MXPA06010021A - Muteinas combinatorias de interleucina-2. - Google Patents

Muteinas combinatorias de interleucina-2.

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MXPA06010021A
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Susan E Wilson
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Abstract

Se proporcionan nuevas muteinas de interleucina-2 (IL-2) humanas, o variantes de las mismas, y moleculas de acido nucleico y variantes de las mismas. Tambien se describen metodos para producir estas muteinas asi como metodos para estimular el sistema inmunitario de un animal. Ademas, la invencion proporciona vectores de expresion recombinante que comprenden las moleculas de acido nucleico de esta invencion y celulas hospedadoras en las cuales se han introducido vectores de expresion. Se incluyen composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad terapeuticamente efectiva de una muteina de IL-2 humana de la invencion y un portador farmaceuticamente aceptable. Las muteinas de IL-2 tienen menor toxicidad que la IL-2 nativa o la proleucinaMR IL-2, en tanto que mantienen o mejoran efectos mediados por celulas NK, y se pueden usar en composiciones farmaceuticas para el uso en el tratamiento de cancer y en la estimulacion de la respuesta inmunitaria.

Description

MUTEINAS COMBINATORIAS DE INTERLEUCINA-2 Campo de la Invención La invención se refiere a muteínas de interleucina-2 humana (IL-2) que tienen eficiencia terapéutica mejorada. También se proporcionan métodos para producir las nuevas moléculas y formulaciones farmacéuticas que se pueden utilizar para tratar cáncer y para estimular el sistema inmunitario de un mamífero.
Antecedentes de la Invención La interleucina-2 (IL-2-) es un potente estimulador de la proliferación y función -de las células aniquiladoras naturales . (NK) y células T (Morgan et al., (1976) Sience 193:1007-1011). Esta linfocina que se presenta de forrma natural se ha mostrado que tiene actividad anti-tumoral contra una variedad de malignidades ya sea sola o cuando se combina con células aniquiladoras activadas por linfocinas (LAK) o linfocitos de infiltración en tumor (TIL) (ver, por ejemplo Rosenberg et al. (1987) N. Engl . J. Med. 316:889- 897; Rosenberg (1988) Ann . Surg. 208:121-135; Topalian et al. (1988) J. Clin . Oncol . 6:839-853; Rosenberg et al., (1988) N. Engl . J. Med. 319:1676-1680; y Weber et al. (1992) J". Clin . Oncol . 10:33-40). Sin embargo, las altas dosis de IL-2 usadas para lograr efectos terapéuticos positivos con REF:175418 respecto al crecimiento tumoral, frecuentemente provocan efectos secundarios severos, incluyendo fiebre y escalofríos, hipotensión y fuga capilar (síndrome de fuga vascular o VLS) , y cambios neurológicos (ver, por ejemplo Duggan et al. (1992) J. Immunotherapy 12:115-122; Gisselbrecht et al. (1994) Blood 83:2081-2085; y Sznol y Parkinson (1994) Blood 83 : 2020-2022) . Aunque no es claro el mecanismo preciso que fundamenta la toxicidad inducida por IL-2 y el VLS, la acumulación de datos sugiere que las células aniquiladoras naturales (NK) inducidas por IL-2 activan las toxicidades limitadoras de dosis (DLT) como una consecuencia de la producción excesiva de citocinas pro-inflamatorias que incluyen IFN-ar, IFN-?, TNF-a, TNF-ß, IL-lß, IL-lß, e IL-6. Estas citocinas activan monocitos/macrófagos e inducen producción de óxido nítrico que conduce a daño subsiguiente de células endoteliales (Dubinett et al., (1994) Cell Inmunol . 157:170-180; Sa lowski et al. (1995) J. Inmunother .
Em.pha.sis Tumor Immunol . 18:166-178). Estas observaciones han conducido a otros a desarrollar muteínas de IL-2 que demuestran selectividad preferencial para células T como lo opuesto a células NK en base a la hipótesis que el receptor de IL-2 (IL-2R) de alta afinidad se expresa de forma selectiva en células T (ver, por ejemplo, BAY50-4798, la muteína de IL-2 N88R de IL-2 humana madura descrita en la Publicación internacional No. WO 99/60128, y Shanafelt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:1197-202). Diversas funciones efectoras de NK tal como la aniquilación natural (?K) , LAK y la aniquilación citolítica dependiente de anticuerpo (ADCC) , la producción de citocinas y la proliferación dependen de la activación de compuestos intermedios específicos en distintas rutas de señalización intracelular de ?K. De manera importante, existe evidencia que la modulación selectiva de las interacciones IL-2-IL-2R puede tener influencia en diversas funciones efectoras en dirección 3' mediadas por células M y T de etapas posteriores tal como proliferación, producción de citocinas y aniquilación citolítica (Sauve et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:4636-4640; Heaton et al. (1993) Cáncer Res. 53:2597-2602; Eckenberg et al. (2000) J. Exp. Med. 191:529-540). La proleucina"" IL-2 (que comprende la aldesleucina de la muteína de IL-2 humana, recormbinante; Chiron Corporation, Emeryville, California) se ha aprobado por la FDA para tratar melanoma metastático y carcinoma renal, y se está estudiando para otras indicaciones clínicas, incluyendo linfoma no de Hodgkin, VIH, y cáncer de mama. Sin embargo, debido a los efectos secundarios tóxicos asociados con IL 2, existe una necesidad de una muteína menos tóxica de IL-2 que permita mayor uso terapéutico de esta interleucina. Las rmuteínas de IL-2 que tienen tolerabilidad mejorada y/o funciones efectoras mejoradas de células NK y células T mediadas por IL-2 tendrían un mayor uso y serian particularmente ventajosas para terapia de cáncer y para modular la respuesta inmunitaria.
Breve Descripción de la Invención La invención se refiere a muteínas de interleucina-2 (IL-2) que tienen perfiles funcionales mejorados predictivos de toxicidades reducidas. Se proporcionan las moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican para las muteínas de IL-2 humana y polipéptidos aislados que comprenden estas muteínas. Las muteínas inducen un menor nivel de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK en tanto que mantienen o incrementan la proliferación de células ?K, mantienen las funciones de ?K, LAK y citolíticas de ADCC, mediadas por células ?K, y mantienen la función proliferativa de células T en comparación a las muteínas de des-alanil-1, de IL-2 humana C125S o IL-2 humana de C125S. También se describen los usos clínicos de estas mejoraron las muteínas de IL-2 humana en el tratamiento de cáncer y en la modulación de la respuesta inmunitaria . En un aspecto, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una muteína de IL-2. En ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica para una muteína de IL-2 humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, la invención incluye una molécula aislada de ácido nucleico que codifica para una muteína de IL-2 humana que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Nos: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 y 71. En ciertas modalidades, la invención incluye una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una muteína de IL-2 humana, en donde la muteína tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos : 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, la invención incluye una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 4-399 de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 y 71. En ciertas modalidades, las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente pueden comprender además una substitución, en los nucleótidos 373-375 de SEQ ID No: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 o 71 se reemplazan con un codón de triplete que codifica para alanina. En ciertas modalidades, las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente pueden comprender además una substitución, en donde los nucleótidos 373-375 de SEQ ID No : 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 o 71 se reemplazan con un codón de triplete que codifica para cisteína. En ciertas modalidades, las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente se modifican adicionalmente para optimizar la expresión. Estos ácidos nucleicos comprenden una secuencia de nucleótidos, en donde se han optimizado uno o más codones que codifican para la muteína para la expresión en una célula hospedadora de interés. Los ácidos nucleicos de ejemplo que contienen codones optimizados pueden incluir, de manera enunciativa y sin limitación, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No: 73, los nucleótidos 4-399 de SEQ ID No: 73, SEQ ID No : 74 y los nucleótidos 4-399 de SEQ ID No : 74. La presente invención incluye además un vector de expresión para el uso en células hospedadoras seleccionadas, en donde el vector de expresión comprende uno o más de los ácidos nucleicos de la presente invención. En estos vectores de expresión, las secuencias de ácido nucleico se enlacen de manera operable a elementos de control compatibles con la expresión en la célula hospedadora seleccionada. Los numerosos elementos de control de expresión se conocen por aquellos expertos en la técnica, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, lo siguiente: promotores de trascripción, elementos intensificadores de trascripción, señales de terminación de trascripción, secuencias de poliadenilación, secuencias para optimización de iniciación de traducción, y secuencias de terminación de traducción. Los promotores de trascripción de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, aquellos derivados de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus, y Virus Simiesco 40. En otro aspecto, la invención proporciona células que comprenden los vectores de expresión de la presente invención, en donde las secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, que codifica para una muteína de IL-2 humana) , se enlaza de forma operable a elementos de control compatibles con. la expresión en la célula seleccionada. En una modalidad, estas células son células de mamífero. Las células de mamífero de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, células de ovario de hámster Chino (CHO) o células COS. Otras células, tipos de célula, tipos de tejido, etc., que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, aquellas obtenidas de lo siguiente: insectos (por ejemplo, Trichoplusia ni (Tn5) y Sf9) , bacterias, levadura, plantas, células que presentan el antígeno (por ejemplo, macrófagos, monocitos, células dendríticas, células B, células T, células madre, y células progenitoras de las mismas), células primarias, células inmortalizadas, células derivadas de tumor. En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los vectores de expresión y células hospedadoras de la presente invención para producción recombinante de muteínas de IL-2 humana. Estas composiciones pueden incluir un portador f rmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una muteína de IL-2 humana. En ciertas modalidades, la invención incluye un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, la invención incluye un polipéptido aislado que comprende los residuos 2-133 de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, los polipéptidos descritos en la presente pueden comprender además una sustitución, en donde se sustituye un residuo de alanina para el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID Nos : 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, -52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 , 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, los polipéptidos descritos en la presente pueden comprender además una substitución, en donde se sustituye un residuo de cisteína por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID Nos : 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, la invención incluye un polipéptido aislado que comprende una muteína de IL-2 humana, en donde la muteína comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No : 4 con una serina sustituida por cisteína en la posición 125 de SEQ ID No : 4 y al menos dos sustituciones adicionales de aminoácidos dentro de SEQ ID No : 4, en donde la muteína: 1) mantiene o mejora la proliferación de células aniquiladoras naturales (NK) , y 2) induce un nivel disminuido de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK; en comparación con una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. Las sustituciones de combinación de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, 19D40D, 19D81K, 36D42R, 36D61R, 36D56L, 40D36D, 40D61R, 40D65Y, 40D72N, 40D80K, 40G36D, 40G65Y, 80K36D, 80K65Y, 81K36D, 81K42E, 81K61R, 81K65Y, 81K72N, 81K88D, 81K91D, 81K107H, 81L107H, 91N95G, 107H36D, 107H42E, 107H65Y, 107R36D, 107R72N, 40D81K107H, 40G81K107H y 91N94Y95G . En ciertas modalidades, la muteína comprende además una supresión de alanina en la posición 1 de SEQ ID No : 4. La proliferación incrementada de células aniquiladoras naturales (?K) y los niveles disminuidos de la producción de citocinas pro-inflamatorias por células ?K se puede detectar usando un bioensayo de NK-92. Los efectos de los polipéptidos descritos en la presente en la proliferación de células ?K y la producción de citocinas pro-inflamatorias por células ?K se comparan con los efectos de una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des- alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo. En ciertas modalidades, se usa un bioensayo de ?K-92 para mostrar que los polipéptidos descritos en la presente inducen un nivel disminuido de la citocina pro- inflamatoria T?F-a con relación a aquel observado para una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo, condiciones comparables de ensayo. En ciertas modalidades, se usa. un bioensayo de citotoxicidad de NK3.3 para mostrar que los polipéptidos descritos en la presente mantienen o mejoran la citotoxicidad aniquiladora natural mediada por células ?K humanas, la citotoxicidad aniquiladora activada por linfocinas (LAK) o la citotoxicidad mediada por ADCC con • relación a aquella observada por una cantidad similar de des-alanil-1 , muteína de IL-2 humana C125S o IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo. En ciertas modalidades, la proliferación de células NK inducida por la muteína es mayor de 150 % de aquella inducida por una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo. En ciertas modalidades, la proliferación de células NK inducida por la muteína es mayor de 170 % de aquella inducida por IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la proliferación de células NK inducida por la muteína es de aproximadamente 200 % a aproximadamente 250 % de aquella inducida por IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la proliferación de células NK inducida por la muteína se incrementa por al menos 10 % con respecto a aquella inducida por una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo. En ciertas modalidades, la proliferación de células ?K inducida por la muteína se incrementa por al menos 15 % con respecto a aquella inducida por IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la producción de citocinas pro-inflamatorias inducida por la muteína es menos de 100 % de aquella inducida por una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones similares de ensayo. En ciertas modalidades, la producción de citocinas pro-inflamatoria inducida por la muteína es menos de 70 % de aquella inducida por IL-2 humana C125S, des- alanil-1 o IL-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la invención incluye un polipéptido aislado que comprende una muteína de IL-2 humana, en donde la muteína comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No : 4 con una serina sustituida por cisteína en la posición 125 de SEQ ID ?o : 4 y al menos dos sustituciones adicionales de aminoácidos dentro de SEQ ID No : 4, en donde la relación de la proliferación de células ?K inducida por IL-2 "- a la producción de TNF-a inducida por IL-2 de la muteína es al menos 1.5 veces mayor que aquella observada para una cantidad similar de des-alanil-1, muteína de IL-2 humana C125S o muteína de IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo, en donde la proliferación de células NK en muteína 0.1 nM y la producción de T?F-a en muteína 1.0 nM se valoran usando el bioensayo de NK-92 . En ciertas modalidades, la relación es al menos 2.5 veces mayor que aquella observada para IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la relación es al menos 3.0 veces mayor que aquella observada para IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. En ciertas modalidades, la invención incluye un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos para una muteína de IL-2 humana, en donde la muteína comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No: 4 con una serina sustituida por cisteína en la posición 125 de SEQ ID No: 4 y con al menos dos sustituciones adicionales de aminoácidos, en donde las sustituciones adicionales residen en las posiciones de SEQ ID No : 4 seleccionadas del grupo que consisten de las posiciones 19, 36, 40, 42, 61, 65, 72, 80, 81, 88, 91, 95 y 107. Las sustituciones de combinación de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación 19D40D, 19D81K, 36D42R, 36D61R, 36D56L, 40D36D, 40D61R, 40D65Y, 40D72?, 40D80K, 40G36D, 40G65Y, 80K36D, 80K65Y, 81K36D, 81K42E, 81K61R, 81K65Y, 81K72?, 81K88D, 81K91D, 81K107H, 81L107H, 91?95G, 107H36D, 107H42E, 107H65Y, 107R36D, 107R72?, 40D81K107H, 40G81K107H y 91?94Y95G. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende además una supresión de alanina en la posición 1 de SEQ ID ?o : 4. En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una muteína de interleucina-2 humana (IL-2) que comprende transformar una composición hospedadora con un vector de expresión que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente; cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo celular bajo condiciones que permitan la expresión de la molécula de ácido nucleico como un polipéptido; y aislar el polipéptido. En ciertas modalidades, la muteína de interleucina 2 -humana (IL-2) es capaz de mantener o mejorar la proliferación de células NK y también induce un menor nivel de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK en comparación con una cantidad similar de una muteína de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 e IL-2 humana C125 bajo condiciones similares de ensayo, en donde la proliferación de células ' NK y la producción de citocinas pro- inflamatorias se valoran usando el bioensayo de NK- 92 . En otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de los polipéptidos descritos en la presente que comprenden una muteína de IL-2 humana. Estas composiciones incluyen además un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención proporciona un método para estimular el sistema inmunitario de un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una muteína de IL-2 humana, en donde la muteína induce un menor nivel de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK y mantiene o mejora la proliferación de células ?K en comparación a una cantidad similar de una muteína de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 e IL-2 humana de C125S bajo condiciones comparables de ensayo, en donde la proliferación de células NK y la producción citocinas pro-inflamatorias se valoran usando el bioensayo de NK-92. En cierta modalidad, el mamífero es un humano. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 humana usada para estimular el sistema inmunitario comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 , 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 humana usada para estimular el sistema inmunitario comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 humana usada para estimular el sistema inmunitario puede comprender además una substitución, en donde un residuo de alanina se sustituye por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 humana usada para estimular el sistema inmunitario puede comprender además una sustitución, en donde un residuo de cisteína se sustituye por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar un cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una muteína de IL-2 humana, en donde la muteína - - induce un menor nivel de producción de citocinas pro- inflamatorias por células NK y mantiene o mejora la proliferación de células NK én comparación "' a una cantidad similar de una muteína de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 e IL-2 humana C125S bajo condiciones similares de ensayo, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocinas pro- inflamatorias se valoran usando el bioensayo de NK-92. En ciertas modalidades, el mamífero es un humano. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 humana usada para tratar un cáncer puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 , 68, 70 y 72.
En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 humana C125S usada para tratar un cáncer puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de SEQ ID No: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 humana usada para tratar un cáncer puede comprender además una substitución, en donde un residuo de alanina se sustituye por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 humana usada para tratar un cáncer puede comprender además una substitución, en donde un residuo de cisteína se sustituye por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir los síntomas de toxicidad inducidos por interleucina-2 (IL-2) en un sujeto que se somete a administración de IL-2 como un protocolo del tratamiento. El método de tratamiento comprende administrar IL-2 como una muteína de IL-2. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 usada en el tratamiento comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 , 62, 64, 66 , 68 , 70 y 72. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 usada en el tratamiento comprende los residuos 2-133 de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo "que consiste de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 , 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 usada en el tratamiento comprende además una substitución, en donde se sustituye un residuo de alanina por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. En ciertas modalidades, la muteína de IL-2 usada en el tratamiento comprende además una substitución, en donde se sustituye un residuo de cisteína por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 delinea la vista esquemática para la compilación del procedimiento de ensayo de proliferación/producción de citocinas pro-inflamatorias, de combinación, usado con PBMC humanas estimuladas con muteína de IL-2, aisladas de donadores humanos normales. La Figura 2 muestra la proliferación y producción de TNF-a mediada por la muteína de IL-2 40D72? en PBMC humanas . La Figura 3 muestra la proliferación y producción de T?F-a mediada por la muteína de IL-2 40D61R en PBMC humana . La Figura 4 muestra el mantenimiento de la actividad de LAK y ADCC mediada por ?K humanas para PBMC humanas estimuladas con muteína de IL-2 aisladas de donadores humanos normales .
Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a nuevas muteínas ' de interleucina-2 (IL-2) humana que tienen eficiencia terapéutica mejorada debido a su toxicidad reducida y/o funciones efectoras mejoradas de células ?K o T. La muteínas de IL-2 humana descritas en la presente, y variantes biológicamente activas de las .mismas, producen producción reducida de citocinas pro-inflamatorias en tanto que mantienen o incrementan la proliferación de células aniquiladoras naturales (NK) , en comparación a la muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o la muteína de IL-2 humana C125S. Por "citocina pro-inflamatoria" se propone una citocina que es capaz de estimular el sistema inmunitario. Estas citocinas incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, IFN-a, IFN-?, TNF-a, TNF-ß, IL-lß, IL-lß, e IL-6. El término "muteína" se refiere a una proteína que comprende una secuencia mutante de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos para la proteína que se presenta de forma natural por supresiones, sustituciones de aminoácidos o ambas. Las muteínas de IL-2 humana de la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia madura de IL-2 humana al tener un residuo de serina sustituido por el residuo de cisteína en la posición 125 de la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, C125S) y al menos dos sustituciones de aminoácidos, y puede comprender además una o más supresiones de aminoácidos con relación a la secuencia madura de IL-2 humana, tal como supresión de la alanina N-terminal (Ala) en la posición 1 de la proteína madura de IL-2 humana. En modalidades alternativas, las muteínas de IL-2 humana de la presente invención retienen el residuo de cisteína en la posición 125 de la secuencia madura de IL-2 humana pero tienen al menos otras dos sustituciones de aminoácidos, y pueden comprender además una o más supresiones de aminoácidos con relación a la secuencia madura de IL-2 humana, tal como supresión de la alanina N- terminal (Ala) en la posición 1 de la proteína madura de IL-2 humana. Estas muteínas de IL-2 humana se pueden glicosilar o no estar glicosiladas dependiendo del sistema de expresión hospedador usado en su producción. Las sustituciones particulares descritas en la presente dan por resultado una variante de IL-2 humana que retiene las actividades deseadas de producir producción reducida de citocinas pro-inflamatorias en tanto que mantiene o incrementa la proliferación de células NK, en comparación a la muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o la muteína de IL-2 humana C125S usando los ensayos de células NK-92 descritos en la presente. Habiendo identificado las posiciones dentro de la secuencia de IL-2 humana y las sustituciones pertinentes en estas posiciones que dan por resultado una variante de IL-2 con toxicidad reducida y/o proliferación mejorada de células NK, está dentro de la habilidad de un experto en la técnica variar otros residuos dentro de la secuencia de IL-2 humana para obtener variantes de las muteínas de IL-2 humana descritas en la presente que también retienen estas actividades deseadas. Estas variantes de las muteínas de IL-2 humana descritas en la presente también se propone que se abarquen por la presente invención, y se describen adicionalmente más adelante . La IL-2 humana se traduce inicialmente como un polipéptido precursor, mostrado en SEQ ID No: 2, que se codifica por una secuencia de " aminoácidos tal como aquella expuesta en SEQ ID No : 1. El polipéptido precursor incluye una secuencia de señal en los residuos 1-20 de SEQ ID No:2. El término "IL-2 humana, madura" se refiere a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID No : 4, que se codifica por una secuencia de nucleótidos tal como aquella expuesta • como SEQ ID No : 3. Los términos "-muteína de IL-2 humana C125S" o "IL-2 humana C125S" se refieren a . una muteína de IL-2 humana madura que retiene la alanina N-terminal que reside en la posición 1 de la secuencia IL-2 humana madura y que tiene una substitución de serina por cisteína en la posición 125 de la secuencia de IL-2 humana madura. La muteína de IL-2 humana C125S tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID ?o : 6 , que se codifica por una secuencia de nucleótidos como aquella expuesta en SEQ ID No : 5 . Los términos "IL-2 humana C125S, des-alanil-1" e "IL-2 humana de serina 125" des-alanil-1 se refieren a una muteína de la IL-2 humana madura que tiene una substitución de serina por cisteína en la posición 125 de aminoácido de la secuencia de IL-2 humana madura y que carece de la alanina N-terminal que reside en la posición 1 de la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, en la posición 1 de SEQ ID No: 4) . La IL-2 humana C125S, des-alanil-1 tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en 'SEQ ID. No: 8, que se codifica por una secuencia de nucleótidos tal como aquella expuesta en SEQ ID No : 7. La muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1, recombinantemente producida de E. coli , que se refiere como "aldesleucina" está disponible de forma comercial como una formulación que se comercializa bajo la marca comercial ProelucinaMR IL-2 (Chiron Corporation, Emeryville, California) . Para los propósitos de la presente invención, las muteínas de IL-2 -humana C125S, des-alanil-1 y de IL-2 humana C125S sirven como muteínas de IL- 2 de referencia para determinar las actividades deseables que se van a exhibir por las muteínas de IL-2 humana de la invención. Es decir, la actividad deseada de producción reducida de citocinas pro-inflamatorias inducida por IL-2, particularmente producción de TNF-a, por células NK en una muteína adecuada de IL-2 humana de la invención se mide con relación a la cantidad de producción de citocinas pro-inflamatorias de células NK que se induce por una cantidad equivalente de la muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o de la muteína de IL-2 humana C125S bajo condiciones similares de ensayo. De manera similar, la actividad deseada de mantener o incrementar la proliferación de células NK inducida por IL-2 en una muteína adecuada de IL- 2 humana de la invención se mide con relación a la cantidad de proliferación de células ?K inducida por una cantidad equivalente de la muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil- 1 con la muteína de IL-2 humana C125S bajo condiciones similares de ensayo. Se proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican para muteínas de IL-2 humana, y variantes biológicamente activas de las mismas, que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 (SEQ ID ?o:8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID ?o:6) con al menos dos sustituciones adicionales de aminoácido, y que inducen un menor nivel de producción de citocinas pro-inflamatorias por células ?K en tanto que mantienen o incrementan la proliferación de células ?K en comparación a estas dos muteínas de IL-2 de referencia. También se proporcionan los polipéptidos aislados codificados por las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las muteínas de IL-2 humana de la invención incluyen las muteínas expuestas en SEQ ID Nos : 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72, que también se refieren en la presente como "las secuencias expuestas en aún las SEQ ID Nos : 10-72". La presente invención también proporciona cualquier secuencia de nucleótidos que codifique para estas muteínas, por ejemplo, las secuencias codificantes expuestas en SEQ ID Nos: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 y 71., respectivamente. Estas secuencias codificantes también se refieren en la presente como "las secuencias expuestas en las SEQ ID Nos: 9-71 impares". Las muteínas expuestas en estas secuencias de aminoácidos anteriores comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125S con al menos dos sustituciones adicionales, donde estas sustituciones adicionales se representan por las sustituciones de combinación mostradas en la Tabla 1 posterior. Por "substitución de combinación" se propone un grupo de dos o -más sustituciones de residuos que pueden presentarse dentro de la secuencia de muteína de IL-2 humana. De esta manera, por ejemplo, la substitución de combinación designada como "19D40D" se propone que signifique la muteína de IL-2 humana de la invención que comprende tanto una substitución de un residuo de ácido aspártico (es decir, D) por el residuo de leucina en la posición que corresponde a la posición 19 de la IL-2 humana madura (mostrada en SEQ ID No: 4) y una substitución de un residuo de ácido aspártico (es decir, D) para el residuo de leucina en la posición que corresponde a la posición 40 de la IL-2 humana madura (mostrada en SEQ ID No: 4) . De manera similar, la substitución de combinación designada como "40D81K107H" se propone que signifique la muteína de IL-2 humana de la invención que comprende las tres siguientes sustituciones . Una substitución de un residuo de ácido aspártico (es decir, D) por el residuo de leucina en la posición que corresponde a la posición 40 de la IL-2 humana madura, una substitución de un residuo de lisina (es decir, K) por el residuo de arginina en la posición que corresponde en la posición 81 de la IL-2 humana madura, y una substitución de un residuo de histidina (es decir, H) por el residuo de tirosina en la posición que corresponde a la posición 107 de la IL-2 humana madura. En modalidades alternativas, las muteínas de IL-2 humana de la presente invención tienen el residuo de alanina inicial en la posición 1 de esta secuencia de aminoácidos suprimidas, y de esta manera comprenden las secuencias de aminoácidos de IL-2 humana C125S, des-alanil-1, con al menos dos sustituciones adicionales, donde estas sustituciones adicionales se representan por las sustituciones de combinación mostradas en la Tabla 1 posterior. Estas muteínas tienen de esta manera una secuencia de aminoácidos que comprenden los residuos 2-133 de la secuencia expuesta en SEQ ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 , 68, 70 y 72. La presente invención también proporciona cualquier secuencia de nucleótidos que codifique para estas proteínas, por ejemplo, las secuencias de codificación expuestas en los nucleótidos 4-399 de la secuencia expuesta en SEQ ID Nos: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 y 71.. También se proporcionan variantes biológicamente activas de las muteínas de IL-2 humana de la invención, incluyendo fragmentos y formas truncadas de las mismas, que tengan el perfil funcional deseado de la muteína de IL-2 humana como se señala en la presente. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos o formas truncadas de las muteínas descritas de IL-2 humana al remover los residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la muteína de IL-2 humana de longitud completa usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica y descritas en otra parte de la presente. Las variantes adecuadas de las muteínas de IL-2 humana de la invención tendrán actividades biológicas similares a aquellas exhibidas por las nuevas muteínas mismas de IL-2 humana, es decir, tendrán una baja toxicidad de la nueva muteína de IL-2 humana (es decir, producción baja o reducida de citocinas pro-inflamatorias) , así como la capacidad de mantener o incrementar la proliferación de células NK, en comparación a la molécula de IL-2 de referencia, es decir, IL-2 humana C125S, o C125S, des-alanil-1, usando los bioensayos descritos en otra parte de la presente. Se reconoce que una variante de cualquier nueva muteína dada de IL-2 humana identificada en la presente puede tener un nivel absoluto diferente de una actividad biológica particular con relación a aquella observada para la nueva muteína de IL-2 humana de ?a invención, en tanto que retenga el perfil deseado de tener toxicidad reducida (es decir, 'induce un menor nivel de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK, y/o proliferación incrementada de células NK en comparación a la muteína de IL-2 humana de referencia.
Tabla 1 Ejemplos de muteínas de IL-2 humana de la invención que comprende la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) o IL-2 humana C125S, des-alanil-1 (SEQ ID NO: 8) con al menos dos sustituciones adicionales, donde las sustituciones adicionales se seleccionan de las sustituciones de combinación mostradas más adelante. La posición del residuo es con relación a la posición dentro de la secuencia de IL-2 humana madura expuesta en SEQ ID N0:4. Estas posiciones de residuo también corresponden a la posición dentro de la secuencia de IL-2 humana C125S expuesta en SEQ ID NO: 6. Cada posición de residuo se sigue por la abreviación de la primera letra para el aminoácido que se ha sustituido por el residuo que se representa de forma natural en esta posición.
Las composiciones de la invención comprenden además vectores y células hospedadoras para la producción recombinante de muteínas de IL-2 de la invención o variantes biológicamente activas de las mismas. Además, también se proporcionan las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de una muteína de IL-2 humana descrita en la presente o variante biológicamente activa de la misma, y un portador farmacéuticamente aceptable . Los métodos para producir muteínas de IL-2 humana que inducen un menor nivel de producción de citocinas pro- inflamatorias por células NK y que mantienen o incrementan la proliferación de células NK con relación a aquella observada para las muteínas de IL-2 de referencia se abarcan por la presente invención. Estos métodos comprenden transformar una célula hospedadora con un vector- de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una nueva muteína de IL-2 humana de la invención, o que codifica para una variante biológicamente activa de la misma, cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo celular bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido codificado, y aislar el producto de polipéptido. También se proporcionan métodos para estimular el sistema inmunitario de un animal, o para tratar un cáncer en un mamífero, que comprende administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de una muteína de IL-2 humana de la invención, o variante biológicamente activa de la misma, en donde la muteína de IL-2 o variante de la misma induce un menor nivel de producción de citocinas pro- inflamatorias por células NK, y mantiene o incrementa la proliferación de células NK en comparación a IL-2 humana C125S, des-alanil-1, o IL-2 humana C125S como se determina usando los bioensayos descritos más adelante en la presente. La presente invención también proporciona un método para reducir los síntomas de toxicidad inducidos por interleucina-2 (IL-2) en un sujeto que se somete a administración de IL-2 como un protocolo de tratamiento. El método comprende administrar una muteín'a de IL-2 de la presente invención, es decir, una muteína que induce un menor nivel de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK y que mantiene o incrementa la proliferación de células NK en comparación a IL-2 humana C125S, des-alanil-1, o IL-2 humana C125S como se determinan usando los bioensayos descritos más adelante en la presente. Como se usa en la presente, el término "moléculas de ácido nucleico" se propone que incluya moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos de AR? o AD? generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de hebra individual o de doble hebra, pero de manera preferente es AD? de doble hebra. La invención abarca composiciones de proteína o ácido nucleico aisladas o sustancialmente purificadas. Una molécula o proteína "aislada" o "purificada" de ácido nucleico, o porción biológicamente activa de la misma, está sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente acompañan o interactúan con la molécula o proteína de ácido nucleico como se encuentra en su ambiente que se presenta de forma natural. De esta manera, una molécula o proteína aislada o purificada de ácido nucleico están sustancialmente libres de otro material celular, o medio de cultivo, cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos que se sintetizan de forma química. De manera preferente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (de manera preferente secuencias codificantes de proteína) que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula aislada de ácido nucleico puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, ó 0.1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. Una proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, ó l % (por peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención o variante biológicamente activa de la misma se produce de manera recombinante, de manera preferente el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, ó l % (por peso seco) de precursores químicos o productos químicos no de proteína de interés .
Actividad Biológica de Nuevas Muteínas de IL-2 Humana Las nuevas muteínas de IL-2 humana de la presente invención tienen índice terapéutico incrementado en comparación a la muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o en comparación a la muteína de IL-2 humana C125S. Estas dos últimas muteínas se refieren en la presente como "muteínas de IL-2 de referencia" , puesto que los perfiles biológicos de las nuevas muteínas de la invención se comparan a los perfiles biológicos de estas dos muteínas de IL-2 humana, anteriormente caracterizadas, donde cualquier comparación dada se hace usando concentraciones similares de proteína y condiciones comparables de ensayo, a fin de clasificar las muteínas de la presente invención. El índice terapéutico incrementado de las muteínas de la presente invención se refleja en un perfil mejorado de toxicidad (es decir, la muteína induce un menor nivel de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK) , una función efectora incrementada de células NK y/o T sin toxicidad incrementada, o tanto un perfil mejorado de toxicidad como una función efectora mejorada de células NK y/o T de estas muteínas en comparación al perfil de toxicidad y la función efectora de células NK y/o T de cualquiera de estas dos muteínas de IL-2 de referencia. Se usaron tres puntos terminales funcionales para seleccionar las muteínas con índice terapéutico incrementado: (1) la capacidad para reducir la producción de citocinas pro-inflamatorias inducida por IL-2, por células NK, en comparación a IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S; (2) la capacidad para mantener o incrementar la proliferación inducida por IL-2 de células NK y T sin un incremento en la producción de citocinas pro-inflamatorias por las células NK en comparación a IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S; y (3) * la capacidad para mantener o mejorar (es decir, incrementar) la aniquilación celular citolítica mediada por NK en comparación a IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S. La aniquilación celular citolítica mediada por NK incluye aniquilación citolítica mediada por aniquiladores activados por linfocina (LAK) y mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Las nuevas muteínas de IL-2 humana descritas en la presente que exhiben las más grandes mejoras en el índice terapéutico caen dentro de estas tres clases funcionales predictivas de beneficio clínico mejorado. Se señala que todas estas muteínas exhiben actividad mantenida o incrementada de la proliferación de células T y actividad citolítica mediada por NK. La primera clase funcional de muteínas se caracteriza por tener mutaciones benéficas que reducen la producción de citocinas pro-inflamatorias inducida por IL-2, por células NK, en comparación a una muteína de IL-2 de referencia, es decir, IL-2 humana, C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S, en tanto que mantiene la proliferación de células NK inducida por IL-2. La segunda clase funcional de muteínas incrementa la proliferación de células NK inducida por IL-2 con relación a aquella inducida por cualquiera de las muteínas de IL-2 de referencia, sin impactar de forma negativa (es decir, sin incrementar) la producción de citocinas pro-inflamatoria con relación a aquella inducida por cualquiera de las muteínas de IL-2 de referencia. La tercera clase funcional de muteíhas incluyen muteínas que son "bifuncionales" ya que son capaces de reducir la producción de citocinas pro-inflamatorias inducida por IL-2, por células NK, en tanto que incrementan la proliferación de células NK inducida por IL-2 en comparación a los niveles de estas actividades inducidas por cualquiera de estas dos muteínas de IL-2 de referencia. Los ensayos para medir la proliferación de células NK inducida por IL-2 y la producción de citocinas pro- inflamatorias por células NK recién aisladas, son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Perussia (1996) Methods 9:370 y Baume et al . (1992) Eur. J. Immunol . 22:1-6. La línea de células NK-92 tiene características fenotípicas y funcionales de las células NK, incluyendo proliferación de la presencia de IL-2 (Gong et al . (1994) Leukemia 8:652), en tanto que se ha reportado anteriormente (Nagashima et al . (1988) Blood 91:3850) poca o ninguna producción de TNF-a en la presencia de IL-2. Los bioensayos de IL-2 que se han desarrollado para detectar actividades funcionales de células NK y T funcionales se describen en la presente y en la sección experimental más adelante. Aunque se pueden usar otros ensayos para medir la proliferación de células NK y la producción de citocinas pro-inflamatorias de células NK, y la función efectora de células T, de manera preferente los bioensayos de IL-2 descritos en la presente se usan para detectar muteínas de IL-2 de interés para determinar si retienen las características deseadas de las muteínas descritas en la presente. De interés particular, es su inducción disminuida de producción de TNF-a por células NK. De esta manera, en una modalidad, la proliferación de células NK inducida por IL-2 y la producción de TNF-a se miden usando el bioensayo de IL-2 descrito en la presente más adelante para la línea de células NK-2 humanas (ATCC CRL-2407, CMCC ID #11925) . Para una descripción de la línea de células NK-92, ver Gong et al . (1994) Leukemia 8(4):652- 658. Para los propósitos de la presente invención, este bioensayo se refiere como el "bioensayo de NK-92" . Por "reduce" o "reducen" producción de citocinas pro-inflamatorias se propone que las muteínas de IL-2 humana de la invención induzcan un nivel de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK que se disminuye con relación a aquella inducida por las muteínas de IL-2 de referencia, es decir, la muteína de IL-2 humana, C125S, des- alanil-1 o de IL-2 humana C125S, particularmente con respecto a la inducción de producción de TNF-a por células NK. Aunque las muteínas de IL-2 humana de la presente invención induzcan un nivel mínimo de producción de TNF-a por células NK que es al menos 20 % a aquella inducida por una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo, el nivel máximo de producción de TNF-a por células NK que se puede inducir por una muteína de la presente invención depende de la clase funcional en la cual se ha categorizado una muteína. De esta manera, por ejemplo, en algunas modalidades, las muteínas se han seleccionado para mejorar en su mayor parte la inducción de la proliferación de células NK sin tener un impacto negativo en la producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK (es decir, la segunda clase funcional de muteínas) . En estas modalidades, las muteínas de IL-2 humana de la presente invención inducen un nivel de producción de TNF-a por células NK que es similar a (es decir, + 10 %) que aquél inducido por las muteínas de IL-2 de referencia o, de manera preferente, menos de 90 % de aquél inducido por las muteínas de IL-2 de referencia, donde la producción de TNF-a se valora usando la línea de células NK-92 humanas (ATCC CRL-2407, CMCC ID #11925) (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) y una concentración de 1.0 nM ó 100 pM (es decir, 0.1 nM) de las muteínas respectivas de IL-2 humana. En otras modalidades de la invención, las muteínas de IL-2 humana de la presente invención inducen un nivel - de producción de TNF-a por células NK que es menor de 90 %, de manera preferente menor de 85 %, de manera aún más preferente menos de 80 % de la producción de TNF-a inducido por una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo, donde la producción de TNF-a se valora usando la línea celular NK-92 humana, (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) y una concentración de 1.0 nM de las muteínas respectivas de IL-2 humana. En algunas modalidades, las muteínas de IL-2 humana de la invención inducen al menos 20 % pero menos de 60 % de la producción de TNF-a inducida por IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S, donde la producción de TNF-a se valora usando la línea celular NK-92 humana (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) y una concentración de 1.0 nM de las muteínas IL-2 humana, respectivas.- Estas 'muteínas, que también mantienen e incrementan la proliferación de células NK inducida por IL-2 con relación a las muteínas de IL-2 de referencia, caen dentro de la primera clase funcional de muteínas de IL-2. Por "mantener" se propone que las muteínas de IL-2 humana de la presente invención induzcan al menos 70 %, de manera preferente al menos 75 %, de manera más preferente al menos 80 %, y de manera más preferente al menos 85 % y hasta e incluyendo 100 % (es decir, valores equivalentes) de la actividad biológica deseada con relación al nivel de actividad observado para una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo. De esta manera, donde la actividad biológica deseada sea inducción de proliferación de células NK, las muteínas adecuadas de IL-2 de la invención inducen un nivel de proliferación de células NK que es al menos 70 %, de manera preferente al menos 75 %, de manera más preferente .al menos 80 %, y de manera más preferente al menos 85 %, 90 %, 95 % y hasta e incluyendo 100 % (± 5 %) de la actividad de proliferación de células NK inducida por una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S, donde la proliferación de células NK se valora bajo condiciones comparables usando el mismo bioensayo (es decir, el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) y cantidades similares de estas muteínas de IL-2. Por "intensificar" o "incrementar" o "mejorar" se propone que la muteína de IL-2 humana . induzca la actividad biológica deseada a un nivel que se incrementa con relación a aquél observado para una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo. De esta manera, donde la actividad biológica deseada sea la inducción de la proliferación de células NK", las muteínas adecuadas de IL-2 de la invención inducen un nivel de proliferación de células NK que es al menos 105%, 110 %, 115 %, de manera preferente al menos 120 %, de manera aún más preferente al menos 125 %, y de manera más preferente al menos 130 %, 140 %, ó 150 % de la actividad de proliferación de células NK observada para una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S usando el mismo ensayo de proliferación de células NK (por ejemplo, el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) . Los ensayos para medir la proliferación de células NK son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo Baume et al . (1992) Eur. J. Inmuno . 22:1-6, Gong et al . (1994) Leukemia 8(4) :652-658, y el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) . De manera preferente, las células NK-92 se usan para medir la producción de citocinas pro-inflamatorias inducida por IL-2, particularmente la producción de TNF-a, y la proliferación de células NK (es decir, el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) . Las concentraciones adecuadas de la muteína de IL-2 humana para el uso en el ensayo de proliferación de células NK incluye aproximadamente 0.005 nM (5 pM) a aproximadamente 1.0 nM (1000 pM) , incluyendo 0.005 nM, 0.02 nM, 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 1.0 nM, y otros valores por el estilo entre aproximadamente 0.005 nM y aproximadamente 1.0 nM. En modalidades preferidas descritas más adelante en la presente, el ensayo de proliferación de células NK se lleva a cabo usando células NK-92 y una concentración de muteína de IL-2 humana de aproximadamente 0.1 nM o aproximadamente 1.0 nM. Como resultado de su inducción reducida de producción de citocinas pro-inflamatorias y proliferación de células NK inducida por IL-2, mantenida o mejorada, las muteínas de IL-2 humana de la presente invención tienen una relación más favorable de proliferación de células NK inducida por IL-2 : producción de citocinas pro-inflamatorias inducida por IL-2 por las células NK que aquella de ya sea IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S, donde estas actividades se miden para cada muteína usando concentraciones comprables de proteína y condiciones del ensayo. Donde la citocina pro-inflamatoria que se mide es TNF-a, las muteínas adecuadas de IL-2 humana de la invención tienen una relación de proliferación de células NK inducida por IL-2 a muteína 0.1 rnM:producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK a muteína 1.0 nM que es al menos 1.5 veces aquella obtenida con IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S bajo condiciones similares de ensayo y concentraciones similares de proteína, de manera más preferente al menos 1.75 veces, 2.0 veces, 2.25 veces, de manera aún más preferente al menos 2.75 veces, 3.0 veces, ó 3.25 veces que la obtenida con las muteínas de IL-2 de referencia. En algunas modalidades, las muteínas de IL-2 humana de la invención tienen una relación de proliferación de células NK inducida por IL-2 a muteína 0.1 nM:producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK a muteína 1.0 nM que es al menos 3.5 veces, 3.75 veces, 4.0 veces, 4.5 veces o aún 5.0 veces aquella obtenida con la muteína de IL-2 humana, des-alanil-1 o muteína de IL-2 humana C125S bajo condiciones similares de bioensayo y concentraciones similares de proteína. Las muteínas de la presente invención también mejoran (es decir, incrementan) la supervivencia de células NK con relación a aquélla observada con IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S bajo condiciones similares de bioensayo y concentraciones similares de proteína. La supervivencia de células NK se puede determinar usando cualquier ensayo conocido en la técnica, incluyendo los ensayos descritos en la presente. De esta manera, por ejemplo, la supervivencia de células NK en la presencia de una muteína de IL-2 de interés se puede determinar al medir la capacidad de la muteína de IL-2 para bloquear la muerte celular programada de glucocorticosteroide e inducir la expresión de BCL-2 en células NK (ver, por ejemplo, Armant et al.. (1995) Immunology 85:331) . La presente invención proporciona un ensayo para monitorizar los efectos de IL-2 en la supervivencia de células NK. De esta manera, en una modalidad, la supervivencia de células NK en la presencia de una muteína de IL-2 humana de interés se determina al medir la capacidad de la muteína para inducir la cascada de señalización de supervivencia celular en células NK 3.3 (CMCC ID#2022; ver Kornblufh (1982) J. Immunol . 129 (6) : 2831-2837) usando un ELISA de pAKT. De esta manera, el favorecimiento de la expresión de la fosforilación de AKT en células NK por una muteína de IL-2 de interés se usa como un indicador de la supervivencia de células ?K. Las muteínas de IL-2 para el uso en los métodos de la presente invención activarán y/o expandirán las células aniquiladoras naturales (?K) para mediar la actividad aniquiladora activada por linfocina (LAK) y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Las células NK en reposo (no activadas) medían la citotoxicidad espontánea o natural contra ciertos objetivos celulares referidos como objetivos "sensibles a células NK" , tal como la línea de células K562 de eritroleucemia humana. Después de la activación por IL-2, las células NK adquieren actividad de LAK. Se puede valorar esta actividad de LAK, por ejemplo, al medir la capacidad de las células NK activadas por IL-2 para aniquilar una amplia variedad de células tumorales y otros objetivos "sensibles a LAK/insensibles a NK" , tal como la línea de linfoma de células B de Daudi, que es normalmente resistente a lisis por células NK en reposo (es decir, no activadas) . De manera similar, la actividad de ADCC se puede valorar al medir la capacidad de células NK activadas por IL-2 para lisar células objetivo "sensibles a LAK/insensibles a NK" , tal como la línea de linfoma de células B de Daudi, u otras células objetivo no lisadas fácilmente por células NK de reposo (es decir, no activadas) en la presencia de concentraciones óptimas de anticuerpos pertinentes específicos de células tumorales. Los métodos para generar y medir la actividad citotóxica de células NK/LAK y ADCC se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Immunology. Immunologic Studies in Humans, Supplement 17, Unit 7.7, 7.18 y 7.27 (John Wiley & Sons, Inc., 1996) . En una modalidad, la actividad de ADCC de las muteínas de IL-2 de la invención se mide usando la línea de células NK3.3 , que exhibe características fenotípicas y funcionales de las células NK de sangre periférica. Para propósitos de la presente invención, este ensayo se refiere en la presente como el "bioensayo de citotoxicidad de NK3.3". Las muteínas de IL-2 humana de la invención también pueden mantener o intensificar la proliferación de células T inducida por IL-2 en comparación a aquella observada, para IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 C125S bajo condiciones similares de bioensayo y concentraciones similares de proteína. Los ensayos de proliferación de células T son bien conocidos en la técnica. En una modalidad, la línea de células T humana Kit225 (CMCC ID#11234; Hori et al . (1987) Blood 70 (4) : 1069-1072) se usa para medir la proliferación de células T de acuerdo con el ensayo descrito en la presente más adelante. Como se señala anteriormente, los candidatos de muteína de IL-2 humana identificados en la presente (es decir, aquellas muteínas nuevas que tienen el índice terapéutico más mejorado) caen dentro de tres clases funcionales. La primer clase funcional incluye aquellas muteínas que inducen un nivel menor de producción de TNF-a por células NK, aproximadamente 60 % o menos, de aquella inducida por IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S cuando todas las muteínas se valoran bajo condiciones similares a una concentración de proteína de 1.0 nM, y que mantiene o mejora la proliferación de células NK con relación a IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S. Estas muteínas se pueden subdividir adicionalmente en dos sub-clases: (1) aquellas muteínas de IL-2 humana que mejora (es decir, por más de 100 %) la proliferación de células NK inducida por IL-2 con relación a aquella observada para las muteínas de IL-2 humana de referencia cuando estas muteínas se valoran bajo condiciones similares de ensayo a una concentración de proteína de aproximadamente 1.0 nM, pero que tienen actividad proliferativa reducida de células NK (es decir, menos de 100 %) con relación a aquélla observada para las muteínas de IL-2 humana de referencia a concentraciones de aproximadamente 0.1 nM o menor; y (2) aquellas muteínas de IL-2 humana que mejoran (es decir, más de 100 %) o mantienen (es decir, al menos 70 % hasta aproximadamente 100 %) la proliferación de células NK inducida por IL-2 con relación a aquella observada para las muteínas de IL-2 humana de referencia cuando estas muteínas se valoran bajo condiciones similares de ensayo a concentraciones de proteína de aproximadamente 1.0 nM hacia abajo hasta aproximadamente 0.05 nM (es decir, aproximadamente 50 pM)" . En algunas modalidades, la proliferación de NK inducida por IL-2 y la producción de TNF-a se determinan usando células NK-92 (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) , en el cual se determina la proliferación de células NK usando un equipo comercialmente disponible de reducción de tinte MTT (CellTiter 96®, Equipo de Ensayo de Proliferación- Celular no Radioactivo, disponible de Promega Corp., Madison, Wisconsin) y un índice de estimulación se calcula en base a una lectura colorimétrica; y TNF-a se cuantifica usando un equipo de ELISA de TNF-a comercialmente disponible (BioSource CytoscreenMR, equipo de ELISA de TNF-a Humano; Camarillo, California) . Las muteínas de IL-2 humana dentro de la subclase (1) de la primera clase funcional incluyen aquellas muteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con al menos una de las sustituciones de combinación seleccionadas del grupo que consiste de 19D40D, 36D61R, 36D65L, 40D61R, 40D65Y, 40G65Y, 81K91D, donde la posición del residuo (es decir, 19, 36, 40, 61, 65, 81 ó 91) es con relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a SEQ ID NO: 4) . Ver, Ejemplo 2, y Tabla 3 más adelante en la presente. Las muteínas de IL-2 humana dentro de la subclase (2) de la primera clase funcional incluyen aquellas muteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con al menos una de las sustituciones de combinación seleccionadas del grupo que consiste de 40D72N, 80K65Y, 81K88D, 81K42E, 81K72N, 107H65Y, 107R72N, donde la posición del residuo (es decir, 40, 42, 65, 72, 80, 81, 88 ó 107) es con relación a la muteína de IL-2 humana madura (es decir, con relación al SEQ ID NO:4) . Ver Ejemplo 2, y Tabla 4 más adelante en la presente . La segunda clase funcional de muteínas de IL-2 humana incluye aquellas muteínas que incrementan fuertemente la proliferación de células NK sin impacto perjudicial en la producción TNF-a inducida por IL-2 por células NK. Las muteínas dentro de este grupo funcional cumplen con los tres criterios de selección: (1) nivel de proliferación de células NK inducida por IL-2 que es mayor de aproximadamente 200 % de aquél inducido de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S a una o más concentraciones de muteína de IL-2 humana seleccionada del grupo que consiste de 0.005 nM (es decir, 5 pM) , 0.02 nM (es decir, 20 pM) , 0.05 nM (es decir, 50 pM) , 0.1 nM (es decir, 100 pM) , ó 1.0 nM (es decir, 1000 pM) ; (2) nivel de proliferación de células NK inducida por IL-2 que es mayor de aproximadamente 150 % de aquél inducido por IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S cuando se mide por al menos dos concentraciones de muteína de IL-2 humana seleccionados del grupo que consiste de 0.005 nM (es decir, 5 pM) , 0.02 nM (es decir, 20 pM) , 0.05 nM (es decir, 50 pM) , 0.1 nM (es decir, 100 pM) , ó 1.0 nM (es decir, 1000 pM) ; y (3) un nivel de producción de TNF-a inducido por IL-2 por células NK que es similar a (es decir, ± 10 %) aquél indicudo por las muteínas de IL-2 de referencia o de manera preferente, menor de 90 % de aquél inducido por las muteínas de IL-2 de referencia, donde la producción de TNF-a se valora a una concentración de muteína de 1.0 nM (es decir, 1000 pM) ó 0.1 nM (es decir, 100 pM) . En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK y la proliferación de células NK inducida por IL-2 se determinan usando células NK-92 (es decir, usando el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) , en el cual se mide la producción de TNF-a usando ELISA, y se mide la proliferación de células NK por un ensayo de MTT como se denota anteriormente en la presente. Las muteínas de IL-2 humana dentro de esta segunda clase funcional incluyen aquellas muteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 C125S, des-alanil-1 (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con al menos una de las sustituciones de combinación seleccionada del grupo que consiste de 19D81K, 40G36D, y 81K36D, donde la posición del residuo (es decir, 19, 36, 40 u 81) es con relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a SEQ ID NO: 4) . Ver Ejemplo 3, y Tabla 5 más adelante en la presente. La tercera clase funcional de muteínas de IL-2 humana incluye aquellas muteínas que son "bi-funcionales" que ya sea inducen proliferación incrementada de células NK y producción disminuida de TNF-a por células NK con relación a las muteínas de IL-2 de referencia. Las muteínas dentro de esta tercera clase funcional cumplen con los siguientes criterios: (1) inducen un nivel de proliferación de células NK que es al menos aproximadamente 150 % de aquél observado para IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S cuando se valoran para cualquier concentración de muteínas seleccionada del grupo que consiste de 0.005 nM (es decir, 5 pM) , 0.02 nM (es decir, 20 pM) , 0.05 nM (es decir, 50 pM) , 0.1 nM (es decir, 100 pM) , ó 1.0 nM (es decir, 1000 pM) , y (2) inducen un nivel de producción de TNF-a por células NK que es menor de aproximadamente 75 % de aquél inducido por IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S cuando se valoran a una concentración de muteína de aproximadamente 1.0 nM. En una modalidad, la producción de TNF-a inducida por IL-2 y proliferación de células NK inducida por IL-2 se determinan usando células NK-92 (es decir, el bioensayo de NK-92 descrito en la presente) , en el cual se mide la producción de TNF-a inducida por IL-2 usando ELISA, y se mide la proliferación de células NK inducida por IL-2 por un ensayo de MTT como se describe anteriormente en la presente. Las muteínas de IL-2 humana dentro de esta tercera clase funcional incluyen aquellas muteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 (SEQ ID N0-.8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID N0:6) con al menos una de las sustituciones de combinación seleccionada del grupo que consiste de 36D42R, 36D80K, 40D80K, 81K61R, 91N95G, 107H36D, 107R36D, y 91N94Y95G, donde la posición del residuo (es decir, 36, 40, 42, 61, 80, 81, 91, 94, 95, ó 107) es con relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a SEQ ID NO: 4) . Ver Ejemplo 4 y Tabla 6 más adelante en la presente. La presente invención también proporciona muteínas de IL-2 humana que cumplen otros criterios de selección que contribuyen a un índice terapéutico mejorado con relación a aquél observado para IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S. De esta manera, por ejemplo, en otra modalidad, la presente invención proporciona muteínas de IL-2 humana que también exhiben una relación de proliferación de células NK inducida por IL-2 a 0.1 nM de muteína con relación a la producción de TNF-a inducida por IL-2 por células NK a muteína 1.0 nM que es al menos 1.25 veces mayor, 1.5 veces mayor, 1.75 veces mayor, de manera preferente al menos 2.0 veces mayor, 2.5 veces mayor, 3.0 veces mayor, de manera más preferente al menos 3.5 veces mayor, 3.75 veces mayor, 4.0 veces mayor, 4.5 veces mayor, y hasta aproximadamente 5.0 veces mayor que aquél observado para IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S.
Las muteínas que cumplen estos criterios incluyen todas las muteínas mostradas en la Tabla 1, con la excepción de la muteína de IL-2 humana que comprende la sustitución de combinación 19D40D. Un incremento en este índice es predictivo de beneficio clínico mejorado en vista de los efectos benéficos de la función efectuada mejorada de células NK y toxicidad reducida.
Variantes Biológicamente Activas de las Nuevas Muteínas de IL-2 Humana La presente invención también proporciona variantes biológicamente activas de las nuevas muteínas de IL-2 humana descritas en la presente que también tienen estas propiedades mejoradas con relación a la molécula de IL-2 de referencia, es decir, las variantes biológicamente activas inducen poca o reducida producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK, así como mantienen o incrementan la proliferación de células NK, en comparación a la molécula de IL-2 de referencia, es decir, IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S usando los bioensayos descritos en otra parte de la presente. Como se señala -anteriormente, se reconoce que una variante de cualquier nueva muteína dada de IL-2 humana identificada en la presente puede tener un nivel absoluto diferente de una actividad biológica particular con relación a aquella observada para la nueva muteína IL-2 humana de la invención, en tanto que tiene las características deseadas con relación a las moléculas de IL-2 de referencia, es decir, toxicidad reducida, que es producción reducida de citocinas pro- inflamatorias, y/o proliferación incrementada de células NK en comparación a la molécula de IL-2 de referencia, es decir, IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S, usando los bioensayos descritos en otra parte de la presente . Por "variante" se propone secuencias sustancialmente similares. Las variantes de las nuevas muteínas de IL-2 humana descritas en la presente se pueden derivar de secuencias de aminoácidos o ácido nucleico que se presentan de forma natural (por ejemplo, variantes alélicas que se presentan en el locus IL-2) o producidas de forma recombinante (por ejemplo, muteínas) . Las variantes de polipéptido pueden ser fragmentos de las nuevas muteínas de IL-2 humana descritas en la presente, o pueden diferir de las nuevas muteínas de IL-2 humana al tener una o más sustituciones o supresiones de aminoácidos adicionales, o inserciones de aminoácidos, en tanto que el polipéptido variante retenga las sustituciones particulares de aminoácidos de interés que están presentes dentro de las nuevas muteínas de IL-2 humana descritas en la presente. De esta manera, las variantes de polipéptido adecuadas incluyen aquellas con la sustitución de C125S que corresponde a la posición 125 de la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, SEQ ID N0:4), una de las sustituciones de combinación identificadas en la presente como que contribuyen al índice terapéutico mejorado de las nuevas muteínas de IL-2 humana de la presente invención (es decir, las sustituciones de combinación mostradas en la Tabla 1 anterior) , y que tienen una o más sustituciones o supresiones de aminoácidos, adicionales, o inserciones de aminoácidos. De esta manera, por ejemplo, cuando la nueva muteína de IL-2 humana comprende la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 (SEQ ID NO: 8) o IL-2 humana C125S (SEQ ID NO: 6) con una de las sustituciones de combinación mostradas en la Tabla 1, las variantes biológicamente activas, adecuadas., de estas nuevas muteínas de IL-2 humana también comprenderán la sustitución C125S así como la sustitución de combinación mostrada en la Tabla 1, pero pueden diferir de la nueva muteína respectiva de IL-2 humana al tener una o más sustituciones, inserciones o supresiones adicionales, en tanto que el polipéptido variante tiene las características deseadas con relación a la molécula de IL-2 de referencia (es decir, la muteína de IL-2 de referencia, IL-2 humana C125S ó IL-2 humana C125S, des-alanil-1) , y de esta manera tienen toxicidad reducida, que es producción reducida de citocinas pro-inflamatorias, y/o proliferación incrementada de células NK en comparación a la molécula de IL-2 de referencia (es decir, IL-2 humana C125S ó IL-2 humana C125S, des-alanil-1) . Estas variantes tendrán la secuencia de aminoácidos que son al menos 70 %, en general al menos 75 %, 80 %, 85%, 90 % idénticas, de manera preferente al menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idénticas a la secuencia de aminoácidos para la respectiva muteína nueva de IL-2 humana, por ejemplo, la nueva muteína de IL-2 humana expuesta en SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 , 68, 70, ó 72, donde al por ciento de identidad de secuencia se determina como se señala más adelante en la presente. En otras modalidades, las variantes biológicamente activas tendrán secuencias de aminoácidos que son al menos 70 %, en general al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 % idéntica, de manera preferente al menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idénticas a la secuencia de aminoácidos expuesta en los residuos 2-133 de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, ó 72, donde el por ciento de identidad de secuencia se determina como se señala más adelante en la presente. En algunas modalidades de la invención, las variantes biológicamente activas de las muteínas de IL-2 humana de la invención tienen la sustitución C125S reemplazada por otro aminoácido neutral tal como alanina, que no afecta las características funcionales deseadas de la muteína de IL-2 humana. De esta manera, por ejemplo, estas variantes tienen una secuencia de aminoácidos que comprende un residuo de alanina sustituido por el residuo de serin.a en la posición 125 de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, ó 72. En aún otras modalidades, las variantes biológicamente activas de las muteínas de IL-2 humana de la invención comprenden los residuos 2-133 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, ó 72, con la excepción que tienen un residuo de alanina sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de estas secuencias. En modalidades alternativas de la invención, las variantes biológicamente activas de las. muteínas de IL-2 humana de la invención comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 4-0, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, ó 72, con la excepción de que tienen un residuo de cisteína sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de estas secuencias. En aún otras modalidades, las variantes biológicamente activas de las muteínas de IL-2 humana de la invención comprenden los residuos 2-133 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 , 62 , 64, 66 , 68, 70, ó 72, con la excepción que tienen un residuo de cisteína sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de estas secuencias. Por ácido nucleico "variante" se propone un polinucleótido que codifica para una nueva muteína de IL-2 humana de la invención pero cuya secuencia de nucleótidos difiere de la secuencia de la nueva muteína descrita en la presente debido a la degeneración del código genético. Son bien conocidos en la técnica los codones para los aminoácidos que se presentan de forma natural, incluyendo aquellos codones que se usan más frecuentemente en organismos hospedadores particulares usados para expresar proteínas recombinantes . Las secuencias de nucleótidos que codifican para las muteínas de IL-2 descritas en la presente incluyen aquellas expuestas en el listado de secuencias anexo, así como secuencias de nucleótidos que difieren de las secuencias descritas debido a la degeneración en el código genético. De esta manera, por ejemplo, donde la muteína de IL-2 de la invención comprende una sustitución de ácido aspártico (es decir, D) , tal como en la muteína C125S o C125S, des-alanil-1 que comprenden la sustitución de combinación 19D40D, 19D81K, 36D42R, 36D614, 36D65L, 40D36D, 40D61R, 40D65Y, 40D72N, 40D80K, 40G36D, 80K36D, 81K36D, 81K88D, 81K91D, 107H36D, 107R36D, ó 40D81K107H, la secuencia de nucleótidos que codifica para el residuo sustituido de ácido aspártico se puede seleccionar de los dos codones de triplete universales para ácido aspártico, es decir, GAC y GAT. Donde la sustitución de combinación comprende dos- sustituciones de residuos similares, tal como en las muteínas que comprenden la sustitución de combinación 19D40D ó 40D36D, los residuos sustituidos se pueden codificar por el mismo codón universal (es decir, ambas sustituciones codificadas ya sea por GAC o GAT) o se pueden codificar por codones universales alternativos (es decir, una sustitución codificada por GAC y otra sustitución codificada por GAT) . De manera similar, donde la muteína de IL-2 de la invención comprende una sustitución de glicina, (es decir, G) , tal como en la muteína de C125S ó C125S, des-alanil-1 que comprende la sustitución de combinación 40G36D, 40G65Y, 91N95G, 40G81K107H, ó 91N94Y95G, la secuencia de nucleótidos que codifica para el residuo sustituido de glicina se puede seleccionar de los cuatro codones de triplete universales para glicina, es decir, GGT, GGC, GGA, y GGG. Donde la muteína de IL-2 de la invención comprende una sustitución de glicina (es decir, K) , tal como en la muteína de C125S ó C125S, des-alanil-1, que comprende la sustitución de combinación 19D81K, 40D80K, 80K36D, 80K65Y, 81K36D, 81K42E, 81K61R, 81K65Y, 81K72N, 81K88D, 81K91D, 81K107H, 40D81K107H, ó 40G81K107H, la secuencia de nucleótidos que codifica para el residuo sustituido de lisina se puede seleccionar de los dos codones de triplete universales para lisina, es decir, AAA y AAG. De manera similar, donde la muteína de IL-2 de la invención comprende una sustitución de leucina (es decir, L) , tal como en la muteína de C125S ó C125S, des-alanil-1, que comprende la sustitución de combinación 36D65L u 81L107H, la secuencia de nucleótidos que codifica para el residuo sustituido de leucina se puede seleccionar en los seis codones de triplete universales para leucina, es decir, TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, y CTG. Donde la muteína de IL-2 de la invención comprende una substitución de asparagina (es decir, N) , tal como la muteína de C125S o C125S, des-alanil-1 , que comprende la substitución de combinación 40D72N, 81K72N, 91N95G, 107R72N, o 91N94Y95G, la secuencia de nucleótidos que codifica para el residuo sustituido de asparagina se puede seleccionar de los dos codones de triplete universales para asparagina, es decir, GAT y GAC. De manera similar, donde la proteína de IL-2 de la invención comprende una substitución de histidina (es decir, H) , tal como en la muteína de C125S o C125S, des-alanil-1 , que comprende la substitución de combinación 81K107H, 81L107H, 107H36D, 107H42E, 107H65Y, 40D81K107H, o 40G81K107H, la secuencia de nucleótidos que codifica para el residuo sustituido de histidina se puede seleccionar de los dos codones de triplete universales para histidina, es decir, CAT y CAC. Donde la muteína de IL-2 de la invención comprende una substitución de arginina (es decir, R) tal como en la muteína de C125S o C125S, des-alanil-1 que comprende la substitución de combinación 36D42R, 36D61R, 40D61R, 81K61R, 107R36D, o 107R72N, la secuencia de nucleótidos que codifica para el residuo sustituido de arginina se puede seleccionar de los seis codones de triplete universales para arginina, es decir, CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, y AGG. De manera similar, donde la muteína de IL-2 de la invención comprende una substitución de tirosina (es decir, Y) , tal como en la muteína de C125S o C125S, des-alanil-1 que comprende la substitución de combinación 40D65Y, 40G65Y, 80K65Y, 81K65Y, 107H65Y o 91N94Y95G, la secuencia de nucleótidos que codifica para el residuo sustituido de tirosina se puede seleccionar de los dos codones de triplete universales para tirosina, es decir, TAT y TAC. Donde la muteína de IL-2 de la invención comprende una substitución de ácido glutámico (es decir, E) , tal como en la muteína de C125S o C125S, des-alanil-1 que comprende la substitución de combinación 81K42E o 107H42E, la secuencia de nucleótidos que codifica para el residuo sustituido de ácido glutámico se puede seleccionar de los dos codones de triplete universales para ácido glutámico, es decir, GAA y GAG. Aunque la lista anterior de variantes de ácido nucleico ha citado los codones universales que se pudieran utilizar para codificar las sustituciones particulares de residuos identificadas en la presente, se reconoce que la presente invención abarca todas las variantes de ácido nucleico que codifiquen para las muteínas de IL-2 humana descritas en la presente como resultado de la degeneración en el código genético. Las variantes alélicas que se presentan de forma natural de IL-2 humana nativas se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación, y pueden servir como guía a las mutaciones adicionales que se pueden introducir en las muteínas de IL-2 humana descritas en la presente sin impactar el índice terapéutico deseado de estas nuevas muteínas de IL-2 humana. Las secuencias variantes de nucleótídos también incluyen muteínas derivadas de las secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas que se han generado, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio pero que codifican aún para las nuevas muteínas de IL-2 descritas en la presente, como se analizan más adelante. En general, las variantes de secuencia de nucleótidos de la invención tendrán 70 %, en general al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 % de identidad de secuencia, de manera preferente al menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia a sus respectivas secuencias de nucleótidos' de la nueva muteína de IL-2 humana, por ejemplo, con respecto a una secuencia de codificación de una nueva proteína de IL-2 humana expuesta en SEQ ID Nos: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 o 71, donde el por ciento de identidad de secuencia se determina como se señala más adelante en la presente. En otras modalidades, las variantes de secuencias de nucleótidos de la invención tendrán al menos 70 %, en general al menos 75 %, 80 %, • 85 %, 90 %, de identidad de secuencia, de manera preferente al menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de ' secuencia a los nucleótidos 4-399 de la secuencia de codificación expuesta en SEQ ID No : 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 o 71, donde el por ciento de identidad de secuencia se determina como se señala más adelante en la presente. Como se usa en la presente, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un cuadro de lectura abierto que comprende una muteína de IL-2 de la invención. Como se usa en la presente, la frase "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se presenta en un locus de IL-2 o un polipéptido codificado por esa secuencia de nucleótidos. Estas variaciones alélicas naturales pueden dar por resultado, típicamente 1-5 % de variación en la secuencia de nucleótidos del gen de IL-2. Cualquiera y todas las variaciones de nucleótidos y polimorfismos resultantes de aminoácidos ó variaciones en una secuencia de IL-2 que sean el resultado de variación alélica natural y que no alteren la actividad funcional de las nuevas muteínas de IL-2 humana de la invención se propone que sean secuencias que se pueden mutar de acuerdo a la presente invención y todas las secuencias resultantes se propone que caigan dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, las variaciones de secuencias de aminoácidos de las nuevas muteínas de IL-2 humanas descritas en la presente se pueden preparar al hacer mutaciones en la secuencia de ADN clonado que codifica para la nueva muteína de IL-2, en tanto que las mutaciones no alteren las sustituciones de combinación identificadas en la Tabla 1. Los métodos para la mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Walker y Gaatra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc . Nati . Acad . Sci . USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol . 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York); Patente de los Estados Unidos No. 4,873,192; y referencias citados en los mismos. La guía para sustituciones apropiadas de aminoácidos que no puedan afectar la actividad biológica deseada de la muteína de- IL-2 (es decir, producción reducida de citocinas pro-inflamatorias por células NK predictiva de toxicidad reducida y proliferación mantenida o incrementada de células NK) se puede encontrar en el modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Polypeptide Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found. , Washington, D.C.) . Cuando se diseñan variantes biológicamente activas de una muteína de IL-2 humana descrita en la presente, se pueden preferir sustituciones conservadoras, tal como cambiar un aminoácido con otro que tenga propiedades similares. Una "substitución conservadora de aminoácido" es una en la cual el residuo de aminoácido se remplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han identificado en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Ver, por ejemplo, Bowie et al. (1990) Science 247:1306. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen, de manera enunciativa y sin limitación Gly Ala, Val <?= lie = Leu, Asp Glu, Lys <=> Arg, Asn <í=> Gln, y Phe <i=> Trp => Tyr. De manera preferente, estas sustituciones no se harán para residuos conservados de cisteína, tal como los residuos de cisteína contiguos amino-terminales. La guía en cuanto a las regiones de la proteína de IL-2 humana que se pueden alterar ya sea mediante sustituciones de residuos, supresiones o inserciones fuera de las sustituciones deseadas identificadas en la presente, se puede encontrar en la técnica. Ver, por ejemplo las relaciones de estructura/función y/o estudios de unión analizados en Bazan (1992) Science 257:410-412; McKay (1992) Science 257:412; Theze et al. (1996) Immunol . Today 17:481-486; Buchili y Ciardelli (1993) Biochem . Biophys 307:411-415; Collins et al. (1988) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 85:7709-7713, Kuziel et al. (1993). J. Immunol . 150:5731; Eckenberg et al. (1997) Cytokine 9:488-498. Al construir variantes de una nueva muteína de IL-2 humana de la invención, las modificaciones a las secuencias de nucleótidos que codifican para las variantes se harán tal que los polipéptidos variantes puedan continuar poseyendo la actividad deseada. Obviamente, cualquier mutación hecha en el ADN que codifica para un polipéptido variante no colocará la secuencia fuera del cuadro de lectura y de 'manera preferente no creará regiones complementarias que pudieran producir estructura secundaria de ARNm. Una variante de un polipéptido puede diferir por tan poco como 1 a 15 residuos de aminoácido, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o aún 1 residuo de aminoácidos . Una variante de una secuencia de nucleótidos puede diferir por tan poco como 1 a 30 nucleótidos, tal como 6 a 25, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o aún 1 nucleótido . Las variantes biológicamente activas de las muteínas de IL-2 humana de la invención, incluyen fragmentos de estas muteínas. Por "fragmento" se propone una porción de la secuencia de nucleótidos codificante o una porción de la secuencia de aminoácidos. Con respecto a las secuencias codificantes, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos de muteína de IL-2 humana pueden codificar para fragmentos de muteína que retiene la actividad biológica deseada de la nueva muteína de IL-2 humana. Un fragmento de una nueva muteína de IL-2 humana descrita en la presente puede ser de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130 aminoácidos o hasta la longitud completa del nuevo polipéptido de IL-2 humana. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos codificante pueden variar desde al menos 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 165, 180, 195, 210, 225, 240, 255, 270, 285, 300, 315, 330, 345, 360, 375, 390, nucleótidos, y hasta la secuencia completa de nucleótidos que codifica para la nueva muteína de IL-2 humana. Las muteínas de IL-2 humanas descritas en la presente y las variantes biológicamente activas de las mismas se pueden modificar adicionalmente en tanto que tengan las características deseadas con relación a las moléculas de IL-2 de referencia, es decir, toxicidad reducida y/o proliferación incrementada de células NK con relación a la muteína de IL-2 humana C125S o muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1. Las modificaciones adicionales incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, fosforilización, substitución de análogos no naturales de aminoácidos, y similares. Las modificaciones a las muteínas de IL-2 que pueden conducir a exposición in vivo prolongada, y por lo tanto incrementar la eficiencia de las formulaciones farmacéuticas de muteína de IL-2, incluyen glicosilación o PEGilación de la molécula de proteína. La glicosilación de proteínas no glicosiladas de forma nativa usualmente se realiza por inserción de sitios de glicosilación N-enlazados en la molécula. Este planteamiento se puede usar para prolongar la vida media de las proteínas tal como muteínas de IL-2. Además, este planteamiento se puede usar para proteger los epitopes inmunogénicos, incrementar la solubilidad de proteína, reducir la agregación e incrementar los rendimientos de la expresión y purificación. Una vez que se obtienen las variantes de las muteínas de IL-2 humanas descritas en la presente, las supresiones, inserciones y sustituciones de las secuencias de muteína de IL-2 humana no se espera que produzcan cambios radicales en las características de la muteína particular de IL-2 humana. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la substitución, supresión o inserción por adelantado, un experto en la técnica apreciará que el efecto se valora por ensayos de detección 'de rutina. Es decir, la actividad de proliferación de células NK o T inducida por IL-2 se puede evaluar por ensayos normales de proliferación celular conocidos por aquellos expertos en la técnica, incluyendo los ensayos descritos en la presente. • La producción de citocinas pro- inflamatorias inducida por IL-2. se puede medir usando ELISA, específicos ' de citocinas, por ejemplo, el ELISA específico de TNF-a señalado en otra parte de la presente. Se puede medir la señalización de supervivencia de células NK por un ELISA de pAKT (ver, por ejemplo, el ensayo descrito más adelante en la presente) . Se puede medir la' actividad citolítica mediada por células NK (es decir, citotoxicidad) por ensayos conocidos en la técnica (por ejemplo, medición de la actividad citolítica mediada por ADCC o mediada por LAK, mediada por NK como se señala en otra parte de la presente. Las muteínas de IL-2 humana descritas en la presente, y variantes biológicamente activas de las mismas, se pueden construir como fusiones o conjugados de IL-2 que comprenden la muteína de IL-2 (o variante biológicamente activa de la misma como se define en la presente) fusionada a una segunda proteína o enlazada covalentemente a poliprolina o un polímero soluble en agua para reducir las frecuencias de dosificación o para mejorar adicionalmente la tolerabilidad de IL-2. Por ejemplo, la muteína de IL-2 humana (o variante biológicamente activa de la misma como se define en la presente) se puede fusionar a albúmina humana o un fragmento de albúmina usando métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo, WO 01/79258) . De manera alternativa, la muteína de IL-2 humana (o variante biológicamente activa de la misma como se define en la presente) se puede conjugar de manera covalente a homopolímeros de poliprolina o polietilenglicol y polioles polioxietilados, en donde el homopolímero está insustituido o sustituido en un extremo con un grupo alquilo y el popliol está insustituido, usando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos Nos. 4,766,106, 5 , 206 , 344 y 4 , 894 , 226) . Por "identidad de secuencia" se propone los mismos nucleótidos o residuos de aminoácido que se encuentran dentro de la secuencia variante y una secuencia de referencia cuando un segmento contiguo, especificado de la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos de la variante se alinea y compara a la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos de la secuencia de referencia. Los métodos para alineación de secuencia y para determinar la identidad entre secuencias son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) ; y el programa ALIGN (Dayhoff (1978) en Atlas of Polypeptide Sequence and Structure 5: Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington. D.C.). Con respecto a la alineación óptima de dos secuencias nucleótidos, el segmento contiguo de la secuencia de nucleótidos variante puede tener nucleótidos adicionales o nucleótidos suprimidos con respecto a la secuencia de nucleótidos de referencia. Igualmente, para propósitos de alineación óptima de dos secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia de aminoácidos variante puede tener residuos de aminoácidos adicionales o residuos de aminoácido suprimidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El secuencia contiguo usado para comparación a la secuencia de nucleótidos de referencia o secuencia de aminoácidos de referencia comprenderá al menos 20 nucleótidos contiguos, - o residuos de aminoácido, y pueden ser 30, 40, 50, 100 o más nucleótidos o residuos de aminoácido . Las colecciones para identidad incrementada de secuencia, asociada con inclusión de separaciones en la secuencia de nucleótidos de la variante o secuencia de aminoácidos de la variante se pueden hacer al asignar penalidades de separación. Son bien conocidos en la técnica •los métodos de alineación de secuencias. La determinación del por ciento de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. Para propósitos de la presente invención, el por ciento de identidad de secuencia de una secuencia de aminoácidos se determina usando el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman que se enseña en Smith y Waterman (1981) Adv. Appl . Math 2 : 482-489. De manera alternativa, el por ciento de identidad de una secuencia de nucleótidos se determina usando el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una penalidad de abertura de separación de 25 y una penalidad de extensión de separación de 5. Esta determinación de identidad de secuencia se puede realizar, por ejemplo usando el DeCypher Hardware Accelerator de TimeLogic . Adicionalmente se reconoce que cuando se considera el por ciento de identidad de aminoácidos, algunas posiciones de aminoácidos pueden diferir como resultado de las sustituciones conservadoras de aminoácidos, que no afectan las propiedades de la función del polinucleótido. En estos casos, el por ciento de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba para dar cuenta de la similitud en los aminoácidos conservadoramente sustituidos. Estos ajustes son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo Meyers et al. (1988) Computer Applic . Biol . Sci . 4:11-17.
Vectores de Expresión Recombinante y Células Hospedadoras En general, las muteínas de IL-2 humana de la invención se expresarán de vectores, de manera preferente vectores de expresión. Los vectores son útiles para la replicación autónoma en una célula hospedadora o se puede integrar en el genoma de una célula hospedadora en la introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto el genoma hospedador (es decir, vectores de mamífero no episomales) . Los vectores de expresión son capaces de dirigir la expresión de secuencias codificantes a las cuales están enlazadas de forma operable. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de 7ADN recombinante frecuentemente están en la forma de plásmidos (vectores) . Sin embargo, la invención se propone que incluya otras formas de vectores de expresión, tal como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus, y virus adeno-asociados) . Las construcciones de expresión o vectores de la invención comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica para una muteína de IL-2 humana de la presente invención en una forma adecuada para la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula hospedadora. La secuencia codificante de interés se puede preparar por técnicas de ADN recombinante como se describe, por ejemplo por Taniguchi et al. (1983) Nature 302:305-310 y Devos (1983) Nucleic Acids Research 11:4307-4323 o usando IL-2 mutacionalmente alterada como se describe por Wang et al . (1984) Science 224:1431-1433. Se reconoce que las secuencias codificantes expuestas en las SEQ ID Nos: 9-71 impares empiezan con un codón para el primer residuo de la secuencia de IL-2 humana madura de SEQ ID No: 4 (es decir, un codon para la alanina en la posición 1) , en lugar de un codon para metionina, que en general es el codon de inicio de traducción, ATG en el ARN mensajero. Estas secuencias de nucleótidos descritas también carecen de un codon de terminación de traducción seguido por el nucleótido en la posición 399 de SEQ ID Nos: 9-71 impares. Donde estas secuencias, o secuencias que comprenden los nucleótidos 4- 399 de SEQ ID Nos: 9-71 impares, se van a usar para expresar las muteínas de IL-2 humana de la invención, se reconoce que la construcción de expresión que comprende estas secuencias codificantes de muteína de IL-2 humana comprenderán adicionalmente un codon de inicio de traducción, por ejemplo, un codon ATG, en la dirección 5' y en el cuadro de lectura apropiado dentro de la secuencia codificante de muteína de IL-2 humana. El codon de inicio de traducción se puede proporcionar en una ubicación en la dirección 5' del codon inicial de la secuencia codificante de muteína de IL-2 humana al utilizar un codon de inicio de traducción, por ejemplo, ATG, que está ya en una secuencia que comprende la secuencia codificante de muteína de IL-2 humana, o puede ser proporcionado de otro modo de una fuente extraña tal como el plásmido que se va a usar para la expresión, con la condición que el codon de inicio de traducción aparezca primero antes de donde está el codon inicial en la secuencia codificante de IL-2 humana en el cuadro de lectura apropiada con el codon inicial de la secuencia codificante de muteína de IL-2 humana. De manera similar, la secuencia codificante de muteína de IL-2 humana descrita en la presente se seguirá por uno o más codones de terminación de traducción, por ejemplo, TGA, para permitir que la producción de una muteína de IL-2 humana que termina con el último aminoácido de la secuencia expuesta en los SEQ ID Nos: 10-72 pares. Los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células hospedadoras que se van a usar para la expresión, enlazadas operablemente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. "Enlazada de forma operable" se propone que signifique que la secuencia de nucleótidos de interés (es decir, una secuencia que codifica para una muteína de IL-2 humana de la presente invención) se enlace a las secuencias reguladoras de una manera que permita la expresión de la secuencia de nucleótidos (por. ejemplo, en un sistema de .trascripción/traducción in vi tro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora) . Las "secuencias reguladoras" incluyen promotores, intensificadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación).
Ver, por ejemplo, Goeddel (1990) en Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academia Press, San Diego, California) . Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas del tejido) . Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tal como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, y similares. Las construcciones de expresión de la invención se pueden introducir en células hospedadoras para producir de este modo las muteínas de IL-2 humanas descritas en la presente o producir variantes biológicamente activas de las mismas. Las construcciones de expresión o vectores de la invención se pueden diseñar para la expresión de la muteína de IL-2 humana o variante de la misma en células hospedadoras procarióticas o eucarióticas. Más frecuentemente la expresión de las proteínas en las procariotas se lleva a cabo en Escherichia coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles . Las estrategias para aumentar al máximo la expresión de proteínas recombinantes en E. Coli se puede encontrar, por ejemplo en Gottesman (1990) en Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 1985 (Academic Press, San Diego, CA) , pp 119-128 y Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res . 20:2111-2118. Los procesos para cultivar, recolectar, interrumpir y extraer la muteína de IL-2 humana o variante de la misma de células se describen sustancialmente por ejemplo en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,604,377; 4,738,927; 4,656,132; 4,569,790; 4,748,234; 4,530,787; 4,572,798; 4 , 748 , 234 y 4 , 931 , 543. Los muteínas de IL-2 humana, recombinantes o variantes biológicamente activas de las mismas también se pueden elaborar en eucariotas, tal como levadura o células humanas. Las células hospedadoras eucarióticas adecuadas incluyen células de insecto (ejemplos de vectores de Baculovirus adecuados para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol . Cell Biol . 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39)); células de levadura (ejemplos de vectores para expresión en levadura S. cerevisiae que incluyen pYepSecl (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:299-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) , y pPicZ (Invitrogen Corporation, San Diego, California) ) ; o en células de mamífero (vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al . (1987) EMBO J. 6:187:195)). Las células de mamífero adecuadas incluyen células de ovario de hámster Chino (CHO) o células COS. En células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión frecuentemente se proporcionan por elementos reguladores virales . Por ejemplo, los promotores comúnmente usados, se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus, y Virus Simiesco 40. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procarióticas como eucarióticas, ver, capítulos 16 y 17 de Smabrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d .ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) . Ver-, Goeddel (1990) en Gene Expression Technology; Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, California) . Las secuencias que codifican para las muteínas de IL-2 humana de la presente invención se pueden optimizar para la expresión en la célula hospedadora de interés. El contenido de G-C de la secuencia se puede ajustar a niveles promedio para un hospedador celular dado, como se calcula por referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedadora. Los métodos para optimización de codones son bien conocidos en la técnica. Los codones individuales se pueden optimizar, por ejemplo, los codones donde se han hecho sustituciones de residuo, por ejemplo, en la substitución C125S, la substitución C125A y/o las sustituciones de combinación adicionales indicadas en la Tabla 1. De manera alternativa, se pueden optimizar otros codones dentro de la secuencia codificante de muteína de IL-2 humana para mejorar la expresión en la célula hospedadora, tal que 1 %, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o hasta 100 % de los codones dentro de la secuencia codificante se han optimizado para la expresión en una célula hospedadora particular. Ver, por ejemplo las secuencias de muteína de IL-2 humana descritas en SEQ ID Nos: 73 y 74, donde los codones para las sustituciones de combinación 36D61R y 107R36D, respectivamente, se han optimizado para la expresión en E. coli . Los términos "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se usan de manera indistinta en la presente. Se entiende que estos términos se refieren no sólo a las células sujeto particular sino también a la progenie o progenie potencial de esta célula. Debido a que se pueden presentar ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido ya sea a mutación o influencias ambientales, esta progenie puede ser en realidad no idéntica a la célula de origen pero aún se incluyen dentro del alcance del término como se usa en la presente . El ADN de vector se puede introducir en células procarióticas o eucarióticas mediante técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se usa en la presente, los términos "transformación" y "transfección" se propone que se refieran a una variedad de técnicas bien conocidas para introducir ácido nucleico . extraño (por ejemplo, ADN en una célula hospedadora, que incluyen co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada con DEAE-dextrano, lipofección, pistola de partículas o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras se pueden encontrar en Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratoy Press, Plainview, New York) y otros manuales de laboratorio de biología molecular normales . Las células procarióticas y eucarióticas usadas para producir las muteínas de IL-2 de esta invención y variantes biológicamente activas de las mismas se cultivan en medios adecuados, como se describe en general en Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratoy Press, Plainview, New York) .
Composiciones Farmacéuticas Después de que se producen y purifican las muteínas de IL-2 humana o variantes de las mismas, se pueden incorporar en una composición farmacéutica para la aplicación en productos terapéuticos veterinarios y humanos, tal como terapia de cáncer, inmunoterapia y el tratamiento de enfermedades infecciosas. De esta manera, las muteínas de IL-2 humana o variantes biológicamente activas de la misma se pueden formular como formulaciones farmacéuticas para una variedad de usos terapéuticos. Como una composición, las muteínas de IL-2 humana o variantes biológicamente activas de las mismas se administran de manera parenteral al sujeto por métodos conocidos en la técnica. Los sujetos incluyen mamíferos, por ejemplo, primates, humanos, perros, vacas, caballos, etc. Estas composiciones farmacéuticas pueden contener otros compuestos que incrementen la efectividad o promueven las cualidades deseables de las muteínas de IL-2 humana de la invención. Las composiciones farmacéuticas deben ser seguras para administración por la ruta que se elija, deben ser estériles, retener bioactividad, y deben solubilizar de forma estable la muteína de IL-2 humana o variante biológicamente activa de la misma. Dependiendo del proceso de formulación, las composiciones farmacéuticas de muteína de IL-2 de la invención se pueden almacenar en forma líquida ya sea en el ambiente, refrigeradas o congeladas o preparadas en la forma seca, tal como polvo liofilizado, que se pueden reconstituir en la solución líquida, suspensión o emulsión antes de la administración por cualquiera de los varios métodos incluyendo rutas orales o parenterales de administración. Estas composiciones farmacéuticas comprenden típicamente al menos una muteína de IL-2 humana, variante biológicamente activa de la misma o una combinación de las mismas, y un portador farmacéuticamente aceptable. Los métodos para formular las muteínas de IL-2 humana de la invención para administración farmacéuticamente se conocen por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo Gennaro (ed.) (1995) Remington : The Science and Practice of Pharmacy (19th ed. , Mack Publishing Company, Easton, PA) . Como se describe en la presente, el texto "portador farmacéuticamente aceptable" se propone que incluya cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes de retraso de absorción e isotónicos, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en lo que se refiere a cualquier medio o agente convencional que sea incompatible con el compuesto activo, este medio se puede usar en las formulaciones farmacéuticas de muteína de IL-2 humana de la invención. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos complementarios . Una composición farmacéutica de muteína de IL-2 que comprende una muteína de IL-2 humana de la invención o variante de la misma se fórmula para ser compatible con su ruta .propuesta de administración. La ruta dé administración variará dependiendo del resultado deseado. La composición farmacéutica de muteína de IL-2 se puede administrar por dosis de. bolo, infusión continua, o infusión constante (infusión durante un corto periodo de tiempo, es decir, 1-6 horas) . La composición- farmacéutica de IL-2 se puede -administrar de manera oral, en forma intranasal, parenteralmente, incluyendo de forma intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, etc., por administración intradérmica, transdérmica (tópica) transmucosal y rectal, o por inhalación pulmonar. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes. Un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílico o metilo-parabenos ; antioxidantes tal como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como EDTA, agentes tensioactivos tal como polisorbato 80; SDS; amortiguadores tal como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede encerrar en ampolletas, jeringas desechables o frascos de múltiples dosis elaborados de plástico o vidrio. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión estéril. Donde la formación de agregado de proteína se reduce al mínimo en el proceso de formulación, los portadores adecuados para administración intravenosa incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELMR (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida al grado que exista una fácil capacidad de manejo en jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos tal como bacterias y hongos . El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se pueden mantener en la fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, "azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar al incluir en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles al incorporar el compuesto activo (por ejemplo, una proteína o anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio básico de dispersión y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente . En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución anteriormente filtrada de forma estéril del mismo. En general las composiciones orales incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimir en tabletas.
Para administración oral, el agente puede estar contenido en formas entéricas para sobrevivir al estómago o revestido o mezclado de forma adicional para ser liberado en una región particular del tracto Gl por métodos conocidos. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en la forma de tabletas, trociscos o cápsulas. También se pueden preparar composiciones orales usando un portador fluido para el uso como un lavado bucal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica de forma oral y se menea y gargajea o se traga. Los agentes de unión farmacéuticamente combatibles, y/o materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o sabor naranja. También la administración sistémica puede ser por un medio transmucoso o transdérmico. Para la administración transmucosa o transdérmica, los penetrantes apropiados a la barrera que se va a permear se usan en la formulación. Estos penetrantes se conocen en general en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico . En una modalidad, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán al compuesto contra la rápida eliminación del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas microencapsulados de distribución. Se pueden usar polímeros biocompatibles, biodegradables, tal como etilen-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de estas formulaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener de manera comercial a partir de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos virales) también se pueden usar como portadores farmacéuticamente aceptables . Estos se pueden preparar de acuerdo a métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos número 4,522,811. - Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en la forma de dosis unitarias para facilidad de administración y uniformidad de dosis. La forma de dosis unitaria como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que se trate; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitarias de la invención se dirige por y es directamente dependiente a las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica del mezclado de este compuesto activo para el tratamiento de individuos . Las muteínas de IL-2 humana de la presente invención, o variantes biológicamente activas de las mismas, se pueden formular usando cualquier proceso de formulación conocido en la técnica para IL-2 humana. Las formulaciones adecuadas que son útiles en el presente método se muestran en varias patentes y publicaciones. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 4,604,377 muestra una formulación preferida de IL-2 que tiene una cantidad terapéutico de IL-2, que está sustancialmente libre de proteína no de IL-2 y endotoxina, un portador soluble en agua fisiológicamente aceptable, y una cantidad suficiente de un agente activo en la superficie para solubilizar la IL-2, -tal como dodecil-sulfato de sodio. Se pueden incluir otros ingredientes, tal como azúcares. La patente de los Estados Unidos número 4,766,106 muestra formulaciones que incluyen IL-2 modificada con polietilenglicol (PEG) . La Solicitud de patente Europea, Número de Publicación 268,110, muestra IL-2 formulada con varios agentes tensioactivos no iónicos seleccionados del grupo que consiste de esteres de ácidos grasos de polioxietilen-sorbitan (Tween-80) , monoestearato de polietilenglicol, y compuestos de octilfenoxi-polietoxi-etanol (Tritón X405) . La patente de los Estados Unidos número 4,992,271 describe formulaciones de IL-2 que comprenden albúmina de suero humano y la patente de los Estados Unidos número 5,078,997 describe formulaciones de IL-2 que comprenden albúmina de suero humano y aminoácidos . La patente de los Estados Unidos número 6,525,102 describe formulaciones de IL-2 que comprenden una base de aminoácido, que sirve como el agente estabilizador primario del polipéptido, y un ácido y/o su forma de sal para amortiguar la solución dentro de un intervalo aceptable de pH para estabilidad del polipéptido. La solicitud de patente co-pendiente de los Estados Unidos número 10/408,648 describe formulaciones de IL-2 adecuadas para distribución pulmonar.
Usos Terapéuticos Las formulaciones farmacéuticas que comprenden las muteínas de IL-2 humana de la presente invención o variantes biológicamente activas de las mismas obtenidas de estas muteínas de IL-2 humana son útiles en la estimulación del sistema inmunitario, y en el tratamiento de cánceres, tal como aquellos actualmente tratados usando IL-2 humana nativa o ProleucinaMR IL-2. Las muteínas de IL-2 humana de la presente invención y variantes adecuadas biológicamente activas de las mismas tienen la ventaja de reducir la producción de citocinas pro-inflamatorias predictivas de que tienen menor toxicidad, en tanto que mantienen o mejoran actividades funcionales deseables tal como proliferación de células NK, supervivencia, citotoxicidad mediada por NK (NK, LAK, y ADCC) , y proliferación de células T. Debido a la menor toxicidad prevista, en aquellas indicaciones clínicas que requieren altas dosis de IL-2, las muteínas de IL-2 humana de' la presente invención, y variantes biológicamente activas de las mismas, se pueden administrar en dosis- similares o mayores que aquellas de ?a IL-2 nativa o ProleucinaMR IL-2 en tanto que reducen al mínimo los efectos de toxicidad. De esta manera, la presente invención proporciona un método para reducir los síntomas de toxicidad inducidos por interleucina-2 (IL-2) en un sujeto que se somete a administración de IL-2 como un protocolo de tratamiento, en donde el método comprende administrar la IL-2 como una muteína de IL-2 descrita en la presente. Adicionalmente, las muteínas de IL-2 humana de la presente invención y variantes adecuadas biológicamente activas de las mismas tienen la -ventaja adicional de mayor eficiencia terapéutica, de modo que menores dosis de estas muteínas de IL-2 humana puede proporcionar mayor eficacia terapéutica que dosis comparables de IL-2 nativa o ProleucinaMR IL-2. Una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de muteína de IL-2 de la invención se administra a un sujeto. Por "cantidad farmacéuticamente efectiva" se quiere decir una cantidad que es útil en el tratamiento, prevención o diagnosis de una enfermedad o condición. Por "sujeto" se proponen mamíferos, por ejemplo, primates, humanos, perros, gatos, vacas, caballos, cerdos, ovejas y similares. De manera preferente, el sujeto que se somete a tratamiento con las formulaciones farmacéuticas de la invención es un humano. Cuando la administración es para el propósito de tratamiento, la administración puede ser ya sea para un propósito profiláctico o terapéutico. Cuando se proporciona de forma profiláctica, la sustancia se proporciona por adelantado de cualquier síntoma. La administración profiláctica de la sustancia sirve para prevenir o atenuar cualquier síntoma subsiguiente. Cuando se proporciona de forma terapéutica, la sustancia se proporciona en (o brevemente después) del comienzo de un síntoma. La administración terapéutica de la sustancia sirve para atenuar cualquier síntoma actual . De esta manera, por ejemplo, las formulaciones que comprenden una cantidad efectiva de una composición farmacéutica de la invención que comprende una muteína de IL-2 humana de la invención o variante biológicamente activa de la misma se pueden usar para el propósito de tratamiento, prevención y diagnosis de varias indicaciones clínicas sensibles a terapia con IL-2. Las muteínas de IL-2 humana de la presente invención y variantes biológicamente activas de las mismas se pueden formular y usar en las mismas terapias como la IL-2 de secuencia nativa o Proleucina"11 IL- 2. Por consiguiente, las formulaciones de la invención que comprenden una muteína de IL-2 humana de la invención o variantes biológicamente activa de la misma son útiles para la diagnosis, prevención y tratamiento (local o sistémico) de infecciones bacterianas, virales, parásitas, protozoarias y fúngales; para aumentar la citotoxicidad mediada por células; para estimular la actividad de células aniquiladoras activadas por linfocinas (LAK) ; para mediar la recuperación de función inmunitaria de linfocitos; Para aumentar la sensibilidad a aloantígenos; para facilitar la reconstitución inmunitaria en pacientes con cáncer después de radioterapia, o después o en unión con trasplante autólogo de células madre o de médula ósea; para facilitar la recuperación de la función inmunitaria en estados inmunodeficientes adquiridos; para reconstitución de inmunofunción normal en humanos y animales envejecidos; en el desarrollo de ensayos de diagnóstico tal como aquellos que emplean amplificación por enzimas, radiomarcado, radioformación de imágenes y otros métodos conocidos en la técnica para monitorizar niveles de IL-2 en los estados de enfermedad; para la promoción del crecimiento de células T in vi tro para propósitos terapéuticos y de diagnóstico; para bloquear los sitios de receptor para linfocinas; y en otras varias aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico e investigación. Las varias aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico de IL-2 humana o variantes de la misma, tal como muteínas de IL-2, se han investigado y reportado en Rosenberg et al . (1987) N. Engl . J. Med. 316:889-897; Rosenberg (1988) Ann . Surg. 208:121-135; Topalian et al . (1988) J. Clin . Oncol . 6:839-853; Rosenberg et al . (1988) N. Engl J. Med. 319:1676-1680; Weber et al . (1992) J". Clin . Oncol . 10:33-40; Grimm et al . (1982) Cell . Immunol . 70 (2) :248-259; Mazumder (1997) Cáncer J. Sci . Am . 3 (Suppl. l):S37-42; Mazumder y Rosenberg (1984) J. Exp . Med. 159 (2) :495-507; y Mazumder et al . (1983) Cáncer Inmuno 1 . Immunother. 15(1) :1-10. Las formulaciones de la invención que comprenden una muteína de IL-2 humana de la invención o variante biológicamente activa de la misma se pueden usar como el agente terapéuticamente activo individual o se pueden usar en combinación con otras células inmunológicamente pertinentes u otros agentes terapéuticos . Los ejemplos de células pertinentes son células B ó T, células ?K, células LAK, y similares, y los reactivos terapéuticos de ejemplo que se pueden usar en combinación con IL-2 o variantes de la misma son los varios interferones, especialmente interferón-gamma, factor de crecimiento de célula B, IL-1, y anticuerpos, por ejemplo anticuerpos anti-HER2 tal como Herceptin^ (Trastuzumab; Genentech, Inc., South San Francisco, California) o anticuerpos anti-CD20 tal como RituxanMR (Rituximab; IDEC- C2B8; Biogen IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California) . La cantidad de muteína de IL-2 humana o variante biológicamente activa de la misma administrada puede variar entre aproximadamente 0.1 a aproximadamente 15 mIU/M2. Las dosis terapéuticamente efectivas y protocolos particulares de tratamiento para inmunoterapia de IL-2 en combinación con anticuerpos monoclonales anti-cáncer se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, los protocolos de dosis y tratamiento descritos en la Publicación de Solicitud de Patente co-pendiente de los Estados Unidos números 2003-0185796, titulada Methods of Therapy for Non-Hodgkin ' s Lymphoma, " y 20030235556, titulada "Combination IL-2/Anti -HER2 Antibody Therapy for Cancers Characterized by Overexpression of the HER2 Receptor Protein, y Solicitud de Patente co-pendiente de los Estados Unidos Número 60/491,371, titulada "Methods of Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia" , documento de abogado número 59516-278, presentada el 31 de julio de 2003. Para indicaciones tal como carcinoma de células renales y melanoma metastático, la muteína de IL-2 humana o variante biológicamente activa de la misma se puede administrar como un bolo intravenoso de alta dosis a 300,000 a 800,000 IU/kg/8 horas. Ver las anteriores solicitudes de patente de los Estados Unidos para dosis recomendadas para inmunoterapia de IL-2 para linfomas de células B, cánceres de HER2+ tal como cáncer de mama y CLL. También se conoce en la técnica el uso de inmunoterapia de IL-2 para el tratamiento de infección de VIH. Ver por ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 6,579,521, para dosis y protocolos recomendados para esta indicación clínica. De esta manera, la invención proporciona un método para el tratamiento de cáncer en un sujeto o para modular la respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una muteína de IL-2 humana de la invención o variante biológicamente activa de la misma. La "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a un nivel de dosis suficiente para inducir un resultado biológico deseado sin inducir efectos inaceptables de toxicidad. Las cantidades para administración pueden variar en base a la concentración de muteína de IL-2 humana o variante de la misma dentro de la composición farmacéutica, la actividad deseada, el estado de enfermedad del mamífero que se trate, la forma de dosis, método de administración, y factores del paciente tal como edad, sexo y severidad de enfermedad. Se reconoce que una cantidad terapéuticamente efectiva se proporciona en un intervalo amplio de concentraciones y que al sujeto se le pueden administrar tantas dosis terapéuticamente efectivas como se requiera para reducir y/o aliviar los signos, síntomas o causas del trastorno en cuestión, u ocasionar cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. En general, una composición farmacéutica de muteína de IL-2 de la invención comprenderá la muteína de IL-2 humana o variante de la misma" en un intervalo de concentración que es mayor que aquél usado para ProleucinaMR IL-2. Conforme las dosis se incrementan con relación a aquélla de ProleucinaMR IL-2, el sujeto se debe monitorizar cercanamente para determinar si aparecen efectos secundarios tóxicos. Estos análisis experimentales clínicos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, y por ejemplo se habrían usado para establecer las dosis actuales de ProleucinaMR IL-2 para el uso en inmunomodulación y terapia de cáncer.
Bioensayos para Monitorizar Actividad Funcional de Muteínas de IL-2 Humana La presente invención también proporciona nuevos bioensayos para monitorizar proliferación de células NK inducida por IL-2 y producción de TNF-a, citotoxicidad mediada por células NK inducida por IL-2, proliferación de células T inducida por IL-2, y supervivencia de células NK inducida por IL-2. Estos ensayos se han desarrollado para detectar muteínas candidatas de IL-2 para el perfil funcional deseado de producción reducida de citocinas pro- inflamatorias (particularmente, TNF-a) para mejorar la tolerabilidad, y función mejorada mediada por células NK como se refleja en la capacidad de la muteína para mantener o incrementar la proliferación de células NK y/o T, para mantener o incrementar la citotoxicidad mediada por NK (NK, LAK, y ADCC) , y para mantener o incrementar la supervivencia de células NK. El primero de estos ensayos se refiere en la presente como el "bioensayo de NK-92", que monitoriza la inducción de IL-2 de la producción de TNF-a y la proliferación de células NK inducida por IL-2. Este bioensayo utiliza la línea celular NK-92 humana (ATCC CRL-2407, CMCC ID #11925) . La línea celular NK-92, originalmente descrita por Gong et al . (1994) Leukemia 8 (4) : 652-658, exhibe características fenotípicas y funcionales de células NK activadas. La proliferación de NK-92 es dependiente de IL-2; las células morirán si se cultivan en ausencia de IL-2 durante 72 horas. La línea celular también produce niveles detectables de TNF-a en el espacio de 48-72 horas después de la exposición a IL-2. De acuerdo con los métodos de la presente invención, se pueden detectar muteínas candidatas de IL-2 or la capacidad relativa para inducir producción de TNF-a e inducir proliferación de células NK usando este bioensayo NK-92. De esta manera, se cultivan células NK-92 en medio completo (medio NK-92) que consiste de Alfa-MEM, 12 % de suero bovino fetal inactivado con calor (FBS) , 8 % de suero de caballo inactivado con calor, ácido fólico 0.02 mM, inositol 0.2 mM, L-glutamina 2 mM, y ß-mercaptoetanol 0.1 mM. Los cultivos se siembran a una densidad mínima de 1-3 x 105 células/ml y se complementan con 1000 IU/ml de la muteína de IL-2 recombinante de referencia (por ejemplo, la muteína de IL-2 de referencia designada IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó muteína de IL-2 humana C125S de referencia) . En la preparación para el ensayo, las células se colocan en medio NK-92 fresco a un mínimo de 48 horas antes del uso en el ensayo. Un día antes del ensayo, se lavan NK-92 tres veces y se colocan en medio NK-92 sin ninguna IL-2 complementaria durante 24 horas. Las células se centrifugan, se suspenden en medio NK-92 (sin IL-2) y se colocan en placas de fondo plano de 96 cavidades a una densidad de 4 x 104 células/cavidad en 200 µl con concentraciones variables de la muteína de IL-2 de referencia, por ejemplo, IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S, o concentraciones variables de una muteína candidata de IL-2 que se está detectando para el perfil funcional de interés diluida en el medio NK-92. Después de una incubación de 72 horas a 37°C, C02 al 5 %, se remueve una alícuota de 100 µl del sobrenadante de cultivo y se congela para cuantificación subsiguiente de TNF-a usando un equipo de ELISA de TNF-a comercialmente disponible (por ejemplo, BioSource CytoscreenMR, equipo ELISA de TNF-a humana; Camarillo, California) . Para las células restantes en cultivo, se determina la proliferación usando un equipo de reducción de tinte de MTT comercialmente disponible (CellTiter 96MR, Equipo de Ensayo de Proliferación Celular - No Radioactivo (Promega Corp., Madison, Wisconsin), y entonces se calcula un índice de estimulación en base a una lectura colorimétrica . El segundo bioensayo de IL-2 descrito en la presente proporciona un método para detectar muteínas candidatas de IL-2 para su capacidad para inducir citotoxicidad mediada por células aniquiladoras naturales (NK) . Este bioensayo, designado el "bioensayo de citotoxicidad NK3.3", utiliza la línea celular NK3.3 humana.
La línea celular NK3.3 exhibe características fenotípicas y funcionales de las células NK de sangre periférica (Kornbluth (1982) J. Immunol . 129 ( 6) : 2831-2837) , y puede mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) mediante el receptor Fc (CD16, Fc?RIIIA) . La Tabla 2 en la sección experimental más adelante resume las actividades biológicas de las células NK3.3 examinadas con este bioensayo de IL-2.
De acuerdo con los métodos de la presente invención, se pueden detectar muteínas candidatas de IL-2 para su actividad citotóxica usando este bioensayo de citotoxicidad de NK3.3. De esta manera, las células NK3.3 se expanden y mantienen en el medio RPMI-1640 complementado con 15 % de suero bovino fetal inactivado con calor, HEPES 25 M, L-glutamina 2 mM, y 20 % de T-StimMR Humana con/PHA como una fuente de IL-2. En la preparación para el ensayo, las células NK3.3 se cultivan en ausencia de IL-2 ("ayunada") durante 24 horas. El ensayo consiste de 5 x 104 células NK3.3 "ayunada" colocadas en placas de 96 cavidades de fondo en U, expuestas a concentraciones variables de una muteína de IL-2 de referencia, por ejemplo, muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó C125S, o concentraciones variables de una muteína candidata de IL-2 de interés en un volumen total de 100 µl . Después de una incubación de 18 horas, las células efectoras de NK3.3 estimuladas con IL-2 se co-incuban con 5 x 103 células objetivo marcadas con calceína AM (K562 o Daudi) u objetivos marcados con calceína AM, revestidos con anticuerpo (Daudi revestido con rituximab a una concentración final de 2 µg/ml) para lograr una relación final de efector a objetivo de 10:1 en volumen final de 200 µl . Después de la co-incubación del efector y células objetivo durante 4 horas, las placas de 06 cavidades se centrifugan brevemente; se remueven 100 µl del sobrenadante de cultivo y se colocan en una placa de 96 cavidades, de fondo- plano, de fondo claro, negra, para cuantificación de liberación de calceína AM por fluorímetro. La cuantificación se expresa como por ciento de lisis específica, 'y se calcula por la siguiente ecuación: % de lisis específica = 100 x [(medio experimental - liberación espontánea media) / (liberación media máxima - liberación espontánea media)]; por lo que la liberación espontánea se determina de las cavidades que contienen objetivos marcados y ningún efector, y se determina la liberación máxima de las cavidades que contienen objetivos marcados y Tritón X-100 al 1 ^5. El tercer ensayo de IL-2 descrito en la presente proporciona un método para detectar muteínas candidatas de IL-2 para su capacidad para inducir proliferación de células T. De esta manera, este bioensayo de IL-2 para proliferación de células T utiliza la línea de células T humanas Kit225 (CMCC ID#11234), derivada de un paciente con leucemia linfocítica crónica de células T (Hori et al . (1987) Blood 70 (4) :1069-1072) . Las células Kit225 expresan constitutivamente las subunidades a, ß, ? del complejo de receptor de IL-2. La proliferación de Kit225 es dependiente de IL-2; las células morirán si cultivan en la ausencia de IL-2 durante un periodo prolongado de tiempo. De acuerdo con la presente invención, el ensayo consiste de cultivar células Kit225 en la ausencia de IL-2 durante 24 horas, seguido por colocación en placa de un número específico de células con concentraciones variables de la muteína de IL-2 de referencia, por ejemplo, muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó C125S, o concentraciones variables de una muteína de IL-2 candidata de interés. Después de una incubación durante 48 horas, se determina la proliferación usando un equipo de reducción de tinte MTT, comercialmente disponible, normal, y se calcula un índice de estimulación en base a una lectura colorimétrica. El cuarto bioensayo de IL-2 de la presente invención proporciona un método para detectar muteínas candidatas de IL-2 para su capacidad para promover la supervivencia de células NK. De esta manera, se detectan muteínas candidatas para su capacidad para inducir señalización de supervivencia de células NK. La ProleucinaMR IL-2 (es decir, la formulación que comprende la muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1) induce la fosforilación de AKT en células NK3.3 anteriormente puestas en ayuno para IL-2, que se considera una "señal de supervivencia". De acuerdo con este bioensayo, las células NK3.3 se expanden y mantienen en medio RPMI-1640 complementado con 15 % de suero bovino fetal inactivado con calor, HEPES 25 mM, L-glutamina 2 M, y 20 % de T-StimMR Humana con/PHA como una fuente de IL-2. En la preparación para el ensayo, las células NK3.3 se cultivan en la ausencia de IL-2 durante 24 horas. Como un indicador de la señalización de supervivencia celular, las células NK3.3 "ayunadas" (2 x 106) se estimulan por la adición de 2 nM de la muteína de IL-2 de referencia, por ejemplo, la muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó C125S, o 2 nM de una muteína candidata de IL-2 de interés, durante 30 minutos. Las células se lavan dos veces en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . El sedimento celular se lisa en 50 µl de un amortiguador de extracción celular que contiene inhibidores de proteasa y se somete a un ciclo de congelación-descongelación. El extracto se centrífuga a 13,000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Se adiciona una alícuota de lisado clarificado a una dilución 1:10 a las cavidades del Equipo de Inmunoensayo de AKT [pS473]* (Biosource International) . Siguiendo el protocolo del fabricante, se detectan los niveles de AKT fosforilada por ELISA cuantitativo. La presente invención también proporciona bioensayos para el uso en la detección de muteínas de IL-2 para sus perfiles funcionales usando células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) . El primero de estos bioensayos es un bioensayo de producción de citocinas pro-inflamatorias/proliferación de combinación. En la exposición a IL-2, las PBMC humanas proliferan y segregan citocinas de una manera dependiente de la dosis. Este ensayo de combinación se diseña para valorar los niveles de proliferación y producción de citocina después de una estimulación de 72 con una muteína de IL-2 de referencia (tal como la muteína de C125S, des-alanil-1 ó muteína de C125S) o una muteína candidata de IL-2 de interés. Las PBMC se aislan por separación por gradiente de densidad (por ejemplo, usando tubos ACDA Vacutainer CPT) de uno o más donadores humanos normales. En placas tratadas de cultivo de tejido de 96 cavidades, se incuban 200,000 células por cavidad con concentraciones variadas de IL-2 (0.039 nM - 10 nM) o sin IL-2.. como un control negativo del medio completo de RPMl (RPMl, 10 %' de suero AB humano inactivado con calor, HEPES 25 mM, glutamina 2 rmM, penicilina/estrepto icina/fungizona) a 37 °C, CO2 al 7 %. Después de 66 horas de incubación, se remueve una alícuota del sobrenadante de cultivo celular y se congela para detección de citocinas en un momento posterior. Las células se someten a impulsos con 1 µCi de 3H-timidina durante 6 horas, y luego se recolectan para determinar los niveles de incorporación de nucleótidos (por ejemplo, usando un Lector de Placas Wallac Trilux Microbeta) como una medida de proliferación celular. Entonces se pueden usar equipos de ELISA comercialmente disponibles (por ejemplo, de - BioSource International) para detectar niveles de TNF-a en los sobrenadantes de cultivo celular por guías del fabricante.
Repitiendo en ensayo para un panel completo de donadores separados, por ejemplo, 6, 8 ó 10 donadores, se proporciona una caracterización de las respuestas representativas de citocinas y proliferativas a IL-2 en una "población normal". Entonces se pueden analizar los datos como se muestra en la Figura 1, y descritos más adelante en la presente de forma adicional en el Ejemplo 10. El segundo bioensayo basado en PBMC se puede usar para detectar muteínas candídatas de IL-2 para su capacidad para mediar citotoxicidad de células efectoras. En este ensayo, las PBMC se separan de la sangre entera usando centrifugación por gradiente de densidad. Las PBMC se estimulan durante 3 días en la presencia de un control de IL-2 10 mM o la muteína de IL-2 de interés, para generar actividad de LAK como se practica en general en el estado actual de la técnica (ver, por ejemplo, Isolation of Human NK Cells and Generation of LAK activi ty IN: Current Protocols in Immunology; 1996 John Wiley & Sons, Ine) . La población celular resultante contiene células "efectoras", que se pueden clasificar como NK o LAK, y pueden aniquilar objetivos de células tumorales de K562 y Daudi, respectivamente. Estas células efectoras también pueden mediar ADCC, por lo que las células efectoras reconocen la porción Fc de un anticuerpo específico que se une a las células objetivo Daudi. En una modalidad, el anticuerpo unido a células objetivo Daudi es RituxanMR (rituximab) . De acuerdo con los métodos de la presente invención, las PBMC humanas (células efectoras) que se han estimulado con una muteína candidata de IL-2 de interés o un control de IL-2 de referencia se co-incuban con células objetivo marcadas con calceína AM a varias relaciones de efector a célula objetivo (relaciones E:T) durante 4 horas. La cantidad de actividad citotóxica se relaciona a la detección, de calceína AM en el sobrenadante de cultivo. La cuantificación se expresa como por ciento de lisis especifica en cada relación E:T, en base a la determinación, de los controles de liberación máxima y espontánea. Este bioensayo examina las siguientes actividades biológicas: citotoxicidad natural/espontánea (NK) , donde el objetivo es células K562; aniquilación activada por linfocina (LAK), donde el objetivo es células Daudi; y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), donde el objetivo es células Daudi revestidas con anticuerpo (por ejemplo, células Daudi revestidas con RituxanMR) . Se obtienen datos de un fluorímetro y se expresan en unidades relativas de fluorescencia (rfu) . Los controles para este bioensayo incluyen células objetivo marcadas solas (min) y células objetivo marcadas con Tritón X-100 al 1 % final como una medida de 100 % de lisis (max) . El por ciento de relación min a max se calcula usando la siguiente ecuación como una medida de la validez de ensayo (ensayo inválido si >30 %) : % de min a max = 100 X liberación espontánea media, rfu liberación máxima media rfu Una vez que el ensayo se juzga válido, la desviación estándar y media para puntos de muestra triplicado se calcula, seguido por el por ciento de lisis específica de la media de los puntos triplicados usando la siguiente ecuación: 10 % de lisis = 100 X media experimental, rfu - liberación espontánea media, rfu liberación máxina media, rfu - liberación espontánea media, rfu Entonces los datos se reportan como % de lisis específica; además, la relación de la muteína candidata de IL-2 al •jr control de referencia de IL-2 pertinente (por ejemplo, muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó muteína de IL-2 humana C125S) se puede usar para determinar si se mantiene actividad citotóxica con relación al control de referencia de IL-2 en una población mezclada de donadores de PBMC 0 humanas. Los ensayos anteriores se pueden utilizar para detectar bibliotecas de muteínas candidatas de IL-2 para perfiles funcionales deseados, donde las actividades funcionales de interés incluyen una o más de las siguientes: 5 producción de citocinas pro-inflamatorias inducida por IL-2 (particularmente TNF-a y/o IF-?) , proliferación de células NK y/o T inducida por IL-2, citotoxicidad mediada por NK inducida por IL-2 (NK, LAK, y ADCC) , y supervivencia de células NK inducida por IL-2. Los siguientes ejemplos se aprecian a manera de ilustración y no a manera de limitación.
Parte Experimental La utilidad terapéutica de IL-2 se entorpece por las toxicidades asociadas con su administración, incluyendo fiebres, - escalofríos, hipotensión y síndrome de fuga vascular. Las muteínas de IL-2 con tolerabilidad mejorada y funciones efectoras de células NK y T mediadas por IL-2 permitirán la administración de dosis terapéuticas similares que son mejor toleradas o dosis terapéuticas superiores, incrementando de este modo el potencial de eficiencia terapéutica mayor de esta proteína. La estrategia total del trabajo presentado en la presente fue seleccionar nuevas muteínas de IL-2 humana que exhiben el siguiente perfil funcional usando un panel comprensivo de sistemas de detección de inmunoensayo, basados en células NK humanas, de rendimiento moderado, especializados: producción reducida de citocinas pro-inflamatorias (particularmente TNF-a) para mejorar la tolerabilidad, y función mejorada mediada por células NK como se refleja en la capacidad de la muteína para mantener o incrementar proliferación de células NK y/o T, para mantener o incrementar citotoxicidad mediada por NK (NK, LAK,' -y ADCC), y para mantener o incrementar supervivencia de células NK. Para • propósitos de identificar muteínas adecuadas de IL-2 con el perfil terapéutico deseado, las actividades biológicas de las muteínas candidatas recombinantes de IL-2 humana se compararon a aquellas actividades biológicas exhibidas por IL-2 humana C125S, des-alanil-1 (abreviada como "Pro" en los ejemplos posteriores) e IL-2 humana C125S (abreviada como "Ala-Pro" .-en los ejemplos posteriores), que se refieren como las muteí-nas de IL-2 de referencia. La muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1, producida de manera recombinante en E. coli, que es aldesleucina, se comercializa como una formulación bajo la marca comercial ProleucinaMR IL-2 (Chiron Corporation, Emeryville, California) . La ProleucinaMR IL-2 es una formulación liofilizada específica que usa una forma no glicosilada de la muteína que se ha producido en E. coli , y se reconstituyó en agua destilada para el uso en los bioensayos descritos más adelante en la presente. Los sistemas de expresión de mamífero de AME, DirectAMEMR y ExpressAMEMR (Applied Molecular Evolution, Inc., San Diego,. California) se utilizaron en la producción recombinante de IL-2 humana de C125S usada en los experimentos de detección inicial.
Las muteínas de IL-2 humana descritas en la presente más adelante se expresaron en células 293T hospedadoras de mamífero. Donde la muteína de IL-2 de referencia fue IL-2 humana C125S, las células hospedadoras se han transformado con una construcción de expresión que comprende la secuencia codificante de IL-2 humana nativa con una mutación de C125S enlazada operablemente al promotor Pro-1. La secuencia codificante comprendió la secuencia de señal de IL-2 auténtica y el codón para la alanina N- terminal de IL-2 humana (es decir, nucleótidos 1-63 de SEQ ID -N0:1) fusionada en la secuencia codificante para IL-2 humana C125S, des-alanil-1 (es decir, SEQ ID NO:7). La proteína se expresó como proteína marcada con GSHis en el sistema de expresión de mamífero de células 293T y se purificó con cuentas de NI-NTA.
Ejemplo 1: Detección Inicial de Muteínas de IL-2 Humana Una biblioteca que comprende las 2,508 variantes posibles de muteínas de aminoácidos individuales de la molécula de IL-2 humana C125S (designada "Ala-Pro" en los ejemplos en la presente) se construyó usando una plataforma de tecnología de mutagénesis basada en codones (Applied Molecular Evolution, Inc. , San Diego, California) . Ala-Pro difiere de la muteína de IL-2 humana, C125S, des-alanil-1 utilizada en el producto PrbleucinaMR IL-2 comercialmente disponible al tener el residuo Ala N-terminal en la posición 1 de la secuencia de IL-2 humana madura que se presenta de forma natural retenida en la muteína de IL-2 humana, C125S. Los sistemas de expresión de mamífero de AME DirectAMEMR y ExpressAMEMR (Applied Molecular Evolution, Inc., San Diego, California) se utilizaron en la producción recombinante de muteínas de Ala-Proporciona La detección primaria se llevó a cabo usando un inmunoensayo funcional basado en la línea celular NK-92 humana, que valoró la producción de citocinas pro- inflamatorias (TNF-a) y la proliferación de células NK, y la aniquilación citolítica de NK (NK, LAK, y ADCC) y la supervivencia celular (pAKT) se valoraron usando la línea celular NK3.3 - humana. Los puntos finales funcionales primarios seleccionados incluyeron: (1) producción reducida de TNF-a pro-inflamatoria por la línea celular NK-92 humana con relación a aquélla observada con IL-2 de Ala-Pro (es decir, muteína de IL-2 humana, C125S) o ProleucinaMR IL-2 (es decir, muteína de IL-2 humana, C125S, des-alanil-1) ; (2) proliferación mantenida o mejorada de línea celular NK-92 con relación a aquella observada con cualquiera de estas dos muteínas de IL-2 de referencia; y (3) aniquilación citolítica mediada por ADCC, NK y LAK, mediada por línea celular NK3.3 humana, mantenida o mejorada, con relación a aquélla observada con cualquiera de estas dos muteínas de IL-2 de referencia. Los puntos finales funcionales secundarios se mantuvieron o mejoraron la inducción de AKT fosforilada (pAKT) en la línea celular NK3.3 con relación a aquélla observada con cualquiera de estas dos muteínas de IL-2 de referencia y se mantuvieron o mejoraron proliferación de células T por línea de células T Kit225 humana con relación a aquella observada con IL-2 de Ala-Pro (es decir, muteína de IL-2 humana, C125S) o ProleucinaMR IL-2 (es decir, que comprende la muteína de IL-2 humana, C125S, des-alanil-1) . El proceso de detección inicial identificó 168 sustituciones de aminoácidos individuales (ver, Solicitud de Patente co-pendiente de los Estados Unidos No. 60/550,868, titulada "Irmproved Interleukin-2-Muteins", Documento de Abogado No. PP20354.001 (035784/261164), presentada el 5 de Marzo de 2004) dentro de la muteína de IL-2 humana, C125S que entonces se combinaron en tres bibliotecas combinatorias diseñadas para combinar los perfiles funcionales deseables de estas 168 variantes de aminoácidos individuales de la muteína de IL-2 humana, C125S para encontrar muteínas adicionales de IL-2 con tolerabilidad incrementada (es decir, inducción reducida de IL-2 de producción de TNF-a por células NK) y función efectora mantenida o incrementada de células NK. Las bibliotecas combinatorias estuvieron comprendidas de 753 muteínas de IL-2 con múltiples sustituciones de aminoácidos que varían desde un mínimo de una sustitución a tanto como seis posibles sustituciones de aminoácidos (es decir, además de la sustitución de CÍ25S de la secuencia de IL-2 humana madura que se presenta de forma natural) . De estas tres bibliotecas combinatorias, se identificaron 32 muteínas combinatorias (ver Tabla 1 anteriormente en la presente para sustituciones de combinación en estas muteínas) que tienen el perfil funcional deseado (en comparación a IL-2 humana, C125S, des- alanil-'l ó IL-2 humana, C125S usando un panel comprensivo de sistemas de inmunoensayo de rendimiento moderado, basados en células NK y T, humanas, especializadas que se desarrollaron para cuantificar la proliferación de líneas de células NK y T, humanas, dependiente de IL-2, producción de citocinas pro-inflamatorias (TNF-a) por células NK, y actividad citolítica mediada por NK (NK/LAK/ADCC) . Los datos de detección para las 32 muteínas se muestran en la Tabla 7 más adelante en la presente. El análisis subsiguiente después de la detección de estas muteínas en intervalos de respuesta de dosis extendida dieron por resultado identificación de muteínas específicas que comprenden tres clases distintas funcionales predictivas de beneficio clínico mejorado, descritas en los ejemplos 2-4 posteriores. Todas las muteínas de IL-2 seleccionadas mantienen función citolítica de NK (NK/LAK/ADCC) en comparación a las muteínas de IL-2 humana, C125S des-alanil-1 ó C125S. Se usaron los siguientes protocolos en el proceso de detección.
Proliferación de Células NK/Producción de TNF-a El bioensayo de IL-2 para proliferación de células aniquiladoras naturales (NK) y producción de TNF-a utiliza la línea de células NK-92 humana (ATCC CRL-2407, CMCC ID #11925)-. La línea de células NK-9, originalmente descrita por Gong et al. (1994) Leukemia 8 (4):652-658, exhibe características fenotípicas y funcionales de células NK -activadas. La proliferación de NK-92 es dependiente de IL-2; las células morirán si se cultivan en la ausencia de IL-2 durante 72 horas. La línea celular también produce niveles detectables de TNF-a en el espacio de 48-72 horas después de la exposición a IL-2. Se cultivaron células NK-92 en medio completo (NK-92) que consiste de Alfa-MEM, 12 % de suero bovino fetal inactivado con calor (FBS) , 8 % de suero de caballo inactivado con calor, ácido fólico 0.02 mM, inositol 0.2 mM, L-glutamina 2 mM, y ß-mercaptoetanol 0.1 M. Se sembraron los cultivos a una densidad mínima de 1-3 x 105 células/ml y se complementaron con 1000 IU/ml de muteína de 1L-2 recombinante (IL-2 humana, C125S, des-alanil-1 (es decir, aldesleucina o ProleucinaMR IL-2; Chiron Corporation, Emeryville, California) ó IL-2 humana C125S (producida recombinantemente en el sistema de expresión de mamífero de AME, señalado anteriormente) . En la preparación para el ensayo, las células se colocaron en medio NK-92 fresco a un mínimo de 48 horas antes del uso en el ensayo. Un día antes del ensayo, se lavaron las NK-92 tres veces y se colocaron en el medio NK-92 sin ninguna IL-2 complementaria durante 24 horas. Las células se centrifugaron, se suspendieron en medio NK-92 (sin IL-2) y se colocaron en placas de fondo plano de 96 cavidades a una densidad de 4 x 104 células/cavidad en 200 µl con concentraciones variables de IL-2 humana, C125S, des-alanil-1 ó C125S como una molécula de IL-2 de referencia o concentraciones variables de una muteína de IL-2 de la invención diluida en el medio NK-92.5 Después de una incubación de 72 horas a 37 °C, C02 al 5 %, se removió una alícuota de 100 µl del sobrenadante de cultivo y se congeló para cuantificación subsiguiente de equipo ELISA de TNF-a comercialmente disponible (BioSource CytoscreenMR, Equipo de ELISA de TNF-a humano; Camarillo, California) , Para las células restantes en cultivo, se determinó la proliferación usando un equipo de reducción de tinte de MTT comercialmente disponible (CellTiter 96MR Equipo de Ensayo de Proliferación Celular No Radioactivo (Promega Corp., Madison, Wisconsin) , y se calculó entonces un índice de estimulación en base a una lectura colorimétrica.
Citotoxicidad Mediada por Células NK El bioensayo de IL-2 par citotoxicidad mediada por células aniquiladoras naturales (NK) utiliza la línea de células K3.3 humanas. La línea de células ?K3.3 exhibe características fenotípicas y funcionales de las células NK de sangre periférica (Kornbluth (1982) J. Immunol . 129 (6) :2831-2837) , y puede mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (7ADCC) mediante el receptor Fc (CD16, Fc?RIII) . La línea celular se obtuvo de Jackie Korhbluth, Ph.D. , bajo un acuerdo de licencia de uso limitado con St. Louis University, y se depositó en CMCC (ID 12022) . La Tabla 2 resume las actividades biológicas de las células ?K3.3 examinadas con este bioensayo de IL-2.
Tabla 2 Actividades biológicas de células ?K3.3 examinadas con bioensayo de IL-2 Se expandieron células NK3.3 y mantuvieron en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal complementado con 15 % de suero bovino fetal inactivado con calor, HEPES 25 mM, L-glutamina 2 mM, y 20 % de T-Stim1 humana con PHA como una fuente de IL-2. En la preparación para el ensayo, las células NK3.3 se cultivaron en la ausencia de IL-2 ("ayunaron") durante 24 horas. El ensayo consiste de 5 x 104 células NK3.3 "ayunadas" colocadas en placas de 96 cavidades de fondo en U, expuestas a concentraciones variables de IL-2 humana, C125S des-alanil- 1, ó C125S como la molécula e IL-2 de referencia o concentraciones variables de una muteína de IL-2 de la invención en un volumen total de 100 µL . Después de una incubación de 18 horas, las células efectoras NK3.3 estimuladas con IL-2 se co-incubaron con 5 x 103 células objetivo (K562 ó Daudi) marcadas con calceína AM u objetivos marcados con calceína AM, revestidos con anticuerpo (Daudi revestido con rituximab a una concentración final de 2 µg/ml) para lograr una relación final de efector a objetivo de 10:1 en volumen final de 200 µl . Después de la coincubación de células efectoras y objetivo durante 4 horas, las placas de 96 cavidades se centrifugaron de forma breve; se removieron 100 µl del sobrenadante de cultivo y se colocaron en una placa de 96 cavidades, de fondo plano, de fondo claro, negra para cuantificación de liberación de calceína AM por fluorímetro. La cuantificación se expresó como por ciento de lisis específica, y se calculó por la siguiente ecuación: % de lisis específica = 100 x [ (media experimental - liberación espontánea media) / (liberación máxima media - liberación espontánea media) ] ; por lo que se determinó la liberación espontánea de las cavidades que contienen objetivos marcados y no efectores, y se determinó la liberación máxima de las cavidades que contiene objetivos marcados y Tritón X-100 al 1 % .
Proliferación de Células T El bioensayo de IL-2 para proliferación de células T utiliza la línea de células T humanas Kit225 (CMCC ID#11234), derivada de un paciente con leucemia linfocítica crónica de células T (Hori et al. (1987) Blood 70(4):1069-1072). Las células Kit225 expresan constitutivamente las sub-unidades a, ß, y del complejo de receptor de IL-2. La proliferación de Kit225 es dependiente de IL-2; la células morirán si se cultivan en la ausencia de IL-2 durante un periodo prolongado de tiempo. El ensayo consiste de células Kit225, cultivadas en la ausencia de IL-2 durante 24 horas, seguido por colocación en placa de un número específico de células con concentraciones variables de IL-2 humana, C125S, des-alanil-1 ó C125S como la molécula de IL-2 de referencia o concentraciones variables de una muteína de IL-2 de la invención. Después de una incubación de 48 horas, se determinó la proliferación usando un equipo, normal, comercialmente disponible de reducción de tinte MTT, y se calculó un índice de estimulación en base a una lectura colorimétrica.
Señalización de Supervivencia de Células NK Se detectó un subconjunto de la biblioteca de muteínas de IL-2 humana para la capacidad para inducir señalización de supervivencia de células NK. La ProleucinaMR (es decir, formulación que comprende aldesleucina, la muteína de IL-2 humana, C125S, des-alanil-1, induce la fosforilación de AKT en células NK3.3 anteriormente ayunadas para IL-2, que se considera una "señal de supervivencia". Las células NK3.3 se expandieron y mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 15 % de suero bovino fetal inactivado con calor, HEPES 25 m, L-glutamina 2 mM, y 20 % de T-StimMR humana con PHA como una fuente de IL-2. En la preparación para el ensayo, las células NK3.3 se cultivaron en la ausencia de IL-2 durante 24 horas. Como un indicador de la señalización de supervivencia celular, se estimularon las células NK3.3 "ayunadas" (2 x 106) por adición de 2 nM de IL-2 humana, C125S, des-alanil-1 ó C125S como la molécula de IL-2 de referencia ó 2 nM de una muteína de IL-2 de la invención, durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . El sedimento celular se liso en 50 µl de un amortiguador de extracción celular que contiene inhibidores de proteasa y se sometió a un ciclo de congelación-descongelación. El extracto se centrifugó a 13,000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Se adicionó una alícuota del lisado depurado o clarificado a una dilución 1:10 a las cavidades del Equipo de Inmunoensayo AKT [pS473]* (BioSource International). Siguiendo el protocolo del fabricante, se detectaron niveles de AKT fosforilada por ELISA cuantitativo.
Ejemplo 2: Identificación de Mutaciones Benéficas que Reducen la Producción de TNF-a por Células NK La primera clase funcional de muteína se predice que tiene tolerabilidad mejorada como se evidencia por una inducción deteriorada de producción de TNF-a por células NK que es <60 % de aquella observada con la muteína de IL-2 humana, C125S (designada "Ala-Pro" en los datos más adelante en la presente) cuando se valora a 1.0 nM. Las muteínas dentro de esta clase caen dentro de dos categorías: (1) aquellas que inducen baja producción de TNF-a por células NK y mantienen proliferación de células NK a una concentración de muteína de 1.0 nM (es decir, 1000 pM) , pero la actividad proliferativa cae a menores concentraciones de la muteína, que incluyen las muteínas de IL-2 humana, C125S, des-alanil-1, ó C125S que comprende además la sustitución de combinación 19D40D, 36D61R, 36D65L, 40D61R, 40D65Y, 40G65Y ó 81K91D, donde la posición del residuo (es decir, 19, 36, 40, 61, 65, 81 ó 91) es con relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a SEQ ID NO:4), que se muestran en la Tabla 3 posterior; y (2) aquellas que inducen baja producción de TNF-a por células NK, y donde la actividad proliferativa se mantiene por .abajo de 50 pM; adicionalmente, la producción de TNF-a por células NK debe haber sido <80 % de aquella de IL-2 humana, C125S a 0.05 nM (es decir, 50 pM) y 0.1 nM (es decir, 100 pM) ; esta subclase incluye las muteínas de IL-2 humana, C125S, des-alanil-1 ó C125S que comprenden además la sustitución de combinación 40D72N, 80K65Y, 81K88D, 81K42E, 81K72N, 107H65Y ó 107R72N, donde la posición del residuo (es decir, 40, 42, 65, 72, 80, 81, 88 ó 107) es con relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a SEQ ID NO: 4), que se muestran en la Tabla 4 posterior.
Tabla 3 Muteínas de IL-2 identificadas como que tienen inducción reducida de producción de TNF-a por células NK. Producción de TNF-a por células NK a las varias concentraciones de muteína de IL-2 se expresa como una relación de aquella observada para IL-2 humana, C125S (:Ala-Pro). Proliferación de células NK (NK92-MTT) a varias concentraciones de muteína IL-2 se expresa como una relación de aquella observada par IL-2 humana, C125S (:Ala-Pro).
Tabla 4 Muteínas de IL-2 adicionales identificadas como que tienen inducción reducida de producción de TNF-a por células NK. La producción de TNF-a por células NK a las varias concentraciones de muteína de IL-2 se expresa como una relación de aquella observada para IL-2 humana C125S ^Ala-Pro) . La proliferación de células NK (NK92-MTT) a las varias concentraciones de la muteína de IL-2 se expresa como una relación de aquella observada para IL-2 humana, C125S (:Ala-Pro) .
Ejemplo 3: Identificación de Mutaciones Benéficas que Mejoran la Proliferación de Células NK La segunda clase funcional de muteínas de IL-2 humana, mejora la proliferación de células NK >200% en comparación a IL-2 humana. C125S a una o varias concentraciones probadas (5 pM, 20 pM, 50 pM, 100 pM y 1000 pM) sin impacto perjudicial en la producción de TNF-a (producción de TNF-a <100 % con relación a aquella observada para la muteína de IL-2 de referencia a una concentración de 100 pM ó 1 nM) . Adicionalmente, los criterios de selección incluyeron un índice de proliferación mayor a 150 % de aquel observado para la muteína de IL-2 de referencia, es decir IL-2 humana, C125S (Ala-Pro) para al menos 2 concentraciones probadas . Esta clase funcional incluye las muteínas de IL-2 humana, C125S, des-alanil-1 ó C125S que comprende además la sustitución 19D81K, 40G36D ó 81K36D, donde la posición de residuo (es decir, 19, 36, 40 ú 81) es con relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir con relación a SEQ ID NO:4). Ver Tabla 5 posterior.
Tabla 5 Muteínas de IL-2 identificadas como que tienen inducción mejorada de proliferación de células NK sin impactar negativamente la producción de TNF-a por células NK. La producción de TNF-a por células NK a las varias concentraciones de la muteína de IL-2 se expresa como una relación de aquella observada para IL-2 humana, C125S ^Ala- Pro) . La proliferación de células NK (NK92-MTT) a las varias concentraciones de muteína de IL-2 se expresa como una relación de aquella observada para IL-2 humana, C125S ( ¡Ala- Pro) .
Ejemplo 4: Identificación de Mutaciones "Bi-funcionales" La tercera clase funcional de muteínas de IL-2 humana muestran actividad proliferativa incrementada y producción de TNF-a, disminuida por células NK, donde la producción de TNF-a es <75 % de aquella observada para la muteína de IL-2 humana, C125S cuando se prueba a 1 nM, y la proliferación de células NK es mayor a >150 % de aquella observada para la muteína de IL-2 humana, C125S en cualquier concentración probada (5 pM, 20 pM, 50 pM, 100 pM y 1000 pM) . Este grupo incluye la muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1, ó la muteína de IL-2 humana, C125S que comprende además la sustitución 36D42R, 36D80K, 40D80K, 81K61R, 91N95G, 107H36D, 107R36D ó 91N94Y95G, donde la posición del residuo (es decir, 36, 40, 42, 61, 80, 81, 91, 94, 95 ó 107) es con relación a la secuencia de IL-2 humana madura (es decir, con relación a SEQ ID NO: 4). Ver Tabla 6 posterior .
Tabla 6 Muteínas de IL-2 Bi-funcionales como que tienen inducción mejorada de proliferación de células NK e inducción disminuida de producción de TNF-a por células NK. La producción de TNF-a por células NK a las varias concentraciones de muteína de IL-2 se expresa como una relación de aquella observada para IL-2 humana, C125S (:Ala-Pro) . La proliferación de células NK (NK92-MTT) a las varias concentraciones de muteína IL-2 se expresa como una relación de aquella observada para IL-2 humana, C125S ( :Ala-Pro) .
La Tabla 7 más adelante resume el perfil funcional de las 32 muteínas combinatorias identificadas en este proceso de detección. 3 10 15 ?n Ejemplo 5: Identificación de mutaciones benéficas de IL-2 que reducen la producción de citocinas pro-inflamatorias en tanto que mantienen o incrementan los niveles de proliferación y citotoxicidad en células mononucleares normales de sangre periférica humana. De la serie de substitución de aminoácidos de combinación de las 32 . muteínas - - de IL-2 descritas anteriormente, se seleccionaron 18 muteínas de IL-2 para una expresión/purificación a pequeña escala como se indica en la Tabla 8. Estas muteínas de IL-2 se probaron para su capacidad para generar un perfil funcional similar de tolerabilidad incrementada y actividad mantenida en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de varios donadores normales de sangre humana, en comparación a los controles pertinentes de IL-2 (muteína de IL-2 humana, C125S des-alanil 1 (presente en ProleucinaMR) y muteína de IL-2 humana, C125S des-alanil-1, expresada en levadura (designada Y-Pro en los datos descritos más adelante) . De manera específica, las muteínas de IL-2 purificadas se detectaron al estimular las PBMC humanas derivadas de un panel de donadores humanos normales, y valorando la proliferación y producción de citocinas pro-inflamatorias (TNF-c.) , así como la capacidad para aniquilar objetivos de células tumorales por citotoxicidad natural/espontánea (NK) , aniquilación activada por linfocinas (LAK) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) .
Tabla 8 Muteínas de IL-2 humana que comprenden la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana, C125S (SEQ ID No: 6) o IL-2 humana, C125S, des-alanil-1 (SEQ ID No: 8) con las siguientes sustituciones de combinación se detectaron para actividad en PBMC humanas1.
"""Muteínas de IL-2 identificadas por: posición de aminoácido con relación a IL-2 humana madura de SEQ ID NO: 4 y substitución de aminoácidos en esa posición.
Se usaron los siguientes puntos finales, funcionales, primarios: 1) Producción reducida de citocinas pro- inflamatorias (TNF-a) por PBMC humanas estimuladas con muteína de IL-2 en comparación a control pertinente de muteína de IL-2 humana; 2) Proliferación mantenida o mejorada inducida por IL-2 en PBMC humanas sin un incremento en la producción de citocinas pro-inflamatorias en comparación al control pertinente de muteína de IL-2 humana; y 3) Aniquilación citolítica mantenida o mejorada, mediada por NK, LAK y ADCC por PBMC humanas estimuladas in vitro con muteína de IL-2 en comparación a control pertinente de muteína de IL-2 humana.
Descripciones de Ensayos Procedimiento de Ensayo de Producción de Citocinas Pro- inflamatorias/Proliferación de Combinación En la exposición a IL-2, las PBMC humanas proliferan y segregan citocinas de una manera dependiente de la dosis . Para aumentar al máximo la producción de datos y la eficiencia, se diseñó un ensayo de combinación para valorar los niveles de proliferación y producción de citocinas después de una estimulación de 72 horas con muteína de IL-2 de referencia o la muteína de IL-2 humana de interés. La disposición del ensayo comprende el aislamiento de PBMC por separación por gradiente de densidad (tubos ACDA Vacutainer CPT) de uno o más donadores humanos normales. En placas tratadas, de cultivo de tejido de 96 cavidades, se incubaron 200,000 células por cavidad con varias concentraciones de IL-2 (0.039 nM - 10 nM) o sin IL-2 como un control negativo en medio completo de RPMl (RPMl, 10 % de suero AB humano inactivado con calor, HEPES 25 mM, glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina/fungizona) a 37 °C, C02 al 7%. Después de 66 horas de incubación, se removió una alícuota del sobrenadante de cultivo celular y se congeló para la detección de citocinas en un momento posterior. Las células se sometieron a impulsos con 1 µCi de 3H-timidina durante 6 horas luego se recolectaron para determinar los niveles de incorporación de nucleótido (Lector de Placas Wallac Trilux Microbeta) como una medida de la proliferación celular. Se usaron equipos de ELISA comercialmente disponibles (BioSource International) para detectar niveles de TNF-a en los sobrenadantes de cultivo celular por las guías del fabricante. La repetición del ensayo para un panel completo de seis donadores separados proporciona una caracterización de respuestas de citocina y proliferativas, representativas a IL-2 en una "población normal".
Análisis de Datos Las muestras de PBMC se colocaron en placa en duplicado en placas de ensayo separadas para valorar la reproducibilidad. Los datos de proliferación se analizaron al sustraer la proliferación de fondo (PBMC + sin IL-2) y se calcula la media de la muestra duplicada. Los datos de citocina se derivan de los sobrenadantes de cultivo celular removidos de las cavidades de ensayo que contienen PBMC y se mezclan para obtener el nivel medio de citocinas en la disposición por duplicado. Los niveles de TNF-a se cuantificaron a pg/ml, en base a una curva normal de TNF-a purificado contenido en el equipo de ELISA. Los datos se compilaron adicionalmente para el panel de seis donadores humanos normales como se resume en lo esquemático mostrado en la Figura 1.
Ensayo de citotoxicidad (NK/LAK/ADCC) En este ensayo, se separaron la PBMC de la sangre entera usando centrifugación por gradiente de densidad. Las PBMC se estimulan durante 3 días en la presencia de control de IL-2 10 nM o muteína de IL-2 de interés, para generar actividad de LAK como se practica en general en el estado actual de la técnica (ver, por ejemplo Isolation of Human NK Cells and Generation of LAK activi ty IN : Current Protocols in Immunology; 1996 John Wiley & Sons, Ine) . La población celular resultante contiene células "efectoras", que se pueden clasificar -como NK o LAK, y pueden aniquilar objetivos de células tumorales K562 y Daudi, respectivamente. Estas células efectoras también pueden mediar ADCC, por lo que las células efectoras reconocen la porción de Fc de un anticuerpo específico (en este caso RituxanMR) que se une a las células objetivo Daudi. El ensayo comprende co-incubación de células efectoras con células objetivo marcadas con calceína AM a varias relaciones de efectoras célula objetivo (relaciones de E:T) durante "4 horas. La cantidad de actividad citotóxica se relaciona a la detección de calceína AM en el sobrenadante de cultivo. La cuantificación se expresa como por ciento de lisis específica en cada relación de E:T, en base a la determinación de los controles de liberación espontánea y máxima. En resumen, el ensayo examina las siguientes actividades biológicas: Análisis de Datos Se obtienen datos del fluorímetro y se expresan en unidades relativas de fluorescencia (rfu) . Los controles incluyen células objetivo marcadas solas (min) y células objetivo marcadas con Tritón X-100. al 1 % final como una medida de 100 % de lisis (max) . El por ciento de relación de min a más se calcula usando la siguiente ecuación como una medida de la viabilidad del ensayo (ensayo inválido si > 30 de min a max = 100 X liberación espontánea media, rfu liberación máxima media rfu Una vez que el ensayo se juzga válido, la desviación estándar y media para puntos de muestra triplicado se calcula, seguido por el por ciento de lisis específica de la media de los puntos triplicados usando la siguiente ecuación: de lisis = 100 X media experimental, rfu- liberación espontánea media, rfu liberación máxima media, rfu - liberación espontánea media, rfu Los datos se reportan como % de lisis específica; además de la relación de muteína de IL-2 al control pertinente de IL-2 se usó para determinar si se mantuvo la actividad citotóxica con relación a IL-2 de control en una población mezclada de donadores humanos de PBMC.
Resultados Se identificaron dos mutaciones benéficas combinatorias de IL-2 que reducen la producción de citocinas pro-inflamatorias en tanto que mantienen o incrementan niveles de proliferación y citotoxicidad en PBMC humanas normales: 40D72N y 40D61R. Para el conjunto de datos presentado más adelante, las muteínas de IL-2 se probaron junto con el control pertinente, es decir, IL-2 humana, C125S, des-alanil-1 expresada y purificada en el mismo sistema de levadura (designado Y-Pro) . Inicialmente, las muteínas de IL-2 se probaron en el ensayo de producción de citocinas pro-inflamatorias/proliferación de combinación sobre una curva de respuesta de dosis (39 pM-10 nM) en dos disposiciones de ensayo independientes, cada uno con tres PBMC de donadores normales de sangre, probadas en duplicado. El análisis de datos incluyó perfiles de donadores individuales, media ± desviación estándar, análisis de diferencias de controles internos de IL-2, y normalización de producción de citocinas (pg/ml) a proliferación (cpm) para derivar niveles relativos de citocina producida por célula. Finalmente, se calculó el por ciento de disminución en la producción de TNF-a del control de IL-2. Las muteínas de IL-2 con una disminución en la producción de TN-a mayor de 25 % a 10,000 pM se juzgaron benéficas si se mantuvieron los niveles de proliferación. La Tabla 9 resume el por ciento de disminución en la producción de TNF-a observado para las dos muteínas combinatorias benéficas de IL-2, que tuvieron la combinación adicional indicada de sustituciones de aminoácidos en la estructura de la muteína de IL-2 humana C125S, des-alanil-1. Las Figuras 1 y 2 muestran la proliferación y producción de TNF-a mediada por las muteínas de 40D72N y 40D61R, respectivamente, en PBMC humanas .
Tabla 9 Por ciento de disminución en la producción de TNF-a de control de IL-21 1Valores se representan por ciento, promedio de disminución de control de Y-Pro de panel de 6 donadores humanos normales de PBMC. Los datos de citocinas se normalizan a la proliferación .
Una vez que se identificaron las dos muteínas benéficas de IL-2, fue importante determinar si las PBMC estimuladas con muteína de IL-2 retuvieron la capacidad para lisar objetivos de células tumorales por actividad de NK, LAK y ADCC. Como se indica en la Figura 4, no hubo diferencia observada entre ya sea la muteína de IL-2 de 40D72N o la muteína de IL-2 de 40D61R y el control de IL-2 pertinente en la capacidad para lisar objetivos tumorales por actividad de LAK y ADCC. Muchas modificaciones y otras modalidades de las invenciones expuestas en la presente llegarán a la mente de un experto en la técnica a la cual corresponden estas invenciones que tengan el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y los dibujos asociados. Por lo tanto, se va a entender que las invenciones no se limitan a las modalidades específicas descritas y que se propone que se incluyan modificaciones y otras modalidades dentro del alcance de las modalidades descritas en la presente. Aunque se emplean en la presente términos específicos, se usan en el sentido genérico y descriptivo únicamente y no para propósito de limitación. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótidos que codifica para una muteína de IL-2 humana, la muteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 , 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 , 70 y 72; b) la secuencia de nucleótídos expuesta en SEQ ID N0 : 9 , 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 6 71; c) una secuencia de nucleótidos que codifica para una muteína de IL-2 humana, la muteína que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID ?O-.10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72; d) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 4-399 de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO : 9 , 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ó 71; e) una secuencia de nucleótidos de cualquiera de a) , b) , c) ó d) , en donde la secuencia comprende una sustitución de los nucleótidos 373-375 de SEQ ID N0 : 9 , 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ó 71; con un codón de triplete que codifica para alanina; f) una secuencia de nucleótidos de cualquiera de a) , b) , c) , ó d) , en donde la secuencia comprende una sustitución de los nucleótidos 373-375 de SEQ ID NO : 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ó 71; con un codón de triplete que codifica para cisteína; y g) una secuencia de nucleótidos de a) , b) , c) , d) , e) , ó f) , en donde se han optimizado uno o más codones que codifican para la muteína, para la expresión en una célula hospedadora de interés. 2. Molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de g) se selecciona del grupo que consiste de la secuencia de SEQ ID ?O:73, nucleótidos 4-399 de SEQ ID NO : 73, la secuencia de SEQ ID NO : 74, y los nucleótidos 4-399 de SEQ ID NO: 74. 3. Vector de expresión, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2. 4. Célula hospedadora caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2. 5. Polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de SEQ ID NO :10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; c) la secuencia de aminoácidos de a) ó b) , en donde la secuencia comprende un residuo de alanina sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; y d) la secuencia de aminoácidos de a) ó b) , en donde la secuencia comprende un residuo de cisteína sustituido por el residuo de serina en la posición 125 • de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72. 6. Polipéptido aislado que comprende una muteína de IL-2 humana, caracterizado porque la muteína comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 con una serina sustituida por cisteína en la posición 125 de SEQ ID NO: 4 y al menos dos sustituciones de aminoácidos adicionales dentro de SEQ ID NO: 4, en donde la muteína: 1) mantiene o mejora la proliferación de células aniquiladoras naturales (NK) , y 2) induce un nivel disminuido de producción de citocina pro-inflamatoria por células NK; en comparación con una cantidad similar de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables en donde la proliferación de células NK y la producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK se valora usando el bioensayo de NK-92. 7. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muteína comprende adicionalmente una supresión de alanina en la posición 1 de SEQ ID NO: 4. 8. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las sustituciones adicionales dentro de SEQ ID NO : 4 se seleccionan del grupo que consiste de las sustituciones de combinación 19D40D, 19D81K, 34D42R, 36D61R, 36D65L, 40D36D, 40D61R, 40D65Y, 40D72N, 40D80K, 40G36D, 40G65Y, 80K36D, 80K65Y, 81K36D, 81K42E 81K61R, 81K65Y, 81K72N, 81K88D, 81K91D, 81K107H, 81L107H, 91N95G, 107H36D, 107H42E, 107H65Y, 107R36D, 107R72N, 40D81K107H, 40G81K107H y 91N94Y95G. 9. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la muteína comprende además una supresión de alanina en la posición 1 de SEQ ID NO: 4. 10. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la citocina pro-inflamatoria es TNF-a. 11. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muteína proporciona citotoxicidad aniquiladora natural, mediada por células NK humanas, mantenida o mejorada, citotoxicidad aniquiladora activada por linfocinas (LAK) , ó citotoxicidad mediada por ADCC con relación a aquella observada para una cantidad similar de des-alanil-1, muteína de IL-2 humana C125S ó IL-2 humana C125C bajo condiciones de ensayo comparables, en donde se valora la citotoxicidad mediada por células NK usando el bioensayo de citotoxicidad de NK3.3. 12. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la proliferación de células NK inducida por la muteína es mayor de 150 % de aquella inducida por una cantidad similar de des-alanil-1, IL-2-humana C125S ó IL-2 humana C125S bajo condiciones de ensayo comparables . 13. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la proliferación de células NK inducida por la muteína es mayor de 170 % de aquella inducida por IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2- humana C125S. 14. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la proliferación de células NK inducida por la muteína es aproximadamente 200 % a aproximadamente 250 % de aquella inducida por IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S. 15. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la proliferación de células NK inducida por la muteína se incrementa por al menos 10 % con respecto a aquella inducida por una cantidad similar de des-alanil-1, IL-2 humana C125S ó IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo. 16. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la proliferación de células NK inducida por la muteína se incrementa por al menos 15 % con respecto a aquella inducida por IL-2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S. 17. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la producción de citocinas pro-inflamatorias inducida por la muteína es menor de 100 % de aquella inducida por una cantidad similar de IL- 2 humana C125S, des-alanil-1 ó IL-2 humana C125S bajo condiciones similares de ensayo. 18. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la producción de citocinas pro-inflamatorias inducida por la muteína es menos de 70 % de aquella inducida por IL-2. humana C125S, des- alanil-1 ó IL-2 humana C125S. 19. Polipéptido aislado que comprende una muteína de IL-2 humana, caracterizado porque la muteína comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 con una serina sustituida por cisteína en la posición 125 de SEQ ID NO: 4 y al menos dos sustituciones adicionales de aminoácidos dentro de SEQ ID NO: 4, en donde la relación de la proliferación de células NK inducida por IL-2 a la producción de TNF-a inducida por IL-2 de la muteína es al menos 1.5 veces mayor que aquella observada para una cantidad similar de muteína de IL-2-humana C125S, des-alanil-1 o muteína de IL -2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo, en donde la proliferación de células NK en muteína 0.1 hM y la producción de T?F-a en muteína 1.0 nM se valora usando el bioensayo de NK-92. 20. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la relación es al menos 2.5 veces mayor que aquella observada para IL-2 humana C125S, des-alanil-1 o IL-2 humana C125S. 21. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la relación es al menos 3.0 veces mayor que aquella observada para des-alanil- 1, IL-2-humana C125S ó IL-2 humana C125S. 22. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la muteína comprende además una supresión de alanina en la posición 1 SEQ ID NO : 4-. 23. Polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos para una muteína de IL-2 humana, • caracterizado porque la muteína comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 con una serina sustituida por cisteína en la posición 125 de SEQ ID NO: 4 y con al menos dos sustituciones adicionales de aminoácidos, en donde las sustituciones adicionales residen en las posiciones de SEQ ID NO: 4 se selecciona del grupo que consiste de las posiciones 19, 36, 40, 42, 61, 65, 72, 80, 81, 88, 91 y 107. 24. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la muteína comprende además una supresión de alanina en la posición 1 de SEQ ID NO: 4. 25. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las sustituciones adicionales dentro de SEQ ID NO: 4 se seleccionan del grupo que consiste de las sustituciones de combinación de 19D40D, 19D81K, 34D42R, 36D61R, 36D65L, 40D36D, 40D61R, 40D65Y, 40D72N, 40D80K, 40G36D, 40G65Y, 80K36D, 80K65Y, 81K36D, 81K42E 81K61R, 81K65Y, 81K72N, 81K88D, 81K91D, 81K107H, 81L107H, 91N95G, 107H36D, 107H42E, 107H65Y, 107R36D, 107R72N, 40D81K107H, 40G81K107H y 91N94Y95G. 26. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la muteína comprende además una supresión de alanina en la posición 1 de SEQ ID NO: 4. 27. Método para producir una muteína de interleucina-2-humana- ' (IL-2) que es capaz de mantener o mejorar la proliferación de células NK y que también induce un nivel inferior de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK en comparación con una cantidad similar de una muteína de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 e IL-2-humana C125 bajo condiciones similares de ensayo, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocinas pro-inflamatorias se valoran usando el bioensayo de NK-92, el método está caracterizado porque comprende: a) transformar una célula hospedadora dentro de un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1; b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo celular bajo condiciones que permitan la expresión de la molécula de ácido nucleico como un polipéptido; y c) aislar el polipéptido. 28. Método para producir una muteína de interleucina-2-humana (IL-2) que es capaz de mantener o mejorar la proliferación de células NK y que también induce un nivel menor de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK en comparación con una cantidad similar de una muteína de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 e IL-2 humana C125 bajo condiciones similares de ensayo, en donde la proliferación de células de NK y la producción de citocinas pro-inflamatorias se valoran usando el bioensayo de NK-92, el método está caracterizado porque comprende: a) transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de la reivindicación 23; b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo celular bajo condiciones que permita la expresión de la molécula de ácido nucleico como un polipéptido; y c) aislar el polipéptido. 29. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una muteína de IL-2 humana de conformidad con la reivindicación 5 y un portador farmacéuticamente aceptable. 30. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una muteína de IL-2 humana de conformidad con la reivindicación 6 y un portador farmacéuticamente aceptable. 31. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una muteína de IL-2 humana de conformidad con la reivindicación 19 y un portador farmacéuticamente aceptable. 32. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una muteína de IL-2 humana de conformidad con la reivindicación 23 y un portador farmacéuticamente aceptable. 33. Método para estimular el sistema inmunitario de un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una IL-humana, en donde la muteína induce un nivel menor de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK y mantiene y mejora la proliferación de células NK en comparación a una cantidad similar de una muteína de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 e IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocinas pro-inflamatorias se valoran usando el bioensayo de NK-92. 34. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el mamífero es un humano. 35. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la muteína de IL-2-humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia, de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; c) la secuencia de aminoácidos de a) o b) , en donde la secuencia comprende un residuo de alanina sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72; d) la secuencia de aminoácidos de a) ó b) , en donde la secuencia comprende un residuo de cisteína sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; 36. Método para tratar un cáncer en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una muteína de IL-2 humana, en donde la muteína induce un nivel inferior de producción .de citocinas pro-inflamatorias por células NK y mantiene o mejora la proliferación de células NK en comparación a una cantidad similar de una muteína de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 e IL-2 humana C125S bajo condiciones similares de ensayo, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocinas pro-inflamatorias se valoran usando el bioensayo de NK-92. 37. Método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el mamífero es un humano. 38. Método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la muteína de IL-2-humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; c) la secuencia de aminoácidos de a) o b) , en donde la secuencia comprende un residuo de alanina sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID NO: 10, 12, .14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36,. 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; y d) la secuencia de aminoácidos de a) ó b) , en donde la secuencia comprende un residuo de cisteína sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; 39. Método para reducir síntomas de toxicidad inducidos por interleucina-2 (IL-2) en un sujeto que se somete a administración de IL-2 como un protocolo de tratamiento, el método está caracterizado porque comprende administrar la IL-2 como una muteína de IL-2 humana, en donde la muteína de IL-2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; c) la secuencia de aminoácidos de a) ó b) , en donde la secuencia comprende un residuo de alanina sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; y d) la secuencia de aminoácidos de a) ó b) , en donde la secuencia comprende un residuo de cisteína sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72. 40. Uso de una muteína de IL humana en un método para estimular el sistema inmunitario de un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de la muteína de IL-2 humana, en donde la muteína induce un nivel menor de producción de citocinas pro-inflamatorias por células NK y mantiene o mejora la proliferación de células NK en comparación a una cantidad similar de una muteína de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 e IL-2 humana C125S bajo condiciones comparables de ensayo, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocinas pro-inflamatorias se valoran usando el bioensayo de NK-92. 41. Uso de una muteína de IL-2 humana en un método para tratar un cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de la muteína de IL-2 humana, en donde la muteína induce un nivel menor de producción de citocinas pro- inflamatorias por células NK y mantiene o mejora la proliferación de células NK en comparación a una cantidad similar de una muteína de IL-2 de referencia seleccionada de IL-2 humana C125S, des-alanil-1 e IL-2 humana C125S bajo condiciones similares de ensayo, en donde la proliferación de células NK y la producción de citocinas pro-inflamatorias se valoran usando el bioensayo de NK-92. 42. Uso de una muteína de IL-2 humana en un método para reducir los síntomas de toxicidad inducidos por interleucina-2 (IL-2) en un sujeto que se somete a administración de IL-2 como un protocolo de tratamiento, el método que comprende administrar la 1L-2 como una muteína de IL-2, en donde la muteína de IL-2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-133 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; c) la secuencia de aminoácidos de a) ó b) , en donde la secuencia comprende un residuo de alanina sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72; y d) la secuencia de aminoácidos de a) ó b) , en donde la secuencia comprende un residuo de cisteína sustituido por el residuo de serina en la posición 125 de SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ó 72.
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