TWI791894B - 新型白介素２及其用途 - Google Patents

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周帥祥
史新震
劉軍建
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Abstract

本發明涉及新型白介素2(IL-2)突變蛋白及其用途。具體地，本發明涉及，與野生型IL-2相比，具有降低的IL-2R α受體結合能力和/或提高的IL-2R β受體結合能力的IL-2突變蛋白。本發明還提供包含該IL-2突變蛋白的融合蛋白、免疫綴合物，以及編碼該IL-2突變蛋白的核酸、包含該核酸的載體和宿主細胞。本發明進一步提供製備該IL-2突變蛋白的方法、包含該IL-2突變蛋白的醫藥組成物和該突變蛋白的治療用途。

Description

新型白介素2及其用途
本發明涉及新型白介素2(IL-2)突變蛋白及其用途。具體地，本發明涉及與野生型IL-2 2相比，具有降低的IL-2R α受體結合能力和/或提高的IL-2R β受體結合能力的IL-2突變蛋白。本發明還提供包含該IL-2突變蛋白的融合蛋白、免疫綴合物，以及編碼該IL-2突變蛋白的核酸、包含該核酸的載體和宿主細胞。本發明進一步提供製備該IL-2突變蛋白的方法、包含該IL-2突變蛋白的醫藥組成物和該突變蛋白的治療用途。
白介素2(IL-2)，也稱作T細胞生長因子(TCGF)，是一種主要由活化的T細胞，尤其是CD4+ T輔助細胞產生的多能細胞因子。在真核細胞中，人IL-2(uniprot：P60568)作為153個胺基酸的前體多肽合成，在去除N端20個胺基酸後，產生成熟的分泌性IL-2。其它物種的IL-2的序列也已經公開，參見NCBI Ref Seq No.NP032392(小鼠)、NP446288(大鼠)或NP517425(黑猩猩)。
白介素2具有4個反平行的、兩親性α螺旋，此4個α螺旋形成其功能必不可少的四級結構(Smith,Science 240,1169-76(1988)；Bazan,Science257,410-413(1992))。在大多數情況下，IL-2藉由三種不同受體發揮作用：白介素2受體α(IL-2R α；CD25)、白介素2受體β(IL-2R β；CD122)和白介素2受體γ(IL-2R γ；CD132)。IL-2R β和IL-2R γ對於IL-2的信號傳導至 關重要，而IL-2R α(CD25)對於信號傳導不是必需的，但可以賦予IL-2對受體的高親和力結合(Krieg等，Proc Natl Acad Sci 107,11906-11(2010))。由IL-2R α,β，和γ聯合形成的三聚體受體(IL-2 α β γ)為IL-2高親和力受體(KD約10pM)，由β和γ組成的二聚體受體(IL-2 β γ)為中間親和力受體(KD約1nM)，單獨由α亞基形成的IL-2受體為低親和力受體。
免疫細胞表達二聚體或三聚體IL-2受體。二聚體受體在細胞毒性CD8+ T細胞和天然殺傷細胞(NK)上表達，而三聚體受體主要在激活的淋巴細胞和CD4+ CD25+FoxP3+抑制性調節T細胞(Treg)上表達(Byman,O.和Sprent.J.Nat.Rev.Immunol.12,180-190(2012))。由於靜息狀態的效應T細胞和NK細胞在細胞表面上沒有CD25，故對於IL-2相對不敏感。而Treg細胞在體內一貫表達最高水平的CD25，因此，正常情況下IL-2會優先刺激Treg細胞增殖。
IL-2藉由與不同細胞上IL-2受體的結合，在免疫反應中介導多重作用。一方面，作為免疫系統刺激劑，IL-2可以刺激T細胞增殖和分化，誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)生成，促進B細胞增殖和分化和免疫球蛋白合成，並刺激天然殺傷(NK)細胞的生產、增殖和活化，並由此已經被批准作為免疫治療劑用於癌症和慢性病毒感染的治療。另一方面，IL-2可以促進免疫抑制性CD4+CD25+調節性T細胞(即，Treg細胞)的活化與增殖(Fontenot等，Nature Immunol 6,1142-51(2005)；D’Cruz和Klein,Nature Immunol 6,1152-59(2005)；Maloy和Powrie,Nature Immuno16,1171-72(2005))，從而導致免疫抑制。此外，高劑量IL-2在患者中可引起血管滲漏綜合征(VLS)。已經證實，IL-2藉由直接結合肺內皮細胞上的IL-2三聚體受體(IL-2 α β γ)而誘導肺水腫(Krieg等，Proc Nat Acad Sci USA107,11906-11(2010))。
為了克服與IL-2免疫治療相關的上述問題，已經提出了藉由改變IL-2對不同受體的選擇性或偏好性，來降低IL-2治療的毒性和/或提高其功 效。例如，已經提出使用IL-2單克隆抗體與IL-2的複合物，藉由使IL-2靶向表達CD122而非CD25的細胞，誘導對CD122high群體的優先擴增，增強體內IL-2治療效果(Boyman等，Science 311,1924-1927(2006))。Oliver AST等(US2018/0142037)提出在IL-2的胺基酸殘基位置42,45和72上引入三重突變F42A/Y45A/L72G來降低對IL-2R α受體的親和力。Aron M.Levin等(Nature,Vol 484,p529-533,DOI：10.1038/nature10975)提出一種稱作“superkine”的IL-2突變體IL-2H9，該突變體包含五重突變L80F/R81D/L85V/I86V/I92F，具有增強的IL-2R β結合，由此提高了對CD25-細胞的刺激作用。Rodrigo Vazquez-Lombardi等人(Nature Communications,8：15373,DOI：10.1038/ncomms15373)提出一種三重突變人IL-2突變蛋白IL-23X，該蛋白在胺基酸殘基位置38,43和61分別具有殘基突變R38D/K43E/E61R，導致該突變蛋白對IL-2R α不結合，以達到消除IL-2對CD25+細胞的激活偏向性。但是，IL-23X對CD25+細胞的激活偏向性依然存在，且該突變蛋白表達量較低，不利於後續作為藥物大規模生產。
鑒於IL-2在免疫調節和疾病中的作用，本領域仍然存在著開發具有改善性質的新IL-2分子的需求。
[發明概述]
本發明藉由提供相對於野生型IL-2具有改善的IL-2受體選擇性/偏向性的新IL-2突變蛋白，滿足了上述的需求。
因此，在一個方面，本發明提供了新的IL-2突變蛋白。在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白具有以下一個或多個特性：(i)相對於野生型IL-2，對IL-2R α受體的結合親和力降低；(ii)相對於野生型IL-2，對IL-2R β受體的結合親和力增強； (iii)有效降低IL-2對CD25+細胞的激活偏向性；(iv)有效激活CD25-細胞。
在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白相比於野生型IL-2具有表達量高的特性。
在一些實施方案中，本發明提供在IL-2的胺基酸殘基區域35-72中包含至少一個突變的IL-2突變蛋白；在另一些實施方案中，本發明提供在IL-2的胺基酸殘基區域79-92中包含至少一個突變的IL-2突變蛋白；在再一些實施方案中，本發明提供在胺基酸區域35-72和79-92中包含兩個以上且較佳地三個以上突變的IL-2突變蛋白。
此外，本發明提供了包含IL-2突變蛋白的融合蛋白和免疫綴合物，醫藥組成物和組合產品；編碼IL-2突變蛋白的核酸，包含所述核酸的載體和宿主細胞；以及產生本發明的IL-突變蛋白、融合蛋白和免疫綴合物的方法。
再有，本發明也提供了利用本發明的IL-2突變蛋白治療疾病的方法和刺激受試者免疫系統的方法和用途。
在下面的圖式和具體實施方案中進一步說明本發明。然而，這些圖式和具體實施方案不應被認為限制本發明的範圍，並且本領域技術人員容易想到的改變將包括在本發明的精神和所附申請專利範圍的保護範圍內。
第1圖顯示了IL-2與IL-2R α複合物的晶體結構。
第2圖顯示了IL-2與IL-2R β複合物的晶體結構。
第3A圖及第3B圖顯示了用於構建突變文庫IBYDL029以及突變文庫IBYDL030和IBYDL031的引子設計。
第4A圖至第4D圖顯示了從突變文庫IBYDL029和IBYDL031篩選出的一些IL-2突變蛋白及其序列，以及由兩個文庫中選出的突變組合產生的一些新突變蛋白及其序列。
第5A圖至第5D圖顯示了選擇並構建的一些IL-2mutant-FC在CD8+ CD25-/CD25+ T細胞上激活p-STAT5的信號曲線。
第6圖顯示了人白介素(IL-2)的成熟蛋白序列(SEQ ID NO：1)及其胺基酸殘基編號，並顯示了與突變蛋白IL-23X和IL-2H9的序列比對。
[發明詳述]
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本領域一般技術人員通常所理解的含義相同的含義。為了本發明的目的，下文定義了以下術語。
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
術語“和/或”應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或多項的組合。
如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”或“包括”某個突變或突變組合的IL-2突變蛋白時，也旨在涵蓋僅具有所述突變或突變組合的IL-2突變蛋白。
在本文中，野生型“白介素-2”或“IL-2”是指作為引入本發明突變或突變組合的模板的親本IL-2蛋白，較佳天然存在的IL-2蛋白，例如來源 於人、小鼠、大鼠、非人靈長類動物的天然IL-2蛋白，包括未經加工的(例如未去除信號肽)的形式和經加工的(例如去除了信號肽)的形式。此外，該表述也包括天然存在的IL-2等位基因變體和剪接變體、同種型、同源物、和物種同源物。該表述也包括天然IL-2的變體，例如，所述變體可以與天然IL-2具有至少95%-99%或更高同一性或具有不超過1-10個或1-5個胺基酸突變(尤其是保守胺基酸取代)，並與天然IL-2蛋白具有基本相同的IL-2R α結合親和力和/或IL2R β結合親和力。因此，在一些實施方案中，野生型IL-2相比於天然IL-2蛋白可以包含不影響其對IL-2受體結合的胺基酸突變，例如，在125位引入了突變C125S的天然人IL-2蛋白(uniprot：P60568)屬於本發明的野生型IL-2。一個野生型人IL-2蛋白的實例顯示於SEQ ID NO：1中。在一些實施方案中，野生型人IL-2序列可以與SEQ ID NO：1的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%，甚至至少96%、97%、98%、或99%或更高的胺基酸序列同一性。
在本文中，胺基酸突變可以是胺基酸取代、缺失、插入和添加。可以進行取代、缺失、插入和添加的任意組合來獲得具有期望性質(例如降低的IL-2R α結合親和力)的最終突變蛋白構建體。胺基酸缺失和插入包括在多肽序列的胺基和/或羧基末端的缺失和插入。例如，可以在全長人IL-2位置1缺失丙胺酸殘基。較佳的胺基酸突變是胺基酸取代。在一些實施方案中，當旨在藉由在本發明描述的具體突變胺基酸位置上引入突變來獲得具有改變的受體結合特性的IL-2突變蛋白時，較佳在位置上進行非保守胺基酸取代。在一些實施方案中，較佳的非保守胺基酸取代包括用親水性胺基酸替換疏水性胺基酸，或者用不同極性或相反電荷的胺基酸進行替換。
在本發明中，當提及胺基酸位置時，藉由參考SEQ ID NO：1的野生型人IL-2蛋白(也稱作IL-2WT)胺基酸序列(如圖6所示)，予以確定。可以藉由進行胺基酸序列比對(例如使用BLAST；可從http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov /Blast.cgi？PROGRAM=blastp& PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome獲得的Basic Local Alignment Search Tool，使用默認參數，進行比對)，鑒定在其它IL-2蛋白或多肽(包括全長序列或截短片段)上的對應胺基酸位置。因此，在本發明中，例如，當提及“F42”時，是指SEQ ID NO：1的第42位苯丙胺酸殘基F，或經比對在其它IL-2序列上的對應位置的胺基酸殘基。當提及多個位置的組合時，例如F42位、R81位和S87位，可以表示為F42/R81/S87。
在本文中，在提及IL-2突變蛋白時，按照以下方式描述突變。胺基酸取代表示為[原始胺基酸殘基/位置/取代的胺基酸殘基]。例如，位置92的異亮胺酸取代為亮胺酸，可以表示為I92L。當在一個給定位置(例如H79位)可以有多種可選胺基酸取代方式(例如D,E,Q)時，取代可以表示為：(1)H79D,E,Q；或(2)H79D/E/Q。相應地，對於在多個給定位置(例如R81，R83和S87)的組合突變，可以表示為：1)R81D/N,R83E,I92L/F/Y；或(2)R81D/S87D/I92L。
在本文中，可以藉由在比較窗內比較兩條最佳比對的序列來確定“序列同一性百分比”。較佳地，在參考序列(例如SEQ ID NO：1)的全長上確定序列同一性。用於比較的序列比對方法是本領域內公知的。適用於確定序列同一性百分比的算法包括例如BLAST和BLAST 2.0算法(參見Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-402,1977和Altschul等J.Mol.Biol.215：403-10,1990。可藉由美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)公眾獲取(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)用於進行BLAST分析的軟體。出於本申請的目的，同一性百分比通常用設置為缺省參數的BLAST2.0算法來確定。
如本文中使用的，術語“保守取代”意指不會不利地影響或改變包含胺基酸序列的蛋白/多肽的生物學功能的胺基酸取代。例如，可藉由本領域內已知的標準技術例如定點誘變和PCR介導的誘變引入保守取代。典型的保守 型胺基酸取代是指將一種胺基酸取代為具有相似的化學性質(例如電荷或疏水性)的另一種胺基酸。以下六組各自包含彼此可進行典型保守取代的胺基酸：1)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；2)天冬胺酸(D)、谷胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、穀胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、賴胺酸(K)；5)異亮胺酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；和6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。例如，野生型IL-2蛋白可以相對於SEQ ID NO：1具有保守胺基酸取代，或僅具有保守胺基酸取代。再例如，本發明的突變IL-2蛋白相對於野生型IL-2蛋白除了具有本發明的特徵性突變外還可以具有保守胺基酸取代，或僅具有保守胺基酸取代。
“親和力”或“結合親和力”反映結合對子的成員之間相互作用的內在結合能力。分子X對其結合配偶體Y的親和力可以由平衡解離常數(KD)表示，平衡解離常數是解離速率常數和結合速率常數(分別是kdis和kon)的比值。結合親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的生物膜層干涉(BLI)技術測定。此外，也可以藉由本文中所述的流式細胞染色法來初步評估IL-2突變蛋白對不同受體的親和力的變化。例如，可以將展示在酵母細胞上的野生型IL-2和突變IL-2蛋白，用生物素化的IL-2R β或IL-2R α受體進行染色分析，來鑒定相比於野生型IL-2，與IL-2R受體IL-2R β或IL-2R α的結合親和力發生改變的IL-2突變蛋白。
在本文中，抗體結合分子是可以特異性結合抗原的多肽分子，例如，免疫球蛋白分子、抗體或抗體片段，例如Fab片段和scFv片段。
在本文中，抗體Fc片段是指含有至少一部分的恒定區的免疫球蛋白重鏈的C-端區域，並且可以包括天然序列Fc片段和變體Fc片段。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fc片段從重鏈的Cys226或從Pro230延伸至羧基端。在另一實施方案中，Fc-片段的C-端賴胺酸(Lys447)可以存在或可以不存在。在另一些實施方案中，Fc片段可以包含突變，例如L234A/L235A突變。除非本 文中另外指出，Fc片段中的胺基酸殘基的編號根據EU編號系統，也稱為EU索引，如Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。
本發明的各方面將在下面各小節中進一步詳述。
1‧本發明的IL-2突變蛋白
本發明在一方面提供新IL-2突變蛋白，所述突變蛋白具有改善的IL-2受體選擇性/偏好性，更為具體地，降低或消除的對IL-2R α受體的結合親和力和/或增強的對IL-2R β受體的結合親和力。
本發明IL-2突變蛋白的有利生物學性質
IL-2蛋白藉由與IL-2受體相互作用來引發信號傳導和發揮功能。野生型IL-2對不同IL-2受體顯示出不同的親和力。在靜息效應細胞(包括CD8+細胞毒性T細胞和NK細胞)上表達與野生型IL-2具有較低親和力的IL-2 β和γ受體。在調節性T細胞(Treg)細胞和激活的效應細胞上表達與野生型IL-2具有高親和力的IL-2R α。由於高親和力的原因，野生型IL-2會優先結合細胞表面的IL-2R α，再招募IL-2R β γ，藉由IL-2R β γ釋放下游p-STAT5信號，刺激Treg細胞和激活的效應細胞。因此，不受理論的束縛，降低或消除IL-2對IL-2R α受體的親和力，將降低IL-2優先激活CD25+細胞的偏向性，降低IL-2介導的Treg細胞的免疫下調作用。不受理論的束縛，維持或增強對IL-2 β受體的親和力將保留或增強IL-2對效應細胞如CD8+細胞毒性T細胞和NK細胞的激活作用，因此達到免疫刺激作用。
本發明的IL-2突變蛋白藉由在IL-2與IL-2R α相互作用的區域(胺基酸殘基35-72位)和/或在IL-2與IL-2R β相互作用的區域(胺基酸殘基79-92位)引入一個或多個突變，尤其是三個以上突變，使得IL-2突變蛋白與IL-2R α 的結合降低或不結合，和/或與IL-2R β的結合保持不變或增強。由此，相對於野生型IL-2，本發明的IL-2突變蛋白具有改善的性質，包括例如以下的一項或多項：(1)對IL-2R α受體的結合親和力降低或消除；(2)對IL-2R β受體的結合親和力增強；(3)對高親和力IL-2R受體(IL-2R α β γ)的結合親和力降低；(4)對中等親和力IL-2R受體(IL-2R β γ)的結合親和力增加；(5)在CD25+細胞(特別是激活的CD8+ T細胞和Treg細胞)中激活IL-2信號傳導，尤其是激活STAT5磷酸化信號的能力降低；(6)導致減少的由IL-2介導的CD25+細胞(特別是激活的CD8+ T細胞和Treg細胞)激活和增殖；(7)降低或消除IL-2優先刺激Treg細胞增殖的偏向性；(8)降低Treg細胞在IL-2誘導下的免疫下調作用；(9)保持或增強，尤其是增強，對CD25-細胞(尤其是CD25- T效應細胞和NK細胞)的激活作用；(10)導致增加的由IL-2介導的效應T細胞與NK細胞激活和增殖；(11)導致提高的免疫刺激作用；(12)提高抗腫瘤效應。
在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白具有上述(1)的性質，較佳地進一步具有選自(3)和(5)-(8)的一項或多項，尤其是所有的性質；更較地還進一步具有選自(2)和(9)-(12)的一項或多項，尤其是所有性質。在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白具有上述(2)的性質，較佳地進一步具有選自(9)-(12)的一項或多項，尤其是所有的性質；更較地還進一步具有選自(1),(3)和(5)-(8)的一項或多項，尤其是所有的性質。
在一些較佳地實施方案中，本發明IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2還具有以下性質：減小的由IL-2與高親和力受體IL-2 α β γ結合介導的體內毒性。
在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白具有改善的成藥性質，例如，當在哺乳動物細胞例如H293T細胞中表達時，具有選自以下的一項或多項性質：(i)優於野生型IL-2蛋白的表達量；(ii)優於野生型IL-2蛋白的同質性；和(iii)易於純化至更高的蛋白純度。
在本發明的一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白與野生IL-2相比表現出表達水平的增加。在本發明的一些實施方案中，增加的表達發生在哺乳動物細胞表達系統中。表達水平可藉由允許定量或半定量分析細胞培養上清液(較佳一步親和層析純化後的上清液)中的重組IL-2蛋白量的任何合適方法來測定。在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白，與野生型IL-2相比，在哺乳動物細胞中的表達量增加至少1.1倍，或至少1.5倍，或至少2倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍以上。
在一些較佳的實施方案中，一步蛋白A親和層析純化後，本發明IL-2突變蛋白產物的純度可以達到70%，或80%，或90%以上。在一些實施方案中，蛋白純度藉由SEC-HPLC技術檢測。
在一些實施方案中，相對於野生型IL-2(例如SEQ ID NO：1中所示IL-2WT)，本發明IL-2突變蛋白對IL-2R α受體的親和力降低至少5倍、至少10倍、或至少25倍，尤其是至少30倍、50倍或100倍以上。在較佳的實施方案中，本發明的突變蛋白不結合IL-2R α受體。結合親和力可以藉由生物膜層干涉(BLI)技術測定本發明IL-2突變蛋白，例如與Fc片段融合的本發明IL-2突變蛋白，與受體IL-2R α受體的平衡解離常數(KD)來確定。
在一些實施方案中，相對於野生型IL-2，本發明IL-2突變蛋白(例如SEQ ID NO：1中所示IL-2WT)對IL-2R β受體的親和力增強至少5倍，至少10倍，或至少25倍，尤其是至少30倍、50倍或100倍，更佳地，至少150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、或500倍或550倍以上。結合親和力可以藉由生物膜層干涉(BLI)技術測定本發明IL-2突變蛋白，例如與Fc片段融合的本發明IL-2突變蛋白，與受體IL-2R β受體的平衡解離常數(KD)來確定。在一個實施方案中，以IL-2-Fc融合蛋白形式，在BLI測定中，本發明IL-2突變蛋白與受體IL-2R β受體的結親和力KD值小於10.0E-09M，例如小於6.0E-09M、3.0E-09M、2.0E-09M、1.0E-09M，更佳地小於9.0E-10M，例如小於6.0E-10M、5.0E-10M、4.0E-10M、3.0E-10M、2.0E-10M、1.0E-10M，更佳小於9.0E-11M、8.0E-11M、或7.0E-11M。
在一個實施方案中，相對於野生型IL-2，本發明IL-2突變蛋白導致減少的由IL-2介導的CD25+細胞激活和增殖。在一個實施方案中，CD25+細胞是CD25+ CD8+ T細胞。在另一實施方案中，CD25+細胞是Treg細胞。在一個實施方案中，在STAT5磷酸化測定試驗中，藉由檢測IL-2突變蛋白在CD25+細胞中對STAT5磷酸化信號的激活，來鑒定IL-2突變蛋白激活CD25+細胞的能力。例如，如本申請實施例中所述，可以藉由流式細胞術分析細胞中的STAT5磷酸化，確定半最大有效濃度(EC50)。在一個實施方案中，如在STAT5磷酸化測定試驗中測定的，例如以FC融合蛋白形式，本發明IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白(例如SEQ ID NO：1的人IL-2)，激活CD25+細胞的能力降低了至少10倍、50倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍或更高。
在一個實施方案中，相對於野生型IL-2，本發明IL-2突變蛋白導致保持的或增強的由IL-2介導的CD25-效應細胞激活和增殖。在一個實施方案中，CD25-細胞是CD8+效應T細胞或NK細胞。在一個實施方案中，在 STAT5磷酸化測定試驗中，藉由檢測IL-2突變蛋白在CD25-細胞中激活STAT5磷酸化信號的EC50值，來鑒定IL-2突變蛋白激活CD25-細胞的能力。在一個實施方案中，如在STAT5磷酸化測定試驗中測定的，本發明IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白(例如SEQ ID NO：1的人IL-2)，激活CD25+細胞的能力提高了至少1倍、例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍、20倍、50倍、100倍、或150倍。
在一個實施方案中，相對於野生型IL-2，本發明IL-2突變蛋白去除或降低IL-2對CD25+細胞優先激活的偏向性在一個實施方案中，CD25+細胞是CD25+ CD8+ T細胞。在另一實施方案中，CD25+細胞是Treg細胞。在一個實施方案中，在STAT5磷酸化測定試驗中，藉由檢測IL-2突變蛋白分別在CD25-細胞中和在CD25+細胞中激活STAT5磷酸化信號的EC50值，來鑒定IL-2突變蛋白激活CD25-細胞的能力。例如，藉由計算在CD25-和CD25+ T細胞上激活STAT5磷酸化信號的EC50值的比值，確定IL-2突變蛋白對CD25+細胞的激活偏向性。較佳地，相對於野生型蛋白，突變蛋白對CD25+的偏向性降低了至少100倍，較佳至少1000倍、2000倍、3000倍。
本發明的突變蛋白
IL-2蛋白屬於具有四個α螺旋束(A,B,C,D)結構的短鏈I型細胞因子家族成員。根據晶體結構(PDB：1Z92)的分析，IL-2在胺基酸殘基區域35-72具有如下與CD25相互作用的胺基酸位點：35；37；38；41；42；43；45；61；62；68；72。根據晶體結構(PDB：2ERJ)的分析，IL-2在胺基酸殘基區域12-23和胺基酸區域79-92具有如下與CD122相互作用的位點：12；13；15；16；19；20；23；79；81；82；83；84；87；88；91；92。
本發明人發現，藉由在IL-2的胺基酸殘基區域35-72(以下簡稱“CD25結合區”)的CD25相互作用位點上(即，位點35；37；38；41；42； 43；45；61；62；68；72)，引入特定突變，可以降低或消除IL-2與IL-2R α的結合，同時保持或增強與IL-2R β的結合。本發明人也發現，藉由在IL-2的胺基酸殘基區域79-92(以下簡稱“CD122結合區”)的CD122相互作用位點上(即，位點79；81；82；83；84；87；88；91；92)，引入特定突變，可以增強IL-2與IL-2 β的結合。此外，本發明人也發現，可以將兩個區域的突變進行組合，以提供同時具有降低或消除的IL-2R α結合和增強的IL-2 β結合的IL-2突變體。
由此，本發明提供了IL-2突變蛋白，與野生型IL-2(較佳人IL-2，更較佳包含SEQ ID NO：1序列的IL-2)相比，所述突變蛋白包含至少一個突變，所述突變消除或降低對IL-2R α受體的結合親和力和/或增強對IL-2R β受體的結合親和力。
CD25結合區突變
在一個方面，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，在IL-2與其IL-2R α受體(CD25)相互作用的位點，較佳地在與SEQ ID NO：1的35、37、38、41、42、43、45、61、62、68和72位置相應的位置上，包含一個或多個突變(較佳至少3個)，所述突變消除或降低對IL-2R α受體的結合親和力，且較佳地導致增強的IL-2R β結合親和力。較佳地，在上述這些位置上的突變為胺基酸取代。更佳地，在這些位置上的突變分別為選自如下的取代殘基：35位：K35D、E；37位：T37D、E、R、K、F、Y、W；38位：R38D、E、F、Y、W、A、V；41位：T41K、R、M、F、Y、W、Q、E；42位：F42K、R、A、E、Q；43位：K43E、D、F、Y、W；45位：Y45R、K；61位：E61R、K、W、Y、L；62位：E62R、K、W、Y、L；68位：E68R、K、W、Y；72位：L72R、K、F、Y、W。更較佳地，這些位置上的取代殘基分別選自如下：K35D、E；T37E、D、K、W、Y；R38W、E、D、V、F、K；T41E、Y、 R、K、Q；F42E、R、K、Q、A；K43E、Y、D、W；Y45K、R；E61K、R、L、W；E68R、Y、W、K；L72K、F。再佳地，這些位置上的取代殘基分別選自如下：K35D、E；T37D、E；R38D、E、F；T41E；F42A、E、Q；K43E、D、Y；Y45R、K；E61R、K、W、Y、L；E62R、W；E68R、K、W、Y；L72K、F。最佳所述突變蛋白包含選自以下的一個或多個突變：K35D,E；T37E；R38F,E；T41E；F42A,E；Y45K；E68Y。在進一步實施方案中，在本發明IL-2突變蛋白中，降低或消除對IL-2R α受體的結合親和力的突變包括在選自與SEQ ID NO：1的以下位置相應的位置上的突變：K35/T37/R38/T41/K43；K35/T37/R38/T41/K43/L72；K35/T37/R38/K43/Y45/L72；K35/R38/T41/K43；K35/R38/T41/K43/L72；K35/R38/T41/K43/E61/L72；K35/R38/T41/K43/Y45/L72；K35/R38/T41/K43/Y45/E61/L72；K35/R38/F42/Y45；K35/R38/F42/Y45/E61/E68；K35/R38/F42/E68/L72；K35/R38/F42/K43/Y45/E68； K35/R38/F42/K43/Y45/E61/E68；K35/R38/F42/K43/Y45/E61/E68/L72；K35/T37/R38/F42；K35/T37/R38/F42/Y45/E61/E68；K35/T37/R38/F42/K43/Y45/E61/E68；K35/T37/R38/T41/F42/K43/Y45/E61/E68；K35/T37/R38/F42/Y45/E61/E62/E68/L72。
K35/T37/R38/F42/Y45/E62/E68；K35/T37/R38/F42/K43/E68；K35/T37/F42/K43；K35/T37/R38/T41/L72；K35/T37/R38/T41/F42；K35/T37/R38/T41/F42/K43/E68；K35/T37/R38/T41/F42/K43/Y45；K35/T37/R38/T41/F42/K43/Y45/L72；T37/R38/T41/F42/K43/Y45；K35/T37/T41/F42/K43/Y45；K35/T37/T41/F42/K43/E61/E68/L72；K35/T41/F42/K43/E68；K35/T37/R38/T41/K43/Y45；K35/T37/R38/T41/K43/Y45/L72； K35/T37/R38/T41/K43/Y45/E61/L72；K35/T37/R38/K43/L72；K35/R38/K43/L72；K35/T37/E61/L72；K35/Y45/E61/E68；K35/R38/T41/F42；K35/R38/T41/F42/Y45；K35/R38/T41/F42/Y45/E68；K35/R38/T41/E68；K35/R38/Y45/E68/L72；T37/K43/E68/L72；T37/K43/Y45/E68/L72；T37/K43/Y45/E61/E68/L72；T37/F42/Y45/E61/E68/L72；T37/T41/Y45/E61/E68/L72；R38/T41/F42/Y45/E61/E68；T41/K43/Y45/E61/E68/L72。
在一些較佳的實施方案中，降低或消除對IL-2R α受體的結合親和力的突變包括選自以下的突變組合： K35D/T37K/R38E/T41K/F42Q/K43D/E68Y；K35D/T37D/T41F/F42E/K43D/Y45K；K35D/T37K/R38D/T41E/K43E；K35D/R38E/T41E/K43E；K35D/R38F/F42E/Y45K；K35E/R38D/T41E/K43E/L72F；K35D/T37E/R38D/K43E/L72F；K35E/R38D/T41E/K43E/E61K/L72F；K35E/T37D/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R；T37E/K43E/Y45K/E68K/L72K；K35E/R38E/T41M/F42E/Y45K；K35D/T37E/R38D/T41E/K43E；K35D/T37D/R38E/K43E/L72F；K35E/T37D/R38D/K43E/L72F；K35D/R38D/T41E/K43E/Y45K/E61W/L72F；K35D/T37E/R38D/T41E/K43E/L72F；K35D/R38W/F42E/E68R/L72F；K35D/T37E/R38D/K43Y/Y45K/L72F；K35E/T37D/R38W/T41E/F42A/K43F/Y45K；K35D/T37E/R38D/T41R/F42Q；K35E/R38D/T41E/K43D/L72F；K35E/T41Q/F42R/K43D/E68Y；K35E/T37Y/R38W/T41Y/F42E/K43E/Y45K/L72K；K35D/T37E/R38D/K43Y/Y45R/L72F；K35E/T37E/R38D/T41E/K43Y；T37E/T41K/Y45R/E61L/E68K/L72K；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61W/E68R；K35D/T37E/R38E/T41E/L72F；K35D/T37D/R38D/T41E/L72F；K35D/R38E/T41E/K43E/L72F；K35E/T37D/R38D/T41E/K43Y/Y45K；K35D/T37D/F42A/K43E；K35E/R38E/T41E/K43Y/Y45K/L72F；K35D/R38W/F42E/K43Y/Y45R/E61R/E68Y；R38K/T41R/F42Q/Y45K/E61Y/E68W；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61L/E68R；K35D/T37E/R38E/T41E/K43E/Y45K/L72F；K35E/R38D/K43E/L72F；K35E/R38E/K43E/L72F；K35D/T37E/R38D/L72F；K35E/R38E/T41E/K43E/L72F；K35E/T37E/R38E/F42A；K35D/R38F/T41E/F42E/Y45K/E68Y；K35E/T37K/R38E/T41E/K43E/L72F；K35D/R38D/K43E/L72F；K35D/R38A/T41Q/F42R；K35D/T37E/R38F/F42E/K43E/E68R；K35D/T37E/R38D/T41E/K43E/Y45K/E61W/L72F；T37D/R38F/T41F/F42E/K43E/Y45R；K35D/R38W/F42E/K43E/Y45K/E68K； K35E/T37D/R38E/T41E/K43Y；K35E/R38W/F42E/Y45K；K35E/T37D/R38W/F42E/Y45K/E68Y/L72R；K35E/T37D/R38W/F42Q/Y45R/E62R/E68R；K35E/T37D/T41F/F42A/K43E/E61W/E68K/L72W；T41K/K43D/Y45R/E61L/E68K/L72K；K35E/T37E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R；K35E/T37D/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R；K35E/T37D/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R；K35E/T37D/R38W/F42Q/Y45K/E61R/E68R；K35E/R38D/Y45K/E68R/L72K；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R；T37E/K43D/E68Y/L72R；K35E/Y45R/E61L/E68W；K35E/T37D/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R；K35E/T37D/R38V/F42E/K43W/Y45R/E61L/E68W；K35E/T37A/R38W/F42Q/Y45K/E61R/E68R；K35E/T37W/R38E/T41Y/F42R/K43D/Y45K/E61K/E68W；K35D/R38W/F42K/K43Y/Y45R/E61R/E68W/L72K；K35E/T37E/E61W/L72K；K35E/R38Y/T41E/E68Y；K35E/T37E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R；T37D/K43D/Y45R/E61Y/E68K/L72R；K35D/R38W/F42E/K43Y/Y45R/E61R/E68Y/L72K；T37E/F42R/Y45R/E61Y/E68K/L72K；K35E/T37D/R38V/F42A/Y45K/E61R/E62W/E68Y/L72R。
在一些較佳實施方案中，降低或消除對IL-2R α受體的結合親和力的突變包括在選自以下的位置上的突變：K35/R38/F42/T37；K35/R38/F42/Y45/E61/E68；K35/R38/F42/Y45/E61/E68/T37。較佳地，所述突變包括：K35E、R38E、F42A、T37E；或K35E、R38W、F42Q、Y45R/K、 E61K/W/R、E68R，和視需要地T37D/E。最佳地所述突變為選自以下的突變組合：K35E/R38E/F42A/T37E；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61R/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R/T37E；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R/T37E。較佳地，包括這些突變組合的本發明IL-2蛋白相對於野生型IL-2具有提高的IL-2R β結合親和力；更較佳地，還具有降低的對CD25+細胞的激活偏向性。
在一些較佳實施方案中，降低或消除對IL-2R α受體的結合親和力的突變包括在選自以下的位置上的突變：K35/R38/F42/Y45/E61/E68/K43；K35/R38/F42/Y45/E61/E68/K43/L72；K35/R38/F42/Y45/E61/E68/K43/T37；K35/R38/F42/Y45/E61/E68/K43/T37/T41。較佳地，所述突變包括：K35D/E,R38W/V/E,F42E/K/R,Y45R/K,E61R/L/K,E68Y/W,K43Y/W/D，視需要地還包含T37D/W,T41Y；L72K中的一個或多個。更佳，所述突變為選自以下的突變組合：K35D/R38W/F42E/Y45R/E61R/E68Y/K43Y；K35D/R38W/F42E/Y45R/E61R/E68Y/K43Y/L72K；K35D/R38W/F42K/Y45R/E61R/E68W/K43Y/L72K； K35E/R38V/F42E/Y45R/E61L/E68W/T37D/K43W；K35E/R38E/F42R/Y45K/E61K/E68W/T37W/K43D/T41Y。更佳所述突變為：K35D/R38W/F42E/Y45R/E61R/E68Y/K43Y/L72K。較佳地，包括這些突變組合的本發明IL-2蛋白相對於野生型IL-2具有降低的或消除的IL-2R α受體結合親和力，且具有具有提高的IL-2R β結合親和力。
在一些實施方案中，降低或消除對IL-2R α受體的結合親和力的突變包括在選自以下的位置上的突變：K35/R38/T41/K43；K35/R38/T41/K43/T37；K35/R38/T41/K43/L72；K35/R38/T41/K43/T37/L72；K35/R38/T41/K43/E61/L72；K35/R38/T41/K43/Y45/L72；K35/R38/K43/T37/L72；K35/R38/K43/T37/L72/Y45。較佳地，所述突變包括：K35D/E,R38D/E,T41E,K43E/Y，視需要地還包括選自T37K/E、Y45K、E61K、L72F中的一者或兩者；或者較佳地所述突變包括：K35D/E、R38D、K43E/Y、T37D/E、L72F，視需要地還包括Y45K。更佳地所述突變為選自以下的突變組合：K35D/R38E/T41E/K43E；K35D/T37K/R38D/T41E/K43E；K35E/R38E/T41E/K43E/L72F；K35D/T37E/R38D/T41E/K43E/L72F；K35E/R38D/T41E/K43E/E61K/L72F；K35E/R38E/T41E/K43Y/Y45K/L72F；K35D/T37E/R38D/K43E/L72F；K35E/T37D/R38D/K43E/L72F；K35D/T37E/R38D/K43Y/Y45K/L72F；更較佳所述突變為選自以下的突變組合：K35D/T37E/R38D/T41E/K43E/L72F；K35E/R38D/T41E/K43E/E61K/L72F；K35E/R38E/T41E/K43Y/Y45K/L72F；K35D/T37E/R38D/K43E/L72F；K35E/T37D/R38D/K43E/L72F；K35D/T37E/R38D/K43Y/Y45K/L72F；最較佳地所述突變為：K35D/R38E/T41E/K43E。較佳地，包括這些突變組合的本發明IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2具有降低的或消除的IL-2R α受體結合親和力，且具 有提高的IL-2R β結合親和力；更佳地，還具有降低的對CD25+細胞的激活偏向性。
在一些較佳實施方案中，降低或消除對IL-2R α受體的結合親和力的突變包括在選自以下的位置上的突變：K35/R38/F42/Y45/E61/E68；K35/R38/F42/Y45/E61/E68/T37；K35/R38/F42/T37；K35/R38/T41/K43。
在一些較佳的實施方案中，降低或消除對IL-2R α受體的結合親和力的突變包括選自以下的突變組合：K35E/R38E/F42A/T37E；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61R/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R/T37E；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R/T37E；K35D/R38E/T41E/K43E。這些突變組合可以使本發明IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2具有降低的或消除的IL-2R α受體結合親和力，且具有提高的IL-2R β結合親和力；並且導致降低的對CD25+細胞的激活偏向性，同時保持或增強CD25-效應細胞的激活和/或增殖。
再一些較佳實施方案中，降低或消除對IL-2R α受體的結合親和力的突變包括選自以下的突變組合：K35D/T37E/R38E/T41E/K43E/Y45K/L72F；K35E/R38D/T41E/K43E/L72F；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61L/E68R；K35D/T37K/R38E/T41K/F42Q/K43D/E68Y；K35D/T37E/R38D/K43Y/Y45K/L72F；K35E/T37Y/R38W/T41Y/F42E/K43E/Y45K/L72K；K35D/R38W/F42E/K43E/Y45K/E68K；K35E/T41Q/F42R/K43D/E68Y； K35D/R38W/F42E/Y45R/E61R/E68Y/K43Y；K35D/R38F/T41E/F42E/Y45K/E68Y；K35E/T37K/R38E/T41E/K43E/L72F；R38K/T41R/F42Q/Y45K/E61Y/E68W。有利地，這些突變組合可以與本發明79-92區域中增加IL-2R β結合的突變組合，以提供與IL-2R α不結合同時與IL-2R β結合增強的IL-2突變蛋白。
CD122結合區突變
在再一方面，本發明的IL-2突變蛋白可以在IL-2與其β受體CD122(即IL-2R β)相互作用的位點，較佳地在與SEQ ID NO：1的79,81,82,83,84,87,88,91,92位置相應的位置上，包含一個或多個突變，所述突變增強對IL-2R β的結合親和力。較佳地，在上述這些位置上的突變為胺基酸取代。更佳地，在這些位置上的突變分別為選自如下的取代殘基：H79R、K、Y、W、D、E、Q；R81D、E、N、Q、T、H、Y、W；P82I、T、A；R83E；D84E、N、Q、H、T、V；S87T、D、N、E、Q、K、R、Y、W；N88D、E、Q、H、Y、W；V91T、L、I、M、D、N、E、Q、H；I92V、L、M、F、Y、W、N、D、E、Q。
在一個較佳實施方案中，本發明IL-2突變蛋白在與SEQ ID NO：1的79,81,82,83,87,91,92位置相應的位置上包含一個或多個突變，較佳地胺基酸取代，尤其是包含選自以下的一個或多個取代：H79D、E、Q；R81D、N；P82I、T、A；R83E；S87D、E；V91L、I；I92L、M、F、Y。在一個實施方案中，本發明突變蛋白，在與SEQ ID NO：1的12、13、15、16、19、20、23位置相應的位置上相對於野生型IL-2蛋白保持不變。
在一些較佳實施方案中，所述增強對IL-2R β的結合親和力的突變包括在選自以下的位置上的突變：H79/R81/S87/I92，H79/R81/S87/I92/P82。較佳地，所述突變包括H79D/E、R81D、S87D/E、I92L/F，視需要還包括P82T。更較佳所述突變包括選自以下的組合突變：H79D/R81D/S87D/I92L，和H79D/R81D/P82T/S87D/I92L。較佳地，所述突變組合可以使本發明IL-2突變蛋 白相對於野生型IL-2具有顯著提高的IL-2R β結合親和力，且更較佳地導致增強的CD25-效應細胞激活和/或增殖。
在一些較佳實施方案中，所述增強對IL-2R β的結合親和力的突變包括在選自以下的位置上的突變：R81/R83/S87；R81/R83/S87/I92；R81/P82/R83/S87；或R81/P82/R83/S87/I92；較佳還包括在H79和V91中的一個或兩個位置上的突變。較佳地，所述突變包括選自以下的組合突變：R81D、P82T/I/A、R83E、S87E/D；R81D/N、P82T/I/A、R83E、S87E/D、I92/L/M/F/Y；R81D、R83E、S87E/D；R81D、R83E、S87E/D、I92L，更較佳還包括H79D/E/Q和V91L/I中的一個或兩個。更較佳地，所述突變為選自以下的突變組合：H79D/R81D/S87D/I92L；H79D/R81D/P82T/S87D/I92L；R81D/P82T/R83E/S87E；R81D/P82T/R83E/S87E/V91L；R81D/P82A/R83E/S87E/V91L；H79E/R81D/P82T/R83E/S87E/V91L；H79E/R81D/P82I/R83E/S87D；H79Q/R81D/P82A/R83E/S87E；R81N/P82T/R83E/S87E/V91L/I92F；H79D/R81N/P82T/R83E/S87E/V91L/I92F；R81D/P82T/R83E/S87D/I92M；H79E/R81D/P82I/R83E/S87E/I92M；H79Q/R81D/P82T/R83E/S87D/V91L/I92Y；R81D/P82I/R83E/S87D/V91I/I92Y；R81D/P82T/R83E/S87D/I92L；R81D/P82T/R83E/S87D/V91L/I92L；R81D/P82A/R83E/S87E/I92L；H79E/R81N/P82A/R83E/S87D/I92L；R81D/P82T/R83E/S87E/I92M；R81D/P82A/R83E/S87E/I92M；H79E/R81D/P82A/R83E/S87E/I92M；R81D/R83E/S87D/I92L；R81D/R83E/S87E/I92L；H79D/R81D/R83E/S87D；H79D/R81D/R83E/S87E/V91I/I92L。較佳地，所述突變組合可以使本發明IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2具有顯著提高的IL-2R β結合親和力，且更佳地導致增強的CD25-效應細胞激活和/或增殖。
在一些實施方案中，增強對IL-2R β的結合親和力的突變為選自下的組合突變：H79D/R81D/S87D/I92L；H79E/R81D/P82T/R83E/S87E/V91L；H79E/R81D/P82I/R83E/S87D；H79Q/R81D/P82A/R83E/S87E；R81D/P82T/R83E/S87D/I92L；R81D/P82T/R83E/S87D/V91L/I92L；R81D/P82A/R83E/S87E/I92L；H79E/R81N/P82A/R83E/S87D/I92L；R81D/P82T/R83E/S87E/I92M；R81D/P82A/R83E/S87E/I92M；H79E/R81D/P82A/R83E/S87E/I92M；H79D/R81D/R83E/S87E/V91I/I92L。有利地，這些突變組合可以與本發明35-72位置區域中降低IL-2R α結合親和力的突變組合，以提供與IL-2R α不結合同時與IL-2R β結合增強的IL-2突變蛋白。
CD25結合區突變和CD122結合區突變的組合
在再一方面，本發明提供包含CD25結合區突變和CD122結合區突變的IL-2突變蛋白，較佳地所述突變蛋白具有降低的(或消除的)IL-2R α結合且具有增強的IL-2R α結合，更佳地還具有改善的成藥性能，例如更高的表達量和產品純度。
在一些較佳方案中，本發明提供包含選自如下突變組合的IL-2突變蛋白。
Figure 108134033-A0101-12-0025-73
Figure 108134033-A0101-12-0026-2
在一些較佳實施方案中，本發明提供IL-2突變蛋白，其中所述突變蛋白與野生型IL-2相比具有降低的刺激CD25+ T細胞中的信號傳導的能力，較佳地所述突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白(例如SEQ ID NO：1的人IL-2蛋白)包含(或者僅具有)選自以下的突變組合：K35E/R38E/F42A/T37E；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R； K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61R/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R/T37E；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R/T37E。
K35D/R38E/T41E/K43E。
在一些較佳實施方案中，本發明提供IL-2突變蛋白，其中所述突變蛋白與野生型IL-2相比具有降低的刺激CD25+ T細胞中的信號傳導的能力，且具有增強的刺激CD25- T細胞中信號傳導的能力，較佳地所述突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白(例如SEQ ID NO：1的人IL-2蛋白)包含(或者僅具有)選自以下的突變組合：K35D/R38W/F42E/K43E/Y45K/E68K/R81D/P82T/R83E/S87E/I92M；K35D/R38F/T41E/F42E/Y45K/E68Y/R81D/P82T/R83E/S87D/V91L/I92L。
其它突變
除了上述區域和位置中的突變，本發明的IL-2突變蛋白還可以在其它區域或位置上具有一個或多個突變，只要其保留本發明IL-2突變蛋白的上述一個或多個有益性質即可。例如，本發明IL-2突變蛋白還可以包含在位置125的取代，例如C125S、C125A、C125T、或C125V，以提供額外的優點，例如改善的表達或同質性或穩定性(參見例如，美國專利號4,518,584)。本領域技術人員知曉如何確定可以併入本發明IL-2突變蛋白中的額外突變。
IL-2突變蛋白與野生型蛋白之間的序列差異性可以用序列同一性表述，也可以用兩者之間差異胺基酸的數量來表達。在一個實施方案中，IL-2 突變蛋白與野生型蛋白之間具有至少85%、86%、87%、88%、89%同一性，較佳90%以上同一性，較佳95%，但較佳不超過97%，更較佳不超過96%同一性。在另一實施方案中，除了本發明的上述CD25結合區突變或CD122結合區突變或兩者的組合突變外，IL-2突變蛋白與野生型蛋白之間還可以具有不超過15個，例如1-10個，或1-5個突變。在一個實施方案中，所述其它突變可以是保守取代。在一個實施方案中，所述其它突變可以是賦予IL-2其它改善性質的突變。
2.融合蛋白和免疫綴合物
本發明還提供包含本發明IL-2突變蛋白的融合蛋白。在一個較佳的實施方案中，本發明IL-突變蛋白與可以賦予改善的藥代動力學性質的另一多肽融合，例如清蛋白，更佳抗體Fc片段。較佳地，Fc片段包含減小或去除效應子功能的突變，例如降低與Fc γ受體結合的L234A/L235A突變或L234A/L235E/G237A。較佳地，包含Fc的融合蛋白具有增加的血清半衰期。在一個較佳的實施方案中，包含Fc的融合蛋白同時還具有減少的由Fc區介導的效應子功能，例如ADCC或ADCP或CDC。
本發明還提供免疫綴合物，其包含本發明的IL2突變蛋白和抗原結合分子。較佳地，抗原結合分子是免疫球蛋白分子，特別是IgG分子，或抗體或抗體片段，特別是Fab分子和scFv分子。在一些實施方案中，所述抗原結合分子特異性結合腫瘤細胞上或腫瘤環境中呈現的抗原，例如選自以下的抗原：成纖維細胞活化蛋白(FAP)、生腱蛋白C的A1域(TNC A1)、生腱蛋白C的A2域(TNC A2)、纖連蛋白的外域B(Extra Domain B,EDB)、癌胚抗原(CEA)、和黑素瘤有關的硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)。由此，本發明免疫綴合物在施用於受試者體內後可以靶向腫瘤細胞或腫瘤環境，從而提供進一步的治療益處， 例如以更低的劑量進行治療的可行性和由此帶來的低副作用；增強的抗腫瘤效應等。
在本發明的融合蛋白和免疫綴合物中，本發明IL-2突變蛋白可以直接或藉由接頭與另一分子或抗原結合分子連接，且在一些實施方案中，在兩者之間包含蛋白水解切割位點。
3.多核苷酸、載體和宿主
本發明提供編碼以上任何IL-2突變蛋白或融合物或綴合物的核酸。可以採用本領域熟知的方法，藉由從頭固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼野生型IL-2的現有序列，產生編碼本發明突變蛋白的多核苷酸序列。此外，本發明的多核苷酸和核酸可以包含編碼分泌信號肽的區段，並與編碼本發明突變蛋白的區段可操作連接，從而可以指導本發明突變蛋白的分泌性表達。
本發明也提供包含本發明核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體，例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。在較佳的實施方案中，本發明的表達載體是pYDO_017表達載體(SEQ ID NO：13)。
本發明也提供包含所述核酸或所述載體的宿主細胞。適用於複製並支持突變IL-2蛋白或融合物或免疫綴合物表達的宿主細胞是本領域中公知的。可以用特定的表達載體轉染或轉導這類細胞，並且可以生長大量的含載體細胞以用於接種大規模發酵罐，從而獲得充足量的IL-2突變體或融合物或免疫綴合物用於臨床應用。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞或293細胞)。例如，可以在細菌中生成多肽，尤其在不需要糖基化時。在表達後，可以在可溶性級分中將多肽從細菌細胞糊分離並可以進一步純化。除了原核生物外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合編碼多肽的載體的純株或表達宿主，其中 包括糖基化途徑已被“人源化”的真菌和酵母菌株，這導致生成具有部分或完全的人糖基化模式的多肽。參見Gerngross,NatBiotech22,1409-1414(2004)和Li等，NatBiotech24,210-215(2006)。可用的哺乳動物宿主細胞系的例子是由SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚胎腎系(293或293T細胞，如例如記載於Graham等，JGenVirol36,59(1977))、幼侖鼠腎細胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4細胞，如例如記載於Mather,BiolReprod23,243-251(1980))、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、buffalo大鼠肝細胞(BRL3A)、人肺細胞(W138)、人肝細胞(HepG2)、小鼠乳房腫瘤細胞(MMT060562)、TRI細胞(如例如記載於Mather等，AnnalsN.Y.AcadSci383,44-68(1982))、MRC5細胞和FS4細胞。其它可用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub等，ProcNatlAcadSciUSA77,4216(1980))；和骨髓瘤細胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。在一個實施方案中，宿主細胞是真核生物細胞，較佳為哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚胎腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。
4.製備方法
再一方面，本發明提供製備本發明IL-2突變蛋白或融合物或綴合物的方法，其中所述方法包括，在適合IL-2突變蛋白或融合物或綴合物表達的條件下，培養包含編碼所述蛋白或融合物或綴合物的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從所述宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收所述蛋白或融合物或綴合物。
5.測定法
可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供IL-2突變蛋白進行鑒定、篩選，或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。
一方面，可以對本發明的IL-2突變蛋白，測試其與IL-2受體的結合活性。例如，可以藉由本領域已知的方法，諸如ELISA、Western印跡等，或本文實施例公開的例示性方法，來測定與人IL-2R α或β蛋白的結合。例如，可以使用流式細胞術進行測定，其中使經轉染在細胞表面上表達突變蛋白的細胞例如酵母展示細胞，與標記的(例如生物素標記的)IL-2R α或β蛋白進行反應。備選地，突變蛋白與受體的結合，包括結合動力學(例如KD值)，可以使用重組突變蛋白-Fc融合物，在生物膜層干涉(BLI)測定法中測定。在一些實施方案中，使用如實施例所描述的BLI測定法。
再一方面，可以藉由測定在受體結合下游發生的信號傳導和/或免疫激活效應。來間接測量IL-2突變蛋白結合IL-2受體的能力。
因此，在一些實施方案中，提供了用於鑒定具有生物學活性的突變IL-2蛋白的測定法。生物學活性可以包括，例如誘導具有IL-2受體的T和/或NK細胞增殖的能力、誘導具有IL-2受體的T和/或NK細胞中IL-2信號傳導的能力、藉由NK細胞生成干擾素(IFN)-γ作為次級細胞因子的能力、降低的誘導T細胞中細胞凋亡的能力、誘導腫瘤消退和/或改善存活的能力、和降低的體內毒性性質，例如降低的血管通透性。本發明也提供體內和/或體外具有這類生物學活性的突變IL-2蛋白。
本領域中公知多種方法可以用於測定IL-2的生物學活性。例如，用於測試本發明IL-2突變蛋白刺激NK細胞生成IFN-γ的能力的合適測定法，可以包括如下步驟：將培養的NK細胞與本發明的突變IL-2蛋白或融合或免疫綴合物溫育，並隨後藉由ELISA測量培養基中的IFN-γ濃度。IL-2信號傳導誘導數個信號傳導途徑，並且牽涉JAK(Janus激酶)和STAT(信號轉導物和轉錄的激活劑)信號傳導分子。
IL-2與受體β和γ亞基的相互作用導致受體以及JAK1和JAK3(分別與β和γ亞基結合)的磷酸化。然後，STAT5與磷酸化受體結合，並自身在非常重要的酪胺酸殘基上磷酸化。這導致STAT5從受體解離、STAT5二聚化以及STAT5二聚體移位至細胞核，在該處它們促進靶基因的轉錄。由此，可以例如藉由測量STAT5的磷酸化，評估突變體IL-2多肽經由IL-2受體誘導信號傳導的能力。此方法的詳情已經披露在實施例中。例如，可以將PBMC用本發明的突變體IL-2多肽或融合物或免疫綴合物處理，並藉由流式細胞術測定磷酸化STAT5的水平。
此外，可以藉由將從血液分離的T細胞或NK細胞與本發明的突變體IL-2多肽或免疫綴合物溫育來，接著測定經處理細胞的裂解物中的ATP含量，以測量T細胞或NK細胞應答IL-2的增殖。在處理前，可以用植物凝集素(PHA-M)預刺激T細胞。此測定法允許對存活細胞數目的靈敏定量，本領域中還已知大量合適的備選測定法(例如[3H]-胸苷摻入測定法、細胞滴定GloATP測定法、AlamarBlue測定法、WST-1測定法、MTT測定法)。
再有，可以在多種本領域中已知的動物腫瘤模型中評估突變的IL-2對腫瘤生長和存活的影響。例如，可以將人癌症細胞系的異種移植物植入免疫缺陷型小鼠，並用本發明的突變體IL-2多肽或融合物或免疫綴合物處理。可以基於死亡率、生命期觀察(不良作用的可見症狀，例如行為、體重、體溫)以及臨床和解剖病理學(例如測量血液化學值和/或組織病理學分析)來測定本發明的突變體IL-2多肽、融合和免疫綴合物在體內的毒性。例如，可以在預處理血管通透性動物模型中用血管滲漏報告分子檢查藉由用IL-2處理所誘導的血管通透性。較佳地，血管滲漏報告分子足夠大以揭示用於預處理的IL-2野生型形式的通透性。
6.篩選方法
再一方面，本發明提供一種降低消除或降低IL-2蛋白對IL-2R α受體的結合親和力和/或增強對IL-2R β受體的結合親和力的方法，包括在野生型IL-2蛋白中引入本文中描述的突變或突變組合，和鑒定(例如使用前述的測定方法)相對於野生型IL-2蛋白對ILR α或β具有改變的結合親和力、和/或改善的生物活性，例如前文中針對本發明IL-2突變蛋白描述的性質之一或多個的突變蛋白。在一些實施方案中，用作突變模板的親本野生型IL-2蛋白較佳與SEQ ID NO：1具有至少80%，或至少95%或99%或更高的同一性，更佳地為來源人的IL-2蛋白。
7.醫藥組成物和藥物製劑
本發明還包括包含IL-2突變蛋白或其融合物或免疫綴合物的組合物(包括醫藥組成物或藥物製劑)和包含編碼IL-2突變蛋白或其融合物或免疫綴合物的多核苷酸的組合物。這些組合物還可以視需要地包含合適的藥用輔料，如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑，包括緩衝劑。
適用於本發明的藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括那些具有石油、動物、植物或合成起源的，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用醫藥組成物時，水是較佳的載體。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載體，特別是用於可注射溶液。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途，亦參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第五版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的話，所述組合物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸浮液、乳 劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、持續釋放配製劑等的形式。口服配製劑可以包含標準載體，如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精。
可以藉由將具有所需純度的本發明的IL-2突變蛋白、融合物或免疫綴合物，與一種或多種視需要的藥用輔料(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.編(1980))混合，來製備包含本發明的藥物製劑，較佳地以凍幹製劑或水溶液的形式。示例性的凍幹抗體製劑描述於美國專利號6,267,958。水性抗體製劑包括美國專利號6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，後一種製劑包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。此外，可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有蛋白的固體疏水聚合物的半滲透基質，所述基質呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含一種或多種其它活性成分，所述活性成分是被治療的特定適應症所需的，較佳具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還提供其它抗癌活性成分，例如化療劑、PD-1軸結合拮抗劑(例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體)。所述活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。
因此，在一個實施方案中，組合物還包含第二治療劑。例如，第二治療劑可以是免疫檢查點抑制劑。例如第二治療劑可以選自包括但不限於：例如抗-CTLA-4抗體、抗CD47抗體、抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體、抗-CD40抗體、抗-OX40(亦稱為CD134,TNFRSF4,ACT35和/或TXGP1L)抗體、抗-LAG-3抗體、抗-CD73抗體、抗-CD137抗體、抗-CD27抗體、抗-CSF-1R抗體、TLR激動劑或IDO或TGF β的小分子拮抗劑的一種或多種。較佳地，第二治療劑是PD-1拮抗劑，尤其是抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗LAG-3、抗CD47。除了免疫治療藥物，第二治療劑也可以是其它放療或化療藥物。
8.組合產品
在一方面，本發明還提供了組合產品，其包含本發明的突變蛋白或其融合物或免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑等)。本發明的組合產品可用於本發明的治療方法中。
在一些實施方案中，本發明提供組合產品，其中所述其它治療劑為例如有效刺激免疫反應從而進一步增強、刺激或上調受試者的免疫反應的治療劑如抗體。在一些實施方案中，其它抗體為例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體或抗-LAG-3抗體或抗-CTLA-4抗體或抗TIM-3抗體。
在一些實施方案中，所述組合產品用於預防或治療腫瘤。在一些實施方案中，腫瘤為癌症，例如胃腸道癌症，例如胃癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌等；或皮膚癌，例如黑素瘤；或腎細胞癌、膀胱癌、非小細胞肺癌等。在一些實施方案中，所述組合產品用於預防或治療感染，例如細菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染等。
9.治療方法和用途
在本文中，術語“個體”或“受試者”可互換地使用，是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如，奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。特別地，受試者是人。
在本文中，術語“治療”指意欲改變正在接受治療的個體中疾病之天然過程的臨床介入。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態，以及緩解或改善預後。
在一方面中，本發明提供刺激受試者免疫系統的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的包含本發明IL-2突變蛋白或融合物或免疫綴合 物的醫藥組成物。本發明IL-2突變蛋白對於CD25- CD122+效應細胞(細胞毒性CD8+T細胞和NK細胞)具有高活性和選擇性，並具有降低的和去除的對CD25+ Treg細胞的刺激作用。因此，可以以低劑量使用本發明IL-2突變蛋白，以刺激受試者的免疫系統。
因此，在一些實施方案中，本發明涉及在受試者中增強機體的免疫應答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文所述的任何IL-2突變蛋白、或其融合物或免疫綴合物。在一些實施方案，將本發明的IL-2突變蛋白或其融合物或免疫綴合物施用於攜帶腫瘤的受試者，刺激抗腫瘤免疫應答。在另一些實施方案中，將本發明的抗體或其抗原結合部分施用於攜帶感染的受試者，刺激抗感染免疫應答。在一個實施方案中本發明IL-2突變蛋白可以與Treg耗竭抗體(例如，Fc γ R介導的Treg耗竭)組合使用，以進一步降低由Treg引起的免疫抑制作用。在一個實施方案中，本發明IL-2突變蛋白可以與免疫檢查點抑制劑組合施用，以例如提高癌症免疫治療效果，例如與抗PD-1和抗CTLA-4組合。
在另一方面中，本發明涉及治療受試者疾病，如腫瘤和癌症和感染的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文所述的任何IL-2突變蛋白、或其融合物或免疫綴合物。
癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。在一些實施方案中，腫瘤或腫瘤細胞可以選自結直腸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腺腫瘤、肺腫瘤、肺腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸腫瘤、黑色素瘤、宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、成膠質細胞瘤和頭頸部腫瘤。在一些實施方案中、癌症可以選自結直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、宮頸癌、膀胱癌、成膠質細胞瘤和頭頸癌。在一些實施方案中，腫瘤是黑色素瘤、腎細胞癌、結直腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌。
在另一方面中，本發明涉及治療受試者感染性疾病，例如慢性感染的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文所述的任何IL-2突變蛋白或其片段，或包含所述抗體或片段的免疫綴合物、多特異性抗體，或醫藥組成物。在一個實施方案中，所述感染是病毒感染。
在一些實施方案中，除了本發明IL-2突變蛋白或其融合物或綴合物外，本發明的方法還包括向所述受試者聯合施用一種或多種療法(例如治療方式和/或其它治療劑)。在一些實施方案中，治療方式包括手術治療和/或放射療法。在一些實施方案中，本發明方法還包括施用至少一種其它的免疫刺激性抗體，例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗-LAG-3抗體、抗CD43抗體、和/或抗CTLA-4抗體，這些抗體可以是例如全人源的、嵌合的、或人源化的抗體。
在一些實施方案中，抗PD-1抗體選自下組：IBI308(信迪利單抗，WO2017/025016A1)，MDX-1106(納武單抗(nivolumab)，OPDIVO)，Merck 3475(MK-3475，帕博利珠單抗(pembrolizumab)，KEYTRUDA)和CT-011(匹地利珠單抗(Pidilizumab))。在一些實施方案中，抗PD-1抗體是MDX-1106。在一些實施方案中，抗PD-1抗體是納武單抗(nivolumab)(CAS註冊號：946414-94-4)。在進一步的一些實施方案中，單獨或與PD-1拮抗劑組合的IL-2突變蛋白或其片段還能與一種或多種其它療法例如治療方式和/或其它治療劑組合施用。在一些實施方案中，治療方式包括外科手術(例如腫瘤切除術)；放射療法(例如，外粒子束療法，它涉及其中設計照射區域的三維適形放射療法)、局部照射(例如，指向預選靶或器官的照射)或聚焦照射等。
在一些實施方案中，本文提供了治療疾病(例如，腫瘤)的方法，包括給予受試者本文所述的突變蛋白和CTLA-4拮抗劑抗體。抗-CTLA-4抗體可以是例如選自以下的抗體：YERVOY®(伊匹木單抗(ipilimumab)或抗體10D1， 描述於PCT公開號WO 01/14424)，曲美木單抗(tremelimumab)(舊稱替昔利木單抗(ticilimumab),CP-675,206)，和描述於以下公開文獻中的抗-CTLA-4抗體：WO 98/42752；WO 00/37504；美國專利號6,207,156；Hurwitz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17)：10067-10071；Camacho等(2004)J.Clin.Oncology 22(145)：Abstract No.2505(抗體CP-675206)；和Mokyr等(1998)Cancer Res.58：5301-5304。
在一些實施方案中，本文提供了治療疾病(例如，腫瘤)的方法，包括給予受試者本文所述的抗-突變蛋白和抗-LAG-3拮抗劑抗體。抗-LAG3抗體可以是例如選自以下的抗體：描述於美國專利申請號US2011/0150892和WO2014/008218的抗體25F7,26H10,25E3,8B7,11F2或17E5，或包含這些抗體的CDR或可變區的抗體；BMS-986016；描述於US 2011/007023中的IMP731。
在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白可以與化療或化療劑聯合施用。在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白可以與放療或放療劑聯合施用。在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白可以與靶向療法或靶向治療劑聯合施用。在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白可以與免疫療法或免疫治療劑，例如單株抗體聯合施用。
本發明的突變蛋白(以及包含其的醫藥組成物或其融合物或免疫綴合物，和視需要地另外的治療劑)可以藉由任何合適的方法給藥，包括腸胃外給藥，肺內給藥和鼻內給藥，並且，如果局部治療需要，病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程，包括，但不限於，單次給藥或在多個時間點多次給藥、推注給藥及脈衝輸注。
為了預防或治療疾病，本發明突變蛋白的合適劑量(當單獨或與一種或多種其他的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類 型、疾病的嚴重性和進程、以預防目的施用還是以治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對所述抗體的應答，和主治醫師的判斷力。所述抗體以一次治療或經過一系列治療合適地施用於患者。
再一方面，本發明也提供本發明IL-2突變蛋白、組合物、免疫綴合物、融合物在製備用於前述方法(例如用於治療)的藥物中的用途。
描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。
實施例
實施例1：白細胞介素2突變文庫設計與構建
白細胞介素2突變文庫設計
根據白細胞介素2(Interleukin-2，簡稱IL-2)與其α受體CD25(簡稱IL-2R α)複合物的晶體結構(PDB：1Z92)(如第1圖所示)，列出相互作用位點的IL-2殘基按表1突變。各位點原始胺基酸占50%比例，其餘50%比例由表1中“突變胺基酸”均分。針對IL-2與IL-2R α的相互結合位點設計的文庫理論多樣性為3×8×8×9×6×6×3×6×6×5×6
Figure 108134033-A0101-12-0039-70
2.0×108，文庫命名為IBYDL029(Innoventbio Yeast Display Library)。
Figure 108134033-A0101-12-0040-3
根據IL-2與其β受體CD122(簡稱IL-2R β)複合物的晶體結構(PDB：2ERJ)(如第2圖所示)，列出相互作用位點的IL-2殘基按表2突變。各位點原始胺基酸占50%比例，其餘50%比例由表2中“突變胺基酸”均分。由於IL-2與IL-2R β的相互結合位點較多，文庫的理論多樣性太大，將文庫拆分成兩個小的文庫，位點在12-23的突變文庫為IBYDL030，理論多樣性為12×8×9×12×13×7×12
Figure 108134033-A0101-12-0040-71
1.1×107；位點在79-92的突變文庫為IBYDL031，理論多樣性為8×9×4×2×7×10×7×10×11
Figure 108134033-A0101-12-0040-72
3.1×107。
Figure 108134033-A0101-12-0041-4
白細胞介素2突變文庫構建
將野生型IL-2(uniprot：P60568,aa21-153,C125S，簡稱IL-2WT)放入酵母展示質粒pYDC011的兩個BamH I酶切位點之間。IL-2WT的序列在本申 請中顯示於SEQ ID NO：1中，在該序列的125位引入了C125S突變，以避免二硫化物橋接的IL-2二聚體形成。質粒構建的具體步驟如下：1.用引子AMP0210與AMP0211以IL-2WT基因為模板擴增；2.質粒pYDC011用BamH I(New England Biolab，貨號：R3136V)酶切後膠回收(QIAGEN Gel Extraction Kit,Cat.28704)；3.擴增產物與酶切產物經1%瓊脂糖凝膠回收；4.回收後，用One Step Cloning Kit(Vazyme貨號：C113-02)進行體外同源重組；5.重組後產物轉入大腸桿菌Top10感受態細胞(天根，貨號：CB104-02)，塗布於含胺苄抗性的LB平板，37℃培養過夜；6.生長的單株菌落經測序驗證後，正確的質粒命名為pYDC035。
根據已有文獻，IL-2突變體IL-23X與IL-2R α不結合，與IL-2R β結合力維持不變(Rodrigo Vazquez-Lombardi等，Nature Communications,8：15373,DOI：10.1038/ncomms15373)；IL-2突變體IL-2H9與IL-2R β結合增強，與結合IL-2R α維持不變(Aron M.Levin等，Nature,Vol 484,p529-533,DOI：10.1038/nature10975)。將IL-23X與IL-2H9展示於酵母表面，作為對照使用。IL-23X和IL-2H9的序列分別示於SEQ ID NO：2和3中，兩個蛋白與IL-2WT相同也包含C125S突變。
根據表1與表2的文庫構建方案，設計所需引子(如第3圖所示)並由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。
IBYDL029文庫DNA擴增：1.以pYDC035為模板，引子AMP0191、AMP0200擴增片段029-F；2.以pYDC035為模板，引子AMP0201、AMP0199擴增片段029-R；3.膠回收片段029-F、029-R作為PCR擴增模板，用引子AMP0191與AMP0199擴增全長片段029。
IBYDL030文庫DNA擴增：1.以pYDC035為模板，引子AMP0191、AMP0224擴增片段030-F；2.以pYDC035為模板，引子AMP0222、AMP0199擴增片段030-R；3.膠回收片段030-F、030-R作為PCR擴增模板，用引子AMP0191與AMP0199擴增全長片段030。
IBYDL031文庫DNA擴增：1.以pYDC035為模板，引子AMP0191、AMP0225擴增片段031-F；2.以pYDC035為模板，引子AMP0223、AMP0199擴增片段031-R；3.膠回收片段031-F、031-R作為PCR擴增模板，用引子AMP0191與AMP0199擴增全長片段031。
取100μg質粒pYDC011用BamH I酶切，酶切後用PCR產物回收試劑盒(QIAGEN PCR Purification Kit,Cat.28104)回收，獲得足量的線性化質粒。將線性化質粒與文庫DNA按4μg：12μg混合，按照現有的方法(Lorenzo Benatuil等人，An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries.Protein Engineering,Design & Selection vol.23 no.4 pp.155-159,2010)將各個文庫與線性化質粒的混合物電轉入EBY100酵母菌株。電轉後文庫梯度稀釋塗布於SD-Trp(TAKARA，貨號：630309)的平板，統計生長的菌落數，獲得文庫的實際多樣性為IBYDL029：4.2×108,IBYDL030：4.5×108,IBYDL031：3.8×108，均大於文庫的理論多樣性。
實施例2：IL-2 WT -FC、IL-2 3X -FC、IL-2R α、IL-2R β蛋白製備與生物素標記
表達質粒的構建
將IL-2WT,IL-23X基因序列放入載體pYDO_017兩個BamH I酶切位點之間，用於表達IL-2WT-FC與IL-23X-FC融合蛋白，本發明使用的Fc是指人IgG1的Fc(L234A、L235A，簡稱FcLALA)。將IL-2R α(Uiprot：P01589,aa22-217)與IL-2R β(Uiprot：P14784,aa27-240)在序列的C末端接上avi標簽與6個 組胺酸標簽(序列示於SEQ ID NO：11和12)，分別構建到pTT5載體上，用於表達IL-2R α與IL-2R β蛋白。
蛋白的表達及純化
使用化學轉染的方法將以上構建的表達質粒載體轉入HEK293-F(Invitrogen，貨號：R79007)細胞中。使用化學轉染試劑聚乙烯亞胺(簡稱PEI,Polysciences，貨號：23966)，按廠商提供的方案瞬時轉染培養的HEK293-F細胞。取終體積1/10(v/v)的Opti-MEM培養基(Gibco貨號：31985-070)作為轉染緩衝液，加入質粒，混勻，用0.22μm的濾頭過濾備用。加聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences，23966)到上一步的質粒中(質粒與PEI的質量比例在293F細胞中為1：3)，混勻後室溫孵育10min，獲得DNA/PEI混合物。將DNA/PEI混合物輕柔倒入HEK293細胞並混勻，在37℃，8% CO2的條件下培養24h後，補加VPA(Sigma，貨號：P4543-100G)使終濃度至2mM及2%(v/v)Feed(1g/L Phytone Peptone+1g/L Difco Select Phytone)，繼續培養6天。
表達IL-2WT-FC與IL-23X-FC融合蛋白的細胞培養液，以13000rpm離心20min，收集上清，用預裝管柱Hitrap Mabselect Sure(GE,11-0034-95)純化上清液。操作如下：純化前用5倍管柱體積的平衡液(0.2M Tris,1.5M NaCl,pH7.2)平衡填料管柱；將收集的上清藉由管柱，再用10倍管柱體積的平衡液清洗填料管柱，去除非特異性結合蛋白；用5倍管柱體積的洗脫緩衝液(1M sodium citrate，pH 3.5)沖洗填料，收集洗脫液。每1ml洗脫液加入80μL Tris(2M Tris)，使用超濾濃縮管(上海拓開生物科技有限公司，MCPM02C67)交換到PBS緩衝液(Gibco，70011-044)中，並測定濃度。取100μg純化後蛋白，調整濃度至1mg/mL，使用凝膠過濾色譜管柱(TOSOH貨號：18675)測定蛋白純度。
表達IL-2R α與IL-2R β蛋白的細胞培養液，以13000rpm離心20min，收集上清，用0.22μm的濾器過濾；提前將鎳管柱(5mL Histrap excel,GE,17-3712-06)用0.1M NaOH浸泡2h，然後用10倍管柱體積的超純水沖洗，去除鹼液，再用5倍管柱體積的結合緩衝液(20mM Tris,300mM NaCl,pH7.4)平衡純化管柱；將細胞上清藉由管柱，再用10倍管柱體積的沖洗緩衝液(20mM Tris,300mM NaCl,10mM imidazole,pH7.4)清洗管柱，去除非特異性結合的雜蛋白；最後用5倍管柱體積洗脫液(20mM Tris,300mM NaCl,100mM imidazole,pH7.4)將目的蛋白洗脫下來，用蛋白超濾濃縮交換到PBS，純化測定蛋白表達量與純度，見表3。
Figure 108134033-A0101-12-0045-5
IL-2R α與IL-2R β IH蛋白的生物素化標記
利用酶催化方法使IL-2R α與IL-2R β蛋白標記生物素，方法如下：取適量的IL-2R α與IL-2R β IH蛋白溶液，加入1/10(m/m)質量的His-BirA蛋白(uniprot：P06709)，同時加入終濃度為2mM ATP(sigma貨號：A2383-10G),5mM MgCl2,0.5mM D-生物素(AVIDITY貨號：K0717)；30℃ 孵育1h，藉由Superdex200 increase(GE,10/300GL,10245605)純化，去除多餘的生物素和His-BirA；純化後的樣品藉由Fortebio的Streptavidin(SA)傳感器(PALL,18-5019)驗證，確認生物素標記成功。本實施例獲得的生物素標記的IL-2R α、IL-2R β IH蛋白分別簡稱IL-2R α-Biotin和IL-2R β IH-Biotin。
實施例3：IL-2突變文庫篩選獲得IL-2 mutant 及染色鑒定
篩選與IL-2R β親和力高的IL-2 mutant
基於酵母的IL-2mutant展示文庫IBYDL029、IBYDL030、IBYDL031，均取2.0×109的酵母細胞進行培養與誘導，其中文庫的多樣性分別為2.0×108、1.1×107、3.1×107。由於IBYDL029文庫多樣性較大，第一輪篩選使用Miltenyi公司的MACS系統進行磁珠細胞分選。首先，將2×109酵母細胞在FACS洗滌緩衝液中(1×PBS，含有1%牛血清蛋白)室溫孵育30分鐘，緩衝液中含有500nM生物素標記的商購IL-2R β(Acro Biosystems，經EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素標記，簡稱IL-2R β-Biotin)。使用50ml預冷的FACS洗滌緩衝液洗一次，再用10ml相同洗滌緩衝液重懸細胞，並加入40μl鏈黴親和素微珠(Miltenyi biotec，貨號：130-090-485)於4℃孵育15分鐘。3000rpm離心3min棄去上清後用10ml FACS洗滌緩衝液重懸細胞，將細胞溶液加到Miltenyi LS管柱中。加樣完成後，用FACS洗滌緩衝液洗管柱3次，每次3ml。從磁性區域取下Miltenyi LS管柱，用5ml生長培養基洗脫，收集洗脫的酵母細胞並在30℃過夜生長。IBYDL030、IBYDL031文庫的多樣性較小，可以直接使用流式細胞儀進行第一輪的分選：各取1×108、2.5×108的酵母細胞用FACS緩衝液洗三次，於含有100nM IL-2R β-Biotin、Anti Flag抗體(Sigma貨號：F18041，1：1000稀釋)的FACS緩衝液中室溫孵育30分鐘；細胞用FACS洗滌緩衝液洗兩次之後，將細胞與含有SA-PE(鏈黴親和素-PE,Thermo Fisher貨號： S21388，1：200稀釋)、山羊抗小鼠偶聯Alex Flour-647(Thermo Fisher貨號：A21235，1：200稀釋)的FACS洗滌緩衝液混合，4℃下避光孵育15分鐘。用預冷的FACS洗滌緩衝液洗滌兩次，並重懸於1mL緩衝液中，將細胞轉移到帶濾器的分離管中。使用FACS MoFlo_XDP(Beckman)分選細胞，分選後的酵母細胞在30℃過夜生長。
將經過一輪篩選獲得的各文庫細胞在20℃下震盪誘導24小時以展示IL-2mutant，使用流式細胞儀進行第二輪分選。各文庫取3×107酵母細胞用FACS緩衝液洗三次，加入含有不同濃度IL-2R β-Biotin(029：300nM,030/031：100nM)、Anti Flag抗體的FACS緩衝液中，室溫孵育30分鐘；細胞用FACS洗滌緩衝液洗兩次之後，將細胞與含有SA-PE、山羊抗小鼠偶聯Alex Flour-647的FACS洗滌緩衝液混合，4℃下避光孵育15分鐘；用預冷的FACS洗滌緩衝液洗滌兩次，並重懸於1mL緩衝液中，將細胞轉移到帶濾器的分離管中。使用MoFlo_XDP分選細胞，分選後的酵母細胞並在30℃過夜生長。第三輪分選方案同第二輪，經過三輪篩選後，挑取單純株送測序。
使用IL-2R β-Biotin經三輪篩選，IBYDL029獲得53個突變序列，IBYDL030未獲得突變序列，IBYDL031獲得71個突變序列。
基於酵母的IL-2突變體展示文庫IBYDL029、IBYDL030、IBYDL031，使用實施例2獲得的自製IL-2R β IH-Biotin進行第二批次篩選。第一輪篩選使用MACS系統進行磁珠細胞分選。首先，各文庫取2×109酵母細胞在含有不同濃度IL-2R β IH-Biotin(IBYDL029：500nM,IBYDL030/031：200nM)的FACS洗滌緩衝液中室溫孵育30分鐘；後續步驟同第一批次的磁珠分選，經磁珠分選後獲得的酵母細胞在30℃過夜生長。使用流式細胞儀進行第二、三輪分選，兩輪篩選IL-2R β IH-Biotin濃度均選用IBYDL 029：500nM,IBYDL 030/031：100nM，其餘步驟同第一批次的二、三輪篩選。
使用IL-2R β IH-Biotin經三輪篩選，挑取單純株送測序，IBYDL029新增25個突變序列，IBYDL030同樣未獲得突變序列，IBYDL031新增41個突變序列。
IL-2 mutant 染色鑒定
將測序後含單一突變序列的酵母細胞，在20℃下震盪誘導24小時以展示IL-2mutant；分別與其受體IL-2R α-Biotin、IL-2R β IH-Biotin染色，具體步驟如下：
一、IL-2mutant展示的酵母細胞與IL-2R α-Biotin染色分析：1.每個樣品取1×106細胞，離心棄上清用FACS緩衝液洗一次後待用；2.加入100μL含50nM IL-2R α-Biotin與Anti Flag抗體的FACS緩衝液中室溫孵育30分鐘；3.用預冷的FACS緩衝液3000rpm 4℃離心3min洗滌兩次；4.加入100μL含SA-PE、山羊抗小鼠偶聯Alex Flour-647的FACS緩衝液，冰上避光孵育20min；5.用預冷的FACS緩衝液洗滌兩次後，用100μL緩衝液重懸細胞，用流式分析儀(BD,ACCURI C6)分析IL-2mutant與IL-2R α的結合水平。
二、IL-2mutant展示的酵母細胞與IL-2R β IH-Biotin染色分析：1.每個樣品取1×106細胞，離心棄上清用FACS緩衝液洗一次後待用；2.加入100μL含IL-2R β IH-Biotin(30nM-100nM)與Anti Flag抗體的FACS緩衝液中室溫孵育30分鐘；3.同上步驟3-5，分析IL-2mutant與IL-2R β的結合水平。
由流式染色的結果可知：IBYDL029第一批篩選獲得的53個IL-2mutant(具體序列見第4A圖)與IL-2R α結合的平均螢光信號強度同IL-23X接近， 均不結合；與IL-2R β結合的平均螢光信號強度強於IL-23X但弱於IL-2H9，IL-2R β結合信號最高的12個突變列於下表3-1。第二批篩選獲得的25個IL-2mutant(具體序列見第4B圖)與IL-2R α不結合；相對於IL-23X，與IL-2R β結合有不同程度的提高，IL-2R β結合信號最高的14個突變列於下表3-1。IBYDL031兩批次篩選獲得的112個IL-2mutant與IL-2R α、IL-2R β均結合，與IL-2R β結合信號較高的25個突變(具體序列見第4C圖)列於下表3-1，此25個突變與IL-2R β結合的平均螢光信號強度顯著強於IL-23X且相當於或稍弱於IL-2H9。
Figure 108134033-A0101-12-0049-6
此外，將來源於IBYDL029的突變與來源於IBYDL031的突變組合(具體序列見第4D圖)，以獲得與IL-2R α不結合同時與IL-2R β結合增強的新突變體，如表3-2。
Figure 108134033-A0101-12-0050-7
實施例4：IL-2 mutant -FC融合的表達及與受體的親和力(avidity)測定
表達質粒的構建
將IL-2mutant序列放入載體pYDO_017兩個BamH I酶切位點之間，用於表達IL-2mutant-FC融合蛋白。將含IL-2mutant的基因的酵母展示質粒等比例混合作為模板，使用兩端引子擴增片段，擴增後使用1%的瓊脂糖凝膠回收DNA片段；pYDO_017 BamH I酶切載體與回收的片段同源重組，重組後產物轉化大腸桿菌感受態細胞，經測序驗證獲得的IL-2mutant-FC的表達質粒。
IL-2 mutant 與FC融合蛋白的表達及純化
使用化學轉染的方法將含有編碼融合蛋白基因的載體轉入HEK293細胞中。使用化學轉染試劑PEI，按廠商提供的方案瞬時轉染培養的HEK293細胞。首先在超淨工作臺中準備質粒DNA和轉染試劑，取3mL Opti-MEM培養基(Gibco貨號：31985-070)加入50ml離心管中，加入30μg對應質粒的DNA，利用0.22μm的濾頭過濾含有質粒的Opti-MEM培養基，隨後加入90μg PEI(1g/L)，靜置20min。將DNA/PEI混合物輕柔倒入27mL HEK293細胞並混勻，在37℃，8% CO2的條件下培養20h後，補加VPA使終濃度至2mM及2%(v/v)Feed，繼續培養6天。
細胞培養後，以13000rpm離心20min，收集上清，用預裝管柱Hitrap Mabselect Sure純化上清液。操作如下：純化前用5倍管柱體積的平衡液(0.2M Tris,1.5M NaCl,pH7.2)平衡填料管柱；將收集的上清藉由管柱，再用10倍管柱體積的平衡液清洗填料管柱，去除非特異性結合蛋白；用5倍管柱體積的洗脫緩衝液(1M sodium citrate，pH 3.5)沖洗填料，收集洗脫液；每1ml洗脫液加入80μL Tris(2M Tris)，使用超濾濃縮管交換到PBS緩衝液中，並測定濃度。取100μg純化後蛋白，調整濃度至1mg/mL，使用凝膠過濾色譜管柱測定蛋白純度。47個本發明IL-2mutant的表達和純化結果如表4所示。
Figure 108134033-A0101-12-0052-8
Figure 108134033-A0101-12-0053-9
IL-2 mutant -FC與其受體的親和力測定
採用生物膜層干涉(BLI)技術測定了本發明34個IL-2mutant-FC與其受體的平衡解離常數(KD)。
BLI法親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2)：p.270-8)進行。傳感器在分析緩衝液中預濕20分鐘後，按照建立的方法，用Octet Red96測量候選IL-2mutant-FC分別與IL-2R α，IL-2R β的親和力：首先平衡基線120秒；然後將IL-2R α-Biotin或IL-2R β IH-Biotin固化至SA傳感器(PALL,18-5019)；將已固化IL-2R α-Biotin或IL-2R β IH-Biotin的傳感器置於含100nM IL-2mutant-FC的溶液中直至平臺期(100秒)，之後將傳感器轉移至分析緩衝液解離至少2分鐘，分別測定結合及解離。實驗結果使用1：1結合模型進行動力學的分析。
在如以上測定法所述進行的實驗中，36個由HEK293-F表達的IL-2mutant-FC與其受體的親和力KD值如表5所示。
Figure 108134033-A0101-12-0054-10
Figure 108134033-A0101-12-0055-11
由以上表結果可見：(1)經文庫篩選獲得的各IL-2mutant-FC與IL-2R β的親和力相比於IL-2WT與IL-23X，明顯增強；(2)除Y27D2、Y27F6、Y28A2、Y28A5外，各IL-2mutant-FC與IL-2R α的親和力相比於IL-2WT明顯降低或不結合，與IL-23X接近。綜合表4、5結果，選取Y29A2、Y29B2、Y30E1、Y07、Y10、Y33A4、Y33A5、Y33A6、Y33B1、Y33B4、Y33B5、Y33C5、Y33F4、Y34F4進行體外功能實驗。
實施例5：IL-2 mutant -FC體外功能實驗
IL-2WT與IL-2R α親和力高於IL-2R β,IL-2R γ，會優先結合細胞表面的IL-2R α，再招募IL-2R β γ，藉由IL-2R β γ釋放下游p-STAT5信號，刺激T細胞與NK細胞增殖。由於Treg細胞表面有IL-2R α，效應T細胞與NK細胞表面沒有IL-2R α，正常情況下IL-2WT會優先刺激Treg細胞增殖，下調免疫反應。IL-2mutant與IL-2R α不結合，消除了優先刺激Treg細胞增殖的偏好，同時刺激T細胞與NK細胞增殖，使得效應T細胞與NK細胞的數量有效增加，提高抗腫瘤效應。
本實施例藉由檢測各IL-2mutant-FC對原代人CD8+ T細胞p-STAT5信號的激活，驗證各突變體對CD25+細胞激活偏向性的去除，並篩選對CD25-細胞激活作用較強的突變體。具體步驟如下：
1.復蘇PBMC細胞：a)從液態氮取出PBMC細胞(Allcells貨號：PB005F，100M裝)，迅速置於37℃水浴鍋中，復蘇PBMC細胞；b)將細胞加入10mL已預熱的、含5%人AB血清(GemCell貨號：100-512)與1‰ DNA酶(STRMCELL貨號：07900)的X-VIVO15(Lonza貨號：04-418Q)培養基中，400G、25℃離心10分鐘(後續離心均為此條件)洗滌一次；c)加入20mL培養基重懸細胞，37℃二氧化碳培養箱靜置培養過夜。
2.純化人CD8+ T細胞：a)吸取步驟1中懸浮細胞液，離心棄上清；b)加入1mL Robosep緩衝液(STEMCELL貨號：20104)與100μL人AB血清及100μL人CD8+ T細胞純化試劑盒(Invitrogen貨號：11348D)中負性篩選抗體混合液重懸細胞；c)混勻後，4℃孵育20分鐘，每5分鐘搖晃一次；d)孵育後，加入10mL Robosep緩衝液，離心洗滌兩次；e)同時，取1mL磁性微球(人CD8+ T細胞純化試劑盒)，加入7mL Robosep緩衝液置於磁力架上1分鐘棄上清，預洗磁性微球；f)各加入1mL Robosep緩衝液分別重懸微球與細胞，混勻後室溫旋轉孵育30分鐘；g)孵育後，加入6mL Robosep緩衝液，置於磁力架上1分鐘，收集上清； h)收集液再次置於磁力架上1分鐘，收集上清；i)離心棄上清，使用預熱的T培養基重懸，調整密度至1×106/mL；j)取1/3細胞待後需刺激CD25表達，其餘細胞置於37℃二氧化碳培養箱靜置過夜培養。
3.刺激CD8+ T細胞表達CD25：a)取1/3步驟2中純化後的CD8+ T細胞，加入抗人CD3/CD28抗體的磁性微球(GIBCO貨號：11131D)，細胞與微球的比例為3：1；b)置於37℃二氧化碳培養箱靜置三天；c)加入10mL培養基清洗2次；d)加入培養基調整細胞密度至1×106/mL，37℃二氧化碳培養箱中靜置培養2天。
4.檢測細胞純度與表達水平：a)使用抗人CD8-PE(Invitrogen貨號：12-0086-42)、抗人CD25-PE(eBioscience貨號：12-0259-42)、同型對照抗體(BD貨號：556653)檢測細胞的CD8與CD25；b)步驟2中細胞為CD8+CD25-T細胞，步驟3中細胞為CD8+CD25+T細胞。
5.檢測各IL-2mutant-FC對CD8+CD25- T細胞激活p-STAT5信號的EC50：a)取CD8+CD25-T細胞，以每孔1×105細胞鋪96孔U底培養板(Costar貨號：CLS3799-50EA)；b)加入100μL各IL-2mutant-FC、商品化IL-2(R&D貨號：202-IL-500)、IL-2WT-FC、IL-23X-FC，最高濃度從266.7nM開始4倍梯度稀釋共12個梯度，37℃培養箱中孵育20分鐘；c)加入取55.5μL 4.2%甲醛溶液，室溫固定10分鐘； d)離心棄上清，加入200μL冰甲醇(Fisher貨號：A452-4)重懸細胞，4℃冰箱孵育30分鐘；e)離心棄上清，用200μL染色緩衝液(BD貨號：554657)洗滌3次；f)加入200μL含抗p-STAT5-AlexFlour647(BD貨號：562076，1：200稀釋)的破膜/固定緩衝液(BD貨號：51-2091KZ)，室溫避光孵育3小時；g)使用染色緩衝液洗滌三次，100μL染色緩衝液重懸細胞，進行流式細胞儀檢測；h)以抗體濃度為橫坐標、AlexFlour647中間螢光度值為縱坐標，製作p-STAT5信號的EC50值及曲線，結果如第5A圖及第5C圖。
6.檢測各IL-2mutant-FC對CD8+CD25+ T細胞激活p-STAT5信號的EC50：a)取CD8+CD25+T細胞，以每孔1×105細胞鋪96孔U底培養板；b)同步驟5中b)-h)，製作p-STAT5信號的EC50值及曲線，結果如第5B圖及第5D圖。
根據實驗結果，比較IL-2mutant-FC對CD8+CD25+T細胞的激活效應與CD8+CD25-T細胞的激活效應的比值(如表6.1,6.2)可知：1)本發明的各個IL-2mutant-FC對CD8+CD25-T細胞的激活效應好於IL-23X-FC，與IL-2WT-FC比較接近，其中Y07及Y10效果甚至強於商品化的IL-2；2)當刺激CD25表達後，本發明的各個IL-2mutant-FC對CD8+CD25+T細胞的激活效應比CD25-時有小幅提高，但相比於商品化IL-2、IL-2WT-FC的巨大幅度有顯著差別。總而言之，根據CD25+ EC50/CD25- EC50倍數顯而易見，本發明的各個IL-2的突變體有效消除了對CD25+細胞激活偏向性，且Y07、Y10激活CD25-細胞的效應好於其餘突變。
Figure 108134033-A0101-12-0059-12
Figure 108134033-A0101-12-0059-13
序列表
IL-2WT(SEQ ID NO：1)，具有突變(C125S)
Figure 108134033-A0101-12-0059-14
IL-23X(SEQ ID NO：2)，具有突變(C125S,R38D,K43E,E61R)
Figure 108134033-A0101-12-0059-15
IL-2H9(SEQ ID NO：3)，具有突變(C125S,L80F,R81D,L85V,I86V,I92F)
Figure 108134033-A0101-12-0060-17
酵母展示質粒pYDC011(SEQ ID NO：4)
Figure 108134033-A0101-12-0060-16
Figure 108134033-A0101-12-0061-18
Figure 108134033-A0101-12-0062-19
Figure 108134033-A0101-12-0063-20
引子序列：
AMP0191：cccggatcggactactagcagc(SEQ ID NO：5)
AMP0199：CTCCTTGCATTGCCTTCCCGTTG(SEQ ID NO：6)
AMP0210：GTTATTGCTTCAGTTTTAGCAGCTCCCACCAGCAGCAGCACC(SEQ ID NO：7)
AMP0211：CATCGTCATCCTTGTAATCgGAtCCaCCgCCtCCGGTCAGTGTGCT GATGATGC(SEQ ID NO：8)
AMP0224：CTGGGTCTTCTTGGTGCTGC(SEQ ID NO：9)
AMP0225：GAAGTTCTTGCTCTGGGCTAAATTG(SEQ ID NO：10)
IL-2受體序列：
IL-2R α受體(SEQ ID NO：11)，C末端帶avi標簽和His6標簽
Figure 108134033-A0101-12-0064-21
IL-2R β受體(SEQ ID NO：12)，C末端帶avi標簽和His6標簽
Figure 108134033-A0101-12-0064-22
Figure 108134033-A0101-12-0065-25
載體pYDO_017：(SEQ ID NO：13)
Figure 108134033-A0101-12-0065-23
Figure 108134033-A0101-12-0066-26
Figure 108134033-A0101-12-0067-27
Figure 108134033-A0101-12-0068-28
<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司
<120> 新型白介素2及其用途
<130> PF180433CNI
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> IL-2WT具有突變(C125S)
<400> 1
Figure 108134033-A0101-12-0069-29
<210> 2
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> IL-2 3X具有突變(C125S,R38D,K43E,E61R)
<400> 2
Figure 108134033-A0101-12-0070-30
<210> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> IL-2H9具有突變(C125S,L80F,R81D,L85V,I86V,I92F)
<400> 3
Figure 108134033-A0101-12-0070-31
Figure 108134033-A0101-12-0071-32
<210> 4
<211> 4827
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 酵母展示質粒pYDC011
<400> 4
Figure 108134033-A0101-12-0071-33
Figure 108134033-A0101-12-0072-34
Figure 108134033-A0101-12-0073-35
Figure 108134033-A0101-12-0074-36
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引子AMP0191
<400> 5
Figure 108134033-A0101-12-0074-37
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引子AMP0199
<400> 6
Figure 108134033-A0101-12-0074-38
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引子AMP0210
<400> 7
Figure 108134033-A0101-12-0075-42
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引子AMP0211
<400> 8
Figure 108134033-A0101-12-0075-43
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引子AMP0224
<400> 9
Figure 108134033-A0101-12-0075-41
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引子AMP0225
<400> 10
Figure 108134033-A0101-12-0075-40
<210> 11
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> IL-2R α C-末端帶avi標簽及His6標簽
<400> 11
Figure 108134033-A0101-12-0075-39
Figure 108134033-A0101-12-0076-44
<210> 12
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> IL-2R β C-末端帶avi標簽及His6標簽
<400> 12
Figure 108134033-A0101-12-0076-45
Figure 108134033-A0101-12-0077-46
<210> 13
<211> 6147
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 載體pYDO_017
<400> 13
Figure 108134033-A0101-12-0078-47
Figure 108134033-A0101-12-0079-48
Figure 108134033-A0101-12-0080-49
Figure 108134033-A0101-12-0081-50

Claims (21)

  1. 一種IL-2突變蛋白，其在SEQ ID NO：1序列的野生型IL-2蛋白上包含突變，其中，該突變為選自以下的突變組合：K35E/R38E/F42A/T37E；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61R/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R/T37E；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R/T37E；K35D/R38W/F42E/Y45R/E61R/E68Y/K43Y/L72K；K35D/T37E/R38D/T41E/K43E/L72F；K35E/R38E/T41E/K43Y/Y45K/L72F；K35D/T37E/R38D/K43E/L72F；K35E/T37D/R38D/K43E/L72F；K35D/T37E/R38D/K43Y/Y45K/L72F；及K35D/R38E/T41E/K43E； 其中，該IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白具有消除或降低對IL-2Rα受體的結合親和力，且具有增強對IL-2Rβ受體的結合親和力，且其中，該IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白易於純化至更高的蛋白純度。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的IL-2突變蛋白，其在胺基酸125位置具有胺基酸殘基S。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的IL-2突變蛋白，其具有以下的突變組合：K35E/R38E/F42A/T37E。
  4. 一種IL-2突變蛋白，其在SEQ ID NO：1序列的野生型IL-2蛋白上包含選自如下的突變組合：K35D/T37E/R38E/T41E/K43E/Y45K/L72F/H79E/R81D/P82I/R83E/S87D；K35E/R38D/T41E/K43E/L72F/R81D/P82A/R83E/S87E/I92M；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61L/E68R/R81D/P82A/R83E/S87E/I92L；K35D/T37K/R38E/T41K/F42Q/K43D/E68Y/H79E/R81D/P82T/R83E/S87E/V91L；K35D/T37E/R38D/K43Y/Y45K/L72F/R81D/P82T/R83E/S87D/I92L；K35E/T37Y/R38W/T41Y/F42E/K43E/Y45K/L72K/H79Q/R81D/P82A/R83E/S87E；K35D/R38W/F42E/K43E/Y45K/E68K/R81D/P82T/R83E/S87E/I92M；K35E/T41Q/F42R/K43D/E68Y/H79D/R81D/S87D/I92L；K35D/R38W/F42E/Y45R/E61R/E68Y/K43Y/H79E/R81N/P82A/R83E/S87D/I92L； K35D/R38F/T41E/F42E/Y45K/E68Y/R81D/P82T/R83E/S87D/V91L/I92L；及K35E/T37K/R38E/T41E/K43E/L72F/H79E/R81D/P82A/R83E/S87E/I92M；其中，該IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白具有降低或消除對IL-2Rα受體的結合親和力和增強對IL-2Rβ受體的結合親和力，且其中，該IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白易於純化至更高的蛋白純度。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的IL-2突變蛋白，其中，該IL-2突變蛋白與野生型IL-2蛋白相比，具有以下特性之一或多項：-具有消除或降低的對IL-2Rα受體的結合親和力，且具有增強的對IL-2Rβ受體的結合親和力；-具有降低的對高親和力IL-2R受體(IL-2Rαβγ)的結合親和力；-具有增加的對中等親和力IL-2R受體(IL-2Rβγ)的結合親和力；-降低對CD25+ CD8+T細胞的激活；-降低對CD25+ CD8+T細胞中IL-2介導的STAT5磷酸化信號的刺激作用；-去除或降低IL-2對CD25+細胞優先激活的偏向性；-降低由IL-2誘導的Treg細胞引起的免疫反應下調作用；-保持或增強對CD25- CD8+T細胞的激活作用；-刺激效應細胞T細胞和NK細胞的增殖和激活；及-提高抗腫瘤效應。
  6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的IL-2突變蛋白，其中，當以Fc抗體片段融合形式在哺乳動物細胞中表達時，在一步蛋白A親和層 析純化後，該IL-2突變蛋白產物的純度達到70%，或80%，或90%以上，其中，該蛋白純度係藉由SEC-HPLC技術檢測。
  7. 如申請專利範圍第1或4項所述的IL-2突變蛋白，其中，當以Fc抗體片段融合形式在哺乳動物細胞中表達時，該IL-2突變蛋白具有優於野生型IL-2蛋白的表達量，其中，該IL-2突變蛋白包含選自以下的突變組合：-K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R/T37D；-K35E/R38E/F42A/T37E；-K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R/T37E；-K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61L/E68R/R81D/P82A/R83E/S87E/I92L；-K35D/R38W/F42E/K43E/Y45K/E68K/R81D/P82T/R83E/S87E/I92M；及-K35D/R38F/T41E/F42E/Y45K/E68Y/R81D/P82T/R83E/S87D/V91L/I92L。
  8. 如申請專利範圍第1或4項所述的IL-2突變蛋白，其中，該IL-2突變蛋白與野生型IL-2蛋白相比具有降低的刺激CD25+ T細胞中的信號傳導的能力，其中，該IL-2突變蛋白包含選自以下的突變組合：K35E/R38E/F42A/T37E；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61K/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61W/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45K/E61R/E68R/T37D； K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R/T37D；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61R/E68R/T37E；K35E/R38W/F42Q/Y45R/E61K/E68R/T37E；及K35D/R38E/T41E/K43E。
  9. 如申請專利範圍第1或4項所述的IL-2突變蛋白，其中，該IL-2突變蛋白與野生型IL-2蛋白相比具有降低的刺激CD25+ T細胞中的信號傳導的能力，且具有增強的刺激CD25- T細胞中信號傳導的能力，其中，該IL-2突變蛋白包含選自以下的突變組合：K35D/R38W/F42E/K43E/Y45K/E68K/R81D/P82T/R83E/S87E/I92M；及K35D/R38F/T41E/F42E/Y45K/E68Y/R81D/P82T/R83E/S87D/V91L/I92L。
  10. 一種融合蛋白，其包含如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的IL-2突變蛋白。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的融合蛋白，其中，該IL-2突變蛋白與Fc抗體片段融合。
  12. 一種免疫綴合物，其包含如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的IL-2突變蛋白和抗原結合分子。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的免疫綴合物，其中，該抗原結合分子特異性結合腫瘤細胞上或腫瘤環境中呈現的抗原。
  14. 一種分離的多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的IL-2突變蛋白或如申請專利範圍第10或11項所述的融合物或如申請專利範圍第12或13項所述的免疫綴合物。
  15. 一種表達載體，其包含如申請專利範圍第14項所述的多核苷酸。
  16. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第14項所述的多核苷酸或如申請專利範圍第15項所述的載體。
  17. 一種生產IL-2突變蛋白或其融合物或免疫綴合物的方法，包括在適於表達所述IL-2突變蛋白或融合物或綴合物的條件下培養如申請專利範圍第16項所述的宿主細胞。
  18. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的IL-2突變蛋白或如申請專利範圍第10或11項所述的融合物或如申請專利範圍第12或13項所述的免疫綴合物和藥學可接受載體。
  19. 一種如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的IL-2突變蛋白或如申請專利範圍第10或11項所述的融合物或如申請專利範圍第12或13項所述的免疫綴合物或如申請專利範圍第18項所述的醫藥組成物的用途，其用於製備治療癌症的藥物。
  20. 一種藉由向IL-2蛋白中引入突變或突變組合以產生突變IL-2突變蛋白的方法，其中，相對於未引入突變或突變組合的IL-2，該IL-2突變蛋白降低或消除對IL-2Rα受體的結合親和力和增強對IL-2Rβ受體的結合親和力，並且該IL-2突變蛋白易於純化至更高的蛋白純度，其中該方法包括在IL-2蛋白中引入如申請專利範圍第1至4項中任一項中所述的突變或突變組合，其中該IL-2蛋白與SEQ ID NO：1具有至少95%的同一性，且來源於人的IL-2蛋白。
  21. 如申請專利範圍第1項或第4項所述的IL-2突變蛋白，其中，當以Fc抗體片段融合形式在哺乳動物細胞中表達時，在一步蛋白A親和層析純 化後，該IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白易於純化至更高的蛋白純度，其中，該蛋白純度係藉由SEC-HPLC技術檢測。
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