CN104212889A - 一种用于诊断Xp11.2 易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合及其应用 - Google Patents
一种用于诊断Xp11.2 易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104212889A CN104212889A CN201410410230.5A CN201410410230A CN104212889A CN 104212889 A CN104212889 A CN 104212889A CN 201410410230 A CN201410410230 A CN 201410410230A CN 104212889 A CN104212889 A CN 104212889A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tfe3
- transposition
- fluorescence
- psf
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 208000000360 Perivascular Epithelioid Cell Neoplasms Diseases 0.000 title abstract description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000017105 transposition Effects 0.000 claims description 41
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 26
- 210000002415 kinetochore Anatomy 0.000 claims description 20
- 101000837845 Homo sapiens Transcription factor E3 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100028507 Transcription factor E3 Human genes 0.000 claims description 18
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 claims description 17
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 claims description 17
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 claims description 17
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 15
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000003237 epithelioid cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 208000028732 neoplasm with perivascular epithelioid cell differentiation Diseases 0.000 abstract description 40
- 201000005207 perivascular epithelioid cell tumor Diseases 0.000 abstract description 40
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 abstract description 13
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 33
- 101150019258 Tfe3 gene Proteins 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 102100027780 Splicing factor, proline- and glutamine-rich Human genes 0.000 description 12
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 11
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010049459 Lymphangioleiomyomatosis Diseases 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000011242 molecular targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 206010051810 Angiomyolipoma Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 102100031561 Hamartin Human genes 0.000 description 1
- 101000795659 Homo sapiens Tuberin Proteins 0.000 description 1
- 206010068771 Soft tissue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026911 Tuberous sclerosis complex Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000025261 autosomal dominant disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 210000004276 hyalin Anatomy 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000004197 mesenchymoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 208000009999 tuberous sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于荧光原位杂交探针应用领域，公开了一种用于诊断Xp11.2易位性PEComa的探针组合及其应用。该探针组合为BAC克隆片断RP11-918B12，RP11-916D13，RP11-416B14，RP11-344N17。该探针组合诊断Xp11.2易位性PEComa的特异性和敏感性均达到了100％，不但方便、快速、可靠，而且成功率高，可用于制备Xp11.2易位性PEComa诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于荧光原位杂交探针应用领域，涉及一种用于诊断Xp11.2易位性PEComa的探针组合及其在制备Xp11.2易位性PEComa诊断试剂中的应用。
背景技术
血管周上皮样细胞肿瘤(perivascular epithelioid cell neoplasms，PEComa)是一种在组织学和免疫表型上具有血管周上皮样细胞特征的间叶性肿瘤。PEComa家族包括肝脏和肾脏的血管平滑肌脂肪瘤(angiomyolipoma，AML)、淋巴管肌瘤病(lymphangioleiomyomatosis)、肺透明细胞“糖”瘤(clear cell“sugar”tumor)以及发生于腹盆腔、消化道、泌尿生殖道、周围软组织和皮肤等部位的不能完全归入上述这几种特殊类型的PEComa，因此被称为非特殊性PEComa。PEComa的发生部位及形态特征多样，因此诊断难度较大。
从分子遗传学角度出发，大部分PEComa的发病和TSC1和TSC2基因的突变和缺失相关，如果该基因是胚系突变，则表现为常染色体显性遗传性疾病结节性硬化症。除此以外，最近的研究已经发现一部分PEComa的发病机制和TFE3基因的易位相关，并且该部分病例不存在TSC基因的改变。提示他们存在不同的发病机制，从而也存在不同的分子治疗靶点。随着个体化分子靶向治疗时代的到来，根据基因型，来精确诊断此类肿瘤显得十分重要。
目前国内外文献中仅仅通过RT-PCR的方法检测出该类PEComa存在1号染色体PSF基因和X染色体TFE3基因融合，形成PSF-TFE3融合基因。目前认为由于启动子的变换，这些融合基因最终高表达TFE3融合蛋白。因此应用免疫组化检测细胞核TFE3融合蛋白是目前诊断Xp11.2易位性PEComa重要方法之一。但其缺点是该方法容易受到多种因素影响，如组织固定时间、组织修复方式、抗体克隆号以及人为的判读因素等等。使得结果可能出现假阳性或假阴性。尤其是当组织学形态不典型时诊断往往更加困难。
由于不同肿瘤PSF或TFE3基因的融合或易位的节点不一定，RT-PCR方法检测所用的引物很难设计。实际工作中常常出现假阴性的结果，其操作也不便捷。更精确且便捷的分子病理诊断方法有待于进一步建立。
染色体荧光原位杂交(FISH)始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，快速灵敏、特异性好，可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。此外，FISH的方法，可以在石蜡包埋的样本上进行回顾性研究，大大降低了对研究样本的要求。目前，利用荧光原位杂交(FISH)来检测PSF-TFE3融合基因的方法国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种用于诊断Xp11.2易位性PEComa的探针组合。
本发明另一个目的是提供上述探针组合在制备Xp11.2易位性PEComa诊断试剂中的应用。
本发明再一个目的是提供含有上述探针组合的诊断试剂盒。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种用于诊断Xp11.2易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合，该探针组合由BAC克隆片断RP11-918B12，RP11-916D13，RP11-416B14，RP11-344N17组成；其中，RP11-918B12和RP11-916D13定位于PSF着丝粒一侧，二者标记为相同的任意一种颜色的荧光；RP11-416B14和RP11-344N17定位于TFE3端粒一侧，二者标记为相同但与PSF着丝粒一侧标记的颜色不同的荧光。
RP11-918B12和RP11-916D13均标记为绿色荧光，RP11-416B14和RP11-344N17均标记为红色荧光；或者将标记的荧光颜色互换。
上述探针组合在制备Xp11.2易位性血管周上皮样细胞肿瘤诊断试剂中的应用。
一种Xp11.2易位性血管周上皮样细胞肿瘤诊断试剂盒，该试剂盒包含上述探针组合。
以下是本发明技术方案详细的说明：
本发明采用的探针组合为国内外首次利用FISH方法检测PSF-TFE3融合基因，是基于对染色体上PSF基因着丝粒侧和TFE3基因端粒侧的不同的BAC克隆片段结合位点的分布位置、大小等情况的分析而采取的优选方案。相比于本研究小组之前公开的TFE3分离探针有本质区别，二者检测的内容和设计原理均是不一样的。TFE3分离探针是检测TFE3基因有无断裂分离，一旦TFE3基因断裂则出现分离信号，更重要的是无法得知断裂后的TFE3基因和谁融合。基于Xp11.2易位性PEComa的最新研究结果(该肿瘤含有PSF-TFE3融合基因)，本发明公开的是PSF-TFE3融合基因探针，一旦肿瘤含有PSF-TFE3融合基因，则出现融合信号，其检测到的不仅是TFE3基因的断裂，同时检测到TFE3基因融合的对象PSF基因。相比于TFE3分离探针，PSF-TFE3融合探针对Xp11.2易位性PEComa的诊断更具有特异性。此外融合探针和分离探针在制片判读过程中也会存在优劣差异。由于FISH是在2μm的组织切片上进行，分离信号由于距离远，很容易被切散，而不在同一张切片上。因此给观察和判读信号带来不便。而融合信号本身几乎没有距离，不容易被切散，所以观察和判读信号更具优势。
本发明中，PSF着丝粒一侧BAC克隆片段为RP11-918B12(片段长度182kb)和RP11-916D13(片段长度176kb)，TFE3端粒一侧BAC克隆片段为RP11-416B14(片段长度182kb)和RP11-344N17(片段长度202kb)，这些片段为细菌人工染色体(Bacterialartificial chromosome，BAC)克隆，其在人类染色体上的定位已经公开，分别为RP11-918B12(1号染色体35566945-35749420)、RP11-916D13(1号染色体35979254-36155316)、RP11-416B14(X染色体48465815-48648142)、RP11-344N17(X染色体48010297-48212489)。PSF基因的定位为(1号染色体35421787-35431322)。TFE3基因的定位为(X染色体48771185-48787934)。BAC克隆片段与PSF基因的链接顺序为PSF，RP11-918B12，RP11-916D13，1号染色体着丝粒；BAC克隆片段与TFE3基因的链接顺序为X染色体着丝粒，TFE3，RP11-416B14，RP11-344N17。
TFE3基因与染色体上结合的BAC克隆片段之间以及相邻BAC克隆片段之间保持一定距离而不会重叠(本发明中最大为202kb，最小为176kb)。这样，由于采用的BAC克隆片段大小相近(本发明中最大和最小之间相差仅为26kb)，两端BAC克隆片段之间最远距离控制在1500kb以内，彼此之间存在适当的间隔，使得在进行荧光观察时，TFE3端粒侧两个BAC克隆片段显示为一个荧光信号，如红色，PSF着丝粒侧两个BAC克隆片段显示另一个荧光信号，如绿色，在非Xp11.2易位性PEComa不存在PSF-TFE3融合基因时，红绿两种荧光离得比较远，观察时无需放大即可见到分离较远的红绿两种信号；当Xp11.2易位性PEComa存在PSF-TFE3融合基因时，红绿两种荧光靠得比较近，观察时出现红绿融合信号(表现为红绿相连或黄色信号点)，很容易观察。
在X染色体TFE3基因端粒侧和1号染色体PSF着丝粒侧，每端连接2个标记同种颜色的荧光的BAC克隆片段是为了增强荧光强度及范围，通过实验观察，2个BAC克隆片段的荧光强度及范围已经足够观察，既避免了1个BAC克隆片段可能出现荧光强度不够范围过小的情形，又避免了采用多个BAC克隆片段会导致荧光范围较分散容易产生干扰并且成本也较高的弊端。
选择这4种BAC克隆片段有以下几个方面的考虑：①这几个BAC克隆片段大小相近，带来的好处是：每一端的荧光强度保持一致，防止一端过强而另一端过弱而影响观察；另外可使原位杂交条件保持一致性。②结合位置使相邻BAC克隆片段之间能够保持适当的距离，能够增强每一端荧光强度及范围。③可使TFE3基因端粒侧和PSF基因着丝粒侧BAC克隆片段最远距离控制在1500kb之内，当两基因融合时呈现融合信号(如表现为红绿相连或黄色信号点)，而在TFE3基因和PSF基因不存在融合时，两种荧光颜色分离比较远，很容易观察。否则，若TFE3基因端粒侧和PSF基因着丝粒侧BAC克隆片段最远距离过大，如超过1500kb甚至更大，则无论两基因是否融合，均观察到明显分离的两种荧光，就很难判断是否存在PSF-TFE3融合基因。
本发明的有益效果：本发明根据Xp11.2易位性PEComa的特点，设计结合在TFE3基因端粒侧和PSF基因着丝粒侧的荧光标记DNA探针组合，利用该探针组合，在石蜡包埋组织切片的基础上与肿瘤组织芯片进行原位杂交，检测是否存在PSF-TFE3融合基因，可大大提高诊断该类肿瘤的准确率。为诊断分型及分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果，该探针组合诊断的特异性和敏感性均达到了100％，且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行，时间仅为两个工作日。采用本发明提供的探针组合进行检测Xp11.2易位性PEComa，不但方便、快速、可靠，而且成功率高，可用于制备Xp11.2易位性PEComa诊断试剂盒，为Xp11.2易位性PEComa的快速准确的诊断提供了新的工具。
附图说明
图1：BAC克隆探针定位模式图。
图2：RT-PCR方法检测出Xp11.2易位性PEComa的融合基因。测序结果显示1号染色体和X染色体存在易位，形成PSF-TFE3融合基因(PSF外显子6与TFE3外显子2相连)。
图3：组织芯片的平面图。
图4：PSF-TFE3融合探针FISH对Xp11.2易位性PEComa检测结果，肿瘤存在融合信号，记为阳性结果。
图5：用PSF-TFE3融合探针对正常组织FISH检测结果，组织中不存在融合信号，记为阴性结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。
实施例中所述的探针即BAC克隆片段，也可以叫BAC克隆探针。
实施例1：DNA探针组合的制备：
选择能够在X染色体TFE3基因端粒侧和1号染色体PSF基因着丝粒侧分别连接的2个BAC克隆片段，控制两端探针之间最远距离在1500kb以内，BAC克隆片段之间保持一定距离不重叠，片段大小相近。克隆片段出处为EmpireGenomics公司的人类BAC克隆中心(http://www.empiregenomics.com/helixhq/clonecentral/search/human)。PSF着丝粒一侧BAC克隆片段为RP11-918B12(片段长度182kb)和RP11-916D13(片段长度176kb)，TFE3端粒一侧BAC克隆片段为RP11-416B14(片段长度182kb)和RP11-344N17(片段长度202kb)。BAC克隆片段与PSF基因的链接顺序为PSF，RP11-918B12，RP11-916D13，1号染色体着丝粒；BAC克隆片段与TFE3基因的链接顺序为X染色体着丝粒，TFE3，RP11-416B14，RP11-344N17。探针组合的定位结构如图1所示。利用缺口平移方法将TFE3端粒侧的二个BAC克隆片段标记成相同的任意一种颜色的荧光，优选红色荧光，将PSF着丝粒侧的二个BAC克隆片段标记成相同但与TFE3端粒侧标记的颜色不同的荧光，优选绿色荧光；两端标记的荧光颜色可以互换。这些方法为本领域技术人员所熟知(由美国EmpireGenomics公司提供上述这些服务)。PSF着丝粒一侧两个BAC克隆片段在荧光显微镜下为一个绿色荧光信号，代表PSF基因着丝粒侧。TFE3端粒一侧两个BAC克隆片段在荧光显微镜下为一个红色荧光信号，代表TFE3基因端粒侧。两端标记的荧光颜色可以互换。正常情况下红绿信号分离，在PEComa存在PSF-TFE3融合基因时，则观察到融合信号。
进一步，可将制备的探针组合采用荧光原位杂交方法，在Xp11.2易位性PEComa、非Xp11.2易位性PEComa和肿瘤旁组织中验证其定位和/或诊断效果是否可靠。
实施例2：荧光原位杂交过程：
一、标本的组织芯片构建：
收集南京军区南京总医院诊断PEComa61例。由两位经验丰富的病理医生参照WHO软组织肿瘤分类标准、免疫组化TFE3阳性、及RT-PCR检测融合基因结果(图2，61例患者中有1例是在mRNA层面得到了诊断，与本实验结果相互对应更能体现出本实验的可靠性)，进行诊断评估，结果最终诊断Xp11.2易位性PEComa5例、其他类型PEComa 56例。将以上标本(包括肿瘤和肿瘤旁组织)制作成组织芯片(图3)，所有标本均为10％福尔马林固定，常规组织处理、石蜡包埋。采用手工制作组织芯片。所用组织芯片制作仪为美国Beecher手动点样议，取样针直径2mm。每个样本分别选取肿瘤及肿瘤旁组织，并重复2次。
二、荧光原位杂交：
组织芯片3μm厚切片，在脱蜡后，依次置于100％、85％、70％乙醇中各2min，随后浸入去离子水中，100℃水浴15min。将组织切片放入胃蛋白酶K溶液(0.1g胃蛋白酶，40mL0.01MHCl)37℃，15min；2×SSC(氯化钠、柠檬酸钠)漂洗2次，各5min，切片置于0.1mol/L HCl中室温浸泡10min，用2×SSC漂洗2次，各5min；经70％、85％、100％乙醇各脱水2min，于空气中干燥；在组织区域加10μL探针混合液(其中每个探针各0.5μL，4个探针共2μL，另加8μL的杂交缓冲液，杂交缓冲液在购买探针时由EmpireGenomics公司提供，内含人类Cot1DNA)，加盖玻片，用橡皮胶封边；放入原位杂交仪(GeneAmp In Situ PCR System 1000)中88℃变性6min后37℃过夜(16h)；移去盖玻片，将玻片置于0.4×SSC(氯化钠、柠檬酸钠、0.3％NP-40)溶液中，69℃漂洗1min；2×SSC(氯化钠、柠檬酸钠、0.1％NP-40)溶液中漂洗1min，70％乙醇3min，室温暗处干燥；靶区域滴加10μl4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole DAPI)，用盖玻片封片后，再用荧光显微镜观察结果。
结果判定：
正常细胞X染色体，男性标本可见1个红色信号，女性可见2个红色信号，1号染色体，无论男女都可见2个绿色信号。无论男女所有信号均为独立信号。
肿瘤细胞，男性标本可见一对红绿融合的异常信号，和1个绿色野生型信号。女性可见一对红绿融合的异常信号，和红绿各1个野生型信号。无论男女都可见融合信号。
为排除假阳性和假阴性，每个样本计数100个细胞，只有当4个荧光信号(女性)或3个荧光信号(男性)均存在时，才纳入计数对象(在女性，无论正常和肿瘤我们都会看到4个单信号(两绿和两红)，只不过在正常女性红绿信号是分离的，看上去是四个单信号组成。在肿瘤中见到一个融合信号和一对红绿分离的单信号，表面上看是3个信号，但实际还是由4个单信号组成的)。红绿荧光信号之间的距离小于一个信号宽度时计为融合信号。当异常信号大于10％时记为阳性。以上结果判断方法依据市面上多数类似的商业化探针所行使的评判标准，如Vysis公司和Dako公司的探针使用方法。
结果：
我们对61例PEComa进行检测，其中Xp11.2易位性PEComa5例、其他类型PEComa56例。结果5例Xp11.2易位性PEComa均检测出异常分离信号，其阳性细胞数范围在30％－75％(荧光显微镜无法给出100个细胞的视野供人观察，因此30％－75％的数据只能靠多次计数得来)，其余肿瘤及肿瘤旁正常组织均未检测出异常信号(图3－5给出了组织芯片、Xp11.2易位性PEComa代表性阳性图片、正常组织的阴性图片)。说明使用该探针检测Xp11.2易位性PEComa的特异性和敏感性同为100％
敏感性＝真阳性/所有Xp11.2易位性PEComa肿瘤病人数×100％；5真阳性病例/5Xp11.2易位性肾癌＝100％；
特异性＝真阴性/所有非Xp11.2易位性PEComa肿瘤病人数×100％；56真阴性病例/56非Xp11.2易位性PEComa肿瘤病人。
评价：
本组探针使用的克隆片段相对较少，且克隆片段大小相对一致，最大和最小之间相差仅为26kb。在设计上即考虑到了经济性又考虑到了原位杂交条件的一致性。此外，在本实验中该荧光原位杂交探针的特异性和敏感性均达到了100％。利用FISH技术，使用PSF-TFE3双色融合荧光原位杂交探针来诊断Xp11.2易位性PEComa，快速、可靠且成功率高，是诊断Xp11.2易位性PEComa的一项新技术，值得推广。
实施例3：Xp11.2易位性PEComa诊断试剂盒
试剂盒中含有实施例1所述的探针组合，该探针组合的特征主要是：
⑴PSF着丝粒一侧BAC克隆探针为RP11-918B12(片段长度182kb)和RP11-916D13(片段长度176kb)，标记绿色荧光。这两个探针在荧光显微镜下为一个绿色荧光信号，代表PSF基因着丝粒侧。
⑵TFE3端粒一侧BAC克隆探针为RP11-416B14(片段长度182kb)和RP11-344N17(片段长度202kb)，标记红色荧光。这两个探针在荧光显微镜下为一个红色荧光信号，代表TFE3基因端粒侧。
⑶正常情况下红绿信号分离，在Xp11.2易位性PEComa时，由于X染色体TFE3基因和1号染色体PSF基因融合，使得杂交结果出现融合信号。
Claims (4)
1.一种用于诊断Xp11.2易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合，其特征在于，该探针组合由BAC克隆片断RP11-918B12，RP11-916D13，RP11-416B14，RP11-344N17组成；其中，RP11-918B12和RP11-916D13定位于PSF着丝粒一侧，二者标记为相同的任意一种颜色的荧光；RP11-416B14和RP11-344N17定位于TFE3端粒一侧，二者标记为相同但与PSF着丝粒一侧标记的颜色不同的荧光。
2.根据权利要求1所述的用于诊断Xp11.2易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合，其特征在于，RP11-918B12和RP11-916D13均标记为绿色荧光，RP11-416B14和RP11-344N17均标记为红色荧光；或者将标记的荧光颜色互换。
3.权利要求1或2所述的探针组合在制备Xp11.2易位性血管周上皮样细胞肿瘤诊断试剂中的应用。
4.一种Xp11.2易位性血管周上皮样细胞肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1或2所述的探针组合。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410410230.5A CN104212889B (zh) | 2014-08-19 | 2014-08-19 | 一种用于诊断Xp11.2 易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410410230.5A CN104212889B (zh) | 2014-08-19 | 2014-08-19 | 一种用于诊断Xp11.2 易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104212889A true CN104212889A (zh) | 2014-12-17 |
| CN104212889B CN104212889B (zh) | 2017-06-06 |
Family
ID=52094792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410410230.5A Expired - Fee Related CN104212889B (zh) | 2014-08-19 | 2014-08-19 | 一种用于诊断Xp11.2 易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104212889B (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105717082A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-06-29 | 管晓翔 | 一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法 |
| CN107022610A (zh) * | 2017-04-01 | 2017-08-08 | 常州桐树生物科技有限公司 | 肿瘤驱动基因的检测芯片及其应用 |
| CN107177677A (zh) * | 2017-06-06 | 2017-09-19 | 首都医科大学附属北京儿童医院 | 一种用于检测tert基因断裂的探针组、试剂盒及其应用 |
| CN107267608A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-10-20 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种Xp11.2的新易位伴侣及其检测引物和应用 |
| CN107287326A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-10-24 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种Xp11.2的新易位伴侣FUBP1及其检测引物和应用 |
| CN107299152A (zh) * | 2017-08-29 | 2017-10-27 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断mitf易位性肾癌的分离探针组合及其应用 |
| CN109022434A (zh) * | 2018-09-17 | 2018-12-18 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断actb-tfeb易位性肾癌的探针组合及其应用 |
| CN109182519A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-11 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断acta2-mitf易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合及其应用 |
| CN109321653A (zh) * | 2017-07-26 | 2019-02-12 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断prcc-mitf易位性肾癌的探针组合及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102424848A (zh) * | 2011-12-26 | 2012-04-25 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断Xp11.2易位性肾癌的探针组合及其应用 |
| CN103952493A (zh) * | 2014-05-20 | 2014-07-30 | 南京大学医学院附属鼓楼医院 | 肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针及其试剂盒应用 |
-
2014
- 2014-08-19 CN CN201410410230.5A patent/CN104212889B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102424848A (zh) * | 2011-12-26 | 2012-04-25 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断Xp11.2易位性肾癌的探针组合及其应用 |
| CN103952493A (zh) * | 2014-05-20 | 2014-07-30 | 南京大学医学院附属鼓楼医院 | 肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针及其试剂盒应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 刘飞飞等: "伴有TFE3 扩增的宫颈血管周上皮样细胞肿瘤", 《临床与实验病理学杂志》 * |
| 沈勤等: "伴有TFE3扩增的肾脏上皮样血管平滑肌脂肪瘤", 《临床与实验病理学杂志》 * |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105717082A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-06-29 | 管晓翔 | 一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法 |
| CN107022610A (zh) * | 2017-04-01 | 2017-08-08 | 常州桐树生物科技有限公司 | 肿瘤驱动基因的检测芯片及其应用 |
| CN107177677A (zh) * | 2017-06-06 | 2017-09-19 | 首都医科大学附属北京儿童医院 | 一种用于检测tert基因断裂的探针组、试剂盒及其应用 |
| CN107177677B (zh) * | 2017-06-06 | 2018-03-06 | 首都医科大学附属北京儿童医院 | 一种用于检测tert基因断裂的探针组、试剂盒及其应用 |
| CN107267608A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-10-20 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种Xp11.2的新易位伴侣及其检测引物和应用 |
| CN107287326B (zh) * | 2017-07-26 | 2018-02-16 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种Xp11.2的新易位伴侣FUBP1及其检测引物和应用 |
| CN107287326A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-10-24 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种Xp11.2的新易位伴侣FUBP1及其检测引物和应用 |
| CN109321653A (zh) * | 2017-07-26 | 2019-02-12 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断prcc-mitf易位性肾癌的探针组合及其应用 |
| CN109321653B (zh) * | 2017-07-26 | 2021-07-06 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断prcc-mitf易位性肾癌的探针组合及其应用 |
| CN107299152A (zh) * | 2017-08-29 | 2017-10-27 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断mitf易位性肾癌的分离探针组合及其应用 |
| CN107299152B (zh) * | 2017-08-29 | 2020-03-03 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断mitf易位性肾癌的分离探针组合及其应用 |
| CN109022434A (zh) * | 2018-09-17 | 2018-12-18 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断actb-tfeb易位性肾癌的探针组合及其应用 |
| CN109182519A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-11 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断acta2-mitf易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合及其应用 |
| CN109182519B (zh) * | 2018-09-17 | 2019-06-14 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断acta2-mitf易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合及其应用 |
| CN109022434B (zh) * | 2018-09-17 | 2021-07-06 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种用于诊断actb-tfeb易位性肾癌的探针组合及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104212889B (zh) | 2017-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104212889A (zh) | 一种用于诊断Xp11.2 易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合及其应用 | |
| CN102424848B (zh) | 一种用于诊断Xp11.2易位性肾癌的探针组合及其应用 | |
| EP2678446B1 (en) | Presence of erg gene rearrangements and protein over-expression in low grade pin (lg-pin) in prostate biopsies | |
| CN110387421A (zh) | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 | |
| Kiran et al. | The significance of MUM1/IRF4 protein expression and IRF4 translocation of CD30 (+) cutaneous T-cell lymphoproliferative disorders: a study of 53 cases | |
| Schreuder et al. | FISH analysis of MALT lymphoma‐specific translocations and aneuploidy in primary cutaneous marginal zone lymphoma | |
| TR201815847T4 (tr) | İnvazif olmayan kanser teşhisi. | |
| CN104011227A (zh) | 用于前列腺癌的诊断、预后和评估治疗性/预防性治疗的材料和方法 | |
| CN108169490B (zh) | 一组用于评估胶质母细胞瘤预后的联合蛋白及其应用 | |
| CN112014562A (zh) | 用于免疫检查点pd-1/pd-l1动态监测的标记物组合、方法及系统 | |
| CN104388423A (zh) | Aspl-tfe3融合性肾癌基因探针及其试剂盒应用 | |
| CN109182519B (zh) | 一种用于诊断acta2-mitf易位性血管周上皮样细胞肿瘤的探针组合及其应用 | |
| WO2017114011A1 (zh) | Her-2基因和/或top2a基因检测探针及其制备方法和试剂盒 | |
| CN107299152B (zh) | 一种用于诊断mitf易位性肾癌的分离探针组合及其应用 | |
| CN107299134B (zh) | 一种用于诊断prcc-tfe3易位性肿瘤的pcr引物组合及其应用 | |
| CN109022434B (zh) | 一种用于诊断actb-tfeb易位性肾癌的探针组合及其应用 | |
| CN109666746A (zh) | 用于检测人类ros1基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法 | |
| CN108977535A (zh) | 一种用于检测膀胱肿瘤良恶性程度的模型及其应用 | |
| CA2577623A1 (en) | Methods of diagnosis or detection using three-dimensional analysis | |
| WO2017114010A1 (zh) | Top2a基因检测探针及其制备方法和试剂盒 | |
| EP1934367A1 (en) | Molecular method for diagnosis of prostate cancer | |
| EP3633045B1 (en) | Model, diagnostic method, and application thereof | |
| CN109321653B (zh) | 一种用于诊断prcc-mitf易位性肾癌的探针组合及其应用 | |
| WO2017114004A1 (zh) | Erg基因检测探针及其制备方法和试剂盒 | |
| CN110257411B (zh) | 一种用于诊断ewsr1-tfeb易位性肾癌的探针组合及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170606 |