JP2022501009A - 新規インターロイキン2およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規インターロイキン2(IL−2)変異タンパク質に関する。本発明はまた、当該IL−2変異タンパク質を含む融合タンパク質、免疫複合体、および当該IL−2変異タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はさらに、当該IL−2変異タンパク質を調製する方法、当該IL−2変異タンパク質を含む医薬組成物、および当該変異タンパク質の治療的使用を提供する。
Description
本発明は、新規インターロイキン2(IL−2)変異タンパク質およびその使用に関する。特に、本発明は、野生型IL−2と比較して改善された特性、例えば、改善された薬剤形成性、低下したIL−2Rα受容体結合能、および/または増加したIL−2Rβ受容体結合能を有するIL−2変異タンパク質に関する。本発明はまた、当該IL−2変異タンパク質を含む融合タンパク質、免疫複合体、および当該IL−2変異タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はさらに、当該IL−2変異タンパク質を調製する方法、当該IL−2変異タンパク質を含む医薬組成物、および当該変異タンパク質の治療的使用を提供する。
T細胞成長因子(TCGF)とも呼ばれるインターロイキン−2(IL−2)は、活性化T細胞、特にCD4+ Tヘルパー細胞によって主に産生される多能性サイトカインである。真核細胞において、ヒトIL−2(uniprot:P60568)は153アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、N末端20アミノ酸を除去した後、成熟した分泌性IL−2を産生する。他の種のIL−2の配列も開示されており、NCBI Ref Seq No. NP032392(マウス)、NP446288(ラット)またはNP517425(チンパンジー)を参照されたい。
インターロイキン2は、その機能に不可欠な4次構造を形成する4つの反平行両親媒性 αヘリックスを有する(Smith,Science 240,1169−76(1988);Bazan,Science257,410−413(1992))。ほとんどの場合、IL−2は、インターロイキン2受容体α(IL−2Rα;CD25)、インターロイキン2受容体β(IL−2Rβ;CD122)、およびインターロイキン2受容体γ(IL−2Rγ;CD132)の3つの異なる受容体によって機能する。IL−2RβおよびIL−2RγはIL−2のシグナル伝達に重要であるが、IL−2Rα(CD25)はシグナル伝達に必要ではないが、IL−2の受容体への高い親和力結合を与えることができる(Krieg etal., Proc Natl Acad Sci 107,11906−11(2010))。IL−2R α、β、γを組み合わせて形成される三量体受容体(IL−2αβγ)はIL−2高親和力受容体(KDが約10pM)であり、βとγからなる二量体受容体(IL−2βγ)は中間親和力受容体(KDが約1nM)であり、αサブユニットのみから形成されるIL−2受容体は、低親和力受容体である。
免疫細胞は二量体または三量体IL−2受容体を発現する。二量体受容体は細胞傷害性CD8+ T細胞とナチュラルキラー細胞(NK)で発現し、三量体受容体は主に活性化リンパ球とCD4+ CD25+FoxP3+抑制的制御性T細胞(Treg)で発現する(Byman, O.およびSprent. J. Nat. Rev. Immunol. 12, 180−190(2012))。静止状態のエフェクターT細胞およびNK細胞は、細胞表面上にCD25を有さないので、IL−2に対して比較的非感受性である。一方、Treg細胞は体内で常に最高レベルのCD25を発現しているため、通常IL−2はTreg細胞の増殖を優先的に刺激する。
IL−2は、異なる細胞上のIL−2受容体との結合を介して、免疫反応における多重作用を介在する。一方、IL−2は免疫系刺激剤として、T細胞の増殖と分化を刺激し、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の生成を誘導し、B細胞の増殖と分化と免疫グロブリンの合成を促進し、そしてナチュラルキラー(NK)細胞の生産、増殖、活性化を刺激することから、免疫治療剤としてがんやレンチウイルス感染の治療に使用されることが承認されている。他方、IL−2は、免疫抑制性CD4+CD25+制御性T細胞(即ち、Treg細胞)の維持を促進することができ(Fontenot etal.,Nature Immunol 6,1142-51(2005);D’CruzおよびKlein,Nature Immunol 6,1152-59(2005);MaloyおよびPowrie,Nature Immunol6,1171-72(2005))、活性化誘導性細胞死(AICD)を介在し、自己抗原および腫瘍抗原に対する免疫寛容の確立および維持に関与し(Lenardo etal.,Nature 353:858(1991))、したがって、AICDによる腫瘍耐性および活性化されたTreg細胞による免疫抑制が患者において引き起こされる。さらに、高用量IL−2は、患者において血管漏出症候群(VLS)を引き起こす可能性がある。IL−2は、肺内皮細胞上のIL−2三量体受容体(IL−2αβγ)と直接結合することによって肺浮腫を誘導することが示されている(Krieg etal., Proc Nat Acad Sci USA107,11906−11(2010))。
IL−2免疫療法に関連する上述の問題を克服するために、IL−2の様々な受容体に対する選択性または選好性を変化させることにより、IL−2療法の毒性を低下させ、および/またはその有効性を増大させることが提案されている。例えば、IL−2モノクローナル抗体とIL−2との複合物を用いて、CD25ではなくCD122を発現する細胞をIL−2に標的化することにより、CD122high集団の優先的増幅を誘導し、インビボIL−2治療効果を増強することが提案されている (Boyman etal., Science 311, 1924−1927(2006))。Oliver AST etal.(US2018/0142037)は、IL−2Rα受容体に対する親和性を低下させるために、IL−2のアミノ酸残基位置42、45および72に三重変異F42A/Y45A/L72Gを導入することを提案している。Aron M. Levin etal.(Nature, Vol 484, p529−533, DOI:10.1038/nature10975)は、五重変異L80F/R81D/L85V/I86V/I92Fを含む「superkine」と呼ばれるIL−2変異体IL−2H9を提案し、これはIL−2Rβ結合を増強し、それによってCD25−細胞への刺激作用を高め、しかしCD25への高い結合性は保たれている。Rodrigo Vazquez−Lombardi etal.(Nature Communications, 8:15373, DOI: 10.1038/ncomms15373)は、三重変異ヒトIL−2変異タンパク質IL−23Xを提案しており、当該タンパク質は、アミノ酸残基位置38、43および61にそれぞれ残基変異R38D−K43E−E61Rを有するので、当該変異タンパク質はIL−2Rαと結合せず、しかし、当該変異タンパク質はCD25−細胞を活性化する効果が弱く、CD25+細胞に対する活性化の偏向性は依然として存在する。また、Rodrigo Vazquez−Lombardi etal.は、インターロイキン−2−Fc融合体を調製することにより、インターロイキンの薬理学的特性を改善することも提案しているが、この融合タンパク質は発現量が低く、凝集体を形成しやすい。
免疫調節および疾患におけるIL−2の役割を考慮すると、改善された特性を有する新規IL−2分子、特に生産、精製に有利で、および改善された薬理学的特性を示すIL−2分子を開発する必要性が本分野において依然として存在する。
本発明は、野生型IL−2と比較して改善された薬剤形成特性および/または改善されたIL−2受容体選択性/偏向性を有する新規IL−2変異タンパク質を提供することによって、上記の要件を満たす。
したがって、1つの態様において、本発明は、新規IL−2変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、以下の1つ以上の特性を有する。
(i)改善された薬剤形成性、特に哺乳動物細胞において発現された場合の発現および/または精製の改善、
(ii)IL−2Rαとの結合の低減または排除、
(iii)IL−2Rβとの結合の増強。
(ii)IL−2Rαとの結合の低減または排除、
(iii)IL−2Rβとの結合の増強。
いくつかの実施形態において、本発明は、IL−2とIL−2Rαとの結合インターフェースに導入された変異グリコシル化モチーフを含むIL−2変異タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、IL−2のB’C’ループ領域に、切断されたループ配列を有するための欠失および/または置換を含むIL−2変異タンパク質を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、変異グリコシル化モチーフおよび短縮B’C’ループ配列の両方を有するIL−2変異タンパク質を提供する。
さらに、本発明は、IL−2変異タンパク質を含む融合タンパク質および免疫複合体、医薬組成物および組み合わせ製品、IL−2変異タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに本発明のIL−変異タンパク質、融合タンパク質および免疫複合体を産生する方法を提供する。
さらに、本発明は、本発明のIL−2変異タンパク質および融合体および免疫複合体を用いて疾患を治療するための方法、ならびに対象の免疫系を刺激するための方法および使用も提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、対象においてCD25−エフェクターT細胞およびNK細胞の強力な活性化および増幅をもたらす。さらに他の実施形態において、本発明の方法により、Treg細胞で介在されるIL−2の免疫ダウンレギュレート作用を効果的に減少させることができる。
以下、本発明を、図面および実施形態を参照してさらに説明する。しかし、これらの図面および実施形態は、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではなく、当業者が容易に思いつく変更は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲に含まれる。
別に定義しない限り、本出願に用いられる全ての技術と科学用語はいずれも、当業者が通常に理解する意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、下記の用語を定義する。
用語「約」は数値と共に使用されるとき、下限として記載数値より5%小さく上限として記載数値より5%大きい範囲における数値を含むことを意味する。
用語「および/または」は選択可能オプションのうちのいずれか1項または選択可能オプションのいずれか2項または複数項の組み合わせを指すと理解すべきである。
本出願に使用される場合、用語「包含する」または「含む」とは、前記要素、整数またはステップを含むが、他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本出願において、用語「包含する」または「含む」を用いる場合、特記しない限り、述べられた要素、整数またはステップからなる場合を含む必要がある。例えば、ある変異または変異の組み合わせを「包含する」または「含む」IL−2変異タンパク質に言及する場合、その変異または変異の組み合わせのみを有するIL−2変異タンパク質を包含することも意図される。
本明細書において、野生型「インターロイキン−2」または「IL−2」とは、本発明の変異または変異の組み合わせを導入するテンプレートである親IL−2タンパク質、好ましくは天然に存在するIL−2タンパク質、例えば、未処理(例えば、シグナルペプチドの除去なし)の形態および処理済み(例えば、シグナルペプチドの除去あり)の形態を含む、ヒト、マウス、ラット、非ヒト霊長類由来の天然IL−2タンパク質を指す。シグナルペプチドを含む完全長の天然ヒトIL−2配列を配列番号29に示し、成熟タンパク質の配列を配列番号30に示す。さらに、この表現には、天然に存在するIL−2対立遺伝子変異体およびスプライシング変異体、アイソタイプ、相同体、および種相同体も含まれる。この表現には、天然IL−2の変異体も含まれ、例えば、前記変異体は、天然IL−2と少なくとも95%−99%またはそれ以上の同一性を有してもよく、または1−10個以下または1−5個以下のアミノ酸変異(特に保存的アミノ酸置換)を有してもよく、天然IL−2タンパク質と実質的に同じIL−2Rα結合親和性および/またはIL2Rβ結合親和性を有する。したがって、いくつかの実施形態において、野生型IL−2は、天然IL−2タンパク質と比較して、IL−2受容体へのその結合に影響を及ぼさないアミノ酸変異、例えば、変異C125Sを125位に導入した天然ヒトIL−2タンパク質(uniprot:P60568)は、本発明の野生型IL−2に属する。C125S変異を含む野生型ヒトIL−2タンパク質の例を配列番号26に示す。いくつかの実施形態において、野生型IL−2配列は、配列番号26または29または30のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、95%、さらには少なくとも96%、97%、98%、または99%またはさらに高いアミノ酸配列同一性を有する。
本明細書において、アミノ酸変異は、アミノ酸置換、欠失、挿入、および付加であってもよい。置換、欠失、挿入および付加の任意の組み合わせを行って、所望の特性(例えば、IL−2Rα結合親和性の低下)を有する最終変異タンパク質構築物を得ることができる。アミノ酸の欠失および挿入は、ポリペプチド配列のアミノおよび/またはカルボキシ基末端における欠失および挿入を含む。例えば、アラニン残基は、全長ヒトIL−2位置1で欠失することができる。いくつかの実施形態において、好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。他の実施形態において、好ましいアミノ酸変異はアミノ酸欠失である。いくつかの実施形態において、改変されたグリコシル化モチーフを有するIL−2変異タンパク質を得るために、本明細書に記載の特定の変異アミノ酸位置に変異を導入する。いくつかの実施形態において、B’C’ループ配列が切断されたIL−2変異タンパク質を得るために、本明細書に記載の特定の変異アミノ酸位置に変異を導入する。
本発明において、IL−2タンパク質のアミノ酸位置に言及する場合、配列番号26の野生型ヒトIL−2タンパク質(IL−2WTとも呼ばれる)アミノ酸配列(図6に示す)を参照して決定される。アミノ酸配列アラインメントを実施することによって(例えば、BLASTを使用して、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov /Blast.cgi?PROGRAM=blastp& PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomeから取得可能なBasic Local Alignment Search Tool、デフォルトパラメータを使用して、アラインメントを実施する)、他のIL−2タンパク質またはポリペプチド(全長配列または切断断片を含む)上の対応するアミノ酸位置を同定する。したがって、本発明において、IL−2タンパク質またはポリペプチド中のアミノ酸位置は、特記しない限り、配列番号26によるアミノ酸位置である。例えば、「F42」に言及する場合、配列番号26の第42位フェニルアラニン残基F、または他のIL−2ポリペプチド配列上の対応する位置でアラインメントされたアミノ酸残基を指す。
本明細書において、IL−2変異タンパク質に言及するとき、変異は以下のように記載される。アミノ酸置換は、[元のアミノ酸残基/位置/置換されたアミノ酸残基]として表される。例えば、位置35のアミノ酸はアスパラギン(N)に置換されており、35Nと表すことができ、35位の元のアミノ酸残基がリジンであればK35Nと表すこともできる。置換残基がXで表される場合、例えば36Xは、位置36におけるアミノ酸が任意の残基で置換され得ることを意味し、Xが特定の残基を有する場合、その位置は定義された特定のX残基で置換される。しかし、元の残基および位置のみを示す表現、例えば、本発明の変異グリコシル化モチーフK35N−L36−T37におけるL36およびT37は、前記位置36および37において変異が起こらないこと、すなわち、36位および37位が元の残基LおよびTを保持することを意味する。
本明細書では、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウ内で2つの最適アラインメント配列を比較することによって決定することができる。好ましくは、配列同一性は、参照配列(例えば、配列番号26)の全長にわたって決定される。比較のための配列アラインメント方法は、本分野において周知である。配列同一性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムは、例えば、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムを含む(Altschul etal.,Nuc. Acids Res.25: 3389−402,1977およびAltschul etal. J.Mol. Biol. 215: 403−10, 1990参照)。BLAST分析のためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)から公的に入手可能である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。本出願の目的のために、同一性パーセントは、通常、デフォルトパラメータとして設定されたBLAST2.0アルゴリズムを用いて決定される。
本明細書で使用するとき、用語「保存的置換」は、アミノ酸配列を含むタンパク質/ポリペプチドの生物学的機能に悪影響を及ぼさない、または変化させないアミノ酸置換を意味する。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発およびPCR介在性変異誘発などの本分野で公知の標準的な技術によって導入することができる。典型的な保存的アミノ酸置換は、1つのアミノ酸を、類似の化学的特性(例えば、電荷または疎水性)を有する別のアミノ酸に置換することを意味する。以下の6組はそれぞれ、互いに典型的な保存的置換が可能なアミノ酸を含む。1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、4)アルギニン(R)、リジン(K)、5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)、および6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。例えば、野生型IL−2タンパク質は、配列番号26、29または30のいずれかに対して保存的アミノ酸置換を有していてもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有していてもよい。さらに例えば、本発明の変異IL−2タンパク質は、本明細書に具体的に示されるIL−2変異タンパク質配列(例えば、配列番号31−50のいずれか)に対して保存的アミノ酸置換を有していてもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有していてもよい。
「親和力」または「結合親和力」は、結合対のメンバー間の相互作用の内部結合能力を反映するために使用することができる。分子Xのその結合パートナーYに対する親和力は、平衡解離定数(KD)によって示され、平衡解離定数は、解離速度定数と結合速度定数(それぞれkdisとkonである)との比値である。結合親和力は本分野の既知の常用方法で測定される。親和力を測定するための1つの特定の方法は、本明細書におけるバイオレイヤー干渉法(BLI)技術による測定である。
本明細書において、抗体結合分子は、抗原と特異的に結合し得るポリペプチド分子、例えば免疫グロブリン分子、抗体または抗体断片、例えばFab断片およびscFv断片である。
本明細書において、抗体Fc断片とは、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のC−末端領域を意味し、天然配列Fc断片および変異体Fc断片を含むことができる。1つの実施形態において、ヒトIgG重鎖Fc断片は重鎖のCys226からまたはPro230からカルボキシル基末端に延伸する。他の実施形態において、Fc−断片のC−末端リジン(Lys447)が存在してもよく、存在しなくてもよい。他の実施形態において、Fc断片は、L234A/L235A変異などの変異を含んでもよい。本出願では特記しない限り、Fc断片におけるアミノ酸残基の番号付けは、EU番号付けシステムによるものであり、EU索引とも呼ばれる。例えば、Kabat、E.A. et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991)、NIH Publication 91−3242に記載される。
本発明の種々の態様は、以下の各セクションにおいてさらに詳細に説明される。
1.本発明のIL−2変異タンパク質
本発明は、1つの態様において、改善された薬剤形成特性および/または改善されたIL−2受容体選択性/選好性を有する新規IL−2変異タンパク質を提供する。
本発明は、1つの態様において、改善された薬剤形成特性および/または改善されたIL−2受容体選択性/選好性を有する新規IL−2変異タンパク質を提供する。
本発明のIL−2変異タンパク質の有利な生物学的特性
IL−2タンパク質は、IL−2受容体と相互作用することによってシグナル伝達を誘発し、機能する。野生型IL−2は、異なるIL−2受容体に対して異なる親和性を示す。野生型IL−2との親和性が低いIL−2βおよびIL−2γ受容体を、静止エフェクター細胞(CD8+細胞傷害性T細胞およびNK細胞を含む)上で発現した。野生型IL−2との親和性が高いIL−2Rαを、制御性T細胞(Treg)細胞および活性化エフェクター細胞上で発現した。高い親和性のために、野生型IL−2は、細胞表面のIL−2Rαと優先的に結合し、IL−2Rβγを動員し、IL−2Rβγを介して下流のp−STAT5シグナルを放出し、Treg細胞および活性化エフェクター細胞を刺激する。したがって、理論に束縛されるものではないが、IL−2Rα受容体に対するIL−2の親和性を低減または排除することは、IL−2がCD25+細胞を優先的に活性化する偏向を低減し、IL−2介在性Treg細胞の免疫ダウンレギュレート作用を低減するであろう。理論に束縛されるものではないが、IL−2Rβ受容体に対する親和性の維持または増強は、CD8+細胞傷害性T細胞およびNK細胞などのエフェクター細胞に対するIL−2の活性化およびそれによるIL−2の免疫刺激作用を保持または増強する。
IL−2タンパク質は、IL−2受容体と相互作用することによってシグナル伝達を誘発し、機能する。野生型IL−2は、異なるIL−2受容体に対して異なる親和性を示す。野生型IL−2との親和性が低いIL−2βおよびIL−2γ受容体を、静止エフェクター細胞(CD8+細胞傷害性T細胞およびNK細胞を含む)上で発現した。野生型IL−2との親和性が高いIL−2Rαを、制御性T細胞(Treg)細胞および活性化エフェクター細胞上で発現した。高い親和性のために、野生型IL−2は、細胞表面のIL−2Rαと優先的に結合し、IL−2Rβγを動員し、IL−2Rβγを介して下流のp−STAT5シグナルを放出し、Treg細胞および活性化エフェクター細胞を刺激する。したがって、理論に束縛されるものではないが、IL−2Rα受容体に対するIL−2の親和性を低減または排除することは、IL−2がCD25+細胞を優先的に活性化する偏向を低減し、IL−2介在性Treg細胞の免疫ダウンレギュレート作用を低減するであろう。理論に束縛されるものではないが、IL−2Rβ受容体に対する親和性の維持または増強は、CD8+細胞傷害性T細胞およびNK細胞などのエフェクター細胞に対するIL−2の活性化およびそれによるIL−2の免疫刺激作用を保持または増強する。
本発明者らは、IL−2とIL−2Rα受容体との結合インターフェースに1つ以上の特定のNグリコシル化モチーフを導入することにより、IL−2変異タンパク質の発現および/または純度を改善し、および/またはIL−2変異タンパク質のIL−2Rαへの結合を低減することができることを見出した。さらに、本発明者らは、IL−2自体のB’C’ループ配列を、IL−15などの他のインターロイキンサイトカイン由来の短いB’C’ループ配列に置換することにより、またはIL−2自体のB’C’ループ配列を切断することにより、IL−2の発現および/または純度を増加させ、同時にIL−2Rβに対する親和力を増加させることができることをも見出した。
したがって、本発明は、改善された特性を有するIL−2変異タンパク質を提供する。本発明のIL−2変異タンパク質は、野生型IL−2と比較して、例えば、(i)哺乳動物細胞で発現させたときに発現および/または純度が改善されること、(ii)IL−2Rα受容体への結合の低減または排除、および/または(iii)IL−2Rβ受容体への結合の増強の群から選択される1つ以上の改善された特性を有することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、野生型IL−2と比較して、例えば、以下の群から選択される1つ以上の改善された特性を有する。
(1)IL−2Rα受容体への結合親和性の低減または排除、
(2)IL−2Rβ受容体への結合親和性の増強、
(3)高親和性IL−2R受容体(IL−2Rαβγ)への結合親和性の低減、
(4)中程度の親和性IL−2R受容体(IL−2Rβγ)への結合親和性の増加、
(5)CD25+細胞(特に活性化CD8+T細胞およびTreg細胞)におけるIL−2シグナル伝達の活性化、特にSTAT5リン酸化シグナルの活性化能の低下、
(6)IL−2介在性CD25+細胞(特に、活性化CD8+T細胞およびTreg細胞)の活性化および増殖の減少、
(7)Treg細胞の増殖を優先的に刺激するIL−2の偏向の低減または解消、
(8)IL−2誘導下でのTreg細胞の免疫ダウンレギュレート作用の低減、
(9)特に、CD25−細胞(特にCD25−Tエフェクター細胞およびNK細胞)に対する活性化作用の保持または増強、
(10)IL−2介在性エフェクターT細胞およびNK細胞の活性化および増殖の増加、
(11)免疫刺激作用の向上、
(12)抗腫瘍効果の向上。
(2)IL−2Rβ受容体への結合親和性の増強、
(3)高親和性IL−2R受容体(IL−2Rαβγ)への結合親和性の低減、
(4)中程度の親和性IL−2R受容体(IL−2Rβγ)への結合親和性の増加、
(5)CD25+細胞(特に活性化CD8+T細胞およびTreg細胞)におけるIL−2シグナル伝達の活性化、特にSTAT5リン酸化シグナルの活性化能の低下、
(6)IL−2介在性CD25+細胞(特に、活性化CD8+T細胞およびTreg細胞)の活性化および増殖の減少、
(7)Treg細胞の増殖を優先的に刺激するIL−2の偏向の低減または解消、
(8)IL−2誘導下でのTreg細胞の免疫ダウンレギュレート作用の低減、
(9)特に、CD25−細胞(特にCD25−Tエフェクター細胞およびNK細胞)に対する活性化作用の保持または増強、
(10)IL−2介在性エフェクターT細胞およびNK細胞の活性化および増殖の増加、
(11)免疫刺激作用の向上、
(12)抗腫瘍効果の向上。
いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、上記(1)の特性を有し、好ましくは、(3)および(5)−(8)からなる群から選択される1つ以上、特に全ての特性をさらに有し、より好ましくは(2)および(9)−(12)からなる群から選択される1つ以上、特に全ての特性をさらに有する。いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、上記(2)の特性を有し、好ましくは、(9)−(12)から選択される1つ以上、特に全ての特性をさらに有し、より好ましくは(1)、(3)および(5)−(8)からなる群から選択される1つ以上、特に全ての特性をさらに有する。
いくつかの好ましい実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、野生型IL−2と比較して、高親和性受容体IL−2RαβγへのIL−2の結合によって介在されるインビボ毒性の減少という特性の1つ以上をさらに有する。
いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、改善された薬剤形成特性を有し、例えば、H293T細胞などの哺乳動物細胞で発現される場合、好ましくはFc融合タンパク質で発現される場合、(i)野生型IL−2タンパク質よりも優れた発現量、(ii)野生型IL−2タンパク質よりも優れた安定性、および(iii)より高いタンパク質純度への容易な精製からなる群から選択される1つ以上の特性を有する。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、野生型IL−2と比較して発現レベルの増加を示す。本発明のいくつかの実施形態において、発現の増加は哺乳動物細胞発現系で起こる。発現レベルは、細胞培養上清(好ましくはワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製後の上清)中の組換えIL−2タンパク質の量を定量的または半定量的に分析することを可能にする任意の適切な方法によって決定することができる。例えば、試料中の組換えIL−2タンパク質の量は、ウェスタンブロットまたはELISAによって評価することができる。いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、野生型IL−2と比較して、哺乳動物細胞において少なくとも1.1倍、または少なくとも1.5倍、または少なくとも2倍、3倍、または4倍以上の発現量を増加させる。
いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質−Fc融合体は、タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィー後の精製タンパク質の純度を測定することによって示されるように、野生型IL−2タンパク質融合体よりも良好な安定性を示し、例えば凝集体を形成する傾向が少ない。いくつかの実施形態において、タンパク質純度は、SEC−HPLC技術によって検出される。いくつかの好ましい実施形態において、一次タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィー精製後、本発明のIL−2変異タンパク質産物の純度は、70%以上、または80%以上、または90%以上に達することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、野生型IL−2(例えば、配列番号26に示されるIL−2WT)と比較して、IL−2Rα受容体に対する結合親和力が少なくとも5倍、少なくとも10倍、または少なくとも25倍、特に少なくとも30倍、50倍または100倍以上低下した。好ましい実施形態において、本発明の変異はIL−2受容体αと結合しない。結合親和力は、本発明のIL−2変異タンパク質、例えばFc断片と融合した本発明のIL−2変異タンパク質と、受容体IL−2Rα受容体との平衡解離定数(KD)を、バイオレイヤー干渉法(BLI)技術によって測定することで決定され得る。いくつかの実施形態において、受容体IL−2RαまたはIL−2Rβに対するIL−2変異タンパク質(例えばFc融合体の形態)の一価結合親和力は、BLI技術によって測定される。
いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、野生型IL−2(例えば、配列番号26に示されるIL−2WT)と比較して、IL−2Rβ受容体に対する結合親和力が少なくとも5倍、少なくとも10倍、または少なくとも25倍、特に、少なくとも30倍、50倍、または100倍、より好ましくは、少なくとも150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、または500倍、または550倍以上増強される。結合親和力は、本発明のIL−2変異タンパク質、例えばFc断片と融合した本発明のIL−2変異タンパク質と、受容体IL−2Rβ受容体との平衡解離定数(KD)を、バイオレイヤー干渉法(BLI)技術によって測定することで決定され得る。1つの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質の受容体IL−2Rβ受容体に対する一価結合親和力KD値は、BLI測定(例えば、実施例に記載のBLI測定)においてIL−2−Fc融合タンパク質の形態で10.0E−07M未満であり、例えば8.0E−07M〜1.0E−07M、例えば4.0E−07M、3.0E−07M、2.0E−07M、1.0E−07M、より好ましくは10.0E−08M未満、例えば9.0E−10M未満である。
1つの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、野生型IL−2と比較して、IL−2介在性CD25+細胞活性化および増殖の減少をもたらす。1つの実施形態において、CD25+細胞はCD25+ CD8+ T細胞である。別の実施形態において、CD25+細胞はTreg細胞である。1つの実施形態において、STAT5リン酸化測定試験において、IL−2変異タンパク質がCD25+細胞中でSTAT5リン酸化シグナルを活性化することを検出することにより、IL−2変異タンパク質がCD25+細胞を活性化する能力を同定する。例えば、半最大有効濃度(EC50)は、本出願の実施例に記載されるように、フローサイトメトリーによって細胞中のSTAT5リン酸化を分析することによって決定することができる。
1つの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、野生型IL−2と比較して、IL−2介在性CD25−エフェクター細胞の維持されたかまたは増強された活性化および増殖をもたらす。1つの実施形態において、CD25−細胞はCD8+エフェクターT細胞またはNK細胞である。1つの実施形態において、STAT5リン酸化測定試験において、CD25−細胞におけるSTAT5リン酸化シグナルを活性化するIL−2変異タンパク質のEC50値を検出することによって、CD25−細胞を活性化するIL−2変異タンパク質の能力を同定する。1つの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、STAT5リン酸化アッセイにおいて測定されるように、野生型IL−2タンパク質(例えば、配列番号26のヒトIL−2)と比較して、CD25+細胞を活性化する能力は、少なくとも1倍、例えば2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍増加する。
1つの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、野生型IL−2と比較して、CD25+細胞の優先的活性化に対するIL−2の偏向性を排除または低減する。1つの実施形態において、CD25+細胞はCD25+ CD8+ T細胞である。別の実施形態において、CD25+細胞はTreg細胞である。1つの実施形態において、IL−2変異体がCD25−細胞を活性化する能力は、STAT5リン酸化測定試験において、それぞれCD25−細胞およびCD25+細胞においてSTAT5リン酸化シグナルを活性化するIL−2変異タンパク質のEC50値を検出することによって同定される。例えば、CD25+細胞に対するIL−2変異タンパク質の活性化偏向は、CD25−およびCD25+T細胞上のSTAT5リン酸化シグナルを活性化するEC50値の比を計算することによって決定される。好ましくは、変異タンパク質のCD25+に対する偏向性は、野生型タンパク質と比較して少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍、150倍、または200倍減少する。
本発明の変異タンパク質
グリコシル化変異タンパク質
1つの態様において、本発明は、IL−2およびIL−2Ra結合インターフェースに変異グリコシル化モチーフを含むIL−2変異タンパク質を提供する。
グリコシル化変異タンパク質
1つの態様において、本発明は、IL−2およびIL−2Ra結合インターフェースに変異グリコシル化モチーフを含むIL−2変異タンパク質を提供する。
当該技術分野で知られているように、ポリペプチドは、典型的にはN−連結またはO連結を介してグリコシル化される。N−連結グリコシル化とは、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物部分が結合していることを意味する。トリペプチド配列アスパラギン−X−セリン(N X S)およびアスパラギン−X−トレオニン(N X T)は、N−連結グリコシル化モチーフであり、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である。これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在すると、潜在的なグリコシル化部位が生じる。N連結グリコシル化部位のタンパク質(例えばIL−2)への添加は、1つ以上の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変更することによって好都合に達成され得る。例えば、N−連結グリコシル化部位は、単一アミノ酸のコドンを変更させることによって添加することができる。例えば、N−X−z(zは任意のアミノ酸である)をコードするコドンは、N−X−T(またはN−X−S)をコードするように変更されてもよく、またはy−X−T/Sをコードするコドンは、N−X−T/Sをコードするように変更されてもよい。あるいは、2つのアミノ酸をコードするコドンを同時に変更してN−連結グリコシル化部位を導入してもよい(例えば、y−X−zのコドンを変更してN−X−T/Sをコードしてもよい)。
本明細書において、IL−2タンパク質中に導入された変異に起因して出現するグリコシル化モチーフは、変異グリコシル化モチーフとして記述することができる。例えば、変異グリコシル化モチーフK35N−L36−T37は、35位のリジンがアスパラギンに置換され、36位および37位の残基が変化しないN−連結グリコシル化モチーフである。本発明の好ましい実施形態において、導入される変異グリコシル化モチーフは、N−連結グリコシル化モチーフ、N−X−S/Tであり、ここで、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、例えば、Xは、野生型IL−2において対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸であってもよく、またはその保存的置換残基であってもよい。
いくつかの実施形態において、本発明は、野生型IL−2(好ましくはヒトIL−2、より好ましくは配列番号26の配列を含むIL−2)と比較して、
35N−36X−37T/S、38N−39X−40T/S、41N−42X−43T/S、43N−44X−45T/S、45N−46X−47T/S、62N−63X−64T/S、68N−69X−70T/S、72N−73X−74T/S、74N−75X−76T/Sから選択されるアミノ酸位置に1つ以上のグリコシル化モチーフN−X−S/Tを導入する少なくとも1つの変異を含み、ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは、Xは、野生型IL−2において対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸、またはその保存的置換残基であり、ここで、アミノ酸の位置は配列番号26に従って番号付けされる、IL−2変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、導入されるN連結グリコシル化部位の数は、1つより多く、例えば2つのグリコシル化部位であってもよい。異なるグリコシル化部位は、IL−2に異なる特性を付与することができ、例えば、いくつかのグリコシル化部位は、改善された発現および/または精製特性を付与することができ、いくつかのグリコシル化部位は、IL−2受容体選択性を改善することができる。さらに他の実施形態において、本発明の変異タンパク質は、変異によって導入されたグリコシル化モチーフに加えて、野生型IL−2とは異なる少なくとも1−30個のアミノ酸残基、例えば1−20、1−15、1−10、または1−5個の異なるアミノ酸残基を含んでもよい。これらの異なる残基は、保存的置換であってもよく、IL−2に他の改善された特性を与える他の変異であってもよい。
35N−36X−37T/S、38N−39X−40T/S、41N−42X−43T/S、43N−44X−45T/S、45N−46X−47T/S、62N−63X−64T/S、68N−69X−70T/S、72N−73X−74T/S、74N−75X−76T/Sから選択されるアミノ酸位置に1つ以上のグリコシル化モチーフN−X−S/Tを導入する少なくとも1つの変異を含み、ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは、Xは、野生型IL−2において対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸、またはその保存的置換残基であり、ここで、アミノ酸の位置は配列番号26に従って番号付けされる、IL−2変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、導入されるN連結グリコシル化部位の数は、1つより多く、例えば2つのグリコシル化部位であってもよい。異なるグリコシル化部位は、IL−2に異なる特性を付与することができ、例えば、いくつかのグリコシル化部位は、改善された発現および/または精製特性を付与することができ、いくつかのグリコシル化部位は、IL−2受容体選択性を改善することができる。さらに他の実施形態において、本発明の変異タンパク質は、変異によって導入されたグリコシル化モチーフに加えて、野生型IL−2とは異なる少なくとも1−30個のアミノ酸残基、例えば1−20、1−15、1−10、または1−5個の異なるアミノ酸残基を含んでもよい。これらの異なる残基は、保存的置換であってもよく、IL−2に他の改善された特性を与える他の変異であってもよい。
薬剤形成特性を改善するグリコシル化変異
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、IL−2タンパク質の薬剤形成特性を改善し、特にIL−2タンパク質の発現および/または精製を促進する。
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、IL−2タンパク質の薬剤形成特性を改善し、特にIL−2タンパク質の発現および/または精製を促進する。
1つの実施形態において、前記薬剤形成特性を改善する変異グリコシル化モチーフは、35N−36X−37T/S、38N−39X−40T/S、および74N−75X−76T/Sからなる群から選択される。1つの好ましい実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、(i)K35N−L36−T37、(ii)R38N−M39−L40S、および(iii)Q74N−S75−K76Tからなる群から選択される。1つのより好ましい実施形態において、変異グリコシル化モチーフはK35N−L36−T37である。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、野生型IL−2と比較して、35N−36X−37T/S、38N−39X−40T/S、および74N−75X−76T/Sからなる群から選択される変異グリコシル化モチーフを含むIL−2変異タンパク質を提供し、前記変異タンパク質は、改善された薬剤形成特性を有する。1つの実施形態において、前記変異は、哺乳動物細胞において発現されるとき、好ましくはFc融合タンパク質の形態でIL−2変異タンパク質を発現するとき、変異タンパク質の発現および/または精製を促進し得る。さらに別の実施形態において、前記変異は、IL−2の安定性を促進することができ、例えば、Fc融合タンパク質として発現された場合、野生型IL−2と比較して、生産中に凝集体形成の傾向が低下する。例えば、発現およびワンステップタンパク質A親和性精製後、変異タンパク質は、野生型タンパク質よりも高い純度を有することができる。1つの好ましい実施形態において、野生型IL−2と比較して、前記変異タンパク質は、(i)K35N−L36−T37、(ii)R38N−M39−L40S、(iii)Q74N−S75−K76Tからなる群から選択される変異グリコシル化モチーフを含み、より好ましくは前記変異タンパク質は、変異グリコシル化モチーフK35N−L36−T37を含む。
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、変異K35Nを介してIL−2タンパク質を導入する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号26、29または30のいずれかに記載の野生型IL−2タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも90%の同一性を有する成熟領域を有し、アミノ酸残基T37および変異K35Nを有する、IL−2変異タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、R38N/L40SまたはQ74N/K76Tから選択されるペアとなる変異によってIL−2タンパク質を導入する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号26、29または30のいずれかに記載の野生型IL−2タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも90%の同一性を有する成熟領域を有し、R38N/L40SまたはQ74N/K76Tから選択されるペアとなる変異を有する、IL−2変異タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態において、変異タンパク質は、配列番号31、32および38からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または98%または99%の同一性を有する配列を含む。さらに好ましい実施形態において、前記変異タンパク質は、アミノ酸配列配列番号31、32および38を含む。
IL−2Rα結合を低下させるグリコシル化変異
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、IL−2タンパク質の受容体選択性を改善し、特にIL−2RαへのIL−2の結合を低減させる。
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、IL−2タンパク質の受容体選択性を改善し、特にIL−2RαへのIL−2の結合を低減させる。
1つの実施形態において、IL−2RαへのIL−2の結合を低減させる変異グリコシル化モチーフは、41N−42X−43T/S、43N−44X−45T/S、45N−46X−47T/S、68N−69X−70T/S、72N−73X−74T/Sから選択され、好ましくはグリコシル化モチーフ43N−44X−45T/Sであり、ここで、アミノ酸の位置は配列番号26に従って番号付けされる。1つの好ましい実施形態において、IL−2RαへのIL−2の結合を低減させる変異グリコシル化モチーフは、(i)T41N−F42−K43S、(ii)K43N−F44−Y45T、(iii)Y45N−M46−P47S、(iv)E68N−V69−L70S、(v)L72N−A73−Q74T、より好ましくはK43N−F44−Y45Tからなる群から選択される。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、野生型IL−2と比較して、変異グリコシル化モチーフを含むIL−2変異タンパク質を提供し、前記変異タンパク質が、41N−42X−43T/S、43N−44X−45T/S、45N−46X−47T/S、68N−69X−70T/S、72N−73X−74T/Sからなる群から選択される1つ以上の変異グリコシル化モチーフを含み、好ましくは43N−44X−45T/Sであり、ここで、アミノ酸位置は配列番号26に従って番号付けされ、前記変異タンパク質は野生型IL−2と比較してIL−2Rα結合が低減または排除される。
さらに別の実施形態において、本発明は、野生型IL−2と比較して、変異グリコシル化モチーフを含むIL−2変異タンパク質を提供し、前記変異タンパク質が、(i)T41N−F42−K43S、(ii)K43N−F44−Y45T、(iii)Y45N−M46−P47S、(iv)E68N−V69−L70S、(v)L72N−A73−Q74Tからなる群から選択される1つ以上の変異グリコシル化モチーフを含み、より好ましくは、前記変異タンパク質は、変異グリコシル化モチーフK43N−F44−Y45Tを含む。
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、T41N/K43S、K43N/Y45T、Y45N/P47S、E68N/L70S、およびL72N/Q74Tからなる群から選択されるペアとなる変異によってIL−2タンパク質に導入される。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号26、29または30のいずれかに記載の野生型IL−2タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも85%または90%の同一性を有する成熟領域を有し、T41N/K43S、K43N/Y45T、Y45N/P47S、E68N/L70S、およびL72N/Q74Tからなる群から選択されるペアとなる変異を有し、好ましくはペアとなる変異K43N/Y45Tを有する、IL−2変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、変異タンパク質は、配列番号33、34、35、37、および39から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または98%の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、IL−2変異タンパク質は、IL−2RαへのIL−2の結合を低減する上記の変異グリコシル化モチーフに加えて、(i)35N−36X−37T/S、38N−39X−40T/S、および74N−75X−76T/Sから選択される変異グリコシル化モチーフ、および/または(ii)変異K35Qを含み得る。前記変異タンパク質は、野生型IL−2と比較して、IL−2Rα結合が低減または排除されており、(例えば、Fc融合タンパク質の形態で哺乳動物細胞で発現された場合に)発現および/または精製特性が改善されている。いくつかの好ましい実施形態において、本発明はIL−2変異タンパク質を提供し、配列番号26、29または30のいずれかに記載の野生型IL−2タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも85%または90%の同一性を有する成熟領域を有し、T41N/K43S、K43N/Y45T、Y45N/P47S、E68N/L70S、およびL72N/Q74Tからなる群から選択されるペアとなる変異を有し、K35N、R38N/L40S、Q74N/K76T またはK35Qから選択される変異を有する。いくつかの実施形態において、変異タンパク質は、配列番号45−47から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または98%の同一性を有する配列を含む。
B’C’ループキメラ変異タンパク質および切断変異タンパク質
1つの態様において、本発明は、IL−2のB’C’ループ領域に変異を導入して形成されたB’C’ループキメラIL−2変異タンパク質および切断IL−2変異タンパク質を提供する。IL−2タンパク質は、4つのαヘリックス(A、B、C、D)構造を有する短鎖I型サイトカインファミリーのメンバーである。本明細書において、「B’C’ループ領域」または「B’C’ループ配列」は、互換的に使用され、IL−2タンパク質のBヘリックスとCヘリックスとの間の連結配列を指す。1つの実施形態において、当該連結配列は、配列番号26に従って、IL−2ポリペプチドの位置72の残基および位置84の残基を連結する配列である。配列番号26、29および30の野生型タンパク質において、当該連結配列は、A73−R83の合計11個のアミノ酸を含む。
1つの態様において、本発明は、IL−2のB’C’ループ領域に変異を導入して形成されたB’C’ループキメラIL−2変異タンパク質および切断IL−2変異タンパク質を提供する。IL−2タンパク質は、4つのαヘリックス(A、B、C、D)構造を有する短鎖I型サイトカインファミリーのメンバーである。本明細書において、「B’C’ループ領域」または「B’C’ループ配列」は、互換的に使用され、IL−2タンパク質のBヘリックスとCヘリックスとの間の連結配列を指す。1つの実施形態において、当該連結配列は、配列番号26に従って、IL−2ポリペプチドの位置72の残基および位置84の残基を連結する配列である。配列番号26、29および30の野生型タンパク質において、当該連結配列は、A73−R83の合計11個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、導入された変異は、野生型IL−2(好ましくはヒトIL−2、より好ましくは配列番号26の配列を含むIL−2)と比較して、変異タンパク質が切断された B’C’ループ領域(すなわち、アミノ酸残基aa72とaa84との間の連結配列長の短縮)を含み、好ましくは、前記切断されたループ領域は、10、9、8、7、6または5未満のアミノ酸長、好ましくは7アミノ酸長であり、アミノ酸残基は配列番号26に従って番号付けされる。
いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、B’C’ループキメラ変異タンパク質である。前記変異タンパク質は、野生型IL−2と比較して、aa73〜aa83配列の置換、例えば、他の4ヘリックス短鎖サイトカインファミリーのメンバーからの短B’C’ループ配列の置換を含む。IL−15、IL−4、IL−21などの他の4ヘリックス短鎖サイトカインILファミリーメンバー、または非ヒト種(例えば、マウス)由来のILファミリーメンバーから、結晶構造のsuperposeを介して、野生型IL−2を置換するのに適した短いB’C’ループを同定した。1つの好ましい実施形態において、置換のための配列は、インターロイキンIL−15(特にヒトIL−15)由来のB’C’ループ配列である。好ましくは、野生型IL−2中の残基73−83の配列は、配列SGDASIHに置換される。
いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、B’C’ループ切断変異タンパク質である。前記変異タンパク質は、野生型IL−2と比較して、aa73〜aa83配列の切断、例えばC末端からの1、2、3または4アミノ酸の切断を含む。好ましくは、切断されたループ領域(すなわち、位置72と位置84との間の連結配列)は、配列A(Q/G)S(K/A)N(F/I)Hを有し、好ましくは、切断されたループ領域は、配列AQSKNFHまたはAGSKNFHを有する。
1つの実施形態において、B’C’ループの置換または切断により、B’C’ループの安定性を増加させて、IL−2の安定性および/またはIL−2Rβとの親和力を増加させることができる。したがって、1つの実施形態において、本発明は、野生型IL−2と比較して、増大した安定性および/または増大したIL−2Rβ結合親和力を有するIL−2変異タンパク質を提供し、前記変異タンパク質は、前述のB’C’ループキメラ変異またはB’C’ループ切断変異、特に、位置72と位置84との間に位置する代替ループ配列SGDASIHまたは切断ループ配列AQSKNFHまたはAGSKNFHを含む。
1つの実施形態において、キメラB’C’ループ変異または切断B’C’ループ変異は、IL−2Rβ結合の増加を与えるだけでなく、IL−2タンパク質の発現および/または精製、特に哺乳動物細胞発現系における発現および/または精製を促進し得る。したがって、1つの実施形態において、本発明は、野生型IL−2と比較して、IL−2Rβ結合の増強および/または発現の改善および/または精製特性を有するIL−2変異タンパク質を提供する。前記IL−2変異タンパク質は、前述のB’C’ループキメラ変異またはB’C’ループ切断変異、特に、位置72と位置84との間に位置する代替ループ配列SGDASIHまたは切断ループ配列AQSKNFHまたはAGSKNFHを含む。
いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号26、29または30のいずれかに記載の野生型IL−2タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも85%または90%の同一性を有する成熟領域を有し、アミノ酸位置72と84との間に、SGDASIH、AQSKNFH、AGSKNFH、AQSANFH、およびAQSANOHからなる群から選択される連結配列を含む、IL−2変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、変異タンパク質は、配列番号40〜44、好ましくは配列番号40〜42、より好ましくは配列番号40または41からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または98%の同一性を有する配列を含む。
組み合わせ変異タンパク質
1つの態様において、本発明は、組み合わせ変異を含むIL−2変異タンパク質を提供する。1つの態様において、IL−2およびIL−Rα結合インターフェースに導入されるグリコシル化変異は、互いに組み合わせてもよく、B’C’ループ変異と組み合わせてもよく、好ましくは、本明細書に記載のB’C’ループ変異と組み合わせてもよい。別の実施形態において、本発明のB’C’ループ変異は、IL−2およびIL−Rα結合インターフェースに導入されたグリコシル化変異、好ましくは本明細書に記載のグリコシル化変異と組み合わせることもできる。1つの好ましい実施形態において、B’C’ループ変異をIL−2およびIL−Rα結合インターフェースに導入されたグリコシル化変異と組み合わせることにより、(i)IL−2Rα 結合の低減(または排除)、(ii)IL−2Rα結合の増強、および(iii)発現レベルの改善および精製、からなる群から選択される改善された特性を提供することができる。
1つの態様において、本発明は、組み合わせ変異を含むIL−2変異タンパク質を提供する。1つの態様において、IL−2およびIL−Rα結合インターフェースに導入されるグリコシル化変異は、互いに組み合わせてもよく、B’C’ループ変異と組み合わせてもよく、好ましくは、本明細書に記載のB’C’ループ変異と組み合わせてもよい。別の実施形態において、本発明のB’C’ループ変異は、IL−2およびIL−Rα結合インターフェースに導入されたグリコシル化変異、好ましくは本明細書に記載のグリコシル化変異と組み合わせることもできる。1つの好ましい実施形態において、B’C’ループ変異をIL−2およびIL−Rα結合インターフェースに導入されたグリコシル化変異と組み合わせることにより、(i)IL−2Rα 結合の低減(または排除)、(ii)IL−2Rα結合の増強、および(iii)発現レベルの改善および精製、からなる群から選択される改善された特性を提供することができる。
したがって、1つの実施形態において、本発明は、野生型IL−2(好ましくはヒトIL−2、より好ましくは配列番号26の配列を含むIL−2)と比較して、組み合わせ変異:(i)41N−42X−43T/S、43N−44X−45T/S、45N−46X−47T/S、68N−69X−70T/S、72N−73X−74T/Sからなる群から選択される変異グリコシル化モチーフ、ならびに(ii)アミノ酸位置aa72〜aa84の間にある、SGDASIHおよびA(Q/G)S(K/A)N(F/I)Hから選択される短縮B’C’ループ領域配列を含み、ここで、アミノ酸位置は配列番号26に従って番号付けされる、IL−2変異タンパク質を提供する。
いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号26、29または30のいずれかに記載の野生型IL−2タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも85%または90%の同一性を有する成熟領域を有し、アミノ酸位置72と84との間に、SGDASIH、AQSKNFH、AGSKNFH、AQSANFH、およびAQSANOHからなる群から選択される連結配列を含み、T41N/K43S、K43N/Y45T、Y45N/P47S、E68N/L70S、およびL72N/Q74Tからなる群から選択されるペアとなる変異を有する、IL−2変異タンパク質を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、、配列番号26、29または30のいずれかに記載の野生型IL−2タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも85%または90%の同一性を有する成熟領域を有し、アミノ酸位置72と84との間に、SGDASIH、AQSKNFH、またはAGSKNFHからなる群から選択される連結配列を含み、K43N/Y45Tというペアとなる変異を有する、IL−2変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、変異タンパク質は、配列番号48、49または50、好ましくは配列番号48または49から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも 90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または98%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、前記変異タンパク質は、配列番号48、49または50からなる。
いくつかの実施形態において、組み合わせ変異は、CD25+T細胞におけるp−STATA5シグナル伝達を優先的に刺激するIL−2の偏向を減少させ、CD25−T細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力を増強させる。したがって、1つの実施形態において、本発明は、組み合わせ変異:
(i)アミノ酸位置43〜45の変異グリコシル化モチーフK43N−F44−Y45Tとアミノ酸位置aa72〜aa84の間の置換配列SGDASIH、または
(ii)アミノ酸位置43〜45の変異グリコシル化モチーフK43N−F44−Y45Tとアミノ酸位置aa72〜aa84の間の切断配列AQSKNFHを含み、
前記変異タンパク質は、野生型IL−2と比較してCD25+ T細胞におけるp−STATA5シグナル伝達を優先的に刺激する偏向性が低減され、CD25− T細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力が増強される。好ましくは、前記変異タンパク質は、配列番号48または49の配列、またはそれと少なくとも95%、96%、またはそれ以上の同一性を有する配列を含む。より好ましくは、前記変異タンパク質は、配列番号48または49の配列からなる。
(i)アミノ酸位置43〜45の変異グリコシル化モチーフK43N−F44−Y45Tとアミノ酸位置aa72〜aa84の間の置換配列SGDASIH、または
(ii)アミノ酸位置43〜45の変異グリコシル化モチーフK43N−F44−Y45Tとアミノ酸位置aa72〜aa84の間の切断配列AQSKNFHを含み、
前記変異タンパク質は、野生型IL−2と比較してCD25+ T細胞におけるp−STATA5シグナル伝達を優先的に刺激する偏向性が低減され、CD25− T細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力が増強される。好ましくは、前記変異タンパク質は、配列番号48または49の配列、またはそれと少なくとも95%、96%、またはそれ以上の同一性を有する配列を含む。より好ましくは、前記変異タンパク質は、配列番号48または49の配列からなる。
その他の変異
上記の領域および位置における変異に加えて、本発明のIL−2変異タンパク質は、それが本発明のIL−2変異タンパク質の上記の1つ以上の有益な特性を保持する限り、他の領域または位置に1つ以上の変異を有してもよい。例えば、本発明のIL−2変異タンパク質は、位置125での置換、例えばC125S、C125A、C125T、またはC125Vを使用して、発現または均質性または安定性の改善などのさらなる利点を提供することができる(例えば、米国特許第4,518,584号参照)。当業者は、本発明のIL−2変異タンパク質に組み込むことができる追加の変異を決定する方法を知っている。
上記の領域および位置における変異に加えて、本発明のIL−2変異タンパク質は、それが本発明のIL−2変異タンパク質の上記の1つ以上の有益な特性を保持する限り、他の領域または位置に1つ以上の変異を有してもよい。例えば、本発明のIL−2変異タンパク質は、位置125での置換、例えばC125S、C125A、C125T、またはC125Vを使用して、発現または均質性または安定性の改善などのさらなる利点を提供することができる(例えば、米国特許第4,518,584号参照)。当業者は、本発明のIL−2変異タンパク質に組み込むことができる追加の変異を決定する方法を知っている。
IL−2変異タンパク質と野生型タンパク質との間の配列の相違は、配列同一性によって、または両者の間の異なるアミノ酸の数によって表すことができる。1つの実施形態において、IL−2変異タンパク質と野生型タンパク質との間に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%の同一性、好ましくは90%以上の同一性、好ましくは95%であるが、好ましくは97%以下、より好ましくは96%以下の同一性を有する。別の実施形態において、IL−2変異タンパク質と野生型タンパク質との間には、本発明の上記グリコシル化変異またはB’C’ループ変異またはそれらの組み合わせ変異に加えて、15個以下、例えば1−10個、または1−5個の変異を有してもよい。1つの実施形態において、残りの変異は保存的置換であってもよい。
2.融合タンパク質および免疫複合体
本発明はまた、本発明のIL−2変異タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。1つの好ましい実施形態において、本発明のIL−変異タンパク質は、改善された薬物動態特性を付与することができる別のポリペプチド、例えばアルブミン、より好ましくは抗体Fc断片と融合される。1つの実施形態において、Fc断片は、エフェクター機能を低減または排除する変異、例えば、Fcγ受容体に対する結合を低下させるL234A/L235A変異またはL234A/L235E/G237Aを含む。好ましくは、Fcを含む融合タンパク質は、増加した血清半減期を有する。1つの好ましい実施形態において、Fcを含む融合タンパク質は、Fc領域によって介在されるエフェクター機能、例えばADCCまたはADCPまたはCDCエフェクター機能の低減または排除を同時に有する。
本発明はまた、本発明のIL−2変異タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。1つの好ましい実施形態において、本発明のIL−変異タンパク質は、改善された薬物動態特性を付与することができる別のポリペプチド、例えばアルブミン、より好ましくは抗体Fc断片と融合される。1つの実施形態において、Fc断片は、エフェクター機能を低減または排除する変異、例えば、Fcγ受容体に対する結合を低下させるL234A/L235A変異またはL234A/L235E/G237Aを含む。好ましくは、Fcを含む融合タンパク質は、増加した血清半減期を有する。1つの好ましい実施形態において、Fcを含む融合タンパク質は、Fc領域によって介在されるエフェクター機能、例えばADCCまたはADCPまたはCDCエフェクター機能の低減または排除を同時に有する。
1つの実施形態において、本発明はまた、Fc断片がADCCなどのエフェクター機能を含むIL−2変異タンパク質−Fc融合タンパク質を提供する。文献に報告されているように(Rodrigo Vazquez−Lombardi etal.、上記引用)、野生型IL−2は、Fcとの融合によって、Fc−介在性(特にFcγRへの結合によって仲介される)免疫エフェクター機能によってTreg細胞を枯渇させることができ、腫瘍に対する治療が改善する。したがって、改善された発現および/または精製などの生産特性を有する本発明のIL−2変異タンパク質を、免疫エフェクター機能を保持するFc断片と融合させることも、本発明の考察に含まれる。1つの実施形態において、前記融合タンパク質は、変異K35NまたはK35Q、またはペアとなる変異R38N/L40SまたはQ74N/K76Tを含む。他の実施形態において、前記融合タンパク質は、アミノ酸位置aa72〜aa84の間の代替配列SGDASIHまたは切断配列A(Q/G)S(K/A)N(F/I)Hを含む。1つの実施形態において、前記融合タンパク質は、アミノ酸配列配列番号7、8、14、20−22に対して90%−99%以上の同一性を有するものを含む。別の実施形態において、前記融合タンパク質は、アミノ酸配列配列番号12に対して0−10または0−5以下のアミノ酸変異を含む。
いくつかの実施形態において、IL−2変異タンパク質は、リンカーによってFc領域と融合される。いくつかの実施形態において、CD25−T細胞に対するFc融合タンパク質の活性化を増強するために、リンカーを選択することができる。1つの実施形態において、リンカーはGSGSであり、より好ましくは2x(G4S)である。
いくつかの実施形態において、Fc融合タンパク質は、配列番号3−13および16−25からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも95%、または少なくとも96%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、Fc融合タンパク質は、配列番号3−13および16−25の配列からなる。
本発明はまた、本発明のIL−2変異タンパク質および抗原結合分子を含む免疫複合体を提供する。好ましくは、抗原結合分子は、免疫グロブリン分子、特にIgG分子、または抗体もしくは抗体断片、特にFab分子およびscFv分子である。いくつかの実施形態において、前記抗原結合分子は、腫瘍細胞上または腫瘍環境中に存在する抗原、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、テネイシンCのA1ドメイン(TNC A1)、テネイシンCのA2ドメイン(TNC A2)、フィブロネクチンの外部ドメインB(Extra Domain B、EDB)、癌胎児抗原(CEA)、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)からなる群から選択される抗原と特異的に結合する。したがって、本発明の免疫複合体は、対象への投与後に腫瘍細胞または腫瘍環境を標的とすることができ、さらなる治療上の利点、例えば、より低い用量での治療の可能性およびそれによる副作用の低減、抗腫瘍効果の増強などを提供する。
本発明の融合タンパク質および免疫複合体において、本発明のIL−2変異タンパク質は、別の分子または抗原結合分子に直接またはリンカーを介して結合することができ、いくつかの実施形態において、タンパク質加水分解切断部位が両者の間に含まれる。
3.ポリヌクレオチド、ベクターと宿主
本発明は、上記IL−2変異タンパク質または融合体または複合体のいずれかをコードする核酸を提供する。本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知の方法を用いて、新規固相DNA合成、または野生型IL−2をコードする既存の配列のPCR変異誘発によって生成することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸は、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含み、本発明の変異タンパク質をコードするセグメントに作動可能に連結されて、本発明の変異タンパク質の分泌発現を誘導することができる。
本発明は、上記IL−2変異タンパク質または融合体または複合体のいずれかをコードする核酸を提供する。本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知の方法を用いて、新規固相DNA合成、または野生型IL−2をコードする既存の配列のPCR変異誘発によって生成することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸は、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含み、本発明の変異タンパク質をコードするセグメントに作動可能に連結されて、本発明の変異タンパク質の分泌発現を誘導することができる。
本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターを提供する。1つの実施形態において、ベクターは発現ベクターで、例えば、真核発現ベクターである。ベクターの非限定的な例は、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体(YAC)を含む。好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターはpYDO_017発現ベクターである。
本発明はまた、前記核酸または前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。変異IL−2タンパク質または融合体または免疫複合体の発現を複製および支持するのに適した宿主細胞は、当該技術分野において周知である。このような細胞は、特定の発現ベクターでトランスフェクションまたは形質導入することができ、しかもベクターを含む多くの細胞を培養して大型の発酵槽に接種して、臨床用として十分な量のIL−2変異体または融合体または免疫複合体が得られる。1つの実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞(例えば、CHO細胞もしくは293細胞)から選択される。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化を必要としない場合、細菌中で生成することができる。発現後、可溶性画分においてポリペプチドを細菌細胞のペースト状物から分離して、さらに精製することができる。原核生物の他、糸状菌または酵母などのような真核微生物は、ポリペプチドコーディングベクターのための適切なクローンまたは発現の宿主であり、グリコシル化経路が既に「ヒト化」される真菌と酵母菌株を含み、これは、一部または完全のヒトグリコシル化モードを有するポリペプチドの生成を引き起こす。Gerngross,NatBiotech22,1409−1414(2004)およびLi etal.,NatBiotech24,210−215(2006)が参照される。有用の哺乳動物宿主細胞系の実例は、SV40形質転換のサル腎臓CV1系(COS−7)、ヒト胎児腎臓系(例えばGraham etal.,JGenVirol36,59(1977)に説明した293または293T細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスセルトリ(sertoli)細胞(例えばMather,BiolReprod23,243−251(1980)に説明したTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76)、ヒト子宮頸がん細胞(HELA)、犬腎臓細胞(MDCK)、buffaloラット肝細胞(BRL 3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝細胞(HepG2)、マウス乳房腫瘍(MMT060562)、TRI細胞(例えばMather etal.,AnnalsN.Y.AcadSci383,44−68(1982)に説明)、MRC 5細胞、およびFS4細胞である。使用可能な他の哺乳動物宿主細胞株は、dhfr−CHO細胞(Urlaub etal.,ProcNatlAcadSciUSA77,4216(1980))などのチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、YO、NS0、P3X63およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。1つの実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚腎(HEK)細胞、またはリンパ球(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)などの哺乳動物細胞である。
4.調製方法
さらに別の態様において、本発明は、本発明のIL−2変異タンパク質または融合体または複合体を調製する方法を提供し、前記方法は、IL−2変異タンパク質または融合体または複合体の発現に適した条件下で、前記タンパク質または融合体または複合体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、場合により宿主細胞(または宿主細胞培地)から前記タンパク質または融合体または複合体を回収することとを含む。
さらに別の態様において、本発明は、本発明のIL−2変異タンパク質または融合体または複合体を調製する方法を提供し、前記方法は、IL−2変異タンパク質または融合体または複合体の発現に適した条件下で、前記タンパク質または融合体または複合体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、場合により宿主細胞(または宿主細胞培地)から前記タンパク質または融合体または複合体を回収することとを含む。
5.測定手法
本分野において既知の様々な測定手法を利用して、本発明のIL−2変異タンパク質に対して同定、スクリーニング、またはその物理的/化学的特性および/または生理活性の特性評価を行うことができる。
本分野において既知の様々な測定手法を利用して、本発明のIL−2変異タンパク質に対して同定、スクリーニング、またはその物理的/化学的特性および/または生理活性の特性評価を行うことができる。
1つの態様において、本発明のIL−2変異タンパク質に対してIL−2受容体への結合活性を測定することができる。例えば、ELISA、Westernブロットなどのような本分野において既知の方法、または本出願の実施例に開示されている例示的な方法を利用して、ヒトIL−2Rαまたはβタンパク質との結合を測定することができる。例えば、細胞表面上で変異タンパク質を発現するようにトランスフェクトされた細胞、例えば酵母ディスプレイ細胞を、標識された(例えばビオチン標識された)IL−2Rαまたはβタンパク質と反応させるフローサイトメトリーを用いて測定することができる。あるいは、結合動力学(例えば、KD値)を含む変異タンパク質の受容体への結合は、組換え変異タンパク質−Fc融合体を使用してバイオレイヤー干渉法(BLI)測定手法において測定することができる。いくつかの実施形態において、例えば実施例に記載のBLI測定手法を使用する。
さらに別の態様において、受容体結合の下流で起こるシグナル伝達および/または免疫賦活効果を測定することによって、IL−2変異タンパク質がIL−2受容体と結合する能力を間接的に測定することができる。
したがって、いくつかの実施形態において、生物学的活性を有する変異IL−2タンパク質を同定するための測定手法をさらに提供する。生物学的活性は、例えば、IL−2受容体を有するTおよび/またはNK細胞および/またはTreg細胞の増殖を誘導する能力、IL−2受容体を有するTおよび/またはNK細胞および/またはTreg細胞におけるIL−2シグナル伝達を誘導する能力、T細胞におけるアポトーシスを誘導する能力の低下、腫瘍の退縮の誘導および/または生存の改善、ならびに血管透過性の低下などのインビボ毒性特性の低下を含む。本発明は、インビボおよび/またはインビトロにおいて、かかる生物学的活性を有する変異IL−2タンパク質も提供する。
IL−2の生物学的活性を決定するために、当技術分野で公知の様な方法を使用することができる。例えば、本発明のIL−2変異タンパク質がNK細胞のIFN−γ産生を刺激する能力を試験するための適切な測定手法は、培養されたNK細胞を本発明の変異IL−2タンパク質または融合または免疫複合体とインキュベートし、その後、培地中のIFN−γ濃度をELISAにより測定することを含む。IL−2シグナル伝達は、いくつかのシグナル伝達経路を誘導し、JAK(Janusキナーゼ)およびSTAT(シグナル伝達物質および転写活性化因子)シグナル伝達分子に関与する。
IL−2と受容体βおよびγサブユニットとの相互作用は、受容体ならびにJAK1およびJAK3(βおよびγサブユニットとそれぞれ結合する)のリン酸化をもたらす。次に、STAT5はリン酸化受容体と結合し、それ自体が非常に重要なチロシン残基上でリン酸化される。これは、標的遺伝子の転写を促進する、受容体解離、STAT5二量体化、およびSTAT5二量体から核へのSTAT5のシフトをもたらす。したがって、変異体IL−2ポリペプチドがIL−2受容体を介してシグナル伝達を誘導する能力は、例えばSTAT5のリン酸化を測定することによって評価することができる。この方法の詳細は、実施例に開示されている。例えば、PBMCを本発明の変異体IL−2ポリペプチドまたは融合体または免疫複合体で処理し、リン酸化STAT5のレベルをフローサイトメトリーによって決定することができる。
さらに、血液から単離されたT細胞またはNK細胞を本発明の変異体IL−2ポリペプチドまたは免疫複合体とインキュベートし、次いで処理された細胞の溶解物中のATP含量を測定することにより、IL−2の増殖に対するT細胞またはNK細胞応答を測定する。処理前に、T細胞を植物レクチン(PHA−M)で予備刺激することができる。この測定手法は、生存細胞数の高感度定量を可能にし、多数の適切な代替測定手法(例えば、[3H]−チミジン取り込み測定手法、細胞滴定GloATP測定手法、AlamarBlue測定手法、WST−1測定手法、MTT測定手法)も当技術分野で知られている。
さらに、腫瘍成長および生存に対する変異IL−2の効果は、当技術分野で公知の様々な動物腫瘍モデルにおいて評価することができる。例えば、ヒト癌細胞株の異種移植片を免疫不全マウスに移植し、本発明の変異体IL−2ポリペプチドまたは融合体または免疫複合体で処理することができる。死亡率、生命期観察(行動、体重、体温などの有害作用の可視症状)、ならびに臨床病理学および解剖病理学(血液化学測定および/または組織病理学分析など)に基づいて、本発明の変異体IL−2ポリペプチド、融合および免疫複合体のインビボでの毒性を測定することができる。例えば、IL−2処理によって誘発された血管透過性は、血管透過性前処理動物モデルにおいて、血管滲出レポータ分子を用いて検査することができる。好ましくは、血管滲出レポータ分子は、前処理のためのIL−2野生型形態の透過性を明らかにするのに十分な大きさである。
さらに、本発明のIL−2グリコシル化変異タンパク質について、グリコシル化の存在、非存在、または程度は、当業者に知られている任意の方法によって決定することができ、分子量(MW)オフセットの半定性的測定、例えばウェスタンブロットまたはクマシー染色SDS−PAGEゲルからの観察を含むことができ、定量的測定は、質量分析計技術の使用およびアスパラギン連結グリコシル化の付加に対応するMWオフセットの観察、またはペプチド−N−グリシングリチルリナーゼF (PNGase−F;SigmaAldrich,St.Louis,MO)などの酵素によるアスパラギン連結グリコシル化の除去に伴う質量オフセットの観察を含むことができる。
6.スクリーニング方法
さらに別の態様において、本発明は、改善された特性を有するIL−2変異タンパク質を得るための方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、改善された特性を有するIL−2変異タンパク質を得るための方法を提供する。
1つの実施形態において、本発明は、
−IL−2とIL−2Raとの結合インターフェースにおいて、1つ以上(例えば、2つまたは3つ)のグリコシル化モチーフN−X−S/T(Xは任意のアミノ酸であってもよいが、P(プロリン)を除く) を人為的に操作し、好ましくはIL−2のaa35−40、aa41−47、aa62−64、aa68−74、aa74−76から選択される領域にグリコシル化モチーフを導入することと、
−改変されたIL−2変異タンパク質を、例えば、Fc融合体(例えば、FcLALA融合体)の形態で、哺乳動物細胞(例えば、HEK293またはCHO細胞)において発現させることと、を含む、IL−2変異タンパク質を得るための方法を提供する。グリコシル化モチーフを導入する部位の設計のために、N−グリコシル化予測ツールを使用して、例えば、標準的なN−x−T/Sグリコシル化部位(Nがアスパラギンであり、xがプロリンを除く任意のアミノ酸である)を形成するように変異可能な残基を同定することによって、潜在的N−連結グリコシル化を促進するように変異可能な部位を選択することができる。さらに、構造ベースの方法を用いて、IL−2におけるIL−2Rαからの距離が3.6Åであり、側鎖が溶液に曝されているアミノ酸を、アスパラギンへの変異の候補アミノ酸として同定することができる。いくつかの好ましい実施形態において、導入されたグリコシル化モチーフ変異は、K35N−L36−T37、R38N−M39−L40S、T41N−F42−K43S、K43N−F44−Y45T、Y45N−M46−P47S、E62N−L63−K64T、E68N−V69−L70S、L72N−A73−Q74T、Q74N−S75−K76Tからなる群から選択される。
−IL−2とIL−2Raとの結合インターフェースにおいて、1つ以上(例えば、2つまたは3つ)のグリコシル化モチーフN−X−S/T(Xは任意のアミノ酸であってもよいが、P(プロリン)を除く) を人為的に操作し、好ましくはIL−2のaa35−40、aa41−47、aa62−64、aa68−74、aa74−76から選択される領域にグリコシル化モチーフを導入することと、
−改変されたIL−2変異タンパク質を、例えば、Fc融合体(例えば、FcLALA融合体)の形態で、哺乳動物細胞(例えば、HEK293またはCHO細胞)において発現させることと、を含む、IL−2変異タンパク質を得るための方法を提供する。グリコシル化モチーフを導入する部位の設計のために、N−グリコシル化予測ツールを使用して、例えば、標準的なN−x−T/Sグリコシル化部位(Nがアスパラギンであり、xがプロリンを除く任意のアミノ酸である)を形成するように変異可能な残基を同定することによって、潜在的N−連結グリコシル化を促進するように変異可能な部位を選択することができる。さらに、構造ベースの方法を用いて、IL−2におけるIL−2Rαからの距離が3.6Åであり、側鎖が溶液に曝されているアミノ酸を、アスパラギンへの変異の候補アミノ酸として同定することができる。いくつかの好ましい実施形態において、導入されたグリコシル化モチーフ変異は、K35N−L36−T37、R38N−M39−L40S、T41N−F42−K43S、K43N−F44−Y45T、Y45N−M46−P47S、E62N−L63−K64T、E68N−V69−L70S、L72N−A73−Q74T、Q74N−S75−K76Tからなる群から選択される。
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、IL−2変異タンパク質を得るための方法を提供する。
−IL−2のB’C’loopループ領域(aa73−83)に欠失および/または置換を導入して短縮ループ領域を形成し、好ましくはIL15のB’C’loopループ配列のような他の4ヘリックス短鎖サイトカインファミリーメンバーに置換してB’C’loopキメラを形成し、またはIL−2のB’C’loopを切断してB’C’loop切断体を形成し、好ましくは短縮ループ領域は10、9、8未満であり、好ましくは7アミノ酸長に等しく、好ましくはループ領域のC末端から1、2、3または4アミノ酸を切断し、好ましくは短縮ループ領域は配列A(Q/G)S(K/A)N(F/I)H、またはSGDASIHを有すること、
−改変されたIL−2変異タンパク質を、例えば、Fc融合体(例えば、FcLALA融合体)の形態で、哺乳動物細胞(例えば、HEK293またはCHO細胞)において発現させることと、を含む、IL−2変異タンパク質を得るための方法を提供する。
−IL−2のB’C’loopループ領域(aa73−83)に欠失および/または置換を導入して短縮ループ領域を形成し、好ましくはIL15のB’C’loopループ配列のような他の4ヘリックス短鎖サイトカインファミリーメンバーに置換してB’C’loopキメラを形成し、またはIL−2のB’C’loopを切断してB’C’loop切断体を形成し、好ましくは短縮ループ領域は10、9、8未満であり、好ましくは7アミノ酸長に等しく、好ましくはループ領域のC末端から1、2、3または4アミノ酸を切断し、好ましくは短縮ループ領域は配列A(Q/G)S(K/A)N(F/I)H、またはSGDASIHを有すること、
−改変されたIL−2変異タンパク質を、例えば、Fc融合体(例えば、FcLALA融合体)の形態で、哺乳動物細胞(例えば、HEK293またはCHO細胞)において発現させることと、を含む、IL−2変異タンパク質を得るための方法を提供する。
1つの実施形態において、本方法は、タンパク質発現および精製後に、薬物性(例えば、発現量および/または製品安定性および/または均質性、例えば、ワンステップFcアフィニティークロマトグラフィー純度)が改善されたIL−2変異タンパク質を同定することをさらに含む。1つの好ましい実施形態において、IL−2の領域aa35−40またはaa74−76にグリコシル化モチーフ変異を導入して、変異タンパク質の薬剤形成性を改善する。好ましくは、導入されたグリコシル化モチーフ変異は、K35N−L36−T37、R38N−M39−L40S、およびQ74N−S75−K76Tからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、変異タンパク質の薬剤形成性は、B’C’loopループをIL15のような短縮ループのループ配列に置換することによって、またはB’C’loopループを切断することによって改善される。好ましくは、切断されたループ配列は、A(Q/G)S(K/A)NFH、またはSGDASIHから選択される。さらに好ましい実施形態において、前記方法は、変異タンパク質の薬剤形成性を改善するために、グリコシル化変異に加えて他の部位変異、例えばK35Qを導入することを含む。当業者には明らかなように、これらの変異を他の改良された特性を付与する変異と組み合わせて、複数の改良された特性を有するIL−2変異タンパク質を得ることができる。
1つの実施形態において、前記方法は、野生型IL−2と比較してIL−2Ra結合能が低減された(好ましくは排除された)IL−2変異タンパク質を同定することをさらに含む。1つの実施形態において、IL−2Raに対するIL−2変異タンパク質の結合能は、例えばバイオレイヤー干渉法技術によって、親和力KD値を測定することによって決定される。さらに別の実施形態において、結合能は、CD25+ T細胞に対するIL−2変異タンパク質の活性化の有効性を決定することによって決定される。1つの実施形態において、IL−2変異タンパク質は、例えば細胞内のp−STAT5シグナルの活性化を測定することによって決定されるように、野生型IL−2と比較してCD25 + T細胞活性化の低下した有効性を示す。好ましくは、変異は、IL−2の領域、aa41−47またはaa68−70またはaa72−74に導入されて、潜在的なN連結グリコシル化部位を形成し、次いで、変異がIL−2RαへのIL−2の結合の低減または排除をもたらすかどうかを検出する。好ましくは、導入されたグリコシル化モチーフ変異は、T41N−F42−K43S、K43N−F44−Y45T、Y45N−M46−P47S、E68N−V69−L70S、L72N−A73−Q74Tからなる群から選択される。当業者には明らかなように、これらのグリコシル化変異を他の修飾特性を付与する変異と組み合わせて、複数の修飾特性を有するIL−2変異タンパク質を得ることができる。
1つの実施形態において、前記方法は、野生型IL−2に対してIL−2Rβ結合が増強されたIL−2変異タンパク質を同定することをさらに含む。1つの実施形態において、IL−2変異タンパク質のIL−2Rβへの結合能は、例えばバイオレイヤー干渉法によって、親和力KD値を測定することによって決定される。さらに別の実施形態において、結合能は、CD25− T細胞に対するIL−2変異タンパク質の活性化の有効性を決定することによって決定される。1つの実施形態において、IL−2変異タンパク質は、例えば細胞内のp−STAT5シグナルの活性化を測定することによって決定されるように、野生型IL−2と比較してCD25− T細胞活性化の増強された有効性を示す。1つの好ましい実施形態において、IL−2Rβへの結合を増強するために、B’C’loopループをIL15のような短縮ループのループ配列に置換するか、または切断されたB’C’loopループに置換する。好ましくは、切断されたループ配列は、A(Q/G)S(K/A)NFH、またはSGDASIHから選択される。当業者には明らかなように、これらのグリコシル化変異を他の修飾特性を付与する変異と組み合わせて、複数の修飾特性を有するIL−2変異タンパク質を得ることができる。
さらに別の実施形態において、前記方法は、上記の薬物形成を改善する変異、IL2Ra結合を減少させる変異、および/またはIL2Rβ結合を増強する変異、および/または複数の修飾された特性を有するIL−2変異タンパク質を得るために他の修飾された特性を付与する変異の組み合わせを導入することを含む。1つの好ましい実施形態において、グリコシル化変異、例えば領域aa41−47およびaa68−74、ならびにB’C’loopループ領域の長さを短縮する切断および/または置換変異を組み合わせて導入する。1つの好ましい実施形態において、前記方法は、野生型IL−2に対して低減したIL−2Ra結合および増強したIL−2Rβ結合を示すIL−2変異タンパク質を同定することと、場合により改善された薬物形成(例えば、改善された発現および/または純度、および/または製品安定性および/または均質性)も有するIL−2変異タンパク質を同定することとを含む。
いくつかの実施形態において、変異テンプレートとして使用される親野生型IL−2タンパク質は、好ましくは、配列番号26に対して少なくとも85%、または少なくとも90%または95%の同一性を有し、より好ましくは、ヒト由来IL−2タンパク質である。
7.医薬組成物と薬物製剤
本発明はまた、IL−2変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を含む組成物(医薬組成物または薬物製剤を含む)、およびIL−2変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を含む。これらの組成物はまた、本分野で既知の薬学的に許容可能な担体、緩衝剤を含む薬用賦形剤などの適切な医薬品添加物を必要に応じて含んでもよい。
本発明はまた、IL−2変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を含む組成物(医薬組成物または薬物製剤を含む)、およびIL−2変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を含む。これらの組成物はまた、本分野で既知の薬学的に許容可能な担体、緩衝剤を含む薬用賦形剤などの適切な医薬品添加物を必要に応じて含んでもよい。
本発明に適する薬学的に許容可能な担体は、石油、動物もしくは植物に由来するまたは合成された、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油など、水、油などの滅菌液体であってもよい。医薬組成物を静脉内に投与する場合、水はベクターとして好ましい。さらに、生理塩水溶液、水性デキストロースとグリセリン溶液を液体ベクターとして、特に注射溶液に用いることができる。適切な薬用賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、ジオール、水、エタノールなどを含む。賦形剤の使用およびその用途に関しては、「Handbook of PharmaceuticalExcipients」,5th editon,R.C.Rowe,P.J.Seskey、S.C.Owen,PharmaceuticalPress,London,Chicagoが参照される。必要があれば、前記組成物は湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤をさらに少量に含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、持続性放出製剤などの形態を採用できる。経口製剤は、薬用マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンなどの標準的なベクターを含んでもよい。
所望の純度を有する本発明のIL−2変異タンパク質、融合体または免疫複合体を任意の1つまたは複数の医薬品添加物(Remington′ s Pharmaceutical Sciences,16th edition,edited by Osol,A.(1980))と混合することによって、本発明を含む薬物製剤を調製し、好ましくは凍結乾燥製剤または水溶液の形式で調製する。例示的な凍結乾燥抗体製剤に関する説明は、米国特許第6,267,958号が参照される。水性抗体製剤に関しては、米国特許第6,171,586号、世界特許WO2006/044908が参照され、後者の製剤はヒスチジン−アセテート緩衝剤を含む。また、持続性放出製剤を調製できる。持続性放出製剤の適切な例は、タンパク質を含有する疎水性固体ポリマーによる半透性マトリックスを含み、前記マトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルなどのように一定の形態を有する。
本発明の医薬組成物または製剤は、1種以上の他の活性成分をさらに含んでもよく、前記活性成分は、特定の適応症の治療に必要であり、好ましくは互いにマイナスの影響を与えない活性的に相補な活性成分を含む。例えば、好ましくは、化学療法剤、PD−1軸結合拮抗剤(例えば、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体または抗PD−L2抗体)などの他の抗がん活性成分をさらに提供する。前記活性成分は、目的用途において有効な量で適切に組み合わせた形で存在する。
したがって、1つの実施形態において、組成物は、第2の治療剤をさらに含む。例えば、第2の治療剤は免疫チェックポイント阻害剤であってもよい。例えば、第2の治療剤は、例えば、抗−CTLA−4抗体、抗CD47抗体、抗−PD−1抗体、抗−PD−L1抗体、抗−CD40抗体、抗−OX40 (CD134、TNFRSF4、ACT35および/またはTXGP1Lとも呼ばれる)抗体、抗−LAG−3抗体、抗−CD73抗体、抗−CD137抗体、抗−CD27抗体、抗−CSF−1R抗体、TLRアゴニストまたはIDOまたはTGFβの小分子アンタゴニストを含むが、これらに限定されない1つ以上から選択することができる。好ましくは、第2の治療剤は、PD−1拮抗剤であり、特に抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、抗LAG−3、抗CD47である。免疫治療薬物に加えて、第2の治療剤は、他の放射線療法または化学療法薬物であってもよい。
8.組み合わせ製品
1つの態様において、本発明は、本発明の変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体、および1種以上の他の治療剤(例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など)を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法において使用できる。
1つの態様において、本発明は、本発明の変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体、および1種以上の他の治療剤(例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など)を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法において使用できる。
いくつかの実施形態において、本発明は、組み合わせ製品を提供し、ここで、前記他の治療剤が、例えば、免疫応答を刺激して対象の免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御するのに有効な、抗体などの治療剤である。いくつかの実施形態において、他の抗体は、例えば、抗PD−1抗体または抗PD−L1抗体または抗PD−L2抗体または抗−LAG−3抗体または抗−CTLA−4抗体または抗TIM−3抗体である。
いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品は、腫瘍の予防または治療に用いられる。いくつかの実施形態において、腫瘍は、がん、例えば、胃がん、直腸がん、結腸がん、結腸直腸がんなどの胃腸管がん、または悪性黒色腫などの皮膚がん、または腎細胞癌、膀胱癌、非小細胞肺癌などである。いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品は、例えば細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、原生動物感染などの感染の予防または治療に用いられる。
9.治療方法と使用
本出願では、用語「個体」または「対象」は、互いに切り替えて用いることができ、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜(例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌとウマ)、霊長類(例えば、ヒトとサルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、げっ歯類(例えば、マウスとラット)を含むが、これらに限定されない。特に、対象はヒトである。
本出願では、用語「個体」または「対象」は、互いに切り替えて用いることができ、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜(例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌとウマ)、霊長類(例えば、ヒトとサルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、げっ歯類(例えば、マウスとラット)を含むが、これらに限定されない。特に、対象はヒトである。
本明細書では、用語「治療」は、治療を受けている個体における疾病の天然過程を変化させようとする臨床介入を指す。所望の治療效果は、疾病の出現または再発を防止すること、症状を軽減すること、疾病の如何なる直接的または間接的病理学結果を減少すること、転移を防止すること、病状進展速度を低減すること、疾病の状態を改善または緩和させること、および、予後を緩和または改善させることを含むが、これらに限定されない。
1つの態様において、本発明は、対象の免疫系を刺激する方法であって、本発明のIL−2変異タンパク質または融合体または免疫複合体を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。本発明のIL−2変異タンパク質は、CD25− CD122+エフェクター細胞(細胞傷害性CD8+T細胞およびNK細胞)に対して高い活性および選択性を有し、CD25+ Treg細胞に対する刺激を低減する。したがって、本発明のIL−2変異タンパク質は、対象の免疫系を刺激するために低用量で使用することができる。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、対象における身体の免疫応答を増強する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の任意のIL−2変異タンパク質、またはその融合体または免疫複合体の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を、抗腫瘍免疫応答を刺激するように、腫瘍を携帯する対象に投与する。別の一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合部分を、抗感染免疫応答を刺激するように、感染を携帯する対象に投与する。1つの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、Tregによる免疫抑制をさらに低減するために、Treg枯渇抗体(例えば、FcγR介在性Treg枯渇)と組み合わせて使用することができる。1つの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、例えば、抗PD−1および抗CTLA−4と組み合わせて、癌免疫治療効果を増強するために投与することができる。
別の態様において、本発明は、腫瘍および癌および感染症などの対象の疾患を治療する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の任意のIL−2変異タンパク質、またはその融合体または免疫複合体の有効量を前記対象に投与することを含む。
がんは、早期、中期または末期にあるがんまたは転移性がんであってもよい。いくつかの実施形態において、腫瘍または腫瘍細胞は、結腸直腸腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、肺腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫および頭頸部腫瘍から選択され得る。いくつかの実施形態において、がんは、結腸直腸がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸がん、黒色腫、子宮頸がん、膀胱がん、神経膠芽腫および頭頸部がんから選択され得る。いくつかの実施形態において、腫瘍はメラノーマ、腎細胞癌、結腸直腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌である。
別の態様において、本発明は、対象における感染性疾患、例えば慢性感染の治療方法に関し、前記方法は、本明細書に係る任意のIL−2変異タンパク質またはその断片、または前記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、または医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む。1つの実施形態において、前記感染はウイルス感染である。
いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質またはその融合体または複合体の他、本発明の方法は、前記対象に1種以上の療法(例えば、治療法および/または他の治療剤)を組み合わせて適用することをさらに含む。いくつかの実施形態において、治療法は、手術治療および/または放射線治療を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、少なくとも1種の他の免疫刺激性抗体、例えば、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、抗−LAG−3抗体、抗CD43抗体、および/または抗CTLA−4抗体を投与することをさらに含み、これらの抗体は、例えば、完全ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であり得る。
いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体は、IBI308(シンディリマブ、WO2017/025016A1)、MDX−1106(nivolumab、OPDIVO)、Merck 3475(MK−3475、pembrolizumab、KEYTRUDA)、CT−011(Pidilizumab)から選択される。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体はMDX−1106である。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体は、nivolumab(CAS登録番号:946414−94−4)である。さらに、いくつかの実施形態において、IL−2変異タンパク質またはその断片は、単独でまたはPD−1拮抗剤との組み合わせとして、1種以上の他の療法、例えば、治療方式および/または他の治療剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、治療法は、外科的手術(例えば、腫瘍切除)、放射線治療(例えば、照射領域が設定された三次元原体放射線療法などの外部粒子ビーム療法)、局所照射(例えば、所定の標的もしくは器官に対する照射)または集中的照射などを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書は、本発明の変異タンパク質およびCTLA−4拮抗性抗体を対象に投与することを含む、疾患(例えば、腫瘍)を治療する方法を提供する。抗−CTLA−4抗体は、例えば、YERVOY(R)(ipilimumabまたは抗体10D1、PCT公開番号WO 01/14424に記載されている)、tremelimumab(旧称ticilimumab,CP−675,206)、およびWO 98/42752、WO 00/37504、米国特許第6,207,156号、Hurwitzetal.(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067−10071、Camacho etal.(2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (抗体CP−675206)、およびMokyr etal.(1998) Cancer Res. 58:5301−5304に記載されている抗−CTLA−4抗体からなる群から選択される抗体であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書は、本発明の抗−変異タンパク質および抗−LAG−3拮抗剤抗体を対象に投与することを含む、疾患(例えば、腫瘍)を治療する方法を提供する。抗−LAG3抗体は、例えば、米国特許出願番号US2011/0150892およびWO2014/008218に記載されている抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2、または17E5、またはこれらの抗体のCDRまたは可変領域を含む抗体、BMS−986016、US2011/007023に記載されているIMP731から選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、化学療法または化学療法剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、放射線療法または放射線療法剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、標的療法または標的治療剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のIL−2変異タンパク質は、免疫療法または免疫治療剤、例えばモノクローナル抗体と併用して投与されてもよい。
本発明の変異(およびそれを含む医薬組成物またはその融合体または免疫複合体、任意の他の治療剤)は、非経口投与、肺内投与、鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、かつ、局所治療の場合は、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与を含む。なお、投与期間の長さによって、例えば、静脈内注射投与または皮下注射投与などの注射を含む任意の適切な経路にすることができる。本発明において、非限定的であるが、単回投与または複数の時刻での複数回投与、ボーラス投与、パルス療法などの様々な頻度の投与が含まれる。
本発明の変異タンパク質は、疾患の予防または治療に用いられる場合、その適切な投与量(単独で投与される場合または1種以上の他の治療剤と組み合わせて投与される場合)が、治療対象疾患の種類、抗体のタイプ、疾患の重症度とその経過、予防目的であるか治療目的であるか、これまでの治療歴、患者の臨床病歴、前記抗体に対する応答、主治医の判断によって決定される。前記抗体は、単回の治療として、または一連の治療において患者に適切に投与される。
さらに別の態様において、本発明は、上述の方法(例えば治療のため)の医薬の調製における、本発明のIL−2変異タンパク質、組成物、免疫複合体、融合体の使用を提供する。
以下の実施例を本発明の理解を補助するように説明する。如何なる形式で実施例を、本発明の保護範囲を制限するものと解釈すべきではない。
実施例1.インターロイキン−2変異体の設計
・ インターロイキン−2グリコシル化タンパク質の設計
PDBデータベース中のインターロイキン−2(Interleukin−2、IL−2と略称する)とその α受容体CD25(IL−2Rαと略称する)の結晶構造(PDB:1Z92)(図1A)により、アミノ酸の部位特異的変異により、IL−2とIL−2Raとの結合インターフェースにN−X−S/Tモチーフ(Xは任意のアミノ酸であってもよいが、P(プロリン)を除く)を人為的に改変することにより、IL−2はHEK293またはCHO細胞の発現過程において、細胞の翻訳後修飾により、IL−2の表面に多糖鎖が形成され、IL−2とIL−2Rとの結合が阻害される(図1Bの構造図に示されるように)。
・ インターロイキン−2グリコシル化タンパク質の設計
PDBデータベース中のインターロイキン−2(Interleukin−2、IL−2と略称する)とその α受容体CD25(IL−2Rαと略称する)の結晶構造(PDB:1Z92)(図1A)により、アミノ酸の部位特異的変異により、IL−2とIL−2Raとの結合インターフェースにN−X−S/Tモチーフ(Xは任意のアミノ酸であってもよいが、P(プロリン)を除く)を人為的に改変することにより、IL−2はHEK293またはCHO細胞の発現過程において、細胞の翻訳後修飾により、IL−2の表面に多糖鎖が形成され、IL−2とIL−2Rとの結合が阻害される(図1Bの構造図に示されるように)。
IL−2グリコシル化部位設計:IL−2中のIL−2Raから3.6Åの距離にあり、かつ、側鎖が溶液に曝されているアミノ酸を探し出し、それをアスパラギンに変異させ、その後3番目のアミノ酸をセリンまたはトレオニンに変異させ、N−X−S/Tモチーフ(Xは任意のアミノ酸であってもよいが、Pを除く)を形成した(表1参照)。
・ IL−2 B’C’loopキメラとトランケートの設計
B’C’loop:IL−2のB helixとC helixとの連結配列(図2A)、A73−R83の合計11アミノ酸を含む。
B’C’loop:IL−2のB helixとC helixとの連結配列(図2A)、A73−R83の合計11アミノ酸を含む。
IL−2モノマー(PDB:1M47)と複合体の結晶構造(PDB:2ERJ)を比較すると、IL−2モノマーの結晶構造でB’C’loopが欠損しているのは、B’C’loopが溶液中で非常に活発であるためであり、比較的安定したコンフォメーションを形成することができないからである。
B’C’loopを遺伝子操作することにより、B’C’loopの安定性が増加し、IL−2の安定性およびIL−2Rbとの親和力が増加する。したがって、ヒトIL15結晶構造(PDB:2Z3Q)を比較し、B’C’loopが短く安定であることを見出した(図2.B)。そこで1つのIL−2キメラ分子(L017)と4つのトランケート分子(L057〜L060)を設計した(表2参照)。
実施例2:IL−2変異体−Fc融合タンパク質およびIL−2受容体の発現精製
発現プラスミドの構築
野生型IL−2(uniprot:P60568,aa21−153,C125S,IL−2WTと略称する)およびIL−2変異体IL−23X(R38D,K43E,E61R),IL−2glycansおよびB’C’loopキメラおよびトランケートを、GSGS連結配列を介してヒトIgG1のFc(L234A、L235A、FcLALA、配列番号28と略称される)と連結し、pTT5のベクター上に構築し、以下のタンパク質を発現させた。
発現プラスミドの構築
野生型IL−2(uniprot:P60568,aa21−153,C125S,IL−2WTと略称する)およびIL−2変異体IL−23X(R38D,K43E,E61R),IL−2glycansおよびB’C’loopキメラおよびトランケートを、GSGS連結配列を介してヒトIgG1のFc(L234A、L235A、FcLALA、配列番号28と略称される)と連結し、pTT5のベクター上に構築し、以下のタンパク質を発現させた。
L011(IL−2glycan5)の上でもう1つのグリコシル化部位を増やしたりK35Q変異部位を増やしたり(K35Q変異は前述の変異タンパク質Y007とタンパク質3D構造に基づいて設計されている)、GSGS連結配列を通じてFcLALAと連結し、pTT5のベクター上に構築され、以下のタンパク質を発現させた。
B’C’loopキメラ(L017)およびトランケート(L057/058)をグリコシル化IL−2(L011)と組み合わせ、2つのGGGGSを介してFcLALAに連結し、pCDNA3.1のベクター上に構築し、以下のタンパク質を発現させた。
上記タンパク質分子の具体的な配列情報を配列表に示す。
上記の分子を構築するために使用される野生型IL−2WTの配列は、ジスルフィド架橋IL−2二量体形成を回避するために125位にC125S変異を有する配列番号26に示されている。IL−23Xは、以前の文献(Rodrigo Vazquez − Lombardi etal.、Nature Communications, 8:15373, DOI: 10.1038/ncomms15373)に報告されたIL−2変異体であり、IL−2WTと同様にC125S変異も含み、変異R38D、K43E、E61Rを含み、その配列を配列番号27に示す。文献によると、IL−23XはIL−2Rαと結合せず、IL−2Rβとの結合力は野生型IL−2と同等に維持される。
IL−2融合タンパク質の発現精製
所定のトランスフェクション体積のExpi293細胞(Invitrogen)を継代培養し、トランスフェクションの前日に細胞密度を1.5×106個の細胞/mlに調整しておく。トランスフェクション当日、細胞密度は約3×106個の細胞/mlである。最終体積の1/10(v/v)のOpti−MEM培地(Gibco製品番号:31985−070)をトランスフェクション緩衝液として使用し、上記で構築した発現プラスミドを加え均一に混合し、0.22μmのフィルターで濾過して使用に備える。前の工程のプラスミドに適量のポリエチレンイミン(PEI)(Polysciences、23966)を加え(プラスミドとPEIの比率は1:3)、均一に混合してから室温で10minインキュベートすることによって、DNA/PEI混合物を得る。DNA/PEI混合物をHEK293細胞に穏やかに注ぎ、均一に混合し、37℃、8% CO2の条件下で24h培養した後、VPAVPA(Sigma、製品番号:P4543−100G)を追加し、最終濃度を2 mMおよび2%(v/v)Feed(1g/L Phytone Peptone + 1g/L Difco Select Phytone)にし、6d培養を継続した。
所定のトランスフェクション体積のExpi293細胞(Invitrogen)を継代培養し、トランスフェクションの前日に細胞密度を1.5×106個の細胞/mlに調整しておく。トランスフェクション当日、細胞密度は約3×106個の細胞/mlである。最終体積の1/10(v/v)のOpti−MEM培地(Gibco製品番号:31985−070)をトランスフェクション緩衝液として使用し、上記で構築した発現プラスミドを加え均一に混合し、0.22μmのフィルターで濾過して使用に備える。前の工程のプラスミドに適量のポリエチレンイミン(PEI)(Polysciences、23966)を加え(プラスミドとPEIの比率は1:3)、均一に混合してから室温で10minインキュベートすることによって、DNA/PEI混合物を得る。DNA/PEI混合物をHEK293細胞に穏やかに注ぎ、均一に混合し、37℃、8% CO2の条件下で24h培養した後、VPAVPA(Sigma、製品番号:P4543−100G)を追加し、最終濃度を2 mMおよび2%(v/v)Feed(1g/L Phytone Peptone + 1g/L Difco Select Phytone)にし、6d培養を継続した。
細胞培養液を13000rpmで 20min遠心分離し、上清を回収し、前カラム Hitrap Mabselect Sure(GE,11−0034−95)を用いて上清を精製した。操作は以下のとおりである:精製前に5倍カラム体積の平衡液(20mM Tris、150mM NaCl、pH7.2)で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに10倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的結合タンパク質を除去し、5倍カラム体積の溶出緩衝液(100mM sodium citrate、pH 3.5)で充填剤を洗浄し、溶出液を収集した。溶出液1mlあたり80μL Tris(2M Tris)を加え、限外濾過濃縮管(MILLIPORE、製品番号:UFC901096)を用いてPBS緩衝液(Gibco、製品番号:70011−044)に交換し、濃度を測定した。精製後のタンパク質100μgの濃度を1mg/mLに調整し、ゲル濾過カラムSW3000(TOSOH製品番号:18675)を用いてタンパク質の純度を測定した。
グリコシル化変異体Y007、Y008およびY014は、表面のアミノ酸の1つまたは2つを変異させることにより、Y001に比べてタンパク質の発現量および純度が有意に向上した。Y048、Y049およびY050は、Y011を基準として、グリコシル化部位を1箇所増やしたり、K35Q変異部位を1箇所増やしたりして、発現量を7.77mg/Lから50mg/L以上(Y048およびY049)または40mg/L(Y050)に向上させ、純度を31.35%から80%以上に向上させることで、分子の薬剤化能を著しく向上させた。
B’C’loopキメラ(Y017)とトランケート(Y057/058/059)はY001に比べて発現量とワンステップ親和性クロマトグラフィー純度が大きく向上した。
B’C’loop最適化後の配列をグリコシル化変異L011と組み合わせると、Y056、Y081およびY082は、L011を有する変異タンパク質Y011と比較して発現量および純度の両方において改善された(表3)。
IL−2受容体の発現と精製
ヒトIL−2受容体a(Uiprot:P01589,aa22−217)およびb(Uiprot:P14784,aa27−240)は、配列のC末端にaviタグ(ポリペプチド:GLNDIFEAQKIEWHE、BirA酵素によるビオチン化を触媒することができる)および6つのヒスチジンタグ(HHHHHH)を連結し、pTT5ベクター上にそれぞれ構築した。プラスミドトランスフェクション293F細胞(Invitrogen)方法はIL−2Fc融合タンパク質の発現方法と同じである。
ヒトIL−2受容体a(Uiprot:P01589,aa22−217)およびb(Uiprot:P14784,aa27−240)は、配列のC末端にaviタグ(ポリペプチド:GLNDIFEAQKIEWHE、BirA酵素によるビオチン化を触媒することができる)および6つのヒスチジンタグ(HHHHHH)を連結し、pTT5ベクター上にそれぞれ構築した。プラスミドトランスフェクション293F細胞(Invitrogen)方法はIL−2Fc融合タンパク質の発現方法と同じである。
精製前に、回収された培地に対し4500rpmで30min遠心分離して、細胞を捨てる。次に上清に対し0.22μlフィルターで濾過する。精製に使用したニッケルカラム(5ml Histrap excel, GE, 17−3712−06)を0.1MのNaOHに2h浸漬した後、5−10倍のカラム体積の超純水で洗浄し、アルカリ液を除去した。精製前に5倍カラム体積の結合緩衝液(20mM Tris pH 7.4, 300mM NaCl)で精製カラムを平衡化し、細胞上清を平衡化カラムに通し、10倍カラム体積の洗浄緩衝液(20mM Tris 7.4, 300mM NaCl, 10mM imidazole)をカラムに通して非特異的結合ヘテロタンパク質を除去し、次いで標的タンパク質を3-5倍カラム体積溶出液(20mM Tris 7.4, 300mM NaCl, 100mM imidazole)で溶出した。回収したタンパク質限外濾過濃縮物をPBS(Gibco,70011−044)に交換した後、 superdex200 increase(GE, 10/300GL, 10245605)をさらに単離して精製し、単量体の溶出ピークを収集し、カラムの平衡化および溶出緩衝液はPBS(Gibco,70011−044)であった。ゲルフィルタカラムSW3000(TOSOH製品番号:18675)を用いて精製後のタンパク質試料100μgのタンパク質純度を測定した(図3および4)。
実施例3.IL−2変異体Fc融合タンパク質(略称:IL−2mutant−FC)とその受容体との親和力測定
ヒトIL−2RαおよびIL−2Rβと結合する本発明のIL−2mutant−FCの平衡解離定数(KD)を、バイオレイヤー干渉法(BiolayerInterferometry、BLI) 技術を用いて測定した。従来の方法(Estep,P et al.,High throughput solution Based measurement of antibody−antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p270−8)でBLI法親和力測定を行う。
ヒトIL−2RαおよびIL−2Rβと結合する本発明のIL−2mutant−FCの平衡解離定数(KD)を、バイオレイヤー干渉法(BiolayerInterferometry、BLI) 技術を用いて測定した。従来の方法(Estep,P et al.,High throughput solution Based measurement of antibody−antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p270−8)でBLI法親和力測定を行う。
実験開始より半時間前に、試料の数量分に応じて、適切な数量のAHC(ForteBio、18−5060)(陽性対照検出用)センサを用意し、SD buffer(PBS 1×、BSA 0.1%、Tween−20 0.05%)に浸漬する。
SD緩衝液、IL−2mutant−FC、IL−2受容体αまたはβ各100μlをそれぞれ96ウェルのブラックポリスチレン半量マイクロプレート(Greiner、675076)に加える。試料の位置に対応するようにプレートを配置し、センサの位置を決定する。次のように機器パラメータを設定する。ステップBaseline、Loading〜1nm、Baseline、Association、Dissociationを実行し、試料の結合と解離の速度で各ステップの実行時間を決定し、回転数は400rpmで、温度は30℃である。ForteBio分析ソフトウェアを用いてKD値を分析する。
以上の親和力データから以下のことが分かる。1)Y009、Y010、Y011、Y013およびY015はIL−2Rαの結合を遮断できること(表4a)、2)B’C’loopキメラ分子および切断分子は、分子の発現量を増加させるだけでなく、分子とIL−2R(R)の親和力も増加したこと(表4b)、3)IL−2グリコシル化とB’C’loop改造の組み合わせY056とY081は、Y045(IL−2WT−2*(G4S)−FcLALA)、Y040(IL−2.3X−2*(G4S)−FcLALA)およびY038(IL−2.glycan5−2*(G4S)−FcLALA)と比較して、IL2Rαとの結合を阻害すると同時に、IL2R(R)結合との親和力を増強させたこと。
実施例4:IL−2mutant−FCインビトロ機能試験
IL−2Rαに対するIL−2WTの親和力はIL−2RβおよびIL−2Rγより高く、細胞表面のIL−2Rαと優先的に結合し、IL−2Rβγを募集し、IL−2Rβγにより下流p−STAT5シグナルを放出し、T細胞とNK細胞の増殖を刺激する。Treg細胞表面にIL−2Rαがあり、エフェクターT細胞とNK細胞表面にIL−2Rαがないため、正常時にIL−2WTはTreg細胞増殖を優先的に刺激し、免疫反応をダウンレギュレートさせる。IL−2mutantはIL−2Rαと結合せず、Treg細胞の増殖を優先的に刺激する選好を解消し、同時にT細胞とNK細胞の増殖を刺激し、エフェクターT細胞とNK細胞の数を効果的に増加させ、抗腫瘍効果を高める。
IL−2Rαに対するIL−2WTの親和力はIL−2RβおよびIL−2Rγより高く、細胞表面のIL−2Rαと優先的に結合し、IL−2Rβγを募集し、IL−2Rβγにより下流p−STAT5シグナルを放出し、T細胞とNK細胞の増殖を刺激する。Treg細胞表面にIL−2Rαがあり、エフェクターT細胞とNK細胞表面にIL−2Rαがないため、正常時にIL−2WTはTreg細胞増殖を優先的に刺激し、免疫反応をダウンレギュレートさせる。IL−2mutantはIL−2Rαと結合せず、Treg細胞の増殖を優先的に刺激する選好を解消し、同時にT細胞とNK細胞の増殖を刺激し、エフェクターT細胞とNK細胞の数を効果的に増加させ、抗腫瘍効果を高める。
本実施例は各IL−2mutant−FCの初代ヒトCD8+ T細胞p−STAT5シグナルに対する活性化を検出することにより、各変異体のCD25+細胞の活性化偏向性の除去を検証し、CD25−細胞の活性化作用が強い変異体をスクリーニングした。具体的な工程は以下のとおりである。
1. PBMC細胞の蘇生
a) 液体窒素からPBMC細胞(Allcells製品番号:PB005F、100M入り)を取り出し、37℃の水浴鍋に迅速に入れ、PBMC細胞を蘇生した。
b) 細胞を予熱した5%ヒトAB血清(GemCell製品番号:100−512)と1‰ DNA酵素(STRMCELL製品番号:07900)を含むX−VIVO15(Lonza製品番号:04−418Q)培地10mLに添加し、400G、25℃で10min遠心分離し(後続遠心分離はすべてこの条件)洗浄した。
c) 20mLの培地を加えて細胞を再懸濁し、37℃の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養した。
a) 液体窒素からPBMC細胞(Allcells製品番号:PB005F、100M入り)を取り出し、37℃の水浴鍋に迅速に入れ、PBMC細胞を蘇生した。
b) 細胞を予熱した5%ヒトAB血清(GemCell製品番号:100−512)と1‰ DNA酵素(STRMCELL製品番号:07900)を含むX−VIVO15(Lonza製品番号:04−418Q)培地10mLに添加し、400G、25℃で10min遠心分離し(後続遠心分離はすべてこの条件)洗浄した。
c) 20mLの培地を加えて細胞を再懸濁し、37℃の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養した。
2. ヒトCD8+ T細胞の精製:
a) 工程1で懸濁した細胞液を吸引し、遠心分離して上清を捨てた。
b) Robosep緩衝液(STEMCELL 製品番号:20104)1mLとヒトAB血清100μLおよびヒトCD8+ T細胞精製キット(Invitrogen 製品番号:11348D)100μLに抗体混合液を陰性スクリーニングして細胞を再懸濁した。
c) 均一に混合した後、4℃で20minインキュベートし、5minごとに振とうした。
d) インキュベートした後、10mLのRobosep緩衝液を加え、遠心分離して2回洗浄した。
e) 同時に、1mLの磁性微小球(ヒトCD8+ T細胞精製キット)を用意し、7mLのRobosep緩衝液を加えて磁気スタンドに入れて1min上清を捨て、磁性微小球を予備洗浄した。
f) 各1mL Robosep緩衝液を加えてそれぞれ微小球と細胞を再懸濁し、均一に混合した後に室温で30min回転インキュベートした。
g) インキュベートした後、 6mLのRobosep緩衝液を加え、磁気スタンドに1min置き、上清を収集した。
h) 収集液を再び磁気スタンドに1min置き、上清を収集した。
i) 遠心分離して上清を捨て、予熱したT培地で再懸濁し、密度を1×106/mLに調整した。
j) 1/3の細胞を用意してCD25の発現を刺激し、残りの細胞は37℃の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養した。
a) 工程1で懸濁した細胞液を吸引し、遠心分離して上清を捨てた。
b) Robosep緩衝液(STEMCELL 製品番号:20104)1mLとヒトAB血清100μLおよびヒトCD8+ T細胞精製キット(Invitrogen 製品番号:11348D)100μLに抗体混合液を陰性スクリーニングして細胞を再懸濁した。
c) 均一に混合した後、4℃で20minインキュベートし、5minごとに振とうした。
d) インキュベートした後、10mLのRobosep緩衝液を加え、遠心分離して2回洗浄した。
e) 同時に、1mLの磁性微小球(ヒトCD8+ T細胞精製キット)を用意し、7mLのRobosep緩衝液を加えて磁気スタンドに入れて1min上清を捨て、磁性微小球を予備洗浄した。
f) 各1mL Robosep緩衝液を加えてそれぞれ微小球と細胞を再懸濁し、均一に混合した後に室温で30min回転インキュベートした。
g) インキュベートした後、 6mLのRobosep緩衝液を加え、磁気スタンドに1min置き、上清を収集した。
h) 収集液を再び磁気スタンドに1min置き、上清を収集した。
i) 遠心分離して上清を捨て、予熱したT培地で再懸濁し、密度を1×106/mLに調整した。
j) 1/3の細胞を用意してCD25の発現を刺激し、残りの細胞は37℃の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養した。
3. CD8+ T細胞を、CD25を発現するように刺激した:
a) 1/3工程2で精製したCD8+ T細胞を用意し、抗ヒトCD3/CD28抗体の磁性微小球(GIBCO製品番号:11131D)を加え、細胞と微小球の割合は3:1であった。
b) 37 ℃の二酸化炭素インキュベーターに3min静置した。
c) 培地10mLを加えて2回洗浄した。
d) 培地を加えて細胞密度を1×106/mLに調整し、 37℃の炭酸ガスインキュベーターで2d静置培養した。
a) 1/3工程2で精製したCD8+ T細胞を用意し、抗ヒトCD3/CD28抗体の磁性微小球(GIBCO製品番号:11131D)を加え、細胞と微小球の割合は3:1であった。
b) 37 ℃の二酸化炭素インキュベーターに3min静置した。
c) 培地10mLを加えて2回洗浄した。
d) 培地を加えて細胞密度を1×106/mLに調整し、 37℃の炭酸ガスインキュベーターで2d静置培養した。
4. 細胞純度と発現レベルの測定:
a) 抗ヒトCD8−PE(Invitrogen製品番号:12−0086−42)、抗ヒトCD25−PE(eBioscience製品番号:12−0259−42)、同型対照抗体(BD製品番号:556653)を用いて細胞のCD8とCD25を検出した。
b) 工程2において細胞はCD8+ CD25−T細胞であり、工程3において細胞はCD8+ CD25+ T細胞であった。
a) 抗ヒトCD8−PE(Invitrogen製品番号:12−0086−42)、抗ヒトCD25−PE(eBioscience製品番号:12−0259−42)、同型対照抗体(BD製品番号:556653)を用いて細胞のCD8とCD25を検出した。
b) 工程2において細胞はCD8+ CD25−T細胞であり、工程3において細胞はCD8+ CD25+ T細胞であった。
5. 各IL−2mutant−FCによるCD8+ CD25−T細胞に対するp−STAT5シグナル活性化のEC50の検出:
a) CD8+ CD25−T細胞を用意し、1ウェルあたり1×105細胞で96ウェルU底培養プレート(Costar製品番号:CLS3799−50EA)を敷いた。
b) 100μLの各IL−2mutant−FC、市販IL−2(R&D製品番号:202−IL−500)、IL−2WT−FC、IL−23X−FCを添加し、最高濃度266.7nMから始めて合計12段階の4倍の濃度勾配で希釈し、37℃のインキュベーター中で20minインキュベートした。
c) 4.2% ホルムアルデヒド溶液55.5μLを加え、室温で10min固定した。
d) 上清を遠心分離し、200μLの氷メタノール(Fisher製品番号:A452−4)を加えて細胞を再懸濁し、4℃の冷蔵庫で30minインキュベートした。
e) 上清を遠心分離し、200μL染色緩衝液(BD製品番号:554657)で3回洗浄した。
f) 抗p−STAT5−AlexFlour647(BD製品番号:562076、1:200希釈)を含む破膜・固定緩衝液(BD製品番号:51−2091KZ)200μLを加え、室温で遮光して3hインキュベートした。
g) 染色緩衝液を用いて3回洗浄し、100μLの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。
h) IL−2分子の濃度を横軸、AlexFlour647中間蛍光値を縦軸として、p−STAT5シグナルのEC50値を作成した結果を図5および表5に示す。
a) CD8+ CD25−T細胞を用意し、1ウェルあたり1×105細胞で96ウェルU底培養プレート(Costar製品番号:CLS3799−50EA)を敷いた。
b) 100μLの各IL−2mutant−FC、市販IL−2(R&D製品番号:202−IL−500)、IL−2WT−FC、IL−23X−FCを添加し、最高濃度266.7nMから始めて合計12段階の4倍の濃度勾配で希釈し、37℃のインキュベーター中で20minインキュベートした。
c) 4.2% ホルムアルデヒド溶液55.5μLを加え、室温で10min固定した。
d) 上清を遠心分離し、200μLの氷メタノール(Fisher製品番号:A452−4)を加えて細胞を再懸濁し、4℃の冷蔵庫で30minインキュベートした。
e) 上清を遠心分離し、200μL染色緩衝液(BD製品番号:554657)で3回洗浄した。
f) 抗p−STAT5−AlexFlour647(BD製品番号:562076、1:200希釈)を含む破膜・固定緩衝液(BD製品番号:51−2091KZ)200μLを加え、室温で遮光して3hインキュベートした。
g) 染色緩衝液を用いて3回洗浄し、100μLの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。
h) IL−2分子の濃度を横軸、AlexFlour647中間蛍光値を縦軸として、p−STAT5シグナルのEC50値を作成した結果を図5および表5に示す。
6. 各IL−2mutant−FCによるCD8+ CD25+T細胞に対するp−STAT5シグナル活性化のEC50の検出:
a) CD8+ CD25+T細胞を用意し、1ウェルあたり1×105細胞で96ウェルU底培養プレートを敷いた。
b) 工程5におけるb−hと同様にして、p−STAT5シグナルのEC50値を作成し、結果を図5および表5に示す。
a) CD8+ CD25+T細胞を用意し、1ウェルあたり1×105細胞で96ウェルU底培養プレートを敷いた。
b) 工程5におけるb−hと同様にして、p−STAT5シグナルのEC50値を作成し、結果を図5および表5に示す。
実験の結果(同じdonorで比較):
1) Y001(IL−2WT−GSGS−FcLALA) とY045(IL−2WT−2*(G4S)−FcLALA)、Y002(IL−2.3X−GSGS−FcLALA)とY040(IL−2.3X−2*(G4S)−FcLALA)、Y011(IL−2.glycan5−GSGS−FcLALA) とY038(IL−2.glycan5−2*(G4S)−FcLALA)の曲線位置を比較し、長い連結配列(GGGGSGGGGS)は短い連結配列(GSGS)よりCD25−CD8+T細胞の活性化に優れていることがわかった(図5A)。
2) ヒトIL−15のB’C’loopをキメラした後、Y017(IL−2hyb15BCL−GSGS−FcLALA)によるCD25−CD8+T細胞の活性化(Y017のEC50値は0.9902)はY001 (EC50値は10.69)より10.79倍向上した(図5A) 。一方、CD25+CD8+T細胞の活性化(Y017のEC50値は0.0018)はY001(EC50値は0.0020)に相当する(図5B)。
3) IL−2のインターフェースにNグリカンが1個増加した後(Y038)、CD25−CD8+T細胞の活性化(Y038のEC50値は369.0)は野生型のIL−2(Y045、EC50値は31.73)より11.63倍低下したが、文献報告のIL−23X(Y040)より優れた。これにヒトIL−15のB’C’loopをキメラしたところ(Y056、EC50値は8.571)、CD25−CD8+T細胞に対する活性化はY045より3.7倍向上し、Y038より43.05倍向上した(図5C)。
4) 同じdonorで、刺激前後のCD8+T細胞を比較すると、Y056およびY081がCD25−CD8+T細胞の活性化を増強し、CD25+細胞の活性化の偏向性を減少させたことが示された(図5D、Eおよび表5)。
1) Y001(IL−2WT−GSGS−FcLALA) とY045(IL−2WT−2*(G4S)−FcLALA)、Y002(IL−2.3X−GSGS−FcLALA)とY040(IL−2.3X−2*(G4S)−FcLALA)、Y011(IL−2.glycan5−GSGS−FcLALA) とY038(IL−2.glycan5−2*(G4S)−FcLALA)の曲線位置を比較し、長い連結配列(GGGGSGGGGS)は短い連結配列(GSGS)よりCD25−CD8+T細胞の活性化に優れていることがわかった(図5A)。
2) ヒトIL−15のB’C’loopをキメラした後、Y017(IL−2hyb15BCL−GSGS−FcLALA)によるCD25−CD8+T細胞の活性化(Y017のEC50値は0.9902)はY001 (EC50値は10.69)より10.79倍向上した(図5A) 。一方、CD25+CD8+T細胞の活性化(Y017のEC50値は0.0018)はY001(EC50値は0.0020)に相当する(図5B)。
3) IL−2のインターフェースにNグリカンが1個増加した後(Y038)、CD25−CD8+T細胞の活性化(Y038のEC50値は369.0)は野生型のIL−2(Y045、EC50値は31.73)より11.63倍低下したが、文献報告のIL−23X(Y040)より優れた。これにヒトIL−15のB’C’loopをキメラしたところ(Y056、EC50値は8.571)、CD25−CD8+T細胞に対する活性化はY045より3.7倍向上し、Y038より43.05倍向上した(図5C)。
4) 同じdonorで、刺激前後のCD8+T細胞を比較すると、Y056およびY081がCD25−CD8+T細胞の活性化を増強し、CD25+細胞の活性化の偏向性を減少させたことが示された(図5D、Eおよび表5)。
Claims (29)
- 野生型IL−2(好ましくはヒトIL−2、より好ましくは配列番号26の配列を含むIL−2)と比較して、
35N−36X−37T/S、38N−39X−40T/S、41N−42X−43T/S、43N−44X−45T/S、45N−46X−47T/S、62N−63X−64T/S、68N−69X−70T/S、72N−73X−74T/S、および74N−75X−76T/S
から選択されるアミノ酸位置に、1つ以上のグリコシル化モチーフN−X−S/Tを導入する少なくとも1つの変異を含み、ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは、Xは、野生型IL−2において対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸、またはその保存的置換残基であり、
ここで、アミノ酸の位置は配列番号26に従って番号付けされる、IL−2変異タンパク質。 - 35N−36X−37T/S、38N−39X−40T/S、および74N−75X−76T/Sから選択される1つ以上の変異グリコシル化モチーフを含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号26に従って番号付けされ、
ここで、哺乳動物細胞において発現される場合、好ましくはFc融合タンパク質の形態で発現される場合、野生型IL−2と比較して、改善された発現および/または純度を有する(好ましくは、変異タンパク質の純度は、発現および一段階アフィニティー精製後に測定する)、請求項1に記載の変異タンパク質。 - 野生型IL−2と比較して、
(i)K35N−L36−T37、
(ii)R38N−M39−L40S、
(iii)Q74N−S75−K76T
から選択される変異グリコシル化モチーフを含み、好ましくは、変異グリコシル化モチーフK35N−L36−T37を含む、請求項2に記載の変異タンパク質。 - 配列番号31、32、および38から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または98%の同一性を有する配列を含む、請求項2または3に記載の変異タンパク質。
- 41N−42X−43T/S、43N−44X−45T/S、45N−46X−47T/S、68N−69X−70T/S、および72N−73X−74T/Sから選択される1つ以上の変異グリコシル化モチーフを含み、好ましくはグリコシル化モチーフ43N−44X−45T/Sを含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号26に従って番号付けされ、
ここで、野生型IL−2と比較して、IL−2Rαへの結合が低減または排除されている、請求項1に記載の変異タンパク質。 - 野生型IL−2と比較して、
(i)T41N−F42−K43S、
(ii)K43N−F44−Y45T、
(iii)Y45N−M46−P47S、
(iv)E68N−V69−L70S、および
(v)L72N−A73−Q74T
から選択される変異グリコシル化モチーフを含み、
好ましくは、変異グリコシル化モチーフK43N−F44−Y45Tを含む、請求項5に記載の変異タンパク質。 - (i)35N−36X−37T/S、38N−39X−40T/S、および74N−75X−76T/Sから選択される変異グリコシル化モチーフ、および/または
(ii)変異K35Q
をさらに含み、
ここで、野生型IL−2と比較して、IL−2Rα結合が低減または排除されており、Fc融合タンパク質の形態で哺乳動物細胞で発現されるときに発現および純度が改善されている、請求項5または6に記載の変異タンパク質。 - 配列番号33、34、35、37、39、および45〜47から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または98%の同一性を有する配列を含む、請求項5〜7のいずれか1項に記載の変異タンパク質。
- 野生型IL−2(好ましくはヒトIL−2、より好ましくは配列番号26の配列を含むIL−2)と比較して、切断されたB’C’ループ領域(すなわち、アミノ酸残基aa72とaa84との間の連結配列)、好ましくは、前記切断されたB’C’ループ領域は、10、9、8、7、6、または5未満のアミノ酸長、より好ましくは7アミノ酸長であり、ここで、アミノ酸残基は配列番号26に従って番号付けされる、IL−2変異タンパク質。
- 野生型IL−2と比較して、
(i)例えば、IL15のB’C’ループ配列などの、4ヘリックス短鎖サイトカインILファミリーメンバー由来の短いB’C’ループ配列の置換であり、好ましくは、置換されたループ領域は、配列SGDASIHを有する、aa73〜aa83配列の置換、または
(ii)例えば、C末端から1、2、3または4アミノ酸の切断であり、好ましくは、切断されたループ領域は、配列A(Q/G)S(K/A)N(F/I)Hを有し、好ましくは、前記切断されたループ領域は、配列AQSKNFHまたはAGSKNFHを有する、aa73〜aa83配列の切断
を含む、請求項9に記載の変異タンパク質。 - 野生型IL−2と比較して、IL−2Rβ結合が増強され、および/または発現収率および/または純度が改善されている、請求項8〜10のいずれか1項に記載の変異タンパク質。
- 配列番号40〜44、好ましくは配列番号40〜42、より好ましくは配列番号40または41から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または98%の同一性を有する配列を含む、請求項8〜11のいずれか1項に記載の変異タンパク質。
- 野生型IL−2(好ましくはヒトIL−2、より好ましくは配列番号26の配列を含むIL−2)と比較して、組み合わせ変異:(i)41N−42X−43T/S、43N−44X−45T/S、45N−46X−47T/S、68N−69X−70T/S、および72N−73X−74T/Sから選択される変異グリコシル化モチーフ、ならびに(ii)アミノ酸位置aa72〜aa84の間にある、SGDASIHおよびA(Q/G)S(K/A)N(F/I)Hから選択される短縮B’C’ループ領域配列を含み、ここで、アミノ酸位置は配列番号26に従って番号付けされる、IL−2変異タンパク質。
- 配列番号48、49または50、好ましくは配列番号48または49から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または98%の同一性を有する配列を含む、請求項13に記載の変異タンパク質。
- 野生型IL−2と比較して、以下の特性:
−IL−2Rα受容体への結合親和性の排除または低減、
−IL−2Rβ受容体への結合親和性の増強、
−高親和性IL−2R受容体(IL−2Rαβγ)への結合親和性の低減、
−中程度の親和性IL−2R受容体(IL−2Rβγ)への結合親和性の増加、
−CD25+細胞(特にCD8+T細胞、特にTreg細胞)に対する活性化の低下、
−CD25+細胞(特にCD8+T細胞)のIL−2介在性シグナル伝達に対する刺激作用の低下、
−IL−2がCD25+細胞(特にTreg細胞)を優先的に活性化する偏向性の排除または低減、
−IL−2誘導性Treg細胞による免疫反応のダウンレギュレート作用の低下、
−CD25−細胞に対する活性化作用の保持または増強、
−エフェクターT細胞とNK細胞の増殖と活性化の刺激、ならびに
−抗腫瘍効果の向上
のうちの1つ以上を有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の変異タンパク質。 - HEK293細胞などの哺乳動物細胞において発現されるとき、以下の特性:
−野生型IL−2タンパク質よりも優れた発現量、
−野生型IL−2タンパク質よりも優れた安定性、
−より高いタンパク質純度、例えばワンステップ親和性クロマトグラフィー精製後のより高い純度への容易な精製
のうちの1つ以上を有する、請求項1〜15のいずれか1項に記載のIL−2変異タンパク質。 - 野生型IL−2と比較して少なくとも85%、少なくとも95%、または少なくとも96%の同一性を有する、請求項1〜16のいずれか1項に記載のIL−2変異タンパク質。
- 野生型IL−2と比較してCD25+T細胞におけるp−STATA5シグナル伝達を優先的に刺激する偏向性が低減され、かつ、CD25−T細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力が増強され、
好ましくは、組み合わせ変異:
(i)アミノ酸位置43〜45の変異グリコシル化モチーフK43N−F44−Y45Tとアミノ酸位置aa72〜aa84の間の置換配列SGDASIH、または
(ii)アミノ酸位置43〜45の変異グリコシル化モチーフK43N−F44−Y45Tとアミノ酸位置aa72〜aa84の間の切断配列AQSKNFH
を含み、
より好ましくは、配列番号48または49の配列、またはそれと少なくとも95%、96%、またはそれ以上の同一性を有する配列を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のIL−2変異タンパク質。 - IL−2変異タンパク質の融合タンパク質であって、請求項1〜18のいずれか1項に記載のIL−2変異タンパク質を含み、好ましくはFc抗体断片と融合し、好ましくはIL−2変異タンパク質はリンカーを介してFcと融合し、前記リンカーは好ましくはGSGSであり、より好ましくは2x(G4S)であり、
好ましくは、配列番号3〜13および16〜25から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも95%、または少なくとも96%の同一性を有する配列を含む、融合タンパク質。 - 請求項1〜18のいずれか1項に記載のIL−2変異タンパク質と抗原結合分子とを含み、好ましくは、抗原結合分子が免疫グロブリン分子、特にIgG分子、または抗体もしくは抗体断片、特にFab分子およびscFv分子である、免疫複合体。
- 前記抗原結合分子が、腫瘍細胞上または腫瘍環境中に存在する抗原、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、テネイシンCのA1ドメイン(TNC A1)、テネイシンCのA2ドメイン(TNC A2)、フィブロネクチンの外部ドメインB(Extra Domain B、EDB)、癌胎児抗原(CEA)、およびメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)から選択される抗原、と特異的に結合する、請求項20に記載の免疫複合体。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載のIL−2変異タンパク質、請求項19に記載の融合体、または請求項20または21に記載の免疫複合体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項22に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- 請求項22に記載のポリヌクレオチドまたは請求項23に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは哺乳動物細胞、特にHEK293細胞、または酵母である、宿主細胞。
- IL−2変異タンパク質またはその融合体もしくは免疫複合体を製造する方法であって、請求項24に記載の宿主細胞を、IL−2変異タンパク質または融合体または免疫複合体の発現に適した条件下で培養することを含む、方法。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載のIL−2変異タンパク質、請求項19に記載の融合体、または請求項20もしくは21に記載の免疫複合体、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 対象の疾患を治療する方法であって、請求項1〜18のいずれか1項に記載のIL−2変異タンパク質、請求項19に記載の融合体、請求項20もしくは21に記載の免疫複合体、または請求項26に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記疾患は癌である、方法。
- 対象の免疫系を刺激する方法であって、請求項1〜18のいずれか1項に記載のIL−2変異タンパク質、請求項19に記載の融合体、または請求項20もしくは21に記載の免疫複合体を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- IL−2変異タンパク質を取得するための方法であって、
−IL−2とIL−2Raとの結合インターフェースにおける変異により1つ以上(例えば2つまたは3つ)のグリコシル化モチーフN−X−S/Tを導入する工程であって、ここで、XはP(プロリン)を除く任意のアミノ酸であってもよく、および/または、IL−2のB’C’ループ領域において変異により当該ループ領域配列を切断する工程、
好ましくは、請求項1〜7のいずれか1項に記載のグリコシル化変異および/または請求項9もしくは10に記載のB’C’ループ配列変異を導入する工程、より好ましくは請求項13または18に記載の組み合わせ変異を導入する工程、
−哺乳動物細胞(例えばHEK293またはCHO細胞)において、前記IL−2変異タンパク質を、例えばFc融合体(例えばFcLALA融合体)の形態で発現する工程、ならびに
−(i)発現量および/または安定性の改善、(ii)IL2Rα結合の低減、ならびに(iii)IL2Rβ結合の増強、のうちの1つ以上の改善された特性を有する変異タンパク質を同定する工程
を含む、方法。
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