CN108333356A

CN108333356A - 基于EML4-ALK抗体的isPLA技术在检测非小细胞肺癌中的应用

Info

Publication number: CN108333356A
Application number: CN201710957412.8A
Authority: CN
Inventors: 张炬; 吴金芸
Original assignee: Bio Tech Development (yancheng) Co Ltd
Current assignee: Bio Tech Development (yancheng) Co Ltd
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2017-10-16
Publication date: 2018-07-27

Abstract

一种ALK(3B12)和EML4(1D11)单抗结合原位邻位连接isPLA技术在检测非小细胞肺癌中的应用。本发明利用单抗技术制备了两株分别识别EML4和ALK的高亲和性单克隆抗体，并以其为邻位探针建立了一种新型EML4‑ALK检测技术——基于新型EML4和ALK抗体的isPLA技术。该技术具有高效、灵敏、经济、便捷等优点，并可能应用于临床诊断，为今后肿瘤标志物和治疗靶点的检测提供了新的方向。

Description

基于EML4-ALK抗体的isPLA技术在检测非小细胞肺癌中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于EML4-ALK抗体的isPLA技术在检测非小细胞肺癌中的应用。

背景技术

肺癌是肺组织内细胞生长失去控制而导致的一种疾病。在过去的半个多世纪中，肺癌的发病率和死亡率逐年增加，已经从20世纪初的一种罕见疾病发展为当今的全球头号癌症杀手。根据世界卫生组织(WHO)定期公布的资料，肺癌的发病率和死亡率在世界各国尤其是发达国家呈明显的上升趋势，已经成为许多发达国家最常见的肿瘤，位列男性常见恶性肿瘤第一位和女性常见恶性肿瘤第二位，并且成为恶性肿瘤中最常见的死亡原因。在我国，男性肺癌年龄标准化发病率为47.51/10万，女性肺癌年龄标准化发病率为22.69/10万，并且呈逐年增加的趋势，参见，She J,Yang P,Hong Q,等人Lung cancer in China:challenges and interventions[J].Chest.2013,143(4):1117-1126。预计到2025年，我国每年仅死于肺癌的人数就将接近100万，成为世界第一肺癌大国。

根据肺癌细胞的分化程度和形态特征，临床上将其分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌 (non-small lung cancer,NSCLC)两类，其中非小细胞肺癌占到85％左右。根据预后情况，几种非小细胞肺癌又可以归为三类：鳞状细胞癌、肺腺癌和大细胞肺癌。尽管诊断方法和治疗手段都有了很大的进步，70％的NSCLC患者在初次确诊时大多已处于ⅢB/Ⅳ期，其中约40％的患者失去手术治疗的机会，5年生存率往往低于5％，参见Molina J R,Yang P,Cassivi S D, 等人Non-small cell lung cancer:epidemiology,risk factors,treatment,and survivorship[J].Mayo Clin Proc.2008,83(5):584-594。因此，针对该疾病分子起源和疾病发生发展过程的研究，对其预防和治疗具有重要意义。

非小细胞肺癌(Non-small-cell carcinoma NSCLC)是世界上癌症相关死亡的首要原因。每年大概有120万患者被诊断出非小细胞肺癌，同时，110万人死于该症。虽然在过去的数据十年中对NSCLC进行大量的研究，NSCLC患者的五年存活期依然很低。肿瘤结节转移 (TNM)分期系统在国际上广为认可，用于NSCLC的预后预测。尽管如此，早期的患者显示出变化范围较大的生存率，这就使得寻找能更好的预测结果的有效预后标志物成为必须。因此，人们在借鉴可改善NSCLC诊断的分子标志物方面做了大量的工作。适合的标志物不仅能提供预后信息，而且，也有助于预测患者是否可以受惠于新的治疗策略或额外的治疗措施。

随着肺癌个性化治疗研究的不断深入，渐变性淋巴激酶(anaplastic lymphomakinase， ALK)酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptor，TKR)逐渐发展为的一个重要的NSCLC 标志物和治疗靶点，其代表性的亚型是棘皮动物微管相关蛋白4-渐变性淋巴激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK) 融合基因。

EML4-ALK融合基因的形成是由于2号染色体短端的小片段转位导致EML4基因的N端与ALK胞内段酪氨酸激酶区基因融合，使得酪氨酸激酶持续活化并最终引发癌变。目前Soda等已经通过动物模型证实了EML4-ALK融合基因的致癌性，使得其立即成为即 EGFR、K-Ras等肺癌标志物之后的又一研究热点。此外，ALK的其他融合基因型包括 KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK和PTPN3-ALK等也不断被报道出来。随着研究的不断深入，EML4-ALK融合基因很可能会发展为新一代的肿瘤标志物和治疗靶点，为世界癌症患者带来新的希望。

据统计，约2％-12％的NSCLC患者含有EML4-ALK融合基因，且这一数字还在逐年上升。由于ALK相关肿瘤的生长对ALK酪氨酸激酶活性具有高度依赖性，因此对于ALK阳性患者而言，抑制ALK酪氨酸激酶活性可能成为一种有效的治疗手段。大量临床试验表明，ALK阳性肺癌患者对ALK酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)高度敏感，如crizotinib，而对于其他肺癌标志物(如EGFR)的抑制剂却没有明显的反应。大量临床结果表明，crizotinib对于EML4-ALK阳性肺癌患者具有良好的治疗效果。故而，EML4- ALK的精确诊断对于EML4-ALK阳性肺癌患者治疗方案的选择至关重要。

EML4-ALK的检测方式主要包括3种：逆转录-链式酶聚合反应(Reversetranscriptase- polymerase chain reaction，RT-PCR)，荧光原位杂交技术(Fluorescence in Situ hybridization， FISH)和免疫组织化学染色(Immunohistochemistry stain，IHC)。尽管大量的实验结果已经证明了这3种方法的可靠性，但是它们的一些缺陷却大大限制了其推广使用虽然许多研究者多次比较了RT-PCR、FISH和IHC在检测EML4-ALK上的特异性和灵敏性，但最佳检测方式依然没有确定。除此之外，研究人员还建立了多种新的EML4-ALK检测技术，但每一种都存在一定的局限性，难以成为EML4-ALK临床标准检测技术。

因此，找寻对于NSCLC易感分析或NSCLC预后诊断有用的诊断标记物、提高NSCLC患者的生存率，改善NSCLC的生活质量，已成为NSCLC治疗的当务之急。

发明内容

为克服上述现有技术中的不足，本发明目的在于提供一种基于EML4-ALK抗体的isPLA 技术在检测非小细胞肺癌中的应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种ALK(3B12)和EML4(1D11)单抗结合原位邻位连接isPLA技术在检测非小细胞肺癌中的应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供两株分别识别EML4和ALK的高亲和性单克隆抗体，并以其为邻位探针建立了一种新型EML4-ALK检测技术——基于新型EML4和ALK 抗体的isPLA技术，建立了一种新型的EML4-ALK检测系统，并在肺癌细胞株中检测其特异性。

上述技术方案中，相关内容解释如下：

1、上述方案中，所述EML4-ALK抗体为ALK(3B12)和EML4(1D11)的高亲和性单克隆抗体。

2、上述方案中，所述ALK(3B12)和EML4(1D11)单抗可特异性地识别非小细胞肺癌样品中的EML4-ALK致瘤蛋白。

本发明利用单抗技术制备了两株分别识别EML4和ALK的高亲和性单克隆抗体，并以其为邻位探针建立了一种新型EML4-ALK检测技术——基于新型EML4和ALK抗体的isPLA技术。该技术具有高效、灵敏、经济、便捷等优点，并可能应用于临床诊断，为今后肿瘤标志物和治疗靶点的检测提供了新的方向。

附图说明

图1是ALK(3B12)和EML4(1D11)抗体亲和性及特异性检测结果图；其中：A：采用EML4(1D11)和ALK(3B12)单抗进行Western Blot检测H2228(EML4-ALK+)和H460(EML4-ALK-) 中EML4-ALK融合蛋白表达；B-I:采用EML4(1D11)和ALK(3B12)单抗及ALK-1和EML4-1单抗进行ICC检测H2228细胞与H460细胞中EML4-ALK融合蛋白表达；J-R:采用EML4(1D11)和 ALK(3B12)单抗及ALK-1和EML4-1单抗进行IHC检测EML4-ALK阴性及阳性临床样品中EML4-ALK融合蛋白表达；

图2是PLA探针制备图；其中，A抗体与低聚物连接模型；B:SDS-PAGE检测结果；

图3是新型的EML4-ALK检测系统检测肺癌细胞株中EML4-ALK融合蛋白特异性结果图；

图4是新型的EML4-ALK检测系统检测FFPE活体样品及FrFr样品中EML4-ALK融合蛋白特异性结果图；其中：A-D：NSCLC活体检测样品的isPLA和FISH显微照片；case1(A和B)以及case2(C和D)的isPLA(A和C)或FISH(C和D)的检测结果。黄色箭头表示EML4-ALK分布情况；E:case1、case2、case3和case4的RT-PCR结果；F-K:基于EML4(1D11)和 ALK(3B12)单抗的isPLA检测NSCLC FFPE样品。(F,G和H)以及FrFr样品(I、J和K),包括 case1(F和I)，case3(G和J)和case4(H和K)。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1至图4。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

实施例：

本发明所使用的试剂和材料来源如下：

材料：人肺癌细胞株H2228和H460购自ATCC。人类NSCLC组织样品由韩国庆北国立大学医学中心提供，所有实验均已经过当地伦理委员会批准。

试剂：ALK-1抗体购自Cell Signaling Technology公司；EML4-1抗体购自Dako公司；GAPDH抗体购自Superview Biotechnology公司；ALK Break Apart FISH Probe试剂盒购自Vysis公司；SP-9002免疫组化染色试剂盒、HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥公司；BCA蛋白定量试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；ECLWestern Blotting试剂盒购自Pierce公司；IllustraTM NAP-5columns购自GE healthcare公司；邻位探针probe arm PLUS、probe arm MINUS、连接探针connector oligo1、connector oligo2、检测探针购自Bioneer公司；T4DNA连接酶、phi20DNA聚合酶购自Solgent公司；RPMI1640、胎牛血清购自GIBCOBRL公司；抗褪色封固剂(含DAPI)、 SSC缓冲液(20X)、Triton X-100购自Sigma-Aldrich公司；SMCC、TCEP-HCl购自Thermo scientific公司；SuperScriptTM III逆转录酶购自美国Invitrogen公司；Tris、 Glycine、SDS、Tween-20、TEMED购自美国AMRESCO公司；酒精、NaCl购自Merck公司； KCl、KH2PO4、Na2HPO4、乙酸钠、二甲苯、乙腈购自杭州屹达化工有限公司。

细胞培养：

H2228细胞及H460细胞培养于RPMI-1640培养基中，内含10％灭活新生小牛血清，置于 37℃、5.0％CO2饱和湿度的培养箱中培养。

Western-blotting：

取状态良好的H2228及H460细胞，以预冷的PBS清洗3遍之后，加入150-200μL的 1×细胞裂解液，反复吹打使细胞充分裂解。将吹打后的样品液吸入EP管中并在冰上放置20-30min。将样品液13000rpm离心10min之后吸取上清溶液，并以BCA蛋白定量试剂盒分析样品液的蛋白浓度，然后将制备好的样品放入-80℃冰箱中储存备用。

在SDS-PAGE电泳中，每孔加入30μg总蛋白进行电泳。电泳结束后采用湿转法将电泳产物转印到NC膜上。使用5％脱脂牛奶室温封闭1h。以相应的一抗稀释液(ALK(clone3B12)、EML4(clone 1D11)、ALK-1、EML4-1和GAPDH抗体，稀释比为1:2000)4℃孵育过夜。一抗孵育结束后以TBST洗膜3次每次10min。使用二抗稀释液(HRP标记山羊抗兔IgG 与山羊抗鼠IgG，稀释比为1:5000)室温孵育1h。孵育结束后以TBST洗膜3次每次 10min。加入ECL试剂，并在暗室内进行X线胶片曝光、显影、定影等操作。

FFPE样品的准备：

FFPE切片在65℃条件下放置1-3h，二甲苯脱蜡，3次每次3min。梯度酒精复水，100％酒精2次，每次3min。随后95％、80％、70％、50％酒精3min各1次。PBS清洗3 次，每次2min。使用0.5％Triton X-100对FFPE切片进行通透，室温10min。PBS清洗3 次，每次2min。用1mM pH 8.0的EDTA溶液进行热修复(此步骤后直到显色过程中应绝对避免切片干燥，反应过程均处于湿盒中进行)：1mM pH 8.0的EDTA煮沸，置入爬片，煮沸20min，冷却20min。TBS-T冲洗3次，每次5min。将切片放入过氧化氢中温育10- 15min，阻断内源性过氧化物酶活性。TBS-T冲洗3次，每次5min。

FrFr样品的准备：

FrFr切片在室温孵育5-10min。以预冷的甲醛固定5-10min。梯度酒精复水， 90％、80％和70％酒精3min各1次。PBS清洗3次，每次2min。使用0.5％Triton X-100 对FFPE切片进行通透，室温10min。PBS清洗3次，每次2min。

IHC使用我们制备的EML4(1D11)和ALK(3B12)单抗以及北京中杉金桥公司的SP-9002免疫组化染色试剂盒完成，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

FISH实验使用Vysis公司的ALK Break Apart FISH Probe试剂盒完成，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。ALK探针包括标有橙色和绿色荧光基团的两种DNA探针，它们分别识别ALK基因2p23处断裂点的两侧。

RT-PCR：

总RNA的提取以及cDNA的合成：

FFPE和FrFr样品中的总RNA使用Trizol法进行提取。抽提的总RNA经由琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度，取2μg抽提的总RNA作为模板，使用SuperScriptTM III逆转录酶合成cDNA。待逆转录反应结束后得到约40μL的cDNA样品，取1μL进行随后的PCR实验。

RT-PCR检测EML4-ALK分布情况：

根据之前报道的EML4-ALK Variant 1鉴定结果设计相应的引物，进行PCR扩增。扩增条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃，2 min。反应35个循环后用相应软件对结果进行分析。得到的PCR产物首先通过琼脂糖凝胶电泳初步验证(EML4-ALK Variant 1大小约247bp)，若出现预计条带则进一步分析其核苷酸序列。

isPLA实验所用材料由韩国Medisensor公司提供，具体操作严格按照Medisensor公司说明书执行。

如图1所示，利用单克隆抗体制备方法制备分别针对ALK和EML4的新型单抗ALK(3B12) 和EML4(1D11)，并用Western Blot、免疫细胞化学染色(ICC)和免疫组织化学染色(IHC)等方法检测ALK(3B12)和EML4(1D11)的亲和性和特异性。

利用单克隆抗体制备方法制备分别针对ALK和EML4的新型单抗ALK(3B12)和 EML4(1D11)。采用EML4-ALK阳性细胞系H2228(EML4-ALK变型3，90kDa)和EML4-ALK阴性细胞系H460通过Western Blot、免疫细胞化学染色(ICC)和免疫组织化学染色(IHC)等方法检测ALK(3B12)和EML4(1D11)的亲和性和特异性，结果如图1中A-R所示。图1中A的 WesternBlot结果显示，用ALK(3B12)和EML4(1D11)抗体检测，EML4-ALK阳性细胞系 H2228呈阳性，而在EML4-ALK阴性细胞H460呈阴性。如图1中B-I所示，免疫细胞化学染色实验中发现，在EML4-ALK阳性细胞系H2228中所制备的单抗ALK(3B12)和EML4(1D11)检测结果呈阳性，而在EML4-ALK阴性细胞系H460中则呈阴性，说明我们制备的新型 ALK(3B12)和EML4(1D11)单抗可特异性地识别细胞样品中的EML4-ALK致瘤蛋白。同时，将所制备的抗体与市场上同类抗体ALK-1(Dako#M7195，USA)和EML4-1(CST#12548，USA)进行比较发现无论是EML4(1D11)还是ALK(3B12)，其阳性率均大于同类抗体。为了进一步验证 ALK(3B12)和EML4(1D11)单抗在组织样品中的适用性，取临床病理样品进行了IHC染色。 IHC的结果与之前的结果完全吻合(如图1中J-R)，证明了ALK(3B12)和EML4(1D11)单抗检测临床病理样品的可行性。结果表明ALK(3B12)和EML4(1D11)具有高亲和性和特异性。

如图2所示，使用新型的ALK(3B12)和EML4(1D11)单抗结合原位邻位连接技术(insitu proximity ligation assay，isPLA)，建立了一种新型的EML4-ALK检测系统，并在肺癌细胞株中检测其特异性。将Probe arm PLUS(32mer)和Probe arm MINUS(35mer)氨基端连续与SMCC结合5次，形成一个低聚物(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane- 1-carboxylate)-SMCC，随后该低聚物再与ALK(3B12)和EML4(1D11)单抗连接，形成PLA探针。连接模型如图2中A图所示。连接后经SDS-PAGE电泳验证，探针制备成功如图2中B 图所示。

如图3所示，用新型的EML4-ALK检测系统检测EML4-ALK融合蛋白阳性细胞株(H2228)及阴性细胞株(H460)中EML4-ALK融合蛋白荧光显微镜下观察，发现H2228可观察到明显的阳性，而H460呈阴性。

如图4所示，首先选取EML4-ALK阳性样品及阴性样品进行检测。荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridizatio,FISH)和RT-PCR实验同时进行以验证isPLA检测结果的可靠性。新型的EML4-ALK检测系统实验结果表明，在EML4-ALK阳性样品中检测到大量代表着EML4-ALK融合蛋白的荧光基团，而在EML4-ALK阴性样品中的荧光基团则微乎其微(case1and2，图4中A和C)。上述结果与FISH和RT-PCR结果完全一致(图4中B、D和E)。此外，为了研究我们建立的新型isPLA使用的广泛性，我们同时检测了25名NSCLC患者的 FFPE样品和新鲜冰冻样品(fresh frozen specimens，FrFr)。

在所有25例NSCLC患者的检测结果中，没有新型isPLA检测结果阴性而RT-PCR检测结果阳性的案例，而新型isPLA检测结果阳性而RT-PCR检测结果阴性的有4例。相对于RT-PCR而言，新型isPLA的特异性和灵敏度分别为76％和100％(表1)。

表1新型isPLA与RT-PCR的比较

在发明中，我们建立了一种基于新型EML4和ALK单抗的isPLA检测系统，该系统能够高效灵敏的检测NSCLC患者FFPE和FrFr样品中EML4-ALK致瘤蛋白的分布情况。

邻近连接技术(isPLA)一种新颖、高效、灵敏且简便的检测技术，该技术的关键是通过不同的蛋白识别抗体的邻近结合完成与抗体相连的DNA链的邻近结合，从而产生可供识别检测的DNA扩增序列。邻近连接技术的独特之处在于其将较难分析的蛋白质检测、定量、定位问题转化为较易解决的DNA分析问题，其效果明显优于传统检测方法。我们通过Western Blotting、ICC和IHC的方式验证了我们制备的EML4(1D11)和ALK(3B12)的性能，进而确保后续的isPLA实验顺利进行。isPLA实验结果显示，EML4-ALK阳性样品有强烈的信号而 EML4-ALK阴性样品则没有检测到信号。为了取得最佳的实验结果，一抗的稀释比例应该在预试验中得到优化。所有的isPLA结果均得到了FISH和RT-PCR的有力支持，证明了isPLA系统的可靠性。新型isPLA系统可同时运用于FFPE和FrFr样品，说明该系统检测EML4- ALK融合蛋白的有力工具，并可能广泛应用于临床诊断。

我们使用作为isPLA的探针抗体检测了25名患者的NSCLC活体检测样品，结果新型isPLA系统表现出了优异的特异性(100％)和灵敏性(76％)。此外，EML4(1D11)和ALK(3B12)的识别位点分别为EML4的N端和ALK的C端，这意味着所有的EML4-ALK变型均可使用EML4(1D11)和ALK(3B12)进行检测。

大规模高通量筛选新型标志物的方法需要经济、可靠、便于操作并对患者无害。isPLA 技术可能是一种有效的EML4-ALK筛选技术，但是以二抗作为邻位探针极大的限制了这项技术的应用。二抗探针要求两个探针来自不同种属，这意味着相应的一抗也要来自不同种属，极大的限制了一抗的选择。此外，以二抗作为邻位探针使得isPLA的操作变得复杂，而且增加了假阳性结果出现的可能性。现在将寡核苷酸链探针标记至抗体的技术已经变得经济便捷，使得以一抗作为邻位探针变得可能。因此，我们使用一抗(EML4(1D11)和ALK (3B12))标记了特异的寡核苷酸链作为邻位探针。没有了二抗孵育和随后的洗涤步骤，新型isPLA系统变得更加简便可靠，也更适用于大规模高通量筛EML4-ALK融合蛋白。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.ALK(3B12)和EML4(1D11)单抗结合原位邻位连接isPLA技术在检测非小细胞肺癌中的应用。

2.两株分别识别EML4和ALK的高亲和性单克隆抗体，并以其为邻位探针建立了一种新型EML4-ALK检测技术——基于新型EML4和ALK抗体的isPLA技术，建立了一种新型的EML4-ALK检测系统，并在肺癌细胞株中检测其特异性。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述ALK(3B12)和EML4(1D11)单抗可特异性地识别非小细胞肺癌样品中的EML4-ALK致瘤蛋白。