TW202014432A - 新型白介素２及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及新型白介素2(IL-2)突變蛋白。本發明還提供包含該IL-2突變蛋白的融合蛋白、免疫綴合物，以及編碼該IL-2突變蛋白的核酸、包含該核酸的載體和宿主細胞。本發明進一步提供製備該IL-2突變蛋白的方法、包含該IL-2突變蛋白的醫藥組成物和該突變蛋白的治療用途。

Description

新型白介素2及其用途
本發明涉及新型白介素2(IL-2)突變蛋白及其用途。具體地，本發明涉及，與野生型IL-2相比，具有改善的性質，例如，改善的成藥性、降低的IL-2R α受體結合能力和/或提高的IL-2R β受體結合能力的IL-2突變蛋白。本發明還提供包含該IL-2突變蛋白的融合蛋白、免疫綴合物，以及編碼該IL-2突變蛋白的核酸、包含該核酸的載體和宿主細胞。本發明進一步提供製備該IL-2突變蛋白的方法、包含該IL-2突變蛋白的醫藥組成物和該突變蛋白的治療用途。
白介素-2(IL-2)，也稱作T細胞生長因子(TCGF)，是一種主要由活化的T細胞，尤其是CD4+ T輔助細胞產生的多能細胞因子。在真核細胞中，人IL-2(uniprot：P60568)作為153個胺基酸的前體多肽合成，在去除N端20個胺基酸後，產生成熟的分泌性IL-2。其它物種的IL-2的序列也已經公開，參見NCBI Ref Seq No.NP032392(小鼠)、NP446288(大鼠)或NP517425(黑猩猩)。
白介素2具有4個反平行的、兩親性α螺旋，此4個α螺旋形成其功能必不可少的四級結構(Smith,Science 240,1169-76(1988)；Bazan,Science257,410-413(1992))。在大多數情況下，IL-2藉由三種不同受體發揮作用：白介素2受體α(IL-2R α；CD25)、白介素2受體β(IL-2R β；CD122) 和白介素2受體γ(IL-2R γ；CD132)。IL-2R β和IL-2R γ對於IL-2的信號傳導至關重要，而IL-2R α(CD25)對於信號傳導不是必需的，但可以賦予IL-2對受體的高親和力結合(Krieg等，Proc Natl Acad Sci 107,11906-11(2010))。由IL-2R α,β，和γ聯合形成的三聚體受體(IL-2 α β γ)為IL-2高親和力受體(KD約10pM)，由β和γ組成的二聚體受體(IL-2 β γ)為中間親和力受體(KD約1nM)，單獨由α亞基形成的IL-2受體為低親和力受體。
免疫細胞表達二聚體或三聚體IL-2受體。二聚體受體在細胞毒性CD8+ T細胞和天然殺傷細胞(NK)上表達，而三聚體受體主要在激活的淋巴細胞和CD4+ CD25+FoxP3+抑制性調節T細胞(Treg)上表達(Byman,O.和Sprent.J.Nat.Rev.Immunol.12,180-190(2012))。由於靜息狀態的效應T細胞和NK細胞在細胞表面上沒有CD25，故對於IL-2相對不敏感。而Treg細胞在體內一貫表達最高水平的CD25，因此，正常情況下IL-2會優先刺激Treg細胞增殖。
IL-2藉由與不同細胞上IL-2受體的結合，在免疫反應中介導多重作用。一方面，作為免疫系統刺激劑，IL-2可以刺激T細胞增殖和分化，誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)生成，促進B細胞增殖和分化和免疫球蛋白合成，並刺激天然殺傷(NK)細胞的生產、增殖和活化，並由此已經被批准作為免疫治療劑用於癌症和慢性病毒感染的治療。另一方面，IL-2可以促進免疫抑制性CD4+CD25+調節性T細胞(即，Treg細胞)的維持(Fontenot等,Nature Immunol 6,1142-51(2005)；D’Cruz和Klein,Nature Immunol 6,1152-59(2005)；Maloy和Powrie,Nature Immunol6,1171-72(2005))，並介導活化誘導的細胞死亡(AICD)和參與針對自體抗原和腫瘤抗原的免疫耐受的建立和維持(Lenardo等人，Nature 353：858(1991))，從而在患者中引起由AICD導致的腫瘤耐受性和由激活的Treg細胞導致的免疫抑制。此外，高劑量IL-2在患者中可引起血管滲漏綜合征 (VLS)。已經證實，IL-2藉由直接結合肺內皮細胞上的IL-2三聚體受體(IL-2 α β γ)而誘導肺水腫(Krieg等，Proc Nat Acad Sci USA107,11906-11(2010))。
為了克服與IL-2免疫治療相關的上述問題，已經提出了藉由改變IL-2對不同受體的選擇性或偏好性，來降低IL-2治療的毒性和/或提高其功效。例如，已經提出使用IL-2單株抗體與IL-2的複合物，藉由使IL-2靶向表達CD122而非CD25的細胞，誘導對CD122high群體的優先擴增，增強體內IL-2治療效果(Boyman等，Science 311,1924-1927(2006))。Oliver AST等(US2018/0142037)提出在IL-2的胺基酸殘基位置42,45和72上引入三重突變F42A/Y45A/L72G來降低對IL-2R α受體的親和力。Aron M.Levin等(Nature,Vol 484,p529-533,DOI：10.1038/nature10975)提出一種稱作“superkine”的IL-2突變體IL-2H9，該突變體包含五重突變L80F/R81D/L85V/I86V/I92F，具有增強的IL-2R β結合，由此提高了對CD25-細胞的刺激作用，但仍保持了對CD25的高結合性。Rodrigo Vazquez-Lombardi等人(Nature Communications,8：15373,DOI：10.1038/ncomms15373)提出一種三重突變人IL-2突變蛋白IL-23X，該蛋白在胺基酸殘基位置38,43和61分別具有殘基突變R38D-K43E-E61R，導致該突變蛋白對IL-2R α不結合，但是該突變蛋白激活CD25-細胞的效應弱，對CD25+細胞的激活偏向性依然存在。此外，Rodrigo Vazquez-Lombardi等人也提出了藉由製備白介素2-Fc融合物來改善白介素的藥效學性質，但是該融合蛋白的表達量低且易於形成聚集體。
鑒於IL-2在免疫調節和疾病中的作用，本領域仍然存在著開發具有改善性質的新IL-2分子的需求，特別是展現出有利生產、純化、具有改善的藥效學性質的IL-2分子。
本發明藉由提供相對於野生型IL-2具有改善的成藥性質和/或改善的IL-2受體選擇性/偏向性的新IL-2突變蛋白，滿足了上述的需求。
因此，在一個方面，本發明提供了新的IL-2突變蛋白。在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白具有以下的一個或多個特性：(i)改善的成藥性，尤其是在哺乳動物細胞中表達時改善表達和/或純化，(ii)降低或消除與IL-2R α的結合；(iii)增強與IL-2R β的結合。
在一些實施方案中，本發明提供在IL-2與IL-2R α的結合界面包含引入的突變糖基化基序的IL-2突變蛋白；在另一些實施方案中，本發明提供在IL-2的B’C’環區包含缺失和/或替代以具有縮短的環序列的IL-2突變蛋白；在再一些實施方案中，本發明提供具有突變的糖基化基序和縮短的B’C’環序列兩者的IL-2突變蛋白。
此外，本發明提供了包含IL-2突變蛋白的融合蛋白和免疫綴合物，醫藥組成物和組合產品；編碼IL-2突變蛋白的核酸，包含所述核酸的載體和宿主細胞；以及產生本發明的IL-突變蛋白、融合蛋白和免疫綴合物的方法。
再有，本發明也提供了利用本發明的IL-2突變蛋白和融合物和免疫綴合物治療疾病的方法和刺激受試者免疫系統的方法和用途。在一些實施方案中，本發明方法在受試者中導致CD25-效應T細胞和NK細胞的強激活和擴增。在再一些實施方案中，藉由本發明方法，可以有效地減少IL-2在Treg細胞上介導的免疫下調作用。
在下面的圖式和具體實施方案中進一步說明本發明。然而，這些圖式和具體實施方案不應被認為限制本發明的範圍，並且本領域技術人員容易想到的改變將包括在本發明的精神和所附申請專利範圍的保護範圍內。
第1圖顯示了IL-2與IL-2R α的晶體結構(PDB：1Z92)(A)和IL-2糖基化修飾蛋白的結構示意圖(B)。
第2圖顯示了IL-2晶體結構(PBD：2ERJ)(A)和人與鼠的IL-2及人IL15的B’C’loop結構superpose(B)。
第3圖顯示了IL-2R α純化後的樣品HPLC純度檢測圖譜。
第4圖顯示了IL-2R β純化後的樣品HPLC純度檢測圖譜。
第5圖顯示了選擇並構建的一些IL-2mutant-FC在CD8+ CD25-/CD25+ T細胞上激活p-STAT5的信號曲線。
第6圖顯示了人白介素(IL-2)的成熟蛋白序列(SEQ ID NO：26)及其胺基酸殘基編號，並顯示了示例性的IL-2糖基化突變體和IL-2嵌合及截短B’C’環突變體。
[發明詳述]
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本領域一般技術人員通常所理解的含義相同的含義。為了本發明的目的，下文定義了以下術語。
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
術語“和/或”應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或多項的組合。
如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”或“包括”某個突變或突變組合的IL-2突變蛋白時，也旨在涵蓋僅具有所述突變或突變組合的IL-2突變蛋白。
在本文中，野生型“白介素-2”或“IL-2”是指作為引入本發明突變或突變組合的模板的親本IL-2蛋白，較佳天然存在的IL-2蛋白，例如來源於人、小鼠、大鼠、非人靈長類動物的天然IL-2蛋白，包括未經加工的(例如未去除信號肽)的形式和經加工的(例如去除了信號肽)的形式。包含信號肽的一個全長天然人IL-2序列顯示於SEQ ID NO：29中，其成熟蛋白的序列顯示於SEQ ID NO：30中。此外，該表述也包括天然存在的IL-2等位基因變體和剪接變體、同種型、同源物、和物種同源物。該表述也包括天然IL-2的變體，例如，所述變體可以與天然IL-2具有至少95%-99%或更高同一性或具有不超過1-10個或1-5個胺基酸突變(尤其是保守胺基酸取代)，並與天然IL-2蛋白具有基本相同的IL-2R α結合親和力和/或IL2R β結合親和力。因此，在一些實施方案中，野生型IL-2相比於天然IL-2蛋白可以包含不影響其對IL-2受體結合的胺基酸突變，例如，在125位引入了突變C125S的天然人IL-2蛋白(uniprot：P60568)屬於本發明的野生型IL-2。一個包含C125S突變的野生型人IL-2蛋白的實例顯示於SEQ ID NO：26中。在一些實施方案中，野生型IL-2序列可以與SEQ ID NO：26或29或30的胺基酸序列具有至少85%，95%，甚至至少96%,97%,98%，或99%或更高的胺基酸序列同一性。
在本文中，胺基酸突變可以是胺基酸取代、缺失、插入和添加。可以進行取代、缺失、插入和添加的任意組合來獲得具有期望性質(例如降低的IL-2R α結合親和力)的最終突變蛋白構建體。胺基酸缺失和插入包括在多肽序 列的胺基和/或羧基末端的缺失和插入。例如，可以在全長人IL-2位置1缺失丙胺酸殘基。在一些實施方案中，較佳的胺基酸突變是胺基酸取代。在另一些實施方案中，較佳的胺基酸突變是胺基酸缺失。在一些實施方案中，在本發明描述的具體突變胺基酸位置上引入突變來獲得具有改變的糖基化基序的IL-2突變蛋白。在一些實施方案中，在本發明描述的具體突變胺基酸位置上引入突變來獲得具有縮短的B’C’環序列的IL-2突變蛋白。
在本發明中，當提及IL-2蛋白的胺基酸位置時，藉由參考SEQ ID NO：26的野生型人IL-2蛋白(也稱作IL-2WT)胺基酸序列(如圖6所示)予以確定。可以藉由進行胺基酸序列比對(例如使用BLAST；可從http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome獲得的Basic LocalAlignment Search Tool，使用默認參數，進行比對)，鑒定在其它IL-2蛋白或多肽(包括全長序列或截短片段)上的對應胺基酸位置。因此，在本發明中，除非另有說明，否則IL-2蛋白或多肽中的胺基酸位置為根據SEQ ID NO：26編號的胺基酸位置。例如，當提及“F42”時，是指SEQ ID NO：26的第42位苯丙胺酸殘基F，或經比對在其它IL-2多肽序列上的對應位置的胺基酸殘基。
在本文中，在提及IL-2突變蛋白時，按照以下方式描述突變。胺基酸取代表示為[原始胺基酸殘基/位置/取代的胺基酸殘基]。例如，位置35的胺基酸取代為天冬醯胺(N)，可以表示為35N，如果35位的原始胺基酸殘基是賴胺酸，則也可以表示為K35N。當取代的殘基以X表示時，例如36X，是指在位置36的胺基酸可以被任何殘基取代，如果X具有特定殘基取值，則該位置由所定義的特定X殘基取代。但在僅給出原始殘基和位置的表示中，例如在本發明的突變糖基化基序K35N-L36-T37中的L36和T37，其是指在所述位置36和37不發生突變，即，36位和37位保留原始殘基L和T。
在本文中，可以藉由在比較窗內比較兩條最佳比對的序列來確定“序列同一性百分比”。較佳地，在參考序列(例如SEQ ID NO：26)的全長上確定序列同一性。用於比較的序列比對方法是本領域內公知的。適用於確定序列同一性百分比的算法包括例如BLAST和BLAST 2.0算法(參見Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-402,1977和Altschul等J.Mol.Biol.215：403-10,1990。可藉由美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)公眾獲取(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)用於進行BLAST分析的軟體。出於本申請的目的，同一性百分比通常用設置為缺省參數的BLAST2.0算法來確定。
如本文中使用的，術語“保守取代”意指不會不利地影響或改變包含胺基酸序列的蛋白/多肽的生物學功能的胺基酸取代。例如，可藉由本領域內已知的標準技術例如定點誘變和PCR介導的誘變引入保守取代。典型的保守型胺基酸取代是指將一種胺基酸取代為具有相似的化學性質(例如電荷或疏水性)的另一種胺基酸。以下六組各自包含彼此可進行典型保守取代的胺基酸：1)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；2)天冬胺酸(D)、谷胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、穀胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、賴胺酸(K)；5)異亮胺酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；和6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。例如，野生型IL-2蛋白可以相對於SEQ ID NO：26,29或30之一具有保守胺基酸取代，或僅具有保守胺基酸取代。再例如，本發明的突變IL-2蛋白可以相對於本文中具體給出的IL-2突變蛋白序列(例如SEQ ID NO：31-50之任一)具有保守胺基酸取代，或僅具有保守胺基酸取代。
“親和力”或“結合親和力”可以用於反映結合對子的成員之間相互作用的內在結合能力。分子X對其結合配偶體Y的親和力可以由平衡解離常數(KD)表示，平衡解離常數是解離速率常數和結合速率常數(分別是kdis和kon) 的比值。結合親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的生物膜層干涉(BLI)技術測定。
在本文中，抗體結合分子是可以特異性結合抗原的多肽分子，例如，免疫球蛋白分子、抗體或抗體片段，例如Fab片段和scFv片段。
在本文中，抗體Fc片段是指含有至少一部分的恒定區的免疫球蛋白重鏈的C-端區域，並且可以包括天然序列Fc片段和變體Fc片段。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fc片段從重鏈的Cys226或從Pro230延伸至羧基端。在另一實施方案中，Fc-片段的C-端賴胺酸(Lys447)可以存在或可以不存在。在另一些實施方案中，Fc片段可以包含突變，例如L234A/L235A突變。除非本文中另外指出，Fc片段中的胺基酸殘基的編號根據EU編號系統，也稱為EU索引，如Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。
本發明的各方面將在下面各小節中進一步詳述。
1．本發明的IL-2突變蛋白
本發明在一方面提供新IL-2突變蛋白，所述突變蛋白具有改善的成藥性質和/或改善的IL-2受體選擇性/偏好性。
本發明IL-2突變蛋白的有利生物學性質
IL-2蛋白藉由與IL-2受體相互作用來引發信號傳導和發揮功能。野生型IL-2對不同IL-2受體顯示出不同的親和力。在靜息效應細胞(包括CD8+細胞毒性T細胞和NK細胞)上表達與野生型IL-2具有較低親和力的IL-2 β和γ受體。在調節性T細胞(Treg)細胞和激活的效應細胞上表達與野生型IL-2具有高親和力的IL-2R α。由於高親和力的原因，野生型IL-2會優先結合細胞 表面的IL-2R α，再招募IL-2R β γ，藉由IL-2R β γ釋放下游p-STAT5信號，刺激Treg細胞和激活的效應細胞。因此，不受理論的束縛，降低或消除IL-2對IL-2R α受體的親和力，將降低IL-2優先激活CD25+細胞的偏向性，降低IL-2介導的Treg細胞的免疫下調作用。不受理論的束縛，維持或增強對IL-2β受體的親和力將保留或增強IL-2對效應細胞如CD8+細胞毒性T細胞和NK細胞的激活作用和由此IL-2的免疫刺激作用。
本發明人發現，可以藉由在IL-2與IL-2R α受體結合界面引入一個或多個特定的N糖基化基序，改善IL-2突變蛋白的表達和/或純度、和/或降低IL-2突變蛋白對IL-2R α的結合。此外，本發明人還發現，可以藉由將IL-2本身的B’C’環序列替換為來自其它白介素細胞因子例如IL-15的短B’C’環序列，或藉由對IL-2本身的B’C’環序列進行截短，來增加IL-2的表達和/或純度，並同時提高對IL-2R β的親和力。
由此，本發明提供了具有改善的性質的IL-2突變蛋白。本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，可以具有選自例如以下的一項或多項的改善性質：(i)在哺乳動物細胞中表達時改善的表達和/或純度；(ii)降低或消除的對IL-2R α受體的結合；和/或(iii)增強的對IL-2R β受體的結合。
在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，具有選自例如以下的一項或多項的改善性質：(1)對IL-2R α受體的結合親和力降低或消除，(2)對IL-2R β受體的結合親和力增強；(3)對高親和力IL-2R受體(IL-2R α β γ)的結合親和力降低；(4)對中等親和力IL-2R受體(IL-2R β γ)的結合親和力增加； (5)在CD25+細胞(特別是激活的CD8+ T細胞和Treg細胞)中激活IL-2信號傳導，尤其是激活STAT5磷酸化信號的能力降低；(6)導致減少的由IL-2介導的CD25+細胞(特別是激活的CD8+ T細胞和Treg細胞)激活和增殖；(7)降低或消除IL-2優先刺激Treg細胞增殖的偏向性；(8)降低Treg細胞在IL-2誘導下的免疫下調作用；(9)保持或增強，尤其是增強，對CD25-細胞(尤其是CD25- T效應細胞和NK細胞)的激活作用；(10)導致增加的由IL-2介導的效應T細胞與NK細胞激活和增殖；(11)導致提高的免疫刺激作用；(12)提高抗腫瘤效應。
在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白具有上述(1)的性質，較佳地進一步具有選自(3)和(5)-(8)的一項或多項，尤其是所有的性質；更較佳地還進一步具有選自(2)和(9)-(12)的一項或多項，尤其是所有性質。在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白具有上述(2)的性質，較佳地進一步具有選自(9)-(12)的一項或多項，尤其是所有的性質；更較佳地還進一步具有選自(1),(3)和(5)-(8)的一項或多項，尤其是所有的性質。
在一些較佳實施方案中，本發明IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2還具有以下一個或多個性質：減小的由IL-2與高親和力受體IL-2 α β γ結合介導的體內毒性。
在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白具有改善的成藥性質，例如，當在哺乳動物細胞例如H293T細胞中表達時，較佳地以Fc融合蛋白表達時，具有選自以下的一項或多項性質：(i)優於野生型IL-2蛋白的表達量；(ii)優於野生型IL-2蛋白的穩定性；和(iii)易於純化至更高的蛋白純度。
在本發明的一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白與野生IL-2相比表現出表達水平的增加。在本發明的一些實施方案中，增加的表達發生在哺乳動物細胞表達系統中。表達水平可藉由允許定量或半定量分析細胞培養上清液(較佳一步親和層析純化後的上清液)中的重組IL-2蛋白量的任何合適方法來測定。例如，可以藉由蛋白質印跡或ELISA，評估樣品中的重組IL-2蛋白量。在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白，與野生型IL-2相比，在哺乳動物細胞中的表達量增加至少1.1倍，或至少1.5倍，或至少2倍、3倍或4倍以上。
在一些實施方案中，如藉由測定蛋白A親和層析後純化蛋白的純度所顯示的，本發明IL-2突變蛋白-Fc融合物，相對於野生型IL-2蛋白融合物，表現出更好的穩定性，例如具有更少的形成聚集體的傾向。在一些實施方案中，蛋白純度藉由SEC-HPLC技術檢測。在一些較佳的實施方案中，一步蛋白A親和層析純化後，本發明IL-2突變蛋白產物的純度可以達到70%，或80%，或90%以上。
在一些實施方案中，相對於野生型IL-2(例如SEQ ID NO：26中所示IL-2WT)，本發明IL-2突變蛋白對IL-2R α受體的結合親和力降低至少5倍、至少10倍、或至少25倍，尤其是至少30倍、50倍或100倍以上。在較佳的實施方案中，本發明的突變蛋白不結合IL-2受體α。結合親和力可以藉由生物膜層干涉(BLI)技術測定本發明IL-2突變蛋白，例如與Fc片段融合的本發明IL-2突變蛋白，與受體IL-2R α受體的平衡解離常數(KD)來確定。在一些實施方案中，藉由BLI技術測定IL-2突變蛋白(例如以Fc融合物的形式)與受體IL-2R α或IL-2R β的單價結合親和力。
在一些實施方案中，相對於野生型IL-2(例如SEQ ID NO：26中所示IL-2WT)，本發明IL-2突變蛋白對IL-2R β受體的結合親和力增強至少5倍， 至少10倍，或至少25倍，尤其是至少30倍、50倍或100倍，更佳地，至少150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、或500倍或550倍以上。結合親和力可以藉由生物膜層干涉(BLI)技術測定本發明IL-2突變蛋白，例如與Fc片段融合的本發明IL-2突變蛋白，與受體IL-2R β受體的平衡解離常數(KD)來確定。在一個實施方案中，以IL-2-Fc融合蛋白形式，在BLI測定中(例如實施例中所述的BLI測定)，本發明IL-2突變蛋白與受體IL-2R β受體的單價結合親和力KD值小於10.0E-07M，例如8.0E-071M至1.0E-07M，例如4.0E-07M,3.0E-07M，2.0E-07M,1.0E-07M，更佳地小於10.0E-08M，例如小於9.0E-10M。
在一個實施方案中，相對於野生型IL-2，本發明IL-2突變蛋白導致減少的由IL-2介導的CD25+細胞激活和增殖。在一個實施方案中，CD25+細胞是CD25+ CD8+ T細胞。在另一實施方案中，CD25+細胞是Treg細胞。在一個實施方案中，在STAT5磷酸化測定試驗中，藉由檢測IL-2突變蛋白在CD25+細胞中對STAT5磷酸化信號的激活，來鑒定IL-2突變蛋白激活CD25+細胞的能力。例如，如本申請實施例中所述，可以藉由流式細胞術分析細胞中的STAT5磷酸化，確定半最大有效濃度(EC50)。
在一個實施方案中，相對於野生型IL-2，本發明IL-2突變蛋白導致保持的或增強的由IL-2介導的CD25-效應細胞激活和增殖。在一個實施方案中，CD25-細胞是CD8+效應T細胞或NK細胞。在一個實施方案中，在STAT5磷酸化測定試驗中，藉由檢測IL-2突變蛋白在CD25-細胞中激活STAT5磷酸化信號的EC50值，來鑒定IL-2突變蛋白激活CD25-細胞的能力。在一個實施方案中，如在STAT5磷酸化測定試驗中測定的，本發明IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白(例如SEQ ID NO：26的人IL-2)，激活CD25+細胞的能力提 高了至少1倍、例如2倍，3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍。
在一個實施方案中，相對於野生型IL-2，本發明IL-2突變蛋白去除或降低IL-2對CD25+細胞優先激活的偏向性。在一個實施方案中，CD25+細胞是CD25+ CD8+ T細胞。在另一實施方案中，CD25+細胞是Treg細胞。在一個實施方案中，在STAT5磷酸化測定試驗中，藉由檢測IL-2突變蛋白分別在CD25-細胞中和在CD25+細胞中激活STAT5磷酸化信號的EC50值，來鑒定IL-2突變蛋白激活CD25-細胞的能力。例如，藉由計算在CD25-和CD25+ T細胞上激活STAT5磷酸化信號的EC50值的比值，確定IL-2突變蛋白對CD25+細胞的激活偏向性。較佳地，相對於野生型蛋白，突變蛋白對CD25+的偏向性降低了至少10倍，較佳至少100倍，150倍，或200倍。
本發明的突變蛋白
糖基化突變蛋白
在一方面，本發明提供了在IL-2和IL-2Ra結合界面包含突變糖基化基序的IL-2突變蛋白。
如本領域已知，多肽典型地經N-連接或O-連接進行糖基化。N-連接糖基化指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸(N X S)及天冬醯胺-X-蘇胺酸(N X T)為N-連接糖基化基序，其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸。這些三肽序列的任一者在多肽中的存在將導致潛在的糖基化位點。向蛋白質(例如IL-2)添加N連接的糖基化位點可以便利地藉由改變胺基酸序列使得其含有一個或多個上述三肽序列來完成。例如，可藉由改變用於單一胺基酸的密碼子添加N-連接的糖基化位點。例如，編碼N-X-z(其中z為任何胺基酸)的密碼子可經改變以編碼N-X-T(或N-X-S)，或編碼y-X-T/S的密碼子可經改變以編碼N-X-T/S。可替代地，可同時改變編碼兩個胺基酸的 密碼子，以引入N-連接的糖基化位點(例如，y-X-z的密碼子可經改變以編碼N-X-T/S)。
在本文中，因引入的突變而出現在IL-2蛋白中的糖基化基序，可以以突變糖基化基序來描述。例如，突變糖基化基序K35N-L36-T37是由35位賴胺酸替代為天冬醯胺而36和37位殘基保持不變而形成的N-連接糖基化基序。在本發明較佳的實施方案中，引入的突變糖基化基序為N-連接的糖基化基序，N-X-S/T，其中X是除脯胺酸外的任何胺基酸。在一些實施方案中，例如，X可以是與野生型IL-2相應位置的胺基酸相同的胺基酸，或是其保守取代殘基。
在一些實施方案中，本發明提供IL-2糖基化突變蛋白，與野生型IL-2(較佳人IL-2，更佳包含SEQ ID NO：26序列的IL-2)相比，所述突變蛋白包含至少一個突變，所述突變在選自以下的胺基酸位置引入一個或多個糖基化基序N-X-S/T：
35N-36X-37T/S；38N-39X-40T/S；41N-42X-43T/S；43N-44X-45T/S；45N-46X-47T/S；62N-63X-64T/S；68N-69X-70T/S；72N-73X-74T/S；74N-75X-76T/S，其中，X是除脯胺酸外的任何胺基酸，較佳地X是與野生型IL-2相應位置的胺基酸相同的胺基酸，或是其保守取代殘基；其中胺基酸位置根據SEQ ID NO：26編號。在一些實施方案中，所引入的N連接糖基化位點的數量可以是一個以上，例如兩個糖基化位點。不同的糖基化位點可以賦予IL-2不同的性質，例如一些糖基化位點可以賦予改善的表達和/或純化性質，一些糖基化位點可以改善的IL-2受體選擇性。在再一些實施方案中，除了藉由突變引入的糖基化基序外，本發明突變蛋白還可以包含與野生型IL-2不同的至少1-30個胺基酸殘基，例如1-20,1-15，1-10，或1-5個不同的胺基酸殘基。這些不同殘基可以是保守取代，也可以是賦予IL-2其它改善性質的其它突變。
改善成藥性質的糖基化突變
在一些實施方案中，突變糖基化基序改善IL-2蛋白的成藥性質，尤其是促進IL-2蛋白的表達和/或純化。
在一個實施方案中，所述改善成藥性質的突變糖基化基序選自：35N-36X-37T/S；38N-39X-40T/S；和74N-75X-76T/S。在一個較佳實施方案中，突變糖基化基序選自：(i)K35N-L36-T37；(ii)R38N-M39-L40S；和(iii)Q74N-S75-K76T。在一個更佳的實施方案中，突變糖基化基序是K35N-L36-T37。
由此，在一些實施方案中，本發明提供，與野生型IL-2相比，包含突變糖基化基序的IL-2突變蛋白，所述突變糖基化基序選自：35N-36X-37T/S；38N-39X-40T/S；和74N-75X-76T/S，且所述突變蛋白具有改善的成藥性質。在一個實施方案中，當在哺乳動物細胞中表達時，較佳地以Fc融合蛋白形式表達IL-2突變蛋白時，所述突變可以促進突變蛋白的表達和/或純化。在再一實施方案中，所述突變可以促進IL-2的穩定性，例如以Fc融合蛋白表達時在生產過程中相比野生型IL-2具有降低的形成聚集體的傾向。例如，在表達和一步蛋白A親和純化後，突變蛋白可以具有比野生型蛋白更高的純度。在一個較佳實施方案中，與野生型IL-2相比，所述突變蛋白包含選自以下的突變糖基化基序：(i)K35N-L36-T37；(ii)R38N-M39-L40S；(iii)Q74N-S75-K76T；更佳地所述突變蛋白包含突變糖基化基序K35N-L36-T37。
在一些實施方案中，突變糖基化基序藉由突變K35N而引入IL-2蛋白。在一些實施方案中，本發明提供這樣的IL-2突變蛋白，其具有在胺基酸序列上與SEQ ID NO：26,29或30之一中所列出的野生型IL-2蛋白的成熟區具有至少90%同一性的成熟區，且具有胺基酸殘基T37和突變K35N。
在一些實施方案中，突變糖基化基序藉由選自R38N/L40S或Q74N/K76T的成對突變而引入IL-2蛋白。在一些實施方案中，本發明提供這樣 的IL-2突變蛋白，其具有在胺基酸序列上與SEQ ID NO：26,29或30之一中所列出的野生型IL-2蛋白的成熟區具有至少90%同一性的成熟區，且具有選自R38N/L40S或Q74N/K76T的成對突變。
在一些實施方案中，突變蛋白包含與選自SEQ ID NO：31，32和38的胺基酸序列具有至少90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或98%或99%的同一性的序列。在再一較佳的實施方案中，所述突變蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO：31，32和38。
降低IL-2R α結合的糖基化突變
在一些實施方案中，突變糖基化基序改善IL-2蛋白的受體選擇性，尤其是降低IL-2與IL-2R α的結合。
在一個實施方案中，降低IL-2與IL-2R α結合的突變糖基化基序選自：41N-42X-43T/S；43N-44X-45T/S；45N-46X-47T/S；68N-69X-70T/S；72N-73X-74T/S，較佳糖基化基序43N-44X-45T/S，其中胺基酸位置根據SEQ ID NO：26編號。在一個較佳實施方案中，降低IL-2與IL-2R α結合的突變糖基化基序選自：(i)T41N-F42-K43S；(ii)K43N-F44-Y45T；(iii)Y45N-M46-P47S；(iv)E68N-V69-L70S；(v)L72N-A73-Q74T；更佳地，K43N-F44-Y45T。
由此，在一些實施方案中，本發明提供，與野生型IL-2相比，包含突變糖基化基序的IL-2突變蛋白，其中所述突變蛋白包含一個或多個選自以下的突變糖基化基序：41N-42X-43T/S；43N-44X-45T/S；45N-46X-47T/S；68N-69X-70T/S；72N-73X-74T/S，較佳糖基化基序43N-44X-45T/S，其中胺基酸位置根據SEQ ID NO：26編號，且其中，與野生型IL-2相比，所述突變蛋白具有降低的或消除的IL-2R α結合。
在再一實施方案中，本發明提供，與野生型IL-2相比，包含突變糖基化基序的IL-2突變蛋白，其中所述突變蛋白包含一個或多個選自以下的 突變糖基化基序：(i)T41N-F42-K43S；(ii)K43N-F44-Y45T；(iii)Y45N-M46-P47S；(iv)E68N-V69-L70S；(v)L72N-A73-Q74T；更佳地，所述突變蛋白包含突變糖基化基序K43N-F44-Y45T。
在一些實施方案中，突變糖基化基序藉由選自T41N/K43S；K43N/Y45T；Y45N/P47S；E68N/L70S；和L72N/Q74T的成對突變，而引入IL-2蛋白中。在一些實施方案中，本發明提供這樣的IL-2突變蛋白，其具有在胺基酸序列上與SEQ ID NO：26,29或30之一中所列出的野生型IL-2蛋白的成熟區具有至少85%或90%同一性的成熟區，且具有選自T41N/K43S；K43N/Y45T；Y45N/P47S；E68N/L70S；和L72N/Q74T的成對突變，較佳具有成對突變K43N/Y45T。在一些實施方案中，突變蛋白包含與選自以下的胺基酸序列具有至少90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或98%同一性的序列：SEQ ID NO：33、34、35、37、和39。
在一些實施方案中，除了上述降低IL-2與IL-2R α結合的突變糖基化基序，IL-2突變蛋白還可以包含：(i)選自35N-36X-37T/S；38N-39X-40T/S；和74N-75X-76T/S的突變糖基化基序；和/或(ii)突變K35Q。與野生型IL-2相比，所述突變蛋白具有降低的或消除的IL-2R α結合，且(例如在以Fc融合蛋白形式在哺乳動物細胞中表達時)具有改善的表達和/或純化特性。在一些較佳實施方案中，本發明提供IL-2突變蛋白，其具有在胺基酸序列上與SEQ ID NO：26,29或30之一中所列出的野生型IL-2蛋白的成熟區具有至少85%或90%同一性的成熟區，且具有選自T4IN/K43S；K43N/Y45T；Y45N/P47S；E68N/L70S；和L72N/Q74T的成對突變，並具有選自K35N；R38N/L40S；Q74N/K76T；或K35Q的突變。在一些實施方案中，突變蛋白包含與選自SEQ ID NO：45-47的胺基酸序列具有至少90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或98%同一性的序列。
B’C’環嵌合突變蛋白和截短突變蛋白
在一個方面，本發明提供在IL-2的B’C’環區引入突變形成的B’C’環嵌合IL-2突變蛋白和截短IL-2突變蛋白。IL-2蛋白屬於具有四個α螺旋束(A,B,C,D)結構的短鏈I型細胞因子家族成員。在本文中，“B’C’環區”或“B’C’環序列”可互換使用，是指IL-2蛋白的B螺旋和C螺旋之間的連接序列。在一個實施方案中，根據SEQ ID NO：26的編號，該連接序列是IL-2多肽中連接位置72的殘基和位置84的殘基的序列。在SEQ ID NO：26、29和30的野生型蛋白中，該連接序列包括A73-R83共11個胺基酸。
在一些實施方案中，所引入的突變導致，與野生型IL-2(較佳人IL-2，更佳包含SEQ ID NO：26序列的IL-2)相比，突變蛋白包含縮短的B’C’環區(即，胺基酸殘基aa72和aa84之間的連接序列長度縮短)，較佳地，所述縮短的環區具有小於10，9,8，7，6個或5個胺基酸長度，且較佳7個胺基酸長度，其中胺基酸殘基根據SEQ ID NO：26編號。
在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白為B’C’環嵌合突變蛋白。相對於野生型IL-2，所述突變蛋白包含對aa73至aa83序列的替代，例如替代為來自其它四螺旋短鏈細胞因子家族成員的短B’C’環序列。可以藉由晶體結構的superpose，從其它四螺旋短鏈細胞因子IL家族成員，例如IL-15，IL-4，IL-21，或來自非人物種(如小鼠)的IL家族成員，鑒定適用於替代野生型IL-2的短B’C’環。在一個較佳實施方案中，用於替代的序列為來自白介素IL-15(尤其是人IL-15)的B’C’環序列。較佳地，野生型IL-2中殘基73-83的序列被替代為序列SGDASIH。
在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白為B’C’環截短突變蛋白。相對於野生型IL-2，所述突變蛋白包含對aa73至aa83序列的截短，例如自C端截短1、2、3或4個胺基酸。較佳地，截短的環區(即，位置72和 位置84之間的連接序列)具有序列A(Q/G)S(K/A)N(F/I)H，較佳所述截短的環區具有序列AQSKNFH或AGSKNFH。
在一個實施方案中，藉由對B’C’環的替代或截短，可以增加B’C’環的穩定性，從而增加IL-2的穩定性和/或與IL-2R β的親和力。因此，在一個實施方案中，本發明提供，相對於野生型IL-2，具有增加的穩定性和/或增加的IL-2R β結合親和力的IL-2突變蛋白，所述突變蛋白包含前述的B’C’環嵌合突變或B’C’環截短突變，尤其是，位於位置72和位置84之間的替代的環序列SGDASIH或截短的環序列AQSKNFH或AGSKNFH。
在一個實施方案中，嵌合的B’C’環突變或截短的B’C’環突變不僅賦予增加的IL-2R β結合，也可以促進IL-2蛋白的表達和/或純化，尤其是在哺乳動物細胞表達系統中的表達和/或純化。由此，在一個實施方案中，本發明提供，相對於野生型IL-2，具有增強的IL-2R β結合和/或改善的表達和/或純化性質的IL-2突變蛋白。所述IL-2突變蛋白包含前述的B’C’環嵌合突變或B’C’環截短突變，尤其是，位於位置72和位置84之間的替代的環序列SGDASIH或截短的環序列AQSKNFH或AGSKNFH。
在一些較佳實施方案中，本發明提供這樣的IL-2突變蛋白，其具有在胺基酸序列上與SEQ ID NO：26,29或30之一中所列出的野生型IL-2蛋白的成熟區具有至少85%或90%同一性的成熟區，且在胺基酸位置72和84之間包含選自以下的連接序列：SGDASIH；AQSKNFH；AGSKNFH；AQSANFH；和AQSANIH。在一些實施方案中，突變蛋白包含與選自以下的胺基酸序列具有至少90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或98%同一性的序列：SEQ ID NO：40-44，較佳SEQ ID NO：40-42，更佳SEQ ID NO：40或41。
組合突變蛋白
在一方面，本發明提供包含組合突變的IL-2突變蛋白。在一個實施方案中，引入IL-2和IL-R α結合界面的糖基化突變可以相互組合，也可以與B’C’環突變組合，較佳地與本文中描述的B’C’環突變組合。在另一實施方案中，本發明B’C’環突變也可以與引入IL-2和IL-R α結合界面的糖基化突變組合，較佳地與本文中描述的糖基化突變組合。在一個較佳的實施方案中，藉由將B’C’環突變與引入IL-2和IL-R α結合界面的糖基化突變組合，可以提供選自以下兩項或全部三項的改善性質：(i)降低的(或消除的)IL-2R α結合；(ii)增強的IL-2R α結合，和(ii)改善的表達水平和純化。
由此，在一個實施實施方案中，本發明提供IL-2突變蛋白，其中，與野生型IL-2(較佳人IL-2，更佳包含SEQ ID NO：26序列的IL-2)相比，所述突變蛋白包含組合突變：(i)選自41N-42X-43T/S；43N-44X-45T/S；45N-46X-47T/S；68N-69X-70T/S；72N-73X-74T/S的突變糖基化基序；和(ii)在胺基酸位置aa72至aa84之間、選自SGDASIH和A(Q/G)S(K/A)N(F/I)H的縮短B’C’環區序列，其中胺基酸位置根據SEQ ID NO：26編號。
在一些較佳實施方案中，本發明提供這樣的IL-2突變蛋白，其具有在胺基酸序列上與SEQ ID NO：26,29或30之一中所列出的野生型IL-2蛋白的成熟區具有至少85%或90%同一性的成熟區，且在胺基酸位置72和84之間包含選自以下的連接序列：SGDASIH；AQSKNFH；AGSKNFH；AQSANFH；和AQSANIH；並具有選自以下的成對突變：T41N/K43S；K43N/Y45T；Y45N/P47S；E68N/L70S；和L72N/Q74T。在一些較佳實施方案中，本發明提供這樣的IL-2突變蛋白，其具有在胺基酸序列上與SEQ ID NO：26,29或30之一中所列出的野生型IL-2蛋白的成熟區具有至少85%或90%同一性的成熟區，且在胺基酸位置72和84之間包含選自以下的連接序列：SGDASIH；AQSKNFH；或AGSKNFH；並具有成對突變：K43N/Y45T。在一些實施方案中，突變蛋白 包含與選自以下的胺基酸序列具有至少90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或98%同一性的序列：SEQ ID NO：48，49或50，較佳SEQ ID NO：48或49。在一些實施方案中，所述突變蛋白由SEQ ID NO：48、49或50組成。
在一些實施方案中，組合突變導致IL-2具有降低的優先刺激CD25+T細胞中p-STATA5信號傳導的偏向性，且具有增強的刺激CD25- T細胞中信號傳導的能力。因此，在一個實施方案中，本發明也提供這樣的IL-2突變蛋白，所述突變蛋白包含組合突變：(i)在胺基酸位置43-45的突變糖基化基序K43N-F44-Y45T和在胺基酸位置aa72至aa84之間的替代序列SGDASIH；或(ii)在胺基酸位置43-45的突變糖基化基序K43N-F44-Y45T和在胺基酸位置aa72至aa84之間的截短序列AQSKNFH，且所述突變蛋白，與野生型IL-2相比，具有降低的優先刺激CD25+ T細胞中p-STATA5信號傳導的偏向性，且具有增強的刺激CD25- T細胞中信號傳導的能力。較佳地，所述突變蛋白包含SEQ ID NO：48或49的序列，或與其具有至少95%,96%、或更高的同一性的序列。更佳地，所述突變蛋白由SEQ ID NO：48或49的序列組成。
其它突變
除了上述區域和位置中的突變，本發明的IL-2突變蛋白還可以在其它區域或位置上具有一個或多個突變，只要其保留本發明IL-2突變蛋白的上述一個或多個有益性質即可。例如，本發明IL-2突變蛋白還可以包含在位置125的取代，例如C125S、C125A、C125T、或C125V，以提供額外的優點，例如改善的表達或同質性或穩定性(參見例如，美國專利號4,518,584)。本領域技術人員知曉如何確定可以併入本發明IL-2突變蛋白中的額外突變。
IL-2突變蛋白與野生型蛋白之間的序列差異性可以用序列同一性表述，也可以用兩者之間差異胺基酸的數量來表達。在一個實施方案中，IL-2突變蛋白與野生型蛋白之間具有至少85%，86%,87%,88%,89%同一性，較佳90%以上同一性，較佳95%，但較佳不超過97%，更佳不超過96%同一性。在另一實施方案中，除了本發明的上述糖基化突變或B’C’環突變或兩者的組合突變外，IL-2突變蛋白與野生型蛋白之間還可以具有不超過15個，例如1-10個，或1-5個突變。在一個實施方案中，所述其餘突變可以是保守取代。
2.融合蛋白和免疫綴合物
本發明還提供包含本發明IL-2突變蛋白的融合蛋白。在一個較佳的實施方案中，本發明IL-突變蛋白與可以賦予改善的藥代動力學性質的另一多肽融合，例如清蛋白，更佳抗體Fc片段。在一個實施方案中，Fc片段包含減小或去除效應子功能的突變，例如降低與Fc γ受體結合的L234A/L235A突變或L234A/L235E/G237A。較佳地，包含Fc的融合蛋白具有增加的血清半衰期。在一個較佳的實施方案中，包含Fc的融合蛋白同時還具有減少的由Fc區介導的效應子功能，例如減少的或消除的ADCC或ADCP或CDC效應子功能。
在一個實施方案中，本發明也提供這樣的IL-2突變蛋白-Fc融合蛋白，其中Fc片段包含效應子功能，例如ADCC。如文獻報道的(Rodrigo Vazquez-Lombardi等，同上引文)’野生型IL-2可以藉由與Fc融合，藉由Fc-介導(尤其是由結合Fc γ R所介導)的免疫效應子功能而耗竭Treg細胞，從而改善對腫瘤治療。因此，將具有改善的表達和/或純化等生產性質的本發明IL-2突變蛋白，與保留免疫效應子功能的Fc片段融合，也落入本發明的考慮中。在一個實施方案中，所述融合蛋白包含突變K35N或K35Q或成對突變R38N/L40S 或Q74N/K76T。在另一些實施方案中，所述融合蛋白包含在胺基酸位置aa72至aa84之間的替代序列SGDASIH或截短序列A(Q/G)S(K/A)N(F/I)H。在一個實施方案中，所述融合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7,8,14，20-22具有90%-99%以上同一性。在另一實施方案中，所述融合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：12具有不超過0-10或0-5個胺基酸突變。
在一些實施方案中，IL-2突變蛋白藉由接頭與Fc融合。在一些實施方案中，可以選擇接頭以提高Fc融合蛋白對於CD25- T細胞的激活作用。在一個實施方案中，接頭是GSGS，更較佳為2x(G4S)。
在一些實施方案中，Fc融合蛋白包含與選自以下的胺基酸序列至少85%，至少95%，或至少96%的同一性：SEQ ID NO：3-13和16-25。在一些實施方案中，Fc融合蛋白由SEQ ID NO：3-13和16-25的序列組成。
本發明還提供免疫綴合物，其包含本發明的IL2突變蛋白和抗原結合分子。較佳地，抗原結合分子是免疫球蛋白分子，特別是IgG分子，或抗體或抗體片段，特別是Fab分子和scFv分子。在一些實施方案中，所述抗原結合分子特異性結合腫瘤細胞上或腫瘤環境中呈現的抗原，例如選自以下的抗原：成纖維細胞活化蛋白(FAP)、生腱蛋白C的A1域(TNC A1)、生腱蛋白C的A2域(TNC A2)、纖連蛋白的外域B(Extra Domain B,EDB)、癌胚抗原(CEA)、和黑素瘤有關的硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)。由此，本發明免疫綴合物在施用於受試者體內後可以靶向腫瘤細胞或腫瘤環境，從而提供進一步的治療益處，例如以更低的劑量進行治療的可行性和由此帶來的低副作用；增強的抗腫瘤效應等。
在本發明的融合蛋白和免疫綴合物中，本發明IL-2突變蛋白可以直接或藉由接頭與另一分子或抗原結合分子連接，且在一些實施方案中，在兩者之間包含蛋白水解切割位點。
3.多核苷酸、載體和宿主
本發明提供編碼以上任何IL-2突變蛋白或融合物或綴合物的核酸。可以採用本領域熟知的方法，藉由從頭固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼野生型IL-2的現有序列，產生編碼本發明突變蛋白的多核苷酸序列。此外，本發明的多核苷酸和核酸可以包含編碼分泌信號肽的區段，並與編碼本發明突變蛋白的區段可操作連接，從而可以指導本發明突變蛋白的分泌性表達。
本發明也提供包含本發明核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體，例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、粘粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。在較佳的實施方案中，本發明的表達載體是pYDO_017表達載體。
本發明也提供包含所述核酸或所述載體的宿主細胞。適用於複製並支持突變IL-2蛋白或融合物或免疫綴合物表達的宿主細胞是本領域中公知的。可以用特定的表達載體轉染或轉導這類細胞，並且可以生長大量的含載體細胞以用於接種大規模發酵罐，從而獲得充足量的IL-2突變體或融合物或免疫綴合物用於臨床應用。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞或293細胞)。例如，可以在細菌中生成多肽，尤其在不需要糖基化時。在表達後，可以在可溶性級分中將多肽從細菌細胞糊分離並可以進一步純化。除了原核生物外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合編碼多肽的載體的純株或表達宿主，其中包括糖基化途徑已被“人源化”的真菌和酵母菌株，這導致生成具有部分或完全的人糖基化模式的多肽。參見Gerngross,NatBiotech22,1409-1414(2004)和Li等，NatBiotech24,210-215(2006)。可用的哺乳動物宿主細胞系的例子是由SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚胎腎系(293或293T細胞，如例如記載於Graham 等，JGenVirol36,59(1977))、幼侖鼠腎細胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4細 胞，如例如記載於Mather,BiolReprod23,243-251(1980))、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)，buffalo大鼠肝細胞(BRL3A)、人肺細胞(W138)、人肝細胞(HepG2)、小鼠乳房腫瘤細胞(MMT060562)、TRI細胞(如例如記載於Mather等，AnnalsN.Y.AcadSci383,44-68(1982))、MRC5細胞和FS4細胞。其它可用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub 等，ProcNatlAcadSciUSA77,4216(1980))；和骨髓瘤細胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。在一個實施方案中，宿主細胞是真核生物細胞，較佳為哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚胎腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。
4.製備方法
再一方面，本發明提供製備本發明IL-2突變蛋白或融合物或綴合物的方法，其中所述方法包括，在適合IL-2突變蛋白或融合物或綴合物表達的條件下，培養包含編碼所述蛋白或融合物或綴合物的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從所述宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收所述蛋白或融合物或綴合物。
5.測定法
可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供IL-2突變蛋白進行鑒定，篩選，或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。
一方面，可以對本發明的IL-2突變蛋白，測試其與IL-2受體的結合活性。例如，可以藉由本領域已知的方法，諸如ELISA、Western印跡等，或本文實施例公開的例示性方法，來測定與人IL-2R α或β蛋白的結合。例如，可以使用流式細胞術進行測定，其中使經轉染在細胞表面上表達突變蛋白的細胞例如酵母展示細胞，與標記的(例如生物素標記的)IL-2R α或β蛋白進 行反應。備選地，突變蛋白與受體的結合，包括結合動力學(例如KD值)，可以使用重組突變蛋白-Fc融合物，在生物膜層干涉(BLI)測定法中測定。在一些實施方案中，使用如實施例所描述的BLI測定法。
再一方面，可以藉由測定在受體結合下游發生的信號傳導和/或免疫激活效應。來間接測量IL-2突變蛋白結合IL-2受體的能力。
因此，在一些實施方案中，提供了用於鑒定具有生物學活性的突變IL-2蛋白的測定法。生物學活性可以包括，例如誘導具有IL-2受體的T和/或NK細胞和/或Treg細胞增殖的能力、誘導具有IL-2受體的T和/或NK細胞和/或Treg細胞中IL-2信號傳導的能力、降低的誘導T細胞中細胞凋亡的能力、誘導腫瘤消退和/或改善存活的能力、和降低的體內毒性性質，例如降低的血管通透性。本發明也提供體內和/或體外具有這類生物學活性的突變IL-2蛋白。
本領域中公知多種方法可以用於測定IL-2的生物學活性。例如，用於測試本發明IL-2突變蛋白刺激NK細胞生成IFN-γ的能力的合適測定法，可以包括如下步驟：將培養的NK細胞與本發明的突變IL-2蛋白或融合或免疫綴合物溫育，並隨後藉由ELISA測量培養基中的IFN-γ濃度。IL-2信號傳導誘導數個信號傳導途徑，並且牽涉JAK(Janus激酶)和STAT(信號轉導物和轉錄的激活劑)信號傳導分子。
IL-2與受體β和γ亞基的相互作用導致受體以及JAK1和JAK3(分別與β和γ亞基結合)的磷酸化。然後，STAT5與磷酸化受體結合，並自身在非常重要的酪胺酸殘基上磷酸化。這導致STAT5從受體解離、STAT5二聚化以及STAT5二聚體移位至細胞核，在該處它們促進靶基因的轉錄。由此，可以例如藉由測量STAT5的磷酸化，評估突變體IL-2多肽經由IL-2受體誘導信號傳導的能力。此方法的詳情已經披露在實施例中。例如，可以將 PBMC用本發明的突變體IL-2多肽或融合物或免疫綴合物處理，並藉由流式細胞術測定磷酸化STAT5的水平。
此外，可以藉由將從血液分離的T細胞或NK細胞與本發明的突變體IL-2多肽或免疫綴合物溫育，接著測定經處理細胞的裂解物中的ATP含量，以測量T細胞或NK細胞應答IL-2的增殖。在處理前，可以用植物凝集素(PHA-M)預刺激T細胞。此測定法允許對存活細胞數目的靈敏定量，本領域中還已知大量合適的備選測定法(例如[3H]-胸苷摻入測定法、細胞滴定GloATP測定法、AlamarBlue測定法、WST-1測定法、MTT測定法)。
再有，可以在多種本領/或中已知的動物腫瘤模型中評估突變的IL-2對腫瘤生長和存活的影響。例如，可以將人癌症細胞系的異種移植物植入免疫缺陷型小鼠，並用本發明的突變體IL-2多肽或融合物或免疫綴合物處理。可以基於死亡率、生命期觀察(不良作用的可見症狀，例如行為、體重、體溫)以及臨床和解剖病理學(例如測量血液化學值和/或組織病理學分析)來測定本發明的突變體IL-2多肽、融合和免疫綴合物在體內的毒性。例如，可以在預處理血管通透性動物模型中用血管滲漏報告分子檢查藉由用IL-2處理所誘導的血管通透性。較佳地，血管滲漏報告分子足夠大以揭示用於預處理的IL-2野生型形式的通透性。
此外，對於本發明的IL-2糖基化突變蛋白，糖基化的存在、不存在或程度也可藉由本領域的技術人員已知的任何方法來測定，包括分子量(MW)偏移的半定性測量，如藉由蛋白質印跡或自考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠所觀察，而定量測量可包括利用質譜儀技術和觀察對應於天冬醯胺連接的糖基化的添加的MW偏移，或藉由觀察由酶諸如肽-N-糖甘酶F(PNGase-F；SigmaAldrich，St.Louis，MO)去除天冬醯胺連接的糖基化而伴有的質量偏移。
6.篩選方法
再一方面，本發明提供用於獲得具有改善性質的IL-2突變蛋白的方法。
在一個實施方案中，本發明提供用於獲得IL-2突變蛋白的方法，包括如下步驟：- 在IL-2與IL-2Ra的結合界面人為改造一個或多個(如兩個或三個)糖基化基序N-X-S/T(X可以為任意胺基酸，但P(脯胺酸)除外)，較佳在選自IL-2的如下區域引入糖基化基序：aa35-40,aa41-47，aa62-64,aa68-74，aa74-76；- 使得改造的IL-2突變蛋白，例如以Fc融合物形式(例如FcLALA融合物)，在哺乳動物細胞(例如HEK293或者CHO細胞)中表達。對於引入糖基化基序的位點的設計，N-糖基化預測工具可用於選擇可加以突變以促進潛在N-連接糖基化的位點，例如藉由鑒定可加以突變以形成標準N-x-T/S糖基化位點(其中N為天冬醯胺，x為除脯胺酸的任何胺基酸)的殘基。此外，可以使用基於結構的方法，鑒定IL-2中與IL-2R α距離為3.6Å，並且側鏈暴露在溶液中的胺基酸，作為突變為天冬醯胺的候選胺基酸。在一些較佳實施方案中，引入的糖基化基序突變選自：K35N-L36-T37；R38N-M39-L40S；T41N-F42-K43S；K43N-F44-Y45T；Y45N-M46-P47S；E62N-L63-K64T；E68N-V69-L70S；L72N-A73-Q74T；Q74N-S75-K76T。
另一方面，本發明提供用於獲得IL-2突變蛋白的方法，包括如下步驟：- 在IL-2的B’C’loop環區(aa73-83)引入缺失和/或替代以形成縮短的環區，較佳地將其替代為其它四螺旋短鏈細胞因子家族成員如IL15的B’C’loop環序列以形成B’C’loop嵌合體，或將IL-2的B’C’loop截短以形成B’C’loop截短體，較佳地縮短的環區具有小於10，9,8，且較佳等於7 個胺基酸長度；較佳地自環區C端截短1、2、3或4個胺基酸；較佳地縮短的環區具有序列A(Q/G)S(K/A)N(F/I)H，或SGDASIH；- 使得改造的IL-2突變蛋白，例如以Fc融合物形式(例如FcLALA融合物)，在哺乳動物細胞(例如HEK293或者CHO細胞)中表達。
在一個實施方案中，所述方法還包括：在蛋白表達和純化後，鑒定成藥性(例如表達量和/或產品穩定性和/或同質性，例如一步Fc親和層析純度)改善的IL2突變蛋白。在一個較佳實施方案中，在IL-2的區域aa35-40或aa74-76引入糖基化基序突變，以改善突變蛋白的成藥性。較佳地，引入的糖基化基序突變選自：K35N-L36-T37；R38N-M39-L40S；和Q74N-S75-K76T。在另一較佳實施方案中，藉由將B’C’loop環替代為縮短的環例如IL15的環序列或藉由截短B’C’loop環，以改善突變蛋白的成藥性。較佳地，縮短後的環序列選自：A(Q/G)S(K/A)NFH，或SGDASIH。在再一較佳實施方案中，所述方法包括，在糖基化突變之外，還引入其他點突變，例如K35Q，以改善突變蛋白的成藥性。如本領域技術人員明瞭，可以將這些突變與賦予其它改良性質的突變組合，以獲得具有多重改良性質的IL-2突變蛋白。
在一個實施方案中，所述方法還包括：鑒定相對於野生型IL-2表現出降低的(較佳消除的)IL-2Ra結合能力的IL-2突變蛋白。在一個實施方案中，IL-2突變蛋白與IL-2Ra的結合能力藉由測定親和力KD值確定，例如藉由生物膜薄層干涉技術測定。再一實施方案中，結合能力藉由測定IL-2突變蛋白對CD25+ T細胞的激活功效來確定。在一個實施方案中，IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，表現出降低的CD25+ T細胞激活功效，例如藉由測定細胞中p-STAT5信號的激活所確定的。較佳地將突變引入IL-2的區域：aa41-47或aa68-70或aa72-74，以形成潛在的N連接糖基化位點，然後檢測突變是否導致降低或消除的IL-2與IL-2R α的結合。較佳地，引入的糖基化基序突變選自： T41N-F42-K43S；K43N-F44-Y45T；Y45N-M46-P47S；E68N-V69-L70S；L72N-A73-Q74T。如本領域技術人員明瞭，可以將這些糖基化突變與賦予其它改良性質的突變組合，以獲得具有多重改良性質的IL-2突變蛋白。
在一個實施方案中，所述方法還包括鑒定相對於野生型IL-2表現出具有增強的IL-2R β結合的IL-2突變蛋白。在一個實施方案中，IL-2突變蛋白與IL-2R β的結合能力藉由測定親和力KD值確定，例如藉由生物膜薄層干涉技術測定。再一實施方案中，結合能力藉由測定IL-2突變蛋白對CD25- T細胞的激活功效來確定。在一個實施方案中，IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，表現出增強的CD25- T細胞激活功效，例如藉由測定細胞中p-STAT5信號的激活所確定的。在一個較佳實施方案中，將B’C’loop環替代為縮短的環例如IL15的環序列或藉由截短B’C’loop環，以增強對IL-2R β的結合。較佳地，縮短後的環序列選自：A(Q/G)S(K/A)NFH，或SGDASIH。如本領域技術人員明瞭，可以將這些糖基化突變與賦予其它改良性質的突變組合，以獲得具有多重改良性質的IL-2突變蛋白。
在再一實施方案中，所述方法包括組合引入上述改善成藥性的突變、降低IL2Ra結合的突變、和/或增強IL2R β結合的突變，和/或賦予其它改良性質的突變組合，以獲得具有多重改良性質的IL-2突變蛋白。在一個較佳實施方案中，組合引入糖基化突變，例如在區域aa41-47和aa68-74，以及縮短B’C’loop環區長度的截短和/或替代突變。在一個較佳實施方案中，所述方法包括鑒定相對於野生型IL-2表現出降低的IL-2Ra結合且增強的IL-2R β結合的IL-2突變蛋白，視需要地鑒定還具有改善成藥性(例如改善的表達和/或純度、和/或產品穩定性和/或同質性)的IL-2突變蛋白。
在一些實施方案中，用作突變模板的親本野生型IL-2蛋白較佳與SEQ ID NO：26具有至少85%，或至少90%或95%的同一性，更較佳地為來源人的IL-2蛋白。
7.醫藥組成物和藥物製劑
本發明還包括包含IL-2突變蛋白或其融合物或免疫綴合物的組合物(包括醫藥組成物或藥物製劑)和包含編碼IL-2突變蛋白或其融合物或免疫綴合物的多核苷酸的組合物。這些組合物還可以視需要地包含合適的藥用輔料，如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑，包括緩衝劑。
適用於本發明的藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括那些具有石油、動物、植物或合成起源的，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用醫藥組成物時，水是較佳的載體。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載體，特別是用於可注射溶液。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途，亦參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第五版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的話，所述組合物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、持續釋放配製劑等的形式。口服配製劑可以包含標準載體，如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精。
可以藉由將具有所需純度的本發明的IL-2突變蛋白、融合物或免疫綴合物，與一種或多種視需要的藥用輔料(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.編(1980))混合，來製備包含本發明的藥物製劑，較佳地以凍幹製劑或水溶液的形式。示例性的凍幹抗體製劑描述於美國專利號 6,267,958。水性抗體製劑包括美國專利號6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，後一種製劑包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。此外，可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有蛋白的固體疏水聚合物的半滲透基質，所述基質呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含一種或多種其它活性成分，所述活性成分是被治療的特定適應症所需的，較佳具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還提供其它抗癌活性成分，例如化療劑、PD-1軸結合拮抗劑(例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體)。所述活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。
因此，在一個實施方案中，組合物還包含第二治療劑。例如，第二治療劑可以是免疫檢查點抑制劑。例如第二治療劑可以選自包括但不限於：例如抗-CTLA-4抗體、抗CD47抗體、抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體、抗-CD40抗體、抗-OX40(亦稱為CD134,TNFRSF4,ACT35和/或TXGP1L)抗體、抗-LAG-3抗體、抗-CD73抗體、抗-CD137抗體、抗-CD27抗體、抗-CSF-1R抗體、TLR激動劑或IDO或TGF β的小分子拮抗劑的一種或多種。較佳地，第二治療劑是PD-1拮抗劑，尤其是抗PD-1抗體，抗PD-L1抗體、抗LAG-3，抗CD47。除了免疫治療藥物，第二治療劑也可以是其它放療或化療藥物。
8.組合產品
在一方面，本發明還提供了組合產品，其包含本發明的突變蛋白或其融合物或免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑等)。本發明的組合產品可用於本發明的治療方法中。
在一些實施方案中，本發明提供組合產品，其中所述其它治療劑為例如有效刺激免疫反應從而進一步增強、刺激或上調受試者的免疫反應的治 療劑如抗體。在一些實施方案中，其它抗體為例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體或抗-LAG-3抗體或抗-CTLA-4抗體或抗TIM-3抗體。
在一些實施方案中，所述組合產品用於預防或治療腫瘤。在一些實施方案中，腫瘤為癌症，例如胃腸道癌症，例如胃癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌等；或皮膚癌，例如黑素瘤；或腎細胞癌、膀胱癌、非小細胞肺癌等。在一些實施方案中，所述組合產品用於預防或治療感染，例如細菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染等。
9.治療方法和用途
在本文中，術語“個體”或“受試者”可互換地使用，是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如，奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。特別地，受試者是人。
在本文中，術語“治療”指意欲改變正在接受治療的個體中疾病之天然過程的臨床介入。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態，以及緩解或改善預後。
在一方面中，本發明提供刺激受試者免疫系統的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的包含本發明IL-2突變蛋白或融合物或免疫綴合物的醫藥組成物。本發明IL-2突變蛋白對於CD25- CD122+效應細胞(細胞毒性CD8+T細胞和NK細胞)具有高活性和選擇性，並具有降低的對CD25+ Treg細胞的刺激作用。因此，可以以低劑量使用本發明IL-2突變蛋白，以刺激受試者的免疫系統。
因此，在一些實施方案中，本發明涉及在受試者中增強機體的免疫應答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文所述的任何IL-2 突變蛋白、或其融合物或免疫綴合物。在一些實施方案，將本發明的IL-2突變蛋白或其融合物或免疫綴合物施用於攜帶腫瘤的受試者，刺激抗腫瘤免疫應答。在另一些實施方案中，將本發明的抗體或其抗原結合部分施用於攜帶感染的受試者，刺激抗感染免疫應答。在一個實施方案中本發明IL-2突變蛋白可以與Treg耗竭抗體(例如，Fc γ R介導的Treg耗竭)組合使用，以進一步降低由Treg引起的免疫抑制作用。在一個實施方案中，本發明IL-2突變蛋白可以與免疫檢查點抑制劑組合施用，以例如提高癌症免疫治療效果，例如與抗PD-1和抗CTLA-4組合。
在另一方面中，本發明涉及治療受試者疾病，如腫瘤和癌症和感染的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文所述的任何IL-2突變蛋白、或其融合物或免疫綴合物。
癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。在一些實施方案中，腫瘤或腫瘤細胞可以選自結直腸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腺腫瘤、肺腫瘤、肺腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸腫瘤、黑色素瘤、宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、成膠質細胞瘤和頭頸部腫瘤。在一些實施方案中，癌症可以選自結直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑色素瘤、宮頸癌、膀胱癌、成膠質細胞瘤和頭頸癌。在一些實施方案中，腫瘤是黑色素瘤、腎細胞癌、結直腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌。
在另一方面中，本發明涉及治療受試者感染性疾病，例如慢性感染的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文所述的任何IL-2突變蛋白或其片段，或包含所述抗體或片段的免疫綴合物、多特異性抗體，或醫藥組成物。在一個實施方案中，所述感染是病毒感染。
在一些實施方案中，除了本發明IL-2突變蛋白或其融合物或綴合物外，本發明的方法還包括向所述受試者聯合施用一種或多種療法(例如治療 方式和/或其它治療劑)。在一些實施方案中，治療方式包括手術治療和/或放射療法。在一些實施方案中，本發明方法還包括施用至少一種其它的免疫刺激性抗體，例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗-LAG-3抗體、抗CD43抗體、和/或抗CTLA-4抗體，這些抗體可以是例如全人源的、嵌合的、或人源化的抗體。
在一些實施方案中，抗PD-1抗體選自下組：IBI308(信迪利單抗，WO2017/025016A1)，MDX-1106(納武單抗(nivolumab，)OPDIVO)，Merck 3475(MK-3475，帕博利珠單抗(pembrolizumab)，KEYTRUDA)和CT-011(匹地利珠單抗(Pidilizumab))。在一些實施方案中，抗PD-1抗體是MDX-1106。在一些實施方案中，抗PD-1抗體是nivolumab(CAS註冊號：946414-94-4)。在進一步的一些實施方案中，單獨或與PD-1拮抗劑組合的IL-2突變蛋白或其片段還能與一種或多種其它療法例如治療方式和/或其它治療劑組合施用。在一些實施方案中，治療方式包括外科手術(例如腫瘤切除術)；放射療法(例如，外粒子束療法，它涉及其中設計照射區域的三維適形放射療法)、局部照射(例如，指向預選靶或器官的照射)或聚焦照射等。
在一些實施方案中，本文提供了治療疾病(例如，腫瘤)的方法，包括給予受試者本文所述的突變蛋白和CTLA-4拮抗劑抗體。抗-CTLA-4抗體可以是例如選自以下的抗體：YERVOY®(伊匹木單抗(ipilimumab)或抗體10D1，描述於PCT公開號WO 01/14424)，曲美木單抗(tremelimumab)(舊稱替昔利木單抗(ticilimumab),CP-675,206)，和描述於以下公開文獻中的抗-CTLA-4抗體：WO 98/42752；WO 00/37504；美國專利號6,207,156；Hurwitz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17)：10067-10071；Camacho等(2004)J.Clin.Oncology 22(145)：Abstract No.2505(抗體CP-675206)；和Mokyr等(1998)Cancer Res.58：5301-5304。
在一些實施方案中，本文提供了治療疾病(例如，腫瘤)的方法，包括給予受試者本文所述的抗-突變蛋白和抗-LAG-3拮抗劑抗體。抗-LAG3抗體可以是例如選自以下的抗體：描述於美國專利申請號US2011/0150892和WO2014/008218的抗體25F7,26H10,25E3,8B7,11F2或17E5，或包含這些抗體的CDR或可變區的抗體；BMS-986016；描述於US 2011/007023中的IMP731。
在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白可以與化療或化療劑聯合施用。在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白可以與放療或放療劑聯合施用。在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白可以與靶向療法或靶向治療劑聯合施用。在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白可以與免疫療法或免疫治療劑，例如單株抗體聯合施用。
本發明的突變蛋白(以及包含其的醫藥組成物或其融合物或免疫綴合物，和視需要地另外的治療劑)可以藉由任何合適的方法給藥，包括腸胃外給藥，肺內給藥和鼻內給藥，並且，如果局部治療需要，病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程，包括，但不限於，單次給藥或在多個時間點多次給藥、推注給藥及脈衝輸注。
為了預防或治療疾病，本發明突變蛋白的合適劑量(當單獨或與一種或多種其他的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重性和進程、以預防目的施用還是以治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對所述抗體的應答，和主治醫師的判斷力。所述抗體以一次治療或經過一系列治療合適地施用於患者。
再一方面，本發明也提供本發明IL-2突變蛋白、組合物、免疫綴合物、融合物在製備用於前述方法(例如用於治療)的藥物中的用途。
描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。
實施例1. 白細胞介素-2突變體的設計
●白細胞介素-2糖基化蛋白的設計
根據PDB數據庫中白細胞介素-2(Interleukin-2’簡稱IL-2)與其α受體CD25(簡稱IL-2R α)的晶體結構(PDB：1Z92)(第1A圖)，我們藉由胺基酸的定點突變，在IL-2與IL-2Ra的結合界面人為改造一個N-X-S/T基序(X可以為任意胺基酸，但P(脯胺酸)除外)，使得IL-2在HEK293或者CHO細胞表達過程中，藉由細胞的翻譯後修飾，在IL-2的表面形成一個多糖鏈，阻斷IL-2與IL-2R α結合(如第1B圖的結構示意圖所示)。
IL-2糖基化位點設計：找出IL-2中與IL-2Ra距離為3.6Å，並且側鏈暴露在溶液中的胺基酸，將其突變為天冬醯胺，並將後面第三個胺基酸突變絲胺酸或者蘇胺酸，形成一個N-X-S/T基序(X可以為任意胺基酸，但P除外)，見表1。
Figure 108134032-A0101-12-0039-1
●IL-2B’C’loop嵌合體和截短體的設計
B’C’loop：IL-2的B helix與C helix的連接序列(第2A圖)，包括A73-R83共11個胺基酸。
比較IL-2單體(PDB：1M47)和複合物的晶體結構(PDB：2ERJ)，我們發現在IL-2單體的晶體結構中B’C’loop是缺失的，這是由於B’C’loop在溶液中非常活躍，無法形成相對穩定的構象。
藉由對B’C’loop進行基因工程改造，增加B’C’loop的穩定性，從而增加IL-2的穩定性和與IL-2R β的親和力。因此我們比對了人IL15晶體結構(PDB：2Z3Q)，發現它的B’C’loop較短且穩定(第2B圖)。因此我們設計了一個IL-2嵌合分子(L017)和4個截短體分子(L057~L060)(見表2)。
Figure 108134032-A0101-12-0040-2
實施例2：IL-2突變體-Fc融合蛋白和IL-2受體的表達純化
表達質粒的構建
野生型IL-2(uniprot：P60568,aa21-153,C125S，簡稱IL-2WT)，以及IL-2突變體IL-23X(R38D,K43E,E61R)，IL-2glycans和B’C’loop嵌合體和截短體，藉由GSGS連接序列與人IgG1的Fc(L234A,L235A，簡稱FcLALA，SEQ ID NO：28)連接，並構建到pTT5的載體上，用以表達如下蛋白：
Figure 108134032-A0101-12-0040-3
Figure 108134032-A0101-12-0041-4
IL-2WT,IL-23X和L011(IL-2glycan5)藉由2個GGGGS與FcLALA連接，並構建到pCDNA3.1的載體上，用以表達以下蛋白：
Figure 108134032-A0101-12-0041-5
在L011(IL-2glycan5)基礎上再增加了1個糖基化位點或增加一個K35Q突變位點(K35Q突變基於前述突變蛋白Y007和蛋白質3D結構而設計)，藉由GSGS連接序列與FcLALA連接，並構建到pTT5的載體上；用以表達如下蛋白：
Figure 108134032-A0101-12-0042-6
將B’C’loop嵌合體(L017)和截短體(L057/058)與糖基化IL-2(L011)組合，藉由2個GGGGS與FcLALA連接，並構建到pCDNA3.1的載體上，用以表達以下蛋白：
Figure 108134032-A0101-12-0042-7
上述蛋白分子的具體序列信息見序列表。
用於構建上述分子的野生型IL-2WT的序列示於SEQ ID NO：26中，在該序列的125位具有C125S突變，以避免二硫化物橋接的IL-2二聚體形成。IL-23X是之前文獻(Rodrigo Vazquez-Lombardi等，Nature Communications,8：15373,DOI：10.1038/ncomms15373)中報道的IL-2突變體，與IL-2WT相同也包含C125S突變，並包含突變R38D,K43E,E61R，其序列示於SEQ ID NO：27中。據文獻報道，IL-23X與IL-2R α不結合，與IL-2R β的結合力維持與野生型IL-2相當。
IL-2融合蛋白的表達純化
根據所需轉染體積傳代Expi293細胞(Invitrogen)，轉染前一天將細胞密度調整至1.5×106個細胞/ml。轉染當天細胞密度約為3×106個細胞/ml。取終體積1/10(v/v)的Opti-MEM培養基(Gibco貨號：31985-070)作為轉染緩衝液，加入上述構建的表達質粒，混勻，用0.22μm的濾頭過濾備用。加合適的聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences，23966)到上一步的質粒中(質粒與PEI的質量比例為1：3)，混勻後室溫孵育10min，獲得DNA/PEI混合物。將DNA/PEI混合物輕柔倒入HEK293細胞並混勻，在37℃，8% CO2的條件下培養24h後，補加VPA(Sigma，貨號：P4543-100G)使終濃度至2mM及2%(v/v)Feed(1g/L Phytone Peptone+1g/L Difco Select Phytone)，繼續培養6天。
細胞培養液以13000rpm離心20min，收集上清，用預裝管柱Hitrap Mabselect Sure(GE,11-0034-95)純化上清液。操作如下：純化前用5倍管柱體積的平衡液(20mM Tris,150mM NaCl,pH7.2)平衡填料管柱；將收集的上清藉由管柱，再用10倍管柱體積的平衡液清洗填料管柱，去除非特異性結合蛋白；用5倍管柱體積的洗脫緩衝液(100mM sodium citrate，pH 3.5)沖洗填料，收集洗脫液。每1ml洗脫液加入80μL Tris(2M Tris)，使用超濾濃縮管(MILLIPORE，貨號：UFC901096)交換到PBS緩衝液(Gibco，貨號：70011-044)中，並測定濃度。取100μg純化後蛋白，調整濃度至1mg/mL，使用凝膠過濾色譜管柱SW3000(TOSOH貨號：18675)測定蛋白純度。
糖基化突變體Y007，Y008和Y014藉由突變表面一個或兩個胺基酸後，使蛋白的表達量和純度相對於Y001都有了明顯的提升。Y048，Y049和Y050藉由在Y011基礎上再增加了1個糖基化位點或增加一個K35Q突變位點，使得表達量從7.77mg/L提高到了50mg/L以上(Y048和Y049)或40mg/L(Y050)，純度從31.35%提高到80%以上，使得分子的成藥性得到了顯著的改善。
B’C’loop嵌合體(Y017)和截短體(Y057/058/059)相比於Y001，表達量和一步親和層析純度都有很大的提高。
將B’C’loop優化後的序列和糖基化突變L011組合後，與具有L011的突變蛋白Y011相比，Y056,Y081和Y082在表達量和純度都得到了提升(表3)。
Figure 108134032-A0101-12-0044-8
Figure 108134032-A0101-12-0045-9
●IL-2受體的表達和純化
人IL-2受體α(Uiprot：P01589，aa22-217)和β(Uiprot：P14784，aa27-240)在序列的C末端接上avi標簽(一段多肽：GLNDIFEAQKIEWHE，可以被BirA酶催化發生生物素化)和6個組胺酸標簽(HHHHHH)，分別構建到pTT5載體上。質粒轉染293F細胞(Invitrogen)方法同IL-2Fc融合蛋白的表達方法。
純化前將收集的培養基4500rpm離心30min，棄掉細胞。再將上清使用0.22μl的濾器過濾。將純化使用的鎳管柱(5ml Histrap excel,GE,17-3712-06)用0.1M NaOH浸泡2h，然後用5-10倍管柱體積的超純水沖洗，去除鹼液。純化前用5倍管柱體積的結合緩衝液(20mM Tris pH 7.4,300mM NaCl) 平衡純化管柱；將細胞上清藉由平衡後的管柱；用10倍管柱體積的沖洗緩衝液(20mM Tris 7.4,300mM NaCl,10mM imidazole)藉由管柱，去除非特異性結合的雜蛋白；然後用3-5倍管柱體積洗脫液(20mM Tris7.4,300mM NaCl,100mM imidazole)將目標蛋白洗脫下來。將收集的蛋白超濾濃縮交換到PBS(Gibco，70011-044)中，然後用superdex200 increase(GE,10/300GL,10245605)進一步分離純化，收集單體的洗脫峰，管柱的平衡和洗脫緩衝液為PBS(Gibco，70011-044)。取100μg純化後的蛋白樣品，使用凝膠過濾色譜管柱SW3000(TOSOH貨號：18675)測定蛋白純度(第3圖和第4圖)。
實施例3. IL-2突變體Fc融合蛋白(簡稱：IL-2 mutant -FC)與其受體的親和力測定
採用生物膜薄層干涉(Biolayer Interferometry，BLI)技術測定本發明IL-2mutant-FC結合人IL-2R α和IL-2R β的平衡解離常數(KD)。BLI法親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2)：第270-8頁)進行。
實驗開始前半個小時，根據樣品數量，取合適數量的AHC(ForteBio，18-5060)(用於陽性對照檢測)傳感器浸泡於SD buffer(PBS 1×，BSA 0.1%，Tween-200.05%)中。
取100μl的SD緩衝液、IL-2mutant-FC、IL-2受體α或β分別加入到96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner，675076)中。根據樣品位置布板，選擇傳感器位置。儀器設置參數如下：運行步驟：Baseline、Loading~1nm、 Baseline、Association和Dissociation；各個步驟運行時間取決於樣品結合和解離速度，轉速為400rpm，溫度為30℃。使用ForteBio分析軟體分析KD值。
Figure 108134032-A0101-12-0047-10
Figure 108134032-A0101-12-0048-11
Figure 108134032-A0101-12-0048-12
 N.B.：IL-2與受體沒有結合；P.F：結合很弱，擬合效果差。
由以上親和力數據可知：1)Y009，Y010，Y011，Y013和Y015可以阻斷IL-2R α的結合(表4a)；2)B’C’loop嵌合分子和截短分子，不僅增加了分子的表達量，還增加分子與IL-2R β的親和力(表4b)；3)IL-2糖基化與 B’C’loop改造的組合體Y056和Y081，與Y045(IL-2WT-2*(G4S)-FcLALA)、Y040(IL-2.3X-2*(G4S)-FcLALA)和Y038(IL-2.glycan5-2*(G4S)-FcLALA)相比，在阻斷IL2R α結合的同時，增強了與IL2R β的親和力。
實施例4：IL-2 mutant -FC體外功能實驗
IL-2WT與IL-2R α親和力高於IL-2R β和IL-2R γ，會優先結合細胞表面的IL-2R α，再招募IL-2R β γ，藉由IL-2R β γ釋放下游p-STAT5信號，刺激T細胞與NK細胞增殖。由於Treg細胞表面有IL-2R α，效應T細胞與NK細胞表面沒有IL-2R α，正常情況下IL-2WT會優先刺激Treg細胞增殖，下調免疫反應。IL-2mutant與IL-2R α不結合，消除了優先刺激Treg細胞增殖的偏好，同時刺激T細胞與NK細胞增殖，使得效應T細胞與NK細胞的數量有效增加，提高抗腫瘤效應。
本實施例藉由檢測各IL-2mutant-FC對原代人CD8+ T細胞p-STAT5信號的激活，驗證各突變體對CD25+細胞激活偏向性的去除，並篩選對CD25-細胞激活作用較強的突變體。具體步驟如下：
1.復蘇PBMC細胞：
a)從液態氮取出PBMC細胞(Allcells貨號：PB005F，100M裝)，迅速置於37℃水浴鍋中，復蘇PBMC細胞；b)將細胞加入10mL已預熱的、含5%人AB血清(GemCell貨號：100-512)與1‰ DNA酶(STRMCELL貨號：07900)的X-VIVO15(Lonza貨號：04-418Q)培養基中，400 G、25℃離心10分鐘(後續離心均為此條件)洗滌一次；c)加入20mL培養基重懸細胞，37℃二氧化碳培養箱靜置培養過夜。
2.純化人CD8+ T細胞：
a)吸取步驟1中懸浮細胞液，離心棄上清； b)加入1mL Robosep緩衝液(STEMCELL貨號：20104)與100μL人AB血清及100μL人CD8+ T細胞純化試劑盒(Invitrogen貨號：11348D)中負性篩選抗體混合液重懸細胞；c)混勻後，4℃孵育20分鐘，每5分鐘搖晃一次；d)孵育後，加入10mL Robosep緩衝液，離心洗滌兩次；e)同時，取1mL磁性微球(人CD8+ T細胞純化試劑盒)，加入7mL Robosep緩衝液置於磁力架上1分鐘棄上清，預洗磁性微球；f)各加入1mL Robosep緩衝液分別重懸微球與細胞，混勻後室溫旋轉孵育30分鐘；g)孵育後，加入6mL Robosep緩衝液，置於磁力架上1分鐘，收集上清；h)收集液再次置於磁力架上1分鐘，收集上清；i)離心棄上清，使用預熱的T培養基重懸，調整密度至1×106/mL；j)取1/3細胞待後需刺激CD25表達，其餘細胞置於37℃二氧化碳培養箱靜置過夜培養。
3.刺激CD8+ T細胞表達CD25：
a)取1/3步驟2中純化後的CD8+ T細胞，加入抗人CD3/CD28抗體的磁性微球(GIBCO貨號：11131D)，細胞與微球的比例為3：1；b)置於37℃二氧化碳培養箱靜置三天；c)加入10mL培養基清洗2次；d)加入培養基調整細胞密度至1×106/mL，37℃二氧化碳培養箱中靜置培養2天。
4.檢測細胞純度與表達水平：
a)使用抗人CD8-PE(Invitrogen貨號：12-0086-42)、抗人CD25-PE(eBioscience貨號：12-0259-42)、同型對照抗體(BD貨號：556653)檢測細胞的CD8與CD25；b)步驟2中細胞為CD8+ CD25-T細胞，步驟3中細胞為CD8+ CD25+T細胞。
5.檢測各IL-2mutant-FC對CD8+ CD25- T細胞激活p-STAT5信號的EC50：
a)取CD8+ CD25-T細胞，以每孔1×105細胞鋪96孔U底培養板(Costar貨號：CLS3799-50EA)；b)加入100μL各IL-2mutant-FC、商品化IL-2(R&D貨號：202-IL-500)、IL-2WT-FC、IL-23X-FC，最高濃度從266.7nM開始4倍梯度稀釋共12個梯度，37℃培養箱中孵育20分鐘；c)加入取55.5μL 4.2%甲醛溶液，室溫固定10分鐘；d)離心棄上清，加入200μL冰甲醇(Fisher貨號：A452-4)重懸細胞，4℃冰箱孵育30分鐘；e)離心棄上清，用200μL染色緩衝液(BD貨號：554657)洗滌3次：f)加入200μL含抗p-STAT5-AlexFlour647(BD貨號：562076，1：200稀釋)的破膜/固定緩衝液(BD貨號：51-2091KZ)，室溫避光孵育3小時；g)使用染色緩衝液洗滌三次，100μL染色緩衝液重懸細胞，進行流式細胞儀檢測；h)以IL-2分子的濃度為橫坐標、AlexFlour647中間螢光度值為縱坐標，製作p-STAT5信號的EC50值，結果如圖5和表5所示。
6.檢測各IL-2mutant-FC對CD8+ CD25+ T細胞激活p-STAT5信號的EC50：
a)取CD8+ CD25+T細胞，以每孔1×105細胞鋪96孔U底培養板； b)同步驟5中b-h，製作p-STAT5信號的EC50值，結果如第5圖和表5所示。
Figure 108134032-A0101-12-0052-13
實驗結果表明(在同一個donor下對比)：
1)對比Y001(IL-2WT-GSGS-FcLALA)和Y045(IL-2WT-2*(G4S)-FcLALA)，Y002(IL-2.3X-GSGS-FcLALA)和Y040(IL-2.3X-2*(G4S)-FcLALA)，Y011(IL-2.glycan5-GSGS-FcLALA)和Y038(IL-2.glycan5-2*(G4S)-FcLALA)的曲線位置，發現長的連接序列(GGGGSGGGGS)優於短的連接序列(GSGS)對於CD25-CD8+T細胞的激活(第5A圖)。
2)嵌合人IL-15的B’C’loop後，Y017(IL-2hyb15BCL-GSGS-FcLALA)對CD25- CD8+T細胞的激活(Y017的EC50值為0.9902)比Y001(EC50值為10.69)提高了10.79倍(第5A圖)；而對CD25+CD8+T細胞的激活(Y017的EC50值為0.0018)與Y001(EC50值為0.0020)相當(第5B圖)。
3)在IL-2的界面增加了一個N聚糖後(Y038)，對CD25-CD8+T細胞的激活(Y038的EC50值為369.0)比野生型的IL-2(Y045，EC50值為31.73) 下降了11.63倍，但優於文獻報道的IL-23X(Y040)；而在此基礎上嵌合人IL-15的B’C’loop後(Y056,EC50值為8.571)，對CD25-CD8+T細胞的激活比Y045提高了3.7倍，比Y038提高了43.05倍(第5C圖)。
4)在同一個donor下，在對比刺激前後CD8+T細胞，說明Y056和Y081增強了CD25-CD8+T細胞的激活，同時減少了對CD25+細胞激活偏向性(第5D圖、第5E圖和表5)。
Figure 108134032-A0101-12-0053-14
Figure 108134032-A0101-12-0054-15
Figure 108134032-A0101-12-0055-16
Figure 108134032-A0101-12-0056-17
Figure 108134032-A0101-12-0057-18
Figure 108134032-A0101-12-0058-19
Figure 108134032-A0101-12-0059-20
Figure 108134032-A0101-12-0060-21
<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司
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<160> 50
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y001：IL-2-GSGS-FcLALA
<400> 1
Figure 108134032-A0101-12-0061-22
Figure 108134032-A0101-12-0062-23
<210> 2
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y002：IL-2.3X-GSGS-FcLALA
<400> 2
Figure 108134032-A0101-12-0063-24
Figure 108134032-A0101-12-0064-25
<210> 3
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y007：ILL-2.聚糖1-GSGS-FcLALA
<400> 3
Figure 108134032-A0101-12-0064-26
Figure 108134032-A0101-12-0065-27
Figure 108134032-A0101-12-0066-28
<210> 4
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y008：IL-2.聚糖2-GSGS-FcLALA
<400> 4
Figure 108134032-A0101-12-0066-29
Figure 108134032-A0101-12-0067-30
Figure 108134032-A0101-12-0068-31
<210> 5
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y009：IL-2.聚糖3-GSGS-FcLALA
<400> 5
Figure 108134032-A0101-12-0068-32
Figure 108134032-A0101-12-0069-33
<210> 6
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y010：IL-2.聚糖4-GSGS-FcLALA
<400> 6
Figure 108134032-A0101-12-0070-34
Figure 108134032-A0101-12-0071-35
<210> 7
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y011：IL-2.聚糖5-GSGS-FcLALA
<400> 7
Figure 108134032-A0101-12-0071-36
Figure 108134032-A0101-12-0072-37
Figure 108134032-A0101-12-0073-38
<210> 8
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y012：IL-2.聚糖6-GSGS-FcLALA
<400> 8
Figure 108134032-A0101-12-0073-39
Figure 108134032-A0101-12-0074-40
<210> 9
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y013：IL-2.聚糖7-GSGS-FcLALA
<400> 9
Figure 108134032-A0101-12-0075-41
Figure 108134032-A0101-12-0076-42
<210> 10
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y014：IL-2.聚糖8-GSGS-FcLALA
<400> 10
Figure 108134032-A0101-12-0076-43
Figure 108134032-A0101-12-0077-44
Figure 108134032-A0101-12-0078-45
<210> 11
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y015：IL-2.聚糖9-GSGS-FcLALA
<400> 11
Figure 108134032-A0101-12-0078-46
Figure 108134032-A0101-12-0079-47
Figure 108134032-A0101-12-0080-48
<210> 12
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y017：IL-2hyb15BCL-GSGS-FcLALA
<400> 12
Figure 108134032-A0101-12-0080-49
Figure 108134032-A0101-12-0081-50
<210> 13
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y038：IL-2.聚糖5-2＊(G4S)-FcLALA
<400> 13
Figure 108134032-A0101-12-0082-51
Figure 108134032-A0101-12-0083-52
<210> 14
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y040：IL-2.3X-2＊(G4S)-FcLALA
<400> 14
Figure 108134032-A0101-12-0083-53
Figure 108134032-A0101-12-0084-54
Figure 108134032-A0101-12-0085-55
<210> 15
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y045：IL-2WT-2＊(G4S)-FcLALA
<400> 15
Figure 108134032-A0101-12-0085-56
Figure 108134032-A0101-12-0086-57
Figure 108134032-A0101-12-0087-58
<210> 16
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y048：IL-2聚糖5〔聚糖8-GSGS-FcLALA
<400> 16
Figure 108134032-A0101-12-0087-59
Figure 108134032-A0101-12-0088-60
Figure 108134032-A0101-12-0089-61
<210> 17
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y049：IL-2聚糖5〔聚糖1-GSGS-FcLALA
<400> 17
Figure 108134032-A0101-12-0089-62
Figure 108134032-A0101-12-0090-63
<210> 18
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y050：IL-2聚糖5.K35Q-GSGS-FcLALA
<400> 18
Figure 108134032-A0101-12-0090-64
Figure 108134032-A0101-12-0091-65
Figure 108134032-A0101-12-0092-66
<210> 19
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y056：IL-2.聚糖5.15BCL-2＊(G4S)-FcLALA
<400> 19
Figure 108134032-A0101-12-0092-67
Figure 108134032-A0101-12-0093-68
Figure 108134032-A0101-12-0094-69
<210> 20
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y057：IL-2截短1-GSGS-FcLALA
<400> 20
Figure 108134032-A0101-12-0094-70
Figure 108134032-A0101-12-0095-71
<210> 21
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y058：IL-2截短2-GSGS-FcLALA
<400> 21
Figure 108134032-A0101-12-0096-72
Figure 108134032-A0101-12-0097-73
<210> 22
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y059：IL-2截短3-GSGS-FcLALA
<400> 22
Figure 108134032-A0101-12-0097-74
Figure 108134032-A0101-12-0098-75
Figure 108134032-A0101-12-0099-76
<210> 23
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y060：IL-2截短4-GSGS-FcLALA
<400> 23
Figure 108134032-A0101-12-0099-77
Figure 108134032-A0101-12-0100-78
Figure 108134032-A0101-12-0101-79
<210> 24
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y081：IL-2.聚糖5.截短1-2＊(G4S)-FcLALA
<400> 24
Figure 108134032-A0101-12-0101-80
Figure 108134032-A0101-12-0102-81
<210> 25
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Y082：IL-2.聚糖5.截短2-2＊(G4S)-FcLALA
<400> 25
Figure 108134032-A0101-12-0103-82
Figure 108134032-A0101-12-0104-83
<210> 26
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 野生型IL-2：IL-2wt
<400> 26
Figure 108134032-A0101-12-0104-84
Figure 108134032-A0101-12-0105-85
<210> 27
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> IL-2突變體：IL-2.3X
<400> 27
Figure 108134032-A0101-12-0105-86
Figure 108134032-A0101-12-0106-87
<210> 28
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 突變Fc區：FcLALA
<400> 28
Figure 108134032-A0101-12-0106-88
Figure 108134032-A0101-12-0107-89
<210> 29
<211> 153
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 29
Figure 108134032-A0101-12-0107-90
Figure 108134032-A0101-12-0108-91
<210> 30
<211> 133
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 30
Figure 108134032-A0101-12-0108-92
<210> 31
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L007：IL-2.聚糖1
<400> 31
Figure 108134032-A0101-12-0109-93
<210> 32
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L008：IL-2.聚糖2
<400> 32
Figure 108134032-A0101-12-0109-94
Figure 108134032-A0101-12-0110-95
<210> 33
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L009：IL-2.聚糖3
<400> 33
Figure 108134032-A0101-12-0110-96
Figure 108134032-A0101-12-0111-97
<210> 34
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L010：IL-2.聚糖4
<400> 34
Figure 108134032-A0101-12-0111-98
<210> 35
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L011：IL-2.聚糖5
<400> 35
Figure 108134032-A0101-12-0112-99
<210> 36
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L012：IL-2.聚糖6
<400> 36
Figure 108134032-A0101-12-0112-100
Figure 108134032-A0101-12-0113-101
<210> 37
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L013：IL-2.聚糖7
<400> 37
Figure 108134032-A0101-12-0113-102
Figure 108134032-A0101-12-0114-103
<210> 38
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L014：IL-2.聚糖8
<400> 38
Figure 108134032-A0101-12-0114-104
Figure 108134032-A0101-12-0115-105
<210> 39
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L015：IL-2.聚糖9
<400> 39
Figure 108134032-A0101-12-0115-106
<210> 40
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L017：IL-2hyb15BCL
<400> 40
Figure 108134032-A0101-12-0116-107
<210> 41
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L057：IL-2截短1
<400> 41
Figure 108134032-A0101-12-0116-108
Figure 108134032-A0101-12-0117-109
<210> 42
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L058：IL-2截短2
<400> 42
Figure 108134032-A0101-12-0117-110
Figure 108134032-A0101-12-0118-111
<210> 43
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L059：IL-2截短3
<400> 43
Figure 108134032-A0101-12-0118-112
<210> 44
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> L060：IL-2截短4
<400> 44
Figure 108134032-A0101-12-0119-113
<210> 45
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 組合突變：IL-2聚糖5.聚糖8
<400> 45
Figure 108134032-A0101-12-0119-114
Figure 108134032-A0101-12-0120-115
<210> 46
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 組合突變：IL-2聚糖5.聚糖1
<400> 46
Figure 108134032-A0101-12-0120-116
Figure 108134032-A0101-12-0121-117
<210> 47
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 組合突變：IL-2聚糖5.K35Q
<400> 47
Figure 108134032-A0101-12-0121-118
Figure 108134032-A0101-12-0122-119
<210> 48
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 組合突變：IL-2.聚糖5.15BCL
<400> 48
Figure 108134032-A0101-12-0122-120
<210> 49
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 組合突變：IL-2.聚糖5.截短1
<400> 49
Figure 108134032-A0101-12-0123-121
<210> 50
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 組合突變：IL-2.聚糖5.截短2
<400> 50
Figure 108134032-A0101-12-0123-122
Figure 108134032-A0101-12-0124-123

Claims (29)

  1. 一種IL-2突變蛋白，該突變蛋白，與野生型IL-2(較佳人IL-2，更較佳包含SEQ ID NO：26序列的IL-2)相比，包含至少一個突變，該突變在選自以下的胺基酸位置引入一個或多個糖基化基序N-X-S/T：35N-36X-37T/S；38N-39X-40T/S；41N-42X-43T/S；43N-44X-45T/S；45N-46X-47T/S；62N-63X-64T/S；68N-69X-70T/S；72N-73X-74T/S；74N-75X-76T/S，其中，X是除脯胺酸外的任何胺基酸，較佳地X是與野生型IL-2相應位置的胺基酸相同的胺基酸，或是其保守取代殘基；其中胺基酸位置根據SEQ ID NO：26編號。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的突變蛋白，其中，該突變蛋白包含一個或多個選自以下的突變糖基化基序：35N-36X-37T/S；38N-39X-40T/S；和74N-75X-76T/S，其中胺基酸位置根據SEQ ID NO：26編號，其中，與野生型IL-2相比，該突變蛋白，當在哺乳動物細胞中表達時，較佳地以Fc融合蛋白形式表達時，具有改善的表達和/或純度(較佳地，藉由在表達和一步親和純化後測定突變蛋白的純度)。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的突變蛋白，其中，與野生型IL-2相比，該突變蛋白包含選自以下的突變糖基化基序：(i)K35N-L36-T37；(ii)R38N-M39-L40S；(iii)Q74N-S75-K76T；較佳該突變蛋白包含突變糖基化基序K35N-L36-T37。
  4. 如申請專利範圍第2或3項所述的突變蛋白，其中，該突變蛋白包含與選自以下的胺基酸序列具有至少90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或98%的同一性的序列：SEQ ID NO：31，32和38。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的突變蛋白，其中該突變蛋白包含一個或多個選自以下的突變糖基化基序：41N-42X-43T/S；43N-44X-45T/S；45N-46X-47T/S；68N-69X-70T/S；72N-73X-74T/S，較佳糖基化基序43N-44X-45T/S，其中胺基酸位置根據SEQ ID NO：26編號，其中，與野生型IL-2相比，該突變蛋白具有降低的或消除的IL-2R α結合。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的突變蛋白，其中，與野生型IL-2相比，該突變蛋白包含選自以下的突變糖基化基序：(i)T41N-F42-K43S；(ii)K43N-F44-Y45T；(iii)Y45N-M46-P47S；(iv)E68N-V69-L70S；(v)L72N-A73-Q74T；較佳地，該突變蛋白包含突變糖基化基序K43N-F44-Y45T。
  7. 如申請專利範圍第5或6項所述的突變蛋白，其中，該突變蛋白還包含：(i)選自35N-36X-37T/S；38N-39X-40T/S；和74N-75X-76T/S的突變糖基化基序；和/或(ii)突變K35Q， 其中，與野生型IL-2相比，該突變蛋白具有降低的或消除的IL-2R α結合，且在以Fc融合蛋白形式在哺乳動物細胞中表達時具有改善的表達和純度。
  8. 如申請專利範圍第5至7項中任一項所述的突變蛋白，其中，該突變蛋白包含與選自以下的胺基酸序列具有至少90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或98%同一性的序列：SEQ ID NO：33、34、35、37、39、和45-47。
  9. 一種IL-2突變蛋白，該突變蛋白，與野生型IL-2(較佳人IL-2，更佳包含SEQ ID NO：26序列的IL-2)相比，包含縮短的B’C’環區(即，胺基酸殘基aa72和aa84之間的連接序列)，較佳地，所述縮短的環區具有小於10、9、8、7、6、或5個的胺基酸長度，且較佳7個胺基酸長度，其中胺基酸殘基根據SEQ ID NO：26編號。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的突變蛋白，其中該突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含(i)對aa73至aa83序列的替代，例如替代為來自四螺旋短鏈細胞因子IL家族成員的短B’C’環序列，如IL15的B’C’環序列，較佳地經替代的環區具有序列SGDASIH；或(ii)對aa73至aa83序列的截短，例如自C端截短1、2、3或4個胺基酸；較佳地截短的環區具有序列A(Q/G)S(K/A)N(F/I)H，較佳所述截短的環區具有序列AQSKNFH或AGSKNFH。
  11. 如申請專利範圍第8至10項中任一項所述的突變蛋白，其中該突變蛋白，相對於野生型IL-2，具有增強的IL-2R β結合，和/或改善的表達產量和/或純度。
  12. 如申請專利範圍第8至11項中任一項所述的突變蛋白，其中該突變蛋白包含與選自以下的胺基酸序列具有至少90%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、或98%同一性的序列：SEQ ID NO：40-44，較佳SEQ ID NO：40-42，更佳SEQ ID NO：40或41。
  13. 一種IL-2突變蛋白，該突變蛋白，與野生型IL-2(較佳人IL-2，更佳包含SEQ ID NO：26序列的IL-2)相比，包含組合突變：(i)選自41N-42X-43T/S；43N-44X-45T/S；45N-46X-47T/S；68N-69X-70T/S；72N-73X-74T/S的突變糖基化基序；和(ii)在胺基酸位置aa72至aa84之間的、選自SGDASIH和A(Q/G)S(K/A)N(F/I)H的縮短B’C’環區序列，其中胺基酸位置根據SEQ ID NO：26編號。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的突變蛋白，其中該突變蛋白包含與選自以下的胺基酸序列具有至少90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或98%的同一性的序列：SEQ ID NO：48、49或50，較佳SEQ ID NO：48或49。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項的突變蛋白，其中該突變蛋白，與野生型IL-2相比，具有以下特性之一或多項：-具有消除或降低的對IL-2R α受體的結合親和力，-具有增強的對IL-2R β受體的結合親和力；-具有降低的對高親和力IL-2R受體(IL-2R α β γ)的結合親和力；-具有增加的對中等親和力IL-2R受體(IL-2R β γ)的結合親和力；-降低對CD25+細胞(尤其是CD8+T細胞，特別是Treg細胞)的激活；-降低對CD25+細胞(尤其是CD8+T細胞)中IL-2介導的信號傳導的刺激作用；-去除或降低IL-2優先激活CD25+細胞(尤其是Treg細胞)的偏向性；-降低由IL-2誘導的Treg細胞引起的免疫反應下調作用；-保持或增強對CD25-細胞的激活作用， -刺激效應細胞T細胞和NK細胞的增殖和激活；-提高抗腫瘤效應。
  16. 如申請專利範圍第1至15項中任一項所述的IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白在哺乳動物細胞如HEK293細胞中表達時，具有以下一個或多個特徵：-優於野生型IL-2蛋白的表達量；-優於野生型IL-2蛋白的穩定性；-易於純化至更高的蛋白純度，例如，一步親和層析純化後更高的純度。
  17. 如申請專利範圍第1至16項中任一項所述的IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白與野生型IL-2相比具有至少85%、至少95%、或至少96%的同一性。
  18. 如申請專利範圍第1至16項中任一項所述的IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，與野生型IL-2相比，具有降低的優先刺激CD25+ T細胞中p-STATA5信號傳導的偏向性，且具有增強的刺激CD25- T細胞中信號傳導的能力，較佳地所述突變蛋白包含組合突變：(i)在胺基酸位置43-45的突變糖基化基序K43N-F44-Y45T和在胺基酸位置aa72至aa84之間的替代序列SGDASIH；或(ii)在胺基酸位置43-45的突變糖基化基序K43N-F44-Y45T和在胺基酸位置aa72至aa84之間的截短序列AQSKNFH，更佳，該突變蛋白包含SEQ ID NO：48或49的序列，或與其具有至少95%,96%、或更高的同一性的序列。
  19. 一種IL-2突變蛋白融合蛋白，其包含根據如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL2突變蛋白，較佳地與Fc抗體片段融合，較佳地IL-2突變蛋白藉由接頭與Fc融合，該接頭較佳為GSGS，更佳為2x(G4S)，較佳地，該融合蛋白包含與選自以下的胺基酸序列至少85%、至少95%、或至少96%的同一性：SEQ ID NO：3-13和16-25。
  20. 一種免疫綴合物，其包含如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL2突變蛋白和抗原結合分子，較佳地，抗原結合分子是免疫球蛋白分子，特別是IgG分子，或抗體或抗體片段，特別是Fab分子和scFv分子。
  21. 如申請專利範圍第20項所述的免疫綴合物，其中該抗原結合分子特異性結合腫瘤細胞上或腫瘤環境中呈現的抗原，例如選自以下的抗原：成纖維細胞活化蛋白(FAP)、生腱蛋白C的A1域(TNC A1)、生腱蛋白C的A2域(TNC A2)、纖連蛋白的外域B(Extra DomainB,EDB)、癌胚抗原(CEA)、和黑色素瘤有關的硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)。
  22. 一種分離的多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL-2突變蛋白或如申請專利範圍第19項所述的融合物或如申請專利範圍第20或21項所述的免疫綴合物。
  23. 一種表達載體，其包含如申請專利範圍第22項所述的多核苷酸。
  24. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第22項所述的多核苷酸或如申請專利範圍第23項所述的載體，較佳該宿主細胞是哺乳動物細胞，特別是HEK293細胞，和酵母。
  25. 一種生產IL-2突變蛋白或其融合物或免疫綴合物的方法，包括在適於表達所述IL-2突變蛋白或融合物或綴合物的條件下培養如申請專利範圍第24項所述的宿主細胞。
  26. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL-2突變蛋白或如申請專利範圍第19的融合物或如申請專利範圍第20-21的免疫綴合物和藥學可接受載體。
  27. 一種治療受試者疾病的方法，所述方法包括向該受試者施用如申請專利範圍第1-18的IL-2突變蛋白或如申請專利範圍第19項所述的融合物或如申請專利範圍第20或21項所述的免疫綴合物或如申請專利範圍第26項所述的醫藥組成物，較佳地，該疾病是癌症。
  28. 一種刺激受試者免疫系統的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的包含如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL-2突變蛋白或如申請專利範圍第19項所述的融合物或如申請專利範圍第20或21項所述的免疫綴合物的醫藥組成物。
  29. 一種用於獲得IL-2突變蛋白的方法，包括如下步驟：-在IL-2與IL-2Ra的結合界面藉由突變引入一個或多個(如兩個或三個)糖基化基序N-X-S/T，其中X可以為任意胺基酸，但P(脯胺酸)除外，和/或在IL-2的B’C’環區藉由突變以縮短該環區序列，較佳地引入如如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的糖基化突變和/或如如申請專利範圍第9或10項中所述的B’C’環序列突變，更佳地引入如申請專利範圍第13或18項中所述的組合突變；-在哺乳動物細胞(例如HEK293或者CHO細胞)中表達IL-2突變蛋白，例如以Fc融合物形式(例如FcLALA融合物)；-鑒定具有如下一項或多項改善性質的突變蛋白：(i)表達量和/或穩定性；(ii)降低IL2R α結合；(iii)增強的IL2R β結合。
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