KR20220155317A - 인터루킨-2 돌연변이 및 이의 용도 - Google Patents

인터루킨-2 돌연변이 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 인터루킨-2(IL-2) 돌연변이 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 상기 IL-2 돌연변이 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 면역접합체, 상기 IL-2 돌연변이 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본 발명은 상기 IL-2 돌연변이 단백질을 제조하기 위한 방법, 상기 IL-2 돌연변이 단백질을 포함하는 약제학적 조성물, 및 상기 돌연변이 단백질의 치료적 용도를 추가로 제공한다.

Description

인터루킨-2 돌연변이 및 이의 용도
본 발명은 신규 인터루킨-2(IL-2) 돌연변이 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 야생형 IL-2 단백질에 비해 약물 기량성 개선, IL-2Rα 수용체에 대한 결합 능력 감소 및/또는 IL-2Rβ 수용체에 대한 결합 능력 향상과 같은 개선된 특성을 지니는 IL-2 돌연변이 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 상기 IL-2 돌연변이 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 면역접합체, 상기 IL-2 돌연변이 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본 발명은 IL-2 돌연변이 단백질, 상기 IL-2 돌연변이 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하고 스크리닝하기 위한 방법, 및 상기 돌연변이 단백질의 치료적 용도를 추가로 제공한다.
T-세포 성장 인자(TCGF)로도 알려진 인터루킨-2(IL-2)는 주로 활성화된 T 세포, 특히 CD4+T 보조 세포에 의해 생성되는 다기능 사이토킨이다. 진핵세포에서 인간 IL-2(UniProt: P60568)는 153개 아미노산으로 이루어진 전구체 폴리펩타이드로 합성되며, 20개의 N-말단 아미노산이 제거되면 성숙한 분비성 IL-2가 생성된다. 다른 종의 IL-2 서열에 대해서도 개시된 바 있었다. NCBI 참조 서열번호 NP032392(마우스), NP446288(랫트) 또는 NP517425(침팬지)를 참조한다.
인터루킨-2는 4개의 역평행 및 양친매성 α 나선을 가지며, 이는 기능에 필수적인 4차 구조를 형성한다(문헌[Smith, Science 240,1169-76 (1988)]; 문헌[Bazan, Science 257,410-413 (1992)]). 대부분의 경우 IL-2는 인터루킨-2 수용체 α(IL-2Rα; CD25), 인터루킨-2 수용체 β(IL-2Rβ; CD122), 인터루킨-2 수용체 γ(IL-2Rγ; CD132)의 세 가지 다른 수용체를 통해 작용한다. IL-2Rβ 및 IL-2Rγ는 IL-2 신호전달에 중요한 반면, IL-2Rα(CD25)는 신호전달에 필수적이지는 않지만 IL-2가 높은 친화성으로 수용체에 결합할 수 있도록 한다(문헌[Krieg 등, Proc Natl Acad Sci 107,11906-11 (2010)]). IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ의 조합에 의해 형성된 삼량체 수용체(IL-2αβγ)는 IL-2 고친화성 수용체이고(약 10pM의 KD를 가짐), IL-2Rβ 및 IL-2Rγ로 구성된 이량체 수용체(IL-2βγ)는 중간 친화성 수용체이고(약 1nM의 KD를 가짐), 서브유닛 α에만 의해서 형성된 IL-2 수용체는 저친화성 수용체이다.
면역 세포는 이량체 또는 삼량체 IL-2 수용체를 발현한다. 이량체 수용체는 세포독성 CD8+ T 세포 및 자연 살해(NK) 세포에서 발현되는 반면, 삼량체 수용체는 활성화된 림프구 및 CD4+ CD25+ FoxP3+ 억제 조절 T 세포(Treg)에서 주로 발현된다(문헌[Byman, O. 및 Sprent. J. Nat. Rev. Immunol. 12, 180-190 (2012)]). 휴지 상태의 이펙터 T 세포와 NK 세포는 세포 표면에 CD25가 없기 때문에 IL-2에 상대적으로 둔감하다. 그러나 Treg 세포는 체내에서 최고 수준의 CD25를 일관되게 발현하므로 일반적으로 IL-2는 Treg 세포 증식을 우선적으로 자극한다.
IL-2는 다른 세포의 IL-2 수용체에 결합함으로써 면역 반응에서 여러 작용을 매개한다. 한 측면에서, 면역계 자극제로서, IL-2는 T 세포 증식 및 분화를 자극하고, 세포독성 T 림프구(CTL) 생성을 유도하고, B 세포 증식과 분화 및 면역글로불린 합성을 촉진하고, 자연 살해(NK) 세포의 생성, 증식 및 활성화를 자극할 수 있으므로 암 및 만성 바이러스 감염의 치료를 위한 면역 치료제로서 승인 받았다. 또 다른 측면에서, IL-2는 면역억제성 CD4+ CD25+ 조절 T 세포(즉, Treg 세포)의 유지에 기여하고(문헌[Fontenot 등, Nature Immunol 6,1142-51 (2005)]; 문헌[D'Cruz 및 Klein, Nature Immunol 6,1152-59 (2005)]; 문헌[Maloy 및 Powrie, Nature Immunol 6,1171-72 (2005)]), 활성화 유도 세포 사멸(AICD)을 매개하고 자가항원 및 종양 항원에 대한 면역 관용의 확립 및 유지에 참여하는 것(문헌[Lenardo 등, Nature 353:858 (1991)])으로 인해, 환자에게 AICD에 기인한 종양 관용 및 활성화된 Treg 세포에 기인한 면역 억제를 초래하게 된다. 또한 고용량 IL-2 투여는 환자에게 혈관 누출 증후군(VLS)을 초래할 수 있다. IL-2는 폐 내피 세포의 IL-2 삼량체 수용체(IL-2αβγ)에 직접 결합함으로써 폐부종을 유도하는 것으로 나타났다(문헌[Krieg 등, Proc Nat Acad Sci USA 107,11906-11 (2010)]).
IL-2 면역요법과 관련된 상기 문제를 해결하기 위해, IL-2 요법의 독성을 감소시키고 및/또는 이 효과를 개선하기 위해 상이한 수용체에 대한 IL-2의 선택성 또는 선호도를 변경하는 것이 제안되었다. 예를 들어, 모노클로날 항체와 IL-2의 복합체는 CD25가 아닌 CD122를 발현하는 세포에 IL-2를 표적화함으로써 CD122high 집단의 증폭을 우선적으로 유도하고 체내 IL-2 요법의 효과를 개선하는 것으로 제안되었다(문헌[Boyman 등, Science 311, 1924-1927 (2006)]). Oliver AST 등 (US2018/0142037)은 IL-2Rα 수용체에 대한 친화성을 감소시키기 위해 IL-2의 아미노산 잔기 위치 42, 45 및 72에 삼중 돌연변이 F42A/Y45A/L72G를 도입하는 것을 제안하였다. Aron M. Levin 등(문헌[Nature, Vol 484, p529-533, DOI: 10.1038/nature10975])은 "슈퍼카인"이라고 하는 IL-2 돌연변이 IL-2H9를 제안했으며, 이는 5중 돌연변이 L80F/R81D/L85V/I86V/I92F를 포함하고 IL-2Rβ에 대한 결합이 강화되어 CD25에 대한 높은 결합을 유지하면서 CD25-세포의 자극을 증가시킨다. Rodrigo Vazquez-Lombardi 등(문헌[Nature Communications, 8:15373, DOI: 10.1038/ncomms15373])은 삼중 돌연변이가 있는 인간 IL-2 돌연변이 단백질 IL-23X를 제안한 것으로, 이는 각각 아미노산 잔기 위치 38, 43 및 61에서 잔기 돌연변이 R38D-K43E-E61R이 발생하여 돌연변이 단백질이 IL-2Rα에 결합하지 않도록 하였다. 그러나, 돌연변이 단백질은 CD25- 세포에 대한 활성화 효과가 약하지만 CD25+ 세포에 대한 활성화 선호도는 변하지 않는다. 또한 Rodrigo Vazquez-Lombardi 등은 또한 인터루킨의 약력학적 특성을 개선하기 위해 인터루킨-2-Fc 융합체를 제조할 것을 제안하였다. 그러나 융합 단백질의 발현 수율이 낮고 응집체를 형성하기 쉽다.
면역 조절 및 질환에서 IL-2의 역할을 고려하여, 개선된 특성을 갖는 새로운 IL-2 분자, 특히 생성 및 정제에 유리하고 개선된 약력학적 특성을 갖는 IL-2 분자를 개발할 필요성이 당업계에 남아있다.
본 발명은 야생형 IL-2 단백질과 비교하여 개선된 약물 기량성 및/또는 개선된 IL-2 수용체 선택성/선호도를 갖는 신규 IL-2 돌연변이 단백질을 제공함으로써 상기 요구를 충족시킨다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 신규 IL-2 돌연변이 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 하기 특성 중 하나 이상, 바람직하게는 적어도 특성 (i) 및 (ii)를 갖는다.
(i) 포유동물 세포에서 발현되는 경우 개선된 약물 기량성, 특히 개선된 발현 수율 및/또는 정제 성능;
(ii) IL-2Rα에 대한 감소된 또는 제거된 결합;
(iii) IL-2Rβ에 대한 향상된 결합.
일부 실시양태에서, 본 발명은 IL-2Rα와 IL-2의 결합 계면에 있는 돌연변이를 포함하고 단축된 B'C' 루프 서열을 갖는 IL-2 돌연변이 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 IL-2 돌연변이 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 면역접합체, 약제학적 조성물 및 조합 생성물; 상기 IL-2 돌연변이 단백질을 인코딩하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포; 및 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질, 융합 단백질 및 면역접합체를 생성하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질, 융합체 및 면역접합체를 사용하여 질환을 치료하기 위한 방법, 및 대상체의 면역계를 자극하기 위한 방법 및 용도를 추가로 제공한다.
본 발명을 다음의 도면 및 특정 실시양태에서 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 도면 및 특정 실시양태가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 당업자가 용이하게 상도할 수 있는 변형은 본 발명의 사상 및 첨부된 청구범위의 보호 범위에 포함된다.
도 1은 IL-2Rα와 IL-2(PDB: 1Z92)의 복합체의 결정 구조를 나타낸다.
도 2는 (A) IL-2의 결정 구조(PBD: 2ERJ) 및 (B) 인간 IL-2 및 인간 IL-15가 중첩된 B'C' 루프 구조를 나타낸다.
도 3은 돌연변이 라이브러리 IBYDL029를 구축하는 데 사용된 프라이머를 나타낸다.
도 4는 돌연변이 라이브러리 IBYDL029로부터 스크리닝된 IL-2 돌연변이 단백질 및 이의 서열을 나타낸다.
도 5A 내지 도 5B는 (A) CD8+ CD25- T 세포 및 (B) CD8+ CD25+ T 세포에서 선별되고 구축된 IL-2mutant-FC 융합 단백질에 의한 p-STAT5의 활성화 신호 곡선을 나타낸다.
도 6A 내지 도6C는 (A) IL-2mutant-FC 융합 단백질 Y092의 체내 항종양 효과, 및 (B 및 C) 동물에게 투여한 후 모니터링된 체중의 변화를 나타낸다.
도 7A 내지 도7C는 (A) IL-2mutant-FC 융합 단백질 Y144의 체내 항종양 효과, 및 (B 및 C) 동물에게 투여한 후 모니터링된 체중의 변화를 나타낸다.
도 8은 야생형 IL-2 단백질 IL-2WT(서열번호 1)의 아미노산 서열 및 이의 아미노산 잔기의 넘버링을 나타내며, 돌연변이 단백질 IL-23X와의 서열 정렬을 나타낸다.
도 9는 효모 표면 디스플레이 플라스미드 pYDC011의 완전한 서열을 나타낸다.
별도로 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 분야의 당업자들이 통상적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 지닌다. 본 발명의 목적을 위하여 하기 용어를 다음과 같이 정의한다.
수치와 함께 사용되는 용어 "약"은 명시된 수치보다 5% 적은 하한에서 명시된 수치보다 5% 많은 상한까지의 범위 내 수치를 망라하는 것으로 의도된다.
용어 "및/또는"은 옵션 중 임의의 하나 또는 옵션 중 임의 둘 이상을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함한다(comprise/include)"는 기술된 요소, 정수 또는 단계를 포함하되, 이 외의 요소, 정수 또는 단계를 배제하는 것이 아님을 의도된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함한다(comprise/include)"는, 달리 표시하지 않는 한, 전체가 기재된 요소, 정수 또는 단계로 구성되는 상황을 또한 망라한다. 예를 들어, 돌연변이 또는 돌연변이의 조합을 "포함하는(comprising/including)" IL-2 돌연변이 단백질이 언급될 때, 이는 또한 돌연변이만 또는 돌연변이의 조합만을 갖는 IL-2 돌연변이 단백질을 망라하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 야생형 "인터루킨-2" 또는 "IL-2"는 모 IL-2 단백질, 바람직하게는 자연 발생 IL-2 단백질(예를 들어 인간, 마우스, 랫트 또는 인간이 아닌 영장류로부터 유래된 천연 IL-2 단백질)을 지칭하며, 본 명세서에 개시된 돌연변이 또는 돌연변이의 조합이 도입될 템플릿으로써 작용하고, 처리되지 않은 형태(예를 들어, 신호 펩타이드가 제거되지 않음) 및 처리된 형태(예를 들어, 신호 펩타이드가 제거됨) 둘 다를 포함한다. 신호 펩타이드를 포함하는 전체 길이 천연 인간 IL-2 서열은 서열번호 2에 제시되며, 이의 성숙 단백질의 서열은 서열번호 3에 제시된다. 또한, 이 용어는 또한 IL-2의 자연 발생한 대립 유전자 변이체와 스플라이스 변이체, 이소타입, 상동체 및 종 상동체를 포함한다. 이 용어는 또한 천연 IL-2의 변이체를 포함하며, 이는 예를 들어 천연 IL-2와 적어도 95% 내지 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖거나 1개 내지 10개 또는 1개 내지 5개 이하의 아미노산 돌연변이를 가질 수 있고(특히 보존적 아미노산 치환) 바람직하게는 천연 IL-2 단백질과 실질적으로 동일한 IL-2Ra 및/또는 IL-2Rβ에 대한 결합 친화성을 가질 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 천연 IL-2 단백질과 비교하여, 야생형 IL-2 단백질은 IL-2 수용체에 대한 이의 결합에 영향을 미치지 않는 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 위치 125에 도입된 돌연변이 C125S를 갖는 천연 인간 IL-2 단백질(UniProt: P60568)은 본 명세서에 개시된 야생형 IL-2 단백질이다. C125S 돌연변이를 포함하는 야생형 인간 IL-2 단백질의 예는 서열번호 1에 제시된다. 일부 실시양태에서, 야생형 IL-2 서열은 서열번호 1, 2 또는 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% 또는 95% 초과, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 첨가일 수 있다. 치환, 결실, 삽입 및 첨가의 임의의 조합이 가능하여 IL-2Rα에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 개선된 약물 기량성과 같은 원하는 특성을 갖는 최종 돌연변이 단백질 구조를 획득할 수 있다. 아미노산 결실 및 삽입은 폴리펩타이드 서열 내의 결실 및 삽입뿐만 아니라 폴리펩타이드 서열의 아미노- 및/또는 카복시 말단 결실 및 삽입을 포함한다. 예를 들어, 알라닌 잔기는 전체 길이 인간 IL-2의 위치 1에서 결실될 수 있거나, 루프 영역의 길이를 단축시키기 위해 B'C' 루프 영역으로부터 하나 이상의 아미노산이 결실될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바람직한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환, 예를 들어 단일 아미노산 치환의 조합 또는 아미노산 서열의 단편 치환이다. 예를 들어, 야생형 IL-2의 B'C' 루프 영역 서열의 전체 또는 일부는 상이한 서열로 대체되어 바람직하게는 단축된 B'C' 루프 영역 서열을 획득할 수 있다.
본 발명에서 IL-2 단백질 또는 IL-2 서열 단편의 아미노산 위치를 언급할 때, 서열번호 1에 제시된(도 8에 도시된 바와 같음) 야생형 IL-2 단백질(IL-2WT이라고도 함)의 아미노산 서열을 참조하여 결정한다. 다른 IL-2 단백질 또는 폴리펩타이드(전체 길이 서열 또는 절단된 단편 포함)에서 상응하는 아미노산 위치는 서열번호 1과의 아미노산 서열 정렬에 의해 확인될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 달리 언급하지 않는 한 IL-2 단백질 또는 폴리펩타이드에서의 아미노산 위치는 서열번호 1에 따라 넘버링된 아미노산 위치이다. 예를 들어, "F42"가 언급될 때, 이는 서열번호 1의 위치 42에 있는 페닐알라닌 잔기 F, 또는 정렬에 의해 다른 IL-2 폴리펩타이드 서열에서 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기를 지칭한다. 아미노산 위치를 결정하기 위한 서열 정렬을 수행하려면 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 사용할 수 있는 기본 로컬 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool)를 기본 매개변수로 사용할 수 있다.
IL-2 돌연변이 단백질이 본 명세서에서 언급될 때, 단일 아미노산 치환은 [원래 아미노산 잔기/위치/치환용 아미노산 잔기]로 기술된다. 예를 들어, 위치 35의 라이신이 글루타메이트로 치환되면 K35E로 표시될 수 있다. 주어진 위치(예를 들어, K35)에서 여러 선택적인 아미노산 치환(예를 들어, D 및 E)이 있는 경우, 아미노산 치환은 K35D/E로 표시될 수 있다. 상응하게, 단일 아미노산 치환은 "+" 또는 "-"를 통해 함께 연결되어 여러 주어진 위치에 있는 조합 돌연변이를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 위치 K35E, T37E, R38E 및 F42A의 조합 돌연변이는 K35E+T37E+R38E+F42A 또는 K35E-T37E-R38E-F42A로 표시된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "서열 동일성 퍼센트"는 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 바람직하게는, 서열 동일성은 참조 서열(예를 들어, 서열번호 1)의 전체 길이에 의해 결정된다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 서열 동일성 퍼센트를 결정하는 데 적합한 알고리즘은 예를 들어 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 포함한다(문헌[Altschul 등, Nuc. Acids Res.25: 3389-402, 1977]; 및 문헌[Altschul 등, J.mol. Biol. 215: 403-10, 1990] 참조). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)에서 공개적으로 사용할 수 있다. 본 출원의 목적을 위해, 퍼센트 동일성은 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 사용 가능한 기본 로컬 정렬 검색 도구를 기본 매개변수로 사용함으로써 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 치환"은 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩타이드의 생물학적 기능에 악영향을 미치거나 이를 변경하지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 예를 들어, 보존적 치환은 부위 지정된 돌연변이 유발 및 PCR에 의해 매개된 돌연변이 유발과 같은 당업계에 알려진 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 전형적인 보존적 아미노산 치환은 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산의 보존적 대체 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에서, 보존적 치환용 잔기는 하기 보존적 치환 표 X, 특히 표 X에서의 보존적 아미노산 치환용 바람직한 잔기로부터 유래한다.
[표 X]
Figure pct00001
예를 들어, 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 하나에 비해 야생형 IL-2 단백질은 보존적 아미노산 치환을 갖거나 보존적 아미노산 치환만 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 본 명세서에 구체적으로 제시된 IL-2 돌연변이 단백질 서열(예를 들어, 서열번호 22 내지 서열번호 26 중 하나)에 비해 보존적 아미노산 치환을 갖거나 보존적 아미노산 치환만을 가질 수 있다.
"친화성" 또는 "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성 성분 간의 상호작용을 반영하는 고유한 결합 능력을 지칭한다. 결합 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 해리 속도 상수(kdis) 대 결합 속도 상수(kon)의 비율인 평형 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 결합 친화성은 당업계에서 알려진 일반적인 방법으로 측정할 수 있다. 친화성을 측정하기 위한 한 가지 특정 방법은 본 명세서에 기재된 포테바이오 친화성 분석(ForteBio affinity assay) 기술이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 항원 결합 분자는 항원, 예를 들어 면역글로불린 분자, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, Fab 단편 및 scFv 단편)에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드 분자이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체 Fc 단편은 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭하며, 천연 서열의 Fc 단편 및 변이체 Fc 단편을 포함할 수 있다. 천연 서열의 Fc 단편은 면역글로불린의 다양한 천연 발생 Fc 서열, 예컨대 다양한 Ig 서브클래스 또는 이의 동종이형의 Fc 영역을 포함한다(문헌[Gestur Vidarsson 등, IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions, 20 October 2014, doi: 10.3389/fimmu.2014.00520]). 한 실시양태에서, 인간 IgG의 중쇄 Fc 단편은 중쇄의 Cys226 또는 Pro230에서 카복시 말단까지 연장된다. 또 다른 실시양태에서, Fc 단편의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 단편은 돌연변이, 예를 들어 L234A-L235A 돌연변이를 포함하는 변이체 Fc 단편이다. 본 명세서에서 달리 표시하지 않는 한, 문헌[Kabat, E.A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 기재된 바와 같이, Fc 단편의 아미노산 잔기는 EU 인덱스라고도 하는 EU 넘버링 시스템에 의해 넘버링된다.
본 발명의 모든 측면은 하기 섹션에서 보다 상세하게 설명된다.
1. 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질
한 측면에서, 본 발명은 개선된 약물 기량성 및/또는 개선된 IL-2 수용체 선택성/선호도를 갖는 신규한 IL-2 돌연변이 단백질을 제공한다.
본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질의 유리한 생물학적 특성
본 발명자들은 IL-2 돌연변이 단백질의 IL-2Rα에 대한 결합이 IL-2Rα와 IL-2 수용체의 결합 계면에서 하나 이상의 특이적 돌연변이를 도입함으로써 감소되거나 제거될 수 있음을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 IL-2의 발현 및/또는 순도는 증가될 수 있고 및/또한 IL-2Rβ에 대한 IL-2의 친화성은 IL-2의 B'C' 루프 서열을 IL-15와 같은 다른 인터루킨 사이토킨의 짧은 B'C' 루프 서열로 대체함으로써, 또는 IL-2의 B'C' 루프 시퀀스를 절단함으로써 증가될 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 추가로, 예를 들어 하기 중 하나 이상으로부터 선택된 개선된 특성을 갖는 IL-2 돌연변이가 IL-2Rα 수용체 결합 계면 돌연변이를 단축된 B'C' 루프 영역 돌연변이와 조합함으로써 제공될 수 있음을 발견하였다: (i) 개선된 발현 및/또는 순도; (ii) IL-2Rα 수용체에 대한 감소 또는 제거된 결합; 및/또는 (iii) IL-2Rβ 수용체에 대한 향상된 결합.
따라서, 본 발명은 전술한 개선된 특성 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상, 특히 개선된 특성 (i) 및 (ii)를 모두 갖는 IL-2 돌연변이 단백질을 제공한다.
개선된 약물 기량성
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 개선된 약물 기량성을 갖는다. 예를 들어, 포유동물 세포, 예컨대 H293T 세포 또는 CHO 세포에서, 예를 들어 Fc 융합 단백질의 형태로 발현되는 경우, IL-2 돌연변이 단백질은 하기로부터 선택된 하나 이상의 특성을 갖는다: (i) 야생형 IL-2 단백질에 비해 우수한 발현 수율; 및 (ii) 더 높은 단백질 순도를 위한 정제 용이성. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 추가로 보관 안정성을 갖는다. 예를 들어, 40℃에서 pH 7.4의 PBS 완충액에 14일 동안 보관한 후, 단백질은 SEC-HPLC로 측정했을 때 순도가 5%, 2% 또는 1% 이하 감소하거나, CE-SDS에 의해 측정했을 때 순도가 5%, 3% 또는 2% 이하 감소한다.
본 명세서에 개시된 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 야생형 IL-2에 비해 증가된 발현 수준을 나타낸다. 본 명세서에 개시된 일부 실시양태에서, 증가된 발현은 포유동물 세포 발현 시스템에서 발생한다. 발현 수준은 세포 배양 상청액, 바람직하게는 1단계 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 상청액에서 재조합 IL-2 단백질의 양에 대한 정량적 또는 반정량적 분석을 근거하는 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 재조합 IL-2 단백질의 양은 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA로 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포에서 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질의 발현 수율은 야생형 IL-2에 비해 적어도 1.1배, 또는 적어도 1.5배, 또는 적어도 2배, 3배 또는 4배 이상, 또는 적어도 5, 6, 7, 8 또는 9배, 심지어 10배 이상 증가한다.
일부 실시양태에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 단백질의 순도를 결정함으로써 나타낸 바와 같이, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질-Fc 융합체는 야생형 IL-2 단백질 융합체에 비해 더 높은 순도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 단백질의 순도는 SEC-HPLC에 의해 결정된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 실시예 2에 기재된 IL-2 융합 단백질을 정제하기 위한 방법에 따라 1단계 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제한 후 최대 70%, 또는 80%, 또는 90% 이상, 바람직하게는 92%, 93%, 94%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 순도를 지닐 수 있다.
개선된 IL-2 수용체 선택성/선호도
IL-2 단백질은 IL-2 수용체와 상호작용함으로써 신호 전달 및 기능을 촉발한다. 야생형 IL-2는 서로 다른 IL-2 수용체에 대해 서로 다른 친화성을 나타낸다. 야생형 IL-2에 대해 낮은 친화성을 갖는 IL-2β 및 IL-2γ 수용체는 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 포함하는 휴지기 이펙터 세포에서 발현된다. 야생형 IL-2에 대한 높은 친화성을 갖는 IL-2Rα 수용체는 조절 T 세포(Treg) 세포 및 활성화된 이펙터 세포에서 발현된다. 그 높은 친화성으로 인해 야생형 IL-2는 세포 표면의 IL-2Rα에 우선적으로 결합한 다음 IL-2Rβγ를 모집한다. Treg 세포와 활성화된 이펙터 세포는 IL-2Rβγ를 통해 방출되는 다운스트림 p-STAT5 신호에 의해 자극된다. 따라서, 이론에 얽매이지 않고, IL-2Rα 수용체에 대한 IL-2의 친화성이 감소 또는 제거되면 CD25+ 세포를 우선적으로 활성화하고, Treg 세포의 IL-2 매개 면역 하향조절에 대한 IL-2의 선호도가 감소할 것이다. 이론에 얽매이지 않고, IL-2β 수용체에 대한 친화성을 유지하거나 향상시키면 CD8+ T 세포 및 NK 세포와 같은 이펙터 세포에 대한 IL-2의 활성화를 유지하거나 향상시켜 IL-2의 면역자극을 유지하거나 향상시킬 것이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 예를 들어 하기 중 하나 이상으로부터 선택되는 야생형 IL-2에 비해 개선된 특성을 갖는다.
(1) IL-2Rα 수용체에 대한 결합 친화성 감소 또는 제거;
(2) IL-2Rβ 수용체에 대한 결합 친화성 향상;
(3) 고친화성 IL-2R 수용체(IL-2Rαβγ)에 대한 결합 친화성 감소;
(4) 중간 친화성 IL-2R 수용체(IL-2Rβγ)에 대한 결합 친화성 증가;
(5) CD25+ 세포(특히 활성화된 CD8+ T 세포 및 Treg 세포)에서 IL-2 신호, 특히 STAT5 인산화 신호를 활성화하는 능력 감소;
(6) CD25+ 세포(특히 활성화된 CD8+ T 세포 및 Treg 세포)의 IL-2 매개 활성화 및 증식의 감소를 초래함;
(7) Treg 세포 증식을 우선적으로 자극하기 위한 IL-2의 선호도 감소 또는 제거;
(8) Treg 세포의 IL-2 매개 면역 하향조절 효과 감소;
(9) CD25- 세포, 특히 CD25- T 이펙터 세포 및 NK 세포의 활성화를 유지 또는 향상, 특히 향상; 및
(10) 이펙터 T 세포 및 NK 세포의 IL-2 매개 활성화 및 증식의 증가를 초래함.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 위 (1)의 특성을 갖고, 바람직하게는 추가로 (3) 및 (5) 내지 (8)로부터 선택된 특성 중 하나 이상, 특히 모든 특성을 갖고, 더욱 바람직하게는 한층 더 추가로 (2), (4) 및 (9) 내지 (10)으로부터 선택된 하나 이상의 특성, 특히 모든 특성을 가진다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 상기 (2) 및 (4)의 특성을 갖고, 바람직하게는 (9) 내지 (10)으로부터 선택된 하나 이상의 특성, 특히 모든 특성을 추가로 갖고, 더욱 바람직하게는 한층 더 추가로 (1), (3) 및 (5) 내지 (8)로부터 선택된 하나 이상의 특성, 특히 모든 특성을 가진다.
바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 예를 들어 결장암에 대해 체내 항종양 효과를 갖는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 또한 야생형 IL-2 단백질에 비해 고친화성 수용체 IL-2αβγ에 대한 IL-2의 결합에 의해 매개되는 감소된 체내 독성을 갖는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 예를 들어 투여 후 대상체의 체중 변화에 의해 반영되는 바와 같이 대상체에게 투여된 후 유의한 독성을 갖지 않는다. 예를 들어, 일정 기간, 예를 들어 20일 이상 투여 후 체중은 투여 전 체중과 비교하여 15% 이하, 또는 10% 이하, 또는 5% 이하 감소된다.
일부 실시양태에서, IL-2Rα 수용체에 대한 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질의 결합 친화성은 야생형 IL-2(예를 들어, 서열번호 1에 제시된 IL-2WT)에 비해 적어도 5배, 적어도 10배, 또는 적어도 25배, 특히 적어도 30배, 50배 또는 100배 이상 감소된다. 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 돌연변이 단백질은 IL-2Rα 수용체에 결합하지 않는다. 결합 친화성은 포테바이오 친화성 분석 기술을 사용하여 IL-2Rα 수용체에 대한 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질(예컨대 Fc 단편에 융합된 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질)의 결합의 평형 해리 상수(KD)를 측정함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, IL-2Rβ 수용체에 대한 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질의 결합 친화성은 야생형 IL-2(예를 들어, 서열번호 1에 제시된 IL-2WT)에 비해 5 내지 10배 이상 증가된다. 결합 친화성은 포테바이오 친화성 분석 기술을 사용하여 IL-2Rβ 수용체에 대한 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질(예컨대 Fc 단편에 융합된 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질)의 결합의 평형 해리 상수(KD)를 측정함으로써 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 포테바이오 친화성 분석(예를 들어, 실시예에 기재된 포테바이오 친화성 분석)에서, IL-2Rβ 수용체에 대한 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질(IL-2-Fc 융합 단백질 형태)의 2가 결합 친화성 KD 값은 10.0E-09M 미만, 예를 들어 1.0E-09M 내지 7E-09M, 또는 예를 들어 1.0E-09M 미만, 예를 들어 1.0E-10M 내지 7.0E-10M이다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 야생형 IL-2에 비해 CD25+ 세포의 IL-2-매개 활성화 및/또는 증식을 감소시킨다. 한 실시양태에서, CD25+ 세포는 CD25+ CD8+ T 세포이다. 또 다른 실시양태에서, CD25+ 세포는 Treg 세포이다. 한 실시양태에서, STAT5 인산화 분석에서, CD25+ 세포를 활성화시키는 IL-2 돌연변이 단백질의 능력은 CD25+ 세포에서 IL-2 돌연변이 단백질에 의한 STAT5 인산화 신호의 활성화를 측정함으로써 확인된다. 예를 들어, 본 출원의 실시예에 기재된 바와 같이, 세포의 STAT5 인산화는 유세포 분석에 의해 분석되어 최대 유효 농도의 절반(EC50)을 결정할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 야생형 IL-2에 비해 CD25-이펙터 세포의 IL-2-매개 활성화 및/또는 증식을 유지하거나 향상시킨다. 한 실시양태에서, CD25- 세포는 CD8+ 이펙터 T 세포 또는 NK 세포이다. 한 실시양태에서, STAT5 인산화 분석에서, CD25- 세포를 활성화시키는 IL-2 돌연변이 단백질의 능력은 CD25- 세포에서 STAT5 인산화 신호를 활성화하는 IL-2 돌연변이 단백질의 EC50 값을 측정함으로써 확인된다. 한 실시양태에서, STAT5 인산화 분석에서 결정된 바와 같이, CD25- 세포를 활성화시키는 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질의 능력은 야생형 IL-2 단백질에 비해(예를 들어, 서열번호 1에 제시된 인간 IL-2) 적어도 1배, 예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 향상된다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 야생형 IL-2에 비해 CD25+ 세포를 우선적으로 활성화하기 위한 IL-2의 선호도를 제거하거나 감소시킨다. 한 실시양태에서, CD25+ 세포는 CD25+ CD8+ T 세포이다. 또 다른 실시양태에서, CD25+ 세포는 Treg 세포이다. 한 실시양태에서, STAT5 인산화 분석에서, CD25- 세포를 활성화시키는 IL-2 돌연변이 단백질의 능력은 각각 CD25- 세포 및 CD25+ 세포에서 STAT5 인산화 신호를 활성화하는 IL-2 돌연변이 단백질의 EC50 값을 측정함으로써 확인된다. 예를 들어, CD25+ 세포에 대한 IL-2 돌연변이 단백질의 활성화 선호도는 CD25- 및 CD25+ T 세포에서 STAT5 인산화 신호를 활성화할 때 IL-2 돌연변이 단백질의 EC50 값의 비율을 계산함으로써 결정된다. 바람직하게는, CD25+ 세포에 대한 돌연변이 단백질의 선호도는 야생형 단백질에 비해 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 100배, 150배, 200배, 또는 300배 이상 감소된다.
본 명세서에 개시된 돌연변이 단백질
IL-2 단백질은 4개의 α-나선 다발(A, B, C 및 D)이 있는 단쇄 I형 사이토킨 패밀리의 구성원이다. 결정 구조(PDB: 1Z92)에 대한 분석에 따르면, IL-2는 아미노산 잔기 35 내지 72: 35, 37, 38, 41, 42, 43, 45, 61, 62, 68 및 72의 영역에서 CD25(즉, IL-2Rα)와 상호작용하는 다음 아미노산 부위를 가지고 있다. 본 발명자들은 IL-2의 아미노산 잔기 35 내지 72 영역에서 CD25와 상호작용하는 부위(즉, 부위 35, 37, 38, 41, 42, 43, 45, 61, 62, 68 및 72)에 특정 돌연변이를 도입함으로써 IL-2Rα에 대한 IL-2의 결합은 감소되거나 제거될 수 있음을 발견하였다. 본 명세서에서, 이 영역의 이들 부위에서의 돌연변이는 "CD25 결합 영역" 돌연변이로 지칭된다.
또한, IL-2 단량체(PDB: 1M47)의 결정 구조를 복합체(PDB: 2ERJ)의 결정 구조와 비교함으로써, 본 발명자들은 B'C' 루프는 IL-2 단량체의 결정 구조에 존재하지 않는데 그 이유는 이것이 용액에서 매우 활성이고 비교적 안정한 형태를 형성할 수 없기 때문인 것을 발견하였다. 그러나, 예를 들어 서열 교체 또는 절단에 의해 B'C' 루프를 유전적으로 조작함으로써 B'C' 루프의 안정성을 향상시킬 수 있고, 따라서 IL-2의 약물 기량성 및/또는 IL-2Rβ 수용체에 대한 IL-2의 결합 친화성도 개선될 수 있다. 본 명세서에서, 이러한 B'C' 루프 영역에서의 서열 치환 또는 절단 돌연변이는 "B'C' 루프 영역 돌연변이"로 지칭된다.
본 발명자들은 "CD25 결합 영역" 돌연변이 및 "B'C' 루프 영역 돌연변이"가 조합되어 IL-2의 특성을 추가로 개선할 수 있음을 추가로 발견하였다. 따라서, 본 발명은 야생형 IL-2(바람직하게는 인간 IL-2, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 포함하는 IL-2)에 비해, (i) "CD25 결합 영역" 돌연변이; 및 (ii) "B'C' 루프 영역 돌연변이"를 포함하는 IL-2 돌연변이 단백질을 제공한다.
CD25 결합 영역 돌연변이
한 측면에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 야생형 IL-2에 비해 CD25 결합 영역, 바람직하게는 위치 35, 37, 38, 41, 42, 43, 45, 61, 68 및 72에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 IL-2Rα 수용체에 대한 결합 친화성을 제거하거나 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 CD25 결합 영역 돌연변이는 하기 조합 (1) 내지 (9) 중 하나로부터 선택된 돌연변이의 조합을 포함한다.
Figure pct00002
바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 CD25 결합 영역 돌연변이는 하기 조합 (1) 내지 (9) 중 하나, 특히 조합 (1) 내지 (6) 중 하나로부터 선택된 돌연변이의 조합을 포함한다.
Figure pct00003
한 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 CD25 결합 영역 돌연변이는 돌연변이 K35E+T37E+R38E+F42A의 조합을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 CD25 결합 영역 돌연변이는 포테바이오 친화성 분석에 의해 측정 시 CD25 결합, 예를 들어 검출 한계 미만의 CD25 결합을 제거하도록 한다.
본 발명에 적합한 CD25 결합 영역 돌연변이에 대해서는 출원인의 동시 계류 중인 출원 PCT/CN2019/107055를 참조하고, 이 출원의 전체 내용이 참고로 본 명세서에 포함된다.
B'C' 루프 영역 돌연변이
IL-2 단백질은 4개의 α-나선 다발(A, B, C 및 D)이 있는 단쇄 I형 사이토킨 패밀리의 구성원이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "B'C' 루프", "B'C' 루프 영역" 및 "B'C' 루프 서열"은 IL-2 단백질의 B 및 C 나선 사이의 링커 서열을 지칭하면서 상호교환적으로 사용된다. IL-2 단백질의 B'C' 루프 서열은 IL-2 결정 구조(예를 들어, PDB: 2ERJ)에 대한 분석을 수행하여 결정할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 서열번호 1의 넘버링에 따르면, B'C' 루프 서열은 IL-2 폴리펩타이드에서 위치 72의 잔기를 위치 84의 잔기에 연결해주는 서열을 가리킨다. 서열번호 1, 2 및 3에 제시된 야생형 IL-2 단백질에서 링커 서열은 11개의 아미노산, 즉 A73-R83을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단축된 루프 영역" 또는 "단축된 B'C' 루프 영역"은 돌연변이 단백질이 야생형 IL-2 단백질에 비해 길이가 감소된 B'C' 루프 서열을 갖고, 즉, 아미노산 잔기 aa72와 aa84 사이의 링커 서열은 서열번호 1의 넘버링에 따라 단축됨을 가리킨다. "단축된 루프 영역"은 루프 서열에 대한 교체 또는 절단에 의해 달성될 수 있다. 대체 또는 절단은 B'C' 루프 서열의 임의의 영역 또는 부분에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 대체 또는 절단은 루프 영역에서 서열 A73-R83의 대체 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 의한 서열의 절단일 수 있다. 또 다른 예로서, 교체 또는 절단은 루프 영역에서 서열 A74-R83의 교체 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 의한 서열의 절단일 수 있다. 교체 또는 절단 후, 필요한 경우 단일 아미노산 치환, 예를 들어 글리코실화 및/또는 역 돌연변이를 제거하기 위한 아미노산 치환을 루프 영역 서열에 추가로 도입하여 돌연변이 단백질의 성능, 예를 들어 약물 기량성을 추가로 개선할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 돌연변이된 단축된 B'C' 루프 영역은 돌연변이가 도입된 후 위치 72의 잔기를 위치 84의 잔기에 연결해주는 서열을 통해 기재될 수 있다.
한 측면에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 야생형 IL-2에 비해 B'C' 루프 영역 돌연변이를 포함하고; 바람직하게, 돌연변이는 B'C' 루프 영역의 증가한 안정성을 초래하고; 보다 바람직하게는, 돌연변이는 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질의 개선된 약물 기량성, 예를 들어 증가된 발현 수율 및/또는 순도를 초래한다.
일부 실시양태에서, 도입된 돌연변이로 인해, 돌연변이 단백질은 야생형 IL-2(바람직하게는 인간 IL-2, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 포함하는 IL-2)에 비해 단축된 B'C' 루프 영역(즉, 아미노산 잔기 aa72와 aa84 사이의 단축된 링커 서열)을 포함하고, 여기서 바람직하게는 단축된 루프 영역은 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개 미만의 아미노산 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 7개 아미노산 길이를 가지며; 아미노산 잔기는 서열번호 1에 따라 넘버링된다.
여기서, 본 발명에 적합한 B'C' 루프 영역 돌연변이는 B'C' 루프 영역의 절단 및 교체를 포함한다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 B'C' 루프 영역에서 아미노산 잔기 aa73 내지 aa83의 절단 또는 대체, 예를 들어 A(Q/G)S(K/A/D)N(F/I)H를 형성하는 절단 또는 SGDASIH로 대체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 돌연변이는 B'C' 루프 영역에서 아미노산 잔기 aa74 내지 aa83의 절단 또는 대체, 예를 들어 (Q/G)S(K/A/D)N(F/I)H를 형성하는 절단 또는 GDASIH로 대체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 B'C' 루프 키메라 돌연변이를 포함한다. 야생형 IL-2에 비해 돌연변이 단백질은 aa72를 aa84에 연결해주는 서열의 전체 또는 일부를, 예를 들어 다른 4-나선 단쇄 사이토킨 패밀리 구성원으로부터의 짧은 B'C' 루프 서열로 치환하는 것을 포함한다. 야생형 IL-2의 치환에 적합한 짧은 B'C' 루프는 결정 구조의 중첩에 의해 다른 4-나선 단쇄 사이토킨 IL 패밀리 구성원, 예컨대 마우스와 같은 비인간 종의 IL-15, IL-4, IL-21 또는 IL 패밀리 구성원으로부터 식별될 수 있다. 한 실시양태에서, 치환에 사용되는 서열은 인터류킨 IL-15, 특히 인간 IL-15로부터의 B'C' 루프 서열이다. 한 실시양태에서, 치환은 B'C' 루프 영역에서 아미노산 잔기 aa73 내지 aa83의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 치환은 B'C' 루프 영역에서 아미노산 잔기 aa74 내지 aa83의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 치환 후, SGDASIH 및 AGDASIH로부터 선택된 B'C' 루프 서열(즉, aa72를 aa84에 연결해주는 서열)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 B'C' 루프 절단 돌연변이를 포함한다. 야생형 IL-2에 비해 돌연변이 단백질은 aa72를 aa84에 연결해주는 서열의 절단을 포함한다. 한 실시양태에서, 절단은 B'C' 루프 영역에서 아미노산 잔기 aa73 내지 aa83의 절단을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 절단은 B'C' 루프 영역에서 아미노산 잔기 aa74 내지 aa83의 절단을 포함한다. 예를 들어, 서열은 C-말단에서 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산에 절단될 수 있다. 바람직하게는, 절단 후, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 A(Q/G)S(K/A/D)N(F/I)H의 서열을 갖는 B'C' 루프 영역을 갖는다. 바람직하게는, 절단 후, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 하기로부터 선택되는 B'C' 루프 서열(즉, aa72를 aa84에 연결해주는 서열)을 갖는다.
Figure pct00004
한 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 AQSKNFH, AQSANFH, AQSDNFH, SGDASIH 및 AGDASIH로부터 선택된 B'C' 루프 영역 서열을 포함한다.
본 발명에 적합한 B'C' 루프 돌연변이에 대해서는 출원인의 동시 계류 중인 출원 PCT/CN2019/107054를 참조하고, 이 출원의 전체 내용이 참고로 본 명세서에 포함된다.
돌연변이의 바람직한 예시적 조합
일부 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 B'C' 루프 돌연변이 및 CD25 결합 영역 돌연변이는 조합되어 하기 개선된 특성 중 2개 또는 3개 모두를 제공한다: (i) IL-2Rα에 대한감소(또는 제거)된 결합, (ii) IL-2Rα에 대한 강화된 결합, 및 (iii) 발현 수준 및 순도 개선.
일부 실시양태에서, 본 발명은 야생형 IL-2에 비해 하기를 포함하는 IL-2 돌연변이 단백질을 제공한다.
(i) 다음 조합 (1) 내지 (9) 중 하나, 특히 조합 (1) 내지 (6) 중 하나로부터 선택된 돌연변이 조합:
Figure pct00005
및 (ii) 하기로부터 선택된 B'C' 루프 영역 서열:
Figure pct00006
특히 하기 B'C' 루프 영역 서열: AQSKNFH, AQSANFH AQSDNFH, SGDASIH 및 AGDASIH.
바람직하게는, 본 발명은 야생형 IL-2에 비해 하기를 포함하는 IL-2 돌연변이 단백질을 제공한다.
(i) 돌연변이 K35E+T37E+R38E+F42A의 조합; 및
(ii) AQSKNFH, AQSANFH, AQSDNFH, SGDASIH 및 AGDASIH로부터 선택된 B'C' 루프 영역 서열.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 3 중 하나에 제시된 야생형 IL-2 단백질의 아미노산 서열과 적어도 85% 또는 90%의 동일성을 갖는 성숙한 영역을 갖는 IL-2 돌연변이 단백질을 제공하고, 또한 AGDASIH, SGDASIH, AQSKNFH, AQSANFH, AQSDNFH, AGSKNFH, AQSANFH 및 AQSANIH로부터 선택된 아미노산 위치 72와 84 사이의 링커 서열을 포함하고, 돌연변이 조합 K35E+T37E+R38E+F42A를 갖는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 22, 23, 24, 25 및 26 중 하나로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 돌연변이 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 22, 23, 24, 25 및 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직하게는, 조합 돌연변이로 인해 IL-2는 CD25+ T 세포에서 p-STATA5 신호전달을 우선적으로 자극하는 선호도가 감소하고 CD25- T 세포에서 신호전달을 자극하는 능력이 향상된다.
기타 돌연변이
위의 "CD45 결합" 영역 및 "B'C' 루프 영역"에서의 돌연변이 이외에, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 위에 기술한 하나 이상의 유익한 특성을 유지하는 한, 다른 영역 또는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 또한 개선된 발현 또는 균질성 또는 안정성과 같은 추가 이점을 제공하기 위해 위치 125에 C125S, C125A, C125T 또는 C125V와 같은 치환을 포함할 수 있다(예를 들어, 미국특허 제4,518,584호 참조). 또 다른 예로서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 또한 IL-2의 N-말단에서 O-글리코실화를 제거하기 위해 위치 3에서의 치환, 예를 들어 T3A를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 또한 T 세포 활성화 활성을 향상시키기 위해 위치 76에서의 치환, 예를 들어 K76D/A를 포함할 수 있다. 당업자는 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질에 혼입될 수 있는 추가 돌연변이를 결정하는 방법을 알고 있다.
IL-2 돌연변이 단백질과 야생형 단백질 사이의 서열 차이는 서열 동일성 측면에서 또는 둘 사이의 상이한 아미노산의 수 측면에서 표현될 수 있다. 한 실시양태에서, IL-2 돌연변이 단백질은 야생형 단백질과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89% 동일성, 바람직하게는 90% 초과(바람직하게는 95%), 그러나 바람직하게는 97% 이하, 더 바람직하게는 96% 이하의 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 위의 CD25 영역 돌연변이 및 B'C' 루프 영역 돌연변이 이외에, IL-2 돌연변이 단백질은 또한 야생형 단백질에 비해, 15개 이하, 예를 들어, 1 내지 10개, 또는 1 내지 5개, 예를 들어, 0, 1, 2, 3 또는 4개의 돌연변이를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 추가 돌연변이는 보존적 치환일 수 있다. 한 실시양태에서, 추가 돌연변이는 CD25 영역 및 B'C' 루프 영역 외부에서 발생한다.
2. 융합 단백질 및 면역접합체
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 개선된 약동학적 특성을 제공할 수 있는 또 다른 폴리펩타이드, 예컨대 알부민, 바람직하게는 항체 Fc 단편에 융합된다. 한 실시양태에서, Fc 단편은 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 L234A/L235A 돌연변이 또는 L234A/L235E/G237A 돌연변이와 같은 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, Fc-함유 융합 단백질은 증가된 혈청 반감기를 갖는다. 한 바람직한 실시양태에서, Fc-함유 융합 단백질은 또한 감소되거나 제거된 ADCC 또는 ADCP 또는 CDC 이펙터 기능과 같은 감소된 Fc-매개 이펙터 기능을 갖는다.
일부 실시양태에서, IL-2 돌연변이 단백질에 융합된 Fc 단편은 인간 IgG Fc, 예를 들어, 인간 IgG1 Fc, 인간 IgG2 Fc 또는 인간 IgG4 Fc이다. 한 실시양태에서, Fc 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이와 적어도 90% 동일성, 예를 들어, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, IL-2 돌연변이 단백질은 링커를 통해 Fc에 융합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 CD25- T 세포 상의 Fc 융합 단백질의 활성화를 향상시키도록 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 링커는 GSGS, 바람직하게는 2×(G4S)이다.
일부 실시양태에서, Fc 융합 단백질은 서열 15 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 96% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 융합 단백질은 서열 15 내지 19의 서열로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 IL-2 변이 단백질 및 항원 결합 분자를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 바람직하게는, 항원 결합 분자는 면역글로불린 분자, 특히 IgG 분자, 항체 또는 항체 단편이고, 보다 구체적으로 Fab 분자 또는 scFv 분자이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 종양 세포 상에 또는 종양 환경에 존재하는 항원(예컨대 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 테나신-C의 A1 도메인(TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B(EDB), 암배아 항원(CEA) 및 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)으로부터 선택된 항원)에 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 면역접합체는 대상체에게 투여된 후 종양 세포 또는 종양 환경을 표적으로 할 수 있고, 따라서 더 낮은 투여량의 치료 가능성 및 이에 따른 낮은 부작용 및 향상된 항종양 효과와 같은 추가 치료 이점을 제공한다.
본 명세서에 개시된 융합 단백질 및 면역접합체에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 직접적으로 또는 링커를 통해 또 다른 분자 또는 항원-결합 분자에 연결될 수 있고, 일부 실시양태에서 단백질분해 절단 부위가 그 사이에 제공된다.
3. 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 숙주
본 발명은 위의 IL-2 돌연변이 단백질, 융합체 또는 접합체 중 임의의 하나를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 본 명세서에 개시된 돌연변이 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 신규 고체상 DNA 합성에 의해 또는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 야생형 IL-2를 인코딩하는 기존 서열의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 분비 신호 펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고, 본 명세서에 개시된 돌연변이 단백질의 분비 발현이 지시될 수 있도록 본 명세서에 개시된 돌연변이 단백질을 인코딩하는 단편에 조작 가능하게 연결된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터, 예컨대 진핵 발현 벡터이다. 벡터는 바이러스, 플라스미드, 코스미드, λ 파지 또는 효모 인공 염색체(YAC)를 포함하되 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 발현 벡터는 pCDNA3.1 발현 벡터이다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 더 제공한다. IL-2 돌연변이 단백질, 융합체 또는 면역접합체의 발현을 복제하고 지원하는 데 적합한 숙주 세포는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 세포는 특정 발현 벡터로 형질감염되거나 형질도입될 수 있고, 벡터를 포함하는 다수의 세포는 대규모 발효기에서 접종을 위해 배양되어 임상 적용을 위한 충분한 IL-2 돌연변이, 융합체 또는 면역접합체를 획득할 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵세포이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 효모 세포 및 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포 또는 293 세포)로부터 선택된다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생산될 수 있다. 발현 후, 폴리펩타이드를 가용성 분획의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다. 원핵생물 이외에, 사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 글리코실화 경로가 "인간화"된 진균 및 효모 균주를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하기에 적합한 벡터에 대한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 이는 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩타이드의 생산을 초래한다. 문헌[Gerngross, NatBiotech, 22,1409-1414 (2004)] 및 문헌[Li 등, NatBiotech, 24,210-215 (2006)]을 참조한다. 이용가능한 포유동물 숙주 세포계의 예는 SV40 형질전환된 원숭이 신장 CV1계(COS-7), 인간 배아 신장계(293 또는 293T 세포, 예를 들어 문헌[Graham 등, JGenVirol 36,59 (1977)]에 기재된 바와 같음), 아기 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(TM4 세포, 예를 들어 문헌[Mather, BiolReprod 23,243-251 (1980)]에 기재된 바와 같음), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 쥐 간 세포(BRL3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(HepG2), 마우스 유방 종양 세포(MMT060562), TRI 세포(예를 들어, 문헌[Mather 등, AnnalsN.Y.AcadSci 383,44-68 (1982)]에 기재된 바와 같음), MRC5 세포 및 FS4 세포를 포함한다. 다른 이용가능한 포유동물 숙주 세포주는 dhfr-CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(문헌[Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,4216 (1980)]), 및 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포계를 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포, 또는 림프구(예를 들어, Y0, NS0, 및 Sp20 세포)이다.
4. 제조 방법
추가 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질, 융합체 또는 접합체를 제조하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 위에 제공된 바와 같은 IL-2 돌연변이 단백질, 융합체 또는 접합체의 발현에 적합한 조건 하에 단백질, 융합체 또는 접합체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계와 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 단백질, 융합체 또는 접합체를 단리하는 단계를 포함한다.
5. 분석
본 명세서에 제공된 IL-2 돌연변이 단백질은 당업계에 공지된 다양한 분석을 통해 이의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
한 측면에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 IL-2 수용체에 대한 이의 결합 활성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 인간 IL-2Rα 또는 β 단백질에 대한 결합은 ELISA 및 웨스턴 블롯팅과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해, 또는 본 명세서의 실시예에 개시된 예시적인 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 세포 표면에서 돌연변이 단백질을 발현하도록 형질감염된 효모 디스플레이 세포와 같은 세포가 표지된(예를 들어, 비오틴 표지된) IL-2Rα 또는 β 단백질과 반응하는 유동 세포측정법을 사용할 수 있다. 대안적으로, 결합 동역학(예를 들어, KD 값)을 포함하는 돌연변이 단백질의 수용체에 대한 결합은 재조합 돌연변이 단백질-Fc 융합을 사용하는 포테바이오 분석에 의해 결정될 수 있다.
추가 측면에서, IL-2 수용체에 결합하는 IL-2 돌연변이 단백질의 능력은 수용체 결합의 다운스트림에서 신호전달 및/또는 면역 활성화를 측정함으로써 간접적으로 측정될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 생물학적 활성을 갖는 IL-2 돌연변이 단백질을 확인하기 위한 분석이 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들어 IL-2 수용체를 갖는 T 세포 및/또는 NK 세포 및/또는 Treg 세포의 증식을 유도하는 능력, IL-2 수용체를 갖는 T 세포 및/또는 NK 세포 및/또는 Treg 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 능력, T 세포에서 세포 사멸을 유도하는 감소된 능력, 종양 퇴행을 유도하고/하거나 생존을 개선하는 능력, 및 감소된 혈관 투과성과 같은 감소된 체내 독성 특성을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 체내 및/또는 체외에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 IL-2 돌연변이 단백질을 제공한다.
IL-2의 생물학적 활성을 결정하기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, NK 세포에 의한 IFN-γ 생산을 자극하는 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질의 능력을 시험하기에 적합한 분석은 배양된 NK 세포를 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질, 융합체 또는 면역접합체와 함께 인큐베이션하고, ELISA에 의해 배양 배지 중 IFN-γ 농도를 측정하는 단계를 포함한다. IL-2 신호전달 여러 신호전달 경로를 유도하고 JAK(야뉴스 키나은제) 및 STAT(신호 변환기 및 전사 활성화제) 신호전달 분자를 포함한다.
IL-2와 수용체의 β 및 γ 서브유닛의 상호작용은 수용체와 JAK1 및 JAK3(각각 β 및 γ 서브유닛에 결합함)의 인산화를 초래한다. 그런 다음 STAT5는 인산화된 수용체에 결합하고 매우 중요한 타이로신 잔기에서 인산화된다. 이것은 수용체로부터 STAT5의 해리, STAT5의 이량체화 및 표적 유전자의 전사를 촉진하는 핵으로의 STAT5 이량체의 전위를 초래한다. 따라서, IL-2 수용체를 통한 신호전달을 유도하는 돌연변이 IL-2 폴리펩타이드의 능력은 예를 들어 STAT5의 인산화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 이 방법의 세부사항은 실시예에 개시되어 있다. 예를 들어, PBMC는 본 명세서에 개시된 돌연변이 IL-2 폴리펩타이드, 융합체 또는 면역접합체로 처리될 수 있고, 인산화된 STAT5의 수준은 유세포분석에 의해 결정된다.
또한, 종양 성장 및 생존에 대한 돌연변이 IL-2의 효과는 당업계에 공지된 다양한 동물 종양 모델에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 암 세포계의 이종이식편을 면역결핍 마우스에 이식하고 본 명세서에 개시된 돌연변이 IL-2 폴리펩타이드, 융합체 또는 면역접합체로 치료할 수 있다. 본 명세서에 개시된 돌연변이 IL-2 폴리펩타이드, 융합체 및 면역접합체의 체내 항종양 효과는 종양 성장 억제에 기초하여 결정될 수 있다(예를 들어, 이소형 대조군 항체 대비 계산됨). 또한, 본 명세서에 개시된 돌연변이 IL-2 폴리펩타이드, 융합체 및 면역접합체의 체내 독성은 동물의 체중 변화에 기초하여 결정될 수 있다(예를 들어, 절대 체중의 변화 또는 투여 전 체중 대비 체중의 백분율 변화). 체내 독성은 또한 사망률, 수명 관찰(행동, 체중, 체온과 같은 부작용의 가시적 증상), 및 임상 및 해부학적 병리를 기반으로 결정할 수 있다(예를 들어, 혈액 화학 값에 대한 측정 및/또는 조직병리학적 분석).
추가 측면에서, 본 명세서에 개시된 돌연변이 단백질의 약물 기량성(예를 들어, 발현 수율 및 생성물 순도)은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 특성화할 수 있다. 발현 수율의 측정을 위해, 돌연변이 단백질이 배양된 세포로부터 분비되어 배양 상청액에서 발현되는 경우, 원심분리에 의해 수집된 세포 배양액에서 단백질 함량을 분석할 수 있다. 대안적으로, 분석은 수집된 세포 배양액에 대한 1단계 정제 후, 예를 들어 1단계 친화성 크로마토그래피 정제 후에 수행될 수 있다. 생성물의 순도 결정을 위해, 순도는 수집된 생산 세포의 배양 상청액에 대한 1단계 친화성 크로마토그래피 정제 후에 결정되어, 돌연변이 단백질의 정제 성능을 결정할 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 돌연변이 단백질은 해당 1단계 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 후, 야생형 단백질보다 상당히 높은 순도를 가지며, 이는 본 명세서에 개시된 돌연변이 단백질이 더 나은 정제 성능을 가짐을 나타낸다. 순도 결정 방법은 SEC-HPLC 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 통상적인 방법일 수 있다.
추가 측면에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질의 저장 안정성은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명에서 "안정한" 항체는 완충액에 제형화된 항체가 특정 조건에서 보관된 후에도 허용 가능한 정도의 물리적 및/또는 화학적 안정성을 유지하는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 완충액은 pH 7.4의 PBS 완충액이다. 또 다른 실시양태에서, 완충액은 pH 6.5의 히스티딘 완충액이다. 한 실시양태에서, 항체는 일정 기간, 예를 들어 2주 이상 동안 40℃에서 보관된 후 안정성에 대해 시험된다. 항체의 안정성은 SEC-HPLC 방법 또는 CE-SDS 방법을 사용하여 저장된 항체의 순도 감소를 측정함으로써 결정될 수 있다.
6. 스크리닝 방법
추가 측면에서, 본 발명은 특성이 개선된 IL-2 돌연변이 단백질을 획득하기 위한 방법 및 이 방법을 사용하여 획득한 IL-2 돌연변이 단백질을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) IL-2Rα와 IL-2의 결합 계면에서 돌연변이를 수행함으로써 하나 이상의 돌연변이를 도입하고, 이 내부의 돌연변이에 의해 IL-2의 B'C' 루프 영역의 서열을 단축시키고,
바람직하게는 위에 기재된 CD25 결합 영역 돌연변이 및/또는 위에 기재된 B'C' 루프 서열의 키메라 또는 절단 돌연변이의 조합을 도입하는 단계; 및
(2) 포유동물 세포(예를 들어, HEK293 또는 CHO 세포)에서, 예를 들어 Fc 융합(예를 들어, FcLALA 융합)의 형태로 상기 IL-2 돌연변이 단백질을 발현시키고;
하기 개선된 특성 중 하나 이상을 갖는 돌연변이 단백질 확인하는 단계: (i) 정제 후 개선된 발현 수율 및/또는 단백질 순도(예를 들어, 1단계 친화성 크로마토그래피 후 SEC-HPLC에 의해 측정된 순도); (ii) IL-2Rα에 대한 감소된 결합; 및 (iii) IL-2Rβ에 대한 향상된 결합.
한 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (1)에서 돌연변이의 조합이 수행되기 전에 약물 기량성(예를 들어, 1단계 Fc 친화성 크로마토그래피 순도같은 발현 수율 및/또는 생성물 안정성 및/또는 균질성)을 개선하는 IL-2 돌연변이를 확인하는 단계를 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 돌연변이 단백질의 약물 기량성은 B'C' 루프를 단축된 B'C' 루프로 대체하거나 B'C' 루프를 절단하여 단축된 B'C' 루프를 형성함으로써 개선된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (1)에서 돌연변이의 조합이 수행되기 전에 야생형 IL-2에 비해 IL-2Rα에 결합하는 감소된 능력을 부여하는 IL-2 돌연변이를 확인하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, CD25 결합 친화성은 CD25 결합 영역의 부위에서 아미노산 치환 또는 조합된 치환을 수행함으로써 감소되거나 제거된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이들 돌연변이는 다중 개선된 특성을 갖는 IL-2 돌연변이 단백질을 획득하기 위해 추가로 개선된 약물 기량성 또는 기타 개선된 특성을 부여하는 돌연변이와 조합될 수 있다.
한 실시양태에서, IL-2Rα에 대한 감소된 결합을 초래하는 CD25 영역 돌연변이(예를 들어, 공지됨) 및 약물 기량성을 개선하기 위해 B'C' 루프 영역을 절단 및/또는 대체하는 돌연변이(예를 들어, 공지됨)의 조합이 IL-2 단백질에 도입되어 특성을 확인한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 확인은 IL-2Rα에 대한 감소된 결합 및 개선된 약물 기량성(예를 들어, 개선된 발현 및/또는 순도, 및/또는 제품 안정성 및/또는 균질성), 및 선택적으로 야생형 IL-2에 비해 실질적으로 변하지 않거나 약화되거나 강화된 IL-2Rβ에 대한 결합 친화성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 돌연변이 주형으로써 사용된 모 야생형 IL-2 단백질은 바람직하게는 서열번호 1과 적어도 85%, 또는 적어도 90% 또는 95% 동일성을 갖고, 보다 바람직하게는 인간으로부터 파생된 IL-2 단백질이다.
7. 약제학적 조성물 및 약제학적 제조
본 발명은 또한 IL-2 돌연변이 단백질 또는 이의 융합체 또는 면역접합체를 포함하는 조성물(약제학적 조성물 또는 약제학적 제제 포함), 및 IL-2 돌연변이 단백질 또는 이의 융합체 또는 면역접합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 완충제를 포함하는 당업계에 공지된 약제학적 담체 및 약제학적 부형제와 같은 적합한 약제학적 보조제를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 적용 가능한 약제학적 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성유(예컨대 땅콩유, 대두유, 광유 및 참기름)로부터 파생된 물 및 기름과 같은 멸균 액체일 수 있다. 제약 조성물이 정맥 내에 투여되는 경우 바람직한 담체는 물이다. 특히 식염수, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 주사 용액에 쓰이는 액체 담체로 사용할 수 있다. 적합한 제약 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아린산나트륨, 모노스테아린산글리세롤, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 부형제의 사용 및 적용에 관해서는, 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, 제5판, R. C. Rowe, P. J. Seskey 및 S. C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicago]를 참조한다. 필요한 경우, 조성물은 소량의 습윤제, 유화제, 또는 pH 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방 제제 등 형태가 될 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예컨대 제약 등급 만니톨, 락토스, 전분, 스테아린산마그네슘 및 사카린을 포함할 수 있다.
IL-2 돌연변이 단백질을 포함하는 약제학적 제제는 원하는 순도의 IL-2 돌연변이 단백질, 본 명세서에 개시된 융합체 또는 면역접합체를 하나 이상의 선택적 제약 부형제와 혼합함으로써 바람직하게는 동결건조 제제 또는 수용액 형태로 제형화될 수 있다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 제16판, Osol, A. eds. (1980)]). 동결 건조 항체 제제의 예시는 미국특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국특허 제6,171,586호 및 국제공개특허 WO2006/044908호에 기재되어 있는 물질을 포함하며, 후자는 히스티딘 아세테이트 완충액을 포함한다. 또한, 서방형 제제를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 단백질을 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 매트릭스는 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품의 형태이다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 pH 6 내지 8의 완충액, 예를 들어 PBS 완충액 또는 히스티딘 완충액을 포함한다. 한 실시양태에서, PBS 완충액은 예를 들어, 약 pH 7.4의 PBS 완충액이다. 한 실시양태에서, 히스티딘 완충액은 예를 들어 10mM 히스티딘, 5% 소르비톨, 및 0.02% 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 pH 6.5의 히스티딘 완충액이다. 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 바람직하게는 완충액에 보관될 때 안정하다.
본 출원에 개시된 제약 조성물 또는 제제는 치료 대상인 특정 징후에 필요한 하나 이상의 다른 활성 성분, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 가지는 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학요법제 및 면역 관문 억제제와 같은 다른 항암 활성 성분을 추가로 제공하는 것이 바람직하다. 활성 성분들은 의도하는 목적에 효과적인 양으로 적절하게 조합된다.
8. 조합 생성물
한 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 돌연변이 단백질 또는 이의 융합체 또는 면역접합체, 및 하나 이상의 다른 치료제를 포함하는 조합 생성물을 추가로 제공한다(예를 들어, 화학요법제, 기타 항체, 세포독성제, 백신 및 항감염 활성제). 본 명세서에 개시된 조합 생성물은 본 명세서에 개시된 치료 방법에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 조합 생성물을 제공하고, 여기서 상기 다른 치료제는 예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 자극하여 면역 반응을 추가로 향상, 자극 또는 상향조절하는 데 효과적인 치료제, 예컨대 항체를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 조합 생성물은 암을 예방 또는 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 암은 예를 들어 위장암, 예를 들어 직장암, 결장암, 또는 결장직장암이다. 일부 실시양태에서, 조합 생성물은 박테리아 감염, 바이러스 감염, 곰팡이 감염 및 원충 감염과 같은 감염을 예방 또는 치료하기 위해 사용된다.
9. 치료 방법 및 용도
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "개체" 및 "대상체"는 상호교환적으로 사용되며 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 가축화된 동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 원숭이와 같은 인간 이외의 영장류), 토끼류 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 랫트) 등을 포함하고 이에 한정되지 않는다. 특히, 대상체는 인간이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 치료되는 개체에서 질환의 자연적 진행을 변경하려는 임상적 개입을 가리킨다. "원하는 치료적 효과"란 질환의 발병 또는 재발을 예방하는 것, 증상 완화, 질환의 직접적 또는 간접적인 병리학적 효과를 감소시키는 것, 전이 예방, 질환의 진행을 늦추는 것, 병태를 향상 또는 완화시키는 것 및 예후를 완화 또는 향상시키는 것을 포함하되 이에 한정되지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질, 융합체 또는 면역접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 면역계를 자극하기 위한 방법을 제공한다. 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 CD25- CD122+ 이펙터 세포(세포독성 CD8+ T 세포 및 NK 세포)에 대해 높은 활성 및 선택성을 가지며, CD25+ Treg 세포에 대한 감소된 자극 효과를 갖는다. 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질은 대상체의 면역계를 자극하기 위해 저용량으로 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 본 명세서에 기재된 IL-2 돌연변이 단백질 또는 이의 융합체 또는 면역접합체 중 임의의 하나를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 신체의 면역 반응을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질 또는 이의 융합체 또는 면역접합체는 항종양 면역 반응을 자극하기 위해 종양이 있는 대상체에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항감염 면역 반응을 자극하기 위해 감염이 있는 대상체에게 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암과 같은 질환을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 유효량의 본 명세서에 기재된 IL-2 돌연변이 단백질 또는 이의 융합체 또는 면역접합체 중 임의의 하나를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 암은 초기, 중기 또는 말기 단계 암일 수 있으며, 또는 전이성 암일 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 예를 들어 위장암, 예를 들어 직장암, 결장암, 또는 결장직장암일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 감염성 질환, 예를 들어 만성 감염을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 유효량의 IL-2 돌연변이 단백질 또는 이의 단편, 또는 면역접합체, 다중특이적 항체, 또는 본 명세서에 기재된 항체 또는 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 감염은 바이러스 감염이다.
본 명세서에 개시된 돌연변이 단백질(또는 이를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 이의 융합체 또는 면역접합체, 및 선택적으로 추가 치료제)은 비경구 투여, 폐 내 투여, 비강 내 투여, 및 국소 치료에 의해 필요한 경우 병변 내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 치료 기간(단기 또는 장기)에 따른 적절한 양을 주사, 예를 들어 정맥 내 또는 피하 주사와 같은 임의의 적합한 수단으로 주입하는 것으로 실시한다. 본 명세서는 단일 투여 또는 여러 시점에서의 다중 투여, 볼루스 주사 및 펄스 주입을 포함하되 이에 한정되지 않는 다양한 투여 방식을 망라한다.
질환을 예방하거나 치료하기 위해, 본 명세서에 개시된 돌연변이 단백질(단독으로 또는 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 사용됨)의 적절한 투여량은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 심각성과 진행, 항체를 투여하는 목적(예방 또는 치료), 이전 치료, 환자의 임상 이력, 항체에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 단일 치료 또는 일련의 치료를 통해 환자에게 적절하게 투여된다.
추가 측면에서, 본 발명은 또한 위에 언급된 방법(예를 들어, 치료용)에 사용하기 위한 약물의 제조에서 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 단백질, 조성물, 면역접합체, 및 융합체의 용도를 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 설명된 것이다. 실시예는 본 발명의 청구범위를 제한하지 않으며, 어떠한 경우에도 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 인터루킨-2 포인트 돌연변이 라이브러리의 설계 및 구축
인터루킨-2 포인트 돌연변이 라이브러리의 설계
인터루킨-2(IL-2로 칭함)의 복합체와 이의 알파 수용체 CD25(IL-2Rα로 칭함)의 복합체의 결정 구조(PDB: 1Z92)(도 1에 도시됨)에 따르면, 상호 작용 부위에 나열된 IL-2 잔기는 표 1에 따라 돌연변이되었다. 각 부위의 원래 아미노산은 50%를 차지하고 나머지 50%는 표 1의 "돌연변이 아미노산"으로 균등하게 나누었다. IL-2Rα와 IL-2의 결합 부위를 위해 설계된 라이브러리의 이론적 다양성은 3×8×8×9×6×6×3×6×6×5×6
Figure pct00007
2.0×108이었고, 라이브러리는 IBYDL029(Innoventbio 효모 디스플레이 라이브러리)로 명명되었다.
[표 1]
IBYDL029 라이브러리의 돌연변이 부위
Figure pct00008
인터루킨-2 돌연변이 라이브러리의 구축
야생형 IL-2(UniProt: P60568, aa21-153, C125S, IL-2WT로 지칭됨)를 효모 표면 디스플레이 플라스미드 pYDC011의 2개의 BamHI 제한 효소 절단 부위 사이에 배치하였다(플라스미드의 전체 서열은 도 9 참조). IL-2WT의 서열은 본 출원에서 서열번호 1에 제시되었다. C125S 돌연변이는 이황화 가교된 IL-2 이량체의 형성을 피하기 위해 서열의 위치 125에 도입되었다. 플라스미드 구축의 구체적인 단계는 다음과 같다.
1. IL-2WT 유전자를 주형으로 하여 프라이머 AMP0210 및 AMP0211을 사용하여 단편을 증폭시키는 단계(프라이머 서열은 도 3 참조);
2. 플라스미드 pYDC011을 BamHI(New England Biolab, 카탈로그 번호 R3136V)로 분해한 다음 겔 추출하는 단계(QIAGEN Gel Extraction Kit, 카탈로그 번호 28704);
3. 증폭된 생성물과 분해된 생성물을 1% 아가로스 겔에서 추출하는 단계;
4. 추출 후, 생성물은 1단계 클로닝 키트(Vazyme 카탈로그 번호 C113-02)를 사용하여 체외에서 상동 재조합되는 단계;
5. 재조합된 생성물을 대장균 Top10 컴피턴트 세포(Tiangen, 카탈로그 번호 CB104-02)로 옮기고, 세포를 암피실린 내성 LB 플레이트에 코팅하고 37℃에서 밤새 배양하는 단게;
6. 성장하는 단일 클론 콜로니가 시퀀싱에 의해 검증된 후 올바른 플라스미드는 pYDC035로 명명되는 단계.
기존 문헌에 따르면, IL-2 돌연변이 IL-23X는 IL-2Rα에 결합하지 않고 IL-2Rβ에 대한 결합이 변하지 않는다(문헌[Rodrigo Vazquez-Lombardi 등, Nature Communications, 8:15373, DOI: 10.1038/ncomms15373]). IL-23X를 효모의 표면에 표시하여 대조군으로 사용하였다. IL-23X의 서열은 서열번호 4에 제시되었다. IL-2WT와 유사하게, 단백질은 또한 C125S 돌연변이를 포함하였다.
필요한 프라이머(도 3에 도시됨)는 표 1의 라이브러리 구축 계획에 따라 설계되었으며 쑤저우 Genewiz Biological Technology 유한회사에서 합성되었다.
IBYDL029 라이브러리 DNA 증폭: 1. pYDC035를 주형으로 사용하여 프라이머 AMP0191 및 AMP0200으로 단편 029-F를 증폭하였다; 2. pYDC035를 주형으로 사용하여 프라이머 AMP0201 및 AMP0199로 단편 029-R을 증폭하였다; 3. 029-F 및 029-R 단편을 겔에서 추출하고 프라이머 AMP0191 및 AMP0199로 전체 길이 단편 029를 증폭하기 위한 PCR 증폭 주형으로 사용하였다.
100μg의 플라스미드 pYDC011을 BamHI로 분해하고, PCR 생성물 회수 키트(QIAGEN PCR 정제 키트, 카탈로그 번호 28104)를 사용하여 추출하여 충분한 양의 선형 플라스미드를 얻었다. 선형 플라스미드와 라이브러리 DNA를 4μg:12μg의 비율로 혼합하였다. 라이브러리 DNA와 선형 플라스미드의 혼합물을 기존 방법에 따라 EBY100 효모 균주에 전기형질감염시켰다(문헌[Lorenzo Benatuil 등, An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Engineering, Design & Selection vol. 23, no. 4, pp. 155-159, 2010]). 전기트랜스펙션 후, 라이브러리를 연속적으로 희석하고 SD-Trp(TAKARA, 카탈로그 번호 630309) 플레이트에 적용하였다. 성장하는 콜로니의 수를 세었다. 획득한 라이브러리의 실제 다양성은 IBYDL029: 4.2×108로 라이브러리의 이론적 다양성보다 컸다.
실시예 2: IL-2 포인트 돌연변이 라이브러리의 스크리닝 및 확인
IL-2Rα 및 IL-2Rβ 단백질의 제조 및 비오틴 라벨링
발현 플라스미드의 구축 및 형질감염
avi 태그(GLNDIFEAQKIEWHE, 태그 펩타이드는 BirA 효소 촉매 하에서 비오틴화될 수 있음) 및 6개의 히스티딘 태그(HHHHHH)가 IL-2 수용체 IL-2Rα(UniProt: P01589, aa22-217) 및 IL-2Rβ(UniProt: P14784, aa27-240)의 서열 C-말단에 연결되었고, IL-2Rα 및 IL-2Rβ 단백질을 발현하기 위해 pTT5 벡터(Addgene)로 단독으로 구축되었다. 구축된 수용체의 서열은 서열번호 5 및 6에 제시되었다.
배양된 HEK293-F(Invitrogen, 카탈로그 번호 R79007) 세포를 제조자가 제공한 계획에 따라 화학적 형질감염 시약 폴리에틸렌이민을 사용하여 위의 구축된 발현 플라스미드 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다(PEI로 지칭함, Polysciences, 카탈로그 번호 23966).
단백질의 발현 및 정제
IL-2Rα 및 IL-2Rβ 단백질을 발현하는 세포의 배양액을 4500rpm에서 30분 동안 원심분리하고 세포를 폐기하였다. 상청액을 0.22μm 필터를 통해 여과하고 추가로 정제하였다. 요약하면, 정제를 위해 사용된 니켈 컬럼(5mL Histrap excel, GE, 17-3712-06)을 0.1M NaOH에 2시간 동안 담근 후 5 내지 10 컬럼 부피의 초순수로 세척하여 알칼리 용액을 제거하였다. 컬럼은 정제 전에 5 컬럼 부피의 결합 완충액(20mM Tris pH 7.4, 300mM NaCl)으로 평형화되었다. 세포 상청액을 평형 컬럼에 통과시키고 10 컬럼 부피의 세척 완충액(20mM Tris pH 7.4, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸)으로 컬럼을 세척하여 비특이적 결합 불순물 단백질을 제거하였다. 그런 다음 표적 단백질을 3 내지 5 컬럼 부피의 용리액(20mM Tris pH 7.4, 300mM NaCl, 100mM 이미다졸)으로 용리하였다. 수집된 단백질을 한외여과 농축에 의해 PBS(Gibco, 70011-044)로 완충액 교환하고, 추가로 슈퍼덱스 200 증가(GE, 10/300GL, 10245605)를 사용하여 분리 및 정제하였다. 단량체의 용출 피크를 수집하였으며, 컬럼용 평형 완충액 및 용출 완충액은 PBS(Gibco, 70011-044)를 사용하였다. 정제된 단백질 샘플 100μg을 취하여 겔 여과 컬럼 SW3000(TOSOH 카탈로그 번호 18675)을 사용하여 단백질 순도를 결정하였다.
IL-2Rα 및 IL-2Rβ 단백질의 비오틴 라벨링
IL-2Rα 및 IL-2Rβ 단백질은 효소적 방법에 의해 비오틴으로 표지하였으며, 그 절차는 다음과 같다: 적절한 양의 상기 발현 및 정제된 IL-2Rα 및 IL-2Rβ 단백질의 용액에 His-BirA 단백질(UniProt: P06709) 1/10(m/m) 질량을 첨가한 후, 최종 농도가 2mM인 ATP(Sigma, 카탈로그 번호 A2383-10G)를 첨가하고, 최종 농도가 5mM인 MgCl2를 첨가하고, 최종 농도가 0.5mM인 D-비오틴(AVIDITY, 카탈로그 번호 K0717)을 첨가하였고; 혼합물을 30℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 Superdex200 증가(GE, 10/300GL, 10245605)로 정제하여 과량의 비오틴 및 His-BirA를 제거하였고; 정제된 샘플을 포테바이오(Fortebio)의 Streptavidin(SA) 센서(PALL, 18-5019)에 의해 검증하여 성공적인 비오틴 라벨링을 확인한다. 본 실시예에서 획득한 비오틴 표지된 IL-2Rα 및 IL-2Rβ IH 단백질을 각각 IL-2Rα-비오틴 및 IL-2Rβ IH-비오틴으로 지칭하였다.
IL-2 mutant 및 분별염색을 제공하기 위한 IL-2 돌연변이 라이브러리의 스크리닝
IL-2Rα에는 결합하지 않지만 IL-2Rβ에는 결합하는 IL-2 mutant 에 대한 스크리닝
2.0×108의 다양성을 가진 효모 기반 IL-2mutant 디스플레이 라이브러리 IBYDL029에서, 배양 및 유도를 위해 2.0×109개의 효모 세포를 채취하였다. IBYDL029 라이브러리의 다양성으로 인해 첫 번째 스크리닝에서 Miltenyi의 MACS 시스템을 사용하여 자기 활성화 세포 분류를 수행하였다. 먼저, FACS 세척 완충액(1×PBS, 1% 소 혈청 알부민 함유)에서 2×109개의 효모 세포를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였고, 완충액은 500nM 비오틴 표지된 IL-2Rβ를 함유하였다(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin으로 표지된 Acro Biosystems, IL-2Rβ-Biotin이라고 지칭함). 세포를 미리 냉각된 FACS 완충액 50mL로 1회 세척하고 동일한 완충액 10mL에 재현탁한 다음, 스트렙타비딘 마이크로비드(Miltenyi biotec, 카탈로그 번호 130-090-485) 40μL를 첨가하고 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 3분 동안 3000rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐긴 후, 세포를 10mL의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 생성된 세포 현탁액을 Miltenyi LS 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼을 각각 3mL의 FACS 완충액으로 3회 세척하였다. Miltenyi LS 컬럼을 자기장으로부터 제거하고 5mL의 성장 배지로 용리시켰다. 용출된 효모 세포를 수집하고 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
1차 스크리닝을 통해 획득한 라이브러리의 세포를 20℃에서 24시간 동안 진탕시켜 IL-2mutant를 발현하도록 유도하고, 2차 선별은 유세포분석기를 이용하여 수행하였다. 간단히 말해서, 라이브러리에서 가져온 3×107 효모 세포를 FACS 완충액으로 3회 세척하고, IL-2Rβ-비오틴(300nM) 및 Anti Flag 항체를 함유하는 FACS 완충액에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. FACS 세척 완충액으로 두 번 세척한 후, 세포를 SA-PE(피코에리트린 표지된 스트렙타비딘, eBioscience, 카탈로그 번호 12-4317-87) 및 Alex Flour-647과 접합된 염소 항-마우스 IgG를 함유하는 FACS 세척 완충액과 혼합하였고(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 A21235), 4℃에서 15분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 세포를 미리 냉각된 FACS 세척 완충액으로 두 번 세척하고, 완충액 1mL에 재현탁하고, 필터가 있는 분리기 튜브로 옮겼다. 세포를 MoFlo_XDP를 사용하여 분류하고 분류된 효모 세포를 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세 번째 라운드의 정렬 방식은 두 번째 라운드와 동일하다. 3회의 스크리닝 후에 모노클론을 선별하여 시퀀싱을 위해 보냈다.
IL-2Rβ-비오틴을 사용한 3회의 스크리닝 후, 라이브러리 IBYDL029에서 53개의 돌연변이 서열을 획득하였다.
IL-2 mutant 의 분별염색
시퀀싱 후 단일 돌연변이 서열을 포함하는 효모 세포를 20℃에서 24시간 동안 진탕하여 IL-2mutant를 표시하도록 유도하고, 각각 수용체 IL-2Rα-비오틴 및 IL-2Rβ IH-비오틴과 함께 염색하였다. 구체적인 단계는 다음과 같다.
I. IL-2Rα-비오틴과 함께 표시되는 IL-2mutant의 염색 분석:
1. 각 샘플의 1×106 세포를 원심분리하여 상청액을 폐기하고 나중에 사용하기 위해 FACS 완충액으로 한 번 세척하였다;
2. 세포를 50nM IL-2Rα-비오틴 및 안티 플래그 항체를 함유하는 100μL의 FACS 완충액에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다;
3. 혼합물을 3분 동안 4℃에서 3000rpm으로 원심분리하고, 미리 냉각된 FACS 완충액으로 두 번 세척하였다;
4. Alex Flour-647과 접합된 SA-PE 및 염소 항-마우스를 함유하는 100μL의 FACS 완충액을 첨가하고, 혼합물을 얼음 위에서 20분 동안 암실에서 인큐베이션하였다;
5. 미리 냉각된 FACS 완충액으로 두 번 세척한 후, 세포를 완충액 100μL에 재현탁하고, IL-2Rα에 대한 IL-2mutant의 결합 수준을 유세포 분석기(BD, ACCURI C6)로 분석하였다.
II. IL-2Rβ IH-비오틴과 함께 표시되는 IL-2mutant의 염색 분석:
1. 각 샘플의 1×106 세포를 원심분리하여 상청액을 폐기하고 나중에 사용하기 위해 FACS 완충액으로 한 번 세척하였다;
2. 세포를 IL-2Rβ IH-비오틴(30nM-100nM) 및 항 플래그 항체를 함유하는 100μL의 FACS 완충액에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다;
3. 위에서 기재한 3 내지 5 단계에 따라 IL-2Rβ에 대한 IL-2mutant의 결합 수준을 분석하였다.
유세포 분석의 염색 결과로부터 다음을 알 수 있다: 라이브러리 IBYDL029 의 IL-2Rα에 대한 스크리닝을 통해 획득한 53 IL-2mutant의 결합의 평균 형광 강도는 IL-23X의 평균 형광 강도에 가까웠고, 즉, 둘 다 IL-2Rα에 결합하지 않았고; IL-2Rβ에 대한 결합의 평균 형광 강도는 IL-23X보다 더 강했다.
IL-2 mutant -FC 융합 단백질의 발현 및 수용체에 대한 이들의 친화성(결합력) 확인
발현 플라스미드의 구축
IL-2mutant 서열은 2개의 GGGGS를 통해 FcLALA에 연결되었고 IL-2mutant-FC 융합 단백질을 발현하기 위해 pCDNA3.1(Addgene)의 벡터로 구축되었다.
또한, 대조군으로서 IL-2WT 및 IL-23X 유전자 서열을 2개의 GGGGS를 통해 FcLALA에 연결하고 IL-2WT-FC 및 IL-23X-FC 융합 단백질을 발현하기 위해 pCDNA3.1로 구축하였다. 본 실시예 및 후속 실시예에서 사용된 Fc는 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 IgG1의 Fc였다(FcLALA로 지칭됨, 서열번호 7).
IL-2 및 FC 융합 단백질의 발현 및 정제
전술한 융합 단백질을 인코딩하는 유전자를 함유하는 벡터를 화학적 형질감염 방법을 사용하여 HEK293 세포에 옮겼다. 배양된 HEK293 세포를 제조업자가 제공한 계획에 따라 화학적 형질감염 시약 PEI를 사용하여 일시적으로 형질감염시켰다. 먼저 슈퍼클린 벤치에서 플라스미드 DNA와 형질감염 시약을 준비하였다. 3mL의 Opti-MEM 배지(Gibco, 카탈로그 번호 31985-070)를 50mL 원심분리 튜브에 첨가한 다음 상응하는 플라스미드 DNA 30μg을 첨가하였다. 플라스미드가 함유된 Opti-MEM 배지를 0.22μm 필터로 여과한 후, 90μg의 PEI(1g/L)를 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 방치하였다. DNA/PEI 혼합물을 27mL의 HEK293 세포에 부드럽게 붓고 잘 혼합하고 37℃에서 8% CO2로 20시간 동안 배양한 다음 VPA를 첨가하여 최종 농도가 2mM이 되도록 하였다. 그런 다음 2%(v/v)의 Feed를 첨가하고 얻어진 혼합물을 6일 동안 더 배양하였다.
배양 후 13000rpm으로 20분 동안 원심분리하고 상청액을 수집하여 미리 포장된 컬럼 Hitrap Mabselect Sure로 정제하였다. 절차는 다음과 같다: 패킹 컬럼은 정제 전에 5 컬럼 부피의 평형 완충액(20mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.2)으로 평형화되었고; 수집된 상청액을 컬럼에 통과시킨 후, 컬럼을 10 컬럼 부피의 평형 완충액으로 세척하여 비특이적 결합 단백질을 제거하였고; 패킹을 5 컬럼 부피의 용리 완충액(1M 시트르산나트륨, pH 3.5)으로 세척하고 용리액을 수집하였다. 용리액 1mL당에 80μL의 Tris(2M Tris)를 첨가하였고, 혼합물을 한외여과 농축 튜브를 사용하여 PBS로 완충제 교환한 다음, 농도를 결정하였다. 100μg의 정제된 단백질을 1mg/mL로 농도를 조정하여 취하였다. IL-2-Fc 이량체 단백질의 순도는 겔 여과 크로마토그래피로 측정하였다. 결과는 표 2에 나타나 있다. 표 2에 열거된 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이의 서열은 도 4에 나타나 있다.
[표 2]
293 세포에서 IL-2-FC의 발현 수율 및 순도
Figure pct00009
수용체에 대한 IL-2 mutant -FC 융합 단백질의 친화성 확인
본 명세서에 개시된IL-2mutant-FC 융합 단백질의 수용체에 대한 결합에 대한 평형 해리 상수(KD)를 생물학적 광학 간섭계(포테바이오)에 의해 측정하였다.
포테바이오 친화성 분석은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행하였다(문헌[Estep, P 등, High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binding. mAbs, 2013.5(2): p. 270-8]). 간단히 말해서, IL-2Rα 및 IL-2Rβ 각각에 대한 후보 IL-2mutant-FC의 친화성은 다음과 같이 측정되었다: 기준선을 설정하기 위해 센서를 20분 동안 분석 버퍼에서 오프라인으로 평형화하고 120초 동안 온라인으로 평형화하였고; 인간 비오틴 표지된 IL-2Rα 또는 IL-2Rβ를 포테바이오 친화성 분석을 위해 SA 센서(PALL, 18-5019)에 로딩하였고; IL-2Rα-비오틴 또는 IL-2Rβ IH-비오틴이 장착된 센서를 100nM IL-2mutant-FC가 포함된 용액에 안정기(plateau)가 될 때까지 넣은 다음, 적어도 2분 동안 해리를 위한 분석 완충액으로 옮겨 연관 및 해리 속도를 측정한다. 1:1 결합 모델을 사용하여 동역학 분석을 수행하였다.
위에 기술된 분석에서, HEK293-F 세포에 의해 발현되는 IL-2mutant-FC 융합 단백질의 수용체에 대한 친화성 KD 값이 표 3에 나타나 있다. 대조군으로서, 동일한 방법을 사용하여 측정한 IL-2WT-FC 및 IL-23X-FC 융합 단백질의 친화성 KD 값도 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
IL-2mutant-FC 융합 단백질의 수용체에 대한 친화성 KD 값
Figure pct00010
N.B: 결합 없음
친화성 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 라이브러리 IBYDL029에서 획득한 위의 모든 돌연변이는 IL-2Rα에 대한 결합이 차단된 반면, IL-2Rβ에 대한 결합은 유지된다.
실시예 3: IL-2 키메라 및 절단된 돌연변이의 구축, 스크리닝 및 확인
IL-2 B'C' 루프 키메라 및 IL-2 B'C' 루프 절단 설계
B'C' 루프: 11개 아미노산, 즉 A73-R83을 포함하는 IL-2의 B 나선 및 C 나선의 링커 서열(도 2A).
IL-2 단량체(PDB: 1M47)의 결정 구조를 복합체(PDB: 2ERJ)의 결정 구조와 비교함으로써, B'C' 루프는 IL-2 단량체의 결정 구조에 존재하지 않는데 그 이유는 이것이 용액에서 매우 활성이고 비교적 안정한 형태를 형성할 수 없기 때문인 것으로 발견되었다.
B'C' 루프를 유전적으로 조작함으로써 B'C' 루프의 안정성이 증가되고, 따라서 IL-2의 안정성 및 IL-2Rβ에 대한 IL-2의 친화성도 증가하였다. 따라서 우리는 인간 IL-15(PDB: 2Z3Q)의 결정 구조를 관찰하고 B'C' 루프가 비교적 짧고 안정적임을 발견하였다(도 2B). 따라서 우리는 IL-2 키메라 분자(L017)와 4개의 단축된 분자(L057-L060)를 설계하였다(표 4 참조).
[표 4]
IL-2 B'C' 루프의 최적화된 서열
Figure pct00011
발현 플라스미드의 구축
야생형 IL-2(UniProt: 줄여서 P60568, aa21-153, C125S, IL-2WT), IL-2 돌연변이 IL-23X (R38D, K43E, E61R) 및 B'C' 루프 키메라 및 절단된 부분을 GSGS 링커 서열을 통해 인간 IgG1의 Fc(줄여서 L234A, L235A, FcLALA, 서열번호 7)에 연결하고 pTT5 벡터로 구축되어 다음 단백질을 발현한다.
Figure pct00012
라이브러리 스크리닝을 통해 획득한 돌연변이 Y30E1(K35E, T37E, R38E, F42A)과 조합된 B'C' 루프 키메라(Y017) 또는 절단(Y057)을 두 개의 GGGGS를 통해 FcLALA에 연결하고 pCDNA3.1 벡터로 구축하여 다음 단백질을 발현한다. 그중 Y092는 키메라 B'C' 루프 서열 AGDASIH를 갖고 Y017의 위치 71 내지 73에 있는 아미노산 잔기 NLS로 인한 잠재적인 N-글리코실화가 제거되었고; B'C' 루프 절단의 T 세포 활성화 활성을 개선하기 위한 것으로 의도된 Y089를 기반으로 절단된 루프 서열에 추가 아미노산 치환 K76A 또는 K76D를 도입함으로써 Y093 및 Y094를 획득하였고; Y144에는 IL-2의 N-말단에서 O-글리코실화를 제거하기 위한 Y092를 기반으로 하는 추가 T3A가 있다.
Figure pct00013
또한, IL-2WT 및 IL-23X는 2개의 GGGGS를 통해 FcLALA에 연결되었고 다음 단백질을 발현하기 위해 pCDNA3.1 벡터로 구축되었다.
Figure pct00014
위의 단백질 분자의 구체적인 서열 정보는 서열 목록에 나타나 있다.
IL-2 융합 단백질의 발현 및 정제
위의 단백질 분자는 각각 293 세포 및 CHO 세포에서 발현되었다. HEK293 세포에서의 발현은 실시예 2의 IL-2-Fc 융합 단백질 발현 방법을 이용하여 수행되었다. CHO 세포에서의 발현을 다음과 같이 수행하였다.
ExpiCHO 세포(Invitrogen)를 원하는 세포 부피에 따라 계대하였다. 세포 밀도는 트랜스펙션 전날 3.5×106cells/mL로 조절되었다. 세포 밀도(약 8 내지 10×106cells/mL)는 형질감염 당일에 측정되었다. 생존율은 95% 이상에 도달하였다. ExpiCHO™ 발현 배지(Gibco, 카탈로그 번호 A29100-01)를 사용하여 세포 밀도를 6×106cells/mL로 조정하였다. 8%(v/v)의 최종 부피에서의 OptiPROTM SFM(Gibco, 카탈로그 번호 12309-019)을 형질감염 완충제로 취하였다. 상응하는 양(0.8μg/mL 세포)의 플라스미드를 첨가하고 혼합물을 잘 혼합하고 0.22μm 필터 막을 통해 여과하여 박테리아를 제거하였다. ExpiFectamineTM CHO 형질감염 키트(Gibco, 카탈로그 번호 A29130)의 시약을 3.2μL/mL의 세포 비율로 첨가하였다. 형질감염 시약과 플라스미드 DNA로 형성된 복합체를 실온에서 1 내지 5분 동안 인큐베이션한 후 천천히 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 8% CO2와 함께 18시간 동안 배양한 다음, 0.6%(v/v) 인핸서(Enhancer) 및 30%(v/v) Feed를 첨가하였다. 세포를 6일 동안 더 배양하였다.
배양 후 세포 배양액을 13000rpm으로 20분 동안 원심분리하고 상청액을 수집하여 미리 포장된 컬럼 Hitrap Mabselect Sure(GE, 11-0034-95)로 정제하였다. 절차는 다음과 같다: 패킹 컬럼은 정제 전에 5 컬럼 부피의 평형 완충액(20mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.2)으로 평형화되었고; 수집된 상청액을 컬럼에 통과시킨 후, 컬럼을 10 컬럼 부피의 평형 완충액으로 세척하여 비특이적 결합 단백질을 제거하였고; 패킹을 5 컬럼 부피의 용리 완충액(100mM 시트르산나트륨, pH 3.5)으로 세척하고 용리액을 수집하였다. 용리액 1mL당 80μL의 Tris(2M Tris)를 첨가하였고, 혼합물을 한외여과 농축 튜브(MILLIPORE, 카탈로그 번호 UFC901096)를 사용하여 PBS(Gibco, 카탈로그 번호 70011-044)로 완충제 교환한 다음, 농도를 결정하였다. 100μg의 정제된 단백질을 1mg/mL로 농도를 조정하여 취하였다. 단백질 순도는 겔 여과 컬럼 SW3000(TOSOH 카탈로그 번호 18675)에 의해 결정되었다.
B'C' 루프 키메라(Y017) 및 절단(Y057/058/059)의 융합 단백질은 야생형 IL-2 융합 단백질(Y001)에 비해 HEK293 세포에서 크게 개선된 발현 수율 및 1단계 친화성 크로마토그래피 순도를 가졌다. 결과는 하기 표 5에 나타나 있다.
[표 5]
HEK293에서 IL-2 돌연변이의 발현 수율 및 순도
Figure pct00015
B'C' 루프 키메라(Y092/144), 절단(Y089/093/094) 및 추가 돌연변이 Y30E1의 융합 단백질은 또한 야생형 IL-2 융합 단백질(Y045)에 비해 CHO 세포에서 크게 개선된 발현 수율 및 1단계 친화성 크로마토그래피 순도를 가졌다. 결과는 하기 표 6에 나타나 있다.
[표 6]
CHO에서 IL-2 돌연변이의 발현 수율 및 순도
Figure pct00016
수용체에 대한 IL-2 돌연변이 Fc 융합 단백질의 친화성 확인
하기 돌연변이 단백질에 대해 실시예 2에 기재된 포테바이오 친화성 측정 방법에 따라 친화성 KD 값을 측정하였다. 결과는 하기 표 7에 나타나 있다.
[표 7]
IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 IL-2 돌연변이의 KD 값
Figure pct00017
N.B: 결합 없음
위의 데이터에 따르면 다음과 같은 사실을 알 수 있다: 1) 효모 라이브러리 스크리닝으로 획득한 Y30E1과 같은 포인트 돌연변이 분자는 IL-2Rα에 대한 결합을 차단할 수 있다; 2) B'C' 루프 키메라 분자 및 절단 분자는 분자 발현 수율 및 순도 및 또한 IL-2Rβ에 대한 분자의 친화성을 개선하였다; 3) Y30E1과 B'C' 루프 돌연변이의 조합 분자는 IL-2Rα에 대한 차단을 달성하고, 분자 발현 수율 및 순도를 개선하고, IL-2Rβ에 대한 결합 활성도 개선하였다.
실시예 4: IL-2 돌연변이의 체외 기능 분석
IL-2Rβ와 IL-2Rγ보다, IL-2Rα에 대한 친화성이 더 높은 것으로 인해 IL-2WT는 세포 표면의 IL-2Rα에 우선적으로 결합한 다음 IL-2Rβγ를 모집한다. 다운스트림 p-STAT5 신호는 IL-2Rβγ에 의해 방출되어 T 세포와 NK 세포의 증식을 자극한다. IL-2Rα는 Treg 세포의 표면에 존재하지만 이펙터 T 세포 및 NK 세포의 표면에는 없기 때문에 일반적으로 IL-2WT는 Treg 세포 증식을 우선적으로 자극하고 면역 반응을 하향 조절한다. IL-2mutant는 IL-2Rα에 결합하지 않기 때문에 Treg 세포 증식을 우선적으로 자극하기 위한 IL-2mutant에 대한 선호도가 제거되는 동시에 이펙터 T 세포 및 NK 세포의 수는 T 세포 및 NK 세포 증식을 자극함으로써 효과적으로 증가되어 항종양 효과를 향상시킨다.
본 실시예에서는 CD25+ 세포에 대한 각 돌연변이에 대한 활성화 선호도의 제거는 1차 인간 CD8+ T 세포의 p-STAT5 신호에 대한 각 IL-2mutant-FC의 활성화 효과를 검출함으로써 확인되었고, CD25-세포에 대한 높은 활성화 효과를 갖는 돌연변이를 스크리닝하였다. 구체적인 단계는 다음과 같다.
1. PBMC 세포 해동:
a) PBMC 세포(Allcells, 카탈로그 번호 PB005F, 100M 패키지)를 액체 질소에서 꺼낸 다음 해동을 위해 37℃ 수조에 신속하게 넣었고;
b) 세포를 5% 인간 AB 혈청(GemCell, 카탈로그 번호 100-512) 및 1‰ DNase(STRMCELL, 카탈로그 번호 07900)를 함유하는 예열된 X-VIVO15 배양 배지(Lonza, 카탈로그 번호 04-418Q) 10mL에 첨가하고, 400G 및 25℃에서 10분 동안 원심분리하고(이후 원심분리는 동일한 조건 하에 이루어짐), 한번 세척하였고;
c) 20mL의 배양액을 첨가하여 세포를 재현탁하고, 세포를 37℃ 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 배양하였다.
2. 인간 CD8+ T 세포 정제:
a) 1단계에서 획득한 세포 현탁액을 피펫팅하고, 원심분리 후 상청액을 폐기하였고;
b) 인간 CD8+ T 세포 정제 키트(Invitrogen, 카탈로그 번호 11348D)에 1mL의 Robosep 완충액(STEMCELL, 카탈로그 번호 20104), 100μL의 인간 AB 혈청 및 100μL의 음성 스크리닝 항체의 혼합물을 첨가하여 세포를 재현탁시켰고;
c) 잘 혼합한 후, 세포를 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하고 5분마다 진탕시켰고;
d) 배양한 후, 10mL의 Robosep 완충액을 첨가하고, 세포를 원심분리하고 두 번 세척하였고;
e) 한편, 1mL의 자기 미소구체(인간 CD8+ T 세포 정제 키트)를 취하고 7mL의 Robosep 완충액을 첨가하였고; 혼합물을 자기 프레임에 1분 동안 놓아 상청액을 폐기하고 자기 미소구체를 미리 세척하였고;
f) 미소구체 및 세포를 1mL의 Robosep 완충액으로 재현탁시키고, 잘 혼합한 후, 혼합물을 실온에서 30분 동안 회전 인큐베이션하였고;
g) 배양 후 Robosep 완충액 6mL를 첨가하고 혼합물을 자기 프레임에 1분 동안 놓은 후 상청액을 수집하였고;
h) 수집된 액체를 자기 프레임에 1분 동안 놓고 상청액을 수집하였고;
i) 원심분리를 수행하여 상청액을 폐기하고, 세포를 예열된 T 배양 배지를 사용하여 재현탁하고, 세포 밀도를 1×106/mL로 조정하였고;
j) 세포의 1/3을 취하여 나중에 CD25의 발현을 자극하고, 나머지 세포를 밤새 정적 배양을 위해 37℃ 이산화탄소 인큐베이터에 두었다.
3. CD25를 발현하도록 CD8+ T 세포 자극:
a) 단계 2에서 정제된 CD8+ T 세포의 1/3을 취하고 여기에 항-인간 CD3/CD28 항체(GIBCO, 카탈로그 번호 11131D)의 자기 미소구체를 첨가하였고(세포 대 미소구체의 비율은 3:1임);
b) 혼합물을 3일 동안 정적 배양을 위해 37℃ 이산화탄소 인큐베이터에 넣었고;
c) 10mL의 배양 배지를 첨가하여 세포를 두 번 세척하였고;
d) 배양 배지를 첨가하여 세포 밀도를 1×106/mL로 조정하고, 세포를 2일 동안 정적 배양을 위해 37℃ 이산화탄소 인큐베이터에 넣었다.
4. 세포의 순도 및 발현 수준 검출:
a) 항인간 CD8-PE 항체(Invitrogen, 카탈로그 번호 12-0086-42), 항인간 CD25-PE 항체(eBioscience, 카탈로그 번호 12-0259-42) 및 이소형 대조군 항체(BD, 카탈로그 번호 556653)를 세포의 CD8 및 CD25를 검출하기 위해 채택하였고;
b) 단계 2의 세포는 CD8+ CD25- T 세포이고 단계 3의 세포는 CD8+ CD25+ T 세포였다.
5. CD8+ CD25- T 세포에서 p-STAT5 신호 활성화 시 각 IL-2mutant-FC의 EC50 값 검출:
a) CD8+ CD25- T 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트(Costar, 카탈로그 번호 CLS3799-50EA)에 웰당 1×105개 세포로 첨가하였고;
b) IL-2mutant-FC, 상용화된 IL-2(R&D, 카탈로그 번호 202-IL-500), IL-2WT-FC, 및 IL-23X-FC(각각 100μL)를 추가하고, 266.7nM의 최대 농도에서 구배로, 총 12개의 희석 구배로 4배 희석하고, 세포를 37℃ 인큐베이터에서 20분 동안 인큐베이션하였고;
c) 55.5μL의 4.2% 포름알데히드 용액을 첨가하여 위의 세포를 실온에서 10분 동안 고정시켰고;
d) 원심분리를 수행하여 상청액을 폐기하고 200μL의 얼음 메탄올(Fisher, 카탈로그 번호 A452-4)을 첨가하여 세포를 재현탁한 다음 4℃ 냉장고에서 30분 동안 인큐베이션하였고;
e) 원심분리를 수행하여 상청액을 폐기하고 잔류물을 200μL의 염색 완충액(BD, 카탈로그 번호 554657)으로 3회 세척하였고;
f) 항-p-STAT5-AlexFlour647(BD, 카탈로그 번호 562076, 1:200 희석)을 함유하는 200μL의 투과/고정 완충액(BD, 카탈로그 번호 51-2091KZ)을 추가하였고, 세포를 실온에서 3시간 동안 암실에서 인큐베이션하였고;
g) 세포를 염색 완충액으로 세 번 세척하고, 100μL의 염색 완충액으로 재현탁하고, 유세포 분석기를 사용하여 검출하였고;
h) p-STAT5 신호를 활성화하기 위한 EC50 값은 가로축으로 IL-2 분자 농도를 사용하고 세로축으로 AlexFlour647 형광 중앙값을 사용하여 플롯팅하였고, 결과를 도 5A 및 표 8에 나타나 있다.
6. CD8+ CD25+ T 세포에서 p-STAT5 신호 활성화 시 각 IL-2mutant-FC의 EC50 값 검출:
a) CD8+ CD25- T 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에 웰당 1×105개 세포로 첨가하였고;
b) p-STAT5 신호를 활성화하기 위한 EC50 값은 단계 5의 b-h와 동일한 단계를 거쳐 플로팅되었으며, 이의 결과를 도 5B 및 표 8에 나타나 있다.
[표 8]
CD25+/- T 세포에서 p-STAT5 신호를 활성화하는 IL-2 돌연변이의 EC50 및 이의 비율
Figure pct00018
실험 결과는 다음을 나타낸다: 1) Y30E1, Y089, Y092, Y093 및 Y094의 모든 B'C' 루프 돌연변이는 Y30E1보다 EC50이 더 낮은 CD25- CD8+ T 세포에서 p-STAT5 신호를 활성화하며, 이는 분자에 의한 CD25- CD8+ T 세포의 활성화는 B'C' 루프 최적화 후에 개선될 수 있음을 나타내며, 이는 IL-2Rβ에 대한 친화성 데이터와 일치하는 것; 2) CD25- EC50/CD25+ EC50의 비율에 따라 돌연변이 단백질 Y30E1, Y089, Y092, Y093 및 Y094는 Y045(IL-2WT-Fc)에 비해 CD25+ 세포의 활성화에 대한 선호도가 현저히 감소했으며, 이는 Y30E1 돌연변이가 CD25에 대한 결합을 안전하게 차단했음을 나타내는 것.
실시예 5: IL-2 돌연변이의 안정성
PBS 완충액(pH 7.4, Gibco, 카탈로그 번호 10010-023) 또는 히스티딘 완충액(10mM 히스티딘, 5% 소르비톨, 0.02% 폴리소르베이트 80, 염산으로 pH 6.5로 조정)에 보관한 Y089, Y092 및 Y094의 안정성을 40℃ 자동 온도 조절식 인큐베이터(Zhicheng SHP-150)에서 7일 및 14일 동안 평가하였다. 테스트 인덱스는 SEC-HPLC 및 CE-SDS에 의해 결정된 IL-2 돌연변이 단백질의 순도였다.
[표 9a]
SEC-HPLC에 의해 결정된 40℃ 환경에서 IL-2 돌연변이의 안정성 결과
Figure pct00019
[표 9b]
CE-SDS에 의해 결정된 40℃ 환경에서 IL-2 돌연변이의 안정성 결과
Figure pct00020
결과는 Y089, Y092 및 Y094가 모두 PBS 완충액 및 히스티딘 완충액에 14일 보관 후 우수한 안정성을 나타냄을 보여준다.
실시예 6: IL-2 돌연변이 분자의 체내 항종양 효능
IL-2 돌연변이 분자의 체내 효능을 입증하기 위해, Balb/c 마우스에 CT26 세포(마우스 결장암 세포주, ATCC)를 접종하여 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 분자(Y092)의 항종양 효능을 결정하였다. 인증서 번호 1811230011이 있는 SPF 암컷 Balb/c 마우스(18 내지 20g, Zhejiang Vital River Laboratory Animal Technology 유한회사에서 구입)를 실험에서 사용하였다.
CT26 세포를 후속 체내 연구를 위해 통상적으로 계대 배양하였다. CT26 세포를 원심분리에 의해 수집하고 PBS(1×)에 분산시켜 2.5×106cells/mL의 세포 농도를 갖는 세포 현탁액을 형성하였다. 0일째에, 0.2mL의 세포 현탁액을 Balb/c 마우스의 우측 복부 부위에 피하 접종하여 CT26 종양-보유 마우스 모델을 확립하였다.
종양 세포 접종 7일 후, 각 마우스의 종양 부피를 측정하였다. 마우스를 6개의 그룹으로 나누었다. 투여량 및 투여 경로를 표 10에 나타나 있다.
[표 10]
체내 실험에서 그룹, 투여량 및 투여 경로
Figure pct00021
*: h-IgG는 Equitech-Bio(로트 번호 161206-0656)에서 구입한 이소형 대조군 항체였다.
h-IgG 및 Y092는 각각 10mg/ml 및 6.4mg/ml의 농도로 사용하였고, 7일마다 총 2회 투여하였다(Q7D×2). 투여는 CT26 세포 접종 후 7일 및 14일에 수행하였다. 마우스의 종양 부피 및 체중을 도 6A, 6B 및 6C에 도시된 바와 같이 21일 동안 주 2 내지 3회 모니터링하였다. 접종 후 21일째에 상대 종양 성장 억제(TGI%)를 하기 식에 의해 계산하였다: TGI% = 100%×(대조 그룹 종양 부피-치료 그룹 종양 부피)/(대조 그룹 종양 부피-접종 전의 대조 그룹 종양 부피). 종양 크기 측정: 종양의 장축(L) 의 최대 길이와 단축(W)의 최대 길이는 버니어 칼리퍼(vernier caliper)로 측정했고, 종양의 부피는 하기 공식으로 계산했다: V = L×W2/2. 마우스의 체중은 전자저울을 이용하여 측정하였다.
종양 성장 억제 결과는 표 11에 나타나 있다: 접종 후 21일째에, 0.004mg/kg Y092, 0.02mg/kg Y092, 0.1mg/kg Y092 및 0.5mg/kg Y092는 h-IgG에 비해 각각 3.7%, 16.2%, 43.8% 및 53.5%의 단일 약물 억제율을 가졌다. 결과는 조작된 IL-2 분자(Y092)가 항종양 효과를 갖고 용량 의존적 반응을 달성했음을 나타낸다. 한편, 마우스의 체중 측정 결과(도 6B 내지 6C)는 접종 후 21일 동안 고용량군(Y092, 0.5mg/kg)에 체중이 10% 초과 감소한 반면, 다른 그룹의 마우스에서는 체중이 5% 이하 감소하였다. 마우스의 투여군에서는 사망이 발생하지 않았다.
[표 11]
21일째의 종양 성장 억제율
Figure pct00022
실시예 7: IL-2 돌연변이 분자의 체내 항종양 효능
분자의 글리코실화를 감소시키기 위해 분자 Y092에서 돌연변이(T3A)가 추가로 수행되었다. IL-2 돌연변이 분자의 체내 효능을 입증하기 위해, C57 마우스에 MC38 세포(마우스 결장암 세포주, ATCC)를 접종하여 본 명세서에 개시된 IL-2 돌연변이 분자(Y144)의 항종양 효능을 결정하였다. 인증서 번호 1100111911070497이 있는 SPF 암컷 C57 마우스(15 내지 18g, Beijing Vital River Laboratory Animal Technology 유한회사에서 구입)를 실험에 사용하였다.
MC38 세포를 후속 체내 연구를 위해 통상적으로 계대 배양하였다. MC38 세포를 원심분리에 의해 수집하고 PBS(1×)에 재현탁하여 5×106cells/mL의 세포 농도를 갖는 세포 현탁액을 형성하였다. 0일째에, 0.2mL의 세포 현탁액을 C57 마우스의 우측 복부 부위에 피하 접종하여 MC38 종양-보유 마우스 모델을 확립하였다.
종양 세포 접종 7일 후, 각 마우스의 종양 부피를 측정하였다. 마우스를 6개의 그룹으로 나누었다. 투여량 및 투여 경로를 표 12에 나타나 있다.
[표 12]
체내 실험에서 그룹, 투여량 및 투여 경로
Figure pct00023
*: h-IgG는 Equitech-Bio(로트 번호 161206-0656)에서 구입한 이소형 대조군 항체였다.
h-IgG 및 Y144는 각각 10mg/ml 및 0.5mg/ml의 농도로 사용하였고, 7일마다 총 3회 투여하였다(Q7D×3). 투여는 MC38 세포 접종 후 7일, 14일 및 21일에 수행하였다. 마우스의 종양 부피 및 체중을 도 7A, 7B 및 7C에 도시된 바와 같이 24일 동안 주 두 번 모니터링하였다. 접종 후 24일째에 상대 종양 성장 억제(TGI%)를 하기 식에 의해 계산하였다: TGI% = 100%×(대조 그룹 종양 부피-치료 그룹 종양 부피)/(대조 그룹 종양 부피-접종 전의 대조 그룹 종양 부피). 종양 크기 측정: 종양의 장축(L) 의 최대 길이와 단축(W)의 최대 길이는 버니어 칼리퍼(vernier caliper)로 측정했고, 종양의 부피는 하기 공식으로 계산했다: V = L×W2/2. 마우스의 체중은 전자저울을 이용하여 측정하였다.
종양 성장 억제 결과는 표 13에 나타나 있다: 접종 후 24일째에, Y144는 1mg/kg h-IgG 그룹과 비교하여 30.05%의 단일 약물 억제율을 가졌다. 한편, 마우스의 체중 측정 결과(도 7C)는 접종 후 24일째에 마우스의 체중에 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.
서열 목록 설명
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
SEQUENCE LISTING <110> 신달바이오제약(쑤저우) 유한회사(Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd.) <120> 인터루킨-2 돌연변이 및 이의 용도 <130> PF 210146PCT <160> 26 <170> PatentIn 버전 3.3 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 153 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 2 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala 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Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 4 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Asp Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 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Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 130 135 140 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 145 150 155 160 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 165 170 175 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 180 185 190 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 195 200 205 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 210 215 220 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 225 230 235 240 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 245 250 255 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 260 265 270 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 275 280 285 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 290 295 300 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 305 310 315 320 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 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Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu 85 90 95 Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu 100 105 110 Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu 115 120 125 Thr <210> 23 <211> 129 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 23 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Glu Leu Glu Glu Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gly Asp Ala Ser Ile His Asp 65 70 75 80 Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu 85 90 95 Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu 100 105 110 Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu 115 120 125 Thr <210> 24 <211> 129 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 24 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys 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Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu 85 90 95 Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu 100 105 110 Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu 115 120 125 Thr <210> 26 <211> 129 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 26 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Glu Leu Glu Glu Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gly Asp Ala Ser Ile His Asp 65 70 75 80 Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu 85 90 95 Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu 100 105 110 Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu 115 120 125 Thr

Claims (22)

  1. IL-2 돌연변이 단백질로서,야생형 IL-2(바람직하게는 인간 IL-2, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 포함하는 IL-2)에 비해, 하기 돌연변이를 포함하고:
    (i) CD25와 IL-2의 결합 계면에서, 특히 위치 35, 37, 38, 41, 42, 43, 45, 61, 68 및 72로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서 IL-2α 수용체에 대한 상기 결합 친화성을 제거하거나 감소시키는 돌연변이, 여기서 바람직하게는, 상기 돌연변이는 K35D/E, T37D/E, R38Y/W/E/D, T41E, F42N/Q/V/L/I/A, K43D/E/F/Y, Y45R/K, E61R/K, E68R/K 및 L72Y/F 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 K35D/E, T37D/E, R38W/E/D, T41E, F42Q/A, K43E/Y, Y45K, E61K, E68R 및 L72F 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고;
    및
    (ii) 단축된 B'C' 루프 영역(즉, 아미노산 잔기 aa72 및 aa84를 연결하는 서열), 여기서 바람직하게는 상기 단축된 루프 영역은 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개 미만의 아미노산 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 7개 아미노산 길이를 가지며; 바람직하게는, 상기 단축된 B'C' 루프 영역은 IL-2Rβ 수용체에 대한 개선된 단백질 발현 수율 및/또는 순도 및/또는 결합 친화성을 초래하고,
    상기 아미노산 위치는 서열번호 1에 따라 번호가 매겨지는, IL-2 돌연변이 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 (i)은 하기 조합 (1) 내지 (9), 특히 조합 (1) 내지 (6)으로부터 선택된 돌연변이의 조합이고:
    Figure pct00027
    ;
    바람직하게는, 상기 돌연변이 (i)은 하기 조합 (1) 내지 (9), 특히 조합 (1) 내지 (6)으로부터 선택된 돌연변이의 조합인, 돌연변이 단백질:
    Figure pct00028
    .
  3. 제1항에 있어서, 돌연변이 K35E+T37E+R38E+F42A의 조합을 포함하는, 돌연변이 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 (ii)는:
    (a) 예를 들어 IL-15의 B'C' 루프 서열과 같은 4-나선 단쇄 사이토킨 IL 패밀리 구성원으로부터의 짧은 B'C' 루프 서열로, 바람직하게는 서열 GDASIH로, B'C' 루프 영역에서의 aa74 내지 aa83의 치환; 또는
    (b) 바람직하게는 서열 (Q/G)S(K/A/D)N(F/I)H를 형성하기 위해, 예를 들어 C-말단에서 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산에 의해 B'C' 루프 영역에서의 aa74 내지 aa83의 절단, 보다 바람직하게는 하기로부터 선택된 서열을 형성하기 위한 절단을 포함하는, 돌연변이 단백질:
    Figure pct00029
    .
  5. 제1항에 있어서, 상기 야생형 IL-2에 비해,
    (i) 돌연변이 K35E+T37E+R38E+F42A의 조합; 및
    (ii) 하기로부터 선택된 B'C' 루프 영역 서열:
    -AQSKNFH;
    -AQSANFH;
    -AQSDNFH;
    -SGDASIH; 및
    -AGDASIH,
    및 선택적으로, (iii) 돌연변이 T3A를 포함하는, 돌연변이 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 IL-2에 비해, 보존적 아미노산 잔기 돌연변이와 같은, 0 내지 5개 이하의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함하는, 돌연변이 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    -서열번호 22 내지 26, 바람직하게는 서열번호 23 및 26으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    -서열번호 22 내지 26, 바람직하게는 서열번호 23 또는 26으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 돌연변이 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 IL-2에 비해, 하기 특성:
    - IL-2Rα에 대한 감소된 또는 제거된 결합,
    - IL-2Rβ에 대한 향상된 결합; 및
    -예를 들어 Fc 융합 단백질로서, 포유동물 세포(예를 들어, 293 세포 또는 CHO 세포)에서 발현될 때, 개선된 발현 수율 및/또는 더 높은 순도(예를 들어, 1단계 친화성 크로마토그래피 후 SEC-HPLC에 의해 측정 시 더 높은 순도)에 대한 정제 용이성 중 적어도 하나, 둘 또는 세 개 모두를 포함하는, 돌연변이 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 IL-2에 비하여, 하기 특성:
    - 고친화성 IL-2R 수용체(IL-2Rαβγ)에 대한 결합 친화력이 감소됨;
    - 중간 친화성 IL-2R 수용체(IL-2Rβγ)에 대한 결합 친화성이 증가함;
    - CD25+ 세포(예를 들어, CD8+ T 세포 및 Treg 세포)의 활성화 감소;
    - CD25+ 세포(예를 들어, CD8+ T 세포)에서 IL-2 매개 신호전달에 대한 자극 감소;
    - CD25+ 세포(예를 들어, Treg 세포)를 우선적으로 활성화하기 위한 IL-2의 선호도 제거 또는 감소;
    - IL-2에 의해 유도된 Treg 관련 면역 반응 하향 조절 감소;
    - CD25-세포(예를 들어, CD25- CD8+ T 세포)의 활성화 유지 또는 향상; 및
    - CD25-이펙터 T 세포 및 NK 세포의 증식 및 활성화의 증가를 초래;
    여기서 선택적으로, 상기 돌연변이 단백질은 하기 특성 중 하나 이상을 추가로 가지며,
    - 예를 들어 결장암에 대한 체내 항종양 효과;
    - 예를 들어, 투여 후 대상체의 체중 변화에 의해 반영된 바와 같이 체내 투여 후 현저한 독성 없음(예를 들어, 투여 전과 비교하여, 예를 들어 투여 후 20일, 체중의 15% 이하 또는 10% 이하 또는 5% 이하 감소); 및
    - 보관 안정성을 가짐(여기서 예를 들어, pH 7.4의 PBS 완충액에서 40℃에서 14일 동안 보관한 후, 상기 단백질은 SEC-HPLC에 의해 측정할 때 순도가 2% 또는 1% 이하로 감소하거나, CE-SDS로 측정했을 때 순도가 3% 또는 2% 이하로 감소함) 중 하나 이상을 갖는, 돌연변이 단백질.
  10. IL-2 돌연변이 단백질의 융합 단백질로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 돌연변이 단백질을 포함하고, 여기서 바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이 단백질은 Fc 항체 단편에 융합되고, 보다 바람직하게는 상기 IL-2 돌연변이 단백질은 링커를 통해 상기 Fc에 융합되며, 상기 링커는 바람직하게는 GSGS, 더욱 바람직하게는 2×(G4S)이고, 여기서 상기 Fc는 인간 IgG1 Fc이고 바람직하게는 FcγR에 대한 상기 Fc의 결합을 감소 또는 제거하는 돌연변이, 예를 들어, L234A+L235A를 포함하고;
    바람직하게는, 상기 융합 단백질은 서열번호 15 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 96% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  11. 면역접합체로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 돌연변이 단백질 및 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 바람직하게는, 상기 항원 결합 분자는 면역글로불린 분자, 특히 IgG 분자, 또는 항체 또는 항체 단편, 보다 특히 Fab 분자 및 scFv 분자인, 면역접합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 테나신-C의 A1 도메인(TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B(EDB), 암배아 항원(CEA) 및 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)으로부터 선택된 항원과 같은, 종양 세포 또는 종양 환경에 존재하는 항원에 특이적으로 결합하는, 면역접합체.
  13. 분리된 폴리뉴클레오타이드로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 돌연변이 단백질, 제10항에 따른 융합체, 또는 제11항 또는 제12항에 따른 면역접합체를 인코딩하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  14. 발현 벡터로서, 제13항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 발현 벡터.
  15. 숙주 세포로서, 제13항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제14항에 따른 벡터를 포함하고, 여기서 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포, 특히 HEK293 세포 또는 CHO 세포, 또는 효모인, 숙주 세포.
  16. IL-2 돌연변이 단백질, 또는 이의 융합체 또는 면역접합체를 생산하기 위한 방법으로서, 제15항에 따른 숙주 세포를 상기 IL-2 돌연변이 단백질, 또는 이의 융합체 또는 접합체를 발현하기에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 돌연변이 단백질, 제10항에 따른 융합체, 또는 제11항 또는 제12항에 따른 면역접합체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 여기서 바람직하게는, 상기 조성물은 인산염 완충제 또는 히스티딘 완충제를 포함하고; 바람직하게는 상기 조성물의 pH는 6.0 내지 7.6인, 약제학적 조성물.
  18. 대상체의 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 돌연변이 단백질, 제10항에 따른 융합체, 제11항 또는 제12항에 따른 면역접합체, 또는 제17항에 따른 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 바람직하게는 상기 질환은 암인, 방법.
  19. 대상체의 상기 면역 체계를 자극하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 돌연변이 단백질, 제10항에 따른 융합체, 또는 제11항 또는 제12항에 따른 면역접합체를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. IL-2 돌연변이 단백질을 획득하기 위한 방법으로서,
    - IL-2Rα와 IL-2의 결합 계면에서 돌연변이를 수행함으로써 하나 이상의 돌연변이를 도입하고, 이 내부의 돌연변이에 의해 상기 IL-2의 B'C' 루프 영역의 서열을 단축시키는 단계,
    바람직하게는 제2항에 기재된 돌연변이의 상기 조합 및/또는 제4항에 기재된 상기 B'C' 루프 서열의 상기 돌연변이를 도입하는 단계;
    - 포유동물 세포(예를 들어, HEK293 또는 CHO 세포)에서, 예를 들어 Fc 융합(예를 들어, FcLALA 융합)의 형태로, 상기 IL-2 돌연변이 단백질을 발현하는 단계; 및
    - 하기 개선된 특성 중 하나 이상을 갖는 돌연변이 단백질 확인하는 단계: (i) 정제 후 개선된 발현 수율 및/또는 단백질 순도(예를 들어, 1단계 친화성 크로마토그래피 후 SEC-HPLC에 의해 측정된 순도); (ii) IL-2Rα에 대한 감소된 결합; 및 (iii) IL-2Rβ에 대한 향상된 결합을 포함하는, 방법.
  21. IL-2 단백질의 B'C' 루프 영역을 조작하기 위한 방법으로서,
    (a) 예를 들어 IL-15의 B'C' 루프 서열과 같은 4-나선 단쇄 사이토킨 IL 패밀리 구성원으로부터의 짧은 B'C' 루프 서열로, 바람직하게는 GDASIH를 포함하는 서열로, 상기 B'C' 루프 영역에서 aa74 내지 aa83을 치환하는 단계; 또는
    (b) 예를 들어 IL-15의 B'C' 루프 서열과 같은 4-나선 단쇄 사이토킨 IL 패밀리 구성원으로부터의 짧은 B'C' 루프 서열로, 바람직하게는 AGDASIH를 포함하는 서열로 상기 B'C' 루프 영역에서 aa73 내지 aa83을 치환하는 단계; 또는
    (c) 바람직하게는 서열 (Q/G)S(K/A/D)N(F/I)H를 형성하기 위해, 보다 바람직하게는 하기로부터 선택된 서열을 형성하기 위해, 예를 들어 C-말단에서 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산에 의해, 상기 B'C' 루프 영역에서 aa74 내지 aa83을 절단하는 단계를 포함하는, 방법:
    Figure pct00030
    .
  22. IL-2 단백질로서, 제21항에 따른 방법을 사용하여 조작된, IL-2 단백질.
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