KR100767980B1 - 재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체의 바이머 또는 올리고머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체의 올리고머에 관한 것이다. 상기 올리고머는 재조합 융합 단백질이, 생물학적 기능, 특히 항체, 가용성이거나 막 결합된 시그날 분자, 또는 수용체 또는 항체, 또는 항체 분절에 대한 리간드 기능을 갖는 단백질 또는 단백질 분절을 포함하는 하나 이상의 성분 A 및 제3 구성원 분자의 작용 없이 재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체를 이량체화 또는 올리고머화하는 단백질 또는 단백질 분절을 포함하는 하나 이상의 성분 B를 가짐을 특징으로한다. 또한, 본 발명은 의약 제조를 위한 이러한 유형의 이량체 또는 올리고머의 용도, 이량체 또는 올리고머를 이루는 융합 단백질 및 이의 DNA 서열 및 이러한 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 숙주 세포에 관한 것이다.
재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체의 바이머 또는 올리고머, 시그날 분자, 항체, 바이머화, 올리고머화, 리간드 기능

Description

재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체의 바이머 또는 올리고머{Bimer or oligomer of a dimer, trimer, quatromer or pentamer of recombinant fusion proteins}
본 발명은 하나 이상의 성분 A 및 하나 이상의 성분 B를 갖는 재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체의 바이머(bimer) 또는 올리고머에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약물을 제조하기 위한 이러한 유형의 바이머 또는 올리고머의 용도 및/또는 시험관내 진단을 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 또한 하나의 성분 A 및 하나의 성분 B를 갖는 융합 단백질로서, 당해 성분 B가 C1q 단백질 또는 콜렉틴(collectins)의 계열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질의 다량체화 및 올리고머화 분절, 또는 이러한 유형의 분절의 기능성 유도체를 함유하는 융합 단백질에 관한 것이다. 당해 유형의 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열 및 발현 벡터 및 당해 DNA 서열 및/또는 당해 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포도 본 발명의 목적이다.
생리학적으로 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체로서 존재하는 단백질은 천연에서 다수가 발견된다. 용액속에서 이량체화 또는 다량체화되는 이들 단백질의 표면상의 상호작용으로 인해, 단백질의 자발적 응집뿐만 아니라, 응집이 농도 또는 환경에 의해 좌우되기 때문에 심지어 예를 들어 속도론적으로 지연된 응집도 존재할 수 있다. 이의 원인은 소수성 상호작용, 수소 결합 형성 및/또는 쿨롱력(coulomb force)이다.
그러나, 이와 함께, 일부 단백질의 경우 특이적 구조인 초2차 구조를 형성시켜 단백질 이량체 또는 다량체를 형성하는 구조 모티프가 밝혀졌다. 초2차 구조의 형성은 이러한 이량체 또는 다량체를 형성하는 단백질의 특징적 아미노산 서열에 기초한다. "코일드-코일(coiled-coil) 나선"은, 예를 들어, 코일드-코일 형태를 형성하는 각 단백질 간에 존재하는 특징적 α-나선의 상호작용을 통해 단백질의 이량체화 또는 다량체화에 영향을 미치는 초2차 구조를 의미할 수 있다. 코일드-코일 나선은 단백질의 분자내 "이량체화 또는 다량체화 도메인"으로서 구조적으로 2개 이상의 나선 그 자체가 감긴 초 나선을 나타낸다. 이러한 유형의 코일드-코일 모티프는 특히, 세포외 단백질 이량체 또는 다량체 및 특히 연결 조직의 단백질 또는 단백질 복합체에서 발견된다.
문헌[참조 문헌: Beck et al., J. Mol. Biol. (1996) 256, 909-23]에는, 예를 들어, 3개의 상보적 나선 응집의 결과인, 삼중 나선상 동종삼량체로의 응집이 코일드-코일 패턴에 기초하는 연결 조직 단백질인, 이른바 연골 매트릭스 단백질(CMP)이 기술되어 있다. 삼중 나선을 형성하는 이러한 유형의 나선의 아미노산 서열의 특징은 7가 패턴인 (abcdefg)n이다. 위치 a 및 d의 후자의 아미노산은 비극성 측쇄를 지니므로 본원에서 3개의 나선으로 이루어진 삼중 나선으로서 상기 기술한 초나선 구조가 형성되도록 할 수 있다.
또한, 상기 문헌에는 또 다른 세포외 매트릭스 단백질(연골 올리고머 매트릭스 단백질; COMP)의 경우 서로 상호작용하므로 오량체를 형성시킬 수 있는 5-코일 코일드 코일 나선 형태인 5개의 나선이 사실상 존재한다는 것도 기술되어 있다[참조 문헌: Kajava, PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 24:218-226 (1996); Malashkevich et al., Science, Vol. 274, 761-765, 1996].
콜라겐 계열로부터의 단백질에 속하지 않는 매트릭스 단백질 COMP 및 CMP와 함께, 콜라겐 계열로부터의 단백질에서는 초2차 구조의 형성을 통한 특이적 구조 다량체화 현상이 또한 발견된다. 이때, 콜라겐 섬유의 구조는 나선형으로 꼬인 3개의 폴리펩타이드로 이루어진 트로포콜라겐을 특징으로 한다. 모발의 원시원섬유도 "코일드-코일" 모티프를 갖는 α-케라틴의 삼중 나선으로부터 발달되는데, 이러한 경우에는 좌선성(left-handed)이다.
리간드의 결합력을 증가시키기 위해, 테르스키(Terskikh) 등[참조 문헌: PNAS, Vol. 94, 1663-1668, 1997]은 리간드 기능을 갖는 짧은 펩타이드와 매트릭스 단백질 COMP의 "코일드-코일" 도메인을 갖는 융합 단백질을 사용하는 것을 제안하였다. 이러한 오량체에 대한 결합력의 증가는 입증될 수 있는 바 보다 높은 차수의 응집체는 이러한 방법으로 수득될 수 없다.
추가로, 각각의 다량체화 서열 절편에서의 이의 서열 상동성으로 인해, 단백질 계열로서 단백질 C1q, 콜라겐 α1(X), α2(VII), 동면 단백질, ACRP30, 내이(internal ear)구조 단백질, 세레벨린(cerebellin) 및 멀티메린(multimerin)은 구조적으로 이량체 또는 다량체로서 발견되는 C1q 계열이라는 명칭으로 함께 분류된다[참조 문헌; Kischore and Reid, Immunopharmacol., 42 (1999) 15-21]. 이러한 계열에 존재하는 다량체화 특징을 갖는 단백질 중, 예를 들어, 보체계에 흔히 있는 단백질 C1q의 구조는 각각 구형의, 이른바 헤드 도메인 및 "콜라겐형" 나선형 서열 절편을 갖는 단량체를 특징으로 한다. 단량체는 코일드-코일 삼중 나선을 형성하는 이러한 나선 서열 절편을 통해 삼량체화된다. 이들 C1q 삼량체 중의 6개는 그 자체가 올리고머를 형성하여 단백질 삼량체의 올리고머화는 각 코일드-코일 삼중 나선 간의 상호작용에 기초한다. 그 결과는 이러한 단백질 또는 다량체화된(올리고머화된) 단백질 복합체 C1q의 구조적 배열이 "부케(bouquet)"로 지칭되는 구조를 야기하므로, 18개의 C-말단적으로 배열된 구형 헤드 도메인이 삼량체의 육량체에 연결된다는 것이 보증된다는 점이다.
단백질 C1q와 유사한 구조는 마찬가지로 C1q 계열로부터의 단백질인 단백질 ACRP30에서 볼 수 있다[참조 문헌: Hu et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, No.18, 10697-10703, 1996]. 지방 세포에 의해 분비되는 이러한 혈청 단백질은 반드시 삼량체의 사량체이므로, C1q 단백질의 경우 구형의 C-말단 도메인은 콜라겐과 유사한 삼중 나선을 통해 연결된다. 가능하게는, 이들 삼중 나선 중의 4개는 최종적으로 상응하는 상호작용을 통해 그 자체가 올리고머를 형성한다. 사피로(Shapiro) 및 쉐러(Scherer)에 의해 의한 공보[참조 문헌: Current Biology 1998, 8:335-338]에는, X-선 구조 분석을 보조로 하여 측정된 ACRP30의 동종삼량체의 구조가 제시되어 있다.
추가로, 콜라겐형 도메인, 목 부위 및 또한 구형의 카복시말단 렉틴-결합 도메인을 특징으로 하는 콜렉틴 계열로부터의 단백질이 문헌에 공지되어 있다. 콜렉틴은 또한 생리학적으로 삼량체의 올리고머로서 존재한다. 예를 들어, 둘다 콜렉틴 부류로부터 유래되는 폐 표면활성 단백질 A(SP-A) 및 만노스 결합 단백질(MBP)은 "콜라겐형" 도메인의 상호작용을 통해 삼량체화되며 최종적으로 삼량체의 육량체로서 발견된다[참조 문헌: Epstein et al., Current Opinion in Immunology, Vol. 8, No. 1, 1996, 29-35]. 따라서, 콜렉틴이라는 명칭으로 공지된 단백질은 다량체(예: 삼량체)의 올리고머(예: 육량체)를 형성한다.
문헌은 또한 생리학적으로 시그날 분자로서 작용하는 다수의 단백질이 특정 조건하에서만 생물학적 시그날을 전달한다는 것을 제시한다. 예를 들어, 막 결합된 FasL은 생물학적으로, 즉 세포소멸(apoptosis)적으로 효과적인 반면, 세포외 단백질 분절(이른바 sFasL)이 분해된 후에 비-막 결합된 당해 sFasL 분획은 더이상 표적 세포에 적절한 효과를 미칠 수 없다. 슈나이더(Schneider) 등에 의한 공보[참조 문헌: J. Exp. Med., Vol. 187, No. 8, 1998, 1205-1213]에는 앞서 설명한 바와 같이 막-결합된 단백질 분절로부터 분해된 후에 수득된 sFasL 삼량체의 생물학적 효과가 가교 항체의 사용을 통해 이의 생리학적 작용에 관해 사실상 재활성화시킬 수 있다는 것이 기술되어 있다. 당해 목적을 위해, FasL의 삼량체화 도메인, 짧은 링커 서열 및 플래그 표시(플래그 아미노산 서열(단일 문자 코드) DYKDDDDK를 사용함)로 이루어진 융합 단백질을 작제하고 발현시키며, 비구조적으로 삼량체화되는(즉, 초2차 구조의 형성을 야기하는 특이적 이차 구조 상호작용을 통한 것이 아닌) 이러한 유형의 융합 단백질을 플래그 태그에 대해 지시된 항체를 통해 가교시킨다.
항체 결합을 통해 가교된 이러한 유형의 sFasL 분자는 비가교된 sFasL 삼량체에 비하여 현저하게 증가된 특이적 세포소멸 활성을 나타낸다. 그러나, 슈나이더 등에 의해 제안된 상기 과정은, 삼량체화 도메인을 갖는 비-막 결합된 재조합 FasL 단백질과 함께 특이적 항체도 사용해야 한다는, 달리 언급하면 생물학적 활성의 증가는 추가의 분자 분획의 공급을 통해서만 달성할 수 있다는 단점을 갖는다. 또한, 슈나이더 등이 제안한 이론에 있어서, 다량체의 정확하게 예비조정되거나 측정가능한 올리고머화도를 보증할 수 없다. 즉, 항체는 FasL 삼량체가 이량체에 결합되게 하거나 심지어 올리고머화된 복합체부터 대형 sFasL/항체 응집체에 이르기까지 다양한 범위의 응집체의 형성에 효과를 가질 수 있다. 최대 효율로 정확하게 한정된 생성물이 요구되기 때문에, 예를 들어, 의학적 적용의 경우 슈나이더 등에 의해 제안된 방식은 sFasL 활성을 재활성화시키고/시키거나 증가시키는데 있어 실용적이지 못하다.
따라서, 본 발명의 주 목적은 당해 분야의 양상의 단점을 해결하고, 특히 증가된 생물학적 활성을 나타내거나 생물학적 활성의 재활성화를 달성하는 화합물을 제공하는 것이다.
당해 목적은 청구항 제1항의 실체적 내용, 즉 생물학적 기능, 특히 결합 기능을 지니는 단백질 또는 단백질 분절을 포함하는 하나 이상의 성분 A 및 생물학적 기능을 지니는 재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체를 3급 분자의 효과 없이 바이머화 또는 올리고머화하거나 융합 단백질을 이량체 또는 다량체로 응집시키고 동시에 이들 이량체 또는 다량체를 함께 3급 분자의 효과 없이 바이머 또는 올리고머로 연결시키는 단백질 또는 단백질 분절을 포함하는 하나 이상의 성분 B를 가지는 재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체의 바이머 또는 올리고머에 의해 해결된다.
본 발명의 설명에서, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체라는 용어는 다량체라는 명칭으로 요약되어 있으며 이는 2개, 3개, 4개 또는 5개의 폴리펩타이드(단백질)가 결합된 단백질 복합체로서 이해될 것이다. 이와 달리, 다음으로 높은 차수의 응집체, 즉 상기 의미에서 2개 이상의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체의 응집체는 바이머 또는 올리고머를 의미한다. 생물학적 기능을 지니는 단백질 또는 단백질 분절(융합 단백질중의 성분 A)은 특히, 항체 또는 수용체, 변형된 아미노산 서열, 예를 들어, (가능한 한 유기-화학적 성질의) 효과제가 공유 또는 비공유 커플링된 아미노산 서열, 파라토프를 갖는 항체 또는 항체의 분절 또는 심지어 호르몬, 예를 들어, 펩타이드 호르몬에 대한 리간드 기능(즉, 하나 이상의 분자와 상호작용시 결합 파트너로서 존재할 수 있다)을 갖는 단백질 또는 단백질 분절인 것으로 이해된다. 특히, 본 발명은, 단량체로서 생물학적으로 이미 활성이므로 그 효과가 본 발명에 따르는 복합체중의 성분으로서 증가되거나 본 발명에 따라서 개시되는 다량체화 또는 올리고머화를 통해 또는 (융합 단백질의 성분 A가 삼량체로서 발견되는 한) 본 발명에 따라서만 개시되는 올리고머화를 통해서만 활성이 되는 시그날 단백질의 아미노산 서열을 융합 단백질중의 성분 A로서 포함한다. 생리학적으로 막 결합된 시그날 단백질, 예를 들어, TNF 사이토킨의 경우, 막외부의, 특히 세포외 단백질 분절을 함유하는 분해 생성물이 바람직하다. 그러나, 항원으로서 작용할 수 있는 아미노산 서열을 재조합 융합 단백질중의 성분 A로서 사용할 수도 있다. 마지막으로, 수용체, 예를 들어, I형 막 단백질 계열에 속하는 TNF 수용체 계열로부터의 수용체(예: FasR) 또는 이러한 수용체의 분절 또는 유도체도 성분 A로서 사용할 수 있으며, 이는 결합 기능을 가지므로(즉, 결합 파트너로서 기타 분자와 상호작용하므로) 본 발명의 의미내에서 "리간드"라는 용어에 포함된다. 상보적 생물학적 리간드가 환자에서 비생리학적 고농도로 발견되는 경우, 생물학적 수용체의 단편에 결합할 수 있는 이러한 유형이 특히 약물로서 사용하기에 적합하다.
바람직한 양태에서, 성분 A는 본 발명에 따르는 올리고머내에서 발견되는 다량체, 즉 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체, 동일한 성분 A(동종이량체 또는 동종다량체의 올리고머) 또는 상이한 성분 A(이종이량체 또는 이종다량체의 올리고머)를 가질 수 있다. 이러한 방식으로, 상이한 성분 A와 함께 가능하게는 상이한 생물학적 기능도 가질 수 있는 단백질은 본 발명에 따르는 올리고머의 이량체 또는 다량체로서 함께 연결시킬 수 있다. 바이머 또는 올리고머로서 응집된 각각의 이종이량체 또는 이종다량체는 또한 동일하거나 상이할 수 있으며, 즉 본 발명에 따르는 바이머 또는 올리고머는 상이한 이종이량체 또는 이종다량체로 이루어질 수도 있다.
그러나, 바이머 또는 올리고머의 아단위로서의 각 이량체 또는 다량체중의 융합 단백질은 동일할 수도 있으나, 반면에 이량체 또는 다량체로서 배열된 바이머 또는 올리고머중의 각각의 아단위는 상이할 수 있다(동종이량체, 동종삼량체, 동종사량체 또는 동종오량체의 이종바이머 또는 이종올리고머). 이러한 방식으로, 예를 들어, 성분 A에 관해 상이한 6개 이하의 동종삼량체는 본 발명에 따르는 삼량체의 육량체로서 결합될 수 있다. 이러한 방식으로, 통상적으로 정확히 조절된 생물학적 활성은 선택, 배열, 특정 조합 및/또는 바이머 또는 올리고머중의 성분 A의 갯수에 의해 달성될 수 있다. (본 발명에 따라서 확장된 의미가 아닌 생물학적 의미에서)특정 생물학적 효과가 2개 이상의 리간드의 상호작용을 통해서만 목적하는 생물학적 효과, 예를 들어, 세포 활성화를 야기한다는 것이 공지되어 있다. 이는, 예를 들어, T-세포 또는 B-세포 활성화제로서의 효과에 대해 특정 인터루킨의 조합에서 바람직하다는 것을 의미한다. 본 발명에 따라서, 조합된 경우에만 효과적인 이러한 유형의 이펙터(effector)는 본 발명에 따르는 복합체로서 배열될 수 있다. 그러나, 예를 들어 각각의 성분 A에 관해서는 상이한 올리고머를 함유하는 조성물이 제공될 수 있다는 것도 고려할 수 있다.
다른 바람직한 양태에서, 재조합 융합 단백질중의 성분 A는 펩타이드 호르몬, 성장 인자, 사이토킨, 인터루킨 또는 이들의 분절, 바람직하게는 결합할 수 있는 분절이다. 그러나, 상기 언급한 펩타이드 및/또는 단백질의 기능성 유도체를 본 발명에 따르는 올리고머의 성분인 재조합 융합 단백질중의 성분 A로서 사용할 수도 있다.
특히 생물학적 기능을 유지하나, 동시에 상응하는 천연 서열과 상이한 서열을 갖는 단백질이 생물학적 활성 단백질, 단백질 분절 또는 펩타이드의 기능성 유도체로서 기술된다. 서열 유도화는 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환일 수 있으므로, 70% 이상의 서열 상동성이 바람직하며 사용된 유도체와 천연 서열 간의 85% 이상의 서열 상동성이 특히 바람직하다. 이러한 아미노산 서열은 특히 생리학적 서열에 비해 보존적 치환을 나타내는 "기능성 유도체"라는 용어로 분류된다. 보존적 치환은 동일한 부류로부터 유래되는 아미노산끼리 서로 치환되는 치환인 것으로 고려된다. 지방족 측쇄, 양하전 또는 음하전된 측쇄, 측쇄내의 방향족 그룹을 갖는 아미노산 또는 측쇄가 수소 결합의 일부일 수 있는, 예를 들어, 하이드록시 작용기를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산이 있다. 이는, 예를 들어, 극성 측쇄를 갖는 아미노산이 마찬가지로 극성 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로 대체되며, 예를 들어, 소수성 측쇄를 특징으로 하는 아미노산이 마찬가지로 소수성 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 것을 의미한다(예를 들어, 세린(트레오닌)이 트레오닌(세린)으로 치환 또는 루신(이소루신)이 이소루신(루신)으로 치환).
본 발명에 따라, 리간드는 결합 반응에 관여하는 모든 분자인 것으로 이해된다. 따라서, 리간드는 보통 수용체로서 기술되는 단백질일 수 있다. 이러한 유형의 수용체는 시그날 분자에 결합하는 경우 본 발명의 의미내에서 "리간드"일 수도 있다.
본 발명하에, 재조합 융합 단백질의 삼량체의 올리고머가 바람직하며, 특히 삼량체의 삼량체 또는 사량체(3×3 또는 4×3) 또는 삼량체의 육량체(6×3)가 바람직하다.
재조합 융합 단백질 중의 성분 A가 TNF 사이토킨 계열로부터의 사이토킨, 이러한 유형의 TNF 사이토킨의 분절이나 TNF 사이토킨 또는 상응하는 TNF 사이토킨 분절의 기능성 유도체인 경우, 재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체의 바이머 또는 올리고머가 특히 바람직하다. 이때, 사용되는 TNF 사이토킨은, 예를 들어, 상응하는 수용체에 결합함으로써 표적 세포에서 세포소멸성의 증식 또는 활성화 효과를 야기할 수 있다. 비포괄적 목록에서, 특히 단백질 CD40L, FasL, TRAIL, TNF, CD30L, OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APRIL, EDA, VEGI 및 BAFF를 TNF 사이토킨으로서 사용하기 위해 고려할 수 있다. 상기 언급한 막 결합된 TNF-사이토킨 또는 기타 기능성 유도체의 세포외 분절이 재조합 융합 단백질중의 성분 A로서 사용하기에 바람직하다. 이들 분해 생성물은 이의 각 생물학적 기능성, 특히 각 수용체에 결합하는 이의 능력이 보유된 경우 특히 바람직하다. 상기 언급한 TNF 사이토킨 또는 TNF 사이토킨의 분절의 상기 의미의 기능성 유도체를 융합 단백질의 성분 A로서 사용할 수도 있다. 특히 바람직한 양태에서, 재조합 융합 단백질의 성분 A는 hFasL(AA 139-261), hTRAIL(AA 95-281), hCD40L(AA 116-261) 및 m 또는 hTNFα(AA 77-235)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또한, (막 결합되거나 세포외) 수용체, 특히 TNF 사이토킨 계열의 단백질의 수용체, 특히 상기 언급한 TNF 사이토킨의 생리학적 수용체 또는 당해 수용체의 분절 또는 유도체가 재조합 융합 단백질중의 성분 A로서 바람직한 양태에서 사용된다. 수용체의 분절이 성분 A로서 사용되는 경우, 이들 분절은, 특히 생리학적으로 막외부에 배열된 이러한 수용체 유형의 생리학적 단백질 서열의 분절일 수 있다. 이때, 특히 이러한 유형의 수용체의 세포외 분절이 고려된다. 예를 들어, 본 발명에 따라, 수용체, 특히 TNF 사이토킨 계열로부터의 사이토킨과 결합하는 수용체(예: FasR, CD30, CD40, GITR, TNF-R1 및/또는 TNF-R2)의 결합 도메인(들)이 이량체화 면역글로불린(이량체화 Fc 단편)에 제공될 수 있으며, 이들 이량체는 그 자체가 성분 B, 예를 들어, 이량체 또는 다량체를 바이머화 또는 올리고머화하는 능력을 갖는 콜라겐형 분절을 통해 본 발명에 따르는 바이머 또는 올리고머 복합체로 바이머화 또는 올리고머화될 수 있다. 당해 목적을 위해, 예를 들어, 이량체 또는 다량체의 사량체(예를 들어, ACPR30의 사량체화 분절을 통해), 또는 이량체 또는 다량체의 오량체(예를 들어, 성분 B로서 사용되는 COMP 복합체로부터의 단량체의 상응하는 서열 절편을 통해) 또는 심지어 이량체 또는 다량체의 육량체(예를 들어, C1q 복합체의 단량체로부터의 육량체화 분절을 통해)가 고려될 수 있다.
본 발명하에 다음 가능성이 제공된다: 본 발명에 따르는 올리고머의 성분이 될 재조합 융합 단백질로부터 선택되는 성분 A는 이미 이량체 또는 다량체로서 용액속에서 발견된다. 이러한 경우에 성분 B는 단지 성분 A의 이량체화 또는 다량체화를 증대시키고 필수적으로 재조합 융합 단백질의 바이머화 또는 올리고머화를 야기할 수 있다. 이러한 상황은, 예를 들어, 성분 A로서, 통상적으로 용액속에서 이미 삼량체화되는 하나 이상의 TNF 리간드 또는 이의 분절 또는 유도체가 융합 단백질의 성분(들)으로서 올리고머화되는 경우 발견된다. 그러나, 용액속의 성분 A가 표면 상호작용에 의해 매개되는 어떠한 이량체화 또는 다량체화도 나타내지 않는 경우, 본 발명에 따라서, 성분 B는 성분 A의 이량체화 또는 다량체화 뿐만 아니라 이량체화되거나 다량체화된 재조합 융합 단백질의 바이머화 또는 올리고머화도 보증하지 않는다. 이는 통상적으로, 예를 들어, 수용체 또는 이의 분절이 재조합 융 합 단백질중의 성분 A를 형성하는 경우에 필수적이다.
본 발명의 관점에서, 성분 A가 바람직하게는 항원 또는 항원의 분절인 재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체의 바이머 또는 올리고머가 기술된다. 이때, 바이러스, 세균 또는 원생동물 병원체로부터의 항원을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 병원체의 모든 통상의 항원, 예를 들어, 단백질 분절 및/또는 특이적 탄수화물 구조일 수 있으나, 통상적으로 각 병원체의 표면 항원 또는 또한 항원성을 나타내는 병원체의 표면 단백질의 분절이다. 예를 들어, 다음의 비포괄적 예가 사용될 수 있을 것이다: 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, PreS1, PreS2, HBs 항원, gp120, gp41 또는 심지어 통상의 종양 항원.
바람직한 양태에서, 재조합 융합 단백질의 성분 A는 수용체 효능제 또는 수용체 길항제용 담체로서 작용하기에 적합한 아미노산 서열일 수도 있다. 예를 들어, 약리학적 제제로서 활성인 소형 유기-화학적 분자는 통상적으로, 예를 들어, 트레오닌 또는 세린에의 에테르 결합, 아미드형 결합 또는 에스테르 결합을 통해 이러한 유형의 아미노산 서열에 공유적으로 커플링될 수 있다. 본 발명을 통해, 예를 들어, 수용체 효능제 또는 수용체 길항제와 각각 연결된, 18개의 융합 단백질의 대형 올리고머 복합체(예: 3×6 융합 단백질)이 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어 사람 의학 또는 수의학에서 약물로서 사용하기 위해, 이러한 유기-화학 분자의 효능 또는 결합성을 바이머 또는 올리고머 단백질 담체상에 위치하는 이의 각 수용체에서 현저하게 개선시킬 수 있다.
바이머 또는 올리고머로서 이량체화 또는 다량체화되어 발견되는 재조합 융 합 단백질의 성분 B는 통상적으로 C1q 단백질 또는 콜렉틴 계열로부터의 단백질이다. 재조합 융합 단백질중의 이량체화/다량체화 서열 또는 바이머화/올리고머화 서열만이 전사 또는 해독되는 경우, 재조합 융합 단백질의 성분, 즉 성분 B로서 C1q 단백질 또는 콜렉틴 계열의 단백질이 특히 바람직하다. 따라서, 천연 단량체의 서열중에 함유되어 있는 주로 구형인 헤드 도메인(도 14)은 본 발명에 따르는 재조합 융합 단백질내의 해독 생성물로서 나타나지 않을 수 있으므로 당해 단백질중의 성분 B의 성분이 아니다. 성분 B로서 사용된 상기 기술한 계열의 단백질의 콜라겐형 분절이 통상적으로, 그 자체가 또 다른 삼중 나선과 함께 바이머 또는 올리고머(예를 들어, 삼중 나선의 사량체 또는 육량체)내로 도입되는 기능을 갖는 삼중 나선의 형성에 참여하기 때문에, 상기 기술한 본 발명에 따르는 재조합 융합 단백질중의 성분 B는, 각각 이량체화/다량체화 또는 바이머화/올리고머화에 대한 기능성을 갖는, 통상적으로 주로 중첩되는 서열을 나타낼 수 있다.
따라서, 통상적으로 다량체화 및 올리고머화 융합 단백질은, 이량체화 및 다량체화 및/또는 바이머화 및 올리고머화되도록 하는 C1q 단백질 또는 콜렉틴 패밀로부터의 도메인을 성분 B로서 가질 수 있으며, 각 헤드 도메인이 성분 A로서 생물학적 기능을 또한 지니는 기타 단백질 또는 단백질 분절에 의해 대체된다. 따라서, "재조합 융합 단백질"이란 용어는 본 발명의 관점에서 인공적으로 융합되는 재조합 융합 단백질중의 하나 이상의 성분 A 및 하나 이상의 성분 B로서 이해되며, 즉 본 발명의 의미내의 융합 단백질은 천연적으로 발생하는 단백질에 상응하지 않는다.
C1q 계열 또는 콜렉틴의 계열부터의 단백질의 기능성, 즉 바이머화 또는 올리고머화 유도체 또는 상기 언급한 단백질의 분절의 유도체는 재조합 융합 단백질을 바이머 또는 올리고머로 응집하는데 성분 B로서 사용할 수도 있다. 이러한 경우, 예를 들어, 성분 B는 단백질 C1q, MBP, SP-A(폐 표면활성 단백질 A), SP-D(폐 표면활성 단백질 D), BC(소 혈청 콘글루티닌(conglutinin)), CL43(소 콜렉틴-43) 및/또는 ACRP30의 서열, 또는 상기 언급한 단백질중 하나 이상 또는 이들 단백질의 기능성 유도체의 바이머화 또는 올리고머화 분절 또는 기능성 유도체의 분절의 서열(들)을 함유할 수 있다. 재조합 융합 단백질의 바이머 또는 올리고머는 재조합 융합 단백질의 성분 B가 단백질 C1q 또는 단백질 ACRP30, 특히 사람 변이체 또는 포유동물 변이체, 보다 특히 쥐 변이체의 단백질 분절인 경우 특히 바람직하므로 이러한 유형의 각 단백질 분절은 통상적으로 천연 단백질 C1q 또는 단백질 ACRP30의 구형 헤드 도메인을 갖지 않는다.
본 발명의 매우 바람직한 양태는 성분 B가 도 6A(사각형내의 서열) 또는 도 6B에 따르는 아미노산 서열 또는 이러한/이들 아미노산 서열(들)의 기능성 유도체 및/또는 이들 서열(들)의 분절을 함유하는 재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체의 바이머 또는 올리고머로 표현된다. 통상적으로, 이러한 서열은, 예를 들어, 아미노산 18번 내지 111번을 갖는, 단백질 mACRP30(m: 쥐)의 분절 또는 예를 들어 아미노산 18번 내지 108번을 갖는, 사람 변이체(hACRP30)의 분절이다. 특히, 본 발명에 따라서, 사람에서 가능한 면역 반응이 치료학적 적용시 차단될 수 있도록 성분 A 및 B가 사람 기원인 융합 단백질이 제공될 수 있다.
상이한 숙주 유기체 유래 서열을 갖는 당해 융합 단백질의 이량체 또는 다량체의 올리고머의 바이머가 특히 바람직하다. 본 발명에 따르는 응집체는 이들이 키메라 융합 단백질로부터 유래되는 경우에 매우 바람직하므로, 성분 A는 성분 B와 이한 유형의 동물로부터 유래된다. 성분 A가 마우스, 랫트, 피그 또는 기타 척추동물, 특히 포유동물로부터의 아미노산 서열 또는 이의 기능성 유도체에 상응하고, 성분 B가 사람 기원이거나 또는 그 반대인 경우에도 유리할 수 있다. 예를 들어, 성분 A가 사람 기원의 성분 B가 조합된, 바이러스, 세균 또는 원생동물로부터의 서열에 상응하는 당해 단백질의 본 발명에 따르는 복합체가 또한 바람직하다. 물론, 본 발명에 따르는 융합 단백질중의 성분 A 및 성분 B의 서열은 동일한 유형의 동물로부터 유래될 수도 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 융합 단백질의 다량체화 및/또는 올리고머화는 재조합 융합 단백질중에 성분 B로서 존재하는 6개 이상의 아미노산, 바람직하게는 8개 내지 20개의 아미노산의 짧은 아미노산 서열을 통해 발생한다. 통상적으로 이러한 짧은 아미노산 서열을 통해 달성되는, 초2차 구조를 통해서가 아니라 용액중의 표면 상호작용을 통해 이미 이량체 또는 다량체로서 발견되는 융합 단백질의 바이머화 또는 올리고머화는 바람직하게는 재조합 융합 단백질중의 특이적 아미노산 서열을 통해 가능한 디설파이드 브릿지의 형성에 기초한다. 이는 성분 B가 바람직하게는 산화 조건하에 하나 이상의 다른 이량체 또는 다량체의 융합 단백질의 하나 이상의 시스테인과 공유 연결을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인을 갖는다는 것을 의미한다. 아미노산 서열(단일 문자 코드) VDLEGSTSNGRQCAGIRL은 성분 B가 8개 내지 20개의 아미노산의 짧은 바이머화 또는 올리고화 아미노산 서열을 함유하는 바람직한 경우의 한 예일 수 있다. 상기 18개 아미노산의 서열은 이량체 또는 다량체 간에 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 위치 11에 갖는다.
이들 18개 아미노산을 함유하는 서열의 기능성 유도체 또는 분절은 성분 B로서 사용될 수 있다. 이때, 위치 11의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환되었다 해도, 서열 VDLEGSTSNGRQSAGIRL은 여전히 융합 단백질 다량체의 바이머화 또는 올리고머화를 보증할 수 있다.
바람직한 양태에서, 융합 단백질은, 고차 응집체가 이량체화 또는 다량체화된 융합 단백질의 바이머화 또는 올리고머화 이상으로 형성될 수 있는 방식으로 배열될 수 있다. 그 자체가 2개 이상의 바이머 또는 올리고머를 포함하는 이러한 고차 응집체는, 예를 들어, 가교를 통한 항체에 의해 제공될 수 있다. 항체는 본 발명에 따르는 복합체의 융합 단백질상의 에피토프, 바람직하게는 성분 B의 에피토프에 대해 지시된다. 그러나, 융합 단백질은 성분 A 및 성분 B와 함께, 항체를 가교하기 위한 항원으로서 작용하는 추가의 서열 절편을 가질 수도 있다. 이러한 범주에서, 이른바 태그 서열, 예를 들어, 플래그 태그, 달리 언급하면 아미노산 서열 DYKDDDDK이나 또한 예를 들어 His 태그(수개의 보존적 히스티딘을 함유함)가 본 발명의 관점에서 바람직하다.
그러나, 본 발명에 따라 재조합 융합 단백질중에 함유되는 하나 이상의 성분 B를 통해 고차 응집체를 제공하는 것이 특별히 바람직하다. 바람직하게는, 고차 응집체의 형성을 위해, 융합 단백질은 올리고머의 바이머를 형성하기 위한 성분 B1 및 추가로 통상적으로 성분 B1과 상이한 하나 이상의 다른 성분 B(바람직하게는 성분 B2)를 함유할 수 있다. 본 발명에 따르는 바이머 또는 올리고머의 하나 이상의 융합 단백질에서 발견되어야 하는 성분 B2는 바이머 또는 올리고머가 고차 응집체를 형성한다는 것을 보증한다. 예를 들어, 성분 B1은 C1q 또는 콜렉틴 단백질 계열로부터의 단백질의 바이머화 또는 올리고머화 분절일 수 있으며, 성분 B2는 하나 이상의 디설파이드 브릿지를 형성하는, 8 내지 예를 들어 28개의 아미노산을 갖는 서열이다. 하나 이상의 디설파이드 브릿지가 2개의 상이한 올리고머 간에 형성되는 경우, 본 발명에 따르는 고차 응집체는 예를 들어 유용한 올리고머의 바이머로 제조될 수 있다.
또한, 이른바 링커 서열을, 성분 A와 성분(들) B 사이 또는 융합 단백질중의 수개의 성분 B가 존재하는 경우에는 이들 2개 이상의 성분들 사이에 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 이들 링커 서열은 재조합 융합 단백질중의 상이한 기능성 성분을 구조적으로 분리할 수 있도록 하며, 바람직하게는 "힌즈(hinge)" 기능을 지닐 수 있는, 즉 유연성 구조를 갖는 아미노산 서열을 나타낼 수 있다.
본원에서는 일반적으로 본 발명에 따라서 상보적 단백질의 증가된 생물학적 효율 및/또는 증가된 결합력을 특징으로하는 바이머 또는 올리고머 또는 고차 응집체를 기술한다. 이러한 방식으로, 본 발명의 추가의 실체적 내용으로서, 생물학적 효율을 증가시키고/시키거나 리간드 기능을 갖는 생분자 또는 약물의 결합력을 증가시키는 방법이 본 발명의 의미에서 기술된다. 이러한 유형의 방법은 생물학적 기능을 갖는 단백질 또는 단백질 분절에 상응하는 하나 이상의 성분 A와 하나 이상의 이량체화 또는 다량체화 및 바이머화 또는 올리고머화 성분 B의 재조합을 특징으로 하므로, 성분 A의 생물학적 활성 및/또는 결합력은 이량체 및 다량체의 바이머 또는 올리고머로의 다량체화 및 올리고머화를 통해 완전히 바이머화 또는 올리고머화되는 재조합 융합 단백질에 의해 증가된다. 본 방법은 성분 A가 TNF 사이토킨, TNF 사이토킨의 분절 또는 이러한 단백질 또는 단백질 분절의 기능성 유도체인 경우 매우 바람직하다. 추가의 바람직한 방법은 수용체 또는 수용체의 분절, 바람직하게는 TNF 수용체의 분절인 하나 이상의 성분 A와 하나 이상의 성분 B를 재조합 융합 단백질로 재조합하는 것이다. 본 발명에 따르는 상기 종류의 방법의 바람직한 양태에 관해서는, 상기 기술한 바이머 또는 올리고머에 대한 바람직한 양태가 유사하게 적용된다.
본 발명의 바이머 또는 올리고머는 약물을 제조하거나 의료용으로, 즉 사람 의학 및 수의학용으로 질병 또는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따라서 바이머 또는 올리고머로부터 형성된 고차 응집체도 약물로서 사용되거나 약물을 제조하는데 적합하다. 광범위한 질병 또는 질환은 본 발명에 따라 청구된 바이머 또는 올리고머 또는 고차 응집체를 사용하여 치료할 수 있다. 이러한 종류의 바이머 또는 고차 응집체를 사용하여 비포괄적인 다음 목록의 질병 또는 질환의 치료뿐만 아니라 감염성 질병, 종양 및/또는 내분비 질환의 치료용 약물을 제조할 수 있다: 과염증 질환, 자가면역 질환, 과세포소멸 반응(hyperapoptotic reaction) 또는 저세포소멸 반응(hypoapototic reaction)에 기초하는 질병, 신경퇴행성 질병. 감염성 질병에 관해서는, 세균성 또는 원생동물성 질병, 특히 바이러스 감염에 있어 바이머 또는 올리고머의 용도가 제시되며, 이때 파라토프를 지니는 항체 또는 항체의 분절이 재조합 융합 단백질중의 성분 A로서 특히 바람직하다. 바이머 또는 올리고머 또는 이들의 고차 응집체는, 예를 들어, 치료 및/또는 종양, 특히 림프계 종양 치료용 약물의 제조를 포함하여, 생물학적 활성 사이토킨을 사용한 치료가 필수적인 질병인 경우에 특별히 적합하다.
또한, 본 발명에 따르는 바이머 또는 올리고머는 백신으로서 사용하거나 감염성 질병에 대한 능동 또는 수동 면역화용 백신을 제조하기 위해 사용할 수도 있다. 능동 면역의 경우, 예방접종용으로 적합한 항원을 재조합 융합 단백질중의 성분 A로서 사용할 수 있다. 특히, 세균, 바이러스 또는 원생동물, 예를 들어, 플라스모디아(Plasmodia) 또는 트리파노솜(trypanosomes)의 표면 항원 또는 표면 항원의 분절을 사용할 수 있다. 비포괄적 목록에서, 바이머 또는 올리고머 또는 이들의 응집체를 함유하므로 재조합 융합 단백질이 하나 이상의 성분 A, 즉 병원체의 하나 이상의 동일하거나 상이한 항원을 가져야 하는 백신을 사용하여 풍진, 홍역, 소아마비, 광견병, 파상풍, 디프테리아, BCG, 결핵, 말라리아, 황열병, HIV 또는 인플루엔자 바이러스(예: 리노바이러스)의 예방접종을 할 수 있다. 바이머 또는 올리고머, 또는 바이머 또는 올리고머로부터 형성된 고차 응집체에서 상이한 조합이 본 발명에 따라서 또한 가능하므로, 동일한 병원체로부터의 상이한 항원이 바이머 또는 올리고머로 조합될 수 있거나, 2개 이상의 병원체로부터의 항원이 바이머 또는 올리고머 또는 고차 응집체로 조합될 수 있다. 통상적으로, 2개 이상의 성분 A1, A2 내지 AX가, 후속적으로 바이머 또는 올리고머 또는 본 발명에 따르는 고차 응집체의 성분이 되는 융합 단백질중에 함유될 수 있거나, 하나 이상의 성분 A에 관해서는 상이한 2개 이상의 융합 단백질이 하나 이상의 성분 B를 통해 바이머 또는 올리고 또는 고차 응집체로 조합될 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따르는 2개 이상의 상이한 바이머 또는 올리고머형도 약물 또는 백신으로서 사용하기 위한 또는 이의 제조를 위한 조성물내에 함유될 수 있다.
본 발명에 따르는 추가의 양태에서, 본 발명에 따르는 융합 단백질중의 성분 A는 면역조절제, 예를 들어, 인터루킨(IL), 특히 IL-2이다.
또한, 본 발명의 관점에서, 면역 및/또는 백신 아주반트로서의 본 발명에 따르는 바이머 또는 올리고머의 용도를 기술한다. 면역화용으로 사용되는 다수의 항원은 시험자에서 불만족스런 면역 반응만을 유발시키는 것으로 공지되어 있다. 아주반트의 역활은 면역원성 효과를 증가시키는 것이다. 이러한 유형의 아주반트는 본 발명에 따르는 융합 단백질중의 성분 A로서 사용될 수 있으므로 본 발명에 따르는 바이머 또는 올리고머의 성분으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 성분 A는 CD40 리간드(CD40L)로부터의 아미노산 서열 또는 인터류킨, 예를 들어, 인터류킨 1 내지 12 중의 하나의 서열 또는 서열 단편을 함유할 수 있다. CD40L의 생리학적 역활은 불활성 B 세포의 세포 주기내로의 형질전환을 조절한다. 인터류킨, 예를 들어, IL-4, IL-5, IL-6 및/또는 CD40L은 본 발명에 따르는 바이머화되거나 올리고머화된 복합체(바이머 또는 올리고머인 상이한 재조합 융합 단백질)내에서 조합될 수 있거나 통상적으로 하나 이상, 바람직하게는 본 발명에 따르는 2가지 이상의 상이한 유형의 바이머 또는 올리고머와 함께 면역원(들)을 함유하는 조성물(각각이 동일하거나 상이한 융합 단백질로부터 발달될 수 있는 2개 이상의 상이한 유형의 바이머 또는 올리고머)의 성분으로서 존재할 수 있다.
이러한 유형의 조성물의 올리고머의 바이머 또는 고차 응집체도 성분(들) A에 관해서는 동일하거나 상이한 융합 단백질로 이루어질 수 있다. 따라서, 동시-자극 특징 및/또는 면역계(세포 또는 체액성 면역 반응)를 활성화시키는 특징을 갖는 각 생리학적 서열을 성분 A로서 고려할 수 있다. 이는 생리학적 화합물 또는 합성 화합물일 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따르는 하나 이상의 바이머 또는 올리고머형(들)과 함께 하나 이상의 면역원(들)을 함유하여 본 발명에 따르는 바이머 또는 올리고머형이 바람직하게는 하나 이상의 면역조절제/면역조절제 아주반트가 이러한 유형의 바이머화 또는 올리고머화된 복합체내에 함유되도록 배열될 수 있는, 즉 이종 바이머 또는 이종올리고머가 존재하는 조성물을 기술한다. 경우에 따라, 본 발명에 따르는 이종바이머 또는 이종올리고머는 성분 A로서 면역원을 갖는 하나 이상의 융합 단백질뿐만 아니라, 성분 A로서 보조 성분(예: CD40L)을 갖는 하나 이상의 융합 단백질을 모두 지닐 수 있다. 각각 상이한 아주반트 또는 면역조절제 성분을 갖는 2개 이상의 상이한 융합 단백질을 본 발명에 따르는 이종올리고머에서 고려할 수도 있다. 이는 본 발명이 사람 의학 또는 수의학에 있어서 이러한 유형의 동종올리고머 또는 이종올리고머, 또는 본 발명에 따르는 이종올리고머 또는 동종올리고머의 한가지 이상의 유형을 함유하는 화합물의 약물 또는 백 신으로서의 용도를 또한 기술한다는 것을 의미한다.
본 발명의 관점에서, 바이머 또는 올리고머는, 바람직하게는 약물을 제조하거나 이들 바이머 또는 올리고머가 경구 투여, 즉 예를 들어, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여 또는 심지어 경구 또는 비강내 투여용으로 적합한 방식으로 상기 언급한 질병 또는 질환을 치료하기 위해 사용된다. 바이머 또는 올리고머 또는 이들의 응집체는 백신 또는 백신 제조용 기재로서 비경구 또는 경구 투여형으로 투여하나, 경우에 따라 비강내 투여형으로 투여하기도 한다.
본 발명에 따르는 바이머 또는 올리고머 및/또는 고차 응집체는 의약으로서 단독으로 사용될 수 있거나 의약의 제조시 포함될 수 있다. 그러나, 이는 다른 활성제 성분과 배합하여 의약으로서 사용할 수도 있다. 본 발명에 따르는 바이머 또는 올리고머 및/또는 고차 응집체는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 첨가제와 배합할 수도 있다. 적절한 제조 경로는 본 발명의 내용의 일부인 문헌[참조 문헌: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack. Pub. Co., Easton, PA, 1980]에 기재되어 있다. 비경구 투여용으로 고려될 수 있는 담체 물질의 예로는 멸균수, 멸균 NaCl 용액, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌 및 특히 생체적합성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체가 있다.
본 발명에 따르는 바이머 또는 올리고머, 또는 상응하는 고차 응집체는 시험관내 진단 분야 또는 예를 들어, 생화학적 정제법에서 또한 사용된다. 바이머 또는 올리고머 및/또는 이들의 고차 응집체로 충전될 수 있는 정제 컬럼에서 이러한 유형의 복합체의 용도가 고려될 것이다. 이는, 본 발명의 관점에서 이러한 유형의 복합체의 용도가 검출의 목적을 위해서도 기술된다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 관점에서, 상호작용으로 인해 단백질 표면에서 상호작용하고 그 결과 용액속에서 이량체화 또는 다량체화되어 발견되는 특별히 관련된 단백질을 제조하는 방법이 기술된다. 특히, 용액속에서 삼량체화되는 TNF 사이토킨 또는 바람직하게는 이러한 유형의 사이토킨의 가용성 분절의 경우, 이를 순수한 분획중에서 정의된 화학량론으로 사용한다. 서로 결합될 수 있는 상이한 단백질, 예를 들어, 3개의 상이한 TNF 사이토킨 또는 이러한 TNF 사이토킨의 상이한 분절이 단순히 동시발현되는 경우, 동시발현된 단백질의 통계학적으로 가능한 모든 분포는 발현 후에 결합된 삼량체, 즉 단백질 P1, P2 및 P3으로부터의 목적하는 삼량체뿐만 아니라, 2개의 단백질 P1 및 단백질 P3의 삼량체 등으로서 발견된다.
본 발명에 이르러, 소정의 목적하는 이종다량체, 예를 들어, TNF 사이토킨의 이종삼량체 또는 이러한 유형의 TNF 사이토킨의 분절을 수득하기 위해 본 발명에 따르는 올리고머를 본 방법에 따라서 사용할 수 있다. 당해 목적을 위해, 상이한 융합 단백질을 작제하고 바람직하게는 숙주 세포에서 발현시킨다. 이때 발현된 융합 단백질은 이종다량체로부터 동종올리고머를 형성시키는, 예를 들어, 3개의 상이한 쇄로 삼량체를 형성시키고 동일한 삼량체가 바이머화하거나 올리고머화하는 단백질의 성분 B 서열 절편을 갖는다. 바람직하게는, 융합 단백질중의 당해 성분 B는 보체 또는 콜렉틴 계열로부터의 단백질, 예를 들어, 이종삼량체로부터 동종육량체를 형성하는 C1q의 서열 단편에 상응한다. 따라서, 융합 단백질에서, 천연 단백질이 이종다량체내의 다량체화 서열을 제공하는 서열 단편은 성분 B로서 성분 A(예: TNF 사이토킨)과 조합되며, 다른 융합 단백질(이종삼량체로서 존재한다)은 각각 이종다량체화를 위해 또 다른 성분 A(예: 상이한 TNF 사이토킨 또는 이의 단편)와 천연 단백질(예: C1q 단백질)내의 또 다른 서열 절편의 조합을 갖는다.
이종다량체를 형성할 수 있는 상이한 융합 단백질은 바람직하게는 숙주 세포에서 발현된다. 성분 B가 동일한 이종다량체만을 올리고머화할 수 있기 때문에, 이종다량체는 동종올리고머로 조합된다. 본 발명에 따라서, 각각이 C1q의 다량체화 및 올리고머화 α, β또는 γ쇄와 조합되는 상이한 성분 A, 즉 예를 들어 바람직하게는 상이한 TNF 사이토킨을 각각 갖는 3개의 상이한 융합 단백질을 발현시킬 수 있다. 이어서, 모든 3개의 TNF 사이토킨을 갖는 이종다량체만이 관련 올리고머로서 발결될 수 있다. 반면에, 상이한 화학량론을 갖는 이종다량체는 발견되지 않는다. 이는, 본 발명에 따라서, 단순히 융합 단백질의 선택을 통해서 화학량론이 명확하고 통계학적 분포에 영향을 받지 않을 수 있는 화합물이 수득될 수 있다.
또한, 이러한 융합 단백질, 또는 성분 A와 성분 B 간에 링커를 갖는 이종다량체를 기존의 화학량론으로 추출하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 링커는, 이들 링커가 (이종다량체의) 동종올리고머 복합체로부터의 성분 A가 성분 B로부터 분해되도록 하는 하나 이상의 단백분해성 절단 부위를 함유할 수 있는 경우 특히 바람직하다. 이러한 방식으로, 오직 목적하는 이종다량체, 예를 들어, 상이한 TNF 사이토킨으로부터의 이종삼량체로만 이루어진 분획이 수득된다. 링커내의 단백분해성 절단 부위는 바람직하게는 트롬빈 보존(consensus) 서열이다.
본 발명의 추가의 목적으로서, 본원에서는 재조합 융합 단백질이 생물학적 기능, 특히 항체 또는 수용체에 대한 리간드 기능을 갖는 단백질 또는 단백질 분절 또는 항체 또는 항체의 분절을 함유하는 하나 이상의 성분 A 및 C1q 단백질 또는 콜렉틴 계열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질의 이량체화 또는 다량체화 및 바이머화 또는 올리고머화 분절 또는 이러한 분절의 기능성 유도체를 함유하는 하나 이상의 성분 B를 함유하는 한 이량체 또는 다량체를 바이머화 또는 올리고머화하기에 적합한 융합 단백질을 기술한다. 이들 유형의 단백질은, 재조합 융합 단백질의 성분 B가 단백질 C1q, SP-A, SP-D, BC, CL43 및 ACRP30의 다량체화 및/또는 올리고머화 분절을 함유하는 경우 매우 바람직하다. 이러한 상기 언급한 단백질의 분절의 기능성 유도체를 본 발명의 관점에서 사용할 수도 있다. 이러한 경우, 생물학적 활성을 갖는 성분 A와 함께, 융합 단백질은 통상적으로 오직 응집할 수 있는 상기한 단백질의 분절만을 갖지만 바람직하게는 이의 구형 "헤드" 도메인은 갖지 않는 성분 B를 함유할 수 있다.
리간드 EDA, 특히 포유동물 변이체, 보다 특히 사람 변이체의 올리고머화 콜라겐 도메인 또는 이러한 도메인의 기능성 유도체의 아미노산 서열을 함유하는 서열이 본 발명에 따르는 융합 단백질의 성분 B로서 또한 고려된다. 성분 B로서 보다 더욱 바람직한 사람 EDA 단백질의 아미노산 160 내지 242번을 함유하는 서열 분절 또는 기능성 유도체, 예를 들어, 단편을 사용할 수 있다. 바람직하게는 이는 육량체를 의미할 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 언급한 유형의 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다. 상기 유형의 DNA 서열은 발현 벡터에서 발현되므로, 본 발명에 따르는 융합 단백질의 DNA 서열을 함유하는 상응하는 발현 벡터가 또한 본 발명의 목적이다.
또한, 본 발명에 따르는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열로 형질감염시킨숙주 세포도 본 발명에 포함된다. 이러한 범주에서 특히 바람직한 것은 발현 벡터로 형질감염시킨 숙주 세포이며, 이로써 발현 벡터는 본 발명에 따르는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유한다.
본 발명의 추가의 목적은 수용체, 특히 이량체화 또는 다량체화되어 발견되는 TNF 사이토킨 계열로부터의 시그날 분자 리간드에 결합하는 수용체이다. 예를 들어, 이러한 종류의 수용체, 이의 유도체 또는 수용체 또는 유도체의 분절, 특히 수용체의 세포외 영역을 포함하며 이로써 결합 도메인(들)이 바람직한 분절은 이량체 또는 다량체의 성분인 융합 단백질의 성분 A로서 발견될 수 있다. 이량체화는 면역글로불린의 분절, 특히 Fc 단편과의 재조합을 통해 달성할 수 있으며, 다량체화는, 예를 들어, 단백질의 상응하는 다량체화 도메인과 재조합한 후에 달성할 수 있다. 당해 목적을 위해서는, 예를 들어 초2차 구조, 예를 들어, 코일드-코일 나선 또는 통상의 콜라겐형 삼중 나선(예: CMP, COMP, 콜라겐, 라미닌)의 형성을 통해 이량체 또는 다량체를 생성하는, 단백질의 모든 서열 분절이 적합하다. C1q 계열의 단백질 또는 콜렉틴의 분절도 통상적으로 수용체 또는 수용체 분절을 이량체화 또는 다량체화하는데 적합하다. 예를 들어, 성분 A로서 오량체 형태인, TNF 수용체 계열 구성원(예: Fas 수용체(FasR))의 세포외 분절은 COMP의 상응하는 오량체화 도메인과의 재조합을 통해 성분 B로서 발현시킬 수 있다. 이때, 수용체 또는 수용체 분절을 가지는 융합 단백질의 동종이량체, 이종이량체 또는 이종다량체가 있을 수 있다.
이러한 수용체 또는 수용체 분절을 함유하는 성분 A를 갖는 재조합 단백질의 이량체 또는 다량체도 의약으로서 고려될 수 있거나 의약 제조용으로 고려될 수 있다. 특히, 상응하는 수용체 리간드의 세포외 농도가 임상 사진에서 증가되는 경우 이를 사용한다. 이때, 세포상의 막 결합된 시그날 분자 그 자체, 예를 들어, TNF 사이토킨 또는 가용성 시그날 분자의 증가된 농도도 관련될 수 있다. 그러나, 상응하는 막 결합된 수용체에서 개시되는 시그날 절단 회로의 활성화가, 시그날 분자를 차단하고 수용체 또는 수용체 분절을 성분 A로서 함유하는 융합 단백질로 이루어진 본 발명에 따르는 외인성의 가용성 이량체 또는 다량체를 통해 방해되거나 저하되는 경우, 특히 이러한 유형의 다량체를 사용하는 것도 통상적으로 바람직하다. 본 발명을 하기 도면을 통해 더욱 상세히 설명한다.
도 1은 (2) 본 발명에 따르는 올리고머(FasL 육량체), 즉 삼량체의 바이머로 존재하는, 본 발명에 따르는 재조합 융합 단백질의 아미노산 서열을 단일 문자 코드로 나타낸 것이다. hFasL의 서열 분절(AA 103번 또는 139번 내지 281번)은 성분 A로서 동정되며, 서열 VDLEGSTSNGRQCAGIRL을 갖는 특이적 링커(결과적으로 바이머화되는)는 성분 B로서 나타낸다. 도 1은 (1) 당해 분야의 기술에 따라서 FasL 삼량체의 성분으로서만 나타나는, 즉 당해 경우에서 삼량체인, 현재의 다량체를 바이머화 또는 올리고머화하는 어떠한 성분 B도 가지지 않는 재조합 융합 단백질 아미노산 서열을 또한 함유한다. 두 융합 단백질(1) 및 (2)의 재조합 분절은 이의 각 기능성에 대한 서열 세부 사항과 함께 도 1에 표시한다.
도 2는, 환원 조건(r) 및 비환원 조건(nr)하에 특이적 링커 서열(성분 B)을 갖는 본 발명에 따르는 융합 단백질(2)의 전기영동(SDS-PAGE)의 결과를 도 2A에 포함한다. 본 발명에 따라서, 상이한 삼량체의 각 성분인, 본 발명에 따르는 2개의 융합 단백질(2)의 성분 B 간에 디설파이드 브릿지가 형성되기 때문에, 비환원 조건하에, 용액속에서 올리고머는 본 발명에 따르는 6개의 폴리펩타이드의 천연 복합체(융합 단백질(2))로서 용출된다. 당해 결과는, 단량체 형태인 본 발명에 따르는 융합 단백질(2)의 분자량의 6배에 상응하는 분자량을 갖는 FasL 육량체로서 본 발명에 따르는 올리고머가 존재한다는 것이다. 변성조건이 존재하는 경우(예를 들어, SDS-PAGE에서), 본 발명에 따르는 융합 단백질은 환원제의 부재하에 2개의 단량체 간의 디설파이드 브릿지의 형성에 의해 유발된 이량체로서 이동한다. 반면에, 환원 및 변성 조건하에, 본 발명에 따르는 융합 단백질(2)의 단량체는 SDS 겔에서 이동한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본원에서는 삼량체의 바이머인, 본 발명에 따르는 융합 단백질(2)의 본 발명에 따르는 올리고머를 도 2B에 도식적으로 나타낸다.
도 3은, FasL 삼량체(당해 분야의 양상에 따른 3개의 융합 단백질로부터의 삼량체, 예를 들어, 성분 B를 갖지 않는 도 1에 따르는 융합 단백질(1)), 또는 A20 또는 유르캣(Jurkat) 세포에 대한 항-플래그 M2 항체의 존재(■, ▲) 또는 부재(□, △)하에 도 2B에 도식적으로 나타낸 본 발명에 따르는 FasL 바이머(삼량체의 바이머로서의 육량체)의 농도에 따른 세포독성 검정의 결과를 나타낸다. 490nm에서 광학 밀도는 세포 생존성의 측정 수단이다(높은 광학 밀도는 첨가된 물질의 낮은 세포소멸 효과에 상응하므로 세포의 보다 높은 생존성에 상응한다). A20 세포(도 3A 및 도 3B) 및 유르캣 세포(도 3C 및 도 3D)에 있어 본 발명에 따르는 삼량체의 FasL 바이머(육량체)의 세포소멸 효과(각 △의 경우, 도 3B 및 3D)는 바이머화 또는 올리고머화 성분 B를 갖지 않는 융합 단백질의 FasL 삼량체(당해 분야의 양상, 도 3A 및 도 3C, 각 □의 경우)의 효과보다 3 내지 10배로 증가한다. 도 1에 나타낸 융합 단백질(1) 및 (2)의 플래그 서열에 대해 지시되는 추가의 항-플래그 항체의 경우, 세포소멸 효과는, 예를 들어, 가교를 통한 본 발명에 따르는 융합 단백질의 올리고머화도 증가에 의해 모든 표본(도 3A 내지 3D, 각각 ■또는 ▲)에서 증가한다.
도 4는, 특이적 링커 단편(융합 단백질(3)성분 B)이 (C→S) 치환된 것을 고려한 본 발명에 따르는 융합 단백질(3)("초 FasL")의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 겔-여과 시험에 있어, 용액속의 "초 FasL"은 육량체로서 본 발명에 따르는 바이머화된 형태로 발견되는 것으로 나타난다. 아미노산 치환 C→S로 인해 디설파이드 브릿지가 링커 단편에서 형성될 수 없기 때문에, SDS-PAGE상의 변성 조건하에, 본 발명에 따르는 융합 단백질(3)은 심지어 환원제의 부재하에서도 단량체로서 이동한다.
도 3과 유사하게, 도 5는, 항-플래그 M2 항체의 존재(●) 또는 부재(○)하에 도 4에 나타낸 바와 같은 본 발명에 따르는 융합 단백질(3)의 본 발명에 따르는 응집체를 첨가한 후에 A20(도 5B) 또는 유르캣 세포(도 5D)의 생존성을 나타낸 것이다. 본 발명에 따르는 융합 단백질(3)은 비교용으로 사용되는, 바이머화 또는 올리고머화 성분 B를 갖지않는 당해 분야의 양상에 따르는 FasL 삼량체(대조용으로 사용됨)(도 3A(A20세포) 및 도 3C(유르캣 세포))보다 약 1000배 이상의 세포소멸 효과를 야기한다. 항-플래그 M2 항체(●)를 첨가하여 "초 FasL"를 본 발명에 따르는 고차 응집체(도 5B 및 도 5D)로 보다 올리고머화시킴으로써 A20 및 유르캣 세포 둘다에 있어서 항-플래그 항체를 갖지 않는 표본보다 약 2배, 바람직하게는 1.5배 이상으로 다소 증가시킬 수 있다. 이의 결과는, 필수적으로, 성분 B로서 사용되는 본 발명에 따르는 융합 단백질(3)의 특이적 링커를 통해 야기되는 세포 표면상의 올리고머화를 통해 유발되는 세포소멸에 대한 올리고머화도(이때 삼량체의 바이머로서)가 사실상 이미 최적이며 본 발명에 따르는 고차 응집체에 의해 다소 증가될 수 있다는 것이다.
도 6A는, (N 말단부터 C 말단까지의 서열내의) 융합 단백질(4)는 플래그 서열, 성분 B로서 링크 서열, 단백질 mACRP30(m: 쥐)의 아미노산 18 내지 111번, 링커 LQ 및 성분 A로서의 hFasL의 아미노산 139 내지 281번을 갖는, 본 발명에 따르는 융합 단백질(4)인 FasL-ACRP30의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 6B는 추가의 융합 단백질을 나타낸 것이다. 이는 사람 ACRP30 리간드(hACRP30, 아미노산 18 내지 108번을 가짐)의 콜라겐 도메인을 포함하며, 이로써 이의 N-말단은 플래그 태그 DYKDDDDK에 융합되며 이의 C-말단은 사람 FasL의 세포외 도메인(AA 139 내지 281번)에 융합된다. hACRP30의 C-말단과 hFasL 사이뿐만 아니라 플래그 태그와 hACRP30의 N-말단(GPGQVQLQ) 사이에 링커 서열(MHVD)이 삽입된다. 상기 언급한 모든 데이터는 아미노산의 1문자 코드에 관한 것이다.
도 6C는, 항-플래그 항체 M2를 첨가한 경우(+) 및 항-플래그 항체 M2를 첨가하지 않은 경우(-)에 한편으로 FasL을 사용하고 다른 한편으로 융합 단백질 hACRP30/FasL을 사용한 유르캣 T-세포의 역가로부터 야기되는 곡선을 나타낸 것이다. 따라서, FasL 또는 hACRP30/FasL로 일시적으로 형질감염시키고 이들 단백질을 발현하는 293-세포의 상등액(OPTIMEM)을 유르캣 세포에 첨가한다. 연속적 시험에서, 도 6C의 x-축에 나타낸 농도 감소를 사용하고 각 T 세포의 생존율을 다른 경우에서 기술한 표준 세포독성 시험으로 측정한다. 그래프로부터, FasL이 가교 M2 항체 없이는(◆) 불활성이고 M2 항체의 가교 효과만이 세포독성 효과를 유발한다는 것이 명백하다. 이와 달리, 본 발명에 따르는 융합 단백질, 즉 hACRP30/FasL의 상응하는 효과는 M2 항체를 첨가하지 않은 경우(▲)에도 이미 나타난다. M2 항체의 첨가는 본 발명에 따르는 융합 단백질의 효과를 거의 증가시키지 못한다.
도 3과 유사하게, 도 7은 항-플래그 M2 항체의 존재(▲) 및 부재(△)하에, 바이머화 또는 올리고머화할 수 없는 FasL 삼량체(도 1에 따르는 융합 단백질(1)에 기초한 비교 시험; 도 7A) 및 본원에서는 본 발명과 도 6에 따르는 융합 단백질(4)의 삼량체의 테트라머, 즉 십이량체로서의 본 발명에 따르는 올리고머를 첨가한 후 BJAB의 생존성을 나타낸 것이다. 본 발명에 따르지 않는 FasL 삼량체는 플래그 서열로의 결합을 통해 올리고머화하는 항체의 부재하에 BJAB 세포에서 세포소멸 효과를 나타내지 않으며(도 7A, △), 융합 단백질(4)의 본 발명에 따르는 십이량체(삼량체의 테트라머)는 약 10ng/㎖(K50=8ng/㎖)의 농도에서 이미 세포 사멸을 유도하였다(도 7B). 이는 490nm에서 OD가 감소한다는 것을 통해 매우 명백하게 알 수 있다. 이러한 세포소멸 활성은 본 발명에 따르는 FasL-ACRP30 융합 단백질로 이루어진 본 발명에 따르는 십이량체의 제제에 항-플래그 M2 항체를 첨가하여 다소 증가시킬 수 있으며, 즉 본 발명에 따르는 십이량체는 세포소멸 효과에 대한 사실상 최적 응집 상태를 나타낸다. 반면에, 상응하는 항체에 의해 유발되는, 본 발명에 따른 고차 응집체로의 추가의 응집은 보다 현저한 어떠한 생물학적 효과도 야기할 수 없다.
성분 B로서의 ACRP30(AA 18-111)의 올리고머화 도메인과 조합된 성분 A로서의 hTRAIL의 아미노산 95번 내지 281번을 함유하는, 본 발명에 따르는 융합 단백질(5)의 아미노산 서열은 도 8(TRAIL-ACRP30)에 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 융합 단백질(5)는 용액속에서 올리고머, 즉 삼량체의 테트라머로서 발견된다.
도 9는, 항-플래그 M2 항체의 존재(▲) 및 부재(△)하에, 당해 분야의 양상에 따르는 바이머화 또는 올리고머화 능력을 갖지 않는 TRAIL 삼량체(N 말단에 플래그 서열 및 사람 TRAIL의 아미노산 95번 내지 281번을 갖는 융합 단백질)(비교 시험, 도 9A) 및 본 발명에 따르는 융합 단백질(5)의 십이량체인 TRAIL-ACRP30를 첨가한 후 유르캣 세포의 생존성을 나타낸 것이다. 도 9의 시험 관찰은 도 7에 나타낸 결과에 상응한다. TRAIL 삼량체가 플래그 서열에의 결합을 통해 올리고머화하는 항체의 부재하에 유르캣 세포에서 세포소멸 효과를 나타내지 않는 반면(도 9A(△)), 융합 단백질(5)의 본 발명에 따르는 십이량체는 본 시험뿐만 아니라 약 100ng/㎖의 농도(약 K50)에서 세포 사멸을 유도하였다(도 9B(△)). 올리고머화도를 추가로 증가시킴으로써, TRAIL 십이량체와 항-플래그 항체를 조합하여 첨가하는 것은 본 발명에 따르는 올리고머로부터 본 경우에서는 세포소멸-유도 활성이 (10배 이상) 증가된 본 발명에 따르는 고차 응집체(도 9B, (▲))를 추가로 형성시킬 수 있다.
성분 B로서 mACRP30(AA 18-111)의 올리고머화 도메인과 N-말단에 링커를 갖는 플래그 서열과 조합된 성분 A로서 mTNFα(m:쥐)의 아미노산 77번 내지 235번을 함유하는, 본 발명에 따르는 융합 단백질(6)의 아미노산 서열은 도 10(TNFα-ACRP30)에 도시되어 있다. 이는, 융합 단백질(6)이 용액속에서 십이량체, 즉 다량체(삼량체)의 올리고머(테트라머)로서 발견된다는 것을 의미한다.
도 11은 세포 증식 시험의 결과를 나타낸 것이다. 이때, CT6 세포의 세포 증식에 대한 값으로서, 성분 B를 갖지 않는 당해 분야의 양상에 따르는 삼량체(쥐 TNFα로부터의 아미노산 77번 내지 235번을 후속적으로 갖는 N 말단의 플래그 및 링커), 즉 mTNFα 삼량체(도 11A) 또는 본 발명과 도 6에 따르는 융합 단백질(6)에 따르는 십이량체(4×3)인 mTNFα-ACRP30(도 11B)의 농도의 함수로서의 마우스의 CT6 세포내로의 3[H]-티미딘의 혼입을 측정한다. 3[H]-티미딘의 혼입은 분당 총계(cmp)로 나타낸다. 당해 시험은 항-플래그 M2 항체의 존재(▲) 및 부재(△)하에 수행한다. 이때, 당해 분야의 양상에 통상적인 mTNFα의 삼량체는 TNF 수용체 2(TNF-R2)에 결합된 후 CT6 세포에 약간의 증식 효과만을 갖는다(도 11A). 명백하게 증가된 증식 효과는 항-플래그 항체를 첨가한 후(▲)에만 이의 가교 및 이에 따른 올리고머화 효과를 통해 관찰될 수 있다.
이와 달리, 도 11B에서, 본원에서는 본 발명에 따르는 융합 단백질(6)의 십이량체인, 삼량체의 본 발명에 따르는 올리고머는 이미 5ng/㎖에서 관찰될 수 있는 대규모의 증식 효과를 나타낸다(△). 반면에, 참조로서 가교 항-플래그 항체와 본 발명에 따르는 십이량체의 조합(▲)은 본 발명에 따르는 십이량체만을 첨가한 경우의 결과와 비교하여 증식 효과를 약간만 증가시킨다. 본원에서는 십이량체 형태인, 본 발명에 따르는 올리고머가 사실상 최적의 증식 효과를 이미 갖고 있다는 것을 이로부터 알 수 있다.
성분 A로서 hCD40L(h: 사람)의 아미노산 116번 내지 261번과 조합된 성분 B로서 ACRP30(AA 18-111)의 올리고머화 도메인을 함유하는, 본 발명에 따르는 융합 단백질(7)은 도 12(CD40L-ACRP30)에 도시되어 있다.
도 13은 도 11과 정확히 동일한 방식으로 세포 증식 시험의 결과를 나타낸다. 그러나, 본 경우에는 도 11과 달리 사람 PBL(말초혈 림프구)를 사용한다. 당해 도면은, 도 12에 나타낸 바와 같은 본 발명에 따르는 융합 단백질(7)의 본 발명에 따르는 십이량체인 CD40L-ACRP30(도 13B)의 효과와 비교한, 세포 증식에 미치는 용액속에서 삼량체 형태로 존재하는 통상의 CD40L(도 12에 나타낸 바와 같은 올리고머화 성분 B를 갖지 않는 hCD40의 아미노산 116번 내지 261번을 후속적으로 갖는 플래그 및 링커 서열; 도 13A)의 효과를 나타낸 것이다. 항-플래그 M2 항체의 부재하에 수행한 시험(△)은, CD40L 삼량체가 실질적으로 증식 효과를 갖지 않는 반면, 도 13B에서 상응하는 증식 효과가 매우 낮은 농도의 hCD40L의 경우 이미 검출될 수 있다는 것을 나타낸다. 도 13B에서, x-축은 가변적 "1/희석액", 즉 절대 농도가 공지되지 않은 농축된 상등액을 첨가하기 때문에 절대적이지 않은 농도를 나타낸다. 참조로서 가교 항-플래그 항체와 본 발명에 따르는 융합 단백질(7)의 조합(▲)은 고차 응집체의 형성을 통해 상응하는 증식 효과를 추가로 (보다 저 농도로) 변화시킬 수 있다.
도 14는 올리고머화된 다량체의 구조의 도식적 설명을 나타낸 것이다. 도 14A 및 도 14B는 이미 천연의 올리고머화된 구조를 갖는 천연 "다발(bundle) 단백질"의 모양의 도식을 나타낸 것이다(도 14A: 보체 단백질 C1q를 형성하는 헤드 도메인 삼량체의 육량체; 도 14B: 지방세포를 통해 생성되는 혈청 단백질인 ACRP30을 형성하는 헤드 도메인 삼량체의 테트라머). 이러한 방식으로, C1q 또는 ACRP30 복합체에서 천연 단량체의 헤드 도메인은 다량체화 및 올리고머화된다. C1q 올리고머화 복합체가 3개의 상이한 유전자 생성물로부터 형성되는 반면, ACRP30 올리고머화 복합체는 동종십이량체, 즉 다량체화 및 올리고머화된 동일한 유전자 생성물이다. 상기 언급한 천연 올리고머화 복합체가 기초하는 각각의 개별적인 폴리펩타이드 쇄는 헤드 도메인, 콜라겐 삼중 나선을 형성할 수 있는 서열 절편, 및 6개(C1q 복합체) 또는 4개(ACPR30 복합체)의 콜라겐 삼중 나선을 각각 18개 또는 12개 단량체의 나선 다발로 올리고머화할 수 있는 서열 절편을 각각 갖는다.
도 14C는, 예를 들어 성분 A로서 본 발명에 따르는 융합 단백질에서 발견되는 성분 B로서 ACRP30 단백질의 콜라겐형 서열 절편을 통해 본 발명에 따르는 동종십이량체로 올리고머화되는 4개의 삼량체화된 TNF 리간드(예: TNF 리간드 FasL) 또는 TNF 리간드의 분절을 갖는 본 발명에 따르는 융합 단백질(예: 도 6에 나타낸 융합 단백질(4)인 FasL-ACRP30)의 올리고머화된 다량체의 도식적 설명을 포함한다.
도 15A는 본 발명에 따르는 추가의 융합 단백질, 즉 hEDA/FasL의 구성을 기술한다. 여기에서, 사람 EDA의 콜라겐 도메인(아미노산 160번 내지 242번)은 플래그 에피토프가 링커를 통해 N-말단적으로 융합되고 도 15A의 FasL(AA 139-281, 즉 FasL의 세포외 도메인 또는 이의 단편)인 성분 A가 마찬가지로 링커를 통해 C-말단적으로 커플링되는 성분 B로서 작용한다. 본 발명에 따르는 융합 단백질 hEDA/FasL은 2×3량체인 육량체로서 존재한다. EDA 단백질은 경막 도메인 및 TNF 도메인 이외에 콜라겐 도메인(상기 도 15A)을 또한 가지며 이의 사람 형태인 391개의 아미노산을 포함하는, TNF 계열의 추가의 구성원이다.
도 15B는 본 발명에 따르는 융합 단백질 hEDA/FasL를 사용한 연구를 설명한다. 융합 단백질을 생성하기 위해, 사람 EDA의 콜라겐 도메인(아미노산 160번 내지 242번)를 먼저 상응하는 프라미를 사용해 증폭시킨 다음, 플래그 및 사람 FasL의 세포외 도메인(아미노산 139번 내지 281번)에 대해 각각 N-말단 및 C-말단에서 상응하는 서열로 융합시킨다.
도 15B는, 항-플래그 항체 M2를 첨가한 경우 및 항-플래그 항체 M2를 첨가하지 않은 경우에 한편으로 FasL을 사용하고 다른 한편으로 융합 단백질 hEDA/FasL을 사용한 유르캣 T-세포의 역가로부터 야기되는 곡선을 나타낸 것이다. 따라서, FasL 또는 hEDA/FasL로 일시적으로 형질감시키고 이들 단백질을 발현하는 293-세포의 상등액(OPTIMEM)을 유르캣 T-세포에 첨가한다. 연속적 시험에서, 도 15B의 x-축에 나타낸 농도 감소를 사용하고 각 T 세포의 생존율을 다른 경우에서 기술한 표준 세포독성 시험으로 측정한다. 그래프로부터, FasL이 가교 M2 항체 없이는(□) 불활성이고, 당해 경우에 M2 항체에 의한 가교 효과만이 세포독성 효과를 유발한다(■)는 것이 명백하다. 이와 달리, 본 발명에 따르는 융합 단백질, 즉 hEDA/FasL의 상응하는 효과는 M2 항체의 첨가 없이도 이미 나타난다(○). 당해 경우에, M2 항체의 첨가는 본 발명에 따르는 융합 단백질의 효과를 여전히 증가시킬 수 있다(●).
본 발명은 하기 양태를 사용하여 보다 상세히 설명한다.
다음의 실험 상황 (a) 내지 (f)는 기술된 적절하고 상응하는 변형이 적용되지 않는 한도내에서 다음 여섯 가지 양태를 위해 기술할 것이다.
(a) FasL, TRAIL. TNFα 및 CD40L 융합 단백질용 벡터 작제
5' 영역내의 비해독된 서열의 6개의 염기(CAA AAC ATG GCT ATC ATC TAC CTC ATC CTC CTG TTC ACC GCT GTG GGG GGC)를 포함하는, 헤마글루티닌의 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA 단편 및 플래그 에피토프(GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA), 링커(GGA CCC GGA CAG GTG CAG), 제한 부위 PstI, SalI, XhoI 및 BamHI을 염기 720번 내지 769번이 결실된, 변형된 PCRIII 벡터(공급원: InVitrogen, NV Leedk, Netherlands)(PS 038)의 제한 부위 HindII 및 BamHI 간에 클로닝시킨다. 삼량체 FasL의 발현 벡터의 경우, 제한 부위 PstI 및 EcoRI로 프레임된, 사람 FasL을 암호화하는 서열의 아미노산 139번 내지 281번을 PCR로 증폭시키고 변형된 PCRIII 벡터에 클로닝시킨다.
육량체 FasL의 경우, 양측면이 EcoRI 제한 부위로 프레임되고 5' 말단에 링커 서열 GGCTT가 첨가되고 3' 말단에 종결 코돈(TAA)가 첨가된 아미노산 103번 내지 281번에 대한 암호화 서열 및 천연의 비해독된 서열(GAG AAG CAC TTT GGG ATT CTT TCC ATT ATG ATT CTT TGT TAC AGG CAC CGA GAT GTT GAA GCC)을 벡터 PS 038의 EcoRI 제한 부위내로 클로닝시킨다. EcoRI 제한 부위의 5' 측면의 서열 CAGTGTGCTG를 PCR 돌연변이 방법을 보조로 하여 CAGTCTGCAG로 대체된 벡터 PS 038의 링커 서열에 점 돌연변이를 도입하여 "초 FasL"(도 4, 융합 단백질(3))를 생성시킨다. 이어서 상기 FasL(아미노산 103번 내지 281번)을 상기 기술한 방법으로 변형된 PS 038내로 클로닝시킨다.
사람 TRAIL, 쥐 TNFα 및 사람 CD40L의 경우, 5'말단에 PstI 제한 부위 및 종결 코돈 및 SpeI 및 EcoRI 제한 부위를 갖는 세포외 도메인의 일부(TRAIL: 아미노산 95번 내지 281번, TNFα: 아미노산 77번 내지 235번, CD40L: 아미노산 116번 내지 261번)을 PCR을 통해 증폭시키고 벡터 PCRIII(공급원: Invitrogen)에 클로닝시킨다. 리간드를 삼량체로서 발현시키기 위해, 먼저 플래그 태그를 암호화하는 서열 GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA 및 링커 서열 GGA CCC GGA CAG GTG CAG GTG CAG를 벡터 pQE-16(공급원: Qiagen)내의 제한 부위 BamHI과 PstI 간에 삽입한다(PS 330). 마지막으로, 리간드를 PstI/SpeI 단편으로서 PS 330에 아클로닝시킨다.
FasL-ACRP30용 발현 벡터를 다음 방식으로 작제한다. EST 클론 AA673154를 사용하여, 제한 부위 NsiI 및 PstI으로 프레임된, 쥐 ACRP30의 아미노산 18번 내지 111번에 대한 암호화 서열을 PCR법을 사용하여 (융합된 NsiI/PstI 제한 부위가 암호화 서열의 5' 측면에 위치되게 하는 방식으로) 삼량체 FasL을 암호화하는 벡터의 PstI 제한 부위내로 클로닝시킨다. 기타 TNF 사이토킨과 ACRP30의 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터는 발현 벡터 FasL-ACRP30내의 FasL의 상응하는 서열을 각 리간드 서열에 의해 제한 부위 PstI 및 EcoRI내로 치환시켜 생성시킨다.
(b) 재조합 융합 단백질의 발현 및 정제
안정한 클론을 삼량체 TRAIL, TNFα및 CD40L용 세균에서 확립시킨다. 각 클론을 37℃에서 암피실린(100㎍/㎖) 및 가나마이신(50㎍/㎖)이 첨가된 LB 브로쓰에서 밤새 예비배양하고, 1시간 후에 발현을 위해 0.5mM IPTG(공급원: Sigma)로 6시간 동안 유도한 주 배양물을 접종하는데 사용한다. 상기 세균을 원심분리에 의해 수거하고 PBS에서 2회 세척하고 "프렌치 프레스"에서 용해시키고 용해물을 원심분리에 의해 불용성 잔사로부터 분리한다. 800㎍/㎖ G418에서 선별하여 HEK293 세포에서 모든 FasL 단백질에 대한 안정한 클론을 제조한다[참조 문헌: Schneider et al., J. Exp. Med, 1998].
삼량체 및 육량체 리간드 및 초 FasL를 M2 아가로스(공급원: Switzerland)에서 친화성 크로마토그래피시켜 안정한 클론 또는 세균 용균물의 상등액으로부터 정제하고 50mM 시트레이트 NaOH(pH=2.5)로 용출시키고 0.2 용량 Tris-HCl(pH=8)로 즉시 중화시킨다. 완충액을 농축기(Centrikon-30, 공급원: Amicon Corp., Easton, TX, USA)에서 PBS로 대체한다.
FasL과 쥐 ACRP30의 융합물을 다음 방식으로 정제한다. 상등액을 50mM NaCl 및 1mM CaCl2와 혼합하고 pH 값을 염산/NaOH를 사용하여 7.0으로 조정한다. 이어서 재조합 융합 단백질을 M1-아가로스(공급원: Sigma, Switzerland)에 결합시키고 TBS-EDTA(10mM)에서 용출시킨다. 완충액을 농축기에서 PBS로 대체한다. 정제된 단백질의 농도는 표준으로서 소 혈청 알부민을 사용하는 비시콘산 방법(공급원: Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA)을 통해 측정하고 샘플의 순도를 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색을 통해 측정한다.
각 검정에서, TRAIL, TNFα 및 CD40L과 ACRP30의 융합 단백질을 다음 방식으로 생성된 농축된 상등액 형태로 첨가한다: 237T 세포를 인산칼슘 방법을 통해 각각의 발현 플라스미드로 형질감염시킨다. 세포를 16시간 동안 침진시키면서 배양한 후, 세포를 PBS로 세척하고 무혈청 배지(공급원: Optimen, Gibco BRL)에서 4시간 동안 배양한다. 상등액을 농축기를 통해 본래 용적의 1/20로 감소시키고 단백질의 존재를 웨스턴 블롯팅(Western blotting)으로 조사한다. 재조합 융합 단백질의 각 농도를 측정하기 위해, TRAIL-ACRP30 및 TNFα-ACRP30의 경우 이들 단백질의 역가를 정제된 삼량체 TRAIL 또는 TNFα의 역가와 비교한다.
(C) 겔-투과 크로마토그래피를 통한 다량체의 분자량 조사
상이한 융합 단백질의 크기를 슈퍼덱스 200 HR10/30(공급원: Pharmacia)에서 겔-여과를 통해 측정한다. 삼량체 및 육량체 리간드의 경우 내부 표준 카탈라제 및 난백알부민을 갖는 재조합 단백질, 및 ACRP30 융합 단백질에 대한 페리틴 및 난 백알부민을 200㎕의 용적으로 컬럼에 부가하고, PBS(0.5㎖/분)로 용출시키고 0.25㎖의 분획으로 수집한다. 트리클로로 에탄산을 통해 침전시킨 후 상이한 분획중의 단백질의 존재를 웨스턴 블롯팅으로 측정한다. 단백질의 크기는 티로글로불린(669kDa), 페리틴(440kDa), 카탈라제(262kDa), 알돌라제(158kDa), 소 혈청 알부민(67kDa), 난백알부민(43kDa), 키모트립시노겐 A(25kDa) 및 리보뉴크레아제 A(13.7kDa)를 보조로 하여 측정한다.
(d) 세포
쥐 B-림프종 A20 세포를 5% 열-불활성화된 FCS가 함유된 DMEM에 보유시킨다. 사람 T- 림프아세포종 유르캣 세포, BJAB 버킷트-림프종 세포를 10% FCS가 첨가된 RPMI에서 배양한다. 사람 배아 신장 세포 293을 2% FCS가 첨가된 DMEM 다중 물질 혼합물 F12(1:1)에서 배양한다. 모든 배지는 항생제(각각 5㎍/㎖의 페니실린 및 스트렙토마이신 및 10㎍/㎖의 네오마이신)를 함유한다. IL-2 의존성 쥐 세포독성 T-세포주 CT6을 10% FCS, 1mM 나트륨피루베이트, 50μM 2-머캅토에탄올, 10mM HEPES 및 10% 조건화된 EL-4 세포 상등액이 보충된 RPMI에서 배양한다.
(e) 세포독성 검정
세포독성 검정은 필수적으로 슈나이더 등이 이미 기술한 바와 같이 수행한다[참조 문헌: J Biol. Chem., 272:18827-18833, 1997]. 5만개의 세포를, 1㎍/㎖ M2 항체(TRAIL의 경우 2㎍/㎖)의 존재 또는 부재하에 표시한 리간드 농도를 함유하는 100㎕ 배지에서 16시간에 걸쳐 배양한다. 생존성(세포 생존 비율)은 PMS/MTS(페난진메토설페이트 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-5-[3-카복시메톡시페닐]-2-[4-설포페닐]-2H-테타라졸륨, 염](공급원: Promega Corp., Madison, WI)를 보조로 하여 측정한다. 필요한 시간(통상적으로 1 내지 3시간) 동안 발색되게 한다. 흡광도는 490nm에서 측정한다.
(f) B 세포 증식 검정
CD19 양성 세포는 마그네틱 "비드"를 사용하여 사람 PBL(말초혈 림프구)로부터 FACS 선별함으로써 선택하고 정제하며, CD-19 음성 세포는 3000래드로 조사(照射)한다. 100만개의 정제된 CD-19 양성 세포를 M2 항체가 첨가되거나 첨가되지 않은 적정된 가용성 CD40L 융합 단백질을 함유하는 120㎕ 배지(RPMI 10% FCS, 항생제)에서 조사된 100,000개의 자가 CD-19 음성 PBL를 함유하는 96-웰 플레이트에서 72시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 [3H]-티미딘으로 6시간 동안 펄스시키고 혼입을 액체 섬광 계측으로 측정한다.
양태를 실행하기 위해 사용된 방법의 설명에 관해서는, 문헌[참조 문헌: Schneider et al., J. Exp. Med., Vol. 187, No. 8, 1998, 1205-1213] 및 여기서 인용된 공보가 참조로 명백히 인용된다.
제1 양태
성분 A로서 hFasL(h: 사람)의 아미노산 103번 내지 281번을 가지며 성분 B로서 아미노산 103번의 N-말단에 18개 아미노산의 서열(ADLEGSTSNGRQCAGIRL)을 갖는 재조합 융합 단백질(2)를 발현시킨다. 추가로, 아미노산 DYKDDDK을 갖는 플래그 서열 및 이에 후속적인 링커 서열 GPGQVQLQ을 융합 단백질의 N-말단(성분 B의 N-말단)(도 1)에 커플링시킨다.
비교 시험을 위해, 마찬가지로 N-말단에 상기 언급한 플래그 서열을 가지며 C-말단에 후속적인 동일한 링커 서열을 갖는 융합 단백질(1)를 발현시키고, C-말단에서 hFasL의 아미노산 139번 내지 281번을 이에 연결시킨다. 따라서, 융합 단백질은 특이적 링커 및 hFasL(도 1)의 아미노산 103번 내지 138번을 포함하는 결실로 인해 융합 단백질(2)와 상이하다.
융합 단백질(1) 및 (2)의 벡터 작제는 (a)에 기술한 과정에 따라서 수행한다. 융합 단백질의 발현 및 정제는 (b)에서 기술한 과정에 따라서 수행한다.
정제된 융합 단백질(1)을 환원 또는 비환원 조건에 도입한 다음, 겔 전기영동에 의해 분리하고(도 2) 대략적으로 측정한 분자량의 각 밴드와 연결시킨다.
마지막으로, (d)에 따라 배양된 A20 및 유르캣 세포를 제거하고 (e)에 따라 세포독성 검사를 한다. 본 검정은 항-플래그 M 항체(공급원: Sigma, Buchs, Switzerland)의 존재 또는 부재하에 삼량체화된 융합 단백질(1) 또는 융합 단백질(2)의 삼량체의 바이머(즉, 육량체)를 증가시키면서 2개의 세포주에 대해 각각 수행하며(도 3), 이때 흡광도는 OD 490nm에서 측정한다.
제2 양태
성분 A로서 hFasL의 아미노산 103번 내지 281번을 가지며 성분 B로서 아미노산 103번의 N-말단에 18개의 아미노산의 아미노산의 서열(VDLEGSTSNGRQSAGIRL, 이른바 특이적 링커)를 갖는 재조합 융합 단백질(3)을 발현시킨다. 추가로, 아미노산 DYKDDDK을 갖는 플래그 서열 및 이에 후속적인 링커 서열 GPGQVQLQ을 융합 단백질의 N-말단(성분 B의 N-말단)(도 4)에서 커플링시킨다. 비교 시험을 위해, 융합 단백질(1)을 제1 양태(도 4)와 동일한 방식으로 발현시킨다.
융합 단백질(3) 및 (1)의 벡터 작제는 제1 양태에서 기술한 과정에 따라서 수행한다. 융합 단백질의 발현 및 정제는 (b)에 기술한 과정에 따라서 수행한다.
마지막으로, (d)에 따라 배양된 A20 및 유르캣 세포를 제거하고 (e)에 따라 세포독성 검사를 한다. 본 검정은 항-플래그 M2 항체(공급원: Sigma, Buchs, Switzerland)의 존재 또는 부재하에 삼량체화된 융합 단백질(3)의 농도 증가를 나타내는 2개의 세포주에 대해 각각 수행하며(도 5), 이때 흡광도는 OD 490nm에서 측정한다.
제3 양태
성분 A로서 hFasL의 아미노산 139번 내지 281번을 가지며 성분 B로서 성분 A의 아미노산 139번의 N-말단에 먼저 서열 LQ를 갖는 링커 이량체 및 추가로 N-말단에 단백질 mACRP30으로부터의 94개의 아미노산의 서열(아미노산 18번 내지 111번), 올리고머화 도메인을 가지는 재조합 융합 단백질(4)를 발현시킨다. 추가로, 아미노산 DYKDDDDK를 갖는 플래그 서열 및 이에 후속적인 링커 서열 GPGQVQLH를 융합 단백질(4)의 N-말단(성분 B로부터 N-말단적으로)(도 6)에서 커플링시킨다.
융합 단백질(1)을 비교 시험용으로 사용한다.
융합 단백질의 발현 및 정제는 (b)에서 기술한 과정에 따라서 수행한다.
마지막으로, (d)에 따라서 배양한 BJAB 버킷트 림프종 세포 및 유르캣 세포를 제거하고 (e)에 따라 세포독성 검정을 한다. 본 검정은 항-플래그 M2 항체(공급원: Sigma, 상기 참조)의 존재 또는 부재하에 융합 단백질(1)의 삼량체, 또는 재조합 FasL-ACRP30(4×3)을 의미하는 융합 단백질(4)의 올리고머화된 삼량체(십이량체)에 대해 각각 수행하며(도 7), 이때 흡광도는 OD 490nm에서 측정한다.
제4 양태
성분 A로서 hTRAIL(h: 사람)의 아미노산 95번 내지 281번을 가지며 성분 B로서 성분 A의 아미노산 95번의 N-말단에 먼저 서열 LQ를 갖는 링커 이량체 및 추가로 N-말단에 단백질 mACR30으로부터의 94개의 아미노산의 서열(아미노산 18번 내지 111번), 올리고머화 도메인을 가지는 재조합 융합 단백질(5)를 발현시킨다. 추가로, 아미노산 DYKDDDDK를 갖는 플래그 서열 및 이에 후속적인 링커 서열 GPGQVQLH를 융합 단백질(4)의 N-말단(성분 B로부터 N-말단적으로)(도 8)에서 커플링시킨다. 비교 시험을 위해, 용액속에서 삼량체(TRAIL 삼량체)로서 발견되는 융합 단백질을 발현시킨다(도 8에 나타내지 않음). 이러한 비교 시험용 단백질은 (N-말단부터 C-말단까지) 플래그 서열, 서열 GPGQVQLH를 링커 및 마지막으로 hTRAIL(AA 95번 내지 281번)을 갖는다. 융합 단백질(5)와 달리, 성분 B(mACRP30: AA 18번 내지 111번) 및 서열 LQ를 갖는 링커는 결실되어 있다.
융합 단백질의 발현 및 정제는 (b)에서 기술한 과정에 따라서 수행한다.
마지막으로, (d)에 따라서 배양한 T-림프아세포종 유르캣 세포를 제거하고 (e)에 따라 세포독성을 검정한다. 본 검정은 항-플래그 M2 항체(공급원: Sigma, 상기 참조)의 존재 또는 부재하에 ACRP30 서열을 갖지 않는 융합 단백질의 올리고머화된 삼량체(비교용) 또는 융합 단백질(5)의 십이량체, 즉 재조합 TRAIL-ACRP30의 십이량체(4×3)의 농도를 증가시키면서 수행하며(도 9), 이때 흡광도는 OD 490nm에서 측정한다.
제5 양태
성분 A로서 mTNFα(m:쥐)의 아미노산 77번 내지 235번을 가지며 성분 B로서 아미노산 85번의 N-말단에 서열 LQ를 갖는 링커 이량체 및 이어서 추가로 N-말단에 단백질 mACRP30으로부터의 94개의 아미노산의 서열(AA 18번 내지 111번), 올리고머화 도메인을 갖는 재조합 융합 단백질(6)을 발현시킨다. 추가로, 아미노산 DYKDDDDK를 갖는 플래그 서열 및 이에 후속적인 링커 서열 GPQVQLH를 융합 단백질의 N-말단에(성분 B로부터 N-말단적으로) 커플링시킨다(도 10).
비교 시험을 위해, 용액속에서 삼량체(TNFα 삼량체)로서 발견되는 융합 단백질을 발현시킨다(도 10에 나타내지 않음). 이러한 비교 시험용 단백질은 (N-말단부터 C-말단까지) 플래그 서열, 서열 GPGQVQLH를 링커 및 마지막으로 mTNFα(AA 77번 내지 235번)을 갖는다. 융합 단백질(6)과 달리, 성분 B(mACRP30: AA 18번 내지 111번) 및 서열 LQ를 갖는 링커는 결실되어 있다.
융합 단백질의 발현 및 정제는 (b)에서 기술한 과정에 따라서 수행한다.
(f)에 따르는 세포 증식 검정을 보조로 하여, 항-플래그 M2 항체(공급원: Sigma, 상기 참조)의 존재 또는 부재하에 TNFα 삼량체 또는 TNFα-ACRP30 올리고머(TNFα의 동종십이량체)의 농도를 증가시키면서 CT6 세포에 첨가하는 것의 효과를 측정한다.
당해 목적을 위해, CT6 세포는 증식 시험에 앞서 4일 동안 감소된 농도의 EL-4 상등액(2.5%)의 존재하에 제조한다. 상기 세포를, 2㎍/㎖ M2 모노클로날 항 체의 존재 또는 부재하와 EL-4 상등액의 부재하에 지시된 농도의 TNFα-ACRP30 올리고머 또는 mTNFα와 함께 96-웰 역가 플레이트(웰당 40,000개 세포)에서 16시간 동안 배양한다. 세포를 추가로 6시간에 걸쳐 3[H]-티미딘(0.5μCi/웰)로 펄스시키고 3회의 동결 및 해동 사이클에 도입하고 마지막으로 수거한다. 3[H]-티미딘 혼입을 액체 섬광 방법으으로 마지막으로 조사한다(도 11).
제6 양태
성분 A로서 hCD40L(h: 사람)의 아미노산 116번 내지 261번을 가지며 성분 B로서 성분 A의 아미노산 95번의 N-말단에 먼저 링커 이량체 LQ 및 추가로 N-말단에 단백질 mACR30으로부터의 94개의 아미노산의 서열(아미노산 88번 내지 111번), 올리고머화 도메인을 가지는 재조합 융합 단백질(7)를 발현시킨다. 추가로, 아미노산 DYKDDDDK를 갖는 플래그 서열 및 이에 후속적인 링커 서열 GPGQVQLH를 융합 단백질(4)의 N-말단(성분 B로부터 N-말단적으로)에서 커플링시킨다(도 12).
비교 시험을 위해, 용액속에서 삼량체(CD40L 삼량체)로서 발견되는 융합 단백질을 발현시킨다(도 12에 나타내지 않음). 이러한 비교 시험용 단백질은 (N-말단부터 C-말단까지) 플래그 서열, 서열 GPGQVQLH를 갖는 링커 및 마지막으로 hCD40L(AA 116번 내지 261번)을 갖는다. 융합 단백질(7)과 달리, 성분 B(mACRP30: AA 18번 내지 111번) 및 서열 LQ를 갖는 링커는 결실되어 있다.
융합 단백질의 발현 및 정제는 (b)에서 기술한 과정에 따라서 수행한다.
마지막으로, (f)에 따르는 세포 증식 검정을 PBL에서 유사하게 수행하여, CD40L 삼량체 CD40L-ACRP30 올리고머(동종십이량체)를 항-플래그 M2 항체(공급원: Sigma, 상기 참조)의 존재 또는 부재하에 첨가한다(도 13).
제7 양태
7.1 시험 과정
제7 양태는 다량체화 및 올리고머화 성분 A 및 성분 B로서의 수용체로 이루어진 융합 단백질에 관한 것이다.
(A) 벡터 작제
융합 단백질은 교환가능한 모듈을 다음 순서(5' 내지 3')에 따라 배열함으로써 변형된 PCR-3 벡터(공급원: Invitrogen)로부터 작제한다:
(a) 선행하는 코작(Kozak) 서열 GCCACC(5'-비해독된 영역의 처음 24개의 뉴클레오타이드에 위치하는, hTNF-R1(아미노산 1번 내지 211번); h-TRAIL-R1(아미노산 1번 내지 239번); h-TRAIL-R2(아미노산 1번 내지 212번); h-TRAIL-R3(아미노산 1번 내지 240번) 및 hCD40(아미노산 1번 내지 193번) 또는 hFasR(아미노산 1번 내지 170번)의 경우)과 함께 수용체의 세포외 도메인을 함유하는 HindIII/SalI 모듈, (b) (문헌[참조 문헌: Terskikh et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1663]에 기재되어 있는 바와 같은) SalI/XhoI-카셋트내의 14개의 아미노산 길이의 링커(PQPQPKPQPKPEPE), (c) OPG(아미노산 187번 내지 401번, 본원에서는 δN-OPG로 명명됨), CMP(아미노산 451번 내지 493번), 진뱅크 115555); COMP(아미노산 32번 내지 75번), 진뱅크 1705995)의 경우 Xhol/NotI-모듈의 올리고머화 도메인, (d) 조합된 His6-myc-태그 및 종결 코돈을 함유하는 NotI/XbaI-카셋트. 올리고머화 도메인은 각각 N-말단 및 C-말단에서 아미노산 서열 GGCC 및 ARTPGGGS로 프레임된다. 링커는 모든 작제물에 사용한다. Fc-작제물의 경우, "힌즈" 영역, CH2 및 CH3 도메인 및 hIgG1의 종결 코돈을 앞서 기술한 바와 같은 SalI/NotI-카셋트로서 클로닝시킨다[참조 문헌: Schneider et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 18827; Scheneider et al. (1998) J. Exp. Med. 187, 1205]. 재조합 융합 단백질을 생성하기 위한 안정한 HEK-293 유도된 세포주를 앞서 기술한 방법[참조 문헌: Schneider et al. (1997), 부분적으로 인용됨]으로 800㎍/㎖ G418에서 선별함으로써 확립시킨다.
(B) 일시적 형질감염
293T 세포를 앞서 기술한 CaCl2 방법[참조 문헌: Schneider et al. (1997), 부분적으로 인용됨]으로 형질감염시키고 PBS로 세척한 다음, 무혈청 Optimem 배지에서 3일 동안 배양한다. 상등액을 30배로 농축시키고 필요할때까지 동결 상태로 유지한다. 농축된 Optimem 배지중의 Fas/δN-OPG 및 Fas/CMP 융합 단백질의 농도를 표준으로서 정제된 Fas/COMP를 사용하여 "웨스턴 블롯"상에서 적정하여 측정한다.
(C) 재조합 단백질의 정제
안정하게 형질감염된 293-세포의 상등액을 M2-아가로스(리간드로서) 또는 단백질 A-세파로스(Fc 융합 단백질)에 부가하고 PBS로 세척하고 50mM 시트레이트-NaOH(pH 2.5)로 용출시킨다. 용출물을 Tris-HCl(pH 8)로 중화시키고 완충액을 센 트리콘30 농축기(공급원: Amicon, Easton, Texas)에서 PBS로 변경한다. COMP 및 CMP 융합 단백질을 하이트랩-킬레이트(HiTrap-chelate) 컬럼에서 정제한다. 당해 목적을 위해, 안정하게 형질감염된 293 세포의 상등액을 500mM NaCl 및 10mM 이미다졸로 보충하고, 0.5M ZnSO4(pH 2.5)로 피복하고 PBS에서 평형시킨 컬럼에 부가한다. 상기 컬럼을 PBS로 세척하고 단백질을 50mM EDTA를 함유하는 PBS로 용출시킨다. 완충액을 앞서 기술한 바와 같이 PBS로 변경한다.
플래그-FasL 및 플래그-TRAIL을 앞서 기술한 바와 같이 제조한다[참조 문헌: Schneider et al. 1997, J. Biol. Chem. 272, 18827 및 Thome et al., 1997, Nature 386, 517]. 상기 참조 문헌 둘다는 본 출원의 실체적 내용에서 참조로 인용된다. Flag-CD40L(AA 116번 내지 261번)를 플래그-TRAIL에 대해 기술한 바와 같이 세균에서 발현시키고 M2-아가로스에서 정제한다. 단백질 농도는 비시콘산 방법을 사용하여 측정한다. 정제도는 SDS-PAGE 및 쿠마시-블루 염색으로 조사한다.
(D) 겔 투과 크로마토그래피
겔 투과 크로마토그래피를 위해, 200㎕ 용적의 개개 양의 융합 단백질을 수퍼덱스 200 HR 10/30 컬럼(공급원: Pharmacia)에 부가하고 PBS에서 0.5㎖/분으로 용출시키면서 동시에 280nm에서 흡광도를 측정한다. 하기에서 기술하는 바와 같이, 각 분획(0.25㎖)을 세포독성 시험으로 검사한다. 분자량을 측정하기 위해, 컬럼을 표준 단백질 티로글로불린(669kDa), 페리틴(440kDa), 카탈라제(262kDa), 알돌라제(158kDa), 소 혈청 알부민(67kDa), 닭 난백알부민(43kDa), 키모트립시노겐 A(25kDa) 및 리보뉴크레아제 A(13.7kDa)로 검량한다.
(E) 경쟁적 ELISA
경쟁적 ELISA는 다음과 같이 수행한다. 96"웰"-ELISA-플레이트를 수용체/Fc-융합 단백질(PBS중의 0.2㎍/㎖, 100㎕, 16시간, 25℃)로 피복한다. 웰을 37℃에서 1시간 동안 5% 태아 소 혈청(차단 완충액으로서)을 함유하는 PBS에서 포화시킨다. sCD40L를 사용하는 경우 차단 완충액은 4% 무지방 우유 및 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS이다. 경쟁 Fc 또는 COMP 융합 단백질을 1㎍/㎖ 단백질 A의 존재 또는 부재하에 100㎕ 차단 완충액속에 연속적으로 용해시킨다. 리간드는 일정한 농도(모두 차단 완충액중의 sFasL: 2㎍/㎖, 36nM, sTNFα: 0.02㎍/㎖, 0.36nM; sTRAIL: 0.1㎍/㎖ 1.4nM; sCD40L: 0.5㎍/㎖, 9.2nM)로 첨가하고 37℃에서 1시간에 걸쳐 걸합시킨다. 결합된 리간드는 M2-항 플래그 항체(차단 완충액중의 1㎍/㎖, 100㎕, 45분, 37℃), 퍼옥시다제-접합된 염소-항-마우스 항체(차단 완충액중의 1:2000, 100㎕, 30분, 37℃) 및 o-페닐렌디아민 하이드로클로라이드(50mM 시트르산중의 0.3mg/㎖, 100mM Na2HPO4, 0.01% H2O2)로 동정한다. 흡광도는 490nM에서 측정한다.
(F) 세포독성 시험
세포독성 시험은 실질적으로 문헌[참조 문헌: Schneider et al. (1997), 부분적으로 인용됨]에서 기술한 바와 같이 100㎕ 용적의 96-웰 플레이트에서 측정한다. 키메라 수용체를 95% 이상의 세포 사멸을 유도할 수 있는 소정의 세포독성 리간드를 함유하는 배지중에 연속적으로 희석시킨다. 명시하는 경우, 단백질 A는 1㎍/㎖의 농도로 사용한다. sFasL은 1㎍/㎖ M2의 존재하에 사용하고 sTRAIL는 2㎍/㎖ M2의 존재하에 사용한다. sTNFα를 사용한 일련의 시험의 경우 항체는 사용하지 않는다. 세포는 16시간 동안 배양하고 이의 생존율을 PMS/MTX-시험 시스템(염 형태의 페나신메토설페이트/3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-5-[3-카복시메톡시페닐]-2-[4-설포페닐]-2H-테타라졸륨)(공급원: Promega, Medison, Wisconsin)을 사용하여 측정한다. 흡광도는 490nm에서 측정한다. 다양한 융합 단백질의 몰농도를 명시하기 위해, 몰중량을 다음과 같이 산정한다:[(가정된 N-커플링된 글리안당 이론상 Mr+3kDa)×다중도]. 각각 Fas:Fc, :COMP, :CMP, :δ-OPG:98, 172, 100 및 105kDa. TRAILR2:Fc,: COMP:, :CMP, : δN-OPG: 86, 142, 82 및 93kDa. TNFR1: Fc, :COMP:104 및 187kDa. CD40:Fc, :COMP:101 및 180kDa. TRAILR2:Fc:86kDa, TRAILR3:Fc:127kDa. 각각, 플래그-TRAIL, Flag-FasL, 플래그-TNFα, 플래그-CD40L:71, 55, 56 및 54kDa.
(G) 비아코어(BIAcore) 측정법
비아코어 측정법은 CM5-카복시메틸덱스트란-변형된 센서 칩(공급원: BIAcore AB, Uppsala, Sweden)에서 5㎕/분의 유속으로 수행한다. CM5-칩은 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드: N-하이드록시석신이미드의 1:1 혼합물 50㎕ 용량으로 활성화시킨다. 이어서, 10mM NaHCO3(pH 5.5)중의 100㎍/㎖의 M2-항-플래그 모노클로날 항체 용액 6㎕를 활성화된 표면상으로 옮긴다. 1M 에탄올아민-HCl 50㎕ 용량으로 잔류 N-하이드록시석신이미드에스테를 불활성화시킨다. 본 과정을 위해 필요한 고정된 M2-항체의 양은 약 4600단위이다. FasL-Fas: 융합 단백질 및 TRAIL-TRAIL-R2: 융합 단백질의 상호작용을 분석하기 위해, 일정량의 표지된 리간드를 M2-변형된 표면에 고정시킨다. 이를 달성하기 위해, 2.5㎍/㎖ 플래그-FasL 또는 플래그-TRAIL 7㎕ 용량을 표면으로 옮긴다. 이는 100 내지 150단위를 결합시킨다. 이외에, 이러한 조건들은 리간드가 M2 표면으로부터 최소로 해리되게 하며, 동시에 분석 동안 충분한 수용체가 결합되게 한다. 이어서, 100 내지 150단위에 상응하는 1 내지 100㎍/㎖의 농도의 정제된 수용체:융합 단백질 15㎕ 를 주사하여 수용체:융합 단백질의 결합을 분석한다. 결합 속도는 3분에 걸쳐서 측정하고 해리 속도는 3 내지 5분에 걸쳐서 측정한다. 이어서 50mM 시트레이트-HCl(pH 2.5) 5㎕ 용량을 사용하여 표면을 (단순 M2 표면으로) 재생시킨다. 고정된 M2-항체의 결합 특성의 현저한 변화없이 결합 및 재생은 30회까지 연속적으로 반복한다. 해리 및 결합 속도는 AB=A+B 및 A+B=AB 모델을 사용한, 제조업자에 의해 공급된 속도 분속 프로그램을 보조로 하여 분석한다.
(H) 1차 마우스 간세포의 배양
1차 마우스 간세포를 배양하기 위해, C57BL/6 마우스를 희생시키고, 후속적으로 "간세포-결합 배지"(HAM)에서 유지시키기 위해 담즙관에 걸친 간 부위를 즉시 제거한다. 적혈구를 제거하기 위해, 먼저 간 부위를 10mM HEPES(pH 7.6) 16㎖으로 관류시킨 다음, HEPES(4mM CaCl2)중의 0.5mg/㎖ 콜라겐 H(공급원: Boehringer Mannheim) 12㎖로 관류시키고 이어서 페트리 디쉬에서 HEPES으로 세척한 다음, 원심분리하고(100×g, 30초) HAM중의 60% 등장 Percoll 용액(공급원: Pharmacia)속에서 재현탁하고 다시 원심분리한다(700×g, 2분). 모든 완충액 및 배지는 37℃에서 사용한다. 침강된 세포를 HAM속에 재현탁시키고 계수하여 플랫디쉬 형태의 미세역가 플레이트(웰당 10000, 200㎕)에 접종하고 상응하게 결합시킨다. 시험 혼합물(연속적으로 희석시킨 억제제, sFasL(최종 농도: 400ng/㎖, 7nM) 및 M2 항체(최종 농도: 1㎍/㎖))를 첨가한 다음, 세포를 추가로 16시간 동안 배양한다. 상등액을 제거하고, 새로운 HAM(100㎕)을 첨가하고 생존성 시험 PMS/MTS를 상기 기술한 바와 같이 수행한다.
(I)활성화-유도된 세포 사멸
플랫디쉬 형태의 미세역가 플레이트를 37℃에서 3시간에 걸쳐 PBS중의 항-사람 CD3 TR66(10㎍/㎖)로 피복시킨다. 상기 플레이트를 PBS로 2회 세척하고 RPMI 1640배지로 1회 세척한다. 유르캣 세포(㎖당 5x105 세포, 100㎕)를 억제제와 혼합하고 각 웰에 분배한 다음, 원심분리하고(200xg, 3분) 37℃에서 24시간 동안 배양한다. 세포의 생존성(OD 490nm에서)를 상기 기술한 바와 같이 측정한다. 특이적 세포 보호율(%)을 다음과 같이 계산한다: [(항-CD3+억제제)-항-CD3)]/[(대조군)-(항-CD3)]×100.
혼합된 백혈구 배양물을 제공하기 위해, 퍼포린(perforin)이 결실되거나 gld C57BL/6 마우스(H-2b)로부터의 비장세포를 Balb/c-마우스(H-2d)로부터의 감마-조사된(36 Gy) 비장세포와 함께 5일 동안 배양한다. 사용하기 전에, 비생존성 세포를 Ficoll-paque(공급원: Pharmacia Biotech)에서 구배 원심분리하여 샘플로부터 제거한다. 표지화는 상기 기술한 방법에 따라 수행한다[참조 문헌: Kataoka et. al.]. 간단하게, 표적 세포(A20 세포)를 나트륨[51Cr](공급원: Dupont, Boston, MA)으로 1시간 동안 표지화킨 다음, RPMI 1640으로 3회 세척한다. MLC 세포를 40㎍/㎖의 Fas:Fc 및 Fas:COMP의 존재 또는 부재하에 최종 용적이 200㎕이 되도록 40U자 모양의 미세역가 플레이트에서 표적 세포(웰당 104개의 세포)와 혼합하고 플레이트를 원심분리한다(200xg, 3분). 4시간 동안 배양한 후, 상등액을 제거하고 이의 방사능을 측정한다. 특이적 [51Cr]방출율(%)을 다음 식에 따라 계산한다:[(시험상 방출량-자발적 방출량)/(최대 방출량-자발적 방출량)]x100.
(K) FACS-표지화
FACS-표지화를 위해, CD40L+-유르캣 클론 D1.1(5x105 세포)를 FACS 완충액(PBS, 10% 태아 소 혈청 및 0.02% NaN3)중의 CD40:COMP 2㎍와 함께 배양한다.
Fas:COMP를 음성 대조군으로 사용한다. 수용체:COMP를 9E10 항-myc 항체 1㎍로 검출하고 이어서 FITC-표지된 염소-항-마우스 항체(1:100)로 처리한다. 4℃에서 20분 동안 FACS 완충액 50㎕에서 배양한다.
(L) B 세포 증식 검정
B 세포 증식의 검정을 위해, 사람 말초혈 림프구(PBL)로부터의 CD19+-세포를 마그네틱 비드로 정제하고, 잔류 CD19- 세포에 조사한다(3000래드). 105개의 정제된 CD19+ 세포를 105 CD19- 조사된 PBL와 함께 100ng/㎖(1.8nM) 농도의 sCD40L, 1㎍/㎖ 농도의 단백질 A가 첨가되거나 첨가되지 않은 10㎍/㎖의 M2-항체 및 명시한 농도의 CD40:Fc 또는 CD40:COMP를 함유하는 배지 120㎕에서 배양한다. 이어서, 세포를 96 웰 플레이트에서 72시간 동안 배양하고 [3H] 티미딘(1μCi/웰)로 6시간 동안 펄스시키고 수거한다. [3H] 티미딘의 배양물을 액체 섬광 계측법으로 검사한다.
7.2 제7 양태의 결과
IgG(수용체: Fc)의 Fc-부분에 융합되는 수용체의 세포외 도메인으로 이루어진 융합 단백질은 수용체 리간드 상호작용을 조사하기 위한 억제제로서 당해 분야에 공지되어 있다. 제7 양태에서, 정제된 Fas:Fc-융합 단백질의 크기는 배재 크로마토그래피시켜 조사하면, 예상된 정체 시간을 갖는 단일 피크가 용출된다. 시험에서 FasL에 대한 Fas:Fc의 산정된 비율이 약 1000이라는 점을 고려한다면 보호 정도(50% 이하)가 비정상적으로 낮지만, Fas:Fc 함유 분획은 치사량의 가용성 FasL(sFasL)에 노출된 A20-세포를 세포 사멸로부터 보호할 수 있다.
약한 보호 활성은 측정불가능한 소량의 Fas:Fc의 고분자량 복합체를 함유하는 용출물의 초기 분획의 일부에서 관찰된다. 본 발명에 따라서, 이러한 융합 단백질의 응집체가 FasL-유도된 세포 사멸의 단백질 억제제로서 작용할 수 있다는 것이 인지된다. 따라서, 면역글로불린 가교제 단백질을 첨가함으로써 이러한 응집체 Fas:Fc의 고분자량 분획이 먼저 생성된다. 주사된 Fas:Fc의 약 10%만이 초기 용출 분획으로 이동되는 조건하에 분석을 수행하자 마자, 고분자량 Fas:Fc 복합체가 FasL에 의해 유도된 세포독성의 효과적 길항제인 것으로 나타난다. 이와 비교하여, 잔류 Fas:Fc 분획은 여전히 이량체로서 용출되며 10배가 높은 농도에도 불구하고 부분적인 보호만이 세포에 부여되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 따라서, 제7 양태의 결과는 고차 Fas:Fc 응집체의 형성이 특이적 보호 활성을 실질적으로 증가시킨다는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따라서, FasL에 대한 보다 우수한 결합성을 나타내며 올리고머화도를 증가시킴으로써 억제 특징을 개선시키는 융합 단백질의 복합체는 상기 결과에 기초하여 작제한다. 본 발명에 따르는 융합 단백질로는, 예를 들어, TNF 계열의 수용체(예: Fas, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-3, TNF-R1 또는 CD40)의 세포외 도메인이 14개의 아미노산 길이의 링커를 통해 이른바 연골 올리고머 단백질(COMP; 수용체:COMP로서 명명되는 융합 단백질) 또는 이른바 연골 매트릭스 단백질(CMP; 융합 단백질: 수용체:CMP)의 올리고머화된 도메인에 융합되는 융합 단백질이 있다. 이들 매트릭스 단백질 및 이의 도메인은 각각 오량체 및 삼량체 코일드-코일 구조를 형성하는 고유한 특성을 갖는다. 상기 언급한 융합 단백질(뿐만 아니라 대조군으로서 수용체:Fc 융합 단백질)을 포유동물 세포에서 발현시키고 금속킬레이트 컬럼 또는 단백질 A에서 친화성 크로마토그래피시켜 정제한다. 제7 양태에서, 수용체 Fas 및 TRAIL-R2를 또한 TNF 계열(수용체:δN-OPG)의 단백질 오스테오프로테그린(osteoprotegrin)의 C-말단 이량체화 도메인에 결합시킨다.
COMP 또는 CMP에 융합되는 수용체는 비환원 조건하에 폴리아크릴아미드 겔에서의 저속 이동으로 나타난 바와 같이 올리고머화된다. Fas:COMP 및 TRAIL-R2:CMP는 겔 투과 크로마토그래피 방법을 적용함으로써 용출되는데, 이는 겉보기 분자량이 각각 약 400kDA 및 170kDA인 피크를 나타낸다. 분자량은 각각 오량체 융합 단백질의 오량체 및 삼량체 구조에 상응한다. 따라서, 제7 양태의 시험으로부터 상기 언급한 매트릭스 단백질의 코일드 코일 올리고머화 도메인의 응집 특징이 TNF 수용체 계열의 단백질(또는 단백질 도메인)의 단백질에의 융합에 의해 방해되지 않는 것으로 결론을 내릴 수 있다.
융합 단백질 Fas:COMP는 당해 융합 단백질이 적용된 Fas:Fc와 sFasL-결합에 대해 경쟁하는 경우 Fas:Fc보다 낮은 Kd를 나타낸다. 이러한 결과와 일치하여, Fas-Fas:COMP 상호작용의 경우 Fas:Fc에 대한 비교 수치보다 약 8배 내지 9배가 낮은 0.77nM의 해리 상수가 측정된다. 시험된 대다수의 세포주의 경우, Fas:COMP의 억제 활성도는 이량체 융합 단백질 Fas:Fc의 억제 활성도보다 약 10배 내지 20배가 높은 것으로 나타난 반면, 가교 단백질 A에 의해 유발되는 Fas:Fc 응집체(Fas:Fc/PA)의 결과는 Fas:COMP에 대한 Fas:Fc 수치를 나타낸다. 이량체 Fas: δ-OPG 융합 단백질의 보호 활성도는 이량체 Fas:Fc 복합체의 보호 활성도와 유사하다. 삼량체 Fas:CMP는 sFasL-매개된 용해를 거의 Fas:Fc/PA만큼 효과적으로 억제하므로, 따라서 Fas:COMP보다 5배가 덜 효과적이다. Fas;COMP의 억제 활성은 양호하거나 FasL-차단 모노클로날 항체 Nok-1, 4H9 및 4A5의 억제 활성보다 우수하다. Fas:Fc 복합체와 비교하여, Fas:COMP의 억제 활성이 보다 우수하다는 것은 1차 쥐 간세포를 사용한 시험 또는 항-CD3-활성화된 유르캣 세포를 사용한 활성화-유도된 세포 사멸용 모델 시스템으로부터 명백하다. 이러한 시험 모두에서, Fas:Fc-PA의 경우 중간의 보호 수준이 야기된다. 추가로, Fas:COMP가 CTL에서 발현된 FasL의 효과를 억제할 수 있는가를 조사한다. 4시간의 시험 시스템에서 A20-세포의 사멸은, 퍼포린뿐만 아니라 FasL이 결실된 CTL4가 이들 세포에 효과를 미칠 수 없기 때문에 단지 퍼포린 및 FasL-의존성 시그날 전달 경로에 의해 좌우된다. 상응하는 시험에서, A20 세포는 예상한 대로 퍼포린이 결실된 CTL뿐만 아니라 FasL이 결실된 CTL에 의해 치사된다. Fas:Fc 및 Fas:COMP는 특히 퍼포린이 결실된 CTL에 노출된 세포에 특정 정도의 보호를 유발한다.
본 발명에 따르는 CD40;Fc, CD40:Fc/PA 또는 CD40:COMP에 대한 sCD40L의 친화성을 경쟁적 ELISA로 비교하는 경우, 친환성의 현저한 증가(30배)가 오량체화된 수용체에서 관찰되며, CD40:Fc/PA의 경우 다시 중간의 효과가 발생된다(8배). CD40:COMP도 막 결합된 CD40L을 인식할수 있는가의 여부에 관해서는, 본질적으로 표면 단백질 CD40L을 발현하는 유르캣-유도된 세포주 D1.1를, 샘플로서 CD40 융합 단백질을 사용한 FACS 표지화 분석의 올리고머화에 사용한다. 현저한 표지화는 본 발명에 따르는 CD40:COMP에서 관찰되며, 이는 CD40-COMP가 사실상 비가공된 천연의 CD40L에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 생물학적 시스템에서 CD40 융합 단백질의 특이적 활성을 조사하기 위해, 항-B-세포 수용체로 동시자극된 사람 B 세포의 CD40L-의존성 증식을 억제하고자 시도하였다. CD40:Fc뿐만 아니라 CD40:Fc/PA도 심지어 고 투여량으로 투여되는 경우에도 증식을 현저하게 억제할 수 없다. 반면에, 본 발명에 따르는 CD40:COMP는 이미 비교적 저 투여량에서도 증식을 차단할 수 있다.
요약하면, 본 양태로부터 경쟁적 억제제에 의한 FasL-유도된 세포소멸의 억제는 올리고머화도에 따라 증가되며 다양한 억제제의 상대적 활성도(각각의 IC50 값의 비율로서 표현됨)는 다양한 세포주에 대해 비교적 일정하게 유지되는 것으로 결론을 내릴 수 있다. Fas:Fc와 비교하여 증가된, 본 발명에 따르는 Fas:COMP의 억제 활성은 이의 높은 결합성의 결과일 수 있다. 유사한 결과는 본 발명에 따르는 CD40 융합 단백질의 활성에서도 측정된다. 본 발명에 따르는 CD40:COMP는 시험관내에서 1차 B 세포의 CD40L-유도된 증식의 억제에 관해서는 CD40:Fc보다 확연하게 우수하다. 따라서, 제7 양태의 결과는, 본질적으로 리간드에 대한 중간의 친화성을 특징으로하는 예를 들어 Fas 및 CD40과 같은 수용체가 본 발명이 의도하는 바와 같이 보다 높은 올리고머화도를 특징으로하는 융합 단백질의 성분인 경우 낮은 나노몰 단위의 해리 상수가 이들 수용체에서 관찰될 수 있다는 것을 나타낸다.
<110> Apotech Research and Development Ltd. <120> Di- or oligomer of a dimer, trimer, quatromer or pentamer of recombinant fusion proteins <130> AP01P004WO <140> DE 199 63 859.4 <141> 1999-12-30 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: FasL-Trimer <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(8) <223> Flag <220> <221> DOMAIN <222> (9)..(16) <223> Linker <220> <221> DOMAIN <222> (17)..(159) <223> humanFasL aa 139-281 <400> 1 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu Gln 1 5 10 15 Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn 20 25 30 Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu 35 40 45 Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr 50 55 60 Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys 65 70 75 80 Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr 85 90 95 Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser 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Phe Arg Phe Gln 195 200 205 Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr 210 215 220 Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser 225 230 235 240 Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser 245 250 255 Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe 260 265 270 Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser 275 280 285 Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 290 295 <210> 6 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: TNFa-ACRP30 <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(8) <223> Flag <220> <221> DOMAIN <222> (9)..(16) <223> Linker <220> <221> DOMAIN <222> (17)..(108) <223> mouseACRP30 aa 18-111 <220> <221> DOMAIN <222> (109)..(110) <223> Linker <220> <221> DOMAIN <222> (111)..(268) <223> mouseTNFa aa 77-235 <400> 6 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu His 1 5 10 15 Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro 20 25 30 Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His 35 40 45 Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro 50 55 60 Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly 65 70 75 80 Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe 85 90 95 Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Leu Gln Thr Leu 100 105 110 Thr Leu Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His 115 120 125 Val Val Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Leu Ser Gln Arg 130 135 140 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu 145 150 155 160 Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe 165 170 175 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser 180 185 190 Arg Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val 195 200 205 Lys Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro 210 215 220 Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly 225 230 235 240 Asp Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala 245 250 255 Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu 260 265 <210> 7 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: CD40L-ACRP30 <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(8) <223> Flag <220> <221> DOMAIN <222> (9)..(16) <223> Linker <220> <221> DOMAIN <222> (17)..(108) <223> mouseACRP30 aa 18-111 <220> <221> DOMAIN <222> (109)..(110) <223> Linker <220> <221> DOMAIN <222> (111)..(255) <223> humanCD40L aa 116-261 <400> 7 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu His 1 5 10 15 Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro 20 25 30 Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His 35 40 45 Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro 50 55 60 Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly 65 70 75 80 Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe 85 90 95 Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Leu Gln Gly Asp 100 105 110 Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys 115 120 125 Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Thr Met Ser Asn 130 135 140 Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln 145 150 155 160 Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu 165 170 175 Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro 180 185 190 Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser 195 200 205 Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu 210 215 220 Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln 225 230 235 240 Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 245 250 255

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  29. FasL 단백질의 세포외 분절 또는 생물학적 기능을 갖는 이의 분절인 성분 A 및
    제3 분자의 작용 없이 재조합 융합 단백질을 올리고머화하는 ACRP30의 단백질 분절인 성분 B를 갖는 재조합 융합 단백질.
  30. 제29항에 있어서, 성분 B가 mACRP30의 아미노산 18번 내지 111번의 서열인 재조합 융합 단백질.
  31. 제29항에 있어서, 성분 B가 hACRP30의 아미노산 18번 내지 108번의 서열인 재조합 융합 단백질.
  32. 제29항에 있어서, 성분 A가 hFasL의 아미노산 제139번 내지 281번의 서열인 재조합 융합 단백질.
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  35. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 성분 A와 성분 B사이에 링커 서열을 갖는 재조합 융합 단백질.
  36. 제29항에 있어서, 성분 A가 hFasL의 아미노산 제139번 내지 281번의 서열이고 성분 B가 hACRP30의 아미노산 18번 내지 108번의 서열인 재조합 융합 단백질.
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  38. 제29항 내지 제32항 또는 제36항 중 어느 한 항에 따른 재조합 융합 단백질의 올리고머.
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  42. 제29항 내지 제32항 또는 제36항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는, 과염증 질환, 자가면역 질환, 과세포소멸(hyperapoptotic) 또는 저세포소멸(hypoapoptotic) 장애에 기초하는 질병, 감염성 질병, 바이러스 감염성 질병, 종양 또는 내분비 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  43. 제38항에 따른 올리고머를 포함하는, 과염증 질환, 자가면역 질환, 과세포소멸 또는 저세포소멸 장애에 기초하는 질병, 감염성 질병, 바이러스 감염성 질병, 종양 또는 내분비 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
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  45. 제29항 내지 제32항 또는 제36항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 DNA 서열.
  46. 제45항에 따른 DNA 서열을 함유함을 특징으로 하는 발현 벡터.
  47. 제46항에 따른 발현 벡터로 형질감염됨을 특징으로 하는 숙주 세포.
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  57. 제35항에 따른 재조합 융합 단백질의 올리고머.
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  61. 제35항에 따른 융합 단백질을 포함하는, 과염증 질환, 자가면역 질환, 과세포소멸 또는 저세포소멸 장애에 기초하는 질병, 감염성 질병, 바이러스 감염성 질병, 종양 또는 내분비 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
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  69. 제35항에 따른 융합 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 DNA 서열.
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  71. 제57항에 따른 올리고머를 포함하는, 과염증 질환, 자가면역 질환, 과세포소멸 또는 저세포소멸 장애에 기초하는 질병, 감염성 질병, 바이러스 감염성 질병, 종양 또는 내분비 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  72. 삭제
  73. 제69항에 따른 DNA 서열을 함유함을 특징으로 하는 발현 벡터.
  74. 제73항에 따른 발현 벡터로 형질감염됨을 특징으로 하는 숙주 세포.
KR1020027008522A 1999-12-30 2000-12-20 재조합 융합 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체의 바이머 또는 올리고머 KR100767980B1 (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104299540A (zh) * 2013-07-15 2015-01-21 驰众信息技术（上海）有限公司 广告互动播放系统及其广告机终端

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7300774B1 (en) * 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
DE19963859A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
JPWO2001090382A1 (ja) * 2000-05-26 2004-04-30 持田製薬株式会社 Ｆａｓリガンド融合蛋白質
GB0015426D0 (en) * 2000-06-24 2000-08-16 Univ Southampton Method for generating soluble highly multimeric proteins
WO2002074795A2 (en) * 2001-01-18 2002-09-26 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Oligomeric complexes of chimeric proteins with enhanced immunogenic potential
DE10122140A1 (de) * 2001-05-08 2002-11-28 Apotech Res & Dev Ltd Rekombinante Fusionsproteine und deren Trimere
EP1456651B1 (en) * 2001-11-30 2008-05-07 National Research Council Of Canada Self-assembly molecules
AU2002333502A1 (en) 2002-02-10 2003-09-04 Apoxis Sa Fusion constructs containing active sections of tnf ligands
AU2003221256A1 (en) * 2002-02-21 2003-09-09 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
WO2003095489A1 (en) * 2002-05-08 2003-11-20 Apoxis S.A. Hexamers of receptors, members of the tnf receptor family, their use in therapy and pharmaceutical compositions comprising the same
FR2840307B1 (fr) * 2002-05-30 2006-07-07 Centre Nat Rech Scient Nouvelles molecules multimeriques, leur procede de preparation, et leur utilisation pour la preparation de medicaments
DE10247755B4 (de) * 2002-10-14 2006-01-19 Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine
US20070010658A1 (en) * 2002-10-29 2007-01-11 Holtet Thor L Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
CA2520254A1 (en) * 2003-03-26 2004-10-07 Apogenix Gmbh Treatment of viral infections
SI2298347T1 (sl) * 2003-05-06 2016-03-31 Biogen Hemophilia Inc. Himerni proteini s faktorjem strjevanja krvi za zdravljenje hemostatske motnje
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050143297A1 (en) * 2003-05-26 2005-06-30 Jean-Pierre Rosat Method for the administration of ligands, agonists of ligands of the TNF family with reduced toxicity
EP1481686A1 (en) * 2003-05-26 2004-12-01 Apoxis SA Use of multimeric ligands of the TNF family with reduced toxicity for treating cell proliferative diseases
US20050287118A1 (en) * 2003-11-26 2005-12-29 Epitomics, Inc. Bacterial plasmid with immunological adjuvant function and uses thereof
DE102004014983A1 (de) 2004-03-26 2005-10-20 Univ Stuttgart Rekombinante Polypeptide der Mitglieder der TNF Ligandenfamilie und deren Verwendung
ATE482268T1 (de) * 2004-10-01 2010-10-15 Topotarget Switzerland Sa Ex-vivo-spülverfahren für autologe transplantationen mittels löslicher fasl-moleküle
FR2879202B1 (fr) * 2004-12-15 2007-02-23 Centre Nat Rech Scient Cnrse Nouveaux ligands multimeriques de cd40, leur procede de preparation et leur utilisation pour la preparation de medicaments
WO2006077232A2 (en) * 2005-01-20 2006-07-27 Apoxis Sa Multimeric soluble fas ligand for eliminating alloreactive t lymphocyte in allogenic harmatopoietic stem-cell transplantation transplantation
JP5164167B2 (ja) 2005-08-30 2013-03-13 ユニバーシティー オブ マイアミ 免疫調節性腫瘍壊死因子受容体２５（ｔｎｆｒ２５）のアゴニスト、アンタゴニスト及び免疫毒素
US20090081157A1 (en) * 2006-01-09 2009-03-26 Richard Syd Kornbluth Immunostimulatory Combinations for Vaccine Adjuvants
WO2007117339A2 (en) * 2006-01-11 2007-10-18 The United States Of America As Respresented By The Secretary Of The Navy Adhesin-enterotoxin chimera based immunogenic composition against entertoxigenic escherichia coli
EP3072903B1 (en) * 2007-07-10 2017-10-25 Apogenix AG Tnf superfamily collectin fusion proteins
DK2604693T3 (en) 2008-07-21 2016-05-30 Apogenix Gmbh Single-chain TNFSF molecules
AU2009308707A1 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Biogen Idec Ma Inc. LIGHT targeting molecules and uses thereof
JP5844158B2 (ja) 2009-01-09 2016-01-13 アポゲニクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＡｐｏｇｅｎｉｘ ＧｍｂＨ 三量体形成融合タンパク質
WO2010102518A1 (zh) * 2009-03-13 2010-09-16 北京表源生物技术有限公司 一种融合蛋白多聚体
US8486421B2 (en) 2009-06-09 2013-07-16 Children's Hospital Medical Center Antigen-norovirus P-domain monomers and dimers, antigen-norovirus P-particle molecules, and methods for their making and use
CA2806840C (en) 2009-08-03 2019-08-27 Eckhard R. Podack Method for in vivo expansion of t regulatory cells
US10822396B2 (en) 2009-12-15 2020-11-03 MuHyeon CHOE Repeat-chain for the production of dimer, multimer, multimer complex and super-complex
EP2518078B1 (en) * 2009-12-15 2020-05-20 Choe, Muhyeon Method for manufacturing dimers and multimers by increasing the production of bond bridges in a complex of multiple monomers and repeating chains of an affinity domain of a type specifically binding to protein monomers
US8932575B2 (en) 2010-09-21 2015-01-13 University Of Miami Compositions and methods for inducing migration by dendritic cells and an immune response
WO2012040266A2 (en) * 2010-09-24 2012-03-29 University Of Miami Gene-based adjuvants and compositions thereof to increase antibody production in response to gene-based vaccines
AU2012222833B2 (en) * 2011-03-03 2017-03-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
NZ700025A (en) * 2012-02-15 2018-07-27 Biocon Ltd A process for detection and optional quantification of an analyte
US9562077B2 (en) * 2012-07-11 2017-02-07 Children's Hospital Medical Center Protein complex system for increased immunogenicity and functionality, and methods making and use
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
KR20150136047A (ko) 2013-01-09 2015-12-04 유니버시티 오브 마이애미 TL1A-Ig 융합 단백질을 사용한 T 조절 세포의 조절을 위한 조성물 및 방법
CA2899089C (en) 2013-03-15 2021-10-26 Biogen Ma Inc. Factor ix polypeptide formulations
AU2014233114B2 (en) 2013-03-15 2018-03-08 Richard S. Kornbluth Composition comprised of antigen linked to a TNF SuperFamily ligand
WO2014179494A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Colorado State University Research Foundation Sensors and assays for ubiquitin or ubiquitin-like proteins
KR101722054B1 (ko) * 2013-05-30 2017-03-31 최무현 반복사슬과 단량체의 복합체 간의 교차결속에 의해 형성된 초복합체 및 이의 용도
US9321803B2 (en) 2013-07-12 2016-04-26 Children's Hospital Medical Center Compositions and methods for inhibiting norovirus infection
NO2776305T3 (ko) 2014-04-23 2018-01-27
JP2014218510A (ja) * 2014-08-11 2014-11-20 アポゲニクスゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテルハフツングＡｐｏｇｅｎｉｘ ＧｍｂＨ 三量体形成融合タンパク質
CN104356233B (zh) * 2014-10-11 2017-09-29 中国科学院微生物研究所 一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用
WO2016112983A1 (en) 2015-01-15 2016-07-21 Biontech Ag Cytokine fusion proteins
US10689449B2 (en) 2015-01-20 2020-06-23 Igm Biosciences, Inc. Multimeric death domain-containing receptor-5 (DR5) antibodies and uses thereof
MA41460A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Oncomed Pharm Inc Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations
EP3292143B1 (en) 2015-05-04 2019-08-21 Apogenix AG Single-chain cd40-receptor agonist proteins
MX2018001787A (es) * 2015-08-12 2018-06-06 Medimmune Ltd Proteinas de fusion del ligando de la proteina relacionada con el receptor de factor de necrosis tumoral inducido por glucorticoides (gitrl) y usos de las mismas.
AU2016342420B2 (en) 2015-10-23 2020-10-01 Apogenix Ag Single-chain LIGHT receptor agonist proteins
WO2017068192A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Apogenix Ag Single-chain cd27-receptor agonist proteins
CA3002741A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Apogenix Ag Single-chain gitr-receptor agonist proteins
WO2017072080A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Apogenix Ag Single-chain tl1a receptor agonist proteins
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
CN109312000A (zh) 2016-03-30 2019-02-05 Ab生物科学有限公司 重组静脉内免疫球蛋白(rIVIG)组合物及其生产和使用方法
JP2019528689A (ja) 2016-08-11 2019-10-17 ザ カウンシル オブ ザ クイーンズランド インスティテュート オブ メディカル リサーチ 免疫調節化合物
US11015205B2 (en) * 2016-12-22 2021-05-25 Leibniz-Institut für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung (IPK) Oligomeric vaccines from plants by S-Tag-S-protein fusions
EP3600397A4 (en) 2017-03-28 2021-01-27 Children's Hospital Medical Center NOROVIRUS PARTICLE VACCINES AND THEIR MANUFACTURING AND USE PROCEDURES
WO2018178074A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Trimeric antigen binding molecules specific for a costimulatory tnf receptor
EP3678699A1 (en) 2017-09-07 2020-07-15 University Of Oslo Vaccine molecules
CN112552415B (zh) * 2021-02-22 2021-06-22 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用
AU2022280269A1 (en) * 2021-05-27 2023-11-30 Beijing Anxinhuaide Biotech. Co., Ltd A super-trail molecule comprising two trail trimers
WO2024003353A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Transgene Fusion protein comprising a surfactant-protein-d and a member of the tnfsf

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999002711A2 (en) * 1997-07-10 1999-01-21 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5859330A (en) * 1989-12-12 1999-01-12 Epitope, Inc. Regulated expression of heterologous genes in plants and transgenic fruit with a modified ripening phenotype
US5763733A (en) * 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US5869330A (en) * 1995-06-05 1999-02-09 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA encoding a novel serum protein produced exclusively in adipocytes
US6046310A (en) * 1996-03-13 2000-04-04 Protein Design Labs., Inc. FAS ligand fusion proteins and their uses
BR9810917A (pt) * 1997-07-18 2000-08-15 Zymogenetics Inc Polipeptìdeo isolado, proteìna de fusão, vetor de expressão, célula cultivada, processo para produzir um polipeptìdeo, composição farmacêutica, anticorpo, proteìna de ligação, polinucleotìdeo isolado, e, sonda de oligonucleotìdeo ou iniciador
JP4057127B2 (ja) * 1998-02-19 2008-03-05 セイコーエプソン株式会社 アクティブマトリックス基板及びアクティブマトリックス基板の製造方法並びに液晶装置
JP2002504342A (ja) * 1998-02-19 2002-02-12 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 一価ｍｈｃ結合ドメイン融合タンパク質および接合体、多価ｍｈｃ結合ドメイン融合タンパク質および接合体、ならびに多量体ｍｈｃ結合ドメイン融合タンパク質および接合体、そしてそれらのための使用
US7300774B1 (en) * 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
JP2003501027A (ja) * 1999-05-27 2003-01-14 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 脂肪細胞補体関連タンパク質同族体ｚａｃｒｐ５
BR0013231A (pt) * 1999-08-09 2002-07-23 Lexigen Pharm Corp Complexos citocina-anticorpo múltiplos
DE19963859A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999002711A2 (en) * 1997-07-10 1999-01-21 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104299540A (zh) * 2013-07-15 2015-01-21 驰众信息技术（上海）有限公司 广告互动播放系统及其广告机终端

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