JP2019136023A - 細菌検出装置及び細菌検出方法 - Google Patents

細菌検出装置及び細菌検出方法 Download PDF

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Abstract

【課題】細菌を好適に検出できる細菌検出装置及び細菌検出方法を実現する。【解決手段】細菌検出装置１００は、メンブレンフィルター１が定置されている検出チップ１０が載置されたステージ２０を第１駆動機構３０と第２駆動機構４０とによって前後方向と左右方向に移動させて、光照射部５０からの励起光が照射されたメンブレンフィルター１の上面を撮像部６０による撮像範囲に合わせて撮像することができる。メンブレンフィルター１の上面に蛍光標識が結合された細菌が捕捉されていれば、その細菌を発光点として撮像部６０によって撮像できる。そして、撮像部６０が撮像した画像中の発光点を制御部７０がカウントするようにして、メンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌を好適に検出することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、細菌に結合させた蛍光標識を発光させ、その蛍光を観察することによって細菌を検出する細菌検出装置及び細菌検出方法に関する。
従来、メンブレンフィルターで濾過して捕捉した細菌をＡＴＰ発光させ、その発光点を計数するようにして細菌数を測定する細菌検出装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特開平６−７８７４８号公報
また、蛍光試薬で染色した細菌に所定の波長域の励起光を照射して、細菌に結合させた蛍光標識を発光させて細菌を検出するようにした細菌検出装置も使われている。
この蛍光観察によって細菌を検出する細菌検出装置の改良を本発明者らが鋭意検討した結果、従来の装置よりも好適に細菌を検出可能な細菌検出装置及び細菌検出方法を開発するに至った。
本発明の目的は、細菌を好適に検出できる細菌検出装置及び細菌検出方法を提供することである。
上記目的を達成するため、本出願に係る一の発明である細菌検出装置は、
蛍光標識が結合された細菌を上面側で捕捉しているメンブレンフィルターがその上面を上にして定置される凹部が設けられている検出チップと、
前記検出チップを載置可能な載置部を有するステージと、
前記ステージを一の方向に移動させる第１駆動機構と、
前記ステージを一の方向と直交する方向に移動させる第２駆動機構と、
前記検出チップの前記メンブレンフィルターの上面に光を照射する光照射部と、
前記メンブレンフィルターの上面を撮像する撮像部と、
前記撮像部が撮像した画像中の発光点をカウントすることで、前記メンブレンフィルター上の細菌の数をカウントする制御部と、
を備えるようにした。
かかる構成の細菌検出装置によれば、メンブレンフィルターが定置されている検出チップが載置されたステージを第１駆動機構と第２駆動機構とによって一の方向と該方向と直交する方向に移動させて、光照射部からの光が照射されたメンブレンフィルターの上面を撮像部による撮像範囲に合わせて撮像することができる。
検出チップの凹部に定置されているメンブレンフィルターに蛍光標識が結合された細菌が捕捉されていれば、その細菌を発光点として撮像部によって撮像できる。
そして、撮像部が撮像した画像中の発光点をカウントするように細菌の数を計数するなどして、メンブレンフィルターの上面に捕捉されている細菌を好適に検出することができる。
また、望ましくは、
前記検出チップが前記ステージに載置された向きで、前記凹部を挟んで前記光照射部の反対側となる前記検出チップの上面の所定部位には、前記光照射部が照射した光が前記凹部側に反射するのを低減する遮光板部が設けられているようにする。
検出チップの上面に設けられている遮光板部は、光照射部が照射した光が凹部側に反射するのを低減する機能を有しているので、その遮光板部によって撮像部による撮像範囲に反射光が入らないようにする迷光対策を行うことによって、凹部に定置されたメンブレンフィルターの上面の撮像を良好に行うことができ、細菌を検出する測定をより正確に行うことが可能になる。
また、望ましくは、
前記検出チップの少なくとも前記遮光板部は暗色系の色に着色されているようにする。
暗色系の色に着色され、蛍光を出さないようにされた遮光板部であれば、遮光板部に当たった光を吸収するようにして、光の反射を低減する迷光対策を好適に行うことができる。
なお、検出チップ全体が暗色系の色に着色されていれば、遮光板部以外の箇所での光の反射も低減でき、より一層の迷光対策を行うことができる。
また、望ましくは、
前記メンブレンフィルターは、前記凹部に嵌め入れられたガラス板の上に定置されているとともに、前記ガラス板と前記メンブレンフィルターの間には自家蛍光を有さない液体が介在されているようにする。
ガラス板とメンブレンフィルターの間に自家蛍光を有さない液体を介在させるようにすれば、その液体の表面張力によってメンブレンフィルターの姿勢を凹部内で安定させることができる。
具体的には、検出チップの凹部に定置されたメンブレンフィルターが水などの液体の表面張力によってガラス板に対して平行な姿勢を保つことで、そのメンブレンフィルターの上面の平坦性が確保されるようになるので、撮像部によってメンブレンフィルターの上面を良好に撮像することができ、細菌を検出する測定を正確に行い易くなる。
また、望ましくは、
前記検出チップには前記凹部が２つ設けられているようにする。
検出チップに２つの凹部が設けられていれば、検出チップに２つのメンブレンフィルターを定置することができるので、２つの試料（被検体液）の測定をスムーズに行うことができる。
また、本出願に係る他の発明は、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌検出装置を用いた細菌検出方法であって、
蛍光標識が結合された細菌をメンブレンフィルターで捕捉するステップと、
前記検出チップの凹部にガラス板を設置するステップと、
前記ガラス板の上に自家蛍光を有さない液体を滴下するステップと、
前記ガラス板上に前記メンブレンフィルターを定置するステップと、
前記メンブレンフィルターが定置されている前記検出チップを前記ステージに載置するステップと、
前記メンブレンフィルターに前記光照射部から励起光を照射するステップと、
前記メンブレンフィルターを前記撮像部で撮像するステップと、
前記撮像部が撮像した画像中の発光点に基づき、前記メンブレンフィルターで捕捉している細菌を検出するステップと、
を有するようにした。
なお、蛍光染料（蛍光試薬）で染色された細菌が含まれている被検体液をメンブレンフィルターで濾過してその細菌を捕捉しても、細菌が含まれている被検体液をメンブレンフィルターで濾過し、捕捉した細菌を蛍光染料（蛍光試薬）で染色するようにしてもよい。
かかる構成の細菌検出方法によれば、検出チップの凹部に定置されているメンブレンフィルターに蛍光標識が結合された細菌が捕捉されていれば、撮像部が撮像した画像中の発光点に基づき、メンブレンフィルターの上面に捕捉されている細菌を好適に検出できる。
特に、検出チップの凹部にガラス板を介して定置されたメンブレンフィルターが水などの液体（自家蛍光を有さない液体）の表面張力によってガラス板に対して平行な姿勢を保つことで、そのメンブレンフィルターの上面の平坦性が確保されるようになり、撮像部によるメンブレンフィルターの上面の撮像を良好に行うことができ、細菌を検出する測定を正確に行うことが可能になる。
また、本出願に係る他の発明は、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌検出装置において、前記光照射部として所定の励起光を照射可能な１つの光源を備え、前記撮像部としてモノクロカメラを備えている細菌検出装置を用いた細菌検出方法であって、
蛍光標識が結合された細菌をメンブレンフィルターで捕捉する第１ステップと、
前記検出チップの凹部にガラス板を設置する第２ステップと、
前記ガラス板の上に自家蛍光を有さない液体を滴下する第３ステップと、
前記ガラス板上に前記メンブレンフィルターを定置する第４ステップと、
前記メンブレンフィルターが定置されている前記検出チップを前記ステージに載置する第５ステップと、
前記メンブレンフィルターに前記光照射部から励起光を照射する第６ステップと、
前記メンブレンフィルターを前記撮像部で撮像する第７ステップと、
前記撮像部が撮像した画像中の発光点に基づき、前記メンブレンフィルターで捕捉している細菌を検出する第８ステップと、
を有し、
生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識を用いて前記第１ステップから前記第８ステップを行って総菌数を検出し、生菌と死菌のいずれか一方に結合可能な蛍光標識を用いて前記第１ステップから前記第８ステップを行って生菌数又は死菌数を検出するようにした。
モノクロカメラを備えた構成の細菌検出装置を用いた細菌検出方法によれば、１つの励起光源で２つの蛍光標識に対応する菌数測定を行うことができる。
具体的には、モノクロカメラ（撮像部）で細菌の発光点を撮像した場合、生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識の蛍光と、生菌と死菌のいずれか一方に結合可能な蛍光標識の蛍光をそれぞれ捉え、総菌数（生菌数と死菌数をあわせた菌数）を検出することと、生菌数または死菌数を検出することができる。
こうすることで、総菌数と死菌数の差分に基づき生菌数を検出したり、総菌数と生菌数の差分に基づき死菌数を検出したりすることができる。
また、総菌数に対する死菌数の割合を算出したり、総菌数に対する生菌数の割合を算出したりすることができる。
また、本出願に係る他の発明は、
請求項５に記載の細菌検出装置において、前記光照射部として所定の励起光を照射可能な１つの光源を備え、前記撮像部としてモノクロカメラを備えている細菌検出装置を用いた細菌検出方法であって、
蛍光標識が結合された細菌をメンブレンフィルターで捕捉する第１ステップと、
前記検出チップの凹部にガラス板を設置する第２ステップと、
前記ガラス板の上に自家蛍光を有さない液体を滴下する第３ステップと、
前記ガラス板上に前記メンブレンフィルターを定置する第４ステップと、
前記メンブレンフィルターが定置されている前記検出チップを前記ステージに載置する第５ステップと、
前記メンブレンフィルターに前記光照射部から励起光を照射する第６ステップと、
前記メンブレンフィルターを前記撮像部で撮像する第７ステップと、
前記撮像部が撮像した画像中の発光点に基づき、前記メンブレンフィルターで捕捉している細菌を検出する第８ステップと、
を有し、
生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識を用いて前記第１ステップから前記第４ステップを行って、生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識が結合された細菌を捕捉しているメンブレンフィルターを前記検出チップの一方の凹部に定置し、生菌と死菌のいずれか一方に結合可能な蛍光標識を用いて前記第１ステップから前記第４ステップを行って、生菌と死菌のいずれか一方に結合可能な蛍光標識が結合された細菌を捕捉しているメンブレンフィルターを前記検出チップの他方の凹部に定置した後、前記第５ステップを行ってその検出チップを前記ステージに載置し、
前記一方の凹部に定置されている前記メンブレンフィルターに対し前記第６ステップから前記第８ステップを行って総菌数を検出し、前記他方の凹部に定置されている前記メンブレンフィルターに対し前記第６ステップから前記第８ステップを行って生菌数又は死菌数を検出するようにした。
モノクロカメラを備えた構成の細菌検出装置を用いた細菌検出方法によれば、１つの励起光源で２つの蛍光標識に対応する菌数測定を行うことができる。
そして、上述したように、総菌数と死菌数の差分に基づき生菌数を検出したり、総菌数と生菌数の差分に基づき死菌数を検出したりすることができる。
また、総菌数に対する死菌数の割合を算出したり、総菌数に対する生菌数の割合を算出したりすることができる。
特に、２つの凹部が設けられている検出チップを使用することで、メンブレンフィルターや検出チップの付け替えを行うことなく、生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識が結合された細菌数の計測と、生菌と死菌のいずれか一方に結合可能な蛍光標識が結合された細菌数の測定をスムーズに行うことができる。
本発明によれば、細菌を好適に検出することができる。
本実施形態の細菌検出装置に取り付けて使用する検出チップを示す分解斜視図（ａ）と、斜視図（ｂ）と、平面図（ｃ）である。 本実施形態の細菌検出装置を示す斜視図である。 本実施形態の細菌検出装置を示す斜視図である。 本実施形態の細菌検出装置のステージ部分を拡大して示す斜視図である。 本実施形態の細菌検出装置の撮像部を示す側面図である。 検出チップの変形例を示す分解斜視図（ａ）と、斜視図（ｂ）である。 検出チップの変形例を示す分解斜視図（ａ）と、斜視図（ｂ）である。
以下、図面を参照して、本発明に係る細菌検出装置及び細菌検出方法の実施形態について詳細に説明する。但し、以下に述べる実施形態には、本発明を実施するために技術的に好ましい種々の限定が付されているが、本発明の範囲を以下の実施形態及び図示例に限定するものではない。
本実施形態の細菌検出装置１００は、蛍光染色法とメンブレンフィルター法を組み合わせた測定原理を利用して、被検体液中に含まれる細菌を検出する装置である。
まず、細菌検出装置１００に取り付けて使用する検出チップ１０について説明する。
検出チップ１０の上面には、図１（ａ）（ｂ）に示すように、メンブレンフィルター１がその上面を上にして定置される凹部１１が設けられている。
この検出チップ１０の凹部１１に定置されて取り付けられるメンブレンフィルター１は、蛍光標識が結合された細菌を上面側で捕捉しているものである。
なお、蛍光染料（蛍光試薬）で染色された細菌が含まれている被検体液をメンブレンフィルター１で濾過してその細菌を捕捉しても、細菌が含まれている被検体液をメンブレンフィルター１で濾過し、捕捉した細菌を蛍光染料（蛍光試薬）で染色するようにしてもよい。
検出チップ１０の凹部１１に取り付けられるメンブレンフィルター１は、凹部１１に嵌め入れられたガラス板２の上に定置されており、ガラス板２とメンブレンフィルター１の間に自家蛍光を有さない液体である水を介在した状態で取り付けられている。
例えば、検出チップ１０の凹部１１には、予めガラス板２が嵌め入れられており、そのガラス板２の上に所定量の水滴が付着された状態でメンブレンフィルター１が凹部１１に取り付けられている。
このようにガラス板２とメンブレンフィルター１の間に水を介在させることで、その水の表面張力によってメンブレンフィルター１の姿勢が凹部１１内で安定する。
具体的には、検出チップ１０の凹部１１に定置されたメンブレンフィルター１が水の表面張力によってガラス板２に対して平行な姿勢を保つことで、そのメンブレンフィルター１の上面の平坦性が確保されるようになり、後述する撮像部６０による撮像（検出チップ１０のメンブレンフィルター１の上面の撮像）を良好に行うことができ、細菌を検出する測定を正確に行い易くなる。
なお、鏡面加工などによって、凹部１１の底面が高い平滑性を有する面に仕上げられていれば、ガラス板２を用いなくてもよい。例えば、その凹部１１の底面に水滴を付着させた状態で、凹部１１にメンブレンフィルター１を定置させれば、水の表面張力によってメンブレンフィルター１の姿勢を凹部１１の底面に対して平行に保つことができる。
なお、ガラス板２とメンブレンフィルター１の間に介在させる液体は水であることに限らず、自家蛍光を有さない液体としてグリセリンを用いることもできる。
グリセリンは水に比べて揮発し難い液体であるので、細菌を検出する測定に時間が掛かる場合にはグリセリンを用いることが好ましい。
また、グリセリンは水に比べて粘性が高い液体であるので、ガラス板２とメンブレンフィルター１を密着させることができ、そのメンブレンフィルター１の上面の平坦性を確保することができる。
また、この検出チップ１０の上面の所定部位には、図１（ａ）（ｂ）に示すように、フランジ状の遮光板部１２が設けられている。
遮光板部１２は、検出チップ１０が細菌検出装置１００のステージ２０（後述）の所定位置に載置された向きで、凹部１１を挟んで光照射部５０（後述）の反対側となる検出チップ１０の上面に設けられている（図２参照）。
この遮光板部１２は、光照射部５０（後述）が検出チップ１０（メンブレンフィルター１）に向けて照射した光が凹部１１側に反射するのを低減するために設けられている。
具体的には、遮光板部１２は暗色系の色に着色され、蛍光を出さないようにされており、遮光板部１２に当たった光を吸収するようにして反射光を低減し、後述する撮像部６０による撮像範囲に反射光が入らないようにする迷光対策を可能にしている。
このように検出チップ１０の上面に設けた遮光板部１２によって光の反射を低減するようにした迷光対策によって、後述する撮像部６０による撮像（検出チップ１０のメンブレンフィルター１の上面の撮像）を良好に行うことができ、細菌を検出する測定をより正確に行うことが可能になる。
なお、検出チップ１０においては、少なくとも遮光板部１２が暗色系の色に着色されていればよいが、本実施形態では、例えば暗色系の色を有する樹脂材料によって検出チップ１０を形成するようにして、検出チップ１０ごと遮光板部１２を暗色系の色に着色している。
検出チップ１０全体が暗色系の色に着色されていれば、遮光板部１２以外の箇所での反射光も低減でき、より一層の迷光対策を行うことができる。
次に、上述した検出チップ１０を備えている細菌検出装置１００について説明する。
本実施形態の細菌検出装置１００は、図２、図３に示すように、検出チップ１０が取り付けられているステージ２０と、ステージ２０を一の方向（前後方向）に移動させる第１駆動機構３０と、ステージ２０を一の方向と直交する方向（左右方向）に移動させる第２駆動機構４０と、ステージ２０に載置された検出チップ１０に向けて光を照射する光照射部５０と、ステージ２０に載置された検出チップ１０のメンブレンフィルター１の上面を撮像する撮像部６０と、装置各部を統括制御するとともに、撮像部６０が撮像した画像に基づいてメンブレンフィルター１上の細菌の数をカウントする制御部７０等を備えている。
ステージ２０は、検出チップ１０が載置されるステージ本体２１と、ステージ本体２１を移動可能に支持しているサブステージ２２と、を備えている。
サブステージ２２は、装置の筐体に設けられている前後方向に延在するガイド（図示省略）に沿って前後に移動可能に配設されている。
ステージ本体２１は、サブステージ２２に設けられている左右方向に延在する軸２２ａに沿って左右に移動可能に配設されている。このステージ本体２１に検出チップ１０が取り付けられる載置部が設けられている。
第１駆動機構３０は、図４に示すように、第１モータ３１と、第１モータ３１の回転力をステージ２０のサブステージ２２に伝達するコグドベルト３２等を有している。
第１モータ３１とコグドベルト３２は装置の筐体に配設されており、コグドベルト３２がサブステージ２２の一部に連結されている。第１モータ３１はステッピングモータである。
この第１駆動機構３０によって、サブステージ２２が前後方向に移動される。
なお、サブステージ２２上のステージ本体２１と第２駆動機構４０（第２モータ４１、円筒カム４２）は、サブステージ２２とともに前後方向に移動される。
第２駆動機構４０は、図４に示すように、第２モータ４１と、第２モータ４１の回転力をステージ２０のステージ本体２１に伝達する円筒カム４２等を有している。
第２モータ４１と円筒カム４２はサブステージ２２上に配設されており、円筒カム４２の螺旋状の案内溝４２ａには、ステージ本体２１に設けられているピン２１ａが挿し入れられている。第２モータ４１はステッピングモータである。
この第２駆動機構４０によって、ステージ本体２１がサブステージ２２上で左右方向に移動される。
光照射部５０は、図４に示すように、光源支持部５１を介して装置の筐体に固定されており、その光源支持部５１に支持されてステージ２０の上方に配設されている。
光照射部５０は、例えば、半導体レーザー（LD：Laser Diode）を備えており、ステージ本体２１（ステージ２０）に載置された検出チップ１０のメンブレンフィルター１の上面に励起光としてのレーザー光を照射する。
具体的には、光照射部５０は、左右方向に沿う斜め上からメンブレンフィルター１に向けてレーザー光（励起光）を照射する。
なお、この光照射部５０は、撮像部６０の撮像範囲にレーザー光を照射することで、その撮像範囲内にあるメンブレンフィルター１に向けてレーザー光（励起光）を照射するようになっている。
撮像部６０は、図５に示すように、例えば、ＣＣＤカメラ６１と、レンズユニット６２と、ＣＣＤカメラ６１とレンズユニット６２の間の光路を折り返すためのミラー６３，６４等を備えている。
このＣＣＤカメラ６１はレンズユニット６２を通して、ステージ本体２１（ステージ２０）に載置された検出チップ１０を撮像する。
具体的には、ＣＣＤカメラ６１（撮像部６０）は、検出チップ１０のメンブレンフィルター１の上面を分割して撮像する。本実施形態では、例えば、図１（ｃ）に示すように、検出チップ１０のメンブレンフィルター部分を４９升（７×７）の枡目に分割するようにして撮像する。
なお、メンブレンフィルター１の上面には、蛍光標識が結合された細菌が捕捉されている。
制御部７０は、例えば、装置の制御基板７１にケーブル７２を介して接続されたノート型パソコン等のパーソナルコンピュータであり、キーボードやマウスなどの操作部と、液晶ディスプレイなどの表示部等を備えている。
制御部７０には、細菌検出装置１００の制御用プログラムが格納されており、この制御部７０から装置の制御基板７１へ動作指令を与える。そして、制御基板７１から装置各部に動作指令を与えて、第１駆動機構３０（第１モータ３１）や第２駆動機構４０（第２モータ４１）を作動させてステージ２０（ステージ本体２１、サブステージ２２）を移動させたり、光照射部５０を作動させてステージ本体２１（ステージ２０）に載置されている検出チップ１０に向けてレーザー光を照射したりすることができるように構成されている。
また、制御部７０は、撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）に動作指令を与えて、蛍光標識が結合された細菌が捕捉されているメンブレンフィルター１の上面を撮像することができるように構成されている。
特に、制御部７０は、撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）が撮像した画像（蛍光標識が結合された細菌が捕捉されているメンブレンフィルター１の上面の画像）に基づき、メンブレンフィルター１上の細菌の数をカウントする処理を実行する。
具体的には、制御部７０は、撮像部６０が撮像した画像中の発光点をカウントすることで、メンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌の数をカウントする。
次に、本実施形態の細菌検出装置１００によって、被検体液中の細菌の数をカウントする処理ついて説明する。
まず、所定量の被検体液をメンブレンフィルター１で濾過する。
また、検出チップ１０の凹部１１にガラス板２を載置し、そのガラス板２上に自家蛍光を有さない液体である水を滴下する。
そして、ＤＡＰＩなどの蛍光標識が結合された細菌を上面側で捕捉しているメンブレンフィルター１を、検出チップ１０の凹部１１のガラス板２上に水を介在させて取り付け、その検出チップ１０をステージ本体２１（ステージ２０）にセットする。
次いで、制御部７０としてのパーソナルコンピュータを操作して細菌検出装置１００による細菌数の測定を開始すると、光照射部５０が検出チップ１０のメンブレンフィルター１に向けてレーザー光（励起光）を照射するとともに、ステージ２０に載置されている検出チップ１０のメンブレンフィルター１を撮像部６０の撮像エリアＲに合わせるように、第１駆動機構３０と第２駆動機構４０によってステージ２０（ステージ本体２１、サブステージ２２）を移動させ、所定位置で撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）がメンブレンフィルター１の上面を撮像する。
このとき、検出チップ１０の上面に設けられている遮光板部１２によって迷光対策がなされているので、撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）によってメンブレンフィルター１の上面を好適に撮像できる。
メンブレンフィルター１の上面に蛍光標識が結合された細菌が捕捉されていれば、撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）によってその細菌を発光点として撮像できる。なお、励起光によって蛍光標識を発光させ、蛍光標識が結合された細菌を発光点として撮像する技術は公知なので、ここでは詳述しない。
この細菌検出装置１００の撮像部６０の撮像エリアＲは、例えば、図１（ｃ）に示した４９升の一升に相当するので、その位置合わせと撮像を複数回（ここでは４９回）繰り返すようにして、メンブレンフィルター１の全領域を撮像するようになっている。
具体的には、第２駆動機構４０によってステージ２０（ステージ本体２１）を左右方向に移動させて、４９升の枡目を構成する７列のいずれかに撮像部６０の撮像エリアＲを合わせ、第１駆動機構３０によってステージ２０（サブステージ２２）を前後方向に移動させつつ、その列を７つに分割した画像を撮像する。
細菌検出装置１００の第２駆動機構４０は、円筒カム４２を介してステージ２０（ステージ本体２１）を移動させるので、４９升の枡目において左右に並んでいる７列のいずれかに撮像部６０の撮像エリアＲを合わせるような、比較的短い移動に適している。
また、細菌検出装置１００の第１駆動機構３０は、コグドベルト３２を介してステージ２０（サブステージ２２）を移動させるので、その列に沿う各所に撮像部６０の撮像エリアＲを合わせるような、比較的長い移動に適している。
次いで、制御部７０は、撮像部６０が撮像した複数の画像の重複部分を取り除く画像処理を行い、各升（４９升）の画像中の発光点をカウントする処理を行って、メンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌の数をカウントする。
このように、メンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌の数を計測することで、例えば、フィルターで濾過した被検体液１ｃｃ当りの細菌数を検出することができる。
以上のように、本実施形態の細菌検出装置１００（細菌検出方法）であれば、メンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌を好適に検出できる。
特に、この細菌検出装置１００が備えている検出チップ１０に設けた遮光板部１２による迷光対策を行うことと、その検出チップ１０の凹部１１に定置されるメンブレンフィルター１の上面の平坦性を水などの液体（自家蛍光を有さない液体）の表面張力で確保することによって、検出チップ１０に取り付けたメンブレンフィルター１の上面の画像を好適に撮像できるので、その画像に基づいてメンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌を好適に検出することができる。
なお、この細菌検出装置１００は、メンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌（被検体液中に含まれていた細菌）の数を正確にカウントすることに用いることに限らず、その細菌の数が閾値以上か、閾値未満か判定することにも用いることができる。細菌の数が閾値以上か否かを判定する処理であれば、細菌の数を全てカウントする処理よりも、細菌の検出処理を短時間で行うことができる。
なお、以上の実施の形態において、細菌検出装置１００の撮像部６０は、検出チップ１０のメンブレンフィルター部分を４９升（７×７）の枡目に分割するようにして撮像したが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、撮像部６０の撮像倍率などに応じて、その他の任意の分割数（升数）で撮像するようにしてもよい。
次に、本実施形態の細菌検出装置１００を用いた菌数測定に関する他の実施形態として、１つの励起光源と２つの蛍光標識（蛍光試薬）を使用した菌数測定について説明する。
なお、上記実施形態と異なる部分についてのみ説明し、上記実施形態と同様の構成については説明を割愛する。
従来、生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識を用いて総菌数（生菌数と死菌数をあわせた菌数）を検出する処理と、死菌に結合可能な蛍光標識を用いて死菌数を検出する処理を行い、総菌数と死菌数の差分に基づき生菌数を検出するという手法が採られることがある。
但し、従来行われていた技術では、生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識に対応させた励起光を照射可能な第１の励起光源と、死菌に結合可能な蛍光標識に対応させた励起光を照射可能な第２の励起光源の、２つの励起光源が用いられていたが、本発明者らが鋭意検討した結果、１つの励起光源で２つの蛍光標識に対応する菌数測定を可能にする技術を開発するに至った。
その菌数測定に用いる細菌検出装置１００は、光照射部５０として所定の励起光を照射可能な１つの励起光源を備え、撮像部６０としてモノクロカメラを備えている。
所定の波長の励起光を照射可能な光照射部５０は、例えば、波長が４０５ｎｍのレーザー光（励起光）を照射可能な励起光源である半導体レーザー（LD：Laser Diode）を備えている。
また、撮像部６０が備えているＣＣＤカメラ６１はモノクロＣＣＤカメラであり、その撮像部６０のレンズユニット６２には、波長４０５ｎｍの光を透過させないように、例えば、波長４５０ｎｍ以上の光を透過する励起カットフィルターが配設されている。
また、この菌数測定に使用する２つの蛍光標識（蛍光試薬）として、生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識にはＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、死菌に結合可能な蛍光標識にはＡＯ（アクリジンオレンジ）を挙げることができる。
本実施形態では、２つの蛍光標識（蛍光試薬）として、ＤＡＰＩとＡＯを使用した。
そして、蛍光標識が結合された細菌が捕捉されているメンブレンフィルター１に向けて光照射部５０が所定の波長の励起光を照射し、モノクロＣＣＤカメラ（ＣＣＤカメラ６１）を備えた撮像部６０で細菌の発光点を撮像した場合、ＤＡＰＩの蛍光（発光点）とＡＯの蛍光（発光点）をそれぞれ好適に捉えることが可能であることを本発明者らが見出した。具体的には、波長が４０５ｎｍのレーザー光を照射した場合、ＤＡＰＩからの蛍光強度とＡＯからの蛍光強度が異なるが、それぞれの発光点を好適に捉えることが可能であった。
つまり、モノクロＣＣＤカメラを用いれば、１つの励起光源で２つの蛍光標識に対応する菌数測定を行うことが可能であることを本発明者らが見出した。
ここでは、ＤＡＰＩが結合された細菌の数（発光点の数）を計測することで総菌数（生菌数と死菌数をあわせた菌数）を検出することができ、ＡＯが結合された細菌の数（発光点の数）を計測することで死菌数を検出することができる。
そして、後述するように、ＤＡＰＩが結合された細菌の数（生菌数と死菌数をあわせた菌数（総菌数））とＡＯが結合された細菌の数（死菌数）の差分をとるようにすれば、生菌数を算出することができる。
なお、このような菌数測定を行って総菌数と死菌数の差分をとるようにして求めた生菌数と、従来公知の培養法（寒天培地に検体を塗布した後に形成されたコロニー数を計測する方法）によって求めた生菌数とに相関があることを本発明者らは確認し、１つの励起光源と２つの蛍光標識を使用するとともに、モノクロＣＣＤカメラを用いた菌数測定が有効であると判断した。
次に、１つの励起光源と２つの蛍光標識を使用した菌数測定について、具体的に説明する。
まず、ＤＡＰＩが結合された細菌を上面側で捕捉しているメンブレンフィルター１を、検出チップ１０の凹部１１のガラス板２上に水などの液体（自家蛍光を有さない液体）を介在させて取り付け、その検出チップ１０をステージ本体２１（ステージ２０）にセットする。
次いで、制御部７０としてのパーソナルコンピュータを操作して細菌検出装置１００による細菌数の測定を開始すると、光照射部５０が検出チップ１０のメンブレンフィルター１に向けて所定の波長の励起光を照射するとともに、ステージ２０に載置されている検出チップ１０のメンブレンフィルター１を撮像部６０の撮像エリアＲに合わせるように、第１駆動機構３０と第２駆動機構４０によってステージ２０（ステージ本体２１、サブステージ２２）を移動させ、所定位置で撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）がメンブレンフィルター１の上面を撮像する。
メンブレンフィルター１の上面にＤＡＰＩが結合された細菌が捕捉されていれば、撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）によってその細菌を発光点として撮像できる。
次いで、制御部７０は、撮像部６０が撮像した画像中の発光点をカウントする処理を行って、メンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌の数をカウントする。
このように、メンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌であって、ＤＡＰＩが結合された細菌の数を計測することで、例えば、フィルターで濾過した被検体液１ｃｃ当りの総菌数（生菌数と死菌数をあわせた菌数）を検出することができる。
このＤＡＰＩが結合された細菌の数の計測が第一工程である。
なお、総菌数を検出した後、検出チップ１０をステージ本体２１（ステージ２０）から取り外す。
次いで、ＡＯが結合された細菌を上面側で捕捉しているメンブレンフィルター１を、検出チップ１０の凹部１１のガラス板２上に水などの液体（自家蛍光を有さない液体）を介在させて取り付け、その検出チップ１０をステージ本体２１（ステージ２０）にセットする。
次いで、制御部７０としてのパーソナルコンピュータを操作して細菌検出装置１００による細菌数の測定を開始すると、光照射部５０が検出チップ１０のメンブレンフィルター１に向けて所定の波長の励起光を照射するとともに、ステージ２０に載置されている検出チップ１０のメンブレンフィルター１を撮像部６０の撮像エリアＲに合わせるように、第１駆動機構３０と第２駆動機構４０によってステージ２０（ステージ本体２１、サブステージ２２）を移動させ、所定位置で撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）がメンブレンフィルター１の上面を撮像する。
メンブレンフィルター１の上面にＡＯが結合された細菌が捕捉されていれば、撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）によってその細菌を発光点として撮像できる。
次いで、制御部７０は、撮像部６０が撮像した画像中の発光点をカウントする処理を行って、メンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌の数をカウントする。
このように、メンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌であって、ＡＯが結合された細菌の数を計測することで、例えば、フィルターで濾過した被検体液１ｃｃ当りの死菌数を検出することができる。
このＡＯが結合された細菌の数の計測が第二工程である。
そして、第一工程で検出した総菌数と、第二工程で検出した死菌数の差分をとる処理を制御部７０にて行って、生菌数を算出することができる。
また、検出した総菌数と死菌数、算出した生菌数は、表示部に表示する。
なお、制御部７０は、総菌数と死菌数の差分に基づき生菌数を算出する処理を実行することに限らず、総菌数に対する死菌数の割合を算出する処理を実行してもよい。
以上のように、本実施形態の細菌検出装置１００（細菌検出方法）であれば、１つの励起光源と２つの蛍光標識を使用した菌数測定を好適に行うことができる。
そして、総菌数と死菌数の差分に基づき生菌数を算出したり、総菌数に対する死菌数の割合を算出したりすることができる。
なお、本発明は上記実施形態に限られるものではない。
本実施形態の細菌検出装置１００に取り付けて使用する検出チップ１０として、例えば、図６（ａ）（ｂ）に示すように、凹部１１が２つ設けられている検出チップ１０を用いることができる。
図６（ａ）（ｂ）に示した検出チップ１０の２つの凹部１１は、検出チップ１０がステージ本体２１（ステージ２０）にセットされた状態で、前後に並ぶ配置に設けられている。
検出チップ１０に２つの凹部１１が設けられていれば、一方の凹部１１にＤＡＰＩが結合された細菌を上面側で捕捉しているメンブレンフィルター１を定置し、他方の凹部１１にＡＯが結合された細菌を上面側で捕捉しているメンブレンフィルター１を定置して使用することができる。
このような２つの凹部１１が設けられている検出チップ１０を使用するとともに、１つの励起光源と２つの蛍光標識を使用した菌数測定について説明する。
まず、ＤＡＰＩが結合された細菌を上面側で捕捉しているメンブレンフィルター１を、検出チップ１０の一方の凹部１１のガラス板２上に水などの液体（自家蛍光を有さない液体）を介在させて定置する。
また、ＡＯが結合された細菌を上面側で捕捉しているメンブレンフィルター１を、検出チップ１０の他方の凹部１１のガラス板２上に水などの液体（自家蛍光を有さない液体）を介在させて定置する。
そして、２つの凹部１１にそれぞれメンブレンフィルター１を取り付けた検出チップ１０をステージ本体２１（ステージ２０）にセットする。
次いで、制御部７０としてのパーソナルコンピュータを操作して細菌検出装置１００による細菌数の測定を開始すると、光照射部５０が検出チップ１０のメンブレンフィルター１に向けて所定の波長の励起光を照射するとともに、ステージ２０に載置されている検出チップ１０のメンブレンフィルター１を撮像部６０の撮像エリアＲに合わせるように、第１駆動機構３０と第２駆動機構４０によってステージ２０（ステージ本体２１、サブステージ２２）を移動させ、所定位置で撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）がメンブレンフィルター１の上面を撮像する。なお、２つの凹部１１に定置されたそれぞれのメンブレンフィルター１を撮像部６０の撮像エリアＲに合わせることができるように、第１駆動機構３０によるサブステージ２２の前後方向の可動域と、第２駆動機構４０によるステージ本体２１の左右方向の可動域が調整されている。
一方の凹部１１に定置されたメンブレンフィルター１の上面にＤＡＰＩが結合された細菌が捕捉されていれば、撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）によってその細菌を発光点として撮像できる。同様に、他方の凹部１１に定置されたメンブレンフィルター１の上面にＡＯが結合された細菌が捕捉されていれば、撮像部６０（ＣＣＤカメラ６１）によってその細菌を発光点として撮像できる。
次いで、制御部７０は、撮像部６０が撮像した画像中の発光点をカウントする処理を行って、メンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌の数をカウントする。
一方の凹部１１に定置されたメンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌であって、ＤＡＰＩが結合された細菌の数を計測することで、例えば、フィルターで濾過した被検体液１ｃｃ当りの総菌数（生菌数と死菌数をあわせた菌数）を検出することができる。
また、他方の凹部１１に定置されたメンブレンフィルター１の上面に捕捉されている細菌であって、ＡＯが結合された細菌の数を計測することで、例えば、フィルターで濾過した被検体液１ｃｃ当りの死菌数を検出することができる。
こうして検出した総菌数と死菌数の差分をとる処理を制御部７０にて行って、生菌数を算出することができる。
また、検出した総菌数と死菌数、算出した生菌数は、表示部に表示する。
なお、制御部７０は、総菌数と死菌数の差分に基づき生菌数を算出する処理を実行することに限らず、総菌数に対する死菌数の割合を算出する処理を実行してもよい。
以上のように、本実施形態の細菌検出装置１００（細菌検出方法）であれば、１つの励起光源と２つの蛍光標識を使用した菌数測定を好適に行うことができる。
そして、総菌数と死菌数の差分に基づき生菌数を算出したり、総菌数に対する死菌数の割合を算出したりすることができる。
特に、２つの凹部１１が設けられている検出チップ１０を使用すれば、メンブレンフィルター１や検出チップ１０の付け替えを行うことなく、ＤＡＰＩが結合された細菌数の計測とＡＯが結合された細菌数の測定をスムーズに行うことができる。
なお、図６（ａ）（ｂ）に示した検出チップ１０の２つの凹部１１は、検出チップ１０がステージ本体２１（ステージ２０）にセットされた状態で、前後に並ぶ配置に設けられていたが、本発明は上記実施形態に限られるものではない。
例えば、図７（ａ）（ｂ）に示すように、検出チップ１０がステージ本体２１（ステージ２０）にセットされた状態で、左右に並ぶ配置に２つの凹部１１が設けられている検出チップ１０であってもよい。
この場合、ステージ本体２１に設けられている検出チップ１０の載置部は、図７（ａ）（ｂ）に示した検出チップ１０に応じた形状に形成されている。
また、２つの凹部１１に定置されたそれぞれのメンブレンフィルター１を撮像部６０の撮像エリアＲに合わせることができるように、第１駆動機構３０によるサブステージ２２の前後方向の可動域と、第２駆動機構４０によるステージ本体２１の左右方向の可動域が調整されている。
このような配置であっても、２つの凹部１１が設けられている検出チップ１０を使用すれば、メンブレンフィルター１や検出チップ１０の付け替えを行うことなく、ＤＡＰＩが結合された細菌数の計測とＡＯが結合された細菌数の測定をスムーズに行うことができる。
なお、上記した実施形態においては、総菌数と死菌数の差分に基づき生菌数を算出する処理（総菌数に対する死菌数の割合を算出する処理）について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識と、生菌に結合可能な蛍光標識を使用して、総菌数と生菌数の差分に基づき死菌数を算出する処理（総菌数に対する生菌数の割合を算出する処理）を実行するようにしてもよい。
また、上記した実施形態においては、検出チップ１０の２つの凹部１１に、それぞれ異なる蛍光標識が結合された細菌を上面側で捕捉しているメンブレンフィルター１を定置したが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、検出チップ１０の２つの凹部１１に同じ蛍光標識が結合された細菌を上面側で捕捉しているメンブレンフィルター１を定置するようにして、２つの試料（被検体液）の測定を行うようにしてもよい。
また、その他、具体的な細部構造等についても適宜に変更可能であることは勿論である。
１ メンブレンフィルター
２ ガラス板
１０ 検出チップ
１１ 凹部
１２ 遮光板部
２０ ステージ
２１ ステージ本体
２１ａ ピン
２２ サブステージ
２２ａ 軸
３０ 第１駆動機構
３１ 第１モータ
３２ コグドベルト
４０ 第２駆動機構
４１ 第２モータ
４２ 円筒カム
４２ａ 案内溝
５０ 光照射部
５１ 光源支持部
６０ 撮像部
６１ ＣＣＤカメラ
６２ レンズユニット
６３、６４ ミラー
７０ 制御部
７１ 制御基板
７２ ケーブル
１００ 細菌検出装置
Ｒ 撮像エリア

Claims (8)

  1. 蛍光標識が結合された細菌を上面側で捕捉しているメンブレンフィルターがその上面を上にして定置される凹部が設けられている検出チップと、
    前記検出チップを載置可能な載置部を有するステージと、
    前記ステージを一の方向に移動させる第１駆動機構と、
    前記ステージを一の方向と直交する方向に移動させる第２駆動機構と、
    前記検出チップの前記メンブレンフィルターの上面に光を照射する光照射部と、
    前記メンブレンフィルターの上面を撮像する撮像部と、
    前記撮像部が撮像した画像中の発光点をカウントすることで、前記メンブレンフィルター上の細菌の数をカウントする制御部と、
    を備えたことを特徴とする細菌検出装置。
  2. 前記検出チップが前記ステージに載置された向きで、前記凹部を挟んで前記光照射部の反対側となる前記検出チップの上面の所定部位には、前記光照射部が照射した光が前記凹部側に反射するのを低減する遮光板部が設けられていることを特徴とする請求項１に記載の細菌検出装置。
  3. 前記検出チップの少なくとも前記遮光板部は暗色系の色に着色されていることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出装置。
  4. 前記メンブレンフィルターは、前記凹部に嵌め入れられたガラス板の上に定置されているとともに、前記ガラス板と前記メンブレンフィルターの間には自家蛍光を有さない液体が介在されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌検出装置。
  5. 前記検出チップには前記凹部が２つ設けられていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌検出装置。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌検出装置を用いた細菌検出方法であって、
    蛍光標識が結合された細菌をメンブレンフィルターで捕捉するステップと、
    前記検出チップの凹部にガラス板を設置するステップと、
    前記ガラス板の上に自家蛍光を有さない液体を滴下するステップと、
    前記ガラス板上に前記メンブレンフィルターを定置するステップと、
    前記メンブレンフィルターが定置されている前記検出チップを前記ステージに載置するステップと、
    前記メンブレンフィルターに前記光照射部から励起光を照射するステップと、
    前記メンブレンフィルターを前記撮像部で撮像するステップと、
    前記撮像部が撮像した画像中の発光点に基づき、前記メンブレンフィルターで捕捉している細菌を検出するステップと、
    を有することを特徴とする細菌検出方法。
  7. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌検出装置であって、前記光照射部として所定の励起光を照射可能な１つの光源を備え、前記撮像部としてモノクロカメラを備えている細菌検出装置を用いた細菌検出方法において、
    蛍光標識が結合された細菌をメンブレンフィルターで捕捉する第１ステップと、
    前記検出チップの凹部にガラス板を設置する第２ステップと、
    前記ガラス板の上に自家蛍光を有さない液体を滴下する第３ステップと、
    前記ガラス板上に前記メンブレンフィルターを定置する第４ステップと、
    前記メンブレンフィルターが定置されている前記検出チップを前記ステージに載置する第５ステップと、
    前記メンブレンフィルターに前記光照射部から励起光を照射する第６ステップと、
    前記メンブレンフィルターを前記撮像部で撮像する第７ステップと、
    前記撮像部が撮像した画像中の発光点に基づき、前記メンブレンフィルターで捕捉している細菌を検出する第８ステップと、
    を有し、
    生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識を用いて前記第１ステップから前記第８ステップを行って総菌数を検出し、生菌と死菌のいずれか一方に結合可能な蛍光標識を用いて前記第１ステップから前記第８ステップを行って生菌数又は死菌数を検出することを特徴とする細菌検出方法。
  8. 請求項５に記載の細菌検出装置であって、前記光照射部として所定の励起光を照射可能な１つの光源を備え、前記撮像部としてモノクロカメラを備えている細菌検出装置を用いた細菌検出方法において、
    蛍光標識が結合された細菌をメンブレンフィルターで捕捉する第１ステップと、
    前記検出チップの凹部にガラス板を設置する第２ステップと、
    前記ガラス板の上に自家蛍光を有さない液体を滴下する第３ステップと、
    前記ガラス板上に前記メンブレンフィルターを定置する第４ステップと、
    前記メンブレンフィルターが定置されている前記検出チップを前記ステージに載置する第５ステップと、
    前記メンブレンフィルターに前記光照射部から励起光を照射する第６ステップと、
    前記メンブレンフィルターを前記撮像部で撮像する第７ステップと、
    前記撮像部が撮像した画像中の発光点に基づき、前記メンブレンフィルターで捕捉している細菌を検出する第８ステップと、
    を有し、
    生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識を用いて前記第１ステップから前記第４ステップを行って、生菌と死菌の両方に結合可能な蛍光標識が結合された細菌を捕捉しているメンブレンフィルターを前記検出チップの一方の凹部に定置し、生菌と死菌のいずれか一方に結合可能な蛍光標識を用いて前記第１ステップから前記第４ステップを行って、生菌と死菌のいずれか一方に結合可能な蛍光標識が結合された細菌を捕捉しているメンブレンフィルターを前記検出チップの他方の凹部に定置した後、前記第５ステップを行ってその検出チップを前記ステージに載置し、
    前記一方の凹部に定置されている前記メンブレンフィルターに対し前記第６ステップから前記第８ステップを行って総菌数を検出し、前記他方の凹部に定置されている前記メンブレンフィルターに対し前記第６ステップから前記第８ステップを行って生菌数又は死菌数を検出することを特徴とする細菌検出方法。
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