JPH04507250A - Ｉｌ―２削除ミュータント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＩＬ−２削除ミユータント 発明の背景 本発明はミュータントのインターロイキン−２（ＩＬ−２）分子及びキメラ■Ｌ −２／毒素分子を製造するための組換えＤＮＡ技術の用途に関する。

ＩＬ−２は、活性化Ｔ−リンパ球のＩＬ−２リセブターに結合してＴ−リンパ球 の増殖を刺激する能力を有するヒトＴ−リンパ球から分泌される蛋白質である。

ＩＬ−２はヒトにおける治療的免疫刺激剤であることが示され（Ｒｏｓｅｎｂｅ ｒｇ、１９８８．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　９：２：５８−６２）、 そしてＩＬ−２またはその特異的結合部分はジフテリア毒素の酵素的に活性な部 位に結合して、多くの治療応用性をもったハイブリッド分子を形成しつることが 知られている（Ｍｕｒｐｈｙの米国特許４，６７５，３８２．参照により本明細 書に含まれる）。このＭｕｒｐｈ）’の米国特許のＩＬ−２／ジフテリア毒素ノ ）イブリッド蛋白質は、組換えＤＮＡ技術を用いて作製されたが、移植器官の拒 絶ｏｎ　４７：３１８−３２２（１９８９））、そしてＩｎ、−２リセブターが 役割を果たすある種の癌及び自己免疫疾患の治療における有望な治療剤でもある 。

ＩＬ−２をコードするＤＮＡ配列は多くの文献に報告されており、さらに、安定 性を高めるためにシスティンコドンが置換された修飾Ｉ　Ｌ−２をコードする遺 伝子も米国特許第４，５１８，５８４に記載されており、その内容は参照により 本明細書に含まれる。１９８６年２月２８日に出願された米国特許出願８３４゜ ９００（その内容は参照により本明細書に含まれる）にも、合成ＩＬ−２−コー ドＤＮＡ配列が記載され、これは原核細胞がより好む翻訳コドンを含む点で天然 Ｉ　Ｌ−２コードＤＮＡと異なっている。

アミノ酸の削除または置換もＩＬ−２のアミノ酸配列に作製されている（欧州特 許出願８６１１４４６８．１及び８７１０１８３９．６、米国特許４．６０４． ３７７）。ＩＬ−２のＤＮＡ及びアミノ酸配列及びその結晶構造は知られている が（Ｂｒａｎｄｈｕｂｅｒら、１９８７，５ｃｉｅｎｃｅ、２３８．１０７０） 、ＩＬ−２の生物学的活性に関するもしくは蛋白分解に感受性の領域の正確な予 測を可能にするデータは殆ど得られていない；例えばＩ　Ｌ−２アミノ酸配列の １２５位のシスティン残基をセリンに単一置換すると、分子の安定性の増加をも たらしく米国特許４，６０４，３７７）、１２１位のトリプトファン残基を置換 すると分子を不活性化し；アミノ酸残基１００−１０４を削除すると生物学的活 性を二指のオーダーで減少し；アミノ酸残基１２４−１２６を削除すると分子を 不活性化する（Ｃｏｆｆｉｎｓら、１９８８．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ 。

Ｓｃｉ、、８５ニア７０９；Ｃｏｈｅｎら、１９８６，５ｃｉｅｎｃｅ、２３４ ：３４９）。

発明の概要 本発明はＩＬ−２ミユータントボリベブチドを提供し、これは１〜５アミノ酸の 削除を有し、しかもＩＬ−２リセブターを有する細胞への結合能力を保持してい る。Ｉ　Ｌ−２分子内においてリジン７６が蛋白分解（プロテオリティック）部 位であることは知られている（Ｃｏｈｅｎら、１９８６，５ｃｉｅｎｃｅ、２３ ８：３４９）。これらのミュータントがこの蛋白分解（プロテオリティック）部 位を完全に削除されているか、または該領域の構造を変更して蛋白分解性を減少 させる努力がなされている。これらのＩＬ−２ミユータントは免疫刺激剤として 用いることが可能であり、あるいは毒素と結合してハイブリッドＩＬ−２−毒素 を形成させて、ＬＬ−２リセブターの存在により特徴づけられる免疫性または他 の疾患の治療に用いることができる。

したがって、本発明は一般に、ｒＬ−２リセブターに結合することができる８種 類の新規ミュータントＩＬ−２ポリペプチドに関し、これらのＩＬ−２ポリペプ チドは、以下のような１またはそれ以上のアミノ酸残基の削除を有する；７４． ７４−７８．７５−７７．７６−７８．７６−７９．７５；７８；及び７９（Ｗ ｉｌｌｔａｍｓら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、ｖｏｌ、１６．ｎｏ、２２ 　（１９８８）から採用して図に示す番号規約に従う）。

好ましい態様のあるものにおいて、ミュータントＩＬ−２ポリペプチドは、好ま しくはカルボキシ末端でペプチド結合により該ミュータントポリペプチドに共有 結合した毒素部分（例えば、ジフテリア毒素由来のもの）を含む融合蛋白質の一 部分であってもよい。ジフテリア毒素部分は細胞毒性を発揮するために十分に大 きくそして一般的真核細胞に対する結合性を発揮することが出来ないほど十分に 小さい。

好ましくは、ＩＬ−２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現に用られる 細胞の中で遺伝子の発現を最大化するために設計されたヌクレオチドの置換を有 する；即ち、Ｅ、ｃｏｌｉのような原核細胞を用いる場合は、好ましい原核細胞 コドンで天然コドンのいくつかを置換する（これは図に示す配列の中で行われて いる）。

本発明のハイブリッド分子はＩＬ−２リセブターが役割を果たす病気を治療する ために有用であり、例えばＩＬ−２リセブター陽性悪性症、アレルギー反応、及 び全身性紅廠性狼１（ＳＬＥ）、または移植拒絶において生じるＩＬ−２リセブ ター保持Ｔ細胞による免疫反応を防止するために有用である。この向標的毒素は 次のメカニズムで作用する：ＩＬ−２／毒素はＩ　Ｌ−２部分によって、高親和 性ＩＬ−２リセブター保持細胞に結合する。そしてこのｒ　Ｌ−２−毒素はＩＬ −２リセブターを介するエンドサイト−シスにより細胞内小胞（ｅｎｄｏｃｙｔ ｉ（ｖｅｓｉｃｌｅｓ）の内部に取り込まれる。エンドサイトの酸性化が毒素の 構造変化を引き起こし、その模作用性領域を細胞内小胞の膜と相互作用可能にし 、そして酵素的に活性なフラグメントＡを細胞質（サイトソール）中へ移行させ る。フラグメントＡは細胞質に運搬されると、エロンゲーションファクター２の ＡＤＰ−リボシル化を触媒し、蛋白質合成の阻害を生じ、続いてＩ　Ｌ−２−リ セブター保持細胞の死滅を引き起こす。

本発明の他の観点及び利点は好ましい態様に関する以下の記載及び請求の範囲の 記載から明らかにされる。

好ましい態様の説明 先ず図面を説明する。

図面 図は好ましい原核細胞翻訳コドンが採用されたＩＬ−２コ一ドＤＮＡ配列を示し 、番号は本明細書で既に説明した番号規約による。

Ｈミュータント　、　コード　る゛　−の゛６アミノ酸７４から７９は、合成Ｉ 　Ｌ−２遺伝子のＸｂ　ａＩ　／Ｎｏ　ｔ　Ｉフラグメント内に含まれる（図を 参照）。８種の削除ミュータントの各々について、慣用技術にしたがう自動ＤＮ Ａ合成装置を用いて、１〜５アミノ酸をコードするＤＮＡを削除したＸｂ　ａｌ 　／Ｎｏ　ｔ　Ｉフラグメントを合成する。オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を 表１に示す。

各Ｘｂ　ａｌ　／Ｎｏ　ｔ　Ｉフラグメントは、５゛末端に１／２のＸｂａＩ部 位、モして３゛末端に１／２のＮｏｔＩ部位を有する二つの相補鎖として合成す る。これらの合成りＮＡを変性条件下のポリアクリルアミド−尿素ゲルで精製し 、慣用方法により相補鎖をアニールする。アニールしたＤＮＡを、図に示す合成 ＩＬ−２遺伝子を含む発現プラスミドｐＤＷ１５　（Ｗｉ　１１　ｉ　ａｍｓら 、１９８７．Ｐｒｏｔ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　１：４９３）にライゲートす る。ライゲートした反応物を慣用技術によって適当なＥ、ｃｏｌｔ宿主に形質転 換する。

形質転換体を、制限酵素Ｄｄｅｌを用いてミニライゼートＤＮＡの制限酵素分析 によりスクリーニングする。これらのＩ　Ｌ−２ミユータントのＤｄｅＩ制限酵 素分解プロフィールは、該削除ミュータントのＸｂ　ａＩ　／Ｎｏ　ｔ　Ｉフラ グメント内のＤｄｅ１部位の削除のために、非削除ＩＬ−２のものとは異なる。

このＩＬ−２削除ミユータントのＤＮＡ配列をＳａｎｇｅｒらのグイデオキシ法 （１９７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７４：５４６３）を 用いて確認する。

ＩＬ−２／ジフテリア毒素融合蛋白質をコードする遺伝子は、次のようにして標 準的組換えＤＮＡ技術で造成される。融合遺伝子のＩＬ−２部分は、ｐ　ＤＷＩ ５由来のＩＬ・−２削除ミユータントのＳ　ｐ　ｈｌ　／Ｈｉ　ｎ　ｄｌｌ！フ ラグメント内に含まれている。このＤＮＡフラグメントを、融合物のアミノ酸残 基Ａ　１　ａ４８６までの（これを含む）ジフテリア毒素関連部分を含有する５ ｐｈｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドｐＡＢＭ６５０８　（Ｂｉｓｈａｉら、 １９８７．Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ、ｏｌ、１６９：５１４０）にライゲートする。

このＤＮＡを適当なＥ、ｃｏ１ｉ宿主に形質転換し、そして慣用技術で、ルリア ブロス（選択の為に適当な抗生物質を含む）上にブレーティングする。形質転換 体はミニライゼートＤＮＡのＤｄｅｌ制限酵素分析およびウェスタンプロット分 析により、次のようにスクリーニングする。

文ｘ７．９−≦乙）Ｌｈ公析 全バクテリア細胞ライゼートを、ＩＬ−２／毒素蛋白質の生産に関して、５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０．Ｎａｔｕｒｅ 　２２７：６８０）で分析する。蛋白質をナイロン膜上に電気的にプロットし、 慣用技術でイムノプロット分析を行う。期待される構築物の確認は、抗−ジフチ リア毒素（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、）ｏント、オンタ リオ、カナダ）及びモノクローナル抗−ＩＬ−２抗体の両者に対する交差反応性 の陽性により、並びに既知ＩＬ−２／毒素標準品と発現された蛋白質の大きさの 比較により行う。この構築物の最終的確認は、ＩＬ−２／毒素遺伝子のＤＮＡ配 列分析により行う。

細鳳責性Ωヱヱ竺歪 表ＩＴを参照すると、Ｃ９１／ＰＩ細胞Ｃ高親和性ＩＬ−２リセブター含有細胞 ライン）を、９６穴の■底プレート（Ｎｕｎｃ、　ロスキルド、デンマーク）を 用いて、１００μｍの完全培地中で１０６／ウエルの細胞密度でシードした。完 全培地中のＩＬ−２−毒素を種々の濃度（１０−”Ｍから１０−’Ｍ）で添加し た。

培地単独で培養した細胞をコントロールとして含めた。５％Ｃ０２雰囲気中で３ ７℃で１８時間インキュベートした後、プレートを１７０Ｘｇで５分間遠心分離 し、培地を除去し、そして２．５μｃｉ／ｍｌの（”Ｃ）−０イシン（Ｎｅｗ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、ボストン、ＭＡ）を含むロイシン不含培地（ ＤＭＥＭ　Ｓｅｌｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｇｔｂｃｏ）１００μｍと交換した。細胞 を次に３７℃で９０分間インキユベートシ、そしてセルハーベスタ−（Ｓｋａｔ ｒｏｎ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）を用いて、グラスファイバーフィルターに集 めた。フィルターを洗浄し、乾燥しそして標準的方法によりカウントした。全て の測定は５回の繰り返しで行った。Ｉ’　Ｃ５０は未処理コントロールに比較し て、蛋白質合成を５０％抑制するために要求されるＩＬ−２の濃度を示す。

闘 ｇ二１　二コ　璽コ　冒３　冒コ　璽１　ジコ　冒１　二コブラスミド　アミノ 酸 ｌ　Ｃ９１ＰＬ　ＩＣ５０ ｐｓ１１３３　φ７４　６　ｘ　１０−’Ｍｐｓ　Ｉ　１３４　φ７５　１ＸＩ Ｏ−”Ｍｐｓ１１３６　φ７８　５Ｘ１０−１１Ｍｐｓ　Ｉ　１３７　φ７９　 ２Ｘ１０−０Ｍ２Ｘ１１４３　φ７５−７７　２Ｘ１０−”　Ｍｐｓ１１４１　 φ７４−７８　１ＸＩＯ−”　Ｍｐｓ１１４５　φ７６−７８　２ｘｌＯ−”　 ＭｐＳ　Ｉ　１５０　φ７６−７９　７ｘ１０１１Ｍ（ｐｓ１１２９　削除無し 　典型的には他の態様 他の態様は下記請求の範囲に記載されている。例えば、削除ミュータントＩＬ− ２分子は、毒素とのハイブリッドとしての使用の他に、単独で用いることができ 、削除体は二つの場合のいずれにおいても蛋白分解に対する有利な耐性を与える ことが可能である。さらに、ジフテリア毒素以外の毒素、例えばシュードモナス のエクソトキシンの酵素活性部分をミュータントに結合させることもできる。

５篇四　酉＝　ミ　Ｇ吊　藁 ｍ１ｌｌ　＜：１句−０ １−１ｃｅ　＜　＜ｅｌｏＣ：）　−ｃＪＣＪ−１）く 、！協目　β藁　足　酉＝　足 Ｃ１ａ　（Ｊ　ロ　ロコｅ１００　ロｈｃａｕＨ−＜：　’５　：＝品ご　コ謂 ８　と ｔｓｒｕ　（Ｊ の１）＜−一ト Ｈ−＜　＜（社）　Ｃ５Ｓ閃　く ；認　３　＝ａ：　＝屈　整 品Ｅ：ｅｉＯ：　０−！：　３　簿旙“む−ｕｕｕ　−＋ｏａｏ　（！ｌ　＋＜ ｃａｕｕ＝ａ七七　！認　１　１３　兵 ｑ−一←　Ｑ（社）Ｑ　〉聞　ロ 国際調査報告 一１伽−＾−−−陶、π側ん（５ Ｉｎｌａ＋ｎ＠１ｍｎ＋１Ａｏｐ引＋ａ＋１６−Ｎｏ、ＰＣＴ／ＵＳ９０１０４ ２５８

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ酸残基７４のみが削除されたミュータントＩＬ−２分子。
2. ２．アミノ酸残基７４−７８のみが削除されたミュータントＩＬ−２分子。
3. ３．アミノ酸残基７６−７８のみが削除されたミユータントＩＬ−２分子。
4. ４．アミノ酸残基７６−７９のみが削除されたミュータントＩＬ−２分子。
5. ５．アミノ酸残基７５のみが削除されたミュータントＩＬ−２分子。
6. ６．アミノ酸残基７８のみが削除されたミュータントＩＬ−２分子。
7. ７．アミノ酸残基７５−７７のみが削除されたミュータントＩＬ−２分子。
8. ８．アミノ酸残基７９のみが削除されたミュータントＩＬ−２分子。
9. ９．請求項１ないし８のいずれか１項記載のミュータントＩＬ−２分子をコード するＤＮＡ配列。
10. １０．発現ベクター内に含まれる請求項９記載のＤＮＡ配列。
11. １１．請求項１０記載の発現ベクターを含む細胞。
12. １２．天然のＩＬ−２をコードするＤＮＡよりも原核細胞により好まれる翻訳コ ドンを含む合成配列である、請求項９記載のＤＮＡ配列。
13. １３．請求項１２記載の細胞を培養し、そしてミュータントＩＬ−２を回収する ことよりなる、ミュータントＩＬ−２の製造方法。
14. １４．細胞毒性を発揮するために十分に大きいが、一般的真核細胞に対する結合 を生じることができない程度に小さい毒素分子の部分に共有結合した、請求項１ ないし８のいずれか１項記載のミュータントＩＬ−２分子。
15. １５．毒素分子がジフテリア毒素であり、そしてジフテリア毒素の前記部分が該 ミュータントＩＬ−２分子にペプチド結合でつながっている、請求項１４記載の 分子。