CN112014562A - 用于免疫检查点pd-1/pd-l1动态监测的标记物组合、方法及系统 - Google Patents

用于免疫检查点pd-1/pd-l1动态监测的标记物组合、方法及系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于免疫检查点PD‑1/PD‑L1动态监测的标记物组合、方法及系统。该方法采用Opal/TSA多标记免疫荧光技术在肿瘤组织中同时检测多个与肿瘤免疫相关的标志物并结合Vectra自动多光谱定量病理图像分析系统进行数据处理。本发明的方法可以对肿瘤免疫抑制剂的实际用药进行指导，在同一组织上，不同免疫检测点以及免疫细胞标志物均可检测到信号，不仅能够对细胞进行亚分型，并获得各个表型的细胞，对肿瘤患者治疗前后的疗效判断以及指导肿瘤免疫治疗提供理论依据。还可以为肿瘤免疫治疗疗效提供动态检测，更好的指导临床用药，使更多肿瘤患者能受益于免疫治疗；在检测靶点上比常规免疫组化检测技术更加丰富和更直观。

Description

用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合、方法及 系统
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合、方法及系统。
背景技术
当今社会,由于人口老龄化、生活方式和生存环境等多种因素的影响,癌症已成为全社会日益关注的焦点问题。据WHO的数据，全球范围内有1/6的人口死亡是由于罹患癌症，同时有1/2的人群会在整个生命周期中出现不同种类的肿瘤。近年来，作为肿瘤治疗新的革命性技术，免疫治疗尤其是免疫检查点治疗模式发展迅猛，多个程序性死亡受体/配体-1(PD-1/PD-L1)抑制剂在肺癌、肝癌、黑色素瘤等十几种恶性肿瘤中迅速得到临床批准。如何提高PD-1/PD-L1抑制剂的疗效，并对疗效进行精准评估和动态监测成为临床界最关注的问题。
PD-1/PD-L1免疫疗法是一种当前备受瞩目的抗肿瘤疗法，旨在利用人体自身的免疫系统对抗肿瘤细胞。前者是免疫T细胞表面的一种受体，后者是癌细胞分泌的。当两者结合时，通过传递抑制信号阻止免疫T细胞活化，免疫T细胞将被窒息并促使癌细胞生长。但是，现有的通过PD-1或PD-L1蛋白抗体进行的重度免疫疗法，阻止了PD-1和PD-L1的识别，从而恢复了T细胞的正常识别和防御攻击功能，并杀死了肿瘤细胞。PD-1表达于多种肿瘤组织中的肿瘤浸润型淋巴细胞，包括头颈部癌、黑色素瘤和非小细胞肺癌(non-small-celllung cancer,NSCLC)；PD-L1也在多种恶性肿瘤中高表达，如NSCLC等。然而，PD-1/PD-L1抑制剂(如Nivolumab和Pembrolizumab等)因其在多种恶性肿瘤中临床疗效良好且患者能获得长期缓解，被认为是有潜力的抗肿瘤药物，但总体应答率仅为20-30％，且可产生获得性抵抗，以及其高发的耐药问题(包括原发性及获得性耐药)仍不容忽视。目前研究显示抗PD-1/PD-L1单抗的原发性耐药与肿瘤免疫微环境动态变化、肿瘤突变负荷及致癌通路激活等因素相关。
PD-L1表达具有时空异质性，其表现为空间和时间两个方面。空间异质性表现为PD-L1表达在同一肿瘤的不同位置，这种位置的异质性意味着穿刺部位不同导致PD-L1表达检测结果不同。空间异质性还表现为肿瘤转移到不同部位后PD-L1表达也不尽相同，如肾上腺和肝脏转移灶活检组织PD-L1表达通常比较高，转移灶位于骨骼或者头颅时PD-L1表达比较低。时间异质性表现为随着病程的延长，肿瘤PD-L1表达也会发生动态变化。
在治疗过程中，由于肿瘤的时空异质性，需要进行不同部位、不同治疗节点的多次基因信息检测，在临床上需进行更加精准的治疗。目前临床上主要通过影像学和肿瘤标记物进行肿瘤监测/疗效评价，但存在灵敏度和特异性不足的问题，而且单从影像学和肿瘤标记物的表达只能判断病情进展，却无法得知疾病进展的真正原因。目前，PD-L1表达水平的检测主要是通过传统免疫组织化学方法，由于存在肿瘤异质性和微小转移灶不可见的原因，原位癌组织中PD-L1检测并不能直接反映体液及转移灶中PD-L1的水平。而PD-L1表达判读涉及到多个方面，如肿瘤细胞、免疫细胞、肿瘤细胞数量、阳性强度等等。传统的免疫组化结果判读，应首先观察HE染色切片，确定肿瘤细胞的数量及在切片中的位置，然后低倍镜下观察PD-L1免疫组化切片，确定PD-L1是否阳性以及阳性的部位，最后高倍镜下观察符合要求的PD-L1染色的肿瘤细胞以及计算百分比，但是这种方法往往不能辨别阳性信号具体出现在哪个细胞。而且肿瘤患者单纯PD-L1表达水平的检测，并不能准确反映患者接受PD-1/PD-L1治疗的效果。治疗效果的差异取决于肿瘤微环境的异质性和复杂性，这反映在肿瘤细胞和肿瘤浸润的淋巴细胞(TILs)表达的免疫检查点之间的差异和相互作用。
肿瘤的免疫治疗是一个动态变化的过程，是发动人体自身免疫细胞去攻击癌细胞，与人体自身的免疫系统与肿瘤的一次殊死搏斗。因此，或许真正最靠谱的预测PD-1/PD-L1抗体是否起效的办法，还是通过用药前后多次的穿刺活检取得肿瘤组织，进行详细的免疫表型分析。因此迫切需要一种新的方法，对肿瘤患者整体PD-1/PD-L1表达水平和患者免疫细胞状态进行动态监测，联合二者检测结果用于动态监测患者PD-1/PD-L1治疗的疗效，为疾病治疗方案的选择提供参考，更好的指导临床应用。mIHC可以更直观地看到肿瘤微环境中每个免疫检查点以及免疫细胞，定位、定量和相互作用，可为上述传统方法的局限性提供一些解决方案。mIHC可以同时检测同一组织切片样品上的多个免疫相关分子。这对于理解肿瘤微环境中各种细胞之间的关系，分析信号通路的上游和下游蛋白表达之间的关系，以及对于临床诊断和治疗都至关重要。通过多标记全景分析的方法，可以充分有效地研究肿瘤的微环境。mIHC的另一个好处是通过应用图像分析提高了定位的准确性，并使用了专门用于指示组织结构的界标标记。借助多光谱成像技术和定量分析软件，可以更清楚地了解肿瘤微环境中免疫检查点(如PD-L1肿瘤细胞)与TILs之间的时空分布关系。同时，通过mIHC对PD-1/PD-L1进行动态监测可了解患者对治疗药物的敏感性，及早发现耐药信号。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中尚无采用mIHC的方法同时检测PD-1/PD-L1表达水平在肿瘤样本治疗前后的肿瘤细胞和TILs表达之间的差异，提出了一种用于PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合、方法及系统。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合，其特征在于：所述标记物组合由PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD68和CK组成。
第二方面，本发明提供一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)收集免疫治疗前后的石蜡包埋肿瘤样本；
2)利用多色免疫荧光组织化学技术检测用于评估免疫治疗疗效的标记物组合；所述标记物组合由PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD68和CK组成；
3)利用Vectra自动多光谱定量病理图像分析系统采集多标记的实验结果并详细分析PD-1/PD-L1相关的免疫表型；所述定量病理图像分析系统包括PerkinElmer多光谱成像设备和inForm2.4图像定量分析软件；
4)根据所获得以上结果，提交PD-1/PD-L1表达状态的分子报告。
作为优选方案，所述步骤1)中的肿瘤样本包括均处于中晚期的肺癌、恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈部和胃肠道肝胆系统的恶性肿瘤细胞。
进一步地，所述步骤2)中，多色免疫荧光组织化学技术依次检测相应的PD-1/PD-L1免疫检查点和淋巴细胞、巨噬细胞标记物；在检测过程中，需要注意抗体和不同荧光染料的最佳搭配以及检测顺序。
更进一步地，所述步骤3)中，采用PerkinElmer多光谱成像设备和inForm2.4图像定量分析软件详细分析PD-1/PD-L1相关的免疫表型，在阴性对照和阳性对照的协助下，可完成每个指标的单通道分析，肿瘤与间质区域的区分，组织分割、细胞分割以及感兴趣免疫表型的新发现及定量获取。
更进一步地，所述步骤4)中，提交PD-1/PD-L1表达状态的分子报告，在完成每个指标的详细分析中，对比免疫治疗前后的样本，对获取的PD-1/PD-L1相关的免疫表型和细胞毒性T细胞的改变，提交分子报告。
第三方面，本发明提供一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的系统，其特征在于：包含如上述的标记物组合；或者采用如上述的用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，以实现免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测功能。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明提出的采用mIHC的方法动态监测PD-1/PD-L1的表达水平。病理科医生只需将治疗前后的的肿瘤石蜡包埋样本进行mIHC染色，就能同时检测多种分子标记物，将多元化信息呈现在同一视野内，更能直观的反映出肿瘤微环境中各个免疫检查点的定位以及相互作用的量的变化，并能获得各种表型细胞亚群，对免疫治疗效果进行评估并指导肿瘤免疫治疗提供理论依据。该方法用于PD-1/PD-L1动态监测，不仅显著丰富了从组织微环境中提取数据，扩充了细胞亚型之间的关系，分析以获取更有利的信息；并且在尽可能地保留原有组织的条件下，更加深入地了解肿瘤的异质性和驱动疾病发生的分子生物学机制。这为以后更精准的进行肿瘤疗效评估和免疫抑制剂的联合用药，了解肿瘤样本对治疗药物的敏感性，及早发现耐药信号提供了一个至关重要的平台和系统。
具体优点如下：
1、本发明的检测方法运用Opal/TSA多标记免疫荧光技术，与运用常规的免疫组化/荧光技术标记的酶标二抗放大检测信号相比，本发明可以同时标记6个及以上靶点，常规的免疫组化的方法只能同时标记2-3种靶点，而且只能证实标记物是否有表达，但很难精确定位到具体的细胞。
2、本发明的检测方法通过微波去除了前一步骤里的一抗-二抗-辣根过氧化物酶(HRP)复合物，所以没有抗体的交叉反应，那么一抗就可以来源于同一种属。抗体种属差异不影响多标的检测，只需要重复前一步的染色过程，使用简单方便，其染色效果也更加稳定，灵敏度更强，特异性更好，荧光信号淬灭时间更长。
3、本发明的检测方法的一抗工作浓度比常规的免疫组化要求的浓度低，说明此方法的灵敏度高，这样可大大降低实验成本。
4、本发明的实验结果使用Vectra自动多光谱定量病理图像分析系统采集的图像再经过其独有的inForm高级图像分析软件，以“圈选-训练”的方式教会软件辨识特定的组织类型，通过类流式聚类统计分析，进一步精准识别单个细胞以及共定位表达的不同表型的细胞亚型，甚至对细胞核、细胞质、细胞膜中各自的蛋白表达进行定量分析，从而明确各个免疫检查点的定位和表达量，相互之间表达量的关系以及空间分布距离。并且可以识别背景自发荧光并降低背景染色，从而使各个靶点的信噪比大大提高。
5、本发明实验结果通过多光谱成像的另外一个优势是可以实现荧光和明场视野的自由互换，即使在没有做常规免疫组化的情况下，也可以通过该软件看到明场的单标图像。
6、本发明可对肿瘤样本治疗前后的疗效进行动态监测，如根据PD-1/PD-L1，CD8阳性细胞的降低或升高情况监测肿瘤治疗是否有效以及耐药情况；可以评估肿瘤样本免疫治疗效果，更精准的指导PD-1/PD-L1抑制剂的治疗。
本发明动态监测PD-1/PD-L1的方法与现有技术如液态活检CTC实时检测PD-L1相比，稳定性强；CTC富集技术的要求极高，假阴性率高，所以使其检出率较低。与现有技术对肿瘤组织中PD-1/PD-L1进行传统免疫组化检测相比，对肿瘤组织中的多个靶点进行标记，能够更精准的反映PD-L1与TILs之间的关系，能够更好的指导用药；另外，本发明的实验结果采用的是inForm软件进行多参数的表型分析，比基于免疫单标的检测技术所包含的肿瘤微环境的信息更丰富更有价值。
附图说明
图1实验流程图；
图2使用PerkinElmer多光谱成像设备和inForm2.4图像定量分析软件进行定量分析的工作流程图；
图3Vextra3.0自动多光谱组织定量病理分析系统工作界面；
图4多光谱解混后获取所需要的各种免疫表型。
具体实施方式
下面结合附图和实施实例对本发明进行进一步地详细的描述。
本发明的检测原理为：首先根据辣根过氧化物酶介导的活化反应，将荧光信号直接富集标记到目标抗原上，使信号有效被放大这一原理，去标记PD1/PD-L1等其他免疫检查点以及免疫细胞，标记的荧光分子以共价键形式与抗原稳定结合，然后根据抗原抗体反应原理，通过洗脱抗体后的多轮复染，实现多标记免疫荧光染色。再用Vectra自动多光谱组织定量病理分析系统，在相同曝光时间内，从420nm到720nm之间每隔20nm捕获荧光光谱，并结合这些捕获的多光谱图像(MSI)创建一个图库，保留所有指标的独特光谱特征。最后再利用inForm图像分析软件进行解混单通道以及通过“圈选-训练”的方式教会软件辨识特定的组织和细胞类型，进行组织分割和细胞分割以及感兴趣免疫表型的训练和分析，最后可获得不同表型的细胞亚型。多色荧光信号必须有荧光显微镜才能观察，有时候不是很方便，如何快速准确的观察分析实验结果也是需要解决的难点。本发明经过多次筛选研究，最终得到一种优化的方法，解决了上述困难，同时在实践过程中进行了多次验证，本发明的检测结果和现有技术相比检测精度和准确率大大提高。
具体来讲，应用本发明的方法实现对PD-1/PD-L1的动态检测的应用方法包括如下步骤：
步骤一：对PD-1/PD-L1及免疫细胞标记物进行mIHC染色，具体操作步骤为：
1)切片准备：将准备好的肿瘤样本石蜡切片放入65℃烤箱烤1h；二甲苯脱蜡三次，每次10min；无水酒精水化三次，按100％、95％、75％浓度梯度，每次10min；蒸馏水冲洗后用10％缓冲甲醛固定液浸泡20min，流水冲洗后用AR缓冲液(由柠檬酸和柠檬酸钠配制而成，用去离子水1：1稀释)冲洗。
2)微波处理：将标本浸泡在AR缓冲液中进行修复，轻盖盖子，100％火力150s，30％火力12min，室温冷却10min，然后修复盒泡在冷水中，让其冷却至室温，蒸馏水冲洗后用TBST(用100ml Tris-HCL缓冲液和5ml Tween配制成10×TBST缓冲液，再加入900ml去离子水配制成1×TBST)缓冲液冲洗。
3)封闭：用免疫组化笔圈定组织，加封闭液，在室温下湿盒内孵育12min。
4)一抗孵育：把封闭液甩去，滴加一抗(PD-1,PD-L1,CD3,CD8,CD68和CK中的一个，用封闭液稀释)在37℃烤箱中孵育或者4℃冰箱内过夜，取出后室温静置30min，用TBST缓冲液冲洗三次，每次2min。
5)二抗孵育：将标本放置于湿盒内，滴加Polymer HRP Ms+Rb二抗，在湿盒室温下孵育10min，用TBST缓冲液在室温下冲洗三次，每次2min。
6)加OPAL荧光：将缓冲液甩干，滴加一种不同发射波长的Opal荧光(加前用荧光稀释液1：100稀释)，放置湿盒37℃烤箱孵育10min，用TBST缓冲液在室温下冲洗三次，每次2min，AR缓冲液冲洗。
7)微波处理：将标本完全浸泡在AR缓冲液中进行微波修复，100％火力150s，30％火力12min，流水冲洗，TBST冲洗[这一步微波修复是为了移除已经结合的一抗-二抗-辣根过氧化物酶(HRP)复合物，方便引入下一个一抗]，接着从步骤4开始重复，若所有需要检测的指标已经检测完，那么进入步骤8。
8)加入DAPI：2滴DAPI(染胞核)溶于1ml TBST，混匀，湿盒室温孵育5min，TBST冲洗2min，蒸馏水冲洗2min，晾干封片。
9)每次实验过程中需要设置阴性对照(未加待检的任何抗体)用于清除自发荧光和阳性对照(扁桃体组织)用于找到每一个必须分析的免疫表型。
步骤二、图像采集和数据分析处理，具体操作步骤为：
1)先用Vectra3.0自动多光谱组织病理定量分析系统在相同的时间内曝光，从420nm到720nm之间每隔20nm捕获荧光光谱，并结合这些捕获的多光谱图像(MSI)创建一个图库，保留所有指标的独特光谱特性。
2)用inForm2.4高级图像分析软件进行解混单通道以及通过”圈选-训练”的方式教会软件辨识特定的组织和细胞类型，进行组织分割和细胞分割，最后可获得不同表型的细胞亚型，特别是能反映肿瘤患者治疗前后的PD-1/PD-L1，细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)等免疫表型的动态改变。
步骤三、据以上结果，提交PD-1/PD-L1表达状态的分子报告
根据检测分析的结果，可以得出以下免疫表型的单位面积(mm2)的定量数据：PD-L1阳性的肿瘤细胞(CK+PD-L1+)，PD-L1阴性的肿瘤细胞(CK+PD-L1-)，细胞毒性T细胞[(CD3+CD8+)+(CD3+CD8+PD-1+)+(CD3+CD8+PD-L1+)]，活性被抑制的T细胞[(CD3+PD-1+)+(CD3+CD8+PD-1+)]，PD-L1阳性的巨噬细胞(CD68+PD-L1+)，PD-L1阴性的巨噬细胞(CD68+PD-L1-)。根据免疫抑制剂治疗前后的数据对比，评估肿瘤患者的治疗反应(细胞毒性T细胞量的改变)、活性被抑制的T细胞量的改变和PD-L1表达状态的改变(PD-L1阳性的肿瘤细胞和巨噬细胞)。
本发明的检测方法和系统，可以适用于多种癌症细胞的检测，所述癌症可包括以下至少一种：肺癌、恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈部和胃肠道肝胆系统的恶性肿瘤、泌尿系统恶性肿瘤等各种实体瘤。
结合本发明的检测方法与现有技术的异同点及具体实施方式及实验数据对本发明的方案进行详细叙述如下：
实施例：
研究对象：
选择PD-L1过表达的NCI-H1299肺癌细胞系制作的小鼠皮下移植瘤模型为研究对象，该细胞系无EGFR、ALK和K-ras的突变。分为模型组和PD-L1抗体治疗组。
实验步骤：
1)小鼠肺癌模型组和PD-L1抗体治疗组的石蜡切片放在烤箱65℃烤1h；二甲苯脱蜡三次，每次10min；100％酒精水化10min，95％酒精水化10min，70％酒精冲洗；去离子水冲洗然后浸泡在10％中性甲醛缓冲液中20min；蒸馏水冲洗，AR缓冲液冲洗；
2)标本浸泡在pH6.0的AR缓冲液中进行微波修复，100％火力修复45s到1min，20％火力修复15min，室温冷却15min-30min，蒸馏水冲洗，TBST缓冲液冲洗；
3)用免疫组化笔将圈定组织，加封闭液，在室温湿盒中孵育10min；
4)将封闭液甩干，依次滴加表1所示顺序的一抗(用封闭液稀释)，孵育时间和温度37℃2h或者4℃过夜用TBST缓冲液冲在室温下洗三次每次2min；
5)将缓冲液甩干加Polymer HRP Ms+Rb，在湿盒室温下孵育10min，用TBST缓冲液在室温下冲洗三次，每次2min；
6)将缓冲液用干，滴加一种不同发射波长的Opal荧光(将Opal试剂溶于75ul的DMSO中，充分溶解，用1×Plus Amplification Diluent以1：100稀释)，在湿盒室温下孵育10min，用TBST缓冲液冲在室温下冲洗三次，每次2min，AR缓冲液冲洗；
7)标本浸泡在AR缓冲液中进行微波修复，100％火力修复45s到1min，20％火力修复15min，室温冷却15min-30min，蒸馏水冲洗，TBST缓冲液冲洗(这一步微波修复是为了移除一抗一二抗HRP复合物，方便引入下个一抗)，接着从步骤3封闭开始重复，若所有的6个指标(PD-1、CD8、CK、CD68、CD3、PD-L1按照此顺序逐个引入)已检测完，那么进入步骤8。
8)加DAPI(2滴DAPI溶于1mi TBST，混匀)，湿盒室温孵育5min，TBST冲洗2min，蒸馏水冲洗2min，晾干封片。实验过程中阳性对照组织采用人扁桃体组织。肺癌组织以TBS代替一抗，其余步骤不变，作为空白对照。
9)用Vectra3.0多光谱组织病理定量分析系统拍照并用inForm软件进行实验结果的定量分析。
具体的一抗检测顺序和对应的荧光染料如表1所示：
表1.一抗的检测顺序和对应荧光染料
Figure BDA0002633748130000141
结果说明：
本发明同时检测了免疫检査点PD-L1、PD-1和上皮标记物CK的表达，T淋巴细胞标记物CD3和细胞毒性T淋巴细胞CD8以及巨噬细胞标记物CD68的表达。从图4可以看出各指标的单通道图像如CK主要用于标记所有上皮来源的正常和肿瘤组织，定位于胞膜和保质。CD3标记T淋巴细胞胞质，CD8标记细胞毒性T淋巴细胞胞质，PD-L1可表达于肿瘤细胞胞膜和炎症细胞的胞膜和或胞质，PD-1主要表达于T淋巴细胞胞质和胞膜，CD68主要用于标记巨噬细胞。图3显示的是组织分割的图像，可以清楚地区分癌巢区域和肿瘤的间质，并能显示细胞分割完成后，可以获得各种免疫表型如PD-L1阳性的肿瘤细胞表型(CK+PD-L1+)，PD-L1阳性的巨噬细胞表型(CD68+PD-L1+)，细胞毒性T淋巴细胞(CD3+CD8+)等，分别予以不同颜色在原位显示。
最终根据治疗前后PD-1/PD-L1的单位面积的数据，可以提交指导肿瘤样本免疫治疗的分子报告，动态监测免疫治疗疗效。

Claims (8)

1.一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合，其特征在于：所述标记物组合由PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD68和CK组成。
2.一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)收集免疫治疗前后的石蜡包埋肿瘤样本；
2)利用多色免疫荧光组织化学技术检测用于评估免疫治疗疗效的标记物组合；所述标记物组合由PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD68和CK组成；
3)利用Vectra自动多光谱定量病理图像分析系统采集多标记的实验结果并详细分析PD-1/PD-L1相关的免疫表型；所述定量病理图像分析系统包括PerkinElmer多光谱成像设备和inForm2.4图像定量分析软件；
4)根据所获得以上结果，提交PD-1/PD-L1表达状态的分子报告。
3.根据权利要求2所述用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，其特征在于：所述步骤1)中的肿瘤样本包括均处于中晚期的肺癌、恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈部和胃肠道肝胆系统的恶性肿瘤细胞。
4.根据权利要求2或3所述的用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，其特征在于：所述步骤2)中，多色免疫荧光组织化学技术依次检测相应的PD-1/PD-L1免疫检查点和淋巴细胞、巨噬细胞标记物；在检测过程中，需要注意抗体和不同荧光染料的最佳搭配以及检测顺序。
5.根据权利要求2或3所述的用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，其特征在于：所述步骤3)中，采用PerkinElmer多光谱成像设备和inForm2.4图像定量分析软件详细分析PD-1/PD-L1相关的免疫表型，在阴性对照和阳性对照的协助下，可完成每个指标的单通道分析，肿瘤与间质区域的区分，组织分割、细胞分割以及感兴趣免疫表型的新发现及定量获取。
6.根据权利要求4所述的用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，其特征在于：所述步骤3)中，采用PerkinElmer多光谱成像设备和inForm2.4图像定量分析软件详细分析PD-1/PD-L1相关的免疫表型，在阴性对照和阳性对照的协助下，可完成每个指标的单通道分析，肿瘤与间质区域的区分，组织分割、细胞分割以及感兴趣免疫表型的新发现及定量获取。
7.根据权利要求2或3或6所述的用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，其特征在于：所述步骤4)中，提交PD-1/PD-L1表达状态的分子报告，在完成每个指标的详细分析中，对比免疫治疗前后的样本，对获取的PD-1/PD-L1相关的免疫表型和细胞毒性T细胞的改变，提交分子报告。
8.一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的系统，其特征在于：包含如权利要求1所述的标记物组合；或者采用如权利要求2或3或6所述的用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，以实现免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测功能。
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