MXPA06010017A - Muteinas de interleucina-2 mejoradas. - Google Patents

Muteinas de interleucina-2 mejoradas.

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Susan E Wilson
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Abstract

Se proporcionan muteinas de interleucina-2 humana (IL-2) novedosas o variantes de las mismas; y moleculas de acidos nucleicos, y variantes de las mismas. Son descritos tambien metodos para producir estas muteinas asi como tambien metodos para estimular el sistema inmune de un animal. Ademas, la invencion proporciona vectores de expresion recombinante que comprenden las moleculas de acido nucleico de esta invencion y celulas huesped en las cuales se han introducido vectores de expresion. Se incluyen composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad efectiva terapeuticamente de una muteina de IL-2 humana de la invencion y un portador aceptable farmaceuticamente. Las muteinas de IL-2 tienen toxicidad inferior que la IL-2 nativa o Proleukin(r); la IL-2, mientras mantiene o incrementa los efectos mediados por celulas NK, puede ser usada en composiciones farmaceuticas para uso en el tratamiento del cancer, y para estimular la respuesta inmune.

Description

MUTEINAS DE INTERLEUCINA-2 MEJORADAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a muteínas de interleucina-2 humana (IL-2) que tienen eficacia terapéutica mejorada. También se proporcionan métodos para producir las moléculas novedosas y formulaciones farmacéuticas que pueden ser utilizadas para tratar el cáncer y para estimular el sistema inmune de un mamífero. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La interleucina-2 (IL-2) es un estimulante potente de proliferación y función de célula asesina natural (NK por sus siglas en inglés) y T (Morgan et al. (1976) Science 193:1007-1011). Esta linfocina que se encuentra en forma natural ha sido mostrada para tener actividad antitumoral contra una variedad de malignancias ya sea solas o cuando se combinan con células asesinas activadas por linfocina (LAK por sus siglas en inglés) o linfocitos de infiltración tumoral (TIL por sus siglas en inglés) (ver, por ejemplo, Rosenberg et al. (1987) N. Engl. J. Med. 316:889-897; Rosenberg (1988) Ann. Surg. 208:121-135; Topalian et al. • (1988) J. Clin. Oncol. 6 : 839-853 ; Rosenberg et al. (1988) N. Engl. J. Med. 319:1676-1680; y eber et al. (1992) J.
Clin. Oncol. 10:33-40). Sin embargo, altas dosis de IL-2 usadas para lograr resultados terapéuticos positivos con respecto a crecimiento tumoral provocan frecuentemente varios Ref.:175312 efectos colaterales, incluyendo fiebre y escalofríos, hipotensión y pérdida capilar (síndrome de pérdida vascular o VLS) , y cambios neurológicos (ver, por ejemplo, duggan et al. (1992) J. Immunotherapy 12:115-122; Gisselbrecht et al. (1994) Blood 83:2081-2085; y Sznol and Parkinson (1994) Blood 83:2020-2022) . Aunque el' mecanismo preciso que subyace a la toxicidad inducida por IL-2 y VLS no es claro, datos acumulantes sugiere que las células asesinas naturales inducidas por IL-2 (NK) accionan toxicidades limitantes a dosis (DLT por sus siglas en inglés) como una consecuencia de sobreproducción de citocinas pro-inflamatorias incluyendo IFN-a, IFN-?, TNF-a, TNF-ß, IL-lß, y IL-6. Estas citocinas activan los monocitos/macrófagos e inducen la producción de óxido nítrico que lleva a daño subsecuente de células endoteliales (Dubinett et al. (1994) Cell Immunol. 157:170-180; Samlowski et al. (1995) J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol . 18:166-178). Estas observaciones han llevado a otros a desarrollar muteínas IL-2 que demuestran selectividad preferencial para células T opuesto a células NK basadas en la hipótesis que la alta afinidad del receptor de IL-2 (IL-2R) es expresada selectivamente en las células T (ver, por ejemplo, BAY50-4798, la muteína IL-2 N88R de IL-2 humana madura descrita en la Publicación Internacional NO. WO 99/60128 y Shanafelt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:1197- Diversas funciones de NK tales como muertenatural (NK) , LAK y citolítico DAC, producción de citocina, y proliferación dependen de la activación de intermediarios específicos en distintas trayectorias de señalización intracelular de .NK distintas. En forma importante, existe evidencia de que la modulación selectiva de interacciones de IL-2-IL-2R puede influir en diversas funciones efectoras medias por células T y NK corriente abajo tales como proliferación, producción de citocina, y muertecitolítica (Sauve et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 88:4636- 4649; Heaton et al. (1993) Cáncer Res. 53:2597-2602; Eckenberg et al. (2000) J. Exp. Med. 191-529-540). Se ha aprobado la Proleukin® IL-2 (que comprende la aldesleucina muteína IL-2 humana recombinante; Chiron corporation, Emeryville, California) por la FDA para tratar el melanoma y carcinoma renal, y está siendo estudiada para otras indicaciones clínicas, incluyendo Linfor a no de Hodgkin, VIH, y cáncer de mama. Sin embargo, debido a los efectos colaterales tóxicos asociados con IL-2, hay una necesidad para una muteína de IL-2 menos tóxica que permite mayor uso terapéutico de esta interleucina. Las muteínas de IL-2 que tienen toxicidades reducidas y/o funciones efectoras de células NK o células T mediadas por IL-2 incrementadas pueden tener un uso más amplio y pueden ser particularmente ventajosos par terapia de cáncer y para modular la respuesta inmune . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a muteínas de interleucina-2 (IL-2) humana que tienen perfiles funcionales mejorados predictivos de toxicidades reducidas. Las muteínas inducen un nivel inferior de producción de citocina pro- inflamatoria por células NK - mientras que mantiene o incrementa la proliferación de células NK, manteniendo funciones citolíticas NK mediada por NK, LAK y ADCC, y mantiene la función proliferativa de células T como se compara con las muteínas de IL-2 humanas C125S o IL-2 humanas C125S, des-alanilo-1. son proporcionadas las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican muteínas de IL-1 humana y polipéptidos aislados que comprenden estas muteínas. Usos clínicos de estas muteínas de IL-2 humanas mejoradas en el tratamiento de cáncer y en modular la respuesta inmune son también descritos. En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una muteína de IL-2 humana. En ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica una muteína de IL-2 humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 y 344. En ciertas modalidades, la invención incluye una molécula de ácido nucleico asilado que codifica una muteína de una IL-2 humana que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, y 343. En ciertas modalidades, la invención incluye una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una mutéína de IL-2 humana, en donde la muteína tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 y 344.
En ciertas modalidades, la invención incluye una molécula de ácido nucleico asilada que comprende una secuencia de nucleótido que comprende los nucleótidos 4-399 de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97", 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153,' 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, ": 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, y 343. En ciertas modalidades, las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente pueden además comprender una substitución, en donde los nucleótidos 373-375 de la SEQ SED ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, - 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219,- 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269 , 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283,. 285, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, o 343, se reemplazan con un codon triplete que codifica la alanina. En ciertas modalidades, las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente pueden además comprender una substitución, en donde los nucleótidos 373-375 de la SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167,. 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, o 343, se reemplazan con un codón triplete que codifica la cisteína. En ciertas modalidades, las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente son además modificadas para optimizar la expresión. Tales ácidos nucleicos comprenden una secuencia de nucleótido, en donde uno o más codones que codifican la muteína han sido optimizados para expresión en una célula huésped de interés. Los ácidos nucleicos de ejemplo que contienen codones optimizados pueden incluir, pero no se limitan a, ácido nucleico que comprende una secuencia de . nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 346, nucleótidos 4-399 de SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 346, y nucleótidos 4-399 de SEQ ID NO: 346. La presente invención además incluye un vector de expresión para uso en células huésped seleccionadas, en donde el vector de expresión comprende uno o más de los ácidos nucleicos de la presente invención. En tales vectores de expresión, las secuencias de ácido nucleico son enlazadas operablemente para controlar elementos compatibles con expresión en la célula huésped seleccionada. Son conocidos numerosos elementos de control de expresión por aquellos expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, lo siguiente: promotores de transcripción, elementos de incrementadores de transcripción, señales de terminación de transcripción, secuencias de poliadenilación, secuencias para optimización de inicio de traducción, y secuencias de terminación de traducción. Promotores de transcripción de ejemplo incluyen, pero no se limitan a aquellos derivados de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus, y Virus 40 de Simio. En otro aspecto, la invención proporciona células que comprende los vectores de expresión de la presente invención, en donde la secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, codificar una muteína de IL-2 humana) es enlazada operablemente para controlar elementos compatibles con expresión en la célula seleccionada. En una modalidad, tales células son células maiiiíferas. Las células mamíferas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, células de ovario de hámster Chino (CHO por sus siglas en inglés) o células COS. Otras células, tipos celulares, tipos de tejido, etc., que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos obtenidos a partir de lo siguiente: insectos (por ejemplo, Trichoplusia ni (Tn5) y Sf9) , bacterias, levaduras, plantas, células que presenten antígeno (por ejemplo, macrófago, monocitos, células dendríticas, células B, células T, células germinales, y células progenitoras de las mismas) , células primarias, células inmortalizadas, células derivadas de tumor. En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los vectores de expresión y células huésped de la presente invención para producción recombinante de las muteínas de IL-2 humana. Tales composiciones pueden incluir un portador aceptable farmacéuticamente. En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido aislado el cual comprende una muteína de IL-2 humana. En ciertas modalidades, la invención incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 y 344. En ciertas modalidades, la invención incluye un polipéptido aislado que comprende residuos de aminoácidos de 2-133 de secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 y 344. En ciertas modalidades, los polipéptidos descritos en la presente pueden además comprender una substitución, en donde se substituye un residuo de alanina por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En ciertas modalidades, los polipéptidos descritos en la presente pueden además comprender una substitución, en donde se substituye un residuo -de cisteína para el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98/ 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344.
En ciertas modalidades, el polipéptido aislado comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4 con una serina substituida para cisteína en la posición 125 de la SEQ ID NO: 4 y por lo menos una substitución de aminoácido adicional dentro de la SEQ ID NO: 4, en donde la muteína: 1) mantiene o incrementa la proliferación de células asesinas naturales (NK) , y 2) induce un nivel disminuido de producción de citocina pro-inflamatoria por células NK; como se compara con una cantidad similar de IL-2 humana C125S des-alanil-1, o IL-2 humana C125S. Las substituciones de ejemplos incluyen, pero no se limitan a, T7A, T7D, T7R, K8L, K9A, K9D, K9R, K9S, K9V, K9W, T10K, T10N, Q11A, Q11R, Q11T, E15A, -H16D, H16E, L19D, L19E, D20E, I24L, K32A, K32W, N33E, P34E, P34R, P34S, P34T, P34V, K35D, K35I, K35L, K35M, K35N, K35P, K35Q, K35T, L36A, L36A, L36E, L36F, L36G, L36H, L36I, L36K, L36M, L36N, L36P, L36R, L36S, L36W, L36Y, R38D, R38G, R38N, R38P, R38S, L40D, L40G, L40N, L40S, T41E, T41G, F42A, F42E, F42R, F42T, F42V, K43H, F44K, M46I, E61K, E61M, E61R, E62T, E62Y, K64D, K64E, K64G, K64L, K64Q, K64R, P65D, P65E, P65F, P65G, P65H, P65I, P65K, P65L, P65N, P65Q, P65R, P65S, P65T, P65V, P65W, P65Y, L66A, L66F, E67A, L72G, L72N, L72T, F78S, F78W, H79F, H79M, H79N, H79P, H79Q, H79S, H79V, L80E, L80F, L80G, L80K, L80N, L80R, L80T, L80V, L80W, L80Y, R81E, R81K, R81L, R81M, R81N, R81P, R81T, D84R, S87T, N88D, N88H, N88T, V91A, V91D, V91E, V91F, V91G, V91N, V91Q, V91W, L94A, L94I, L94T, L94V, L94Y, E95D, E95G, E95M, T102S, T102V, M104G, E106K, Y107H, Y107K, Y107L, Y107Q, Y107R, Y107T, E116G, N119Q, T123S, T123C, Q126I, y Q126V. En ciertas modalidades, los polipéptidos pueden además comprender una eliminación de alanina en la posición 1 de la SEQ ID NO: 4. La proliferación incrementada de células asesinas naturales (NK) y niveles disminuidos de producción de citocina pro-inflamatoria por células nk puede ser detectada usando un bioensayo NK-92. Los efectos de los polipéptidos descritos en la presente en la proliferación de células NK y producción de citocina pro-inflamatoria por células Nk son comparados con los efectos de una cantidad similar de IL-2 humana C125S des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables. En ciertas modalidades, se usa un bioensayo NK-92 para mostrar que los polipéptidos descritos en la presente inducen un nivel disminuido del TNF-a de citocina proinflamatoria con relación a aquella observada para una cantidad similar de IL-2 humana C125S des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables. En ciertas modalidades, se usa un bioensayo de citotoxicidad NK3.3 para mostrar que los polipéptidos descritos en la presente mantienen o mejoran la citotoxicidad asesina natural mediada por células NK humanas, citotoxicidad asesina (LAK) activada por linfocina, o citotoxicidad mediada por ADCC con relación a aquella observada para una cantidad similar de IL-2 humana C125S des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables. En ciertas modalidades, los polipéptidos descritos en la presente mantienen o mejoran la inducción de AKT fosforilado e en la línea celular NK 3.3 con relación a aquella observada para una cantidad similar de IL-2 humana C125S des-alanil 1 ó IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables. En ciertas modalidades, la proliferación de células NK inducida por la muteína es mayor a 150% de aquella inducida por una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables . En ciertas modalidades, la proliferación de células NK inducida por la muteína es mayor a 170% de aquella inducida por IL-2 humana C125, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la proliferación de células NK inducida por la muteína es aproximadamente 200% a aproximadamente 210% de aquella inducida por IL-2 humana C125, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la proliferación de células NK inducida por la muteína es incrementada por al menos 10% sobre aquella inducida por una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables. En ciertas modalidades, la proliferación de células inducida por la muteína es incrementada por al menos 15% sobre aquella inducida por IL-2 humana C125, des-alanil-1 o 11-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la producción de citocina proinflamatoria inducida por la muteína es menor a 100% de aquella inducida por una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo similares. En ciertas modalidades, la producción de citocina proinflamatoria inducida por la muteína es menor a 70% de aquella inducida por IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una muteína de IL-3 humana, en donde la muteína comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 4 con una serina substituida por cisteína en la posición 125 de la SEQ ID NO: 4 y por lo menos una substitución de aminoácidos adicional dentro de la SEQ ID NO: 4, en donde la proporción de la proliferación de células NK inducida por NK a producción de TNF-a de la muteína es por lo menos 1.5 veces mayor que aquella observada para una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1, o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables, en donde la proliferación de células Nk en la muteina 0.1 nM y la producción de TNF-a en muteína 1.0 nM son ensayados usando el bioensayo NK-92. En ciertas modalidades, la proporción es por lo menos 2.5 veces mayor que aquella observada por IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. En otras modalidades, la proporción es por lo menos 3.0 veces mayor que aquella observada por IL-2 humana C125-, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado, en donde la muteína demuestra tolerabilidad mejorada cuando se administra a un sujeto coomo se determina por medición de temperatura corporal usando un chip de temperatura in vivo, medición de caida vascular, o medición de dosis tolerada máxima en el sujeto. En ciertas modalidades, la invención propociona un polipéptido aislado el cual comprende una muteina de IL-2 humana, en donde la muteína tiene una dosis tolerada máxima superior con relación a aquella observada para el IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S, en donde la dosis tolerada máxima es determinada usando un modelo animal de melanoma B16F10. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una muteína de IL-2 humana, en donde la muteína muestra actividad antitumoral comparable o mejorada y efectos adversos reducidos comparada con el tratamiento con IL- humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de tratamiento comparables, en donde se evalúa la actividad antitumoral usando un modelo animal de melanoma B16F10. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado el cual comprende una muteína de IL-2 humana, en donde la muteina muestra actividad antitumoral comparable o mejorada y efectos adversos reducidos comparada con el tratamiento con IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de tratamiento comparables, en donde la actividad antitumoral es evaluad usando un modelo de animal de melanoma B16F10. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado el cual comprende una muteína de IL-2 humana, en donde la muteina muestra actividad antitumoral comparable o mejorada y efectos adversos reducidos comparada con el tratamiento con IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de tratamiento comparables, en donde se evalúa la actividad antitumoral usando un modelo de animal Namalwa de linfoma no de Hodgkin alto grado o un modelo de animal Daudi de linfoma no de Hodgkin grado bajo. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado el cual comprende una muteína de IL-2. humana, en donde la muteína cuando se coadministra con rituximab muestra actividad antitumoral comparable o mejorada y efectos adversos reducidos comprado con el tratamiento con IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de tratamiento comparables, en donde se evalúa la actividad antitumoral usando un modelo de animal Namalwa de linfoma no de Hodgkin grado alto o un modelo animal Daudi de linfoma no de Hodgkin grado bajo. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado, en donde la muteína muestra activación celular efectora inmune mejorada comparada con una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. Las células inmunes activadas pueden incluir, pero no se limitan a, células T, una célula NK, un monocito, un macrófago, y un neutrófilo. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado, en donde la muteína muestra muerte citolítica mediada por citotoxicidad celular dependiente a anticuerpo mejorada (ADCC) comparada con una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado, en donde la muteína provoca menos caida vascular como se compara con una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1 o 11-2 humana C125S en un modelo animal de síndrome de caída vascular. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado, en donde la muteína provoca menos cambio en la temperatura corporal como se compara con una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1 o XL-2 humana C125S en un modelo animal, en donde la temperatura corporal se monitorea en el animal con un chip de temperatura. En ciertas modalidades, la invención incluye un polipéptido aislado el cual comprende una secuencia de aminoácido para una muteína de IL-2 humana, en donde la muteína comprende la secuencia de aminoácido indicada en la SEQ" ID NO: 4, con una serina substituida por cisteí'na en la posición 125 de la SEQ ID NO: 4 y con por lo menos una substitución de aminoácidos adicional en una posición de la SEQ ID NO: 4 seleccionada del grupo que consiste de las posiciones 16, 36, 40, 42, 61, 65, 67, 72, 91, 94, 95 y 107. En ciertas modalidades, el polipéptido además comprende una eliminación de alanina en la posición 1 de la SEQ ID NO: 4. En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una muteína de interleucina-2 humana (IL-2) el cual comprende transformar una célula huésped con un vector de expresión el cual comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente y cultivar la célula huésped en un medio de cultivo celular bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula del ácido nucleico como un polipéptido, y aislar el polipéptido. En ciertas modalidades, la muteína de interleucina-2 (IL-2)- humana es capaz.de mantener o incrementar la proliferación de células NK y también induce un nivel de poder de producción de citocina proinflamatoria por células NK como se compara con una cantidad similar de una muteína de IL-2 humana de referencia selecciona de IL-2 humana C125, des-alanil-1 y IL- 2 humana 125, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocinas proinflamatorias son ensayadas bajo condiciones de ensayo similares usando el bioensayo NK-92. En otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden una cantidad efectiva terapéuticamente de uno o más de los polipéptidos descritos en la presente que comprenden una muteína de IL-2 humana. Tales composiciones pueden además incluir un portador aceptable farmacéuticamente. En otro aspecto, la invención proporciona un método para estimular el sistema inmune de un mamífero. El método comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva terapéuticamente de una muteína de IL-2 humana que induce un nivel inferior de producción de citocina pro-inflamatoria por las células NK y mantiene o incrementa la proliferación de células NK comparada con una cantidad similar de una molécula IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana C125, des-alanil-1 y IL-2 humana C125S, en donde la proliferación de células Nk y la producción de citocinas proinflamatorias son ensayadas bajo condiciones de ensayo comparables usando un bioensayo NK-92. En ciertas modalidades, el mamífero es un humano . En ciertas modalidades, la muteína IL-2 humana usada para estimular el sistema inmune comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En ciertas modalidades, la muteína IL-2 humana usada para estimular el sistema inmune comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, .322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En ciertas modalidades, la muteína IL-2 humana usada para estimular el sistema inmune puede además comprender una substitución, en donde el residuo de alanina es substituido por el residuo serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En ciertas modalidades, la muteína IL-2 humana usada para estimular el sistema inmune puede • además comprender una substitución, en donde un residuo de cisteína es substituido por el residuo serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, ?40, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174,- 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar un cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva terapéuticamente de una muteína IL-2 humana, en donde la muteína induce un nivel inferior de producción de citocina proinflamatoria por células Nk y mantiene o incrementa la proliferación de células Nk comparada con una concentración similar de una molécula IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana C125, des-alanil-1 y IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo similares, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocina proinflamatoria son ensayadas usando el bioensayo NK-92. En ciertas modalidades, el mamífero es un humano. En ciertas modalidades, la muteína IL-2 humana usada para tratar un cáncer puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 , 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290,. 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En ciertas modalidades, la muteína IL-2 humana usada para tratar un cáncer puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96,' 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En ciertas modalidades, la muteína IL-2 humana usada para tratar un cáncer puede además comprender una substitución, en donde un residuo de alanina es substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, '84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, .324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En ciertas modalidades, la muteína IL-2 humana usada para tratar un cáncer puede además comprender una substitución, en donde el residuo de cisteína es substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir los síntomas de toxicidad inducida por interleucina-2 (IL-2) . en un sujeto que sufre de administración de IL-2 como un protocolo de tratamiento. El método para tratamiento comprende administrar IL-2 como una muteína de IL-2. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 usada en el tratamiento comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En ciertas modalidades, la muteína IL-2 usada en el tratamiento comprende los residuos 2-133 de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 usada en el tratamiento además comprende una substitución, en donde un residuo de alanina es substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En ciertas modalidades, la muteína IL-2 usada en el tratamiento además comprende una substitución, en donde se substituye un residuo de cisteína por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 indica el dibujo esquemático para compilación del procedimiento de ensayo de producción de citocina proinflamatoria/proliferación de combinación usado con la PBMC humana estimulada por muteína de IL-2 aisalda de donadores humanos normales. La Figura 2 muestra la proliferación y producción de TNF-a mediada por la muteína de IL-2 F41E en PBMC humna. La Figura 3 muestra la proliferación y producción de TNF-a mediada por muteína de IL-2 L94Y en PBMC humana. La Figura 4 muestra la proliferación y producción de TNF-a mediada por Muteína de IL-2 E95D en PBMC humana. La Figura 5 muestra la proliferación y producción de TNF-a mediada por muteína de IL-2 E95G en PBMC humana. La Figura 6 muestra la proliferación y producción de TNF-a mediada por muteína de IL-2 Y107R en PBMC humana. La Figura 7 muestra el mantenimiento de actividad LAK y ADCC mediada por NK humana para PBMC humana estimulada por muteína de IL-2 aislada a partir de donadores humanos normales .
La Figura 8 muestra una gráfica de barras que compara las eficacias de muteínas Proleukin®, L2-7001®, RL-2 y IL-2, E95D y Y107R, administrada tres veces a la semana en el modelo de metástasis de pulmón con el melanoma B16F10 en ratones C57BL/6, como se describe en el Ejemplo 11. La Figura 9 compara los pesos corporales promedio de ratones tratados con muteínas de. Prol.eukin®, L2-7001®, RL- 2, o IL-2, E95D y Y107R, dosificados tres veces en el modelo de metástasis de pulmón con el melanoma B16F10 en ratones C57BL/6, como se describe en el Ejemplo 11. La Figura 10 muestra una gráfica de barras que compara las eficacias de muteínas de proleukin®, L2-7001®, RL-2, y 11-2, E95D y Y107R, administradas de acuerdo al protocolo "Sleijfer" (5 días en/2 días fuera/5 días en) en el modelo de metástasis de pulmón de melanoma B16F10 en ratones C57BL/6, como se describe en el Ejemplo 11. La Figura 11 compara los pesos corporales promedio de ratones tratados con muteínas de Proleukin®, L2-7001®, RL-2, o IL-2, E95D y Y107R, dosificados de acuerdo al protocolo "Sleijfer" (5 días en/2 días fuera/5 días en) en el modelo de metástasis de pulmón de melanoma B16F10 en ratones C57BL/6, como se describe en el Ejemplo 11. La Figura 12 muestra una gráfica de barras que compara las eficacias de muteínas de Proleukin®, L2-7001 ®, RL-2 y IL-2, F42E y Y104R, administradas de acuerdo al protocolo "Sleijfer" (5 días/2 dias fuera/5 días en) en el modelo de metástasis de pulmón de melanoma B16F10 en ratones C57BL/6, en estudio repetido como se describe en el Ejemplo 11. La Figura 13 compara los pesos corporales promedio de ratones tratados con muteína de Proleukin®, L2-7001®, RL-2 o IL2, F42E y Y107R, dosificada de acuerdo con el protocolo de "Sleijfer" (5 días en/2 días fuera de/5 días en) en el modelo de metástasis de pulmón de melanoma B16F10 en ratones C57BL/6, en un estudio repetido como se describe en el Ejemplo 11. La Figura 14 compara eficacias de Proleukin® y L2-7001®, dosificadas tres veces semanalmente en el modelo de linfoma no de Hodgkin humano agresivo (Namalwa) en ratones desnudos Balb/c irradiados, como se describe en el Ejemplo 12. La Figura 14 muestra una gráfica del volumen de tumor promedio (mm3) contra tiempo (días post estadía) . La Figura 15 compara las eficacias de muteína de IL-2 Proleukin®, L2-7001® y Y104R dosificada tres veces semanalmente en el modelo de linfoma no de Hodgkin humano agresivo (Namalwa) en ratones desnudos Balb/c irradiados, como se describe en el Ejemplo 12. La Figura 15 muestra una gráfica del volumen tumoral promedio (mm3) contra tiempo (días post estadia) . La Figura 16 compara las eficacias de muteína de IL-2 Proleukin®, L2-7001® y E95D dosificada tres veces semanalmente en el modelo de linfoma no de Hodgkin humano agresivo (Namalwa) en ratones desnudos Balb/c irradiados, como se describe en el Ejemplo 12. La Figura 16 muestra una gráfica del volumen tumoral promedio (mm3) contra tiempo (días post estadía) . La Figura 17 compara las eficacias de una terapia de un solo agente con muteína de IL-2 Proleukin®, L2-7001® y Y104R dosificada tres veces semanalmente en el modelo de linfoma no de Hodgkin humano de células B humana Daudi bajo grado en ratones desnudos Balb/c irradiados, como se describe en el Ejemplo 12. La Figura 17 muestra una gráfica del volumen tumoral promedio (mm3) contra tiempo (días post estadía), y un resumen de resultados estadísticos: % inhibición de crecimiento tumoral (TGI por sus siglas en inglés), respuesta parcial/respuesta completa (PR/CR) , valor P, cambio de % de peso corporal (BW) y observaciones clínicas . La Figura 18 compara las eficacias de muteína de IL-2 Proleukin®, L2-7001® y Y104R administrada en combinación con rituximab tres veces semanalmente en el modelo de linfoma no de Hodgkin humano de células B humana Daudi bajo grado en ratones desnudos Balb/c irradiados, como se describe en el Ejemplo 12. La Figura 18 muestra una gráfica del volumen tumoral promedio (mm3) contra tiempo (días post estadía) , y un resumen de resultados estadísticos: % inhibición de crecimiento tumoral (TGI por sus siglas en inglés) , respuesta parcial/respuesta completa (PR/CR) , valor P, cambio de % de peso corporal (BW) y observaciones clínicas. La Figura 19 compara los niveles de sobrevivencia condicional e inhibición de crecimiento tumoral para ratones tratados con muteína de IL-2 Proleukin®, L2-7001® y Y104R en combinación con rituximab tres veces semanalmente en el modelo de linforna no de Hodgkin humano de células ' B humana Daudi bajo grado en ratones desnudos Balb/c irradiados, como se describe en el Ejemplo 12. La Figura 19 muestra una gráfica de la sobrevivencia condicional (%) contra tiempo de retraso de crecimiento tumoral (días para progresión tumoral a 1000 mm3) y una tabla que resume las estadísticas de respuesta completa (CR por sus siglas en ingles) . La Figura 20 compara los pesos corporales promedio de ratones tratados con muteína de IL-2 Proleukin®, L2-7001® y Y104R en la presencia o ausencia de rituximab, dosificada tres veces semanalmente en el modelo de linfoma no de Hodgkin humano de células B humana Daudi bajo grado en ratones desnudos Balb/c irradiados, como se describe en el Ejemplo 12. La Figura 21 muestra una gráfica de barras que compara la tolerancia a fármaco de muteína de IL-2 Proleukin®, L2-7001® y E95D y Y104R, como se evalúa en un modelo de síndrome de caída vascular inducida por IL-2 aguda experimental en ratones C57B1/6. La retención de 125I-albúmina en los pulmones de ratones, que resultan de caida vascular incrementada provocada por tratamiento con IL-2, es medida como se describe en el Ejemplo 13. La Figura 22 muestra una gráfica que representa los cambios en temperatura corporal de núcleo de ratones en respuesta al tratamiento con IL-2. Se administran Proleukin® y L2-7001® de acuerdo al protocolo "Sleijfer" (5 días en/2 días fuera/5 días con) a ratones C57BL/6 implantados subcutáneamente con un chip de temperatura para monitorear la temperatura después de dosificación con IL-2. Se monitorea la temperatura hasta 9 horas post- dosificación por 10 dosis sobre un periodo de 2 semanas. Los cambios más consistentes, significativos en temperatura ocurre en 4 horas post dosificación en el día 5 del tratamiento. La Figura 23 muestra una gráfica que compara las temperaturas corporales de núcelco de ratones C57BL/6 tratados con Proleukin®, L2-7001® o una muteína de IL-2, L94Y, F42E o E95G. Los ratones C57BL/6, implantados subcutáneamente con un chip de temperatura, son monitoreados hasta 9 horas post dosificación por 10 dosis sobre un periodo de 2 semanas como se describe en el Ejemplo 14. La Figura 24 muestra una gráfica de barras que compara las temperaturas corporales de núcleo de ratones C57BL/6 en el día 5 en 4 horas post dosificación con Proleukin®, L2-7001® o una muteína de IL-2, E95D, L94Y, Y107R o F42E. Se administra IL-2 de acuerdo al protocolo de "Sleijfer" (5 días con/2 días sin/5 días con) en ratones C57BL/6 implantados subcutáneamente con un chip de temperatura, como se describe en el Ejemplo 14. La Figura 25 muestra la correlación entre las disminuciones de temperatura corporal y niveles plasmáticos de TNF-a en ratones C57BL/6 tratados con Proleukin®, L2-7001® o una muteína de IL-2, E95D, L94Y, Y107R o F42E. Las gráficas de barra son mostradas comparando los cambios en temperatura corporal y niveles de TNF-a plasmáticos de ratones en el día 5, 4 horas post dosificación con IL-2, de acuerdo al protocolo "Sleifjer" como se describe en el Ejemplo 14. Una gráfica de cambio de temperatura contra concentración de TNF-aindica que las disminuciones en la temperatura e incrementos en los niveles plasmáticos de TNF-a están correlacionados linealmente. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a muteinas de interleucina-2 humana (hIL-2) que tienen eficacia terapéutica mejorada debido a su toxicidad reducida y/o funciones efectoras de células NK o T mejoradas. Las muteínas IL-2 humanas descritas en la presente, y variantes activas biológicamente de las mismas, producen producción de citocina pro-inflamatoria reducida mientras que mantienen o incrementan la proliferación de células asesinas naturales (NK) , como se compara con la des-alanil-1, muteína de IL-2 humana C125S o la muteína de IL-2 humana C125S. por "citocina pro-inflamatoria" se propone una citocina que es capaz de estimular el sistema inmune. Tales citosinas incluyen, pero no se limitan, a IFN-a, IFN-?, TNF-a, TNF-ß, IL-lß y IL-6. El término "muteína" se refiere a una proteína la cual comprende una secuencia de aminoácidos mutante que difiere de la secuencia de aminoácidos para la proteína que se encuentra en forma natural por eliminaciones de aminoácidos, substituciones o ambas. Las muteínas IL-2 humanas de la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de IL-2 humana madura por tener un residuo de serina substituida por el residuo de cisteía en la posición 125 de la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, C125S) y por lo menos otra substitución de aminoácidos, y puede además comprender una o más eliminaciones de aminoácido con relación a la secuencia de IL-2 humana madura, tal como eliminación de la alanina N terminal (Ala) en la posición 1 de la proteína IL_2 humana madura. En las modalidades alternativas, las muteínas de IL-2 humanas de la presente invención retienen el residuo de cisteína en la posición 125 de la secuencia de IL-2 humana madura pero tiene por lo menos otra substitución de aminoácidos, y puede además comprender una o más eliminaciones de aminoácido con relación a la secuencia de IL-2 humana madura, tal como eliminación de la alanina N- terminal (Ala) en la posición 1 de la proteína IL-2 humana madura. Estas muteínas de IL-2 humana pueden ser glicosiladas o no glicosiladas dependiendo del sistema de expresión de huésped usado en su producción. Las substituciones particulares descritas en la presente resultan en una variante de IL-2 humana que retiene las actividades deseadas para producir producción de citosina pro-inflamatoria reducida mientras que mantiene o incrementa la "proliferación de células NK, como se compara con des-alanil-2, muteína de IL-2 humana C125S o la muteína IL-2 humana C125S usando los ensayos de células NK-92 descritos en la presente. Habiendo identificado las posiciones dentro de la secuencia de IL-2 humana y las substituciones relevantes en estas posiciones que resultan en una variante de IL-2 con toxicidad reducida y/o proliferación de células NK mejoradas, está dentro de la experiencia de una persona en la técnica para variar otros residuos dentro de la secuencia de IL-2 humana para obtener variantes de las muteínas de IL-2 humanas descritas en la presente que también retienen estas actividades deseadas. Tales variantes de las muteínas de IL-2 humanas descritas en la presente son también propuestas para estar comprendidas por la presente invención, y son además definidas posteriormente . La IL-2 humana es traducida inicialmente como un polipéptido precursor, mostrado en la SEQ ID NO: 2, la cual es codificada por una secuencia de nucleótidos tal como aquella indicada en la SEQ ID N0:1. El polipéptido precursor incluye una secuencia de señal en los residuos 1-20 de la SEQ ID NO: 2. El término "IL-2 humana madura" se refiere a la secuencia de aminoácidos indicada como la SEQ ID NO: 4, la cual se codifica por una secuencia de nucleótidos tal como aquella indicada como la SEQ ID NO: 3. Los términos "muteína de IL-2 humana C125S" o "IL-2 humana C125S" se refiere a una muteína de IL-2 humana madura que retiene la alanina N-terminal que reside en la posición 1 de la secuencia de IL-2 humana madura y la cual tiene una substitución de serina por cisteína en la posición 125 de la secuencia de IL-2 humana madura. La muteína de IL-2 humana C125S tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 6, la cual se codifica por una secuencia de nucleótidos tal como aquella indicada como la SEQ ID NO: 5. Los términos "des-alanil-1", "IL-2 humana C125S", y "des-alanil-1, serina-125 IL-2 humana" se refiere a una muteína de IL-2 humana madura que tiene una substitución de serina por cisteína en la posición de aminoácidos 125 de la secuencia de IL-2 humana madura y la cual carece de la alanina N-terminal que reside en la posición 1 de la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, en la posición 1 de la SEQ ID NO: 4). IL-2 humana C125, des- alanil-1 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 8, la cual se codifica por una secuencia ' de nucleótidos tal como aquella indicada en la SEQ ID NO: 7. La E. coli produce recombinantemente des-alanil-1, muteínan de IL_2 humana C125S, la cual es referida como "aldesleucina", está disponible comercialmente como una formulación que es vendida bajo la marca Proleukin® IL-2 (Chiron Corporation, Emeriville, California) . Para los propósitos de la presente invención, la IL-2 humana C125, des-alanil-1 y muteínas de IL-2 humana C125S sirven como muteínas de IL-2 de referencia para determinar las actividades deseables que están para ser exhibidas por las muteínas de IL-2 humanas de la invención. Es decir, la actividad deseada de la producción de citocina pro-inflamatoria inducida por IL-2 reducida, particularmente la producción de TNF-a, por células NK en una muteína de IL-2 humana adecuada de la invención se mide con relación a la cantidad de la producción de citocina pro-inflamatoria de células NK que es inducida por una cantidad equivalente de des-alanil-1, muteína de IL-2 humana C125S o muteína de IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo similares. Similarmente, la actividad deseada para mantener o incrementar la proliferación de células NK inducida por IL-2 en una muteína de IL-2 humana adecuada de la invención se mide con relación a la cantidad de proliferación de células NK inducida por una cantidad equivalente de la IL-2 humana C125, des-alanil-1 o muteina IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo similares . Se proporcionan también las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las muteinas de IL-2 humanas, y variantes activas biológicamente de las mismas, que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125, des-alanil-1 (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución y la cual induce un nivel inferior de producción de citocina pro-inflamatoria por células NK mientras mantiene o incrementa la proliferación de células NK, como se compara con estas dos muteinas de IL-2 de referencia . Las muteinas de IL-2 humana de la invención incluyen las muteinas indicadas en la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228", 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 y 344, las cuales son también referidas en la presente como "las secuencias indicadas en incluso las SEQ ID NO: 10-344". La presente invención también proporciona cualesquiera secuencias de nucleótidos que codifican estas muteinas, por ejemplo, las secuencias de codificación indicadas en las SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183,. 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231,' 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, y 343, respectivamente. Estas secuencias de codificación son también referidas en la presente como "las secuencias indicadas en la SEQ ID NO: 9-343" raras. Las muteinas indicadas en estas secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente comprenden la secuencia de aminoácidos IL-2 humana C125S con una de las substituciones adicionales mostradas en la Tabla 1 posterior. En modalidades alternativas, las muteinas IL-2 humanas de la presente invención tienen el residuo de alanina residual en la posición 1 de estas secuencias de aminoácidos eliminadas, y de esta forma comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125, des-alanil-1 con una de las substituciones adicionales mostradas en la Tabla 1 posterior. Estas muteinas de esta forma tienen una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de la secuencia indicada en la" SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, , 340, 342 o 344. La presente invención también proporciona cualesquiera secuencias de nucleótidos que codifican estas muteínas, por ejemplo, las secuencias de codificación indicadas en los nucleótidos 4-399 de la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 'l45, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 201, 203, 205, ( 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, o 343. Las variantes biológicamente activas de las muteinas de IL-2 humanas de la invención, incluyendo fragmentos y formas truncadas de las mismas. Que tienen el perfil funcional de muteina de IL-2 humana deseada como se indica en la presente son también proporcionados. Por ejemplo, fragmentos o formas truncadas de las muteinas de IL-2 humanas descritas pueden ser generadas por remover residuos de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos de muteina de IL-2 humana de longitud completa usando técnicas de ADN recombinantes bien conocidas en la técnica y descritas en la presente. Las variantes adecuadas de las muteinas de IL-2 humanas de la invención tendrán actividades biológicas similares a aquellas exhibidas por las muteinas de IL-2 humanas novedosas por si mismas, es decir, tienen una baja toxicidad de la muteina de IL-2 humana novedosa (es decir, producción de citocina pro-inflamatoria baja o reducida) , así como también la capacidad para mantener o incrementar la proliferación de células NK, cuando se comparan con la molécula de IL-2 de referencia, es decir, IL-2 humana C125, des-alanil-1 o C125S, usando los bioensayos descritos en la presente. Se reconoce que una variante de cualquier muteina de IL-2 humana novedosa dada identificada en la presente puede tener un nivel absoluto diferente de una actividad biológica particular con relación a aquella observada para la muteina de IL-2 humana novedosa de la invención, siempre y cuando retenga el perfil biológico deseado de tener toxicidad reducida, es decir, induzca un nivel inferior de producción de citosina pro-inflamatoria por células NK, y/o proliferación de células NK incrementada cuando se compara con la muteina de IL-2 humana de referencia. Tabla 1. Ejemplos de muteinas de IL-2 humana de la invención que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) o IL-2 humana C125, des-alanil-1 (SEQ ID NO : 8) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo mostrado posteriormente. T7A L36G P65E R81L T7D L36H P65F R81M T7R L36I P65G R81? K8L L36K P65H R81P K9A L36M P65I R81T K9D L36N P65K D84R K9R L36P P65L S87T K9S L36R P65? ?88D K9V L36S P65Q ?88H K9W L36W P65R ?88T T10K L36Y P65S V91A T10? R38D P65T V91D Q11A R38G P65V V91E Q11R R38? P65W V91F QHT R38P P65Y V91G E15A R38S L66A V91Q H16D L40D L66F V91W H16E L40G E67A V91? L19D L40? L72G L94A L19E L40S L72? L94I D20E T41E L72T L94T I24L T41G F78S L94V K32A F42A F78W L94Y Las composiciones de la invención además comprende vectores y células huésped para la producción recombinante de las muteinas de IL-2 humanas de la invención o variantes biológicamente activas de las mismas. Además, las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva terapéuticamente de una muteína de IL-2 humana descrita en la presente o variante biológicamente activo del mismo, y un portador aceptable farmacéuticamente, son también proporcionados . Los métodos para producir muteinas de IL-2 humana que inducen un nivel inferior de producción pro-inflamatoria por células NK y las cuales mantienen o incrementan la proliferación de células NK con relación a aquella observada para las muteínas de IL-2 de referencia están comprendidas por la presente invención. Estos métodos comprenden transformar una célula huésped con un vector de expresión el cual comprende una .molécula de ácido nucleico que codifica una muteina de IL-2 humana novedosa de la invención, o codificar una variante activa biológicamente de la misma, cultivar la célula huésped en un medio de cultivo celular bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido codificado, y aislando el producto de polipéptido. Los métodos son también proporcionados para estimular el sistema inmune de un animal, o para tratar un cáncer en un mamífero, el cual comprende administrar al animal una cantidad efectiva terapéuticamente de una muteina de IL-2 humana de la invención, o una variante activa biológicamente de la misma, en donde la muteina de IL_ o variante de la misma induce un nivel inferior de producción de citocina pro-inflamatoria por células NK y mantiene o incrementa la proliferación de células NK comparada con la IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S como se determina usando los bioensayos descritos en la presente posteriormente . La presente invención también proporciona un método para reducir los síntomas de toxicidad inducidas por la interleucina-2 (IL-2) en un sujeto que sufre de administración de IL-2 como un protocolo de tratamiento. El método comprende administrar una muteina de IL-2 de la presente invención, es decir, una muteina que "induce un nivel inferior de producción de citocina pro-inflamatoria por células NK, y la cual mantiene o incrementa la proliferación de células Nk comparada con des-alanil-1, IL-2 humana C125S o IL-2 humana C125S como se determina usando los bioensayos descritos posteriormente en la presente. Como se usa en la presente, "molécula de ácido nucleico" se propone para incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado usando análogos de nucleótido. La molécula de ácido nucleico puede ser de una cadena o de doble cadena, pero preferentemente es ADN de doble cadena. La invención comprende ácido nucleico substancialmente purificado o aislado o composiciones de proteína. Una molécula o proteína de ácido nucleico "Aislado" o "purificado", o porción biológicamente activa de la misma, es substancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con la molécula de ácido nucleico o proteína como se encuentra en su ambiente donde se encuentra naturalmente. De esta forma, una molécula de ácido nucleico purificada o aislada o proteína es substancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o substancialmente libre de precursores químicos, u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Preferentemente, un ácido - nucleico "Aislado" es libre de secuencia (preferentemente secuencias que codifican proteína) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, las secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula de ácido nucleico aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, ó 0.1 kb, de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico. Una proteína que es substancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% ó 1% (en peso seco), de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención o variante activa biológicamente de la misma es producida recombinantemente, preferentemente el medio de cultivo representa menos de .aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% ó 1% (en peso seco) de precursores químicos o químicos no proteína de interés. Actividad biológica de muteinas de IL-2 humana novedosa Las muteinas IL-2 humanas novedosas de la presente invención tiene un índice terapéutico incrementado comparado con la muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1, o comparada con la muteina de IL-2 humana C125S. Las últimas dos muteinas son referidas en la presente como "muteinas de IL-2 de referencia", ya que los perfiles biológicos de las muteinas novedosas de la invención son comparados con los perfiles biológicos de estas dos muteinas caracterizadas previamente, donde cualquier comparación dada es hecha usando concentraciones de proteína similares y condiciones de ensayo comparables, con el fin de clasificar las muteinas de la presente invención. El índice terapéutico incrementado de las muteinas de la presente invención se refleja en un perfil de toxicidad mejorado (es decir, la muteina induce un nivel inferior de producción de citocina pro-inflamatoria por células NK) , una función efectora de células NK y/o T incrementada sin toxicidad incrementada, o ambas un perfil de toxicidad mejorada y una función efectora de células T y/o Nk' incrementada de estas muteinas cuando se compara con el perfil de toxicidad y la función efectora de células NK y/o T de a sea dos muteinas de IL-2 de referencia.
Se usan tres puntos finales funcionales para seleccionar las muteinas con índice terapéutico incrementado: (1) la capacidad para reducir la producción de citocina pro- inflamatoria inducida por IL-2 por células NK como se compara con IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S; (2) la capacidad para mantener o incrementar la proliferación inducida por IL-2 de células NK o T sin un incremento en la producción de citocina pro-inflamatoria por las células Nk como se compara" con des-alanil-1, IL-2 humana C!25S o IL-2 humana C125S; y (3) la capacidad para mantener o mejorar (es decir, incrementar) la muerte celular citolítica mediada por NK como se compara con KL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. La muerte celular citolítica mediada por NK incluye muerte citolítica mediada por asesina activada por linfocina (LAK) , mediada por NK y mediada por citotoxicidad celular dependiente a anticuerpo (ADCC) . Las muteinas de IL-2 humana novedosa descritas en la presente que exhiben las mejoras más grandes en índice terapéutico caen dentro de tres clases funcionales predictivas de beneficio clínico mejorado. Es de notar que todas estas muteinas exhiben actividad de proliferación de células T mantenida o incrementada y actividad citolítica mediada por NK. La primera clase funcional de muteinas se caracteriza por tener mutaciones benéficas que reducen la producción de citocina pro-inflamatoria inducida por IL-2 por células NK como se compara con la muteina IL-2 de referencia, es decir, des-alanil-1, IL-2 humana C125 o IL-2 humana C125S, mientras que mantiene una proliferación de células NK inducida por IL-2. La segunda clase funcional de muteinas incrementa la proliferación de células NK inducida por IL-2 con relación a aquella inducida por ya sea las muteinas de IL-2 de referencia, sin impactar negativamente (es decir, incrementar) la producción de citocina pro-inflamatoria con relación a aquella inducida por cualquiera de las muteinas de IL_2 de referencia. La tercera clase funcional de muteinas incluye muteinas que son "bifuncionales" ya que son capaces de reducir la producción de citocina pro-inflamatoria inducida por IL-2 por células NK mientras que incrementan la proliferación de células NK inducida por IL-2 cuando se comparan con los niveles de estas actividades inducidas por cualquiera de estas dos muteinas de IL-2 de referencia. Los ensayos para medir la proliferación de células NK inducida por IL-2 y producción de .citocina pro-inflamatoria por células NK aisladas recientemente son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Perussia (1996) Methods 9:370 and Baume et al. (1992) Eur. J. Im unol. 22 : 1-6. La línea celular NK-92 tiene características fenotípicas y funcionales de células NK, incluyendo proliferación en la presencia de IL-2 (Gong et al. (1994) Leukemia (8:652), sin embargo poca o ninguna producción de TNF-a en la presencia de IL-2 ha sido previamente reportada (Nagashima et al. (1998) Blood 91:3850). Los bioensayos de IL-2 que han sido desarrollados para tamizar actividades funcionales de células NK y T humanas son descritas en la presente y en la sección Experimental posterior. Aunque pueden ser usados otros ensayos para medir la proliferación de células NK y producción de citocina pro-inflamatoria de células NK, y función efectora de células. T, preferentemente los bioensayos de IL-2 descritos en la presente son usados para tamizar muteinas de IL-2 de interés para determinar si retienen las características deseada de las muteinas descritas en la presente. Es de particular interés su inducción disminuida de producción de TNF-a por células NK. De esta forma, en una modalidad, la proliferación de células NL inducida por IL-2 y la producción de TNF-a son medidas usando el bioensayo de IL-2 descrita en la presente posteriormente para la línea celular NK-92 humana (ATCC CRL-2407, CMCC ID #11925) . Para una descripción de la líena celular NK-92, ver Gong et al. (1994) Leukemia 8 (4 ): 652-658. Para propósitos de la presente invención, este bioensayo es referido como el "bioensayo de NK-92". Por "reducir" o producción de citocina pro-inflamatoria "reducida" se propone que las muteinas de IL-2 humanas de la invención inducen un nivel de producción de citocina pro-inflamatoria por células NK que es disminuida con relación a aquella inducida por las muteinas de IL-2 de referencia, es decir, IL-2 humana C125, des-alanil-1 o muteina de IL-2 humana C125S, particularmente con respecto a la inducción de producción de TNF-a por células NK. Aunque las muteinas de IL-2 humanas de la presente invención inducen un nivel mínimo de producción de TNF-a por células NK que es por lo menos 20% de aquella inducida por una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables, el nivel máximo de producción de TNF-a por células NK que pueden ser inducidas por una muteina de la presente invención depende de la clase funcional en la cual se ha categorizado una muteína. De esta forma, por ejemplo, en algunas modalidades, las muteinas han sido seleccionadas- para incrementar bastante la inducción de proliferación de células NK sin tener un impacto negativo en la producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK (es decir, la segunda clase funcional de muteinas) . En estas modalidades, las muteinas de IL-2 humanas de la presente invención inducen un nivel de producción de TNF-a por células NK que es similar a (es decir, + 10%) a aquella inducida por las muteinas de IL-2 de referencia o, preferentemente, menos de 90% de aquella inducida por la muteina de IL-2 de referencia donde la producción de TNF-a ensayada usando la línea celular NK-92 humana (ATCC CRL-2407, CMCC ID # 11925) (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) y 1.0 nM ó 100 pM (es decir, 0.1 nM) de concentración de las muteinas de IL-2 humanas respectivas. En otras modalidades de la invención, las muteinas de IL-2 humanas de la presente invención inducen un nivel de producción de TNF-a por células NK es decir menos de 90%, preferentemente menos de 85%, incluso más preferentemente menos de 80% de la producción de TNF-a inducida por una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables, donde se ensaya la producción de TNF-a usando, la línea de células NK- 92 humana (es decir, usando el bioensayo de Nk-92 descrito en la presente) y una concentración 1.0 nM de las muteinas de IL-2 humana respectiva. En algunas modalidades, las muteinás de IL-2 humanas de la invención inducen por lo menos 20% pero menos de 60% de la producción de TNF-a inducida por IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S, donde se ensaya la producción de TNF-a usando la línea celular Nk-92 humana (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) y una concentración 1.0 nM de las muteinas de IL-2 humanas respectivas. Tales muteinas, las cuales también mantienen o incrementan la proliferación de células NK inducida por IL-2 con relación a las muteinas de IL-2 de referencia, caen dentro de la primera clase funcional de las muteinas de IL-2. Por "mantener" se entiende que las muteinas de IL-2 humanas de la presente invención induce por lo menos 70%, preferentemente por lo menos 75%, más preferentemente por. lo menos 80%, y más preferentemente por lo menos 85% y hasta incluir 100% (es decir, valores equivalentes) de la actividad biológica deseada con relaciona al nivel de actividad observada por una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables. De esta forma, donde la actividad biológica deseada es inducción de proliferación de células NK, muteinas de IL-2 adecuadas de la invención inducen un nivel de proliferación de células NK que es por lo menos 70%, preferentemente por lo menos 75%, más preferentemente por lo menos 80%, y más preferentemente por lo menos 85%, 90%, 95% y hasta e incluyendo 100% (+ 5%) de la actividad de proliferación de células NK inducida por una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S, donde la proliferación de células NK es ensayada bajo condiciones comparables usando el mismo bioensayo (es decir, el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) y cantidades similares de estas muteinas de IL-2. Por "mejora" o "incremento" o "mejora" se proprone que la muteina de IL-2 humana induce la actividad biológica deseada en un nivel que es incrementado con. relación a aquel observada para una cantidad similar de IL-2 humana C125, des-alanil-1, o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables. De esta forma, donde la actividad biológica deseada es inducción de proliferación celular de NK, adecuadas muteinas de IL-2 de la invención inducen un nivel de proliferación de células NK que es por lo menos 105%, 110%, 115%, más preferentemente por lo menos 120%, incluso más preferentemente por lo menos 125%, y más preferentemente por lo menos 130%, 140%, ó 150% de la actividad de proliferación de células NK observada para una cantidad similar de des-alanil-1, IL-1 humana C125S o IL-2 humana C125S usando el mismo ensayo de proliferación de células NK (por ejemplo, el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) . Los ensayos para medir la proliferación de células Nk son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Baume et al. (1992) Eur. J. Immuno . 22 :l-6, Gong et al., (1994) Leukemia 8 (4) : 652-658 , y el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) . Preferentemente las células de NK-92 son usadas para medir la producción de citocina pro-inflamatoria inducida por IL-2, particularmente producción de TNF-a, y proliferación de células NK (es decir, el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) . Las concentraciones adecuadas de muteina IL-2 humana para uso en el ensayo de proliferación de células NK incluye aproximadamente 0.005 nM (5 pM) a aproximadamente 1.0 nM (1000 pM) , incluyendo 0.005 nM , 0.02 nM, 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 1.0 nM, y otros de tales valores entre aproximadamente 0.005 nM y aproximadamente 1.0 nM. En modalidades preferidas descritas en la presente posteriormente, el ensayo de proliferación de células NK se realiza usando células NK-92 y una concentración de muteina de IL-2 humana de aproximadamente 0.1 nM o aproximadamente "1.0 nM. Como un resultado de su inducción reducida de " producción de citocina pro-inflamatoria y proliferación de células NK inducidas por IL-2 mantenida o incrementada, las muteinas de IL-2 humanas de la presente invención tienen una proporción más favorable de proliferación de células NK inducida por IL-2 : producción de citocina pro-inflamatoria inducida por IL-2 por células NK que ya sea lo hacen IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S, donde estas actividades son medidas para cada muteina usando concentraciones de proteína comparables y condiciones de bioensayo. Donde la citocina pro-inflamatoria que es medida es TNF-a, muteinas de IL-2 humanas adecuadas de la invención tienen una proporción de proliferación de células Nk inducida por IL-2 en 0.1 nM de muteína: producción de TNF-a inducida por IL-2 por células Nk en muteina 1.0 nM que es por lo menos 1.5 veces aquella obtenida con IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de bioensayo similares y concentraciones de proteína, más preferentemente por lo menos 1.75 veces, 2.0 veces, 2.25 veces, incluso más preferentemente por lo menos 2.75 veces, 3.0 veces, ó 3.25 veces aquella obtenida con las muteinas de IL-2 de referencia. En algunas modalidades, las muteinas de IL-2 humanas de la invención tienen una proporción de proliferación de células NK inducida por IL-2 en 0.1 nM de muteina: producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK en 1.0 nM de muteina que es por lo menos 3.5 veces, 4.0 veces, 4.5 veces, o incluso 5.0 veces aquella obtenida con des-alanil-1, 11-2 humana o muteina de IL-2 humana C125S bajo condiciones de bioensayo similares y concentraciones de proteína. Las muteinas de la presente invención, pueden también incrementar (es decir, incrementar) la sobrevivencia de células NK con relación a aquella observada con IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de bioensayo similares y concentraciones de proteína. La sobrevivencia de células NK puede ser determinada usando cualquier ensayo conocido en la técnica, incluyendo los ensayos descritos en la presente. De esta forma, por ejemplo, la sobrevivencia de células NK en la presencia de una muteína de IL-2 de interés puede ser determinada por medir la capacidad de la muteina de IL-2 para bloquear la muerte celular programada por glucocorticosteroide e inducir la expresión de BCL-2 en células NK (ver, por ejemplo, Ar ant et al (1995) Immunology 85:331) .
La presente invención proporciona un ensayo para monitorear efectos de IL-2 en sobrevivencia de células de NK. De esta forma, en una modalidad, la sobrevivencia de células NK en la presencia de una muteina de IL-2 humana de interés se determina por medir la capacidad de la muteina - para inducir la cascada de señalización de sobrevivencia de células en las células NK 3.3 (CMCC ID # 12022; ver Kornbluth (1982) J. Immunol. 129 ( 6) : 2831-2837) usando pAKT ELISA. EN esta forma, la sobreregulación de fosforilación de AKT en • células NK por una muteina de IL-2 de interés se usa como un indicador de sobrevivencia de células NK. Las muteinas de IL-2 para uso en los métodos de la presente invención activarán y/o expanderan células asesinas naturales (NK) para mediar la actividad asesina activada de linfocina (LAK) y citotoxicidad celular dependiente a anticuerpo (ADCC) . Las células NK de descanso (inactivadas) median la citotoxicidad espontánea o natural contra .ciertos objetivos celulares referidos como objetivos "sensibles a células NK", tales como la línea celular K562 de eritroleucemia humana. Después de la activación por IL-2, las células NK adquieren actividad LAK. Tal actividad LAK puede ser ensayada, por ejemplo, por medir la capacidad de células NK activadas por IL-2 para matar una variedad amplia de células tumorales y otros objetivos "insensibles a NK", tales como la línea de linfoma de células B Daudi, que son normalmente resistentes a lisis por células NK de descanso (es decir, inactivadas) . Similarmente, la actividad de ADCC puede ser ensayada por medir la capacidad de células NK activadas por IL-2 para lisar las células objetivas "insensibles a NK/sensibles a LAK", tales como línea de linfoma de células B Dauda, u otras células objetivo no fácilmente lisadas por células NK de descanso (es decir, inactivado) en la presencia de concentraciones óptimas de anticuerpos específicos de células tumorales relevantes. Los métodos para generar y medir la actividad citotóxica de células NK/LAK y ADCC son conocidas en la técnica. Ver por ejemplo, Current Protocols in Immunology: Immunologic Studies in Humans, Supplement 17, Unidad 7.7, 7.18 y 7.27 (John wiley & Sons, Inc., 1996). En una modalidad, la actividad de ADCC de las muteinas de IL-2 de la invención se mide usando la línea celular de NK3.3, la cual exhibe características fenotípicas y funcionales de células NK sanguíneas periféricas. Para propósitos de la presente invención, este ensayo se refiere en la presente como "bioensayo de citotoxicidad de NK3.3". Las muteinas de IL-2 humana de la invención pueden también mantener o incrementar la proliferación de células T inducida por IL-2 comparada con aquella observada para IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones de bioensayo similares y "concentraciones de proteína. Los ensayos de proliferación de células T son bien conocidos en la técnica. En una modalidad, la línea celular T humana Kit225 (CMCC ID#11234; Hori et al. (1987) Blood 70 (4) : 1069-1072) se usa para medir la proliferación de células T de acuerdo con el ensayo descrito en la presente posteriormente . Como se indica anteriormente, los candidatos de muteina de IL-2 humana conductores identificados en la presente (es decir, aquellas muteinas novedosas que tienen el índice terapéutico más mejorado) caen dentro de tres clases funcionales. La primera clase funcional incluye aquellas muteinas que inducen un nivel inferior de producción de TNF-a por células NK, aproximadamente 60%, o menos, de aquella inducida por IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S, cuando todas las muteinas son ensayadas bajo condiciones similares en una concentración de proteína de 1.0 nM, y la cual mantiene o incrementa la proliferación de células NK con relación a des-alanil-1, IL-1 humana C125S o IL-2 humana C125S. Estas muteinas pueden ser además subdivididas en dos subclases: (1) aquellas muteinas de IL-2 humanas que incrementan (es decir, mayor a 100%) la proliferación de células NK inducida por IL-2 con relación a aquella observada para las muteinas de IL-2 humanas de referencia cuando estas muteinas son ensayadas bajo condiciones similares en una concentración de proteína de aproximadamente 1.0 nM, pero la cual ha reducido (es decir, menos de 100%) la actividad proliferativa de células NK con relación a aquella observada para las muteinas de IL-2 humanas de referencia en concentraciones de aproximadamente 0.1 nM o abajo:, y (2) aquellas muteinas de IL-2 humana que incrementan (es decir, más de 100%) o mantienen (es decir, por lo menos aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100%) la proliferación de células NK inducidas por IL-2 con relación a aquella observada para las muteinas de IL-2 humanas de referencia cuando estas muteinas son ensayadas bajo condiciones similares en concentraciones de proteína de aproximadamente 1.0 nM hacia abajo a aproximadamente 0.05 nM (es decir, aproximadamente 50 pM) . En una modalidad, la proliferación de NK inducida por IL-2 y la producción de TNF-a son determinadas usando las células NK-92 (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) , en el cual la proliferación de células NK se determina usando un equipo de reducción de tinte MTT disponible comercialmente (CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit: disponible de Promega Corp., Madison, Wisconsin) y un índice de estimulación es calculado en base a la lectura colorimétrica y se cuantifica el TNF-a usando un equipo ELISA TNF-a disponible comercialmente (BioSource Cytoscreen™ Equipo ELISa de TNF-a Humano; Camarillo, California) . Las muteinas de IL-2 humanas dentro de esta primera clase funcional incluyen aquellas muteinas que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125, des-alanil-1 (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo que consiste de F42E, V91D y L72N, donde la posición de residuo (es decir, 42, 91 ó 72) es relativa a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a la SEQ ID NO: 4) . Las muteinas de la IL-2 humana que comprenden la substitución de F42E o V91D además de la substitución de C125S, la cual puede o no puede comprender la alanina N-terminal en la posición 1 de la IL-2 humana, cae dentro de la subclase (1) de esta primera clase funcional de muteinas. Ver el Ejemplo 8, y la Tabla 13 en la presente posteriormente, las muteinas de IL-2 humanas que comprenden la substitución de L72N además de la substitución de C125S, la cual puede o no puede comprender la alanina N terminal en la posición 1 de la 1L-2 humana, cae dentro de la subclase (2) de esta primera clase funcional de muteinas. Ver el Ejemplo 8, y la Tabla 14, posteriormente en la presente. La segunda clase funcional de las muteinas de IL-2 humanas incluye aquellas muteinas que incrementan fuertemente la proliferación de células NK sin impacto dañino en la producción de TNF-a inducida por IL-2 por las células NK. Las muteínas dentro de este grupo funcional cumple tres criterios de selección: (1) nivel de proliferación de células NK inducida por IL-1 que es mayor a aproximadamente 200% de aquella inducida por la IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S en una o más concentraciones de la muteina de IL-2 humana seleccionada del grupo que consiste de 0.005 nM (es decir, 5 pM) , 0.02 nM (es decir, 20 pM) , 0.05 nM (es decir, 50 pM), -0.1 nM (es decir, 100 pM) , ó 1.0 nM (es decir, 1000 pM) ; (2) nivel de proliferación de células de NK inducida por IL-2 que es mayor de aproximadamente 150% de aquella inducida por IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S Cuando se mide por al menos dos concentraciones de muteina de IL-2 humana seleccionada del grupo que consiste de 0.005 nM (es decir, 5 pM) , 0.02 nM (es decir, 20 pM) , 0.05 nM ( es decir, 50 pM) , 0.1 nM (es decir, 100 pM) , ó 1.0 nM (es decir, 1000 pM) y (3) un nivel de producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK que es similar a (es decir, + 10%) aquella inducida por las muteinas de IL-2 de referencia, o preferentemente, menos de 90% de aquella inducida por las muteinas de IL-2 de referencia, donde la producción de TNF-a es ensayada en una concentración de muteina de 1.0 nM (es decir, 1000 pM) ó 0.1 mM (es decir, 100 pM) . En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK y proliferación de células NK inducidas por IL-2 son .determinadas usando células NK-92 (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrita en la presente) , en la cual la producción de TNF-a es medida usando ELISA, y la proliferación de células NK es medida por un ensayo MTT como se indica en la presente anteriormente. Las muteinas de IL-2 humanas dentro de esta segunda clase funcional incluyen aquellas muteinas que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125, des-alanil-1 (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo que consiste de L36D y L40D, donde la posición de residuo (es decir, 36 ó 40) es relativa a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a la SEQ ID NO: 4). Ver el Ejemplo 8, y la Tabla 5 indicada posteriormente . La tercera clase funcional de las muteinas de IL-2 humanas incluye aquellas muteinas que son "bifuncionales" ya que inducen proliferación de células NK incrementadas y producción de TNF-a disminuidas por las células NK con relación a las muteinas de IL-2 de referencia. Las muteinas dentro de esta tercera clase funcional cumplen con . los siguiente criterios: (1) inducen un nivel de proliferación de células NK que es por lo menos aproximadamente 150% de aquel observado para IL-2 humana C125, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S cuando se ensayan para cualquiera concentración de muteina seleccionada a partir del grupo que consiste .de 0.005 nM (es decir, 5 pM) , 0.02 • nM (es decir, 20 pM) , 0.05 nM (es decir, 50 pM) , 0.1 nM (es decir, 100 pM) , ó 1.0 nM (es decir, 100 pM) , y (2) induce un nivel de producción de TNF-a por las células NK que es menor a aproximadamente 75% de aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en una concentración de muteina de aproximadamente 1.0 nM. En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 y proliferación de células NK inducida por IL-2 son determinadas usando las células NK-92 (es decir, el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) , en la cual la producción de TNF-a inducida por IL-2 es medida usando ELISA,' y proliferación de células NK inducida por IL-2 es medida por un ensayo MTT como se indica anteriormente en la presente. Las muteinas de IL-2 humanas dentro de esta tercera clase funcional incluyen aquéllas muteinas que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-humana des-alanil-l,C125S (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo que consiste de L19D, F42R y E61R, donde la posición del residuo (es decir, 19, 42 ó 61) es relativo a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a la SEQ ID NO:4). Ver el Ejemplo 8, y la Tabla 16 posteriormente en la presente. La invención también proporciona muteinas de IL-2 humanas que cumplen con otros criterios de selección que contribuyen a un índice terapéutico mejorado con relación a aquel observado para IL-2humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S. De esta forma, por ejemplo, en otra modalidad, las múteinas de IL-2 humanas de la invención inducen un nivel de producción de TNF-apor las células NK que es menor a aproximadamente 100%, preferentemente menor a aproximadamente 95% ó 90%, más preferentemente menor a aproximadamente 85% del nivel de la producción de TNF-a por las células NK que es inducida por IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en una concentración de muteina de 1.0 nM, e incrementa la proliferación de células NK inducida por IL-2 a más de aproximadamente 130% con relación a aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en una concentración de muteína de 0.1 nM. En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 y la proliferación de células NK inducida por IL-2 son determinadas usando células NK-92 (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) , en la cual la producción de TNF-a inducida por IL-2 es medida usando ELISA, y la proliferación de células NK inducida por IL-2 es medida por un ensayo de MTT como se indica en la presente anteriormente. Las muteinas de IL-2 humanas con estos criterios funcionales comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana des-alanil-2, C125S (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo que consiste de H16D, L19D, L36D, L36P, L40D, L40G, P65L, P65Y, E67A, L72N, L80K, L94Y, E95D, E95G, Y107H, y Y107R, donde la posición del residuo (es decir, 16, 19, 36, 40, 65, 67, 72, 80, 94, 95 y 107) está en relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, cn relación a la SEQ ID NO: 4). Las muteinas que cumplen estos criterios funcionales también exhiben una proporción de proliferación de células NK inducida por IL-2 en 0.1 nM de muteína: producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK en 1.0 nM de muteina que es por lo menos 1.25 veces mayor, preferentemente por lo menos 1.5 veces, 1.75 veces, ó 2.0 veces más, y hasta aproximadamente 2.5 veces a aproximadamente 2.75 veces más que aquella observada para IL— 2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S. Ver también el ejemplo 2, y Tabla 3 en la presente posteriormente, donde se enlistan substituciones adecuadas adicionales dentro de la muteina de IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S. En otra modalidad, las muteinas de IL-2 humanas de la invención inducen un nivel de producción de TNF-a por las células NK que es < aproximadamente 100% del nivel de la producción de TNF-a por las células NK que se induce por IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en una concentración de muteina de 1.0 nM e incrementan la proliferación de células NK inducida por IL-2 a más de aproximadamente 150% con relación a aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en una concentración de muteina de 0.1 nM.
En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 y la proliferación de células NK inducida por IL-2 son determinadas usando células NK (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) , en la cual la producción de TNF-a inducida por IL-2 se mide usando ELISA, y la proliferación de células NK inducida por IL-2 es medida por un ensayo de MTT como se indica anteriormente en la presente. Las muteinas de IL-2 humanas con estos criterios funcionales comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana des- alanil-1 C125S (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo que consiste de L36G, L36H, L40G y P65F, donde la posición del residuo (es decir, 36, 40, y 65) está en relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a la SEQ ID NO: 4). Las muteinas que cumplen estos criterios funcionales también exhiben una proporción de proliferación de células NK inducidas por IL-2 en 0.1 nM muteina: producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK en 1.0 nM de muteina que es por lo menos 1.5 veces mayor, preferentemente por lo menos 2.0 veces más, y hasta aproximadamente 2.5 veces más de aquel observado para IL-2 humana des-alanil-1 C125S, o IL-2 humana C125S. Ver el ejemplo 2, y la tabla 4-posteriormente en la presente. Otras muteinas de IL-2 humanas de la invención inducen un nivel de producción de TNF-a por células NK que es mayor que y hasta aproximadamente 110%) el . nivel de la producción de TNF-a por las células NK que se induce por IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en una concentración de 1.0 nM, e incrementa la proliferación de células NK inducida por IL-2 a más de 150% con relación a aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en 0.1 nM. En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 y la proliferación de células NK inducida por IL-2 son determinadas usando las células NK-92 (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito posteriormente en la presente) , en el cual la producción de TNF-a inducida por IL-2 es medida usando ELISA, y se mide la proliferación de células NK inducida por IL-2 por un ensayo de MTT como se indica anteriormente en la presente. Las muteinas de IL-2 humanas con estos criterios funcionales comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana des-alanil-2, C125S (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo que consiste L36R, K64G, K64L, P65E, P65G, P65T y P65V, donde - la posición del residuo (es decir, 36, 64 y 65) está en relación con la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a la SEQ ID N0:4).
Las muteinas que cumplen estos criterios funcionales pueden también exhibir una proporción de proliferación de células NK inducida por IL-2 en 0.1 nM de muteína: producción de TNF-a •inducida por IL-2 por células NK en 1.0 nM de muteina que ' es por lo menos 1.5 veces mayor, preferentemente por lo menos 1.75 veces mayor, y hasta aproximadamente 2.0 veces a aproximadamente 2.5 veces mayor que aquella observada para IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S. Ver el Ejemplo 2, y la Tabla 4 posteriormente en la presente. En otras modalidades, las muteinas de IL-2 humanas de la invención inducen un nivel de producción de TNF-a por células NK que es menor a aproximadamente 90%, preferentemente menor a aproximadamente 80% del nivel de producción de TNF-a por células NK que se induce por IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL_2 humana C125S cuando se ensaya en una concentración de 1.0 nM, e induce una proliferación de células NK que es por lo menos 95%, preferentemente por lo menos 105%, más preferentemente por lo menos 120% a aproximadamente 200% de aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-1 C125S cuando se ensaya en 0.1 nM y en 1.0 nM, o la cual mantiene (es decir, por lo menos 70%, preferentemente por lo menos 75%, 80%, ó 85%, más preferentemente por lo menos 90% hasta aproximadamente 100%) , la proliferación de células' NK inducida por IL-2 con relación a aquella inducida por la muteina de IL-2 humana C12% en 0.1 nM. En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 y la proliferación de células NK inducida por IL-2 son determinadas usando las células NK-92 (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) , en la cual la producción de TNF-a inducida por IL-2 es medida usando ELISA, y la proliferación de células NK inducida por IL-2 es medida por un ensayo de MTT como se indica anteriormente en la presente. Las muteinas de IL-2 humanas con estos criterios funcionales comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana des-alanil C125S (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos una substitución seleccionada del grupo que consiste de H16D, L19D, L36D, L36P, F42E, F42R, E61R, P65L, P65Y, E67A, L72N, L80V, R81K, .N88D, V91D, L94Y, E95D, E95D, 395G, Y107H y Y107R, donde la posición del residuo (es decir, 16, 19, 36, 42, 61, 65, 67, 72, 80, 81, 88, 91, 94, 95 ó 107) está en relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a la SEQ ID N0:4). Otras muteinas adecuadas dentro de esta categoría son mostradas en la Tabla 5 posterior en la presente. Las muteinas que cumplen con estos criterios funcionales también exhiben una proporción de proliferación de células NK inducida por IL-2 en 0.1 nM de muteina: producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK en 1.0 n-M de muteina que es por lo menos 1.25 veces mayor, preferentemente por lo menos 1.5 veces mayor, 1.75 veces mayor, 2.0 veces mayor, y hasta aproximadamente 2.5 veces a aproximadamente 2.75 veces mayor que aquella observada para IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S. Ver el Ejemplo 3, y la Tabla 5 posteriores en la presente. En modalidades alternativas, las muteinas de IL-2 de la invención inducen un nivel de producción de TNF-a por las células NK que es menor que aproximadamente 80%, preferentemente menor a aproximadamente 70% del nivel de producción de TNF-a por las células Nk que se induce por IL-2 humana C125S des-alanil-2 o IL-2 humana C125S cuando se ensayan en una concentración de 1.0 nM, e 'inducen la proliferación de células NK que es por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, 95%, 100% ó 105%, más preferentemente por lo menos 110%, a aproximadamente 150% de aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-1 C125S cuando se ensaya en 1.0 nM. En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 y la proliferación de células NK inducida por IL-2 son determinadas usando las células NK-92 (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) , en la cual se mide la producción de TNF-a inducida por IL-2 usando ELISA, y se mide la proliferación de células NK inducida por IL-2 por un ensayo de MTT como indica en la presente anteriormente. Las muteinas de IL_2 humana con estos criterios funcionales comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana des-alanil-1, C125S (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo que consiste de F78S, F78W, H79F, H79M, H79N, H79P, H79Q, H79S H79V, L80E, L80F, L80Y, R81E, R81L, R81N, R81P, R81T, N88H y Q126I, o por lo menos una substitución seleccionada del grupo que consiste de E61M, E62T, E62Y, L80G, L80N, L80R, L80W, D84R, N88T, E95M, Y107L, Y107Q y Y107T, donde la posición del residuo (es- decir, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 84, 88, 95 ó 107) está en relación con la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a la SEQ ID NO: 4). Ver el Ejemplo 3, y las Tablas 6 y 7 posteriores en la presente. En aún otra modalidad, las muteinas de IL-2 de la invención cumplen con los siguientes criterios funcionales: (1) inducen un nivel de producción de TNF-a por células Nk que es menor a aproximadamente 100%, preferentemente menor a aproximadamente 95%, 90% ó 85%, más preferentemente menor a aproximadamente 80% ó menor a aproximadamente 75% del nivel de producción de TNF-a por las células NK que es inducida por IL-2 humana des-alanil-1 C125 o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en una concentración de 1.0 nM; (2) mantienen (aproximadamente 100%) o incrementan (aproximadamente 105% hasta aproximadamente 120%) la proliferación de células NK inducida .por IL_2 con relación a IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en 0.1 nM y 1.0 nM; y (3) mejoran la citotoxicidad mediada por NK a más de aproximadamente 140% hasta aproximadamente 160% de aquella observada para la muteina de IL-2 humana C125S y a más de aproximadamente 115% hasta aproximadamente 130% de aquella observada para IL-2 humana des-alanil-1 C125S. En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 y la proliferación de células NK inducida por IL-2 son determinadas usando las células NK-92 (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) , en la cual se mide la producción de TNF-a inducida por IL-2 usando ELISA, y se mide la proliferación de células NK inducida por IL-2 por un ensayo de MTT como se indica anteriormente en la presente; y se mide la actividad de la citotoxicidad mediada por NK contra las células K562, por ejemplo, usando la línea celular NK3.3 en el bioensayo de citotoxicidad NK3.3 descrito en la presente. Las muteinas de IL-2 humanas con estos criterios funcionales comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana des-alanil-1, C125S (SEQ ID NO; 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo que consiste de P34R, P34T, L36A, L36D, L36P, R38P, F42A y L80R, donde la posición del residuo (es decir, 34, 36, 38, 42 u 80) está en relación a la secuencia de IL-2 madura humana (es decir, con relación a la SEQ ID NO: 4) . Ver el ejemplo 4, y la Tabla 8 posteriormente en la presente. En otra modalidad, las muteinas de IL-2 de la invención se seleccionan por su capacidad para inducir niveles inferiores de citosinas pro-inflamatorias predictivas de toxicidad mejorada, así como también actividad de proliferación de células NK mejorada, y actividad de citotoxicidad mediada' por LAK mejorada. Estas muteinas cumplen con los siguientes criterios funcionales: (1) inducen un nivel de producción de TNF-a que es menor a 100%, preferentemente menor a 95%, 90%, 85% o 80% de aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-1 • C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en una concentración de 1.0 nM; (2) mantiene (aproximadamente 100%) o incrementa (aproximadamente 105% hasta aproximadamente 140%) la proliferación de células NK inducida por IL-2 con relación a IL-1 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en 1.0 nM o en 0.1 nM; y (3) mejora la actividad de citotoxicidad mediada por LAK a más de aproximadamente 105%, preferentemente mayor a aproximadamente 110%, 115% ó 120%, hasta aproximadamente 140% de aquella inducida por la IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S. En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 y la proliferación de células NK inducida por IL-2 son determinadas usando las células NK-92 (es decir, usando el bioensayo NK-92 descrito en la presente) , en la cual se mide la producción de TNF-a inducida por IL-2 usando ELISA, y se mide la proliferación de células NK inducida por IL-2 por un ensayo de MTT como se indica anteriormente en la presente; y se mide la actividad de citotoxicidad mediada por LAK contra células Daudi usando la línea celular NK3.3 y el bioensayo de citotoxicidad NK3.3 descrito en la presente. Las muteinas de IL-2 humanas con estos criterios funcionales comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana des- alanil-1, C125S (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125 (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otras substituciones seleccionadas del grupo que- consiste de L36P, L36R, F42A, L80R, y V91Q, donde la posición del residuo (es decir, 36, 42, 80 ó 91) está en relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a la SEQ ID NO: 4). Ver el ejemplo 5, y la Tabla 9 posteriormente en la presente. En otras modalidades, las muteinas de IL-2 de la invención se seleccionan por su toxicidad mejorada, la actividad de proliferación de células NK mejorada, y la actividad de citotoxicidad mediada por ADCC mejorada. Estas muteinas cumplen con los siguientes criterios funcionales: (1) inducir un nivel de producción de TNF-a que es menor a 100%, preferentemente menor a 95%, 90%, 85%, u 80% de aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en una concentración 1.0 nM; (2) mantener (por lo menos 90%) o incrementar (aproximadamente 105% hasta aproximadamente 115%) la proliferación de células NK inducida por IL-2 con relación a la IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S cuando se ensaya en 1.0 nM o en 0.1 nM; y (3) mejorar la actividad de citotoxicidad mediada por ADCC a más de aproximadamente 105%, preferentemente más de aproximadamente 110% ó 115%, hasta aproximadamente 120% de aquella inducida por IL-2 humana des- alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S. En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 y la proliferación de células NK inducida por IL-2 son determinadas usando las células NK-92 (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) , en la cual se mide la producción de TNF-a inducida por IL-2 usando ELISA, y se mide la proliferación de células NK inducida por IL-2 por un ensayo de MTT como se indica anteriormente en la presente; y la actividad de citotoxicidad mediada por ADCC contra células Daudi en la presencia de anticuerpo, tal como Rituxan ® (rituximab; TDEC-C2B8; IDEC Pharmaceuticals Corp., San diego, California) se mide usando la línea celular NK3.3 y el bioensayo de citotoxicidad de NK3.3 descrito en la presente.
Las muteinas de IL-2 humanas con estos criterios funcionales comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana des-alanil- C125S (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo que consiste de D20E ó E67A, donde la posición de residuo (es decir, 20 ó 67) está en relación con la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a la SEQ ID NO: 4) . Ver el Ejemplo 6, y la Tabla 10 posteriormente en la presente . En otra modalidad, las muteinas de IL-2 mantienen o incrementan la sobrevivencia de células NK con relación a aquella observada para las muteinas de IL-2 de referencia, como se mide por un ensayo de pAKT ELISA usando células de NK3.3. Las muteinas de IL-2 humanas con estos atributos funcionales comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana des-alanil-1 C125S (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo que consiste de L40D, L40G, L80K, R81K, L94Y y E95D, donde la posición del residuo (es decir, 40, 8O, 81, 94 ó 95) está en relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a la SEQ ID NO: 4) . Ver el Ejemplo 7, y la Tabla 11 posteriormente en la presente, la cual muestra otras muteinas adecuadas que cumplen con estos criterios funcionales. Variantes activas biológicamente de muteinas de IL-2 humanas novedosas La presente invención también proporciona variantes activas biológicamente de las muteinas de IL-2 humanas novedosas descritas en la presente que tienen también estas propiedades mejoradas con relación a la molécula de IL-2 de referencia, es decir, las variantes activas biológicamente inducen producción de citocina pro-inflamatoria baja o reducida por las células NK, así como también mantener o incrementar la proliferación de células NK, cuando se compara con la molécula de IL-2 de referencia, es decir, IL-2 humana des-alanil-1 C125S o C125S, usando los bioensayos estándar descritos en cualquier parte en la presente. Como se indica previamente, se reconoce que una variante de cualquier muteina de IL-2 humana novedosas dada identificada en la presente puede tener un nivel absoluto diferente de una actividad biológica particular con relación a aquella observada para la muteina de IL-2 humana novedosa de la invención, siempre y cuando tenga las características deseadas con relación a las moléculas de IL-2 de referencia, es decir, la toxicidad reducida, es decir producción de citosina pro-inflamatoria reducida, y/o proliferación de células NK incrementada cuando se compara con la muteina de IL-2 humana de referencia. Por "variante" se propone secuencias substancialmente similares. Variantes de las muteinas de IL-2 humana novedosa descritas en la presente pueden ser derivadas de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos que se encuentran en forma natural (por ejemplo, variantes alélicas que ocurren en el locus IL-2) o producidas recombinantemente (por ejemplo muteinas). Las variantes de polipéptido pueden ser fragmentos de las muteinas de IL-2 humanas novedosas descritas en la presente, o pueden diferir de las muteinas de IL-2 humanas novedosas que tienen una o más substituciones o eliminaciones de aminoácidos adicionales, o inserciones de aminoácidos, siempre y cuando el polipéptido variante retenga las substituciones de aminoácidos particulares de interés que están presentes dentro de las muteinas de IL-2 humanas novedosas descritas en la presente. De esta forma, las variantes de polipéptido adecuadas incluyen aquellas con la substitución de C125S que corresponden a la posición 125 de la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, la SEQ ID NO: 4), la segunda substitución de aminoácidos identificada en la presente como que contribuye a al índice terapéutico mejorado de las muteinas de IL-2 humanas novedosas de la presente invención (es decir, una substitución mostrada en la Tabla 1 anterior, preferentemente una- substitución mostrada en la Tabla 12 posterior) , y la cual tiene una o más substituciones o eliminaciones de aminoácidos adicionales, o inserciones de aminoácidos. De esta forma, por ejemplo, donde la muteina de IL-2 humana novedosa comprende la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana des-alanil-1, C125S (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con por lo menos otra substitución seleccionada del grupo mostrado en la Tabla 1, variantes activas biológicamente adecuadas de estas muteinas de IL-2 humanas novedosas también comprenderán la substitución de C125S así como también otra substitución representada por aquellas mutaciones mostradas en la Tabla 1, pero puede - diferir de la muteina de 1L-2 humana novedosa respectiva en que tiene una o más substituciones adicionales, inserciones, o deleciones, siempre y cuando el polipéptido variante tenga las características deseadas con relación a las moléculas de IL-2 de referencia (es decir, la IL-2 humana C125S y IL-2 humana des-alanil-1, C125S) , y de esta forma tiene toxicidad reducida, es decir producción de citosina pro-inflamatoria reducia, y/o proliferación de célula sNk incrementada cuando se compara con la muteina de IL-2 humana de referencia. Tales variantes tendrán secuencias de aminoácidos que son por lo menos 70%, generalmente por lo menos 75%, 80%, 85%, 90% idénticas, preferentemente por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idénticas a la secuencia de aminoácidos para la muteina de IL-2 humana novedosa respectiva, por ejemplo, la muteina de IL-2 humana indicada en la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344, donde el por ciento de identidad de secuencia es determinado como se indica posteriormente en la presente. -En otras modalidades, las variantes activas biológicamente tendrán secuencias de aminoácidos que son por lo menos 70%, generalmente por lo menos 75%, 80%, 85%, 90% idénticas, preferentemente por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idénticas a la secuencia de aminoácidos indicada en los residuos 2-133 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36,- 38, 40, 42, 44, 4.6, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344, donde el porcentaje de identidad de secuencia es determinada como se indica posteriormente en la presente. En algunas modalidades de la invención, las variantes biológicamente activas de las muteinas de IL-2 humanas de la invención tienen la substitución C125S reemplazada con otros aminoácidos neutrales tales como la alanina, lo cual no afecta las características funcionales de la muteina de IL-2 humana. De esta forma, por ejemplo, tales variantes tienen una secuencia de aminoácidos que comprenden un residuo de alanina substituido para el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54/ 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. En aún otras modalidades, las variantes biológicamente activas de las muteinas de IL-2 humanas de la invención comprenden los residuos 2-33 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278,' 280, 282, 284, 286, 288, 290, ' 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344, con la excepción de que tener un residuo de alanina substituido por el residuo de serina en la posición 125 de estas secuencias. En modalidades alternativas de la invención, las variantes activas biológicamente de las muteinas de IL-2 humanas de la invención comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, .336, 338, 340, 342 o 344, con la excepción de tener un residuo de cisteina substituido por el residuo de serina en la posición 125- de estas secuencias. En aún otras modalidades, las variantes biológicamente activas de las muteinas de IL-2 humanas de la invención comprenden los residuos 2-133 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28-, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 5?', 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344, con la excepción de tener un residuo de cisteína substituido por el residuo de serina en la posición 125 de estas secuencias. Por "variante" de ácido nucleico se propone un polinucleótido que codifica una muteina de IL-2 humana novedosa de la invención pero cuya secuencia de nucleótidos difiere de la secuencia de muteina novedosa . descrita en la presente debido a la degeneración del código genético. Los- codones para los aminoácidos que se encuentran en forma natural son bien conocidos en la técnica, incluyendo aquellos codones que son más frecuentemente usados en organismos huésped particulares para expresar las proteínas recombinantes. Las secuencias de nucleótidos que codifican las muteinas de IL-2 descritas en la presente incluyen aquellas indicadas en el Listado de Secuencia anexo, así como también secuencias de nucleótidos que difieren de las secuencias descritas debido a la degeneración en el código genético . De esta forma, por ejemplo, donde la muteina de IL- 2 de la invención comprende una substitución de residuo de alanina (es decir, A) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución T7A, K9A, Q11A, E15A, K32A, L36A, F42A, L66A, E67A, V91A, o L94A, la secuencia de nucleótido que codifica el residuo de alanina substituido puede ser seleccionada para los codones de tripletes universales para la alanina, es decir, GCA, GCC, GCG, y GCT. Similarmente, donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de ácido aspártico (es decir, D) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil-1 C125S que comprende la substitución T7D, K9D, H16D, L19D, K35D, L36D, R38D, L40D, K64D, P65D, N88D, V91D, o E95D, la secuencia de nucleótidos que codifica el residuo de ácido aspártico substituido puede ser seleccionada de dos codones de triplete universales para el ácido aspártico, es decir, GAC y GAT. Donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de arginina (es decir, R) , tal como en la muteina de C125S o des-alanilC125S que comprende la substitución T7R, K94, Q11R, P34R, L36R, F42R, E61R, K64R, P65R, L80R, D84R o Y107R, la secuencia de nucleótidos que codifica el residuo de arginina substituido puede ser seleccionado de cuatro codones de triplete universales para arginina, es decir, CGT, CGC, CGA y CGG. Similarmente, donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de leucina (es decir, L) , tal como en la muteina C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución K8L, I24L, K35L, K64L, P65L, R81L, o Y107L, la secuencia de nucleótido que codifica el residuo de leucina substituido puede ser seleccionada de seis codones de triplete universales para leucina, es decir, TTA, TTG, CTT, CTC, CTA y CTG. En donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de serina (es decir, S) , tal como en muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución K9S, P34S, L36S, R38S, L40S, P65S, F78S, H79S, T102S, o T123S, la secuencia de nucleótido que codifica el residuo de serina substituida puede ser seleccionada de dos codones de tripletes universales para serina, es decir, AGT y AGC. Similarmente, donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de valina (es decir, V) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución de K9V, P34V, F42V, P65V,' H70V, L80V, L94V, T102V, o Q126V, la secuencia de nucleótido que codifica el residuo de valina substituida puede "ser seleccionada de los cuatro tripletes universales, es decir, GTT, GTC, GTA, y GTG. Donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de lisina (es decir, K) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución T10K, L36K, -F44K, E61K, P65K, L80K, R81K, E106K o Y107K, la secuencia de nucleótidos que codifica el residuo de lisina substituido puede ser seleccionado de los dos codones de triplete universales para lisina, es decir, AAA y AAG. Similarmente, donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de asparagina (es decir, N) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución T10N, K35N, L36N, L38N, L40N, P65N, L72N, H79N, L80N, R81N o V91N, la secuencia de nucleótido que codifica el residuo de asparagina substituida puede ser seleccionada de los dos codones de tripletes universales para asparagina, es decir, GAT y GAC. Donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de treonina (es decir, T) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución de QllT, P34T, K35T, F42T, E62T, P65T, L72T, L80T, R81T, S87T, N88T, L94T, o Y107T, la secuencia de nucleótido que codifica el residuo de treonina substituido puede ser seleccionada de los cuatro codones de triplete universales para treonina, es decir, ACT, ACC y AC , ACG. Similarmente, donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de ácido glutámico (es decir, E) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución H16E, L19E, D20E, N33E, P34E, L36E, T41E, F42E, K64E, P65E, L80E, R81E, o V91E, la secuencia de nucleótidos que codifica el residuo de ácido glutámico substituido puede ser seleccionado de los dos codones de triplete universales para ácido glutámico, es decir, GAA Y GAG. Donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substituciónd e isoleucina (es decir, I) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución K35I, L36I, M46I, P65I, L94I o Q126I, la secuencia de nucleótido que codifica el residuo de isoleucina substituido puede ser seleccionado a partir de tres codones de triplete universales para isoleucina, es decir, ATT, ATC, y ATA. Similarmente, donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de prolina (es decir, P) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución K35P, L36P, R38P, H79P, o R81P, la secuencia de nucleótidos que codifica el residuo de prolina substituido puede ser seleccionada de los cuatro codones de triplete universales para prolina, es decir, CCT, CCC, CCA y CCG. Donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de glutamina (es decir, Q) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución K35D, K64Q, P65Q, H79Q, V91Q, Y107Q o N119Q, la secuencia de nucleótidos que codifica el residuo de glutamina substituido puede ser seleccionado de los dos codones de triplete universal para glutamina, es decir, CA y CAG. Similarmente, donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de fenilalanina (es decir, F) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución de L36F, P65F, L66F, H79F, L80F o V91F, la secuencia ' de nucleótidos que codifica el residuo de fenilalanina substituido puede ser seleccionado de los dos codones de tripletes universales para fenilalanina, es decir, TTT y TTC. Donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de glicina (es decir, G) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución L36G, R38G, L40G, T41G, K64G, P65G, L72G, L80G, V91G, E95G, M104G, o E116G, la secuencia de nucleótidos que codifica el residuo de glicina substituido puede ser seleccionado de los cuatro codones de triplete universales para glicina, es decir, GGT, GGC, GGA y GGG. Similarmente, donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de histidina (es decir, H) , tal como en la muteina de C125S o des-ananil C125S que comprende la substitución de L36H, K43H, P65H, N88H, 0 Y107H, la secuencia de nucleótido que codifica el residuo de histidina substituido puede ser seleccionada de los dos codones de triplete universales para histidina, es decir, CAT y CAC. Donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de tirosina (es decir Y) , tal como en la muteina de C125S o des-alanil C125S que comprende la substitución L36Y, E62Y, P65Y, L80Y, o L94Y, la secuencia de nucleótido que codifica el residuo de tirosina substituida puede ser seleccionada de los dos codones de triplete universales para tirosina, es decir, TAT y TAC. Similarmente, donde la muteina de IL-2 de la invención comprende una substitución de cisteína (es decir, C) , tal como en la muteina de C125s o des-alanil C125S que comprende la substitución de T123C, la secuencia de nucleótidos que codifica el residuo de cisteina substituido puede ser seleccionada de los dos codones de triplete universales para cisteina, es decir, TGT y TGC. Aunque la lista mencionada anteriormente de variantes de ácido nucleico han descrito los codones universales que pueden ser utilizados para codificar las substituciones de residuo particulares identificadas en la misma, se reconoce que la presente invención comprende todas las variantes de ácido nucleico que codifican las muteinas de IL-2 humanas descritas en la presente como un resultado de degeneración en el código genético. Las variantes alélicas que se encuentran en forma natural de IL-2 humana nativa pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como la reacción de cadena polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) y técnicas de hibridización, y pueden servir como una guía para las mutaciones adicionales que pueden ser introducidas en las muteinas de IL-2 humanas descritas en la presente sin impactar el índice terapéutico deseado de estas muteinas de IL-2 humans. Las secuencias de nucleótido variantes también incluyen muteínas derivadas de secuencias de nucleótidos derivados sintéticamente que han sido generadas, por ejemplo, por mutagénesis dirigida a sitio pero la cual todavía codifica las muteinas de IL-2 novedosas descritas en la presente, como se discute posteriormente. Generalmente, las variantes de secuencia de nucleótidos de la invención tendrán por lo menos 70%, generalmente por lo menos 75%, 80%, 85%, 90% de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% de identidad de secuencia para sus secuencias de nucleótido de muteina de IL-2 humana novedosa respectivas, por ejemplo, con respecto a una secuencia de codificación de muteina de IL-2 humana novedosa indicada en la SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, - 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273,- 275, 277, 279, 281, 283, 285, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309,' 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, o 343; donde se determina el por ciento de identidad de secuencia como se indica en la presente posteriormente. En otras modalidades, las variantes de secuencia de nucleótido de la invención tendrán por lo menos 70%, generalmente por ?o menos 75%, 80%, 85%, 90% de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a nucleótidos 4-399 de la secuencia de codificada indicada en la SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195,- 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327', 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, o 343, donde el por ciento de la identidad de secuencia se determina como se indica posteriormente en la presente. Como se usa en la presente, los términos "gen" y "gen recombinante" se refiere a moléculas de ácido nucleico que comprenden un cuadro de lectura abierta que codifica una muteina de IL-3 de la invención. Como se usa en la presente, la frase "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótido que ocurre en el locus IL-2 o a un polipéptido codificado por aquella secuencia de nucleótido. Tales variaciones alélicas naturales pueden resultar típicamente en 1-5% de varianza en la secuencia de nucleótido del gen IL-2. Cualquiera y todas las variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes o variaciones en la secuencia de IL-2 que son resultado de variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de las muteinas de IL-2 humanas novedosas de la invención son propuestas para ser secuencias las cuales pueden ser mutadas de acuerdo a la presente invención, y todas las secuencias resultantes son propuestas para caer dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos de las muteinas de IL-2 humanas novedosas descritas en la presente pueden ser preparadas por hacer mutaciones en la secuencia de ADN clonado que codifica la muteina de IL-2 novedosa, siempre y cuando la mutación no altere la substitución adicional identificada en la Tabla 1. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de secuencia de nucleótidos son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Walker and Gastar, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) ; Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) ; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,873,192; y las referencias citadas en la misma. La guía en cuanto a substituciones apropiadas de aminoácidos que pueden no afectar la actividad biológica deseada de la muteina de IL-2 (es decir, producción pro-inflamatoria reducida por células NK predictivas de toxicidad reducida y proliferación de células Nk mantenida o incrementada) puede ser encontrada en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Polypeptide Seqúense and Structure (Nati. Biomed. Res. Found. Washington, D.C.) . Cuando se diseñan las variantes activas biológicamente de la muteina de IL-2 humana descrita en la presente, pueden ser preferidas substituciones conservativas, tales como intercambiar un aminoácido con otro que tiene propiedades similares. Una "substitución de aminoácido conservativa" es una en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Han sido definidas en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) ,- cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Ver, por ejemplo, Bowie et al. (1990) Science 247:1306. Ejemplos de substituciones conservativas incluyen, pero no se limitan a, Gly Ala, Val <=Ile=>Leu, Asp <=>Glu, ' Lys íArg, Asn <=>Gln, y Phe <íí> Trp <?3> Tyr. Preferentemente, tales substituciones no pueden ser hechas para residuos de cisteína conservados, tales como los residuos de cisteína contiguas amino terminales. La guía en cuanto a las regiones de la proteína de IL-2 humana que puede ser alterada ya sea por medio de substituciones de residuo, eliminaciones, o inserciones fuera de las substituciones deseadas identificadas en la presente puede ser encontrado en la técnica. Ver, por ejemplo, las relaciones de estructura/función y/o estudios de enlace discutidos en Bazan (1992) Science 257:410-412; McKay (1992) Science 257:412; Theze et al. (1996) Immunol . Today 17:481-486; Buchli and Ciardelli (1993) Biochem Biophys 307:411-415; Collins et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:7709-7713; Kuziel et al. (1993) J. Immunol . 150 :5731 ; Eckenberg et al. (1997) Cytokine 9 : 488-498. Para construir variantes de una muteina de IL-2 humana novedosa de la invención, serán hechas modificaciones a las secuencias de nucleótidos que codifican las variantes de tal forma que los polipéptidos variantes puedan continuar poseyendo la actividad deseada. Obviamente, cualesquiera mutaciones hechas en el ADN que codifica un polipéptido variante no debe colocar la secuencia fuera del cuadro de lectura y preferentemente no creará regiones complementarias que pueden producir la estructura secundaria de ARNm. Una variante de un polipéptido puede diferir por unos cuantos 1 a 15 residuos de aminoácidos, tales como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2, ó incluso 1 residuo de aminoácido. Una variante de secuencia de nucleótido puede diferir por tan poco como 1 a 30 nucleótidos, tales como 6 a 25, tan poco como 4, 3, 2, o incluso 1 nucleótido. Las variantes activas biológicamente de las muteinas de IL-2 humana de la invención incluyen fragmentos de estas, muteinas . Por "fragmento" se propone una porción de la secuencia de nucleótido de codificación o una porción de la secuencia de aminoácidos. Con respecto a las secuencias de codificación, fragmentos de una secuencia de nucleótido de muteina de IL-2 humana puede codificar fragmentos de muteina que retienen la actividad biológica deseada de la muteina de IL-2 humana novedosa. Un fragmento de la muteina de IL-2 humana novedosa descrita en la presente puede ser 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130 aminoácidos o hasta la longitud completa del polipéptido de IL-2 humana novedosa. Los fragmentos de una secuencia de nucleótido de codificación pueden estar en el intervalo de por lo menos 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 165, 180, 195, 210, 225, 240, 255, 270, 285, 300, 315, 330, 345, 360, 375, 390, nucleótidos, y hasta' la secuencia de nucleótidos total que codifica la muteina de IL-2 humana novedosa. Las muteinas de IL-2 humana descritas en la presente y variantes biológicamente activas de la misma pueden ser modificadas además siempre y cuando tengan las características deseadas con relación a las moléculas de IL-2 de referencia, es decir, toxicidad reducida y/o proliferación de células NK incrementada con relación a la muteina IL-2 humana C125S o IL-2 humana des-alanil-1, C125. Modificaciones adicionales incluyen, pero no se limitan a, fosforilación, substitución de análogos de aminoácidos no naturales, y similares. Modificaciones a las muteinas de IL-2 que pueden llevar a exposición in vivo prolongada, y por lo tanto eficacia incrementada de las formulaciones farmacéuticas de muteina de IL-2, incluyen glicosilación o PEGilación de la molécula de proteína. La glicosilación de proteínas no glicosiladas nativamente es usualmente realizada por inserción de sitios de glicosilación N enlazados en la molécula. Este procedimiento puede ser usado para prolongar la vida media de proteínas tales como muteinas de IL-2. Además, este procedimiento puede ser usado para cubrir epitopos inmunogénicos, incrementar la solubilidad de la proteína, reducir la agregación, e incrementar la expresión y rendimientos de purificación. Una vez que son obtenidas las variantes de las muteinas de IL-2 humanas descritas en la presente, las eliminaciones, inserciones y substituciones de las secuencias de muteina de IL-2 humana no son esperadas para producir cambios radicales en las características de la muteina de IL- 2 humana particular. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la substitución, eliminación o inserción antes de hacerlo, un experto en la técnica apreciará que el efecto será evaluado por ensayos de tamizado de rutina. Esto es, la actividad de proliferación de células NK o T inducida por IL-2 puede ser evaluada por ensayos de proliferación de células estándar conocidos por aquellos expertos en la técnica, incluyendo los ensayos descritos en la presente. LA producción de citocina pro-inflamatoria inducida por IL-2 puede ser medida usando las ELISA específicas a citocina, por ejemplo, ELISA específica a TNF-a, indicada en otra parte en la presente. La señalización de sobrevivencia de células NK puede ser medida por pAKT ELISA (ver, por ejemplo, el ensayo descrito posteriormente en la presente) . La actividad citolítica mediada por células NK (es decir, citotoxicidad) puede ser medida por ensayos conocidos en la técnica (por ejemplo, medición de actividad citolítica mediada por NK, mediada por LAK, o mediada por ADCC como se indica en cualquier parte en la presente) . Las muteinas de IL-2 humanas descritas en la presente, y variantes activas biológicamente de las mismas, pueden ser construidas como fusiones o conjugados de IL-2 que comprenden la muteina de IL-2 (o variante activa biológicamente de la misma como se define en la presente) fusionada a una segunda proteína o conjugado covalentemente a poliprolina o un polímero soluble en agua para reducir las frecuencias de dosificación o para además mejorar la tolerabilidad de IL-2. Por ejemplo, la muteina de IL-2 humana (o variante activa biológicamente de la misma como se define en la presente) puede ser fusionada a albúmina humana o un fragmento de albúmina usando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, la solicitud WO 01/79258) .
• Alternativamente, la muteina de IL-2 humana (o variante activa biológicamente de la misma como se define en la presente) puede ser conjugada covalentemente a homopolímeros de poliprolina o polietilenglicol, en donde el homopolímero no se substituye o substituye en un extremo con un grupo alquilo y el poliol es no substituido, usando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 4,766,106, 5,206,344 y 4,894,226) . Por "identidad de secuencia" se propone los mismos nucleótidos o residuos de aminoácidos que son encontrados dentro de la secuencia variante y una secuencia de referencia cuando un segmento específico, contiguo de la secuencia de nucleótido o secuencia de aminoácidos de la variante es alineada y comparada con la secuencia de nucleótido o secuencia de aminoácidos de la secuencia de referencia. Los métodos para alineación de secuencia y para determinar la identidad entre las secuencias son bien conocidas dentro de la técnica. Ver, por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) ; y el programa Align (Dayhoff (1978) en Atlas of Polypeptide Sequence and Structure 5 : Suppl . 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.G.). Con respecto a la alineación óptima de dos secuencias de nucleótido, el segmento contiguo de la secuencia de nucleótido variante puede tener nucleótidos adicionales o nucleótidos eliminados con respecto a la secuencia de nucleótidos de referencia. Similarmente, para propósitos de alineación óptima de dos secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia de aminoácido variante puede tener residuos de aminoácidos adicionales o residuos de aminoácidos eliminados con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo usado para comparación con la secuencia de nucleótido 'de referencia o secuencia de aminoácido de referencia comprenderá por lo menos 20 nucleótidos contiguos, o residuos de aminoácidos, y puede tener 30, 40, 50, 100 o más nucleótidos o residuos de aminoácidos. Las correcciones para identidad de secuencia incrementada asociada con la inclusión de espacios en la secuencia de nucleótido de variante o secuencia de aminoácidos pueden ser hechas por asignar penalidades de espacio. Los métodos para alineación de secuencia son bien conocidos en la técnica. La determinación del por ciento de identidad entre dos secuencias puede ser realizada usando un algoritmo matemático. Para propósitos de la presente invención, el por ciento de identidad de secuencia de una secuencia de aminoácidos se determina usando el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman usando una búsqueda de espacio de 6 de afinidad con una penalidad abierta de espacio de 12 y una penalidad de extensión de espacio de 2, matriz 62 BLOSUM. El algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman es enseñada en Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482-489. Alternativamente, el por ciento de identidad de una secuencia de nucleótido es determinada usando el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una penalidad abierta de espacio de 25 y una penalidad de extensión de espacio de 5. Tal determinación de identidad de secuencia puede ser realizada usando, por ejemplo, el Acelerador de Hardware DeCypher de TimeLogic. Se reconoce además que cuando se considera el por ciento de identidad de aminoácidos, algunas posiciones de aminoácidos pueden diferir como un resultado de substituciones de aminoácidos conservativas, lo cual no afecta las propiedades de función de polinucleótidos. En estos casos, el por ciento de identidad de secuencia puede ser ajustado hacia contar la similitud en aminoácidos substituidos conservativamente. Tales ajustes son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Meyers et al. (1988) Computer Applic. Biol.. ?ci. 4:11-17. Vectores de expresión recombinantes y células huésped Generalmente, las muteinas de IL-2 humanas de la invención serán expresadas a partir de vectores, preferentemente vectores de expresión. Los vectores son útiles para replicación autónoma en una célula huésped o pueden ser integrados en el genoma de una célula huésped ante introducción en la célula huésped, y por lo mismo son replicados junto con el genoma huésped (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) . Los vectores de expresión son capaces de dirigir la expresión de secuencias de codificación a los cuales son enlazados operablemente. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinantes están con frecuencia en la forma de plásmidos (vectores) . Sin embargo, la invención se propone para incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus, y virus adenoasociados) . Las construcciones o vectores de expresión de la invención comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una muteina de IL-2 humana de la presente invención en una forma adecuada para expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula huésped. La secuencia de codificación de interés puede ser preparada por técnicas de ADN recombinantes como se describe, por ejemplo, por Taniguchi et al. (1983) Nature 302:305-310 y Devos (1983) Nucleic Acids Research 11:4307-4323 o usando IL-2 alterada mutacionalmente' como se describe por Wang et al. (1984) Science 224:1431-1433. Se reconoce que las secuencias de codificación indicadas en las SEQ ID NO: 9-343 raras inician con un codon para el primer residuo de la secuencia de IL-2 humana_ madura de la SEQ ID NO: 4 (es decir, un codon para la alanina en la posición 1) , más que un codon para metionina, el cual es generalmente el codon de inicio de traducción ATG en ARN mensajero. Estas secuencias de nucleótidos descritas también carecen de un codon de terminación de traducción siguiendo el nucleótido en la posición 399 de la SEQ ID NO: 9-343 extraña. Donde estas secuencias, o secuencias que comprenden los nucleótidos 4-399 de SEQ ID NO: 9-343 extraños, son para ser usadas para expresar las muteinas de IL-2 humana de la invención, se reconoce que la construcción de expresión que comprende estas secuencias de codificación de muteina de IL-2 humana además comprende un codon de inicio de traducción, por ejemplo, un codon de ATG, corriente arriba y en un cuadro de lectura apropiado con la secuencia de codificación de muteina de IL-2 humana. El codon de inicio de traducción puede ser proporcionado en una ubicación corriente arriba a partir del codon inicial de la secuencia de codificación de muteina de IL-2 humana por utilizar un codon de inicio de traducción, por ejemplo ATG, que está ya en una secuencia que comprende la secuencia de codificación de muteina de IL-2 humana, o puede ser de -otra forma proporcionada a partir de una fuente extraña tal como el plásmido a ser usado para expresión, con la condición de que el codon de inicio de traducción aparezca primero antes de que el codon inicial en la secuencia de codificación de muteina de IL-2 humana esté en cuadro de lectura apropiada con el codon inicial en la secuencia de codificación de muteina de IL-2 humana. Similarmente, la secuencia de codificación de muteina de IL-2 humana descrita en la presente será seguida por uno o más codones de terminación de traducción, por ejemplo, TGA, para permitir la producción de una muteina de IL-2 humana que termina con el último aminoácido de la secuencia indicada en incluso la SEQ ID NO: 10-344. Los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias regulatorias, seleccionadas de la base de las células huésped a ser usadas para expresión, enlazadas operablemente a la secuencia de ácido nucleico a ser expresada. "enlazado operablemente" se propone para significar que la secuencia de nucleótido de interés (es decir, una secuencia que codifica una muteina de IL-2 humana de la presente invención) se enlaza a la secuencia regulatoria en una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótido (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando se introduce el vector en la célula huésped) . "Secuencias regulatorias" incluyen promotores, incrementadores y otros elementos de control de expresión '(por ejemplo, señales de poliadenilación). Ver, por ejemplo, Goeddel (1990) en Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, California) . Las secuencias regulatorias incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótido en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótido solamente en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias regulatorias específicas a tejidos). Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de tales factores como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, y similares. Las construcciones de expresión de la invención pueden ser introducidas en células huésped para por lo mismo producir las muteinás de IL-2 humanas descritas en la presente o para producir variantes activas biológicamente de las mismas. Las construcciones o vectores de expresión de la invención pueden ser diseñados para expresión de. la muteina de IL-2 humana o variante de la misma en células huéspedes-procarióticas o eucarióticas. La expresión de proteínas en procariotes es en su mayoría con frecuencia realizada én Escherichia coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Las estrategias para maximizar expresión de proteína recombinante en E coli pueden ser encontradas, por ejemplo, en Gottesman (1990) en Gene' Expresión Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Dieg.o, CA) , pág. 119-128 y Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118. El proceso para hacer crecer, cosechar, alterar, o extraer la muteina de IL-2 humana o variante de la misma a partir de células son substancialmente descritos en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 4,604,377; 4,738,927; 4,656,132; 4,569,790; 4,748,234; 4,530,787; 4,572,798; 4,748,234; y 4,931,543. Las muteinas de IL-2 humana recombinantes o variantes activas biológicamente de las mismas pueden también ser hechas en eucariotes, tales como levadures o células humanas. Las células huésped eucarióticas adecuadas incluyen células de insectos (ejemplos de vectores de Baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insectos cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluyen las series pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) y las series pVL (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31- 39) ) ; células de levaduras (ejemplos de vectores para expresión en levaduras S . cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. t (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) , y pPicZ (Invitrogen Corporation, San Diego, California) ) ; o células mamíferas (vectores de expresión mamífera incluyen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195)). Células mamíferas adecuadas incluyen células de ovarios de hámster Chino (CHO) o células COS. En células de mamíeros, las funciones de control del vector de expresión son con frecuencia proporcionadas por elementos regulatorios virales. Por ejemplo, promotores usados comúnmente son derivados de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y virus 40 de simio. Para otros sistemas de expresión adecuados para tanto células procarióticas y eucarióticas, ver los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York) . Ver, Goeddel (1990) en Gene Expression Technology: Methods in Enzymoloy 185 (Academic Press, San Diego, California) .
Las secuencias que codifican las muteinas de IL-2 humanas de la presente invención pueden ser optimizadas para expresión en la célula huésped de interés. El contenido G-c de la secuencia puede ser ajustado a niveles promedio para un huésped celular dado, como se calcula por referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Los métodos para optimización de codones son bien conocidos en la técnica. Los codones individuales pueden ser optimizados, por ejemplo, los codones donde las substituciones de residuo han sido hechas, por ejemplo, la substitución C125S, la substitución C125A, y/o la substitución adicioinal indicada en la Tabla 1. Alternativamente, otros codones dentro de la secuencia de codificación de muteina de IL-2 humana puede ser optimizada para incrementar la expresión en la célula huésped, de tal forma que 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ó hasta 100% de los codones dentro de la secuencia de codificación han sido optimizados para expresión en una células huésped particular. Ver, por ejemplo, las secuencias de muteina de IL-2 humanas descritas en la SEQ ID NO: 345 y 346, donde los codones para las substituciones E61R y Y107R, respectivamente, han sido optimizados para expresión en E. coli . Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" son usados intercambiablemente en la presente. Se entiende que tales términos no se refieren solamente a la célula objeto particular sino también a la progenie o progenie potencial de tal célula. Ya que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones posteriores debido a su mutación o influencias ambientales, tal progenie no pueden, de hecho, ser idéntica a la célula progenitora pero todavía está incluida dentro del alcance del término como se usa en la presente. El ADN de vector puede ser introducido en las células procarióticas o eucarióticas por medio de técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usa en la presente, los términos "transformación" y "transfección" son propuestas para referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación fosfato de calcio o de cloruro de calcio, transfección mediada por dextrano-DEAE, lipofección, pistola de partículas, o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar las células huésped pueden ser encontrados en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edicación, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York) y otros manuales de laboratorio de biología molecular estándar. Las células procaríoticas y eucarióticas usadas para producir las muteinas de IL-2 de esta invención y variantes activas biológicamente de las mismas son cultivas en medio adecuado, descrito generalmente en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York) . Composiciones farmacéuticas Después de que se producen y purifican las muteinas de IL-2 humanas o variantes de la misma, pueden ser incorporadas en una composición farmacéutica para aplicación en terapéuticos humanos y veterinarios, tales como terapia o prevención de cáncer, inmunoterapia, y el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas. De esta forma, las muteinas de IL-2 humanas o variantes biológicamente activas de las mismas pueden ser formuladas como formulaciones farmacéuticas para una variedad de usos terapéuticos. Como una composición, las muteinas de IL-2 humanas o variantes activas biológicamente de las mismas son administradas parentalmente al sujeto por métodos conocidos en la técnica. Los sujetos incluyen mamíferos, por ejemplo, primates, humanos, perros, ganado, caballos, etc. Estas composiciones farmacéuticas pueden contener otros compuestos que incrementan la eficacia o promueven las calidades deseables de las muteinas de IL-2 humana de la invención. Las composiciones farmacéuticas deben ser seguras para administración por medio de la ruta que se elija, deben ser estériles, retener bioactividad, y deben solubilizar establemente la muteina de IL-2 humana o variante biológicamente activa de la misma. Dependiendo del proceso de formulación, las composiciones farmacéuticas de muteina de IL-2 de la invención pueden ser almacenadas en una forma líquida ya sea al ambiente, refrigerada o congelada, o preparada en la forma seca, tal como un polvo liofilizado, el cual puede ser reconstituido en la solución líquida, suspensión, o emulsión antes de la administración por cualquiera de los métodos que incluyen rutas de administración oral o parental. Tales composiciones farmacéuticas comprenden típicamente por lo menos una muteina de IL-2 humana, variante biológicamente activa de la misma, o una combinación de las mismas, y un portador aceptable farmacéuticamente. Los métodos para formular las muteinas de IL-2 humana de- la invención para administración farmacéutica son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Gennaro (ed.) (1995) Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19a edición, Mack Publishing Company, Easton, PA) . / Como se usa en la presente el lenguaje "portador acceptable farmacéuticamente" se propone para incluir cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retraso de absorción e isotónicos, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tal medio y agentes para substancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto que hasta ahora cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, tal medio puede ser usado en las formulaciones farmacéuticas de muteina de IL-2 humana de la invención. Los compuestos activos complementarios pueden también ser incorporados en las composiciones. Una composición farmacéutica de muteina de IL-2 la cual comprende una muteina de IL-2 humana de la invención o variante de la misma es formulada para ser compatible con su ruta propuesta de administración. La ruta de administración variará dependiendo del resultado deseado. La composición farmacéutica de muteina de IL-2 puede ser administrada por dosis de bolo, infusión continua, o infusión constante (infusión, por un periodo corto de tiempo, es decir, 1-6 horas) . La composición farmacéutica de muteina de IL-2 puede ser administrada oral, intranasal, parentalmente, incluyendo intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscularmente, etc, por administración intradérmica, transdérmica (tópica) , transmucosa y rectal, o por inhalación pulmonar. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parental, intradérmica, o subcutánea puede incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos, agentes antibacteriales tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como EDTA; tensioactivos tales como polisorbato 80; SDS; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parental puede ser encerrada en ampolletas, jeringas desechables, o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico . Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersión inyectable estéril. Donde la formación de agregados de proteína es minimizada en el proceso de formulación, portadores adecuados para administración intravenosa incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS por sus siglas en inglés) . En todos los casos, las composiciones pueden ser estériles y deben ser fluidas al grado que exista fácil capacidad de manejo en jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser conservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol,. poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerida en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos . La prevención de la acción de microorganismos puede ser lograda por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser llevada a cabo aproximadamente por incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas por incorporar el compuesto activo (por ejemplo, una proteína o anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con un o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones son preparadas por incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación lo cual produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada estéril previamente del mismo. Las composiciones orales generalmente . incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden ser encerradas en cápsulas de gelatina o comprimidas en tabletas. Para administración oral, el agente puede estar contenido en formas entéricas para sobrevivir al estómago o además recubiertas o mezcladas para ser liberadas en una región particular del tracto Gl por métodos conocidos. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser incorporado con excipientes y usado en la forma de tabletas, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales pueden también ser preparadas usando un portador fluido para uso como un lavado bucal, en donde el compuesto en el portador fluido es aplicado oralmente y agitado y expectorado o tragado. Agente de enlace compatibles farmacéuticamente, y/o materiales adyuvantes pueden ser incluidos como una parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto, o gelatina; un excipiente tal como un almidón o lactosa, un agente de desintegración tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un glidante tal como un bióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como, sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo, o sabor de naranja. - La administración sistémica puede también ser por medio transmucosal o transdérmica. Para la administración transmucosal o transdérmica, se usan penetrantes apropiados para la barrera a ser per eada en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosal, detergentes, sales biliares, y derivados de ácidos fusídicos. En una modalidad, los compuestos activos son preparados con portadores que protegerán el compuesto contra eliminación rápida a partir del cuerpo, tal como formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados . Los polímeros biodegradables, biocompatibles pueden ser usados, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para preparación de tales formulaciones serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. Los materiales pueden también ser obtenidos comercialmente a partir de Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas objetivados a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) pueden también ser usadas como portadores farmacéuticamente aceptables. Estas pueden ser preparadas de acuerdo a los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica,"- por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 4,522,811. Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parentales en forma de unidad de dosis para facilidad de administración y uniformidad de dosis. La forma de unidad de dosis como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas como dosis de unidad para el sujeto a ser tratado; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosis de la invención son dictadas por y directamente dependiente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a ser logrado, y las limitaciones inherentes en la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos .
Las muteinas de IL-2 humanas de la presente invención o variantes activas biológicamente de las mismas, pueden ser formuladas usando cualquier proceso de formulación conocido en 1 técnica para 1L-2 humana. Las formulaciones adecuadas que son útiles en el método presente son mostradas en las varias patentes y publicaciones. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,604,377 muestra una formulación de IL-2 preferida que tiene una cantidad terapéutica de IL-2, la cual es substancialmente libre de proteína no IL-2 y endotoxina, un portador soluble en agua aceptable fisiológicamente, y una cantidad suficiente de un agente tensioactivo para solubilizar la IL-2, tal como el dodeciisulfato de sodio. Pueden ser incluidos otros ingredientes, tales como azúcares, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,766,106 muestra formulaciones que incluyen IL-2 modificada con polietilenglicol (PEG) solicitud de patente Europea, Publicación NO. 268,110 muestra la IL-2 formulada con varios tensioactivos no iónicos seleccionados del grupo que consiste de esteres de ácidos grados de polioxietilensorbitán (Tween 80) , monoestearato de polietilenglicol y compuestos de octilfenoxipolietoxietanol (Tritón X405) , la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 4,992,271 describe las formulaciones de IL- 2 que comprenden la albúmina sérica humana y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,078,997 describe formulaciones de IL-2 que comprenden la albúmina de suero humana y aminoácidos. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 6,525,102 describe formulaciones de IL-2 que comprenden una base de aminoácidos, la cual sirve como el agente estabilizante primario del polipéptido, y un ácido y/o su forma de sal para amortiguar la solución dentro de un intervalo de pH aceptable para estabilidad del polipéptido. La solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica copendiente NO. 10/408,648 describe las formulaciones de IL-2 adecuadas para suministro pulmonar. Usos terapéuticos Las formulaciones farmacéuticas que comprenden las muteinas de IL-2 humanas de la presente invención o variantes activas biológicamente de las mismas obtenidas a partir de estas muteinas de IL-2 humanas son útiles en la estimulación del sistema inmune, y en el tratamiento de cánceres, tales como aquellos actualmente tratados usando la IL-2 humana nativa o Proleukin® IL-2. Las muteinas de IL-2 humanas de la presente invención y variantes activas biológicamente activas de las mismas tienen la ventaja de reducir la producción de citocina pro-inflamatoria predictiva de tener toxicidad inferior, mientras que mantiene o incrementa las actividades funcionales deseables tales como proliferación de células NK, sobrevivencia, citotoxicidad mediada por NK (NK, LAK y ADCC) y proliferación de células T.
Debido a su toxicidad inferior predictiva, en aquellas indicaciones clínicas que requieren altas dosis de TL-2, las muteinas de IL-2 humanas de la presente invención, y variantes activas biológicamente de las mismas, pueden ser administradas en dosis similares o superiores que la IL-2 nativa o IL-2 de Proleukin®, mientras que minimiza efectos de toxicidad. De esta forma, la presente invención proporciona un método, para reducir los síntomas de toxicidad inducidos por interleucina-2 (IL-2) en un sujeto que sufre de administración de IL-2 como un protocolo de tratamiento, donde el método comprende administrar la IL-2 como una muteina de IL-2 descrita en la presente. Adicionalmente, las muteinas de IL-2 humana de la presente invención y variantes activas biológicamente adecuadas de las mismas tienen la ventaja adicional de mayor eficacia terapéutica, de tal forma que dosis menores de estas muteinas de IL-2 humana pueden proporcionar mayor eficacia terapéutica que. las dosis comparables de IL-2 nativa o IL-2 de Proleukin®. Una cantidad efectiva farmacéuticamente de una composición farmacéutica de muteina de IL-2 de la invención se administra a un sujeto. Por "cantidad efectiva farmacéuticamente" se propone una cantidad que es útil en el tratamiento, prevención o diagnosis de una enfermedad o condición. Por "sujeto" se propone mamíferos, por ejemplo, primates, humanos, perros, gatos, ganado, caballos, cerdos, borregos y similares. Preferentemente el sujeto que sufre de tratamiento con las formulaciones farmacéuticas de la invención es un humano. Cuando la administración es para el propósito del tratamiento, la administración puede ser para ya sea un propósito profiláctico o. terapéutico. Cuando se proporciona profilácticamente, se proporciona la substancia antes a cualquier síntoma. La administración profiláctica de la substancia sirve para prevenir o atenuar cualquier síntoma subsecuente. Cuando se proporciona terapéuticamente, se proporciona la substancia en (o brevemente después) del inicio de un síntoma. La administración terapéutica de la substancia sirve para atenuar cualquier síntoma actual. De esta forma, por ejemplo, las formulaciones que comprenden una cantidad efectiva de una composición farmacéutica de la invención que comprenden una proteína de IL-2 humana de la invención o una variante biológicamente activa de la misma pueden ser usadas para el propósito del tratamiento, prevención y diagnosis de un número de indicaciones clínicas responsivas a la terapia con IL-2..Las muteinas de IL-2 humanas de la presente invención y variantes activas biológicamente de las mismas pueden ser formuladas y usadas en las mismas terapias como IL-2 de secuencia nativa o IL-2 de Proleukin®. Por consiguiente, las formulaciones de la invención que comprenden una muteina de IL-2 humana de la invención o una variante de la misma activa biológicamente pueden ser útiles para diagnóstico, prevención y tratamiento (local o sistémico) de infecciones bacterianas, virales, con parásitos, protozoarios y fúngicos, para aumentar la citotoxicidad mediada por células; para estimular la actividad celular asesina activada por linfocina (LAK) , para mediar la recuperación de la función inmune de linfocitos; para aumentar la respuesta a aloantígeno; para facilitar la reconstitución inmune en pacientes con cáncer después de la radioterapia, o después o junto con quimioterapia sola o en combinación con otros agentes anticáncer, o después o junto con médula ósea o trasplante de célula germinal autóloga; para facilitar la recuperación de función inmune en estados de inmunodeficiencia adquirida; para reconstitución de inmunofunción normal en humanos y animales envejecidos; en el desarrollo de ensayos de diagnóstico tales como aquellos que emplean amplificación de enzimas, radioetiquetado, radioimagen, y otros métodos conocidos en la técnica para monitorear niveles de IL-2 en el estado de enfermedad; para la promoción de crecimiento de células T in vitro para propósitos terapéuticos y de diagnóstico; para bloquear sitios receptores para linfocinas; y en varias otras aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación. Las varias aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico de la IL-2 humana o variantes de la misma, tales como muteinas de IL-2, han sido investigadas y reportadas en Rosenberg et al. (1987) N. Engl. J. Med. 316:889-897; Rosenberg (1988) Ann.
Surg. 208:121-135; Topalian et al. 1988) J. Clin. Oncol. 6 : 839-853 ; Rosenberg et al. (1988) N. Engl. J. Med. 319:1676-1680; Weber et al. (1992) J. Clin. Oncol. 10:33-40, Grimm et al. (1982) Cell. Immunol. 70 (2) : 248-259; Mazumder (1997) Cáncer J. Sci. Am. 3 (Suppl l):S37-42; Mazumder and Rosenberg (1984) J. Exp. Med. 159 (2) : 495-507; y Mazumder et al. (1983) Cáncer Immunol . Immunother. 15(1):1-10. Las formulaciones de la invención que comprenden una muteina de IL-2 humana de la invención o variante biológicamente activa de la misma puede ser usada como el único agente activo terapéuticamente o puede ser usado en combinación con otras células relevantes inmunológicamente u otros agentes terapéuticos. Ejemplos de células relevantes son células B o T, células NK, células LAK, y similares, y reactivos terapéuticos de ejemplo que pueden ser usados en combinación con IL-2 o una variante de la misma son los varios interferones, especialmente el gamma interferón, factor de crecimiento de células B, IL-1 y anticuerpos, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos anti-HER2 tal como Herceptin® (Genentech, Inc., San Francisco, California) o anticuerpos anti-CD20 tales como Rituxan® (Rituximab; IDEC-C1B8; IDEC Pharmaceuticals Corp. San Diego, California) . La cantidad de la muteina de IL-2 humana o variante biológicamente activa de la misma administrada puede estar en el intervalo entre aproximadamente 0.1 a aproximadamente 15 mlü/m2. Las dosis efectivas terapéuticamente y protocoles de tratamiento particulares para inmunoterapia con IL-2 en combinación con anticuerpos monoclonales anticáncer son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las dosis y protocolos de tratamiento descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 2003-0185796, titulada Methods of Therapy for Non- Hodgkin' s Lymphoma" y 20030235556, titulada "Combination IL- 2/anti-HER2 Antibody Therapy for Cancers Characterized by Overexpression of the HER2 Receptor Protein, y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica copendiente No. 60/491,371, titulada "Methods of Therapy for Chronic Lymphocytic, Leukemia" Documento del apoderado NO. 59516-278, presentada el 31 de Julio de 2003. Para indicaciones tales como carcinoma de célula renal y melanoma metastásico, la muteina de IL-2 humana o variante biológicamente activa de la misma puede ser administrada como un bolo intravenoso de dosis alta en 300,000 a 800,000 IU/kg/8 horas. Ver las solicitudes de patente de los Estados Unidos de Norteamérica ' mencionadas anteriormente para las dosis recomendadas para la inmunoterapia con IL-2 para linfomas de células B, cánceres de HER2+ tales como cáncer de mama, y CLL. El uso de inmunoterapia con IL-2 para el tratamiento de infección de VIH es también conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6,579,521, para dosis recomendadas y protocoles para esta indicación clínica. De esta forma, la invención proporciona un método para el tratamiento de cáncer en un sujeto o para- modular la respuesta inmune en un sujeto, el cual comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de una muteina de IL-2 humana de la invención o variante biológicamente activa ' de la misma. La "cantidad efectiva terapéuticamente" se refiere a un nivel de dosis suficiente para- inducir un resultado biológico deseado sin inducir efectos de toxicidad inaceptables. Las cantidades para administración pueden variar en base a la concentración de muteina de IL-2 humana o variante de la misma dentro de la composición farmacéutica, la actividad deseada, el estado de enfermedad del mamífero que es tratado, la forma de dosis, método de administración, frecuencia de administración, y factores de paciente tales como edad, sexo, y severidad de la enfermedad. Se reconoce que una cantidad efectiva terapéuticamente se proporciona en un intervalo amplio de concentraciones, y que el sujeto puede ser administrado con muchas dosis efectivas terapéuticamente como se requiera para reducir y/o aliviar los signos, síntomas o causas del desorden en cuestión, o llegar a aproximadamente cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Generalmente, una composición farmacéutica de muteina de IL-2 de la invención comprenderá la muteina de IL-2 humana o variante de la misma en un intervalo de concentración el cual es mayor que aquel usado para IL-2 de Proleukin®. En cuanto las dosis son incrementadas con relación a aquella de IL-2 de Proleukin®, el sujeto debe ser monitoreado cercanamente para determinar si aparecen efectos colaterales tóxicos. Tales análisis experimentales clínicos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, y pueden, por ejemplo, haber sido usado para establecer las dosis actuales de IL-2 de Proleukin® para uso en inmunomodulación y terapia con cáncer. Bioensayos para monitorear la actividad funcional de muteinas de IL-2 humanas . La presente invención también proporciona bioensayos novedosos para monitorear la proliferación de células de NK inducidas por IL-2 y producción de TNF-a, citotoxicidad mediada por células NK inducida por IL-2, proliferación de células T inducidas por IL-2, y sobrevivencia de células NK inducidas por IL-2. Estos ensayos han sido desarrollados para tamizar muteinas de IL-2 candidatas para el perfil funcional deseado de producción de citocina pro-inflamatoria reducida (particularmente TNF-a y/o IFN-?) para así mejorar la capacidad de tolerancia, y función mediada por células NK mejorada como se refleja en la capacidad de la muteina para mantener o incrementar la proliferación de células NK y/o T, para mantener o incrementar la citotoxicidad mediada por NK (NK, LAK y ADCC) y para mantener o incrementar la sobrevivencia de células NK. El primero de estos ensayos es referido en la presente como "bioensayo de NK-92", el cual monitorea la inducción de IL-2 de producción de TNF-a y proliferación de células NK inducida por IL-2. Este bioensayo utiliza la línea celular NK-92 humana (ATCC CRL-2407, CMCC ID #11925) . La línea celular NK-92, originalmente descrita por Gong et al. (1994) Leukemia 8 (4) : 652-658 , exhibe características fenotípicas y funcionales de células NK activadas. La proliferación de NK-92 es dependiente a IL-2; las células morirán si se cultivan en la ausencia de IL-2 por 72 horas. La línea celular también produce niveles detectables de TNF-a dentro de 48-72 horas después de la exposición a IL-2. De acuerdo con los métodos de la presente invención, las muteinas de IL-2 candidatas pueden ser tamizadas para capacidad relativa para inducir la producción de TNF-a e inducir la proliferación de células Nk usando este bioensayo de NK-92. En esta forma, las células NK-92 son cultivadas en medio completo (medio MK-92) que consiste de Alpha-MEM, suero bovino fetal inactivado por calor al 12% (FBS por sus siglas en inglés) , suero de caballo inactivo por calor al 8%, ácido fólico 0.02 mM, inositol 0.2 mM, L- glutamina 2 M, y ß-mercaptoetanol 0.1 mM. Los cultivos son sembrados en una densidad mínima de 1-3 x 10~5 células/ml y complementados con 1000 IU/ml de la muteina de IL-2 humana recombinante de referencia (por ejemplo, la muteina de IL-2 de referencia, designada IL-2 des-alanil 1 C125S humana o la muteina de IL-2 humana C125S de referencia) . En la preparación para el ensayo, las células se colocan en medio de NK-92 fresco un medio de 48 horas antes al uso del ensayo. Un día antes del ensayo, se lavan NK-92 tres veces y se colocan en medio de NK-92 sin ninguna IL-2 complementaria por 24 horas. Las células son centrifugadas, suspendidas en medio de NK-92 (no IL-2) y se coloca en placas en placas de fondo plano de 96 pozos en una densidad de 4 x 104 células/pozo en 200 µl con concentraciones variadas de la muteina de IL-2 de referencia, por ejemplo, IL-2 humana des-alanil-1 C125S o concentraciones variadas de una muteina de IL-2 candidato que está siendo tamizada para el perfil funcional de interés diluida en medio de NK-92. Después de una incubación de 72 horas en 37 °C, C02 al 5%, 100 µl de alícuota de sobrenadante de cultivo se remueven y se congelan para cuantificación subsecuente de TNF-a usando un equipo de ELISA de TNF-a disponible comercialmente (por ejemplo, Biosource Cytoscreen™ Human TNF-a ELISA kit; Camarillo, California) . Para las células restantes en cultivo, se determina la proliferación usando un equipo de reducción de tinte MTT comercialmente disponible (CellTiter 96® Non- Radioactive Cell Proliferation Assay Kit (Promega Corp. Madison, Wisconsin) y un índice de estimulación es entonces calculado en base a una lectura colorimétrica. El segundo bioensayo de IL-2 descrito en la presente proporciona un método para tamizar las muteinas de IL-2 candidato por su capacidad para inducir citotoxicidad mediada por células asesinas naturales (NK) . Este bioensayo, designado el "bioensayo de citotoxicidad NK3.3" utiliza la línea celular NK3.3 humana. La línea celular NK3.3 exhibe características fenotípicas y funcionales de células NK sanguíneas periféricas (Kornbluth (1982) J. Immunol . 129 (6) : 2831-2837) , y puede mediar la citotoxicidad celular dependiente a anticuerpo (ADCC) por medio del receptor de Fe (CD16, Fc?RIIIA) . La Tabla 2 en la sección experimental posterior resume las actividades biológicas de las células NK3.3 examinadas con este bioensayo de IL-2. De acuerdo con los métodos de la presente invención, las muteinas de IL-2 candidato pueden ser tamizadas para su actividad de citotoxicidad usando este bioensayo de citotoxicidad NK3.3. En esta forma, las células NK3.3 son expandidas y mantenidas en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 15%, HEPES 25 mM, L-glutamina 2 mM, y T-Stim™ w humano al 20%/PHA como una fuente de IL-2. En la preparación para el 1.37 ensayo, las células NK3.3 son cultivadas en la ausencia de IL-2 ("cosechado) por 24 horas. El ensayo consiste de 5 x 104 células NK3.3 "cosechadas" llevadas a placa en placas de 96 pozos de fondo de U. Expuestas a concentraciones variadas de una muteina de IL-2 de referencia, por ejemplo, muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S o C125S, o concentraciones variadas de una muteina de IL-2 candidato de interés en un volumen total de 200 µl . Después de una incubación de 18 horas, las células efectoras NK3.3 estimuladas por 1L-2 son coincubadas con 5 x 103 células objetivo etiquetadas con calceina AM (K562 o Daudi) o objetivos etiquetados con calceina .AM, recubierto con anticuerpo (Daudi recubierto con rituximab en una concentración final de 2 µg/ml) para lograr una proporción de efecto final a objetivo de 10:1. Después de la coincubación del células efectoras y objetivo por 4 horas, las placas de 96 pozos son centrifugadas brevemente; 100 µl de sobrenadante de cultivo se remueve y se coloca en una placa de 96 pozos de fondo plano, claras, negras para cuantificación de liberación de calceina AM por fluorímetro. Se expresa la cuantificación como por ciento de lisis específico, y se calcula por la siguiente ecuación: % de lisis específica=100x[liberación experimental promedio-liberación espontánea promedio) / (liberación máxima promedio-liberación espontánea media)]; donde la liberación espontánea es determinada a partir de pozos que contiene objetivos etiquetados y no efectores, y se determina la liberación máxima a partir de células que contiene objetivos etiquetados y Tritón X-100 al 1%. El tercer bioensayo de IL-2 descrito en la presente proporciona un método para tamizar muteinas de IL-2 candidatos por su capacidad para inducir proliferación de células T. En esta forma, este bioensayo de IL-2 para proliferación de células T utiliza la línea cellular T humana Kit225 (CMCC ID#11234), derivado de un paciente con una leucemia linfocítica crónica con células T (Hori et al. (1987) Blood 70 (4) : 1069-1072 ) . Las células Kit225 expresan constitutivamente las subunidades a, ß, ? del complejo receptor de IL-2. La proliferación de Kit225 es dependiente a IL-2; las células morirán si se cultivan en la ausencia de IL-2 por un periodo- extendido de tiempo. De acuerdo con la presente invención, el ensayo consiste de cultivar células Kit225 en la ausencia de IL-2 por 24 horas, después por colocar en placa un número específico de células con concentraciones variadas de la muteina de IL-2 de referencia, por ejemplo, muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S o C125S, o concentraciones variadas de muteina de IL-2 candidato de interés. Después de una 'incubación de 48 horas, se determina la proliferación usando un equipo de reducción de tinte MTT comercialmente disponible, estándar, y un índice de estimulación se calcula en base a la lectura colorimétrica. El cuarto bioensayo de IL-2 de la presente invención proporciona un método para tamizar las muteinas de IL-2 candidato por su capacidad para promover la sobrevivencia de células NK. En esta forma, las muteinas candidato son tamizadas por su capacidad para inducir señalización de sobrevivencia de células NK. La IL-2 de Proleukin® (es decir, la formulación que comprende la muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125) induce la fosforilación de AKT en células NK3.3 previamente cosechadas para IL-2, lo cual se considera, una "señal de sobrevivencia". De acuerdo con este bioensayo, las células NK .3 son expandidas y mantenidas en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal inactivado al calor al 15%, HEPES 25 mM, L-glutamina 2 mM, y T-Stim™w humano al 20%/PHA como una fuente de IL-2. En la preparación para el ensayo, las células NK3.3 son cultivadas en la ausencia de IL-2 por 24 horas. Como un indicador de señalización de sobrevivencia de células, son estimuladas las células NK3.3 (2xl06) por la adición de 2 nM de la muteina de IL-2 de referencia, por ejemplo, la muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S o C125S, o 2 nM de una muteina de IL-2 candidato de interés, por 30 minutos. Se lavan las células dos veces en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . El granulo celular es lisado en 50 µl de un amortiguador de extracción celular que contiene inhibidores de proteasa y sometido a un ciclo de congelado- descongelado. Se centrífuga la extracción en 13,000 rpm por 10 minutos @ 4°C. Una alícuota del lisado clarificado es agregado en una dilución 1:10 a pozos de la AKT ['S473]* equipo de inmunoensayo (BioSource International) . Siguiendo el protocolo del fabricante, niveles de AKT fosforiladas son detectados por ELISA cuantitativa. La presente invención también proporciona bioensayos para uso en tamizado de muteinas de IL-2 por sus perfiles funcionales usando células mononucleares sanguíneas periféricas humanas (PBMC) . El primero de estos bioensayos es un bioensayo de proliferación de combinación/producción de citocina pro-inflamatorio. Ante exposición a IL-2, las PBMC proliferan y secretan citocinas en una forma dependiente a dosis. Este ensayo de combinación es diseñado para evaluar los niveles de proliferación y producción de citocina después de una estimulación de 72 horas con una muteina de IL-2 de referencia (tal como la muteina des-alanil-1, C125S o muteina de C125S) o una muteina de IL-2 candidato de interés. Las PBMC son aisladas por separación de gradiente de densidad (por ejemplo, usando tubos CPT vacutainer ACDA) a partir de uno o más donadores humanos normales. En placas tratadas con cultivo de tejido de 96 pozos, se incuban 200,000 células por pozo con varias concentraciones de IL-2 (0.030 nM-10 nM) como un control negativo en medio completo de RPMI (RPMI, suero AB humano inactivado por calor al 10%, HEPES 25 mM, glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina/fungizona) en 37 °C, C02 al 7%. Después de 66 horas de incubación, se remueve una alícuota de sobrenadante de cultivo celular y se congela por detección de citocina en un último momento. Las células son impulsadas con 1 µCi 3H-timidina por 6 horas, y después cosechadas para deteminar los niveles de incorporación de nucleótido (por ejemplo usando un lector de placa de Microbeta Trilux Wallac) como una medición de proliferación de células. Equipos ELISA comercialmente disponibles (por ejemplo, de BioSource International) pueden ser usados para detectar niveles de TNF-a en los sobrenadantes de cultivo celular por las pautas del fabricante. Repetir el ensayo para un panel completo de donadores separados, por ejemplo, 6, 8, ó 10 donaodres, proporciona una caracterización de respuestas proliferativas y de citocina representativas a IL-2 en una "población normal". Los datos pueden entonces ser analizados como se muestra en la Figura 1, y descritos adicionalmente en la presente posteriormente en el Ejemplo 10. El segundo bioensayo a base de PBMC puede ser usado para tamizar las muteinas de IL-2 candidato por su capacidad para mediar la citotoxicidad de células efectoras. En este ensayo, las PBMC humanas son separadas de la sangre entera usando centrifugación de gradiente de densidad. Las PBMC son estimuladas por 3 días en la presencia de 10 nM de control de IL-2 o muteina de IL-2 de interés, para generar la actividad de LAK como se practica generalmente en el estado corriente de la técnica (ver por ejemplo Isolation of Human NK Cells and Generation of LAK activity IN: Current Protocols in Immunology; 1996 John Wiley & Sons, Inc.). La población celular resultante contiene células "efectoras" las cuales pueden ser clasificadas como NK o LAK y pueden matar objetivos de células tumorales K562 y Daudi, respectivamente. Estas células efectoras pueden también mediar ADCC, donde las células efectoras reconocen la porción Fe de un anticuerpo específico que se enlaza a las células objetivas Daudi. En una modalidad, el anticuerpo enlazado a las células objetivo Daudi es Rituxan® (rituximab) . De acuerdo con los métodos de la presente invención, PBMC humana (células efectoras) que han sido estimuladas con una muteina de IL-2 candidato de interés o un control de IL-2 de referencia son coincubadas con células objetivas etiquetadas con calceina AM en varios efectores para objetivar la célula (proporciones E:T) por 4 horas. La cantidad de la actividad citotóxica está relacionada con la detección de AM de calceina en el sobrenadante de cultivo. Se expresa la cuantificación como un por ciento de lisis específica en cada proporción E:T, en base a la determinación de controles de liberación espontánea y máxima. Este bioensayo examina las siguientes actividades biológicas: citotoxicidad natural/espontánea (NK) , donde el objetivo es las células K562, muerte activa por linfocina (LAK) , donde el objetivo es células Daudi; y citotoxicidad celular dependiente a anticuerpo (ADCC) , donde el objetivo es células Daudi recubiertas con anticuerpo (por ejemplo, células Daudi recubierto por Rituxan®) . Se obtienen los datos a partir de un fluorímetro y se expresan en unidades de fluorescencia relativas (rfu) .
Controles para este bioensayo incluyen células de objetivo etiquetadas solas (min) y células objetivas etiquetadas con Tritón X-100 al 1% como una medición de 100% de lisis (máxima) . El por ciento de proporción de min a max se calcula usando la siguiente ecuación como una medición de validez de ensayo (ensayo inválido si>30%) . . % min a max=100 x (rfu de liberación espontánea promedio) / (rfu de liberación máxima media) una vez que el ensayo es en efecto válido, la desviación media y estándar para puntos de muestra triplicadas se calcula, seguido por el por ciento de lisis específica a partir de media de puntos triplicados usando la siguiente ecuación: % de lisis=(rfu experimental promedio-rfu de liberación espontánea promedio) / (rfu de liberación máxima promedio-rfu de liberación espontánea promedio) X 100 Los datos se reportan como % de lisis específica, además, la proporción de muteina de IL-2 candidato a control de referencia de IL-2 relevante (por ejemplo, muteina de IL-2 des-alanil-1 C125S o muteina de IL-2 humana C125S) puede ser usada para determinar ya sea si la actividad citotóxica es mantenida con relación al control de referencia de IL-2 en una población mixta de donadores de PBMC humana. Los ensayos mencionados en la presente pueden ser utilizados para tamizar bibliotecas de muteina de IL-2 candidato para perfiles funcionales deseados, cuando las actividades funcionales de interés incluyen uno o más de los siguientes: producción de citocina pro-inflamatorio inducida por IL-2 (particularmente TNF-a y/o IFN-?) , proliferación de células NK y/o T inducida por IL-2, citotoxicidad mediada por NK inducida por IL-2 (NK, LAK y ADCC) , y sobrevivencia de células NK inducidas por IL-2. Los siguientes ejemplos son ofrecidos por la forma de ilustración y no por la forma de limitación. EXPERIMENTAL La utilidad terapéutica de IL-2 es obstaculizada por las toxicidades asociadas con su administración, incluyendo fiebre, resfriados, hipotensión, y síndrome de caída vascular. Las muteinas de IL-2 con capacidad de tolerancia mejorada y funciones efectoras NK y T mediadas por IL-2 pueden permitir la administración de dosis terapéuticas similares que son mejor toleradas de dosis terapéuticas superiores, por lo mismo incrementado el potencial para mayor eficacia terapéutica de esta proteína.
La estrategia total del trabajo presentado en la presente es seleccionar muteinas de IL-2 humanas novedosas que exhiben el siguiente perfil funcional usando un panel comprensivo de sistemas de tamizado de inmunoensayo en base a las células NK humanas de capacidad total moderados especializados: la producción de citocina pro-inflamatoria reducida (particularmente TNF-a y/o IFN-?) para así mejorar la capacidad de tolerancia, e incrementar la función mediada por células NK como se refleja en la capacidad de la muteina para mantener o incrementar la proliferación de células NK y/o T, para mantener o incrementar la citotoxicidad mediada por NK (NK, LAK y ADCC) y para mantener o incrementar la sobrevivencia de células NK. Para propósitos de identificar las muteinas de IL-2 adecuadas con el perfil terapéutico deseado, las actividades biológicas de las muteinas de IL-2 humana recombinantes candidato son comparadas con estas actividades biológicas exhibidas por IL-2 humana des-alaníl-1, C125S (abreviado como "Pro" en los ejemplos posteriores) y IL-2 humana C125S (abreviada como "Ala-Pro" en los ejemplos posteriores), lo cual es referido como las muteinas de IL-2 de referencia. La E. coli produce recombínantemente muteina de IL-2 humana des-alanil-1, C125S, la cual es aldesleukin, es vendida como una formulación bajo la marca IL-2 Proleukin® (Chiron Corporation, Emeryville, California) . La IL-2 de Proleukin® es una formulación liofilizada específica que usa una forma 'no glicosilada de la muteina que ha sido producida en E. coli y es reconstituida en agua destilada para uso en los bioensayos descritos en la presente posteriormente. En ciertos experimentos, se usa una formulación monomérica de aldesleukin vendida bajo la marca IL-2 L2-7001® (Chiron) , la cual es una formulación líquida que comprende la misma muteina de IL-2 humana (aldesleukin) como IL-2 Proleukin®, pero que difiere en las etapas de purificación final antes a su formulación. Ver, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 4,931,543 y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6,525,102. La IL-2 humana C125S usada en los experimentos de tamizado iniciales es producida en el sistema de mamífero AME, y se formula en amortiguador de AME registrada. Las muteinas de IL-2 humanas descritas en la presente posteriormente son expresadas en células 293T mamíferas huésped. Donde la muteina de IL-2 de referencia es IL-2 humana C125S, las células huésped han sido transformadas con una construcción de expresión que comprende la secuencia de codificación de IL-2 humana nativa con una mutación de C125S enlazada operablemente al promotor Pro-1. La secuencia de codificación comprende la secuencia de señal IL-2 auténtica y codon para la alanina N-terminal de IL-2 humana (es decir, nucleótidos 1-63 de la SEQ ID N0:1) fusionada en la secuencia de codificación para IL-2 humana des-alanil-1, C125S (es decir, la SEQ ID N0;7). La proteína es expresada como proteína con etiqueta GSHis en el sistema de expresión mamífera de células 293T y purificada con perlas NI-NTA. Ejemplo 1: Tamizado inicial de muteinas de IL-2 humana Una biblioteca que comprende todas las 2,508 variantes de muteina de aminoácido sencillo de la molécula de IL-2 humana C125S (diseñada "Ala-Pro" en los ejemplos en la presente) se construye usando una plataforma de tecnología de mutagénesis en base codones (Applied Molecular Evolution, Inc., San Diego, California). Ala-Pro difiere de muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S utilizada en el producto Proleukin® IL-2 disponible comercialmente que tiene el residuo Ala N-terminal en la posición 1 de la secuencia de IL_2 humana nativa retenida en la muteina de IL-2 humana C125S. Los sistemas de expresión mamíferos AME DirectAME™ y ExpressAME™ (Applied Molecular Evolution, Inc., San Diego, California) son utilizados en la producción recombinante de las muteinas de Ala-Pro. Se realiza el tamizado usando un inmunoensayo funcional a base de línea celular NK-92 humana, en el cual se ensayan la producción de citocina pro-inflamatoria (TNF-a) , proliferación de células NK, y muerte citólica de NK (NK, LAK y ADCC), y sobrevivencia celular (pAKT; línea celular NK3.3). Los puntos finales funcionales primarios seleccionados incluyen: (1) producción de TNF-a pro-inflamatoria reducida por la línea celular NK-92 humana con relación a aquella observada con Ala-Pro IL-2 (es decir, muteina de IL-2 humana C125S) o IL-2 Proleukin® (es decir, muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S) ; (2) proliferación de línea celular NK-92 humana mantenida o mejorada con relación a aquella observada con ya sea una de estas muteinas de IL-2 de referencia, y 3) muerte citolítica mediada por NK, LAK y DAC mediada por línea celular NK3.3 humana mantenida o mejorada con relación a aquella observada con cualquiera de estas dos muteinas de IL-2 de referencia. Los puntos finales funcionales secundarias son inducción mantenida o mejorada de AKT fosforilada (pAKT) en la línea celular NK3.3 con relación a aquella observada con cualquiera de estas dos muteinas de IL-2 de referencia, y proliferación de células T mantenida o mejorada por la línea celular T Kit225 humana con relación a aquella observada con Ala-Pro IL-2 (es decir, muteina IL-2 humana C125S) o Proleukin®, (muteina de IL-2 humana des-alanil-1, C125S) . Fuera de todas las 2,508 variantes de muteina de aminoácido sencillas de la molécula de IL-2 C125S humana, 168 se identifican para prueba adicional (ver la Tabla 1 posterior) . Tres clases de muteinas de IL-2 altamente deseables con perfiles funcionales mejoradas son identificadas usando este procedimiento. Todas las muteinas de IL-2 seleccionadas mantienen la función citolítica NK (NK/LAK/DAC) cuando se comparan con las muteinas de IL-2 humana des-alanil-1, C125S (es decir, presente Proleukin® IL- 2) o C125S (es decir, Ala-Pro) . La primera clase de muteinas es predicha para tener tolerabilidad mejorada como se evidencia por inducción disminuida de producción de TNF-a por células NK con relación a aquella observada con la muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S o muteina de IL-2 humana C125S. Las muteinas dentro de esta clase caen dentro de dos categorías: (1) aquellas que inducen baja producción de TNF-a y mantienen la proliferación de células NK en concentraciones de 50 pM a 1000 pM, lo cual incluye las muteinas de IL-2 des-alanil-1, C125 o C125S además que comprenden la substitución de L72N; y (2) aquellas que inducen la producción baja de TNF-a y mantener la proliferación en alta concentración (1 nM) solamente, lo cual incluye las muteinas de IL-2 humana des-alanil-1 C125S o C125S que además comprende la substitución de V91D o F42E. Ver el Ejemplo 8 y la Tablas 13 y 14, posteriores. La segunda clase de muteinas incluye aquellas que son identificadas como que tienen función celular de NK incrementada, particularmente proliferación de célula NK, con relación a aquella observada con muteina de IL-2 humana des- alanil-1 C125S (es decir, en IL-2 Proleukin®) o la muteina de IL-2 humana C125S (designado Ala-Pro IL-2 en la presente) . Las muteinas identificadas dentro de esta clase funcional incluye las muteinas de IL-2 humana des-alanil-1, C125S o C125 además que comprende la substitución de L36D y L40D. Ver el ejemplo 8 y la Tabla 15, posterior. La tercera clase de muteinas incluye muteinas "bifuncionales" que son predichas para tener tolerabilidad mejorada en base a la inducción disminuida de TNF-a mientras que todavía mantiene proliferación de NK con relación a aquella observada con la muteina de IL-2 humana des-alanil-1, C125S presente en Proleukin® IL-2 o la muteina de IL-2 humana C125S (designada Ala-Pro IL-2 en la presente) . Estas muteinas "bifuncionales" exhiben una proporción mejorada de proliferación de NK: producción de TNF-a de más de 1.5. Las muteinas identificadas dentro de esta clase funcional incluyen las muteinas de IL-2 humanas des-alanil-1, C125S o C125S además que comprenden la substitución L19D, F42R o E61R. Ver el Ejemplo 8 y la Tabla 16, posterior. El proceso de tamizado que lleva a la identificación de los candidatos líder que se fijan en estas tres clases funcionales es además descrito en los ejemplos posteriores. Los siguientes protocolos son usados en el proceso de tamizado.
Proliferación de células NK/producción de TNF-a En el bioensayo de IL-2 para proliferación de células asesinas naturales (NK) y la producción TNF-a utiliza la línea celular NK-92 humana (ATCC CRL-2407 , CMCC ID#11925 ) . La línea celular NK-92 , originalmente descrita por Gong et al . (1994 ) Leukemia 8 ( 4 ) : 652- 658 , exhibe características fenotípicas y funcionales de células NK activadas . La proliferación de NK-92 es dependiente a IL-2 ; las células morirán si se cultivan en la ausencia de IL-2 por 72 horas . La línea celular también produce niveles detectables de TNF-a dentro de 48-72 después de la exposición a IL-2 . Se cultivan las células NK-92 en medio completo (medio NK-92 ) que consiste de alfa-MEM, suero bovino fetal inactivado por calor al 12% (FBS ) , suero de caballo inactivado por calor al 8% , ácido fólico 0 . 02 mM, inositol 0 . 2 mM, L-glutamina 2 M, y ß-mercaptoetanol 0 .1 mM. Se siembran los cultivos en una densidad mínima de 1-3 x 105 células/ml y se complementa con 1000 IU/ml de muteina de IL-2 humana recombinante (IL-2 humana des-alanil-1, C125S (es decir, aldesleukin o Proleukin® IL-2; Chiron Corporation, Emeryville, California) o IL-2 humana C125S (producida recombinantemente en el sistema de expresión de mamífero de AME indicado anteriormente) . En la preparación para el ensayo, se colocan las células en medio NK-92 fresco un mínimo de 48 horas antes al uso de ensayo. U día antes del ensayo , se lava NK-92 tres veces y se coloca en medio de NK- 9, sin ninguna IL-2 complementaria por 24 horas. Se centrifugan las células, se suspenden en medio NK-92 (sin IL- 2) y se colocan en placas de fondo plano de 96 pozos en una densidad de 4 x 104 células/pozo en 200 µl con concentradas variadas de IL-2 humana des-alanil-1 C125S o C125S como la molécula de IL-2 de referencia o concentraciones variadas de una muteina de IL-2 de la invención diluida en medio NK-92.
Después de una incubación de 72 horas en 37 °C, C02 al 5%, una alícuota de 100 µl de sobrenadante de cultivo es removida y congelada para cuantificación subsecuente de- TNF-a usando un equipo ELISA TNF-a comercialmente disponible (BioSource Cytoscreen™ Human TNF-a ELISA kit; Camarillo, California) .
Para las células restantes en cultivo, se determina la proliferación usando un equipo de reducción de tinte MTT comercialmente disponible (CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit (Promega Corp., Madison, Wisconsin), y se calcula entonces un índice de estimulación en base a la lectura colorimétrica. Citotoxicidad mediada por células NK El bioensayo de IL_2 para citotoxicidad mediada por células asesinas naturales (NK) utiliza la línea celular NK3.3 humana. La línea celular NK3.3 exhibe características fenotípicas y funcionales de células NK sanguíneas periféricas (Kornbluth (1982) J. Immunol . 129 ( 6) : 2831-2837) y pueden mediar la citoxicidad celular dependiente a anticuerpo (ADCC) por medio del receptor Fe (CDl6, Fc?RIIIA) . Se obtiene la línea celular a partir de Jackie Kornbluth, Ph. D., bajo uso limitado de acuerdo de licencia con St. Louis University, y depositado a CMCC (ID 12022) . La Tabla 2 resume las actividades biológicas de células NK3.3 examinadas con este bioensayo de IL-2. Tabla 2. Actividades biológicas de células NK3.3 examinadas con el bioensayo de IL-2 Se expanden las células NK3.3 y se mantienen en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 15%, HEPES 25 mM, L-glutamina 2 mM, y T-Stim™ Humana al 20% /PHA como una fuente de IL-2. En la preparación para el ensayo, se cultivan las células NK3.3 en la ausencia de IL-2 ("cosechada) por 24 horas. El ensayo consiste de 5 x 104 células NK3.3 "cosechadas" en placas de 96 pozos de fondo U, expuestas a concentraciones variadas de IL-2 humana des-alanil-1, C125S o C125 como la molécula IL-2 de referencia o concentraciones variadas de una muteina de IL-2 de la invención en un volumen total de 200 µl . Después de una incubación de 18 horas, las células efectoras NK3.3 estimuladas por IL-2 son co-incubadas con 5 x 103 células objetivo etiquetadas con calceina AM (K562 o Daudi) u objetivos recubiertos con anticuerpos, etiquetados con calceina AM (Daudi recubierto con rituximab en una concentración final de 2 µg/ml) para lograr una proporción efector final a objetivo de 10:1. Después de la co-incubación del efector y células objetivo por 4 horas, se llevan a centrifugación brevemente las placas con 96 pozos; 100 µl del sobrenandante de cultivo se remueven y se colocan en una placa de 96 pozos de fondo plano, claro, negro para cuantificación de liberación de calceina AM por fluorímetro.
Se expresa la cuantificación como por ciento de lisis específico, y se' calcula por la siguiente ecuación: % de lisis específica= 100 x [(media experimental-liberación espontánea promedio) / (liberación máxima media- liberación espontánea media)]; donde la liberación espontánea se determina de pozos que contienen objetivos etiquetados y no efectores, y se determina la liberación máxima a partir de pozos que contienen objetivos etiquetados y Tritón X-100 al 1%. Proliferación de células T El bioensayo de IL-2 para proliferación de células T utiliza el equipo Kit225 de línea celular T humana (CMCC ID #11234), derivada de un paciente con leucemia linfocítica crónica de células T (Hori et al. (1987) Blood 70(4):1069- 1072) . Las células Kit 225 expresan constitutivamente las subunidades a, ß, y ? del complejo del receptor de IL-2. La proliferación de Kit225 es dependiente a IL-2; las células se morirán si se cultivan en la ausencia de IL-2 por un periodo de tiempo prolongado. El ensayo consiste de células Kit225, se cultivan en la ausencia de ?L-2 por 24 horas, seguido por colocar en placa un número específico de células con concentraciones variadas de IL-2 humana des-alanil-1 C125S o C125S como la molécula de referencia IL-2 o concentraciones variadas de una muteína de IL-2 de la invención. Después de una incubación de 48 horass, se determina la proliferación usando un equipo de reducción de tinte MTT comercialmente disponibles, estándar, y se calcula un índice de estimulación en base a una lectura colorimétrica. Señalización de sobrevivencia de células NK Un subgrupo de la biblioteca de muteina de IL-2 humana es tamizado para la capacidad de inducir señalización de sobrevivencia de células NK. La IL_2 Proleukin® (es decir, aldesleukina, la muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S) induce la fosforilación de AKT en células NK3.3 previamente cosechadas para IL-2, la cual se considera una "señal de sobrevivencia". Se expanden las células NK3.3 y se mantienen en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal inactivado con calor al 15%, HEPES 15 mM, L-glutamina 2 mM, y T-Stim™ humano w/PHA al 20% como una fuente de IL-2. En la preparación para el ensayo, se cultivan las células NK3.3 en la ausencia de IL_2 por 24 horas. Como un indicador de señalización de sobrevivencia celular, las células NK3.3 "cosechadas" (2 x 106) son estimuladas por la adición de 2 nM de IL-2 humana des-alanil-1 C125S o C125S como la molécula IL-2 de referencia o 2 nM de una muteína de IL-2 de la invención, por 30 minutos. Se lavan las células dos veces en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Se lisa el granulo celular en 50 µl de un amortiguador de extracción de células que contiene inhibidores de proteasa y se somete a un ciclo de congelamiento descongelamiento. Se centrífuga el extracto en 13,000 rpm por 10 minutos @ 4°C. Una alícuota del lisado clarificado es agregado en una dilución 1:10 a pozos del equipo de inmunoensayo AKT [pS473]* (BioSource International) . Siguiendo el protocolo del fabricante, se detectan los niveles de AKT fosforilado por ELISA cuantificado . Ejemplo 2: Identificación de muteinas de IL-2 en base a la proliferación de células NK incrementada Fuera de las 168 muteinas identificadas para tamizado adicional (Tabla 1) , un total de 97 mutaciones benéficas que aumentan la proliferación de células NK a más de 130% de aquella exhibida por IL-2 humana des-alanil-1 C125S (es decir, muteina presente en Proleukin IL-2) en 0.1 nM sin producción de TNF-a concomitantemente incrementada (es decir, menor a 100 + 8% de la producción de TNF-alfa mediada por la muteina de IL-2 humana des-alanil-1, C125S en 1 nM) . Estas muteinas son enlistadas en la Tabla 3. Tabla 3. Muteinas de IL-2 identificadas usando el ensayo de proliferación de células NK-92 (CPA) como el criterio primario de selección. Se muestra la producción de TNF-a total (pg7ml) en proteína 1.0 nM y producción de TNF-a como un porcentaje de aquella observada para IL-2 humana des- alanil-1, C125S (% Pro) . Se expresan los valores CPA como un porcentaje de aquellos observados para IL-2 humana des- alanil-1 C125S (% Pro) . La proporción de % de proliferación de células NK en una proteína 0.1 nM con relación a la % de producción de TNF-a en proteína 1.0 nM es mostrada (% de CPA 0.1 : TNF-a) . Se expresan los valores de ensayo de citotoxicidad como una proporción de los valores observados para IL-2 humana des-alanil-1, C125S (:Pro) o para IL-2 humana C125S (Ala-Pro) .
T7A 78.2 95.3 150.9 115.6 1.5- 0.75 0.81 0.75 0.85 0.89 0.95 T7D 81.2 99.1 154.4 113.7 1.56 0.81 0.87 0.83 0.95 0.91 0.98 T7R 78.7 96.0 152.8 110.1 1.59 0.77 0.83 0.77 0.89 0.83 0.89 K8 76.7 93.5 153.8 112.3 1.65 0.75 0.81 0.79 0.90 0.84 0.90 K9A 79.7 97.3 159.6 115.1 1.64 0.79 0.86 0.82 0.93 0.89 0.95 K9D 77.8 94.6 159.4 114.5 1.69 0.88 0.95 0.87 0.99 0.89 0.95 K9R 78.1 95.4 151.6 113.2 1.59 0.77 0.83 0.77 0.88 0.86 0.92 K9S 74.1 90.4 169.0 133.6 1.87 0.92 0.99 0.81 0.92 0.84 0.90 K9V 79.7 97.4 162.1 113.0 1.67 1.01 1.09 0.85 0.97 0.84 0.90 K9W 77.9 94.9 156.2 115.0 1.65 0.7É 0.93 0.89 0.95 0.85 0.92 T10K 77.9 94.6 167.6 123.3 1.77 0.85 0.91 0.77 0.88 0.76 0.81 T10N 77.9 94.9 163.8 119.0 1.73 0.82 0.98 0.90 0.95 0.87 0.94 Q11A 73.8 89.9 153.4 116.8 1.71 0.78 0.85 0.84 0.96 0.86 0.92 Q11R 73.4 89.5 150.6 112.7 1.68 1.01 1.09 0.94 1.08 0.88 0.94 Q11T 76.9 93.7 152.3 105.1 1.63 1.05 1.13 0.91 1.04 0.94 1.00 H16E 64.8 98.9 153.8 92.2 1.56 1.21 1.36 0.84 0.98 1.06 1.15 H16D 38.2 72.4 131.2 97.4 1.56 0.75 1.08 0.91 1.16 0.96 1.02 L19D 42.6 0.7 140.9 97.6 1.56 0.85 1.08 0.81 1.00 0.92 0.99 L19E 45. í 88.4 130.8 93.5 1.56 0.90 1.13 0.94 1.12 1.07 1.19 I24 55.! 107.4 136.6 101.2 1.56 1.18 1.62 0.97 1.13 1.09 1.22 K32A 160.1 96.4 166.0 89.5 1.72 0.7É 1.06 0.83 1.05 0.96 1.00 K32 167.9 98.5 155.6 77.7 1.5E 0.63 0.76 0.79 0.91 0.92 0.99 P34E 161.9 96.2 176.4 105.6 1.83 0.82 1.12 0.92 1.15 0.99 1.02 P3 R 165.8 98.6 157.5 92.3 1.60 0.68 0.92 0.82 1.03 0.94 0.97 P34S 161.0 92.8 157.3 97.2 1.70 0.71 0.96 0.82 1.03 1.00 1.03 P34T 163.1 96.2 167.0 106.9 1.74 0.77 1.05 0.88 1.10 1.05 1.09 P34V 158.7 95.6 173.5 99.2 1.81 0.76 1.03 0.85 1.07 0.99 1.02 K35D 173.5 99.2 191.2 106.4 1.93 0.88 1.06 0.94 1.08 0.95 1.03 K35I 147.2 95.9 152.1 94.1 1.59 0.67 0.92 0.82 1.04 0.99 1.02 K35L 162.3 96.2 161.1 101.3 1.67 0.67 0.91 0.89 1.12 1.01 1.04 K35M 157.9 93.1 173.4 108.0 1.86 0.79 1.08 0.94 1.1E 1.06 1.09 35N 165.1 97.0 187.6 109.7 1.93 0.83 1.13 0.86 1.08 1.02 1.05 K35P 172.3 95. < 188.1 106.8 1.97 0.76 0.91 0.85 0.98 0.93 1.01 K35Q 182.0 100.3 179.9 109.9 1.79 0.76 0.91 0.86 0.99 0.97 1.05 K35T 179.2 99.8 170.5 112.9 1.71 0.65 0.84 0.79 0.97 0.97 1.03 L36A 157.1 94.7 181.3 97.7 1.91 0.65 0.89 0.80 1.01 0.82 0.85 36D 150.2 88.2 208.8 96.5 2.37 1.03 1.40 0.83 1.04 0.95 0.98 L36E 150.4 86.5 216.0 108.1 2.50 0.94 1.28 0.84 1.06 1.01 1.04 36F 153.2 90.2 188.3 104.9 2.09 0.84 1.14 0.77 0.97 0.94 0.97 36I 163.9 91.9 181.9 111.8 1.98 0.81 0.97 0.89 1.02 0.97 1.05 L36K 167.5 91.9 193.2 114.3 2.10 0.85 1.02 0.88 1.02 0.93 1.01 L36M 157.9 89.9 193.9 113.7 2.16 0.72 0.93 0.81 1.00 0.94 0.99 L36N 157.1 90.2 201.4 110.1 2.23 0.79 1.02 0.83 1.03 0.96 1.01 L36P 40.1 76.8 132.7 113.8 1.73 1.24 1.52 1.04 1.26 0.95 1.03 L36S 41.7 80.3 131.7 115.2 1.64 0.66 0.91 0.69 0.81 0.94 1.05 L36W 160.7 93.0 185.9 95.0 2.00 0.89 1.07 0.90 1.03 0.98 1.06 L36Y 170.3 95.6 177.6 96.3 1.86 0.93 1.13 0.96 1.11 0.95 1.03 R38G 109.5 95.4 150.7 91.3 1.5E 0.66 0.84 0.83 0.89 0.95 0.96 R38N 44.1 85.0 132.7 100. 1.56 1.03 1.2£ 0.94 1.12 0.94 1.05 R38P 45.8 135.8 101.3 1.53 1.17 1.44 0.87 1.05 0.91 0.99 R38S 43.4 83.7 136.3 100.0 1.63 0.95 1.17 0.96 1.15 0.90 0.97 40D 13. í 84.9 140.2 112.0 1.65 1.05 1.29 0.96 1.16 1.00 1.08 L40G 40.8 78.1 142.6 110.9 1.83 1.11 1.37 0.96 1.16 1.00 1.08 40N 46.3 89.5 135.6 110.0 1.52 0.85 1.17 0.65 0.77 0.96 1.08 L40S 45.1 36.7 135.1 105.0 1.56 0.96 1.33 0.71 0.83 0.89 1.00 T41E 110.8 96.7 175.9 99.9 1.82 0.96 1.16 0.92 1.03 1.05 1.06 T41G 113.5 99.2 158.7 104.7 1.60 0.84 0.96 0.83 0.91 0.96 0.94 F42A 101.3 96.4 168.4 168.8 1.75 0.76 0.91 0.74 0.80 0.87 0.88 K64D 131.1 91.9 152.5 109.4 1.66 0.75 0.94 0.91 1.02 0.98 1.13 K64E 134.5 94.4 154.9 109.5 1.64 0.53 0.66 0.76 0.85 0.88 0.92 K64Q 135.2 95.0 150.7 107.4 1.59 0.69 0.86 0.81 0.90 1.17 1.34 K64R 135.0 94.8 152.0 106.3 1.60 0.71 0.90 0.96 1.08 0.96 1.10 P65D 134.8 94.4 174.4 117.3 1.85 0.65 0.79 0.82 0.97 0.91 0.94 P65H 123.1 87.0 210.2 105.1 2.42 0.61 0.77 0.89 1.00 1.21 1.39 P65I 132.4 93.7 204.5 101.8 2.18 0.61 0.76 0.90 1.01 1.00 1.14 P65K 84.4 59.8 149.8 103.9 2.51 0.46 0.58 0.78 0.87 0.98 1.12 P65 102.9 72.4 175.7 104.2 2.43 0.38 0.47 0.63 0.71 0.83 0.87 P65Q 111.4 78.9 189.9 93.2 2.41 0.69 0.87 0.86 0.97 1.07 1.11 P65R 135.3 95.4 178.4 103.9 1.87 0.83 1.01 0.88 1.04 0.91 0.94 P65S 127.7 9.3 205.3 119.7 2.30 0.80 0.97 0.82 0.97 0.96 1.00 P65W 134.5 95.4 181.6 91.4 1.90 0.51 0.64 0.71 0.79 1.22 1.40 P65Y 129.6 91.9 194.9 99.9 2.12 0.60 0.75 0.81 0.91 1.28 1.47 L66A 137.0 97.0 141.8 103.9 1.46 0.87 1.09 0.97 1.08 1.24 1.43 L66F 135.1 95.4 157.9 105.8 1.66 0.70 0.88 0.84 0.94 0.94 0.98 E67A 128.5 91.1 168.6 98.2 1.85 0.68 0.83 0.75 0.89 0.82 0.84 72W 43.2 75.7 134.1 109.0 1.77 0.89 1.19 0.85 1.09 0.92 1.00 72T 50.7 137.0 108.9 1.54 0.76 1.02 0.90 1.15 0.98 1.07 L80F 54.3 95.2 130.8 107.2 1.37 0.85 1.15 0.92 1.10 0.99 1.06 80G 54.9 96.1 139.3 107.4 1.45 0.80 1.02 0.94 1.11 0.92 1.02 L80K 52.1 91.3 149.7 109.7 1.64 0.99 1.26 O.f 1.04 0.96 1.07 L80R 56.0 98.1 135.4 101.6 1.38 1.21 1.63 1.06 1.36 1.02 1.11 L80Y 52.9 100.5 130.7 111.4 1.30 0.78 1.12 0.76 0.98 0.98 1.03 V91A 47.5 89.7 136.1 119.7 1.52 0.83 1.19 0.90 1.16 1.02 1.08 V91E 40.6 77.0 135.6 96.7 1.76 0.84 1.06 0.84 1.03 0.93 1.01 V91F 41.5 78.9 134.8 101.9 1.71 1.00 1.27 0.92 1.14 1.01 1.09 V91G 36.3 68.5 133.7 104.4 1.95 0.83 1.06 0.94 1.15 0.93 1.00 V91Q 49.0 93.4 130.3 101.6 1.40 0.77 1.07 1.04 1.22 0.93 1.07 L94T 43.1 81.3 133.0 117.7 1.64 0.95 1.20 0.96 1.1E 1.02 1.10 L94Y 37.5 71.1 137.4 128.1 1.93 0.62 0.87 0.80 0.94 0.88 1.01 E95D 38.2 72.5 134.3 125.1 1.87 0.70 0.98 0.87 1.02 0.89 1.02 E95G 41.5 78.4 137.7 113.0 1.76 0.82 1.15 0.90 1.06 0.91 1.05 N119Q 10.5 27.4 323.6 618.3 11.81 0.81 1.04 0.58 0.65 0.78 0.83 Y107H 37.8 71.3 144.3 104.2 2.02 0.79 1.13 0.89 1.15 0.95 1.00 Y107K 33.9 64.1 131.5 112.0 2.05 0.78 0.99 0.80 0.98 0.93 1.00 Y107R 31.0 138.5 121.6 2.36 0.67 0.94 0.88 1.04 0.83 0.95 T123S 50.0 94.1 133.0 .120.9 1.41 0.83 1.19 0.86 1.10 1.00 1.06 T123C 50.6 95.2 142.5 106.7 1.50 0.95 1.21 0.98 | 1.21 1.01 1.09 Se realiza un análisis secundario para preparaciones de muteina de IL-2 cuantificadas en < 0.066 ng/µl. Este análisis identifica 4 mutaciones adicionales, todas que ocurran en posiciones clave 35, 40, y 65, en la cual la muteina induce proliferación de células NK mayor a 150% de aquella mediada por la muteina de IL-2 humana des- alanil-1 C125S (es decir, presente en IL-2 Proleukin®) en 0.1 nM, e induce producción de TNF-a en"" 1 nM que es < 100% de aquella mediada por una cantidad similar de muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S (es decir, 1 nM) . Este análisis secundario también identifica 7 mutaciones adicionales, todas que ocurren en posiciones clave 36, 64 y 64, "ya que producen incrementos ligeros en producción de TNF-a en 1 nM (aproximadamente 101-109% de aquella observada con una cantidad similar de la molécula de referencia IL-2 humana des-alanil-1, C125S) mientras que todavía induce proliferación de células NK mayor a 150% de aquella mediada por la muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S en 0.1 nM. Pruducción de TNF-alfa. Ver la Tabla 4. Tabla 4. Muteinas de IL-2 adicionales identificadas usando ensayo de proliferación de células NK-92 (CPA) como el criterio de selección primario. La producción de TNF-a total (pg/ml) en 1.0 nM y producción de TNF-a como un porcentaje de aquella observada para IL-2 humana des-alanil-1 C125S (% Pro) . Se expresan los valores CPA como un porcentaje de aquellos observados para IL-2 humana des-alanil-1, C125S (% Pro) . La proporción de <% de proliferación de células NK en proteía 0.1 nM con relación a aquella producción de % de TNF- a en una proteína 1.0 nM es mostrada (% de CPA 0.1: TNF-a). Los valores de ensayo de citotoxicidad son expresados como una proporción de los valores observados para IL-2 humana des-alanil-1, C125S ( : Pro ) o para IL-2 humana C125S (: Ala- Pro) .
Ejemplo 3: Identificación de muteinas de IL-2 en base a la producción de TNF-a reducida Se seleccionan las muteinas que producen menos de 87% de la producción de TNF-a de muteina de IL-2 humana dés- alanil-1, C125S (es decir, muteina presente en Proleukin® IL- 2) o C125S (designada Ala-Pro 11-2), cada una en 1 nM, y que mantiene (por lo menos 96.4%) o incrementa la proliferación de células NK como se compara con IL-2 humana des-alanil-1, C125S en tanto 0.1 nM y 1 nM, y que mantiene (por lo menos 79.2%) de proliferación de células NK con relación a la muteina de IL-2 humana C125S en 0.1 nM (datos no mostrados. Ver la Tabla 5. Tabla 5 : Muteinas de IL-2 identificadas usando los siguientes criterios de selección: producción de TNF-a <87% de aquella observada para IL-2 humana des-alanil-1, • C125S (Pro) en proliferación de células 1.0 nM y Nk en dos concentraciones (0.1 y 1.0 nM) mantenidas o mejoradas con relación a aquella observada para IL-2 humana des-alanil-1, C125S (Pro) . La producción de TNF-a total (pg/ml) en 1.0 nM y producción de TNF-a como un porcentaje de aquella observada para IL-2 humana des-alanil-1 C125S (%Pro) o IL-2 humana C125S (% Ala-Pro) son mostradas. Se expresan los valores CPA co o un porcentaje de aquel observado para IL-2 humana des- alanil-1, C125S (%Pro) . La proporción- de % de proliferación de células NK en 0.1 nM de proteína con relación a % de producción de TNF-a en 1.0 nM de proteína es mostrada (% CPA 0.1: TNF-a) . Los valores de ensayo de- citotoxicidad son expresados como una proporción de los valores observados para la'IL-2 humana des-alanil-1 , C125S (-.Pro) o para IL-2 humana C125S ( : la-Pro) .
Estos criterios de tamizado se ajustan para capturar aquellas muteinas que cumplen con los criterios para la producción de TNF-a menor a 81% de aquella simulada por IL-2 humana des-alanil-1, C125S o C125S en cada una 1 nM, y aquella mantenida o incrementada proliferación de células NK (por lo menos 95%) con relación a IL-2 humana des-alanil-1, C125S en 1 nM (es decir, solamente en una concentración sencilla de la muteina de IL-2 de referencia) . Aquellos criterios de tamizado identifican muteinas adicionales que implican cambios de residuos en las posiciones 20, 78, 79, 80, 81, 88 y 126. Ver la Tabla 6. Tabla 6. Muteinas de IL-2 identificadas usando los siguientes criterios de selección: producción de TNF-a <81% de aquella observada para la IL-2 humana des-alanil-1, C125S (Pro), cada una en 1.0 nM, y proliferación de células Nk en 1.0 nM mantenida o mejorada con relación a la muteina de IL-2 humana des-alanil-1, C125S (Pro) . La producción de TNF-a total (pg/ml) en 1.0 nM y la producción de TNF-a como unporcentaj e" de aquel observada para IL-2 humana des-alanil- 1, C125S (%Pro) o IL-2 humana C125S (% Ala-Pro) son mostradas. Los valores CPA son expresados como un porcentaje de aquel observado para IL-2 humana des-alanil-1 C125S (%Pro) . La proporción de % de proliferación de células Nk en 0.1 nM de proteina con relación al % de producción de TNF-a - en 1.0 nM de proteína se muestra (%CPA 0.1:TNF-a). Se expresan los valores de ensayo de citotoxicidad como una proporción de los valores observados para IL-2 humana des- alanil-1, C125S (:Pro) o para IL-2 humana C125S (Ala-Pro).
F78 51.3 74.0 64.3 59.1 117.6 0.80 0.45 0.57 0.61 0.75 0.73 0.79 H79F 54 8 79.0 68.5 53.5 100.5 0.68 0.50 0.85 0.57 0.96 0.81 0.88 H79M 51 2 73.9 64.2 71.6 126.9 0.97 0.60 0.74 0.80 0.90 0. 0.90 H79N 49 0 70.5 61.2 77.2 142.1 1.10 0.62 0.77 0.73 0.81 0.89 0.94 P H79P 41.9 60.4 52.4 60.7 142.0 1.00 0.44 0.55 0.63 0.7 0.73 0.79 H79Q 46.3 66.7 57.9 70.5 133.6 1.06 0.42 0.53 0.59 0.72 0.76 0.82 H79S 41.2 59.5 51.6 59.9 127.6 1.01 0.46 0.58 0.64 0.79 0.81 0.88 H79V 42.2 60.8 52.7 52.0 118.3 0.85 0.34 0.40 0.60 0.73 0.80 0.87 L80E 35.7 51.3 44.5 56.6 117.6 1.10 0.43 0.54 0.72 0.80 0.81 0.85 L80F 40.4 58.1 50.4 83.2 137.0 1.43 0.60 0.75 0.84 0.95 1.00 1.05- L80Y 50.6 72.8 63.1 89.1 110.1 1.23 0.49 0.61 0.66 0.81 0.81 0.87 R81E 46.7 67.3 58.4 66.2 124.3 0.98 0.50 0.58 0.66 0.79 0.82 0.89 R81L 40.4 58.2 50.5 63.7 107.0 1.10 0.60 0.75 0.70 0.79 0.83 0.87 R81M 42.8 61.7 53.5 70.5 107.8 1.14 0.59 0.73 0.65 0.72 0.88 0.82 R81N 36.2 52.2 45.3 67.3 100.0 1.29 0.41 0.52 0.57 0.70 0.70 0.76 R81P 44.6 64.3 55.8 80.7 113.7 1.26 0.47 0.60 0.67 0.82 0.75 0.81 R81T 49.5 71.3 61.9 80.4 128.3 1.13 0.54 0.63 0.68 0.82 0.83 0.90 N88H 30.4 38.7 36.9 56.3 97.9 1.45 0.38 0.43 0.59 0.62 0.73 0.87 Q126I 45.9 I 51.9 I 50.0 | 78.2 | 95.9 1.51 0.60 | 0.76 | 0.70 | 0.85 | 0.86 | 0.95 Se realiza un análisis secundario para preparaciones de muteina de IL-2 cua?tificado en < 0.066 ng/µl. Este análisis identifica muteínas de IL-2 adicionales que también exhiben producción de TNF-alfa menor a 96.2% de aquella exhibida por la muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S, cada una en 1 nM, y la cual mantiene proliferación de células NK por lo menos 100% de aquella inducida por este molécula de IL-2 de referencia cuando está en concentración de 1 nM. Ver la Tabla 7. Tabla 7. Muteinas de IL-2 identificadas usando los siguientes criterios de selección: producción de TNF-a <96.2% de aquella observada para IL-2 humana des-alanill, C125S (Pro), cada una en 1.0 nM y proliferación de células NK en 1.0 nM mantenida o mejorada con relación a la IL-2 humana des-alanil-1 C125S (Pro) . La producción de TNE-a total (pg/ml) en 1.0 nM y producción de TNF-a como un porcentaje de aquel observado para. IL-2 humana des-alanil-1, C125S (%Pro) o C125S (%Ala-Pro) se muestra. Se expresan los valores CPA como un porcentaje de aquel observado para IL-2 humana des-alanil- 1, C125S (%Pro) . Se muestra la proporción de % de proliferación de células NK en 0.1 nM de proteína con relación a % de producción de TNF-a en 1.0 nM de proteína (%CPA 0.1:TNF-a). Se expresan los valores de ensayo de citotoxicidad como una proporción de los valores observados para IL-2 humana des-alanil-1, C125S (:Pro) o para IL-2 humana C125S (:Ala-Pro).
Ejemplo 4: Identificación de muteinas de IL-2 con citotoxicidad mediada por NK incrementada Se seleccionan las muteínas que incrementan citotoxicidad mediada por NK incrementada contra células K562 por lo menos 140% sobre aquella de la muteina de IL-2 humana C125S (es decir, Ala-Pro) y por lo menos 115% sobre aquella de muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S (es decir, muteina presente en IL-2 Proleukin®) cuando se ensaya en ya sea 0.1 nM ó 1.0 nM, así como también producir menos de 100% de la producción de TNF-a exhibida por ya sea dos de estas muteinas de IL-2 de refrencia cuando se ensayan en 1 nM, y mantiene la proliferación de células NK (por lo menos 100%) con relación a estas dos muteinas de IL-2 de referencia cuando se ensaya en 0.1 nM ó 1 nM. Ver la Tabla 8.
Tabla 8. Muteina de IL-2 muteinas de citotoxicicad naturales identificadas usando el ensayo de citotoxicidad NK3.3 (objetivos K562). La producción de TNF-a total (pg/ml) en 1.0 nM y producción de TNF-a como un porcentaje de aquel observado para IL-2 humana des-alanil-1, C125S (%Pro) ó IL-2 humana C125S (%Ala-Pro) se muestran. Los valores de CPA son expresados como un porcentaje de aquel observado para IL-2 humana des-alanil-1, C125S (%Pro) o IL-2 humana C125S (%Ala-Pro) en 0.1 nM ó 1 nM. La proporción de % de proliferación de células NK en 0.1 nM de proteína con relación a % de producción de TNF-a en 0.1 nM de proteína como se muestra para el Pro (%CPA:TNF-a(PRO) ) y Ala-Pro (%CPA:TNF-a(Ala-Pro) ) . Los valores de ensayo de citotoxicidad son expresados como una proporción de los valores observados para 1-2 humana des-alanil-1, C125S (:Pro) o para IL-2 humana C125S (^la-Pro) ) .
C? 10 15 Ejemplo 6: Identificación de las muteinas de IL-2 con actividad de ADCC incrementada Las muteinas se seleccionan entonces en base a los criterios de tener actividad de ADCC mediada por células NK por lo menos 115% de aquella de la muteina de IL-2 humana C125S (Ala-Pro) y por lo menos 105% de aquella de muteina de IL-2 humana, des-alanil-1, C125S (Pro) , y que produce menos de 100% de TNF-a de tanto las muteinas de IL-2 de referencia, cada una en 1 nM, y mantiene proliferación de células NK (por lo menos 100%) comparada con ambas de las muteinas de IL-2 de referencia, cada una en 0.1 nM. Ver la Tabla 10.
Tabla 10. Los aciertos de citotoxicidad celular dependiente a anticuerpo de muteina de IL-2 (ADCC) identificados usando ensayo de citotoxicidad NK3.3 (objetivos Daudi recubiertos con rituximab) . Se muestra la producción total de TNF-a (pg/ml) y producción de TNF-a como un porcentaje de aquel observado para IL-2 humana des-alanil-1 C125S (%Por) o IL-2 humana C125s (%Ala-Pro) . Los valores CPA son expresados como un porcentaje de aquel observado para IL-2 humana des-alanil-1, C125S (%Pro) . La proporción de % de proliferación de células NK en 0.1 nm de proteína con relación al % de producción de TNF-a en 1.0 nM de proteína se muestra (%CPA: TNF-a) . Los valores de ensayo de citotoxicidad son expresados como una proporción de los valores observados para IL-2 humana des-alanil-1, C125S (:Pro) o para IL-2 humana C125S (:Ala-Pro). 10 15 Ej emplo 7 : Selección de muteinas que soportan sobrevivencia de células NK incrementada Se tamizan las muteinas por su capacidad para incrementar la sobrevivencia de células NK como se compara con la muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S . Ver la Tabla 11 . Tabla 11 . Aciertos positivos de sobrevivencia de células de muteina de IL-2 identificados usando el ensayo de inducción NK3 .3 pAKT .
Ejemplo 8: Selección de muteinas de IL-2 humanas con el perfil terapéutico en su mayoría mejorado Usando los criterios de selección descritos anteriormente, veinticinco muteinas de IL-2 humanas son identificadas como que son de interés particular. Estas muteinas son mostradas en la Tabla 12.
Tabla 12. 25 muteinas de IL-2 humanas superiores identificadas en proceso de 10 15 m >n « »n > Después de la selección de las muteinas en base a los criterios anteriores, se dividen además las muteinas en grupos que satisfacen los siguientes criterios de selección: 1) Las muteinas que exhiben producción de TNF-a <80% de aquella observada para la muteina de IL-2 humana C125S y que: a) mantiene la proliferación en 1 nM, pero con relación a la muteina de IL-2 de referencia, la actividad proliferativa cae en concentraciones menores, lo cual incluye -la muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S o la muteina de IL-2 humana C125S además que comprende la mutación de F42E o V91D (ver la Tabla 13) ; o, b) exhibir disminuciones significativas en la producción de TNF-a en 1 nM, y donde se mantiene la actividad proliferativa hacia debajo de 50 pM, lo cual incluye la muteina de IL-2 humana des-alanil-1, C125S o la muteina de IL-2 humana C125S que además comprende la mutación L72N (ver la Tabla 14) ; 2) Muteinas que aumentan la proliferación de NK- 92 > 200% comparada con la muteina de IL-2 humana C125S en una o más concentraciones probadas (5 pM, 20 pM, 50 pM, 100 pM, y 1000 pM) sin impacto dañino en la producción de TNF-a (<100% de producción de TNF-a con relación a aquélla observada para la muteina de IL-2 de referencia en una concentración de 100 pM o 1 nM) . Adicionalmente, los criterios de selección incluyen un índice de proliferación mayor a 150% de aquel observado para la muteina de IL-2 de referencia, una IL-2 humana C125S (Ala-Pro) por al menos 2 concentraciones probadas: este grupo incluye muteina de IL-2 humana des-alanil-1, C125S o la muteina de IL-2 humana C125S que además comprende la mutación L36D o L40D (ver la Tabla 15) ; y, 3) Muteinas que muestran actividad proliferativa incrementada y producción de TNF-a disminuida, donde la producción de TNF-a es <75% de aquella observada para la muteina de IL-2 humana C125S cuando se prueba en 1 nM, y la proliferación de células NK es >150% de aquella observada para la muteina de IL-2 humana C125S en cualquier concentración probada (5 pM, 20 pM, 50 pM, 100 pM, y 1000 pM) , este grupo incluye la muteina de IL-2 humana des-alanil-1 , C125S o la muteina de IL-2 humana C125S que además comprende la mutación L19D, F42R o E61R (ver la Tabla 16) .
Tabla 13. Las muteinas de IL-2 han reducido bastante la producción de TNF-a .Tabla 14. Muteinas de IL-2 que han reducido bastante la producción de TNF-a con O proliferación de NK mantenida en 50 pM. 10 15 Tabla 15. Muteina de IL-2 que induce fuerte proliferación de células NK sin impacto dañino en producción de TNF-a Tabla 16. Muteina de IL-2 identificada dentro de la proliferación de NK incrementada en serie bifuncional- y TNF-a disminuida con relación a muteina de IL-2 humana C125S " 10 15 Ejemplo 9 : Muteinas de IL-2 humana mantienen proliferación de células T Un punto final funcional secundario que sirve como una base para seleccionar mutaciones benéficas es mantener o mejorar la proliferación de células T por la línea celular T Kit225 humana con aquella observada con Ala-Pro IL-2 (es decir, muteina de IL-2 humana C25S) o Proleukin® (es decir, muteina de IL-2 humana des-alanil-1, C125S) . Un subgrupo de las 168 muteínas mostradas en la Tabla 1 anterior se selecciona para prueba por este punto final funcional.' Los resultados son mostrados en la Tabla 17 posterior.- *Y-Pro=IL-2 des-alanil-1 , C125S expresada en sistema de levadura¡ todas las muteinas en este ensayo expresadas en vector de levadura Definición de "mantener" la proliferación de células T es +/- 20% de los controles de IL-2 Ej emplo 10 : Identi f icación de mutaciones de IL-2 benéf icas que reducen la producción de citocina pro-inf lamatoria mientras que manti enen o incrementan l os nivel es de proli f eración y citotoxicdad en células mononucl eares de s angre peri f éri ca humana normal . A partir de la serie de substituciones de aminoácidas sencillas descritas anteriormente, las muteinas de IL-2 son seleccionadas para una expresión/purificación de escala pequeña como se indica en la Tabla 18 . Estas muteinas de IL-2 son probadas para su capacidad de generar un perfil funcional similar de capacidad de tolerancia incrementada y actividad mantenida en células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) aisladas de varios donadores de sangre humana normal , como se compara con los controles de IL-2 relevante (muteina de IL-2 humana des-alanil-1 C125S (presente en Proleukin®) y muteina de IL-2 humana C125S expresada en levadura (designada Y-Pro en los datos en la presente) . Específicamente, PBMC humana derivada de un panel de donadores humanos normales son estimuladas con la muteina de IL-2 de interés, y se ensayan para proliferación y producción de citocina pro-inflamatoria (TNF-a) , así como también la capacidad para matar objetivos de células tumorales por citotoxicidad natural/espontánea (NK) , muerte activada por linfocina (LAK) , o citotoxicidad dependiente a anticuerpo (ADCC) . Tabla 18. Se tamizan muteinas de IL-2 que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) o IL-2 humana des-alanil-1, C125S (SEQ ID NO: 8) con la siguiente substitución adicional para actividad en PBMC humana1. } -"-Muteinas de IL-2 identificadas por : posición de • aminoácidos con relación a la IL-2 humana madura de SEQ ID NO : 4 y substitución de aminoácidos en esa posición . Se usan los siguientes puntos finales funcionales primarios : 1 ) producción de citocina pro-inflamatoria reducida (TNF-a) por. PBMC estimulada con la muteina de IL-2 como se compara con el control de muteina de IL-2 humana relevante. 2) Proliferación inducida por IL-2 mantenida o mejorada en PBMC humana sin un incremento en la producción de citocina pro-inflamatoria como se compara con el control de muteina de IL-2 humana relevante. 3) La muerte citolítica mediada por NK, LAK y ADCC, mantenida o mejorada por PBMC humana estimulada in vitro con muteina de IL-2 como se compara con el control de muteina de IL-2 humana relevante. Descripciones de ensayo Proliferación de combinación/Procedimiento de ensayo de producción de citocina pro-inflamatoria Ante exposición a IL-2, las PBMC humanas proliferan y secretan citocinas en una forma dependiente a dosis. Para maximizar la salida y eficiencia de datos, se diseña un ensayo de combinación para evaluar los niveles de proliferación y producción de citocina después de 72 horas de estimulación con la muteina de IL-2 de referencia o la muteina de IL-2 humana de interés. La fijación de ensayo implica aislamiento de PBMC por separación de gradiente de densidad (tubos Vacutainer ACDA CPT) a partir de una o más donadores humanos normales . En las placas . tratadas con cultivo de tejido de 96 pozos, las 200,000 células por pozo son incubadas con varias concentraciones de IL-2 (0.039 nM - 10 nM) o no IL-2 como un control negativo en medio RPMI completo (RPMI, suero AB humano inactivado por calor al 10%, HEPES 25 mM, glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina/fungizona) en 37°C, C02 al 7%. Después de 66 horas de incubación, una alícuota de sobrenadante de cultivo celular se remueve y se congela para detección de citocina en un tiempo posterior. Las células son impulsadas con 1 µCi3H-timidina por 6 horas después se cosechan' para determinar niveles de incorporación de nucleótidos (Reactor de placa de Wallac Trilux Microbeta) como una medición de proliferación celular. Los equipos ELISA comercialmente disponibles (BioSource International) son usados para detectar niveles de TNF-a en los sobrenadantes de cultivo celular por pautas del fabricante. Repetir el ensayo para un panel completo de seis donadores separados proporciona una caracterización de respuestas proliferativas y de citocina representativas a IL-2 en una "población normal" . Análisis de datos Se colocan en placas las muestras PBMC por duplicado en placas de ensayo separadas para evaluar la reproducibilidad. Se analizan los datos de proliferación por substraer proliferación antecedente (PBMC + no IL-2) y se calcula un medio de muestras de duplicado. Se derivan los datos de citocina a partir de sobrenadantes de cultivo celular removidos a partir de pozos de ensanyo los cuales contienen PBMC y se agrupan para obtener el nivel de citocina promedio en la fijación duplicada. Los niveles de TNF-a son cuantificados en pg/ml, en base a la curva estándar de TNF-a purificado contenido en el equipo de ELISA. Los datos son además compilados para el panel de seis donadores humanos normales como se indica en el esquemático mostrado en la Figura 1. Ensayo de citotoxicidad (NK/LAK/ADCC) En este ensayo, las PBMC son separadas a partir de sangre entera usando centrifugación de gradiente de densidad. Se estimulan las PBMC por 3 días en la presencia de 10 nM de control de IL-2 o muteina de IL-2 de interés, para generar la actividad de ALKJ como se practica generalmente en el estado actual de la técnica (ver por ejemplo Isolation of Human NK Cells and Generatión of LAK activity IN: Current Protocols in Immunology; 1996 John Wiley & Sons, Inc.). La población celular resultante contiene "células efectoras", las cuales pueden ser clasificadas como NK o LAK, y pueden matar objetivos de células tumorales K562 y Daudi, respectivamente. Estas células efecotras puede también mediar ADCC, donde las células efectoras reconcen la porción Fe de un anticuerpo específico (en este caso Rituxan®) que se enlaza a las células objetivo Daudi. El ensayo implica la coincubación de células efectoras con células objetivas etiquetadas con calceina AM en varios efectores para células objetivo (proporciones E:T) por 4 horas. La cantidad de actividad citotóxica está relacionada con la detección de calcein aAM en el sobrenadante de cultivo. Se expresa la cuantificación como un por ciento de lisis específico en cada proporción E:T, en base a la determinación de controles de liberación espontánea y máxima. En resumen, el ensayo examina las siguientes actividades biiológicas : Análisis de datos Se obtienen los datos a partir del fluorí etro y se expresan en unidades de fluorescencia relativa (rfu) . Los controles incluyen células objetivo etiquetadas solas (min) y las células objetivo etiquetadas con Tritón X-100 al 1% final como una medición de 100% de lisis (maxi) . La proporción de por - ciento min a max es calculada usando la siguiente ecuación como una medición de validez de ensayo (invalidez de ensayo si>30%) : %min a max=100 X (rfu de liberación espontánea media) / (rfu de liberación máxima media) Una vez que el ensayo es considerado válido, la desviación media y estándar para puntos de muestra por triplicado se calcula, seguido por el por ciento de lisis específica a partir de la media de puntos por triplicado usando la siguiente ecuación: %lisis=100x (rfu experimental media- rfu de liberación espontánea media) / (rfu de liberación máxima media - rfu de liberación espontánea media) Se reportan los datos como % de lisis específica; además la proporción de muteina de IL-2 a control de IL-2 relevante se usa para determinar si se mantiene la actividad citotóxica con relación a la IL-2 de control en una población mixta de donadores de PBMC humana. Resultados Se identifican cinco mutaciones de IL-2 benéficas que reducen la producción de citocina pro-inflamatoria mientras que mantienen o incrementan los niveles de proliferación y citotoxicidad en PBMC humana normal. Para el grupo de datos presentados posteriormente, se prueban las muteinas de IL-2 junto con el control relevante, es decir, IL-2 humana des-alanil-1, C125S expresada y purificada en el mismo sistema de levadura (Designado Y-Pro) . Inicialmente las muteinas de IL-2 son probadas en el ensayo de producción de proliferación combinada/citocina pro-inflamatoria sobre una curva de respuesta de dosis (30 pM-10 nM) en dos fijaciones de ensayo independientes, cada uno con tres PBMC de donadores de sangre normales probadas por duplicado. Los datos de análisis incluyen perfiles de donadores individuales, media _+ desviación estándar, análisis de diferencias a partir de controles de IL-2 internas, y normalización de producción de citocina (pg/ml) a proliferación (cpm) para derivar niveles relativos de citocina producida por célula. Finalmente, se calcula el por ciento de disminución en producción de TNF-a a partir del control de IL-2. Las muteinas de IL-2 con una disminución en la producción de TNF-a mayor a 25% en 10,000 pM son consideradas benéficas si se mantienen los niveles de proliferación. La Tabla 19 resume el por ciento de disminución en la producción de TNF-a observada para las 5 muteinas de IL-2 benéficas, lo cual tiene la substitución de aminoácidos adicionales indicada en la estructura principal de muteina de IL-2 humana des-alanil-1, C125S. La Figura 2-6 muestra la proliferación y la producción de TNF-a mediada por las muteinas F42E, L94Y, E95D, E95G y Y107R, respectivamente, en la PBMC humana. Tabla 1 . Por ciento de disminución en la producción de TNF-a a partir del control de IL-2 ID 625pM 2500pM lOOOpM 1 los valores representan la disminución en por ciento promedio a partir del control Y-Pro a partir del panel de 6 donadores de PBMC humana normal . Los datos de citocina son normalizados para proliferación. Una vez que se identifican las muteinas de IL-2 beneficias, es importante determinar si la PBMC estimulada con la muteina de IL-2 retienen la capacidad para lisar objetivos de células tumorales por actividad de NNK, LAK y ADCC. Como se indica en la Figura 7, no hay diferencia observada entre la muteina de IL-2 y el control de IL-2 relevante en la capacidad para lisar objetivos tumorales por actividad de LAK y DAC. Ejemplo 11: Evaluación de eficacia de muteinas de IL-2 usando un modelo de melanoma B16F10. Diseño Experimental Se prueban las muteinas de IL-2 Y107R, F42E y E95D en un modelo de melanoma B16F10 sensible a IL-2. Los objetivos son para evaluar la respuesta a dosis,, determinar la dosis efectiva mínima (MED) y demostrar la eficacia en términos de inhibición de metástasis pulmonar. Los ratones C57B/6 son implantados intravenosamente con células de melanoma B16F10 (50,000 células/ratón) en un día del estudio. Los ratones tienen 4-6 semanas de edad y son aleatorios en grupos de diez en base al peso corporal . Todos los grupos tienen pesos corporales promedio dentro de 20% entre sí. Los tratamientos son administrados a ratones en el día dos y consisten de IL-2 en la forma de RL-2 Proleukin® (grado de investigación IL-2 a partir de E. coli), L2-7001® (una formulación monómerica de IL-2) , o una muteina de IL-2, ya sea E95D o Y107R. Dos regímenes de dosis son probados: 1) un régimen "Sleijfer" modificado en base al protocolo descrito por Sleijfer et al. (J. Clin. Oncol.. 10(7):1119- 1123, 1992), que consiste de dos semanas de tratamiento con IL-2 administrada subcutáneamente una vez al día por 5 días en una semana (5 días con/5 días sin, con diseño de dosificación y 2) un régimen en el cual se administra tres veces semanalmente. Se evalúa la eficacia y tolerancia de tratamiento en base a la determinación del número de metástasis de pulmón ( en los días 18-21, cegados), observación clínica y medición del peso corporal como un indicador de tolerabilidad de fármaco. Resultados Se administran las muteinas Proleukin®, RL-2, L2-7001® y de IL-2, E95D y Y107R tres veces semanalmente intravenosamente en modelos de metástasis de pulmón de melanoma B16F10 de murino en ratones C57B/6 (Figuras 8 y 9) .
La dosis efectiva mínima (MED) de los agentes de prueba IL-2 (dosis que es estadísticamente significativa contra el vehículo farmacéutico) son como a continuación: Proleukin® (3.3 mg/kg), L2-7001 ® (3.3 mg/kg), RL-2 (3.3 mg/kg), E95D (5.7 mg/kg), y Y107R (5.7 mg/kg). Las ED50 (50% de inhibición de metástasis comparada con el vehículo farmacéutico) de agentes de prueba 2.4 mg/kg para L2-7001®, 4.8 mg/kg para E95D, y 6.1 mg/kg para Y107R. Y107R y E95D dosificados en 5.7 mg/kg (3 veces por semana) producen inhibición equivalente de metástasis comparada con los marcadores de laboratorio de IL-2 (Proleukin®, L2-7001) . La dosis tolerada máxima (MTD) no se alcanza para las muteinas o L2-7001®. Todas las dosis de agentes de prueba son bien toleradas, y los ratones exhiben pesos corporales normales en toda la duración del estudio (Figura 9) . Ver la Tabla 20 posterior, la cual proporciona un resumen de resultados de eficacia. Tabla 20. Eficacia de proleukin, RL-2, RL-2, L2-7001, y muteinas de IL-2 E95D y Y107R dosificados tres veces semanalmente en el modelo de metástasis de pulmón el melanoma B16F10 de murino.
*ANOVA/prueba de Student-Newman-Keul Los agentes de IL-2 son entonces probados usando el régimen de dosis "Sleijfer" (5 días si/ 2 días no/5 días si) . E95D y Y104R en todas las dosis (3.3, 5.7 y 8.1 mg/kg) muestran reducción significativa en el número promedio de metástasis de pulmón comparado con los ratones tratado con vehículo o no tratados (p<0.001 ANOVA/prueba de Student-Newman-Keul) , y la eficacia es equivalente a los marcadores de laboratorio de IL-2 (Proleukin®, L2-7001® ) (Figuras 10 y 11). Y107R en 3.3 y 8.1 mg/kg demostró 2/100 y 1/10 de una respuesta completa (CR por sus siglas en inglés) , respectivamente (Tabla 21) , donde una CR es definida como la desaparición completa de tumores (incluyendo lesiones microscópicas) en el pulmón de ratón. Proleukin® en 5.7 mg/kg y RL-2 en 8.1 mg/kg y L2-7001® en 3.3 , 5.7 y ' 8.1 mg/kg reduce metástasis de pulmón significativamente comparada con los ratones tratados con vehículo o no tratados (p<0.001 ANOVA/prueba de Student-Newman-Keul) . . La dosis efectiva mínima es 3.3 mg/kg para L2-7001, E95D y Y107R y la ED50 computarizada de E95D, Y107R y L2-7001 son <3.3 mg/kg. Todas las dosis de agentes de prueba hasta 8.1 mg/kg son bien toleradas, y los ratones exhiben pesos corporales normales. Se logra la MTD (Figura 11) . Ver la Tabla 21 posterior, la cual proporciona un resumen de resultados de eficacia. Tabla 21. Eficacia de Proleukin, RL-2, L2-7001 y muteinas de IL-2 E95D y Y104R dosificada de acuerdo al- protocolo de "Sleijfer" (5 días si/2 días no/5 días si) en el modelo de metástasis de pulmón de melanoma B16F10 de murino.
ANOVA/prueba de Student-Newman-Keul En un estudio de repetición, las eficacias de Proleukin®, L2-7001®, Y104R y en F42E de adición se evalúan usando el régimen de dosis "Sleifjer" (5 días si/2 días no/5 días si) en el modelo de metástasis de pulmón de melanoma B16F10. Y107R, F42E, L2-7001 en 5.7 mg/kg y 10.5 mg/kg y Proleukin® en 5.7 mg/kg demuestra una reducción significativa en el número de metástasis de pulmón comparada con los ratones tratados con vehículo o no tratados (p<0.05 ANOVA/Student-Newman-Keul) (Figuras 12 y 13) . La dosis efectiva mínima es 5.7 mg/kg para L-2-7001, F42E y Y104R, y las ED50 computarizadas son 6.47 mg/kg para F42E, 6.33 mg/kg para Y107R y 5.37 mg/kg para L2-7001. En dosis similares, no hay diferencia en la eficacia entre los agentes de prueba (Proleukin®, L2-7001®, F42E y Y107R) , indicando que las muteinas de IL-2 demuestran actividad equivalente comparada con marcadores de laboratorio, Proleukin® y L2-7001®. Las dosis de 5.7 mg/kg de Proleukin® y 10.5 mg/kg L2-7001® exhiben pérdida de peso corporal de ratón y se identifican como dosis MTD de cada agente, respectivamente (Figura 13). No se observa pérdida de peso corporal para muteínas de Y107R y F42E en todas las dosis probadas (es decir, muteina de IL-2 no se logra MTD) , indicando que las muteinas son mejor toleradas que las marcas de laboratorio de IL-2 (Figura 13) . Ver la Tabla 22 posterior, la cual proporciona un resumen de resultados de eficacia. Tabla 22. Eficacia de Proleukin, RL-2, L2-7001, y muteinas de IL-2 E95d y Y107R dosificados de acuerdo con el protocolo de "Sleijfer" (5 días si/2 días no/5 días si) en el modelo de metástatis de pulmón de melanoma B16F10 de murino en estudio repetido.
ANOVA/prueba de Student-Newmans-Keul Conclusiones 1. Muteinas de IL-2 E95D, Y107R y F42E retienen actividad antitumoral in vivo. 2. La eficacia de las muteinas de IL-2 E95D, Y107R y F42E en el modelo de metástasis de melanoma B16 clásico es equivalente a los marcadores de laboratorio Proleukin® ó L2-7001® en dosis similares cuando se administran tres veces semanalmente o de acuerdo al régimen "Sleijfer". 3. Las muteinas de IL-2 Y107R y F42E son mejor toleradas que los marcadores de laboratorio de IL-2 Proleukin® y L2-7001®, retienen actividad de IL-2, y demuestran un índice terapéutico superior. 4. Dosis toleradas máximas superiores (MTD) pueden ser logradas con las muteinas de IL-2 Y107R y F42E y pueden permitir mayor intensificación de dosis en regímenes clínicos, lo cual puede traducirse en eficacia mejorada. Ejemplo 12: Actividad antitumoral de muteinas en modelos de Xenoinjerto de linfoma No de Hodgkin. Diseño experimental Los objetivos de estos estudios son para evaluar la actividad de Proleukin® (IL-2), L2-7001®, E95D y Y107R como agentes sencillos o en combinación con el anticuerpo monoclonal rituximab (Rituxan®; IDEC-C2B8; IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California) en NK (o células inmunoefectoras) /modelos de eficacia mediada por ADCC (Figuras 14-20) . Se evalúa la eficacia de las muteinas de IL-2 en dos modelos de linfoma no de Hodgkin distinta (NHL) , es decir, modelo Namalwa (NHL de alto grado) el cual es sensible a IL-2 y el modelo de Daudi ( NHL grado bajo, CD20+) ,. el cual exhibe actividad marginal con IL-2; pero da respuesta a rituximab. Resultados Los ratones BALB/c desnudos atímicos son aclimatados por 1 semana antes a la inoculación con ya sea las células Namalwa o Daudi . Las células Namalwa o Daudi (5 x 106 células/ratón) son implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de ratones desnudos jóvenes irradiados (3Gy~3.2 minutos) con 50% de matrigel en un volumen de 0.1 ml . El tratamiento empieza cuando el volumen de tumor promedio es 100-200 mm3. Esto se designa como el día 1 del estudio. Los volúmenes tumorales y las mediciones de cuerpo corporal son evaluados dos veces a la semana. Se indican las observaciones clínicas . Los ratones individuales con volúmenes tumorales mayores a 3000 mm3 ó grupos con volúmenes tumorales promedio mayores a 2000 mm3 son eutanizados. Los ratones con pérdida de peso corporal menor a 20% son también sacrificados . Los puntos finales son mediciones de volumen tumoral, pesos corporales y observaciones clínicas. Las eficacias de regímenes tres veces semanalmente De Proleukin®, L2-7001®, muteinas Y107R o E95D son evaluadas en un modelo NHL humanao agresivo, en estadía (Namalwa) en ratones desnudos Balb/c irradiados (Figuras 14-16) . El agente sencillo L2-7001® muestra un buen efecto de respuesta a dosis con una ED50 calculada de 2 mg/kg (Figura 16) .
Comparado con el tratamiento con vehículo solo, la actividad de L2-7001® es significativamente diferente en 1 mg/kg, 3 veces por semana (p=0.038) y 3 mg/kg, 3 veces por semana (p=0.009). Sin embargo, no hay diferencia estadística entre el tratamiento con L2-7001 1 en mg/kg, 3 veces por semana contra tratamiento con Proleukin® en 1 mg/kg, 3 veces por semana (p>0.05) (Figura 16?). Las muteinas de IL-2 Y107R y E95D demuestran un efecto de respuesta a dosis en el modelo de tumor de Namalwa (Figuras 15 y 16) . El tratamiento con E95D en 1 y 3 mg/kg, 3 veces por semana es significativamente diferente contra el tratamiento con vehículo (p<0.001), mientras, que la dosis efectiva mínima de Y107R es ligeramente superior (3 mg/kg) en este modelo. El tratamiento con Y107R y E95D en 1 mg/kg, 3 veces por semana demuestra actividad equivalente a marcadores de laboratorio Proleukin® y L2-7001® en 1 mg/kg, 3 veces por semana (p>0.05) en el modelo de Namalwa. Las muteinas son probadas hasta 3 mg/kg y las MTD no se alcanzan. Las eficacias de terapia de combinación con regímenes tres veces semanalmente de Proleukin®, L2-7001®, o la muteina de IL-2 Y107R con rituximab en xenoinjertos de NHL Daudi humano de bajo grado + CD20 en ratones desnudos Balb/c son evaluados (Figuras 17-20) . El objetivo de estos experimentos es evaluar el papel de la activación in vivo de las células efectoras (NK, monocitos, macrófagos, neutrófilos) en la ' eficacia de terapia de recombinación con IL-2 y anticuerpos terapéuticos (rituximab) . La inhibición de crecimiento tumoral por tratamiento con agentes sencillos, Proleukin®, L2-7001® ó Y107R, en 3 mg/kg no es estadísticamente diferente del tratamiento con vehículo (p>0.05, ANOVA día 26) (Figura 17). Sin embargo, cuando se analiza en base al retraso de crecimiento tumoral (es decir, ' los días para progresión tumoral a 1000 mm3) , se observan diferencias estadísticas comparadas con el tratamiento de vehículo (p<0.05, pureba de Lon Rank) . El aumento significativo de eficacia tumoral es observado para el tratamiento con Proleukin® ó L2-7001® en combinación con rituximab contra agentes sencillos respectivos (p<0.05, ANOVA dia 26) (Figuras 18 y 19) . La muteina de Y107R induce aumento similar de eficacia .tumoral como Proleukin/L2-7001 cuando se administra en combinación con rituximab en modelo de xenoinjerto humano Daudi de linfoma de células B. El tratamiento con la combinación de Y107R y rituximba resulta en un número incrementado de respuestas durables (5 CR) y sobrevivencia condicional mejorada comparada con el tratamiento con Proleukin® (Figuras 18 y 19). Todas las dosis del agente sencillo de muteina de IL-2 y combinaciones con rituximab son bien toleradas (Figuras 20) .
Conclusiones 1. Las muteinas E95D y Y107R demuestran inhibición significativa de crecimiento tumoral de NHL de células B agresivas (modelo Namalwa de NHL) . 2. Las muteinas de IL-2 pueden ser efectivas como un solo agente en poblaciones de cáncer subgrupo, incluyendo melanoma, NHL. 3. La actividad de la muteina de IL-2 Y107R es marginal contra el modelo de Daudi NHL de células B de bajo grado, pero es capaz de activar las células inmunoef ectoras (es decir, NK, monocitos, macrófagos, neutrófilos) para mediar potencialmente la ADCC cuando se combina con rituximab. 4. La muteina de IL-2 Y107R y rituximab en terapia de combinación demuestran eficacia superior comparada con los agentes sencillos IL-2 o rituximab solos . 5. La actividad de las muteinas de IL-2 puede ser aplicable a ' combinaciones con otros anticuerpos que median los efectos a través de- DAC o mecanismos efectores de células inmunes similares. 6. Las implicaciones de estos descubrimientos pueden ser aplicables a otras moléculas de citosinas con efectos mecánicos similares a IL-2 (o muteinas) para mediar las respuestas de células efectoras que pueden ser aplicables a otras terapias o indicaciones de enfermedad. Ejemplo 13: Evaluación de tolerabilidad en modelo de síndrome de caida vascular inducida por IL-2 Diseño experimental Los ratones C57B/6 hembras son aclimatados por 1 semana antes al inicio del estudio. Los ratones tienen 8-10 semanas de edad y son tomados al azar en grupos de cinco en base al peso corporal. Se inyectan Proleukin®, L2-701® o una muteina de IL-2, E95D o Y107R, intraperitonealmente (i.p.) en 6 mg/kg (-2,000,000 IU) , 3 veces por día. Se repiten las inyecciones por 10 dosis. Se inyecta 125I-albúmina (1 µCi, PerkinElmer Life Sciences Inc. Boston, MA) en 0.1 de PBS que contiene 1% de suero de ratón 4 horas después de la dosis de Proleukin® en el día 4. Se eutanizan los ratones 60 minutos después de la inyección con 125I-albúmina. Los pulmones son cosechados y colocados en un vial para gamma conteo. Resultados El tratamiento con altas dosis de IL-2 ó L2-7001® (6 mg/kg, i.p., 3x/día, 10 dosis) produce un incremento estadístico en retención dé 125I-albúmina en los pulmones de ratones, lo cual resulta a partir de caida vascular incrementada y mimitizar un modelo patológico de síndrome de caida vascular (VLS) similar a aquel observado en humanos (Figura 21) . En este modelo "agudo" de VLS experimental, tanto las muteinas de IL-2 E95D y Y107R provocan incrementos en retención de 15I-albúmina; sin embargo, Y107R demuestra una reducción de 16% en el extendido de inducción VLS comparada con el tratamiento con Proleukin® (Figura 21) . Ejemplo 14: Evaluación de tolerabilidad de muteinas de IL-2 por monitorear cambios de temperatura corporal usando un chip de temperatura Introducción Aunque, el mecanismo preciso que subyace a la toxicidad inducida por IL-2 y VLH no es claro, los datos de acumulación sugiere que las células asesinas naturales inducidas por IL-2 (NK) accionan toxicidades limitantes a dosis como una consecuencia de sobreproducción de citosinas pro-inflamatorias incluyendo IFN-?, TNF-a, TNF-ß, IL-lß y IL- 6 que activan monocitos/macrófagos e induce la producción de óxido nítrico (NO) llevando a un daño subsecuente de células endoteliales (Dubinett et al. (1994) Cell Immunol . 157 (1) .-170-180; y Samlowski et al. (1995) J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol . 18 (3) :166-78) . La fiebre y los escalofríos son eventos adversos Grado 3 comunes durante la terapia de IL-2. La fiebre es una reacción fisiológica a TNF-a induciendo la prostaglandina E2 y el inicio de fiebre induce vasoconstricción y los escalofríos que preceden el cambio real en temperatura de núcleo. La IL-2 no induce directamente la síntesis de prostaglandina E2 in vitro; por lo tanto la IL-2 por sí misma es clasificada como una citocina no pirogénica. Sin embargo, después de la administración exógena, IL-2 induce la liberación de citosinas pirogénicas, particularmente TNF-a, una causa principal de fiebre y otros aspectos de respuesta de fase agua durante la terapia con IL-2 (Mier, et al. (1988) J. Clin. Immunol . 8 :426). Se ha reportado que los niveles de plasma de TNF-a pueden alcanzar más de 600 ng/ml en pacientes tratados con IL-2 (Gemlo et al. (1988) Cáncer Res. 48(20) :5864-5867) . Las toxicidades limitantes en dosis _en humanos (por ejemplo, fiebre/escalofríos, VLS e hipotensión) todas tienen correlaciones derivadas con citocina pro-inflamatoria y producción de NO . Ya que hay una relación directa entre la producción de citosinas pro-inflamatorias, tales como TNF-a, y la inducción de cambios en temperatura corporal fisiológica, los cambios en temperatura pueden ser monitoreados como un predictor de tolerabilidad después de la inmunoterapia con IL-2. Para modelar el perfil de eventos adversos, es importante extrapolar la relación entre los cambios de temperatura y producción de citocina pro-inflamatoria a partir de humano a ratón. En ambas especies, la producción de citocinas pro-inflamatorias (TNF-a, IL-lß, etc.) es una causa de cambios de temperatura corporal, mediados por inducción hipotalámica de E2 de prostaglandina. Los mamíferos experimentales usados comúnmente, tales como el ratón exhiben hitermia e hipometabolismo cuando se exponen realmente a muchos fármacos. Esto se postula como una respuesta protectora, inherente para reducir la letalidad de inuslto tóxico (Gordon and Yange (1997) Ann. N. Y. Acad. Sci. 813:835) . Mientras que una persona puede predecir un incremento en la temperatura corporal de núcleo después de la administración de IL-2 en un modelo de ratón, se observa actualmente una disminución en este modelo. Es conocido en la técnica que los mediadores exógenos de inflamación, tales como LPS inducen TNF-a y disminuyen temporalmente la temperatura corporal núcleo en un modelo de ratón (Kozak et al. (1997) . Ann. NY Acad. Sci 813:835). En otro modelo, la evaluación telemétrica de temperatura corporal hipotérmica prueba ser un indicador temperano, significativo de mortalidad en un modelo de" murino de choque entérico SEB (Vlach et al. (2000) Coirp. Med. 50:160). Diseño Experimental Se implantan los ratones subcutáneamente con un chip de temperatura, y se usa un sistema POCKET SCANNER (BioMe ic Data Systems, Inc. Seaford, DE) para monitorear cambios en la temperatura corporal. Se aóministran Proleukin®, L2-701®, o una muteina de IL-2, E95d, Y107R, L94 o F42E subcutánemanete usando el régimen de dosis "Sleijfer" (5 díassi/2 días no/5 días si) . Las temperaturas corporales de ratones son monitoreadas en los puntos de tiempo dados y después de la adirúnistración de IL-2 y comparados con ratones inyectados con un control de amortiguador (vehículo) . Los puntos finales son tempertura corporal de núcleo, observaciones clínicas, peso corporal, y niveles de citocina pro-inflamatoria plasmática (por ejemplo, TNF-a) . Resultados Después de la administración con Proleukin® ó L2-7001® (5.7 mg/kg -ó 8.1 mg/kg, inyección subcutánea diariamente por 5 días), se observan disminuciones significativas en temperatura 4 horas post dosificación en los días 4 y 5. Aunque, hay una disminución en temperatura ( no se observa incremento en humanos) , el efecto es reproducible, y no se observa un efecto con animales tratados con vehículo. La Figura 22 representa un curso de tiempo expandido realizado para incluir monitoreo de temperatura hasta 9 horas post dosificación por 10 dosis sobre un periodo de 2 semanas. Los cambios más consistentes, significativos ocurren en 4 horas post dosificación en el día 5. Adicionalmente, hay una correlación significativa entre los cambios de temperatura inducidos por IL-2 y los niveles de TNF-a plasmáticos en el modelo de ratón. El modelo es reproducible, y los resultados en c srrdLnuciones significativas en temperatura en respuesta a tratamiento, con IL-2 se resumen en la Tabla 23. Tabla 23. Resumen de cambios de temperatura en 4 horas post dosificación SEMANA 1 SEMANA 2 1Los valores se expresan como temperatura corporal promedio (°F) +/- SD, prueba estadística (ANOVA + Student-Newman-Keuls), no significativos para p>0.05 ^Animales en el grupo dosificado en 10.5 mpk por la semana 2 2ratones BALB/c usados en estudio 3animales en estudio que portan tumor, todos los grupos son dosificados en 5.7 mpk para estudio de eficacia 4Uhos ratones mueren 30 minutos después de la última inyección debido a hipotermia severa ^3= no significativo (P>0.05) Es de notar, que la formulación L2-7001 es tolerada mejor en el modelo de ratón, ya que las caídas de temperatura significativas son observadas consistentemente en dosis iguales o mayores a 8.1 mg/kg, mientras que 5.7 mg/kg. de Proleukin® es la dosis tolerada máxima en este modelo. Estas observaciones son consistentes con otros modelos preclínicos, los cuales se dosifican por periodos prolongados de tiempo (generalmente 2 semanas de ciclos de dosificación) en animales que portan el tumor. Dos de las muteinas de IL-2, Y107R y F42E muestran cambios de temperatura reducidos significativamente que se correlacionan con inducción reducida de TNF-a, predictivo de toler bilidad mejorada comparado con Proleukin® y L2-7001®. Ver las Figuras 23-25. Muchas modificaciones y otras modalidades de las invenciones indicadas en la presente llegarán a estar presente en la mente de expertos en la técnica a la cual estas invenciones pertenecen teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones mencionadas anteriormente y los dibujos asociados. Por lo tanto, se entiende que las invenciones no serán limitadas a las modalidades específicas y que las modificaciones y otras modalidades son propuestas para ser incluidas dentro del alcance de las modalidades descritas en la presente. Aunque los términos específicos son empleados en la presente, son usados en un sentido genérico y descriptivo solamente y no para propósitos de limitación. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVIMDICftCiaXtES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótidos que codifica una muteina de IL-2 humana, la muteina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70,- 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 y 344; b) la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, o 343; una secuencia de nucleótidos que codifica una muteina de IL-2 humana, la muteina que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de las secuencias indicadas en las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; d) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 4- 399 de la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, ' 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, -129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 17.5, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, -251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, o 343; e) la secuencia de nucleótidos de cualquiera de a) , b) , c) , o d) , en donde la secuencia comprende una substitución de nucleótidos 373-375 de las SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23; 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143 , 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233 , 235, 237, 239 , 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257 , 259, 261, 263 , 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 291, 293, 295, 297 , 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317', 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339 , 341, o 343 con un codon triplete que codifica la alanina; f ) la secuencia de nucleótidos de cualquiera de a) , b) , c) o d.) , en donde la secuencia comprende una substitución de los nucleótidos 373-375 de la SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 , 25, 27, 29, 31,- 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 5.3, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67 , 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, S5, 87, 89, 91, 93, 95, ' 97, 99, 101, 103, 105, 107 , 109, 111, 1X3, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139 , 141, 143 , 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163 , 165, 167 , 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 0-85, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 , 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237 , 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257 , 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327 , 329, 331, 333 , 335, 337, 339, 341, o 343 con un codón triplete que ccx=^ifica cisteína; y g) una secuencia de nucleótidos de a) , b) , c) , d) , e) , o f) en donde uno o más codones que codifican la muteina ha sido optimizado para expresión en una célula huésped de interés. 5 2. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de nucleótido de g) es seleccionada del grupo que consiste de la secuencia indicada en la SEQ ID NO:345, nucleótidos 4-399 de la SEQ ID NO:345, la secuencia indicada en la SEQ ID NO:346, y nucleótidos 4-399 de la SEQ ,10 ID NO;346. 3. Un vector de expresión caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 4. Una célula huésped caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 15 5. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, '50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 0 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 5 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68-, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; c) la secuencia de aminoácidos de a) , o b) , en donde la secuencia comprende un residuo substituido para el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; y la secuencia de aminoácidos de a) o b) , en donde la secuencia comprende un residuo de cisteina substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. 6. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende una muteina de IL-2 humana, en donde la muteina comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 4, con una serina substituida por cisteína en la posición 125 de la SEQ ID NO:4 y por lo menos una substitución de aminoácidos adicional dentro de la SEQ ID NO:4, en donde la muteina: 1) mantiene o incrementa la proliferación de células asesinas naturales (NK) , y 2) induce un nivel dispünuido de producción de citocina pro-inflamatoria por las células NK; como se compara con una cantidad similar de IL-2 humana des-alanil-1, ' C125S o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables, en donde la proliferación de las células NK y producción de citocina pro-inflamatoria por las células Nk son ensayadas usando el bioensayo de NK-92. 7. El polipéptido asilado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porgue la muteina además comprende una eliminación de alanina en la posición 1 de la SEQ ID NO:4. 8. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la substitución adicional es seleccionada del grupo que consiste de T7A, T7D, T7R, K8L, K9A, K9D, K9R, K9S, K9V, K9W, T10K, T10N, QllA, QllR, Q11T, E15A, H16D, H16E, L19D, L19E, D20E, I24L, K32A, K32W, N33E, P34E, P34R, P34S, P34T, P34V, K35D, K35I, K35L, K35M, K35N, K35P, K35Q, K35T, L36A, L36A, L36E, L36F, L36G, L36H, L36I, L36K, L36M, L36N, L36P, L36R, L36S, L36W, L36Y, R38D, R38G, R38N, R38P, R38S, L40D, L40G, L40N, L40S, T41E, T41G, F42A, F42E, F42R, F42T, F42V, K43H, F44K, M46I, E61K, E61M, E61R, E62T, ?62Y, K64D, K64E, K64G, K64L, K64Q, K64R, P65D, P65E, P65F, P65G, P65H, P65I, P65K, P65L, P65N, P65Q, P65R, P65S, P65T, P65V, P65W, P65Y, L66A, L66F, E67A, L72G, L72N, L72T, F78S, F78 , H79F, H79M, H79N, H79P, H79Q, H79S, H79V, L80E, L80F, L80G, L80K, L80N, L80R, L80T, L80V, L80W, L80Y, R81E, R81K, R81L, R81M, R81N, R81P, R81T, D84R, S87T, N88D, N88H, N88T, V91A, V91D, V91E, V91F, V91G, V91N, V91Q, V91W, L94A, L94I, L94T, L94V, L94Y, E95D, E95G, E95M, T102S, T102V, M104G, E106K, Y107H, Y107K, Y107L, Y107Q, Y107R, Y107T, E116G, N119Q, T123S, T123C, Q126I, y Q126V. 9. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la substitución es H16D, L19D, L19E, L36D, L36P", L40D, L40G, F42E, F42R, E61R, P65Y, L72N, L80K, R81K, N88D, V91D, V9UST, L94Y, E95D, E95G, Y107H y Y107R. 10. El polipéptido aislado de confoimidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la muteina además comprende una eliminación de alanina en la posición 1 de la SEQ ID NO:4. 11. El polipéptido aislado de conformidad con- la reivindicación 6, caracteizado porque la citocina pro-inflamatoria es TNF-a. 12. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muteina proporciona citotoxicidad natural mediada por células Nk humana mantenida o mejorada, citotoxicidad de asesinas activada por linfocina (LAK) , o citotoxicidad mediada por ADCC con relación a aquella observada por una cantidad similar de IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables, en donde la citotoxicidad mediada por células NK es ensayada usando el bioensayo de citotoxicidad NK3.3. 13. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muteina proporciona inducción mantenida o mejorada de AKT fosforilada en la línea celular NK3.3 con relación a aquella observada por una cantidad similar de IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables . 14. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la proliferación de células Nk inducida por la muteina es mayor a 150% de aquella inducida por una cantidad similar de IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables. 15. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la proliferación de células NK inducida por la muteina es mayor a 170% de aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S. 16. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la proliferación de células NK inducida por la muteina es aproximadamente 200% a aproximadamente 210% de aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S. 17. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la proliferación de células NK inducida por la muteina es incrementada por al menos 10% sobre aquella inducida por una cantidad similar de IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables. 18. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la proliferación de células NK inducida por la muteina se incrementa por al menos 15% sobre aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S. 19. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la producción de citocina pro- inflamatoria inducida por la muteina es menor a 100%, de aquella inducida por una cantidad similar de IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo similares. 20. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la producción de citocina pro-inflamatoria inducida por la muteina es menor a 70% de aquella inducida por IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S. 21. Un polipéptido aislado comprende una muteína de IL-2 humana, caracterizado porque la muteina comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO:4 con una serina substituida por cisteina en la posición 125 de la SEQ ID NO:4, y por lo menos una substitución de aminoácidos adicional dentro de SEQ ID NO:4, en donde la proporción de proliferación de células NK inducida por IL-2 a producción de TNF-a de la muteina es por lo menos 1.5 veces mayor que aquella observada para una cantidad similar de IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables, en donde la proliferación de células NK en 0.1 ?M de muteina y producción de TNF-a en muteina a 1.0 riM se ensayan usando el bioensayo NK-92. 22. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la proporción es por lo menos 2.5 veces mayor que aquella observada para IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S. 23. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la proporción es por lo menos 3.0 veces mayor que aquella observada para IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S. 24. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la muteina además comprende una eliminación de alanina en la posición 1 de SEQ ID NO:4. 25. Un polipéptido asilado caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos para una muteina de IL-2 humana, en donde la muteina comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: con una serina substituida para cisteina en la posición 125 de la SEQ ID NO:4, y con por lo menos una substitución de aminoácidos adicional en la posición de la SEQ ID NO:4 seleccionada del grupo que consiste de posiciones 16, 36, 40, 42, 61, 65, 67, 72, 91, 94, 95 y 107. 26. El polipéptido aislado de confoi idad con la reivindicación 25, caracterizado porque la muteina además comprende una eliminación de alanina en la posición 1 de la SEQ ID NO:4. 27. Un método para producir una muteína de interleucina-2 humana (IL-2) que es capaz de mantener o incrementar la proliferación de células NK y la cual también induce un nivel inferior de producción de citocina pro-inflamatoria por las células NK como se compara con una cantidad similar de una muteina de IL-2 humana de referencia seleccionada de IL-2 humana des-alanil-1 C125S y IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo similares, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocina pro-inflamatoria son ensayadas usando el bioensayo de NK-92, el método caracterizado porque comprende: a) transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1; b) cultivar la célula huésped en un medio de cultivo celular bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de ácido nucleico como un polipéptido; y c) aislar el polipéptido. 28. Un método para producir una muteina de interleucina-2 humana (IL-2) que es capaz de mantener o incrementar la proliferación de células NK y la cual también induce un nivel inferior de producción de citocina pro-inflamatoria por las células NK como se compara con una cantidad similar de una muteina de IL-2 humana de referencia selecciona de IL-2 humana des-alanil-1, C125S y IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo similares, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocina pro-inflamatoria son ensayadas usando el bioensayo NK-92, el método caracterizado porque comprende: a) transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de conformidad con la reivindicación 25; b) cultivar la célula huésped en un medio de cultivo celular bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de ácidonucleico como un polipéptido; y c) aislar el polipéptido. 29. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de ua muteina de IL-2 humana de conformidad con la reivindicación 2 y un portador aceptable farmacéuticamente. 30. Un método para estimular el sistema inmune de un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva terapéuticamente de una muteina de IL-2 humana, en donde la muteina induce un nivel inferior de producción de citocina pro-inflamatoria por las células NK y mantiene o incrementa la proliferación de células NK comparada con una cantidad similar de una molécula de IL-2 de referencia a partir de IL-2 humana des-alanil-1, C125S y IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocina pro-inflamatoria son ensayadas usando el bioensayo de NK-92. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el mamífero es un humano. 32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la muteina de IL-2 humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia ?e aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; 5 c) la secuencia de aminoácidos de a) o b) , en donde la secuencia comprende un residuo de alanina substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 10 ' 84, 86,.88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 15 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 20 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; d) la secuencia de aminoácidos de a) , o b) , en donde la secuencia comprende un residuo de cisteina substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 25. 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; 33. Un método para tratar el cáncer en un mamífero, caracterizado porque comprende adrninistrar al mamífero una cantidad efectiva terapéuticamente de una muteína de IL-2 humana, en donde la muteina induce un nivel inferior de producción de citocina pro-inflamatoria por las células NK y mantiene o incrementa la proliferación de células NK comparada con una concentración similar de una molécula de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana des-alanil-1, C125S y IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo similares, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocina pro-inflamatoria se ensayan usando el bioensayo de NK-92. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el mamífero es un humano. 35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la muteina de IL-2 humana comprende una secuencia minoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, .30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142,. 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; c) la secuencia de aminoácidos de a) o b) , en donde la secuencia comprende un residuo de alanina substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; y d) la secuencia de aminoácidos de a) , o b) , en donde la secuencia comprende un residuo de cisteina substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. 36. Un método para reducir síntomas de toxicidad inducida por la interleucin-2 (IL-2) en sujetos que sufren de adrninistración de IL-2 como un protocolo de tratamiento, el método caracterizado porque comprende aóministrar la IL-2 como una muteina de IL-2, en donde la muteina de IL-2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; c) la secuencia de aminoácidos de a) o b) , en donde la secuencia comprende un residuo de alanina substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; y la secuencia de aminoácidos de a) , o b) , en donde la secuencia comprende un residuo de cisteina substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344. 37. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muteina tiene una dosis tolerada máxima superior con relación a aquella observada para IL-2 humana des-alanil-1 C125S ó IL-2 humana C125S, en donde la dosis tolerada máxima es determinada usando un modelo de animal con melanoma B16F10. 38. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muteina muestra actividad antitumoral comparable o mejorada y efectos adversos reducidos comparados con el tratamiento con IL-2 humana des-alanil-1, C125S ó IL-2 humana C125S bajo condiciones de tratamiento comparables, en donde se evalúa la actividad antitumoral usando un modelo de animal con melanoma B16F10. 39. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muteina muestra actividad antitumoral comparable o mejorada y efectos adversos reducidos comparados con el tratamiento con IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de tratamiento, en donde se evalúa la actividad antitumoral usando un modelo de animal Namalwa con linfoma no de Hodgkin de alto grado o un modelo de animal de Daudi con linfoma no de Hodgkin. 40. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muteina cuando se coadministra con rituximab muestra actividad antitumoral comparable o mejorada y efectos adversos reducidos comparados con tratamiento con IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de tratamiento, en donde la actividad antitumoral es evaluada usando un modelo de animal Namalwa con linfoma no de Hodgkin de alto grado o un modelo de animal Daudi con linfoma no de Hodgkin de grado bajo. 41. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 39 ó 40, caracterizado porque la muteina muestra activación de célula efecotra inmune mejorada comparada con una cantidad similar de IL-2 humana des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S. 42. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la muteina muestra la activación de célula efectora inmune mejorada de una célula seleccionada del grupo que consiste de una célula T, una célula NK, un monocito, un macrófago, y un neutrófilo. 43. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la muteina muestra muerte citolítica mediada por citotoxicidad celular dependiente a anticuerpo mejorada (ADCC) comparada con una IL-1 humana des-alanil-1 C125S o 11-2 humana C125S. 44. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muteina provoca menos caida vascular como se compara con una cantidad similar de IL-2 humana des- alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S en un modelo animal de síndrome de caida vascular. 45. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muteina provoca menos cambio en la temperatura corporal como se compara con una cantidad similar de IL-2 humana des-alanil-1 C125S o IL-2 humana C125S en un modelo animal, en donde la temperatura corporal es monitoreada en el animal con un chip de temperatura. 46. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muteina demuestra tolerbilidad mejorada cuando se administra a un sujeto como se determina por la medición de temperatura corporal usando un chip de temperatura in vivo, medición de caida vascular, o medición de dosis tolerada máxima en el sujeto. 47. El uso de una muteina de IL-2 humana en un método para estimular el sistema inmune de un mamífero, el cual comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva terapéuticamente de una muteina de IL-2 humana, en donde la muteina induce un nivel inferior de producción de citocina pro-inflamatoria por células NK y mantiene o incrementa la proliferación de células NK comparada con una cantidad similar de una molécula de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 des-alanil-1, C125S o IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo coirparables, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocina pro-inflamatoria son ensayadas usando el bioensayo de NK-92. 48. El uso de una muteina de IL-2 humana en un método para tratar el cáncer en un mamífero, el cual comprende aóministar al mamífero una cantidad efectiva terapéuticamente de una muteina de IL-2 humana, en donde la muteina induce un nivel inferior de producción de citocina pro-inflamatoria por las células Nk y mantiene o incrementa la proliferación de células NK comparada con una concentración similar de una molécula de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 des-alanil-1, C125S humana y IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo similares, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocina pro-inflamatria son ensayadas usando el bioensayo de NK-92. 49. El uso de una muteina de IL-2 humana en un método para reducir los síntomas de toxicidad inducida por interleucina-2 (IL-2) en un sujeto que sufre de administración de IL-2 como un protocolo de tratamiento, el método que comprende administrar la IL-2 como una muteina de IL-2, en donde la muteina de IL-2 comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, .124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; c) la secuencia de aminoácidos de a) o b) , en donde la secuencia comprende un residuo de alanina substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344; la secuencia de aminoácidos de a) , o b) , en donde la secuencia comprende un residuo de cisteina substituido por el residuo de serina en la posición 125 de la SEQ 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170/ 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292 , 294, 296, 298, 300, 302 , 304, 306, 308 310, 312 , 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342 o 344;
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