CN115190885A

CN115190885A - 白细胞介素2嵌合构建体

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Publication number: CN115190885A
Application number: CN202080085838.9A
Authority: CN
Inventors: 大卫·克拉茨曼; 尼古拉斯·比里尔德; 托马斯·瓦兹奎兹; 热雷米·马里奥
Original assignee: Public Relief Agency Paris Hospital; Iltoo Pharma; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite
Current assignee: Public Relief Agency Paris Hospital; Iltoo Pharma; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2022-10-14
Also published as: WO2021116444A1; IL293628A; BR112022011414A2; AU2020401357A1; CA3159468A1; JP2023505590A; KR20220139293A; US20230036793A1; EP4073094A1; MX2022007203A; ZA202206740B

Abstract

本发明涉及一种嵌合构建体，其包含i)白细胞介素2(IL2)部分和ii)C4b结合蛋白β链(C4BPβ)或其至少一个能够形成二聚体蛋白的片段或功能变体。

Description

白细胞介素2嵌合构建体

本发明涉及具有改进的药代动力学和/或药效学的IL2构建体。

背景技术

白细胞介素-2(IL2或IL-2)是一种调节免疫系统的关键方面的细胞因子。IL2已被用于尝试增强癌症患者以及自身免疫性和/或炎性疾病患者的免疫反应。IL2是一种有效的T细胞生长因子，其促进抗原激活的T细胞的免疫反应(包括克隆扩增)，驱动CD4+T辅助(Th)l和Th2细胞的发育，最终分化CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，并对抗CD4+Thl7和T滤泡辅助(Tfh)细胞的发育。IL2还塑造了T细胞记忆回忆反应。

低剂量的IL2已被用于选择性地提高耐受性，以抑制与自身组织的自身免疫样攻击相关的不需要的免疫反应。迄今为止的经验是，这种疗法是安全的，没有迹象表明自身攻击性T细胞会重新激活，而几乎所有患者中的调节性T细胞(Treg)都增加，这伴随着临床改善。

然而，作为治疗剂的IL2可以得到改善，特别是关于其在体内的短半衰期。出于这些原因，需要具有改进的药代动力学和/或药效学的新的IL2生物制剂。

发明内容

本发明提供了一种嵌合构建体，其包含i)白细胞介素2(IL2)部分和ii)C4b结合蛋白β链(C4BPβ)或其至少一个能够形成二聚体蛋白的片段或功能变体。

这样的构建体，因此IL2部分，具有改进的半衰期。此外，本发明人出乎意料地表明，这样的嵌合构建体改进了Treg扩增的选择性。

在一个特定实施方式中，所述嵌合构建体是二聚体形式，其中单体通过C4BPβ的两个半胱氨酸之间的共价键缔合。下文更详细地描述了同源二聚体和异源二聚体。

在一个优选的实施方式中，所述C4BPβ片段包含以下或由以下组成：C4BPβ的氨基酸残基194至252，或在N端延伸到至多氨基酸135的更长的C4BPβ片段。

在一个优选的实施方式中，所述IL-2部分是人IL-2或其同源变体，其中所述变体与人野生型IL-2具有至少85％氨基酸同一性，优选地其中所述变体是与人野生型IL-2具有至少90％氨基酸同一性的人IL-2的活性类似物，其中所述IL-2部分优选是IL2突变蛋白，其在SEQ ID NO:2的N88位包含替换，更优选替换N88R。

附图说明

图1显示了Treg(A)、Tconv(B)和CD8 T细胞(C)中pSTAT5诱导的剂量反应。Hi2是人IL-2(SEQ ID NO:1)，Hi2cb是融合到C4BPβ(SEQ ID NO:6)的C端区域的人IL-2，Hi2mcb是融合到C4BPβ(SEQ ID NO:7)的C端区域的突变IL-2。

图2显示了在注射10¹¹个表达IL-2构建体的AAV病毒基因组后小鼠中四种不同T细胞区室和NK细胞的倍数增加的动力学曲线。

图3显示了在注射10¹¹个表达IL-2构建体的AAV病毒基因组后小鼠中血浆(A)和尿液(B)人IL-2随时间的动力学。

图4显示了在注射10¹²个表达IL-2构建体的AAV病毒基因组后小鼠中四种不同T细胞区室和NK细胞的倍数增加的动力学曲线。

图5显示了在注射10¹²个表达IL-2构建体的AAV病毒基因组后小鼠的存活Kaplan-Meier曲线。

图6显示了融合蛋白Hi2cb或Hi2mcb在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中与Hi2相比的治疗功效。

图7显示了基于在五天内每天一次注射25 000国际单位的Hi2、Hi2cb或Hi2mcb的实验施用方案。每天在注射前进行免疫表型分析以评定Treg动力学。

图8显示了单次皮下注射后每个构建体Hi2、Hi2cb或Hi2mcb随时间的药代动力学曲线。

具体实施方式

定义

待治疗的“对象”或“患者”可以是任何哺乳动物，优选人类。人类对象可以是儿童、成人或老人。

术语“治疗”是指疾病的任何改善。它包括减轻至少一种症状，或降低疾病的严重程度或发展。当疾病是炎性和/或自身免疫性病症时，所述术语更特定地包括降低急性发作(爆发)的风险、发生或严重程度。术语“治疗”涵盖降低疾病的进展。特别地，本发明涵盖预防或减缓疾病的进展。术语“治疗”还涵盖预防性治疗，其通过降低疾病的风险或延迟疾病的发作，尤其是在无症状但已被诊断为“处于风险中”的对象中。

“调节性T细胞”或“Treg”是具有免疫抑制活性的T淋巴细胞。天然Treg被表征为CD4+CD25+Foxp3+细胞。Treg在炎性疾病的控制中发挥着重要作用，尽管它们在此类疾病中的作用模式尚不清楚。事实上，在大多数炎性疾病中，Treg耗竭会加剧疾病，而Treg增添会降低疾病。大多数Treg是CD4+细胞，尽管也存在少数具有抑制活性的CD8+Foxp3+T淋巴细胞群体。

在本申请的上下文中，“效应T细胞”(或“Teff”)表示除Treg之外的常规T淋巴细胞(在文献中有时也称为Tconv)，其表达一种或多种T细胞受体(TCR)并执行效应子功能(例如，细胞毒性活性、细胞因子分泌等)。根据本发明的人Teff的主要群体包括CD4+T辅助淋巴细胞(例如Th0、Th1、Th2、Th9、Th17、Tfh)和CD4+或CD8+细胞毒性T淋巴细胞，并且它们可以对自身或非自身抗原具有特异性。Teff不包含Foxp3+调节性CD8+T细胞。

在本申请的上下文中，“T滤泡辅助细胞”(或“Tfh”)表示表达BcL6、CXCR5和PD1，为Foxp3-并提供B细胞辅助的T CD4+淋巴细胞。

在本申请的上下文中，“T滤泡调节细胞”(或“Tfr”)表示CD4+CXCR5+PD-1+Bcl6+Foxp3+CD25-T淋巴细胞。

序列表显示以下序列：

SEQ ID NO:1是野生型人IL2(253个氨基酸，包括信号肽)

SEQ ID NO:2是成熟的野生型人IL2(233个氨基酸，包括信号肽)

SEQ ID NO:3是C4BPβ链(1-252)

SEQ ID NO:4是C4BPβ链的片段194-252

SEQ ID NO:5是C4BPβ链的片段137-252

SEQ ID NO:6是Hi2cb的氨基酸序列(包括信号肽)

SEQ ID NO:7是氨基酸序列Hi2mcb(N88R)，包括信号肽

SEQ ID NO:8是GGGGS模式(接头)

SEQ ID NO:9是不具有信号肽的Hi2cb的氨基酸序列

SEQ ID NO:10是不具有信号肽的氨基酸序列Hi2mcb(N88R)

IL-2部分

如本文所用，白细胞介素-2(IL-2)涵盖哺乳动物野生型白细胞介素-2及其变体。优选地，IL-2是人IL-2或其变体。

IL-2的活性变体已在文献中公开。天然IL-2的变体可以是其片段、类似物和衍生物。“片段”意指仅包含多肽序列的一部分的多肽。“类似物”表示包含具有一个或多个氨基酸替换、插入或缺失的天然多肽序列的多肽。突变蛋白和假肽是类似物的具体实例。“衍生物”包括任何修饰的天然IL-2多肽或其片段或类似物，例如糖基化、磷酸化、与另一多肽或分子融合、聚合等，或通过化学或酶促修饰或加成来改善IL-2的性质(例如稳定性、特异性等)。活性变体的IL-2部分通常与参考IL-2多肽(例如成熟的野生型人IL-2)的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、85％、更优选至少90％或至少95％的氨基酸序列同一性。

如本文所用，“野生型IL-2”是指包含天然人IL-2的133个正常存在的氨基酸序列的IL-2(天然的或重组的)，所述天然人IL-2的氨基酸序列描述于Fujita等人,PNAS USA,80,7437-7441(1983)中。SEQ ID NO:2(133个氨基酸)是人IL-2序列减去由另外20个N端氨基酸组成的信号肽。SEQ ID NO:1(153个氨基酸)是包括所述信号肽的人IL-2序列。

如本文所用，“IL-2突变蛋白”是指已对人成熟白细胞介素-2蛋白进行特定氨基酸替换的多肽。除非另有说明，否则所有氨基酸编号均针对SEQ ID NO:2的人成熟白细胞介素-2蛋白进行。

在一些实施方式中，125位的半胱氨酸被替换为中性氨基酸如丝氨酸(C125S)、丙氨酸(C125A)、苏氨酸(C125T)或缬氨酸(C125V)。

例如，当活性变体在哺乳动物细胞如CHO或HEK细胞中表达时，O-糖基化位点的消除会产生更均一的产物。

在某些实施方式中，活性变体包含在对应于人IL-2的残基3的位置处消除IL-2的O-糖基化位点的额外氨基酸突变。在一个实施方式中，在对应于人IL-2的残基3的位置处消除IL-2的O-糖基化位点的所述额外氨基酸突变是氨基酸替换。示例性氨基酸替换包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K和T3P。在一个具体实施方式中，所述额外氨基酸突变是氨基酸替换T3A。

·选择性促进T-reg细胞增殖、存活、活化和/或功能的活性变体在治疗炎性和/或自身免疫性病症中特别有用。

“选择性地促进”是指活性变体促进T-reg细胞中的活性但促进非调节性T细胞中的活性的能力有限或缺乏。本文进一步描述了筛选选择性地促进T-reg细胞增殖、存活、活化和/或功能的活性变体的测定法。

确定变体IL-2多肽是否有活性的方法在本领域中是已有的。参见例如WO2016/014428。活性变体被定义为显示出刺激Treg的能力的变体，包括与野生型IL-2或阿地白介素(如下文所定义)相比，具有刺激Treg的改进能力或类似能力，或甚至降低能力的变体，其刺激Teff的程度不超过其刺激Treg的程度。测试候选分子是否刺激T细胞、特别是Treg或NK细胞的方法是众所周知的。可以测试变体刺激效应T细胞(例如CD8+T细胞)、CD4+Foxp3+Treg或NK细胞的能力。在一个优选的实施方式中，与野生型IL2或阿地白介素相比，活性变体显示出降低的刺激NK细胞的能力。如Yu等人,Diabetes 2015；64:2172–2183中所述，监测STAT5磷酸化是评定变体优先刺激Treg而非Teff的能力的简单方法。在一个特定实施方式中，当使用比其他免疫细胞(包括Teff)低至少10倍的Treg剂量达到给定水平的STAT5磷酸化时，变体特别有用。

所述活性变体诱导信号传导事件，所述信号传导事件优先诱导Treg细胞的存活、增殖、活化和/或功能。在某些实施方式中，所述IL-2变体保留了在Treg细胞中刺激STAT5磷酸化和/或IL-2R下游的一种或多种信号传导分子(例如p38、ERK、SYK和LCK)的磷酸化的能力。在其他实施方式中，所述IL-2变体保留了在Treg细胞中刺激对Treg细胞存活、增殖、活化和/或功能重要的基因或蛋白质如FOXP3、Bcl-2、CD25或IL-10的转录或蛋白质表达的能力。在其他实施方式中，所述IL-2变体展现出在CD25+T细胞的表面上刺激IL-2/IL-2R复合物内吞的能力降低。在其他实施方式中，所述IL-2变体表现出对PI3-激酶信号传导的刺激低效、减少或不存在，例如AKT和/或mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)的磷酸化低效、减少或不存在。在其他实施方式中，所述IL-2变体保留了野生型IL-2刺激Treg细胞中的STAT5磷酸化和/或IL-2R下游的一种或多种信号传导分子的磷酸化的能力，但仍表现出在FOXP3-CD4+或CD8+T细胞或NK细胞中IL-2R下游的STAT5、AKT和/或mTOR或其他信号传导分子的磷酸化的低效、降低或不存在。在其他实施方式中，所述IL-2变体低效或不能刺激FOXP3-CD4+或CD8+T细胞或NK细胞的存活、生长、活化和/或功能。

在所有情况下，这些变体都具有刺激诸如CTLL-2或HT-2的细胞系的能力，所述细胞系可以普遍用于确定其生物活性。

例如，IL-2的生物活性可以通过对生长依赖于IL-2的HT-2细胞系(克隆A5E，

CRL-1841^TM)进行的基于细胞的测定法来确定。将在一系列测试白细胞介素-2产品存在下的细胞生长与用IL-2国际标准品(WHO关于白细胞介素2的第2国际标准品(人类，rDNA来源的)，NIBSC代码：86/500)记录的生长进行比较。在添加[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓(内盐，MTS)并通过活性的活细胞转化为甲臜(formazan)后测量细胞生长。然后通过分光光度法在490nm处测量甲臜浓度。

IL-2变体的实例公开于例如EP109748、EP136489、US4,752,585；EP200280、EP118617、WO99/60128、EP2288372、US9,616,105、US9,580,486、WO2010/085495、WO2016/164937中。

例如，某些突变可能导致对IL-2受体(IL-2Rβ/CD122和/或IL-2Rγ/CD132)信号传导链的亲和力降低和/或从IL-2受体的一个或两个亚基诱导信号传导事件的能力降低。其他突变可能赋予对CD25(IL-2Rα)更高的亲和力。在两种情况下，这些突变定义了优先诱导Treg的存活、增殖、活化和/或功能的活性变体。这种特性可以使用表面等离子体共振来监测。

有用变体的特定实例包括IL-2突变蛋白，其显示在根据野生型IL-2编号的位置D20、N30、Y31、K35、V69、Q74、N88、V91或Q126处的至少一个氨基酸替换，意味着所选择的氨基酸是参照所述氨基酸在SEQ ID NO:2的野生型IL-2的成熟序列中正常出现的氨基酸的位置来鉴定的。

优选的IL-2突变蛋白包含在位置D20H、D20I、D20Y、N30S、Y31H、K35R、V69AP、Q74、N88R、N88D、N88G、N88I、V91K或Q126L处的至少一个替换。

在一些实施方式中，所述IL-2突变蛋白分子包含V91K替换。在一些实施方式中，所述IL-2突变蛋白分子包含N88D替换。在一些实施方式中，所述IL-2突变蛋白分子包含N88R替换。在一些实施方式中，所述IL-2突变蛋白分子包含H16E、D84K、V91N、N88D、V91K或V91R、其任何组合的替换。在一些实施方式中，这些IL-2突变蛋白分子还包含如本文所述的在位置125处的替换。在一些实施方式中，所述IL-2突变蛋白分子包含一个或多个选自以下的替换：T3N、T3A、L12G、L12K、L12Q、L12S、Q13G、E15A、E15G、E15S、H16A、H16D、H16G、H16K、H16M、H16N、H16R、H16S、H16T、H16V、H16Y、L19A、L19D、L19E、L19G、L19N、L19R、L19S、L19T、L19V、D20A、D20E、D20H、D20I、D20Y、D20F、D20G、D20T、D20W、M23R、R81A、R81G、R81 S、R81T、D84A、D84E、D84G、D84I、D84M、D84Q、D84R、D84S、D84T、S87R、N88A、N88D、N88E、N88I、N88F、N88G、N88M、N88R、N88S、N88V、N88W、V91D、V91E、V91G、V91S、I92K、I92R、E95G和Q126。在一些实施方式中，所述IL-2突变蛋白分子的氨基酸序列不同于具有C125A或C125S替换并且具有选自T3N、T3A、L12G、L12K、L12Q、L12S、Q13G、E15A、E15G、E15S、H16A、H16D、H16G、H16K、H16M、H16N、H16R、H16S、H16T、H16V、H16Y、L19A、L19D、L19E、L19G、L19N、L19R、L19S、L19T、L19V、D20A、D20E、D20F、D20G、D20T、D20W、M23R、R81A、R81G、R81 S、R81T、D84A、D84E、D84G、D84I、D84M、D84Q、D84R、D84S、D84T、S87R、N88A、N88D、N88E、N88F、N88I、N88G、N88M、N88R、N88S、N88V、N88W、V91D、V91E、V91G、V91S、I92K、I92R、E95G、Q126I、Q126L和Q126F的一个替换的成熟IL-2序列中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述IL-2突变蛋白分子不同于具有C125A或C125S替换并且具有选自D20H、D20I、D20Y、D20E、D20G、D20W、D84A、D84S、H16D、H16G、H16K、H16R、H16T、H16V、I92K、I92R、L12K、L19D、L19N、L19T、N88D、N88R、N88S、V91D、V91G、V91K和V91S的一个替换的成熟IL-2序列中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述IL-2突变蛋白包含N88R和/或D20H突变。

这些替换可以单独使用或相互组合使用。在一些实施方式中，所述突变蛋白包含这些替换中的每一个。在一些实施方式中，所述突变蛋白包含这些突变中的1、2、3、4、5、6、7或8个。

在一些实施方式中，所述IL-2突变蛋白包含N88R或N88D突变，优选N88R。在一些实施方式中，所述IL-2突变蛋白包含C125A或C125S突变。这些替换可以单独使用或相互组合使用。在一些实施方式中，所述突变蛋白包含这些突变中的1、2、3、4、5、6、7或8个。在一些实施方式中，所述突变蛋白包含这些替换中的每一个。

在一个特定实施方式中，所述IL-2部分是阿地白介素。阿地白介素是

的活性成分。阿地白介素是成熟人IL-2的变体，其与成熟人IL-2(SEQ ID NO:2)的序列相比包含两个氨基酸修饰：第一个氨基酸(丙氨酸)的缺失和125位的半胱氨酸被丝氨酸替换。

涵盖在IL-2的其他位置的保守修饰和替换(即对突变蛋白的二级或三级结构具有最小影响的那些)。这样的保守替换包括Dayhoff在蛋白质序列和结构图谱5(The Atlas ofProtein Sequence and Structure 5)(1978)中和Argos在EMBO J.,8:779-785(1989)中描述的那些。例如，属于以下组之一的氨基酸代表保守变化：-ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；-cys、ser、tyr、thr；-val、ile、leu、met、ala、phe；-lys、arg、his；-phe、tyr、trp、his；和-asp、glu。

具有破坏与IL-2R的α亚基结合的突变的变体不是优选的，因为这些突变体可能具有降低的刺激Treg的能力。

·促进Teff细胞增殖、存活、活化和/或功能的活性变体可用于治疗癌症。

IL-2的此类活性变体包含至少一个氨基酸突变，其消除或降低突变IL-2多肽对IL-2受体(CD25)的α-亚基的亲和力并保持突变IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力，每个都与野生型IL-2多肽相比较。该特性可以使用表面等离子体共振来监测。

优选的活性变体包括包含F42A、K43N、Y45A和/或E62A替换的IL-2突变蛋白。

例如对CD25的亲和力降低的人IL-2(hIL-2)的突变体的活性变体可以例如通过氨基酸位置35、38、42、43、45、62或72或其组合(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:2编号)的氨基酸替换产生。示例性氨基酸替换包括K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、E62G、E62A、E62S、E62T、E62Q、E62E、E62N、E62D、E62R、E62K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K。可用于本发明的嵌合构建体的特定活性变体包含在对应于人IL-2的残基42、45或72或其组合的氨基酸位置处的氨基酸突变。在一个实施方式中，所述氨基酸突变是选自F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K的氨基酸替换，更具体地是选自F42A、Y45A和L72G的氨基酸替换。与野生型形式的IL-2突变体相比，这些活性变体展现出与中等亲和力IL-2受体基本上相似的结合亲和力，并且对IL-2受体的α-亚基和高亲和力IL-2受体(IL2Rαβγ)具有显著降低的亲和力。

有用的活性变体的其他特征可以包括诱导携带IL-2受体的T和/或NK细胞增殖的能力，在携带IL-2受体的T和/或NK细胞中诱导IL-2信号传导的能力，由NK细胞产生干扰素(IFN)-y作为次级细胞因子的能力，降低外周血单核细胞(PBMC)诱导次级细胞因子(特别是IL-10和TNF-a)精制(elaboration)的能力，降低的激活调节性T细胞的能力，降低的诱导T细胞凋亡的能力，和降低的体内毒性概况。

特定的活性变体包含三个氨基酸突变，它们消除或降低了活性变体对IL-2受体的α-亚基的亲和力，但保持了活性变体对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在一个实施方式中，所述三个氨基酸突变位于对应于人IL-2的残基42、45和72的位置。在一个实施方式中，所述三个氨基酸突变是氨基酸替换。在一个实施方式中，所述三个氨基酸突变是选自F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K的氨基酸替换。在一个具体实施方式中，所述三个氨基酸突变是氨基酸替换F42A、Y45A和L72G(相对于SEQ ID NO:2的人IL-2序列编号)。

在某些实施方式中，所述氨基酸突变将突变IL-2多肽对IL-2受体的α-亚基的亲和力降低至少5倍，具体地至少10倍，更具体地至少25倍。在存在超过一种降低活性变体对IL-2受体的α-亚基的亲和力的氨基酸突变的实施方式中，这些氨基酸突变的组合可以将活性变体对IL-2受体的α-亚基的亲和力降低至少30倍、至少50倍、或甚至至少100倍。在一个实施方式中，所述氨基酸突变或氨基酸突变的组合消除了活性变体对IL-2受体的α-亚基的亲和力，从而通过表面等离子体共振检测不到结合。

当所述活性变体展现出大于约70％的野生型形式的IL-2突变体对中等亲和力IL-2受体的亲和力时，实现了与中等亲和力受体的基本上相似的结合，即保持了突变IL-2多肽对所述受体的亲和力。可用于本发明的活性变体可以展现出大于约80％并且甚至大于约90％的这种亲和力。

IL-2对IL-2受体的α-亚基的亲和力的降低与IL-2的O-糖基化的消除相结合，导致具有改进特性的IL-2蛋白。

在一个具体的实施方式中，所述活性变体可以引发一种或多种选自以下的细胞反应：活化的T淋巴细胞中的增殖、活化的T淋巴细胞中的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、活化的B细胞中的增殖、活化的B细胞中的分化、自然杀伤(NK)细胞中的增殖、NK细胞中的细胞毒性活性、NK细胞中的分化、活化的T细胞或NK细胞的细胞因子分泌，以及NK/淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK)抗肿瘤细胞毒性。

在一些实施方式中，这些活性变体还包含如本文所述的位置125处的替换。

C4BPβ或C4BPβ片段

C4BP蛋白参与凝血和补体系统。C4BP的主要形式由7条相同的75kDα链和1条45kDβ链组成。α链和β链分别含有8个和3个SCR(短共有重复)结构域，这些基序存在于许多补体调节蛋白中并且由组织成β折叠的50-70个氨基酸组成。人C4BP的β链的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。

Hillarp和Dahlback(1990,PNAS,第87卷,第1183-1187页)也描述了对应于该多肽序列的核酸序列。

Kask等人(Biochemistry 2002,41,9349-9357)已经研究了α链在C4BP蛋白聚合中的作用。这些作者已经表明，当α链在异源系统中表达时，α链的C端部分，特别是它的螺旋结构和两个半胱氨酸的存在，对于C4BP蛋白的聚合是必需的。

欧洲专利申请2 227 030描述了通过使用与目标多肽融合的C4BP蛋白的α链和β链的C端片段来生产异源多聚体重组蛋白。

美国专利7,884,190描述了C4BP蛋白β链的用途，和其与C4BP蛋白的α链结合用于生产二聚体蛋白的用途无关。

用于实施本发明的C4BP蛋白有利地是人C4BP蛋白。

在一个优选的实施方式中，所述IL2部分与C4BPβ链的片段融合，该片段包含以下或由以下组成：至少氨基酸194至252(SEQ ID NO:4)。

也可以使用编码β链的较长片段或甚至整个β链的序列。对于某些应用，优选避免使用编码能够结合参与凝血的S蛋白的β链的序列。如果选择的序列编码含有β链的前两个SCR基序的片段，则这些会优选是通过氨基酸的添加、缺失或替换而突变的版本，以切断与S蛋白相互作用的可能性。可以添加SCR基序和/或[GS]结构域，目的在于修饰(例如增加)获得的融合多肽的柔韧性或允许嵌合蛋白采用合适的构象以形成多聚体，特别是二聚体。

可以使用在N端延伸到至多氨基酸135的更长的C4BPβ片段。

在一个特定实施方式中，C4BPβ链的片段可以包含以下或由以下组成：至少氨基酸185至252、180至252、175至252、170至252、165至252、160至252、155至252、150至252、145至252、140至252、或135至252(相对于SEQ ID NO:3)。

在一个特定实施方式中，C4BPβ链的片段包含以下或由以下组成：至少氨基酸137至252(SEQ ID NO:5)。

可以使用C4BPβ的功能变体。所述功能变体保持形成至少一种二聚体(例如同源二聚体或异源二聚体)、三聚体、四聚体或含有不同数目嵌合蛋白的任何多聚体的能力。

在本发明的上下文中，术语“C4BPβ链的片段的功能变体”是指通过缺失、替换或添加一个或多个氨基酸而相对于β链片段序列修饰的多肽序列，然而，修饰的序列保留了使用本发明的方法形成至少二聚体蛋白的能力。更准确地说，使用编码所述片段的功能变体的序列产生的二聚体蛋白可以至少80％等于在相同的表达系统中使用编码所述片段的天然序列(SEQ ID NO:3或其片段)获得的二聚体蛋白，优选至少90％，更优选95％)。优选地，所述变体使得其包含的超过80％的融合多肽在根据本发明的真核表达系统中以二聚体的形式产生。

在一个特定实施方式中，所述β链片段的变体由能够在严格条件下与编码所述片段的野生型序列杂交的核酸编码，如Hillarp和Dahlback(1990,PNAS,第87卷,第1183-1187页)所述。

术语“严格条件”是指允许两条单链DNA序列在约65℃下特异性杂交的条件，例如，在6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt溶液和100μg非特异性DNA的溶液或任何其他具有同等离子强度的溶液中，并且在65℃洗涤后，例如在至多0.2×SSC和0.1％SDS的溶液或任何其他具有同等离子强度的溶液中。

优选地，编码所述野生型片段的功能变体并在严格条件下与编码所述片段的序列杂交的核苷酸序列在杂交的部分中具有编码所述片段的序列的长度的至少50％、优选至少80％的长度。在一个特定实现方式中，编码所述片段的功能变体并在严格条件下与编码所述片段的序列杂交的核苷酸序列在杂交的部分中具有与编码所述片段的序列基本上相同的长度。

在另一种实现方式中，功能变体是野生型片段的修饰序列，其中一个或多个对二聚化功能不是必需的氨基酸已被去除或替换和/或一个或多个对二聚化必需的氨基酸已被具有等效官能团的氨基酸替代(保守替换)。特别建议保留位于位置201和215的两个半胱氨酸以及这些半胱氨酸周围的肽结构，以允许形成二聚化所必需的二硫桥，例如通过保留在每个半胱氨酸上游和下游的至少3个氨基酸。特别地，功能变体也可以通过在负责二聚化的半胱氨酸之间插入C4BP的β链的异源序列并且特别是α链的结构域，或者相反，通过除去那些相同的半胱氨酸之间存在的某些氨基酸来获得。或者，功能变体可以通过某些氨基酸的点修饰，特别是用关于参与二聚化过程的中性氨基酸(例如氨基酸A、V、F、P、M、I、L和W)替换负责二聚化的半胱氨酸并同时用半胱氨酸替换另一个氨基酸以保留在半胱氨酸之间形成链内和/或链间二硫桥的能力来产生。因此，这些修饰导致多聚化过程、特别是二聚化中涉及的各种半胱氨酸之间的距离发生变化。

优选地，194至252片段的少于50％的氨基酸被去除或替代，优选地少于25％或甚至少于10％(例如5个氨基酸或更少)或少于5％(例如1个或2个氨基酸)。

在一个特定实施方式中，所述功能变体包括以下或由以下组成：

a)C4BPβ片段(优选194-252片段)的修饰序列，其中所述片段(优选194-252片段)的少于25％、优选少于10％的氨基酸被切除或替代，其中位于位置202和216(相对于SEQ IDNO:3编号)的半胱氨酸以及每个半胱氨酸的上游和下游的至少3个氨基酸被保留；或者

b)C4BPβ片段(优选194-252片段)的修饰序列，其中负责二聚化的半胱氨酸被优选选自丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和色氨酸的氨基酸替换，并且所述片段的另一个氨基酸被半胱氨酸替换；或者

c)通过在负责二聚化的半胱氨酸之间插入与β链异源的序列而修饰的C4BPβ片段(优选194-252片段)的序列；或者

d)通过切除负责二聚化的半胱氨酸之间的氨基酸而修饰的C4BPβ片段(优选194-252片段)的序列。

嵌合构建体

优选地，IL2部分在C4BPβ或其所述片段的N端融合。

在一个优选的实施方式中，所述嵌合构建体包含融合蛋白，其中一个IL2部分在C4BPβ或其所述片段的N端融合，而另一个IL2部分在C4BPβ或其所述片段的C端融合。根据这样的实施方式，所述融合蛋白从N端到C端包含以下序列：IL2-C4BPβ-IL2。

所述IL2部分和C4BPβ或其所述片段可以框内融合(直接地)或通过氨基酸接头、优选polyG接头融合。

术语“接头”是指包含5至80个氨基酸、优选5至30个、更优选10至20个氨基酸的(多)肽。合适的接头是本领域中已知的。在一些实施方式中，所述接头包含GGGGS(SEQ IDNO:8)重复，尽管本领域技术人员会认识到还可以使用遵循一般建议的其他序列(Argos,1990,J Mol Biol.20；211(4):943-58；George R,Heringa J.蛋白质结构域接头分析：它们在蛋白质折叠中的分类和作用(An analysis of protein domain linkers:theirclassification and role in protein folding).Protein Eng.2002；15:871-879)。由小的非极性(例如Gly)或极性(例如Ser或Thr)氨基酸组成的接头提供了灵活性，并允许连接功能结构域的移动性。

在一个特定实施方式中，所述嵌合构建体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。这样的嵌合构建体优选形成同源二聚体，或者可以用于产生异源二聚体，如下所述。

同源二聚体和异源二聚体构建体

本文描述了一种用于生产重组二聚体蛋白的方法，所述方法包括：

a)用允许表达编码嵌合构建体的核苷酸序列的载体转染宿主细胞，所述嵌合构建体是包含以下的融合多肽：i)至少一个白细胞介素2(IL2)部分和ii)C4b结合蛋白β链(C4BPβ)或其至少一个能够形成二聚体蛋白的片段或功能变体；

b)在适合表达编码融合多肽的核苷酸序列和两个融合多肽在体内共价缔合以形成二聚体蛋白的条件下培养转染的细胞；

c)回收并优选纯化所形成的二聚体蛋白。

所述转染的细胞优选不含任何允许表达编码参与C4BP蛋白聚合的C4BP蛋白α链的C端片段的核苷酸序列的核酸。

在一个特定实施方式中，本文描述了一种用于生产异源二聚体的方法，所述方法包括：

a.用一种或多种载体转染宿主细胞以允许表达一种或多种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码：

i.第一融合多肽，其包含i)至少一个白细胞介素2(IL2)部分和ii)C4b结合蛋白β链(C4BPβ)或其至少一个能够形成二聚体蛋白的片段或功能变体；和

ii.第二融合多肽，其包含i)至少一个异源多肽和ii)C4b结合蛋白β链(C4BPβ)或其至少一个能够形成二聚体蛋白的片段或功能变体，其中所述异源多肽被定义为不同于所述第一融合多肽的白细胞介素2(部分)；

b.在适合表达编码所述第一融合多肽和所述第二融合多肽的一个或多个核苷酸序列和两个融合多肽在体内缔合以形成异源二聚体蛋白的条件下培养转染的细胞；

c.回收并优选纯化所形成的异源二聚体蛋白。

优选地，在第二融合多肽中，C4BPβ或所述片段与异源多肽的C端融合。

术语“不同”当涉及异源多肽时是指具有与第一融合多肽的白细胞介素2(部分)的一级序列相差至少一个氨基酸的一级氨基酸序列的多肽。或者，术语“不同”还涵盖具有相同一级序列但具有不同翻译后修饰的异源多肽，例如在乙酰化、酰胺化、生物素化、羧化、羟基化、甲基化、磷酸化或硫酸化方面，或通过添加脂质(异戊二烯化、棕榈酰化和肉豆蔻酰化)、糖类(糖基化)或多肽(泛素化)。

在一个优选的实施方式中，所述异源多肽不是IL2。

在一个特定实施方式中，所述异源多肽可以选自自身抗原、抗体或抗体片段，包括靶向此类自身抗原的那些，以及受体，例如包括IL2R的α链，或受体配体。这样的构建体在治疗自身免疫性和/或炎性病症中特别有用。在这样的实施方式中，所述第一融合多肽的IL-2部分优选地是促进Treg细胞增殖、存活、活化和/或功能的活性变体。

在另一个特定实施方式中，所述异源多肽可以选自肿瘤抗原、微生物抗原、抗体或抗体片段，包括靶向此类抗原的那些，或受体，包括IL2R的α链，或受体配体。这样的构建体在治疗癌症中特别有用。在这种情况下，所述第一融合多肽的IL-2部分优选地是促进Teff细胞增殖、存活、活化和/或功能的活性变体。

这种异源二聚体蛋白也是本发明的一部分。

在一个特定实施方式中，所述宿主细胞允许共表达两种融合多肽，第一融合多肽A包含i)至少一个白细胞介素2(IL2)部分和ii)C4b结合蛋白β链(C4BPβ)或其至少一个能够形成二聚体蛋白的片段或功能变体；和第二融合多肽B，其包含i)至少一个异源多肽和ii)C4b结合蛋白β链(C4BPβ)或其至少一个能够形成二聚体蛋白的片段或功能变体，其中所述异源多肽被定义为不同于所述第一融合多肽的白细胞介素2(部分)。在该特定实施方式中，两种融合多肽的共表达还可以允许产生同源二聚体A-A和B-B以及产生异源二聚体A-B。

还提供了一种重组真核细胞，其允许合成如上定义的二聚体或异源二聚体蛋白，并且可通过进行上文定义的生产方法的步骤a)获得。下面描述了在宿主细胞中生产的更多细节。

生产方法

融合蛋白形式的嵌合构建体和同源或异源二聚体可以通过DNA重组技术在合适的表达载体中产生。

根据引入构建体的宿主细胞来选择表达载体。优选地，所述表达载体选自允许在真核细胞中表达的载体，尤其是来自染色体载体或附加体载体或病毒衍生物，特别是衍生自质粒、酵母染色体或衍生自病毒如杆状病毒、乳多空病毒(papovirus)或SV40、逆转录病毒或其组合、特别是噬菌粒和粘粒的载体。在一个特定实施方式中，它是一种允许表达能够感染昆虫细胞的杆状病毒的载体。

如果需要，编码融合多肽的序列还优选在其5'部分中包含编码用于分泌融合多肽的信号肽的序列。通常，信号肽的序列是15至20个氨基酸的序列，富含疏水氨基酸(Phe、Leu、Ile、Met和Val)。

所述载体包含表达编码融合多肽的序列所必需的所有序列。特别地，它包含合适的启动子，根据要引入构建体的宿主细胞进行选择。

在本发明的上下文中，术语“宿主细胞”是指能够表达由核酸携带的基因的细胞，其中所述核酸与该细胞异源且已经通过转染方法引入该细胞的基因组中。

优选地，宿主细胞是真核细胞。真核宿主细胞特别选自酵母细胞如酿酒酵母(Scerevisiae)、丝状真菌细胞如曲霉属(Aspergillus sp)、昆虫细胞如果蝇(Drosophila)的S2细胞或夜蛾(Spodoptera)的sf9、哺乳动物细胞和植物细胞。可以特别引用的哺乳动物细胞是哺乳动物细胞系，例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、HepG2或L(TK-)细胞。在一个优选的实现方式中，所述宿主细胞选自真核细胞系，优选Sf9昆虫细胞。在美国专利7,884,190中描述了在sf9昆虫细胞中制备重组二聚体蛋白的方法。

技术人员已知的用于产生表达异源核酸的细胞的任何转染方法都可以用于实施所述方法的步骤a)。转染方法例如描述于Sambrook等人,2001,"分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)",第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.中。

或者，所述嵌合构建体可以通过化学肽合成产生。例如，所述蛋白质可以通过平行合成较短的肽来生产，所述肽随后被组装以产生具有适当二硫桥的蛋白质的完整序列。IL-2的合成例如在Asahina等人,应用化学国际版(Angewandte Chemie InternationalEdition),2015,第54卷,第28期,8226-8230中进行了说明，其公开内容通过引用并入本文。

在另一个实施方式中，所述嵌合蛋白可以在向对象施用编码所述嵌合蛋白的核酸后在体内表达。在一个优选的实施方式中，所述核酸由病毒载体如腺病毒相关病毒(AAV)携带。

制剂和施用途径

还提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的构建体、核酸、载体或蛋白质，优选与药学上可接受的媒介物、载剂或赋形剂结合(例如，在溶液、悬浮液或混合物中)。

合适的赋形剂包括任何等渗溶液、盐水溶液、缓冲溶液、缓释制剂等。液体、冻干或喷雾干燥的组合物在本领域中是已知的并且可以制备为水性或非水性溶液或悬浮液。优选地，所述药物组合物包含适当的稳定剂、缓冲剂、填充剂或组合。

所述药物组合物还可以含有另一种活性成分，或者可以与任何其他活性成分组合施用。

所述药物组合物可以使用任何适宜的途径施用，包括肠胃外，例如皮内、皮下或鼻内途径。优选皮下途径。还涵盖口服、舌下或经颊施用。

适合皮下注射的制剂的一个实例描述于国际专利申请WO2017/068031中。

自身免疫性和/或炎性病症的治疗

本文所述的药物组合物可用于治疗自身免疫性和/或炎性病症的方法，所述病症例如系统性红斑狼疮、I型糖尿病、HCV相关血管炎、葡萄膜炎、肌炎、系统性血管炎、牛皮癣、过敏症、哮喘、克罗恩病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、自身免疫性甲状腺疾病、自身炎性疾病、神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病和肌萎缩性侧索硬化症、急性和慢性移植物抗宿主病、自然流产和同种异体移植排斥；实体器官移植排斥、血管炎、炎性肠病(IBD)和过敏性哮喘；脊柱关节炎或强直性脊柱炎；干燥综合征、系统性硬化症、斑秃或溃疡性结肠炎。

在一个优选的实施方式中，本文描述了一种治疗自身免疫性和/或炎性病症的方法，所述方法包括每周一次或两次，或者甚至每月一次或两次，优选通过皮下途径施用所述组合物。在一个实施方式中，剂量优选小于30MIU/天、优选小于20MIU/天、有利地小于10MIU/天、或介于1MIU/天和8MIU/天之间。在另一个特定实施方式中，使用介于1和5MIU/天之间、优选0.1至3.5MIU/天的剂量。

一般来说，允许Treg数量增加1.5、2、3、4或5倍的剂量是优选的。IL-2量的标准量度是国际单位(IU)，从技术上讲，它不是固定重量，而是由世界卫生组织(WHO)确定的在特定细胞增殖测定法中产生固定生物学效应的量。原因在于：i)重量随着分子的确切序列及其糖基化谱而改变，以及ii)重要的是分子的活性，而不是重量。

国际单位的原则正是提供一个标准品，任何IL-2分子都可以与其进行比较(不管它们的来源，或它们的序列，包括野生型或活性变体序列)。

在实践中，WHO提供含有IL-2分子的安瓿，所述IL-2分子已被校准并用作确定由其效力限定的给定IL-2制剂的剂量的参考(同样无论所述IL-2的来源或序列如何)。例如，为了确定给定IL-2制剂的剂量，候选IL-2制剂的生物活性在标准细胞增殖测定法中使用IL-2依赖性细胞系如CTLL-2进行测量，并且与标准品的生物活性进行比较。所述细胞在存在不同剂量的标准品的情况下生长。建立了IL-2的剂量反应效应，其中IL-2的剂量以IU绘制在X轴上并且增殖的量度(pr)绘制在Y轴上。当想要确定任何未知活性的IL-2产品的活性时，用所述产品培养IL-2依赖性细胞并测量增殖。然后将pr值绘制在Y轴上，并从该值绘制一条平行于X轴的线。然后从这条线与剂量反应线的交点绘制一条平行于Y轴的线。它与X轴的交点提供了候选IL-2产品的活性(IU)。

WHO标准安瓿的任何变化都不会影响国际单位，也不会影响任何IL-2制剂剂量的确定。

第一个标准品(WHO国际标准品，编码86/504，日期为1987年)含有源自Jurkat细胞的纯化糖基化IL-2，并被任意指定为100IU/安瓿的效力。由于第一个国际标准品(IS)的库存不足，因此WHO不得不更换它。WHO提供了另一个经校准的IL-2安瓿，这次是使用大肠杆菌(E.coli.)生产的。第二个标准安瓿每安瓿含有210IU的生物活性。标准安瓿的变化并不意味着IU的变化。因此，无论使用第一个标准安瓿还是第二个标准安瓿，或随后的标准安瓿作为参考，测试IL-2制剂剂量的确定都不会改变。

在一个实施方式中，实施长期施用，例如包括每3天一次至每三个月一次施用。如果需要，可以重复这样的施用顺序。

在另一个实施方式中，在可以持续3天至3个月、优选1至4周的施用中断后可以重复的周期中，每隔一天给与IL-2持续1至2周。

在另一个实施方式中，治疗可以包括也被称为诱导疗程的第一疗程和作为维持疗程的第二疗程。

在一个特定实施方式中，治疗可以包括至少一个第一疗程，其中药物组合物在至少约2或3个连续天期间，优选在3至7天期间，更优选在4至5个连续天期间每天施用一次，优选接着是维持剂量，例如在约六天或约1至约4周后。

所述维持剂量通常可以在至少一个月、优选至少约3个月、更优选至少约6个月期间施用。在一个优选的实施方式中，所述维持剂量在约3个月和约12个月之间，优选在约6个月和约12个月之间施用。

在一个优选的实施方式中，维持治疗由每周一次或两次、或每一周或两周、或每月一次施用药物组合物组成。

在一个优选的实施方式中，维持治疗由在至少一个月、优选约3个月至约12个月的期间内每周一次或两次、每一周或两周、或每月一次施用白细胞介素-2组成。

优选地，所述维持剂量与第一疗程剂量基本上相同，或者它可以是更低或更高的剂量。

癌症的治疗

本文所述的药物组合物可用于治疗癌症的方法。在一些实施方式中，对象患有局部晚期或转移性癌症。在一些实施方式中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方式中，所述癌症是结肠癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肾癌、食道癌或前列腺癌。

在一个实施方式中，剂量优选小于30MIU/天、优选小于20MIU/天、有利地小于10MIU/天、或介于3MIU/天和5MIU/天之间。

在其他实施方式中，施用400,000-750,000IU/kg或550,000-750,000IU/kg、优选600,000-700,000IU/kg的IL2。剂量可能与

开具的剂量相似，但预计更少。

所述组合物可以从每天一次或多次到每周一次或多次施用一次；包括每隔一天一次。技术人员会理解某些因素可能影响有效治疗对象所需的剂量和时间，包括但不限于疾病的严重程度、先前的治疗、对象的一般健康和/或年龄，以及存在的其他疾病。此外，对象的治疗可以包括单一治疗，或者可以包括一系列治疗。

上文描述的与自身免疫性和/或炎性病症相关的方案的实例可以相同或类似地应用于治疗癌症。或者，在另一个实例中，所述组合物可以每8小时施用一次，持续5天，接着是2至14天(例如9天)的休息期，接着每8小时再施用5天。在一些实施方式中，施用是每4天施用3剂。

实施例和附图说明了本发明而不限制其范围。

实施例：

实施例1：IL-2/C4BP融合蛋白的生产和表征

用慢病毒载体生产IL-2融合蛋白。简而言之，人IL-2(Hi2，SEQ ID NO:1)、与C4BPβ的C端区域融合的人IL-2(Hi2cb，SEQ ID NO:6)或具有突变IL-2的相同分子(N88R变体；Hi2mcb SEQ ID NO:7)在脾病灶形成病毒(SFFV)启动子下被整合到慢病毒质粒中。使用聚乙烯亚胺(PEI)利用慢病毒质粒转染70％汇合度的HEK 293T细胞，并在无血清培养基中培养48小时。然后将上清液过滤并通过超速离心浓缩并重新悬浮在适当的缓冲液中，然后在-80℃下保存。为了获得稳定的转染细胞，HEK 293T细胞以不同的感染复数(MOI)感染慢病毒，并使用产生的绿色荧光蛋白(GFP)作为选择标记通过流式细胞术评估转导效率。在对GFP+细胞进行细胞分选之前，将具有至少50％转导效率和80％存活率的细胞置于完全培养基中培养一周，以确保几乎100％的细胞产生IL-2融合蛋白。

为了对构建体的功能设计进行体外评估(蛋白质印迹、人全血STAT5磷酸化)，将稳定的细胞系在无血清培养基中培养48小时，并且收集上清液，过滤，浓缩并在利用前通过色谱法纯化。

重组腺相关病毒(AAV)是通过在HEK 293T细胞中用具有相同目标转基因的AAV2/8载体(含有包装在血清型8AAV的衣壳中的血清型2基因组的病毒)和辅助质粒转染产生的。从培养上清液中提取AAV载体，通过离心澄清并且在氯化铯梯度上纯化病毒并透析。

然后使用一级抗人IL-2抗体或一级抗人C4bpβ抗体通过蛋白质印迹对Hi2cb和Hi2mcb进行表征。在还原条件下，检测到Hi2cb和Hi2mcb的分子量为大约23kDa，对应于单体。在正常条件下，检测到具有主要信号的两个条带，分子量为大约46kDa，对应于二聚体。第二个弱信号对应于大约23kDa的单体。

实施例2：融合蛋白在人全血pSTAT5反应中的Treg选择性

免疫表型。在知情同意下收集来自健康成年人的人全血。使用流式细胞术在人CD4+调节性T细胞(Treg；CD4+Foxp3+CD127lo/-)、CD4+常规T细胞(Tconv；CD4+Foxp3-)和CD8+T细胞中评定Hi2、Hi2cb或Hi2mcb对STAT5磷酸化(pSTAT5)的影响。在pSTAT5染色之前，将Hi2、Hi2cb和Hi2mcb的十倍稀释液与100μl全血在37℃下混合15分钟。

图1显示了在不同目标群体上pSTAT5诱导的剂量反应。

Hi2能够在Treg、Tconv和CD8 T细胞中诱导STAT5的磷酸化。两种IL-2-C4bpβ蛋白也都能够在Treg上诱导STAT5磷酸化，而不能在Tconv和CD8 T细胞上诱导STAT5磷酸化，显示融合蛋白在更大的治疗窗口中选择性靶向Treg的能力。

实施例3：T细胞上的IL-2-C4bpβ编码AAV和肾小球滤过的体内评估

小鼠。六至八周龄的C57BL/6(Jrj)雌性小鼠通过腹膜内途径注射10¹¹个编码Hi2、Hi2cb或Hi2mcb的AAV病毒基因组(vg)。

免疫表型。每周一次在肝素管中收集血样以避免凝块形成。溶血后，将免疫细胞染色并通过流式细胞术分析以确定Treg(CD4+CD25+Foxp3+)、Teff(CD4+CD25+Foxp3-)、CD8+Treg(CD8+CD25+Foxp3+)和CD8+Teff(CD8+CD25+Foxp3-)的百分比。

剂量。在不同的时间点收集血液和尿液以使用人IL-2未包被的ELISA试剂盒(ThermoFisher)给与IL-2。

图2显示了与对照相比，四种不同T细胞区室的倍数增加的动力学曲线。关于调节性T细胞，3种蛋白质诱导Treg(图2A)和CD8+Treg(图2C)的显著且类似的增加，其中利用融合蛋白的增加甚至稍好，与Hi2相比具有更高的平台期。虽然Hi2诱导在一周后Teff(3倍，图2B)和CD8+Teff(10倍，图2D)和NK细胞扩增(2倍，图2E)的巨大峰值，但Hi2cb不同，对于CD4+和CD8+T细胞均略微增加约1.5倍，并完全控制NK细胞的扩增。融合蛋白的突变形式Hi2mcb表明了对CD4+和CD8+T细胞中效应区室的完全控制，以及对NK细胞的控制，尽管短暂增加，但显示这种突变有利于Treg选择性的能力。

图3显示了血浆(A)和尿液(B)人IL-2在一段时间内的动力学。观察到血浆和尿液中Hi2和IL-2-C4bpβ融合蛋白动力学之间的重要差异。Hi2在1周后达到峰值，持续平台期在20pg/mL左右(图3A)。相比之下，融合蛋白在第2周有一个较晚的峰值，非常高并维持在300pg/mL左右的平台期。在尿液中，仅在hIL-2编码AAV施用后检测到人IL-2，而在IL-2-C4bpβ编码AAV施用后在尿液中未检测到人IL-2。这些结果突显了这些融合蛋白不被肾脏过滤的能力，表明血浆中这些IL-2-C4bpβ融合蛋白的半衰期增加。

实施例4：高剂量AAV施用后Hi2、Hi2cb或Hi2mcb的毒性

小鼠。六至八周龄的C57BL/6(Jrj)雌性小鼠通过腹膜内途径注射10¹²vg的编码Hi2、Hi2cb或Hi2mcb的AAV。

图4A-4E显示了与对照相比，四种不同T细胞区室的倍数增加的动力学曲线。3种构建体对效应T细胞和调节性T细胞的影响与较低剂量的那些非常相似。简而言之，Hi2mcb增加了CD4+和CD8+Treg两者，同时完美地控制了效应子水平和NK细胞的增加。这种调节性T细胞选择性很可能是良好安全性特征的原因。

Hi2cb编码AAV施用后的动力学证实了仅部分控制CD4+(峰值3倍增加，图4B)和CD8+(峰值9倍增加，图4D)效应子区室的能力。然而，两个Treg区室在2周后都增加，Treg达到几乎4倍增加(图4A)并且CD8+Treg达到7倍增加(图4C)。最后，在用Hi2治疗的小鼠组中，它们都在1周内死亡，而CD4+和CD8+Treg显著增加(图4A、图4C)，并且Teff(25倍增加，图4B)、CD8+Teff(62倍增加，图4D)和NK细胞(3倍增加，图4E)急剧扩增，其可能引起免疫稳态显著失衡，从而导致快速死亡。

图5显示了高剂量AAV施用后小鼠的Kaplan-Meier曲线。高剂量的3种蛋白质的毒性评估表明IL-2-C4bpβ融合蛋白的安全性特征与经典Hi2相比非常好(图5)。事实上，所有注射了Hi2的小鼠都在7天内死亡。使用Hi2cb观察到死亡延迟，因为3只小鼠中仅有2只在第17天死亡。最后，在实验开始后20周，所有用Hi2mcb治疗的小鼠仍然存活，突显了融合蛋白的完全安全性。

实施例5：融合蛋白在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中的治疗功效

小鼠。在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(EAE)诱导前7天，通过腹膜内途径向六至八周龄的C57BL/6(Jrj)雌性小鼠注射10¹¹vg的编码Hi2、Hi2cb或Hi2mcb的AAV，以确保在疾病开始时Treg扩增。使用每种基于IL-2的分子进行预防性治疗可延缓临床发作(图6A)。然而，在疾病发作后3至5天，与对照小鼠(空心圆点，图6C)相比，用标准IL2治疗的小鼠(黑色圆点)显示出相似的临床症状动力学。这一结果在所有分析参数中得到证实并被观察到，体重显著减轻(图6B)并且100％的小鼠出现临床症状(图6A)。相反，用两种融合蛋白治疗的小鼠显示出相同的发病延迟，但临床症状严重程度得到控制(分别为黑色正方形和三角形)、体重减轻得到总体控制(图6B)以及40％的完全疾病预防，完全疾病预防意味着小鼠没有任何临床症状(图6A)。

实施例6：融合蛋白的生产和评估

6.1.融合蛋白的生产

从稳定的细胞系生产中获得纯化的融合蛋白。详细而言，将HEK293T细胞培养并收集上清液，并使用AKTA^TM系统通过尺寸排阻色谱法进行纯化。进行ELISA和蛋白质印迹以收集阳性级分。最后，使收集的样品通过阴离子交换色谱。

6.2.免疫表型

小鼠。六至八周龄的C57BL/6(Jrj)雌性小鼠每天通过皮下途径注射Hi2、Hi2cb或Hi2mcb(25 000UI)，持续五天。

免疫表型。注射前每天一次在肝素管中收集血样以避免凝块形成。溶血后，将免疫细胞染色并通过流式细胞术分析以确定Treg(CD4+CD25+Foxp3+)的百分比和Treg上CD25的平均荧光强度。

图7A显示了基于在五天内每天注射一次25 000国际单位的蛋白质的实验施用方案。在即将注射前，每天进行一次免疫表型分析，持续五天。

图7B-7C显示了与对照相比，T细胞区室和NK细胞的倍数增加的动力学曲线。Hi2和融合蛋白之间的调节性T细胞扩增以及Treg上的CD25 MFI(具有1.6倍增加)非常相似。

6.3.剂量

在不同的时间点收集血液和尿液以使用人IL-2未包被的ELISA试剂盒(ThermoFisher)给与IL-2。

六至八周龄C57BL/6(Jrj)雌性小鼠通过皮下途径接受单次Hi2、Hi2cb或Hi2mcb上清液蛋白施用，并在不同时间点测定血浆hIL-2浓度。在Hi2和融合蛋白之间观察到显著的药代动力学差异(图8)。事实上，与Hi2相比，融合蛋白能够在血浆区室中停留更长时间，消除减少。这些结果突显了如下事实，即这些融合蛋白具有增加的半衰期和减少的清除消除。

序列表

<110> 艾尔图制药公司(ILTOO PHARMA)等

<120> 白细胞介素2嵌合构建体

<130> B3164EP

<160> 10

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 153

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 3

<211> 252

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Phe Phe Trp Cys Ala Cys Cys Leu Met Val Ala Trp Arg Val Ser

1 5 10 15

Ala Ser Asp Ala Glu His Cys Pro Glu Leu Pro Pro Val Asp Asn Ser

20 25 30

Ile Phe Val Ala Lys Glu Val Glu Gly Gln Ile Leu Gly Thr Tyr Val

35 40 45

Cys Ile Lys Gly Tyr His Leu Val Gly Lys Lys Thr Leu Phe Cys Asn

50 55 60

Ala Ser Lys Glu Trp Asp Asn Thr Thr Thr Glu Cys Arg Leu Gly His

65 70 75 80

Cys Pro Asp Pro Val Leu Val Asn Gly Glu Phe Ser Ser Ser Gly Pro

85 90 95

Val Asn Val Ser Asp Lys Ile Thr Phe Met Cys Asn Asp His Tyr Ile

100 105 110

Leu Lys Gly Ser Asn Arg Ser Gln Cys Leu Glu Asp His Thr Trp Ala

115 120 125

Pro Pro Phe Pro Ile Cys Lys Ser Arg Asp Cys Asp Pro Pro Gly Asn

130 135 140

Pro Val His Gly Tyr Phe Glu Gly Asn Asn Phe Thr Leu Gly Ser Thr

145 150 155 160

Ile Ser Tyr Tyr Cys Glu Asp Arg Tyr Tyr Leu Val Gly Val Gln Glu

165 170 175

Gln Gln Cys Val Asp Gly Glu Trp Ser Ser Ala Leu Pro Val Cys Lys

180 185 190

Leu Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu Cys Glu Lys Ala Leu Leu Ala

195 200 205

Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu Ala Met Glu Asn Phe Met Gln

210 215 220

Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met Glu Glu Leu Lys Tyr Ser Leu

225 230 235 240

Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala Lys Leu Leu

245 250

<210> 4

<211> 59

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu Cys Glu Lys Ala Leu Leu Ala Phe

1 5 10 15

Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu Ala Met Glu Asn Phe Met Gln Gln

20 25 30

Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met Glu Glu Leu Lys Tyr Ser Leu Glu

35 40 45

Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala Lys Leu Leu

50 55

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Arg Asp Cys Asp Pro Pro Gly Asn Pro Val His Gly Tyr Phe Glu Gly

1 5 10 15

Asn Asn Phe Thr Leu Gly Ser Thr Ile Ser Tyr Tyr Cys Glu Asp Arg

20 25 30

Tyr Tyr Leu Val Gly Val Gln Glu Gln Gln Cys Val Asp Gly Glu Trp

35 40 45

Ser Ser Ala Leu Pro Val Cys Lys Leu Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro

50 55 60

Glu Cys Glu Lys Ala Leu Leu Ala Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys

65 70 75 80

Glu Ala Met Glu Asn Phe Met Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr

85 90 95

Met Glu Glu Leu Lys Tyr Ser Leu Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys

100 105 110

Ala Lys Leu Leu

115

<210> 6

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hi2cb融合蛋白

<400> 6

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu

165 170 175

Cys Glu Lys Ala Leu Leu Ala Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu

180 185 190

Ala Met Glu Asn Phe Met Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met

195 200 205

Glu Glu Leu Lys Tyr Ser Leu Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Lys Leu Leu

225

<210> 7

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hi2mcb融合蛋白

<400> 7

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu

165 170 175

Cys Glu Lys Ala Leu Leu Ala Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu

180 185 190

Ala Met Glu Asn Phe Met Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met

195 200 205

Glu Glu Leu Lys Tyr Ser Leu Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Lys Leu Leu

225

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头重复

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 9

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hi2cb成熟

<400> 9

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu Cys Glu Lys Ala

145 150 155 160

Leu Leu Ala Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu Ala Met Glu Asn

165 170 175

Phe Met Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met Glu Glu Leu Lys

180 185 190

Tyr Ser Leu Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala Lys Leu Leu

195 200 205

<210> 10

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hi2mcb成熟

<400> 10

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Ile Gln Glu Ala Pro Lys Pro Glu Cys Glu Lys Ala

145 150 155 160

Leu Leu Ala Phe Gln Glu Ser Lys Asn Leu Cys Glu Ala Met Glu Asn

165 170 175

Phe Met Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Met Thr Met Glu Glu Leu Lys

180 185 190

Tyr Ser Leu Glu Leu Lys Lys Ala Glu Leu Lys Ala Lys Leu Leu

195 200 205

Claims

1.一种嵌合构建体，所述嵌合构建体包含i)至少一个白细胞介素2(IL2)部分和ii)C4b结合蛋白β链(C4BPβ)或其至少一个能够形成二聚体蛋白的片段或功能变体。

2.根据权利要求1所述的嵌合构建体，其中C4BPβ片段包含以下或由以下组成：C4BPβ的氨基酸残基194至252或在N端延伸到至多氨基酸135的更长的C4BPβ片段。

3.根据权利要求1或2所述的嵌合构建体，所述嵌合构建体包含C4BPβ的功能变体，其包含

a)C4BPβ片段的修饰序列，其中所述片段的少于25％、优选少于10％的氨基酸已被切除或替换，其中位于位置202和216中的半胱氨酸以及每个半胱氨酸的上游和下游的至少3个氨基酸被保留；或者

b)C4BPβ片段的修饰序列，其中负责二聚化的半胱氨酸被优选选自丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和色氨酸的氨基酸替换，并且所述片段的另一个氨基酸被半胱氨酸替换；或者

c)通过在负责二聚化的所述半胱氨酸之间插入与所述β链异源的序列而修饰的C4BPβ片段的序列；或者

d)通过切除负责二聚化的所述半胱氨酸之间的氨基酸而修饰的C4BPβ片段的序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的嵌合构建体，其中所述IL-2部分是人IL-2或其同源变体，其中所述变体与人野生型IL-2具有至少85％氨基酸同一性，优选地其中所述变体是与人野生型IL-2具有至少90％氨基酸同一性的人IL-2的活性类似物，其中所述IL-2部分优选地是在SEQ ID NO:2的位置N88处包含替换、更优选替换N88R的IL2突变蛋白。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的嵌合构建体，其中所述IL2部分和C4BPβ或其所述片段框内融合或通过氨基酸接头、优选polyG接头融合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合构建体，其中所述IL2部分在C4BPβ或其所述片段的N端融合，优选地其中所述嵌合蛋白是其中一个IL2部分在C4BPβ或其所述片段的N端融合而另一个IL2部分在C4BPβ或其所述片段的C端融合的融合蛋白。

7.一种同源二聚体蛋白，所述同源二聚体蛋白包含两个融合多肽，每个融合多肽由根据权利要求1至6中任一项所述的嵌合产物组成。

8.一种用于生产如权利要求6所定义的重组二聚体蛋白的方法，所述方法包括：

a)用允许表达编码融合多肽的核苷酸序列的载体转染宿主细胞，所述融合多肽是如权利要求1至6中任一项所定义的嵌合构建体；

b)在适合表达编码所述融合多肽的核苷酸序列和两个融合多肽在体内共价缔合以形成二聚体蛋白的条件下培养转染的细胞；

c)回收所形成的二聚体蛋白。

9.一种包含两个融合多肽的异源二聚体蛋白，其中第一融合多肽由根据权利要求1至6中任一项所述的嵌合产物组成，并且第二融合多肽包含i)至少一个异源多肽和ii)C4b结合蛋白β链(C4BPβ)或其至少一个能够形成二聚体蛋白的片段或功能变体，其中所述异源多肽不同于所述第一融合多肽的IL-2部分，优选地其中所述异源多肽是自身抗原或肿瘤抗原。

10.一种用于产生如权利要求9所定义的重组异源二聚体蛋白的方法，所述方法包括：

i.第一融合多肽，其是如权利要求1至6中任一项所定义的嵌合构建体；和

ii.第二融合多肽，其包含i)至少一个异源多肽和ii)C4b结合蛋白β链(C4BPβ)或其至少一个能够形成二聚体蛋白的片段或功能变体，其中所述异源多肽不同于所述第一融合多肽的白细胞介素2部分；

c.回收所形成的异源二聚体蛋白。

11.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1至6中任一项所述的嵌合构建体。

12.一种载体，所述载体包含根据权利要求11所述的核酸。

13.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求11所述的核酸或根据权利要求12所述的载体。

14.根据权利要求7所述的同源二聚体蛋白或根据权利要求9所述的异源二聚体蛋白，其用于治疗对象的炎性和/或自身免疫性病症。

15.根据权利要求7所述的同源二聚体蛋白或根据权利要求9所述的异源二聚体蛋白，其用于治疗对象的癌症。