·h/ml、约740μg·h/ml、约730μg·h/ml、约720μg·h/ml、约710μg·h/ml、约700μg·h/ml、约690μg·h/ml、约680μg·h/ml、约670μg·h/ml、约660μg·h/ml、约650μg·h/ml、约640μg·h/ml、约630μg·h/ml、约620μg·h/ml、约610μg·h/ml、约600μg·h/ml、约590μg·h/ml、约580μg·h/ml、约570μg·h/ml、约560μg·h/ml或约550μg·h/ml。
在一些方面，将融合蛋白以约0.3mg至约9mg之间的剂量经由静脉内途径施用。在一些方面，将融合蛋白按以下剂量经由静脉内途径施用至受试者：约1mg与约9mg之间、约2mg与约9mg之间、约3mg与约9mg之间、约4mg与约9mg之间、约5mg与约9mg之间、约6mg与约9mg之间、约7mg与约9mg之间、约8mg与约9mg之间、约1mg与约8mg之间、约2mg与约8mg之间、约3mg与约8mg之间、约4mg与约8mg之间、约5mg与约8mg之间、约6mg与约8mg之间、约7mg与约8mg之间、约1mg与约7mg之间、约2mg与约7mg之间、约3mg与约7mg之间、约4mg与约7mg之间、约5mg与约7mg之间、约6mg与约7mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的剂量在约3mg与约9mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的剂量在约6mg与约9mg之间。
在一些方面，将融合蛋白按以下剂量经由静脉内途径施用至受试者：约0.1mg与约6mg之间、约1mg与约6mg之间、约2mg与约6mg之间、约3mg与约6mg之间、约4mg与约6mg之间、或约5mg与约6mg之间、约1mg与约5mg之间、约2mg与约5mg之间、约3mg与约5mg之间、约4mg与约5mg之间、约1mg与约4mg之间、约2mg与约4mg之间、约3mg与约4mg之间、约1mg与约3mg之间、或约2mg与约3mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的剂量在约0.1mg与约3mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的剂量在约0.1mg与约1mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的剂量在约0.1mg与约0.3mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的剂量在约0.3mg与约6mg之间。在一些方面，经由静脉内途径施用的剂量在约1mg与约3mg之间。
在一些方面，经由静脉内途径施用的剂量为约0.1mg、约0.3mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg或约9mg。在一些方面，经由静脉内途径施用的剂量大于约9mg。
在一些方面，将融合蛋白经由皮下途径施用至受试者。在一些方面，这样控制皮下施用的剂量的AUC[0-336小时(h)]，使得平均暴露(AUC[INF])受到限制。在一些方面，所述剂量的AUC(0-504h)低于约306μg·h/ml。
在一些方面，所述剂量的AUC(0-504h)低于约300μg·h/ml、约290μg·h/ml、约280μg·h/ml、约270μg·h/ml、约260μg·h/ml、约250μg·h/ml、约240μg·h/ml、约230μg·h/ml、约220μg·h/ml、约210μg·h/ml、约200μg·h/ml、约190μg·h/ml、约180μg·h/ml、约170μg·h/ml、约160μg·h/ml或约150μg·h/ml。
在一些方面，将融合蛋白按以下剂量经由皮下途径施用至受试者：约1mg与约8mg之间、约2mg与约8mg之间、约3mg与约8mg之间、约4mg与约8mg之间、约5mg与约8mg之间、约6mg与约8mg之间、约7mg与约8mg之间、约1mg与约7mg之间、约2mg与约7mg之间、约3mg与约7mg之间、约4mg与约7mg之间、约5mg与约7mg之间、约6mg与约7mg之间、约1mg与约6mg之间、约2mg与约6mg之间、约3mg与约6mg之间、约4mg与约6mg之间、或约5mg与约6mg之间、约1mg与约5mg之间、约2mg与约5mg之间、约3mg与约5mg之间、约4mg与约5mg之间、约1mg与约4mg之间、约2mg与约4mg之间、约3mg与约4mg之间、约1mg与约3mg之间、或约2mg与约3mg之间。在一些方面，经由皮下途径施用的剂量在约3mg与约8mg之间。在一些方面，经由皮下途径施用的剂量在约6mg与约8mg之间。在一些方面，经由皮下途径施用的剂量在约1mg至约6mg之间。在一些方面，经由皮下途径施用的剂量在约1mg至约3mg之间。在一些方面，经由皮下途径施用的剂量在约3mg至约6mg之间。
在一些方面，经由皮下途径施用的剂量为约1mg、约3mg、约6mg或约8mg。在一些方面，经由皮下途径施用的剂量大于约8mg。
在一些方面，本发明方法包括在两个剂量之间以一定给药间隔向有需要的受试者施用多个剂量(即，两个或更多个剂量)。在一些方面，给药间隔(例如，皮下或静脉内)为至少约一天、至少约两天、至少约三天、至少约四天、至少约五天或至少约六天。在一些方面，给药间隔(例如，皮下或静脉内)为至少约一周、至少约两周、至少约三周、至少约四周、至少约一个月、至少约五周、至少约六周、至少约七周、至少约八周、至少约两个月、至少约九周、至少约十周、至少约十一周、至少约十二周或至少约三个月。在一些方面，给药间隔为至少约三周。在一些方面，给药间隔为至少约两周。在一些方面，给药间隔为至少约四周。在一些方面，给药间隔为至少约一个月。在一些方面，给药为静脉内给予，并且给药间隔为至少约三周。在一些方面，给药为静脉内给予，并且给药间隔为至少约两周。在一些方面，给药为静脉内给予，并且给药间隔为至少约四周或约一个月。在一些方面，给药为皮下给予，并且给药间隔为至少约三周。在一些方面，给药为皮下给予，并且给药间隔为至少约两周。在一些方面，给药为皮下给予，并且给药间隔为至少约四周或约一个月。
在一些方面，给药间隔(例如，皮下或静脉内)为约一天、约两天、约三天、约四天、约五天或约六天。在一些方面，给药间隔(例如，皮下或静脉内)为约一周、约两周、约三周、约四周、约一个月、约五周、约六周、约七周、约八周、约两个月、约九周、约10周、约11周、约12周或约三个月。在一些方面，给药间隔为约三周。在一些方面，给药间隔为约两周。在一些方面，给药间隔为约四周。在一些方面，给药间隔为约一个月。在一些方面，给药为静脉内给予，并且给药间隔为约三周。在一些方面，给药为静脉内给予，并且给药间隔为约两周。在一些方面，给药为静脉内给予，并且给药间隔为约四周或一个月。在一些方面，给药为皮下给予，并且给药间隔为约三周。在一些方面，给药为皮下给予，并且给药间隔为约两周。在一些方面，给药为皮下给予，并且给药间隔为约四周或约一个月。
在一些方面，本发明方法包括向有需要的受试者施用多个剂量的本文所述的融合蛋白，其中将所述多个剂量经由两种或更多种不同的途径施用，例如，将一个剂量静脉内施用并且将另一个剂量皮下施用。在一些方面，本发明方法提供了(i)向有需要的受试者静脉内施用第一剂量的融合蛋白，并且(ii)向有需要的受试者皮下施用第二(或最后)剂量的融合蛋白。在一些方面，本发明方法提供了(i)向有需要的受试者静脉内施用一个或多个剂量的融合蛋白，并且(ii)向受试者皮下施用一个或多个剂量的融合蛋白。在一些方面，给药间隔和/或剂量可以在静脉内施用与皮下施用之间调整。
在一些方面，本发明方法进一步包括向受试者施用皮质类固醇。在一些方面，皮质类固醇选自：泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、布地奈德、曲安西龙、可的松、去氧皮质酮、氟氢可的松和帕拉米松。在一些方面，皮质类固醇是泼尼松龙、甲泼尼龙或泼尼松。在一些方面，皮质类固醇是泼尼松龙。
在一些方面，将皮质类固醇经由外用、表皮、粘膜、鼻内、口服、阴道、直肠、舌下、外用、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外或胸骨内途径施用至受试者。在一些方面，将皮质类固醇经由外用、口服、静脉内或肌内途径施用至受试者。
在一些方面，在融合蛋白的所述的每一个剂量之前、同时或之后施用皮质类固醇。在一些方面，在每个剂量之间以一定给药间隔将两个或更多个剂量的皮质类固醇施用至受试者。在一些方面，皮质类固醇的给药间隔为至少约一天、至少约两天、至少约三天、至少约四天、至少约五天、至少约六天、至少约一周、至少约两周、至少约三周、至少约四周、至少约一个月、至少约五周、至少约六周、至少约七周、至少约八周、至少约两个月、至少约九周、至少约十周、至少约十一周、至少约十二周或至少约三个月。在一些方面，皮质类固醇是泼尼松龙，其中将融合蛋白一周两次皮下施用至受试者，并且其中将泼尼松龙一周三次口服施用至受试者。
II.B.疾病和障碍
适合于本发明方法的受试者包括需要增强免疫应答的人患者。所述方法特别适合于治疗患有可以通过增加免疫应答(例如，T细胞介导的免疫应答，例如抗原特异性T细胞应答)来治疗的疾病或障碍的患者。人在一些方面，向受试者施用一定量的IL2融合蛋白修饰受试者的免疫应答。在一些方面，受试者的免疫应答得到增强、刺激或上调。
鉴于本文所述的IL2融合蛋白能够如通过抑制IL2或IL2Rα的负面作用来刺激或共刺激T细胞应答(例如，抗原特异性T细胞应答)，本文提供了使用本文所述的IL2融合蛋白来刺激、增强或上调抗原特异性T细胞应答的体外和体内方法。在一些方面，还提供了CD3刺激(例如，通过与表达细胞膜CD3的细胞共孵育)，所述刺激可以在用本文所述的IL2融合蛋白刺激的同时、之前或之后提供。
抗原特异性T细胞应答的任何合适的指标可以用于测量抗原特异性T细胞应答。此类合适的指标的非限制性例子包括在抗体的存在下T细胞增殖增加和/或在抗体的存在下细胞因子产生增加。在一些方面，抗原特异性T细胞刺激了白介素-2和/或干扰素-γ的产生。
可以用本文所述的IL2融合蛋白增强或共刺激的T细胞包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。T细胞可以是Teff细胞(例如，CD4+Teff细胞、CD8+Teff细胞)、T辅助(Th)细胞(例如，Th1细胞)或T细胞毒性(Tc)细胞。
在一些方面，疾病或障碍是感染性疾病或免疫介导的疾病。用本文所述的IL2融合蛋白治疗患有疾病或障碍的受试者可以导致例如疾病稳定、部分应答、总存活期增加、无疾病存活期增加或无进展存活期增加。
在一些方面，免疫介导的疾病是炎性疾病或自身免疫性疾病。利用Treg的抑制能力来抑制不需要的免疫应答引起了人们的很大兴趣。在小鼠和人中的数据显示，以低剂量的IL2增强IL2R信号传导选择性地增强Treg并增强免疫耐受机制。本文提供的IL2融合蛋白代表IL2的新的且改进的形式，其更可能增强Treg。因此，可以将IL2融合蛋白施用至患有自身免疫性疾病、慢性移植物抗宿主病、移植排斥反应以及其他目的是要抑制自身反应性的病症的患者。
在一些方面，免疫介导的疾病选自：1型糖尿病；多发性硬化；类风湿性关节炎；乳糜泻；系统性红斑狼疮；狼疮性肾炎；皮肤狼疮；幼年型特发性关节炎；克罗恩病；溃疡性结肠炎；系统性硬化病；移植物抗宿主病(GvHD)；银屑病；斑秃；HCV诱导的血管炎；舍格伦综合征；天疱疮；强直性脊柱炎；白塞病；韦氏肉芽肿病；高安病；自身免疫性肝炎；硬化性胆管炎；古-斯综合征；炎性肠病；X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调(IPEX)综合征；和巨噬细胞活化综合征。在一些方面，免疫介导的疾病是系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎或皮肤狼疮。在一些方面，免疫介导的疾病是系统性红斑狼疮。
在一些方面，将本文公开的IL2融合蛋白施用至患有炎性疾病或自身免疫性疾病的患者，所述炎性疾病或自身免疫性疾病对先前治疗展现出不足的反应或进展。在一些方面，将本文公开的IL2融合蛋白施用至先前未接受过(即，未用其治疗过)炎性疾病或自身免疫性疾病治疗的患者。
在一些方面，将本文公开的IL2融合蛋白与炎性疾病或自身免疫性疾病的护理标准治疗一起施用。在一些方面，将本文公开的IL2融合蛋白作为用于炎性疾病或自身免疫性疾病的维持疗法(例如，旨在防止炎症发生或复发的疗法)施用。
在一些方面，将本文公开的IL2融合蛋白作为用于治疗炎性疾病或自身免疫性疾病的单一疗法施用，或作为用于治疗炎性疾病或自身免疫性疾病的唯一免疫刺激疗法施用。在一些方面，将本文公开的IL2融合蛋白与用于治疗炎性疾病或自身免疫性疾病的疫苗接种方案组合。在一些方面，将本文公开的IL2融合蛋白与用于治疗炎性疾病或自身免疫性疾病的抗体组合。
在一些方面，将本文公开的IL2融合蛋白与用于治疗炎性疾病或自身免疫性疾病的皮质类固醇组合。
在一些方面，将本文公开的IL2融合蛋白与用于治疗系统性红斑狼疮的皮质类固醇组合。在一些方面，用于治疗系统性红斑狼疮的皮质类固醇是泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、布地奈德、曲安西龙、可的松、去氧皮质酮、氟氢可的松或帕拉米松。在一些方面，用于治疗系统性红斑狼疮的皮质类固醇是泼尼松龙、甲泼尼龙或泼尼松。在一些方面，用于治疗系统性红斑狼疮的皮质类固醇是泼尼松龙。
在一些方面，将本文公开的IL2融合蛋白与用于治疗狼疮性肾炎的皮质类固醇组合。在一些方面，用于治疗系统性狼疮性肾炎的皮质类固醇是泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、布地奈德、曲安西龙、可的松、去氧皮质酮、氟氢可的松或帕拉米松。在一些方面，用于治疗狼疮性肾炎的皮质类固醇是泼尼松龙、甲泼尼龙或泼尼松。在一些方面，用于治疗狼疮性肾炎的皮质类固醇是泼尼松龙。
在一些方面，将本文公开的IL2融合蛋白与用于治疗皮肤狼疮的皮质类固醇组合。在一些方面，用于治疗皮肤狼疮的皮质类固醇是泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、布地奈德、曲安西龙、可的松、去氧皮质酮、氟氢可的松或帕拉米松。
在一些方面，本文所述的IL2融合蛋白没有显著毒性。例如，如例如在临床试验中所确定的，本文所述的IL2融合蛋白对人的器官(例如，肝脏、肾脏、脑、肺和心脏中的一个或多个)没有显著毒性。在一些方面，本文所述的IL2融合蛋白不显著触发不希望的免疫应答，例如自身免疫或炎症。
在一些方面，用本文所述的IL2融合蛋白治疗受试者不导致免疫系统的过度刺激到受试者的免疫系统随后攻击受试者自身(例如，自身免疫应答)或导致例如过敏反应的程度。因此，在一些方面，本文所述的IL2融合蛋白不引起过敏反应。
在一些方面，用本文所述的IL2融合蛋白治疗受试者不引起显著的炎症反应，例如免疫介导的肺炎、免疫介导的结肠炎、免疫介导的肝炎、免疫介导的肾炎或肾功能不全、免疫介导的垂体炎、免疫介导的甲状腺功能减退和甲状腺功能亢进、或其他免疫介导的不良反应。在一些方面，用本文所述的IL2融合蛋白治疗受试者不引起显著的心脏障碍，例如室性心律失常；眼部障碍，例如虹膜睫状体炎；输注相关反应；淀粉酶增加、脂肪酶增加；神经系统障碍，例如头晕、周围神经病变和感觉神经病变；皮肤和皮下组织障碍，例如皮疹、瘙痒、剥脱性皮炎、多形性红斑、白癜风或银屑病；呼吸道、胸腔和纵隔障碍，例如咳嗽；疲劳；恶心；食欲下降；便秘；关节痛；或腹泻。
本公开文本进一步提供了用于根据本文公开的任何方法使用的组合物。
II.C.IL2融合蛋白
在本发明方法中施用的IL2融合蛋白包含至少两种组分：(a)含有白介素-2(IL2)多肽的第一多肽；和(b)含有白介素-2受体α(IL2Rα)多肽的胞外结构域的第二多肽；其中与天然IL2Rα的胞外结构域(SEQ ID NO:1)相比，IL2Rα多肽的胞外结构域至少少一个糖基化；和/或(ii)与天然IL2(SEQ ID NO:2)相比，IL2多肽至少少一个糖基化。在一些方面，融合蛋白具有IL2活性。
本文所述的融合蛋白特异性结合人IL2R，更具体地，人IL2Rα的胞外结构域内的特定结构域(例如，功能结构域)。在一些方面，包含IL2的融合蛋白是拮抗剂。在一些方面，包含IL2的融合蛋白以高亲和力与人IL2Rα结合。
多种受体亚基有助于有效的IL-2受体信号传导。IL-2Rβ和共同的γ链受体(IL-2Rγ)组成受体的信号传导组分，并且对于IL-2信号传导是既必要又充分的。IL-2Rβγ异二聚体受体的激活导致JAK1和JAK3的募集、PI3K的激活，最终导致STAT5的磷酸化。参见例如，Malek,T.R.,Annu Rev Immunol.26:453-79(2008)。IL-2Rβ和IL-2Rγ在所有IL-2敏感性免疫细胞上都有表达：Treg、Tconv、CD8 T细胞、NK细胞和2型先天淋巴样细胞(ILC2)，而α亚基(IL-2Rα或CD25)的表达更受限制。CD25在Treg上组成性表达，据报道在ILC2上表达，并且在激活的T细胞、B细胞和NK细胞上仅瞬时表达。参见例如，Simoni,Y.等人,Immunity 46(1):148-61(2017)。CD25对IL-2具有中等(约25nM)亲和力，并且不直接参与信号传导。参见例如，Rickert,M.等人,Science 308:1477-80(2005)。
基于IL-2和所有3种受体组分的胞外结构域的四元复合物的晶体结构，CD25似乎不与IL-2Rβ或IL-2Rγ直接接触。参见例如，Nelson,B.H.等人,Nature 369:333-6(1994)；和Stauber,D.J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:2788-93(2006)。相反，CD25似乎充当IL-2的细胞表面汇(sink)，其增加IL-2对CD25与IL-2Rβ和IL-2Rγ亚基在同一细胞上高水平表达的细胞的表观效力。参见例如，Pillet,A.H.等人,J Mol Biol.403:671-92(2010)。Treg上的组成性高CD25表达赋予对IL-2的非常高的敏感性，相对于其他非调节性T细胞，IL-2对Treg的效力明显更大。参见例如，Dupont,G.等人,Cytokine 69:146-9(2014)。对Treg的IL-2治疗导致稳健的增殖和激活，包括CD25和FoxP3以及与Treg抑制活性相关的其他基因的上调。参见例如，Sakaguchi,S.等人,J Immunol.155(3):1151-64(1995)。与Treg相反，效应T细胞和大多数NK细胞需要更高的IL-2水平来激活，因为它们缺乏高组成性CD25表达并且在激活时仅瞬时上调CD25。参见例如，Letourneau,S.等人,J Allergy ClinImmunol.123(4):758-62(2009)。
II.C.1IL2融合蛋白的IL2多肽
IL2融合物包含含有白介素-2(IL2)多肽的第一多肽。
在一些方面，除非另外指示，否则IL2融合蛋白的IL2多肽是来自任何脊椎动物来源的天然或重组IL2，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)以及驯养或农业哺乳动物。
术语IL2涵盖未加工的IL2以及通过在细胞中加工产生的任何形式的IL2(即，IL2的成熟形式)。所述术语还涵盖IL2的天然存在的变体和片段(例如，剪接变体或等位基因变体)，以及非天然存在的变体。人IL2的示例性成熟形式的氨基酸序列(具有20个氨基酸的信号序列)在SEQ ID NO:2中示出。未加工的人IL2还包含在成熟IL2分子中不存在的N末端20个氨基酸的信号肽(SEQ ID NO:7)。小鼠IL2的示例性成熟形式的氨基酸序列(具有20个氨基酸的信号序列)在SEQ ID NO:8中示出。未加工的小鼠IL2还包含在成熟IL2分子中不存在的N末端20个氨基酸的信号肽(SEQ ID NO:9)。“天然IL2”(也称为“野生型IL2”)意指天然存在的或重组的IL2。
IL2的另外的核酸和氨基酸序列是已知的。参见例如，GenBank登录号：Q7JFM2(鬼夜猴(灰腹夜猴))；Q7JFM5(秘鲁夜猴(马夜猴))；P05016(家牛(牛))；Q29416(家犬(犬)(中华田园犬))；P36835(山羊(Capra hircus)(山羊(Goat)))；和P37997(家马(马))。
在一些方面，融合蛋白的第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
还提供了IL2的生物学活性片段和变体。此类IL2活性变体或片段将保留IL2活性。IL2的生物学活性可以指代刺激带有IL2受体的淋巴细胞的能力。既可以在体外又可以在体内测量这种活性。IL2是免疫活性的整体调节剂，并且这里看到的效果是此类活性的总和。例如，它调节存活活性(Bcl-2)，诱导T效应活性(IFN-γ、颗粒酶B和穿孔素)，并且促进T调节活性(FoxP3)。参见例如，Malek等人,Immunity 33(2):153-65(2010)。
IL2的生物学活性变体是已知的。参见例如，美国公开号2006/0269515和2006/0160187以及WO/1999/060128。
IL2的生物学活性片段和变体可以用于本文公开的融合蛋白中。这种功能片段可以包含SEQ ID NO:2的至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、30个、40个、50个、75个、100个、125个、150个或更多个连续氨基酸。可替代地，功能变体可以包含与SEQ ID NO:2所示的序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
进一步提供了编码IL2蛋白的多核苷酸的活性变体和片段。此类多核苷酸可以包含编码SEQ ID NO:2的多肽的至少100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个连续核苷酸，并且继续编码具有IL2活性的蛋白质。可替代地，功能性多核苷酸可以包含与编码SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多肽至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且继续编码功能性IL2多肽。
IL2的示例性多肽序列列举于下表1中。
表1
在一些方面，与天然IL2(SEQ ID NO:2)相比，IL2多肽至少少一个糖基化位点。在一些方面，所述至少少一个糖基化位点是由于去除糖基化的一种或多种突变。
在一些方面，融合蛋白包含突变，其是用不具有糖基化位点的氨基酸对具有糖基化位点的氨基酸的取代。在一些方面，突变去除O-糖基化和/或N-糖基化。在一个方面，突变去除SEQ ID NO:2的氨基酸3处例如苏氨酸的O-糖基化。在另一个方面，突变去除N-糖基化。
在一些方面，突变是用未糖基化的氨基酸对IL2的糖基化的氨基酸的一个或多个取代。在一些方面，突变是用在附近氨基酸处不允许糖基化的氨基酸对IL2的在附近氨基酸处允许糖基化的氨基酸的一个或多个取代。
在一些方面，IL2的氨基酸的所述一个或多个取代是从丙氨酸到选自以下的氨基酸：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，IL2的氨基酸的所述一个或多个取代是从苏氨酸到选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，IL2的氨基酸的所述一个或多个取代是从反应性氨基酸(例如，半胱氨酸)到选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些方面，所述一个或多个取代是从半胱氨酸到丝氨酸。在一些方面，所述一个或多个取代是从半胱氨酸到丙氨酸。在一些方面，所述一个或多个取代是从半胱氨酸到缬氨酸。
在一些方面，与对应于SEQ ID NO:2相比，所述一个或多个取代是在IL2的氨基酸T3处。
在一些方面，取代中的一个是在SEQ ID NO:2的氨基酸C125处。在一个方面，在氨基酸C125处的取代选自C125S、C125A和C125V。
在一些方面，突变是缺失。在一些方面，缺失是在SEQ ID NO:2的氨基酸A1处。
本公开文本还包括IL2多肽的任何其他突变。在其他方面，突变还包括一个或多个取代，其改善IL2的特性，例如，提高IL2的活性、提高IL2的半衰期、提高稳定性等。
如本节下面所公开的，本文列举的突变是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸位置的突变。根据本发明，以下任何单独的突变或与其他公开的突变或本领域已知的任何突变的组合都可以用于如本文所述的一种或多种IL2融合蛋白中。
在一些方面，IL2包含在Carmenate等人,J Immunol,200(10):3475-84(2018)和/或US 8,759,486中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基Q22、Q126、I129、S130或其任何组合处，例如Q22V、Q126A、I129D、S130G或其任何组合。在一些方面，IL2包含如在美国专利号8,759,486B2中披露的L18N、Q126Y和S130R中的一种或多种突变。在一些方面，IL2包含如在美国专利号8,759,486B2中披露的Q13Y、Q126Y、I129D和S130R中的一种或多种突变。在一些方面，IL2包含如在WO 2018/091003 A1中披露的K35E、K35D和K35Q中的一种或多种突变。
在一些方面，IL2包含在Epstein等人Blood,101(12):4853-61(2003)和/或US 7,371,371中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基R38处，例如R38W。在一些方面，IL2包含如在美国专利号7,371,371B2中披露的R38W突变和IL2的氨基酸位置22至58之外的一种或多种突变。
在一些方面，IL2包含在Wittrup等人J Immunother.32(9):887-94(2009)和/或US8,906,356中披露的一种或多种突变：例如氨基酸残基91、126或两者，例如V91R、Q126T或两者。在一些方面，IL2包含如在Wittrup等人J Immunother.32(9):887-94(2009)中并且也在US 8,906,356中披露的E15W突变。在一些方面，IL2包含如在Wittrup等人JImmunother.32(9):887-94(2009)中并且也在US 8,906,356中披露的N88R和V91R中的一种或两种突变。在一些方面，IL2包含如在Wittrup等人J Immunother.32(9):887-94(2009)和/或美国专利号8,906,356中披露的Q126T或Q126I突变。
在一些方面，IL2包含在美国专利号8,906,356B2中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸69、74、91、126或其任何组合处。在一些方面，突变是如在美国专利号8,906,356B2中披露的V91R、Q126T、Q126L、Q127T或其任何组合。
在一些方面，IL2包含在Wittrup等人,J Immunother 32(9):887-94(2009)和/或US 7,569,215B2中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基E15、N30、E68、V69、N71、S75、N90或其任何组合处，例如N30S、E68D、V69A、N71A、S75P、N90H或其任何组合。在一些方面，IL2包含如在Wittrup等人,Biochemistry 44(31)(2005)中披露的E15W突变。在一些方面，突变是如在美国专利号7,569,215B2中披露的V69A。
在一些方面，IL2包含在Wittrup等人,J Immunother.32(9):887-94(2009)和/或美国专利号7,951,360B2中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基N29、Y31、K35、T37、K48、V69、N71、N88或其任何组合处，例如N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、N88D或其任何组合。在一些方面，IL2包含如在Wittrup等人,Biochemistry 44(31)(2005)中披露的E15W突变。
在一些方面，IL2包含在Wittrup等人,J Immunother.32(9):887-94(2009)和/或美国专利号8,349,311B2中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸69、74、128或其任何组合处，例如V69A、I128P或其任何组合。
在一些方面，IL2包含在Wittrup等人,J Immunother.32(9):887-94(2009)中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基S4、T10、Q11、V69、N88、T133或其任何组合处，例如S4P、T10A、Q11R、V69A、N88D、T133A或其任何组合。
在一些方面，IL2包含在Wittrup等人,J Immunother.32(9):887-94(2009)中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基N30、V69、I128或其任何组合处，例如N30S、V69A、I128T或其任何组合。
在一些方面，IL2包含在Wittrup等人,J Immunother.32(9):887-94(2009)中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基K8、Q13、N26、N30、K35、T37、V69或其任何组合处，例如K8R、Q13R、N26D、N30T、K35R、T37R、V69A或其任何组合。
在一些方面，IL2包含在Shanafelt等人,Nat Biotechnol.18(11):1197-202(2000)中披露的一种或多种突变，例如在氨基酸残基N88处，例如N88R。
在一些方面，IL2包含在美国专利号9,616,105B2中披露的一种或多种突变：例如氨基酸20、88、126或其任何组合，例如N88R、N88G或N88I。在一些方面，IL2包含如在美国专利号9,616,105B2中披露的N88R、N88G或N88I突变。在一些方面，IL2包含如在美国专利号9,616,105B2中披露的D20H、D20I或D20Y突变。在一些方面，IL2包含如在美国专利号9,616,105B2中披露的Q126L突变。
在一些方面，IL2包含在美国公开号2018/0125941A1中披露的一种或多种突变：例如D20H、N88I、N88G、N88R、Q126L、Q126F或其任何组合。在一些方面，IL2包含如在美国公开号2018/0037624A1中披露的T3A、N88G、N88R、D20H、C125S、Q126L和Q126F中的一种或多种突变。
在一些方面，IL2包含在美国公开号2017/0327555A1中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基N88、D20、C125、Q126或其任何组合处，例如N88G、N88R、D20H、C125S、Q126L、Q126F或其任何组合。
在一些方面，IL2包含在WO 2016/025385 A1中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基D109、C125或两者处，例如D109C、C125S或两者。在一些方面，IL2包含在WO 2016/025385 A1中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基D20、N88、Q126、C125、Q126或其任何组合处，例如D20H、N88I、N88G、N88R、Q126L、C125S、Q126F或其任何组合。
在一些方面，IL2包含在WO 2016/164937 A1中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基L12、Q13、E15、H16、L19、D20、M23、D84、S87、N88、V91、E95或其任何组合处，例如L12G、L12K、L12Q、L12S、Q13G、E15A、E15G、E15S、H16A、H16D、H16G、H16K、H16M、H16N、H16R、H16S、H16T、H16V、H16Y、L19A、L19D、L19E、L19G、L19N、L19S、L19T、L19V、D20A、D20E、D20F、D20G、D20T、D20W、M23R、D84A、D84E、D84G、D84I、D84M、D84Q、D84R、D84S、D84T、S87E、N88A、N88D、N88E、N88F、N88G、N88M、N88R、N88S、N88V、N88W、V91D、V91E、V91G、V91S、E95G或其任何组合。
在一些方面，IL2包含在美国专利号9,932,380B2或9,580,486中披露的一种或多种突变：例如在氨基酸残基V91处，例如V91K。在一些方面，IL2进一步包含C125A或C125S突变。在一些方面，IL2进一步包含在T3处的突变。在一些方面，在T3处的突变是T3A或T3N中的一种。在一些方面，IL2包含在S5处的突变。在一些方面，突变是S5T。
在一些方面，IL2包含在美国专利号9,732,134B2中披露的一种或多种突变：例如E15、H16、Q22、D84、N88、E95或其任何组合。
在一些方面，IL2包含在美国公开号2015/0218260A1中披露的一种或多种突变：例如N88D。在一些方面，IL2包含在美国专利号9,266,938B2中披露的突变：例如在氨基酸42、45、72或其任何组合处，例如L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R或L72K。在一些方面，IL2包含F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R和F42K突变。在一些方面，IL2包含Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R和Y45K突变。
在一些方面，IL2包含一至四种突变：第一突变L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R或L72K，第二突变F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R或F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R或Y45K，第三突变T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K或T3P，和/或第四突变C125A、C125S、C125T或C125V。将本文列出的或在专利、专利公开案或本文引用的任何其他参考文献中披露的突变通过引用以其整体并入本文。
II.C.2.IL2融合蛋白的ILR2α多肽
融合蛋白包含含有白介素-2受体α(IL2Rα)的胞外结构域的第二多肽。
在一些方面，IL2Rα的胞外结构域包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一些方面，第二多肽包含与SEQ ID NO:1至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些方面，第二多肽包含与SEQ ID NO:3至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
除非另外指示，否则如本文所用，术语“CD25”或“IL2受体a”、“IL2Rα”、“IL2Ra”、“IL2-Rα”和“IL2-Ra”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然或重组IL2Rα，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)以及驯养或农业哺乳动物。所述术语还涵盖IL2Rα的天然存在的变体(例如，剪接变体或等位基因变体)，或非天然存在的变体。人IL2经由通过其受体系统IL2R进行的信号传导发挥其生物学作用。IL2及其受体(IL2R)是T细胞增殖和其他对免疫应答至关重要的基本功能所需要的。IL2R由3个非共价连接的I型跨膜蛋白组成，它们是α(p55)、β(p75)和γ(p65)链。人IL2Rα链含有219个氨基酸的胞外结构域、19个氨基酸的跨膜结构域和13个氨基酸的胞内结构域。IL2Rα(IL2Rα)的分泌型胞外结构域可以用于本文所述的融合蛋白中。
人IL2Rα的示例性成熟形式的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中示出。未加工的人IL2Rα在SEQ ID NO:11中示出。SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:10的胞外结构域示于SEQ IDNO:1中。小鼠IL2Rα的示例性成熟形式的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中示出。未加工的小鼠IL2Rα在SEQ ID NO:13中示出。SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:12的胞外结构域示于SEQ IDNO:14中。“天然IL2Rα”(也称为“野生型IL2Rα”)意指天然存在的或重组的IL2Rα。
IL2Rα的核酸和氨基酸序列是已知的。参见例如，GenBank登录号：NP_001030597.1(黑猩猩(P.troglodytes))；NP_001028089.1(猕猴(M.mulatta))；NM_001003211.1(狼(C.lupus))；NP_776783.1(家牛(B.taurus))；NP_032393.3(小家鼠(M.musculus))；和NP_037295.1(褐家鼠(R.norvegicus))。
除非另外说明，否则如本文所用的IL2Rα的胞外结构域意指发挥其与IL2结合的正常作用的功能性IL2Rα胞外(EC)结构域。术语“IL2RαEC结构域”包括保留全长野生型IL2RαEC在IL2结合方面的功能的其功能片段、变体、类似物或衍生物。IL2RαEC结构域可以是人、猪、犬、大鼠或鼠IL2RαEC结构域。短语“IL2RαEC结构域的生物学活性”是指IL2Rα的EC结构域的一种或多种生物学活性，包括但不限于增强IL2受体反应性细胞中细胞内信号传导的能力。IL2RαEC结构域的生物学活性片段和变体的非限制性例子披露于例如Robb等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5654-8(1988)中。在一些方面，与天然IL2Rα的胞外结构域相比，本文公开的IL2RαEC结构域的生物学活性片段和变体至少少一个糖基化。
IL2Rα的胞外结构域的生物学活性片段和变体可以用于本文公开的融合蛋白中。这种功能片段可以包含SEQ ID NO:1中的任一个的胞外结构域的至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、30个、40个、50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、215个或更多个连续氨基酸。可替代地，功能变体可以包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
进一步提供了编码IL2Rα的胞外结构域的多核苷酸的活性变体和片段。此类多核苷酸可以包含编码SEQ ID NO:1的多肽的至少100个、200个、300个、400个、500个、600个或更多个连续核苷酸，并且继续编码具有IL2Rα的胞外结构域活性的蛋白质。可替代地，功能性多核苷酸可以包含与编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且继续编码具有IL2Rα的胞外结构域活性的蛋白质。
IL2Rα的示例性多肽序列列举于表2中。
表2.
在一些方面，本文提供的融合蛋白可以在IL2Rα的EC结构域内包含至少一种突变。
在一些方面，与天然IL2Rα的胞外结构域(SEQ ID NO:1)相比，IL2Rα多肽的EC结构域至少少一个糖基化、至少少两个糖基化、至少少三个糖基化、至少少四个糖基化、至少少五个糖基化、至少少六个糖基化、至少少七个糖基化、至少少八个糖基化或至少少九个糖基化。
在一些方面，至少少一个糖基化的IL2Rα多肽的EC结构域包含去除糖基化的突变。在其他方面，融合蛋白包含突变，其是用不具有糖基化位点的氨基酸对具有糖基化位点的氨基酸的取代。在一些方面，突变去除O-糖基化和/或N-糖基化。在一个方面，突变去除O-糖基化。在另一个方面，突变去除N-糖基化。
在一些方面，融合蛋白中的突变包括IL2Rα的C末端的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸167至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸168至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸169至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸170至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸171至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸172至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸173至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸174至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸175至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸176至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸177至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸178至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸179至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸180至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸181至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸182至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸183至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸184至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸185至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸186至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸187至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸188至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸189至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸190至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸191至219的缺失。在一些方面，突变是SEQ ID NO:1的氨基酸192至219的缺失。
在一些方面，突变是对应于SEQ ID NO:1的从167、168、169或171直到192至219的氨基酸的缺失。在一些方面，突变不包括对应于SEQ ID NO:1的170至219的缺失。
在一些方面，第二多肽包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在其他方面，第二多肽包含SEQ IDNO:4和+1个、+2个、+3个、+4个、+5个、+6个、+7个、+8个、+9个、+10个、+11个、+12个、+13个、+14个、+15个、+16个、+17个、+18个、+19个、+20个、+21个、+22个、+23个、+24个或+25个氨基酸，基本上由其组成，或由其组成。在一些方面，第二多肽包含SEQ ID NO:4以及不超过25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸，基本上由其组成，或由其组成。在一些方面，第二多肽包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些方面，融合蛋白包含一种或多种突变。在一些方面，所述一种或多种突变是用未糖基化的氨基酸对IL2Rα的糖基化的氨基酸的一个或多个取代。
在一些方面，IL2Rα的氨基酸的所述一个或多个取代是在氨基酸N49、氨基酸N68、氨基酸T74、氨基酸T85、氨基酸T197、氨基酸T203、氨基酸T208和氨基酸T216或其任何组合处，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1。
在一些方面，所述一个或多个取代是从天冬酰胺到另一种氨基酸。在一些方面，所述一个或多个取代是从天冬酰胺到选自以下的氨基酸：丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，所述一个或多个取代是从苏氨酸到另一种氨基酸。在一些方面，所述一个或多个取代是从苏氨酸到选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，取代是SEQ ID NO:1的氨基酸N49。在一些方面，使SEQ ID NO:1的氨基酸N49突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，取代是SEQ ID NO:1的氨基酸N68。在一些方面，使SEQ ID NO:1的氨基酸N68突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，取代是SEQ ID NO:1的氨基酸T74。在一些方面，使SEQ ID NO:1的氨基酸T74突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，取代是SEQ ID NO:1的氨基酸T85。在一些方面，使SEQ ID NO:1的氨基酸T85突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，取代是SEQ ID NO:1的氨基酸T197。在一些方面，使SEQ ID NO:1的氨基酸T197突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，取代是SEQ ID NO:1的氨基酸T203。在一些方面，使SEQ ID NO:1的氨基酸T203突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，取代是SEQ ID NO:1的氨基酸T208。在一些方面，使SEQ ID NO:1的氨基酸T208突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，取代是SEQ ID NO:1的氨基酸T216。在一些方面，使SEQ ID NO:1的氨基酸T216突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，融合蛋白包含一种或多种突变。在一些方面，所述一种或多种突变是用在附近氨基酸处不允许糖基化的氨基酸对IL2Rα的在附近氨基酸处允许糖基化的氨基酸的一个或多个取代。
在一些方面，取代是在氨基酸S50、氨基酸S51、氨基酸T69、氨基酸T70、氨基酸C192或其任何组合处，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1。
在一些方面，取代是对应于SEQ ID NO:1的氨基酸S50。在一些方面，使对应于SEQID NO:1的氨基酸S50突变为脯氨酸。
在一些方面，取代是对应于SEQ ID NO:1的氨基酸S51。在一些方面，使对应于SEQID NO:1的氨基酸S51突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，取代是对应于SEQ ID NO:1的氨基酸T69。在一些方面，使对应于SEQID NO:1的氨基酸T69突变为脯氨酸。
在一些方面，取代是对应于SEQ ID NO:1的氨基酸T70。在一些方面，使对应于SEQID NO:1的氨基酸T70突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一些方面，取代是对应于SEQ ID NO:1的氨基酸C192。在一些方面，使对应于SEQID NO:1的氨基酸C192突变为选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
II.C.3.IL2融合蛋白的接头
本公开文本的融合蛋白可以进一步包含接头。在一些方面，接头可以从N末端到C末端将第一多肽连接至第二多肽，例如N-IL2-接头-IL2RαEC-C。在其他方面，接头可以从N末端到C末端将第二多肽连接至第一多肽，例如N-IL2RαEC-接头-IL2-C。
在一个方面，IL2融合蛋白包含位于IL2多肽与IL2Rα多肽之间的接头序列。接头可以具有任何长度，并且可以包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、50个或60个或更多个氨基酸。在其他方面，可用于本公开文本的接头具有至少一个氨基酸并且少于100个氨基酸、少于90个氨基酸、少于80个氨基酸、少于70个氨基酸、少于60个氨基酸、少于50个氨基酸、少于40个氨基酸、少于30个氨基酸、少于20个氨基酸、少于19个氨基酸、少于18个氨基酸、少于17个氨基酸、少于16个氨基酸、少于15个氨基酸、少于14个氨基酸、少于13个氨基酸或少于12个氨基酸。在一个方面，接头序列包含甘氨酸氨基酸残基。在其他情形下，接头序列包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基的组合。
在一些方面，融合蛋白包含在第一多肽与第二多肽之间框内融合的接头。在一些方面，融合蛋白包含作为甘氨酸/丝氨酸接头的接头。此类甘氨酸/丝氨酸接头可以包含所述氨基酸残基的任何组合，包括但不限于肽GGGS(SEQ ID NO:15)或GGGGS(SE Q ID NO:16)或它们的重复序列，包括这些给出的肽的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个重复序列。本文公开的甘氨酸/丝氨酸接头包含(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n或(GGGGS)n的氨基酸序列，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。在一个方面，接头序列包含GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:6)(也称为(Gly3Ser)3)。在另一个方面，接头序列包含GGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:17)(也称为(Gly3Ser)4)。在其他方面，接头序列包含(Gly3Ser)5(GGGSGGGSGGGS GGGSGGGS)(SEQ ID NO:18)、(Gly3Ser)6(GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS)(SEQ ID NO:19)或(Gly3Ser)7(GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS)(SEQ ID NO:20)中的一个。在其他方面，接头序列包含(Gly4Ser)3(GGGGSGGGGSGGGG S)，如SEQ ID NO:21所示。在另外的方面，接头序列包含GGGGSGGGGSGGGGSGG GGS(SEQ ID NO:22)(也称为(Gly4Ser)4)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23)(也称为(Gly4Ser)5)；(Gly4Ser)2(GGGGSGGGGS)(SEQ ID NO:24)；(Gly4Ser)1(GGGGS)(SEQ ID NO:25)；(Gly4Ser)6(GGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO:26)；(Gly4Ser)7(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO:27)；或(Gly4Ser)5(GGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO:28)。
II.C.4.IL2融合蛋白的异源部分
本公开文本的融合蛋白可以进一步包含另外的元件，例如异源部分。此类元件可以帮助融合蛋白的表达、帮助融合蛋白的分泌、提高融合蛋白的稳定性、允许蛋白质的更有效纯化和/或调节融合蛋白的活性。在一些方面，异源部分是多肽部分。在其他方面，异源部分是非多肽部分。
在一些方面，融合蛋白包含与第一多肽融合的异源部分。在一些方面，融合蛋白包含与第二多肽融合的异源部分。在一些方面，融合蛋白包含与第一多肽和第二多肽融合的异源部分。
在一些方面，本文公开的融合蛋白包含一个或多个另外的异源部分。在一些方面，异源部分是半衰期延长部分。在一些方面，异源部分包含白蛋白、免疫球蛋白恒定区或其部分、免疫球蛋白结合多肽、免疫球蛋白G(IgG)、白蛋白结合多肽(ABP)、PAS化部分、HES化部分、XTEN、PEG化部分、Fc区、及其任何组合。
可以根据本公开文本使用的异源部分的例子披露于美国公开号2019/0359672A1和2019/0300592A1中，将所述公开案中的每一个通过引用并入本文。
II.C.5.示例性IL2融合蛋白
在一些方面，融合蛋白包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34中的任一个，或者如美国专利公开号2019/0359672A1和2019/0300592A1的表3中所列举的序列中的任一个。
在一些方面，融合蛋白包含如下表3中所列举的SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:5、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34中的任一个，和/或融合蛋白包含如美国专利公开号2019/0359672A1和2019/0300592A1的表3中所列举的序列中的任一个。
表3：
还提供了IL2/IL-Ra EC结构域融合蛋白的成熟和未加工形式的生物学活性片段和变体，以及编码它们的多核苷酸。这种功能性多肽片段可以包含以下SEQ ID NO中的任一个的至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、30个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个或更多个连续氨基酸：SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；和SEQ ID NO:34。可替代地，功能性多肽变体可以包含与以下SEQ ID NO所示的序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性：SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；和SEQ ID NO:34。
进一步提供了编码IL2/IL-Ra胞外结构域融合蛋白的多核苷酸的活性变体和片段。此类多核苷酸可以包含编码以下SEQ ID NO所示的多肽的至少100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、1000个、1100个、1200个、1300个、1500个、1800个、2000个连续核苷酸：SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQID NO:33；和SEQ ID NO:34，并且继续编码功能性IL2/IL-Ra胞外结构域融合蛋白。
在一些方面，本公开文本的融合蛋白包含与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34中的任一个至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
本公开文本的IL2融合蛋白可以具有一种或多种以下特性/活性：(1)在基于低剂量IL2的疗法中增加调节性T细胞(Treg)的活性和/或增加免疫耐受性；(2)在较高剂量疗法中增加免疫应答和记忆；(3)当与重组IL2相比时，增加IL2的利用度；和/或(4)增加对体内带有IL2R的淋巴细胞的持久IL2刺激。
在一个方面，与由IL2(SEQ ID NO:2)或SEQ ID NO:29(具有12聚体接头的无截短的wt IL2-CD25序列)组成的多肽的药代动力学特性相比，本文公开的融合蛋白包含一种或多种选自以下的药代动力学特性：半衰期增加、Cmax增加、浓度-时间曲线下面积(AUC)增加、Cmin增加、清除率降低、生物利用度提高及其任何组合。
在一个方面，与IL2(SEQ ID NO:2)或SEQ ID NO:29(具有12聚体接头的无截短的wt IL2-CD25序列)相比，本文公开的融合蛋白具有延长的半衰期。在一些方面，与由IL2(SEQ ID NO:2)或SEQ ID NO:29(具有12聚体接头的无任何截短的wt IL2-CD25序列)组成的多肽的半衰期相比，延长的半衰期是至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约21倍或至少约22倍。
在一些方面，可以以多种方式测定由IL2融合蛋白引起的Treg活性增加，包括例如(1)CD4+T细胞区室中Treg的展示和数目增加；(2)IL2依赖性CD25的上调；(3)如通过增殖标记物Ki67的表达所评估的增殖增加；和(4)依赖IL2的终末分化的Klrg1+Treg亚群的分数增加。这类对Treg的作用可以在例如脾脏和/或发炎的胰腺中看到。
在一些方面，本公开文本的IL2融合蛋白通过增加T效应/记忆应答来增加致耐受性和免疫抑制性Treg和免疫，并且在另外的方面，它通过以下方式展现出改进的药代动力学：(1)以与天然或重组IL2相比较低有效水平的IL2活性递送此类应答；和/或(2)显示比天然或重组IL2更持久的生物学应答。
在一些方面，融合蛋白具有相对于天然或重组IL2提高的活性。例如，与天然或重组IL2相比，IL2融合蛋白的作用可以以约2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍或更低水平的IL2活性增加致耐受性Treg。在其他方面，IL2融合蛋白在诱导Treg的持久增加和相关特性方面比天然或重组IL2更有效。
应进一步认识到，可以以任何顺序看到本文公开的IL2融合蛋白的组分。在一个方面，IL2多肽在融合蛋白的N末端，并且IL2Rα的胞外结构域在融合蛋白的C末端。
在一些方面，融合蛋白形成二聚体。在其他方面，融合蛋白是单体。仍然，在一些方面，二聚体包含两个单体，并且单体经由共价键彼此缔合。在一些方面，二聚体包含两个单体，并且单体经由非共价键缔合。
在本公开文本的一些方面，融合蛋白比由IL2(SEQ ID NO:2)或SEQ ID NO:29(具有12聚体接头的无截短的wt IL2-CD25序列)组成的多肽更稳定。在一些方面，融合蛋白具有一种或多种选自以下的特性：(i)与参考蛋白相比，热力学稳定性增加；(ii)与参考蛋白相比，TM增加；(iii)与参考蛋白相比，抗降解性增加；(iv)与参考蛋白相比，抗修饰性增加；(v)与参考蛋白相比，体内稳定性增加；以及(vi)其任何组合，其中参考蛋白包含(i)含有白介素-2(IL2)多肽的第一多肽；和(b)含有白介素-2受体α(IL2Rα)多肽的胞外结构域的第二多肽；并且与融合蛋白相比至少多一个糖基化。
本文公开的融合蛋白的糖基化位点中的任一个都可以通过其他机制去除。在一些方面，将融合蛋白酶促地或化学地去糖基化。在一些方面，将融合蛋白通过碱、肼解、肽-N-糖苷酶F(PNG酶F)、内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶H(Endo H)、O-糖苷酶或其任何组合去糖基化。
在一些方面，融合蛋白的一个或多个糖基化位点的去除是通过将融合蛋白用碱处理来实现的。在一些方面，通过碱硼氢化物处理从糖基化的多肽中去除聚糖。在其他方面，可以使用碱金属碳酸盐(如碳酸钠和碳酸钾)去除本文公开的融合蛋白的糖基化位点。在一些方面，碱用于β-消除处理。
在一些方面，融合蛋白的一个或多个糖基化位点的去除是通过肼解的方式通过融合蛋白的化学处理来实现的。在一个方面，通过使融合蛋白经受肼解而从本文公开的融合蛋白释放糖基化，并且使所释放的糖链经受用2-氨基吡啶进行的荧光标记。参见Hase等人J.Biochem.95:197(1984)。在一些方面，使用Oxford GlycoSystems提供的仪器(GlycoPrep1000)进行肼解。
在另一个方面，融合蛋白的一个或多个糖基化位点的去除是通过使融合蛋白经受三氟甲磺酸(TFMS)来实现的。
在一些方面，融合蛋白的一个或多个糖基化位点的去除是通过将融合蛋白用酶处理来实现的。在一些方面，酶是糖苷酶。在一些方面，融合蛋白的一个或多个糖基化位点的去除是使用肽-N-糖苷酶F(PNG酶F)来实现的。PNG酶F的浓度可以变化，并且需要凭经验确定。在一些方面，糖苷酶是PNG酶F。PNG酶F是可商购的酶(例如，New England Biolabs，马萨诸塞州伊普斯维奇，目录号P0704或P0710)。在一些方面，PNG酶F是融合蛋白。例如，PNG酶F可以是用几丁质结合结构域(CBD)标记的PNG酶F或PNG酶F-SNAP融合蛋白。在一些方面，将糖苷酶冻干。在一些方面，糖苷酶是冻干的PNG酶F。在一些方面，糖苷酶基本上不含动物来源的试剂。
在一些方面，融合蛋白的一个或多个糖基化位点的去除是通过将融合蛋白用内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶H(Endo H)处理来实现的。Endo-H是由褶皱链霉菌(Streptomyces plicatus)和一些其他链霉菌属物种(Streptomycesspecies)分泌的糖水解酶(Tarentino等人,1976)。它切割寡糖的N-乙酰葡糖胺核心的β-l,4-糖苷键，并且留下一个与糖蛋白的天冬酰胺残基附接的N-乙酰壳二糖(Trimble等人,1978；Muramatsu1971)。褶皱链霉菌(S.plicatus)的Endo H基因为939bp(GenBank登录号AAA26738.1)，编码28.9kDa的蛋白质。最近，来自褶皱链霉菌的Endo H在毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达，并且通过共发酵和发酵后两种处理在体外都展示了毕赤酵母产生的Endo H的去糖基化活性(Wang等人,2015)。
在一些方面，融合蛋白的一个或多个糖基化位点的去除是通过将融合蛋白用O-糖苷酶(New England Biolabs，马萨诸塞州伊普斯维奇)处理来实现的。O-糖苷(也称为内切-α-N-乙酰半乳糖胺糖苷酶)催化从糖蛋白中去除核心1和核心3O-连接的二糖。在一些方面，它从糖蛋白释放未取代的Ser-和Thr-连接。
融合蛋白的一个或多个糖基化位点的去除可以在细胞培养物(例如，生物反应器)中产生IL2蛋白后、在细胞培养物中产生IL2融合蛋白时、在收获融合蛋白后和/或在纯化融合蛋白时实现。在一些方面，一个或多个糖基化位点的去除可以通过在细胞培养期间在表达融合蛋白时添加一种或多种去除剂来实现。在其他方面，一个或多个糖基化位点的去除可以通过选择特定细胞类型作为消除糖基化或具有减少的糖基化的宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)或链霉菌属物种)来实现。在某些方面，一个或多个糖基化位点的去除是通过使编码融合蛋白的基因与编码去除一个或多个糖基化的酶的基因共表达来实现的。
II.D.包含IL2融合蛋白的药物组合物
在一些方面，将IL2融合蛋白作为药物组合物的一部分施用至受试者，所述药物组合物包含IL2融合蛋白和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。
如本文所用，语言“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑了其在组合物中的用途。也可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
配制本公开文本的药物组合物以与其预期的施用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(外用)和经粘膜。另外，可能需要向需要治疗的区域局部施用治疗剂量的药物组合物。这可以通过例如在外科手术期间局部或区域输注或灌注、外用施用、注射、导管、栓剂或植入物(例如，由多孔、无孔或凝胶状材料(包括膜(如硅橡胶膜)或纤维)形成的植入物)等来实现。在另一个方面，在囊泡(如脂质体)中递送治疗剂量的药物组合物(参见例如，Langer,Science 249:1527-33(1990)；和Treat等人,Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,LopezBerestein和Fidler(编辑),Liss,N.Y.,第353-65页,1989)。
在又另一个方面，可以在控释系统中递送治疗剂量的药物组合物。在一个例子中，可以使用泵(参见例如，Langer,Science 249:1527-33(1990)；Sefton,Crit.Rev.Biomed.Eng.14:201-40(1987)；Buchwald等人,Surgery 88:507-16(1980)；Saudek等人,N Engl.JMed.321:574-79(1989))。在另一个例子中，可以使用聚合材料(参见例如，Levy等人,Science 228:190-92(1985)；During等人,Ann.Neural.25:351-56(1989)；Howard等人,JNeurosurg.71:105-12(1989))。也可以使用其他控释系统，如由Langer(Science 249:1527-33(1990))讨论的控释系统。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在肠胃外制剂中使用的药学上可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬剂和分散剂、乳化剂、螯合剂(sequestering或chelating agent)和其他药学上可接受的物质。水性媒介物的例子包括氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格氏注射液。非水性肠胃外媒介物包括植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂添加到在多剂量容器中包装的肠胃外制剂中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。助悬剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(80)。金属离子的螯合剂(sequestering或chelating agent)包括EDTA。药物载体还包括用于水混溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELS(BASF，新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物都必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。它在制造和储存条件下必须稳定，并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，将优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所枚举成分中的一种或组合的适当溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文所枚举成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
对于通过吸入施用，从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体如二氧化碳)或者雾化器以气溶胶喷雾的形式递送化合物。全身性施用也可以通过经粘膜或经皮方式进行。
对于经粘膜或经皮施用，在配制品中使用适合待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且例如对于经粘膜施用，包括洗涤剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮施用，将活性化合物配制成如本领域通常已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。也可以将化合物制备为呈栓剂(例如，用常规栓剂基质如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式以供直肠递送。
在一个方面，用载体制备活性化合物，所述载体将保护化合物免于从身体迅速消除，如控释配制品，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的可生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类配制品的方法对于本领域技术人员而言将是清楚的。材料也可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体悬浮液也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据例如如在美国专利号4,522,811中所述的本领域技术人员已知的方法来制备。
以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物是尤其有利的，以便于施用和剂量的均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位，其中每个单位含有经计算与所需的药物载体联合产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物。本公开文本的剂量单位形式的规格取决于并且直接依赖于活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，以及在合成用于治疗个体的这种功能性化合物的领域中固有的局限性。药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
除非另外指示，否则本公开文本的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，所述技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中有充分解释。参见例如，Sambrook等人编辑(1989)MolecularCloning A Laboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人编辑(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold SpringsHarbor Laboratory,NY)；D.N.Glover编辑,(1985)DNA Cloning,第I和II卷；Gait编辑(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编辑(1984)TranscriptionAnd Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical GuideTo Molecular Cloning；论文Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold SpringHarbor Laboratory)；Wu等人编辑,Methods In Enzymology,第154和155卷；Mayer和Walker编辑(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(AcademicPress,London)；Weir和Blackwell编辑,(1986)Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；Crooks,Antisense drug Technology:Principles,strategies and applications,第2版CRC Press(2007)以及Ausubel等人(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)。
将以上引用的所有参考文献以及本文引用的所有参考文献和氨基酸或核苷酸序列(例如，GenBank号和/或Uniprot号)都通过引用以其整体并入本文。
通过说明的方式而不是通过限制的方式，提供以下实施例。
III.实施例
III.A.BMS-986326的非临床研究
非临床药理学
BMS-986326的生物化学和生物物理学表征表明，它主要作为自阻断同二聚体存在，在37℃下的体外解离半衰期为大约3天并且估计的解离常数(Kd)为1pM。BMS-986326与人、食蟹猴、小鼠和大鼠CD25(IL-2Rα)的结合亲和力分别为：2,410nM、2,000nM、4,200nM和7,500nM，并且对于IL-2Rβγ(作为预装配的异二聚体)，分别为：111nM、105nM、>4,000nM和>4,000nM。基于这些亲和力值，猴是用于评价BMS-986326药理学的合适物种，而啮齿动物相对于人可以展现出改变的药理学。由于活性单体水平低，与重组IL-2相比，BMS-986326的体外效力降低了>100倍。在Kit225干扰素调节因子1(IRF1)驱动的报告细胞系中，BMS-986326所显示出的平均半最大有效浓度(EC50)为3.4nM±1.8，相比之下重组IL-2为0.027nM±0.014。在测量Treg中STAT5的磷酸化(pSTAT5)(IL-2信号传导的近端标记物)的全血测定中，BMS-986326在人血中所展现出的EC50为0.23nM±0.14，并且在猴血中为0.078nM±0.040。在全血测定中，BMS-986326展示出对Treg的选择性，在Treg中检测到近最大信号(在最高的药物浓度下pSTAT5+Treg>90％)，并且在常规CD4+FoxP3-T细胞(Tconv)、CD8细胞和NK细胞中仅检测到部分信号(在71nM的最高药物浓度下pSTAT5+细胞<50％)。
由于人IL-2与小鼠IL-2Rβγ二聚体结合的亲和力的显著差异，以及为了在慢性功效研究中避免潜在的抗药物抗体(ADA)，使用小鼠替代品(mIL2-CD25)来探索在小鼠疾病模型中同源二聚体融合蛋白的活性。在BALB/c野生型小鼠中，相对于可结晶片段(Fc)和mIL-2融合蛋白(Fc-mIL2)或日剂量的鼠IL2(mIL2)，mIL2-CD25显示出延长的药代动力学(PK)，以及稳健的Treg扩增与相对于CD8细胞和NK细胞增强的Treg选择性。在两个狼疮小鼠模型中测试了mIL2-CD25分子：NZB/W和MRL/lpr，它们显示出在人中观察到的狼疮样症状的经典表现。在两种小鼠模型中，早期疾病的mIL2-CD25治疗都展示出稳健且剂量依赖性的药效学(“PD”；Treg增殖和扩增以及Treg上IL-2信号传导的生物标记物)，以及类似于高剂量类固醇治疗的疾病终点的稳健改善：自身抗体和肾损伤的减少与肾功能的改善。在这些研究中，0.2mg/kg的剂量是提供最大功效的最小剂量。另外，当与低剂量类固醇治疗(0.1mg/kg泼尼松龙)组合时，次优剂量的mIL2-CD25(0.1mg/kg)显示出加性功效。在小鼠研究中测量Treg百分比(在CD4+T细胞门内)作为主要PD读数。CD4+T细胞门中Treg％的变化通过从治疗组中CD4+T细胞门中的Treg％减去媒介物组中CD4+T细胞门中的Treg％来计算，表示为ΔTreg％。在以每周两次(BIW)给药进行的几项研究中，在引起最大功效的剂量(0.2mg/kg)下，CD4+群体中的Treg百分比比媒介物对照水平增加了Δ12％至Δ18％(取决于研究和对Treg的门控定义)。在NZB/W模型中，尽管事实是每5天一次(Q5D)研究的Treg水平在PK谷处适度下降，但用BIW和Q5D的给药频率实现了类似的功效。使用来自NZB/W疾病模型的数据来确定目标PD反应以确定功效，以帮助人体剂量预测。
在猴单次皮下(SC)注射后评价在大范围的剂量(0.075mg/kg、0.25mg/kg、0.75mg/kg和2.5mg/kg，分别对应于大约48、157、407和1046μg·h/mL的AUC)下BMS-986326的PK、PD和耐受性。在此研究中，在所有剂量下，Treg的频率、绝对数目和增殖百分比都有明显的剂量依赖性增加。在所有剂量下，在Treg上通过流式细胞术分析测量的指示IL-2R信号传导的标记物(包括STAT5的磷酸化以及CD25的表达)也都有增加。尽管关于在任何剂量下Tconv或CD8+T细胞中pSTAT5水平或细胞表面CD25表达的变化的证据极少，但有证据表明了Tconv和CD8+T细胞在所测试的两种最高剂量下的剂量依赖性扩增和增殖。另外，在2.5mg/kg的最高剂量水平下，在猴中观察到较差的耐受性。在0.25mg/kg的耐受性良好的Treg选择性剂量下，CD4 T细胞中Treg的峰值百分比距基线的变化达到了远高于在小鼠模型中最大功效所需的Treg％水平(比媒介物对照高Δ12％-18％)的水平(在峰处比给药前高Δ23％，在峰处比给药前增加4.8倍)。另外，在此剂量下，CD4+T细胞门中的Treg％比基线高Δ10％的增加得到维持，直到第21天施用。总的来说，这些数据证明BMS-986326在预期的有效剂量下引起具Treg选择性的稳健且延长的PD反应。
非临床药代动力学
进行了各种体外和体内研究以表征BMS-986326在非临床环境中的PK。用于确定BMS-986326或mIL2-CD25的血清暴露的配体结合测定测量包括活性单体和无活性二聚体形式的总浓度。在静脉内(IV)施用后，在小鼠和猴中BMS-986326的稳态分布容积(Vss)分别为0.0954和0.0734L/kg。在小鼠和猴中，BMS-986326的总血清清除率(CLT)分别为3.25和0.769mL/h/kg，并且皮下(SC)给药后的表观消除半衰期(T-HALF)分别为1.18和3.30天。在小鼠和猴中皮下给药后的最大浓度时间(Tmax)分别为7和24小时。皮下给药后的绝对生物利用度在小鼠中为58％，并且在猴中为46％。在皮下施用BMS-986326后在人血清样品中进行的体外研究(长达72小时)和在猴血清样品中进行的离体研究(长达168小时)在经由IL-2的免疫捕获后通过测量基于液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的IL-2和CD25的面积比进行评估时未显示出接头切割的迹象。
人PK使用猴PK参数的异速放大法(allometric scaling)来预计，并且假定其具有与猴中类似的皮下生物利用度。预计在人中的半衰期为6天。由于已表明BMS-986326对猴和人IL-2Rα和IL-2Rβγ具有相当的结合亲和力，并且在猴和人全血测定中具有相当的体外效力，因此使用猴PK/PD模型参数预计人PD反应(包括CD4+Treg、CD8+T细胞和pSTAT5+Treg％的细胞计数的变化)。
使用两种方法预计BMS-986326在人中的有效剂量。第一种方法是基于用mIL2-CD25给药的小鼠模型中的最大临床前功效。由于在NZB/W小鼠模型中mIL2-CD25(0.2mg/kgBIW)的最大功效与在谷处CD4+T细胞中的Treg超过基线Δ14％相关，因此在谷处的类似PD反应被用于预计BMS-986326的人体有效剂量。BMS-986326在人中达到在谷处CD4+T细胞中的TregΔ14％目标的有效剂量为6mg SC，每2周给予一次(Q2W)。在此剂量下，BMS-986326的预计稳态最大血清浓度(Cmax,ss)为1.5μg/mL，预计的AUC(TAU)为217μg·h/mL，并且预计的稳态最小浓度(C谷,ss)为0.3μg/mL。
在随后的研究中，在NZB/W小鼠模型中降低的mIL2-CD25给药频率(0.2mg/kg Q5D)也展示出最大功效，谷暴露要低10倍。因此，预测将达到与6mg SC Q2W剂量相比低10倍的C谷,ss(0.03μg/mL)的每月一次(Q1M)给予的6mg SC的预计人体剂量具有类似的功效。预测6mg Q1M给药方案在峰处实现CD4+T细胞中的TregΔ12％，并且在谷处实现CD4+T细胞中的TregΔ4％。
用于预计BMS-986326的人体有效剂量的第二种方法是基于重组人IL-2(rhIL-2)在SLE患者中的功效的临床证明。在SLE患者中进行的临床研究中，将rhIL-2每隔一天以1MIU(百万国际单位)皮下给药2周，然后是为期2周的无治疗期，得到具有CD4+T细胞中的TregΔ5％的峰和CD4+T细胞中的TregΔ1％的谷的Treg分布。由于与安慰剂相比，显示此治疗可改善SLE应答指数4(SRI-4)，因此类似的Treg分布被用于估计BMS-986326的有效剂量。基于临床数据，BMS-986326在人中实现类似的Treg分布的预计有效剂量为2mg SC Q1M。在此剂量下，BMS-986326的预计Cmax,ss为0.4μg/mL，预计的AUC(TAU)为71μg·h/mL，并且预计的C谷,ss为0.01μg/mL。综上所述，预计BMS-986326在人中的有效剂量范围为2至6mg SCQ1M。
非临床毒理学
基于体外受体亚基结合数据和已证明的体内药理学(选择性Treg扩增)以及在历史上已经用于IL-2R激动剂分子证明了大鼠和猴是相关的毒理学物种。使用选定的给药频率，在大鼠(长达2周)和猴(长达12周)中进行的一系列研究中表征了BMS-986326的单剂量毒性和重复剂量毒性。在两个物种中进行的关键良好实验室规范(GLP)重复剂量研究都采用皮下施用BMS-986326并且包括以下研究：在大鼠中使用不同剂量频率进行的两项为期2周的研究(每周一次[QW]相比于每周两次[2QW])，在猴中进行的为期2周的每周一次的给药研究，以及在猴中进行的为期12周(每3周一次，Q3W)的给药研究。另外，最初在大鼠和猴两者中都完成了单剂量探索性研究以探索BMS-986326的耐受性，并且在遥测猴中使用静脉内给药也完成了单剂量GLP IV毒性和心血管安全性研究以支持在首次人体(FIH)单次递增剂量(SAD)研究(IM034001)中进行静脉内施用。
在大鼠中，注意到BMS-986326是高度免疫原性的，在84％ BMS-986326治疗的大鼠中发生ADA形成。通常，ADA的存在与暴露减少和PD活性丧失相关，但是与毒性无关。在猴中，ADA在关键毒性研究中总体上不会在暴露于BMS-986326后产生，并且在探索性研究中发生率较低。
在每项毒性研究的所有剂量下预期和非预期的PD效应都以剂量依赖性方式发生，并且在猴中比在大鼠中总体上更为明显。作为IL-2R激动剂，BMS-986326在大鼠和猴中在所有剂量下都诱导Treg细胞中STAT5的最大磷酸化(72％至95％)，增加Treg细胞(在猴中高达63倍)和/或CD4 Treg上的CD25表达(在大鼠中高达4.5倍)，并且提高IL-10的血清水平(在大鼠中高达2倍并且在猴中高达87倍)。除了对Treg的期望的药理效应外，BMS-986326还导致非预期的效应，包括常规CD4和CD8 T细胞群体和NK细胞的剂量依赖性激活，以及血清IL-5、MCP-1和穿孔素的伴随升高。在猴中当每周给药时在较高剂量的BMS-986326下，还注意到B细胞(1.6倍)和其他炎性细胞因子(如IFN-γ(7.9倍)、IL-1Ra(49倍)和IL-6(5.1倍))的增加。在为期12周的猴毒性研究中，当将较低剂量的BMS-986326以较低频率(Q3W)给予时，这些炎性细胞因子并不升高。
在给药后恢复期后，所有PD效应(预期和非预期的)总体上都是可逆的。总体上在给药后4-12天观察到药理学反应的峰值，并且在频率更高的给药方案的情况下(即，在大鼠中每周两次或在猴中每周一次，其中在PD反应的峰值处施用连续剂量)，这与更高的毒性发生率和严重程度相关(参见下文)。在为期12周的其中以较低频率(每3周)施用剂量的猴研究中，就在每个连续剂量前(给药后3周)，Treg和非Treg两者中的PD反应都从其在给药后4-12天的峰值反应减少，因此，有证据表明了在所有剂量下的靶标接合和良好免疫调节倾向，在大多数动物中对非预期的免疫应答的刺激最小。综上所述，尽管在以Q3W给药进行的为期12周的猴研究中既观察到预期的剂量相关药理效应又观察到一些非预期的剂量相关药理效应，但在整个剂量范围内Treg的增加幅度比常规T细胞的增加高出多达大约2倍。
在给予5、25、75或200mg/kg的皮下剂量的大鼠中进行的单剂量探索性研究中，雄性大鼠不耐受≥25mg/kg/天(平均AUC[0-96h]≥2,080μg·h/mL)的BMS-986326，导致在第5天发病或死亡，临床病理变化指示出血、肝胆损伤和功能性胆汁淤积，所有都与IL-2的高剂量效应一致。在5mg/kg(平均AUC[0-96h]＝501μg·h/mL)下未观察到有害效应。
在猴中以0.075、0.25、0.75或2.5mg/kg的皮下剂量进行的单剂量探索性耐受性PK/PD研究中，高达0.75mg/kg(AUC[INF]407μg·h/mL)的剂量是耐受性良好的，PD终点有期望的(Treg中STAT5的磷酸化与Treg扩增以及增加的Treg上的CD25表达和IL-10)和非预期的(Tconv和CD8+T细胞的适度扩增、促炎性细胞因子(包括IL-5、MCP-1、穿孔素和GM-CSF)的增加)变化，以及嗜酸性粒细胞增多和红细胞量减少。2.5mg/kg(AUC[INF]1040μg·h/mL)的BMS-986326是不耐受的，有几只猴展现出液体粪便、活动减少、异常/鳞状/红色皮肤和重度脱水，以及指示很可能与腹泻和脱水有关的细胞因子释放、肝毒性和肾损害的临床病理学特征。
在猴中进行的关键单剂量IV毒性和心血管安全性研究中，所有剂量(0.05、0.15或0.5mg/kg；平均AUC[0-336h]≤757μg·h/mL)的BMS-986326在临床上都是耐受性良好的。与重组hIL-2(其在高剂量下引起降压效应和毛细血管渗漏综合征(CLS))不同，在所施用的BMS-986326剂量下未观察到血压降低、CLS样效应或者对血液动力学或心电图参数的其他影响。在所有剂量下值得注意的毒理学发现包括与骨髓中嗜酸性粒细胞的极少至中度髓系增生和脾脏中嗜酸性粒细胞细胞密度的极少至轻度增加(与脾脏增大和重量增加相关)相关的嗜酸性粒细胞的极少至明显增加(高达91.6倍)。在0.5mg/kg的高剂量下，另外的值得注意的发现包括可能与促炎性细胞因子升高有关的平均体温的短暂升高(高达1.1℃)，校正QT间期的短暂降低和心率的最低限度增加(相对于基线4％)，以及广泛反映短暂、低度炎症反应的临床病理学特征。通过显微镜，在一些组织中有剂量依赖性的嗜酸性粒细胞和单个核细胞的多系统浸润。基于变化的小幅度和性质、所检查的所有组织/器官中组织损伤和炎症变化的缺乏以及没有相关的功能后果，所有发现都被认为是非不利的，并且在猴中单次静脉内剂量后的无可见有害作用水平(no-observed-adverse-effect level，NOAEL)被认为是0.5mg/kg IV的高剂量(平均AUC[0-336h]＝757μg·h/mL)。
在大鼠中以不同给药频率进行的两项单独的为期2周的毒性研究中，将BMS-986326以0.5、1或2.5mg/kg SC的每周两次剂量或者以0.25、0.5或1mg/kg SC的每周一次剂量施用，并且其在所有剂量(≤2.5mg/kg，平均AUC[0-336h]≤600μg·h/mL)下在临床上都是耐受的。由于ADA的影响，注意到在每项研究的第一周期间的暴露最高，并且在第二周期间的暴露大大减少。不利发现仅在每周两次的研究期间发生，并且包括在所有剂量(≥0.5mg/kg 2QW，第1天的平均AUC≥189μg·h/mL)下脾脏的囊性纤维增生(capsularfibroplasia)和炎症以及在2.5mg/kg下血小板计数的减少(0.8倍至0.4倍)。在所有每周两次剂量下的脾脏囊性纤维增生与炎症由于中度至明显的严重程度都被认为是不利的，并且还与肠系膜(与胃和胰腺相邻)的极少至轻度炎症相关，这进一步导致该发现的不利性。结果，在每周两次的给药研究中未鉴定出NOAEL。在所有剂量(≥0.5mg/kg，每周两次)下其他值得注意的非不利发现包括嗜酸性粒细胞的增加(3倍至22倍于对照)，IL-2激动剂药理活性的反映并且与IL-5增加相关；以及嗜酸性粒细胞向若干器官浸润的发生率和/或严重程度增加。总体而言，与每周2次给药所展示的情况相比，为第二项为期2周的大鼠研究选择的降低的剂量水平和频率(每周一次)成功地维持了靶标接合并且减少了非预期的药理作用。在所有每周一次剂量(0.25、0.5或1mg/kg)下主要BMS-986326相关效应的严重程度大多极小，并且包括嗜酸性粒细胞增加(1.9倍至6.7倍)；脾脏的极少囊性纤维增生/纤维化，邻近肠系膜没有炎症或损害；以及药理介导的嗜酸性粒细胞向少数组织的浸润，由于变化幅度小并且缺乏所受累器官的功能完整性受到任何损害的证据，其中没有一个被认为是不利的。在大鼠中每周一次给药2周后的NOAEL为1mg/kg(平均AUC 162μg·h/mL)。
在猴中以0.125、0.25或0.75mg/kg SC的每周剂量进行的为期2周的毒性研究中，≤0.25mg/kg的BMS-986326在临床上是耐受的，但是导致与在0.75mg/kg下的IL-2R激动作用和免疫刺激一致的不利临床毒性体征，包括活动减少、脱水、红斑、瘀点和体温升高。在所有剂量下，值得注意的BMS-986326相关毒理学发现总体上是剂量相关的，并且主要涉及对白细胞的影响(即嗜酸性粒细胞增多[4倍至40倍]，伴有相关的组织炎症/浸润)；红细胞量(0.9倍至0.6倍于测试前)和血小板(0.9倍至0.6倍)的减少；脾脏红髓充血；肝脏重量增加(16％至75％)，与细胞密度增加、窦状隙白细胞增多和库普弗细胞肥大相关；以及骨髓的极少至中度髓系增生，很可能是对嗜酸性粒细胞增多的再生反应。在包括脑的脉络丛和眼睛的脉络膜在内的多个组织和器官(约16至28个剂量相关数目的受影响的组织)中发生了极少至轻度的泛发多灶性混合细胞炎症。在≥0.25mg/kg/周下在眼脉络膜和脑脉络丛中的混合细胞炎症以及在0.75mg/kg/周下RBC量的减少由于这些发现的严重程度和性质而被认为是不利的，但是在0.125mg/kg/周下由于极小的严重程度和低的发生率而被认为是非不利的。在0.75mg/kg/周的高剂量下，另外的值得注意的发现包括心率增加(25％至28％)，伴有R-R间期的相关降低，被认为是继发于细胞因子释放并且被认为是非不利的；肝脏的极少至中度肝细胞空泡化；肾脏中的极少至轻度皮质小管再生；以及仅在恢复期处死时，2只雄性的坐骨神经的极少至轻度轴突变性。基于在≥0.25mg/kg/周(平均AUC[0-168h]≥234μg·h/mL)下眼脉络膜和脑脉络丛的不利炎症以及在0.75mg/kg/周(平均AUC[0-168h]≥601μg·h/mL)下伴有临床体征和红细胞量的不利减少，NOAEL被认为是0.125mg/kg/周(平均AUC[0-168h])132μg·h/mL)。
在为期12周的猴研究中，与以0.0625、0.125或0.25mg/kg SC Q3W(第1、22、43和64天)施用BMS-986326的为期2周的研究相比，剂量范围和频率减小。在所有剂量下，BMS-986326相关发现都是非不利的，并且包括嗜酸性粒细胞计数的极小至轻度非不利增加(3倍至8倍于对照)、脾脏的大小和重量增加(26％至65％)以及骨髓中的极少嗜酸性粒细胞髓系增生。重要的是，注意到没有嗜酸性细胞或单个核细胞向其他组织的浸润。基于没有临床效应以及临床病理和病理发现的非不利性质，NOAEL被认为是0.25mg/kg/剂的最高测试剂量(平均AUC 306μg·h/mL)。
考虑到BMS-986326的不同结构、大多数BMS-986326作为无活性二聚体循环的倾向、BMS-986326相比于rhIL-2的差异巨大的PK以及跨物种和研究的差别很大的剂量方案，BMS-986326与rhIL-2非临床研究之间的剂量比较具有挑战性。定性地说，BMS-986326的毒性特征表明与rhIL-2有一些相似之处，但是也有显著差异。相似之处包括嗜酸性粒细胞增多和白细胞向组织的浸润，主要是嗜酸性粒细胞并且有时包括单个核细胞。这些发现可见于所有BMS-986326毒理学研究中，并且在多种物种中在各种给药范式下针对rhIL-2以不同的严重程度都有报道。嗜酸性粒细胞增多(其在临床上也在低剂量和高剂量rhIL-2((阿地白介素)，Novartis Pharmaceuticals Canada Inc.)的情况下被观察到)很可能是继发于通过IL-2刺激的ILC2的IL-5产生(Van Gool等人,Blood 124:3572-6(2014)；Anderson等人,Int Rev Exp Pathol.34第A部分:57-77(1993))，并且在BMS-986326研究中不是不利的。关于白细胞在组织中的浸润，在关键毒性研究中所研究的剂量下，肝脏是rhIL-2的主要靶器官，但是不是BMS-986326的重要靶标(Anderson等人,Int RevExp Pathol.34第A部分:57-77(1993)；Harada等人,Int Rev Exp Pathol.34第A部分:37-55(1993))。肝功能障碍是肿瘤适应证中高剂量rhIL-2的常见副作用，而肝功能障碍在包括GvHD、1型糖尿病、斑秃和SLE在内的多种适应证中在低剂量rhIL-2的临床试验中尚未成为特征(Castela等人,JAMA Dermatol.150:748-51(2014)；He等人,Nat Med.22:991-93(2016)；Klatmann等人,Nat Rev Immunol.15:283-94(2015)；Koreth等人,Blood 128:130-37(2016))。除了肝功能障碍外，CLS也限制疗法在高剂量IL-2肿瘤方案下在人中使用。在GLP关键非临床研究中，在BMS-986326的情况下尚未观察到CLS。
总体而言，关键BMS-986326研究中的NOAEL剂量为在正常健康参与者中进行的单剂量首次人体(FIH)研究提出的剂量起始和剂量递增提供了合适的暴露边际。
III.B.BMS-986326的1期临床评价
总体概述
在1期、随机、双盲、安慰剂对照、单次递增剂量(SAD)研究中评估BMS-986326，以在健康成人参与者中评价单剂量BMS-986326的安全性、耐受性、药代动力学(PK)和药效学(PD)。
研究的主要目的是评估健康参与者中单次递增静脉内(IV)和皮下(SC)剂量的BMS-986326的安全性和耐受性。
研究的次要目的包括：
·确定健康参与者中静脉内和皮下BMS-986326的单剂量PK；
·确定与静脉内施用相比皮下施用后BMS-986326的绝对生物利用度；
·评估皮下和静脉内施用BMS-986326后的PD；以及
·评价皮下和静脉内施用BMS-986326后免疫原性的潜力。
靶标受试者群体
健康的成人参与者符合研究的条件。仔细考虑研究的资格标准以确保研究参与者的安全并且确保研究的结果可以使用。健康参与者(而非患者)的入组允许清楚解释安全性结果，因为没有由疾病状态变化、并发器官功能障碍和/或伴随药物引起的混杂因素。另外，在健康参与者中的新分子实体的评估避免了在患者中进行时的疾病潜在恶化的风险。
在研究的每个队列中纳入安慰剂治疗的参与者有助于评估在研究中所评估的对于所有研究程序的相比于基线参数的任何变化，并且帮助确定这些变化是否与BMS-986326的施用或与研究程序相关。
研究的总体设计
将研究的参与者随机分为大约9个总剂量水平队列，其中有8个队列(静脉内队列A1-A5；皮下队列B1-B3)和1个任选的静脉内(A6)队列。
每个参与者的研究总持续时间长达12周，包括长达28天的筛查期、21天的临床现场内部观察期和大约34天的门诊/随访期。
根据以下提供的用于施用试验用药品的程序，多达大约6个队列(队列A1-A6)接受单次静脉内输注BMS-986326。根据以下提供的用于施用试验用药品的程序，大约3个队列(队列B1-B3)接受经由一次或多次皮下注射BMS-986326给予的单剂量。因为这是首次人体(FIH)研究，研究设计允许以逐步方式收集安全性、耐受性、PK和PD数据。在接受过静脉内给予的类似剂量的参与者队列中证明可接受的安全性和耐受性后进行BMS-986326的皮下施用。
在所有队列中对由2名健康参与者组成的哨兵组进行评价。此哨兵组1:1随机化至安慰剂组或BMS-986326组。将每个剂量水平内的其余6名参与者分别1:5随机化至安慰剂组或BMS-986326组。哨兵组给药后至少120小时，如果安全性特征是可接受的安全性特征(至少基于不良事件(AE)、伴随药物和程序以及任何其他重要的安全性相关临床观察)，则队列的其余者根据随机化时间表给药。对于静脉内队列，其余6名参与者依序给药并且每天最多2名参与者。在一些方面，以参与者之间至少2小时的间隔向参与者给药。
直到在接受了静脉内给予的类似剂量的参与者队列中证明可接受的安全性和耐受性并且评价PD(Treg计数和Treg与常规CD4细胞[Tconv]比率)数据后，皮下剂量水平队列才开始。
在研究过程期间，每个参与者完成筛查期和治疗期(包括基线和门诊就诊)，如图1A所示。对参与者进行资格筛选。从第-2天或第-1天直到第21天，符合条件的参与者居住在临床现场。根据随机化时间表在第1天施用试验用药品(安慰剂或BMS-986326)。在令人满意的安全性审查并且完成所需的研究程序后，参与者在第21天从临床现场出院。参与者在第28、36、45和55天返回门诊就诊，以评价在第10至18天之间的预期PD反应高峰后Treg扩增的持久性和潜在ADA的发展。如果参与者提前停止研究，则进行提前终止访视。
每个队列完成给药后，在剂量递增前审查包括但不限于AE、体格检查(PE)、生命体征、12导联安全性ECG、注射部位评价、临床实验室安全性测试结果(包括嗜酸性粒细胞计数)、伴随药物/程序和PD数据(包括Treg计数和Treg与Tconv比率)的安全性数据。将来自完成队列的PK数据持续不断地用于预测暴露。
计划的剂量水平如图1B所示。如以下提供的剂量递增程序所述，计划的剂量水平(包括最高剂量)可以根据来自先前队列的新得到的PD和PK数据(包括来自皮下队列的生物利用度数据)进行调整。当需要改变计划的剂量递增步阶时，最大剂量递增步阶大约≤上一剂量水平的3倍。仅施用这样的静脉内剂量，预测其外推至无限时间的血清浓度-时间曲线下平均暴露面积(AUC[INF])不超过大约757μg·h/ml的AUC[0-336小时(h)]。仅施用这样的皮下剂量，预测其平均暴露(AUC[INF])不超过AUC(0-504h)≤306μg·h/ml。
如以下提供的剂量修改/停止标准所述，如果受试者经历严重不良事件可以停止递增到下一个剂量水平。严重不良事件包括在被施用研究治疗的临床研究参与者中的任何新的不幸医学事件或先前存在的医学状况的恶化，并且其不一定与此治疗有因果关系。
主要和次要终点
本研究的主要终点，其用于评价在健康参与者中评估BMS-986326的单次递增静脉内和皮下剂量的安全性和耐受性的主要目的，包括不良事件、临床实验室值、生命体征、心电图和体格检查的评价。这些评估将在下文中进一步讨论。
与确定健康参与者中静脉内和皮下BMS-986326的单剂量药代动力学(“PK”)的次要目的相关的研究终点包括血清PK参数，例如：
·Cmax：观察到的最大血清浓度；
·Tmax：观察到的最大血清浓度的时间；
·AUC(0-T)：从时间零到最后可计量浓度的时间的血清浓度-时间曲线下面积；
·AUC(INF)：从时间零外推至无限时间的血清浓度-时间曲线下面积；
·CLT/F或CLT：对于静脉内，表观总体清除率或总体清除率；
·Vz/F或Vz：对于静脉内，末端相时表观分布容积或末端相时分布容积；
·T-HALF：末端相半衰期；和
·F：绝对生物利用度。
与确定在皮下施用相比于静脉内施用后BMS-986326的绝对生物利用度的次要目的相关的研究终点包括皮下(测试)与静脉内(参考)的以下几何平均比率：通过剂量校正的Cmax、AUC(0-T)和AUC(INF)。
与评估在皮下和静脉内施用BMS-986326后的药效学的次要目的相关的研究终点包括测量Treg计数和Treg与Tconv比率相比于基线的变化。
与评价在皮下和静脉内施用BMS-986326后免疫原性潜力的次要目的相关的研究终点包括测量可以中和或可以不中和的抗药物抗体的发生率。
哨兵给药的基本原理
研究中利用哨兵给药策略以在有突发急性安全事件时使风险最小化。在研究的所有剂量队列中对两名健康参与者(1名施用活性药物和1名施用安慰剂)进行评价。在对同一队列的其余参与者给药之前，观察每个哨兵组最少120小时。基于猴中的毒性研究，所述研究表明，总体上在给药后4天开始观察到峰值药理学反应，至少5天的临床安全性监测覆盖了急性发作如毛细血管渗漏综合征(CLS)或免疫激活(例如，细胞因子释放综合征)的潜在安全顾虑。基于可用的安全性数据(例如，不良事件(AE)、生命体征、体格检查(PE)、心电图(ECG)和临床实验室检验)做出继续对与哨兵参与者在同一队列中的其余参与者给药的决定。
剂量范围的基本原理
为研究选择的剂量范围预计提供一定范围的暴露和药理活性，从而提供足够的、适当阶段的安全性数据并且允许表征PK/PD关系。
0.1mg IV的起始剂量的选择基于可用的临床前PK、毒理学和药理学数据。进行PK/PD建模和模拟以由非临床数据生成预测的人PK和PD特征。实际剂量递增(不超过大约3倍剂量递增增量)和测试的实际剂量通过来自研究的新得到的PK、PD和安全性数据来确定。这是一项旨在允许安全性、耐受性、PK和PD数据的FIH研究。
表4列出了由建议的剂量引起的预计PD变化和暴露：
表4：在建议的人剂量下的预计暴露和峰值药效学反应
药物特性和试验用药品的配制品(注射用BMS-986326-01，30mg/小瓶(25 mg/mL))
已开发出注射用BMS-986326-01(30mg/小瓶；25mg/mL)，以用作1期临床研究的静脉内输注或一次或多次的皮下注射。所述药物产品是一种无热原亲液物，其是包含在用13mm塞子封闭，并且用13mm铝密封圈密封的3cc I型玻璃小瓶中的白色至灰白色、完整或分裂的饼状物。每个小瓶的药物产品均含有标示量的BMS-986326药物物质、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、蔗糖、三胺五乙酸和聚山梨醇酯80、以及盐酸和氢氧化钠(用于pH调节)，pH为7.0。在每个小瓶中包含0.31mL的过填充以考虑VNS(小瓶、针、注射筒)滞留。将药物产品在施用前进行重构。
在施用前，将每个小瓶的注射用BMS-986326-01(30mg/小瓶；25mg/mL)用0.9％氯化钠注射液(生理盐水)重构至蛋白质浓度为25mg/mL。对于皮下使用，药物产品可以通过管线过滤器作为皮下团注注射液施用，所述药物产品是在25mg/mL的蛋白质浓度下未稀释的或者是用0.9％氯化钠注射液稀释至0.2mg/mL的蛋白质浓度。对于静脉内使用，通过管线过滤器输注药物产品；在输注前，将药物产品用0.9％氯化钠注射液稀释至0.2mg/mL至5mg/mL的蛋白质浓度范围内。
在BMS-986326注射液与不含二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯(DEHP)的聚烯烃或PVC(DEHP增塑的)包、不含DEHP的或PVC(DEHP增塑的)静脉内装置和0.2μm聚醚砜或尼龙过滤器之间未观察到不相容性。
对于注射用BMS-986326-01的安慰剂是可商购的0.9％氯化钠注射液。
将注射用BMS-986326-01的小瓶(30mg/小瓶；25mg/mL)在2℃-8℃(36°F-46°F)下冷藏储存并且避免光照和冷冻。
注射用BMS-986326-01的重构和稀释溶液可以在2℃-8℃(36°F-46°F)的冷藏下储存长达24小时，并且总24小时中最多有4小时在15℃-25℃(59°F-77°F)的室温下以及暴露于室内光线下。在室温和室内光线条件下的最多4小时期间包括产品施用时间段。
施用试验用药品的程序
静脉内队列(A1-A6)中的参与者在第1天接受经由静脉内输注施用的单剂量。皮下队列(B1-B3)中的参与者在第1天接受经由一次或多次皮下注射施用的单剂量。每个队列的计划剂量水平包括在下表5中。如以下提供的剂量递增程序所述，计划剂量水平(包括最高剂量)可以根据来自先前队列的新得到的PD和PK数据(包括来自皮下队列的生物利用度数据)进行改变。假如需要改变计划的一个或多个剂量递增步阶，则最大剂量递增步阶将大约≤上一剂量水平的3倍。
每个参与者接受取决于BMS-986326剂量队列的皮下或静脉内剂量。缓慢且稳定地施用一次或多次皮下注射到腹部皮肤皱襞(脐部周围5cm除外)中。每次注射最多2mL的体积。如下所述，监测注射部位反应的反应。经大约30至60分钟输注BMS-986326。对初始剂量队列可使用较短的输注时间，并且对更高剂量队列可使用更长的输注时间。监测输注相关反应(IRR)。
表5
缩写：AUC(0-T)＝从时间零到最后可计量浓度的时间的血清浓度-时间曲线下面积；AUC(INF)＝从时间零外推至无限时间的血清浓度-时间曲线下面积；IV＝静脉内；NOAEL＝无可见有害作用水平；PD＝药效学；PK＝药代动力学；Q3W＝每3周一次；SC＝皮下。
a这些是建议的剂量；然而，实际剂量可以根据安全性、PK和PD数据进行改变。
b最大静脉内剂量将是预期提供不大于对于静脉内单剂量猴毒理学研究的NOAEL(AUC[0-336h]<757μg·h/mL)的平均暴露(AUC[INF])的剂量。
c可以测试高于6mg SC的剂量，高达这样的剂量，预期其提供将不超过对于为期12周的Q3W SC猴毒理学研究的NOAEL(AUC[0-504h]<306μg·h/mL)的平均暴露(AUC[INF])。
剂量递增程序：静脉内队列A1-A6
剂量递增决定受安全性、耐受性和PD(Treg计数和Treg与Tconv比率)影响。每次剂量递增前审查的安全性数据的评估包括AE、PE、生命体征、12导联安全性ECG、临床实验室检验以及伴随药物/程序。在递增到下一个剂量水平队列前，对来自先前剂量水平队列的最少21天的安全性数据进行审查。直到对先前(静脉内或皮下)剂量水平队列的安全性和耐受性进行评价并认为其是可接受的，才开始下一个剂量水平的施用。
除了安全性和耐受性外，在每个静脉内剂量水平队列完成给药后审查PD数据(Treg计数和Treg与Tconv比率)，并且将其用于为剂量递增决定提供信息。如果新得到的PD数据表明，不仅在3个连续的静脉内剂量水平队列内的PD反应保持稳定(即，峰值Treg增加倍数)而且Treg和Tconv细胞的峰值增加倍数(至少2倍)近似相等，这表明丧失选择性，则不探索更高的静脉内剂量水平。来自队列内8名可评价参与者中的至少6名参与者的安全性和PD数据需要在剂量递增前进行安全性审查，前提是不怀疑任何停药与BMS-986326有关。为了剂量递增的目的，可评价的参与者被定义为已接受一剂试验用药品(BMS-986326或安慰剂)的参与者。
来自早期队列的PK数据随着其变得可用而持续不断地用于预测平均暴露。除了安全性和PD数据外，还将来自先前队列(包括队列A5)的PK数据用于做出从队列A5转移到任选的队列A6的剂量递增决定。
计划的剂量水平可以基于从先前队列获得的数据进行修改或消除。所探索的最大静脉内剂量是这样的剂量，预期其在任何单独参与者中提供不超过NOAEL暴露(AUC[0-336h]≤757μg·h/mL)的平均暴露AUC(INF)。假如需要改变计划的一个或多个剂量递增步阶，则最大剂量递增步骤大约≤上一剂量水平的3倍。
皮下队列B1-B3的剂量递增程序
在审查来自1mg静脉内剂量水平队列的21天的安全性数据后，向第一个皮下剂量水平队列(1mg)中的参与者皮下施用BMS-986326。在审查先前皮下剂量水平队列(较低剂量)和先前静脉内剂量水平队列(类似剂量)两者的安全性、耐受性和PD(Treg计数和Treg与Tconv比率)数据后，对下一个皮下剂量水平队列进行剂量递增。每次剂量递增前审查的安全性数据评估包括AE、PE、生命体征、12导联安全性ECG、临床实验室检验以及伴随药物/程序。在剂量递增前，对来自两个先前剂量水平队列的最少21天的安全性数据进行审查。
在剂量递增前对来自每个皮下队列内8名可评价参与者中的至少6名参与者的安全性数据进行审查，前提是不怀疑任何停药与BMS-986326有关。为了剂量递增的目的，可评价参与者被定义为已接受一剂试验用药品(BMS-986326或安慰剂)的参与者。
来自早期队列的PK数据随着其变得可用而持续不断地用于预测平均暴露。仅施用这样的皮下剂量，预测其在任何施用的单独参与者中不超过稳态暴露(大约306μg·h/mL的AUC[0-INF])。
计划的剂量水平可以基于从先前队列获得的数据进行修改或消除。假如需要改变计划的一个或多个剂量递增步阶，则最大剂量递增步骤大约≤上一剂量水平的3倍。
剂量修改/停止标准
如果满足来自先前队列的以下条件中的任一个，则可能无法按计划继续递增到下一剂量水平：
a.在一名或多名BMS-986326治疗的参与者中发生严重AE(SAE)并且认为所述严重AE与BMS-986326有关；
b.两名或更多名BMS-986326治疗的参与者经历被认为与BMS-986326有关的重度AE；
c.在同一队列的两名参与者中发生被认为与研究药物施用有关的重度嗜酸性粒细胞增多症。重度嗜酸性粒细胞增多症被定义为：
i.嗜酸性粒细胞增多症：>5000个细胞/μL持续超过5天；
ii.症状性嗜酸性粒细胞增多症(嗜酸性粒细胞增多症≥1500个细胞/μL)：嗜酸性粒细胞增多症伴皮炎、粘膜炎或丙氨酸转氨酶(ALT)/天冬氨酸转氨酶(AST)的>2倍升高；
d.新得到的PD数据指示3个连续静脉内剂量水平队列内的PD反应(即Treg峰值增加倍数)保持稳定并且新得到的PD数据指示Treg和Tconv细胞的近似相等的峰值增加倍数(至少2倍)；
e.被研究者认为或通过赞助者的医疗监测仪认识到由于剂量递增而对参与者造成不可接受风险的任何其他事件。
如果满足上述任一项，则对可用的安全性、PD(Treg计数和Treg与Tconv比率)和暴露数据进行审查。进行数据的评价后，可能发生以下情况：
a.剂量递增可以按照原来计划的继续。仅当在审查后将所述满足停止标准的一种或多种AE判断为与BMS-986326无关时才允许这样做；
b.基于安全性和耐受性审查的结果，或者如果安全性信号的进一步表征是适当的，则可以修改计划的剂量递增以包括重复如下剂量水平，在所述剂量水平下发生了满足停止标准的一种或多种AE。仅当在审查后将满足停止标准的一种或多种AE判断为与BMS-986326无关时才允许这样做；
i.可以添加中间剂量(低于满足停止标准的剂量)队列；
c.可以停止剂量递增。
用于评估安全性和耐受性的方案
在筛查时，安全性评估包括全面的体格检查，其包括对一般外观和生命体征的评价以及眼、耳、鼻、口、喉咙、颈部、呼吸系统、心血管、呼吸系统、胃肠道/腹部、淋巴、肌肉骨骼、皮肤和神经检查。筛查评估还包括连续动态心电图监测、12导联ECG以及对先前和伴随药物使用的审查。生命体征监测包括体温、呼吸频率、血压和心率。
在研究过程期间，作为安全性评估的一部分，在各种不同的时间点进行另外的身体检查。这些随后的身体检查是有针对性的并且包括对以下项的检查：头部、耳、眼、颈部和喉咙；心血管系统、神经系统和呼吸系统；腹部；皮肤(包括注射部位评估)；和四肢。
在研究过程期间，在各个不同时间点进行的进一步的安全性和耐受性评估还包括生命体征监测；心电图；连续动态心电图监测；结核病检测；注射部位监测；COVID-19筛查；和临床安全实验室评估，所述临床安全实验室评估包括临床化学、凝血和尿分析。
另外，在研究过程期间，不良事件和严重不良事件评估用于评价安全性。不良事件通常包括在被施用研究治疗的临床研究参与者中的任何新的不幸医学事件或先前存在的医学状况的恶化，并且其不一定与此治疗有因果关系。此评估部分基于在研究过程期间获得的实验室结果以及其他上述安全性评估的结果，所述评估在整个研究过程中进行。严重不良事件通常被定义为在任何剂量下导致死亡或危及生命的任何不幸医学事件。假如发生了任何不良事件和严重不良事件，评价所有不良事件和严重不良事件的强度和因果关系。
用于评估BMS-986326的药代动力学(PK)和免疫原性的方案
收集单独的血清样品以用于PK和抗药物抗体(ADA)评估，并且所述单独的血清样品包括在第1天在BMS-986326前长达一小时采集的剂量前血清样品和在第1天采集的输注结束(EOI)血清样品，以及在整个研究过程(例如，在第2-21天的居住期间以及在第28、36、45和55天的门诊就诊期间)中采集的另外的血清样品。
从第-2天或第-1天直到第21天，符合条件的参与者居住在临床现场。根据随机化时间表在第1天施用试验用药品(安慰剂或BMS-986326)。在令人满意的安全性审查并且完成所需的研究程序后，参与者在第21天从临床现场出院。参与者在第28、36、45和55天返回门诊就诊
从血清浓度与时间的关系推导出BMS-986326的药代动力学。评估的PK参数包括Cmax；Tmax；AUC(0-T)；AUC(INF)；CLT/F或CLT；Vz/F或Vz；T-HALF；和F。
通过经验证的PK分析程序通过非隔室模型法获得单独参与者PK参数值。实际时间用于分析。
通过测量总药物(其包括二聚体和单体两者的水平)的经验证的配体结合测定来分析血清样品的BMS-986326。从接受安慰剂的参与者收集的PK样品不作分析。另外，将血清样品存档以用于潜在的单体分析。可以使用未经验证的探索性配体结合测定来测量单体水平。
通过经验证的免疫原性测定来分析免疫原性样品的抗BMS-986326抗体。在第1天收集给药前的剂量前样品；随后的采样可以在第15、28和55天完成。将确认为阳性的样品滴定并且储存入库以用于使用经验证的测定进行对于抗内源性IL-2的中和抗体的未来可能发生的分析。
用于评估BMS-986326的药效学(PD)的方案
将血液样品收集并且通过流式细胞术测量，以用于通过表面标记物定量免疫细胞(如Treg、Tconv、滤泡辅助性T细胞(Tfh)、B细胞和NK细胞)，所述表面标记物可以包括但不限于细胞谱系和激活标记物CD3、CD4、CD8、CD14、CD25、CD39、CD45、CD45RA、CD56、CD127、Foxp3、Helios、CXCR5、CCR7和Ki67。还将血液样品收集并且通过流式细胞术测量，以用于确定通过pSTAT5鉴定的BMS-986326与Treg、Tconv、CD8 T细胞和NK细胞的接合。
在选定的皮下给药队列中进行离体Treg抑制测定。收集血液样品，并且在可包括但不限于T细胞增殖和细胞因子分泌测量的测定中测试Treg细胞对激活的Tconv细胞的离体抑制活性。
来自BMS-986326队列A4(3 mg单次静脉内输注)的临床前结果
与接受安慰剂的受试者相比，接受BMS-986326的受试者的Treg从基线水平增加。
III.C.mIL-2/CD25融合蛋白在系统性红斑狼疮的临床前模型中诱导Treg扩增和免疫抑制
总体概述
Treg在抑制免疫应答和控制自身免疫方面具有确立已久的作用(Bluestoned等人,J Clin Invest.125:2250-60(2015)；Dominguez-Villar等人,Nat Immunol.19:665-73(2018))。因此，Treg对诱导和维持自我耐受有着至关重要的作用。Treg功能的调节异常牵涉到众多自身免疫性病症(Castela等人,JAMA Dermatol.150:748-51(2014)；Koreth等人,N Engl J Med.365:2055-66(2011)；Saadoun等人,N Engl J Med.365:2067-77(2011))。促进耐受性诱导状态是针对无药物缓解的下一代免疫学疗法的关键目标，并且Treg的诱导和激活表示朝向此目标的有吸引力的靶标。
IL-2最初作为强效T细胞生长因子被发现(Gillis等人,J Exp Med.146:468-82(1977))，并且许多研究专注于其在促进促炎性免疫应答中的作用。例如，高剂量IL-2(通常为500,000U/kg，重复使用)是用于增强T细胞和NK细胞的功能的经批准的治疗癌症患者的疗法；然而，反应率通常较低并且所述疗法还伴随严重毒性(Fraenkel等人,JImmunother.25:373-8(2002))。由于在IL-2或IL-2R有缺陷的小鼠中观察到快速的自身免疫而不是受损的免疫应答，因此发现了IL-2的另外的作用(Sadlack等人,Cell 75:253-61(1993)；Suzuki等人,Science 268:1472-76(1995)；Willerford等人,Immunity 3:521-30(1995))。此表型由IL-2在Treg发育和稳态中所起的关键作用的丧失引起(Cheng等人,JImmunol.109:1567-75(2013)；Fontenot等人,Nat Immunol.6:1142-51(2005)；Yao等人,Blood 109:4368-75(2007))。与小鼠数据一致，已发现人IL-2信号传导途径中的突变与自身免疫性疾病相关；IL-2、IL-2RA和IL-2RB基因座中的自身免疫风险变体已通过全基因组关联研究鉴定出(Abbas等人,Sci Immunol.3(2018))。系统性红斑狼疮(SLE)已被特别鉴定为与Treg功能障碍相关的自身免疫性疾病，其已被归因于IL-2缺乏状态(von Spee-Mayer等人,Ann Rheum Dis.75:1407-15(2016))。
在临床前，已证明低IL-2R信号传导选择性地促进Treg(而非T效应(Teff)细胞)的关键活性。用低水平的IL-2治疗小鼠预防非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的糖尿病发展(Grinberg-Bleyer等人,J Exp Med.207:1871-8(2010)；Tang等人,Immunity 28:687-97(2008)；Yu等人,Immunity 30:204-17(2009))。据报道，几个采用低剂量IL-2的小型临床试验在SLE中取得了令人鼓舞的结果(He等人,Nat Med.22:991-3(2016)；Klatzmann等人,NatRev Immunol 15:283-94(2015))。然而，重组IL-2治疗需要每天注射。另外，还观察到促炎性细胞因子和非Treg细胞的不希望的增加。
通过不可切割的接头连接的小鼠IL-2(mIL-2)和小鼠IL-2Rα(CD25)的融合蛋白(FP)在NOD小鼠中在Treg扩增和糖尿病控制方面已显示出比重组IL-2更大的体内功效(Ward等人,J Immunol.201:2579-92(2018))。在体内，mIL-2/CD25是长期存在的，持续地并且选择性地刺激Treg(Ward等人)。本文中基于蛋白尿的水平、血清自身抗体滴度以及炎症和损伤的肾脏组织学得分证明了mIL-2/CD25融合蛋白在NZB x NZW F1和MRL/lpr小鼠中有效诱导Treg扩增并且抑制狼疮性肾炎。在其有效剂量下，mIL-2/CD25不导致BALB/c小鼠中的促炎性细胞因子或非Treg细胞的任何增加。综上所述，这些数据支持将IL-2/CD25融合蛋白用于治疗SLE患者。
NZB x NZW小鼠中的Treg CD25表达
在SLE患者中Treg调节异常。据报道，高百分比的Treg(CD4+Foxp3+)显示出较低水平的CD25表达，反映IL-2缺乏状态(Humrich等人,Expert Rev Clin Immunol.12:1153-60(2016))。NZB x NZW F1是自发性狼疮的经典模型，其发展出与狼疮患者表型可比较的重度狼疮样表型(Xie等人,J Immunol.192:4083-92(2014))。为了评估NZB xNZW狼疮模型是否也捕获如在SLE患者中观察到的低CD25表达的Treg异常，将来自NZB x NZW小鼠(n＝5，26周龄)和对照BALB/c小鼠(n＝6，9-10周龄)的脾细胞进行针对CD4、FoxP3和CD25的染色。代表性点图在图2A示出。CD4+Foxp3+细胞表示Treg。在代表性BALB/c小鼠中，73％的Treg是CD25hi；而在代表性NZB x NZW小鼠中，仅35％的Treg是CD25hi。CD25表达水平通过Treg门(CD4+Foxp3+)中的CD25平均荧光强度(MFI)确定。如图2B所示，对于BALB/c组，CD25 MFI为1744.8±98.9(平均值±SEM)，而对于NZB×NZW小鼠，CD25 MFI仅为364.2±34.5。因此，在SLE患者中观察到的低CD25表达的Treg异常在NZB x NZW小鼠中也类似地观察到。
BALB/c小鼠中的mIL2-CD25短期治疗
在测试mIL-2/CD25在NZB x NZW狼疮小鼠中的慢性作用前，在每周给药两次持续三个剂量的BALB/c小鼠中进行了短期研究(7天)。作为比较物，每隔一天给药Fc-mIL2，持续四个剂量。将脾脏收集并且通过流式细胞术分析，评价血浆的细胞因子产生。与Fc-mIL2相比，以0.25mg/kg和0.5mg/kg施用mIL-2/CD25导致CD4+门中Treg百分比的更大增长(图3A)。由于Treg的增加，单个细胞门中CD8+细胞的百分比降低，而两个分子都没有在统计学上改变NK细胞的百分比(数据未示出)。基于总的脾脏计数计算脾脏中各种细胞类型的绝对数目，以提供潜在的非Treg接合的灵敏量度。类似地，与Fc-mIL2相比，以0.25mg/kg和0.5mg/kg施用mIL-2/CD25显示出Treg数目的更大增长(图3B)。观察到mIL2-CD25的CD8+、CD4+Foxp3-和NK细胞的最小变化，而Fc-mIL2显著增加了这些群体(图3C-图3E)。循环的细胞因子的测量支持Treg选择性。对于以这些剂量施用mIL-2/CD25，在0.5mg/kg剂量下没有细胞因子升高，并且仅IL-5稍微升高(数据未示出)。这些结果证实，相对于Fc-mIL2，mIL2-CD25提供了改进的Treg接合和选择性特征，以及更大的Treg增长，并且没有迹象表明非Treg接合。基于这些结果，选择每周两次0.1-0.4mg/kg的剂量范围以用于在狼疮动物模型中进一步测试mIL-2/CD25功效。
在早期狼疮NZB x NZW小鼠中的mIL-2/CD25
为了评估mIL-2/CD25在SLE动物模型中的作用，将22-24周龄、具有30mg/dL(得分为1)蛋白尿水平的NZB x NZW F1小鼠入组用于研究。向小鼠每周两次以0.1、0.2和0.4mg/kg给予PBS或mIL-2/CD25的皮下注射液，或者每周三次以10mg/kg口服给药泼尼松龙以充当阳性对照(每组n＝10)。在第一次给药后确定的mIL2-CD25的血清暴露(AUC和Cmax)在0.1与0.4mg/kg剂量之间以剂量依赖性方式增加，并且平均终末半衰期为20.6小时。PK参数如表6所示。在为期14周的实验过程中，mIL-2/CD25施用是耐受性良好的，并且没有观察到体重减轻(数据未示出)。通过mIL-2/CD25施用以剂量依赖性方式显著降低如由蛋白尿得分判断的疾病进展(图4A)。发展出得分为3或更高得分的重度蛋白尿的动物百分比也降低了(图4B)。每2-3周将小鼠放血并且检查血清自身抗体的存在。相对于PBS处理的小鼠，通过mIL-2/CD25治疗以剂量依赖性方式显著降低抗dsDNA IgG滴度，并且最大效果(通过0.2和0.4mg/kg两种剂量均达到)与在泼尼松龙对照中观察到的效果是可比较的(图4C)。显微镜评价揭示经PBS处理的对照小鼠的肾脏中明显的肾小球肾炎。其特征在于肾小球中不同程度的细胞过多和基质沉积、小管腔中的蛋白管型以及间质和血管周围组织中的炎性细胞浸润。mIL-2/CD25治疗显著降低了肾小球、肾小管和间质性肾炎的组织学评分(图4D)。总之，在NZB x NZW狼疮模型中，mIL-2/CD25以剂量依赖性方式展示出在降低蛋白尿水平、dsDNAIgG滴度和肾脏组织学评分方面的功效；在0.2mg/kg和0.4mg/kg剂量(2次/周)下观察到最大功效，其与在大剂量泼尼松龙的情况下观察到的功效是可比较的。
为了将功效与Treg扩增程度相关联，在给药四周后(第8个剂量后48小时)收集血液和脾脏(每组n＝4)以用于流式细胞术。mIL-2/CD25治疗剂量依赖性地增加血液和脾脏两者中CD4+门中的Treg(CD25+Foxp3+)的百分比。在血液中，Treg的百分比从PBS组中的2.3％±0.1％(平均值±SEM)显著增加到分别在0.1、0.2和0.4mg/kg剂量组中的11.7％±2.3％、21.9％±1.9％、24.2％±0.5％(图5A)。同样，在所有剂量下，脾脏Treg的百分比都有所增加(图5B)。将脾细胞针对Ki67进行染色以显示Treg的增殖状态。如图5C所示，Ki67+细胞在Treg门(CD4+CD25+Foxp3+)中的百分比以剂量依赖性方式从PBS组中的27.0％±6.4％增加到分别在0.1、0.2和0.4mg/kg mIL-2/CD25治疗组中的49.5％±5.9％、56.6％±2.4％和69.8％±8.0％。Treg上的CD25表达(CD25 MFI)(其在NZB x NZW中相对于Balb/c小鼠更低(图2B))也以剂量依赖性方式(图5D)从媒介物组中的1745±96MFI增加到分别在0.1、0.2和0.4mg/kg mIL-2/CD25治疗组中的4361±408、5340±390和5057±335(±SEM)MFI。给药14周后，还对血液和脾脏Treg进行分析，并且结果与在第4周获得的结果是可比较的(数据未示出)。总之，mIL-2/CD25治疗增加了Treg的数目和Treg上的CD25表达两者，其结果是抑制了NZB x NZW狼疮小鼠中的疾病进展。
表6.在NZB x NZW小鼠中的mIL-2/CD25的血清暴露。
剂量 0.1mg/kg s.c. 0.2mg/kg s.c. 0.4mg/kg s.c.
Cmax(nM) 9.5 26.5 56.9
Tmax(h) 24 24 24
AUC(0-80h)(nM·h) 368.9 877.2 2045.9
T1/2(h) 24 18 19
在0.1、0.2或0.4mg/kg s.c.剂量的mIL-2/CD25后，mIL-2/CD25的血清水平以剂量依赖性方式增加。在0.1、0.2或0.4mg/kg s.c.给药后，药代动力学参数分别为368.9、877.2或2045.9nM·h(AUC0-80 h)以及分别为9.5、26.5或56.9nM(Cmax)。Tmax为24小时。平均终末半衰期为20.6小时。
NZB x NZW小鼠中的晚期狼疮中的mIL-2/CD25
进一步测试mIL-2/CD25改善晚期疾病体征的能力，其是功效的更高标准。将具有晚期蛋白尿(≥100mg/dL；约27周龄)的小鼠入组用于为期10周的治疗研究。0.3mg/kg 2次/周的mIL-2/CD25显示出蛋白尿水平(图6A)、抗dsDNA IgG滴度(图6B)、血浆IL-12p40水平(图6C)和对炎症和损伤的肾脏组织学得分(图6D)的显著降低。在研究完成后，对脾细胞进行流式细胞术。CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+门中的百分比从PBS组中的5.5％±0.6％(平均值±SEM)增加到分别在0.1mg/kg和0.3mg/kg mIL-2/CD25治疗组中的18.9％±4.8％和22.4％±6.3％(图6E)。此数据支持IL-2/CD25在治疗更晚期狼疮患者中的治疗潜力。
mIL-2/CD25和泼尼松组合在NZB x NZW小鼠中的作用
为了评估mIL-2/CD25疗法减少对皮质类固醇(目前的狼疮医护标准)的依赖的潜在效用，在具有30mg/dL蛋白尿的NZB x NZW早期狼疮小鼠(21-23周龄)中测试采用部分有效剂量的mIL-2/CD25(0.1mg/kg s.c.2次/周)和泼尼松龙(1mg/kg p.o.3次/周)的组合研究。高剂量的泼尼松龙(10mg/kg，p.o.3次/周)和mIL-2/CD25(0.2mg/kg s.c.2次/周)组作为最大功效单一疗法对照被包括在内。如图7所示，虽然1mg/kg泼尼松龙或0.1mg/kg mIL-2/CD25的单一疗法在降低蛋白尿水平和抗dsDNA滴度方面显示出部分保护作用，但两者的组合证明与高剂量泼尼松龙或mIL-2/CD25对照可比较的功效，其优于单独的任一种疗法(图7A和图7B)。基于RT-PCR，组合治疗在进一步降低肾脏中诸如IFIT1、IFIT3、MX1、IRF7、GBP2和LIGP1的1型干扰素基因表达方面也展示出优越的效果(图8A至图8F，分别地)。基于组织学得分，组合治疗的优势不太明显(图7C)，因为基于半定量组织学得分，0.1mg/kgmIL-2/CD25单一疗法已经实现了组织学得分的高水平降低。
在本研究完成后(治疗14周后)，还在脾脏中评估了mIL-2/CD25对Treg的影响。正如预期的那样，泼尼松龙单一疗法(1和10mg/kg组两者)并未改变Treg(CD4+CD25+Foxp3+)百分比或Treg上的CD25 MFI。与先前的研究一致，mIL-2/CD25单一疗法增加了Treg的百分比和Treg上的CD25 MFI(图7D和图7E)。重要的是，泼尼松龙的共治疗不会干扰mIL-2/CD25在增加Treg的百分比或Treg上的CD25 MFI方面的作用(图6D和图6E)。这些数据表明，IL-2/CD25疗法可以有效地与标准照护类固醇疗法组合，而不失去其在增加Treg数目和潜在抑制SLE患者疾病进展方面的功效。
mIL-2/CD25在MRL/lpr狼疮模型中
还在另一种鼠狼疮模型MRL/lpr中评价mIL-2/CD25。在此模型中，免疫细胞的未经检查的异常增殖导致自发性自身免疫性狼疮样综合征。以0.1、0.2或0.4mg/kg 2次/周皮下给药mIL-2/CD25持续12周(每组n＝10)防止蛋白尿恶化(图9A)、自身抗体产生(图9B)和肾脏炎症和损伤(图9C)。与NZB x NZW研究中的数据类似，0.2mg/kg至0.4mg/kg的剂量范围在所有上述三个终点中均达到最大功效。同样，收集(第一次给药后12周，最后一次给药后48小时)血液和脾脏(每组n＝4)以用于在研究完成后的流式细胞术。mIL-2/CD25治疗剂量依赖性地增加血液和脾脏两者中CD4+门中Treg(CD4+CD25+Foxp3+)的百分比。在血液中，Treg百分比从PBS组中的4.0％±0.8％(平均值±SEM)显著增加到分别在0.1、0.2和0.4mg/kg剂量组中的14.3％±2.3％、21.9％±6.2％和28.1％±5.5％(图9D)。同样，在所有剂量下脾脏Treg均增加(图9E)。如图9F所示，CD4+CD25+Foxp3+门中的CD25 MFI从PBS组中的1842±118(平均值±SEM)显著增加到分别在0.1、0.2和0.4mg/kg mIL-2/CD25治疗组中的3301±470、6185±713和6863±680。总之，mIL-2/CD25通过增加Treg的数目和Treg上的CD25表达来抑制MRL/lpr小鼠的疾病进展。
讨论
由于疾病的异质性，活动性SLE的管理具有挑战性(Franklyn,等人,Nat RevRheumatol.10:567-71(2014)；Tsokos,N Engl J Med.365:2110-21(2011))。目前活动性SLE的疗法主要依靠皮质类固醇和免疫抑制剂来降低疾病活动性。然而，这些药物不是完全有效的，并且因此结局被显著的有害效应、特别是治疗相关的感染进一步抵消(Goldblatt,等人,Lupus 18:682-89(2009)；Kang等人,Curr Opin Rheumatol.15:528-34(2003)；Bruce,等人,Lupus 25:699-709(2016))。Treg为SLE发病机制中的许多重要细胞类型和途径提供了广泛的上游控制，其将Treg调节与其他SLE临床管线资产(pipeline asset)区分开来。虽然Treg的主要靶标是效应T细胞活性，但免疫应答的Treg控制不止是对T效应细胞，包括影响NK和NK T细胞、B细胞和巨噬细胞/抗原呈递细胞以及进一步促进组织修复的潜力(Abbas等人,Sci Immunol.3(2018)；Dutcher等人,J Immunother Cancer.2:26(2014)；Li等人,Front Immunol.9:585(2018)；Tiemessen等人,Proc Natl Acad Sci USA 104:19446-51(2007)；Williams等人,Nature 441:890-3(2007))。基于包括SLE研究在内的多项临床试验的有希望的初步结果，使用低剂量IL-2疗法促进T调节功能以抑制炎症和自身免疫已引起关注(Castela等人,JAMA Dermatol.150:748-51(2014)；Saadoun等人,N EnglJMed.365:2067-77(2011),Abbas等人,Sci Immunol.3(2018)；von Spee-Mayer等人,AnnRheum Dis.75:1407-15(2016)；He等人,Nat Med.22:991-3(2016)；Churlaud等人,JAllergy Clin Immunol 142:1344-6(2018)；Rosenzwajg等人,J Autoimmun.58:48-58(2015)；Rosenzwajg等人,Ann Rheum Dis.78:209-17(2019))。在11种自身免疫性疾病中的低剂量IL-2的初步结果已经证明了这种方法的广泛效用的潜力(Rosenzwajg等人,AnnRheum Dis.78:209-17(2019))。
由用不可切割的接头与CD25融合的IL-2组成的长效IL-2受体激动剂已证明在小鼠中体内血清半衰期和Treg选择性相比于重组IL-2的改善(Ward等人,J Immunol.201:2579-92(2018))。mIL-2/CD25融合蛋白具有独特的作用机制(MOA)，其在溶液中主要作为自阻断、无活性同二聚体存在。通过解离和被表达CD25的Treg捕获而缓慢释放活性单体导致细胞激活和增殖(Ward等人,J Immunol.201:2579-92(2018))。此MOA使分子能够实现药代动力学(PK)和药效学(PD)延长，这在递送IL-2受体激动作用的其他机制下是尚未实现的，部分是由于在分子以无活性二聚体形式循环时所述分子能够避免靶标介导的清除(TMDD)。如本文所示，在NZB x NZW小鼠和MRL/lpr小鼠两者即狼疮和狼疮性肾炎的两种常见模型中，mIL-2/CD25具有延长的PK(T1/2：20.6h)和期望的Treg扩增/Treg上的CD25上调。此外，对来自NZB x NZW模型的Treg的分析表明降低的Treg CD25水平(一种IL-2缺乏标记物)，这类似于来自SLE患者的观察结果。结果表明NZB x NZW模型概括了在人疾病中观察到的Treg功能障碍的元素。mIL-2/CD25在此模型中逆转了表观IL-2缺乏，导致Treg数目和CD25表达均增加。
在mIL-2/CD25的情况下观察到的Treg诱导和激活导致如通过降低的蛋白尿水平、自身抗体滴度和肾脏组织学得分判断的疾病进展的显著降低，即使在NZB x NZW小鼠已显示出晚期疾病体征时开始治疗仍是如此。本文测试的剂量不激活非Treg细胞或促炎性细胞因子产生。重要的是，剂量反应关系表明，在此模型中需要显著且持续的Treg增加以达到最大功效，并且表明在人疾病中，需要稳健且持续的但选择性的Treg增加以达到最大功效。
皮质类固醇仍然是狼疮治疗的主要手段，尤其是治疗突然复发。已知皮质类固醇抑制T细胞应答；然而，Treg可以比T效应细胞更不易受类固醇治疗的影响(Prenek等人,Apoptosis 25:715-29(2020))。本文证明，即使在与低剂量类固醇结合时，mIL-2/CD25治疗也可以增加Treg并且改善疾病。相对于任意一种单一疗法，组合治疗导致大多数功效读数的提高。这些结果表明，将延长的且选择性的IL-2R Treg激动作用(如通过mIL2/CD25治疗提供的)与SLE标准照护组合的潜在临床效用实现改善的功效。
迄今为止，已经开发的人IL-2/CD25融合蛋白在食蟹猴中以限定的剂量显示了延长的且选择性的Treg激活(未发表的结果)。将在临床试验中测试人IL-2/CD25以评价PK、PD(Treg)、安全性和耐受性。将在临床上探讨选择性靶向具有Treg群体中的IL-2缺乏的SLE患者的假说。对于此机制提供临床功效以及类固醇节制和长期缓解的潜力尚待在未来的研究中观察。
材料和方法
试剂：
mIL-2/CD25是用在IL-2的C末端与CD25胞外区的N末端之间的由12个氨基酸组成的接头将鼠IL-2与鼠IL-2受体α亚基(CD25)组合的融合蛋白。mIL-2/CD25融合蛋白形成非共价自阻断二聚体。生物化学评估支持二聚体不与受体结合并且因此防止靶标介导的药物处置。缓慢解离产生低剂量的活性单体，其导致IL-2R的激活(Ward等人,JImmunol.201:2579-92(2018))。泼尼松龙(Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯)是一种用作对照化合物的抗炎类固醇药物。
用于小鼠研究中的流式细胞术的抗体组包括：来自BD Biosciences的CD4-V500(克隆RM4-5)、pSTAT5-AF488(克隆47/Stat5 pY694)，来自ThermoFisher Scientific的CD8-PerCP-Cy5.5(克隆53-6.7)、CD25-PE(克隆PC61.5)、Foxp3-ef450(克隆FJK-16s)，和来自Biolegend的CD335-BV605(克隆29A1.4)、Ki67-APC(克隆16A8)。
小鼠：
雌性NZB x NZW F1、雌性BALB/c和雄性MRL/lpr小鼠来自杰克逊实验室(缅因州巴尔港)。所有程序均按照BMS动物照顾与使用委员会批准的方案进行。
蛋白尿监测：
在随机化至治疗组前，通过诱导小鼠在Albustix条上排尿使用Albustix(Siemens，德国慕尼黑)来评价小鼠的蛋白尿。具有相当于痕量的蛋白尿水平读数(30mg/dL)的小鼠被纳入用于评价早期疾病的功效的研究中。入组早期疾病研究中的小鼠的典型年龄对于NZB x NZW小鼠为21-23周并且对于MLR/lpr小鼠为12-14周。具有大于100mg/dL的蛋白尿水平的NZB x NZW小鼠(约27周龄)被纳入用于评价晚期疾病的功效的研究中。在研究期间，每2-3周继续监测小鼠的蛋白尿的存在。根据制造商说明书对蛋白尿进行如下评分：痕量：0.5；≥30mg/dL：1；≥100mg/dL：2；≥300mg/dL：3；≥2000mg/dL：4。
小鼠给药
在PBS媒介物中，向小鼠每周两次皮下(s.c.)注射mIL-2/CD25，每次注射200μL给药体积。向给予泼尼松龙的小鼠每周三次口服(p.o.)给药10mg/kg，并且给药剂量为溶解在水中的10mL/kg。
血清抗体滴度
在研究期间，将小鼠用异氟烷麻醉并且每2-3周放血一次。在研究完成后，通过ELISA测试血清中抗dsDNA自身抗体的存在。在每种测定中，将来自患有晚期狼疮的MRL/lpr小鼠的混合血清用作阳性比较物。基于用阳性对照血清产生的标准曲线以任意单位定量自身抗体水平。根据制造商的说明书，使用来自BD Biosciences的IL-12p40 ELISA试剂盒，从mIL-2/CD25给药10周结束时采集的血清中测量IL-12p40血清蛋白水平。
组织学
在研究结束后，从每只动物切除一个肾脏，将其在10％ NBF中浸泡固定72小时，并且在完全固定后，横向修剪，常规加工石蜡包埋(RPPE)并且以4μm切片以用于H&E染色，以及以3μm切片以用于PASH染色。对于肾炎的显微镜分析，由训练有素的组织病理学家以单盲方式评价载玻片。使用单独评价相关病理的半定量0-4量表对肾小球肾炎(GN)和肾小管-间质性肾炎(TIN)进行评分。将GN针对肾小球膜、细胞管型形成、肾丝球丛中的单个核细胞浸润以及鲍曼囊的纤维硬化的变化进行评分。将TIN针对管状管腔(tubularluminal)浸润、肾小管上皮细胞再生、蛋白管型、间质纤维化和单个核细胞浸润的变化进行评分。理论上最高肾炎总得分为36。
血液和脾脏制备和染色
将血液样品收集在肝素管中，然后立即裂解并且用1X BD FACS裂解溶液在37℃下固定10min。将细胞用PBS洗涤一次，然后用含有2％ FBS的PBS洗涤第二次，然后在4℃下使用冰冷的甲醇透性化处理30分钟。然后将样品洗涤两次以去除过量的甲醇以供染色。
为了制备单细胞悬浮液，使用gentleMACSTM研磨在PBS中收集的脾脏样品，然后用70μM过滤器过滤。使用ACK裂解缓冲液，裂解红细胞并且将细胞悬浮液用40μM过滤器再过滤一次。将细胞重悬于含有2％ FBS的PBS中，并且在37℃下直接使用1.5％多聚甲醛将1x 106个细胞固定10分钟。将细胞用含有2％ FBS的PBS洗涤，然后使用冰冷的甲醇在4℃下透性化处理30分钟。随后将样品洗涤两次以去除过量的甲醇，然后进行染色。
将制备的血液或脾脏样品使用CD16/CD32单克隆抗体(BD Biosciences)阻断，然后在4℃下用细胞表面(CD4/CD8/CD25/CD335)和细胞内(Foxp3/Ki67/pSTAT5)标记物同步染色45分钟。使用BD Canto X流式细胞仪获取样品并且使用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。
肾脏RT-PCR
在研究完成后，将每只小鼠的一个肾脏收集在RNA Later中，然后用组织研磨仪(Tissue Lyser)在mRNA捕集器裂解缓冲液中均质化。根据制造商的方案(Invitrogen)使用mRNA捕集器PLUS纯化mRNA。cDNA是使用SuperScript II与随机六聚体引物合成的。用SYBR绿色预混液(Invitrogen)进行PCR。使用亲环蛋白(PPIA)作为持家基因，使用2-ΔΔCT方法确定相对量化分析。分析炎性细胞因子的表达和白细胞表面受体。引物对：
Ifit1：5'-AGAGCAGAGAGTCAAGGCAGGT-3'(SEQ ID NO:35)；5'-TGGTCACCATCAGCATTCTCTCCCA-3'(SEQ ID NO:36)
Ifit3：5'-GCTCAGCCCACACCCAGCTTT-3'(SEQ ID NO:37)；5'-AGATTCCCGGTTGACCTCACTCAT-3'(SEQ ID NO:38)
Mx1：5'-ACTACCAGGAGTGCAGACGGAA-3'(SEQ ID NO:39)；5'-TCCTCCAGGAACCAGCTGCACTTA-3'(SEQ ID NO:40)
Irf7：5'-GAGTCTGGGGCAGACCCCGT-3'(SEQ ID NO:41)；5'-CTGCGCTCGGTGAGAGCTGG-3’(SEQ ID NO:42)
Gbp2：5'-AGCTGCTAAACTTCGGGAACAGGA-3'(SEQ ID NO:43)；5'-AGAGGTTTGGGCCTTGGGCCT-3'(SEQ ID NO:44)
Ligp1：5'-GGACACAGGAGTTTCTGTGCCTTT-3'(SEQ ID NO:45)；5'-AGGTGAAGAGAACAGCTGACCCA-3'(SEQ ID NO:46)
药代动力学
在第一剂量(0.1、0.2或0.4mg/kg s.c.)后，在NZB x NZW F1小鼠中确定mIL-2/CD25的血清水平。使用混合采样(每个时间点4只小鼠)在给药后24、48和80小时通过颏下出血获得血液样品(0.1mL)。允许血液样品凝结并且将其在4℃下离心(1500至2000x g)以获得血清。将血清样品在-80℃下储存，直到通过化学发光平台上的配体结合测定进行分析。通过血清浓度与时间数据的关系的非隔室分析(Phoenix WinNonlin，6.4版，Certara USA,Inc.，新泽西州普林斯顿)获得mIL-2/CD25的药代动力学参数(AUC、Cmax、Tmax和半衰期)。
用于定量血清中mIL-2/CD25的配体结合测定
将样品、标准品和质量对照提高到在具有1％ BSA的PBS中33％小鼠血清的最终基质浓度。简言之，在4℃下将96孔黑色板用在PBS中1.0μg/mL的大鼠抗小鼠CD25(eBioscience-克隆：PC61.5)包被过夜。在室温下与血清一起孵育2小时前，用PBS/Tween/20％酪蛋白将板阻断1小时。通过与生物素化的大鼠抗小鼠IL-2(eBioscience-克隆：JES6-SH4)、中性抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(Thermo Scientific)和Pico化学发光底物溶液(Thermo Scientific)一起依序孵育来检测mIL-2/CD25。以发光模式在SpectraMax读板仪中读板。使用由mIL-2/CD25校准物生成的Log-Log线性校准曲线(Softmax分析程序，Molecular Devices)，从发光强度计算小鼠血清中mIL-2/CD25的浓度。测定LLOQ为25pg/mL。
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序列表
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 用于治疗疾病的融合蛋白
<130> 3338.234PC02
<150> US 63/123,991
<151> 2020-12-10
<150> US 63/198,615
<151> 2020-10-29
<160> 46
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2Rα (人，成熟形式的IL2Rα胞外结构域)
<400> 1
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
35 40 45
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
50 55 60
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
85 90 95
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
100 105 110
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
115 120 125
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
130 135 140
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu
165 170 175
Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
180 185 190
Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr
195 200 205
Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
210 215
<210> 2
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2 (人，成熟形式)
<400> 2
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 3
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2Rα (人，成熟形式的IL2Rα胞外结构域)
- 半截短
<400> 3
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
35 40 45
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
50 55 60
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
85 90 95
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
100 105 110
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
115 120 125
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
130 135 140
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu
165 170 175
Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser
180 185 190
<210> 4
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2Rα (人，成熟形式的IL2Rα胞外结构域)
- 全截短
<400> 4
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
35 40 45
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
50 55 60
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
85 90 95
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
100 105 110
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
115 120 125
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
130 135 140
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Ile Cys Thr Gly Glu
165
<210> 5
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2-CD25(22-212)
<400> 5
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe
145 150 155 160
Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys
165 170 175
Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr
180 185 190
Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser
195 200 205
Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu
210 215 220
Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val
225 230 235 240
Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu
245 250 255
Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val
260 265 270
Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala
275 280 285
Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro
290 295 300
Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu
305 310 315 320
Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser
325 330 335
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 6
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2 (人，未加工的)
<400> 7
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 8
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2 (小鼠，成熟形式)
<400> 8
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln
1 5 10 15
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu
20 25 30
Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu
35 40 45
Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu Pro Lys Gln Ala
50 55 60
Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu
65 70 75 80
Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp
85 90 95
Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys
100 105 110
Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr
115 120 125
Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys Gln Ser Ile Ile
130 135 140
Ser Thr Ser Pro Gln
145
<210> 9
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2 (小鼠，未加工的)
<400> 9
Met Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Val Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu
35 40 45
Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn
50 55 60
Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu
85 90 95
Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe
100 105 110
Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val
115 120 125
Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp
130 135 140
Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys
145 150 155 160
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
165
<210> 10
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2Rα (人，成熟形式)
<400> 10
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
35 40 45
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
50 55 60
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
85 90 95
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
100 105 110
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
115 120 125
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
130 135 140
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu
165 170 175
Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
180 185 190
Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr
195 200 205
Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln Val Ala Val Ala Gly
210 215 220
Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp
225 230 235 240
Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
245 250
<210> 11
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2Rα (人，未加工形式)
<400> 11
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 12
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2Rα (小鼠，成熟形式)
<400> 12
Glu Leu Cys Leu Tyr Asp Pro Pro Glu Val Pro Asn Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Leu Ser Tyr Lys Asn Gly Thr Ile Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Leu Lys Glu Leu Val Tyr Met Arg Cys Leu Gly Asn
35 40 45
Ser Trp Ser Ser Asn Cys Gln Cys Thr Ser Asn Ser His Asp Lys Ser
50 55 60
Arg Lys Gln Val Thr Ala Gln Leu Glu His Gln Lys Glu Gln Gln Thr
65 70 75 80
Thr Thr Asp Met Gln Lys Pro Thr Gln Ser Met His Gln Glu Asn Leu
85 90 95
Thr Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Lys His Glu Asp Ser Lys
100 105 110
Arg Ile Tyr His Phe Val Glu Gly Gln Ser Val His Tyr Glu Cys Ile
115 120 125
Pro Gly Tyr Lys Ala Leu Gln Arg Gly Pro Ala Ile Ser Ile Cys Lys
130 135 140
Met Lys Cys Gly Lys Thr Gly Trp Thr Gln Pro Gln Leu Thr Cys Val
145 150 155 160
Asp Glu Arg Glu His His Arg Phe Leu Ala Ser Glu Glu Ser Gln Gly
165 170 175
Ser Arg Asn Ser Ser Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys Pro Ile Thr Thr
180 185 190
Thr Asp Phe Pro Gln Pro Thr Glu Thr Thr Ala Met Thr Glu Thr Phe
195 200 205
Val Leu Thr Met Glu Tyr Lys Val Ala Val Ala Ser Cys Leu Phe Leu
210 215 220
Leu Ile Ser Ile Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp Gln His Arg Trp
225 230 235 240
Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
245
<210> 13
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2Rα (小鼠，未加工形式)
<400> 13
Met Glu Pro Arg Leu Leu Met Leu Gly Phe Leu Ser Leu Thr Ile Val
1 5 10 15
Pro Ser Cys Arg Ala Glu Leu Cys Leu Tyr Asp Pro Pro Glu Val Pro
20 25 30
Asn Ala Thr Phe Lys Ala Leu Ser Tyr Lys Asn Gly Thr Ile Leu Asn
35 40 45
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Leu Lys Glu Leu Val Tyr Met
50 55 60
Arg Cys Leu Gly Asn Ser Trp Ser Ser Asn Cys Gln Cys Thr Ser Asn
65 70 75 80
Ser His Asp Lys Ser Arg Lys Gln Val Thr Ala Gln Leu Glu His Gln
85 90 95
Lys Glu Gln Gln Thr Thr Thr Asp Met Gln Lys Pro Thr Gln Ser Met
100 105 110
His Gln Glu Asn Leu Thr Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Lys
115 120 125
His Glu Asp Ser Lys Arg Ile Tyr His Phe Val Glu Gly Gln Ser Val
130 135 140
His Tyr Glu Cys Ile Pro Gly Tyr Lys Ala Leu Gln Arg Gly Pro Ala
145 150 155 160
Ile Ser Ile Cys Lys Met Lys Cys Gly Lys Thr Gly Trp Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Leu Thr Cys Val Asp Glu Arg Glu His His Arg Phe Leu Ala Ser
180 185 190
Glu Glu Ser Gln Gly Ser Arg Asn Ser Ser Pro Glu Ser Glu Thr Ser
195 200 205
Cys Pro Ile Thr Thr Thr Asp Phe Pro Gln Pro Thr Glu Thr Thr Ala
210 215 220
Met Thr Glu Thr Phe Val Leu Thr Met Glu Tyr Lys Val Ala Val Ala
225 230 235 240
Ser Cys Leu Phe Leu Leu Ile Ser Ile Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr
245 250 255
Trp Gln His Arg Trp Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265
<210> 14
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2Rα (小鼠，成熟形式的IL2Rα胞外结构域)
<400> 14
Glu Leu Cys Leu Tyr Asp Pro Pro Glu Val Pro Asn Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Leu Ser Tyr Lys Asn Gly Thr Ile Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Leu Lys Glu Leu Val Tyr Met Arg Cys Leu Gly Asn
35 40 45
Ser Trp Ser Ser Asn Cys Gln Cys Thr Ser Asn Ile Leu Arg Ala Ser
50 55 60
His Asp Lys Ser Arg Lys Gln Val Thr Ala Gln Leu Glu His Gln Lys
65 70 75 80
Glu Gln Gln Thr Thr Thr Asp Met Gln Lys Pro Thr Gln Ser Met His
85 90 95
Gln Glu Asn Leu Thr Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Lys His
100 105 110
Glu Asp Ser Lys Arg Ile Tyr His Phe Val Glu Gly Gln Ser Val His
115 120 125
Tyr Glu Cys Ile Pro Gly Tyr Lys Ala Leu Gln Arg Gly Pro Ala Ile
130 135 140
Ser Ile Cys Lys Met Lys Cys Gly Lys Thr Gly Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Thr Cys Val Asp Glu Arg Glu His His Arg Phe Leu Ala Ser Glu
165 170 175
Glu Ser Gln Gly Ser Arg Asn Ser Ser Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
180 185 190
Pro Ile Thr Thr Thr Asp Phe Pro Gln Pro Thr Glu Thr Thr Ala Met
195 200 205
Thr Glu Thr Phe Val Leu Thr Met Glu Tyr Lys
210 215
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 15
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 17
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 18
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 19
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 19
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20
<210> 20
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 20
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 27
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 28
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸接头
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 29
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2(21-153)-(G3S)3-CD25(22-240)
<400> 29
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe
145 150 155 160
Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys
165 170 175
Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr
180 185 190
Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser
195 200 205
Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu
210 215 220
Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val
225 230 235 240
Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu
245 250 255
Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val
260 265 270
Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala
275 280 285
Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro
290 295 300
Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu
305 310 315 320
Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser
325 330 335
Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala
340 345 350
Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
355 360
<210> 30
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2-CD25(22-187)
<400> 30
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe
145 150 155 160
Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys
165 170 175
Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr
180 185 190
Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser
195 200 205
Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu
210 215 220
Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val
225 230 235 240
Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu
245 250 255
Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val
260 265 270
Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala
275 280 285
Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro
290 295 300
Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu
305 310
<210> 31
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 天然信号肽-IL2-CD25(22-187)
<400> 31
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
165 170 175
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
180 185 190
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr
195 200 205
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
210 215 220
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
225 230 235 240
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
245 250 255
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
260 265 270
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
275 280 285
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
290 295 300
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
305 310 315 320
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu
325 330
<210> 32
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 天然信号肽-HuIL2-CD25(22-212)-PP
<400> 32
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
165 170 175
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
180 185 190
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr
195 200 205
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
210 215 220
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
225 230 235 240
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
245 250 255
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
260 265 270
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
275 280 285
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
290 295 300
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
305 310 315 320
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
325 330 335
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
340 345 350
Ser Glu Thr Ser Pro Pro
355
<210> 33
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2-CD25(22-187)
<400> 33
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe
145 150 155 160
Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys
165 170 175
Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr
180 185 190
Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser
195 200 205
Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu
210 215 220
Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val
225 230 235 240
Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu
245 250 255
Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val
260 265 270
Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala
275 280 285
Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro
290 295 300
Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu
305 310
<210> 34
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2-T23A-C145S-CD25(22-187)
<400> 34
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe
145 150 155 160
Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys
165 170 175
Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr
180 185 190
Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser
195 200 205
Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu
210 215 220
Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val
225 230 235 240
Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu
245 250 255
Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val
260 265 270
Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala
275 280 285
Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro
290 295 300
Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu
305 310
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ifit1
<400> 35
agagcagaga gtcaaggcag gt 22
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ifit1
<400> 36
tggtcaccat cagcattctc tccca 25
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ifit3
<400> 37
gctcagccca cacccagctt t 21
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ifit3
<400> 38
agattcccgg ttgacctcac tcat 24
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Mx1
<400> 39
actaccagga gtgcagacgg aa 22
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Mx1
<400> 40
tcctccagga accagctgca ctta 24
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Irf7
<400> 41
gagtctgggg cagaccccgt 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Irf7
<400> 42
ctgcgctcgg tgagagctgg 20
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gbp2
<400> 43
agctgctaaa cttcgggaac agga 24
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Gbp2
<400> 44
agaggtttgg gccttgggcc t 21
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ligp1
<400> 45
ggacacagga gtttctgtgc cttt 24
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ligp1
<400> 46
aggtgaagag aacagctgac cca 23

Claims (46)

1.一种治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的白介素-2(IL2)融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：
(a)含有IL2多肽的第一多肽；和
(b)含有白介素-2受体α(IL2Rα)多肽的胞外结构域的第二多肽，
其中(i)与天然IL2Rα的胞外结构域(SEQ ID NO:1)相比，所述IL2Rα多肽的胞外结构域至少少一个糖基化；和/或(ii)与天然IL2(SEQ ID NO:2)相比，所述IL2多肽至少少一个糖基化；
其中所述剂量为约0.1mg至约9mg。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述融合蛋白经由外用、表皮、粘膜、鼻内、口服、阴道、直肠、舌下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外或胸骨内途径施用至所述受试者。
3.根据权利要求1所述的方法，其中将所述融合蛋白经由静脉内途径施用至所述受试者。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述剂量在约0.3mg至约9mg之间。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述剂量在约3mg与约9mg之间。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述剂量在约6mg与约9mg之间。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述剂量在约0.1mg与约3mg之间。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述剂量在约0.1mg与约1mg之间。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述剂量在约0.1mg与约0.3mg之间。
10.根据权利要求3所述的方法，其中所述剂量在约0.3mg与约6mg之间。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述剂量在约1mg与约3mg之间。
12.根据权利要求3所述的方法，其中所述剂量大于约9mg。
13.根据权利要求1所述的方法，其中将所述融合蛋白经由皮下途径施用至所述受试者。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述剂量在约1mg与约8mg之间。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述剂量在约3mg与约8mg之间。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述剂量在约6mg与约8mg之间。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述剂量在约1mg至约6mg之间。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述剂量在约1mg至约3mg之间。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述剂量在约3mg至约6mg之间。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述剂量是约1mg、约3mg、约6mg或约8mg。
21.根据权利要求13所述的方法，其中所述剂量大于约8mg。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中在两个剂量之间以一定给药间隔施用两个或更多个所述剂量。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述给药间隔为至少约一天、至少约两天、至少约三天、至少约四天、至少约五天、至少约六天、至少约一周、至少约两周、至少约三周、至少约四周、至少约一个月、至少约五周、至少约六周、至少约七周、至少约八周、至少约两个月、至少约九周、至少约十周、至少约十一周、至少约十二周或至少约三个月。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述给药间隔为至少约三周。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述给药间隔为约三周。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述给药间隔遍及所述剂量是相同的。
27.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述给药间隔遍及所述剂量是不同的。
28.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中将所述两个或更多个剂量中的至少一个静脉内施用，并且将所述两个或更多个剂量中的至少一个皮下施用。
29.根据权利要求28中任一项所述的方法，其中将所述静脉内施用的剂量在所述皮下施用的剂量之前给予。
30.根据权利要求22-29中任一项所述的方法，其中将所述第一剂量静脉内施用，并且将所述最后的剂量皮下施用。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述疾病或障碍是感染性疾病或免疫介导的疾病。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述免疫介导的疾病是炎性疾病或自身免疫性疾病。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述免疫介导的疾病选自：1型糖尿病；多发性硬化；类风湿性关节炎；乳糜泻；系统性红斑狼疮；狼疮性肾炎；皮肤狼疮；幼年型特发性关节炎；克罗恩病；溃疡性结肠炎；系统性硬化病；移植物抗宿主病(GvHD)；银屑病；斑秃；HCV诱导的血管炎；舍格伦综合征；天疱疮；强直性脊柱炎；白塞病；韦氏肉芽肿病；高安病；自身免疫性肝炎；硬化性胆管炎；古-斯综合征；炎性肠病；X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调(IPEX)综合征；和巨噬细胞活化综合征。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述免疫介导的疾病是系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎或皮肤狼疮。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述免疫介导的疾病是系统性红斑狼疮。
36.根据权利要求31-35中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用皮质类固醇。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述皮质类固醇是泼尼松龙。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中将所述皮质类固醇经由外用、口服、静脉内或肌内途径施用至所述受试者。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中在所述融合蛋白的所述的每一个剂量之前、同时或之后施用所述皮质类固醇。
40.根据权利要求36-39中任一项所述的方法，其中在每剂之间以一定给药间隔将两个或更多个剂量的所述皮质类固醇施用至所述受试者。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中与天然IL2Rα的胞外结构域(SEQ IDNO:1)相比，所述IL2Rα多肽的胞外结构域至少少一个糖基化、至少少两个糖基化、至少少三个糖基化、至少少四个糖基化、至少少五个糖基化、至少少六个糖基化、至少少七个糖基化、至少少八个糖基化或至少少九个糖基化。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中与天然IL2(SEQ ID NO:2)相比，所述IL2多肽至少少一个糖基化。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述第二多肽是SEQ ID NO:4。
46.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述第二多肽是SEQ ID NO:3。
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