CN100335900C - 新的自组装分子 - Google Patents

新的自组装分子 Download PDF

Info

Publication number
CN100335900C
CN100335900C CNB028238427A CN02823842A CN100335900C CN 100335900 C CN100335900 C CN 100335900C CN B028238427 A CNB028238427 A CN B028238427A CN 02823842 A CN02823842 A CN 02823842A CN 100335900 C CN100335900 C CN 100335900C
Authority
CN
China
Prior art keywords
self assembly
molecule
territory
target position
interaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB028238427A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1596371A (zh
Inventor
C·罗杰·麦肯西
张剑冰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Research Council of Canada
Original Assignee
National Research Council of Canada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Research Council of Canada filed Critical National Research Council of Canada
Publication of CN1596371A publication Critical patent/CN1596371A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100335900C publication Critical patent/CN100335900C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®

Abstract

本发明提供了一种构建具有靶位亲和性的多聚复合物的方法。所述方法包括：获取多个ABS源性的自组装分子，所述自组装分子包括互补自组装单位如vero毒素B亚基，每一单位操作性连接于特异性针对靶位的相互作用域如单域抗体；联合所述自组装分子，使得至少三个所述自组装分子基本上同时彼此结合且能允许相互作用域结合靶位。

Description

新的自组装分子
技术领域
本发明涉及自组装分子，特别是用于构建具有兴趣靶位亲和性的复合物的自组装分子。
背景技术
已知，多种分子具有针对细胞内特定结合位点的亲和性。例如，抗体和细胞表面受体能与特定靶位结合。但是，在某些情况下，特定分子和其靶位间的相互作用的强度低。
增加抗体片段对其靶位亲和性的研究成果导致了抗体片段二聚物的制备，其中所述二聚物具有两个结合位点，每一位点均特异性结合抗体靶位。可以采用多种方法实施二聚化，所述方法通常包括对抗体片段所附“尾”区域的修饰。因此，自相联的二级结构螺旋束已成功用于制备保留了兴趣靶位结合特异性和能力的可二聚化单位。但是，使用已知自相联结构域可能会带来某些问题，这些问题包括不需要的和无功能的分子群聚，以及难以获得分子间理想空间，这是由于对所得结构的几何学构型控制受限所致。一般需要二聚物中每一分子的结合结构域位于二聚体的相同面上，且分子间空间足以使其结合靶分子。
在构建含有两种以上与特异性结合区域相联的自相联亚基的寡聚体的方面所取得的成果是有限的。在一种情况下，制备了包括修饰的转录因子GCN4螺旋和“小抗体(miniantibody)”的亚基四聚物。同样地，与小肽融合的低聚软骨基质蛋白的卷曲螺旋型组装结构域已被用于构建五聚物。但是，低聚软骨组装的结构被认为：由于是薄且柱形的，而使其不适合用于需要较大亚基内空间的较大的肽或蛋白质。
Pluckthun等，1997，参考文献1，以及Terskikh等，1997，参考文献2中已经论述制备自组装分子的研究成果。
发明内容
亲和力，在生物分子相互作用力中起重要作用的多价性(multivalency)，是抗原—抗体相互作用的关键特性。本发明提供了一种通过引入亲和力从而显著提高相互作用域如单域抗体(dAbs)的结合特性的方法。将所述相互作用域与适用的自组装单位如大肠杆菌vero毒素(″VTB″)的B-亚基融合。VTB自组装从而构建同形五聚物(homopentamer)。当VTB与相互作用域融合时，所得分子会倾向于发生五聚化。所述五聚化分子即称为五聚体。
引入亲和力是提高抗体片段的抗原结合特性的非常好的方法。多聚化是用于提高dAb的抗原结合特性的特别好的策略。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种构建自组装多聚复合物的方法，所述方法包括获取适用的自组装分子，包括操作性连接于相互作用域的互补自组装单位的至少三种自组装分子；并将自组装分子联合，从而使至少三种自组装单位同时彼此结合而构建复合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了自组装分子，每一分子均包括操作性连接于相互作用域的互补自组装单位。更特别地，本发明提供了一种自组装分子，所述自组装分子包括操作性连接在一起的多个蛋白的或肽的部分，第一所述部分包括能与至少两种同种和不同组成的其它自组装分子的自组装区域结合的自组装区域，从而构建包括至少三种自组装分子的复合物，以及第二所述部分包括适于与另一，不同分子上的靶位发生特异性相互作用的相互作用域。
附图说明
根据下面的描述并参照附图可明确地阐样本发明所述的以及其它的优势
图1：显示了VTB-dAb融合蛋白的实施方案的确定的一级结构。
图2：显示了VTB寡聚化结构域与寡糖以及融合dAbs复合的实施方案的确定的结构带型图。图2A中显示了糖结合面，图2B为侧视图，而图2C为PTH50十聚体的实施方案的确定的模型结构。
图3：显示了PTH50-VTB(图3A)和PTH50(图3B)的实施方案的Superdex200层析和SDS-PAGE的结果。以下将PTH50-VTB融合产物简称为1V5。
图4：显示了2nM VTB的实施方案和2nM 1V5的实施方案的寡糖结合特性的BIACORE分析。
图5：显示了PTH50和1V5的实施方案的的抗原结合特性的BIACORE分析。图5A涉及0.25～2μM PHT50与固定肽抗原的结合；图5B涉及2～10μMPHT50与固定1V5；而图5C涉及2.5～15nM1V5与固定肽抗原的结合。
图6：显示了特定兴趣序列列表的实施方案。
图7：显示了十聚体1V5的热诱导变性曲线—参见实施例1，热稳定性实验。
图8：显示了sdAB的蛋白酶敏感性—参见实施例1，蛋白酶稳定性实验。
图9：显示了十聚体1V12的一级结构，根据实施例2。
图10：显示了iV12的大小排阻层析检测结果。
图11：显示了1V12结合的表面等离子体共振检测。
图12：显示了实施例3中的产物。
图13：显示了实施例3中十价单域抗体1V13的构建和大小排阻层析。
图14：显示了实施例4中1V13和其变体的大小排阻层析的比较。
具体实施方式
定义
本说明书所使用的术语“自组装单位(self-assembly units)”和“自组装单位(自self-assembling units)”是指适于与独立分子上的其它所述区域相互作用，而构建一个或多个具有基本上确定几何学构型以及包括三个或更多个单位的结构的肽或蛋白质(其可与糖类或其它修饰相联)。
本说明书所使用的术语“相互作用域”是指适于与起身不同的其它分子上的靶区域(或靶位)发生特异性相互作用的肽或蛋白质(其可以是糖基化的或其它修饰的)。其它分子优选为非自组装单位。
本说明书所使用的术语“同形五聚物”是指包含彼此之间发生特异性相互作用从而构建具有基本上确定几何学构型结构的五个单位的结构，其中每一单位与其它的单位基本上相同。
本说明书所使用的术语“多聚化”是指通过将两种以上自组装单位联合在一起而构建具有确定几何学构型的较大复合物的方法。
本说明书所使用的“sdAb”和“dAb”是指单域抗体片段。
本说明书所使用的术语“互补自组装单位”是指适合彼此结合而构建具有确定几何学构型的复合物的至少三个自组装单位。
本说明书所使用的术语“具有基本上确定几何学构型的结构”是指当在相同条件下从相同组分构建时，其近似大小和形状连贯的结构。
本说明书所使用的术语“来自编码的遗传物质”是指包括基本上可通过DNA转录和/或RNA的翻译来制备的肽和蛋白质，其中所述DNA和RNA编码构建部分的肽或蛋白或较大蛋白，然后如需要通过剪切(天然的或非天然的)和/或转录后修饰的情况。很明显，即使编码其的遗传物质由于遗传密码的简并性或保守性替代等而不同，肽或蛋白仍将来自遗产物质。
自组装分子
本发明提供了新的自组装分子(也称为“自组装分子”或“亚基”)，其在一个实施方案中，可以包括与相互作用域操作性连接的自组装单位。每一自组装分子都含有在适宜条件下能够特异性结合靶位的部分以及在适宜条件下能够与其它自组装分子结合从而构建包括至少三个自组装分子的复合物的部分。该自组装单位可通过“连接子区(连接子region)”(也称为“连接区”、“连接子”、“连接结构域”或“连接子结构域”)与相互作用域相连。
很明显，本发明的自组装分子在某些情况下可以是融合蛋白。所述融合蛋白可通过如下多种方法进行合成，所述方法包括化学合成然后按需进行化学修饰、细菌或其它培养物内合成或哺乳类宿主内合成，例如根据标准技术通过基因治疗的方法将编码兴趣融合蛋白的核苷酸施用于哺乳类宿主。本发明的自组装分子还可通过任意适用的方法进行制备，所述方法包括将相互作用域化学连接至自组装单位的区域从而保持靶位结合和特异性以及自组装。
自组装单位
自组装单位的定义如上。在某些情况下，其可以是适于与相似蛋白一起构建三个或多个单位的寡聚体的蛋白，所述寡聚体具有确定几何学构型的最终结构。
在某些情况下，需要选择基本上按照定向于结构单面上的或者其N-末端或者其C-术端进行组装的自组装单位。在某些情况下，需要选用基本上线形排列组装于其第一面上的N-端区域和其第二面上的C-端区域的自组装单位。在某些情况下，需要使用基本上线形混排组装于分子单面上的N-端区域和C-端区域的自组装单位。
在某些情况下，需要使用彼此不同的自组装单位。例如，最终组装物的每一亚基不需要相同，只要每一自组装单位的结合区域与其它的互补即可，从而三个或多个自组装单位能构建具有确定几何学构型的复合物。
在某些情况下，需要使用选自AB5毒素家族(包括但不限于vero毒素，志贺氏菌毒素，热不稳定性肠毒素，霍乱毒素和百日咳毒素)成员的自组装区的自组装单位。在某些情况下，需要使用是或来自由用于表达亚基的生物体相同家族所天然编码的蛋白质的自组装单位。
在某些情况下，需要选择能提供可以构建4～100个组装分子的多聚结构的自组装分子的自组装单位。在某些情况下，需要能提供具有5～50个自组装分子的多聚结构的自组装单位，而在某些情况下，需要选择能提供具有5～15个自组装分子的多聚结构的自组装单位。
一般而言，由较多自组装分子构建的多聚复合物结合靶位的能力要比具有较少分子的复合物强。
但是，非常大的多聚复合物通过基质或组织的能力可能会较低，而且被细胞摄取的可能性较小。
在某些情况下，需要使用分离常量(“KD”或“KD”)在亚-纳摩尔范围内的自组装单位。在某些情况下，需要使用分离常量在皮摩尔范围内的自组装单位。
在某些情况下，需要选用所提供的自组装分子的寡聚化结构域相互作用的KD为10μM～1fM的自组装单位。在某些情况下，需要KD为100nM～100fM。在某些情况下，需要KD为100nM～1pM。
根据本说明书所述，本领域技术人员能够确定适用的KD，并能根据所要进行的应用和要使用的浓度来选择适用的自组装单位。
某些自组装单位，如vero毒素B-亚基天然倾向于结合细胞表面特定标记物或其它靶位。如果与该天然靶位的结合是不需要的，可以通过传统方法如靶位结合位点的突变而保存对其它组装单位亲和性将所述结合阻断。
在一个实施方案中，本发明提供了适用于较大的相互作用域，特别是包括15个或以上氨基酸的相互作用域的自组装单位。在另一个实施方案中，提供了适用于含有25～500个氨基酸的相互作用域的自组装单位。在另一个实施方案中，提供了适用于含有50～300个氨基酸的相互作用域的自组装单位。在另一个实施方案中，提供了适用于含有75～200个氨基酸的相互作用域的自组装单位。在本发明的另一个实施方案中，提供了适用于包含糖基化或其他修饰的肽或蛋白区域的较大相互作用域的自组装单位。
在一个实施方案中，提供了适用于相互作用域和标记物的自组装单位。在一个实施方案中，提供了适用于相互作用域和破坏性物质的自组装单位。
在很多情况下，需要使用在使用时不会与相互作用域过度拥挤的最小的自组装单位。如果自组装单位过分小，可将相互作用域过度拉进而导致过度拥挤。一般而言，构建短距复合物的自组装单位通常优选那些能够构建细长尾部的复合物的单位，因为通常将相互作用域融合至每一自组装分子的相同区域，因此通常表现为相同面上。当使用细长自组装单位时，每个面上的相互作用域可用的受限空间可在相互作用域间造成阻碍，可能降低了这些相互作用域与靶位的结合或可能导致相互作用域由于太接近了而不利于在表面结合靶位。
在不将本发明限制于任何特定机制或结合区的情况下，一般认为VTB中负责寡聚化的区域为beta折叠(AA11-15)以及反平行beta折叠(65-68)。这两种区域呈现出毗邻单体的结合。另外，5alpha-螺旋环(一个来自每一单体，AA36-46)表现为在这些独立自组装单位彼此之间的选择性结合中发挥作用。根据本发明能够对其它自组装单位进行相同的分析，然后进行常规检测以确定结合位点的定位，由此本领域技术人员能够鉴定出显著性结合区域。
虽然认为本说明书是首次公开抗体片段五聚化，不过软骨寡聚化基质蛋白的同形五聚物已被用于制备被称为五聚体的寡聚肽(Terskikh等，1997，参考文献2)。但是，其直径约为20(Efimov等，1994，参考文献3)，抗体片段和该蛋白的五聚化需要长连接子，而导致了更广的应用范围。24个氨基酸的连接子用于肽的寡聚化。相反地，分子量为38.5kDa的VTB-五聚物小于31.3kDa的基质蛋白但具有非常不同的几何学特性，其直径为56。一般优选所述直径和以及N-和C-术端的边缘位置，因为其在不需要长连接子序列的情况下可连接五个dAbs。
因此，可特异性操作自组装单位从而提供所需几何学结构、直径和N-末端或C-末端的方向，提供作用于自组装单位间联合的区域，且保留了结合所需的几何学特性、疏水性和电特性。
本领域技术人员根据本说明书所述，能够确定适用的自组装单位。虽然多种方法都是可用的，一种理想的方法为当三个或三个以上自组装单位联合时，观察其构建的三维结构，从而确定C-或N-末端是否按所需进行线性排列，并确定所述末端间的空间。然后可将该信息与所需相互作用域(以及连接子区、标记物和/或破坏性物质(如果使用了))对方向和空间的需要进行比较来选择适用的自组装单位。在某些情况下，需要使用在大肠杆菌中表达时能提供良好可溶性产物表达水平的自组装单位。
相互作用域
根据本说明书所述，多种相互作用域对本领域技术人员来说是可以预想且显而易见的。例如，相互作用域如抗体、抗体片段、单域抗体片段(“dAbs”和“sdAbs”)，编码抗体(“scFv”)的VL和VH区的单链多肽、来自抗体结合区的肽或蛋白质、细胞表面受体部分、细胞表面受体的结合区、能够特异性结合细胞表面受体的分子或其结合部分，以及其它具有特异性靶位亲和性的分子。
在某些情况下，所述单域抗体片段可通过从编码抗体可变区的文库中分离抗体片段来制备。SdAb的大小多变，且可通过编码其的DNA进行确定。
出于寡聚化目的，单域抗体有时优选scFv。寡聚体形式的sdAbs由于一般大约为scFv大小的一半，因此其通常比其scFv对应物要小得多。同样地，sdAbs在大肠杆菌中可溶性产物的产出一般大大高于scFv的产出。更重要地，但是，sdAbs通常以单体形式存在而scFv通常构建二聚体、三聚体等，其中一个scFv的VL结合第二个scFv的VH，反之亦然。通过仔细选择VL和VH间的连接子长度以便构建单一的二聚体、三聚体scFv(称为二聚体和三聚体)可以观察到这一特性(Hudson等，1999，参考文献4)。但是，引入另一层寡聚化还有可能导致不需要的复合物。
本领域技术人员根据本说明书所述可以很明显地认识到，可通过将一个相互作用域(如sdAb等)连接至自组装单位的C-末端区，以及将第二个相互作用域连接至N-末端区来构建能够识别一个以上靶位的自组装分子。
当选择相互作用域时，通常需要避免有损于与靶位的结合的相互作用域的彼此结合倾向。相互作用域间的直接结合不仅降低了对靶位的结合，还改变了寡聚体整体的形状并且降低了寡聚体内部其它相互作用域与其靶位结合的能力。
相互作用域和其靶位间的所需的分散常数依赖于如下几个因素，包括靶位丰度、所需结合的范围、所需结合的均值和持续时间。
在某些情况下，将选择来提供自组装分子KD(对单体、非寡聚化的)为10fM～100μM的相互作用域。在某些情况下，需要KD为1nM～10μM。
在某些情况下，需要使用相互作用域和自组装单位来构建自组装分子，所述自组装分子在单体形式下仅微弱结合靶位(如，KD约为10μM～10mM，或约为100μM～1mM)，而在聚合物形式下能够强烈的结合靶位(如，KD约为10fM～10nM，或约为1pM～10nM)。通过这一方式，可将连接的毒素或放射性同位素靶向至高水平表达靶位的细胞，而将这种表达大量减少到低水平。这在如某些细胞表面标记物的丰富且不仅仅存在该标记的某些情况下是有用的，定性不需要的细胞。Kaminski等，1999，参考文献5中记载了使用不同系统提供对过表达靶位的细胞的选择性识别。
在某些情况下，需要选择包括“阻遏子(spoiler)”的相互作用域或自组装单位。阻遏子是位于或邻近或操作性连接于结合区而使结合区开始不能牢固连接的任何物质，并仅在进入兴趣细胞或组织时才从该状态解脱。例如，可通过组织特异性磷酸酶的作用而影响结合位点的易接近性的改变，而使去磷酸化状态结合位点能够有效结合而在其磷酸化状态则不能结合。
同样地，被封闭了结合位点的肽区可被组织特异性蛋白酶选择性剪切而恢复其结合能力。例如，具有特异性针对在前列腺和远距组织健康细胞中均发现的靶位的相互作用域的自组装分子可被设计为包括阻滞了能够结合前列腺癌细胞上靶位的相互作用域结合位点的肽。该肽可包括对PSA(前列腺特异性蛋白酶)剪切敏感的序列，所述PSA能够释放出该肽。因此，自组装分子在非前列腺组织中不能显著性结合靶位，但在前列腺中可以自由结合癌细胞。当自组装分子包括破坏性物质如毒素或放射性同位素时，所述组织特异性结合可有助于降低癌症治疗的副作用。
连接子区
自组装单位和相互作用域间的连接可包括使用连接自组装单位和相互作用域的“连接子区”。连接子区可选自任何数量的肽序列或其它适用的物质。连接子区的长度将依赖于若干因素，包括自组装单位几何学构型，相互作用域的大小以及标记物或破坏性物质的大小和定位(如果使用)。一般需要提供足以使操作性连接于每一自组装单位的相互作用域定向于其靶位的连接子区，从而使得当其自组装单位彼此连接时，某些相互作用域与其靶位结合。
在某些情况下，需要使用长度为4至3百个氨基酸的连接子，在某些情况下，需要使用长度为4个氨基酸至2百个氨基酸的连接子，而在某些情况下，需要使用长度为5个氨基酸至20个氨基酸的连接子。在选择连接子时，有时需要选择耐蛋白酶的序列。
在某些情况下，需要使用具有通式(GGGGS)n的连接子，其中“n”优选1～50。有时“n”优选1～25，有时优选1～10而有时优选1～4。在某些情况下，需要选择C-末端连接子序列GGGGS和N-末端连接子序列GGGGSGGGGS。
优选的连接子区能使相互作用域具有最大的靶位易接近性。通常在用于体内应用时，选择耐蛋白酶的连接子。但是，有些情况下，可使用具有组织特异性蛋白酶敏感的连接子，例如需要在特定组织中从剩余复合物中解离相互作用域时。
连接子还可用于将标记物(如生物素或放射性或荧光基团或化合物)或破坏性物质(如毒素或足量活性的放射性物质)连接于自组装单位。在一个实施方案中，连接子可固定在(例如作为融合蛋白)自组装单位的相互作用域对侧末端。
大小
有些情况下需要考虑包含自组装单位和相互作用域，及连接子(以及标记物和/或破坏性物质)(使用时)单个自组装分子的完整大小。特别是，在自组装分子需要通过基质或组织时，优选较小的自组装分子。
在某些情况下，需要使用能提供具有10～200直径的多聚复合物的亚基。在某些情况下，需要直径为20～180，在某些情况下，需要直径为50～150。在某些情况下，需要直径为60～100。
很明显，本说明书所描述的特定实施方案可方便地进行修饰以适应其它环境。例如，图1的结构的N-末端的5个氨基酸的序列，仅是为了便于克隆，如有需要可以将其除去。在向大肠杆菌细胞质中分泌成熟蛋白时，可以除去ompA序列。组氨酸5尾不是通常所需的，因为根据融合蛋白中VTB结合PK三糖的保留的亲和性纯化方法(图4)可替代使用。如果抗-VTB单克隆抗体为有效的(参见Soltyk等，2002，参考文献6)，c-myc检测标记将不是通常所必需的。(将这些修饰联合在一起将五价分子的大小降至13.5kDa。)
根据本说明书所述，本领域技术人员可以显而易见地应用特定的变体、修饰体和改变的实施方案。
内在化
在某些情况下，需要选用自组装单位、相互作用域(以及需要时的连接子、标记物和/或破坏性物质)来提供能够以其单体形式内在化进入细胞的自组装分子。在某些情况下，需要设计能使所述多聚复合物易于内在化进入细胞的自组装分子。
结合分子内在化的特定触发点是已知的。例如，结合于特定细胞表面受体的物质的内在化机制是已知的。因此，根据本说明书所述，本领域技术人员能够制备适于以单体或寡聚体形式在特定细胞中内在化的亚基。内在化在某些情况下可以是必需的，例如，在包括多种类型毒素或放射性同位素、优选在细胞内发生作用的亚基的情况下。
诊断用途
本发明的自组装分子和多聚复合物可用于病症的诊断，以及鉴定生物材料中的兴趣蛋白或其它物质。例如，特异性针对肿瘤抗原的相互作用域可与适用的自组装单位以及放射性或化学可识别标记物亚基融合从而提供具有诊断用途的自组装分子。例如，该类型的自组装分子将能够在发现抗原在表面例如肿瘤细胞高表达的区域构建多聚复合物。通过检测标记物即可检测该多聚复合物的存在，从而可用于诊断培养物中或个体中肿瘤细胞的存在。相同地，包含特异性食物、水或相似物质中病原体的相互作用域的亚基可用于检测这些制品样本的安全性。
构建多聚复合物能增强结合靶位的亲和力，由此增强了这些检测的敏感性，并提供了更强的信号强度，使得污染制品更易于检测。
治疗用涂
本发明的自组装分子和多聚复合物可用于多种哺乳动物个体中多种疾病的治疗用途。具有特异性针对特定兴趣的细胞表型的标记物(或特异性针对特定兴趣的细胞表型上高表达的标记物，所述亚基和兴趣细胞表型的结合优选与其它细胞表型发生的结合)的相互作用域的自组装分子可用于治疗的用途。
需要破坏某些类型的细胞时，可在亚基中加入毒性或其它破坏性的“负载”。例如，在自组装单位为vero毒素B-亚基或其变体时，即还需要包括vero毒素A-亚基。Vero毒素B-亚基通常为修饰的，以消除或基本上减低其与PK抗原的固有结合。vero毒素A-亚基具有毒性且当加入到特异性针对不需要的细胞的亚基时，能用除去患者体内的或将再施用患者的患者细胞培养物中的该类型的细胞。
例如，在很多类型的肿瘤的血管上都存在VEGF受体的过表达。因此，破坏过表达该受体的细胞的结构即能够用于阻滞向肿瘤的血液供应，由此可能降低肿瘤负荷而改善治疗效果。相似地，在多种乳癌上都存在HER-2的过表达，其即可作为适用的靶位从而降低个体的乳癌肿瘤细胞负荷。可很容易的鉴定特异性针对特定细胞表面靶位的相互作用域，只要靶位自身是已知的。在很多情况下，特异性针对细胞表面靶位的sdAb为优选的相互作用域。
在某些情况下，需要使用多聚复合物将两种不同细胞表型靠近。例如，需要将杀手细胞靠近不需要的细胞表型，如癌细胞。根据本说明书可以很容易地通过构建表现为一侧特异性针对不需要的细胞表型而另一侧特异性针对杀手细胞的相互作用域的多价分子而得以实现。例如，表现为sdAb在VTB的C-末端侧识别癌细胞且含有在VTB的N-末端识别杀手细胞的第二sdAb的十价分子将会在将杀手细胞和肿瘤细胞置于一起时，能够促进癌细胞的结构破坏。
根据本说明书所述以及N-末端和C-末端的位置(图2A和2B)，本领域普通技术人员能够制备十价结构。
当用于治疗性处理和组合物时，术语“有效量”是指当施用于患者超过2周的时间时能显著降低不需要的或过量表达的细胞或物质的数量或存活的量。
在某些情况下，多价-双特异性抗体要比双价-双特异性抗体具有优势，特别是在呈现多价抗原的情况下，如在细胞表面上。
此处所描述的寡聚化策略，特别是在结合噬菌体展示技术时，提供了一种分离用于蛋白质组学的抗体试剂的相对快速的方法。此外，根据本发明所述可制备相互作用域融合至破坏性物质或毒素如强毒性VTA亚基或联合放射性同位元素的免疫毒素，而且所述免疫毒素可用于广泛的治疗性和诊断性用途中。
在某些情况下，需要使用不同的自组装分子。单个自组装单位仍要优选那些能够特异性相互识别，能够构建可预知几何学构型和大小的多聚体。但是，一个或全部的相互作用域或所述自组装单位将在分子间存在差异。
例如，可以表达几种不同的相互作用域然后将其共置于多聚复合物中。通过制备多种具有相同自组装单位和不同的相互作用域的融合蛋白将其实现。或者，特别是在需要保持不同的相互作用域间特定化学计量学的情况下，可使用不同的但可以组装在一起来构建具有已知几何学构型和大小的多聚复合物的自组装单位。例如，百日咳毒素异五聚物产品，其包括四种不同的B-亚基，其中之一表现为副本。因此，如果需要构建含有四种不同的相互作用域的五聚物，其中之一表现为五聚物种的两种副本，而其它仅表现为单副本，即可以通过构建与百日咳毒素的四种不同B-亚基相应的四种不同的融合蛋白而得以实现，其中每一亚基融合至(如果需要，可通过适用的连接子)不同的相互作用域。所述组合可特别适用于几种不同靶分子彼此非常接近的表达，而其共表达或其彼此的密切联系具有对兴趣细胞表型特别指示性的情况下。
实施例1-概述
在本发明的一个实施方案中，提供了通过将抗体片段融合至vero毒素B-亚基的C-末端从而增强相互作用域亲和力的新方法。该方法生成了sdAb五聚物，称为五聚体。此处描述的五聚物与固定抗原的结合力比sdAb单体强7,000倍。该方法易用于其它sdAb、单链可变片段，以及其它适用的相互作用域。抗原结合亲和力还可通过体外亲和性成熟化而得以增强(参考文献7和8)，但是该方法是一种耗时的方法，其包括亚文库的构建和筛选。在某些情况下，亲和性的体外增强会改变特定的特异性或引入不需要的交叉反应(参考文献9)。
在sdAb具有肽抗原特异性的情况下，五聚化的结果导致了针对固定抗原的功能性亲和性增加了7,000倍。所述五聚物sdAb在大肠杆菌中能高产表达并表现出优良的物理特性。该方法结合噬菌体显示技术提供了快速生成具有针对固定抗原亚毫微摩亲和性的新的抗原结合分子的方法。而噬菌体显示一般能提供比杂交瘤技术更有效的分离单克隆抗体的方法(参考文献10)，通过噬菌体技术分离的抗体片度的解离常数一般为10-5～10-7(参考文献11和12)，这对很多用途来说可能太低了。
单域抗体通常基于重链抗体可变区，所述可变区具有具有与其天然存在的缺少轻链部分相关的优良物理特性。一个有用的抗体来源是单域抗体文库，来自保留和显示在噬菌体上的驼重链抗体[Tanha(2001)，参考文献13]。该文库可作为选用为评测本说明书所述的寡聚化策略的抗体的来源。
vero毒素B-亚基单体(“VTB”)为自组装域的非限制性实例，因为其大小以及其自组装而构建的同源五聚物的结构相对小。vero毒素B-五聚物具有N-末端和C-末端暴露于分子对侧以及边缘的圆环性结构。
Vero毒素，或志贺氏杆菌样毒素，是一种AB5毒素其中A亚基为毒性体以及五聚物B-亚基介导与 糖脂、简化的GB3(Galα1→4Galβ1→4Glcβ1→神经酰胺)。天然大肠杆菌vero毒素亚基借助糖脂Gb3受体与真核细胞膜结合。Vero毒素具有一些变体。本说明书所记载的特定实验可使用VT-1来实施，尽管该步骤被认为同样适用于其它变体，而所述应用也包括于本发明范围之内。
通过VTB的突变可能克服结合Gb3。例如，34位氨基酸W→A的突变，联合或D17E突变或A56Y突变可以消除醣脂的可检测的结合(Soltylk等，参考文献6)。因此，本领域技术人员根据本说明书所述能够制备不会显著结合Gb3的VTB突变体。
为了阐明与结合至固定的或细胞表面的抗原有关的五价sdAb的全部潜能，选择识别相对小的能以较高密度固定的抗原的sdAb。因此，通过噬菌体的显示，从驼sdAb文库中分离特异性针对来自人甲状旁腺激素的修饰的31个氨基酸的肽序列(“PTH50”)的sdAb(参考文献13)。所述肽含有具有序列1SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKLLQDV31(SEQ.ID.NO.1)，其中β-LACTAM键连接22E和26K的侧链(以粗体显示)。抗-PTH sdAb(PTH50)在大肠杆菌表达非常良好(约200mg/L)，并且未发生群聚。
图1中显示了将抗-PTH sdAb与VTB-亚基单体融合。将sdAb融合至VTB的C-末端以便从B-五聚物的寡糖结合位点定位sdAb，由于糖类结合活性的保留便于实施通过亲和层析的纯化融合蛋白的方法(图2A)。存在靠近sdAb基因的5′-端的Pstl的限制性位点所便于克隆，将VTB基因插入至sdAb残基5之后，其替换了在B-五聚体上延伸的N-末端的5个氨基酸。5个所示sdAba氨基酸在sdAb中被替换，其通过五个氨基酸间隔区融合至VTB，然后检测并纯化标记。
十聚体结构模型(图2C)显示了五个sdAbs从VTB核心的C-末端和边缘呈放射性排列。十聚体的高对称性的构形被认为是高动态结构的快照。SdAbs被认为是高灵活性的，因为借助连接子2构建PTH50与VTB的没有分子空间重叠的融合是相对容易的。
大小排阻亲和分析显示了PTH50和1V5在寡聚化状态上均为非常均一的。其显示于图3，1V5(A)和PTH50(B)的SPERDEX 200层析和SDS PAGE(12％)的实施方案。以在相同条件下分离的分子量标准物为基准，1V5的分子量测为128kDa，其非常接近五聚物融合蛋白预测的114.5kDa的大小。
通过1V5，VTB全糖结合活性的保留证实了融合蛋白为五聚物。含有Globotriaosylceramide，Gal-alpha(1-4)Gal-beta(1-4)GLC-BETAL-CERAMIDE(“GB3”)类似物(参考文献14)复合物中VTB的晶体结构的显示了存在十五个Gb3三糖，并且已知为Pk三糖，每VTB五聚物(图2A)。SDS-PAGE显示了虽然5μM PTH50未结合Synsorb Pk树脂，大多数的1V5在这一浓度下也未结合。在这一浓度下，需五聚物结构要有效结合寡糖(参考文献6)。令人惊讶的是，表面等离子体共振(“SPR”)的结果显示1V5三糖相互作用的KD约为1.7nM，而与之相比，VTB三糖相互作用为6.6nM。1V5上N-末端延伸的五个氨基酸(图1)可能与新糖缀合物上的间隔相互作用，结果相对VTB而言，融合蛋白结合三糖得以增强。在任何情况下，该数据与全功能五聚物分子的构建相一致。图4显示了2nM VTB和2nM1V5的寡糖结合特性的实施方案的BIACORE分析。将该数据适配于分别对VTB和1V5给定kas为2.6×106M-1S-1和5.1×105M-1S-1，并分别对VTB和1V5给定kds为1×10-2和8.8×10-4的1∶1相互作用模型中。
PTH50和1V5的抗原结合图证实了结合于固定肽的VTB融合蛋白比单体sdAb更有效(图5和表1)。与固定肽结合的PTH50(图5A)显示了快速但可检测到的动力学。相互作用的KD测为2.5μM(表1)。虽然肽与固定五聚体的相互作用不能得到速率常量(图5B)，但测定为3.6μM的KD(表1)显示了五聚化未显著地改变dAb结合位点易接近性。在低浓度下分析1V5与固定肽的结合，以便将结合效价最大化并评估参照五价dAb所达到的亲和力(图5C)。在该抗原过剩的条件下，参照五价所达到的亲和力为约7,000(表1)。图5显示了PTH50和1V5的实施方案的抗原结合特性的实施方案的BIACORE分析。(A)-0.25-2μM的PTH50与固定肽抗原结合；(B)-2-10μM肽与固定1V5结合和(c)-2.5-15nM 1V5与固定肽结合。
根据使用CM5传感器芯片的标准步骤实施BIACORE分析。结果示于图4和5中，其中y轴为响应单位(RU)。与固定配体结合的pg/mm2的蛋白的结果为1RU。
实施例1详述
分离PTH50。从按照它处(参考文献13)的描述所构建的无免疫性的驼dAb文库中分离PTH50sdAb。将100μg抗生蛋白链菌素包被的常磁粒子(SA-PMPs)(Promega，Madison，WI)按照用户手册实施淘洗。频繁振荡导管以使得在涉及SA-PMP的步骤中SA-PMP均可以保持悬浊状态。为降低背景结合，将文库噬菌体在无抗原的情况下与已经在室温下用100μl 2％乳在磷酸盐缓冲液(MPBS)中封闭1小时的SA-PMP预孵育。同样的，用于淘洗的SA-PMP在400μl MPBS，37℃，封闭2小时。淘洗混合物包含在总体积为150μl的MPBS中的预吸收的噬菌体(第一个循环中为1012tu，在随后的循环中1011tu)，20mg/mlBSA，0.05％TWEEN 20和1μg/ml的生物素化抗原。通过将混合物转至包含封闭的SA-PMP的试管，然后与室温下孵育30分钟来获得噬菌体生物素化的抗原复合物。用含有0.05％Tween-20的PBS冲洗SA-PMPs五次，然后用PBS冲洗五次。洗脱结合的噬菌体和按所记载的(参考文献13)在琼脂糖板上繁殖。在37℃，孵育过夜后，从培养板上洗脱出噬菌体颗粒，纯化并滴定(参考文献13)。
采用Tanha等，(参考文献13)所记载的ELISA实施用于抗原结合活性的噬菌体克隆的筛选。用5μg/ml streptavidin，4℃过夜包被后，用MPBS于37℃下封闭2小时，置孔内室温30分钟获得生物素化的肽，1μg/ml。在对照实验中，用适用的缓冲液替换生物素化抗原。鉴定了4几种肽特异性抗体，其中之一，PTH50，用于本实验。
VTB-PTH50的构建
标准克隆技术(参考文献15)用于生成VTB-PTH50或1V5基因(图1)。采用能够在两个末端引入Pstl位点的引物用PCR的方法扩增VTB基因(EMBL号：M16625)，并在VTB的C-末端加入了编码DVQLQ(SEQ.ID.NO.3)的序列。
用Pstl消化PCR产物，并连接到用相同酶线性化的PTH50基因(GenBankAF447918)中。Pstl位点编码PTH50的残基5和6(图1)，因此DVQLQ C-末端在VTB PCR产物上延伸(SEQ.ID.NO.3)。鉴定按照正确方向插入VTB的基因并命名为克隆PJR1V5。
分子建模。
采用INSIGHT IITM的BIOPOLYMER和DISCOVERY 3TM建模程序在R10,000SGI工作站上对1V5(SEQ.ID.NO.2)的结构建模。PTH50的模型为SEQ.ID.NO.4(蛋白)和SEQ.ID.NO.5(DNA)。采用Insight II氨基酸数据库构建间隔区。采用AMBER力场填补潜在区，且在建模的所有步骤中均实施能量最小化。
表达和纯化。
培养含有编码PTH50和PTH50-VTB的质粒的大肠杆菌TG1和ER2537，并用1mM ISOPROPYL-β-D-THIOGALACTOPYRANOSIDE诱导。基本上根据Skerra等，1991-参考文献16记载的渗压震扰法提取胞浆蛋白，然后用固定金属亲和性层析法(IMAC)(HI-TRAPTM，Amersham Pharmacia)纯化重组蛋白质。使用c-myc单克隆抗体和抗小鼠IgG/碱性磷酸酶缀合物的Western印迹来检测纯化。采用CENTRICON 10TM超滤(AMICONTM)浓缩纯化的蛋白质，以含有150mM NaCl和3.4mM EDTA的10mM HEPES，pH 7.4下，进行渗析，然后用SDS-PAGE分析。
大小排阻层析法。
采用SUPERDEX 200TM(Amersham Pharmacia)的大小排阻层析法评测PTH50和1V5的寡聚化状态。两种分离均在包含150mM NaCl，34mM EDTA和0.05％TWEEN 20TM的10mM HEPES中，pH 7.4下实施。
寡糖和抗原结合活性
为检测1V5是否保留了VTB的寡糖结合活性以及该活性是否能够用于纯化dAb-VTB融合蛋白，用SYNSORB PK TM(包括固定在CHROMOSORB PTM上的PK三糖的树脂)将5μM PTH50-VTB，以及5μM PTH50混合。通过SDS-PAGE检测两种蛋白质与树脂的结合。通过表面等离子体共振(SPR)比较VTB和PTH50-VTB的寡糖结合活性。使用BIACORE 3000TM生物传感器系统(Johnson)(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)在用前述大小排阻层析法纯化的蛋白质上实施分析。以13,000RU的表面密度，以10mM乙酸盐中100μg/ml的浓度，pH 4.5的条件下，通过根据使用手册的胺偶联的方法在实验级CM5传感器芯片(Biacore，Inc.)上，固定新糖缀合物，BSA-(间隔区-O-Galα1-4Galβ1-4Glcβ)n(GLYCOREX AB)。在包含150mM NaCl，3mM EDTA和0.005％P-20的10mM HEPES中，以10μl每分钟的流率，pH 7.4，25℃下实施分析。通过接触100mM HCl 3秒再生表面。
用SPR分析PTH50和1V5的抗原结合图。将肽抗原和1V5分别以1,300RU和6,000RU的密度，通过根据使用手册的胺偶联的方法固定在实验级CM5传感器芯片表面。以以10mM乙酸盐中50μg/ml的蛋白或肽浓度，pH 4.5的条件下实施固定。按照前述实施实验分析以及数据分析。1V5的表面不需要再生。通过与包括1M NaCl和0.1％P-20的100mM硼酸盐，pH8.5下，接触30秒来再生肽表面。采用获自Biacore，Inc.的BIAEVALUATION 3.0TM软件来计算数据。下面表1中显示了动力学和亲和性的结果。
  表1.PTH50和1V5结合肽抗原的动力学和亲和性。
  配体   分析物   ka(M-1s-1)2   kd(s-1)   kD(M)   相对kD
  肽VT1 B-PTH50肽   PTH50肽1V5   --3×105   --3×10-4   7×10-6b 14×10-6b 0.61×10-9 00014
a速率常量来自置于1∶1相互作用模型的数据
b通过Scatchard分析的检测，因为动力学太快而无法检测其速率常量。
VTB-PTH 50及其构建组件的热稳定性
为了检测1V5十聚体的热稳定性，在多种温度下检测了1V5及其构建组件、PTH50sdAb和VT1 B五聚体的循环二色性(CD)光谱(Circular dichroism(CD)spectra)。用连接于Neslab RTE-110水浴的Jasco J-600分光偏振计记录循环二色性(CD)光谱。在pH 7.0的10mM磷酸钠缓冲液，使用长度为5cm(对PTH50和VT1 B的浓度分别为为1.8和3μg/ml)和1cm(对1V5的浓度为of9μg/ml)的循环试管实施该实验。以0.2nm的间隔从215-260nm记录光谱，扫描速率为20nm每分钟，2nm的带宽和1秒的时间整合。从蛋白光谱中减去空白光谱，然后用Jasco软件平滑化。为了检测Tm，将样品的温度在30℃～82℃内逐步增加。在10分钟温度均衡后，在多个温度下记录光谱。以235、234.8、234.6、234.4和234.2nm五个电值的均值用于建立电对温度的sigmoidal图性，并以50％伸展相应的温度测定为Tm-参见图7。
在234.2，234.4，234.6，234.8和235nm收集到的数据用于获得蛋白的变性曲线。在VT1 B的CD光谱中未观察到明显的改变，甚至在高达70℃的温度下。在高于72℃的温度时，因为蛋白的沉淀观察到信号的急剧增加(数据未显示)。该结果显示了VT1 B五聚物是一种非常稳定的结构，尽管Tm未能检测。在高温下溶解性的突然丧失而没有任何变性的指征，这提示了结构的维持要依赖于五聚物的构建。PTH50的融化温度为一个相对宽的温度范围，其是非协同性构建改变中的典型现象，且用小肽时可频繁观察到。经计算，融化温度为59.7℃，显示了该蛋白具有非常好的热稳定性。有两种构建块制备的融合蛋白具有典型的热-变性曲线，Tm为52℃(图7，1V5十聚体的热—诱导变性曲线)。尽管该数值低于PTH50(该融合蛋白的热稳定性比VT1 B低)的Tm，1V5仍是一种具有非常好的热稳定性的分子。
本说明书所述十聚体的热稳定性是一种将这些分子用于多种用途的良好的指征。而高热稳定性是有用的特性，其在体内的医疗应用中具有重要作用。尽管具有高抗原结合亲和性，肿瘤特应性SCFV不能定位于异种物中，这是由于其热稳定不足所致(Willuda等，1999，参考文献17)。将肿瘤特异性SCFV的抗原结合环移植到高稳定性SCFV的框架上制备出具有良好的血浆稳定性和肿瘤定位的分子。
五聚体的蛋白酶稳定性
胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化实验以下述方法实施：在37℃下，使用购自Boehringer Mannheim的测序级胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，以1∶200的酶∶五聚物比，消化1小时。消化混合液包含100mM Tris-HCI缓冲液中约2μg/ml的1V5，pH 7.8。用50mM CaCl2补足胰凝乳蛋白酶消化混合液。通过加入10μl的0.1μg/ml胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂(Sigma)终止反应。用分子量光谱法测定分子量，加入DTT至终浓度为200mM，并按照先前Tanha，J.等，参考文献18的描述对样品进行操作。
图8显示了五聚体sdAb的蛋白酶易感性。在用胰蛋白酶消化0和2小时(分别为A和B)和用胰凝乳蛋白酶消化0和2小时(分别为C和D)后用SDS-PAGE分析1V5。
1V5表现出非常好的对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化的耐受性。已经观察到胰蛋白酶能很快的将1V5转化为具有较小分子大小的产物，而没有任何证据证明其在使用的条件下发生机一步的消化(图8A和8B)。分子量光谱分析显示出除去了C-末端的标记。胰蛋白酶处理降低1V5单体的大小至1602Da，其相应于从1V5中除去C-末端的LISEEDLNHHHHH序列(图8C)。用胰凝乳蛋白酶孵育1小时后没有观察到剪切产物(图8C和gD)。分子量光谱分析证实了图8C和8D中所示条带对应于1V5单体。
本说明书所述的五聚体sdAb令人惊奇的耐胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。虽然五聚体内有针对两种酶的多个位点，但没有任何证据证明在本说明使用的条件下各酶能将其降解。这一发现显著说明了单域抗体的一个优势：命名为SCFV的来自传统抗体的最小的抗原结合片段包含了蛋白酶敏感的连接子。在体内使用如肿瘤成像时，非常需要耐蛋白酶的特性。在关于耐蛋白酶的方面，VT1 B是作为寡聚化结构域的一种理性选择，因为其天然存在于消化环境中。
实施例2-其中sdAbsare与VT1 B的N-末端融合的五聚体
为确定本说明所述的策略是否普遍适用于sdAb五聚体化，可检测五聚物抗体是否能够在1)将抗体与VTB的N-末端融合，2)PTH50以外的其它抗体分子与VTB融合以及3)如果能将VTB的突变体用作五聚化结构域的时候得以构建。
为达到这一目的：
(a)蛋白1V12，其通过将另一sdAb分子(PTH61)融合至VTB的突变体的N-末端而构建(图9显示了其一级结构)。在将成熟蛋白分泌至大肠杆菌细胞质时，去除ompA序列。PTH61是分离自与PTH50相同淘洗实验的甲状旁腺激素-结合sdAb。按照分离1V5所述方法从包含编码1V12的基因的大肠杆菌TG1细胞中分离蛋白1V12。在Superdex 200柱上实施大小排阻层并显示出，与1V5相比，1V12构建了非常同源的五聚物(图10)。在相同柱以及相同条件下上进行蛋白标记物(单位为kDa)的实验。获自SPR分析的数据显示了蛋白1V12，PTH61的五聚物形式，比PTH61结合其抗原的能力强(图11，单价和五价1V12与固定抗原结合的表面等离子体共振检测)。
(b)采用野生型和突变型VTB和融合至VT1 B的或者N-末端或者C-末端的不同的sdAb分子来制备全部8个五聚体(1V5、1V11、1V12、1V14、PES1、PVTGL10、PJS5、PSJ6)。在大肠杆菌TG1细胞中良好表的全部的构建的五聚体，具有微弱或不具有集簇性的征象而且可观察到其与抗原的结合的功能型亲和力要远高于其单体形式。
实施例3-构建十聚体。
多数，或全部sdAb能够通过将其融合至不同VTB的或者N-末端或者C-末端的而很容易的得以五聚体化，这一事实允许通过将一个sdAb融合至VT1 B的N-末端而把另一个sdAb融合至VT1 B的C-末端从而构建十价抗体。图2中显示了这一观点，图中显示了N-末端五聚体，C-末端五聚体和双特异性十聚体。为对其研究利用，构建了1V13，一种十价抗体，命名为十聚体。其显示于图13中；其中显示了1V13的一级结构和序列以及1V12的大小排阻层析(Superdex 200柱，Amersham Pharmacia)。在相同柱以及相同条件下上进行蛋白标记物(单位为kDa)的实验。1V13为SdAb PTH22融合至C-末端而sdAb PTH61融合至N-末端的VT1 B突变体D17E/W34A(Fig 13A)。PTH22是另一种分离自与PTH50和PTH61相同的淘洗实验的甲状旁腺激素结合sdAb。从包含编码1V13的基因的大肠杆菌TG1细胞中分离1V13。大小排阻层析法显示1V13构建了五聚体，但其并非特别同源(图13B)。
实施例4-增加十聚体的同源性
由于sdAb和VT1 B，这两种用于十聚体构建的构建单位，非常同样而且可在大肠杆菌中良好表达，因此主要改变连接构建部件的连接子。采用不同的连接子构建了四种新的十聚体，PJR9、PJR10、PJR13和PJR14，图14中显示了其序列。图14显示出通过的大小排阻层析法的1V13十聚物和其变体的比较。每一层析图的上部均显示了连接sdAb和VTB的连接子序列。如图14中所示，四种蛋白质构建了非常同源的不具有或仅具有微弱集簇性征象的同源五聚物。采用连接子GPGGGGS来连接PTH61和VTB，以及连接子AKRVAPELLGGPSG来连接VTB和PTH22的蛋白1V9，具有最佳的大小排阻图。
根据本发明的另一实施方案，通过使用已知低价的、水溶性的、与VT1 B糖类受体类似的糖类配体并且其与VT1 B构成复合体例如STARFISH参见Kitov，Pavel I.等；2000，参考文献19，可以将十价抗体(十聚体)制备和用途的概念加以延伸。STARFISH交叉结合两种VT1 B五聚物，其提供了制备十聚体的另一种方法。
STARFISH结合本发明的五聚体，而不结合单个单位。因此，标记的STARFISH可用于检测本说明所述的五聚体。结合在靶位如癌细胞表型、细菌病原体、炭疽孢子等上的五聚体通过加入标记的STARFISH构建复合物从而使得STARFISH-五聚体-靶位复合物得以检测。在加入以及结合后，从系统中洗去未结合的残余STARFISH，然后通过根据其标记(荧光、放射性等)的方法检测结合的STARFISH，从而检测结合的五聚体。另外，STARFISH-型配体还可联合本发明的五聚体而用于治疗用途。例如，可获得独立而且不同的两种类型的根据本发明的自组装分子，一种可用于识别以及结合靶位，而另一种可用于识别和结合杀手细胞(killer细胞)或用于靶位的化合物。两种类型均可以构建五聚体，以获得强的结合力。加入STARFISH以使得两类五聚体结合在一起将使得靶位和杀手细胞靠近，而发生之间的相互作用。
因此，很明显根据本发明提供了一种新的自组装分子，所述分子能完全实现上述目的、目标和优势。虽然本发明已经用其具体实施方案加以描述，但对本领域技术人员根据上述的描述得到其多种改变、修饰和变化是显而易见的。因此，在本发明的精神和范围内包含所有所述的改变、修饰和变化。
参考文献
1.Pluckthun，A and Pack，P.，New protein engineering approaches to multivalentand bispecific antibody fragment...，IMMUNOTECHNOLOGY 3，(1997)83-105.
2.Terskikh et al.，″Peptabody：a new type of high avidity binding protein，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)Vol.94，(1997)1663-1668.
3.Efimov，V P.，Lustig，A.& Engel，J.The thrombospondin-like chains ofcartilage oligomeric matrix protein are assembled by a five-stranded alpha-helicalbundle between residues 20 and 83.FEBS Lett.341，54-58(1994).
4.Hudson，P.J.& Kortt，A.A.High avidity sdFv multimers；diabodies andtriabodies.J.Immunol.Methods 231，177-189(1999).
5.Kaminski，M.J.etal.，The role of homophilic binding in anti-tumor antibodyR24 recognition of molecular surfaces，J.Biol.Chem.，Vol 274 No.9(1999)5597-5604.
6.Soltyk，A.M.et al.，A mutation analysis of the globoriaosylceramide bindingsites of verotoxin VT1.J.Biol.Chem.277，5351-5359(2002).
7.Yang，W.P.et al.，CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of apotent human anti-HIV-1 antibody into the picomolar range.J.Mol.Biol.254，392-403(1995).
8.Schier，R.et al.Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2 single-chain Fvby molecular evolution of the complementarity determining regions in the center ofthe antibody binding site.J.Mol.Biol.263，551-567(1996).
9.Ohlin，M.，Owman，H.，Mach，M.& Borrebaeck，C.A.Light chain shufflingof a high affinity antibody results in a drift in epitope recognition.Mol.Immunol.33，47-56(1996).
10.McCafferty，J.，Griffiths，A.D.，Winter，G.& Chiswell，D.J.Phageantibodies：filamentous phage displaying antibody variable domains.NATURE 348，552-554(1990).
11.Griffiths，A.D.et al.Isolation of high affinity human antibo dies directlyfrom large synthetic repertoires.EMBO J.13，3245-3260(1994).
12.Hoogenboom，H.R.& Chames，P.Natural and designer binding sites madeby phage display technology.Immunol Today 21，371-378(2000).
13.Tanha，J.，Dubuc，G.，Hirama，T.Narang，S.A.& MacKenzie，C.R.Selection by phage display of llama conventional VH fragments with heavy chainantibody VHH properties.J.Immunol.Methods 263，97-109(2002).
14.Ling，H.et al.Structure of the shiga-like toxin I B-pentamer complexed withan analogue of its receptor Gb3.Biochemistry 37，1777-1788(1998).
15.Sambrook，J.&.Russel，D.W.Molecular Cloning，a laboratory manual.
16.Skerra，A.，Pfitzinger，I.& Pluchthun，A.The functional expression ofantibody Fv fragments in Escherichia coli：improved vectors and a generallyapplicable purification technique.Biotechnology(N.Y.)9，273-278(1991).
17.Willuda et al.，High Thermal Stability is Essential for Tumor Targeting ofAntibody fragments：engineering of a humanized anti-epithelial glycoprotein-2(epithelial cell adhesion molcule)single-chain Fv Fragment，1999 Cancer Research59，5758-5767.
18.Tanha et al.，Optimal Design Features of Camelized Human Single-Domainantibody Libraries，J.Biol.Chem.276，24774-24780.
19.Kitov，Pavel I.et.al.，Nature，403，February 2000，669-672.

Claims (31)

1.一种构建具有靶位亲和性的多聚复合物的方法，所述方法包括：
获取多个AB5源性的自组装分子，所述自组装分子包括互补自组装单位，每一单位操作性连接于特异性针对靶位的相互作用域；
联合所述自组装分子，使得至少三个所述自组装分子充分地同时彼此结合且能允许相互作用域结合靶位。
2.根据权利要求1中的方法，其中相互作用域来自编码抗体区和细胞表面受体的遗传物质。
3.根据前述任一项权利要求中的方法，其中所述单位中的相互作用域识别至少两种不同的靶位。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中每一自组装分子的自组装单位在自组装单位的C-或N-末端操作性连接于抗体的单域。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中多聚复合物为五聚物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中多聚复合物为同形五聚物。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中相互作用域为细胞表面结合区。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中相互作用域为特异性针对靶位的抗体单域。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中相互作用域为编码抗体VL和VH区的单链多肽。
10.具有对一种或多种已知靶位亲和性且适用于构建多聚复合物的自组装分子，所述亚基包括：
AB5来源的自组装单位；和
操作性连接于所述自组装单位的相互作用域，从而允许所述相互作用域结合靶位并允许所述自组装单位结合另一自组装单位。
11.一种自组装分子，其包含大量操作性连接在一起的蛋白或肽部分，第一所述部分包括能与相同或不同复合物的至少两种自组装分子的自组装区相结合从而构建至少含有三个自组装分子的复合物的AB5源性自组装区，且第二所述部分包含适于与另一、不同分子上的靶位区域发生特异性相互作用的相互作用域。
12.根据权利要求10或11中的自组装分子，其中相互作用域操作性连接于自组装分子的一个N-末端或C-末端。
13.根据权利要求10或11自组装分子，其中自组装单位来自vero毒素。
14.根据权利要求10或11的自组装分子，其中自组装单位来自百日咳毒素。
15.根据权利要求10或11的自组装分子，其中相互作用域为sdAB。
16.根据权利要求10或11的自组装分子，其中相互作用域为细胞表面结合肽。
17.根据权利要求10或11项的自组装分子，其还包含连接所述相互作用域和所述自组装单位的连接子。
18.根据权利要求10或11的自组装分子，其还包含操作性连接于所述自组装单位的第二相互作用域，以便允许将相互作用域与靶位结合。
19.根据权利要求18中的自组装分子，其中一个相互作用域融合至自组装单位的N-末端，而其它相互作用域融合至自组装单位的C-末端。
20.五聚物形式的根据权利要求10或11的自组装分子。
21.根据权利要求20中的五聚物，二聚化为十聚体。
22.根据权利要求20中的十聚物，其中借助结合在五聚物但不结合在自组装单位上的媒介物进行二聚化。
23.一种检测细胞表面存在大量多肽分子的方法，所述方法包括：
获取多个AB5源性自组装分子，每一自组装分子包括互补自组装单位、特异性针对靶位的相互作用域、和标记物；
将所述细胞表面暴露于自组装分子；
将所述单位自组装为多聚复合物；和
检测标记物。
24.根据权利要求23中的方法，其中标记物为放射性同位素。
25.根据权利要求23中的方法，其中标记物为生物素。
26.AB5源性自主装分子的应用，其特征是每一个所述的自主装分子包括操作性连接于两个特异性针对所述靶位的相互作用域的互补自组装单位和破坏性物质，组成一种减轻细胞表型、病毒或其上具有多种相同的靶位的物质的水平过量的哺乳动物类患者症状的药物，其中自组装分子识别所述靶位，且构建多聚复合物，从而使得破坏性物质导致细胞表型、病毒或物质的死亡、降低或消除。
27.根据权利要求26所述的应用，其中的自组装分子在构建多聚复合物前仅微弱结合靶位，但在多聚复合物中强烈结合靶位。
28.根据权利要求26或27中的应用，其中自组装分子还包含适于在兴趣组织或细胞表型中选择性除去的阻遏子。
29.根据权利要求26或27中的应用，其中自组装分子来自AB5毒素的B-亚基。
30.根据权利要求26中的应用，其中破坏性物质来自vero毒素的A-亚基。
31.根据权利要求26中的应用，其中破坏性物质为放射性同位素。
CNB028238427A 2001-11-30 2002-11-29 新的自组装分子 Expired - Fee Related CN100335900C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33409801P 2001-11-30 2001-11-30
US60/334,098 2001-11-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1596371A CN1596371A (zh) 2005-03-16
CN100335900C true CN100335900C (zh) 2007-09-05

Family

ID=23305560

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028238427A Expired - Fee Related CN100335900C (zh) 2001-11-30 2002-11-29 新的自组装分子

Country Status (14)

Country Link
US (1) US7655412B2 (zh)
EP (1) EP1456651B1 (zh)
JP (1) JP4471656B2 (zh)
CN (1) CN100335900C (zh)
AT (1) ATE394673T1 (zh)
AU (1) AU2002349228B2 (zh)
BR (1) BR0214621A (zh)
CA (1) CA2468583C (zh)
DE (1) DE60226486D1 (zh)
DK (1) DK1456651T3 (zh)
ES (1) ES2306794T3 (zh)
MX (1) MXPA04005134A (zh)
NZ (1) NZ532838A (zh)
WO (1) WO2003046560A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004093A (zh) * 2014-06-03 2014-08-27 大连理工大学 一种抗人甲状旁腺激素的纳米抗体及其筛选方法和应用

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
ES2368733T3 (es) 2002-07-18 2011-11-21 Merus B.V. Producción recombinante de mezclas de anticuerpos.
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
CA2527694C (en) 2003-05-30 2015-07-14 Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
WO2005014615A2 (en) * 2003-06-25 2005-02-17 Massachusetts Institute Of Technology Self-assembling peptides incorporating modifications and methods of use thereof
US7713923B2 (en) 2003-06-25 2010-05-11 Massachusetts Institute Of Technology Self-assembling peptides incorporating modifications and methods of use thereof
EP2267028A3 (en) * 2003-06-30 2011-07-27 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies (dAb) conjugated to PEG
PT1639011E (pt) * 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
CA2547034C (en) * 2003-11-28 2014-02-18 National Research Council Of Canada Anticarcinoma antibodies and uses thereof
EP1737971B1 (en) * 2004-01-20 2017-08-16 Merus N.V. Mixtures of binding proteins
EP1943341A4 (en) * 2005-09-27 2010-07-07 Ca Nat Research Council HEMATOENCEPHALIC BARRIER EPITOPES AND USES THEREOF
AU2007329171A1 (en) * 2006-12-04 2008-06-12 Innovative Purification Technologies Pty Ltd Protein particles
US8586315B2 (en) * 2007-05-30 2013-11-19 Innovative Purification Technologies Pty Ltd Fluorescent protein particles
JP2012505893A (ja) * 2008-10-14 2012-03-08 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 粘膜送達ペンタボディ複合体（ｍｄｐｃ）による粘膜免疫応答の誘導
EP2337798A4 (en) 2008-10-14 2012-10-24 Ca Nat Research Council BSA-SPECIFIC ANTIBODIES
EP2692736B1 (en) 2008-10-14 2018-04-18 National Research Council Of Canada Bsa-specific antibodies
WO2010060216A1 (en) * 2008-11-26 2010-06-03 National Research Council Of Canada Nanoaggregate embedded beads conjugated to single domain antibodies
CN101830986A (zh) * 2009-03-13 2010-09-15 北京表源生物技术有限公司 一种融合蛋白多聚体
WO2010102518A1 (zh) * 2009-03-13 2010-09-16 北京表源生物技术有限公司 一种融合蛋白多聚体
US20100247529A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-30 William Patterson Cooperative and dynamic assembly of affinity complexes
EP2563816B1 (en) 2010-04-27 2014-11-12 National Research Council of Canada Anti-icam-1 single domain antibody and uses thereof
CA2813133C (en) 2010-10-01 2023-10-31 National Research Council Of Canada Anti-ceacam6 antibodies and uses thereof
WO2012055030A1 (en) 2010-10-25 2012-05-03 National Research Council Of Canada Clostridium difficile-specific antibodies and uses thereof
WO2012100343A1 (en) 2011-01-28 2012-08-02 National Research Council Of Canada Engineering of immunoglobulin domains
DK3006464T3 (en) 2011-06-10 2018-09-17 Canada Minister Nat Defence ANTIRICIN ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF
CA2859226C (en) 2011-12-20 2020-07-21 Adaerata, Limited Partnership Single domain antibodies as inhibitors of pcsk9
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
KR20150073211A (ko) 2012-10-24 2015-06-30 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다 항―캄필로박터 제주니 항체 및 그의 용도
CA2942154C (en) 2014-03-06 2023-06-27 National Research Council Of Canada Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof
AU2014385801B2 (en) 2014-03-06 2020-11-12 National Research Council Of Canada Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof
US10106614B2 (en) 2014-03-06 2018-10-23 National Research Council Of Canada Insulin-like growth factor 1 receptor-specific antibodies and uses thereof
WO2016043577A1 (en) 2014-09-16 2016-03-24 Academisch Medisch Centrum Ig-like molecules binding to bmp4
CA3001724A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 National Research Council Of Canada Anti-tau antibody and uses thereof
US10487153B2 (en) 2015-06-10 2019-11-26 National Research Council Of Canada Carbonic anhydrase IX-specific antibodies and uses thereof
JP7059494B2 (ja) 2016-07-06 2022-04-26 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ 血液脳関門を通過するヒト化抗体及びその使用
WO2018109663A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 National Research Council Of Canada Antibody variants transmigrating the blood-brain barrier and uses thereof
US11566064B2 (en) 2017-01-27 2023-01-31 National Research Council Of Canada Hemagglutinin-specific antibodies and uses thereof
US11702466B2 (en) 2017-01-30 2023-07-18 National Research Council Of Canada Fusion protein comprising a blood-brain barrier (BBB)-crossing single domain antibody Fc5, an immunoglobulin Fc fragment and a beta-amyloid binding polypeptide (ABP)
WO2020086793A1 (en) * 2018-10-25 2020-04-30 Hao Shen Self-assembling protein homo-polymers
CN114099701B (zh) * 2021-11-29 2023-11-10 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种自组装复合多肽及其制备方法和药物

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997033617A1 (en) * 1996-03-13 1997-09-18 Protein Design Labs, Inc. Fas ligand fusion proteins and their uses
WO1998018943A1 (en) * 1996-10-28 1998-05-07 Novartis Ag Method for the oligomerisation of peptides
WO1999027964A1 (en) * 1997-12-01 1999-06-10 Cfy Biomedicals, Inc. Multivalent recombinant antibodies for treating hrv infections
WO2000044908A2 (en) * 1999-02-01 2000-08-03 Beth Israel Deaconess Medical Center Comp/tsp-1, comp/tsp-2 and other tsp chimeric proteins
WO2001049866A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Research And Development Ltd. Bi- oder oligomer eines di-, tri-, quattro- oder pentamers von rekombinanten fusionsproteinen

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
US5955293A (en) * 1989-10-17 1999-09-21 New England Medical Center Hospitals, Inc. Assays for shiga toxin and shiga-like toxins
JP3720353B2 (ja) * 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
US6485726B1 (en) * 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5744346A (en) * 1995-06-07 1998-04-28 Athena Neurosciences, Inc. β-secretase
WO1997047971A1 (en) * 1996-06-11 1997-12-18 Advanced Research & Technology Institute Methods and compositions for the use of apurinic/apyrimidinic endonucleases
CA2287872C (en) * 1997-05-12 2010-07-27 Aphton Corporation Immunogenic compositions to the cck-b/gastrin receptor and methods for the treatment of tumors
US6310043B1 (en) * 1998-08-07 2001-10-30 Governors Of The University Of Alberta Treatment of bacterial infections
WO2000061183A2 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Hsc Research And Development Limited Partnership Verotoxin treatment of lymphomas
NZ518342A (en) 1999-10-08 2004-04-30 Active Biotech Ab AB5 toxin B subunit mutants with altered chemical conjugation characteristics
AU2001227966A1 (en) * 2000-01-20 2001-07-31 Chiron Corporation Methods for treating tumors

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997033617A1 (en) * 1996-03-13 1997-09-18 Protein Design Labs, Inc. Fas ligand fusion proteins and their uses
WO1998018943A1 (en) * 1996-10-28 1998-05-07 Novartis Ag Method for the oligomerisation of peptides
WO1999027964A1 (en) * 1997-12-01 1999-06-10 Cfy Biomedicals, Inc. Multivalent recombinant antibodies for treating hrv infections
WO2000044908A2 (en) * 1999-02-01 2000-08-03 Beth Israel Deaconess Medical Center Comp/tsp-1, comp/tsp-2 and other tsp chimeric proteins
WO2001049866A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Research And Development Ltd. Bi- oder oligomer eines di-, tri-, quattro- oder pentamers von rekombinanten fusionsproteinen

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004093A (zh) * 2014-06-03 2014-08-27 大连理工大学 一种抗人甲状旁腺激素的纳米抗体及其筛选方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003046560A2 (en) 2003-06-05
CA2468583A1 (en) 2003-06-05
CA2468583C (en) 2012-05-01
JP4471656B2 (ja) 2010-06-02
US7655412B2 (en) 2010-02-02
EP1456651B1 (en) 2008-05-07
BR0214621A (pt) 2004-10-13
CN1596371A (zh) 2005-03-16
MXPA04005134A (es) 2004-08-11
DE60226486D1 (de) 2008-06-19
WO2003046560A3 (en) 2003-09-04
ATE394673T1 (de) 2008-05-15
DK1456651T3 (da) 2008-09-01
AU2002349228A1 (en) 2003-06-10
WO2003046560B1 (en) 2003-10-16
EP1456651A2 (en) 2004-09-15
AU2002349228B2 (en) 2007-06-14
US20060051292A1 (en) 2006-03-09
ES2306794T3 (es) 2008-11-16
JP2005510719A (ja) 2005-04-21
NZ532838A (en) 2008-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100335900C (zh) 新的自组装分子
JP7293456B2 (ja) 誘導性結合タンパク質及びその使用方法
US11046745B2 (en) Peptide mimotopes of the CD3 T-cell co-receptor epsilon chain and uses thereof
Madej et al. Engineering of an anti‐epidermal growth factor receptor antibody to single chain format and labeling by sortase A‐mediated protein ligation
CN110998329A (zh) 定性和/或定量分析可活化抗体的特性的方法及其用途
CN109219615A (zh) 识别tau的抗体
CN101611056A (zh) 能够结合于血清蛋白的肽
TWI661096B (zh) 功能性抗體片段的高通量篩選方法及其免疫偶聯物以及用於篩選之適體-藥物偶聯物
CN1675244A (zh) Mcam抑制剂
EA028178B1 (ru) Улучшенные связывающие сывороточный альбумин варианты
Wang et al. A novel nanobody specific for respiratory surfactant protein A has potential for lung targeting
WO2019098133A1 (ja) モノクローナル抗体及びその使用
CN1604910A (zh) 亲和性增强物质
CN114591425B (zh) 新冠病毒s蛋白rbd区域的特异性抗体及其制备方法与应用
TW202204381A (zh) 重組抗體、包含重組抗體之套組及其用途
CN114591423A (zh) 新冠病毒n蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用
CN114591424A (zh) 新冠病毒s蛋白ntd区域的特异性抗体及其制备方法与应用
CN107074925A (zh) 用于预防和/或治疗亨廷顿氏病的物质和方法
WO2013093122A2 (en) Antibodies for the treatment and diagnosis of affective and anxiety disorders
CN114591436B (zh) 胃蛋白酶原i的特异性抗体及其制备方法与应用
CN114763379B (zh) 新冠病毒s蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用
JP2005500826A (ja) ヘベイン結合性モノクローナル抗体
WO2017053290A1 (en) Ribotoxin molecules derived from sarcin and other related fungal ribotoxins
Cegarra et al. Search and Characterization of ITM2A as a New Potential Target for Brain Delivery
Weber Novel phage display libraries and selection technologies for the isolation of fully human antibodies for pharmaceutical applications

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20070905

Termination date: 20141129

EXPY Termination of patent right or utility model