CN106153878A - 循环肿瘤细胞（ctc）全自动扫描与分析检测系统及临床检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全自动化扫描和分析检测外周血循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTC)的设备，它包括：a、全自动正置荧光显微镜，荧光显微镜上配置有4种荧光滤色镜，4种荧光滤色镜分别是红色、绿色、橙色、蓝色荧光滤色镜；b、显微镜单细胞自动扫描与图像分析系统，所述系统包含扫描装置、相机、计算机以及图像控制及分析软件，所述软件包含红光曝光时间控制模块、绿光曝光时间控制模块、橙光曝光时间控制模块、蓝光曝光时间控制模块和细胞识别模块。本发明还公开了一种全自动化扫描和分析检测循环肿瘤细胞的方法。本发明检测设备、检测装置、检测方法可以有效、准确检测CTC，实现了自动化和标准化检测，误差小，成本低廉，临床应用前景非常优良。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械和检测技术领域，尤其是涉及循环肿瘤细胞检测的平台系统和循环肿瘤细胞自动检测方法。
背景技术
肿瘤是否发生转移往往与肿瘤的分型和分期、肿瘤的治疗效果、有无复发、以及患者预后密切相关。目前，临床最常用的影像学检查手段包括超声(US)，计算机断层显像(CT)，磁共振显像(MRI)和正电子发射断层显像(PET)。但影像检测肿瘤最低检出直径至少为2-3mm,即小于该直径范围的肿瘤通过影像学检查往往不能被发现，且对检查结果的判别也会受到不同医生主观判断的影响。并且在进行X片、CT等检查的过程中，患者需要暴露于一定剂量的射线中，存在一定的健康危害或健康隐患。另外，多数影像学检查费用昂贵，存在一定的经济负担及医疗保险问题。血浆中的肿瘤标志物也应用于肿瘤辅助性诊断参考和肿瘤随访观察指标，但是这些标志物为非特异性标记物，准确率差，不能作为肿瘤诊断的依据。某些病理生理状态可能引起一些标志物的在血液中的水平不稳定，从而造成结果检出错误。同时，不是所有组织来源的肿瘤均具有可用于肿瘤辅助诊断的、足够可靠的、特异的标志物。而且部分肿瘤由于生长部位的限制难以获得组织病理诊断；肿瘤在未形成转移灶之前，无法知晓肿瘤是否进入血液或潜在转移。
鉴于目前常规肿瘤检查手段的不足，临床医生不但需要更为准确的用于肿瘤本身性质评估的数据，更急需可以精准评估肿瘤治疗疗效准确性与有效性的可靠参数。
循环肿瘤细胞(CTC)是由原发或转移病灶脱落进入外周血的肿瘤细胞，其作为一种实时“液体活检”手段反映了肿瘤是否发生侵袭转移，大量研究结果提示，血液中血环肿瘤细胞与癌症的发生发展都有直接关系，检测和分析外周血中的单个或少量循环肿瘤细胞簇，对肿瘤的早期诊断、肿瘤诊断的分期和分型、手术前评估和手术后辅助性治疗的指导与评价、评估患者对治疗(化疗药物和放疗)反应、预测肿瘤的复发和转移、对肿瘤治疗效果的实施监测、指导肿瘤个体化精准治疗、肿瘤耐药性的监控、预后判断和预测的准确性和有效性的评估非常关键。因此，研发一种无需复杂操作且非侵袭性检测的可以血液准确检测肿瘤细胞的方法(液体活检)在临床上尤其是精准医疗有着极其重要的意义。
但是，相比较外周血中存在的大量白细胞，循环肿瘤细胞仅为外周血中的稀有细胞，检测起来非常困难。目前，CTCs的检测和鉴定方法众多，包括各种荧光原位杂交技术和流式细胞术、聚合酶链反应和逆转录聚合酶链反应及其各种改进的技术等等。
荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization)，简称FISH。是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布。然而，目前需要通过人工观察计数的方式来检测，如，张玉娟，循环肿瘤细胞检测的方法学建立和改良及在实体瘤中的监测应用研究，《中国博士学位论文全文数据库》2014/11医药卫生科技辑E072-11一文中，就是采用人工观察来检测血液中的CTC数量。然而，人工观察的方式非常不方便，成本高，而且不确定因素多，对人员的要求高，人为误差极大，难以实现临床批量和精准检测、以及标准化检测，极大地限制了其实际临床应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了全自动化扫描和分析检测循环肿瘤细胞(CTC)的设备、装置和方法。
本发明全自动化扫描和分析检测循环肿瘤细胞(CTC)的设备，它包括：
a、全自动正置荧光显微镜，荧光显微镜上配置有4种荧光滤色镜，4种荧光滤色镜分别是红色、绿色、橙色、蓝色荧光滤色镜；
b、显微镜单细胞自动扫描与图像分析系统，所述系统包含扫描装置、相机、计算机以及图像控制及分析软件，所述软件包含红光曝光时间控制模块、绿光曝光时间控制模块、橙光曝光时间控制模块、蓝光曝光时间控制模块和细胞识别模块。
其中，所述荧光显微镜为全自动正置荧光显微镜ZEISS Axio Imager Z2。
其中，所述荧光显微镜上的物镜设置为10倍增强反差型平场荧光物镜PA(Plan-APOCHROMAT)镜头。
其中，所述显微镜图像自动扫描与分析系统为Metafer 3.10.2系统。
其中，所述红光曝光时间控制模块设置为控制红光的最低曝光时间为0.04s。
其中，所述绿光曝光时间控制模块设置为控制绿光的最低曝光时间为0.8s。
其中，所述橙光曝光时间控制模块设置为控制橙光的曝光时间为自动曝光。
其中，所述蓝光曝光时间控制模块设置为控制蓝光的最低曝光时间为0.0026s。
其中，所述细胞识别模块设置为循环肿瘤细胞(CTC)识别模块，具体是设置为用于识别CD45染色阴性，大小为10～150μm，并且EpCAM阳性或CK-18阳性及8号染色体数目二倍体或非二倍体的细胞或者EpCAM阴性或CK-18阴性但8号染色体数目非二倍体的细胞。
也就是说，本发明检测循环肿瘤细胞的3个指标是：1、CD45染色阴性；2、细胞大小为10～150μm；3、可以是①EpCAM阳性或CK-18阳性，8号染色体数目可以是二倍体或非二倍体；也可以是②EpCAM阴性或CK-18阴性但8号染色体数目非二倍体。
本发明还提供了一种检测外周血循环肿瘤细胞的装置，包括前述的设备和检测试剂；所述检测试剂包括人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒和CK,EpCAM-iFISH CTC检测试剂盒。
本发明还提供了一种全自动化扫描和分析检测循环肿瘤细胞的方法，步骤如下：取待检样本，用前述的设备进行扫描和分析，即可。
优选地，步骤如下：
(1)取待检血液样本和前述检测外周血循环肿瘤细胞的装置；
(2)用人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒和CK,EpCAM-iFISHCTC检测试剂盒处理待检血液样本，制片，再用检测外周血循环肿瘤细胞的设备进行扫描和分析，即可。
综上，本发明检测设备、检测装置、检测方法可以有效、准确检测CTC，实现了自动化、批量和标准化检测，确保CTC检测的质量控制和保证、误差小，成本低廉，临床应用前景非常优良。
本发明的系统只要是用于循环肿瘤细胞检测和研究均适合本发明，不限于以下所描述的CTC检测方法，包括其他所有用于该设备和系统所进行的CTC检测和研究。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为EpCAM(+)，二倍体的循环肿瘤细胞图。
图2为EpCAM(+)，三倍体的循环肿瘤细胞图。
图3为EpCAM(+)，四倍体的循环肿瘤细胞图。
图4为EpCAM(+)循环肿瘤栓图。
图5为EpCAM(-)，三倍体的循环肿瘤细胞图。
图6为EpCAM(-)，四倍体的循环肿瘤细胞图。
图7为EpCAM(-)，≥5倍体的循环肿瘤细胞图。
图8为EpCAM(-)循环肿瘤栓图。
图9为CK18(+)，四倍体的循环肿瘤细胞图。
图10为CK18(+)循环肿瘤栓图。
具体实施方式
实施例1 本发明全自动化扫描和分析检测外周血循环肿瘤细胞(CTC)的设备以及用该设备检测循环肿瘤细胞(CTC)的方法
1、本发明系统的组成
I、全自动正置荧光显微镜(蔡司)ZEISS Axio Imager Z2
表1 全自动正置荧光显微镜
| 序号 | 数量 | 部件 |
| 1 | 1 | 主机 |
| 2 | 1 | 卤素灯灯室 |
| 3 | 1 | 电动6位反射光模块转盘 |
| 4 | 1 | 插片固定器 |
| 5 | 1 | 反射光组件 |
| 6 | 1 | 可调中的视场光阑插件 |
| 7 | 1 | 荧光防护屏 |
| 8 | 1 | 照相镜筒 |
| 9 | 1 | 增强反差型平场荧光物镜40×(NA0.75) |
| 10 | 1 | 增强反差型平场荧光物镜10×(NA0.3) |
| 11 | 1 | 增强反差型平场荧光物镜20×(NA0.5) |
| 12 | 2 | 10倍视场23mm目镜 |
| 13 | 2 | 目镜罩 |
| 14 | 1 | 聚光镜 |
| 15 | 4 | 荧光滤色镜座 |
| 16 | 1 | C型照相接口1×x |
| 17 | 1 | 白平衡滤光片 |
| 18 | 1 | 滤色镜支架 |
| 19 | 10 | 卤素灯泡 |
| 20 | 1 | 长寿命金属卤化物荧光光源 |
| 21 | 1 | RS232控制线长寿命金属卤化物荧光光源 |
| 22 | 1 | RS232控制线 |
| 23 | 1 | 全自动玻片扫描系统及其软件模块 |
Ⅱ、显微镜单细胞图像自动扫描与分析系统
采用Metafer 3.10.2系统，其包含扫描台，电动机控制卡，操控手柄，自动校正玻片，CoolCube 400万像素单色CCD，系统升级软件包，荧光原位杂交软件模块，防止自动断电保护开关，计算机以及图像控制及分析软件，图像控制及分析软件包括细胞识别模块、红光曝光时间控制模块、绿光曝光时间控制模块、橙光曝光时间控制模块、蓝光曝光时间控制模块。
其中，细胞识别模块设置为循环肿瘤细胞(CTC)识别模块，具体是设置为用于识别CD45染色阴性，细胞大小为10～150μm，并且EpCAM阳性或CK-18阳性及8号染色体数目二倍体或非二倍体的细胞或者EpCAM阴性、CK-18阴性但8号染色体数目非二倍体的细胞。
红光曝光时间控制模块设置为控制红光的最低曝光时间调节为为0.04s(秒)；绿光曝光时间控制模块设置为控制绿光的最低曝光时间调节为0.8s；橙光曝光时间控制模块设置为控制橙光的曝光时间调节自动曝光；蓝光最低曝光时间控制设置为控制蓝光模块的曝光时间调节为0.0026s；
2、本发明系统及其使用和CTC的检测方法
试剂盒：人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒(型号SEH-011，购自Cytelligen)；CK,EpCAM-iFISH CTC检测试剂盒(型号FSH-002，购自Cytelligen)；体腔积液或脑脊液循环肿瘤细胞差相富集试剂盒和检测试剂盒(购自Cytelligen)
(1)血液采集方法：
1.1 采血人在CTC检测专用采血管上标签空白处标注好病人姓名、编号、采集日期、采血人姓名。由于采血管内有负压，黄帽不可打开。
1.2 采血时，为避免上皮细胞污染，请用红帽采血管先采集约2mL弃之(也可安排在其它采血后再用CTC专用采血管继续采血)。
1.3 为避免干扰，抽取受检者饿血，病人抽血处消毒处理，一次性采血针一头插入静脉，另一头插入采血管黄色橡皮塞内，在管内有负压，血液会自动流入采血管，液面到达管上黄色标线时，可停止采血，拔出采血针。
1.4 采血完成后，立即采血管头尾颠倒10次，充分混匀防止凝血，室温避光保存。血样采集后，采血人将采血管放入采血箱内，避免运送途中震荡，以免肿瘤细胞受损，在48小时内进行实验。
(2)制片：
按照“人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒”和“CK，EpCAM-iFISHCTC检测试剂盒”操作说明书对血液样本进行制片。
(3)检测
取片子置于荧光显微镜载物台上，启动显微镜图像自动扫描与分析系统，控制扫描的光和时间，自动扫描并读取信息筛选循环肿瘤细胞，扫描结束后生成编号.MSD(扫描信息，图像库)和编号.MSX(全分辨率视场)数据文件。
以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：
实施例1 采用本发明系统及方法进行临床检测
1、临床资料
100例肿瘤患者的临床资料
| 性别 | 平均年龄 |
| 男(61例) | 50.52 |
| 女(39例) | 49.87 |
部分患者的详细资料
2、检测
采用实施例1的装置、试剂盒，按照实施例1的方法进行检测。
3、检测结果
检测结果如图1～10和表2所示：
表2 100例肿瘤病人循环肿瘤细胞(CTC)检测结果
实验结果说明，采用本发明设备和系统可以有效检测血液中的人循环肿瘤细胞，实现了自动化检测。
实验例2 本发明检测设备、方法的准确性检验
1、方法
选择13个样本，分别采用本发明自动检测方法以及传统人工检测方法检测：
1.1 本发明方法：
采用实施例1的装置、试剂盒，按照实施例1的方法进行检测。
1.2 传统方法：
采用实施例1的试剂盒，按照如下方法检测：
1.2.1 调节显微镜PA10×镜头，置放标本至载物台，调节焦距，直至能清晰地看见细胞。
1.2.2 镜头调节至40×红色通道下，将载物台上标本框右下角移至光路中，视野内显示标本框左上角。
1.2.3 选定第一个视野，从左至右平行移动视野，至右侧边缘时，在视野底部切线上选择一参照物(参照物可为细胞、杂质、气泡等)，向下移动视野，使标志物落在视野的顶部切线上(刚好看不见参照物)，由右向左平行移动视野至左侧边缘后再选择参照物，向下移动视野。如此反复本项步骤至读片结束。如果过程中看到CD45阴性的细胞，通过确定8号染色体数目，再依次调到蓝光、绿光下观察，根据CTC判定标准判断该细胞是否为肿瘤细胞。
2、结果
检测结果如下表所示：
表3 分别采用本发明自动检测方法以及传统人工检测方法的结果
由上表可以看出，在判断待检测样本是否有CTC这一指标上，本发明自动检测方法与传统人工检测方法的检测结果是完全一致的；在CTC个数方面，发明自动检测方法与传统人工检测方法的检测结果也几乎一致。
实验结果证明，本发明方法可以准确检测CTC。
综上，本发明检测设备、检测装置、检测方法可以有效、准确检测CTC，实现了自动化和标准化检测，误差小，方法简便，成本低，临床应用前景非常优良。
Claims (10)
1.一种全自动化扫描和分析检测循环肿瘤细胞的设备，其特征在于：它包括：
a、全自动正置荧光显微镜，荧光显微镜上配置有4种荧光滤色镜，4种荧光滤色镜分别是红色、绿色、橙色、蓝色荧光滤色镜；
b、显微镜单细胞自动扫描与图像分析系统，所述系统包含扫描装置、相机、计算机以及图像控制及分析软件，所述软件包含红光曝光时间控制模块、绿光曝光时间控制模块、橙光曝光时间控制模块、蓝光曝光时间控制模块和细胞识别模块。
2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于：所述荧光显微镜为全自动正置荧光显微镜ZEISS Axio Imager Z2。
3.根据权利要求1所述的设备，其特征在于：所述荧光显微镜上的物镜设置为10倍增强反差型平场荧光物镜PA镜头。
4.根据权利要求1所述的设备，其特征在于：所述显微镜图像自动扫描与分析系统为Metafer 3.10.2系统。
5.根据权利要求4所述的设备，其特征在于：所述红光曝光时间控制模块设置为控制红光的最低曝光时间为0.04s；所述绿光曝光时间控制模块设置为控制绿光的最低曝光时间为0.8s。
6.根据权利要求4所述的设备，其特征在于：所述橙光曝光时间控制模块设置为控制橙光的曝光时间为自动曝光；所述蓝光曝光时间控制模块设置为控制蓝光的最低曝光时间为0.0026s。
7.根据权利要求4所述的设备，其特征在于：所述细胞识别模块设置为循环肿瘤细胞识别模块，具体是设置为用于识别CD45染色阴性，大小为10～150μm，并且EpCAM阳性或CK-18阳性及8号染色体数目二倍体或非二倍体的细胞或者EpCAM阴性、CK-18阴性但8号染色体数目非二倍体的细胞。
8.一种检测外周血循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：包括权利要求1～7任意一项所述的设备和检测试剂；所述检测试剂包括人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒和CK,EpCAM-iFISH CTC检测试剂盒。
9.一种全自动化扫描和分析检测循环肿瘤细胞的方法，其特征在于：步骤如下：取待检样本，用权利要求1～7任意一项所述的设备进行扫描和分析，即可。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)取待检血液样本和权利要求8所述的装置；
(2)用人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒和CK,EpCAM-iFISH CTC检测试剂盒处理待检血液样本，制片，再用权利要求1～7任意一项所述的设备进行扫描和分析，即可。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20161123 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |