JP5911821B2 - 受容体チロシンキナーゼａｌｋの細胞外ドメインに結合する抗体 - Google Patents

Description

関連情報
本出願は、２００６年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／７９５，８３１号に優先権を請求し、該出願の全内容は本明細書に援用される。

本明細書全体で引用されるいかなる特許、特許出願、および参考文献の内容も、その全体が本明細書に援用される。
技術分野
本発明は、ヒトＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）に特異的な抗体、特にｓｃＦｖ、該抗体をコードする核酸配列、その産生、および薬剤としてのまたは診断目的のためのその使用に関する。前記抗体は、腫瘍または癌、特に神経膠芽腫の局所治療に適している。

背景技術
ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ； ＣＤ２４６）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーのメンバーである。このファミリーの典型的なメンバーとして、該キナーゼは、３つのドメイン：１つのＬＤＬ受容体クラスＡドメインおよび２つのＭＡＭドメイン（ＭＡＭ：メプリン、Ａ５抗原、タンパク質チロシンホスファターゼμ）を含有する細胞外リガンド結合性ドメイン（ａａ１９〜１０３８）、膜貫通ドメイン（ａａ１０３９〜１０５９）、ならびにチロシンキナーゼドメインを含有する細胞質ドメイン（ａａ１０６０〜１６２０）から本質的になる、Ｉ型膜貫通タンパク質である。シグナルペプチドは、新生タンパク質のＮ末端に存在し（ａａ１〜１８）、分泌に際して切断される。

全長ヒトおよびマウスＡＬＫは、２つの独立のグループによって、１９９７年にクローニングされた（Ｉｗａｈａｒａ １９９７； Ｍｏｒｒｉｓ １９９７）。ＡＬＫは白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）と呼ばれるＲＴＫに非常に類似であり、そしてインスリン受容体スーパーファミリーに属する。ＡＬＫは、重複領域において、ＬＴＫと５７％のａａ同一性および７１％のａａ類似性を示す（Ｍｏｒｒｉｓ ２００１）。ＡＬＫは非常にＮグリコシル化され、そして２１の推定上のＮグリコシル化部位を含有する。アミノ酸６８７〜１０３４は、ＬＴＫに有意な類似性（５０％のａａ同一性）を有する。しかし、Ｎ末端近位６８６ａａ配列は、ＬＤＬ受容体にも見られる非常に短い配列を例外として、いかなる既知のタンパク質にも相同性をまったく示さない（Ｄｕｙｓｔｅｒ ２００１／ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）。さらに、ＡＬＫは、ａａ２６４〜４２７およびａａ４７８〜６３６に２つのＭＡＭドメインを含有する（メプリン、Ａ５抗原、タンパク質チロシンホスファターゼμ）。これらのドメインは、細胞間相互作用に関連づけられる多様な接着性タンパク質の間に広く行き渡っているため、該ドメインは接着機能を有すると考えられる（Ｄｅ
Ｊｕａｎ ２００２）。さらに、アミノ酸３９６〜４０６に対応する、ＡＬＫの推定上のリガンドの結合性部位がある（Ｓｔｏｉｃａ ２００１；以下を参照されたい）。ネズミＡＬＫのキナーゼドメインのアミノ酸配列は、ヒトＡＬＫに９８％のａａ同一性、マウスＬＴＫに７８％の同一性、マウスｒｏｓに５２％、ヒト・インスリン様増殖因子受容体に４７％、そしてヒト・インスリン受容体に４６％の同一性を示す（Ｉｗａｈａｒａ １９９７； Ｌａｄａｎｙｉ ２０００）。ＡＬＫのスプライス変異体は、現在まで記載されてきていない。しかし、ＡＬＫはしばしば、染色体転位置と関連づけられる（以下を参照されたい）。

ＡＬＫ遺伝子は、約３１５ｋｂに渡り、そして２６エクソンを有する。該遺伝子の大部分は、約１７０ｋｂに渡る２つの巨大イントロンからなる。ＡＬＫ転写物は、長さ６．５
ｋｂである（Ｋｕｔｏｋ ２００２）。Ｍｏｒｒｉｓによると、ｃＤＮＡは６２２６ｂｐに渡る（Ｍｏｒｒｉｓ ２００１）。

マウスにおけるＡＬＫ発現は、発生段階Ｅ１１前後の胚形成中に開始し、そして発生の新生児期において持続し、この際、神経系で発現される。成体においては、生理学的発現は、低レベルで、ＣＮＳの特定の神経（神経細胞およびグリア細胞、ならびにおそらく内皮細胞）領域に限定される（Ｍｏｒｒｉｓ １９９７； Ｄｕｙｓｔｅｒ ２００１； Ｓｔｏｉｃａ ２００１）。実際、ＡＬＫの存在量は出生後の期間に減少する（Ｍｏｒｒｉｓ ２００１）。その発現パターンに基づいて、脳発生において受容体が役割を果たすことが示唆されている（Ｄｕｙｓｔｅｒ ２００１）。ＡＬＫの発現が神経に限定されることから、ＡＬＫが神経栄養因子の受容体として働くことが示唆される（以後を参照されたい）。これと一致して、ＡＬＫの発現パターンは、ニューロトロフィン受容体のＴＲＫファミリーをコードする遺伝子と重なる（Ｍｏｒｒｉｓ ２００１）。しかし、ＡＬＫノックアウトマウスは、いかなる明らかな表現型も示さず（未公表データ）、これはＴＲＫファミリーメンバーまたは他のニューロトロフィン受容体との何らかの機能的冗長性のためである可能性もある。特に、造血組織は、ＡＬＫの検出可能な発現をまったく示さない（以後を参照されたい）（Ｍｏｒｒｉｓ ２００１）。

ＡＬＫの２つの潜在的なリガンド、「プレイオトロフィン」（ＰＴＮ）および「ミッドカイン」（ＭＫ）が、近年、記載されている（Ｓｔｏｉｃａ ２００１； Ｄｕｙｓｔｅｒ ２００１； Ｓｔｏｉｃａ ２０００）。精製ヒト・プレイオトロフィンタンパク質を用いて、ファージディスプレイペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、ＰＴＮ−ＡＬＫ相互作用が同定された。この方法によって、細胞外ドメインに存在するＡＬＫの配列（ａａ ３９６〜４０６）が同定された。重要なことに、この配列は、ＡＬＫに最も緊密に関連するＲＴＫであるＬＴＫとは共有されない。このリガンド結合性領域はまた、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）におけるＡＬＫの潜在的な相同体でも保存されている（Ｌｏｒｅｎ ２００１）。ＡＬＫは、ＰＴＮ結合に際して、迅速にリン酸化される（Ｂｏｗｄｅｎ ２００２）。さらに、ＡＬＫは、細胞培養において、プレイオトロフィンによって刺激されることが示されてきている。このことから、プレイオトロフィンが有する病理学的関与を踏まえると、プレイオトロフィン／ＡＬＫ相互作用は、特に興味深いものとなる（Ｓｔｏｉｃａ ２００１）。ＡＬＫ発現を欠く細胞株はまた、プレイオトロフィンに対する増殖応答を示すことができず、そして逆もまた当てはまる（Ｓｔｏｉｃａ ２００１）。ｉｎ ｖｉｖｏでは、多様な固形腫瘍を患う患者血清において、プレイオトロフィンレベルが上昇していることが立証されてきており、そして動物研究によって、プレイオトロフィンが腫瘍増殖に寄与することが示唆されてきている（Ｓｔｏｉｃａ ２００１）。腫瘍増殖における律速血管新生因子としてのＰＴＮの役割が動物モデルにおいてよく確立されている（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｉ １９９７）。１９９６年、Ｃｚｕｂａｙｋｏら（Ｃｚｕｂａｙｋｏ １９９６）は、リボザイム・ターゲティング・アプローチを用いてＰＴＮレベルを調節することによって、腫瘍血管新生、アポトーシス防止および転移において、ＰＴＮが重要であることを立証した。マウスにおけるＰＴＮの血清レベル測定は、腫瘍サイズと明らかな相関を示した。ＰＴＮは、黒色腫および膵臓癌などの最も侵襲性が高いヒト癌タイプのいくつかで、重要な役割を果たし、したがって、ＡＬＫ阻害剤の潜在的なさらなる適用に関して、興味深い観点を提供する（Ｗｅｂｅｒ ２０００； Ｓｔｏｉｃａ ２００１）。ヒト患者において、膵臓癌（ｎ＝４１； Ｐ＜．０００１）および結腸癌（ｎ＝６５； Ｐ＝．００７９）患者で、血清プレイオトロフィンレベルの上昇が見られた。健康な個体において、ＰＴＮは、周産期臓器発生中に、そして成体中のニューロンおよびグリアの選択された集団において、非常に制御された方式で発現される。

いくつかの癌細胞株に見られるように、ＰＴＮおよびＡＬＫの同時発現によって、これ
らが増殖刺激の自己分泌ループを形成可能であることが示される（Ｓｔｏｉｃａ ２００１）。これらのデータすべてにも関わらず、文献によれば、ＰＴＮの効果がＡＬＫのみによっておよび／または他の同定されていないＰＴＮ受容体によって仲介されるのか、未だ明らかでない（Ｄｕｙｓｔｅｒ ２００１）。ＰＴＮの少なくとも２つの他の潜在的な受容体が示唆されてきている：受容体チロシンホスファターゼＲＰＴＰβおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンＮ−シンデカン。しかし、ＲＰＴＰβは、ＰＴＮ／ＡＬＫシグナル伝達のシグナル伝達調節剤として、そしてＮ−シンデカンはリガンドのシャペロンとして、作用する可能性もある（Ｂｏｗｄｅｎ ２００２）。

近年、ミッドカイン（ＭＫ）と呼ばれる、プレイオトロフィンに関連する別の分泌増殖因子が、ＡＬＫの第二のリガンドとして同定されてきた。ＰＴＮ同様、ＡＬＫ−ＥＣＤに対して作製された同じ抗体によって、ＭＫの結合および活性化機能（例えば細胞培養における軟寒天コロニー形成の誘導）を遮断可能である（Ｓｔｏｉｃａ ２００１）。プレイオトロフィン同様、ミッドカインは多くの腫瘍で上方制御されているが、成体正常組織においては、その生理学的発現は非常に制限されている（Ｓｔｏｉｃａ ２００２）。４７の膀胱腫瘍試料を分析すると、正常膀胱組織と比較して、ＭＫ発現が有意に（約４倍）増進していることが明らかになった。さらに、顕著な過剰発現は、劣った患者生存と相関する（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ １９９６）。

しかし、ＡＬＫに対するＭＫのアフィニティーは、プレイオトロフィンのものより約５倍低い（Ｓｔｏｉｃａ ２００２）。興味深いことに、プレイオトロフィン同様、リボザイムを介したＡＬＫの阻害はまた、細胞培養において、ＭＫの効果を阻害する（Ｓｔｏｉｃａ ２００２）。これらの研究の著者らはまた、そのうちいくつかは、例えば神経膠芽腫および膵臓癌などの、これまで非常に限定された治療オプションしか持たない、多様な疾患の治療に、ＰＴＫ／ＭＫ／ＡＬＫ経路の阻害が、非常に魅力的な可能性を開くと結論づけている（Ｓｔｏｉｃａ ２００２）。

健康な個体において、ＡＬＫ ｍＲＮＡ発現は、新生児期中にピークに到達し、そして神経系のいくつかの選択される部分において、成体で持続する。近年、ＡＬＫタンパク質の発現はまた、神経細胞およびグリア細胞に関連する内皮細胞においても検出された。プレイオトロフィンに関して記載される悪性活性の少なくとも一部が、ＡＬＫを通じて仲介される証拠は、リボザイム・ターゲティング・アプローチによってＡＬＫ発現が枯渇した実験から得られた。こうしたＡＬＫ枯渇は、プレイオトロフィンが刺激する抗アポトーシスタンパク質Ａｋｔのリン酸化を防止し、そして異種移植片を移植されたマウスの生存の延長を導いた。実際、ＡＬＫ発現を枯渇させると、腫瘍移植片中のアポトーシス細胞の数は、有意に増加した（Ｐｏｗｅｒｓ ２００２）。

ＭＫに関して記載される悪性活性が、ＡＬＫを通じて仲介される証拠は、ＡＬＫ ＥＣＤに対して向けられるモノクローナル抗体を用いた実験から得られた。２つの抗ＡＬＫ ＥＣＤ抗体由来のハイブリドーマ細胞上清の１：２５希釈を添加すると、軟寒天中のＳＷ−１３細胞のコロニー形成が有意に減少する（Ｓｔｏｉｃａ ２００２）。１０の異なる細胞株を分析すると、ＰＴＮに対する増殖応答に関する能力は、ＡＬＫ ｍＲＮＡの発現と完全に相関することが明らかになった（以下の細胞株がＰＴＮに応答し、そしてＡＬＫ
ｍＲＮＡを発現することが見いだされた： ＨＵＶＥＣ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＳＷ−１３、Ｃｏｌｏ３５７、ＭＥ−１８０、Ｕ８７、ＭＤ−ＭＢ ２３１； Ｓｔｏｉｃａ ２００１）。興味深いことに、いくつかの癌細胞株（Ｃｏｌｏ３５７膵臓癌、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌およびＵ８７神経膠芽腫）において、ＰＴＮおよびＡＬＫは同時発現されており、これによって、ＰＴＮおよびＡＬＫが増殖刺激の自己分泌ループを形成することが示される（Ｓｔｏｉｃａ ２００１）。

興味深いことに、ＰＴＮおよびＭＫはどちらも、抗アポトーシスｂｃｌ−２タンパク質の転写上方制御を引き起こすことが示されてきている（Ｓｔｏｉｃａ ２００２）。さらに、活性化されたＡｋｔ（異常なＡＬＫシグナル伝達の決定的な下流ターゲット）は、ｂａｄと呼ばれるアポトーシス促進性因子をリン酸化し、こうしてｂｃｌ−ｘ１からの解離を導き、ｂｃｌ−ｘ１は、ｂａｄから解放されると、チトクロムｃの遊離を遮断することによって、アポトーシスを抑制可能である（参考文献として、Ｂｏｗｄｅｎ ２００２を参照されたい）。

ＡＬＫの異常な発現は、いくつかの癌の発展に関与する可能性もある。しかし、これはまず、非常に悪性の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）のサブグループ、いわゆる未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）と関連づけられた。非ホジキンリンパ腫は、リンパ系起源の多様な細胞から生じるクローン性新生組織形成に相当する。

ＡＬＣＬの原発性全身性臨床的サブタイプの患者の大部分は、ｔ２，５転位置を有し、ＡＬＫのＣ末端にヌクレオフォスミン（ＮＰＭ）のＮ末端を連結する融合タンパク質を発現している。融合体は、ＡＬＫのａａ １０５８〜１６２０に融合したＮＰＭのａａ １〜１１７からなり、そして染色体切断は、ＡＬＫのＴＭおよび膜近接ドメインをコードするエクソン間に位置するイントロン中に位置する（Ｄｕｙｓｔｅｒ ２００１）。ＮＰＭ−ＡＬＫは、６８０ａａタンパク質をコードする２０４０ｂｐのＯＲＦを含有する転写物である（Ｍｏｒｒｉｓ ２００１）。これは、９１１ｂｐに渡るＮＰＭのイントロン４および２０９４ｂｐに渡るＡＬＫのイントロン１６における切断に対応する（Ｋｕｔｏｋ ２００２）。この融合タンパク質中のＡＬＫ配列がＡＬＣＬを導くタンパク質に必要な最小配列である可能性が最も高い（Ｄｕｙｓｔｅｒ ２００１）。逆融合体（ＡＬＫ−ＮＰＭ）は、少なくともリンパ系細胞では発現されない（Ｋｕｔｏｋ ２００２）。野生型ＮＰＭタンパク質は、偏在性の発現を示し、そして細胞質から核内へのタンパク質のキャリアーとして機能する。実際、ＮＰＭは、ＮＬＳを含有する、第５番染色体上にコードされる３８ｋＤａ核タンパク質であり、核タンパク質に結合し、そして細胞質／核輸送に関与する（Ｄｕｙｓｔｅｒ ２００１）。ＮＰＭは、最も豊富な核タンパク質の１つであり、そして通常、六量体として存在する（Ｍｏｒｒｉｓ ２００１）。最も重要なことに、ＮＰＭは、通常、自己オリゴマー化（六量体）ならびにＮＰＭ−ＡＬＫを伴うヘテロオリゴマー化を経る（Ｄｕｙｓｔｅｒ ２００１）。２；５転位置は、第２番染色体上のチロシンキナーゼをコードするＡＬＫ遺伝子部分を、第５番染色体上の強いＮＰＭプロモーターの制御下に置き、キメラＮＰＭ−ＡＬＫタンパク質（ｐ８０）の永続的な発現を生じる（Ｄｕｙｓｔｅｒ ２００１）。したがって、ＡＬＫキナーゼは、制御解除され、そして細胞タイプ（リンパ系）および細胞区画（核／仁および細胞質）の両方の意味で異所性である（Ｌａｄａｎｙｉ ２０００）。ＮＰＭの局在（細胞質または核）は、リンパ腫形成に対する効果に影響を及ぼさないようである（Ｄｕｙｓｔｅｒ ２００１）。生じた異常なチロシンキナーゼ活性は、細胞内ターゲットの恒常的なリン酸化を介して、悪性形質転換を誘発する。多様な他のより一般的でないＡＬＫ融合タンパク質がＡＬＣＬに関連する。すべての変異体は、ＡＬＫチロシンキナーゼドメインの発現を制御する別のプロモーターへの該ドメインの連結を示す。

全長ＡＬＫは、原発性神経芽細胞腫細胞の約９２％で、そしていくつかの横紋筋肉腫でもまた発現されることが報告されてきている（Ｌａｍａｎｔ ２０００）。しかし、ＡＬＫ発現および腫瘍生物学の間の相関はこれまでのところ立証されてきていない。この事実は、これらの腫瘍においてＡＬＫが有意なレベルで内因性にリン酸化されている証拠がないことと併せて、神経芽細胞腫におけるＡＬＫ発現が、主要な発癌上の役割を反映するというよりも、未成熟な神経細胞におけるＡＬＫの通常の発現を反映し、そしてこれらの腫瘍においてはＡＬＫは恒常的にはリン酸化されておらず、したがってこれらの腫瘍においてＡＬＫが重要な役割を果たしているかどうかは疑問であることを示唆する（Ｄｕｙｓｔ
ｅｒ ２００１； Ｐｕｌｆｏｒｄ ２００１）。にもかかわらず、神経芽細胞腫由来細胞株における、遺伝子増幅によるＡＬＫの過剰発現および恒常的リン酸化を発見したＭｉｙａｋｅらによって示唆されるように、ＡＬＫシグナル伝達は、少なくともいくつかの神経芽細胞腫においては重要である可能性もある（Ｍｉｙａｋｅ ２００２）。しかし、他の神経芽細胞腫由来細胞株は、ＡＬＫの恒常的活性化を示さず、したがってＡＬＫの一般的な病理学的関与には相反する（Ｄｉｒｋｓ ２００２； Ｐｕｌｆｏｒｄ ２００４）。

最も興味深いことに、ＡＬＫは、非常に限定された療法オプションしか提供しない非常に悪性の脳腫瘍である多形性膠芽腫の増殖に重要であるようである（Ｐｏｗｅｒｓ ２００２）。これらの破壊的な腫瘍においては、多数の遺伝子改変が起こることが示されてきており、これにはＰＴＥＮ、ｐ５３およびＩＮＫ４ａ−ＡＲＦの喪失または突然変異が含まれる。さらに、ＲＴＫシグナル伝達は、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦおよびＶＥＧＦなどの多様な増殖因子を過剰発現する、これらの腫瘍の増殖および発展に特に重要な役割を果たし、このことから自己分泌ＲＴＫシグナル伝達ループが示唆される。Ｐｏｗｅｒｓおよび同僚らは、神経膠芽腫患者腫瘍試料における、ＡＬＫのｍＲＮＡおよびタンパク質発現を示したが、正常の隣接脳組織ではシグナルは検出不能であった（Ｐｏｗｅｒｓ ２００２）。さらに、ヒトＵ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞（患者に由来し、そして神経膠芽腫における腫瘍形成およびシグナル伝達を研究するための、よく性質決定されたモデル系に相当する）は、異種移植片研究において、ＡＬＫに依存性の抗アポトーシス的な振る舞いを示す。リボザイムの使用によって、これらの腫瘍細胞においてＡＬＫが枯渇すると、これらの腫瘍細胞を注射されたマウスは、野生型腫瘍細胞を注射された場合の少なくとも２倍長期間生存し、そしてこれらの腫瘍細胞は、アポトーシスの劇的な増加を示す。したがって、ＡＬＫおよびそのリガンド（単数または複数）は、ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｕ８７ＭＧ細胞の腫瘍増殖に関して律速である、本質的な生存シグナルを提供する。これらの発見は、ＡＬＫシグナル伝達の阻害が、神経膠芽腫患者の平均余命を改善する有望なアプローチでありうることを示す。

多形性膠芽腫は、群を抜いて最も一般的であり、そして悪性である原発性グリア腫瘍であり、罹患率は約２／１００，０００／年である（年あたり、米国および西ヨーロッパにおいて、約１５，０００症例）。該疾患は、優先的に大脳半球に影響を及ぼすが、脳幹（主に小児）または脊髄にも影響を及ぼしうる。腫瘍は、新規に現れることもありうる（原発性神経膠芽腫）し、またはより低いグレードの星状神経腫から発展することもありうる（続発性神経膠芽腫）。原発性および続発性神経膠芽腫は、分子重複をほとんど示さず、そして分子レベルで異なる疾患実体を構成する。これらはどちらも、ｐ５３、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＰＤＧＦ、ＰＴＥＮ、ｐ１６、ＲＢの関与を含む、多くの遺伝子異常を含有する。

最近２５年間で、大きな療法進歩は起こっていない。療法は、対症療法的でしかなく、そして平均余命を３ヶ月〜１年間延長させうる。患者は通常、緩慢な進行性神経学的欠陥、例えば運動麻痺、頭蓋内圧症候群、例えば頭痛、吐き気、嘔吐、認知障害、または癲癇を示す。人格の変化もまた、初期徴候でありうる。神経膠芽腫の病因は未知であり、家族性の症例は１％未満に相当する。同定されている唯一の一貫したリスク要因は、石油化学製品への曝露である。診断は主に、画像研究（ＣＴ、ＮＭＲ）および生検によって行われる。大部分の神経膠芽腫は明らかに明示される縁を持たないため、これらの腫瘍を完全に病期決定するのは、実際的でなくまた可能でもない。むしろ、これらは、局所に浸潤し、そして緻密な白質経路に沿って広がる、よく知られる傾向を示す。治癒的な治療が不可能である主な理由は、腫瘍が診断された際には、局所の制御が到達する範囲を超えているためである。主な化学療法剤はカルムスチン（アルキル化剤）およびシスプラチンであるが、何らかの応答を示すのは患者の４０％でしかない。

神経膠芽腫におけるＡＬＫの役割に関してはかなりの不確実性があるが、この疾患は、ＡＬＫに向けられる薬剤に関して多様なアプローチを提供する。実際、この破壊的な疾患に関しては、現在の療法オプションのわずかな改善であってさえ、大きな医学的ニーズを提供するであろう。神経膠芽腫細胞は、全長ＡＬＫを発現するため、この癌を治療するためには、ＡＬＫは、小分子キナーゼ阻害剤だけでなく、抗体および／またはｓｃＦｖなどの抗体断片のターゲットとも見なされ、すなわち腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することも可能であることに注目することが重要である。神経膠芽腫はＣＮＳに厳密に局在しているため、ｓｃＦｖをＣＮＳに効率的に送達可能であるならば、ｓｃＦｖの使用が支持される（区画化されるため、迅速なクリアランスは起こらないが、サイズがより小さいため、ＩｇＧに比較して腫瘍浸透がより優れている）。抗体および／または抗体断片は、ＡＬＫのリガンド結合性配列（ａａ ３９６〜４０６）に対して、または受容体の細胞外部分の他の部分に対して向けられていてもよい。

生理学的条件下で、健康な組織においてはＡＬＫの発現が非常に制限されていることは、ＡＬＫがこれらの腫瘍の病因に関与しているかどうかに関わらず、ＡＬＫを発現している腫瘍が、放射性または毒素標識抗体および／または抗体断片を用いて疾患を治療するために優れたターゲットでありうることを示す。神経膠芽腫細胞に加えて、ＡＬＫ発現は、黒色腫細胞株および乳癌細胞株で非常に有意に見いだされている（恒常的にリン酸化されてはいない）（Ｄｉｒｋｓ ２００２）。ＡＬＫの細胞外ドメインの大部分は、ヒト・プロテオーム中でかなりユニークであるようである事実から、このアプローチは非常に特異的であるはずである。

ＷＯ９５１５３３１／ＵＳ５５２９９２５は、ヒトｔ（２；５）リンパ腫において起こるｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）染色体転位置事象において再編成される、ヒト核酸配列のクローニングおよび配列決定を開示する。再編成は、染色体５ｑ３５上の仁リンタンパク質遺伝子（ＮＰＭ遺伝子）由来の配列を、染色体２ｐ２３上の以前は同定されていなかったタンパク質チロシンキナーゼ遺伝子（以後、ＡＬＫ遺伝子）由来の配列にもたらすことが見いだされた。融合遺伝子および融合タンパク質の配列（それぞれ、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合遺伝子またはタンパク質）もまた開示された。

全長ＡＬＫ配列は、「ヒトＡＬＫタンパク質チロシンキナーゼ」と題されるＵＳ５７７０４２１に特許される。さらに、「ＡＬＫまたはＮＰＭ遺伝子における切断点を伴う染色体再編成の検出法」と題される特許ＵＳ６１７４６７４Ｂ１は、患者試料において、ＮＰＭ−ＡＬＫ融合配列を検出するためのプライマーを開示する。「ＡＬＫタンパク質チロシンキナーゼ／その受容体およびリガンド」と題される別の特許出願、ＵＳ６６９６５４８において、ＡＬＫリガンドおよびＡＬＫの特定の配列に結合する抗体を検出するためのＡＬＫの使用が開示される。該出願はまた、単離ＡＬＫポリペプチドに結合可能な剤を同定する方法も開示する。ＷＯ０１９６３９４／ＵＳ２００２００３４７６８は、プレイオトロフィンの受容体としてのＡＬＫを開示する。ＵＳ２００４０２３４５１９は抗プレイオトロフィン抗体を開示し、そしてＷＯ２００６０２０６８４はプレイオトロフィンの検出を記載する。

発明の開示
したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでヒトＡＬＫタンパク質に結合する、安定でそして可溶性である抗体または抗体誘導体を提供することが本発明の一般的な目的である。最も好ましくは、抗体はＡＬＫのリガンド結合性ドメイン（アミノ酸３９６〜４０６）に対して特異的にターゲティングされ、そしてしたがって、ＡＬＫに対して約１７０ｐＭのＫｄを有するＭＫの生物学的効果、ならびにＡＬＫに対して約２０〜３０ｐ
ＭのＫｄを有するＰＴＮの生物学的効果の両方を遮断するであろう（Ｓｔｏｉｃａ ２００２； Ｓｔｏｉｃａ ２００１）。好ましい態様において、前記抗体または抗体断片は、ｓｃＦｖ抗体またはＦａｂ断片である。以下において、用語、抗体は、全長抗体ならびに他の抗体誘導体を含む。

ここで、本発明のこれらの目的、および説明が進むにつれてより容易に明らかになるであろうさらなる目的を実行するため、前記抗体は、配列番号２の配列に少なくとも５０％の同一性を持つ配列の可変重鎖ＣＤＲ３を含むという特徴によって明らかになる。好ましくは、配列同一性は、少なくとも６０％、６５％、７５％、８５％、またはより好ましくは少なくとも９２％である。最も好ましくは、前記抗体は、配列番号２の配列のＶＨ ＣＤＲ３を有する。

１つの態様において、本発明の抗体またはその抗原結合性部分は、ＡＬＫタンパク質の特定のエピトープに特異的に結合する。こうしたエピトープは、例えば、ＡＬＫタンパク質のアミノ酸１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜１１００、１１００〜１２００、１２００〜１３００、１３００〜１４００、１４００〜１５００、または１５００〜１６２０、あるいはその任意の区間、部分または範囲内に存在する。１つの態様において、抗体またはその抗原結合性部分は、ＡＬＫタンパク質（配列番号１）のアミノ酸残基３９１±３および４０６±３（配列番号９１は、ヒトＡＬＫタンパク質のアミノ酸残基３８８〜４０９を示す）、好ましくはアミノ酸３９１〜４０６（配列番号１）に渡る領域を含むか、該領域から本質的になるか、または該領域の断片であるエピトープに、特異的に結合する。示した範囲がはっきりした境界を有するとは見なされないものとし、抗体またはその抗原結合性部分が、ＡＬＫのリガンド結合性ドメイン近傍に位置するかまたはそのドメイン内にある領域に結合するかまたは部分的に結合してもよいことが理解される。好ましくは、抗体または抗体誘導体は、長さ１０〜２０アミノ酸のＡＬＫタンパク質エピトープに結合する。

別の態様において、抗体またはその抗原結合性部分は、約１０ｘ１０^−６Ｍ未満のＫ_ＤでＡＬＫタンパク質に特異的に結合すると特徴付け可能である。特定の態様において、抗体またはその抗原結合性部分は、少なくとも約１０ｘ１０^−７Ｍ、少なくとも約１０ｘ１０^−８Ｍ、少なくとも約１０ｘ１０^−９Ｍ、少なくとも約１０ｘ１０^−１０Ｍ、少なくとも約１０ｘ１０^−１１Ｍ、または少なくとも約１０ｘ１０^−１２ＭのＫ_Ｄ、あるいはさらにより好ましいＫ_Ｄで、ＡＬＫタンパク質（またはその断片）に特異的に結合する。

多様な他の態様において、抗体またはその抗原結合性部分には、配列番号４に示すような可変重鎖領域アミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖領域が含まれる。

他の態様において、抗体またはその抗原結合性部分には、配列番号５に示すような可変軽鎖領域アミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域が含まれる。

さらに他の態様において、抗体またはその抗原結合性部分には、配列番号４に示すような可変重鎖領域アミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖領域、お
よび配列番号５に示すような可変軽鎖アミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域の両方が含まれる。

特定の他の態様において、抗体またはその抗原結合性部分は、ＥＳＢＡ５２１（配列番号１９）の抗体または抗体誘導体が結合するエピトープと重複するエピトープに特異的に結合し、そして／またはＥＳＢＡ５２１の抗体または抗体誘導体と、ＡＬＫタンパク質またはその一部への結合に関して競合する。関連する態様において、抗体またはその抗原結合性部分は、ＡＬＫタンパク質の残基３９１〜４０６（配列番号１）またはその一部を含むエピトープに特異的に結合する。

抗体またはその抗原結合性部分の可変重鎖および軽鎖領域には、典型的には、１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。これらには、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が含まれる。特定の態様において、可変重鎖ＣＤＲは、ＥＳＢＡ５２１抗体のＣＤＲに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより好ましくは１００％同一である。他の特定の態様において、可変軽鎖ＣＤＲは、ＥＳＢＡ５２１抗体の可変軽鎖領域のＣＤＲに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより好ましくは１００％同一である。

したがって、本発明の特定の抗体または断片は、ＥＳＢＡ５２１の可変重鎖領域のＣＤＲに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより好ましくは１００％同一である１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる可変重鎖領域、およびＥＳＢＡ５２１抗体の可変軽鎖領域のＣＤＲに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより好ましくは１００％同一である１以上のＣＤＲが含まれる可変軽鎖領域を含む。

抗体またはその抗原結合性部分の可変重鎖領域にはまた、ＥＳＢＡ５２１抗体の可変重鎖領域のＣＤＲに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより好ましくは１００％同一である３つのＣＤＲすべて、および／またはＥＳＢＡ５２１抗体の可変軽鎖領域のＣＤＲに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより好ましくは１００％同一である３つのＣＤＲすべても含まれてもよい。

本発明の別の態様において、抗体またはその抗原結合性部分には（ａ）ヒトＶＨ遺伝子（例えばＨ３型）にコードされるかまたは由来する（すなわちその産物である）重鎖可変領域が含まれ；そして／または（ｂ）ヒトＶカッパまたはラムダ遺伝子（例えばラムダ１型）にコードされるかまたは由来する軽鎖可変領域が含まれる。

本発明の抗体には、エフェクタードメイン（例えばＦｃドメイン）を含む、全長抗体、例えばモノクローナル抗体とともに、一本鎖抗体およびＦａｂ断片などの抗体部分または断片が含まれる。抗体はまた、多様な療法剤（例えば抗癌剤、化学療法剤、または毒素）および／または標識（例えば放射標識）に連結されていてもよい。

別の側面において、本発明は、配列番号２２に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはより好ましくは少なくとも９９％同一である抗体重鎖可変領域をコードする配列を含む単離核酸を特徴とする。本発明はまた、配列番号２１に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはより好ましくは少なくとも９９％同一である抗体軽鎖可変領域をコードする配列を含む単離核酸も特徴とする。

本発明はまた、単独でまたは組み合わせて（例えば１以上のベクターから発現される）のいずれかで、前述の核酸のいずれかを含む発現ベクター、ならびにこうした発現ベクターを含む宿主細胞も特徴とする。

本発明の抗体を発現するのに適した宿主細胞には、多様な真核細胞、例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、例えばチャイニーハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、骨髄腫細胞、または植物細胞が含まれる。本発明の分子はまた、原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）で発現されてもよい。

本発明はまた、宿主細胞において、抗体をコードする核酸を発現させることによって、抗体またはその抗原結合性部分を作製するための方法も特徴とする（例えば抗体の抗原結合性領域部分をコードする核酸）。さらに別の側面において、本発明は、前述の核酸を含むハイブリドーマまたはトランスフェクトーマを特徴とする。

別の態様において、本発明は、ＡＬＫタンパク質の、好ましくはＰＴＮリガンド結合性ドメインのエピトープ、より好ましくはアミノ酸残基３９１±３および４０６±３（ヒトＡＬＫタンパク質のアミノ酸残基３８８〜４０９を示す配列番号９１を参照されたい）、最も好ましくはアミノ酸３９１〜４０６（配列番号１）に渡る領域を含むか、該領域から本質的になる断片、または該領域の断片を含む抗原を提供する。抗ＡＬＫ抗体を作製するか、スクリーニングするか、または該抗体の存在を検出するために抗原を用いてもよいし、あるいは能動免疫療法における剤として、すなわちワクチンとして用いてもよい。

ワクチンとして、抗原を単独で、あるいは適切なアジュバントまたはハプテンと組み合わせて、例えば化学的にまたは遺伝子的にのいずれかで混合するかまたはコンジュゲート化してもよい。また、能動免疫療法に用いた場合、例えば本明細書に開示する抗ＡＬＫ抗体のいずれかを用いた受動免疫療法と組み合わせて、あるいは抗ＡＬＫ抗体のモノクローナルまたはポリクローナル調製物、例えば血清陽性ドナー由来の血清ガンマグロブリンと組み合わせて、抗原を用いてもよい。

別の態様において、抗体分子（またはＶＬおよびＶＨ結合性領域）は完全にヒトである。ヒト・モノクローナル抗体でヒトを治療すると、いくつかの利点が提供される。例えば、抗体は、非ヒト抗体よりも、ヒトにおいてより免疫原性でない可能性がある。抗体が癌部位（ＡＬＫが発現される箇所）に到達すると直ちにＡＬＫ不活性化が起こりうるため、療法はまた、迅速でもある。したがって、関連態様において、抗体は、ｓｃＦｖ抗体、すなわちＥＳＢＡ５２１、あるいはＥＳＢＡ５２１のＶＬおよび／またはＶＨ領域（単数または複数）（またはそのＣＤＲ；例えばＶＬ ＣＤＲ３（配列番号３）および／またはＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２））を含む抗体である。

ヒト抗体はまた、非ヒト抗体よりもより効率的に、ヒトにおいて適切な部位に局在する。さらに、治療はＡＬＫに特異的であり、組換え体であり、そして非常に精製され、そして伝統的な療法と異なって、外来性の病原体が混入する潜在的可能性を回避する。あるいは、本発明の抗体および抗体誘導体は、化学合成によって産生可能である。

別の態様において、本発明は、ミッドカイン（ＭＫ）および／またはプレイオトロフィン（ＰＴＮ）などのＡＬＫのリガンドと競合し、そしてそれによってこうしたリガンドが仲介するＡＬＫシグナル伝達を遮断することによって、被験体において、新生物を防止しうる、癌を治療するための組成物（またはこうして適合する薬剤の作製）を提供する。こうした組成物を、単独でまたは当該技術分野に認識される抗癌剤、例えばメトトレキサート等と組み合わせて投与してもよい。

本発明の抗体および／またはＡＬＫワクチンを単独で、または既知の療法剤、例えば抗癌剤、例えばメトトレキサート等と組み合わせて用いてもよい。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、そして請求項から明らかであ
ろう。

本発明は、以下の詳細な説明を考慮すると、よりよく理解され、そして上記のもの以外の目的が明らかになるであろう。こうした説明は、付属の図に言及する。
発明の詳細な説明
本発明がより容易に理解されうるように、特定の用語をまず定義する。

定義
用語「ＡＬＫ」および「Ａｌｋ−１」には、膜貫通タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）／受容体である、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）遺伝子にコードされるヒトＡＬＫタンパク質が含まれる。

用語「抗体」は、完全抗体およびその任意の抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合性部分」、「抗原結合性ポリペプチド」、または「免疫結合剤」）または一本鎖を指す。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合性部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、Ｖ_Ｈと略される）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、Ｖ_Ｌと略される）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域をさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域に分けてもよい。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の多様な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一構成要素（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介しうる。

用語、抗体の「抗原結合性部分」（または単に「抗体部分」）は、抗原（例えばＡＬＫ）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１以上の断片を指す。全長抗体の断片によって、抗体の抗原結合機能を実行可能であることが示されてきている。用語、抗体の「抗原結合性部分」内に含まれる結合性断片の例には、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）_２断片；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）Ｖ_Ｈドメインからなる一本鎖ドメインまたはｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら， （１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）場合によって合成リンカーによって連結されてもよい、２以上の単離ＣＤＲの組み合わせが含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、別個の遺伝子によってコードされるが、組換え法を用いて、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が対形成して一価分子を形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、これらを連結してもよい（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。こうした一本鎖抗体もまた、用語、抗体の「抗原結合性部分」内に含まれると意図される。当業者に知られる慣用的技術を用いてこれらの抗体断片を得て、そして損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体と同じ方式で、有用性に関して断片をスクリーニングする。組換えＤＮＡ技術によって、あるいは損なわれていない免疫グロブリンの酵素的または化学的切断によって、抗原結合性部分を産生してもよい。抗体は、異なるアイソタイプ、例えばＩｇＧ（例えば
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体のものであってもよい。

用語「フレームワーク」は、より多様なＣＤＲ領域間に存在する、抗体可変領域の当該技術分野に認識される部分を指す。こうしたフレームワーク領域は、典型的には、フレームワーク１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と称され、そしてＣＤＲが抗原結合性表面を形成しうるように、三次元空間中に、重鎖または軽鎖抗体可変領域中に見られる３つのＣＤＲを保持するための骨格を提供する。こうしたフレームワークはまた、より多様なＣＤＲの提示のための支持体を提供するため、骨格とも称されうる。アンキリン・リピートおよびフィブロネクチンなどの、免疫グロブリンスーパーファミリーの他のＣＤＲおよびフレームワークを、抗原結合性分子として用いてもよい（例えば、米国特許第６，３００，０６４号、６，８１５，５４０号、および米国公報第２００４０１３２０２８号もまた参照されたい）。

用語「エピトープ」または「抗原性決定基」は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位を指す（例えばＡＬＫ、例えばヒトＡＬＫ−１のアミノ酸残基３９１〜４０６（例えば配列番号１を参照されたい））。エピトープには、典型的には、ユニークな空間コンホメーションにある、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸が含まれる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６６， Ｇ．Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ監修（１９９６）を参照されたい。

用語「特異的結合性」、「選択的結合性」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」は、あらかじめ決定された抗原上のエピトープへの抗体結合を指す。典型的には、抗体は、およそ１０^−７Ｍ未満、例えば、およそ１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ未満あるいはそれよりさらに低い数値のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）で結合する。

用語「Ｋ_Ｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。典型的には、本発明の抗体は、例えばＢＩＡＣＯＲＥ装置において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて決定されるように、およそ１０^−７Ｍ未満、例えば、およそ１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ未満あるいはそれよりさらに低い解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）で、ＡＬＫに結合する。

用語「ＡＬＫを中和する」、「ＡＬＫを阻害する」、および「ＡＬＫを遮断する」は、交換可能に用いられ、ＡＬＫが１以上のターゲットリガンドと相互作用し、そして例えばシグナル伝達を誘発するのを、本発明の抗体が防止する能力を指す。

用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核酸配列と機能する関係に配置されている場合、「機能可能であるように連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼすならば、該配列に機能可能であるように連結されている。

核酸に関しては、用語「実質的相同性」は、２つの核酸、またはその示される配列が、最適に並列され、そして比較された際、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、ヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％、そしてより好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％で、同一であることを示す。あるいは、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、セグメントが鎖の相補体にハイブリダイズする場合、実質的相同性が存在する。こうしたハイブリダイゼーション条件は、当該技
術分野に知られ、そして例えばＳａｍｂｏｏｋら、下記に記載される。

２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列を最適に並列させるために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一位の数の関数である。以下の限定されない実施例に記載するように、数学的アルゴリズムを用いて、配列比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定を達成してもよい。

ＮＷＳｇａｐｄｎａ、ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ加重、および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用い、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを決定してもよい。また、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用い、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている、Ｅ． ＭｅｙｅｒｓおよびＷ． Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを用いて、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定してもよい。さらに、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ加重および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用い、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み入れられている、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを用いて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定してもよい。

さらに、本発明の核酸およびタンパク質配列を「クエリー配列」として用いて、公的データベースに対して検索を実行して、例えば関連配列を同定してもよい。Ａｌｔｓｃｈｕｕｌら（１９９０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて、こうした検索を実行してもよい。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２でＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実行して、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得てもよい。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を実行して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得てもよい。比較目的のためのギャップを挿入した並列を得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるようなギャップ化ＢＬＡＳＴを利用してもよい。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いてもよい。

本発明はまた、本発明の配列番号中に示される配列の「保存的配列修飾」、すなわち、該ヌクレオチド配列にコードされるかまたは該アミノ酸配列を含有する抗体の、抗原への結合を抑止しない、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾も含む。こうした保存的配列修飾には、ヌクレオチドおよびアミノ酸置換、付加および欠失が含まれる。例えば、当該技術分野に知られる標準的技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発によって、修飾を導入してもよい。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野において定義されてきている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖
を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、ヒト抗ＡＬＫ抗体中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。抗原結合を排除しない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法が当該技術分野に周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３２：１１８０−１１８７ （１９９３）； Ｋｏｂａｙａｓｈｉら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １２（１０）：８７９−８８４ （１９９９）；およびＢｕｒｋｓら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４１２−４１７ （１９９７）を参照されたい）。

あるいは、別の態様において、飽和突然変異誘発によるなどで、抗ＡＬＫ抗体コード配列のすべてまたは一部に渡って、突然変異をランダムに導入し、そして生じた修飾抗ＡＬＫ抗体を、結合活性に関してスクリーニングしてもよい。「コンセンサス配列」は、関連配列のファミリーにおいて、最も頻繁に存在するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列である（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ， Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ （Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７を参照されたい）。タンパク質ファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位は、該ファミリーにおいて、その位で最も頻繁に存在するアミノ酸によって占められる。２つのアミノ酸が等しく頻繁に存在する場合、コンセンサス配列中にどちらが含まれてもよい。

本明細書に提供する表および図を参照することにより、ヒトＡＬＫ−１タンパク質のエピトープ３９０〜４０６に対して反応性である抗体の可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列を最適に並列させることによって、抗体重鎖／軽鎖可変領域ＣＤＲ（単数または複数）のコンセンサス配列を得てもよい。

用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。１つの種類のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントを連結可能な環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に連結可能な、ウイルスベクターである。特定のベクターは、導入された宿主細胞中で、自律複製することが可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。宿主細胞内に導入した際に、宿主細胞ゲノム内に他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）を組み込んでもよく、そしてそれによって、宿主ゲノムと一緒に該ベクターが複製される。

用語「宿主細胞」は、発現ベクターが導入されている細胞を指す。宿主細胞には、細菌、微生物、植物または動物細胞が含まれてもよい。形質転換に感受性である細菌には、大腸菌またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の株などの腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）のメンバー、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）が含まれてもよい。適切な微生物には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。適切な動物宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣株）およびＮＳ０細胞が含まれる。

用語「治療する」、「治療すること」および「治療」は、本明細書記載の療法的または予防的手段を指す。「治療」法は、障害または再発障害の１以上の症状を防止するか、治癒させるか、遅延させるか、その重症度を減少させるか、または改善するための、あるいはこうした治療の非存在下で予期されるものを超えて、被験体の生存を延長するための、
こうした治療が必要な被験体、例えばＡＬＫが仲介する障害を有する被験体またはこうした障害を最終的に獲得しうる被験体への、本発明の抗体の投与を使用する。

用語「ＡＬＫが仲介する障害」は、ＡＬＫが仲介する癌または腫瘍と関連する疾患状態および／または症状を指す。一般的に、用語「ＡＬＫが仲介する障害」は、ＡＬＫの関与を要する、任意の障害、該障害の症状の開始、進行または持続を指す。ＡＬＫが仲介する典型的な障害には、限定されるわけではないが、例えば、癌、特に神経膠芽腫が含まれる。

用語「有効用量」または「有効投薬量」は、望ましい効果を達成するかまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。用語「療法的有効用量」は、疾患をすでに患っている患者において、疾患およびその合併症を治癒させるかまたは少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この使用に有効な量は、治療中の障害の重症度および患者自身の免疫系の全身状態に応じるであろう。

用語「被験体」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を指す。例えば、本発明の方法および組成物を用いて、癌、例えば神経膠芽腫の被験体を治療してもよい。
別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の一般の当業者に、一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書記載のものと類似であるかまたは同等である方法および材料を用いてもよいが、適切な方法および材料を以下に記載する。不一致の場合は、定義を含む本明細書が支配するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は例示のみであり、そして限定することを意図しない。

本発明の多様な側面を、以下のサブセクションにさらに詳細に記載する。多様な態様、優先度および範囲を任意に組み合わせてもよいことが理解される。さらに、特定の態様に応じて、選択される定義、態様または範囲は当てはまらない可能性もある。

本発明は、第一の側面において、ヒトＡＬＫタンパク質に結合する抗体であって、配列番号２の配列に少なくとも５０％の配列同一性を持つ配列の可変重鎖ＣＤＲ３を含む、前記抗体を提供する。好ましくは、配列同一性は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、またはより好ましくは少なくとも９０％である。最も好ましくは、ＣＤＲ３は、配列番号２の正確な配列を有する。

本発明の好ましい態様において、抗体は、ヒトＡＬＫタンパク質に特異的に結合し、すなわち、ヒトＡＬＫタンパク質のＰＴＮ結合性部位（配列番号１）に比較して、ＰＴＮ結合性部位が２アミノ酸残基しか異ならないマウスＡＬＫタンパク質には、結合しない。３位のヒト・イソロイシンは、対応するマウス配列において、バリンであり、そしてアスパラギン酸はアラニンである。

本発明の抗体は、全長抗体であってもよいが、また抗体断片であってもよく、例えばｓｃＦｖまたはＦａｂ断片であってもよい。抗原結合性断片は、当該技術分野に周知である。好ましくは、ｓｃＦｖ抗体を用いる。

重鎖および軽鎖は、各々、抗原結合に主に関与する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、フレームワーク配列で構成される。本発明の抗体は、Ｈ３型のＶＨドメインおよびラムダ１型のＶＬドメインを含む。

本発明の抗体のＶＨおよびＶＬフレームワークは、細胞内還元性環境において機能可能であるように、安定であり、そして可溶性である。好ましくは、フレームワークは、「品
質管理系」と称される酵母スクリーニング系によって以前単離されたフレームワーク４．４である（Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら ２００１； Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら ２００４）。フレームワーク部分が、下線がなくそしてまっすぐな文字によって示され、一方、ＣＤＲ配列が下線で示され、そしてリンカー配列が斜字体である、例えば配列番号２０（以下を参照されたい）から、フレームワークの配列を推定してもよい。

本発明の抗体は、配列番号１の配列に、少なくとも７５％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、または最も好ましくは１００％同一である配列の１６アミノ酸ＡＬＫエピトープペプチドに結合可能である。この配列はまた、ＰＴＮ結合性部位と称され、そして全ヒトゲノムにおいてユニークな配列である。対応するマウス配列は、１６アミノ酸のうち２つが異なり、すなわち、それぞれ、ＩまたはＤの代わりに、３位がＶ、そして７位がＡである。好ましくは、本発明の抗体は、マウスＡＬＫでなくヒトＡＬＫに結合し、すなわち、ヒトタンパク質に特異的である。ほぼ残基３９１〜４０６を含むかまたはこれらの残基からなるＡＬＫエピトープは、ＡＬＫに特異的に結合し、そしてＡＬＫが仲介する活性を遮断しうるかまたは阻害しうる抗体または抗原結合性断片を選択するのにユニークに適している。このエピトープはまた、ＡＬＫ活性を特異的に遮断する抗体をスクリーニングするかまたは作製するのにも適している。したがって、このエピトープ、特にほぼ残基３９１〜４０６を含むかまたはほぼこれらの残基からなるエピトープは、本明細書にさらに記載するような能動免疫療法剤またはワクチンとして使用するのにユニークに適している。

本発明の抗体は、３０ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは３ｎＭ未満のＫ_ｄでＡＬＫエピトープペプチドに対するアフィニティーを有する。
本発明の別の態様において、配列番号３の配列に、少なくとも５０％の配列同一性を持つ配列の可変軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体。好ましくは、配列同一性は、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、より好ましくは少なくとも９０％である。最も好ましくは、ＣＤＲ３は配列番号３と同一である。再び、この抗体は、配列番号１の配列に、少なくとも７５％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、または最も好ましくは１００％のアミノ酸同一性を持つ配列の１６アミノ酸ＡＬＫエピトープペプチドに結合する。また、抗体は、１０ｎＭ未満、好ましくは７ｎＭ未満のＫ_ｄの、ＡＬＫエピトープペプチドに対するアフィニティーを有する。

本発明の好ましい態様において、抗体は、配列番号４のＶＨ配列および配列番号５のＶＬ配列を含む。さらに、該抗体は、ＣＤＲの少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの突然変異を含み、約３ｎＭ未満のＫ_ｄによって特徴付けられる、より高いアフィニティーを生じてもよい。前記の少なくとも１つの突然変異は、好ましくは、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１またはＣＤＲ２中にあり、最も好ましくはＶＨのＣＤＲ２中にある。

本発明の別の好ましい態様において、抗体は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３の群より選択される配列を含む、可変重鎖ＣＤＲ２を含む。好ましくは、全ＣＤＲ２が定義されるように、これらの定義されるＣＤＲ２配列には、アミノ酸残基ＡＩが先行し、そして配列番号１７の配列が続く。

本発明の好ましい抗体は、配列番号４のＶＨ配列および配列番号５のＶＬ配列を含む。ｓｃＦｖ抗体において、ドメイン構造は、ＮＨ_２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−ＶＨ−ＶＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨであってもよく；好ましくは、リンカーは配列番号１６の配列を有する。あるいは、配列番号４および５に示す可変領域を操作して全長抗体、例えばＩｇＧまたはＩｇＭ内に入れてもよい。本発明の可変領域と組み合わせるのに適した定常領域が当該技術分野に知られる。

本発明の範囲内には、薬剤としてのまたは診断ツールとしての抗体または抗体誘導体の使用がある。好ましくは、癌または腫瘍の治療用の薬剤の産生が想定される。この目的のため、放射性核種または放射金属標識を用いて、抗体を放射標識してもよい。これは腫瘍ターゲティング、画像法および生体分布研究に特に価値がある。また、組換えＤＮＡ技術によって、可変Ｖ遺伝子のコード領域を修飾毒素ドメインに遺伝的に融合させることが可能である。例えば、ｓｃＦｖが腫瘍マーカータンパク質に特異的であるｓｃＦｖ毒素融合体は、毒素を腫瘍にターゲティングすることも可能であり、腫瘍部位で毒素が細胞毒性を引き起こす。こうしたターゲティング化療法は、腫瘍において、細胞毒性剤または放射性核種の選択的濃縮を生じ、そして正常組織に対する毒性を和らげるはずである。

本発明の好ましい態様において、癌または腫瘍、好ましくは神経芽細胞腫、神経膠芽腫、横紋筋肉腫、乳癌、黒色腫、膵臓癌、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、小細胞肺癌、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、前立腺癌、結腸癌、または膵臓癌、好ましくは神経膠芽腫、神経芽細胞腫および横紋筋肉腫の治療に、抗体を用いる。ＡＬＫ発現およびタンパク質は、多くの軟組織腫瘍で検出されてきている（Ｌｉら、２００４）。全長ＡＬＫは、これらのヒト腫瘍で見いだされている。さらに、抗体は、好ましくは、局所治療に用いられる。最も好ましいのは、神経膠芽腫の局所治療である。

本発明の別の側面は、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列を提供することである。ＥＳＢＡ５１２（配列番号１９）に適した原核発現ベクターは、ｐＴＦＴ７４である（ＥＳＢＡ５１２コード配列を含む配列に関しては、配列番号９０を参照されたい）。ここで、ＥＳＢＡ５１２コード配列は、Ｔ７プロモーターの調節下にあり、そして組換え遺伝子産物は、通常、封入体上で精製される。別の好ましい原核発現ベクターはｐＡＫ４００であり、この中で、ＥＳＢＡ５１２配列は、精製を単純にするため、ｈｉｓタグ化される（ＥＳＢＡ５１２コード配列を含む配列に関しては、配列番号８９を参照されたい）。遺伝子産物は、宿主細胞によって、周辺質内に分泌される。

さらに、前記ＤＮＡ配列を含む発現ベクター、および前記発現ベクターで形質転換された適切な宿主細胞を提供する。好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌細胞である。
本発明のさらに別の側面は、前記抗体の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、前記抗体の合成を可能にする条件下で培養し、そして前記培養から前記抗体を回収する工程を含む、本発明の抗体の産生である。

本発明の別の側面は、配列番号１の残基３９１〜４０６を含むかまたは該残基から本質的になる、ＡＬＫエピトープを提供することである。前記エピトープは、抗ＡＬＫ抗体またはその断片を同定するか、スクリーニングするか、または作製するのに適している。好ましくは、単離ＡＬＫタンパク質またはその断片の残基３９１〜４０６（配列番号１）に特異的に結合可能な抗体またはその抗原結合性断片。より好ましくは、抗体は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、ＩｇＧまたはＩｇＭである。

さらなる側面において、単離ＡＬＫタンパク質またはその断片、あるいはＡＬＫのエピトープをコードする核酸を含む、ＡＬＫワクチンを提供する。好ましくは、ワクチンは、単離ＡＬＫタンパク質の残基３９１〜４０６を含む。前記ワクチンは、好ましくは、キャリアー、アジュバント、および／または免疫応答を増進するハプテンとともに配合される。

本発明の配列は、以下のものである：

ここで、実施例によって本発明をさらに記載する：
材料および方法
一般的に、本発明の実施は、別に示さない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば抗体技術）の慣用的な技術、およびポリペプチド調製における標準的技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）； Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）， ５１０， Ｐａｕｌ， Ｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ （１９９６）； Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ， １６９）， ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ監修， Ｉｒｌ Ｐｒ （１９９６）； Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗら， Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ． Ｐｒｅｓｓ， Ｐｕｂ． （１９９９）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９２）を参照されたい。

実験１： Ａｌｋ結合性ｓｃＦｖを同定するためのスクリーニング
抗体−抗原相互作用に関する豊富な構造的研究において、重鎖の相補性決定領域３（ＣＤＲ−Ｈ３）中の残基は、一般的に抗原への大部分の実質的な接触に寄与することが見いだされた（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７； Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８５；
Ｐａｄｌａｎ、１９９４）。本発明者らは、本発明者らが最近記載した酵母２ハイブリッド抗原−抗体相互作用スクリーニング技術を適用して、ランダム化した合成ＣＤＲ−Ｈ３配列の４つのｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングすることによって、抗原結合性ｓ
ｃＦｖを直接単離した（Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら、２００２）。４つのライブラリーは、４つの異なる安定ヒトｓｃＦｖフレームワークに基づき、この中で、可変重鎖の第三のＣＤＲループ（ＶＨ−ＣＤＲ３）内の７つのアミノ酸がランダム化された。標準的ＰＣＲクローニング技術によって、ランダム化部分を導入した。「品質管理」と称される酵母スクリーニング系によって、ヒト・チロシン受容体キナーゼ未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の細胞外ドメイン由来の１６アミノ酸ペプチドに対して、ｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングした（Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら、２００１； Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら、２００４）。簡潔には、品質管理技術は、ヒト可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）の天然プールから、安定性、可溶性および発現収率などの好ましい生物物理学的特性を持つＶＬおよびＶＨの組み合わせを同定するための、抗原独立性イントラボディ選択系である。第一のスクリーニング周期後、４つのｓｃＦｖライブラリーの１つから、１つの有望でそして特異的な結合剤を単離した。この特定のｓｃＦｖを、フレームワークＦＷ４．４ライブラリーから得た。ＦＷ４．４（配列番号２０）は、古典的で柔軟なグリシン−セリンリンカー（ＧＧＧＧＳ）_４によって、ＶＨ_３ドメインに連結された、ＶＬドメイン（ラムダ１）からなる。ＦＷ４．４のＶＨ ＣＤＲ３は、１３アミノ酸を含む（ＤＡＧＩＡＶＡＧＴＧＦＤＹ；配列番号１８）。ライブラリーを構築するため、縮重オリゴヌクレオチドを用いた標準的ＰＣＲクローニング法によって、ＶＨ ＣＤＲ３の中央部分をランダム化した（ＤＡＸＸＸＸＸＸＸＧＦＤＹ）。最後の２残基（ＡｓｐおよびＴｙｒ）の構造的重要性が多くの場合で立証されているため、これらを不変のまま維持した（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７）。ライブラリーの複雑性を取り扱い可能な次元に留めるため、残りの残基は修飾しなかった。Ｇａｌ４の転写活性化ドメインへのＣ末端融合体として、酵母発現ベクター（ｐＬｉｂ１）中に、ｓｃＦｖライブラリーをクローニングした（Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら、２００２）。

相互作用スクリーニングのための抗原として、ヒトＡｌｋのリガンド結合性ドメイン（ＬＢＤ）を選択した（Ｓｔｏｉｃａら、２００１）。ＤＮＡ結合性タンパク質ＬｅｘＡへのＣ末端融合体として、別の酵母発現ベクター（ｐＢａｉｔ１）内に、この１６アミノ酸ペプチドをクローニングした。

６つのＬｅｘＡ結合性部位の調節下で安定に組み込まれたレポーター遺伝子ＨＩＳ３およびｌａｃＺを含有するレポーター酵母株ＹＤＥ１７３（Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら、２００２）を、Ｇａｌ４活性化ドメインに融合したランダムＣＤＲ−Ｈ３ ｓｃＦｖライブラリーと一緒に、ＬｅｘＡに融合したＡｌｋ ＬＢＤを発現するベイト（ｂａｉｔ）・ベクターで形質転換した。ヒスチジンを欠き、そしてＨＩＳ３遺伝子産物の競合的阻害剤である２．５ｍＭ ３−アミノ−トリアゾール（３−ＡＴ）を含有するプレート上で、形質転換された細胞を選択した。増殖するコロニーを６日間に渡って摘み取り、そしてライブラリープラスミドを単離した。レスキューされたプラスミドで同じレポーター株を形質転換して、遺伝子活性化が抗原依存性であることを確認した。定量的液体β−ガラクトシダーゼアッセイを実行して、Ａｌｋ ＬＢＤ、すなわち１６アミノ酸ＡＬＫペプチド、および選択されたｓｃＦｖの間の結合強度を測定した。レポーター遺伝子活性化が最高であるｓｃＦｖはまた、ＥＬＩＳＡにおいて、Ａｌｋ ＬＢＤペプチドに、最適なアフィニティー（〜３１ｎＭ）を示した（データ未提示）。

ＡＬＫ結合に寄与すると同定された他のＶＨ ＣＤＲ３配列の配列を、以下の表１ａに提供する。

他の適切なフレームワークの配列を以下の表１ｂに提供する。

実験２：アフィニティー成熟
より高いアフィニティーを持つｓｃＦｖを得るため、突然変異誘発および酵母における第二のスクリーニング周期による、さらなるアフィニティー成熟プロセスに、この一次結合剤を供した。アフィニティー成熟を可能にする際、Ａｌｋ ＬＢＤペプチドと一次結合剤の相互作用によって駆動されるレポーター遺伝子活性化を弱めるため、ＬｅｘＡ Ａｌｋ ＬＢＤペプチド融合タンパク質の発現レベルを減少させた。ｐＢａｉｔ１ベクター上の強いアクチンプロモーターを、ＡＤＨプロモーター（アルコールデヒドロゲナーゼ）の一部切除され、そしてしたがってより活性でない型と交換して、ｐＢａｉｔ３を生じた。一次結合剤の存在下でのベイト発現レベルのこの減少は、ヒスチジンを欠き、そして５ｍＭ ３−ＡＴを含有するプレート上での増殖を阻害するのに十分であった。可変軽鎖内のＣＤＲ３の部分をランダム化することによって、アフィニティー成熟のための、一次結合剤の突然変異誘発を達成した。相同組換えによって、酵母中でこれを直接行った（Ｓｃｈａｅｒｅｒ−ＢｒｏｄｂｅｃｋおよびＢａｒｂｅｒｉｓ、２００４）。ＦＷ４．４のＶＬ
ＣＤＲ３は、１１アミノ酸（配列番号１４： ＧＴＷＤＳＳＬＳＧＶＶ）を含む。最初の２つの位は、第一の位がＧｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎのいずれかをコードし、そして第二の位がＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｌａをコードするように、部分的にランダム化された。ＶＬ ＣＤＲ３内の５〜８位では、すべてのアミノ酸残基を可能にした。残りの位は不変のままにした。ＰＣＲによってランダム化を導入した。生じたＰＣＲ産物は、３５６ｂｐのサイズを有し、そして２６７ｂｐの上流および２７ｂｐの下流フレームワーク配列を持つランダム化ＣＤＲカセットを含んだ。この産物は、いわゆるドナーＰＣＲ断片であり、該断片は、ターゲットベクターに対する相同性を所持する。ターゲットベクターは、Ｇａｌ４の活性化ドメインに融合した一次結合剤をコードする酵母プラスミド（ｐＬｉｂ１）
である。相同組換えの効率を改善し、そして続くスクリーニングにおいて偽陽性を排除するため、ターゲットベクター中のＣＤＲ−Ｌ３をわずかに修飾した。ユニークなＳａｃＩ制限部位をＶＬ ＣＤＲ３の中央に導入し、これによって融合タンパク質のｓｃＦｖコード部分にフレームシフトが起こり、そしてＡｌｋ ＬＢＤに結合不能な一部切除タンパク質が生じる。さらに、ＳａｃＩ部位は、ターゲットベクターの直線化を可能にし、これによって、酵母における組換え効率が増進する。

一部切除ＡＤＨプロモーターからＬｅｘＡ Ａｌｋ ＬＢＤを発現するプラスミド（ｐＢａｉｔ３）でレポーター酵母株ＹＤＥ１７３をプレ形質転換（ｐｒｅ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）することによって、スクリーニングを開始した。このプレ形質転換酵母細胞を再びコンピテントにして、そして直線化したターゲットベクターで、そしてＶＬ ＣＤＲ３の上流および下流に相同性を所持するドナーＰＣＲ断片で同時形質転換した。ＰＣＲ産物およびターゲットベクター間の相同組換えに際して、新規ＶＬ ＣＤＲ３配列をターゲットベクターの対応する部位内に組み込む。この事象の最終結果として、始原ＶＬ
ＣＤＲ３は、ランダム化ＶＬ ＣＤＲ３に交換された。これによって、レポーター遺伝子発現を活性化し、そしてＡｌｋ ＬＢＤペプチドとの相互作用に際して選択プレート上での増殖を可能にするであろう、新規ＶＬ ＣＤＲ３配列を持つ、完全に機能する融合タンパク質を発現する、環状プラスミドの再構築が可能になる。

６日間の観察期間に渡って、選択プレート上で総数１１９のクローンが増殖した。これらのクローンを摘み取り、そしてライブラリープラスミドを単離し、そして同じレポーター酵母株内に再形質転換した。定量的液体β−ガラクトシダーゼアッセイを実行して、Ａｌｋ ＬＢＤ（抗原）およびアフィニティー成熟ｓｃＦｖ間の結合強度を測定した。ｌａｃＺの最高の活性化を持つ２０のクローンを、Ａｌｋ ＬＢＤペプチドを用いたＥＬＩＳＡにおいてもまた試験した。最適候補は、約７ｎＭのＫ_Ｄを明らかにし（図３）、そしてＥＳＢＡ５２１と名付けられた。

ＡＬＫ結合に寄与すると同定された他のＶＬ ＣＤＲ３配列の配列を以下の表１ｃに提供する。

実験３： ｓｃＦｖ ＥＳＢＡ５２１は、ヒトＡＬＫの膜貫通型に特異的に結合する
新たに同定されたｓｃＦｖが、生存細胞表面上の膜貫通ヒトＡＬＫタンパク質もまた認識可能であるかどうかを試験するため、一過性にトランスフェクションされたＨＥＬＡ細胞の免疫染色実験を実行した。ＥＳＢＡ５２１は、ポリクローナル抗体に匹敵する方式で、ＡＬＫタンパク質と反応する（図４）。対照実験において、フレームワーク４．４ ｓｃＦｖは、ヒトＡＬＫと反応しないことが示された。マウス抗原性ペプチドは、ヒトペプチド配列と２つのアミノ酸位が異なるにすぎないが、驚くべきことに、ＥＳＢＡ５２１は、ヒトＡｌｋタンパク質にしか結合せず、対応するマウスタンパク質には結合しない。対照的に、ポリクローナルＡＬＫ抗体は、ヒトおよびマウスタンパク質の両方を認識する。したがって、ＥＳＢＡ５２１の結合は、細胞表面でのヒトＡＬＫタンパク質に特異的である。

実験４： ＶＨ ＣＤＲ２のＰＣＲ突然変異誘発による改善された結合剤の単離
抗原結合をさらに改善するため、この場合は、ＶＨのＣＤＲ２をＰＣＲ突然変異誘発によって変化させ、そして酵母レシピエント内に形質転換し、該レシピエント中で、類似の方式でＣＤＲ２での相同組換えが強制されることを除いて、第一周期のアフィニティー成熟と同じ２ハイブリッドアプローチを用いて、さらなる周期のアフィニティー成熟において、ＥＳＢＡ５２１を出発ｓｃＦｖとして用いた。再び、制限部位をＣＤＲ２中に導入して、ターゲットプラスミドの直線化を可能にした。ＣＤＲ２中に導入した突然変異を表２に示す。

この方法後に得た単離ｓｃＦｖの中で、７つが、２〜３ｎＭの範囲のＫ_ｄを持つ、有意に改善されたアフィニティーを有することがわかり（図５）、このうち最高のものは２８．１１であった。

実験５：抗ＡＬＫ抗体の投与に際する、腫瘍増殖の防止
プレイオトロフィンに結合することが知られるアミノ酸（３９６〜４０６）（Ｓｔｏｉｃａ ２００１）を含む、ＡＬＫのアミノ酸３９１〜４０６に結合する、抗体ＥＳＢＡ５
２１の前駆体を選択した。前駆体のＣＤＲ中のさらなるアミノ酸をランダム化することによって、そしてＡＬＫ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の天然背景中に含有される３９１〜４０６アミノ酸ストレッチに結合する結合剤に関して選択することによって、ＥＳＢＡ５２１を得た。これらの手順によって、ＰＴＮに結合するのと同じ部位で、高いアフィニティーでＡＬＫ ＥＣＤに結合する抗体が生じた。本発明者らの知る限りでは、これは、ＡＬＫのＰＴＮ結合性部位を特異的にターゲティングする最初のモノクローナル抗体である。したがって、ＥＳＢＡ５２１は、ＡＬＫ ＥＣＤに高いアフィニティーを有すると予測され、そしてＡＬＫ受容体に対する結合に関して、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）およびミッドカイン（ＭＫ）と効率的に競合し、そしてしたがって、ＥＳＢＡ５２１抗体は、ＡＬＫタンパク質へのＭＫおよびＰＴＮリガンド結合両方を阻害するのに適している。

ＡＬＫおよびそのリガンドは、新生物、腫瘍浸潤および血管新生に関与するため、ＡＬＫおよびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンド間の相互作用を阻害すると、ＡＬＫが仲介する腫瘍形成が破壊される。

特定の腫瘍に対するＥＳＢＡ５２１の効果は、以下に記載する以下の２つのアッセイによって測定可能である。
第一のアッセイにおいて、ＡＬＫが癌増殖を律速する役割を決定するため、異種移植片実験を準備する（Ｐｏｗｅｒｓ ２００２）。簡潔には、１０％ウシ胎児血清を補った２０００万細胞／ｍｌ培地のＵ８７ＭＧ細胞懸濁物を調製する。これらをＮＵ／ＮＵマウス内に注射して、そして生じた腫瘍を測定する。試験抗体、好ましくは全長抗体、より好ましくはｐｅｇ化抗体を導入し、そして腫瘍増殖を評価する。

本発明の現在好ましい態様を示しそして記載しているが、本発明は、これに限定されず、請求項の範囲内で、別の方式で多様に具現され、そして実施されてもよいことが、はっきりと理解されるものとする。

〔参考文献〕

図１は、用いたヒトＡＬＫタンパク質の図を示す。ｓｃＦｖ結合剤に関する２ハイブリッドスクリーニングにおいて、ＰＴＮ結合性部位（破線（ｄａｓｈｅｄ））の１６アミノ酸ペプチドをエピトープとして用いる。 図２は、二次結合剤としてＥＳＢＡ５２１を、そして三次結合剤としてｓｃＦｖのセットを得た、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ３およびＶＨ ＣＤＲ２部分の段階的ランダム化を示す（表１を参照されたい）。Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。 図３は、改善されたｓｃＦｖの結合特性を、ｓｃＦｖが派生したフレームワークのものに比較する、ＥＬＩＳＡ実験を示す。 図４は、ＥＳＢＡ５２１（左のパネル）およびポリクローナルＡＬＫ特異的抗体（右のパネル）を用いた、一過性トランスフェクションＨｅＬａ細胞の免疫染色を示す。中央のパネル：光学顕微鏡によって可視化された同じ細胞。 図５は、改善された三次結合剤にＥＳＢＡ５１２を比較する、ＥＬＩＳＡ実験を示す。

Claims (18)

1. ヒト未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）タンパク質に結合する抗体であって、
   配列番号４の可変重鎖（ＶＨ）配列またはその変異配列であるＶＨ配列、および
   配列番号５の可変軽鎖（ＶＬ）配列を含み、
   変異配列の場合、
   配列番号４のＶＨ ＣＤＲ２は配列番号７４、７５、７８、８３、８５、８６および８７からなる群より選択されるＶＨ ＣＤＲ２配列で置換され、
   前記抗体がｓｃＦｖ抗体、Ｆａｂ断片、ＩｇＧ、またはＩｇＭである、抗体、但し、該抗体は配列番号４のＶＨ配列および配列番号５のＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体ではない、前記抗体。
2. 請求項１の抗体であって、アミノ酸残基３９１±３および４０６±３（配列番号９１）、またはアミノ酸３９１〜４０６（配列番号１）に渡る領域の断片であるか、該領域を含むエピトープに結合する、前記抗体。
3. ３０ｎＭ以下のＫ_ｄによって特徴付けられるＡＬＫエピトープペプチドに対するアフィニティーを有する、請求項１または２のいずれか１項の抗体。
4. １０ｎＭ以下のＫ_ｄによって特徴付けられるＡＬＫエピトープペプチドに対するアフィニティーを有する、請求項１または２のいずれか１項の抗体。
5. ３ｎＭ未満のＫ_ｄによって特徴付けられるＡＬＫエピトープペプチドに対するアフィニティーを有する、請求項１または２のいずれか１項の抗体。
6. ｓｃＦｖであり、構造ＮＨ_２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを含み、リンカーが配列番号１６の配列を有する、請求項１の抗体。
7. 放射標識または毒素標識されている、請求項の１から６のいずれか一項の抗体。
8. 薬剤または診断ツールとしての、請求項１から７のいずれか一項の抗体。
9. 癌または腫瘍の治療用の薬剤の製造のための、請求項１から８のいずれか一項の抗体の使用。
10. 薬剤が、ＡＬＫおよび／またはＡＬＫが仲介するシグナル伝達へのＭＫおよび／またはＰＴＮ結合の阻害に適している、請求項９記載の使用。
11. 薬剤が、抗癌剤、例えばメトトレキサートと併用して、前記抗体を投与するのに適した併用薬剤である、請求項９または１０の使用。
12. 治療が、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、横紋筋肉腫、乳癌、黒色腫、膵臓癌、Ｂ細胞ＮＨＬ、甲状腺癌、小細胞肺癌、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、前立腺癌、結腸癌、脂肪腫、脂肪肉腫、線維肉腫、特に神経膠芽腫、神経芽細胞腫および横紋筋肉腫の治療である、請求項９の使用。
13. 請求項１〜８のいずれか一項の抗体をコードする、ＤＮＡ。
14. 請求項１３のＤＮＡを含む、発現ベクター。
15. 請求項１４の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
16. 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１５の宿主細胞。
17. 請求項１〜７のいずれか一項の抗体の産生のための方法であって、前記抗体の合成を可能にする条件下で、請求項１５または１６の宿主細胞を培養し、そして前記培養から該抗体を回収する工程を含む、前記方法。
18. 請求項１〜７のいずれか一項の抗体を含有する薬剤。