JPH04501808A - ハイブリッド分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ハイブリッド分子 光■の背景 本発明の分野はサイトカインハイブリッド分子である。 ヘマトポエチンリセプターのスーパーファミリー（Ｉｄｚｅｒｄａら、Ｊ、Ｅｘ ｐ、Ｍｅｄ、１７１　：　８６１−８７３．１９９０）は、サイトカインリセブ ターのフッ・ミリ−であり、その細胞外ドメインは互いに有意な程度のアミノ酸 ホモロジーを示す。これらのりセブタ−（インターロイキン２　（ＩＬ−２）ｐ ７５リセブターも含む）は、ヘマトポエチン細胞（リンホイド細胞およびミニロ イド細胞の両者を含む）の表面上に存在し、ＩＬ−２、インターロイキン３ＣＩ Ｌ−３）、インターロイキン４　（Ｉ　Ｌ−４）　、インターロイキン６　（Ｉ 　Ｌ−６）　、エリスロボエチン（ＥＰＯ）およびプロラクチンのようなサイト カインと結合してその細胞増殖効果に介在する能力を有する。ヘマトポエチンリ セブターのスーパーファミリーのメンバーに結合するサイトカインを、本明細書 中では集合的に「ヘマトボエチンリセブタースーパーファミリーサイトカイン」 と呼ぶ。 ＩＬ−２が特異的にＩＬ−２リセブターを持つ細胞（例えばアログラフトで活性 化されたヒトＴ−細胞やある種の白血病のリンパ球）に結合する能力を有するこ とから、細胞表面に特異的にＩＬ−２リセブタ−（ＩＬ−２Ｒ）を持つ細胞を毒 性効果の標的とする毒素−ＩＬ−２ハイブリツド分子の構築が試みられた。その ようなハイブリッド分子のあるものは、ＩＬ−２と毒素との化学結合により構築 されたが（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、５ｃｉｅｎｃｅ、ｐｐ、２３８，５３６（ １９８７））、最近、組換えＤＮＡ技術を適用して、ジフテリア毒素／Ｉ　Ｌ− ２ハイブリツド（米国特許４，６７５，３８２）およびシュードモナスの外毒素 Ａ／ＩＬ−２ハイブリッド（Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕｍ−Ｇａｌｓｋｉら、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５：１９２２−１９２６．１９８ ８）のような遺伝子ハイブリッド構築物が製造され、その構築においては、毒素 蛋白質が本来もっている細胞特異的リセブター結合ドメインがＩＬ−２に置きか えられている。天然ジフテリア毒素および天然シュードモナス毒素は、感受性細 胞の表面上のある種のりセブターに結合して細胞の膜を通過し、細胞内に入ると 必須の蛋白質合成因子を不活性化して蛋白質合成を阻害し、細胞を殺す。組換え 毒素−ＩＬ−２ハイブリツドによる細胞の殺滅のメカニズムも同様であるが、毒 素自身の細胞結合ドメインがＩＬ−２と置き換えられ、そのためハイブリッド毒 素がＩＬ−２−リセブターを有する細胞に選択的に結合する。 このようなＩＬ−２−特異的リセブターの性質は、いくつかの研究のテーマであ る（例えば、Ｒｏｂｂら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１５４：１４５５−１４６４． １９８１；Ｔｓｕｄｏら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。 ８３：９６９４−９６９８．１９８６．およびＴｅｓｈｉｇａｗａｒａら２Ｊ。 Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６５：２２３−２３４．１９８７）、二つの異なるＩ　Ｌ− ２−結合リセブター分子である５５キロダルトンのグリコプロティン（ｐ５５ま たはＴａｃ）および７５キロダルトンのグリコプロティン（ｐ　７５）がヒトリ ンパ球上に存在すると報告されており、これらは単独でもしくはヘテロダイマー のりセブター複合体としてＩＬ−２に結合する（Ｙａｇｆｔａら、Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、４９．印刷中、１９８９）。ＩＬ−２結合分子が９５５単 独であるときには、比較的低親和性で（Ｋａ　＝１０−　＠Ｍ）　、ｐ７５単独 であるときには中間的親和性で（Ｋ、＝１０−”Ｍ）　、そしてヘテロダイマー 型（ｐ７５＋ｐ５５）であるときには比較的高親和性で（Ｋ、＝１０−１１Ｍ） ＩＬ−２に結合する。Ｈ，−２がｐ７５７５リセブターに結合するためには、Ｉ Ｌ−２のＮ末端アミノ酸残基、具体的にはＡＳｐｔｏが必要である（Ｃｏｌｌｉ ｎｓら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ、８５ニア７０９− ７７１３．１９８８）。 ヘテロダイマー性のｐ７５＋ｐ５５　（高親和性）型のＩＬ−２リセブターを有 する細胞の蛋白質合成を５０％阻害するためには、ピコモル量のジフテリア毒素 ／ＩＬ−２組換えハイブリッドで十分であるが、ｐ５５　（最低親和性）または ｐ７５（中親和性）型のリセブタ゛−を発現する細胞は同じシフ７−リ７毒素／ ＩＬ・−２ハイブリツドの蛋白質合成阻止効果に抵抗性であることが知られてい る（Ｗａｔｅｒｓら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２０ニア８５−７９ １．１９９０）。 これとは異なり、シュードモナス外毒素Ａ／ＩＬ−２組換えハイブリッドは、ヘ テロダイマー性の高親和性リセブターだけでなく、低親和性および中観和性のり セブターザブユニットによっても細胞内に取り込まれることが示された（Ｌ。 ｒｂｅｒｂａｕｍ−Ｇａｌｓｋｉら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３：１８６ ５０−１８６５６．１．９８８）。これらの構築物において、シュードモナス外 毒素は、１Ｌ−２のカルボキシ末端を介してＩＬ−２に結合している。 最近、ヘマトボエチンリセブター・スーパーファミリーのサイトカインのすべて が、異なる結合親和性の複数リセブターを有することが示された（例えば、ｒｔ Ｏｈら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４７：３２４−３２７，１９９０；およびＳａｗｙ ｅｒ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２ニア７−８５．１９ 本発明はその概要において、ヘマトボエチンリセブタースーパーファミリーサイ トカイン（またはそのようなサイトカインの高親和性リセブターに結合すること のできるフラグメントまたは類縁体）を含み、該サイトカインのアミノ末端で一 つの化学成分に共有結合しているハイブリッド分子に関するものであり、上記化 学成分は５、ハイブリッド分子が上記サイトカインに対する低親和性リセプター の介在により処理される程度を低親和性リセブターによるサイトカインの処理よ り低めることを可能とするが、但し、上記化学成分は、参照により本明細書に含 まれるＪｏｈｎ　Ｒ，Ｍｕｒｐｈｙの米国特許４，６７５，３８２に記載されて いるジフテリアのトランスロケーションドメインを含むジフテリア毒素のフラグ メントではない。サイトカインの低親和性リセブターとは、該ナイト力インの高 親和性リセブター以外の、該サイトカインを処理する能力を持つ全てのりセブタ ーである。「処理」とは、そのようなサイトカインリセブターの一つがサイトカ インと結合し、およびリセブターと結合した該サイトカインが細胞内小胞中また は細胞内へ取込まれることを意味する。（本発明のハイブリッド分子が取り込ま れないものであるときは、「処理」とは単に、サイトカインリセブターの一つに よりサイトカインが結合されることを意味する）。従って、サイトカイン分子が 該サイトカインに対する低または中−親和性のりセブターに結合し、そしてさら に細胞によりリガンド／リセプクー複合体として（例えば細胞内小胞中に）取り 込まれたとき、サイトカイン分子は該サイトカインに対する低親和性リセブター により「処理された」ということができる。本発明のハイブリッド分子のそのよ うな処理の程度を天然に存在するサイトカイン分子の処理程度と定量的に比較す るには、例えば、一つの型のりセブターを有する細胞により取り込まれる各分子 の量を測定することにより行うことができる。ハイブリッド分子が高および低親 和性リセブターを識別する能力は、高親和性リセブターのみを持つ細胞による分 子のを込み員を低親和性リセブターのみを持つ細胞による取込み量と比較するこ とにより測定できる：リセブター型を有意程度に識別する能力を持つハイブリッ ドは、本明細書に記載する目的に有用である。 サイトカイン分子のフラグメントとは、天然に存在する分子のある部分に厳密に 相当するがその天然分子の全てよりは短いアミノ酸配列を有するポリペプチドで あり、例えば天然分子を蛋白質分解酵素で消化する方法、化学合成法または組換 えＤＮＡ技法で作成できる。サイトカイン分子の「類縁体」とは、一つ以上の場 所でアミノ酸の置換、付加、および／または削除を有する点で天然サイトカイン とは異なるポリペプチドである：例えば、サイトカインの類縁体は、天然サイト カインの少なくとも半分の長さを有し、天然分子のある部分と少なくとも８０％ の配列ホモロジーを有する連続セグメントを含むポリペプチドを含む。アミノ酸 の置換は保存的であっても非保存的であってもよく、そして例えば該ポリペプチ ドから蛋白質分解酵素に感受性の部位を削除するように設計してもよい。〔保存 的という用語は、置換されたアミノ酸アシル残基が置換前の残基と化学的に類似 している（例えば、酸性、塩基性、疎水性、芳香族である）ことを意味し、例え ばバリンをロイシンに置換することを意味する〕。そのような類縁体は組換えＤ ＮＡ技術により慣用手段で得られるか、またはこの分野の当業者に知られた他の 任意の方法で得られる。そのようなフラグメントまたは類縁体が得られれば、い ずれも、それらを派生させた元のサイトカインの高−親和性および低−親和性の りセプターを介して処理される能力を調べることができる。天然存在サイトカイ ンに匹敵する性質を本発明のハイブリッド分子に取込むことができる。 好ましい態様において、サイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ− ６、ＥＰＯおよびプロラクチンから選択され、化学成分は、ハイブリッド分子の サイトカイン部分による低−親和性リセブターへの結合を阻害し、 化学成分は、Ｘ線に対して不透明な部分であり、螢光部分であり、放射活性部分 であり、抗体分子、リシン、ストレプトアビジン、ゲラニン（ｇｅｌａｎｉｎ） またはフェリチンのようなポリペプチド（ペプチド結合でつながった二つ以上の アミノ酸と定義される）あるいはそのようなポリペプチドの酵素学的に活性なフ ラグメントもしくは類縁体であり、 共有結合はペプチド結合であり、そＬ７てハイブリッド分子は高−親和性リセブ ターを持つ細胞の増殖速度に影響することができるものである。 本発明のハイブリッド分子は、選択的に興味対象のサイトカインに対する高−親 和性リセブターを有する細胞に、該細胞をサイトカイン（または該高−親和性す セブターに結合することのできるフラグメントもしくは類縁体）のアミノ末端に 共有結合させた一つの部位を含むハイブリッド分子に暴露して、該部位を選択的 に結合させる方法に用いることが出来る。好ましい態様においては、該部位は標 識を有し、該方法は高−親和性リセプターまたは高−親和性リセブターを持つ細 胞の画像を形成するために用いられ、あるいは該部位は鉄と複合体を形成した分 子であり、該方法は高−親和性リセプターを比較的多く持つ細胞をそのような高 −親和性リセブターをより少なく持つものから分離するために用いられ、あるい は該ハイブリッド分子はそれが結合する細胞の増殖速度を減少させることができ 、該方法は高−親和性リセブターをもつ細胞の過剰生産により特徴づけられる症 状を治療するために用られる。 本発明のハイブリッド分子はまた、興味対象のサイトカインに対する高親和性リ セブターを持つ細胞を、集団中のある細胞がそのような高−親和性リセブターを 持たない細胞集団から選択的に単離するための方法に用いることができ、その方 法は、（１）ハイブリッド分子を固定化し、（２）細胞集団を高−親和性リセブ ターが固定化ハイブリッド分子に結合することを可能にする条件下で、固定化ハ イブリッド分子に接触させ、そして未結合細胞を結合細胞から分離することより なる。この方法は体液または組織からそのような高−親和性リセブターを有する 細胞を除去するために使用でき、或いはこのような方法に結合細胞を固定化ハイ ブリッド分子から遊離させる工程を含ませて、体液または組織から高−親和性リ セブターを有する細胞を単離するために使用することもできる。 化学成分がポリペプチドであるハイブリッド分子は、例えば興味対象のサイトカ イン（またはその高−親和性リセブターー結合性フラグメントもしくは類縁体） をコードするＤＮＡ配列に融合したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む 組換えＤＮＡ分子を用意し、該組換えＤＮＡ分子を適当な発現システムに導入し 、そしてこの組換えＤＮＡ分子を発現させることにより製造される。 本発明のストーブ！・アビジン含有ハイブリッド分子は、興味対象のサイトカイ ンに特異的な高−親和性リセブターのあるいはそのような高−親和性リセブター を有する細胞の細胞集団中の高−親和性リセプターの画像形成方法のために、（ ａ）高−親和性リセプターを（１）高−親和性リセブターに結合する／１イブリ ・ソド分子の量と（２）細胞集団中の全てのより低い親和性リセブターに結合す る量との相違を実質的に最大化するのに十分な量のハイブリッド分子に暴露し： （ｂ）リセブター結合ハイブリッド分子をビオチンに共有結合させた標識プロー ブに暴露し；そして（ｃ）リセブターと結合したハイブリッド分子に結合した標 識プローブを検出することにより、用いることができる。 本発明は、そのＮ末端で化学成分に結合した時、その低−親和性リセブターを介 してサイトカイン自体よりも低い程度に処理され、高−および低−親和性リセブ ターの識別力が高まるという、ヘマトポエチンリセブタースーノく−ファミリー サイトカインの各々の能力を利用する。本発明の１１イブリッド分子によるリセ プター型のこの増大した識別ソノは、高−親和性リセブターを欠失する細胞を実 質的に除く高−親和性リセブターを有する細胞の選択的な標識、単離、除去また は殺滅を可能にし、従って、骨髄またはリンパ細胞が重要要素として関与する種 々の症状の研究１診断および治療の重要な手段を提供する。例λば、サイトカイ ン部分にＩＬ−２を有する本発明のハイブリッド分子は、活性化されたＴ細胞の 高−親和性リセブターを標的とし、従って移植拒絶反応、自己免疫疾患およびあ る種のリンパ系の癌等への適用に有用であろう。 本発明の他の態様および利点は好ましい態様に関する以下の説明および請求項の 記載から明らかであろう。 好圭旦■聾梯９説■ ４、

【図面の簡単な説明】

図面 第１図はプラスミドｐＤＷ１５を５ｐｈｒで消化した後の、該プラスミドのＩＬ −２遺伝子部分のＤＮＡコード配列および相当するアミノ酸配列の配列図である 。 第２図はＣＲＭ１９７／ＩＬ−２組換え遺伝子を有するプラスミドＰＳ１１３０ の段階的構築を説明する工程図である。 第３図（ａ）は、リシンＡ／ＩＬ−２ハイブリッド遺伝子の構築の組換えＤＮＡ プラスミド中間体の模式図である。 第３図（ｂ）は、リシンＡ／ＩＬ−２ハイブリッド遺伝子を有し、Ｅ、ｃｏｌｉ 中での発現に適する組換えＤＮＡベクターの模式図である。 第４図（ａ）は、ストレプトアビジン／ＩＬ−２／％イブリッド遺伝子構築の組 換えＤＮＡプラスミド中間体の模式図である。 第４図（ｂ）は、ストレプトアビジン／ＩＬ−２／％＃ブリッド遺伝子を有し、 Ｅ、ｃｏｌｉ中での発現に適する組換えＤＮＡベクターの模式図である。 ＩＬ−２ハイブリツドおよび　然ＩＬ−２によるＩＬ−２リセ　ターの−９本発 明はＩＬ−２のＮ末端へ化学成分を付加すると、Ｔ−細胞上の中−親和性リセプ ター（ｐ　７５）による該ハイブリッドのＩＬ−２部分の処理が阻害され、これ はおそらくｐ７５リセブターによって該ノ＼イブリッドの化学成分部分にひき起 こされた構造上の歪みによるものである、との観察に根拠を置いている。（１） 各々が三つの型のＩＬ−２リセプターの一つのみを有する三つの細胞ライン上の 結合部位から、１２５沃素標識ＩＬ−２の５０％を置換するのに必要な、ジフテ リア毒素／ＩＬ−２ハイブリッド分子のモル濃度を、同じ置換を起こすのに必要 なＩＬ−２のモル濃度と比較するアッセイを用いて、ｐ５５リセブター分子のみ を有する細胞ライン上では標識ＩＬ−２の置換のために１０倍多くのＩＬ−２／ ）イブリッドが必要とされるが、一方、ｐ７５リセブターのみを有する細胞にお いては標識ＩＬ−２の５０％置換を達成するために必要なＩＬ−２の濃度よりも １００倍高い濃度のハイブリッド分子が必要であることが見出された。高−親和 性リセブタ−（ｐ７５＋ｐ５５）を有する細胞は、５０％置換を達成するために ＩＬ−２に比べて約１００倍高濃度のＩＬ−２ハイブリツドを要求した。したが って、（ａ）ｐ５５リセブターに対するハイブリッド−ＩＬ−２の親和性は、同 すセブターに対するＩＬ−２の親和性と１桁程度違う強さであり、（ｂ）ｐ７５ リセブターに対するハイブリッド−ＩＬ−２の親和性は、同すセブターに対する Ｉ　Ｌ−２の親和性の約１％であり、そして（Ｃ）高−親和性リセブタ−（ｐ７ ５＋ｐ３５）リセブターに対するハイブリッド−ＩＬ−２の親和性は、同すセブ ターに対するＩＬ−２の親和性の約１％である。 これらの結合性データは、高−親和性リセブターのみを有する細胞および低−親 和性ｐ７５リセブターのみを有する細胞に対するＩＬ−２とＩＬ　２ハイブリツ ドの間の結合性に僅かな相違しか存在しないことを示唆するが、該化学成分がＩ Ｌ−２のＮ末端に結合する総合結果はハイブリッドリガンドの処理においては３ ００〜１０００倍変化し、蛋白質合成の半最大阻止についてのＩＣｓ。で測定し たこの例では、低−親和性リセプターを持つ細胞よりも高−親和性リセブターを 持つ細胞で３００〜１０００倍効率的であった。 上記の実験結果は、ＩＬ−２のアミノ末端に化学成分を付加することにより生じ るリガンド／リヤブタ−相互作用の主要変化は、ｐ７５リセブターに関して生じ ることを示唆する。ｐ７５リセブターが、ヘマトボエチンリセブタースーパーフ ァミリーサイトカインの全てのりセブターのある種のサブユニットと高い配列ホ モロジーを共有する事実は、これら任意のサイトカインのＮ末端にポリペプチド のような化学成分を存在させれば、該ハイブリッド分子がＩＬ−２リセブターの ｐ７５サブユニットとホモロガスなサイトカインのりセブターのサブユニットに より処理される（即ち、結合および取込み）ことが、おそらく立体障害のために 阻害され、それにより本発明のハイブリッド分子による高−親和性リセブターと 低−親和性リセブターの識別を、天然サイトカインまたはＩＬ−２のｐ７５結合 ドメインに類縁の結合ドメインの近傍に立体障害を導入していないサイトカイン ハイブリッド構築物に比べて著しく高めることを可能にするであろう。この識別 レベルの向上は多くの方法で利用でき、そのいくつかを以下に記載する。 塞施雌よＣＲＭ１９７／ＩＬ−２組換え融合遺伝子の構築および発現これらの融 合体（第１図）の構築に用いたＩＬ−２遺伝子は、プラスミドｐＤＷ１５（第２ 図）　（Ｗｉ　１１　ｉ　ａｍ、ｓら、Ｎｕ、ｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１６： １．０４５３−１０４６７．１９８８）から得た。このプラスミドは合成型のＩ Ｌ＝２遺伝子を有し、この遺伝子はＥ、ｃｏｌｔ、７Ｍ１０ｉ中にクローニング すると、同じＥ、ｃｏｌｔ株にクローニングされた天然ｃＤＮＡ配列に比べて約 １６倍の率て１Ｌ−２蛋白質を発現する。 標準的ＤＮＡクローニング技術を使用した。プラスミドをＣａＣｌ、形質転換法 によってＥ、ｃｏｌｉに導入し、アルカリ溶解法で単離し、ＣｓＣｌ密度勾配遠 心分離で精製した（マニアチスら、Ｍｏ１ｅｃ＋目ａｒ　Ｃｌｏｎｆｎｇ：Ａ１ 、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏ１．ｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂ。 ｒ　ｒ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８２）　。ｐＤＷ１５の５ｐ ｈｌ部位に遺伝子融合をおこし、融合遺伝子のＩＬ−２ドメインがＩＬ−２の１ ３３アミノ酸とそのアミノ末端に５ｐｈｙ部位によりコードされる一つの付加的 アミノ酸をコードするようにした（第１図）。 構築の方法は第２図に示した。ジフテリア毒素がα−メラノサイト−刺激ホルモ ンに結合したＮ末端４８５アミノ酸をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＡＢ Ｍ６５０８　（Ｂｉｓｈａｉら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：５１４０− ５１５１．１９８７）を、ＨｉｎｄｌＩｒで完全にそして５ｐｈｌで部分的に消 化し；６ｋｂの５ｐｈｌ−Ｈｊｎｄｌｌｌベクターフラグメントをゲルで精製し て、ｐＤＷ１５からの０．　５ｋｂの５ｐｈｌ　−ＨｉｎｄｌＩｒ　ＩＬ−２− 遺伝子含有フラグメントに連結させて、ｐＡＢＩ６５０８と命名したプラスミド を得た。ｐＡＢＩ６５０８をＡｃｃｌおよびＸｍｎ１で消化して得られた５、７ ｋｂのベクターフラグメントをゲルで精製して、プラスミドｐβ１９７　（Ｂｉ ｓｈａｉら）の０゜８ｋｂＡｃｃｌ−Ｘｍｎｌフラグメントに連結させ、ｐｓ１ １３０と呼ぶプラスミドを得た。ｐβ１９７は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェ ラーゼ活性を欠失しそのために毒性のないジフテリア毒素のＧｌ）’ｓｚ→Ｇｌ ｕｓ□ミスセンス変異体の全長（５３５アミノ酸）であるＣＲＭ１９７の遺伝子 を担っている（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４８：３８３８− ３８４４．　ゴー９７３）。このこのミスセンス変異は、ｐβ１９７の０．　８ ｋｂのＡｃｃＩ−Ｘｍｎｌフラグメントで生じ、従ってｐｓ１１３０中にも存在 する。 Ｅ、ｃｏｌｉ中でのｐｓＩ］、３０の発現はＢｊｓｈａｉ　（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ ｊｏｌ、１９８７）に記載されたようにして誘発し；ＣＲＭ１９７／ＩＬ−２遺 伝子産物はアフィニティークロマトグラフィー（Ｗｆ　１１　ｉ　ａｍｓら、１ ９８８）および引き続＜ＨＰＬＣ分子篩クロマトグラフィーで精製した（Ｍｅｔ ｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９１：１３７−１９０；１９８３）。 大施例’２　ＩＬ−２リセブター識別の生物学的アッセイ組換えヒトＩ　Ｌ−２ （ｒ　Ｉ　Ｌ−２）の５０マイクログラムを、エンザイモビーズ（ｅｎｚｙｍｏ ｂｅａｄｓ）（バイオラッドラボラトリーズ、リッチセント。 ＣＡ）を用いて、製造元の指示書に従って、酵素法で沃素化した。この反応には １ミリキユリーのＮ　ａ１４５１（デュポン−ＮＥＮ、ボストン、ＭＡ）を用い たが、これは制限濃度の沃素の使用であり、ｒＩＬ−２の８分子に対して１分子 の沃素の使用に相当する。反応を室温で５分間続け、Ｎ　ａ　Ｎ　ｓおよびＮａ Ｉの添加により停止させた。ウシ胎児血清（Ｆｅ２；Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を最終濃度１０％に添加して、混合物を 、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ＣｐＨ７，４）（Ｇｊｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａ ｎｄ、ＮＹ）、２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１００単位／ｍＬのペニシリ ン、１００　μｇ　／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および１０％Ｆ ＣＳ　（Ｈｙｃ　１ｏｎｅ）を添加したＲＰＭＴ１６４０培地で平衡化したｌｌ １１１のセファデックスＧ−１０でクロマトグラフィーした。 放射標識ＩＬ−２結合アッセイは実質的にＳｍ１ｔｈおよび共同実験者（Ｒ。 ｂｂらＨＴｅｓｈｉｇａｗａｒａら）により記載されたようにして行った。細胞 を収穫し、そして１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭ１１６４０培地で３回洗浄した 。全ＩＬ−２結合を測定するために、５Ｘ１０５細胞を２５−　ＨＥＰＥＳ　（ ｐＨ７，４）　（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）、２ｍＭ　グ ルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌの ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ＦＣ８（Ｈｙｃ　１ｏｎｅ）を 添加したＲＰＭＩ　１６４０培地（全量１５０μｍ）中で、３７℃で３０分間既 知濃度の１２５１　。 ＩＬ−２（一般にＩ　Ｘ　１０−’Ｍ）に暴露した。”Ｉ−ｒｌＬ−２をそのリ セブターと置換するために必要なｒＩＬ−２またはＰＴ／ＩＬ〜２を測定するた め、徐々に増加する濃度の未標識ｒＩＬ−２またはＰＴ／ＩＬ−２（０，５ない し２０００倍モル過剰）を、各試験管にＩＸ１０＝Ｍの”Ｉ−ｒＩＬ−２の存在 下に添加し、そして未標識の競合体の各濃度における全結合の百分率を測定した 。結合反応の停止は、４００マイクロリツターのミクロ遠心管（ベックマン・イ ンストルメント）中の８０％５５０フエニルフルード（ｐｈｅｎｙｌ　ｆｌｕｆ ｄ）（Ｄｅｘｔｅｒ　Ｈｙｓｏｌ、０１ｅａｎ、ＮＹ）および２０％パラフィン オイル（シグマ、セントルイス、ＭＯ）のオイル混合物中で細胞を遠心分離して 行った。遊離のりガントを含むオイル及び培地を遠心管中に残して、細胞ベレッ トをミクロ遠心管から切り出した。結合した放射活性を代表する細胞ペレットお よび遊離リガンドを代表するオイル／培地上清を、ベックマンガンマカウンター でカウントし、細胞と共にベレット中に集まった全放射活性の百分率を計算した 。全てのアッセイは二連で行った。 実施１　リシンＡ／ＩＬ−２、組換え融合遺伝子の構築と発現および得られたハ イブリッド蛋白質の利用 ＤＮＡクローニング、細胞形質転換およびプラスミド単離の標準的方法（例えば 、マニアチスらにより記載されたような）が、次の構築物の実施に使用できるリ シンｃＤＮＡはＨａｌｌｆｎｇら（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１３：８０１ ９−８０３３．１９８５）またはＬａｍｂら（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ４８：２６５−２７０．１９８５）に記載されたようにして調製した。ＢａｍＨ ＩおよびＨａｅｒｌｉで消化したのち、リシンｃＤＮＡの８５６ｂｐのＢａｍＨ ｌ−ＨａｅＩＩＩフラグメント（リシン遺伝子の５′末端、シグナル配列および １から２７２までのりシンのアミノ酸をコードする）を、アガロースゲル電気泳 動で単離した。 プロテアーゼ感受性領域（Ｌ　ｙ　ｓ　Ａ　ｒ　ｇ）および５ｐｈｌ部位の半分 （ＣＡＴＧ）をコードする次の未ホルホリル化合成りＮＡオリゴマー二５°　Ａ ＡＧＣＧＴＣＧＧＣＡＴＧ　３゜３“　ＴＴＣＧＣΔＧＣＣ５゜ は、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ　７５００ＤＮＡ合成装置により同装置の製造元の指示に 従って、標準的β−シアノエチルホスホルアミダイト化学合成法により合成した 。この合成オリゴヌクレオチドをゲル電気泳動で精製し、相補ストランドを互い にアニールし、リシン遺伝子フラグメントのＨａｅＩＩＩプラント末端に連結し た。このオリゴマーの配列は、（１）Ｓｐｈｉ部位の対応半分を持つＩＬ−２遺 伝子にリシン遺伝子の融合を可能にするため、および（２）細胞による毒素分子 の取込みに際し７て、伺加されたプロテアーゼ−感受性領域での蛋白分解開裂に より、リジンＡ／ＩＬ−２ポリペプチドから酵素的に活性なリジンＡの遊離を可 能にするために選択された。 次に、リシンコード配列の上流の適当なスポットにおいて、残り半分の５ｐｈｌ 部位を挿入するため１ご、上記構築物をＦｎｕＤＩ！（またはＴｈａｉ　）で消 化１゜、生じた約７４０ｂｐのＦｎｕＤＩＩ−（ＨａｅｌｌＩ　／５ｐｈｌ　） フラグメントを単離し、そして下記の未ホスホリル化合成オリゴヌクレオチドの ＦｎｕＤＩＩプラント末端に連結した： ５’　ＣＣＡＴＣＧＣＴ　ＡＴＡ　ＴＴＣＣＣＣＡＡＡ　ＣＡＡ　ＴＡＣＣＣＡ 　ＡＴＴ　ＡＴＡ−３’　ＧＴＡＣＧＧ　ＴＡＣＣＧＡ　ＴＡＴ　ＡＡＧ　ＧＧ Ｇ　ＴＴＴ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＧＧＴ　ＴＡＡ　ＴＡＴ−コード対象＋　ｆＭｅ ｔ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌ ｅ　ｌ１ｅ−（続き）：　−ＡＡＣＴＴＴ　ＡＣＣＡＣＡ　ＧＣＧ　ＧＧＴ　Ｇ ＣＣＡＣＴ　ＧＴＧ　ＣＡＡ　ＡＧＣＴＡＣＡＣＡ　ＡＡＣ−−ＴＴＧ　ＡＡＡ 　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＣＧＣＣＣＡ　ＣＧＧ　ＴＧＡ　ＣＡＣＧＴＴ　ＴＣＧ　Ａ ＴＧ　ＴＧＴ　ＴｒＧ−−Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ−（続き） ：　−ＴｒＴ　ＡＴＣＡＧＡ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＣＧ　３’−ＡＡＡ　ＴＡＧ　 ＴＣＴ　ＣＧＡ　ＣＡＡ　ＧＣ５’−Ｐｈｅ　Ｔｌｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ 　ＡｒｇこのＤＮＡ配列は各末端にＳｐＭ部位の半分を有し、次に実施例１に記 載したようにして５ｐｈｌで部分消化（直線化）したプラスミドｐＤＷ１５に連 結することができる。このプラスミドを次にＮｃｏｌとＨｉｎｄｌｌｌで消化し 、次の全成分をコードする１、３ｋｂのＤＮＡフラグメントを得た：成熟リシン Ａ１リシンＡリンカーの一部、合成プロテアーゼ感受性部位およびＩＬ−２゜こ の１．３ｋｂのＮｃｏＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントを単離し、そして、Ｅ。 ｃｏＮ中での発現のために、Ｎｃｏｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ消化したｐＫＫ２３３− ２ベクター（第３図（ｂ））（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ にＡｒｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ、４０：１８３−１９０．１９８５）にクローニン グした。リシンＡ／ＩＬ−２蛋白質の発現は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ クトシド（ＩＰＴＧ）で誘発した。この蛋白質は免疫アフィニティークロマトグ ラフィーおよび引き続（ＨＰＬＣ分子篩クロマトグラフィーで精製できる。 実施健Ａ　ストレプトアビジン／ＩＬ−２組換え融合遺伝子の構築および発現な らびに得られたハイブリッド蛋白質の高−親和性リセブターの画像形成における 使用 ＤＮＡクローニング、細胞形質転換およびプラスミドの単離の標準的方法が次の 構築物のために使用可能である： ストレプトアビジン遺伝子はストレプトマイセス・アビジニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏ ｍｙｃｅｓ　ａｖｔｄｉｎｉ　ｉ）から、Ａｒｇａｒａｎａら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ １ｄ　Ｒｅｓ、１４：１８７１−１８８２．１９８６に記載されたようにして単 離した。この遺伝子をＮａｅｒで消化したのち、約４３３ｂｐのフラグメントを 単離してＴａｑｌでさらに消化した。約４１４ｂｐのＮａｅＩ−Ｔａｑｌフラグ メントを単離して、その５°Ｎａｅｌプラント末端を次の合成りＮＡオリゴマー と連結した（このオリゴマーは、Ｍｊｌｌｆｇｅｎ　７５００ＤＮＡ合成装置で 、同装置の製造元の指示に従って合成した）：５’　ＣＣＡＴＧ　ＧＡＣＣＣＣ 丁ＣＣＡＡＧ　ＧＡＣＴＣＧ　ＡＡＧ　ＧＣＣＣＡＧ　ＧＴＣ−３’　ＧＴＡＣ ＧＧ　ＴＡＣＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＧＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＡＧＣＴＴＣＣＧＧ　Ｇ ＴＣＣＡＧ−コード対象：　ｆｌＪｅｔ　Ａｓｐ　ＰｒｏＳｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓ ｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ−（続ぎ’）　−ＴＣＧＧＣＣＧ ＣＣＧＡＧＧＣＣ３’−ＡＧＣＣＧＧ−ＣＧＧ　ＣＴＣＣＧＧ　５’−５ｅｒ　 Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａこのフラグメントの（３°）Ｔａｑｌ末端に次 の合成オリゴマーを連結した：５’　ＣＧＡＣＧＣＧ　ＧＣＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ 　ＧＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣ−３’　ＴＧ　ＣＧＣＣＧＣＴＴＣＴ ＴＣＣ（石Ｃ頷ＣＡＧ　ＴＴＧ　ＴＴＣ四−コード対象：　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａ ｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｉａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ−（ 続き）　−ＡＡＣＣＣＧ　ＣＴＣＧＡＣＧＱＩ：　ＧＴＴ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　Ｃ ＡＴ　Ｇ　３゜−ＴＴＧ　ＧＧＣＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＧＴＣＧＴ Ｃ５゜−Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　 Ｈｉｓこのようにし、て付加された合成配列は、ＮａｅＩとＴ　ａ　ｑ、　１で の消化の過程で除去されたストレプトアビジンをコードする配列の全てに置換し 、そしてフラグメントの各末端に５ｐｈｌ部位の半分を付加する。このフラグメ ントを、次に５ｐｈＴで部分的に消化して直線化したｐＤＷ（実施例１参照）中 に連結して、Ｅ、ｃｏｌｉを形質転換することができる。適当な連結生成物は、 形質転換で生じた単一コロニーから得たＤＮＡのプラスミド制限部位マツピング により同定可能であるが、第４図（ａ）に示した。このプラスミドをＮｃ　ｏｒ 　−Ｈｉ　ｒｉｄｌＩＩ消化した後、ストレプトアビジン／ＴＬ−２融合蛋白質 の全コード領域を含む１．０ｋｂのＮ　ｅ　ｏｆ　−Ｈｉ　ｎ　ｄｌＩＩフラグ メントを単離し７、そしてＥ、ｃｏｌｉ中での発現のために、Ｎｃｏｌ−Ｈｉｎ ｄｌｌＩ消化ｐＫＫ２３３−２ベクターにクローニングした。このストレプトア ビジン／ＩＩ、−２コードベクターの最終形態は第４図（ｂ）に示す。Ｅ、ｃｏ ｌｉを形質転換してストレプトアビジン／ＴＬ−２ポリペプチドを単離し、免疫 アフィニティークロマトグラフィーおよび引き続くＨＰＬＣ分子篩クロマトグラ フィーで精製し、そして例えばリンパ腫細胞のＩＬ−２の高−親和性リセブター の存在のアッセイに用いた。 ヒトリンパ腫生検の凍結セクションまたはパラフィンセクションは、標準的方法 により顕微鏡スライド上に作成した。染色の前に先ず凍結セクションをアセトン または他の適当な固定剤で固定し、次いで例えば０８１Ｍ　）リス、　ｐＨ７， ２の緩衝液で洗浄した。次に、全ての非特異的結合部位を飽和させるために、未 標識のビオチンおよび／または遊離の螢光色素を添加した。緩衝液中でゆすいで 未結合のビオチンを除去した後、スライドをストレプトアビジン／ＩＬ−２ハイ ブリッド蛋白質で処理し、次いで未結合のストレプトアビジン／ＩＬ−２を除去 するために緩衝液中でゆすいだ。スライドを次に螢光色素−ビオチン複合体を含 む溶液で処理した。スライドを再度緩衝液中でゆすいで未結合の標識ビオチンを 除去し、適当な波長の光で照射した螢光顕微鏡下で観察した。リンパ腫の生検サ ンプル中に高比率の螢光色素標識細胞が存在することは、その腫瘍がジフテリア 毒素／ＩＬ−２ハイブリッドまたは他のＩＬ−２のＮ末端に結合した毒素ハイブ リッドでの化学療法に対して感受性であろう可能性の指標である。 他の態様 他の態様も、請求の範囲内に含まれる。例えば、ハイブリッド分子のサイトカイ ン部分はへマトポエチンリセブタースーパーファミリーサイトカインの任意のも の又はそのフラグメント・もしくは類縁体でよく、それらのフラグメントもしく は類縁体は標準的技術で製造できる。高−親和性リセブターを有する細胞をそう でない細胞から分離するための使用においては、化学成分はフェリチンであって もよく；単にサイトカインによるリセブター型の識別能力を高めるための不活性 部分でもよく；または宿主自身の高−親和性リセブターを有する細胞への宿主介 在免疫攻撃を誘発する機能を持たせるための抗原であってもよい。その代わりに 、化学成分は酵素、炭水化物、脂質、合成ポリマー、ウィルス粒子または無機分 子でもよい。サイトカインと化学成分の間の結合はペプチド結合または他の任意 のタイプの共有結合でありうる。化学成分の各分子が複数のサイトカイン分子の Ｎ末端に結合できるような化学成分を用いることにより、同時に二種以上の高− 親和性リセプター含有細胞に結合して、混合リンパ球懸濁液から該細胞を凝集除 去できる多価ハイブリッドを造成することもできる。このような方法はアッセイ または治療技術のために有用であろう。 融合蛋白質は、合成りＮＡ配列またはクローン化天然遺伝子から出発して合成す ることもでき、または化学成分をサイトカインと化学的につないで組み立てるこ とも可能である。合成ののち、ハイブリッドを酵素または化学的に修飾すること もできる（例えば螢光標識または放射標識の付加）。任意のハイブリッドのポリ ペプチド部分を、放射活性アミノ酸一つ以上を組み込むシステムで合成しで、得 られたハイブリッド蛋白質を内在的に標識することも可能である。 完全なサイトカインに代えて、興味対象のサイトカインの高−親和性リセブター に結合可能な該サイトカインの任意のフラグメントまたは類縁体を用いることも 可能である。ＩＬ＝２−含有ハイブリッドは、例えば放射性アイソトープまたは りシンまたはゲラニン（ｇｅｌａｎｉｎ）のような高−親和性リセブター含有Ｔ 細胞（リンパ系のある種の腫瘍に関与し、そして移植拒絶反応において致命的役 割を演じる）に特異的な毒素の致死量を配給するための、薬剤配給具としても使 用可能である。さらに別の態様において、ハイブリッドのサイトカイン部分に結 合させる適当な化学成分を選択することにより、ｉｎ　ｖｉｖｏまたは１ｎｖｉ ｔｒｏで高−親和性リセブターの画像成形のために、ハイブリッドを用いること も可能である。その例はリンパ腫組織の凍結セクションを１２５１のような放射 性アイソトープを含むＩＬ−２ハイブリツドにより処理することと標識組織のオ ートラジオグラフィーとの組合わせ、および移植患者へＸ線に不透明な成分を含 むＩＬ−２ハイブリツドを投与することと移植拒絶反応をモニターするための移 植臓器のＣＡＴスキャニングとの組合わせである。本発明のハイブリッドを適当 な固体支持物質に結合させれば、高−親和性リセブター含有Ｔ細胞をそのような りセブターを持たない細胞から分離して治療または他の目的のために、どちらか の細胞のフラクションを回収可能にするための、効率的かつ再使用可能な手段が 提供される。 ”　ＨｉｓＡＬａＰＰｏＴｈｒ １１＠ＬｅｕＡｓｎＧｌｙＫｌａＡｓｎ会５ｎＴｙｒＬｙｓＡｓｎＰｒｃＬｙｓ Ｌｅｖ丁？１＋−Ａｒ’ｌ仁ＩＥＴＬ＝ｗＴｈｒＰｈ＝Ｌｙ■ Ｐｈｅｒｙｒ１旦＝−ＰｒａＬ、ｙｉＬｙｓ八り、ｉｉ’ｈｒ＋ＭｑＬ＝ｕ＋− ノｓド１ＳＬｅ’ＪＩＥＬｒ％Ｃ＼Ｊ引−ｅＬＪＧスｕＧ１浮fｌｕｉ、ｅｕ ｌ−ｙｓＰｒｏＬｅｕＧ１ｕＧｌｕｔ／＝ｌＬｓ＋ｕＡ％ｎ１−ｅｕ＾１ａＧ１ ｎＳｅｒＬｙ＋５ＡｓｎＰｈｅｌ−ｉｉｓＬｅｕＡｒ３Ｐｒ盾`ｒｌ ”！’１ｉＣｙｓ＋３１ｎＳ＝ｒ！、１ｅｉ１２ＳｚｒｒｈｒＬ＝ｕＴｈｒ　− 浄書（内容に変更なし） 浄つ（内容に変更なし） Ｈｉｎｄ　ＩＩ＋ 浄Ｏ（内置に変更なし） 手続補正書（ハ） 平成２年特許願第５１１２８１号 ２、発明の名称 ハイブリッド分子 ３、補正をする者 名　称　セラジエンΦインコーポレーテッド４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　平成　３年１２月１０日　（発送日）６、補正の対象 （１）出願人の代表貴名を記載した国内書面国際調査報告 １Ｒ１ｊＩＩＩＩＩＩＩＩ−ＩＬｅｌｌ心市ａａ　−、ｐ　ｃ〒ｔ　＋　ｌ　Ｑ 　Ｑ　ｎ　ｔ　ｎ　ｑ　Ｒフ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヘマトポエチンリセプタースーパーファミリーサイトカインまたは該サイト カインのフラグメントもしくは類縁体であって該サイトカインに対する高一親和 性リセプターに結合可能なものを、そのアミノ末端で化学成分に共有結合させて なるハイブリッド分子であって、該化学成分は該サイトカインに対する低一親和 性リセプターによる該ハイブリッド分子の処理を該サイトカインの処理よりも低 めるものであるが、但し該化学成分はジフテリア毒素のトランスロケーションド メインを含まない、上記ハイブリッド分子。 ２．サイトカインがＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびプロラクチ ンからなる群から選択される、請求項１記載のハイブリッド分子。 ３．化学成分が、ハイブリッド分子中のサイトカイン部分の低一親和性リセプタ ーへの結合力を、該低一親和性リセプターに対するサイトカインの結合力に比べ て立体障害で低める、請求項１記載のハイブリッド分子。 ４．化学成分がポリペプチドからなる、請求項１記載のハイブリッド分子。 ５．共有結合がペプチド結合である、請求項４記載のハイブリッド分子。 ６．ポリペプチドが抗体分子である、請求項４記載のハイブリッド分子。 ７．ポリペプチドがリシンまたはそのフラグメントもしくは類縁体である、請求 項４記載のハイブリッド分子。 ８．ペプチドがリシンの酵素学的に活性なフラグメントまたは類縁体である、請 求項７記載のハイブリッド分子。 ９．ポリペプチドがストレプトアビジンまたはそのフラグメントもしくは類縁体 である、請求項４記載のハイブリッド分子。 １０．ポリペプチドがフェリチンである、請求項４記載のハイブリッド分子。 １１．化学成分がＸ線に対して不透明な部分である、請求項１記載のハイブリッ ド分子。 １２．化学成分が蛍光部分を含む、請求項１記載のハイブリッド分子。 １３．化学成分が放射活性部分を含む、請求項１記載のハイブリッド分子。 １４．ハイブリッド分子が高一親和性リセプターを有する細胞の増殖速度に影響 することができる、請求項１記載のハイブリッド分子。 １５．サイトカインに対する高一親和性リセプターを有する細胞に対して一つの 部分を選択的に結合させる方法であって、該部分を含む化学成分を持つ請求項１ 記載のハイブリッド分子に対して前記細胞を暴露することよりなる方法。 １６．前記部分が標識を含み、そして高一親和性リセプターを有する細胞または 高一親和性リセプターの画像形成に使用される、請求項１５記載の方法。 １７．前記部分が鉄と複合体を形成した分子からなり、高一親和性リセプターを 比較的多数有する細胞を該リセプターをより少なく有する他の細胞から分離する ために使用される、請求項１５記載の方法。 １８．ハイブリッド分子が細胞に結合した時その増殖速度を低下させることがで きるものであり、そして高一親和性リセプターを有する細胞の過剰生産を伴う症 状の治療に使用される、請求項１５記載の方法。 １９．ハイブリッド分子を固定化し、 固定化したハイブリッド分子に対して、細胞集団を、高一親和性リセプターが固 定化ハイブリッド分子結合することを可能ならしめる条件下で接触させ、そして 該細胞集団中の未結合細胞を、高一親和性リセプターを介して該固定化ハイブリ ッド分子に結合した細胞から分離することよりなる、集団中に高一親和性リセプ ターを有しない細胞も含む細胞集団中から、高一親和性リセプターを有する細胞 を選択的に単離するために、請求項１記載のハイブリッド分子を使用する方法。 ２０．体液または体組織から高一親和性リセプターを有する細胞を除去するため に使用する、請求項１９記載の方法。 ２１．固定化ハイブリッド分子に結合した全ての細胞を開放する追加工程を更に 含む、請求項１９記載の方法。 ２２，サイトカインまたはそのフラグメントもしくは類縁体をコードするＤＮＡ 配列にポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を融合させた組換えＤＮＡ分子を用 意し、 該組換えＤＮＡ分子を適当な発現系に導入し、そして該組換えＤＮＡ分子を発現 させることよりなる、請求項４記載のハイブリッド分子を製造する方法。 ２３．高一親和性リセプターを、（１）高一親和性リセプターに結合するハイブ リッド分子の量と、（２）該細胞集団の他の全てのリセプターに結合する量との 間の相違を実質的に最大にするのに十分な量のハイブリッド分子に対して暴露し ；リセプターと結合したハイブリッド分子を、ビオチンと共有結合した標識プロ ーブに暴露し；そして リセプターと結合したハイブリッド分子に結合した標識プローブを検出すること よりなる、 高一親和性リセプターの画像形成のため、または細胞集団中の高一親和性リセプ ターを有する細胞の画像形成のために、請求項９記載のストレプトアビジンを含 むハイブリッド分子を使用する方法。 ２４．ポリペプチドがゲラニンの酵素的に活性なフラグメントまたは類縁体であ る、請求項４記載のハイブリッド分子。