CN104861069B - 针对间变性淋巴瘤激酶的单克隆抗体1a4及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了特异性结合间变性淋巴瘤激酶(ALK)的单克隆抗体1A4,产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞,所述单克隆抗体的使用方法,以及包含所述单克隆抗体的组合物和试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域。具体地,本发明涉及特异性结合间变性淋巴瘤激酶(ALK)的单克隆抗体1A4,产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞,所述单克隆抗体的使用方法,以及包含所述单克隆抗体的组合物和试剂盒。
发明背景
肺癌是世界上最常见的癌症,每年新诊断出1400万新病例(P.Boyle,WorldCancer Report 2008(World Health Organization,2009))。随着人类分子遗传学的发展,已经鉴别出若干肺癌的致癌驱动突变,且其中一部分已经用作个体化医疗的生物标志物及靶点,例如EGFR突变(Rosell et al.,Lancet382,p720-731,2013)。
最近的遗传学研究显示大于6%的非小细胞肺癌患者具有间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因易位(Camidge&Doebele,Nat Rev Clin Oncol 9,p268-277,2012)。ALK易位最初是在白血病中鉴别到,然而随后在若干实体瘤中也检测出ALK易位(Chiarle et al.,NatRev Cancer 8,p11-23,2008)。正常时,ALK只在胚胎发生时表达且在成人组织中基本上是沉默的。然而,致癌性易位导致表达含有C-端自活化的ALK激酶结构域的融合蛋白(Chiarleet al.,Nat Rev Cancer 8,p11-23,2008)。在不同的癌症类型中已经鉴别到多种的5’端ALK融合配对物,在肺癌中主要是EML4。已经报道了至少8种不同的EML4-ALK融合模式。
临床上,被筛查出具有ALK易位的患者可以使用ALK激酶的ATP竞争性抑制剂克唑替尼进行靶向性治疗(Camidge&Doebele,Nat Rev Clin Oncol 9,p268-277,2012)。目前FDA批准的筛查ALK易位的方法基于原位杂交荧光技术(FISH)。然而,FISH需要对实验过程的精确标定以及需要高度熟练的技术人员以进行准确的定量。在许多病理学实验室中,FISH并不是常规测试。另一种检测ALK易位的方法是定量PCR。定量PCR是检测EML4-ALK融合模式的常规方法。然而这样的定量PCR平台是专门化的平台,并不适合于所有的病理实验室。而且,大部分常见定量PCR检测ALK的方法都限于EML4-ALK融合(Soda et al.,Nature448,p561-566,2007),而其它的例如Klf5B-ALK和KLC1-ALK等则无法检测。
免疫组化(IHC)是目前在病理实验室中最广泛使用的检测方法,主要得益于其低廉的成本和简便的操作。已报道ALK易位导致在肺癌样品中存在功能性融合蛋白的表达,暗示可以使用针对ALK的抗体通过免疫组化(IHC)来筛查ALK易位(Thunnissen et al.,Virchows Arch 461,p245-257,2012)。然而,ALK易位造成的ALK融合蛋白在肺癌中的表达远远低于其在白血病中的表达,因此通过IHC检测肺癌中的ALK融合蛋白需要高灵敏度的抗体(Mino-Kenudson et al.,Clin Cancer Res 16,p1561-1571,2010)。
发明内容
本发明提供了一种高灵敏度的抗ALK小鼠单克隆抗体1A4,其可用于通过免疫组化检测癌症如肺癌中的ALK易位。
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用,“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段,无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的,包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区的保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此,抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片段,例如抗ALK抗体片段。如本文所用,因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段,例如但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如,IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如,IgG2a和IgG2b)的成员。
如本文所用,抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分,其少于全长,但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点),并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力;抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物,以及合成产生的衍生物,例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段,包括修饰的片段(参见,例如,Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(2003);Chapter 1;p 3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链,例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸,并且典型至少或约200个氨基酸。
如本文所用,抗原结合片段指包含抗原结合部分的抗体片段,其与所述抗体片段所来源的抗体结合相同的抗原。如本文所用,抗原结合片段包括任何抗体片段,其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约107-108M-1的Ka)抗原的抗体。抗原结合片段包括抗体片段,例如Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab),并且还包括其他片段,例如包含CDR的片段,以及免疫特异性地结合抗原的多肽或在插入抗体框架时获得免疫特异性地结合抗原的抗体的多肽。
如本文所用,“单克隆抗体”指相同抗体的群体,表示单克隆抗体的群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性是与抗体的多克隆群体的特性相比,所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(Smith et al.(2004)J.Clin.Pathol.57,912-917;和Nelson et al.,J Clin Pathol(2000),53,111-117)。例如,单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备,例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备单克隆抗体。
如本文所用,全长抗体或完整抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体,例如通过抗体分泌B细胞天然产生的人抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
如本文所用,Fv抗体片段由通过非共价相互作用连接的一个可变重链结构域(VH)和一个可变轻链(VL)结构域组成。dsFv指具有稳定VH-VL对的工程化分子间二硫键的Fv。Fd片段是包含抗体重链的可变结构域(VH)和一个恒定区结构域(CH1)的抗体片段。Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的片段,或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链(包含VL和CL)和另一条链,所述另一条链包含重链的可变结构域(VH)和重链的一个恒定区结构域(CH1)。F(ab’)2片段是在pH4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所导致的抗体片段,或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。F(ab’)2片段基本上包含两个Fab片段,其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸,包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸。Fab’片段是包含F(ab’)2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。Fd’片段是包含F(ab’)2片段的一个重链部分的抗体片段。Fv’片段是仅包含抗体分子的VH和VL结构域的片段。hsFv指抗体片段,其中正常存在于Fab片段中的恒定结构域已用异二聚卷曲螺旋结构域取代(参见,例如,Arndt et al.(2001)J Mol Biol.7:312:221-228)。scFv片段指包含通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。接头长度使得两个可变结构域基本不干扰地桥接。示例性接头是分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n残基。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段,并且以与对于完整抗体的方式相同的方式特异性筛选抗体的抗原结合片段。
如本文所用,术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团,例如氨基酸或糖侧链,并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如,表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸,其可以是“线性”表位或“构象”表位。参见,例如,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷,G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中,蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中,相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
可使用本领域技术人员已知的常规技术,就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如,可进行竞争和交叉竞争研究,以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO03/48731中。因此,可使用本领域技术人员已知的常规技术,获得与单克隆抗体1A4竞争结合ALK上的相同表位的抗体及其抗原结合片段。
如本文中所使用的,术语“特异性结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常,抗体以小于大约10-7M,例如小于大约10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合抗原表位。
如本文中所使用的,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。通常,抗体以小于大约10-7M,例如小于大约10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原,例如,如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中所使用的,术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞”可互换使用,并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞”时,其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如,当提及杂交瘤细胞1A4时,其还指杂交瘤细胞1A4的亚克隆和后代细胞。
如本文中所使用的,术语“患者”是指哺乳动物,例如人。
在第一方面,本发明提供了特异性结合间变性淋巴瘤激酶(ALK)的单克隆抗体1A4或其抗原结合片段,所述单克隆抗体1A4由以保藏号CGMCC No.8559于2013年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)的间变性淋巴瘤激酶单克隆抗体杂交瘤细胞株产生。
在另一方面,本发明提供了特异性结合间变性淋巴瘤激酶(ALK)的单克隆抗体或其抗原结合片段,其与单克隆抗体1A4竞争结合ALK上的相同表位,所述单克隆抗体1A4由以保藏号CGMCC No.8559保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的杂交瘤细胞产生。
在另一方面,本发明提供了一种杂交瘤细胞,其以保藏号CGMCC No.
8559保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
在另一方面,本发明提供了一种组合物,其包含本发明的抗体或其抗原结合片段。
在另一方面,本发明提供了一种用于检测ALK蛋白和/或ALK融合蛋白在样品中的存在或表达水平的方法,其包括:
a)使本发明的抗体或其抗原结合片段与所述样品接触;和
b)检测所述样品中ALK蛋白和/或ALK融合蛋白的存在。
在一些实施方案中,所述样品是组织样品,例如癌组织样品(例如肺癌组织)。在一些实施方案中,所述样品是细胞样品,例如细胞裂解液。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在另一些实施方案中,所述方法还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测根据本发明的抗体或其抗原结合片段。此类第二抗体是本领域公知的,例如但不限于可识别抗体1A4的抗小鼠IgG抗体。在一些实施方案中,所述方法包括但不限于,Western印迹法、ELISA法和免疫组织化学法(IHC)。
在另一方面,本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测ALK蛋白和/或ALK融合蛋白在样品中的存在或表达水平。在一些实施方案中,所述样品是组织样品,例如癌组织样品(例如肺癌组织)。在一些实施方案中,所述样品是细胞样品,例如细胞裂解液。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在另一些实施方案中,所述试剂盒还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测根据本发明的抗体或其抗原结合片段。此类第二抗体是本领域公知的,例如但不限于可识别抗体1A4的抗小鼠IgG抗体。
本发明所述“ALK融合蛋白”是指细胞中ALK基因发生重排(易位),与其它基因融合而表达的融合蛋白。所述ALK融合蛋白一般包含ALK蛋白C端的激酶结构域(如C端的大约300个氨基酸)。ALK融合蛋白的实例包括但不限于EML4-ALK、KLF5B-ALK、KLC1-ALK、NPM-ALK和TPM3-ALK。EML4-ALK、KLF5B-ALK和KLC1-ALK主要与非小细胞肺癌相关,而NPM-ALK和TPM3-ALK则主要涉及间变性大细胞淋巴瘤(Chiarle et al.,(2008)Nat Rev Cancer 8:11-23)。
在另一方面,本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于筛查ALK阳性癌症。
如本文所用,ALK阳性癌症指的是癌症细胞表达由ALK易位导致的ALK融合蛋白(如非小细胞肺癌、间变性大细胞淋巴瘤)或过表达全长ALK蛋白(如神经细胞瘤),其可以通过本发明的抗体或其抗原结合片段检测。在确诊的癌症患者中鉴定出ALK阳性癌症使得可以使用针对ALK靶点的药物如克唑替尼(ALK激酶的ATP竞争性抑制剂)进行靶向性治疗(个体化治疗)。
在一些实施方案中,所述ALK阳性癌症包括ALK阳性肺癌(例如ALK阳性非小细胞肺癌)和ALK阳性淋巴瘤。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在另一些实施方案中,所述试剂盒还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测根据本发明的抗体或其抗原结合片段。此类第二抗体是本领域公知的,例如但不限于可识别抗体1A4的抗小鼠IgG抗体。
本发明还提供了一种用于筛查ALK阳性癌症的试剂盒,其包含本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,所述ALK阳性癌症包括ALK阳性肺癌(例如ALK阳性非小细胞肺癌)和ALK阳性淋巴瘤。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在另一些实施方案中,所述试剂盒还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。此类第二抗体是本领域公知的,例如但不限于可识别抗体1A4的抗小鼠IgG抗体。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1产生针对人间变性淋巴瘤激酶(ALK)蛋白C末端的小鼠单克隆抗体。A)鉴别适用于ALK免疫组化检测的单克隆抗体的杂交瘤选择方案。B)使用单克隆抗体1A4通过蛋白印迹检测到在293T细胞表达的全长ALK蛋白。C)使用单克隆抗体1A4通过蛋白印迹检测到肺癌细胞系H2228中的EML4-ALK易位融合蛋白产物。A549是具有野生型ALK基因的肺癌细胞系。通过抗-GAPDH抗体(TA802519)显示H2228和A549细胞裂解物的相同上样量。D)石蜡包埋的ALK-阳性间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)组织的免疫组化染色。E)石蜡包埋的异种移植瘤组织(衍生自H2228细胞系)的免疫组化染色。ALK-阴性细胞为小鼠成纤维细胞和淋巴细胞。
图2小鼠ALK单克隆抗体1A4和兔抗ALK单克隆抗体D5F3的比较。两种抗体在ALK-阳性(PCR确认)组织的肿瘤细胞中产生斑点状细胞质染色(右栏),而在ALK-阴性的非小细胞肺癌(NSCLC)组织上显示可忽略的背景染色(左栏)。
图3通过1A4免疫染色方法和qPCR分析确定的肺癌组织ALK状态之间的相关性。A)确定OriGene组织库中的ALK状态的方案。B)石蜡包埋的肺癌组织中使用1A4单克隆抗体的ALK IHC染色。C)由qPCR确定为ALK-阴性的组织的代表性1A4染色图像。D)石蜡包埋的ALK-阳性胃癌组织的1A4免疫染色。
图4FISH/qPCR方法和1A4免疫染色方法在测定ALK状态中的一致性。A)通过3种不同方法测定的ALK状态的总结。B)两个ALK-阳性肺癌组织样品的1A4免疫染色的代表性图像。C)ALK-阴性肺癌组织样品的1A4免疫染色的代表性图像。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明,否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法(例如,分子生物学实验方法和免疫检测法)。参见,例如,Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992);和Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1990),其全部通过引用合并入本文。按照制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术,如在本领域内通常使用的或如本文描述的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1产生用于免疫组化(IHC)的高灵敏度ALK小鼠单克隆抗体
在许多不同形式的由于易位造成的ALK融合蛋白中,ALK蛋白C末端区域的激酶结构域均恒定表达。因此,选择了ALK蛋白C末端321个氨基酸的区域(核苷酸序列:SEQ ID NO:1,氨基酸序列:SEQ ID NO:2)作为免疫原来产生抗体。
根据标准方法用大肠杆菌重组产生的纯化的ALK C末端321个氨基酸的蛋白片段用于对B6/C57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。使用标准技术将从经免疫的小鼠富集的B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(ATCC)融合,产生杂交瘤细胞。杂交瘤细胞单克隆通过有限稀释法经过3轮筛选和亚克隆获得。
为了获得可用于IHC的抗体,使用低聚甲醛固定的H2228细胞(ATCC)通过免疫细胞化学(ICC)对杂交瘤上清液进行初始筛选,所述H2228细胞已知携带ALK易位(Koivunen etal.,Clin Cancer Res 14,p4275-4283,2008)。
免疫细胞化学(ICC)检测方案如下:
1.准备细胞悬液:细胞培养完成后,弃去培养基,用2ml PBS清洗,然后用1ml胰酶消化,加入2ml培养基终止消化。用6ml培养基洗涤2次。最后用培养基重悬至0.5X104~2X104个/ml。
2.铺板:将调整好浓度的细胞悬液铺在96孔板中,每孔200ul。加完后在工作台静置5min。培养箱过夜培养。
3.固定:在96孔板中加入100ul 4%PFA,固定15min后,用PBS洗3遍。
4.穿透:在96孔板中加入100ul 0.1%Triton-100溶液进行穿透,15min后,用PBS洗3遍。
5.灭活:在96孔板中加入100ul 3%H2O2灭活,15min后用PBS洗3遍。
6.一抗(杂交瘤上清液)孵育:每孔100ul~150ul,室温孵育90min~100min后用PBS洗3遍。
7.加入检测系统(ZSBIO的PV-9000):滴加试剂1,37℃孵育15min,PBST(0.1%Tween-20)洗涤,3min X 2次,PBST(0.02%Tween-20)洗涤,3min×1次;滴加试剂2,37℃孵育15min,PBST(0.1%Tween-20)洗涤,3min X 3次。
9.显色:采用DAB显色剂进行显色,80ul/孔,显色时间5min,后用PBS洗3遍。
10.读取结果。
在初始ICC筛选后,全部阳性的杂交瘤克隆使用石蜡包埋的衍生自H2228细胞系的异种移植瘤组织通过IHC进行进一步筛选。筛选了超过10000个杂交瘤克隆,选出杂交瘤克隆1A4进行进一步的评估(图1A)。该杂交瘤细胞1A4以保藏号CGMCC No.8559于2013年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
免疫组织化学(IHC)检测方案如下:
1、取组织块进行石蜡包埋,使用Finesse组织切片机(Thermo公司)进行切片,组织切片的厚度为6μm。
2、依次使用下列试剂,对组织切片进行脱蜡与水化:分析纯二甲苯(3×10min),无水乙醇(3×10min),95%乙醇(1×5min),85%乙醇(1×5min),75%乙醇(1×5min),去离子水(3×3min)。
3、加入抗原修复液(0.01M枸橼酸钠缓冲液,pH6.0),在121℃下高压热修复2min。待温度降至约90℃时,取出组织切片,并自然冷却至室温,然后用去离子水浸泡3×3min。
4、在室温下,使用3%过氧化氢灭活组织样品中的内源性过氧化物酶,静置10min。然后用去离子水浸泡3×5min。
5、向样品中添加封闭液(PBS+5%脱脂奶粉+5%山羊血清),在37℃下孵育60min。
6、去除封闭液,勿冲洗,加入单克隆抗体,37℃下孵育60min。然后用PBS+0.1%Tween-20洗涤2次,每次洗涤5min;再用PBS+0.02%Tween-20洗涤1次,每次洗涤5min。
7、加入检测系统(ZSBIO的PV-9000):滴加试剂1,37℃孵育15min,PBST(0.1%Tween-20)洗涤,3min X 2次,PBST(0.02%Tween-20)洗涤,3min×1次;滴加试剂2,37℃孵育15min,PBST(0.1%Tween-20)洗涤,3min X 3次。
8、使用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)进行显色,显色3-10min。然后用蒸馏水洗涤。
9、用苏木精复染2min,然后用蒸馏水漂洗,用1%盐酸分化,再用蒸馏水漂洗3次,室温静置1min。
10、依次使用下列试剂,对样品进行脱水和透明:75%乙醇(1×5min),85%乙醇(1×5min),95%乙醇(1×5min),100%乙醇(3×5min),二甲苯(3×5min)。用中性树胶封片。
11、用显微镜(Olympus公司IX70)进行镜检。
实施例2单克隆抗体1A4的性能评估
针对不同的应用评估了单克隆抗体1A4的性能。
首先使用表达ALK全长蛋白(核苷酸序列:NM_004304.4,氨基酸序列:NP_004295.2)的293T细胞(参见中国专利申请CN102803969A)的裂解物、肺癌细胞系H2228以及A549(ATCC)的细胞裂解物,测试了1A4在蛋白印迹测定中的性能。在蛋白印迹中1A4能够有效识别在293T细胞表达的全长ALK蛋白,也能有效识别肺癌细胞系H2228中的内源EML4-ALK融合蛋白,而在具有野生型ALK基因的肺癌细胞系A549(即,ALK蛋白不表达)中则为阴性结果(图1B和C)。
然后测试了1A4在通过IHC测定肿瘤组织样品中的性能。在甲醛固定、石蜡包埋(FFPE)的ALK-阳性间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)组织中该抗体显示强染色,并且该抗体也能够检测衍生自H2228细胞的肺癌异种移植组织中的ALK-阳性细胞(图1D和E)。
由于ALK基因通常在胚胎发生期间表达而不在成年组织中表达,发明人对25个成年人的正常组织进行了IHC测定,没有观察到任何明显的染色(数据未显示)。
实施例3单克隆抗体1A4与D5F3的比较
据报道兔单克隆抗体D5F3能够有效地检测NSCLC样品中的ALK易位(Mino-Kenudson et al.,Clin Cancer Res 16,p1561-1571,2010)。为了评价1A4在ALK-阳性FFPE组织上的IHC性能,在ALK易位患者样品上使用D5F3作为实验基准。
免疫组化染色在4微米厚的石蜡组织切片上进行。简而言之,脱蜡的切片用1mMEDTA(pH8)抗原修复液在高压锅中120度处理3分钟。切片然后在室温下与一抗孵育90分钟。兔抗人ALK单克隆抗体D5F3(Cell signaling technology)和本发明的小鼠抗人ALK单克隆抗体1A4以相同浓度使用。使用ZSBIO两步聚合物检测系统PV9000进行免疫组化测定。
发现与D5F3类似,1A4也在ALK-阳性肿瘤细胞中产生弥散的细胞质染色,同时两种抗体在对照样品中均是完全阴性染色(图2)。当以相同浓度进行测试时,1A4染色比D5F3染色深。相比于D5F3,1A4具有更高的灵敏度。由于在NSCLC中ALK的低表达水平,此种更高的灵敏度在ALK阳性NSCLC的检测中是特别有利的。
实施例41A4能够鉴别OriGene组织库中的EML4-ALK阳性样品
本实验目的在于评估1A4能够在更大的样品库中(例如含140000个样品的OriGene组织库)检测出ALK易位事件。由于ALK易位是相对罕见的事件,通过实时PCR和医疗记录发掘来从OriGene组织库中筛查EML4-ALK融合样品。
根据Takeuchi等人(Takeuchi et al.,Clinical Cancer Research 14,p6618-6624,2008)设计引物筛选EML4-ALK阳性组织,所述引物能够检测全部EML4与ALK外显子20的融合蛋白:
EML4-72F(SEQ ID NO:3):GTCAGCTCTTGAGTCACGAGTT
Fusion-RT-S(SEQ ID NO:4):GTGCAGTGTTTAGCATTCTTGGGG
ALK3078_RR(SEQ ID NO:5):ATCCAGTTCGTCCTGTTCAGAGC
通过qPCR发现6个阳性组织,其中4个有可用的保存物。另外,通过医疗记录鉴定出1个胃肌成纤维细胞肿瘤样品。因此,总共鉴定出4个ALK-阳性肺腺癌组织和1个胃肌成纤维细胞肿瘤样品用于1A4免疫组化测定(图3A)。
此外,设计检测ALK的C末端转录物的引物来鉴定ALK阴性组织:
NM_004448F(SEQ ID NO:6):CCGATGTATTTGATGGTGACCTG
NM_004448R(SEQ ID NO:7):TACTCTGGGTTCTCTGCCGTAGG
选出转录最低的30个阴性肿瘤组织作为阴性样品并用于1A4免疫组化测定(图3A)。
结果发现1A4能够有效鉴别全部5个阳性组织,而在阴性样品没有明显染色(图3B-D)。可见,单克隆抗体1A4具有高灵敏度和高特异性,特别适合于通过IHC筛查ALK阳性癌症。
实施例5单克隆抗体1A4的IHC染色结果与FISH和qPCR结果相关
为了确认1A4的IHC染色结果与其它ALK检测方法(包括FISH和qPCR)之间的相关性,在16个用FISH/qPCR鉴定为ALK-阳性的NSCLC样品和10个用qPCR测定为阴性的样品上独立地用1A4进行IHC检测。FISH和qPCR验证的ALK-阳性组织之前由Zhang等人鉴定并确认(Zhang et al.,PLoS One 8,e64821,2013)。发现1A4的IHC染色结果和现有的FISH和qPCR检测结果100%一致(图4A-C)。因此,使用1A4单克隆抗体的IHC检测与FISH和qPCR同样可靠,但是成本更加低廉,尤其适用于临床上对ALK阳性癌症进行初筛。
Claims (8)
1.特异性结合间变性淋巴瘤激酶ALK的单克隆抗体1A4或其抗原结合片段,所述单克隆抗体1A4由以保藏号CGMCC No.8559保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的杂交瘤细胞产生,其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、单链Fv和单链Fab。
2.一种杂交瘤细胞,其以保藏号CGMCC No.8559保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测ALK蛋白和/或ALK融合蛋白在样品中的存在或表达水平。
4.权利要求3的用途,其中所述ALK融合蛋白包括EML4-ALK、KLF5B-ALK、KLC1-ALK、NPM-ALK和TPM3-ALK。
5.权利要求1的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于筛查ALK阳性癌症。
6.权利要求5的用途,其中所述癌症包括肺癌和淋巴瘤。
7.权利要求6的用途,其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
8.一种用于筛查ALK阳性癌症的试剂盒,其包含权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
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