KR20150073211A - 항―캄필로박터 제주니 항체 및 그의 용도 - Google Patents

항―캄필로박터 제주니 항체 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20150073211A
KR20150073211A KR1020157013633A KR20157013633A KR20150073211A KR 20150073211 A KR20150073211 A KR 20150073211A KR 1020157013633 A KR1020157013633 A KR 1020157013633A KR 20157013633 A KR20157013633 A KR 20157013633A KR 20150073211 A KR20150073211 A KR 20150073211A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fragment
gly
ser
isolated
antibody
Prior art date
Application number
KR1020157013633A
Other languages
English (en)
Inventor
메디 아르바비 하로우디
알리 리아지
크리스틴 엠. 시맨스키
그렉 후삭
잼시드 탄하
로저 메켄지
Original Assignee
내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다 filed Critical 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다
Publication of KR20150073211A publication Critical patent/KR20150073211A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/121—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Helicobacter (Campylobacter) (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/205—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Campylobacter (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

캄필로박터 제주니는 급성 설사병부터 신경 장애까지의, 인간에서의 박테리아 음식 유래 질환에 대한 주된 원인이다. 씨. 제주니에 특이적인 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 기술한다. 항체 또는 그의 단편은 씨. 제주니의 편모 단백질에 결합하여 운동성을 감소시킨다. 항체 또는 그의 단편은 씨. 제주니 편모 단백질로 면역화된 낙타류 동물의 중쇄 IgG 가변 도메인 단편 (VHH)으로부터 유래된 것이다. 항체 또는 그의 단편의 다가 형태 뿐만 아니라, 파지 포맷을 기술한다. 동물 또는 동물 환경에서 씨. 제주니의 존재를 감소시키는 방법, 씨. 제주니 감염을 치료하는 방법 및 치료용 제제, 및 씨. 제주니 검출 방법 또한 기술한다.

Description

항―캄필로박터 제주니 항체 및 그의 용도 {ANTI-CAMPYLOBACTER JEJUNI ANTIBODIES AND USES THEREFOR}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2012년 10월 24일 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/718,062를 우선권 주장하며, 이 가특허는 본원에서 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 항체, 그의 단편, 및 상기 단백질의 유도체 및 적용에 관한 것이다. 기술된 항체 및 단편은 씨. 제주니(C. jejuni)의 편모 단백질에 대한 것이다.
캄필로박터(Campylobacter) 속은 형태상 다양한 (나선형, 곡선형, 또는 막대형) 다수의 박테리아 군을 포함하는데, 35개 초과의 종 및 아종이 보고되어 있으며, 이중 20개는 장 및 장외 질병을 유발하는, 인간에게 병원성이거나, 또는 인간의 다수의 다양한 부위에 콜로니를 형성하는 것으로 밝혀져 있다 (Man, 2011).
그람 음성 나선형 박테리아인 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)는 현재 가장 만연해 있는 음식 유래 병원체 중 하나이며, 전세계 인간의 박테리아성 위장염의 주된 원인이다. 북미에서는 캄필로박테리아증이 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 리스테리아(Listeria) 및 이. 콜라이(E. coli)에 의해 유발된 것으로 보고된 질병 사례수를 합한 것보다도 더 많다 (Stern & Robach, 2003; Newell et al., 2003; Blaser, 1997). 상대적으로 경미한 설사병인 것에도 불구하고, 캄필로박터 감염은 소아마비 근절 이후의 마비의 주된 원인인 길랑-바레 증후군 (GBS); 비마비성 변형인 밀러 피셔 증후군 (Humphery et al. 2007; Hariharan et al. 2004; Blaser et al. 1986); 반응성 관절염 (ReA); 및 염증성 장 질환 (IBD) (Rautelin et al. 2000; Gellynck et al. 2008)을 비롯한, 수개의 장기간의 합병증과 관련되어 있었다.
인간 캄필로박테리아증 사례 중 50-80%는 닭 섭취가 원인이 될 수 있으며, 따라서, 육용계 식육이 인간에게 병원체를 전달하는 1차 벡터인 것으로 간주된다 (EFSA Journal 2011; Hermans et al. 2011). 가금류, 및 특히 닭에서 캄필로박터 수준을 제어하고 감소시키는 것이 가금류 제품의 안전성을 개선시킬 수 있고, 캄필로박터 유도성 위장염의 발병을 감소시킬 수 있다. 따라서, 인간에서의 장기간의 합병증은 감소될 수 있으며, 이로써 전세계적으로 입원 및 다른 관련 비용을 수백억 달러 절약할 수 있다 (EFSA report, 2011; Nyachuba, 2010; Buzby et al. 1997).
씨. 제주니 및 그보다는 빈도가 더 적은 다른 균주 (예컨대, 씨. 콜라이(C. coli) 및 씨. 라리(C. lari))에 대한 현 개입 전략법은 가금류를 육종시키는 동안 (1차 개입), 식육을 생산하는 동안 및/또는 식육을 가공하는 동안인 것을 비롯한, 다양한 생산 단계에서 적용된다. 가장 크게 용인되는 전략법은 위생막과 방충망을 설치하고, 고급수를 사용하고, 도축 연령을 감소시키고, 솎음을 중단함으로써 캄필로박터 종이 무리에 진입하지 못하게 막는 것이다 (Newell & Wagenaar, 2000; Wagenaar et al., 2006, 2008; Lin 2009; EFSA report, 2011). 그러나, 씨. 제주니에 의한 감염에 대한 닭의 감수성 및 환경내 씨. 제주니의 편재가 상기와 같은 차단방역 접근법의 성공에 부정적인 영향을 미치며, 박테리아 감염을 방제하거나, 제거할 수 있는 대체 접근법의 필요성을 강조한다. 박테리오파지를 사료 첨가제 또는 동물용 약물로서 닭에게 투여하였을 때, 맹장 캄필로박터 수준이 0.5-5 log10 CFU/g 감소한 것으로 보고되었다 (El-Shibiny et al., 2009; Carrillo et al., 2005; Wagenaar et al., 2005).
더욱 효과적으로는, 가금류 음용수에 첨가된 박테리오신으로 처리한 결과, 사례 중 90%에서 병원체를 완전하게 제거하였거나, 또는 그의 수준을 106배 이상만큼 감소시켰다 (Svetoch et al., 2010). 다른 생물학적 시약, 예컨대, 프로바이오틱스 (Santini et al., 2010; Willis et al., 2008) 및 식물 생체활성 화합물 (Castillo et al., 2011; Kureckci et al., 2012) 또한 식품 또는 음용수 첨가제로서 사용되었고, 닭 배설물에서 캄필로박터 적재량을 현저하게 감소시킨 것으로 나타났다. 씨. 제주니에 대한 프로바이오틱 균주, 예컨대, 락트산 박테리아 (LAB)의 살균 효과는 유기산, 박테리오신 또는 박테리오신 유사 물질 생산에 기인하는 것이었다 (Santini et al., 2010; Messaoudi et al., 2011). 다수의 이러한 접근법들은 효능, 안전성, 독성, 생산 및 정제 규모 확장, 및 캄필로박터 저항성 발생과 같은 문제로 인해 관련 기술분야에서 널리 채용되지 못했다.
항생제, 예컨대, 플루오로퀴놀론 및 마크로라이드가 가금류 및 인간, 둘 다에서 캄필로박터 종을 처리하기 위한 것으로 승인을 받았다. 그러나, 전세계 많은 국가에서 인간 및 동물 건강을 위해 그를 장기간 사용하였을 때, 저항성 캄필로박터 균주가 급속도로 증가하였고, 이에 동물용 사료 원액에서의 그의 사용은 더 이상 권고되지 않고 있다 (Smith et al., 2010; Luangtongkum et al., 2009; Alfredson et al., 2007; Silva et al., 2011). 중간쇄 지방산 (예컨대, 카프릴산) 및 모노아실 글리세롤이 항생제에 대한 대안이며, 이것이 닭에서의 캄필로박터 적재량을 제어하거나, 감소시키는 사료 및 음용수 첨가제로서 사용되고 있다 (de los Santos et al., 2009; Hermans et al., 2010, Molatova et al., 2010). 그럼에도 불구하고, 화학 화합물로 처리하였을 때의 캄필로박터의 개수 및 만연과 관련된 데이터는 일치하지 않으며, 그의 효과에 대해서도 뚜렷한 결론을 내릴 수 없다 (The EFSA Journal, 2011). 가금류에서 감염원을 감소시키거나, 제거하는 데, 또는 인간 감염을 치료하는 데, 버지니아마이신, 에리트로마이신, 네오마이신 또는 시프로플록사신 사용을 비롯한 항생제 요법이 유용한 도구이다. 그러나, 동물 생산에서 항생제 처리의 광범위한 사용에 관한 우려인 저항성 캄필로박터 균주 발생, 및 닭으로부터의 항생제 저항성 캄필로박터가 인간에서 항생제 저항성 감염을 유발한다는 사실이 증가하고 있다.
다수의 감염성 질환에 대한 백신화가 상업적으로 사육된 닭에서 널리 사용되고 있다 (Clark et al., 2012). 캄필로박터 종 콜로니 형성으로부터 보호하기 위해 가금류를 백신화하는 것 또한 광범위하게 연구되어 오고 있다. 그러나, 새로운 아주반트에 대한 요구와 함께, 단기간에 걸쳐 (3-4주) 빠르고 강한 면역 반응을 유도할 수 있는 교차 반응성 백신 표적을 확인하는 것이 극복해야 할 도전 과제들 중 일부가 된다 (de Zoete et al., 2007; Layton et al., 2011; Zeng et al., 2010; Clark et al., 2012). 결과적으로, 씨. 제주니에 대한 시판용 백신으로서 현재 이용가능한 것은 없다.
문헌 (Nurmi and Rantala (1973))에 의해 최초로 기술된 경쟁적 배제 (CE) 접근법은 캄필로박터가 그의 특정 니치, 특히 맹장에 거주하지 못하도록 막기 위해 건강한 닭의 장으로부터 정의, 또는 미정의 미생물을 사용하여 보호 장내 세균총을 확립하는 것에 기반을 둔다 (Zhang et al., 2007; Chen, 2001; Stern, 2001). CE 접근법을 적용시키는 데 있어 어려움은 CE 생성물에서 복합 종을 확인하는 데 표준화가 부족하다는 점 뿐만 아니라, 캄필로박터 감염을 감소시키는 데 있어 성공률은 한정되어 있고 가변적이라는 점이다 (Lin, 2009; EFSA Journal 2011).
마지막으로, 캄필로박터 종에 대한 닭의 감수성 또는 저항성은 숙주의 유전계에 의존하고, 비면역 및 면역 기전, 둘 다를 포함한다고 제안되었다 (Kaiser et al., 2009). 그러므로, 선발 육종이 유전적으로 물려받은 저항성 닭 계통을 확장시키는 데 있어 최선의 방법이 될 것이다. 이와 관련하여, 4개의 근친교배된 닭 계통에서 캄필로박터 종 콜로니 형성이 10-100배 차이나는 것이 관찰되었고, 유전적 저항성 패턴은 단일 상염색체 우성 유전자좌와 일치하였다 (Boyd et al., 2005). 그러나, 식육 또는 달걀 생산 및 품질을 보존함과 동시에 저항성 닭 계통을 확립한다는 것은 결과는 예측불가능하면서도, 많은 시간이 소요되는 과정이다. 현재까지, 상기 언급된 실험상의 개입 중 어느 것도고 필드 수준에서 모델링되거나, 적용된 바 없으며, 따라서, 어느 것도 성공적으로 상업화되지 못하였다.
항체는 원래 1890년대 초반에 베링(Behring)과 키타사토(Kitasato) (Behring & Kitasato, 1890; Casadevall et al., 2004)에 의해 효과적인 항미생물 시약으로서 인정받았던 것이며, 그 이후로 혈청 요법이 많은 감염성 질환을 퇴치하기 위한 효과적인 전략법이 되었다. 혈청 또는 장내 분비물 중 특이적 항체의 존재가 씨. 제주니에 의한 콜로니 형성에 대한 토끼 (Burr et al., 1988; Pavlovskis et al., 1991; Rollwagen et al., 1993) 및 마우스 (Dolby & Newell 1986; Rollwagen et al., 1993)의 저항성과 관련되었다. 영계 (2-3주령 미만)에서, 캄필로박터 종에 대한 모체의 항체 존재는 콜로니 형성 발생을 지연시키고, 무리에서의 씨. 제주니의 수평적 확산 속도를 감소시키는데 (Sahin et al., 2003), 이는 항캄필로박터 종 항체를 이용하는 수동적 면역요법이 닭에서의 박테리아 콜로니 형성을 방해하는 데 있어 관심의 대상이 되는 접근법이 될 수 있다는 것을 제안한다. 실제로, 항편모 모노클로날 항체를 이용하는 수동적 면역화는 이미 마우스에서 씨. 제주니 콜로니 형성을 감소시킨 것으로 나타났다 (Ueki et al.. 1987). 유사하게, 과면역 항-씨. 제주니 토끼 혈청 또는 항-씨. 제주니 항체를 사용하는 것은 닭에서 씨. 제주니 콜로니 형성을 감소시키는 데 효과적인 것으로 보인다 (Stern et al., 1990). 이와 일관되게, 다른 경우에서는 그의 혈액 중에서 순환하는 고역가의 캄필로박터 종-특이적 IgG를 가지는 가금류 도축장 종사자는 캄필로박테리아증에 거의 걸리지 않는 것으로 나타났다 (Cawthraw et al., 2000). 이러한 모든 관찰 결과에도 불구하고, 캄필로박터 적재량을 감소시키기 위한 작용제로서의 항체는 대개 높은 제조 비용, 종래 항체의 GI관 프로테아제에 대한 감수성, 효과적인 GI관 전달 시스템의 부족, 및 상이한 캄필로박터 균주를 표적화하기 위해 다중의 항체 제제를 필요하게 만드는, 캄필로박터 종들 사이의 높은 항원 변이로 인해 시장의 주목을 받지 못하고 있다.
미국 특허 번호 8,173,130 (살즈만(Salzman) 등), 미국 특허 공개 번호 2009/0208506 (라차민(Rachamim) 등), 및 미국 특허 공개 번호 2010/0239583 (머티(Murthy) 등)에는 박테리아 감염을 방지할 뿐만 아니라, 염증성 장 질환을 비롯한, 질환을 치료하거나, 예방하는 데 사용될 수 있는, 캄필로박터를 비롯한 각종 그람 음성 박테리아로부터의 플라젤린에 대한 모노클로날 항체가 기술되어 있다. 이들 항체는 조작의 어렴움, 생산의 어려움 및 생산 비용, 및 생체내 사용시 느린 조직 침투를 비롯한, 상기 항체의 공통된 단점을 공유한다. 추가로, mAb 및 그의 단편 (예를 들어, scFv 및 Fab)은 GI관 프로테아제에 대해 감수성이 높으며, 이는 경구 투여가 바람직할 경우에는 불리하다.
토끼 및 마우스의 혈청 또는 장내 분비물 중 특이적 항체의 존재가 씨. 제주니에 의한 위장관내 콜로니 형성에 대한 저항성과 관련이 있다. 닭에서의 연구는 또한 능동적 면역화가 씨. 제주니에 의한 장 감염 수준은 감소시키지만, 닭의 조기 도축 이전에 충분한 면역 반응 뿐만 아니라, 비용 및 실현가능성을 수득하기 위한 시간 창을 단축시켜, 상기 접근법을 실현불가능하게 만들 수 있다고 제안하였다.
공급처, 특히 양계장 내에서의 캄필로박터 방제가 병원체에 대한 인간의 노출 위험을 감소시킬 것이며, 식품 안전 및 공중 위생에 상당한 영향을 줄 것이다. 이롭게도, 보다 안전한 식품 공급을 통해 공급자들은 고가의 운영상의 정지 및 제품 리콜을 피할 수 있다. 환경에의 노출 감소, 차단방역 개선, 경쟁적 배제, 백신화, 숙주 유전자 선발, 및 박테리오파지 요법 및 박테리오신 처리를 포함하는 항미생물 또는 항생제 전략법이 유익하지만, 식품 공급에서 씨. 제주니를 감소시킬 수 있는 개선된 전략법은 여전히 요구되고 있다. 캄필로박터 제주니에 의해 제시되는 도전 과제에 대한 혁신적인 접근법이 공중에 도움이 될 것이다.
그러므로, 식품 공급에서 씨. 제주니를 감소시킬 수 있는, 비용면에서 효과적인 방법이 관련 기술분야에서 여전히 요구되고 있으며; 친화도가 높지만, IgG 및 그의 변이체의 단점을 극복할 수 있는 항체 역시 관련 기술분야에서 여전히 요구되고 있다.
본 개시내용은 일반적으로 항체, 그의 단편, 및 상기 단백질의 유도체 및 적용에 관한 것이다. 기술된 항체 및 단편은 씨. 제주니의 편모 단백질에 대한 것이다.
단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편이, 다량체 형태, 예컨대, 펜타바디를 비롯한 그의 변형과 함께 본원에 기술된다. 씨. 제주니 편모에 대한 항체 또는 그의 단편의 친화도 특이성이 예시된다. 항체는 예를 들어, 경구로 투여되었을 때, 닭에서 씨. 제주니 콜로니 형성 수준을 감소시키는 효능을 보인다. 개시된 항체는 박테리아 편모 형성에 대하여 특이적인 결합을 보인다. 본원에 기술된 항체 및 다량체는 씨. 제주니 운동성을 감소시킨다. 유익한 생물리학적 특성을 가진 추가의 변이체도 기술한다. 특이적인 패닝 노력 및 디술피드 결합 조작 전략법을 거쳐, 우수한 열 안정성 및 프로테아제 내성 또는 저항성을 보이는 항체를 기술한다. 우수한 열 안정성 및 주요 위장 (GI) 프로테아제에 대한 저항성을 가지는, 고도로 안정화된 항체 또는 그의 단편 또한 기술한다.
따라서, 본 개시내용은
서열 GLTFRNFHMA (서열 1) 또는 VSTFSINALG (서열 4)를 포함하는 상보성 결정 영역 (CDR) 1;
서열 ISWSRDRQ (서열 2) 또는 IGSDGTV (서열 5)를 포함하는 CDR2; 및
서열 AARTASASGDWYKGSYQY (서열 3) 또는 NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS (서열 6)를 포함하는 CDR3을 포함하는, 씨. 제주니 편모에 특이적으로 결합하는 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 제공한다.
상기 기술된 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 서열 GLTFRNFHMA (서열 1)의 CDR1, 서열 ISWSRDRQ (서열 2)의 CDR2, 및 서열 AARTASASGDWYKGSYQY (서열 3)의 CDR3을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 서열:
Figure pct00001
(여기서, X1=K 또는 Q; X2=E 또는 V; X3=A 또는 C; X4=I 또는 C); 또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다. 구체적인, 비-제한적 예에서, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 서열:
Figure pct00002
; 또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 서열 VSTFSINALG (서열 4)의 CDR1, 서열 IGSDGTV (서열 5)의 CDR2, 및 서열 NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS (서열 6)의 CDR3을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 서열:
Figure pct00003
(여기서, X1=K 또는 Q; X2=E 또는 V; X3=A 또는 C; X4=I 또는 C); 또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다. 구체적인, 비-제한적 예에서, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 서열:
Figure pct00004
;
또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 플라젤린에 특이적으로 결합할 수 있으며; 더욱 구체적으로, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 플라젤린의 Fla A 성분에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 기술된 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 단일 도메인 항체 (sdAb)일 수 있다. sdAb는 낙타류 기원의 것일 수 있다.
단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 다가 디스플레이로 제공될 수 있다. 예를 들어, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 베로독소 B 서브유닛과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 융합 단백질은 펜타바디로 조립될 수 있다. 구체적인, 비-제한적 예에서, 다량체는
Figure pct00005
Figure pct00006
;
또는 그와 실질적으로 동일한 서열로부터 선택되는 1개 또는 1개 초과의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 바로 앞에 기술된 핵산 분자를 포함하는 벡터 또한 제공한다.
본 개시내용의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 검출가능한 표지에 연결된 것일 수 있다.
본 개시내용은 추가로 동물 또는 동물 환경에서 씨. 제주니의 존재를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 동물에게 본 개시내용의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 경구로 투여될 수 있다. 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 효모 발현 시스템에 포함되어 있을 수 있다. 기술된 방법에서, 씨. 제주니에 대해 효과적인 항생제, 박테리오신, 또는 다른 식물 또는 동물 유래 화합물이 동물에게 추가로 투여될 수 있고; 대안적으로, 임의로 프로바이오틱 시스템에서 공동으로 발현되거나, 또는 공동으로 함유되어 있는 경쟁 미생물이 동물에게 추가로 투여될 수 있다.
본 개시내용은 또한 씨. 제주니의 동물 환경 내로의 도입을 감소시키는 방법을 제공한다. 신입 동물을 동물 환경 내로 도입시키기 이전에, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 신입 동물에게 투여한다.
본 개시내용은 추가로 본원에 기술된 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편 및 부형제를 포함하는 씨. 제주니 백신 또는 제제를 제공한다. 백신은 경구 전달을 위한 것일 수 있다.
씨. 제주니로 감염된 대상체를 치료하는 방법 또한 제공하며; 대상체를 본원에 기술된 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 투여함으로써 치료한다. 임의로, 본 방법은 또한 씨. 제주니에 대해 효과적인 항생제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 바로 앞에 기술된 방법에서, 대상체는 닭, 소 또는 양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가축 동물일 수 있고; 대안적으로, 대상체는 인간일 수 있다.
본 개시내용은 추가로 씨. 제주니 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 씨. 제주니 감염을 치료하기 위한, 또는 그의 치료용 의약을 제조하기 위한 본원에 기술된 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편의 용도를 제공한다.
샘플 중 씨. 제주니를 검출하는 방법 또한 제공한다. 샘플을 본원에 기술된 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편과 접촉시킨 후, 결합된 항체의 존재를 검출한다. 샘플은 체액 또는 배설물을 포함할 수 있고; 대안적으로, 샘플은 식품 제품 또는 식품 제품으로부터의 표면 스웝을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 샘플 중 씨. 제주니를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 본 개시내용의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편 및 씨. 제주니 검출에 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편 및 적합한 담체를 포함하는 샘플 중의 씨. 제주니 검출을 위한 검출 시약 또한 제공한다.
첨부된 도면과 함께 구체적인 실시양태에 관한 하기의 설명을 리뷰함으로써 본 개시내용의 다른 측면 및 특징도 통상의 기술자에게 자명해질 것이다.
이제, 본 개시내용의 실시양태는 단지 예로서, 첨부된 도면을 참조로 하여 기술될 것이다.
도 1은 본원에서 제조된 VHH 단량체 및 오량체의 서열을 보여주는 것이다.
도 2는 씨. 제주니 표면 항원에의 단량체 및 오량체 VHH 결합에 관한 ELISA 분석 뿐만 아니라, 쿠마시 염색된 정제된 단량체 및 오량체 항체의 영상을 보여주는 것이다. ELISA에서 (10 내지 0.0001 ㎍/ml 범위의) 다양한 농도의 단량체 (FlagV1M) 및 오량체 (FlagV1P) 형태의 편모 특이적 항체 (VHH)를 사용하였다. 단량체 및 오량체 포맷의 실제 VHH 분자 개수에 대해 흡광도 데이터를 정규화하였다. 솔리드 사각형은 펜타바디 VHH를 나타내고, 개방 사각형은 단량체 VHH를 보여주는 것이다. 상기 ELISA 분석에 대한 쿠마시 염색된 정제된 단량체 및 오량체 VHH의 대표적인 영상이 제시되어 있다.
도 3a, 3b 및 3c는 씨. 제주니 편모에의 단량체 VHH FlagV1M 및 FlagV6M의 결합에 관한 SPR 분석을 보여주는 것이다. 센서그램은 SA 센서칩 상에 포착되어 있는 700 RU의 비오티닐화된 플라젤린에의 28, 42, 56, 70, 140 및 190 nM FlagV1M (도 3a) 또는 FlagV6M (도 3b)의 결합을 보여주는 것이다. 개방 원형은 데이터 점이고, 곡선은 1:1 상호작용 모델에 대한 데이터 피팅이다. 도 3c는 기능적 친화도 (결합성) 증가를 보여주는 오량체 FlaV1P에 대한 SPR 센서그램이고; 이는 도 2에서 제시된 ELISA 결과를 확인시켜 준다.
도 4는 웨스터 블롯으로 FlagV1P 펜타바디에 의해 플라젤린의 FlaA 성분을 검출한 것을 도시한 것이다. 씨. 제주니의 Fla A 돌연변이체 (레인 1), Fla B 돌연변이체 (레인 2) 및 야생형 81-176 (레인 3) 균주로부터 제조된 편모를 니트로셀룰로스 막 상에 블롯팅하고, FlagV1P와 반응시켰다. 플라젤린 성분을 항-His AP 접합체 (레인 1-3)에 의해 검출하였다.
도 5는 FlagV1M 및 FlagV6M에 대한 SPR 공동 주사 실험의 결과를 보여주는 센서그램이다. 각 VHH를 고정화된 편모 상에 주사하였다. 2차 주사로 신호가 대략 2배로 배가되었는바, FlagV1M 및 FlagV6M은 별개의 비-중첩 에피토프에 결합하는 것으로 보였다.
도 6은 씨. 제주니 (균주 81-176) (패널 a, b), 또는 대조군으로서의 씨. 디피실레(C. difficile) 박테리아 (패널 c, d) 및 씨. 제주니 (균주 1293) (패널 e, f)와 혼성화된, 형광 표지된 FlagV1P를 보여주는 사진을 제시하는 것이다. 씨. 제주니 균주 (a, b)는 FITC로 표지된 오량체에 의해 특이적으로 검출되었고, 영상에서 흰색으로 나타난 반면 (a, b), 대조군 균주는 같은 항체에 의해서는 염색되지 않았다 (검은색 또는 회색 배경으로 나타남; c, d, e 및 f).
도 7은 다양한 씨. 제주니 균주 81-176, 81-176 flaA - flaB -, 또는 씨. 제주니 균주 11168 편모에 결합하는 FlagV1P (A행) 및 FlagV6P (B행)를 보여주는 형광 현미경법 영상의 모음이다. C행은 3개의 균주 각각에 결합하는 토끼 폴리클로날 항-81-176 편모 항체를 보여주는 형광 현미경 영상이다. 5 ㎛ 막대로 표시된 바와 같이, 같은 확대 배율로 모든 영상에 대해 대표적인 시야를 제시하였다. FITC로 표지된 펜타바디의 결합은 A행 (좌측 패널); B행 (좌측 및 우측 패널); 및 C행 (좌측 및 우측 패널)의 영상에서 흰색으로 보였다. FlagV1P는 씨. 제주니 균주 1168을 표지하지 않았고 (A행, 우측 패널); FlagV1P 및 FlagV6P 둘 다 81-176 flaA -flab- 돌연변이체를 표지하지 않았다 (A행, B행, 및 C행, 중간 패널).
도 8은 9개의 상이한 씨. 제주니 균주로부터의 편모 단리물에의 Flag1V1P 및 FlagV6P 결합의 ELISA 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 흡광도 값은 2회의 독립 실험의 평균을 나타내는 것이다.
도 9는 FlagV1P의 부재 또는 존재하에서의 씨. 제주니의 운동성 검정에 관한 결과를 도시한 것이다. 53 시간 동안 인큐베이션한 후, 사진 촬영하였다. 패널 A: 대조군으로서 완충제와 함께 인큐베이션된 씨. 제주니 박테리아; 패널 B: 비관련 펜타바디와 함께 인큐베이션된 박테리아; 패널 C: FlagV1M과 함께 인큐베이션된 박테리아; 및 패널 D: FlagV1P와 함께 인큐베이션된 박테리아.
도 10은 박테리아를 펜타바디 및 항생제의 조합으로 처리하였을 때의 씨. 제주니의 운동성 검정에 관한 결과를 도시한 것이다. 상단 행은 대조군인 완충제로 처리하였을 때의 박테리아 성장을 도시한 것인 반면, 하단 행은 (1 ㎍/ml 농도의) FlagV1P로 처리된 박테리아를 나타낸 것이다. 테트라시크린을 농도를 증가시켜 가면서 사용하였다: 0 ㎍/ml (칼럼 A), 4 ㎍/ml (칼럼 B), 16 ㎍/ml (칼럼 C), 및 64 ㎍/ml (칼럼 D). 24 시간 동안 인큐베이션한 후, 사진 촬영하였다.
도 11a 및 11b는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)이 아닌, 씨. 콜라이에의 FlagV6P의 교차 반응성을 도시하는, 운동성 검정 결과를 보여주는 것이다. 씨. 콜라이 균주 VC167 (도 11a) 및 에스. 엔테리카 혈청형 티피무리움 (S. enterica serovar typhimurium) (도 11b)의 박테리아 성장을 상이한 시점에 측정하였다. 항체를 1 ㎍/㎕의 농도로 사용하였다.
도 12a 및 12b는 108개의 씨. 제주니 세포를 접종받은 닭의 캄필로박터 제주니 콜로니 형성 수준에 대해 FlagV1P 및 FlagV1F23P 경구 투여가 미치는 효과를 도시한 것이다. 씨. 제주니를 시험 감염한 후, 닭은 (FlagV1P2R5로 표지된) FlagV1P 또는 (F23P로 표지된) FlagV1F23P를 받았다. 비감염, 음성 대조군 또한 포함하였다. 도 12a는 개체 맹장내 박테리아 부하량의 산점도를 보여주는 것으로서, 여기서, 평균 맹장 박테리아 부하량은 수평선에 의해 표시되어 있다. 도 12b 는 PBS (개방 막대), FlagV1P (폐쇄 막대), 또는 FlagV1F23P (빗금 막대)로 처리된 닭의 맹장내 박테리아 부하량 (평균+SEM)을 보여주는 것이다. *** p < 0.001. 일원 ANOVA에 이은, 본페로니(Bonferroni) 다중 비교 검정.
도 13은 닭 체중에 대해 FlagV1P (1 mg)의 투여가 미치는 효과를 보여주는 것이다. 씨. 제주니 단독으로 시험 감염시킨 후, 또는 그에 이어서, 펜타바디 투여에 의해 시험 감염시킨 후, 1일째 및 4일째 닭의 체중을 측정하였다. PBS를 대조군으로서 사용하고, 체중 (g)을 1일째 및 4일째 측정하였다. 28개의 복제물로부터 수득한 값의 평균 체중±표준 편차가 각 군에 대해 제시되어 있다. 각 군들 사이에는 어떤 유의적인 차이도 관찰되지 않았다.
도 14는 닭 장관의 다른 부위에서의 FlagV1P 검출 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 닭에게 위관 영양법으로 FlagV1P를 공급하고, 맹장, 회장, 공장, 및 십이지장으로부터 장액을 수집하였다. 2배 일련의 희석액을 제조하고, ELISA를 수행하였다. 그래프로 나타낸 결과는 펜타바디가 대개 맹장 및 회장 액 추출물 중에서 검출되었다는 것을 나타낸다.
도 15a, 15b, 및 15c는 프로테아제 저항성 VHH FlagV1M 변이체의 단리 방법론을 도시한 것이다. 도 15a는 파지미드 벡터 pMED6의 다중클로닝 부위를 보여주는 것이다. '3 SfiI 부위 (볼드 및 이탤릭체)와 앰버 종결 코돈 (밑줄친 것) 사이의 서열로부터 His6/HA 태그를 코딩하는 DNA를 제거하였다. 도 15b는 FlagV1M VHH 오류 유발 PCR 라이브러리의 구축, 파지의 프로테아제 처리 및 패닝 방식을 강조한 작업 흐름 다이어그램을 보여주는 것이다. 도 15c는 V1 오류 유발 PCR 라이브러리로부터의 프로테아제 처리된 파지의 패닝으로부터 단리된 9개의 VHH에 대한 파지 ELISA 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 별표 표시는 FlagV1M과 유사한 신호를 보인 클론을 나타내는 것이다.
도 16a, 16b 및 16c는 FlagV1로부터 유래된 항체의 생물리학적 특징 규명을 제공하는 것이다. V1=FlagV1M; F23=FlagV1F23M; V1-DSB=FlagV1MDSB; F23-DSB=FlagV1F23MDSB. 도 16a는 다양한 VHH의 분리를 보여주는 비-환원성 SDS-PAGE 겔이며; 가용성 박테리아 발현으로 최대 23 mg/L VHH를 수득하였다. 모두 그의 예상 분자량으로 전개되었다. 도 16b는 다양한 VHH의 단일 사이클 동역학적 SPR 센서그램을 보여주는 것이다. VHH는 고정화된 씨. 제주니 편모에 대하여 고도한 친화도 결합을 유지하고, 1:1 결합 모델로 피팅된다. 각 VHH에 대한 KD가 센서그램 상에 제시되어 있다. 도 16c는 모든 샘플이 100% 단량체 피크에 도달하였는 바, 모두가 비-응집 단량체임을 입증하는, 다양한 VHH의 슈퍼덱스(Superdex) 75™ 크기 배제 크로마토그래피를 보여주는 것이다.
도 17은 중성 pH (7.3) 및 산성 pH (2.0)에서의 FlagV1M 및 FlagV1F23M VHH 및 그의 디술피드 결합 변이체의 열적 언폴딩 곡선을 보여주는 것이다. 언폴딩 온도 중간점 (융점, Tm)을 계산하였다. pH 2.0하에 25℃의 출발 온도에서, V1은 완전하게 변성되었고, FlagV1F23M은 부분적으로 변성되었다. pH 2.0에서 FlagV1MDSB는 부분적으로 변성된 반면, FlagV1F23MDSB는 완전하게 폴딩되었으며, 이는 FlagV1F23M 및 추가의 디술피드 결합이 VHH 열적 안정성에 미치는 추가의 효과를 입증한다. 개방 원형은 복제물 1을 나타내고; 솔리드 원형은 복제물 2를 나타낸다. V1=FlagV1M; F23=FlagV1F23M; V1-DSB=FlagV1MDSB; F23-DSB=FlagV1F23MDSB.
도 18은 주요 위장관 프로테아제에 대한 FlagV1M 및 FlagV1F23M VHH 및 그의 디술피드 결합 변이체의 프로테아제 감수성을 보여주는 것이다. VHH를 펩신, 트립신, 및 키모트립신으로 분해하였고; 대조군 실험에서는 VHH를 효소 부재하에서 인큐베이션시켰다. 분해된 VHH 및 대조군을 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 막대 그래프는 SDS-PAGE 겔의 농도계 분석에 의해 작성된 프로테아제 저항성 프로파일을 요약한 것이다. 각 VHH 및 각 프로테아제에 대해 총 3회에 걸쳐 독립 분해를 수행하였다. 오차 막대는 평균 프로테아제 저항성±SEM을 나타낸다. V1=FlagV1M; F23=FlagV1F23M; V1-DSB=FlagV1MDSB; F23-DSB=FlagV1F23MDSB.
도 19a, 19b, 및 19c는 다중 프로테아제에 노출된 VHH에 의한 씨. 제주니 운동성 감소를 보여주는 것이다. 도 19a는 펩신에 이어, 트립신 및 키모트립신으로 VHH를 순차적으로 분해하는 것을 도시한 개략적 다이어그램이다. 도 19b는 순차적 분해물의 환원성 SDS-PAGE 겔 분석이다. 도 19c는 운동성 검정에 대한 막 그래프 요약이다. 막대는 3회의 독립 실험으로부터의, 완충제 대조군, VHH, 또는 프로테아제로 분해된 VHH로 처리된 플레이트 상의 씨. 제주니의 평균 직경을 나타낸 것이며; 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 5 mm에서의 점선은 플레이트 상의 씨. 제주니의 출발 직경을 나타낸다. 모두 VHH를 포함하지 않는 대조군에 대한 상대적인 값으로서, 일원 ANOVA에 이어, 던넷(Dunnett) 다중 비교 검정에 의해 통계학적 분석을 수행하였다 (** p < 0.01). FlagV1M 및 FlagV1F23M VHH.
도 20은 대표적인 씨. 제주니 운동성 검정 결과를 도시한 것이다. 씨. 제주니 운동성은 기능적 VHH의 존재하에서 감소된다. 씨. 제주니 균주 81-176을 대조군 완충제 또는 VHH를 포함하는 플레이트에 적용시켰다. 플레이트 접종 후 24 시간째에 박테리아 성장 직경을 측정하였으며, (i) 프로테아제를 함유하는, 대조군 완충제 (VHH 비포함)와의 24 시간 인큐베이션 후의 대조군 씨. 제주니, (ii) 영상에 대한 설명, (iii) FlagV1M 대조군, 15 및 30 min 분해물, (iv) FlagV1MDSB 대조군, 15 및 30 min 분해물, (V) FlagV1F23M 대조군, 15 및 30 min 분해물, 및 (vi) FlagV1F23MDSB 대조군, 15 및 30 min 분해물.
일반적으로, 본 개시내용은 씨. 제주니에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 단편에 관한 것이다. 본원에 기술된 항체 및 그의 단편은 식품 체인에서 씨. 제주니의 만연을 방제하거나, 감소시키는 데 유용한다. 동물에게 씨. 제주니 특이적 단일 도메인 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 씨. 제주니 수준을 감소시키는 방법을 기술한다.
씨. 제주니 편모에 특이적으로 결합하는 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은
서열 GLTFRNFHMA (서열 1) 또는 VSTFSINALG (서열 4)를 포함하는 상보성 결정 영역 (CDR) 1;
서열 ISWSRDRQ (서열 2) 또는 IGSDGTV (서열 5)를 포함하는 CDR2; 및
서열 AARTASASGDWYKGSYQY (서열 3) 또는 NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS (서열 6)를 포함하는 CDR3을 포함한다.
정제된 항체 또는 그의 단편은 씨. 제주니 편모에 특이적인 결합을 보인다. 항-씨. 제주니 기능성은 씨. 제주니의 편모 단백질에의 결합, 씨. 제주니의 운동성 감소, 또는 씨. 제주니의 콜로니 형성 또는 씨. 제주니 감염 발병 감소와 관련하여 측정될 수 있다. 결합 및/또는 운동성 평가는 본원에 기술된 기법을 사용하며, 충분히 통상의 기술자의 능력 범위 내에 포함되어 있다. 한 비-제한적 예에서, 정제된 항체 또는 그의 단편은 플라젤린에 특이적으로 결합한다. 추가의 비-제한적 예에서, 정제된 항체 또는 그의 단편은 플라젤린의 Fla A 성분에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용되는 바, 관련 기술분야에서는 또한 "이뮤노글로불린" (Ig)으로도 지칭되는 "항체"라는 용어는 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드로 구성된 단백질을 의미하며, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM을 비롯한, 다양한 Ig 이소형이 존재한다. 항체가 바르게 폴딩되었을 때, 각 쇄는 더 많은 선형 폴리펩티드 서열에 의해 연결된 다수의 상이한 구형 도메인으로 폴딩된다. 예를 들어, 이뮤노글로불린 경쇄는 가변 (VL) 및 불변 (CL) 도메인으로 폴딩되는 반면, 중쇄는 가변 (VH) 및 3개의 불변 (CH, CH2, CH3) 도메인으로 폴딩된다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (VH 및 VL)의 상호작용으로 항원 결합 영역 (Fv)이 형성된다. 각 도메인은 통상의 기술자에게 알려져 있는 잘 확립된 구조를 가진다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역이 표적 항원에의 결합을 담당하며, 따라서, 상기 영역은 항체 간에 상당한 서열 다양성을 나타낼 수 있다. 불변 영역은 더 적은 서열 다양성을 보이며, 중요한 생화학적 이벤트를 유도하는 다수의 천연 단백질에의 결합을 담당한다. 항체의 가변 영역은 분자의 항원 결합 결정기를 함유하며, 따라서, 그의 표적 항원에 대한 항체의 특이성을 결정한다. 서열 가변성의 대다수는 각 가변 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)마다 3개씩인, 6개의 초가변 영역에서 발생하며; 초가변 영역의 조합으로 항원 결합 부위가 형성되고, 이는 항원 결정기에의 결합 및 인식에 기여한다. 그의 항원에 대한 항체의 특이성 및 친화성은 초가변 영역의 구조 뿐만 아니라, 그의 크기, 항원에게 제시되는 표면의 형상 및 화학 성질에 의해 결정된다. 초가변성 영역을 식별하는 데에는 다양한 시스템이 존재하며, 가장 일반적인 두 시스템은 카바트(Kabat)의 것 및 코티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)의 것이다. 코티아 등 (1991a; 1991b)은 VH 및 VL 도메인의 항원 결합 영역의 서열 가변성에 기초하여 "상보성 결정 영역" (CDR)을 정의하였다. 코티아 및 레스크 (1987)는 VH 및 VL 도메인 중 구조 루프 영역의 위치에 기초하여 "초가변 루프" (H 또는 L)를 정의하였다. 이러한 개별 시스템이 인접하거나, 중첩되는 CDR 및 초가변 루프 영역을 정의한 바, 항체 기술분야의 통상의 기술자는 대개 "CDR" 및 "초가변 루프"라는 용어를 상호교환적으로 사용하며, 상기 용어는 본원에서 그렇게 사용될 수 있다. 이러한 이유에서, 항원 결합 부위를 형성하는 영역은 현재 본원에서는 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체의 경우에는 CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2, CDR H3으로; 또는 중쇄 또는 경쇄 중 하나의 항원 결합 영역인 경우에는 CDR1, CDR2, CDR3으로 지칭된다. 본원에서 CDR/루프는 가변 도메인 비교를 용이하게 하기 위해 개발된 것인 IMGT 넘버링 시스템에 따라 지칭된다 (Lefranc, M.-P. et al., 2003). 본 시스템에서, 보존되는 아미노산 (예컨대, Cys23, Trp41, Cys104, Phe/Trp118, 및 89번 위치의 소수성 잔기)은 항상 같은 위치를 가진다. 추가로, 프레임워크 영역의 표준화된 경계 (FR1: 1번 내지 26번 위치; FR2: 39번 내지 55번 위치; FR3: 66번 내지 104번 위치; 및 FR4: 118번 내지 129번 위치), 및 CDR의 표준화된 경계 (CDR1: 27번 내지 38번 위치, CDR2: 56번 내지 65번 위치; 및 CDR3: 105번 내지 117번 위치)를 제공한다.
CDR 바깥쪽 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭된다. FR은 가변 도메인에 구조적 완전성을 제공하고, 이뮤노글로불린 폴드가 유지될 수 있게 한다. 항체의 이러한 특징적인 구조가 안정한 스캐폴드를 제공하며, 그의 상당한 항원 결합 다양성은 면역계에 의해 연구될 수 있으며, 이로써 광범위한 항원 어레이에 대한 특이성을 수득할 수 있다 (Padlan et al., 1994).
본원에서 지칭되는 "항체 단편"은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 항원 결합 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편은 자연적으로 발생된 항체의 조작에 의해 수득될 수 있거나, 또는 재조합 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편으로는 Fv, 단일 쇄 Fv (scFv; 펩티드 링커로 연결된 VL 및 VH로 구성된 분자), Fab, Fab', F(ab')2, 단일 도메인 항체 (sdAb), 및 이들의 다가 제시물을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
비-제한적 예에서, 항체 단편은 자연적으로 발생된 공급원으로부터 유래된 단일 도메인 항체 (sdAb)일 수 있다. 낙타류 기원의 중쇄 항체 (Hamers-Casterman et al., 1993)에는 경쇄가 존재하지 않으며, 따라서, 그의 항원 결합 부위는 VHH로 명명되는 하나의 도메인으로 구성된다. sdAb는 또한 상어에서도 관찰되었으며, 이는 VNAR로 명명되고 (Greenberg et al., 1995; Nuttall et al., 2003); 다른 sdAb는 인간의 중쇄 또는 경쇄 서열에 기초하여 조작될 수 있다 (Jespers et al., 2004; To et al., 2005). 본원에서 사용되는 바, "sdAb"는 파지 디스플레이 또는 다른 디스플레이 기술을 통해 임의 기원의 VL, VH, VHH 또는 VNAR 저장소로부터 직접 단리된 것 및 인간화, 친화도 성숙, 안정화, 가용화 (예컨대, 낙타화), 또는 다른 항체 조작 방법에 의해 상기 sdAb를 추가로 변형시킴으로써 생성된 것을 포함한다. sdAb의 항원 결합 기능 및 특이성을 유지하는 상동체, 유도체, 또는 단편 또한 본원에 기술된 실시양태에 포함시킨다.
SdAb는 그의 열적 안정성이 높고, 계면활성제 저항성이 높으며, 프로테아제에 대한 저항성도 상대적으로 높으며 (Dumoulin et al., 2002), 생산 수율이 높기 때문에 (Arbabi-Ghahroudi et al., 1997), 신규한 항체 분자에 대해 탁월한 빌딩 블록이고; 이는 또한 면역 라이브러리로부터의 단리에 의해 (Li et al., 2009) 또는 시험관내 친화도 성숙 (Davies & Riechmann, 1996)에 의해 고도로 높은 친화도를 가지도록 조작될 수 있다.
예컨대, 독소 중화 및/또는 표적 불활성화와 같은 적용을 위해서는 원핵생물 시스템에서의 생산 비용이 더 저렴하고, 유전자 조작이 용이하기 때문에, 항체 단편 (특히 sdAb)이 전체 항체 (예컨대, IgG)보다 바람직할 수 있다. 추가로, VHH가 재조합 발현 시스템을 사용하여 단량체로서 클로닝되고 발현되었을 때, 극도로 안정한 것으로 나타났다 (Arbabi-Ghahroudi et al., 1997; Muyldermans 2001).
통상의 기술자는 단일 도메인 항체 구조에 대해 잘 알고 있을 것이다. sdAb는 이뮤노글로불린 폴드를 유지하는 단일 이뮤노글로불린 도메인을 포함하며; 무엇보다도 특히, 단 3개의 CDR만으로도 항원 결합 부위를 형성한다. 그러나, 모든 CDR이 항원 결합에 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 및 제한하고자 하지 않으면서, CDR 중 1, 2, 3개가 본 개시내용의 sdAb에 의한 항원 결합 및 인식에 기여할 수 있다. sdAb의 CDR은 본원에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭되고, 이는 IMGT 넘버링 시스템를 기반으로 한다 (Lefranc, M.-P. et al., 2003).
앞서 언급된 바와 같이, 항체 또는 그의 단편은 sdAb일 수 있다. sdAb는 낙타류 기원의 것일 수 있으며, 따라서, 이는 낙타류 프레임워크 영역에 기반하는 것일 수 있고; 대안적으로, CDR은 다른 항체 도메인의 프레임워크 영역, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, VNAR, 인간 VH 또는 VL 프레임워크 영역 상에 이식될 수 있다. 추가의 또 다른 대안으로, 상기 기술된 CDR은 다른 유형의 항체 단편 (Fv, scFv, Fab)의 프레임워크 영역 상에 이식될 수 있다. 본 실시양태는 추가로 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, CDR 이식 및 버니어링을 사용하여 "인간화된" 항체 단편을 포함한다. 항체 또는 항체 단편의 인간화는, 항원 결합 능력 또는 특이성을 손실시키지 않으면서, 아미노산 서열을 인간 컨센서스 서열에서 발견되는 것과 같은, 그의 인간 대응부로 대체하는 것을 포함하고; 이러한 접근법은 인간 대상체 내로 도입되었을 때, 항체 또는 그의 단편의 면역원성을 감소시킨다. CDR 이식 과정에서, 본원에서 정의된 중쇄 CDR 중 1개 또는 1개 초과의 것이 인간 가변 영역 (VH, 또는 VL), 또는 다른 인간 항체 단편 프레임워크 영역 (Fv, scFv, Fab)에 융합되거나, 또는 이식될 수 있다. 상기 경우에서, 상기 1개 또는 1개 초과의 초가변 루프의 입체형태는 보존되고, 그의 표적 (즉, 편모)에 대한 sdAb의 친화도 및 특이성 또한 보존된다. CDR 이식은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 적어도 하기: 미국 특허 번호 6180370, 미국 특허 번호 5693761, 미국 특허 번호 6054297, 미국 특허 번호 5859205, 및 유럽 특허 번호 626390에 기술되어 있다. 관련 기술분야에서는 또한 "가변 영역 재포장"으로도 지칭되는 버니어링은 항체 또는 단편의 용매 노출 위치를 인간화하는 것을 포함하며; 따라서, 용매 노출 영역에 대한 면역 반응의 잠재성은 최소화되면서, CDR 입체형태에 중요할 수 있는, 포매된 비-인간화된 잔기는 보존된다. 버니어링은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 적어도 하기: 미국 특허 번호 5869619, 미국 특허 번호 5766886, 미국 특허 번호 5821123, 및 유럽 특허 번호 519596에 기술되어 있다. 통상의 기술자는 상기 인간화된 항체 단편을 제조하는 방법에 대해 충분히 잘 알고 있을 것이다.
본 개시내용의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 서열 GLTFRNFHMA (서열 1)의 CDR1, 서열 ISWSRDRQ (서열 2)의 CDR2, 또는 서열 AARTASASGDWYKGSYQY (서열 3)의 CDR3을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 단편은 sdAb일 수 있다. sdAb는 낙타류 기원의 것일 수 있으며, 따라서, 이는 낙타류 프레임워크 영역에 기반하는 것일 수 있다. 더욱 구체적 예에서, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 서열:
Figure pct00007
(여기서, X1=K 또는 Q; X2=E 또는 V; X3=A 또는 C; X4=I 또는 C); 또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다. 추가의 비-제한적 예에서, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 서열:
본원에서 FlagV1M으로도 지칭되는,
Figure pct00008
;
본원에서 FlagV1F23M으로도 지칭되는,
Figure pct00009
;
본원에서 FlagV1MDSB로도 지칭되는,
Figure pct00010
;
본원에서 FlagV1F23MDSB로도 지칭되는,
Figure pct00011
; 또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다.
본원에서는 서열 VSTFSINALG (서열 4)의 CDR1, 서열 IGSDGTV (서열 5)의 CDR2, 또는 서열 NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS (서열 6)의 CDR3을 포함하는, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 기술한다. 항체 또는 그의 단편은 sdAb일 수 있다. sdAb는 낙타류 기원의 것일 수 있으며, 따라서, 이는 낙타류 프레임워크 영역에 기반하는 것일 수 있다. 더욱 구체적 예에서, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 서열:
Figure pct00012
(여기서, X1=K 또는 Q; X2=E 또는 V; X3=A 또는 C; X4=I 또는 C); 또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다. 추가의 비-제한적 예에서, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 서열:
본원에서 FlagV6M으로도 지칭되는,
Figure pct00013
;
본원에서 FlagV6F23M으로도 지칭되는,
Figure pct00014
;
본원에서 FlagV6MDSB로도 지칭되는,
Figure pct00015
;
본원에서 FlagV6F23MDSB로도 지칭되는,
Figure pct00016
; 또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다.
실질적으로 동일한 서열은 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 참조 서열에 대한 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이를 통해, 참조 서열과 비교하였을 때, 생리학적, 화학적 또는 기능적 특성에 대한 실질적인 변화가 없는 돌연변이체 펩티드를 수득할 수 있다는 것은 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 이러한 경우, 참조 및 돌연변이체 서열은 "실질적으로 동일한" 폴리펩티드로 간주될 것이다. 보존적 아미노산 돌연변이는 아미노산의 부가, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있으며; 한 비-제한적 예에서, 보존적 아미노산 돌연변이는 보존적 아미노산 치환이다. 본원에서 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 화학적 특성 (예컨대, 크기, 전하 또는 극성)이 유사한 또 다른 아미노산 잔기를 대신해서 치환되는 것으로 정의된다.
보존적 아미노산 치환은 염기성, 중성, 소수성, 또는 산성 아미노산을 같은 군의 또 다른 것을 대신하여 치환할 수 있다. "염기성 아미노산"이라는 용어는 측쇄 pK 값이 7 초과이며, 전형적으로 생리학적 pH에서 양으로 하전된 것인, 소수성 아미노산을 의미한다. 염기성 아미노산으로는 히스티딘 (His 또는 H), 아르기닌 (Arg 또는 R), 및 리신 (Lys 또는 K)을 포함한다. "중성 아미노산" (또는 "극성 아미노산")이라는 용어는 생리학적 pH에서 비하전된 측쇄를 가지지만, 두 원자가 공통적으로 공유하고 있는 전자 쌍이 원자 중 하나에 의해 더욱 가깝게 유지되는 1개 이상의 결합을 가지는 친수성 아미노산을 포함한다. 극성 아미노산으로는 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 시스테인 (Cys 또는 C), 티로신 (Tyr 또는 Y), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 및 글루타민 (Gln 또는 Q)을 포함한다. "소수성 아미노산" (또한 "비-극성 아미노산")이라는 용어는 문헌 (Eisenberg (1984))의 정규화된 컨센서스 소수성 척도에 따라 0보다 큰 소수성을 보이는 아미노산을 포함하는 것을 의미한다. 소수성 아미노산으로는 프롤린 (Pro 또는 P), 이소류신 (Ile 또는 I), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 발린 (Val 또는 V), 류신 (Leu 또는 L), 트립토판 (Trp 또는 W), 메티오닌 (Met 또는 M), 알라닌 (Ala 또는 A), 및 글리신 (Gly 또는 G)을 포함한다. "산성 아미노산"은 측쇄 pK 값이 7 미만이며, 전형적으로 생리학적 pH에서 음으로 하전된 것인, 친수성 아미노산을 의미한다. 산성 아미노산으로는 글루타메이트 (Glu 또는 E), 및 아스파르테이트 (Asp 또는 D)를 포함한다.
서열 동일성은 두 서열의 유사성을 평가하는 데 사용되며; 이는 두 서열을 잔기 위치 사이가 최대로 일치하도록 정렬하였을 때, 같은 잔기의 비율(%)을 계산함으로써 측정된다. 임의의 공지된 방법을 사용하여 서열 동일성을 계산할 수 있으며; 예를 들어, 서열 동일성을 계산하는 데에는 컴퓨터 소프트웨어가 이용가능하다. 제한하고자 하지 않으면서, 서열 동일성은 소프트웨어, 예컨대, 스위스 생물정보학 연구소(Swiss Institute of Bioinformatics)에 의해 유지되는 NCBI BLAST2 서비스 (및 ca.expasy.org/tools/blast/에서 살펴볼 수 있는 것과 같은 것), BLAST-P, Blast-N, 또는 FASTA-N, 또는 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 다른 적절한 소프트웨어에 의해 계산될 수 있다.
실질적으로 동일한 서열은 90% 이상 동일한 것일 수 있으며; 또 다른 예에서, 실질적으로 동일한 서열은 아미노산 수준에서 본원에 기술된 서열과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 이상 동일한 것일 수 있다. 예를 들어, 및 어느 방식으로든 제한하고자 하지 않으면서, FlagV1M, FlagV1F23M, FlagV1MDSB, 및 FlagV1F23MDSB의 정렬 결과, 서열 동일성은 96.8% 내지 98.4%이다. 중요하게, 실질적으로 동일한 서열은 참조 서열의 활성 및 특이성을 유지한다. 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이, 항체의 특정 아미노산 잔기, 특히 프레임워크 영역 내의 것은 항체의 항원 결합 및 다른 기능적 특성에는 영향을 미치지 않으면서 돌연변이화될 수 있다.
항체 또는 그의 단편은 또한 재조합 항체 또는 그의 단편의 발현, 검출, 또는 정제에 도움을 줄 수 있는 추가의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 및 제한하고자 하지 않으면서, 항체 또는 그의 단편은 표적화 또는 신호 서열 (예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, ompA), 검출 태그 (예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, c-Myc), 정제 태그 (예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 히스티딘 정제 태그, His5 또는 His6), 또는 그의 임의 조합을 포함할 수 있다.
항체 또는 그의 단편은 또한 다가 디스플레이로 존재할 수 있다. 다량체화는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 및 어느 방식으로든 제한하고자 하지 않으면서, 다량체화는 WO2003/046560에 기술된 바와 같이, 자가 조립 분자를 사용하여 달성될 수 있다 (Zhang et al., 2004; Merritt & Hol, 1995). 기술된 방법은 항체 또는 그의 단편 및 AB5 독소 패밀리의 B 서브유닛의 오량체화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현함으로써 펜타바디를 제조한다 (Nielson et al., 2000; WO2003/046560); 예를 들어, 및 제한하고자 하지 않으면서, 오량체화 도메인의 서열은
Figure pct00017
일 수 있다.
오량체화 도메인은 오량체로 조립되고, 그를 통해 항체 또는 그의 단편의 다가 디스플레이가 형성된다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 오량체 중의 각 서브유닛은 상기 기술된 융합 단백질을 포함한다. 또한 통상의 기술자에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 항체 또는 그의 단편의 오량체화가 어느 방식으로든 그의 항원 결합 또는 인식을 변경시키지는 않는다 (즉, 항체 또는 그의 단편은 동일한 항원에 같은 방식으로, 동일한 특이성 및 친화도로 결합함). 생성된 펜타바디는 조밀하고, 높은 결합성 (기능적 친화도)을 가지며, 안정한 항원 결합 분자이다 (Zhang et al., 2004). 이러한 5가 항체는 또한 항원에 결합하였을 때 응집을 증진시킬 수 있으며 (Zhang et al., 2004), 이로써 그의 효능은 증가될 수 있다.
본원에 기술된 다량체의 각 서브유닛은 동일하거나, 또는 상이할 수 있다. 추가로, 다량체화 도메인은 링커를 사용하여 항체 또는 항체 단편에 연결될 수 있고; 상기 링커는 두 분자가 가요성 방식으로 부착될 수 있도록 충분한 길이 및 적절한 조성의 것이어야 하지만, 항체의 항원 결합 특성을 방해하지는 않아야 한다. 한 비-제한적 예에서, 링커는 링커 GPGGGSGGGGS (서열 18)일 수 있다.
한 구체적인 비-제한적 예에서, 다량체는 서열:
본원에서 FlagV1P로도 지칭되는,
Figure pct00018
;
본원에서 FlagV1F23P로도 지칭되는,
Figure pct00019
;
본원에서 FlagV1PDSB로도 지칭되는,
Figure pct00020
;
본원에서 FlagV1F23PDSB로도 지칭되는,
Figure pct00021
;
본원에서 FlagV6P로도 지칭되는,
Figure pct00022
;
본원에서 FlagV6F23P로도 지칭되는,
Figure pct00023
;
본원에서 FlagV6PDSB로도 지칭되는,
Figure pct00024
;
본원에서 FlagV6F23PDSB로도 지칭되는,
Figure pct00025
;
또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다.
다른 형태의 다가 디스플레이 또한 포함된다. 예를 들어, 및 제한하고자 하지 않으면서, 항체 또는 그의 단편은 이량체, 삼량체, 또는 임의의 다른 적합한 올리고머로 제시될 수 있다. 이는 관련 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어, 직접적인 연결 결합 (Nielsen et al., 2000), c-jun/Fos 상호작용 (de Kruif et al., 1996), "노브 인투 홀즈(Knob into holes)" 상호작용 (Ridgway et al., 1996)에 의해 달성될 수 있다. 다량체는 또한 문헌 (Zhu et al. (2010))에 기술된 다량체화 도메인을 사용하여 형성될 수 있으며; 본원에서 "콤바디" 형태로 지칭되는 이러한 형태는 코일드 코일 펩티드와 함께 다량체 분자를 생성하는, 본원에 기술된 항체 또는 그의 단편의 융합체이다 (Zhu et al., 2010).
관련 기술분야에 공지된 또 다른 다량체화 방법은 Fc 도메인을 사용하여 항체 또는 그의 단편을 이량체화하는 것이다. 상기 접근법에서, Fc 유전자는 발현 벡터 내로 삽입되며; 항체 또는 그의 단편의 C 말단이 추가 잔기의 부가 없이 Fc의 힌지 영역에 연결되도록 항체 또는 그의 단편의 뉴클레오티드 서열은 증폭되고, 벡터 내로 삽입될 수 있다. 생성된 벡터는 포유동물 세포주에 형질감염될 수 있고, 융합 단백질는 재조합적으로 발현될 수 있으며, 이후 (예를 들어, 단백질 A 칼럼 상에서) 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 상기 다량체화 방법의 한 비-제한적 예는 문헌 (Bell et al., (2010)) 및 (Iqbal et al., (in press))에 기술되어 있다. 상기 이량체화를 실행하는 기법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
상기 기술된 다량체에서, 다량체내 서브유닛은 본원에 기술된, 동일하거나, 또는 상이한 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열 또한 포함한다. 유전자 코드의 축중성을 고려해 볼 때, 통상의 기술자에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 다수의 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드를 코딩하는 효과를 가질 것이다. 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 바로 앞에서 기술된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터가 포함된다.
본원에 기술된 항체 또는 그의 단편 중 어느 하나를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포 또한 통상의 기술자에 의해 쉽게 이해될 것이다.
본원에 기술된 항체 또는 그의 단편 및/또는 바이러스 코트 단백질 (예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 섬유상 파지의 g3p) 중 하나에의 융합체로서의 디스플레이를 포함하고/거나, 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 파지 또한 포함한다.
본원에 기술된 항체 또는 그의 단편은 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 표지가 검출가능화될 수 있거나, 또는 그 자체가 검출가능한 것일 수 있고, 이로써, 씨. 제주니에의 결합 존재를 관찰할 수 있다. 검출가능한 표지는 방사성 동위원소, 상자성 표지 (예를 들어, 가돌리늄 또는 산화철), 형광단, 형광단, 형광성 작용제 (예를 들어, FITC 또는 증강 녹색 형광 단백질 (EGFP)), 근적외선 (NIR; 예를 들어, Cy5.5, 알렉사680(Alexa680), 다이라이트680(Dylight680), 또는 다이라이트800) 형광 색소 또는 염료, 에코발생 마이크로버블, 검출가능한 단백질계 분자 뉴클레오티드, 양자점, 나노입자, 나노와이어, 또는 나노튜브에 융합된 친화도 표지 (예를 들어, 비오틴, 아비딘 등), 또는 영상화 방법에 의해 검출될 수 있는 임의의 다른 적합한 작용제일 수 있다. 항체 또는 그의 단편은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법 (재조합 기술, 화학적 접합 등)을 사용하여 검출가능한 작용제에 연결될 수 있고; 임의로, 링커는 필요에 따라 사용될 수 있다. 검출 단계는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 광학 영상화, 면역조직화학법 또는 분자 진단 영상화, ELISA, 또는 다른 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적인, 비-제한적 예에서, 항체 또는 그의 단편은 형광성 작용제, 예컨대, FITC에 연결될 수 있거나, 또는 증강 녹색 형광 단백질 (EGFP)에 유전적으로 융합될 수 있다.
본원에서는 동물 또는 동물 환경에서 씨. 제주니의 존재를 감소시키는 방법을 기술한다. 개체 동물 내에서 존재를 감소시키는 것은 동물 표면 상의, 또는 동물 위장관 내의 오염을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 동물이 전신 감염되었다면, 본원에 기술된 방법은 씨. 제주니의 존재를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 동물 환경은 동물에 인접한 주변 환경, 예컨대, 케이지 또는 설비의 벽 또는 바닥, 동물 수용소 내의 사료 공급 및 급수 설비, 동물 수용소에서 발견되는 깔개, 또는 간단하게는 동물 감금소 내의 동물 외부에 존재하는 배설물에 관한 것일 수 있다. 동물에게 본원에 기술된 항체 또는 그의 단편을 투여하는 것은 항체 또는 그의 단편을 투여받는 동물, 또는 상기 동물의 자손 내의, 또는 상기 동물이 사는 무리, 케이지, 또는 외양간 내의 씨. 제주니의 존재를 감소시키는 것을 목적으로 수행될 수 있다. 동물의 위장관 내의 씨. 제주니를 감소시키는 것이 동물 환경 내의 오염을 감소시키는 한 방법이며, 이를 통해서 오염 발생은 감소됨과 동시에 식품 공급 체인은 더욱 안전화된다.
동물에게 투여하는 것은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이롭게, 본원에 기술된 항체 또는 그의 단편은 경구로 투여될 수 있다. 경구 전달을 통해 항체 또는 그의 단편은 음용수 또는 식품 공급물 내에서 동물에게 전달될 수 있고, 경구 전달은 동물에게 주사보다 덜 눈에 띄거나, 스트레스가 덜 하다. 경구 투약 요법의 고도로 정확한 전달이 바람직할 경우, 위관 영양법 또한 허용되는 경구 경로이다. 예컨대, 전신을 통한 투여, 또는 직장 전달 경로를 통한 투여와 같은 다른 투여 경로 또한 고려될 수 있다. 예를 들어, 및 어느 방식으로든 제한하고자 하지 않으면서, 항체 또는 그의 단편은 동물의 식품 공급물에 포함될 수 있다. 한 비-제한적 예에서, 항체 또는 그의 단편은 동물의 식품 공급물에 포함되는 효모 발현 시스템으로 제공될 수 있다. 비-제한적 예에서, 항체 또는 그의 단편은 효모 코트 단백질(들) 상에 디스플레이될 수 있거나 또는 효모에 의해 내부에서 또는 외부에서 발현될 수 있다.
씨. 제주니에 대해 효과적인 또 다른 물질을 공동 투여하는 것 또한 동물 환경에서 씨. 제주니를 감소시키는 가능한 전략법이다. 예를 들어, 항체 또는 그의 단편을 전달할 때 동시에 또는 그에 인접한 시점에 동물에게 항생제를 투여하는 것은 상가 효과를 발휘할 수 있거나, 또는 시너지 효과를 발휘할 수 있다. 그의 결과는 씨. 제주니 오염 가능성 감소 뿐만 아니라, 항생제 사용의 감소이다. 씨. 제주니에 대해 효과적인 박테리오신은 또한 상가 또는 시너지 효과를 위해 항체 또는 그의 단편과 함께 동물에게 제공될 수 있다. 박테리오신 이외에, 또는 그에 대한 대안으로, 씨. 제주니에 대해 효과가 있는 임의의 다른 식물 또는 동물 유래 화합물, 예컨대, 소분자, 펩티드, 또는 단백질은 본원에 기술된 항체 또는 그의 단편과 함께 사용될 수 있다. 상가 또는 시너지 효과를 달성하기 위해 경쟁적 미생물 또한 항체 또는 그의 단편과 함께 동시에 동물에게 제공될 수 있다. 경쟁적 미생물은 프로바이오틱 시스템의 일부로서 본원에 기술된 항체 또는 그의 단편과 함께 사용될 수 있다. 상기 프로바이오틱 시스템 내에서, 항체 또는 그의 단편은 경쟁적 미생물과 함께 공동으로 투여될 수 있거나, 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 프로바이오틱 시스템 내에서의 본원에 기술된 항체 또는 그의 단편의 발현 또한 이행될 수 있다.
CDR 영역 바깥쪽의 항체 또는 그의 단편의 일부에 대한 스캐폴드 조작이 추가의 프로테아제 저항성 뿐만 아니라, 열적 및 낮은 pH 저항성도 부여할 수 있다. 장 효소, 열적 또는 낮은 pH 효과에 대해 보호 효과를 제공하는 코팅제 또는 부형제를 이용함으로써 전달 형태 또한 변경할 수 있고, 이러한 방식으로, 항체 또는 그의 단편의 서열 그 자체는 변형될 필요가 없으며, 오히려 경구 전달을 위해 제조된 제제 그 자체는 항체 또는 그의 단편이 전달되는 대상체의 종에 맞게 최적화될 수 있다.
투여 형태는 펩티드를 동물에게 전달하는 데 허용되는 임의 유형의 것일 수 있다. 바람직할 경우, 코팅된 형태 및 저속 방출형 형태가 사용될 수 있다. 액체, 분제, 크리스탈, 겔, 반-고체, 또는 정제 형태가 사용될 수 있다.
항체 또는 그의 단편이 전달될 수 있는 동물은 조류, 예컨대, 육용계 또는 산란용 닭일 수 있다. 다른 유형의 가축 동물, 예컨대, 소, 양 등도 또한 씨. 제주니가 상기 동물의 장 또는 주변 환경에 존재할 경우에는 상기 펩티드가 유익할 수 있다. 따라서, 가축에의 적용은 가금류로 제한되지 않는다. 전형적인 동물 환경은 외양간 또는 농장, 예컨대, 양계장일 수 있다. 실질적으로 씨. 제주니가 없는 동물 환경의 오염을 피하기 위해, 새로 오염된 동물 또는 "신입" 동물이 상기 환경, 예컨대, 외양간 내로 도입되지 못하도록 하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서, 항체 또는 그의 단편은, 신입 동물이 동물 환경, 예컨대, 외양간 또는 농장 내로 도입되기 이전에 신입에게 투여된다. 이러한 방식으로, 이미 처리를 받은 것일 수도 있는 다른 동물과 함께 거주지를 차지하기 이전에 오염 가능성은 동물로부터 제거될 수 있다.
본원에서는 부형제와 함께, 본원에 기술된 항체 또는 그의 단편을 포함하는 항-씨. 제주니 백신을 기술한다. 백신은 상기 기술된 바와 같이, 경구 전달을 위해 제제화될 수 있다.
대상체에게 상기 기술된 항체 또는 그의 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 씨. 제주니로 감염된 대상체를 치료하는 방법 또한 기술한다. 임의로, 씨. 제주니에 대해 효과적인 항생제도 함께 대상체에게 공동으로 투여될 수 있다. 대상체가 가축, 예컨대, 닭일 수 있지만, 본 방법은 또한 인간 대상체에게도 적용될 수 있다.
씨. 제주니 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 제제는 부형제와 함께 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 따라서, 항체 또는 그의 단편은 씨. 제주니 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 씨. 제주니 감염을 치료하는 의약의 제조에서 사용될 수 있다.
본원에 기술된 항체 또는 그의 단편은 또한 샘플 중 씨. 제주니를 검출하는 방법에도 유용하다. 상기 방법에서, 샘플을 표지의 존재 또는 부재하에서 항체 또는 그의 단편과 접촉시킨 후, 이어서, 결합된 항체 또는 그의 단편의 존재를 임의의 허용되는 수단을 사용하여 검출한다. 샘플은, 검출이 개체의 오염 또는 감염을 측정하는 데 사용되는 체액 또는 배설물을 포함할 수 있다. 씨. 제주니의 존재를 식품 제품 중에서, 또는 식품 가공 환경에서 평가하고자 하는 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편에 의해 접촉되는 샘플은 식품 제품, 식품 용기, 식품 가공 장비, 또는 식품 제품, 용기, 또는 가공 장비로부터의 표면 스웝일 수 있다.
씨. 제주니 검출에 사용하기 위한 설명서와 함께 항체 또는 그의 단편, 그 자체를 포함하는, 상기 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 임의로, 검출 키트에서 사용되는 시약은 사용자의 편의를 위해 포함될 수 있다.
항체 또는 그의 단편 그 자체는 샘플 중 씨. 제주니를 검출하는 데 사용하고자 하는 검출 시약의 주요 성분일 수 있다. 상기 검출 시약은 또한 적합한 담체, 예컨대, 완충제일 것이다.
본 발명자들은 편모 단백질에 대한 패닝에 의해 과면역화된 라마 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리된 플라젤린 결합 단일 도메인 항체 (sdAb)인, 단리된 FlagV1M 및 FlagV6M을 가진다. FlagV1F23M은, 오류 유발 PCR 접근법을 사용하여 FlagV1M DNA에 무작위 돌연변이를 도입하였고; 패닝은 프로테아제 처리 조건하에서 수행된 라이브러리로부터 단리되었다. 등가의 돌연변이 또한 FlagV6M에 부여하여 FlagV6F23M을 수득하였다. sdAb를 베로독소 B 동종오량체로부터 유래된 단백질 도메인과 융합시킴으로써 5가를 FlagV1M, FlagV1F23M, 및 FlagV6M 항체에 부여하여 단백질 FlagV1P, FlagV1F23P, 및 FlagV6P를 수득하였다. "펜타바디"로 지칭될 수 있는 생성된 항체 또는 그의 단편은 조밀하고, 높은 결합성을 보였으며, 안정한 항원 결합 분자이다. 이러한 5가 VHH는 항원에 결합하였을 때, 씨. 제주니 및 씨. 콜라이의 응집을 증진시킬 수 있다.
단일 도메인 항체는 일반적으로 프로테아제에 대하여 종래 항체 단편보다 유의적으로 더 큰 저항성을 가진다. 그러나, FlagV1M, FlagV1F23M, FlagV6M, 및 FlagV6F23M은 또한 장 효소에 대해 증가된 내성을 가지도록 변형되었으며, 이로써, 경구 전달의 효능은 증가되어 있다. 폴리펩티드에 대해 파과적인 효과를 미칠 수 있는 전형적인 장 효소로는 펩신, 트립신 및 키모트립신을 포함한다. 따라서, 펩티드는 장관 내의 주변 씨. 제주니와 결합하는 데 더 긴 노출 시간이 소요될 수 있는 바, 이들 효소에 대한 저항성이 이롭다. 잔기 54와 78 사이에 제2 디술피드 가교를 도입하여 FlagV1M, FlagV1F23M, FlagV6M, 및 FlagV6F23M을 변형시킴으로써 각각 sdAb FlagV1MDSB, FlagV1F23MDSB, FlagV6MDSB, 및 FlagV6F23MDSB를 수득할 수 있다. 디술피드 가교 변형된 항체를 제조하기 위한 변형 부위는 시스테인 잔기가 특정 부위에 도입되었을 때 VHH 열적 안정성 및 단백질 가수 분해 안정성에의 최적의 변경에 기초하여 선택되었다.
VHH 및 펜타바디 대응물은 형광 현미경법에 의해 입증된 바와 같이, 씨. 제주니 세포 표면 항원인 플라젤린에 대해 특이적이었다. 추가로, 본 발명자들은 플라젤린에 대해 개발된 펜타바디가, 포유동물 세포에 침입하는 데 중요한 역할을 하는 flaA 단백질에 결합한다는 것을 입증하였다. SPR을 통해 VHH는 표적에 대하여 낮은 나노몰의 친화도를 가졌다는 것이 입증되었다. VHH는 또한 운동성 검정에서 입증된 바와 같이, 캄필로박터 성장 및 운동성을 방해/파괴할 수 있었다. VHH는 또한 경구로 투여되었을 때, 씨. 제주니 콜로니 형성의 수준을 유의적으로 감소시켰다. 추가로, 캄필로박터 방제에서 항체 및 항생제의 병용 요법에 관한 연구를 통해 VHH 및 펜타바디 투여가 항생제 요구량을 최대 35배만큼 저하시킬 수 있다는 것이 예증되었다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시 목적인 것이며, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 사용되지 않아야 한다는 것을 이해하여야 한다.
실시예 1: 항원 제조
하기 실시예에서 항원으로서 사용하기 위한 편모를 제조하였다.
앞서 기술된 바와 같이 (Power et al., 2003), 씨. 제주니 (균주 81-176) 편모를 단리시켰다. 간략하면, 편모를 제조하기 위해, 씨. 제주니를 밤새도록 배양하고, 세포를 스크래핑하여 뮬러-힌톤(Muller-Hinton) 브로쓰에 넣고, 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 원심분리하여 세포를 수거하고, 100 mL의 트리스-완충처리된 염수 용액 중에 재현탁시켰다. 얼음상에서 워링(Waring) 블렌더를 사용하여 세포로부터 편모를 전단 처리하였다. 원심분리하여 세포 파쇄물을 펠릿화하고, 상층액을 초원심분리 튜브로 옮겨 놓았다. 1시간 동안 45,000 rpm으로 원심분리하여 편모를 펠릿화하였다. 샘플을 2% SDS 중에 재현탁시키고, 원심분리하여 추가 정제를 수행하였다. 200-500 ㎕의 dH2O 중에 펠릿을 재현탁시켰다.
실시예 2: 라마 면역화 및 혈청 반응
씨. 제주니 편모를 표적화하는 VHH를 단리시키기 위해, 실시예 1에서 수득한 편모 항원으로 라마를 면역화시켰다.
씨. 제주니 편모 (실시예 1)로 피하로 수컷 라마 (라마 글라마(Lama glama))를 면역화시켰다. 총 7회에 걸쳐 주사를 수행하고, 매회 주사를 위해 총 부피 0.5 ml 중 100 ㎍의 항원을 동량의 완전 (1일째) 또는 불완전 (21, 35, 49, 63일째) 프로인트(Freund) 아주반트 (시그마(Sigma))와 혼합하였다. 마지막 2회의 주사 (76 및 90일째)는 아주반트 없이 100 ㎍의 항원을 이용하여 수행하였다. 1차 주사 이전 면역전 혈액 (15-20 ml)을 수집하고, 21, 49, 76 및 90일째에 수집하였다. 전체 면역전 및 면역 혈청을 사용하여 ELISA에 의해 특이적 면역 반응을 분석하였다. 문헌 (Hamers-Casterman et al. (1993))에 따라 90일째 얻은 라마 혈청을 분획화하였다. 혈청 분획화를 위해 단백질 G 및 A 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 제조업체의 설명서에 따라 사용하고, 분리된 분획을 1 M 트리스/HCl (pH 8.8)을 이용하여 pH 6으로 조정하고, 4℃에서 밤새도록 미리 냉장된 PBS에 대하여 투석시켰다. 개별 중쇄 분획 (G1, A1 및 A2) 및 G2 (종래 IgG)를 ELISA에 의해 편모에의 특이적 결합에 대하여 분석하였다. 간략하면, 마이크로타이터 플레이트 (맥시소르프(Maxisorp)™ 플레이트) (날지 눈크 인터내셔널(Nalge Nunc International: 미국 뉴욕주 로체스터))를 4℃에서 밤새도록 PBS 중 5 ㎍/ml의 편모 항원 (실시예 1)으로 코팅하였다. 웰을 세정하고, 200 ㎕의 1% 카세인으로 차단시켰다. 정제된 IgG 분획 (G1, G2, A1 및 A2)의 상이한 희석액을 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 PBST (0.05% v/v 트윈-20(Tween-20))로 세척하고, 염소 항-라마 IgG (H+L) (PBS 중 1:1,000) (베틸 래보러토리즈(Bethyl Laboratories: 미국 텍사스주 몽고메리))와 함께 인큐베이션시킨 후, 돼지-항-염소-HRP (PBS 중 1:3,000) (세다래인(Cedarlane: 캐나다 온타리오주 벌링턴))와 함께 인큐베이션시켰다. 100 ㎕/웰 TMB 퍼옥시다제 기질 (키르케가드 앤드 페리 래보러토리즈(Kirkegaard and Perry Laboratories: 미국 메릴랜드주 게이더스버그))을 첨가하여 신호를 검출하였다. 100 1 M 인산을 첨가하여 반응을 중단시키고, 바이오-라드(Bio-Rad) ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 A450을 측정하였다.
SDS-PAGE를 통해 라마 혈청 분획 (G1, G2, A1 및 A2; 데이터 제시하지 않음)의 순도를 확인하였다. 분획에 대한 ELISA 결과, 면역전 출혈 (데이터 제시하지 않음)과 비교하였을 때, 편모 항원에 대하여 중쇄 뿐만 아니라, 종래 분획도 강한 면역 반응을 보이는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 또한 전체 혈청 (데이터 제시하지 않음)으로부터 얻은 ELISA 결과와 유사한 것이었다.
실시예 3: 편모 결합 V H H의 라이브러리 구축 및 선별
실시예 2에서 수집된 혈청으로부터 단리된 RNA에 기초하여 과면역화된 라마 VHH 라이브러리를 구축하였다.
앞서 기술된 바와 같이 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009), 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하였다. 간략하면, 면역화 후 90일째에 수집된 대략 1 X 107개의 림프구로부터 QIA앰프(QIAamp) RNA 혈액 미니 키트 (퀴아젠(Qiagen: 캐나다 온타리오주 미시소가))를 사용하여 전체 RNA를 단리시켰다. 주형으로서 5 ㎍ 전체 RNA를 사용하여 올리고(dT) 프라이머를 이용함으로서 제조사의 권고 내용 (지이 헬스케어)에 따라 제1 가닥 cDNA를 합성하였다 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009). 올리고뉴클레오티드 MJ1-3 (센스) 및 2개의 CH2 도메인 안티센스 프라이머 CH2 및 CH2b3 (프라이머 서열에 대해, 문헌 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009) 참조)을 사용하여 가변부 및 불변 도메인 DNA의 일부를 증폭시키고, QIA퀵(QIAquick) 겔 추출 키트 (퀴아젠)을 사용하여 중쇄 단편 (길이 550-650 bp)을 겔 정제하였다. MJ7 및 MJ8 프라이머 (프라이머 서열에 대해, 문헌 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009) 참조)를 사용하여 2차 PCR 반응에서 중쇄 항체 (IgG2 및 IgG3)의 가변 영역을 다시 증폭시켰다. 증폭된 PCR 생성물을 QIA퀵 PCR 정제용 키트 (퀴아젠)로 정제하고, SfiI (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs: 캐나다 온타리오주 피커링))로 분해하고, 같은 키트를 사용하여 다시 정제하였다. 리가패스트 래피드(LigaFast Rapid) DNA 라이게이션 시스템 및 그의 프로토콜 (프로메가(Promega: 미국 위스콘신주 매디슨))을 사용하여 12 ㎍의 분해된 VHH 단편을 40 ㎍ (각각 3:1 몰비) Sfi 분해된 pMED1 파지미드 벡터와 라이게이션시키고 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009), 앞서 기술된 바와 같이 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009), 시판용 전기천공적격 TG1 이. 콜라이 세포 (스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라졸라))로 형질전환시키고, 라이브러리 크기 5 X 107개의 형질전환체를 수득하였다. 30개의 클로니로부터 얻은 VHH 단편을 PCR로 증폭시키고, 서열 분석하여 라이브러리의 복잡도를 분석하였으며; 모든 클론은 예상된 크기의 삽입체를 가졌고, 그의 코딩 VHH 단편을 서열 분석함으로써 측정된 바, 그의 CDR 영역은 서로 상이하였다. 라이브러리를 2 X YT/Amp-글루코스 (2% w/v) 배지 중 37℃에서 3-4시간 동안 250 rpm에서 성장시켰다. 앞서 기술된 바와 같이 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009), 박테리아 세포를 펠릿화하고, 같은 배지 중에 재현탁시키고, -80℃에서 글리세롤 원액으로서 보관하였다.
본질적으로 앞서 기술된 바와 같이 (Arbabi Ghahroudi et al., 1997 and 2009) 패닝 실험을 수행하였다. 편모 항원에 대하여 총 4회에 걸쳐 패닝을 수행하였다. 2 ml의 라이브러리 원액을 2 X YT/Amp-글루코스 (2% w/v) 배지 중 37℃에서 1-2시간 동안 250 rpm에서 성장시키고 (A600=0.4-0.5), 37℃에서 1시간 동안 M13KO7 헬퍼파지 (뉴 잉글랜드 바이오로바스(New England Biolobas))로 감염시켰다. 4℃에서 배양물을 원심분리한 후, 50 ㎍/ml 카나마이신을 포함하는 200 ml의 2 X YT/Amp 중에 감염된 세포 펠릿을 재현탁시키고, 37℃에서 밤새도록 250 rpm에서 인큐베이션시켰다. 앞서 기술된 바와 같이 (Arbabi-Ghahroudi et al., 2009) 배양물 상층액 중 파지 입자를 PEG 침전시키고, 파지 펠릿을 2 ml의 멸균 PBS 중에 재현탁시키고, 파지 적정을 측정하였다. 96-웰 맥시소르프™ 플레이트를 4℃에서 밤새도록 30 ㎍의 편모 항원으로 코팅하였다. 웰을 PBS로 세정하고, 37℃에서 2 시간 동안 PBS/1% (w/v) 카세인으로 차단하였다. 대략 1012개의 구조된 파지 입자를 차단된 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 PBST (0.1% v/v 트윈-20)로 5회 및 PBS로 5회에 걸쳐 세척하였다. 결합된 파지를 0.1 M 트리에틸아민으로 용리시키고, 1 M 트리스-HCL (pH 7.4)로 중화시키고, 지수 성장 TG1 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시킨 후, 추가의 15 min 동안 세포를 M13KO7로 중복감염시키고, 2X YT-Amp-Kan 중 37℃에서 밤새도록 성장시켰다. 각각 2차, 3차 및 4차 패닝에 대하여 항원 농도를 20, 15, 및 10 ㎍/웰로 감소시키고, PBS-T 및 PBS를 이용하는 세척을 7, 10 및 12회 실시하는 것으로 증가시킨 것을 제외하면 같은 조건인 것에 따라 3회 더 계속해서 패닝을 수행하였다. 4회에 걸쳐 패닝을 수행한 후, 무작위로 선택된 48개의 콜로니를 성장시키고, 앞서 기술된 바와 같이 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009), 단, 5 ㎍/ml의 편모를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅한 것을 예외로 하여, 파지 ELISA 스크리닝을 수행하였다. 양성 클론은 FlagV1M 및 FlagV6M (서열 8 및 서열 13; 도 1)을 포함하고, 본원에서는 이를 추가로 연구하였다.
실시예 4: 단량체 V H H 발현 및 정제
실시예 3에서 확인된 편모에 대한 VHH를 BbsI1-VHH 정방향 프라이머 및 BamHI-VHH 역방향 프라이머 (하기 표 1)를 사용하여 pMED1 파지미드 벡터로부터 PCR 증폭시켰다. BbsI 및 BamHI 제한 효소를 이용하여 PCR 단편을 분해시키고, 유사하게 분해된 pSJF2H 발현 벡터로 라이게이션시켰다 (Arbabi-Ghahroudi et al., 2009). 라이게이션시, 모든 플라스미드를 전기천공적격 TG1 이. 콜라이로 형질전환시키고, LB 한천 플레이트+앰피실린 상에서 선별하였다. 삽입체에 대해 콜로니를 콜로니 PCR에 의해 스크리닝하고, DNA 서열을 분석하였다.
5일 최소 배지 방법을 사용하여 VHH 항체를 발현시켰다 (Arbabi-Ghahroudi et al., 2009). 단백질 발현 유도 후, 6,000 rpm x 30 min (4℃)으로 세포 배양물을 수거하고, 상층액을 경사분리하고, 세포 펠릿으로부터 주변세포질 내용물을 추출하였다. 간략하면, 단량체 VHH 펠릿을 20 ml 빙냉 TES (0.2 M 트리스-HCl (pH 8.0), 20% (w/v) 수크로스, 0.5 mM EDTA) 중에 재현탁시키고, 30 min 동안 얼음상에서 인큐베이션시켰다. 이어서, (dH2O 중에 희석된) 30 ml의 빙냉 1/8 TES를 첨가하고, 추가의 30 min 동안 얼음상에서 인큐베이션시키고, 슬러리를 30 min (4℃) 동안 12,000 rpm으로 원심분리하였다. VHH를 함유하는, 생성된 상층액을 기술된 바와 같이 (Arbabi-Ghahroudi et al., 2009), 고정화된 금속-친화성 크로마토그래피 (IMAC) 완충제 A (10 mM HEPES (pH 7.0), 500 mM NaCl)로 밤새도록 투석하고, 정제하였다. 하이트랩™ 킬레이팅(HiTrap™ Chelating) HP 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 설명서에 따라 항체 정제를 수행하였다. 출발 완충제로서 10 mM HEPES, 500 mM NaCl (pH 7.0), 및 용리 완충제로서 10 mM HEPES, 500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸 (pH 7.0)을 사용하여 AEKTA FPLC 정제용 시스템 (지이 헬스케어) 상에서 분획화를 수행하였다.
정제된 단백질 분획을 풀링하고, PBS에 대해 투석하였다. 용리된 분획을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석한 후, PBS로 투석하였다. 문헌 (Pace et al., 1995)에 따라 ExPASy ProtParam Tool (http://expasy.org/tools/protparam.html)을 이용하여 계산된 흡광 계수 및 MW 이론치를 사용하여 280 nm에서의 흡광도 측정에 의해 VHH 농도를 측정하였다. 정제된 단량체 FlagV1M 및 FlagV6M VHH 수율 범위는 10 내지 80 mg/l 박테리아 배양물이었다 (도 2).
하기 표 1은 실시예 4 및 5에 기술된 바와 같이, 단량체 및 오량체 VHH 클론을 구축하는 데 사용된 프라이머를 보여주는 것이다.
Figure pct00026
실시예 5: 오량체 V H H의 발현 및 정제
VHH를 AB5 독소 패밀리의 B 서브유닛의 오량체화 도메인에 융합시켜 단량체 VHH의 오량체를 제조하였다. 일단 발현되고 나면, 서브유닛은 오량체로 자가 조립된다. FlagV1P 및 FlagV6P (서열 19 및 서열 21; 도 1)를 제조하였다.
실시예 3에서 확인된 편모에 대한 VHH를 BbsI1-VHH 정방향 프라이머 및 ApaI-VHH 역방향 프라이머 (표 1)를 사용하여 pMED1 파지미드 벡터로부터 PCR 증폭시켰다. BbSI 및 ApaI 제한 효소를 이용하여 PCR 단편을 분해시키고, 유사하게 분해된 pVT2 발현 벡터로 라이게이션시켰다 (Arbabi-Ghahroudi et al., 2009). 라이게이션시, 모든 플라스미드를 전기천공적격 TG1 이. 콜라이로 형질전환시키고, LB 한천 플레이트+앰피실린 상에서 선별하였다. 삽입체에 대해 콜로니를 콜로니 PCR에 의해 스크리닝하고, DNA 서열을 분석하였다.
5일 최소 배지 방법을 사용하여 오량체 항체를 발현시켰다 (Arbabi-Ghahroudi et al., 2009). 단백질 발현 유도 후, 6,000 rpm x 30 min (4℃)으로 세포 배양물을 수거하고, 상층액을 경사분리하고, 세포 펠릿으로부터 주변세포질 내용물을 추출하였다. 세포를 100 ml 빙냉 용해 완충제 (50 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 25 mM NaCl) 중에 재현탁시키고, -20℃에서 밤새도록 얼음상에서 유지시키거나, 1 시간 동안 드라이아이스 상에서 냉동시켰다. 1 ml의 100 mM PMSF 및 200 ㎕의 1 M DTT를 냉동된 현탁액에 첨가한 후, 가끔씩 진탕시키면서, 실온에서 해동시켰다. 3 ml의 새로 제조된 리소자임 (최종 농도 = 150 ㎍/ml)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 현탁액을 가끔씩 진탕시키면서, 현탁액이 점성이 될 때까지 실온에서 30 - 50 min 동안 인큐베이션시켰고, 현탁액이 점성이 되는 시점에 200 ㎕ - 300 ㎕의 DNase I (시그마) (1 M MgCl2 중 15 유닛/㎕)를 첨가한 후, 실온에서 추가의 15 min이 이어졌다. 세포 용해물을 원심분리하고, 0.22 ㎛ 막 필터를 통과시켜 여과하였다. VHH를 함유하는, 생성된 상층액을 기술된 바와 같이 (Arbabi-Ghahroudi et al., 2009), 고정화된 금속-친화성 크로마토그래피 (IMAC) 완충제 A (10 mM HEPES (pH 7.0), 500 mM NaCl)로 밤새도록 투석하고, 정제하였다. 하이트랩™ 킬레이팅 HP 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 설명서에 따라 항체 정제를 수행하였다. 출발 완충제로서 10 mM HEPES, 500 mM NaCl (pH 7.0), 및 용리 완충제로서 10 mM HEPES, 500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸 (pH 7.0)을 사용하여 AEKTA FPLC 정제용 시스템 (지이 헬스케어) 상에서 분획화를 수행하였다.
정제된 단백질 분획을 풀링하고, PBS에 대해 투석하였다. 용리된 분획을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석한 후, PBS로 투석하였다. 문헌 (Pace et al., 1995)에 따라 ExPASy ProtParam Tool (http://expasy.org/tools/protparam.html)을 이용하여 계산된 흡광 계수 및 MW 이론치를 사용하여 280 nm에서의 흡광도 측정에 의해 VHH 농도를 측정하였다. 정제된 오량체의 수율 범위는 10-50 mg/l 박테리아 배양물이었다.
실시예 6: 항편모 항체의 생물리학적 특징 규명
실시예 4 및 5에서 발현되고 정제된 FlagV1M, FlagV6M, FlagV1P, 및 FlagV6P 항체의 특징을 규명하였다.
표면 플라즈몬 공명. 단량체 및 오량체 FlagV1 및 FlagV6 (실시예 4)을 150 mM NaCl, 3 mM EDTA를 함유하는 10 mM HEPES (pH 7.4) 중에서 각각 크기 배제 칼럼, 슈퍼덱스 75 및 슈퍼덱스 200 (지이 헬스케어)을 통해 통과시켰다. 단량체 VHH 분획을 수집하고, A280 측정값을 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 피어스 EZ-링크 술포-NHS-LC-LC-비오틴(Pierce EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-biotin) (지이 헬스케어)를 대략 10배 몰 과량으로 10 mM 포스페이트, 150 mM NaCl (pH 7.0) 중에서 실온에서 30 min 동안 혼합하여 0.8 mg/ml의 항플라젤린 VHH를 비오티닐화시킨 후, 같은 완충제에 대해 투석시켰다. 비아코어(Biacore) 3000 장치 (지이 헬스케어)를 이용하여 분석을 수행하였다. 모든 측정은 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20 (지이 헬스케어)을 함유하는 10 mM HEPES (pH 7.4) 중 25℃에서 수행하였다. 대략 700-900 RU의 비오티닐화된 플라젤린을 5 ㎕/min의 유속으로 SA 센서 칩 (지이 헬스케어) 상에 포획시켰다. 참조로서 SA 표면을 사용하여 플라젤린-SA 표면 상에 다양한 농도의 항체를 40 ㎕/min의 유속으로 주사하였다. 전개 완충제로 세척하여 표면을 재생시켰다. BIA이벨류에이션(BIAevaluation) 4.1 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
CM% 센서 칩 상에의 고정화에 사용된 산성 조건에 대해 편모가 감수성이기 때문에, 비오티닐화된 항원은 스트렙트아비딘 상에 포획되었다. SPR 결과는 도 3a-3c에 제시되어 있다. 모든 데이터는 1:1 상호작용 모델에 상당히 잘 피팅되는 것으로 보였고, 이를 통해 속도 및 친화도를 도출해 낸 결과 (하기 표 2 제시), 그 범위는 20-30 nM 범위였다. 도 3c는 FlagV1M (도 3a)과 비교하여 FlagV1P가 매우 느린 오프 속도를 가지고 있다는 것을 보여주는 것으로, 이는 기능적 친화도가 증가하였음을 나타낸다.
항체 결합 검정 . 실시예 2에 기술된 바와 같이 ELISA를 수행하되, 단, 예외적으로, PBST로 플레이트를 세척하고, PBS-카세인 (1%)으로 차단시킨 후, 5 ㎍/ml의 FlagV1M, FlagV1P, 또는 FlagV6P 용액을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 PBST (0.05% v/v 트윈-20)로 세척하고, 토끼 항-His6 IgG를 HRP (PBS 중 1:5,000) (베틸 래보러토리즈)에 접합체시키고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. TMB 기질 (키르케가드 앤드 페리 래보러토리즈)로 결합을 검출하고, 1 M H3PO4로 반응을 중단시키고, 상기 기술된 바와 같이 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 A450을 측정하였다.
ELISA 결과는 도 2에 제시되어 있다. ELISA에 의해 FlagV1M은 강력한 결합 활성을 보였다. 제시된 바와 같이, FlagV1M의 경우, 50% 최대 결합을 0.2 ㎍/ml (15.6 nM)에서 달성한 반면, 오량체 FlagV1P는 0.005 ㎍/ml (40 pM)에서 50% 최대 결합을 달성하였으며 - 이는 기능적 친화도가 거의 400X 증가하였다는 것이다. ELISA에 의해 수득된 FlagV1M의 친화도 근사치 (20-30 nM 범위)는 SPR에 의해 수득된 값과 일치한다.
에피토프 맵핑 . 상기 기술된 바와 같이, 야생형 균주 81-176의 전체 세포 용해물과 함께 씨. 제주니의 Fla A 및 Fla B 돌연변이체 균주로부터 편모를 제조하였다. 환원 조건하에 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 편모 시료를 분리하고, 이를 니트로셀룰로스 막으로 옮겨 놓았다. 막을 PBS 중 3% (w/v) BSA로 차단하고, 실온에서 1시간 동안 FlagV1P 펜타바디와 반응시켰다. PBST로 5회 세척한 후, 막을 마우스 항-베로독소에 이어 염소-항-마우스 AP 접합체와 함께, 또는 항-His AP 접합체 (차단 완충제 중 1:5,000으로 희석) (에브캄(Abcam: 미국 매사추세츠주 케임브리지))와 함께 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 막을 4회에 걸쳐 세척하고, 10 min 동안 AP 기질 (바이오-라드)과 함께 인큐베이션시켰다. 막을 증류된 H2O로 세정하여 AP 반응을 중단시키고, 대기 건조시켰다.
결과는 도 4에 제시되어 있다. FlagV1P는 플라젤린의 Fla A 성분에 결합하였다. Fla B와의 약한 교차 반응성이 관찰되었는데, 이는 가능하게는 Fla A와 Fla B 단백질 사이의 높은 DNA 서열 동일성 (95%)에 기인한다고 볼 수 있었다 (Wassenaar et al. 1991).
FlagV1M 및 FlagV6M이 같은 에피토프에 결합하였는지 여부를 측정하기 위해, 상기 기술된 바와 같이 SPR 공동 주사 실험을 수행하였다. 두 항체 모두, 60-100 ㎕의 각 VHH를 50 x 그의 KD 값 농도로 600-700 RU의 고정화된 편모에 30 ㎕/min으로 주사하였다. 결과는 도 5에 제시되어 있다. 2차 주사로 신호가 대략 2배로 배가되었는바, FlagV1M 및 FlagV6M은 별개의 비-중첩 에피토프에 결합하는 것으로 보였다. 이는 FlagV1 및 FlagV6 단량체, 둘 다의 조합 또는 오량체가 항원, 즉, 편모에 더 높은 효율로 결합할 수 있게 하고, 이로써 잠재적으로는 캄필로박터 콜로니 형성 속도를 감소시키는 데 있어 더욱 우수한 항체 효능을 제공할 것이라는 것을 제안한다.
펜타바디의 FITC 표지 및 형광 현미경법 . 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수한 FITC-표지 키트를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 FlagV1P 및 FlagV6P를 FITC로 2 mg/ml 농도로 표지하였다. 표지된 펜타바디를 수회에 걸쳐 PBS에 대해 투석시켜 비혼입 FITC를 제거하였다. 야생형 씨. 제주니 81-176 및 돌연변이체 cj1293을 로그 성장기에서 3% 포르말린으로 밤새도록 고정화시켰다. 세포를 PBS로 세척하여 포르말린을 제거한 후, 10 ㎕를 유리 커버슬립 상에서 ~1x108/ml로 대기 건조시켰다. 비특이적 결합을 실온에서 1시간 동안 50 ㎕ 5% 유액-PBS로 차단하였다. PBS 중에서 80 ㎍/ml로 희석된 50 ㎕ FITC-표지된 FlagV1P 중에서 세포를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS/0.1% 트윈으로 세척한 후, 벡타실드-DAPI(Vectashield-DAPI) (벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories: 캐나다 벌링턴)) 탑재용 배지를 이용하여 유리 슬라이드 상에 탑재시켰다. 슬라이드를 자이스 악시오버트(Zeiss Axiovert) 200M 현미경 (자이스(Zeiss: 캐나다 토론토))을 이용하여 조사하였다. 이중으로 실험을 수행하였고, 3회의 독립 실험을 수행할 경우, 각 커버슬립 상에서 3개 이상의 시야를 영상화하였다.
결과는 도 6에 제시되어 있다. 펜타바디는 씨. 제주니, 균주 81-176을 특이적으로 표지하는 반면, 씨. 제주니 (균주 1293) 또는 씨. 디피실레 박테리아에 대해서는 어떤 특이적인 결합도 검출되지 않았다. 형광 현미경법에 의해 항체가 씨. 제주니 81-176 세포의 극에 위치하는 편모 필라멘트에 결합하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이를 통해 FlagV1P의 결합이 입증되었다. 씨. 제주니 81-176의 플라젤린은 슈다미닌산(pseudaminic acid)으로 글리코실화되는 것으로 나타났고 (Thibault et al., 2001), 슈다미닌산의 생합성에 관여하는 유전자 pseB의 불활성화는 세포가 편모 필라멘타 조립을 하지 못하게 만든다 (Schoenhofen et al., 2006; Goon et al., 2003). 도 6 (패널 e 및 f)에서 관찰되는 바와 같이, 상기 유전자 파괴로 인해 FlagV1P는 씨. 제주니 세포에 결합하지 못하였고, 이를 통해 상기 결합은 편모 필라멘트에 특이적이라는 것을 확인할 수 있었다.
또 다른 실험에서, 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 형광 현미경법을 수행하되, 단, 씨. 제주니 균주 81-176, 81-176 flaA - flaB -, 또는 씨. 제주니 균주 11168 을 FITC로 표지된 FlagV1P 또는 Flag V6P와 함께 인큐베이션시켰다. 양성 대조군으로서 FITC-표지된 토끼 항편모 폴리클로날로 면역염색한 것을 사용하였다. 도 7에 제시된 결과는 FlagV1P가 균주 81-176의 씨. 제주니 편모에 결합하는 반면, FlagV6P는 81-176 및 11168 균주, 둘 다의 편모에 결합한다는 것을 보여준다. 이는 FlagV6P 항체가 씨. 제주니 균주의 매우 다양한 편모 변이체와 상호작용할 수 있다는 것을 입증한다.
교차 반응성 ELISA . ELISA를 사용하여 정제된 항편모 오량체 (FlagV1P, FlagV6P)의 9개의 상이한 씨. 제주니 균주 (균주 81-176, P1, 11168, P4, P19, P36, P2, P3, 및 P64)와의 교차 반응성을 측정하였다. 송아지로부터 단리된 균주인 씨. 제주니 균주 P2를 제외한, 사용된 균주는 모두 인간 임상 단리물이었다. 상이한 균주로부터 편모를 제조하고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 ELISA 검정법에서 마이크로타이터 플레이트의 코팅에 사용하되, 단, 예외적으로, 다양한 균주로부터 유래된 10 ㎍의 캄필로박터 편모 단백질로 웰을 코팅하고, FlagV1P 또는 FlagV6P 펜타바디를 사용하여 결합을 검출하였다. 흡광도 값는 2회의 독립 실험의 평균을 나타내는 것이다.
결과는 도 8에 제시되어 있다. ELISA 데이터는 FlagV1P가 81-176 (면역원 균주)과 강하게 상호작용하였고, 5개의 다른 균주와는 상이하 정도로 상호작용하였지만, 시험된 조건하에서 11168, P2, 및 P3 균주에는 강력하게 결합하지 않는 것으로 나타났다. 상기 데이터는 두 항체 모두를 함께 적용시키는 것이 씨. 제주니 종 및 아종의 콜로니 형성을 막는 데 더욱 효과적인 생성물을 제공할 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 7: 돌연변이체 V H H 및 펜타바디 제조
장 효소에 대해 내성이 증가되고, 이로써 닭 위장관의 가혹한 환경에 저항할 수 있도록 하기 위해 무작위 돌연변이유발법을 통해 변경된 항체를 개발하였다. 상기를 수행하기 위해, FlagV1M VHH에 기반하여 오류 유발 라이브러리를 구축하였다. VHH V1 오류 유발 PCR 라이브러리의 구축, 파지의 프로테아제 처리 및 패닝 방식을 강조한 작업 흐름 다이어그램이 도 15b에 제시되어 있다.
오류 유발 PCR에 의한 돌연변이체 V1 라이브러리의 구축. V1 오류 유발 PCR 라이브러리를 구축하기 이전에, 프로테아제 감수성 His6/HA 태그를 pMED1 벡터로부터 제거하였다. 새 벡터를 pMED6으로 명명하였고 (도 15a), 이는 이전 His6/HA 태그가 위치하였던 5' SfiI 제한 효소 부위의 하류 쪽에 앰버 "태그" 종결 코돈 4개의 뉴클레오티드를 함유하였다. 오류 유발 PCR을 위해, 10 ng의 FlagV1M DNA를 초기 주형으로서 사용하고, 무작위 돌연변이유발 PCR 키트 (진모르프 II 랜덤 뮤타제네시스(GeneMorph II Random Mutagenesis) 키트, 스트라타진) 및 프라이머 MJ7BACK 및 MJFOR 11 (하기 표 2)을 사용하여 30회 사이클 (95℃ 30 s, 55℃ 30, 72℃ 60 s), 이어서, 72℃에서 10 min 동안 신장시켜 50 ㎕ 반응물 중에서 증폭시켰다. PCR 생성물 (길이 약 500 bp)을 QIA퀵 PCR 정제용 키트 (퀴아젠: 캐나다 온타리오주 미시소가)로 정제하고, 50℃에서 6 시간 동안 SfiI로 분해하고 (뉴 잉글랜드 바이오랩스: 캐나다 온타리오주 피커링), 같은 키트를 사용하여 다시 정제하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 200 ㎍ pMED6 벡터를 또한 50℃에서 밤새도록, 이어서, 2 시간 동안 PstI/XhoI로 분해하였다. 분해된 벡터를 QIA퀵 PCR 정제용 키트 (퀴아젠)로 정제하고, DNA를 멸균 증류 H2O 중에서 용리시켰다 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009). 리가패스트 래피드 DNA 라이게이션 시스템 및 그의 프로토콜 (프로메가: 미국 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 45 ㎍의 분해된 VHH 단편을 150 ㎍ (각각 3:1 몰비) SfiI 분해된 pMED6 파지미드 벡터와 라이게이션시키고 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009) Madison, Wl), 앞서 기술된 바와 같이 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009), 시판용 전기천공적격 TG1 이. 콜라이 세포 (스트라타진: 미국 캘리포니아주 라졸라)로 형질전환시키고, 라이브러리 크기 대략 2 X 109개의 형질전환체를 수득하였다. 30개의 클로니로부터 얻은 VHH 단편을 PCR로 증폭시키고, 서열 분석하여, VHH 아미노산 서열 내의 점 돌연변이의 존재를 입증하였다 (데이터 제시하지 않음). 라이브러리를 2 X YT/Amp-글루코스 (2% w/v) 배지 중 37℃에서 3-4 시간 동안 250 rpm에서 성장시켰다. 앞서 기술된 바와 같이 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009), 박테리아 세포를 펠릿화하고, 같은 배지 중에 재현탁시키고, -80℃에서 글리세롤 원액으로서 보관하였다.
하기 표 2는 오류 유발 PCR 라이브러리 구축, 서브클로닝, 디술피드 결합 돌연변이체에서 사용된 프라이머를 보여주는 것이다. 이들 프라이머를 사용하는 방법은 실시예 7 및 10에 기술되어 있다.
Figure pct00027
V1 오류 유발 PCR 라이브러리의 프로테아제- 패닝. 본질적으로 앞서 기술된 바와 같이 (Arbabi Ghahroudi et al., 1997; Arbabi Ghahroudi et al., 2009) 패닝 실험을 수행하되, 단, 예외적으로, 초기 라이브러리 및 매회 패닝으로부터 구조 및 증폭된 파지를 닭 GI 관액 뿐만 아니라, 펩신, 키모트립신 및 트립신 프로테아제로 전처리하였다. 1 mM 트리스-HCl (pH 7.8) 완충제 중에서 3개의 파지 분취물 (각각 125 ㎕; 1 x 1012개의 파지 입자)을 제조하였다. 제1 파지 분취물에 12.5 ㎕ GI 관 닭 프로테아제 추출물 (10 X 희석액)을 첨가하고, 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 제2 파지 분취물을 1 mM HCl+20 mM CaCl2 중에서 등몰의 키모트립신/트립신 혼합물 (로슈(Roche)) (R1: 2.5 μM의 각 프로테아제, R2: 7.5 μM, 및 R3-4: 10 μM)과 함께 인큐베이션시키고, 15 min (R1), 45 min (R2), 및 60 min (R3-4) 동안 인큐베이션시켰다. 유사하게, 상이한 농도의 펩신 (로슈)을 PBS (R1: 2.5 μM, R2: 7.5 μM, R3-4 10 μM) 및 1/10 부피의 100 mM HCl (pH 2.0) 중에서 125 ㎕ 파지 분취물로 제조하였다. 닭 프로테아제 및 트립신/키모트립신에 대해 12.5 ㎕의 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈)을 첨가하거나, 또는 펩신에 대해 ½ 부피의 1 M 트리스-HCl (pH 7.5)을 첨가하여 프로테아제 반응을 중단시켰다.
프로테아제로 처리된 파지 분취물을 혼합하고, 패닝에 사용하였다. 앞서 기술된 바와 같이 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009), 총 4회에 걸쳐 편모에 대해 패닝을 수행하였다. 간략하면, 96-웰 맥시소르프™ 플레이트 (눈크(Nunc))의 웰을 4℃에서 밤새도록 15 ㎍의 편모 또는 PBS (블랭크로서)로 코팅하였다. 웰을 PBS로 세정하고, 37℃에서 2 시간 동안 PBS/1% (w/v) 카세인으로 차단하였다. 혼합된 프로테아제 처리된 파지 입자 (100 ㎕는 대략 1011 pfu 함유)를 차단된 웰에 첨가하고, 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 PBST (0.1% (v/v) 트윈-20)로 6회, 및 PBS로 6회 세척하였다. 결합된 파지를 0.1 M 트리에틸아민으로 용리시키고, 1 M 트리스-HCl (pH 7.4)로 중화시키고, 지수 성장 TG1 이. 콜라이 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시킨 후, 추가의 15 min 동안 세포를 M13KO7로 중복감염시키고, 2X YT-Amp-Kan 중 37℃에서 밤새도록 성장시켰다. 각각 2차, 3차 및 4차 패닝에 대하여 항원 농도를 12.5, 10, 및 10 ㎍/웰로 감소시키고, PBS-T 및 PBS를 이용하는 세척을 7, 10 및 12회 실시하는 것으로 증가시킨 것을 제외하면 같은 조건인 것에 따라 3회 더 계속해서 패닝을 수행하였다. 4회에 걸쳐 패닝을 수행한 후, 무작위로 선택된 24개의 콜로니에 대해 콜로니 PCR을 수행하고, PCR 단편의 서열을 분석하였다. 1-4개의 점 돌연변이를 포함하는 총 9개의 항편모 VHH를 확인하였다. 모체 V1 클론과 함께 돌연변이체 클론을 성장시키고, 앞서 기술된 바와 같이 (Arbabi Ghahroudi et al., 2009), 단, 5 ㎍/ml의 편모를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅한 것을 예외로 하여, 파지 ELISA 스크리닝을 수행하였다.
패닝하는 동안 닭 GI 관 환경에 저항하는 파지 항체를 선별하기 위해, 파지 항체를, 각종 프로테아제를 포함하는 닭 GI 관액과 함께, 또는 주요 GI 프로테아제, 즉, 펩신, 트립신 및 키모트립신과 함께 미리 인큐베이션시켰다 (도 15b). 섬유상 파지 (f1, fd, 및 M13)는 대부분의 GI 관액 프로테아제에 대해 저항성인 것으로 알려져 있는 바, 따라서, 파지 디스플레이가 저항성 VHH 단일 도메인 항체를 선별하하는 데 있어 이상적인 디스플레이 플랫폼이다. 패닝 후, 9개의 상이한 VHH를 단리시켰으나; 상기 클론 중 절반보다 적은 수의 클론이 파지 ELISA 검정법에서 양성인 것으로 판명되었다 (도 15c). 단량체 및 오량체 발현 벡터 (각각 pSJF2 및 pVT2) 중에서 양성 VHH를 서브클로닝한 후, 오직 클론 FlagV1F23M만이 모체 V1 클론과 유사한 ELISA 신호 및 발현 수준을 가졌고; 다른 클론은 약한 결합제이거나, 열악한 발현을 하는 것으로 판명되었다. 서열 분석 데이터에서는 FlagV1M VHH와 FlagV1F23M 사이의 유일한 차이는 프레임워크 1 중 2개의 잔기 (IMGT 넘버링 시스템에 따라 3번 위치에서의 Lys→Gln; 5번 위치에서의 Glu→Val)에 위치하는 것으로 나타났다. 이어서, FlagV1F23 클론을 단량체 및 오량체로서 발현시켰다 (서열 9 및 서열 20; 도 1). (적절한 프라이머를 사용하여) 같은 돌연변이를 FlagV6 항체에 적용시켜 FlagV6F23M 및 FlagV6F23P (서열 14 및 서열 22; 도 1)를 수득하였다.
가용성 및 오량체 V H H의 발현 및 정제. 실시예 4 및 5에 기술된 바와 같이, 적절하게 FlagV1F23M, FlagV1F23P, FlagV6F23M, 및 FlagV6F23P를 발현시키고, 정제하였다.
실시예 8: 운동성 검정
표준 플레이트 검정법을 사용하여 VHH 및 VHH 펜타바디에 의한 캄필로박터 성장 및 운동성 억제를 연구하였다.
앞서 기술된 바와 같이 (Kalmokoff et al., 2006), 운동성 검정을 수행하였다. 최종 농도 0.25-1 ㎍/㎕의 항체를 씨. 제주니 (균주 81-176) 또는 씨. 콜라이 (5x107 CFU)와 함께 RT에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 혼합물을 뮬러-힌톤 한천 (0.4%)을 함유하는 페트리 디쉬 중앙에 플레이팅하고, 미호기성 조건 (5% O2, 10% CO2, 및 85% N2)하에 37℃에서 인큐베이션시켰다. 박테리아를 플레이팅한 후 24, 48, 및 72 시간째에 성장 박테리아에 의해 생성된 원의 직경을 측정함으로써 박테리아의 운동성을 측정하였다. 항체와 에스. 엔테리카 혈청형 티피무리움의 교차 반응성 또한 바로 앞에서 기술된 방법을 사용하여 시험하였다. 항체와 항생제의 조합이 운동성을 추가로 파괴시킬 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 1 ㎍/㎕의 FlagV1P의 존재하에 상이한 농도의 테트라시클린 (0-64 ㎍/ml)을 배양 플레이트에 첨가하고,나머지 검정은 바로 앞에서 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과는 도 9 및 하기 표 3에 제시되어 있다. FlagV1M, FlagV1P, FlagV6P, 또는 FlagV1P와 FlagV6P의 조합과 함께 공동으로 인큐베이션된 캄필로박터 균주 81-176은 현저히 감소된 박테리아 운동성을 보였다. 보편적으로 사용되는 또 다른 캄필로박터 균주인 균주 11168 또한 조사하고, FlagV6P를 이용하여 플레이트 검정으로 운동성 억제를 입증하였다. FlagV1M 및 FlagV1P, 둘 다 심지어 48 시간의 인큐베이션 후에도 여전히 기능성을 유지하였다.
하기 표 3은 FlagV1 및 FlagV6 단량체 및 오량체와 함께 인큐베이션된 이후의, 플레이트 상에서의 씨. 제주니 81-176 및 11168 운동성을 보여주는 것이다. 접종물 부위로부터의 박테리아의 확산을 나타내는 원의 직경을 측정하였다. 별표 표시는 FlagV1 및 FlagV6 항체 처리 대 대조군 비관련 펜타바디의 통계학적 유의도를 나타내는 것이다.
Figure pct00028
FlagV1P와 항생제의 조합이 씨. 제주니 (균주 81-176)의 운동성에 미치는 효과는 도 10에 제시되어 있다. 상단 행은 대조군인 완충제로 처리하였을 때의 박테리아 성장을 도시한 것인 반면, 하단 행은 1 ㎍/㎕ 농도의 FlagV1P 펜타바디로 처리된 박테리아를 나타낸 것이다. 플레이트는 테트라시클린의 농도를 증가시켜 가면서 포함하였다: 0 ㎍/ml (A), 4 ㎍/ml (B), 16 ㎍/ml (C) 및 64 ㎍/ml (D). 24 시간의 인큐베이션 후, 사진을 촬영하였다. FlagV1P 펜타바디 첨가로 테트라시클린이 캄필로박터 운동성에 미치는 효과는 대략 35배만큼 증진되었다.
펜타바디 FlagV1P로 처리된 캄필로박터 콜라이 및 살모넬라 티피무리움에 대한 운동성 검정 결과는 각각 도 11a 및 b에 제시되어 있다. 씨. 콜라이 균주 VC167 (a) 및 에스. 엔테리카 혈청형 티피무리움 (b)의 박테리아 성장을 다양한 시점에 측정하였다. 항체를 1 ㎍/㎕의 농도로 사용하였다. 펜타바디 중 어느 것도 살모넬라의 운동성에는 영향을 미치지 않는 것으로 보였다. 펜타바디 FlagV1P 및 FlagV6P와 씨. 콜라이 VC167의 교차 반응성 결과는 하기 표 B에 제시되어 있다.
하기 표 4는 펜타바디 FlagV1P 및 FlagV6P와 씨. 콜라이 VC167의 교차 반응성을 보여주는 운동성 검정 결과를 제공하는 것이다. FlagV6P 펜타바디의 경우, 씨. 콜라이의 운동성이 유의적으로 감소된 것이 주목되었다. 값에 대해서는 통계학적 분석을 위해 스튜던츠 t 검정을 수행하였다. * p 값 <0.05; ** p 값 <0.005
Figure pct00029
실시예 9: 병원체 국재화 및 닭 처리
캄필로박터 발생을 막기 위한 대체 접근법으로서 항편모 VHH 단량체 또는 오량체를 사용하여 닭의 장내 씨. 제주니 콜로니 형성을 억제시키는 것에 관하여 조사하였다. 씨. 제주니의 편모가 닭 GI 관의 맹장내 박테리아 콜로니 형성을 매개하는 병원성 인자이다. 그러므로, 항체에의 결합을 통해 편모 운동성을 방해하는 것이 박테리아 운동성 및 장내 증식을 막는 것으로 제안된다.
씨. 제주니 콜로니 형성 및 레그혼 병아리 처리 . 포스페이트 완충처리된 염수 용액 중에서 18 시간 동안 성장시킨 씨. 제주니 81-176 박테리아를 수거함으로써 병아리 콜로니 형성 실험을 위한 접종물을 제조하였다. 박테리아 세포를 PBS 중에 희석시키고, 사용 직전까지 얼음상에 유지시켰다. 카말리(Karmali) 한천 (박토(Bacto) 상에 일련의 희석액을 플레이팅하여 생존가능한 세포 계수를 측정하였다. 1일된 특정 병원체 부재 (SPF) 레그혼 병아리 (혼성)를 캐나다 식품 검역청(Canadian Food Inspection Agency: 캐나다 오타와)의 부화장으로부터 입수하였다. 이들을 음성 대조군, 양성 대조군, 처리군으로 무작위로 지정하고, 체중을 측정하고, ID를 태깅하고, 동물 수용 설비에 하우징시키고, 임의로 사료 및 음용수를 제공하였다. 설비를 환경 조절 수준 2의 생화학적 봉쇄실에 하우징하였다. 도착하는 대로 즉시 조류 중 10%를 무작위로 씨. 제주니에 의한 콜로니 형성에 대해 시험하였다. 2일째, 양성 대조군 및 처리군을 PBS 중 300 ㎕ 씨. 제주니 81-176 108 cfu/ml로 경구로 시험감염하였다. 양성 대조군은 300 ㎕ PBS를 받았고, 처리군 (n=28/군, 2개의 수용 설비 각각에 닭 14마리씩)은 시험감염 후 1 시간, 24 시간 및 48 시간째에 300 ㎕의 FlagV1P 또는 FlagV1F23P를 받았다. 비감염 음성 대조군 또한 포함하였다 (n=15).
항체 처리 후 1 시간 또는 4 시간, 또는 48 시간째에, 캐나다 동물 관리 위원회(Canadian Council for Animal Care)의 승인을 받은 가이드라인에 따라 경부 탈구에 의해 조류를 안락사시켰다. 콜로니 형성을 정질적 뿐만 아니라, 정량적으로 평가하기 위해 맹장을 무균 방식으로 수집하였다. 맹장 내용물을 카말리 한천 (옥소이드(Oxoid)) 상에 일련으로 플레이팅하고, 미호기성 조건하에 37℃에서 2일 동안 인큐베이션시킨 후, 씨. 제주니를 계수하였다. 씨. 제주니로만 단독으로 시험감염 한 후, 또는 펜타바디를 투여한 후, 1일째 및 4일째 닭의 체중 또한 측정하였다. PBS를 대조군으로 사용하였고, 체중 (g)을 1일째 및 4일째 측정하였다.
도 12a 및 12b는 캄필로박터 제주니 콜로니 형성된 닭에서의 병원체 수준에 대해 FlagV1P 또는 FlagV1F23P 경구 투여가 미치는 효과를 보여주는 것이다. 씨. 제주니를 시험감염한 후, 1 시간, 24 시간 및 48 시간째에 닭은 300 ㎕ 오량체 야생형 FlagV1P 또는 돌연변이체 FlagV1F23P를 받았다. 개체 맹장내 박테리아 부하량은 펜타바디 처리된 닭에서 유의적으로 감소된 것으로 나타났다 (도 12a 및 12b). 음성 대조군은 비감염 닭의 맹장내에 어떤 검출가능한 씨. 제주니도 보이지 않았다.
캄필로박터로만 단독으로 시험감염 한 후, 또는 펜타바디를 경구로 투여하였을 때, 1일째 및 4일째 닭의 체중을 측정함으로써 위관 영양법으로 공급받은 FlagV1P가 닭의 체중에 미치는 효과를 조사하였다. PBS를 대조군으로 사용하였다. 각 군에 대한, 28개의 복제물로부터 수득한 값의 평균 체중±표준 편차가 도 13에 제시되어 있으며; 각 군들 사이에는 어떤 유의적인 차이도 관찰되지 않았다.
샌드위치 ELISA에 의한 닭 GI 관내 오량체 국재화 . 콜로니 형성 및 처리에 대해 기술된 스케줄 (상기 섹션 참조)에 따라 1 mg의 FlagV1P 펜타바디를 위관 영양법으로 닭에게 공급하였다. 맥시소르프 96-마이크로타이터 플레이트 (눈크)의 웰을 마우스 모노클로날 항-베로독소 항체 (10 ㎍/ml)로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. PBS-카세인 (1%)으로 차단시킨 후, 맹장, 회장, 공장 및 십이지장으로부터 수집된 장액을 2배식 일련의 희석액 (1/2-1/2,048)으로 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 PBST (0.05% v/v 트윈-20)로 세척하고; HRP (PBS 중 1:5,000)에 접합체된 토끼 항-His6 IgG를 첨가하고 (100 ㎕/웰) (베틸 래보러토리즈), 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. TMB 기질 (키르케가드 앤드 페리 래보러토리즈)로 결합을 검출하고, 1 M H3PO4로 반응을 중단시켰다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 A450을 측정하였다. 달리 명시하지 않는다면, 데이터는 각 군에 대하여 평균±SEM으로 제시된다. 조직 박테리아 부하량의 차이는 스튜던츠 t 검정 또는 일원 분산 분석 (ANOVA)에 이어, 적절할 경우, 본페로니 사후 다중 비교 검정에 의해 평가하였다. p<0.05일 때, 차이는 유의적인 것으로 간주하였다.
맹장, 회장, 공장 및 십이지장으로부터 장액을 수집하여 위관 영양법으로 공급된 펜타바디의 존재에 대해 조사하였다. 도 14는 닭 장관의 다른 부위에서의 항-씨. 제주니 FlagV1P의 검출을 보여주는 것이다. 제시된 바와 같이, 평균적으로 FlagV1P가 맹장 중에 상대적으로 높은 농도로 존재하였다. 캄필로박터 제주니 콜로니 형성의 주요 부위는 맹장, 대장 및 배설강이라고 언급하는 것은 주목할만하다 (Beery et al., 1988; Carrillo et al., 2005). 상기 데이터는 GI 관 및 캄필로박터 콜로니 형성 부위에서의 펜타바디의 공동 국재화 효과를 제안한다.
실시예 10: 디술피드 돌연변이체 V H H 제조
상기 기술된 VHH가, 닭 위장관에서 발견되는 효소에 대한 내성을 추가로 증가시킬 수 있는 추가의 디술피드 가교 조작을 포함하도록 구축하였다.
디술피드 결합 돌연변이체 V H H 구축 . 본질적으로 다른 곳에도 기술되어 있는 바와 같이 (Hussack, 2011), 슬라이스-중첩 확장 PCR을 사용하여 54번 및 104번 위치의 잔기를 시스테인으로 돌연변이화시킴으로써 추가의 디술피드 결합을 FlagV1M 및 FlagV1F23M의 코어 내로 도입하였다. 2개의 디술피드 결합을 함유하는 FlagV1MDSB를 생성하기 위해, BbsI1-VHH/V1-DSB-rev 및 V1-DSB-for/BamHI-VHH 프라이머 세트 (표 2)를 사용하여 FlagV1M을 증폭시켰다. 유사하게, F23-DSB-for/V1-DSB-rev 및 V1-DSB-for/BamHI-VHH 프라이머 세트 (표 2)를 이용하여 FlagV1F23M을 증폭시킴으로써 FlagV1F23MDSB를 생성하였다. 모두를 pSJF2H 발현 벡터로 클로닝하고, 실시예 3에 기술된 바와 같이 TG1 이. 콜라이로 형질전환시켰다. 실시예 4에 기술된 바와 같이 FlagV1MDSB 및 FlagV1F23MDSB (각각 서열 30 및 서열 31; 도 1)를 발현시키고, 정제하였다.
또한, 상기 기술된 방법을 사용하여 FlagV6M 및 FlagV6F23M의 코어 내로 추가의 디술피드 결합을 도입하였다. 생성된 구축물을 FlagV6MDSB 및 FlagV6F23MDSB (각각 서열 32 및 서열 33; 도 1)로 명명하였다.
SDS-PAGE에 의해 디술피드 돌연변이체를 분석한 결과, FlagV1MDSB 및 FlagV1F23MDSB는 그의 예상 분자량으로 전개되었고, 비-환원성 겔 상에는 어떤 고차 다량체에 대한 흔적도 없었다 (도 16a). VHH 수율 범위는 9.5 mg/l (V1-DSB) 내지 21.0 mg/l였다 (표 2).
디술피드 결합 돌연변이체의 크기 배제 크로마토그래피 및 표면- 플라즈몬 공명 ( SPR ) 분석 . SPR 분석을 수행하기 이전에 앞서 기술된 바와 같이 (Hussack, PLoS ONE, 2011), 슈퍼덱스 75 칼럼 및 ~50 μM의 VHH (FlagV1M, FlagV1MDSB, FlagV1F23M, 또는 FlagV1F23MDSB)를 이용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수행하였다. 비아코어 3000 (지이 헬스케어) 상에서 SPR 분석을 수행하기 이전에, EZ-링크 술포-NHS-비오티닐화 키트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 씨. 제주니 균주 81-176으로부터의 플라젤린을 비오티닐화시켰다. 500 mL의 플라젤린 A를 제조하고 (실시예 1), 1 mg/ml의 농도로 사용하였다. 비오틴을 20x 몰 농도로 및 제조사가 제공한 설명서에 따라 사용하였다. 총 8회 동안 1000x 부피의 PBS에 대해 투석시킴으로써 비혼입 비오틴을 제거하였다. 모든 SPR 실험을 위한 전개용 완충제는 HBS-EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA (pH 7.4), 0.005% P20; 지이 헬스케어)였다. 결합 분석을 위해, 사전에 비오틴 캡쳐(CAPture) 시약 (HBS-EP 완충제 중 50 ㎍/ml; 지이 헬스케어)가 적재된 CAP 센서 칩 (지이 헬스케어) 상에 2000 반응 단위 (RU)의 비오티닐화된 편모를 고정화시켰다. SEC 칼럼으로부터 용리된 VHH를 농도를 증가시켜 가면서 다중 주사를 사용하여 25-400 nM 범위의 농도로 고정화된 편모 상에 주사하였다. 재생 완충제 (8 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 1 M NaOH)를 사용하여 각 VHH 다음에 표면을 스트리핑하고, 상기 기술된 바와 같이 새 비오티닐화된 편모 표면을 제조하였다. 단일 사이클 키네틱스 패키지와 함께 업데이트된 BIA이벨류에이션 4.1 소프트웨어를 이용하여 친화도 (KD)를 계산하였다.
야생형 VHH는 23/104번 위치 (IMGT 넘버링)에 정규 디술피드 결합을 포함한다. 54/78번 위치 (IMGT 넘버링)의 추가의, 비-정규 디술피드 결합을 FlagV1M 및 FlagV1F23M 변이체 내로 도입함으로써 디술피드 돌연변이체 FlagV1MDSB 및 FlagV1F23MDSB를 수득하였다. 디술피드 돌연변이체의 가용성 박테리아 발현으로 최대 23 mg/L VHH를 수득하였다. 단일 사이클 키네틱스를 사용하여 SPR에 의해 VHH의 친화도를 측정하였다. FlagV1M, FlagV1MDSB, FlagV1F23M, 또는 FlagV1F23MDSB의 센서그램 및 친화도는 도 16b에 제시되어 있고, 표 2에 기록되어 있다. 모든 VHH는 1:1 결합 모델에 피팅되었고, 씨. 제주니 편모에의 높은 친화도 결합을 유지하였으며, KD 범위는 23.9 nM (FlagV1M) 내지 17.3 nM (FlagV1F23MDSB)이었다. SEC 크로마토그램이 제시되어 있으며 (도 16c), 이를 통해 모든 VHH가 단량체임을 확인하였다 (표 2). 각 크로마토그램 상에 용리 부피 (Ve)가 기록되어 있다.
V H H의 열적 언폴딩 분석 . 데이터 점을 매 0.2℃마다 수득하였다는 점을 예외로 하여, 본질적으로 기술된 바와 같이 (Hussack, PLoS ONE, 2011), 215 nm에서 VHH 언폴딩을 따라 자스코(Jasco) J-815 분광광도계 (자스코: 미국 메릴랜드주 이스턴)를 사용하여 pH 7.3 및 pH 2.0에서 원편광 이색성 분광법을 사용하여 모든 VHH의 열적 언폴딩 중간점 온도 (T m )를 측정하였다. V1 VHH의 경우, 50 ㎍/ml를 사용할 때에는 고온에서 응집되기 때문에 pH 7.3에서 T m 을 측정하기 위해 10 ㎍/ml를 사용하였다는 점을 예외로 하여, 50 ㎍/mL의 단백질 농도를 사용하여 VHH 언폴딩을 측정하였다.
pH 7.3에서 모든 VHH에 대한, 단일 상 전이를 포함하는 언폴딩 곡선을 수득하였다. 상기 pH에서 디술피드 돌연변이체 VHH의 T m 이 단일 디술피드 결합을 포함하는 VHH보다 높았다. 예를 들어, FlagV1M 및 FlagV1F23M인 경우, 각각 61.65±0.38℃ 및 72.33±0.15℃인 것과 비교하여, FlagV1MDSB 및 FlagV1F23MDSB의 T m 은 각각 79.10±0.11℃ 및 80.19±0.12℃였다 (도 17; 표 2). 50 ㎍/ml로 시험되었을 때, FlagV1M은 68℃ 초과의 온도에서는 응집되었다 (도 17, 인서트)는 점에 주의하여야 하며; 그러나, 농도를 10 ㎍/ml로 감소시켰을 때에는 더 높은 고온에서는 어떤 응집도 검출되지 않았고, 단일 상 언폴딩 곡선을 수득하였다. 이어서, VHH의 T m 을 pH 2.0에서 측정하였다. 언폴딩 실험을 수행하기 전, VHH를 pH 2.0에서 2 시간 이상 인큐베이션시켰다. 도 17의 언폴딩 플롯으로부터 명백한 바와 같이, V1은 pH 2.0에서 출발 온도 (25℃)에서 완전하게 언폴딩되었고, T m 은 측정불가능하였다. 대조적으로, FlagV1MDSB는 pH 2.0, 25℃에서 폴딩되었고, T m 은 42.41±0.11℃인 것으로 측정되었으며, 이는 2차 디술피드 결합이 FlagV1MDSB 안정성에 대해 상당한 영향을 미친다는 것을 설명한다. FlagV1F23M은 pH 2.0, 25℃에서 부분적으로 언폴딩되었고, T m 은 30.51±0.26℃인 것으로 측정되었으며, FlagV1M으로부터 개선된 것이었다. 본 결과는 더욱 안정한 결합제 선별에 있어 프로테아제 패닝 전략법의 성공을 분명하게 나타낸다. 중성 pH와 유사하게, pH 2.0에서 가장 높은 T m 을 가지는 클론은 F23-DSB이며, T m 은 44.55±0.03℃이고, 이는 FlagV1F23M에서의 안정화 돌연변이의 효과, 및 2차 디술피드 결합의 효과가 과안정화된 FlagV1F23MDSB 도메인을 생성하는 데 있어 부분적으로 시너지적이라는 것을 제안한다.
V H H의 시험관내 프로테아제 분해 . 주요 GI 프로테아제 펩신 (시그마), 트립신 (로슈), 및 키모트립신 (로슈)을 이용하여 FlagV1M, FlagV1MDSB, FlagV1F23M, 및 FlagV1F23MDSB VHH에 대해 시험관내 프로테아제 분해 검정을 수행하였다. 정확하게 기술된 바와 같이 (Hussack, PLoS ONE, 2011), VHH 분해를 수행하고, 이후 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 간략하면, VHH를 pH 2.0에서 37℃하에 60 min 동안 100 ㎍/mL의 펩신으로 분해하고; 대조군 VHH는 펩신 부재하에 인큐베이션시켰다. 트립신 및 키모트립신 분해를 위해, VHH를 pH 7.3에서 37℃하에 60 min 동안 10 ㎍/mL의 프로테아제와 함께 인큐베이션시키고; 대조군 VHH는 프로테아제 부재하에서 인큐베이션시켰다. 분해된 VHH 및 대조군을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, SDS-PAGE 겔의 농도계 분석을 수행하였다. 각 VHH에 대하여 총 3회에 걸친 독립 프로테아제 분해를 수행하였다.
결과는 도 18에 제시되어 있다. FlagV1M 및 FlagV1F23M 둘 다 펩신 분해에 대하여 감수성이었으며, 각각 22.3±8.1% 및 6.8±3.6%의 VHH가 60 min 후에도 온전한 상태 그대로 유지되었다. 디술피드 조작된 변이체는 펩신에 대하여 상당히 더욱 큰 저항성을 가졌으며, FlagV1MDSB는 시험된 펩신 농도 (100 ㎍/ml)에서 완전한 저항성 (100.5±6.7%)을 보였다. FlagV1F23MDSB 또한 펩신에 대하여 매우 큰 저항성을 가졌으며, 96.9±15.8%의 VHH가 60 min 후에도 온전한 상태 그대로 유지되었다. 60 min 동안 트립신으로 분해하였을 때, F23은 완전하게 저항성이고 (101.1±4.7%), 그 다음은 V1 (84.4±1.8%), FlagV1F23MDSB (49.1±15.4%) 및 FlagV1MDSB (41.3±2.7%) 순이었다. 디술피드 결합을 부가하면 본원의 두 클론 모두에 대한 트립신 저항성은 감소된다는 것을 명백하다. 60 min 동안 키모트립신으로 분해하였을 때, FlagV1F23MDSB는 가장 높은 저항성 (90.9±4.1%)을 보였고, 이어서, 그 다음은 FlagV1F23M (85.4±3.3%), FlagV1M (52.9±6.5%), 및 FlagV1MDSB (49.5±6.7%) 순이었다. 그러므로, 2차 디술피드 결합의 영향이 키모트립신 감수성은 증가시키지는 못하지만, 트립산 감수성은 증가시킨다. 종합하면, 이들 데이터는 프로테아제 패닝으로부터 단리된 FlagV1F23M 변이체가 고도로 높은 트립신 및 키모트립신 저항성 또는 내성에 대해 선별되었다는 것을 보여준다. 경구 투여로 제공될 수 있는 폴리펩티드의 경우, 펩신, 트립신 및 키모트립신 분해에 대한 저항성 개선이 바람직한 특징이다.
개별 프로테아제 분해 이외에도, GI 관에서의 순차적인 프로테아제 분해를 모방하기 위해 순차적인 분해 반응을 수행하였다 (도 19a). VHH (50 ㎍)를 총 부피 50 ㎕ 중에서 먼저 펩신 (37℃, pH 2.0, 최종 10 ㎍/ml)으로 15 또는 30 min 동안 분해한 후, 이어서, 트립신+키모트립신 (37℃, pH 7.4, 각각 최종 10 ㎍/ml)으로 15 또는 30 min 동안 분해하였다. 펩신 분해 후, 1 M NaOH를 이용하여 반응물의 pH를 중화시켰다. 트립신+키모트립신 분해 후, 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. SDS-PAGE에 의해 순차적으로 분해된 VHH를 비처리 대조군과 비교하였다.
SDS-PAGE에 의한 순차적 분해 및 비처리 대조군의 효과는 도 19b에 제시되어 있다. 대조군 FlagV1M과 비교하여 ("V1"을 "V1(15)" 및 "V1(30)"과 비교) 15 및 30 min째 FlagV1M의 거의 완전한 분해는 분명하다. FlagV1F23M은 FlagV1M보다 더욱 큰 저항성을 가졌고, 순차적인 15 min 분해 후에도 강력한 밴드는 존재하였다 ("F23"을 "F23(15)"와 비교). 30 min 후, FlagV1F23M의 거의 완전한 분해가 관찰되었다. 역으로, 디술피드 결합 변이체 둘 다 심지어 처리 30 min 후에도 순차적인 프로테아제 분해에 대하여 강력한 저항성을 가졌다 ("V1-DSB"를 "V1-DSB(30)"과 비교, 및 "F23-DSB"를 "F23-DSB(30)"과 비교). 밴드의 농도계 분석 결과, 같은 처리 후, FlagV1MDSB VHH는 47.6%가 온전한 상태 그대로인 것과 비교하여 FlagV1F23MDSB VHH는 74.5%가 순차적인 30 min 분해 후에도 온전한 상태 그대로였다.
프로테아제-분해된 V H H에 대한 씨. 제주니 운동성 검정 . 앞서 기술된 바와 같이 (Kalmokoff et al., 2006), 운동성 검정을 수행하였다. 최종 농도 1 ㎍/㎕의 항체를 씨. 제주니 (5x104 CFU)와 함께 RT에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 혼합물을 뮬러-힌톤 한천 (0.4%)을 함유하는 페트리 디쉬 중앙에 플레이팅하고, 미호기성 조건 (5% O2, 10% CO2, 및 85% N2)하에 37℃에서 인큐베이션시켰다. 박테리아를 플레이팅한 후 24 시간째에 성장 박테리아에 의해 생성된 원의 직경을 측정함으로써 박테리아의 운동성을 측정하였다.
프로테아제-분해된 V H H 돌연변이체에 대한 씨. 제주니 운동성 검정 . 바로 앞의 상기 섹션에서 기술된 바와 같이 순차적인 프로테아제 분해 방식에 VHH를 노출시켰다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이 (Kalmokoff et al., 2006), 운동성 검정을 수행하였다. 최종 농도 1 ㎍/㎕의 항체를 씨. 제주니 (균주 81-176) (5x104 CFU)와 함께 RT에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 혼합물을 뮬러-힌톤 한천 (0.4%)을 함유하는 페트리 디쉬 중앙에 플레이팅하고, 미호기성 조건 (5% O2, 10% CO2, 및 85% N2)하에 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트 접종 후 24 시간째에 성장 박테리아에 의해 생성된 원의 직경을 측정함으로써 박테리아의 운동성을 측정하였다.
(도 19c 및 도 20에 도시된 바와 같이) 순차적으로 분해된 VHH가 씨. 제주니 운동성을 감소시키는 데 있어서 여전히 기능성인지 여부를 측정하기 위해 운동성 검정에 VHH를 사용하였다. 프로테아제로 처리되지 않은 VHH는 24 시간 동안의 인큐베이션 후에도 플레이트 상의 박테리아 성장 및 확산을 억제시키는 데 있어서 효과적인 상태 그대로 유지되었다. 프로테아제-처리된 FlagV1M 및 FlagV1F23M 항체는 15 min 및 30 min 인큐베이션 후인 두 조건 모두에서 활성을 거의 완전하게 상실하였다. 그에 반해, FlagV1MDSB 및 FlagV1F23MDSB 돌연변이체의 성장 억제 활성은 프로테아제 처리에도 거의 영향을 받지 않았으며, 이를 통해 프로테아제-처리된 VHH는 디술피드 결합 돌연변이체에서 여전히 활성이고, 기능성인 상태로 유지되었다는 것을 추가로 확인할 수 있었다.
하기 표 5는 씨. 제주니 편모 특이적 VHH의 생물리학적 특성을 보여주는 것이다. 속도 및 친화도 상수 또는 "온" 및 "오프" 속도 (ka 또는 k온 및 kd 또는 k오프), 및 장 효소 펩신, 트립신, 및 키모트립신에 대한 저항성을 포함한다. a 슈퍼덱스 75 크기 배제 크로마토그래피 피크 면적 적분에 의해 측정; b 50 ㎍/ml일 때 V1이 응집되는 것에 기인하여 10 ㎍/ml 사용; c 100 ㎍/ml 프로테아제를 사용하여 분해; d 10 ㎍/ml 프로테아제를 사용하여 분해; n/a: pH 2.0, 25℃에서 변성된 단백질.
Figure pct00030
단일 도메인 VHH 항체가 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 신규 도구로서 부상하고 있다는 것은 명백하다. 이러한 폴리펩티드는 크기가 작기 때문에, 종래 항체에는 접근이 어려웠던 에피토프에 결합할 수 있다. 또한 독특한 물리적 특성, 예컨대, 단백질 가수 분해에 대한 저항성, 변성 및 응집에 기인하여 인간 또는 가축을 위한 경구 전달을 위한 치료제로서 적용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 씨. 제주니 편모에 대한 VHH 항체의 라이브러리를 구축하고, 스크리닝하였다. VHH 및 그의 오량체 버전이 항원에 결합할 수 있고, 경구로 투여되었을 때에는 닭내 씨. 제주니 적재량을 저하시키는 데 효과적인 것으로 입증되었다.
시험관내 연구 결과, FlagV1M이 캄필로박터 제주니에 결합하고, 플레이트 검정에서 그의 성장을 파괴시켰지만, 밀접하게 관련된 캄필로박터 (씨. 콜라이) 균주에 대해서는 효과가 없는 것으로 나타났다. FlagV1M 및 FlagV1P, 둘 다 사용된 농도에서 운동성 검정에서 박테리아 성장을 파괴시키는 데 효과가 있었다. 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 작용 모드는 박테리아 운동성 파괴를 유발하는, 응집 및/또는 VHH의 단백질 공동으로의 삽입을 통해 이루어질 수 있다.
캄필로박터 콜로니 형성을 감소시키는 데 있어서의 항체의 효능을 측정하기 위해, 플라젤린 특이적 VHH의 오량체 버전을 구축하고, 박테리아 세포가 펜타바디의 VHH 도메인에 의해 응집화될 것이며, 이는 닭 위장관에 콜로니를 형성할 수 있는 씨. 제주니의 능력을 손상시킬 것이라는 가정하에 닭 연구에서 사용하였다. 캄필로박터의 운동성은 점성인 장 점액의 콜로니 형성을 위해 필요하며, 플라젤린 단백질은 세포 표면에서 면역우성 항원이다.
상기 기술된 항체 또는 그의 단편의 프로테아제 저항성 형태 및 다량체 형태는 유리하게는 닭에서의 캄필로박터의 콜로니 형성을 감소시킬 것이다. 예를 들어, 기재된 기술은 맹장에서 캄필로박터 오염을 방제하는 데 새로운 도구를 제공한다.
설명 목적으로 제시된 상기 기술에서, 다수의 상세한 설명은 본 실시양태를 완전하게 이해시키기 위해 기술된 것이다. 그러나, 이들 구체적인 상세한 설명이 요구되지 않는다는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
상기 기술된 실시양태는 단지 예시인 것으로만 의도된다. 기술된 특정 실시양태의 변경, 수정 및 변형은 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본원에 포함된다.
참조 문헌
본원에서 및 본 출원 전역에 걸쳐 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공개 문헌은 본원에서 참조로 포함된다.
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
SEQUENCE LISTING <110> National Research Council of Canada <120> ANTI-CAMPYLOBACTER JEJUNI ANTIBODIES AND USES THEREFOR <130> PAT 7269W-90 <150> US 61/718,062 <151> 2012-10-24 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> FlagV1 CDR1 <400> 1 Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe His Met Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> FlagV1 CDR2 <400> 2 Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln 1 5 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(18) <223> FlagV1 CDR3 <400> 3 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 1 5 10 15 Gln Tyr <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> FlagV6 CDR1 <400> 4 Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn Ala Leu Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> FlagV6 CDR2 <400> 5 Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val 1 5 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(22) <223> FlagV6 CDR3 <400> 6 Asn Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala 1 5 10 15 Val Ala Ser Phe Gly Ser 20 <210> 7 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> FlagV1 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is K (Lys) or Q (Gln) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is E (Glu) or V (Val) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is A (Ala) or C (Cys) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa is I (Ile) or C (Cys) <400> 7 Gln Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 His Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Ala Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Xaa Ala Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln Tyr Tyr Pro Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Xaa Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> FlagV1M <400> 8 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 His Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Ala Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln Tyr Tyr Pro Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 9 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> FlagV1F23M <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 His Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Ala Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln Tyr Tyr Pro Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 10 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> FlagV1MDSB <400> 10 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 His Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Ala Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Cys Ala Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln Tyr Tyr Pro Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Cys Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 11 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> FlagV1F23MDSB <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 His Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Ala Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Cys Ala Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln Tyr Tyr Pro Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Cys Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 12 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(128) <223> FlagV6 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is K (Lys) or Q (Gln) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is E (Glu) or V (Val) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is A (Ala) or C (Cys) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa is I (Ile) or C (Cys) <400> 12 Gln Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val 35 40 45 Xaa Ala Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Xaa Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala Val 100 105 110 Ala Ser Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(128) <223> FlagV6M <400> 13 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala Val 100 105 110 Ala Ser Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(128) <223> FlagV6F23M <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala Val 100 105 110 Ala Ser Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 15 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(128) <223> FlagV6MDSB <400> 15 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val 35 40 45 Cys Ala Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala Val 100 105 110 Ala Ser Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 16 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(128) <223> FlagV6F23MDSB <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val 35 40 45 Cys Ala Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala Val 100 105 110 Ala Ser Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 17 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pentamerization domain <400> 17 Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys Val Glu Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp 1 5 10 15 Glu Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Gly Asp Lys Glu Leu Phe Thr Asn 20 25 30 Arg Ala Asn Leu Gln Ser Leu Leu Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met 35 40 45 Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala Cys His Asn Gly Gly Gly Phe Ser 50 55 60 Glu Val Ile Phe Arg 65 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 18 Gly Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 19 <211> 205 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(205) <223> FlagV1P <400> 19 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 His Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Ala Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln Tyr Tyr Pro Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Pro Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys 130 135 140 Val Glu Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Asp Thr Phe Thr Val Lys Val 145 150 155 160 Gly Asp Lys Glu Leu Phe Thr Asn Arg Ala Asn Leu Gln Ser Leu Leu 165 170 175 Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala 180 185 190 Cys His Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg 195 200 205 <210> 20 <211> 205 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(205) <223> FlagV1F23P <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 His Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Ala Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln Tyr Tyr Pro Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Pro Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys 130 135 140 Val Glu Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Asp Thr Phe Thr Val Lys Val 145 150 155 160 Gly Asp Lys Glu Leu Phe Thr Asn Arg Ala Asn Leu Gln Ser Leu Leu 165 170 175 Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala 180 185 190 Cys His Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg 195 200 205 <210> 21 <211> 208 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(208) <223> FlagV6P <400> 21 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala Val 100 105 110 Ala Ser Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Gly Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Asp Cys Val 130 135 140 Thr Gly Lys Val Glu Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Asp Thr Phe Thr 145 150 155 160 Val Lys Val Gly Asp Lys Glu Leu Phe Thr Asn Arg Ala Asn Leu Gln 165 170 175 Ser Leu Leu Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys 180 185 190 Thr Asn Ala Cys His Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg 195 200 205 <210> 22 <211> 208 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(208) <223> FlagV6F23P <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala Val 100 105 110 Ala Ser Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Gly Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Asp Cys Val 130 135 140 Thr Gly Lys Val Glu Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Asp Thr Phe Thr 145 150 155 160 Val Lys Val Gly Asp Lys Glu Leu Phe Thr Asn Arg Ala Asn Leu Gln 165 170 175 Ser Leu Leu Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys 180 185 190 Thr Asn Ala Cys His Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg 195 200 205 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BbsI1-VHH forward primer <400> 23 tatgaagaca ccaggcccag gtaaagctgg aggagtct 38 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI-VHH reverse primer <400> 24 ttgttcggat cctgaggaga cggtgacctg 30 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApaI-VHH reverse primer <400> 25 attattatgg gccctgagga gacggtgacc tgggtc 36 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJ7BACK primer <400> 26 catgtgcatg gcctagactc gcggcccagc cggccatggc c 41 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJFOR 11 primer <400> 27 catgtgtaga ttctgcctgg ccggcctggc c 31 <210> 28 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V1-DSB-for primer <400> 28 tagacagtat tatccagatc ccgtgaaggg ccgattcacc tgcaccagag ac 52 <210> 29 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V1-DSB-rev primer <400> 29 ggataatact gtctatctct actccaggaa atagcgcaca ctac 44 <210> 30 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> FlagV1MDSB <400> 30 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 His Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Ala Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Cys Ala Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln Tyr Tyr Pro Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Cys Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 31 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> FlagV1F23MDSB <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 His Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Ala Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Cys Ala Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln Tyr Tyr Pro Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Cys Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 32 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(128) <223> FlagV6MDSB <400> 32 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val 35 40 45 Cys Ala Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala Val 100 105 110 Ala Ser Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 33 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(128) <223> FlagV6MF23DSB <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val 35 40 45 Cys Ala Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala Val 100 105 110 Ala Ser Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 34 <211> 205 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(205) <223> FlagV1PDSB <400> 34 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 His Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Ala Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Cys Ala Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln Tyr Tyr Pro Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Cys Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Pro Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys 130 135 140 Val Glu Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Asp Thr Phe Thr Val Lys Val 145 150 155 160 Gly Asp Lys Glu Leu Phe Thr Asn Arg Ala Asn Leu Gln Ser Leu Leu 165 170 175 Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala 180 185 190 Cys His Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg 195 200 205 <210> 35 <211> 205 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(205) <223> FlagV1F23PDSB <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 His Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Ala Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Cys Ala Ile Ser Trp Ser Arg Asp Arg Gln Tyr Tyr Pro Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Cys Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Pro Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys 130 135 140 Val Glu Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Asp Thr Phe Thr Val Lys Val 145 150 155 160 Gly Asp Lys Glu Leu Phe Thr Asn Arg Ala Asn Leu Gln Ser Leu Leu 165 170 175 Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala 180 185 190 Cys His Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg 195 200 205 <210> 36 <211> 208 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(208) <223> FlagV6PDSB <400> 36 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val 35 40 45 Cys Ala Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala Val 100 105 110 Ala Ser Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Gly Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Asp Cys Val 130 135 140 Thr Gly Lys Val Glu Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Asp Thr Phe Thr 145 150 155 160 Val Lys Val Gly Asp Lys Glu Leu Phe Thr Asn Arg Ala Asn Leu Gln 165 170 175 Ser Leu Leu Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys 180 185 190 Thr Asn Ala Cys His Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg 195 200 205 <210> 37 <211> 208 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(208) <223> FlagV6F23PDSB <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Val Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val 35 40 45 Cys Ala Ile Gly Ser Asp Gly Thr Val Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Ala Gly Lys Arg Ile Gly Ser Asp Gly Ser Ile Trp Phe Ala Val 100 105 110 Ala Ser Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Gly Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Asp Cys Val 130 135 140 Thr Gly Lys Val Glu Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Asp Thr Phe Thr 145 150 155 160 Val Lys Val Gly Asp Lys Glu Leu Phe Thr Asn Arg Ala Asn Leu Gln 165 170 175 Ser Leu Leu Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys 180 185 190 Thr Asn Ala Cys His Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg 195 200 205 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Portion of the pMED6 vector <400> 38 ggccaggccg gccaggcata gact 24 <210> 39 <211> 375 <212> DNA <213> Lama glama <220> <221> misc_feature <222> (1)..(375) <223> FlagV1M <400> 39 caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tcggagactc 60 tcctgtgcaa cctctggtct cacatttagg aattttcaca tggcatggtt ccgccaggtc 120 gccgggaagg agcgtgaggt agtggcagct atttcctgga gtagagatag acagtattat 180 ccagatcccg tgaagggccg attcaccatc accagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240 ctgcagatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc tgcaagaaca 300 gcgtccgcat ctggtgactg gtataaggga tcgtatcaat actggggcca ggggacccag 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 40 <211> 375 <212> DNA <213> Lama glama <220> <221> misc_feature <222> (1)..(375) <223> FlagV1F23M <400> 40 caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tcggagactc 60 tcctgtgcaa cctctggtct cacatttagg aattttcaca tggcatggtt ccgccaggtc 120 gccgggaagg agcgtgaggt agtggcagct atttcctgga gtagagatag acagtattat 180 ccagatcccg tgaagggccg attcaccatc accagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240 ctgcagatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc tgcaagaaca 300 gcgtccgcat ctggtgactg gtataaggga tcgtatcaat actggggcca ggggacccag 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 41 <211> 375 <212> DNA <213> Lama glama <220> <221> misc_feature <222> (1)..(375) <223> FlagV1MDSB <400> 41 caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tcggagactc 60 tcctgtgcaa cctctggtct cacatttagg aattttcaca tggcatggtt ccgccaggtc 120 gccgggaagg agcgtgaggt agtgtgcgct atttcctgga gtagagatag acagtattat 180 ccagatcccg tgaagggccg attcacctgc accagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240 ctgcagatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc tgcaagaaca 300 gcgtccgcat ctggtgactg gtataaggga tcgtatcaat actggggcca ggggacccag 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 42 <211> 375 <212> DNA <213> Lama glama <220> <221> misc_feature <222> (1)..(375) <223> FlagV1F23MDSB <400> 42 caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tcggagactc 60 tcctgtgcaa cctctggtct cacatttagg aattttcaca tggcatggtt ccgccaggtc 120 gccgggaagg agcgtgaggt agtgtgcgct atttcctgga gtagagatag acagtattat 180 ccagatcccg tgaagggccg attcacctgc accagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240 ctgcagatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc tgcaagaaca 300 gcgtccgcat ctggtgactg gtataaggga tcgtatcaat actggggcca ggggacccag 360 gtcaccgtct cctca 375

Claims (38)

  1. 서열 GLTFRNFHMA (서열 1) 또는 VSTFSINALG (서열 4)를 포함하는 상보성 결정 영역 (CDR) 1;
    서열 ISWSRDRQ (서열 2) 또는 IGSDGTV (서열 5)를 포함하는 CDR2; 및
    서열 AARTASASGDWYKGSYQY (서열 3) 또는 NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS (서열 6)를 포함하는 CDR3
    을 포함하는, 씨. 제주니(C. jejuni) 편모에 특이적으로 결합하는 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열 GLTFRNFHMA (서열 1)의 CDR1, 서열 ISWSRDRQ (서열 2)의 CDR2, 및 서열 AARTASASGDWYKGSYQY (서열 3)의 CDR3을 포함하는, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  3. 제2항에 있어서, 서열:
    Figure pct00039
    ; 또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함하며,
    여기서, X1=K 또는 Q; X2=E 또는 V; X3=A 또는 C; X4=I 또는 C인 것인, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 서열:
    Figure pct00040

    Figure pct00041

    또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  5. 제1항에 있어서, 서열 VSTFSINALG (서열 4)의 CDR1, 서열 IGSDGTV (서열 5)의 CDR2, 및 서열 NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS (서열 6)의 CDR3을 포함하는, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  6. 제5항에 있어서, 서열:
    Figure pct00042
    ; 또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함하며,
    여기서, X1=K 또는 Q; X2=E 또는 V; X3=A 또는 C; X4=I 또는 C인 것인, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 서열:
    Figure pct00043

    Figure pct00044
    또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 플라젤린에 특이적으로 결합하는 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 플라젤린의 Fla A 성분에 특이적으로 결합하는 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 도메인 항체 (sdAb)인 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  11. 제10항에 있어서, sdAb가 낙타류 기원의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 다가 디스플레이로 존재하는 것인 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  13. 제12항에 있어서, 베로독소 B 서브유닛과의 융합 단백질로서 발현되는 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  14. 제13항에 있어서,
    Figure pct00045

    Figure pct00046

    및 그와 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 또는 1개 초과의 서열을 포함하는 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  16. 제15항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 검출가능한 표지에 연결된 것인 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  18. 동물에게 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 동물 또는 동물 환경에서 씨. 제주니의 존재를 감소시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편이 경구로 투여되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편이 효모 발현 시스템 중에 포함되는 것인 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 동물에게 씨. 제주니에 대해 효과적인 항생제, 박테리오신, 또는 다른 식물 또는 동물 유래 화합물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 임의로 프로바이오틱 시스템에서 공동으로 발현되거나, 또는 공동으로 함유되어 있는 경쟁 미생물을 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편과 함께 동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 신입 동물을 동물 환경 내로 도입시키기 이전에, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 신입 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 씨. 제주니의 동물 환경 내로의 도입을 감소시키는 방법.
  24. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편, 및 부형제를 포함하는, 씨. 제주니 백신.
  25. 제24항에 있어서, 경구 전달을 위한 백신.
  26. 씨. 제주니로 감염된 대상체에게 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 씨. 제주니로 감염된 대상체를 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 대상체에게 씨. 제주니에 대해 효과적인 항생제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 대상체가 닭, 소 및 양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가축 동물인 방법.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 대상체가 인간인 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편, 및 부형제를 포함하는, 씨. 제주니 감염 치료에 사용하기 위한 제제.
  31. 씨. 제주니 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 씨. 제주니 감염을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편의 용도.
  32. 씨. 제주니 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 씨. 제주니 감염을 치료하기 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편의 용도.
  33. 샘플을 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계, 및 결합된 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중의 씨. 제주니를 검출하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 샘플이 체액 또는 배설물을 포함하는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 샘플이 식품 제품 또는 식품 제품으로부터의 표면 스웝을 포함하는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편 및 씨. 제주니 검출에 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 제33항의 방법을 수행하기 위한 키트.
  37. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편 및 적합한 담체를 포함하는, 샘플 중의 씨. 제주니를 검출하기 위한 검출 시약.
  38. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 포함하는 단리된 항-씨. 제주니 항체.
KR1020157013633A 2012-10-24 2013-10-24 항―캄필로박터 제주니 항체 및 그의 용도 KR20150073211A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261718062P 2012-10-24 2012-10-24
US61/718,062 2012-10-24
PCT/CA2013/050806 WO2014063253A1 (en) 2012-10-24 2013-10-24 Anti-campylobacter jejuni antibodies and uses therefor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150073211A true KR20150073211A (ko) 2015-06-30

Family

ID=50543821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157013633A KR20150073211A (ko) 2012-10-24 2013-10-24 항―캄필로박터 제주니 항체 및 그의 용도

Country Status (12)

Country Link
US (2) US9926363B2 (ko)
EP (1) EP2912059B1 (ko)
JP (1) JP2015535224A (ko)
KR (1) KR20150073211A (ko)
CN (1) CN104870472A (ko)
AU (1) AU2013334451A1 (ko)
BR (1) BR112015009306A2 (ko)
CA (1) CA2889398C (ko)
IN (1) IN2015DN04087A (ko)
MX (1) MX2015005304A (ko)
PH (1) PH12015500929A1 (ko)
WO (1) WO2014063253A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017199094A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Novobind Livestock Therapeutics Inc. Antibodies against microorganisms and uses thereof
CN112867541A (zh) * 2018-07-17 2021-05-28 胡默波斯生物医学公司 针对弯曲杆菌物种的抗体
CN110743009B (zh) * 2019-09-30 2023-08-01 广州医科大学附属第一医院 鞭毛蛋白抗体在制备防治泌尿系结石及肾损伤的药物中的应用
WO2023044158A1 (en) * 2021-09-20 2023-03-23 Biomedit, Llc Multivalent anti-campylobacter antibodies and vaccine
WO2023112965A1 (ja) * 2021-12-15 2023-06-22 学校法人帝京平成大学 Ｖｈｈ抗体

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
EP1291360A1 (en) 1991-12-13 2003-03-12 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
AU3458299A (en) 1998-03-31 1999-10-18 United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture, The Monoclonal antibodies against (campylobacter jejuni) and (campylobacter coli) outer membrane antigens
BR0214621A (pt) 2001-11-30 2004-10-13 Ca Nat Research Council Moléculas de automontagem
US8173130B2 (en) 2007-09-05 2012-05-08 Inotek Pharmaceuticals Corporation Antibodies against flagellin and uses thereof
US20100239583A1 (en) 2009-03-04 2010-09-23 Inotek Pharmaceuticals Corporation Antibodies against flagellin and uses thereof
EA201391086A1 (ru) * 2011-01-28 2014-01-30 Нэшнл Рисеч Каунсил Оф Канада Конструирование иммуноглобулиновых доменов

Also Published As

Publication number Publication date
EP2912059B1 (en) 2019-08-14
AU2013334451A1 (en) 2015-06-04
CA2889398A1 (en) 2014-05-01
US20150307597A1 (en) 2015-10-29
CN104870472A (zh) 2015-08-26
WO2014063253A1 (en) 2014-05-01
BR112015009306A2 (pt) 2017-08-22
JP2015535224A (ja) 2015-12-10
EP2912059A1 (en) 2015-09-02
US10259864B2 (en) 2019-04-16
IN2015DN04087A (ko) 2015-10-09
CA2889398C (en) 2023-08-01
EP2912059A4 (en) 2016-09-28
US20180142000A1 (en) 2018-05-24
US9926363B2 (en) 2018-03-27
MX2015005304A (es) 2016-04-04
PH12015500929A1 (en) 2015-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10259864B2 (en) Anti-campylobacter jejuni antibodies and uses therefor
JP5911821B2 (ja) 受容体チロシンキナーゼａｌｋの細胞外ドメインに結合する抗体
JP7041628B2 (ja) リポ多糖に特異的に結合する抗体分子－薬物コンジュゲートおよびその使用
Riazi et al. Pentavalent single-domain antibodies reduce Campylobacter jejuni motility and colonization in chickens
CN102549013B (zh) 针对金黄色葡萄球菌衍生的α-毒素的人单克隆抗体及其在治疗或预防脓肿形成中的用途
CA2434762A1 (en) Monoclonal antibodies to the clfa protein and method of use in treating or preventing infections
MX2008014978A (es) Moleculas de union humanas que tienen actividad exterminadora contra enterococos y staphylococcus aureus y usos de las mismas.
JP2017502002A (ja) 抗ブドウ球菌剤の食細胞送達用組成物及び方法
CN110431150A (zh) 抗体分子-药物偶联物及其用途
CN105025926B (zh) 针对艰难梭菌的抗体
JP2008179634A (ja) グラム陽性細菌のリポタイコ酸に特異的なオプソニン性モノクローナルおよびキメラ抗体
CA2525291A1 (en) P. aeruginosa mucoid exopolysaccharide specific binding peptides
US20200040067A1 (en) Anti-salmonella antibodies and uses thereof
CN101014621A (zh) 细菌感染的治疗
EP3180024B1 (en) Anti-ospa antibodies and methods of use
ARBABI-GHAHROUDI et al. Patent 2889398 Summary
Raynes Structural and Immunological analysis of the T antigen: a vaccine candidate for Streptococcus pyogenes
Riazi et al. Pentavalent Single Domain Antibodies Reduce Campylobacter jejuni Motility and
Nazari Shirvan Molecular analysis of surface proteins of Clostridium difficile

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid