CN114441411A - 一种肿瘤细胞捕获芯片的捕获结果判读方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肿瘤细胞捕获芯片的捕获结果判读方法及系统,其判读结果较为准确。该捕获结果判读方法,依次包括:提供细胞捕获实验后的肿瘤细胞捕获芯片,肿瘤细胞捕获芯片经过标记有第一荧光分子的CK抗体、标记有第二荧光分子的CD45抗体及细胞核荧光染料孵育处理,第一荧光分子、第二荧光分子及细胞核荧光染料的淬灭速度及荧光颜色互不相同;用第一激发光源对捕获芯片进行照射,采集荧光图像;用第二激发光源对捕获芯片进行照射,采集荧光图像;用第三激发光源对捕获芯片进行照射,采集荧光图像;将荧光图像拼合,若某一光点同时存在第一荧光分子和细胞核荧光染料的荧光颜色且不存在第二荧光分子所对应的荧光颜色,则判断该光点存在肿瘤细胞。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,涉及一种肿瘤细胞捕获芯片的捕获结果判读方法及系统。
背景技术
目前,微流控技术已应用于CTC细胞(循环肿瘤细胞)分选,其中捕获芯片是重要的组成元件,其中的一种捕获芯片为包被有能够和目标分子或细胞特异性结合的抗体的网状芯片。江苏汇先医药技术有限公司的CytoBot2000仪所使用的一次性耗材TIP头即内置这种网状捕获芯片,网状芯片表面结合有抗体,从而能够和靶细胞特异性结合,实现细胞捕获和分选。结合到捕获芯片上的细胞,通过荧光抗体标记技术进行计数。然而,细胞的荧光抗体标记技术存在一定的非特异性,其主要原因如下:(1)抗体与细胞膜表面标志物结合的非特异性,以及(2)生物个体内涉及膜结构交换的细胞间通讯(例如基于外泌体形式的细胞间通讯)。上述两大方向原因会导致一些非目标细胞被标记有荧光分子的抗体结合,并显出不同可见强度的荧光信号,我们将这部分信号定义为背景噪声。还需要声明的一点是:荧光信号在不同类型及强度的激发光源激发下,其信号的淬灭速率是不同的,荧光信号的淬灭也会干扰我们对结果的判读。现有的CTC细胞捕获及荧光抗体染色的判读主要依赖于操作人员的肉眼识别及主观判断,这种判读方式在小规模的科研水平是可行的,但不利于大规模的推广。
基于上述原因,在背景噪声的影响下,需要建立一套标准共识以提高对荧光结果判读的一致性与准确性。
发明内容
针对上述技术问题中,本发明的目的是提供一种肿瘤细胞捕获芯片的捕获结果判读方法及系统,判读结果较为准确。
根据本发明的第一个方面,一种肿瘤细胞捕获芯片的捕获结果判读方法,依次包括如下步骤:
A、提供细胞捕获实验后的肿瘤细胞捕获芯片,所述肿瘤细胞捕获芯片经过标记有第一荧光分子的CK抗体、标记有第二荧光分子的CD45抗体及细胞核荧光染料孵育处理,其中所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料的淬灭速度及所激发荧光的颜色互不相同;
B、用第一激发光源对所述捕获芯片进行照射,采集第一荧光通道内的荧光图像,其中所述第一激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度最大的一者的激发波长相对应;
C、用第二激发光源对所述捕获芯片进行照射,采集第二荧光通道内的荧光图像,其中所述第二激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度居中的一者的激发波长相对应;
D、用第三激发光源对所述捕获芯片进行照射,采集第三荧光通道内的荧光图像,其中所述第三激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度最小的一者的激发波长相对应;
E、将三个荧光通道的荧光图像相互拼合,若图片中某一光点同时存在第一荧光分子和细胞核荧光染料所对应的荧光颜色且不存在第二荧光分子所对应的荧光颜色,则判断该光点存在肿瘤细胞,对这类光点进行计数获得捕获芯片上的肿瘤细胞数量。
在一实施例中,所述第一荧光分子和所述第二荧光分子中一者为FITC而另一者为TRITC,所述细胞核荧光染料为DAPI。
在一具体且优选的实施例中,所述CK抗体标记有FITC,所述CD45抗体标记有TRITC;所述第一激发光源的波长对应FITC的激发波长,所述第二激发光源的波长对应TRITC的激发波长,所述第三激发光源对应DAPI的激发波长;步骤E中,若图片中某一光点上存在黄绿色荧光和蓝色荧光且不存在橙红色荧光,则判断该光点存在肿瘤细胞。
在一具体且优选的实施例中,通过显微镜相机采集各荧光通道的荧光图像,其中,所述第一荧光通道的图像采集参数为曝光300ms,增益13.98;所述第二荧光通道的图像采集参数为曝光142ms,增益0;所述第三荧光通道的图像采集参数为曝光100ms,增益 0。
在一实施例中,所述肿瘤细胞捕获芯片还经过标记有第三荧光分子的肿瘤标志物抗体孵育处理,所述捕获结果判读方法还包括定性检测步骤:用第四激发光源对所述捕获芯片进行照射,采集第四荧光通道内的荧光图像,若已判定存在肿瘤细胞上的光点上还存在第三荧光分子的激发荧光,则判定该肿瘤细胞为所述肿瘤标志物对应种类的肿瘤细胞。
在一具体且优选的实施例中,所述第三荧光分子为AF647荧光分子,若定性检测步骤中,所述光点上还存在红色荧光,则判断该光点处的肿瘤细胞具有所述肿瘤标志物的表达;和/或,所述肿瘤标志物抗体选自PD-L1抗体、HER2-抗体、ARV7抗体中的一种。
根据本发明的第二个方面,一种肿瘤细胞捕获芯片的捕获结果判读系统,包括:
载台,其用于装载细胞捕获实验后的肿瘤细胞捕获芯片,所述肿瘤细胞捕获芯片经过标记有第一荧光分子的CK抗体、标记有第二荧光分子的CD45抗体及细胞核荧光染料孵育处理,其中所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料的淬灭速度及所激发荧光的颜色互不相同;
第一激发光源,其用于出射对所述载台上的捕获芯片进行照射的激光束,所述第一激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度最大的一者的激发波长相对应;
第二激发光源,其用于出射对所述载台上的捕获芯片进行照射的激光束,所述第二激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度居中的一者的激发波长相对应;
第三激发光源,其用于出射对所述载台上的捕获芯片进行照射的激光束,所述第三激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度最小的一者的激发波长相对应;
显微镜相机,其用于依照第一激发光源、第二激发光源、第三激发光源的次序依次对所述载台上的捕获芯片被激光束激发后的状态进行图像采集,以依次获得第一荧光通道内、第二荧光通道内、第三荧光通道内的荧光图像,所述图像采集机构设于所述载台的上方;及
罩体,用于防止外部光线干扰;
所述捕获结果判读系统具有图像采集状态,在所述图像采集状态时,所述载台位于所述罩体内。
在一实施例中,所述显微镜相机包括具有近端和远端的镜筒、设于所述镜筒的近端的物镜、设于所述镜筒远端的CCD相机及设于所述物镜和所述CCD相机之间的滤光片。
在实施例中,所述捕获结果判读系统还包括控制器,所述控制器和所述第一激发光源、所述第二激发光源、所述第三激发光源及所述显微镜相机电性连接,所述控制器用于控制所述第一激发光源出射激光束及所述显微镜相机采集第一荧光通道内的荧光图像;所述控制器还用于在第一荧光通道内的荧光图像采集完成后,控制所述第一激发光源关闭并控制所述第二激发光源出射激光束及所述显微镜相机采集第二荧光通道内的荧光图像;所述控制器还用于在第二荧光通道内的荧光图像采集完成后,控制所述第二激发光源关闭并控制所述第三激发光源出射激光束及所述显微镜相机采集第三荧光通道内的荧光图像。
在一具体且优选的实施例中,所述控制器还用于存储三个荧光通道内的荧光图像并拼合。
在一实施例中,所述捕获芯片包括由多条相互交叉设置的网丝形成的网状基体,所述网状基体具有由多条相互交叉设置的所述网线形成的多个筛孔。所述筛孔的孔径为10μm-50μm。进一步地,所述筛孔的孔径为10μm-20μm。所述网丝为金属丝或塑料丝,包括但不限于不锈钢丝、镀金不锈钢丝、尼龙丝、聚对苯二甲酸乙二醇酯丝等。
本发明采用以上方案,相比现有技术具有如下优点:
本发明的肿瘤细胞捕获芯片的捕获结果判读方法及系统,采用特定的拍照阅片顺序,每个荧光通道都能够获得较佳的拍摄效果,降低荧光信号的淬灭、背景噪声对判读的影响,提高了判读和计数的准确性,且通过构建一个判读标准保证了每次结果判读的一致性与准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为根据本发明实施例的一种捕获结果判读系统的外形示意图;
图2为图1所示的捕获结果判读系统的在一视角下的内部结构示意图,其中罩体未示出;
图3为图1所示的捕获结果判读系统的在另一视角下的内部结构示意图,其中罩体未示出;
图4为显微镜星界的结构示意图;
图5为载台和移动机构在一视角下的结构示意图;
图6为载台和移动机构在另一视角下的结构示意图;
图7a、7b、7c及7d分别为捕获芯片的区域1的第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道及拼合后的荧光图像;
图8a、8b、8c及8d分别为捕获芯片的区域2的第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道及拼合后的荧光图像;
图9a、9b及9c分别为捕获芯片的区域3的第二荧光通道、第三荧光通道及拼合后的荧光图像;
图10a、10b、10c及10d分别示出了捕获芯片上的一个CTC细胞在FITC、DAPI、标志物-AF647通道及拼合后的荧光图像;
图11a、11b、11c及11d分别为整个捕获芯片的第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道及拼合后的荧光图像。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述,以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是,对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明,但并不构成对本发明的限定。
肿瘤细胞捕获芯片:捕获芯片具有由多条相互交叉设置的网丝形成的网状基体,网状基体具有由多条相互交叉设置的网线形成的多个筛孔,筛孔的孔径为10μm-20μm。网丝为镀金的不锈钢丝,其上通过聚乙二醇等高分子偶联有EpCAM抗体。采用该捕获芯片进行细胞捕获实验,使样本(如外周血等)流经该捕获芯片后得到肿瘤细胞捕获芯片,该肿瘤细胞捕获芯片可能捕获有循环肿瘤细胞(CTC细胞)、免疫细胞等背景细胞、细胞碎片等。该肿瘤细胞捕获芯片经过标记有第一荧光分子的CK抗体、标记有第二荧光分子的CD45抗体、细胞核荧光染料及PD-L1-AF647孵育处理,第一荧光分子、第二荧光分子及细胞核荧光染料的淬灭速度及所激发荧光的颜色互不相同。
下述实施例的检测原理为:CTC细胞的检测依赖于CK抗体、CD45抗体、细胞核荧光染料(典型地为DAPI)、以及各类偶联有荧光分子肿瘤标志物抗体(例如:PD-L1- AF647、HER2-AF647、ARV7-AF647)。cytokeratin CK是一类细胞角蛋白的统称,主要在肿瘤性质相关细胞有所表达,CD45是免疫细胞特异性表达的膜表面蛋白。当PBMC 源的细胞具备CK+CD45-DAPI+时可认为该细胞是一个完整的细胞且是非免疫性质的细胞,可判读为CTC细胞,当CTC细胞同时具备AF647+时可判读该CTC细胞具有特殊标志物的表达。当PBMC源的细胞具备CK+CD45+DAPI+时,可判读该细胞是一个完整的免疫细胞。当PBMC源的细胞DAPI-时,可判读该细胞是一个不具备细胞核的非完整细胞,细胞碎片不纳入统计。
具体地,CTC细胞的检测主要依赖的CK抗体标记有(异硫氰酸荧光素FITC)黄绿色荧光,CD45抗体标记有(四甲基异硫氰酸罗丹明TRITC)橙红色荧光,及细胞核荧光染料DAPI(蓝色荧光)。FITC激发波长为:λ=495nm,发射光波长为:λ=518 nm;TRITC激发波长为:λ=547nm,发射光波长为:λ=572nm;DAPI的激发波长为:λ=365nm,发射光波长为:λ=455nm;在显微镜阅片过程中的荧光淬灭原因主要为(photo induced electron transfer PET)光致(导致)电子转移,下面通过淬灭顺序测定实验确定三种荧光分子的淬灭速度。
淬灭顺序测定实验
以分别对应三种荧光染料的三种LED光源作为激发光源,但荧光分子仍会缓慢发生PET。以明美正置荧光显微镜(MF43-N)进行图像采集,以获得较佳的拍摄效果,进行实际评测。
取预结合panCK-FITC的SKBR3细胞系单细胞悬液,滴加10μL至载玻片,4倍镜持续观察FITC荧光点大小及个数,每隔1h统计1次,在持续1小时的照射后,荧光开始逐渐淬灭,在持续2小时的照射后,荧光点数量未显著减少,荧光点的尺寸开始缩小。在持续3小时的照射后,荧光点的尺寸开始缩小,荧光点数量开始减少。在持续6 小时的照射后,各组别荧光点数量均减少至初始数量的50%以下,具体数据如表1。
表1
初始量 | 照射1h | 照射2h | 照射3h | 照射4h | 照射5h | 照射6h | |
组1 | 143 | 143 | 133 | 128 | 98 | 83 | 65 |
组2 | 162 | 160 | 154 | 150 | 128 | 99 | 72 |
组3 | 155 | 153 | 142 | 137 | 103 | 87 | 63 |
组4 | 152 | 152 | 147 | 133 | 107 | 79 | 54 |
组5 | 143 | 143 | 138 | 126 | 89 | 84 | 53 |
组6 | 141 | 141 | 140 | 131 | 112 | 77 | 49 |
组7 | 161 | 160 | 153 | 142 | 119 | 93 | 64 |
组8 | 157 | 155 | 146 | 134 | 103 | 82 | 71 |
取预结合CD45-TRITC的Jurkat细胞系单细胞悬液,滴加10μL至载玻片,4倍镜持续观察TRITC荧光点大小及个数,每隔1h统计1次,在持续4小时的照射后,各组别荧光点数量开始显著下降,在持续8小时的照射后各组别荧光点数量均减少至初始数量的50%以下,具体参见表2。
表2
初始量 | 照射1h | 照射4h | 照射6h | 照射8h | |
组1 | 183 | 183 | 147 | 121 | 84 |
组2 | 192 | 192 | 158 | 129 | 91 |
组3 | 178 | 178 | 144 | 114 | 79 |
组4 | 178 | 178 | 153 | 124 | 83 |
组5 | 193 | 193 | 152 | 123 | 86 |
组6 | 186 | 186 | 149 | 131 | 91 |
组7 | 179 | 179 | 161 | 118 | 74 |
组8 | 181 | 181 | 155 | 123 | 82 |
取预结合DAPI的SKBR3细胞系单细胞悬液,滴加10μL至载玻片,4倍镜持续观察TRITC荧光点大小及个数,每隔1h统计1次,在持续5小时的照射后,各组别荧光点数量开始下降,在持续10小时的照射后各组别荧光点数量显著减少,在持续20小时的照射后各组别荧光点数量显著减少至40%以下,具体参见表3。
表3
初始量 | 照射1h | 照射5h | 照射10h | 照射20h | |
组1 | 103 | 103 | 94 | 81 | 38 |
组2 | 102 | 102 | 97 | 78 | 33 |
组3 | 110 | 110 | 95 | 82 | 24 |
组4 | 108 | 108 | 97 | 82 | 36 |
组5 | 106 | 106 | 99 | 91 | 29 |
组6 | 99 | 99 | 92 | 79 | 30 |
组7 | 105 | 105 | 93 | 87 | 37 |
组8 | 102 | 102 | 95 | 85 | 37 |
基于上述数据,可确定在LED灯作为激发光源的条件下,FITC的淬灭速度大于TRITC的淬灭速度,而TRITC的淬灭速度大于DAPI的淬灭速度。
捕获结果判读方法
各荧光通道的阅片顺序依次为CK-FITC、CD45-TRITC、DAPI。即,依次包括如下步骤:
(1)用波长为495nm的LED光源照射肿瘤细胞捕获芯片,芯片上的FITC荧光分子被激发而产生黄绿色荧光,设置相机的扫描参数为:曝光300,增益13.98,采集此时的荧光图像,即为第一荧光通道的荧光图像,该荧光图像上可能存在多个黄绿色荧光点;
(2)再用波长为547nm的LED光源照射肿瘤细胞捕获芯片,芯片上的TRITC荧光分子被激发而产生橙红色荧光,设置相机的扫描参数为:曝光142,增益0,采集此时的荧光图像,即为第二荧光通道的荧光图像,该荧光图像上可能存在多个橙红色荧光点;
(3)最后用波长为365nm的LED光源照射肿瘤细胞捕获芯片,芯片上的TRITC 荧光分子被激发而产生蓝色荧光,设置相机的扫描参数为:曝光100,增益0,采集此时的荧光图像,即为第三荧光通道的荧光图像,该荧光图像上可能存在多个蓝色荧光点;
(4)将三个通道的荧光图像拼合,对同时存在黄绿色荧光和蓝色荧光而不存在橙红色荧光的光点进行计数,即为所捕获到的循环肿瘤细胞的数量。
该捕获结果判读方法还包括定性检测步骤,以对捕获芯片上的肿瘤细胞进行定性。在定性检测中,用波长为633nm的LED光源照射肿瘤细胞捕获芯片,若芯片上存在结合有AF647的肿瘤细胞,则AF647荧光分子被激发而产生红色荧光,设置相机的扫描参数为:曝光178,增益0.4,采集此时的荧光图像,即为第四荧光通道的荧光图像,该荧光图像上存在红色荧光点,则捕获芯片上的肿瘤细胞具有PD-L1的表达。
捕获结果判读系统
利用图1至图6所示的捕获结果判读系统来对上述肿瘤细胞捕获芯片进行后处理。该捕获结果判读系统包括罩体1、载台2、激发光源3、紫外光源31、显微镜相机4及支架5等。其中,载台2用于装载芯片夹具,本实施例中芯片夹具具体为TIP头101,肿瘤细胞捕获芯片100被固定在TIP头101。载台2上设有用于装载TIP头101的槽 21,槽21的一个优选形式为台阶孔,TIP头101插在槽21内后,芯片100面向上方放置。激发光源3出射对荧光分子进行激发的激光束。显微镜相机4用于对载台2上的芯片100被激光束激发后的荧光状态进行图像采集,显微镜相机4设于载台2的上方。紫外光源31出射照射到载台2上的芯片100上的紫外光束,显微镜相机4还对经紫外照射后的芯片100进行图像采集,以对其他荧光通道的荧光图片的拼合进行定位。
结合图2和图3所示,载台2、激发光源3、紫外光源31及显微镜相机4均设置于支架5上,罩体1能够将支架5罩住从而用于防止外部光线干扰,避免在图像采集时外部光线照射到芯片100上影响采集到的荧光图像或紫外图像。具体地,激发光源3包括第一激发光源、第二激发光源及第三激发光源,均为LED光源,其中,第一激发光源的波长为495nm,第二激发光源的波长为547nm,第三激发光源的波长为365nm。载台2 能够水平移动地设于支架5上,第一激发光源、第二激发光源及第三激发光源设于支架 5上并围绕设置在载台2的旁侧且朝向载台2,紫外光源31及多个激发光源3间隔设置在载台2的四周且高于载台2。显微镜相机4能够上下移动地设于支架5的上部,显微镜相机4设置于载台2的上方。
该捕获结果判读系统还包括用于驱动载台2移动的移动机构,载台2通过移动机构连接于一支架5上。该后处理装置具有至少三个图像采集状态和一个芯片装载状态。结合图1所示,罩体1上设有用于供载台2通过的出仓口11,当后处理装置在图像采集状态时,载台2位于罩体1内;后处理装置在芯片装载状态时,载台2的部分位于罩体1 外。罩体1上还连接有用于在图像采集状态时将出仓口11封闭的封闭门12。该封闭门 12铰接于罩体1上,在装载芯片100时,载台2向外移动使其设有槽21的部分自出仓口11伸出,封闭门12打开,从而便于将芯片100或TIP头101放置到载台2的槽21 中。芯片100装载完成后,载台2退回至罩体1内,封闭门12关闭,进行荧光激发及图像采集。
本实施例中,载台2通过移动机构能够沿左右方向及前后方向移动地设于支架5上。结合图5和图6所示,移动机构包括固设于支架5上的X向导轨51、可沿左右方向滑动地设于X向导轨51上的安装座52及固设于安装座52上的Y向导轨53,载台2可沿前后方向滑动地设于Y向导轨53上。该移动机构还包括用于驱动安装座52沿X向导轨51移动的X向电机54及用于驱动载台2沿Y向导轨53移动的Y向电机55,X向电机54和Y向电机55分别为直线电机。支架5上设有一对第一检测开关511,两个第一检测开关511分别靠近所述X向导轨51的两端,用于检测载台2是否到达其左右方向上的起点和终点;安装座52上设有三个第二检测开关521,三个第二检测开关521沿Y 向导轨间隔排列,其中两个相邻的第二检测开关521用于检测载台2是否到达其前后方向上的起点和终点;第三个检测开关521用于检测载台2是否移至窗口外。第一检测开关511和第二检测开关521分别为光电检测开关。
如图4所示,显微镜相机4包括具有近端和远端的镜筒41、设于镜筒41的近端的物镜42、设于镜筒41的远端的CCD相机43及设于物镜42和CCD相机43之间的滤光片(图中未示出)。物镜42位于载台上的槽21的正上方,以便于正对芯片100进行图像采集。滤光片位于物镜42的正上方一端距离处,以滤除杂光干扰。显微镜相机4能够整体上下移动,从而调节和芯片100之间的距离,以调整拍照视野。支架5上设有用于驱动显微镜相机4上下移动的Z向电机56,Z向电机56具体为直线电机。
该后处理装置还包括控制器,控制器和CCD相机43电性连接以存储采集到的荧光图像;控制器还和第一检测传感器、第二检测传感器、X向电机54及Y向电机55电性连接,以根据各检测传感器的检测信号向X向电机54和/或Y向电机55发出正转、反转或停止的控制信号,从而控制载台2带动芯片100水平移动,直至CCD相机43完成对整个芯片100的扫描采集。
该控制器还和第一激发光源、第二激发光源及第三激发光源电性连接。控制器用于控制第一激发光源出射激光束及CCD相机采集第一荧光通道内的荧光图像;控制器还用于在第一荧光通道内的荧光图像采集完成后,控制第一激发光源关闭并控制第二激发光源出射激光束及CCD相机采集第二荧光通道内的荧光图像;控制器还用于在第二荧光通道内的荧光图像采集完成后,控制第二激发光源关闭并控制第三激发光源出射激光束及CCD相机采集第三荧光通道内的荧光图像。
应用实施例
在20倍镜下扫描CTC细胞捕获芯片的FITC、TRITC、DAPI三种荧光全视野图片,对图片中的荧光点标记绝对坐标(在这里程序预设了荧光点计数的荧光强度阈值范围),比对三种图片坐标点,若坐标重叠折表明该处细胞具有多种荧光信号。将在FITC 与DAPI坐标重叠的数量统计为CTC细胞的捕获数量。
其具体流程为:
1)启动仪器及软件;
2)CTC细胞捕获及染色流程运行结束后取出网状芯片,置于载台;
3)扫描或手动输入芯片编码信息,点击软件上的开始扫描按钮,按照FITC、TRITC、DAPI的顺序执行扫描;
4)完成扫描后,拼合荧光图像,运行CTC计数分析。
5)得到该芯片上富集到的CTC细胞数量,完成实验。
为评价网状捕获芯片CTC自动阅片系统的稳定性,对完成扫描的芯片进行人工阅片核对。本次评测12组数据,人工阅片结果与程序自动阅片结果无显著偏差。
图7a、7b、7c分别示出了捕获芯片的区域1的第一荧光通道(FITC)、第二荧光通道(TRITC)及第三荧光通道(DAPI)的荧光图像,图7d为三个通道的荧光图形拼合后的图像,可以看出,该区域CTC阳性,其中部有1个CTC细胞。
图8a、8b、8c分别示出了捕获芯片的区域2的第一荧光通道(FITC)、第二荧光通道(TRITC)及第三荧光通道(DAPI)的荧光图像,图8d为三个通道的荧光图形拼合后的图像,可以看出,该区域CTC阳性,有1个CTC细胞。
图9a、9b分别示出了捕获芯片的区域3的第二荧光通道(TRITC)及第三荧光通道(DAPI)的荧光图像,图9c为两个通道的荧光图形拼合后的图像。在FITC通道内,拍照视野内无荧光点,而TRITC和DAPI有荧光点,该区域CTC阴性,无CTC细胞。
图10a、10b、10c分别示出了捕获芯片上的已确定的CTC阳性区域上的一个CTC 细胞在FITC、DAPI、标志物-AF647通道的荧光图像,图10d为图10a至图10c拼合后的图像,该CTC细胞呈现标志物阳性。
图11a、11b、11c分别示出了整个捕获芯片的第一荧光通道(FITC)、第二荧光通道(TRITC)及第三荧光通道(DAPI)的荧光图像,图11d示出了整个捕获芯片的三个通道拼合后的图像。例如,图11a为捕获芯片各个区域的第一荧光通道的荧光图形(包括图7a、图8a等)拼接合成,图11b为捕获芯片各个区域的第二荧光通道的荧光图形 (包括图7b、图8b、图9a等)拼接合成,图11c捕获芯片各个区域的第三荧光通道的荧光图形(包括图7c、图8c、图9b等)拼接合成。
若按照TRITC、FITC、DAPI的顺序执行扫描,则在采集FITC通道的荧光图像时,有些黄绿色荧光点的尺寸已经变小且数量较少,检测的准确性较差。
如本说明书和权利要求书中所示,术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素,而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列,方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的组合。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,是一种优选的实施例,其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肿瘤细胞捕获芯片的捕获结果判读方法,其特征在于,依次包括如下步骤:
A、提供细胞捕获实验后的肿瘤细胞捕获芯片,所述肿瘤细胞捕获芯片经过标记有第一荧光分子的CK抗体、标记有第二荧光分子的CD45抗体及细胞核荧光染料孵育处理,其中所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料的淬灭速度及所激发荧光的颜色互不相同;
B、用第一激发光源对所述捕获芯片进行照射,采集第一荧光通道内的荧光图像,其中所述第一激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度最大的一者的激发波长相对应;
C、用第二激发光源对所述捕获芯片进行照射,采集第二荧光通道内的荧光图像,其中所述第二激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度居中的一者的激发波长相对应;
D、用第三激发光源对所述捕获芯片进行照射,采集第三荧光通道内的荧光图像,其中所述第三激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度最小的一者的激发波长相对应;
E、将三个荧光通道的荧光图像相互拼合,若图片中某一光点同时存在第一荧光分子和细胞核荧光染料所对应的荧光颜色且不存在第二荧光分子所对应的荧光颜色,则判断该光点存在肿瘤细胞,对这类光点进行计数获得捕获芯片上的肿瘤细胞数量。
2.根据权利要求1所述的捕获结果判读方法,其特征在于,所述第一荧光分子和所述第二荧光分子中一者为FITC而另一者为TRITC,所述细胞核荧光染料为DAPI。
3.根据权利要求2所述的捕获结果判读方法,其特征在于,所述CK抗体标记有FITC,所述CD45抗体标记有TRITC;所述第一激发光源的波长对应FITC的激发波长,所述第二激发光源的波长对应TRITC的激发波长,所述第三激发光源对应DAPI的激发波长;步骤E中,若图片中某一光点上存在黄绿色荧光和蓝色荧光且不存在橙红色荧光,则判断该光点存在肿瘤细胞。
4.根据权利要求3所述的捕获结果判读方法,其特征在于,通过显微镜相机采集各荧光通道的荧光图像,其中,所述第一荧光通道的图像采集参数为曝光300ms,增益13.98;所述第二荧光通道的图像采集参数为曝光142ms,增益0;所述第三荧光通道的图像采集参数为曝光100ms,增益0。
5.根据权利要求1所述的捕获结果判读方法,其特征在于,所述肿瘤细胞捕获芯片还经过标记有第三荧光分子的肿瘤标志物抗体孵育处理,所述捕获结果判读方法还包括定性检测步骤:用第四激发光源对所述捕获芯片进行照射,采集第四荧光通道内的荧光图像,若已判定存在肿瘤细胞上的光点上还存在第三荧光分子的激发荧光,则判定该肿瘤细胞为所述肿瘤标志物对应种类的肿瘤细胞。
6.根据权利要求5所述的捕获结果判读方法,其特征在于,所述第三荧光分子为AF647荧光分子,若定性检测步骤中,所述光点上还存在红色荧光,则判断该光点处的肿瘤细胞具有所述肿瘤标志物的表达;和/或,所述肿瘤标志物抗体选自PD-L1抗体、HER2-抗体、ARV7抗体中的一种。
7.一种肿瘤细胞捕获芯片的捕获结果判读系统,其特征在于,包括:
载台,其用于装载细胞捕获实验后的肿瘤细胞捕获芯片,所述肿瘤细胞捕获芯片经过标记有第一荧光分子的CK抗体、标记有第二荧光分子的CD45抗体及细胞核荧光染料孵育处理,其中所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料的淬灭速度及所激发荧光的颜色互不相同;
第一激发光源,其用于出射对所述载台上的捕获芯片进行照射的激光束,所述第一激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度最大的一者的激发波长相对应;
第二激发光源,其用于出射对所述载台上的捕获芯片进行照射的激光束,所述第二激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度居中的一者的激发波长相对应;
第三激发光源,其用于出射对所述载台上的捕获芯片进行照射的激光束,所述第三激发光源的波长与所述第一荧光分子、所述第二荧光分子及所述细胞核荧光染料三者中淬灭速度最小的一者的激发波长相对应;
显微镜相机,其用于依照第一激发光源、第二激发光源、第三激发光源的次序依次对所述载台上的捕获芯片被激光束激发后的状态进行图像采集,以依次获得第一荧光通道内、第二荧光通道内、第三荧光通道内的荧光图像,所述图像采集机构设于所述载台的上方;及
罩体,用于防止外部光线干扰;
所述捕获结果判读系统具有图像采集状态,在所述图像采集状态时,所述载台位于所述罩体内。
8.根据权利要求7所述的捕获结果判读系统,其特征在于,所述显微镜相机包括具有近端和远端的镜筒、设于所述镜筒的近端的物镜、设于所述镜筒的远端的CCD相机及设于所述物镜和所述CCD相机之间的滤光片。
9.根据权利要求7所述的捕获结果判读系统,其特征在于,所述捕获结果判读系统还包括控制器,所述控制器和所述第一激发光源、所述第二激发光源、所述第三激发光源及所述显微镜相机电性连接,所述控制器用于控制所述第一激发光源出射激光束及所述显微镜相机采集第一荧光通道内的荧光图像;所述控制器还用于在第一荧光通道内的荧光图像采集完成后,控制所述第一激发光源关闭并控制所述第二激发光源出射激光束及所述显微镜相机采集第二荧光通道内的荧光图像;所述控制器还用于在第二荧光通道内的荧光图像采集完成后,控制所述第二激发光源关闭并控制所述第三激发光源出射激光束及所述显微镜相机采集第三荧光通道内的荧光图像。
10.根据权利要求9所述的捕获结果判读系统,其特征在于,所述控制器还用于存储三个荧光通道内的荧光图像并拼合。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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