KR20220139293A

KR20220139293A - 인터류킨 2 키메라 구축물

Info

Publication number: KR20220139293A
Application number: KR1020227022897A
Authority: KR
Inventors: 다비 크라츠망; 니꼴라 빌리알; 또마 바스케스; 제레미 마리오
Original assignee: 일투 파마; 쏘흐본느 유니베흐시테; 인스티튜트 내셔널 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 (인 썸); 아시스땅스 퍼블리끄-오삐또 드 빠리
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2022-10-14
Also published as: BR112022011414A2; US20230036793A1; AU2020401357A1; EP4073094A1; CA3159468A1; JP2023505590A; MX2022007203A; IL293628A; CN115190885A; ZA202206740B; WO2021116444A1

Abstract

본 발명은 i) 인터류킨 2 (IL2) 모이어티 및 ii) 이량체 단백질을 형성할 수 있는 C4b-결합 단백질의 베타 사슬 (C4BPβ) 또는 이의 적어도 하나의 단편 또는 기능적 변이체를 포함하는 키메라 구축물에 관한 것이다.

Description

인터류킨 2 키메라 구축물

본 발명은 개선된 약동학 및/또는 약역학을 갖는 IL2 구축물에 관한 것이다.

인터류킨-2 (IL2 또는 IL-2) 는 면역계의 주요 측면을 조절하는 사이토카인이다. IL2 는 자가면역 및/또는 염증성 질환 뿐만 아니라, 암을 갖는 환자에서 면역 반응을 증진시키기 위한 시도에 사용되어 왔다. IL2 는 항원-활성화 T 세포의 클론 증대를 포함하는 면역 반응을 촉진하고, CD4+ T-헬퍼 (Th)l 및 Th2 세포의 발달을 유도하고, CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL) 를 말단 분화시키며, CD4+ Thl7 및 T-여포성 헬퍼 (Tfh) 세포의 발달에 반대되는 강력한 T 세포 성장 인자이다. IL2 는 또한 T 세포 기억 회상 반응을 형상화한다.

저용량의 IL2 는 자가 조직의 자가면역-유사 공격과 관련된 원치 않는 면역 반응을 억제하기 위해 내성을 선택적으로 증진시키기 위해 사용되었다. 지금까지의 경험은 이 치료법이 안전하며, 자가-공격성 T 세포의 재활성화의 징후는 없는 반면, 조절 T 세포 (Tregs) 는 거의 모든 환자에서 증가하며, 이는 임상 개선을 동반한다는 것이었다.

그럼에도 불구하고, 치료제로서 IL2 는, 특히 생체 내에서 짧은 반감기에 관하여, 개선될 수 있다. 이러한 이유로, 개선된 약동학 및/또는 약역학을 갖는 새로운 IL2 생물제제가 필요하다.

본 발명은 i) 인터류킨 2 (IL2) 모이어티 및 ii) 이량체 단백질을 형성할 수 있는 C4b-결합 단백질의 베타 사슬 (C4BPβ) 또는 이의 적어도 하나의 단편 또는 기능적 변이체를 포함하는 키메라 구축물을 제공한다.

이러한 구축물, 따라서 IL2 모이어티는 개선된 반감기를 갖는다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도 이러한 키메라 구축물이 Treg 증대의 선택성을 개선한다는 것을 보여주었다.

특정 구현예에서, 키메라 구축물은 이량체 형태이며, 여기서 단량체는 C4BPβ 의 2 개의 시스테인 사이의 공유 결합에 의해 연합된다. 동종이량체 및 이종이량체는 아래에 자세히 설명되어 있다.

바람직한 구현예에서, C4BPβ 단편은 C4BPβ 의 아미노산 잔기 194 내지 252, 또는 N-말단에서 최대 아미노산 135 까지 연장되는 C4BPβ 의 더 긴 단편을 포함하거나, 이로 이루어진다.

바람직한 구현예에서, 상기 IL-2 모이어티는 인간 IL-2 또는 이의 상동 변이체이고, 여기서 변이체는 인간 야생형 IL-2 와 적어도 85% 아미노산 동일성을 갖고, 바람직하게는 변이체는 인간 야생형 IL-2 와 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 인간 IL-2 의 활성 유사체이고, 상기 IL-2 모이어티는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 위치 N88 에서의 치환, 더욱 바람직하게는 치환 N88R 을 포함하는 IL2 뮤테인이다.

도 1 은 Treg (A), Tconv (B) 및 CD8 T 세포 (C) 에서 pSTAT5 유도의 용량-반응을 나타낸다. Hi2 는 인간 IL-2 (SEQ ID NO:1) 이고, Hi2cb 는 C4BPβ 의 C-말단 영역에 융합된 인간 IL-2 (SEQ ID NO:6) 이고, Hi2mcb 는 C4BPβ 의 C-말단 영역에 융합된 돌연변이된 IL-2 (SEQ ID NO: 7) 이다.
도 2 는 AAV 발현 IL-2 구축물의 10¹¹ 바이러스 게놈의 주입 후 마우스에서 4 개의 상이한 T 세포 구획 및 NK 세포의 배수 증가의 동역학적 곡선을 나타낸다.
도 3 은 AAV 발현 IL-2 구축물의 10¹¹ 바이러스 게놈의 주입 후 마우스에서 시간에 따른 혈장 (A) 및 소변 (B) 인간 IL-2 의 동역학을 나타낸다.
도 4 는 AAV 발현 IL-2 구축물의 10¹² 바이러스 게놈의 주입 후 마우스에서 4 개의 상이한 T 세포 구획 및 NK 세포의 배수 증가의 동역학적 곡선을 나타낸다.
도 5 는 AAV 발현 IL-2 구축물의 10¹² 바이러스 게놈의 주입 후 마우스의 생존 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 곡선을 나타낸다.
도 6 은 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서의 Hi2 와 비교하여 융합 단백질 Hi2cb 또는 Hi2mcb 의 치료 효능을 나타낸다.
도 7 은 5 일 동안 매일 25 000 국제 단위의 Hi2, Hi2cb 또는 Hi2mcb 의 한 주사에 기초한 실험 투여 스케줄을 나타낸다. 면역표현형분석은 주사 전 매일 수행되어 Treg 동역학을 평가하였다.
도 8 은 단일 피하 주사 후 시간에 따른 각 구축물 Hi2, Hi2cb 또는 Hi2mcb 의 약동학적 프로파일을 나타낸다.

정의

치료하려는 "대상" 또는 "환자" 는 임의의 포유동물, 바람직하게 인간일 수 있다. 인간 대상은 어린이, 성인 또는 노인일 수 있다.

용어 "치료하기" 또는 "치료" 란 질환의 임의의 개선을 의미한다. 이는 적어도 하나의 증상을 완화시키거나, 질환의 중증도 또는 발병을 감소시키는 것을 포함한다. 상기 질환이 염증성 및/또는 자가면역 장애인 경우, 상기 용어는 보다 구체적으로 급성 에피소드 (발적) 의 위험, 발생 또는 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 용어 "치료하기" 또는 "치료" 란 질환의 진행 감소를 포함한다. 특히, 본 발명은 질환의 진행을 예방하거나 늦추는 것을 포함한다. 용어 "치료하기" 또는 "치료"는, 특히 무증상이지만 "위험" 에 있는 것으로 진단된 대상에서, 질환의 위험을 감소시키거나 질환의 발생을 지연시킴으로써, 예방적 치료를 추가로 포함한다.

"조절 T 세포" 또는 "Tregs" 는 면역억제 활성을 갖는 T 림프구이다. 천연 Treg 는 CD4+CD25+Foxp3+ 세포로서 특징지어진다. Treg 는 염증성 질환의 조절에 중요한 역할을 하지만, 이러한 질환에서의 작용 방식은 잘 이해되지 않는다. 사실, 대부분의 염증성 질환에서, Treg 고갈은 질환을 악화시키는 반면, Treg 첨가는 질환을 감소시킨다. 대부분의 Treg 는 CD4+ 세포이지만, 억제 활성을 갖는 CD8+ Foxp3+ T 림프구의 희귀 집단이 또한 존재한다.

본 출원의 맥락에서, "효과기 T 세포" (또는 "Teff") 는 하나 이상의 T 세포 수용체 (TCR) 를 발현하고 효과기 기능 (예를 들어, 세포독성 활성, 사이토카인 분비 등) 을 수행하는 Treg (때때로 문헌에서 Tconv 로도 지칭됨) 이외의 통상적인 T 림프구를 지칭한다. 본 발명에 따른 인간 Teff 의 주요 집단은 CD4+ T 헬퍼 림프구 (예를 들어, Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, Tfh) 및 CD4+ 또는 CD8+ 세포독성 T 림프구를 포함하고, 이들은 자가 또는 비-자가 항원에 특이적일 수 있다. Teff 는 Foxp3+ 조절 CD8+ T 세포를 포함하지 않는다.

본 출원의 맥락에서, "T 여포성 헬퍼 세포" (또는 "Tfh") 는 BcL6, CXCR5 및 PD1 을 발현하는 T CD4+ 림프구를 지칭하며, Foxp3- 이고, B 세포 도움을 제공한다.

본 출원의 맥락에서, "T 여포성 조절 세포" (또는 "Tfr") 는 CD4+CXCR5+PD-1+Bcl6+Foxp3+CD25-T 림프구를 나타낸다.

서열 목록에는 다음 서열이 제시된다:

SEQ ID NO: 1 은 야생형 인간 IL2 (253 아미노산, 신호 펩티드를 포함함) 이다

SEQ ID NO: 2 는 성숙 야생형 인간 IL2 (233 아미노산, 신호 펩티드를 포함함) 이다

SEQ ID NO : 3 은 C4BP 베타 사슬 (1-252) 이다

SEQ ID NO : 4 는 C4BP 베타 사슬의 단편 194-252 이다

SEQ ID NO : 5 는 C4BP 베타 사슬의 단편 137-252 이다

SEQ ID NO: 6 은 Hi2cb 의 아미노산 서열 (신호 펩티드 포함) 이다

SEQ ID NO: 7 은 신호 펩티드를 포함하는 아미노산 서열 Hi2mcb (N88R) 이다

SEQ ID NO : 8 은 GGGGS 패턴 (링커) 이다

SEQ ID NO : 9 는 신호 펩티드가 없는 Hi2cb 의 아미노산 서열이다

SEQ ID NO : 10 은 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열 Hi2mcb (N88R) 이다

IL-2 모이어티

본원에서 사용되는, 인터류킨-2 (IL-2) 는 포유동물 야생형 인터류킨-2, 및 이의 변이체를 포함한다. 바람직하게는, IL-2 은 인간 IL-2, 또는 이의 변이체이다.

IL-2 의 활성 변이체는 문헌에 개시되어 있다. 고유의 IL-2 의 변이체는 그의 단편, 유사체 및 유도체일 수 있다. "단편" 은 폴리펩티드 서열의 일부 만을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. "유사체" 는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이 있는 천연 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 뮤테인 및 슈도펩티드는 유사체의 특정 예이다. "유도체" 는 글리코실화되거나, 인산화되거나, 다른 폴리펩티드 또는 분자에 융합되거나, 중합되는 등, 또는 IL-2 의 특성 (예를 들어, 안정성, 특이성 등) 을 개선시키기 위한 화학적 또는 효소적 개질 또는 첨가를 통한, 임의의 변형된 천연 IL-2 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 유사체를 포함한다. 활성 변이체의 IL-2 모이어티는 일반적으로 참조 IL-2 폴리펩티드, 예를 들어 성숙 야생형 인간 IL-2 의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 또는 적어도 95% 의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

본원에서 사용된, "야생형 IL-2" 는 천연 또는 재조합체인 IL-2 를 의미하며, 천연 인간 IL-2 의 133 개의 정상적으로 발생하는 아미노산 서열을 포함하며, 이의 아미노산 서열은 Fujita, et. al., PNAS USA, 80,7437-7441 (1983) 에 기재되어 있다. SEQ ID NO: 2 (133 개 아미노산) 는 추가적인 20 개의 N-말단 아미노산으로 구성된, 신호 펩티드가 없는 인간 IL-2 서열이다. SEQ ID NO: 1 (153 개 아미노산) 는 신호 펩티드를 포함하는 인간 IL-2 서열이다.

본원에서 사용된 "IL-2 뮤테인" 은 인간 성숙 인터류킨-2 단백질에 특이적인 아미노산을 치환한 폴리펩티드를 의미한다. 다른 언급이 없는 한, 아미노산의 모든 넘버링은 SEQ ID NO: 2 의 인간 성숙 인터류킨-2 단백질에 관하여 이루어진다.

일부 구현예에서, 위치 125 의 시스테인은 중성 아미노산, 예컨대 세린 (C125S), 알라닌 (C125A), 트레오닌 (C125T) 또는 발린 (C125V) 으로 대체된다.

예를 들어, 활성 변이체가 CHO 또는 HEK 세포와 같은 포유류 세포에서 발현될 때, O-글리코실화 부위의 제거는 좀더 동종의 생성물을 초래한다.

특정 구현예에서, 활성 변이체는 인간 IL-2 의 잔기 3 에 상응하는 위치에서 IL-2 의 O-글리코실화 부위를 제거하는 추가적인 아미노산 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 IL-2 의 잔기 3 에 상응하는 위치에서 IL-2 의 O-글리코실화 부위를 제거하는 상기 추가적인 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예시적인 아미노산 치환은 T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K, 및 T3P 를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 추가적인 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 T3A 이다.

· T-reg 세포 증식, 생존, 활성화 및/또는 기능을 선택적으로 촉진하는 활성 변이체는 염증성 및/또는 자가면역 장애를 치료하는데 특히 유용하다.

"선택적으로 촉진" 이라는 것은 활성 변이체가 T-reg 세포에서 활성을 촉진하지만, 비-조절 T 세포에서 활성을 촉진하는 능력이 제한적이거나 부족하다는 것을 의미한다. T-reg 세포 증식, 생존, 활성화 및/또는 기능을 선택적으로 촉진하는 활성 변이체를 스크리닝하기 위한 분석법이 본원에 추가로 기술된다.

변이체 IL-2 폴리펩티드가 활성인지 여부를 결정하는 방법은 당해 분야에 이용가능하다. 예를 들어, WO2016/014428 을 참조하라. 활성 변이체는 Treg 를 자극하는 것보다는 Teff 를 자극하지 않는 정도까지, 야생형 IL-2 또는 알데스류킨 (하기 정의됨) 과 비교할 때, Treg 를 자극하는 개선된 능력, 또는 유사한 능력, 또는 심지어 감소된 능력을 갖는 변이체를 포함하여, Treg 를 자극하는 능력을 나타내는 변이체로서 정의된다. 후보 분자가 T 세포, 특히 Treg, 또는 NK 세포를 자극하는지 여부를 시험하는 방법은 잘 알려져 있다. 변이체는 효과기 T 세포 (예컨대, CD8+ T 세포), CD4+ Foxp3+ Treg, 또는 NK 세포를 자극하는 이들의 능력에 대해 시험될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 활성 변이체는 야생형 IL2 또는 알데스류킨과 비교하여 NK 세포를 자극하는 감소된 능력을 나타낸다. STAT5 인산화를 모니터링하는 것은 문헌 [Yu et al, Diabetes 2015;64:2172-2183] 에 기재된 바와 같이, Teff 보다 Treg 를 우선적으로 자극하는 능력에 대한 변이체를 평가하는 간단한 방법이다. 특정 구현예에서, 변이체는 주어진 수준의 STAT5 인산화가 Teff 를 포함하는 다른 면역 세포보다 Treg 에 대해 적어도 10 배 낮은 투여량으로 달성되는 경우에 특히 유용하다.

상기 활성 변이체는 Treg 세포의 생존, 증식, 활성화 및/또는 기능을 우선적으로 유도하는 신호전달 사건을 유도한다. 특정 구현예에서, IL-2 변이체는 Treg 세포에서 STAT5 인산화 및/또는 IL-2R 다운스트림의 하나 이상의 신호전달 분자, 예를 들어, p38, ERK, SYK 및 LCK 의 인산화를 자극하는 능력을 보유한다. 다른 구현예에서, IL-2 변이체는 Treg 세포에서, Treg 세포 생존, 증식, 활성화 및/또는 기능에 중요한 유전자 또는 단백질, 예컨대 FOXP3, Bcl-2, CD25 또는 IL-10 의 전사 또는 단백질 발현을 자극하는 능력을 보유한다. 다른 구현예에서, IL-2 변이체는 CD25+ T 세포의 표면 상에서 IL-2/IL-2R 복합체의 세포내이입을 자극하는 감소된 능력을 나타낸다. 다른 구현예에서, IL-2 변이체는 PI3-키나제 신호전달의 자극의 비효율적이거나, 감소되거나, 또는 부재, 예컨대 AKT 및/또는 mTOR (라파마이신의 포유동물 표적) 의 비효율적이거나, 감소되거나 또는 부재하는 인산화를 입증한다. 또 다른 구현예에서, IL-2 변이체는 Treg 세포에서 STAT5 인산화 및/또는 IL-2R 다운스트림의 하나 이상의 신호전달 분자의 인산화를 자극하는 야생형 IL-2 의 능력을 보유하지만, FOXP3-CD4+ 또는 CD8+ T 세포 또는 NK 세포에서 STAT5, AKT 및/또는 mTOR 또는 IL-2R 다운스트림의 다른 신호전달 분자의 비효율적이거나, 감소되거나, 또는 부재하는 인산화를 입증한다. 다른 구현예에서, IL-2 변이체는 FOXP3-CD4+ 또는 CD8+ T 세포 또는 NK 세포의 생존, 성장, 활성화 및/또는 기능을 자극하는데 비효율적이거나 불가능하다.

모든 경우에, 이들 변이체는 그들의 생물학적 활성을 결정하는데 보편적으로 사용될 수 있는 CTLL-2 또는 HT-2 와 같은 세포주를 자극하는 능력을 갖는다.

예를 들어, IL-2 의 생물학적 활성은 그의 성장이 IL-2 에 의존하는 HT-2 세포주 (클론 A5E, ATCC® CRL-1841™) 에 대해 수행된 세포-기반 분석법에 의해 결정될 수 있다. 다양한 시험 인터류킨-2 생성물의 존재 하에서의 세포 성장을 IL-2 국제 표준 (INTERLEUKIN 2 (인간, rDNA 유래) 에 대한 WHO 제 2 국제 표준 NIBSC 코드: 86/500) 으로 기록된 성장과 비교한다. 세포 성장은 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨 (내부 염, MTS) 의 첨가 및 활성 생존 세포에 의한 포르마잔으로의 변환 후 측정된다. 포르마잔 농도는 이어서, 490 nm 에서 분광광도계에 의해 측정된다.

IL-2 변이체의 예는 예를 들어 EP109748, EP136489, US4,752,585; EP200280, EP118617, WO99/60128, EP2288372, US9,616,105, US9,580,486, WO2010/085495, WO2016/164937 에 개시되어 있다.

예를 들어, 특정 돌연변이는 IL-2 수용체의 신호전달 사슬 (IL-2Rβ/CD122 및/또는 IL-2Rγ/CD132) 에 대한 감소된 친화성 및/또는 IL-2 수용체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛으로부터 신호전달 사건을 유도하는 감소된 능력을 초래할 수 있다. 다른 돌연변이는 CD25 (IL-2Rα) 에 대해 더 높은 친화성을 부여할 수 있다. 두 경우 모두에서, 이들 돌연변이는 Treg 의 생존, 증식, 활성화 및/또는 기능을 우선적으로 유도하는 활성 변이체를 정의한다. 이러한 특성은 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 모니터링할 수 있다.

유용한 변이체의 특정 예는 야생형 IL-2 에 따라 넘버링된 위치 D20, N30, Y31, K35, V69, Q74, N88, V91, 또는 Q126 에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 나타내는 IL-2 뮤테인을 포함하며, 이는 선택된 아미노산이 SEQ ID NO:2 의 야생형 IL-2 의 성숙 서열에서 그 아미노산이 정상적으로 발생하는 위치를 참조하여 확인됨을 의미한다.

바람직한 IL-2 뮤테인은 위치 D20H, D20I, D20Y, N30S, Y31H, K35R, V69AP, Q74, N88R, N88D, N88G, N88I, V91K, 또는 Q126L 에서 적어도 하나의 치환을 포함한다.

일부 구현예에서, IL-2 뮤테인 분자는 V91K 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인 분자는 N88D 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인 분자는 N88R 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인 분자는 H16E, D84K, V91N, N88D, V91K, 또는 V91R 의 치환, 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 IL-2 뮤테인 분자는 또한 본원에 기재된 바와 같이 위치 125 에서의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다: T3N, T3A, L12G, L12K, L12Q, L 12S, Q13G, E15A, E15G, E15S, H16A, H16D, H16G, H16K, H16M, H16N, H16R, H16S, H16T, H16V, H16Y, L19A, L19D, L19E, L19G, L19N, L19R, L19S, L19T, L19V, D20A, D20E, D20H, D20I, D20Y, D20F, D20G, D20T, D20W, M23R, R81A, R81G, R81 S, R81T, D84A, D84E, D84G, D84I, D84M, D84Q D84R, D84S, D84T, S87R, N88A, N88D, N88E, N88I, N88F, N88G, N88M, N88R, N88S, N88V, N88W, V91D, V91E, V91G, V91 S, I92K, I92R, E95G, 및 Q126. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인 분자의 아미노산 서열은 C125A 또는 C125S 치환 및 T3N, T3A, L12G, L12K, L12Q L12S, Q13G, E15A, E15G, E15S, H16A, H16D, H16G, H16K, H16M, H16N, H16R, H16S, H16T, H16V, H16Y, L19A, L19D, L19E, L19G, L19N, L19R, L19S, L19T, L19V, D20A, D20E, D20F, D20G, D20T, D20W, M23R, R81A, R81G, R81 S, R81T, D84A, D84E, D84G, D84I, D84M, D84Q, D84R, D84S, D84T, S87R, N88A, N88D, N88E, N88F, N88I, N88G, N88M, N88R, N88S, N88V, N88W, V91D, V91E, V91G, V91 S, I92K, I92R, E95G, Q126I, Q126L, 및 Q126F 로부터 선택되는 하나의 치환을 갖는 성숙 IL-2 서열에 제시된 아미노산 서열과 상이하다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인 분자는 C125A 또는 C125S 치환, 및 D20H, D20I, D20Y, D20E, D20G, D20W, D84A, D84S, H16D, H16G, H16K, H16R, H16T, H16V, I92K, I92R, L12K, L19D, L19N, L19T, N88D, N88R, N88S, V91D, V91G, V91K, 및 V91S 로부터 선택되는 하나의 치환을 갖는 성숙 IL-2 서열에 제시된 아미노산 서열과 상이하다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 N88R 및/또는 D20H 돌연변이를 포함한다.

이들 치환은 단독으로 또는 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 뮤테인은 이들 치환 각각을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 뮤테인은 이들 치환 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개를 포함한다.

일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 N88R 또는 N88D 돌연변이, 바람직하게는 N88R 을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 C125A 또는 C125S 돌연변이를 포함한다. 이들 치환은 단독으로 또는 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 뮤테인은 이들 치환 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개를 포함한다. 일부 구현예에서, 뮤테인은 이들 치환 각각을 포함한다.

특정 구현예에서, IL-2 모이어티는 알데스류킨이다. 알데스류킨은 Proleukin® 의 활성 성분이다. 알데스류킨은 성숙 인간 IL-2 (SEQ ID NO:2) 의 서열과 비교하여 2 개의 아미노산 변형을 포함하는 성숙 인간 IL-2 의 변이체이다: 제 1 아미노산 (알라닌) 의 결실 및 위치 125 에서의 시스테인의 세린으로의 치환.

IL-2 의 다른 위치에서의 보존적 변형 및 치환 (즉, 뮤테인의 2 차 또는 3 차 구조에 최소 효과를 갖는 것들) 이 포함된다. 이러한 보존적 치환은 Dayhoff 에 의해 The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) 에, 그리고 Argos 에 의해 EMBO J., 8: 779-785 (1989) 에 기술된 것들을 포함한다. 예를 들어, 다음 그룹 중 하나에 속하는 아미노산은 보존적 변화를 나타낸다: -ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr; -cys, ser, tyr, thr; -val, ile, leu, met, ala, phe; -lys, arg, his; -phe, tyr, trp, his ; 및 -asp, glu.

IL-2R 의 α 서브유닛에 대한 결합을 파괴하는 돌연변이를 갖는 변이체는 바람직하지 않은데, 그 이유는 이들 변이체가 Treg 를 자극하는 감소된 능력을 가질 수 있기 때문이다.

· Teff 세포 증식, 생존, 활성화 및/또는 기능을 촉진하는 활성 변이체는 암을 치료하는데 유용할 수 있다.

이러한 IL-2 의 활성 변이체는 각각 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, IL-2 수용체 (CD25) 의 α-서브유닛에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 없애거나 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 보존하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 이러한 특성은 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 모니터링할 수 있다.

바람직한 활성 변이체는 F42A, K43N, Y45A, 및/또는 E62A 치환(들) 을 포함하는 IL-2 뮤테인을 포함한다.

CD25 에 대한 감소된 친화성을 갖는 인간 IL-2 (hIL-2) 의 돌연변이체와 같은 활성 변이체는 예를 들어 아미노산 위치 35, 38, 42, 43, 45, 62 또는 72 또는 이들의 조합 (인간 IL-2 서열 SEQ ID NO: 2 에 대한 넘버링) 에서의 아미노산 치환에 의해 생성될 수 있다. 예시적인 아미노산 치환은 K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, E62G, E62A, E62S, E62T, E62Q, E62E, E62N, E62D, E62R, E62K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R, 및 L72K 를 포함한다. 본 발명의 키메라 구축물에 유용한 특정 활성 변이체는 인간 IL-2 의 잔기 42, 45, 또는 72 에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R, 및 L72K 의 군으로부터 선택되는 아미노산 치환, 보다 구체적으로는 F42A, Y45A 및 L72G 의 군으로부터 선택되는 아미노산 치환이다. 이들 활성 변이체는 중간-친화성 IL-2 수용체에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화성을 나타내고, 야생형 형태의 IL-2 돌연변이체와 비교하여 IL-2 수용체의 α-서브유닛 및 고-친화성 IL-2 수용체 (IL2Rαβγ) 에 대해 실질적으로 감소된 친화성을 갖는다.

유용한 활성 변이체의 다른 특징은 IL-2 수용체-보유 T 및/또는 NK 세포의 증식을 유도하는 능력, IL-2 수용체-보유 T 및/또는 NK 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 능력, NK 세포에 의한 2차 사이토카인으로서 인터페론 (IFN)-y 를 생성하는 능력, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 에 의한 2차 사이토카인, 특히 IL-10 및 TNF-a 의 정교화를 유도하는 감소된 능력, 조절 T 세포를 활성화시키는 감소된 능력, T 세포에서 아폽토시스를 유도하는 감소된 능력, 및 생체내에서 감소된 독성 프로파일을 포함할 수 있다.

특정 활성 변이체는 IL-2 수용체의 α-서브유닛에 대한 활성 변이체의 친화성을 폐지하거나 감소시키지만 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 활성 변이체의 친화성을 보존하는 3 개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 3 개의 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2 의 잔기 42, 45 및 72 에 상응하는 위치에 존재한다. 하나의 구현예에서 상기 3 개의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 하나의 구현예에서, 상기 3 개의 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R, 및 L72K 의 군으로부터 선택되는 아미노산 치환이다. 특정 구현예에서, 상기 3 개의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (SEQ ID NO: 2 의 인간 IL-2 서열에 대해 넘버링) 이다.

특정 구현예에서, 상기 아미노산 돌연변이는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 IL-2 수용체의 α-서브유닛에 대한 친화성을 적어도 5 배, 구체적으로 적어도 10 배, 더욱 구체적으로 적어도 25 배 감소시킨다. IL-2 수용체의 α-서브유닛에 대한 활성 변이체의 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 존재하는 구현예에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 IL-2 수용체의 α-서브유닛에 대한 활성 변이체의 친화성을 적어도 30 배, 적어도 50 배, 또는 심지어 적어도 100 배 감소시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 아미노산 돌연변이 또는 아미노산 돌연변이의 조합은 IL-2 수용체의 α-서브유닛에 대한 활성 변이체의 친화성을 파괴하여, 표면 플라스몬 공명에 의해 결합이 검출되지 않도록 한다.

중간-친화성 수용체에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성의 보존은 활성 변이체가 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 야생형 형태의 IL-2 돌연변이체의 친화성의 약 70% 초과를 나타내는 경우에 달성된다. 본 발명에서 유용한 활성 변이체는 이러한 친화성의 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과를 나타낼 수 있다.

IL-2 의 O-글리코실화의 제거와 함께 IL-2 수용체의 α-서브유닛에 대한 IL-2 의 친화성의 감소는 개선된 특성을 갖는 IL-2 단백질을 초래한다.

특정 구현예에서, 활성 변이체는 활성화된 T 림프구 세포에서의 증식, 활성화된 T 림프구 세포에서의 분화, 세포독성 T 세포 (CTL) 활성, 활성화된 B 세포에서의 증식, 활성화된 B 세포에서의 분화, 자연 살해 (NK) 세포에서의 증식, NK 세포에서의 세포독성 활성, NK 세포에서의 분화, 활성화된 T 세포 또는 NK 세포에 의한 사이토카인 분비, 및 NK/림프구 활성화된 살해 (LAK) 항종양 세포독성으로 구성된 군으로부터 선택된 세포 반응 중 하나 이상을 유도할 수 있다.

일부 구현예에서, 이들 활성 변이체는 또한 본원에 기재된 바와 같이 위치 125 에서의 치환을 포함한다.

C4BPβ 또는 C4BPβ 단편

C4BP 단백질은 응고 및 보체 시스템에 관여한다. C4BP 의 주요 형태는 7 개의 동일한 75 kD 알파 사슬 및 하나의 45 kD 베타 사슬로 구성된다. 알파 및 베타 사슬은 각각 8 및 3 개의 SCR (짧은 공통 반복) 도메인을 함유하며, 이러한 모티프는 많은 보체-조절 단백질에서 발견되고 베타 시트로 조직화된 50-70 개의 아미노산으로 구성된다. 인간 C4BP 의 베타 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3 으로서 제시된다.

또한, 이러한 폴리펩티드 서열에 상응하는 핵산 서열은 Hillarp and Dahlback (1990, PNAS, vol 87, pp 1183-1187) 에 의해 기술되었다.

C4BP 단백질의 중합에서 알파 사슬의 역할은 Kask et al (Biochemistry 2002, 41, 9349-9357) 에 의해 연구되었다. 이들 저자는 알파 사슬의 C-말단 부분, 특히 그의 나선 구조 및 2 개의 시스테인의 존재가 알파 사슬이 이종 시스템에서 발현될 때 C4BP 단백질의 중합을 위해 필요하다는 것을 보여주었다.

유럽 특허 출원 2 227 030 은 관심있는 폴리펩티드와 융합하여 C4BP 단백질의 알파 및 베타 사슬의 C-말단 단편을 사용함으로써 이종다량체 재조합 단백질의 생산을 기술한다.

미국 특허 7,884,190 은 이량체 단백질의 생산을 위한 C4BP 단백질의 알파 사슬과 관련된 그의 사용과는 독립적으로, C4BP 단백질의 베타 사슬의 사용을 기술한다.

본 발명을 수행하는데 사용되는 C4BP 단백질은 유리하게는 인간 C4BP 단백질이다.

바람직한 구현예에서, IL2 모이어티는 적어도 아미노산 194 내지 252 (SEQ ID NO: 4) 를 포함하거나 이로 구성된 C4BPβ 사슬의 단편에 융합된다.

베타 사슬의 더 긴 단편, 또는 심지어 전체 베타 사슬을 코딩하는 서열이 또한 사용될 수 있다. 특정 적용에 있어서, 응고에 참여하는 S 단백질에 결합할 수 있는 베타 사슬을 코딩하는 서열을 사용하는 것을 피하는 것이 바람직하다. 선택된 서열이 베타 사슬의 2 개의 제 1 SCR 모티프를 함유하는 단편을 코딩하는 경우, 이들은 바람직하게는 S 단백질과의 상호작용의 가능성으로 절단하기 위해 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의해 돌연변이된 버전에 의할 것이다. SCR 모티프 및/또는 [GS] 도메인은 수득된 융합 폴리펩티드의 유연성을 변형, 예를 들어 증가시키는 목적으로 또는 키메라 단백질이 다량체, 특히 이량체를 형성하기 위해 적합한 입체형태를 채택하게 하기 위해 첨가될 수 있다.

N-말단에서 최대 아미노산 135 까지 연장되는 C4BPβ 의 더 긴 단편이 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, C4BPβ 사슬의 단편은 적어도 아미노산 185 내지 252, 180 내지 252, 175 내지 252, 170 내지 252, 165 내지 252, 160 내지 252, 155 내지 252, 150 내지 252, 145 내지 252, 140 내지 252, 또는 135 내지 252 (SEQ ID NO:3 에 대해) 를 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.

특정 구현예에서, C4BPβ 사슬의 단편은 적어도 아미노산 137 내지 252 (SEQ ID NO: 5) 를 포함하거나 이로 구성된다.

C4BPβ 의 기능적 변이체가 사용될 수 있다. 기능적 변이체는 적어도 하나의 이량체, 예를 들어 동종이량체 또는 이종이량체, 삼량체, 사량체 또는 상이한 수의 키메라 단백질을 함유하는 임의의 다량체를 형성하는 능력을 유지하였다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "C4BPβ 사슬의 단편의 기능적 변이체" 는 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가에 의해 베타 사슬의 단편의 서열에 대해 변형된 폴리펩티드 서열을 의미하며, 상기 변형된 서열은 그러나 본 발명의 방법을 사용하여 적어도 이량체 단백질을 형성하는 능력을 보유한다. 더욱 정확하게는, 단편의 기능적 변이체를 코딩하는 서열을 사용하는 이량체 단백질의 생산은 동일한 발현 시스템에서 단편 (SEQ ID NO: 3, 또는 그의 단편) 을 코딩하는 천연 서열로 수득된 것과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일할 수 있다. 바람직하게는, 변이체는 그것이 함유하는 융합 폴리펩티드의 80% 초과가 본 발명에 따른 진핵생물 발현 시스템에서 이량체의 형태로 생산되도록 하는 것이다.

특정 구현예에서, 베타 사슬의 단편의 변이체는 Hillarp and Dahlback (1990, PNAS, Vol. 87, pp 1183-1187) 에 의해 기술된 바와 같이, 엄격한 조건하에서 단편을 코딩하는 야생형 서열과 혼성화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩된다.

용어 "엄격한 조건" 이란 2 개의 단일 가닥 DNA 서열을 약 65℃ 에서, 예를 들어, 6*SSC, 0.5% SDS, 5* Denhardt's 용액 및 100 ㎍ 의 비특이적 DNA 의 용액 또는 동등한 이온 강도를 갖는 임의의 다른 용액에서, 그리고 65℃ 에서 세척한 후, 예를 들어, 최대 0.2*SSC 및 0.1% SDS 의 용액 또는 동등한 이온 강도를 갖는 임의의 다른 용액에서 특이적으로 혼성화할 수 있는 조건을 의미한다.

바람직하게는, 상기 야생형 단편의 기능적 변이체를 코딩하고 엄격한 조건 하에서 상기 단편을 코딩하는 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열은 혼성화하는 부분에서 단편을 코딩하는 서열의 길이의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 80% 의 길이를 갖는다. 특정 구현에서, 상기 단편의 기능적 변이체를 코딩하고 엄격한 조건 하에서 상기 단편을 코딩하는 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열은 혼성화하는 부분에서 상기 단편을 코딩하는 서열과 실질적으로 동일한 길이를 갖는다.

추가의 구현에서, 기능적 변이체는 야생형 단편의 변형된 서열이며, 이의 하나 이상의 아미노산은 이량체화 기능에 필수적이지 않고, 제거되거나 치환되었고 및/또는 이량체화에 필수적인 하나 이상의 아미노산은 동등한 작용기 (보존적 치환) 를 갖는 아미노산으로 대체되었다. 위치 201 및 215 에 위치한, 2 개의 시스테인, 및 이들 시스테인 주위의 펩티드 구조는 이량체화에 필요한 디술피드 가교의 형성을 허용하기 위해, 예를 들어 각각의 시스테인의 업스트림 및 다운스트림의 적어도 3 개의 아미노산의 보존에 의해 보존되는 것이 특히 권장된다. 특히, 기능적 변이체는 또한 이량체화를 담당하는 시스테인 사이에 베타 사슬의 이종 서열, 및 특히 C4BP 의 알파 사슬의 도메인을 삽입함으로써, 또는 대조적으로, 이들 동일한 시스테인 사이에 존재하는 특정 아미노산으로 제거함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 특정 아미노산의 점 변형, 특히 이량체화 과정에서의 의미와 관련하여 중성 아미노산에 의한 이량체화를 담당하는 시스테인 (예를 들어, 아미노산 A, V, F, P, M, I, L 및 W) 의 치환, 및 동시에 시스테인 사이에 현수선내 (intracatenary) 및/또는 현수선간 (intercatenary) 디술피드 가교를 형성하는 능력을 보존하기 위해 시스테인에 의해 또다른 아미노산을 치환함으로써 기능적 변이체가 생성될 수 있다. 따라서, 이러한 변형은 다량체화 과정, 특히 이량체화에 관여하는 다양한 시스테인 사이의 거리의 변화를 초래한다.

바람직하게는, 194 내지 252 단편의 아미노산의 50% 미만, 바람직하게는 25% 미만 또는 심지어 10% 미만 (예를 들어, 5 개의 아미노산 이하) 또는 5% 미만 (예를 들어, 1 또는 2 개의 아미노산) 이 제거되거나 대체된다.

특정 구현예에서, 기능적 변이체는 다음을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다:

a) C4BPβ 의 단편 (바람직하게는 194-252 단편) 의 변형된 서열로서, 단편 (바람직하게는 194-252 단편) 의 아미노산의 25% 미만, 바람직하게는 10% 미만이 절단되거나 대체되고, 위치 202 및 216 (SEQ ID NO: 3 과 관련하여 넘버링됨) 에 위치하는 시스테인 뿐 아니라, 각각의 시스테인의 업스트림 및 다운스트림의 적어도 3 개의 아미노산이 보존된, C4BPβ 의 단편의 변형된 서열; 또는

b) C4BPβ 의 단편 (바람직하게는 194-252 단편) 의 변형된 서열로서, 이량체화를 담당하는 시스테인은 바람직하게는 알라닌, 발린, 페닐알라닌, 프롤린, 메티오닌, 이소류신, 류신 및 트립토판으로부터 선택된 아미노산으로 치환되고, 단편의 또다른 아미노산은 시스테인으로 치환된, C4BPβ 의 단편의 변형된 서열; 또는

c) 이량체화를 담당하는 시스테인 사이에서, 베타 사슬에 이종성인 서열의 삽입에 의해 변형된 C4BPβ 의 단편 (바람직하게는 194-252 단편) 의 서열; 또는

d) 이량체화를 담당하는 시스테인 사이에서 아미노산을 절단함으로써 변형된 C4BPβ 의 단편 (바람직하게는 194-252 단편) 의 서열.

키메라 구축물

바람직하게는, IL2 모이어티는 C4BPβ 또는 이의 상기 단편의 N-말단에 융합된다.

바람직한 구현예에서, 키메라 구축물은 하나의 IL2 모이어티가 C4BPβ 또는 이의 상기 단편의 N-말단에 융합되고, 또다른 IL2 모이어티가 C4BPβ 또는 이의 상기 단편의 C-말단에 융합되는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 구현예에 따르면, 융합 단백질은 N- 에서 C-말단으로, 다음 서열을 포함한다: IL2- C4BPβ- IL2.

IL2 모이어티 및 C4BPβ 또는 이의 상기 단편은 (직접) 프레임 내에 또는 아미노산 링커, 바람직하게는 polyG 링커를 통해 융합될 수 있다.

용어 "링커" 는 5 내지 80 개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 30 개, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 개의 아미노산을 포함하는 (폴리)펩티드를 의미한다. 적합한 링커는 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 링커는 GGGGS (SEQ ID NO: 8) 반복부를 포함하지만, 당업자는 일반적 권고 (Argos, 1990, J Mol Biol. 20;211(4):943-58; George R, Heringa J. An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding. Protein Eng. 2002;15:871-879) 에 따르는 다른 서열도 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 작은, 무극성 (예를 들어, Gly) 또는 극성 (예를 들어, Ser 또는 Thr) 아미노산으로 구성된 링커는 유연성을 제공하고, 연결 기능성 도메인의 이동성을 허용한다.

특정 구현예에서, 키메라 구축물은 SEQ ID NO:9 또는 SEQ ID NO:10 을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 이러한 키메라 구축물은 바람직하게는 동종이량체를 형성하거나, 또는 하기에 기술되는 바와 같이 이종이량체를 생성하는데 사용될 수 있다.

동종이량체 및 이종이량체 구축물

본원에는 다음을 포함하는 재조합 이량체 단백질의 제조 방법이 기술된다:

a) 숙주 세포를 i) 적어도 하나의 인터류킨 2 (IL2) 모이어티 및 ii) 이량체 단백질을 형성할 수 있는 C4b-결합 단백질의 베타 사슬 (C4BPβ) 또는 이의 적어도 하나의 단편 또는 기능적 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드인 키메라 구축물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 벡터로 트랜스펙션시키는 단계;

b) 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 생체 내에서 2 개의 융합 폴리펩티드의 공유 연합을 발현하기에 적합한 조건 하에서 트랜스펙션된 세포를 배양하여 이량체 단백질을 형성하는 단계;

c) 형성된 이량체 단백질을 회수하고, 바람직하게는 정제하는 단계.

트랜스펙션된 세포는 바람직하게는 C4BP 단백질의 중합에 관여하는 C4BP 단백질의 알파 사슬의 C-말단 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 임의의 핵산을 함유하지 않는다.

특정 구현예에서, 본원에는 하기 단계를 포함하는, 이종이량체의 제조 방법이 기술된다:

a. 숙주 세포를 다음을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 하나 이상의 벡터로 트랜스펙션시키는 단계:

i. i) 적어도 하나의 인터류킨 2 (IL2) 모이어티 및 ii) 이량체 단백질을 형성할 수 있는 C4b-결합 단백질의 베타 사슬 (C4BPβ) 또는 이의 적어도 하나의 단편 또는 기능적 변이체를 포함하는 제 1 융합 폴리펩티드; 및

ii. i) 적어도 하나의 이종 폴리펩티드 및 ii) 이량체 단백질을 형성할 수 있는 C4b-결합 단백질의 베타 사슬 (C4BPβ) 또는 이의 적어도 하나의 단편 또는 기능적 변이체를 포함하고, 이종 폴리펩티드가 제 1 융합 폴리펩티드의 인터류킨 2 (모이어티) 와 상이한 것으로 정의되는 제 2 융합 폴리펩티드;

b. 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 서열들 및 생체 내에서 2 개의 융합 폴리펩티드의 연합을 발현하기에 적합한 조건 하에서 트랜스펙션된 세포를 배양하여 이종이량체 단백질을 형성하는 단계;

c. 형성된 이종이량체 단백질을 회수하고, 바람직하게는 정제하는 단계.

바람직하게는, 제 2 융합 폴리펩티드에서, C4BPβ 또는 상기 단편은 이종 폴리펩티드의 C-말단에 융합된다.

이종 폴리펩티드를 언급할 때, 용어 "상이한" 이란 제 1 융합 폴리펩티드의 인터류킨 2 (모이어티) 의 1 차 서열과 적어도 하나의 아미노산이 상이한 1 차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 대안적으로, 용어 "상이한" 은 또한, 예를 들어 아세틸화, 아미드화, 비오티닐화, 카르복실화, 히드록실화, 메틸화, 인산화 또는 황산화, 또는 지질 (이소프레닐화, 팔미토일화 및 미리스토일화), 글루시드 (글리코실화) 또는 폴리펩티드 (유비퀴틴화) 를 첨가함으로써, 동일한 1 차 서열을 갖지만 상이한 번역-후 변형을 갖는 이종 폴리펩티드를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 IL2 가 아니다.

특정 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 자가-항원, 이러한 자가-항원을 표적화하는 것들을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 및 수용체, 예를 들어, IL2R 의 알파 사슬, 또는 수용체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 구축물은 자가면역 및/또는 염증성 장애를 치료하는데 특히 유용하다. 이러한 구현예에서, 제 1 융합 폴리펩티드의 IL-2 모이어티는 바람직하게는 Treg 세포 증식, 생존, 활성화 및/또는 기능을 촉진하는 활성 변이체이다.

또다른 특정 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 종양 항원, 미생물 항원, 이러한 항원을 표적화하는 것들을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 또는 IL2R 의 알파 사슬, 또는 수용체 리간드를 포함하여, 수용체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 구축물은 암을 치료하는데 특히 유용하다. 이 경우, 제 1 융합 폴리펩티드의 IL-2 모이어티는 바람직하게는 Teff 세포 증식, 생존, 활성화 및/또는 기능을 촉진하는 활성 변이체이다.

이러한 이종이량체 단백질은 또한 본 발명의 일부이다.

특정 구현예에서, 숙주 세포는 2 개의 융합 폴리펩티드의 공동-발현을 허용하는데, 제 1 융합 폴리펩티드 A 는 i) 적어도 하나의 인터류킨 2 (IL2) 모이어티 및 ii) 이량체 단백질을 형성할 수 있는 C4b-결합 단백질의 베타 사슬 (C4BPβ) 또이의 적어도 하나의 단편 또는 기능적 변이체를 포함하고; 제 2 융합 폴리펩티드 B 는 i) 적어도 하나의 이종 폴리펩티드 및 ii) 이량체 단백질을 형성할 수 있는 C4b-결합 단백질의 베타 사슬 (C4BPβ) 또는 이의 적어도 하나의 단편 또는 기능적 변이체를 포함하며, 여기서 이종 폴리펩티드는 제 1 융합 폴리펩티드의 인터류킨 2 (모이어티) 와 상이한 것으로 정의된다. 이러한 특정 구현예에서, 2 개의 융합 폴리펩티드의 공동-발현은 또한 동종이량체 A-A 및 B-B 의 생산 및 이종이량체 A-B 의 생산을 허용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 이량체 또는 이종이량체 단백질의 합성을 가능하게 하며, 상기 정의된 제조 방법의 단계 a) 를 수행함으로써 수득가능한 재조합 진핵 세포를 제공한다. 숙주 세포에서의 생산에 대한 더 상세한 설명은 아래에 설명된다.

제조 방법

융합 단백질의 형태인 키메라 구축물, 및 동종이량체 또는 이종이량체는 적합한 발현 벡터에서 DNA 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다.

발현 벡터는 구축물이 도입된 숙주 세포의 기능으로서 선별된다. 바람직하게는, 발현 벡터는 진핵 세포에서 발현을 허용하는 벡터, 특히 염색체 벡터 또는 에피솜 벡터 또는 바이러스 유도체, 특히 플라스미드, 효모 염색체로부터 유도된, 또는 바이러스, 예컨대 배큘로바이러스, 파포바이러스 또는 SV40, 레트로바이러스 또는 이들의 조합으로부터 유도된 벡터, 특히 파지미드 및 코스미드로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 이는 곤충 세포를 감염시킬 수 있는, 배큘로바이러스의 발현을 허용하는 벡터이다.

필요한 경우, 융합 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 또한 바람직하게는 그의 5' 부분에 융합 폴리펩티드의 분비를 위한 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 통상적으로, 신호 펩티드의 서열은 소수성 아미노산 (Phe, Leu, Ile, Met 및 Val) 이 풍부한 15 내지 20 개 아미노산의 서열이다.

벡터는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 발현에 필요한 모든 서열을 포함한다. 특히, 이것은 구축물이 도입된 숙주 세포의 기능으로서 선별된, 적합한 프로모터를 포함한다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "숙주 세포" 란 세포에 대해 이종성이고, 트랜스펙션 방법에 의해 세포의 게놈에 도입된 핵산이 운반하는 유전자를 발현할 수 있는 세포를 말한다.

바람직하게는, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 진핵 숙주 세포는 특히 효모 세포, 예컨대 S 세레비지애, 사상 진균 세포, 예컨대 아스페르길루스 (Aspergillus) 종, 곤충 세포, 예컨대 드로소필라 (Drosophila) 의 S2 세포 또는 스포도프테라 (Spodoptera) 의 sf9, 포유동물 세포 및 식물 세포로부터 선택된다. 특히 언급될 수 있는 포유동물 세포는 포유동물 세포주, 예컨대 CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, HepG2 또는 L(TK-) 세포이다. 바람직한 구현에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포주, 바람직하게는 Sf9 곤충 세포로부터 선택된다. sf9 곤충 세포에서 재조합 이량체 단백질을 제조하는 방법은 미국 특허 7,884,190 에 기재되어 있다.

이종 핵산을 발현하는 세포의 생산을 위해 당업자에게 공지된 임의의 트랜스펙션 방법을 사용하여 방법의 단계 a) 를 수행할 수 있다. 트랜스펙션 방법은 예를 들어, Sambrook et al, 2001, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y 에 기술된다.

대안적으로, 키메라 구축물은 화학적 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 더 짧은 펩티드의 병렬 합성에 의해 생성될 수 있고, 더 짧은 펩티드는 후속적으로 조립되어 올바른 디술피드 가교를 갖는 단백질의 완전한 서열을 산출한다. IL-2 의 합성은 예를 들어 문헌 Asahina et al., Angewandte Chemie International Edition, 2015, Vol.54, Issue 28, 8226-8230 에 예시되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.

또다른 구현예에서, 키메라 단백질은 상기 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산을 대상에 투여한 후, 생체 내에서 발현될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 아데노-바이러스 연관 바이러스 (AAV) 와 같은 바이러스 벡터에 의해 운반된다.

제형 및 투여 경로

또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 구축물, 핵산, 벡터 또는 단백질을, 바람직하게는 (예를 들어, 용액, 현탁액, 또는 혼합물 중) 약학적으로 허용되는 비히클, 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

적합한 부형제는 임의의 등장성 용액, 식염수, 완충 용액, 서방성 제제 등을 포함한다. 액체, 동결건조, 또는 분무-건조된 조성물은 당업계에 공지되어 있고 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 바람직하게는, 약학 조성물은 적절한 안정화제, 완충제, 벌크제, 또는 조합을 포함한다.

약학 조성물은 또다른 활성 성분을 더 포함할 수 있고, 또는 임의의 다른 활성 성분과 조합하여 투여될 수 있다.

약학 조성물은 비경구, 예를 들어, 피내, 피하 또는 비내 경로를 포함하는 임의의 편리한 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 피하 경로가 바람직하다. 경구, 설하 또는 협측 투여도 포함된다.

피하 주사에 적합한 제형의 예는 국제 특허 출원 WO2017/068031 호에 기재되어 있다.

자가-면역 및/또는 염증성 장애의 치료

본원에 기재된 약학 조성물은 자가-면역 및/또는 염증성 장애, 예컨대 전신성 홍반성 루푸스, 제 I 형 당뇨병, HCV-관련 혈관염, 포도막염, 근염, 전신성 혈관염, 건선, 알레르기, 천식, 크론병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 아테롬성 동맥경화증, 자가면역 갑상선 질환, 자가염증성 질환, 알츠하이머병 및 근위축성 측삭 경화증을 비롯한 신경-변성 질환, 급성 및 만성 이식편-대-숙주 질환, 자발적 낙태 및 동종이식편 거부; 고형 기관 이식 거부, 혈관염, 염증성 장 질환 (IBD), 및 알레르기성 천식; 척추관절염 또는 강직성 척추염; 쇼그렌 증후군, 전신성 경화증, 탈모증, 또는 궤양성 대장염을 치료하기 위한 방법에 유용하다.

바람직한 구현예에서, 바람직하게는 본원에는 피하 경로에 의해 조성물을 주 1 회 또는 2 회, 또는 심지어 월 1 회 또는 2 회 투여하는 것을 포함하는, 자가-면역 및/또는 염증 장애의 치료 방법이 기술된다. 하나의 구현예에서, 30 MIU/일 미만, 바람직하게는 20 MIU/일 미만, 유리하게는 10 MIU/일 미만, 또는 1 MIU/일 내지 8 MIU/일의 투여량이 바람직하다. 또다른 특정 구현예에서, 1 내지 5 MIU/일, 바람직하게는 0.1 내지 3.5 MIU/일의 용량이 사용된다

일반적으로 말하면, Treg 의 수의 1.5, 2, 3, 4 또는 5 배 증가를 허용하는 투여량이 바람직하다. IL-2 의 양의 표준 측정은 국제 단위 (IU) 이며, 이는 기술적으로는 고정된 중량이 아니라, 세계 보건기구 (WHO) 에 의해 결정된 바와 같이, 특정 세포 증식 분석법에서 고정된 생물학적 효과를 생성하는 양이다. 그 이유는, i) 분자의 정확한 서열 및 그의 당화 프로파일에 따라 중량이 달라지며, ii) 분자의 중량이 아니라 활성이 중요하기 때문이다.

국제 단위의 원리는 정확하게 (야생형 또는 활성 변이체 서열을 포함하는, 그들의 공급원, 또는 그들의 서열에 관계없이) 임의의 IL-2 분자가 비교될 수 있는 표준을 제공하는 것이다.

실제로, WHO 는 보정된 IL-2 분자를 함유하는 앰플을 제공하고, 이의 효능에 의해 정의되는 IL-2 의 주어진 제제 (다시 상기 IL-2 의 공급원 또는 서열에 무관하게) 의 투여량을 결정하기 위한 기준으로서 작용한다. 예를 들어, IL-2 의 주어진 제제의 투여량을 측정하기 위해, 후보 IL-2 제제의 생물학적 활성을 IL-2 의존성 세포주, 예컨대 CTLL-2 를 사용하는 표준 세포 증식 분석법에서 측정하고, 표준의 생물학적 활성과 비교한다. 세포는 상이한 투여량의 표준물의 존재 하에 성장된다. IL-2 의 투여량-반응 효과가 확립되고, 여기서 IL-2 의 투여량은 X 축 상에 IU 로서 플롯팅되고, 증식의 측정 (pr) 은 Y 축 상에 있다. 미지의 활성을 갖는 임의의 IL-2 생성물의 활성을 측정하고자 하는 경우, 생성물을 사용하여 IL-2 의존성 세포를 성장시키고 증식을 측정한다. pr 값은 Y 축 상에 플롯팅되고 그 값에서 X 축에 평행한 선이 그려진다. 이 선과 투여량 응답 선의 교차점으로부터, Y 축에 평행한 선이 그어진다. X 축과의 교점은 IU 에서 후보 IL-2 생성물의 활성을 제공한다.

WHO 표준 앰플의 임의의 변화는 국제 단위 또는 임의의 IL-2 제제의 투여량의 결정에 영향을 미치지 않는다.

제 1 표준 (WHO 국제 표준 코드 86/504, 1987년) 은 Jurkat 세포로부터 유래된 정제된 글리코실화된 IL-2 를 함유하였고, 임의로 100 IU/앰플의 효능을 할당하였다. 제 1 국제 표준 (IS) 의 저장액이 바닥나자, WHO 는 이를 대체해야 했다. WHO 는 또다른 보정된 IL-2 앰플을 제공하였고, 이번에는 E. 콜라이를 사용하여 생산되었다. 제 2 표준 앰플은 앰플 당 210 IU 의 생물학적 활성을 함유하였다. 표준 앰플의 변경은 IU 가 변경된다는 의미는 아니다. 따라서, 시험 IL-2 제제의 투여량을 결정하는 것은 기준으로서, 제 1 표준 앰플 또는 제 2 표준 앰플, 또는 후속 표준 앰플을 사용하는지 여부에 따라 변하지 않을 것이다.

하나의 구현예에서, 예를 들어, 3 일마다 1 회 내지 3 개월마다 1 회 투여를 포함하는 만성 투여가 구현된다. 이러한 투여 순서는 필요한 경우 반복될 수 있다.

또다른 구현예에서, IL-2 는 3 일 내지 3 개월, 바람직하게는 1 주 내지 4 주 동안 지속될 수 있는 투여 중단 후에 반복될 수 있는 주기로, 1 내지 2 주 동안 격일로 제공된다.

또다른 구현예에서, 치료는 유도 코스로도 지정되는 제 1 코스, 및 유지 코스인 제 2 코스를 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 치료는 약학 조성물이 적어도 약 2 또는 3 회의 연속 일 동안, 바람직하게는 3 내지 7 일, 더욱 바람직하게는 4 내지 5 일의 연속 일 동안 하루에 한 번 투여되고, 바람직하게는 예를 들어 약 6 일 또는 약 1 내지 약 4 주 후에 유지 투여량이 후속되는 적어도 제 1 코스를 포함할 수 있다.

유지 투여량은 전형적으로 적어도 한 달, 바람직하게는 적어도 약 3 개월, 더욱 바람직하게는 적어도 약 6 개월 동안 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 유지 투여량은 약 3 개월 내지 약 12 개월, 바람직하게는 약 6 개월 내지 약 12 개월 사이에 투여된다.

바람직한 구현예에서, 유지 치료는 주 1 회 또는 주 2 회, 또는 1 주 또는 2 주마다, 또는 한 달에 1 회 약학 조성물의 투여로 구성된다.

바람직한 구현예에서, 유지 치료는 인터류킨-2 를 적어도 한 달, 바람직하게는 약 3 개월 내지 약 12 개월의 기간 동안 일주일에 한 번 또는 두 번, 매 1 또는 2 주마다, 또는 한 달에 한 번 투여하는 것으로 이루어진다.

바람직하게는, 유지 투여량은 제 1 코스 투여량과 실질적으로 동일하거나, 더 낮거나 더 높은 투여량일 수 있다.

암의 치료

본원에 기재된 약학 조성물은 암을 치료하는 방법에 유용하다. 일부 구현예에서, 대상은 국부 진행성 또는 전이성 암을 겪고 있다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다. 일부 구현예에서, 암은 결장암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 유방암, 신장암, 식도암, 또는 전립선암이다.

하나의 구현예에서, 30 MIU/일 미만, 바람직하게는 20 MIU/일 미만, 유리하게는 10 MIU/일 미만, 또는 3 MIU/일 내지 5 MIU/일의 투여량이 바람직하다.

다른 구현예에서, 400,000-750,000 IU/kg 또는 550,000-750,000 IU/kg, 바람직하게는 600,000-700,000 IU/kg, IL2 가 투여된다. 투여량은 PROLEUKIN® 에 대해 처방된 것과 유사할 수 있지만, 이보다 적을 것으로 예상된다.

조성물은 하루에 한 번 이상 내지 일주일에 한 번 이상 1 회; 격일로 1 회를 포함하여, 투여될 수 있다. 당업자는 질환의 중증도, 기존 치료, 대상의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 기타 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는 특정 인자들이 대상을 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 대상의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 일련의 치료를 포함할 수 있다.

자가-면역 및/또는 염증성 장애와 관련하여 상기 기재된 프로토콜의 예는 암을 치료하는데 사용하기 위해 동일하거나 유사하게 적용될 수 있다. 대안적으로, 또다른 예에서, 조성물은 5 일 동안 8 시간마다 투여되고, 이어서 2 내지 14 일, 예를 들어 9 일의 휴지기에 이어, 8 시간마다 추가의 5 일의 투여가 뒤따를 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 4 일마다 3 회 투여량이 투여된다.

실시예 및 도면은 본 발명을 그 범주를 제한하지 않으면서 예시한다.

실시예:

실시예 1: IL-2/C4BP 융합 단백질의 생산 및 특성화

렌티바이러스 벡터를 IL-2 융합 단백질의 생산에 사용하였다. 요약하면, 인간 IL-2 (Hi2, SEQ ID NO:1), C4BPβ 의 C-말단 영역에 융합된 인간 IL-2 (Hi2cb, SEQ ID NO:6) 또는 돌연변이된 IL-2 를 갖는 동일한 분자 (N88R 변이체; Hi2mcb SEQ ID NO: 7) 를 비장 초점-형성 바이러스 (SFFV) 프로모터 하에 렌티바이러스 플라스미드에 통합시켰다. HEK 293T 세포를 폴리에틸렌이민 (PEI) 을 이용하여 렌티바이러스 플라스미드로 70% 컨플루언스로 트랜스펙션시키고, 무혈청 배지에서 48 시간 동안 배양하였다. 이어서, 상청액을 여과하고, 초원심분리에 의해 농축시키고, -80℃ 에서 보존하기 전에 적절한 완충액에 재현탁시켰다. 안정한 트랜스펙션된 세포를 얻기 위해, HEK 293T 세포를 상이한 감염 다중도 (MOI) 에서 렌티바이러스로 감염시키고, 선별 마커로서 생성된 녹색-형광 단백질 (Green-fluorescent protein: GFP) 을 사용하여 유세포 분석으로 형질도입 효율을 평가하였다. 적어도 50% 의 형질도입 효율 및 생존율 80% 를 갖는 세포를 GFP+ 세포의 세포 분류 전에 일주일 동안 완전 배지로 배양하여 IL-2 융합 단백질을 생산하는 세포의 거의 100% 를 보장하였다.

구축물의 기능적 설계의 시험관 내 평가 (웨스턴 블롯, 인간 전혈 STAT5 인산화) 를 수행하기 위해, 안정한 세포주를 무혈청 배지에서 48 시간 동안 배양하고, 상청액을 수확하고, 여과하고, 농축시키고, 이용 전에 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV) 는 HEK 293T 세포에서 동일한 관심 트랜스유전자 및 보조 플라스미드가 있는 AAV2/8 벡터 (혈청형 8 AAV 로부터의 캡시드에 패키징된 혈청형 2 의 게놈을 함유하는 바이러스) 의 트랜스펙션에 의해 생산되었다. AAV 벡터를 배양 상청액으로부터 추출하고, 이를 원심분리에 의해 정화하고, 바이러스를 염화세슘 구배 상에서 정제하고 투석하였다.

이어서, Hi2cb 및 Hi2mcb 를 1 차 항-인간 IL-2 항체 또는 1 차 항-인간 C4bpβ 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 특성화하였다. 환원된 조건 하에서, Hi2cb 및 Hi2mcb 는 단량체에 상응하는 대략 23 kDa 의 분자량에서 검출된다. 정상 조건 하에서, 2 개의 밴드를 대략 46 kDa 의 분자량의 주 신호로 검출하였으며, 이는 이량체에 해당한다. 제 2 약한 신호는 대략 23 kDa 의 단량체에 해당한다.

실시예 2: 인간 전혈 pSTAT5 반응에서 융합 단백질의 Treg 선택성

면역표현형. 건강한 성인으로부터의 인간 전혈을 사전 동의 하에 수집하였다. 인간 CD4+ 조절 T 세포 (Treg; CD4+Foxp3+CD127lo/-), CD4+ 통상의 T 세포 (Tconv; CD4+Foxp3-), 및 CD8+ T 세포에서 유세포 분석법을 사용하여 STAT5 인산화 (pSTAT5) 에 대한 Hi2, Hi2cb, 또는 Hi2mcb 의 효과를 평가하였다. pSTAT5 염색 전에 37℃ 에서 15 분 동안 Hi2, Hi2cb 및 Hi2mcb 의 10 배 희석물을 전혈 100 ㎕ 와 혼합하였다.

도 1 은 상이한 관심 집단에 대한 pSTAT5 유도의 투여량-반응을 나타낸다.

Hi2 는 Treg, Tconv 및 CD8 T 세포에서 STAT5 의 인산화를 유도할 수 있다. IL-2-C4bpβ 단백질 둘 다는 또한 Treg 상에서 STAT5 인산화를 유도할 수 있는 반면, Tconv 및 CD8 T 세포 상에서는 불가능하며, 이는 융합 단백질이 더 큰 치료 윈도우에서 Treg 를 선택적으로 표적화하는 능력을 보여준다.

실시예 3: T 세포 및 사구체 여과에 대한 IL-2-C4bpβ-코딩 AAV 의 생체 내 평가

마우스. 6 내지 8 주령 C57BL/6 (Jrj) 암컷 마우스에 Hi2, Hi2cb 또는 Hi2mcb 를 코딩하는 AAV 의 10¹¹ 바이러스 게놈 (vg) 을 복강내 경로로 주사하였다.

면역표현형. 혈액 샘플을 혈전 형성을 피하기 위해 헤파린 튜브에서 일주일에 한 번 수집하였다. 용혈 후, 면역 세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 Treg (CD4+CD25+Foxp3+), Teff (CD4+CD25+Foxp3-), CD8+ Treg (CD8+CD25+Foxp3+) 및 CD8+ Teff (CD8+CD25+Foxp3-) 의 백분율을 측정하였다.

투여량. 인간 IL-2 비코팅된 ELISA 키트 (ThermoFisher) 를 사용하여 IL-2 를 투여하기 위해 상이한 시점에서 혈액 및 소변을 수집하였다.

도 2 는 대조군과 비교한, 4 개의 상이한 T 세포 구획의 배수 증가의 동역학 곡선을 보여준다. 조절 T 세포에 관하여, 3 개의 단백질은 Treg (도 2A) 및 CD8+ Treg (도 2C) 의 크고 필적하는 증가를 유도하며, 융합 단백질에 있어서 훨씬 더 적은 증가와 함께, Hi2 에 비해 더 높은 평탄도를 갖는다. Hi2 는 1 주 후 Teff (3-배, 도 2B) 및 CD8+ Teff (10-배, 도 2D) 의 증가 및 NK 세포의 증대 (2-배, 도 2E) 의 큰 피크를 유도하는 반면, Hi2cb 는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두에 대해 약 1.5 배의 약간의 증가 및 NK 세포의 증대의 완전한 제어로 이를 방지하는 것으로 보인다. 융합 단백질의 돌연변이된 형태인 Hi2mcb 는 일시적인 증가에도 불구하고 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에서 효과기 구획의 완전한 제어, 뿐만 아니라 NK 세포의 제어를 입증하며, 이는 Treg 선택성에 유리한 이러한 돌연변이의 능력을 나타낸다.

도 3 은 시간에 따른 혈장 (A) 및 소변 (B) 인간 IL-2 의 동역학을 나타낸다. 혈장 및 소변 모두에서 Hi2 와 IL-2-C4bpβ 융합 단백질 동역학 사이의 중요한 차이가 관찰된다. Hi2 는 1 주 후 약 20 pg/mL 의 평탄도를 유지하며 피크를 나타낸다 (도 3A). 비교하자면, 융합 단백질은 2 주째에 매우 높은 후기 피크를 가지며 약 300 pg/mL 의 평탄도를 지속한다. 소변에서, 인간 IL-2 는 hIL-2 코딩-AAV 후에만 검출되는 반면, IL-2-C4bpβ-코딩 AAV 투여 후 소변에서는 인간 IL-2 가 검출되지 않는다. 이들 결과는 이들 융합 단백질이 신장에 의해 여과되지 않는 능력을 강조하며, 이는 혈장 내에서 이들 IL-2-C4bpβ 융합 단백질의 반감기 증가를 시사한다.

실시예 4: AAV 의 고용량 투여 후 Hi2, Hi2cb 또는 Hi2mcb 의 독성

마우스. 6 내지 8 주령 C57BL/6 (Jrj) 암컷 마우스에 Hi2, Hi2cb 또는 Hi2mcb 를 코딩하는 AAV 의 10¹² vg 을 복강내 경로로 주사하였다.

도 4A-4E 는 대조군과 비교한, 4 개의 상이한 T 세포 구획의 배수 증가의 동역학 곡선을 보여준다. 효과기 및 조절 T 세포에 대한 3 개의 구조의 효과는 더 저용량으로의 것과 상당히 유사하다. 간략하게, Hi2mcb 는 CD4+ 및 CD8+ Treg 둘 다를 증가시키는 한편, 효과기 수준 및 NK 세포 둘 다에서의 증가를 완벽하게 제어한다. 이러한 조절 T 세포 선택성은 양호한 안전성 프로파일에 대한 이유일 가능성이 매우 높다.

Hi2cb-코딩 AAV 후의 동역학은 CD4+ (피크에서 3 배 증가, 도 4B) 및 CD8+ (피크에서 9 배 증가, 도 4D) 효과기 구획에서의 증가를 단지 부분적으로 제어하는 능력을 입증한다. 그러나, 두 Treg 구획은 2 주 후에 증가되어, Treg 에 대해서는 거의 4 배 증가하였고 (도 4A), CD8+ Treg 에 대해서는 7 배 증가하였다 (도 4C). 마지막으로, Hi2 로 처리된 마우스의 그룹에서, 이들 모두는 1 주 내에 사망하였지만, 큰 CD4+ 및 CD8+ Treg 증가 (도 4A,C), 및 Teff (25 배 증가, 도 4B), CD8+ Teff (62 배 증가, 도 4D) 및 NK 세포 (3 배 증가, 도 4E) 의 극적인 확장이 있었고 이것은 아마도 면역 항상성에 심각한 불균형을 야기하여 급속한 사망을 야기한 것 같다.

도 5 는 AAV 의 고용량 투여 후 마우스의 Kaplan-Meier 곡선을 나타낸다. 3 개 단백질의 고용량의 독성 평가는 고전적인 Hi2 와 비교하여 IL-2-C4bpβ 융합 단백질에 대해 매우 양호한 안전성 프로파일을 입증한다 (도 5). 실제로, Hi2 를 주사한 모든 마우스는 7 일 이내에 죽었다. 3 마리 중 2 마리가 오직 17 일에 죽었기 때문에, Hi2cb 로의 사망률의 지연이 관찰되었다. 마지막으로, Hi2mcb 로 처리된 모든 마우스는 융합 단백질의 완전한 안전성을 강조하는 실험 시작 후 20 주 후에도 여전히 살아 있다.

실시예 5: 실험적 자가면역 뇌척수염 모델에서 융합 단백질의 치료 효능

마우스. 6 내지 8 주령 C57BL/6 (Jrj) 암컷 마우스를 실험적 자가면역 뇌척수염 모델 (EAE) 유도 7 일 전에 Hi2, Hi2cb 또는 Hi2mcb 를 코딩하는 AAV 의 10¹¹ vg 로 복강내 경로에 의해 주사하여 질환의 개시시 Treg 확장을 보장하였다. 모든 IL-2 기반 분자로의 예방 치료는 임상 발병을 지연시킨다 (도 6A). 그러나, 질환 발병 3 내지 5 일 후, 표준 IL2 로 치료된 마우스 (검은 점) 는 대조군 마우스 (투명한 점, 도 6C) 와 비교할 때 임상 증상의 유사한 동역학을 나타내었다. 이러한 결과는, 중요한 체중 감소 (도 6B) 및 임상 증상을 발병하는 마우스 100% (도 6A) 와 함께, 모든 분석된 파라미터에서 확인되고 관찰된다. 반대로, 융합 단백질 둘 다로 처리된 마우스는 발병의 지연이 동일하지만 임상적 증상 중증도 (각각 검은 사각형 및 삼각형) 의 조절, 체중 감소의 총 조절 (도 6B) 뿐만 아니라 임상적 증상이 없는 마우스를 의미하는 완전한 질환 예방 40% 를 나타내었다 (도 6A).

실시예 6: 융합 단백질의 생산 및 평가

6.1. 융합 단백질의 생산

정제된 융합 단백질은 안정한 세포주 생산으로부터 수득되었다. 구체적으로, HEK 293T 세포를 배양하고, 상청액을 수집하고, AKTA™ 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. ELISA 및 웨스턴 블롯을 수행하여 양성 분획을 수집하였다. 마지막으로, 수집된 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 통과시켰다.

6.2. 면역표현형분석.

마우스. 6 내지 8 주령 C57BL/6 (Jrj) 암컷 마우스를 5 일 동안 매일 Hi2, Hi2cb 또는 Hi2mcb (25 000 UI) 로 피하 경로에 의해 주사하였다.

면역표현형. 혈액 샘플을 혈전 형성을 피하기 위해 헤파린 튜브에서, 주사 하루 전날 한 번 수집하였다. 용혈 후, 면역세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 Treg 의 백분율 (CD4+CD25+Foxp3+) 및 Treg 에 대한 CD25 평균 형광 강도를 측정하였다.

도 7A 는 5 일 동안 매일 25 000 국제 단위의 단백질의 1 회 주사에 기초한 실험 투여 스케줄을 나타낸다. 면역표현형분석을 주사 직전 5 일 동안 매일 수행하였다.

도 7B-7C 는 대조군과 비교한, T 세포 구획 및 NK 세포의 배수 증가의 동역학 곡선을 보여준다. 조절 T 세포 확장은 1.6 배 증가로 Treg 상의 CD25 MFI 뿐만 아니라 Hi2 와 융합 단백질 사이에 상당히 유사하다.

6.3. 투여량

인간 IL-2 비코팅된 ELISA 키트 (ThermoFisher) 를 사용하여 IL-2 를 투여하기 위해 상이한 시점에서 혈액 및 소변을 수집하였다.

6 내지 8 주령 C57BL/6 (Jrj) 암컷 마우스는 피하 경로에 의해 Hi2, Hi2cb, 또는 Hi2mcb 상청액 단백질의 단일 투여를 받고, hIL-2 의 혈장 농도를 상이한 시점에서 결정하였다. Hi2 와 융합 단백질 사이의 주요 약동학 차이가 관찰된다 (도 8). 실제로, 융합 단백질은 Hi2 에 비해 감소된 제거와 함께 혈장 구획에서 더 오래 머무를 수 있다. 이들 결과는 이들 융합 단백질이 감소된 소거 제거와 함께 증가된 반감기를 갖는다는 사실을 강조한다.

<110> ILTOO PHARMA et al <120> interleukin 2 chimeric constructs <130> B3164EP <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 3 <211> 252 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Phe Phe Trp Cys Ala Cys Cys Leu Met Val Ala Trp Arg Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser Asp Ala Glu His Cys Pro Glu Leu Pro Pro Val Asp Asn Ser 20 25 30 Ile Phe Val Ala Lys Glu Val Glu Gly Gln Ile Leu Gly Thr Tyr Val 35 40 45 Cys Ile Lys Gly Tyr His Leu Val Gly Lys Lys Thr Leu Phe Cys Asn 50 55 60 Ala Ser Lys Glu Trp Asp Asn Thr Thr Thr Glu Cys Arg Leu Gly His 65 70 75 80 Cys Pro Asp Pro Val Leu Val Asn Gly Glu Phe Ser Ser Ser Gly Pro 85 90 95 Val Asn Val Ser Asp Lys Ile Thr Phe Met Cys Asn Asp His Tyr Ile 100 105 110 Leu Lys Gly Ser Asn Arg Ser Gln Cys Leu Glu Asp His Thr Trp Ala 115 120 125 Pro Pro Phe Pro Ile Cys Lys Ser Arg Asp Cys Asp Pro Pro Gly Asn 130 135 140 Pro Val His Gly Tyr Phe Glu Gly Asn Asn Phe Thr Leu Gly Ser Thr 145 150 155 160 Ile Ser Tyr Tyr Cys Glu Asp Arg Tyr Tyr Leu Val Gly Val Gln Glu 165 170 175 Gln Gln Cys Val Asp Gly Glu Trp Ser Ser Ala Leu Pro Val Cys Lys 180 185 190 Leu Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu Cys Glu Lys Ala Leu Leu Ala 195 200 205 Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu Ala Met Glu Asn Phe Met Gln 210 215 220 Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met Glu Glu Leu Lys Tyr Ser Leu 225 230 235 240 Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala Lys Leu Leu 245 250 <210> 4 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu Cys Glu Lys Ala Leu Leu Ala Phe 1 5 10 15 Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu Ala Met Glu Asn Phe Met Gln Gln 20 25 30 Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met Glu Glu Leu Lys Tyr Ser Leu Glu 35 40 45 Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala Lys Leu Leu 50 55 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Asp Cys Asp Pro Pro Gly Asn Pro Val His Gly Tyr Phe Glu Gly 1 5 10 15 Asn Asn Phe Thr Leu Gly Ser Thr Ile Ser Tyr Tyr Cys Glu Asp Arg 20 25 30 Tyr Tyr Leu Val Gly Val Gln Glu Gln Gln Cys Val Asp Gly Glu Trp 35 40 45 Ser Ser Ala Leu Pro Val Cys Lys Leu Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro 50 55 60 Glu Cys Glu Lys Ala Leu Leu Ala Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys 65 70 75 80 Glu Ala Met Glu Asn Phe Met Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr 85 90 95 Met Glu Glu Leu Lys Tyr Ser Leu Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys 100 105 110 Ala Lys Leu Leu 115 <210> 6 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hi2cb fusion protein <400> 6 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu 165 170 175 Cys Glu Lys Ala Leu Leu Ala Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu 180 185 190 Ala Met Glu Asn Phe Met Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met 195 200 205 Glu Glu Leu Lys Tyr Ser Leu Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala 210 215 220 Lys Leu Leu 225 <210> 7 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hi2mcb fusion protein <400> 7 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu 165 170 175 Cys Glu Lys Ala Leu Leu Ala Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu 180 185 190 Ala Met Glu Asn Phe Met Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met 195 200 205 Glu Glu Leu Lys Tyr Ser Leu Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala 210 215 220 Lys Leu Leu 225 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker repeat <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 9 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hi2cb mature <400> 9 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu Cys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Leu Leu Ala Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu Ala Met Glu Asn 165 170 175 Phe Met Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met Glu Glu Leu Lys 180 185 190 Tyr Ser Leu Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala Lys Leu Leu 195 200 205 <210> 10 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hi2mcb mature <400> 10 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu Cys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Leu Leu Ala Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu Ala Met Glu Asn 165 170 175 Phe Met Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met Glu Glu Leu Lys 180 185 190 Tyr Ser Leu Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala Lys Leu Leu 195 200 205

Claims

i) 적어도 하나의 인터류킨 2 (IL2) 모이어티 및 ii) 이량체 단백질을 형성할 수 있는 C4b-결합 단백질의 베타 사슬 (C4BPβ) 또는 이의 적어도 하나의 단편 또는 기능적 변이체를 포함하는 키메라 구축물.
제 1 항에 있어서, C4BPβ 의 단편은 C4BPβ 의 아미노산 잔기 194 내지 252 또는 N-말단에서 최대 아미노산 135 까지 연장되는 C4BPβ 의 더 긴 단편을 포함하거나, 이로 이루어지는 키메라 구축물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기를 포함하는 C4BPβ 의 기능적 변이체를 포함하는 키메라 구축물:
a) C4BPβ 의 단편의 변형된 서열로서, 단편의 아미노산의 25% 미만, 바람직하게는 10% 미만이 절단되거나 대체되고, 위치 202 및 216 에 위치하는 시스테인 뿐 아니라, 각각의 시스테인의 업스트림 및 다운스트림의 적어도 3 개의 아미노산이 보존된, C4BPβ 의 단편의 변형된 서열; 또는
b) C4BPβ 의 단편의 변형된 서열로서, 이량체화를 담당하는 시스테인은 바람직하게는 알라닌, 발린, 페닐알라닌, 프롤린, 메티오닌, 이소류신, 류신 및 트립토판으로부터 선택된 아미노산으로 치환되고, 단편의 또다른 아미노산은 시스테인으로 치환된, C4BPβ 의 단편의 변형된 서열; 또는
c) 이량체화를 담당하는 시스테인 사이에서, 베타 사슬에 이종성인 서열의 삽입에 의해 변형된 C4BPβ 의 단편의 서열; 또는
d) 이량체화를 담당하는 시스테인 사이에서 아미노산을 절단함으로써 변형된 C4BPβ 의 단편의 서열.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2 모이어티는 인간 IL-2 또는 이의 상동 변이체이고, 여기서 변이체는 인간 야생형 IL-2 와 적어도 85% 아미노산 동일성을 갖고, 바람직하게는 변이체는 인간 야생형 IL-2 와 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 인간 IL-2 의 활성 유사체이고, 상기 IL-2 모이어티는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 위치 N88 에서의 치환, 더욱 바람직하게는 치환 N88R 을 포함하는 IL2 뮤테인인 키메라 구축물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, IL2 모이어티 및 C4BPβ 또는 이의 상기 단편이 프레임 내에 또는 아미노산 링커, 바람직하게는 polyG 링커를 통해 융합되는 키메라 구축물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, IL2 모이어티가 C4BPβ 또는 이의 상기 단편의 N-말단에 융합되고, 바람직하게는 키메라 단백질이 하나의 IL2 모이어티가 C4BPβ 또는 이의 상기 단편의 N-말단에 융합되고, 또다른 IL2 모이어티가 C4BPβ 또는 이의 상기 단편의 C-말단에 융합되는 융합 단백질인 키메라 구축물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 키메라 생성물로 각각 이루어진 2 개의 융합 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체 단백질.
하기 단계를 포함하는, 제 6 항에 정의된 재조합 이량체 단백질의 제조 방법:
a) 숙주 세포를 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 정의된 키메라 구축물인 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 벡터로 트랜스펙션시키는 단계;
b) 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 생체 내에서 2 개의 융합 폴리펩티드의 공유 연합을 발현하기에 적합한 조건 하에서 트랜스펙션된 세포를 배양하여 이량체 단백질을 형성하는 단계;
c) 형성된 이량체 단백질을 회수하는 단계.
2 개의 융합 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 단백질로서, 제 1 융합 폴리펩티드는 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 키메라 생성물로 이루어지고, 제 2 융합 폴리펩티드는 i) 적어도 하나의 이종 폴리펩티드, 및 ii) 이량체 단백질을 형성할 수 있는 C4b-결합 단백질의 베타 사슬 (C4BPβ) 또는 이의 적어도 하나의 단편 또는 기능적 변이체를 포함하고, 이종 폴리펩티드는 제 1 융합 폴리펩티드의 IL-2 모이어티와 상이하고, 바람직하게는 이종 폴리펩티드는 자가-항원 또는 종양 항원인 이종이량체 단백질.
하기 단계를 포함하는, 제 9 항에 정의된 재조합 이종이량체 단백질의 제조 방법:
a. 숙주 세포를 다음을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 하나 이상의 벡터로 트랜스펙션시키는 단계:
i. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 정의된 키메라 구축물인 제 1 융합 폴리펩티드; 및
ii. i) 적어도 하나의 이종 폴리펩티드, 및 ii) 이량체 단백질을 형성할 수 있는 C4b-결합 단백질의 베타 사슬 (C4BPβ) 또는 이의 적어도 하나의 단편 또는 기능적 변이체를 포함하고, 이종 폴리펩티드가 제 1 융합 폴리펩티드의 인터류킨 2 모이어티와 상이한 제 2 융합 폴리펩티드;
b. 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 서열들 및 생체 내에서 2 개의 융합 폴리펩티드의 연합을 발현하기에 적합한 조건 하에서 트랜스펙션된 세포를 배양하여 이종이량체 단백질을 형성하는 단계;
c. 형성된 이종이량체 단백질을 회수하는 단계.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 키메라 구축물을 인코딩하는 핵산.
제 11 항의 핵산을 포함하는 벡터.
제 11 항의 핵산 또는 제 12 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 7 항 또는 제 9 항에 있어서, 대상에서 염증성 및/또는 자가면역 장애를 치료하는데 사용하기 위한 동종이량체 단백질 또는 이종이량체 단백질.
제 7 항 또는 제 9 항에 있어서, 대상에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 동종이량체 단백질 또는 이종이량체 단백질.