CN108977535A - 一种用于检测膀胱肿瘤良恶性程度的模型及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因诊断领域，具体涉及一种用于检测膀胱肿瘤良恶性程度的模型及其应用，所述模型通过计算印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量对印记基因在肿瘤中的变化进行分级。本发明所述检测模型和装置，首次以直观的方法表现了印记缺失在膀胱肿瘤病人的样本上的表现，通过对印记基因原位标记的方法，客观、直观、早期、精确地检测出印记(迹)基因的变化，并可以提供量化的模型，为分子病理学的诊断做出巨大贡献。

Description

一种用于检测膀胱肿瘤良恶性程度的模型及其应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，涉及基因诊断领域，具体涉及一种用于检测膀胱肿瘤良恶性程度的模型及其应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病率居泌尿系统恶性肿瘤的首位。据世界卫生组织(WHO)统计，2012年全球新增病例429,793例，死亡165,084例，中国新诊断55,486例，死亡26,820例(World Cancer Report 2014)。膀胱癌居中国男性泌尿生殖系恶性肿瘤发病率第一位，居中国恶性肿瘤发病率第八位。膀胱癌发病率呈逐年上升态势，1998至2008年间，中国膀胱癌发病率增长56.69％(中国膀胱癌发病率现状及流行趋势分析2013)。膀胱癌在第一次手术切除后复发率高达75％，并且10-15％的复发肿瘤恶性程度增加。膀胱癌早期，在经尿道膀胱移行细胞癌电切术治疗后，5年存活率可达78％。而膀胱癌晚期，病人接受膀胱根治性切除后，其5年存活率不超过40％。以上数据表明，膀胱癌存在复发率高，早期治疗效果好的特点。
癌症的产生是随时间推移而累积的表观遗传改变和基因上的变异所导致的不受控制的细胞生长/分裂。传统病理学诊断根据细胞和组织的大小，形态和结构上的变异，从而做出膀胱肿瘤良恶性判断。随着分子生物学的发展与深入，越来越多的分子检测技术被应用于膀胱癌症的检测。从癌症的发展过程分析，分子层面的改变(表观遗传学和基因学)远早于细胞形态和组织结构的变异。所以分子生物学检测对癌症早期的检测更敏感。
基因组印记是表观遗传学中基因调控的一种方式。其特点是，通过甲基化来自特定亲代的等位基因，使某个基因只有一个等位基因表达，而另一个则陷入基因沉默状态。该种类的基因，被称为印迹(记)基因。印迹缺失是印迹基因去甲基化导致沉默状态的等位基因被激活并且开始基因表达的一种表观遗传改变。大量研究表明，该现象(印迹缺失)普遍存在于各类癌症并且发生时间早于细胞和组织形态改变。与此同时，在健康细胞中，印迹缺失比例极低，与癌细胞成鲜明对比。所以，印迹基因的甲基化状态可以作为病理标记，通过特定分子检测技术，对细胞异常状态进行分析。
基于上述原因，目前的膀胱癌诊断需要新的检测系统和检测模型，基于患者活检样本，解析膀胱癌在细胞层面上存在的分子标记物变化，以此提供更精确的预诊和诊断信息。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本申请提供了一种用于检测膀胱肿瘤良恶性程度的模型及其应用，该检测装置和模型是用于单细胞和组织水平下早期直观地观察各类型肿瘤的印记(迹)基因的变化从而判断膀胱肿瘤的良恶性及恶性程度。
为达到上述目的，本申请采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于膀胱肿瘤的印记基因分级模型，其通过计算印记基因总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量在膀胱肿瘤中的变化对印记基因的表达状态进行分级；
其中，所述印记基因为Z1、Z2、Z3、Z4或Z5中的任意一个或至少两个的组合，所述印记基因Z1为Gnas，所述印记基因Z2为Igf2，所述印记基因Z3为Peg10，所述印记基因Z4为Igf2r，所述印记基因Z5为Mest。
本发明中，发明人发现通过计算Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中任意一个印记基因在膀胱肿瘤中的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量，对膀胱癌的诊断敏感度可以达到85.0％以上。
根据本发明，所述模型计算印记基因的方法如下：
计算Z1、Z2、Z3、Z4或Z5中的任意一个印记基因，优选为计算Z1、Z2、Z4或Z5中的任意一个印记基因，进一步优选为计算Z2或Z4。
本发明中，发明人发现，单独检测一个Z1印记基因，对膀胱癌的诊断敏感度可以达到85.7％，单独检测一个Z2印记基因，对膀胱癌的诊断敏感度可以达到92.3％，单独检测一个Z3印记基因，对膀胱癌的诊断敏感度可以达到85.0％，单独检测一个Z4印记基因，对膀胱癌的诊断敏感度可以达到95.0％，单独检测一个Z5印记基因，对膀胱癌的诊断敏感度可以达到87.2％。
根据本发明，所述模型计算印记基因的方法为：计算Z1、Z2、Z3、Z4或Z5中的任意两个印记基因的组合，优选为计算Z1和Z2印记基因的组合或Z2和Z4印记基因的组合。
本发明中，发明人发现通过计算两个或两个以上的印记基因的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量可以进一步提高印记基因的敏感度，检测印记基因的两个印记基因的组合，对膀胱癌的诊断敏感度可以达到94.9％以上，检测Z1和Z2的组合，Z2和Z4的组合时，对膀胱癌的诊断敏感度可以达到99.9％以上。
根据本发明，所述印记基因还包括Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15或Z16中的任意一个或至少两个的组合；
其中，所述印记基因Z6为Plagl1，所述印记基因Z8为Dcn，所述印记基因Z9为Dlk1，所述印记基因Z10为Gatm，所述印记基因Z11为Grb10，所述印记基因Z15为Diras3，所述印记基因Z16为Snrpn/Snurf；
本发明中，发明人发现在使用Z1、Z2、Z3、Z4和Z5基因检测的基础上再增加Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16基因进行联合诊断，不仅有助于增加检测的准确度，而且增加其他探针辅助诊断可以进一步避免假阳性的出现，能够将检测准确度进一步提高，从而能够实现所有膀胱样本的精确分级和判断。
根据本发明，所述模型计算印记基因的方法为：计算印记基因的组合，所述印记基因为Z1-Z6、Z8-Z11、Z15-Z16的十二个印记基因的组合。
本发明中，所述印记基因缺失为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，所述印记基因拷贝数异常为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，所述拷贝数异常是由于癌细胞异常地进行基因复制，导致这个基因表达时呈现为三倍体甚至更高的多倍体的情况。
本发明中，所述苏木素染色后的标记选自但不限于红色或棕色，用其他颜色进行染色标记也可用于印迹基因表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的计算。
本发明中，所述印记基因与印迹基因同时一个概念，表示同一个意思，可以进行替换。
根据本发明，所述计算印记基因表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
正常印记基因表达量＝b/(b+c+d)×100％；
印记基因缺失表达量＝c/(b+c+d)×100％；
印记基因拷贝数异常表达量＝d/(b+c+d)×100％；
其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核。
本发明中，所述苏木素染色后的标记选自但不限于红色或棕色，用其他颜色进行染色标记也可用于印迹基因表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的计算。
本发明中，将探针通过原位杂交，和Hemotoxy(苏木精)细胞核染色扩增信号，在40×或60×显微镜下，判断每一个细胞核内印记基因存在、印记基因缺失或拷贝数异常，通过计算印记基因表达量、印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常的基因表达量来判定该样本的肿瘤良恶性程度。由于切片仅为10μm，所以在显微镜下所见细胞核大约有20％为不完整细胞核，也就是说有部分假阴性的可能性存在。
根据本发明，所述印记基因缺失基因表达量、印记基因拷贝数异常基因表达量和总表达量分成五个不同的等级；
优选地，所述五个不同的等级为在样本每个探针表达最阳性的区域对至少1200个细胞进行计数，针对Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的十二个印记基因的印记基因缺失基因表达量、印记基因拷贝数异常基因表达量和总表达量分别进行划分的五个不同的等级：
优选地，所述针对Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量小于10％和/或所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％；
I级：所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量为10-20％和/或所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.5％；
II级：所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量为20-25％和/或所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因拷贝数异常表达量为1.5-3.2％；
III级：所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量为25-30％和/或所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因拷贝数异常表达量为3.2-5％；
IV级：所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量大于30％和/或所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因拷贝数异常表达量大于5％；
本发明中，所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量是相互独立的。
优选地，所述针对Z5和Z6的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z5和Z6的印记基因缺失表达量小于10％和/或所述印记基因Z5和Z6的印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％；
I级：所述印记基因Z5和Z6的印记基因缺失表达量为10-15％和/或所述印记基因Z5和Z6的印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％；
II级：所述印记基因Z5和Z6的印记基因缺失表达量为15-21％和/或所述印记基因Z5和Z6的印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％；
III级：所述印记基因Z5和Z6的印记基因缺失表达量为21-30％和/或所述印记基因Z5和Z6的印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％；
IV级：所述印记基因Z5和Z6的印记基因缺失表达量大于30％和/或所述印记基因Z5和Z6的印记基因拷贝数异常表达量大于4％；
本发明中，所述印记基因Z5和Z6的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量是相互独立的。
优选地，所述针对Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量小于10％和/或所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％；
I级：所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量为10-15％和/或所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％；
II级：所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量为15-21％和/或所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％；
III级：所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量为21-25％和/或所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％；
IV级：所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量大于25％和/或所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于4％。
本发明中，所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量是相互独立的。
第二方面，本发明提供一种检测膀胱肿瘤良恶性程度的装置，其采用如第一方面所述的模型，包括如下单元：
(1)取样单元：获取待测样本；
(2)探针设计单元：根据印记基因序列设计特异性引物；
(3)检测单元：将步骤(2)的探针与待测样本进行原位杂交；
(4)分析单元：显微镜成像分析印记基因的表达状态；
其中，所述分析单元通过计算印记基因总表达量、印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常基因表达量，通过第一方面所述的模型，从而通过印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常基因表达量的等级来判断膀胱肿瘤的良恶性程度。
本发明中，所述印记基因缺失为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记的细胞核，所述印记基因拷贝数异常为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记的细胞核，所述拷贝数异常是由于癌细胞异常地进行基因复制，导致这个基因表达时呈现为三倍体甚至更高的多倍体的情况。
本发明中，所述苏木素染色后的标记选自但不限于红色或棕色，用其他颜色进行染色标记也可用于印迹基因表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的计算。
本发明所述检测系统是用于细胞和组织水平下早期直观地观察各类型肿瘤的印记(迹)基因的变化从而判断肿瘤的良恶性及恶性程度，为早期肿瘤患者提供最有利的治疗机会。
根据本发明，步骤(1)所述的待测样本来自于人的组织和/或细胞。
本发明中，所述待测样本只要RNA经过及时固定的处理都是可行的，本领域技术人员可以根据需要进行选择，在此不做特殊限定，本发明所述待测样本包括组织的石蜡切片、内窥镜筛查样本、尿液脱落细胞涂片或膀胱冲洗液细胞涂片中的任意一种或至少两种的组合。
所述组织的石蜡切片具体操作步骤为获取人体肿瘤组织样本，及时用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，切成10μm厚，用带正电荷的玻片制成组织片子；因为只有10μm厚，因此显微镜下看见的有一部分为不完整的细胞核，所以会出现部分假阴性的基因缺失。
所述内窥镜筛查样本具体操作步骤为在膀胱镜下获取可疑组织，石蜡包埋，切成10μm厚，用带正电荷的玻片制成片子。
本发明中，由于膀胱镜活检对病人伤害小，取样过程简单，相较于血液的循环特性，膀胱镜活检还能定位，膀胱镜活检作为实验样本有其特殊的优势。
本发明中，尿液脱落细胞涂片和膀胱冲洗液细胞涂片对病人伤害小，取样过程简单，作为实验样本有其特殊的优势。
优选地，所述印记基因为Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16，所述印记基因Z1为Gnas，所述印记基因Z2为Igf2，所述印记基因Z3为Peg10，所述印记基因Z4为Igf2r，所述印记基因Z5为Mest，所述印记基因Z6为Plagl1，所述印记基因Z8为Dcn，所述印记基因Z9为Dlk1，所述印记基因Z10为Gatm，所述印记基因Z11为Grb10，所述印记基因Z15为Diras3，所述印记基因Z16为Snrpn/Snurf。
本发明中，所述印记基因Z1(Gnas)，Z2(Igf2)，Z3(Peg10)，Z4(Igf2r)，Z5(Mest)，Z6(Plagl1)，Z8(Dcn)，Z9(Dlk1)，Z10(Gatm)，Z11(Grb10)，Z15(Diras3)，Z16(Snrpn/Snurf)在正常肿瘤细胞组织内有不同程度的表达，在发生恶性病变时，表达量和印记状态都会发生明显变化。
本发明中，所述设计探针是根据印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16，即Gnas，Igf2，Peg10，Igf2r，Mest，Plagl1，Dcn，Dlk1，Gatm，Grb10，Diras3和Snrpn/Snurf进行设计的，具体在每个基因的内旋子内选择一段序列作为探针，具体的探针由Advanced Cell Diagnostics公司设计。
优选地，所述原位杂交采用RNAscope原位杂交方法。
优选地，所述RNAscope原位杂交方法使用单通道或多通道的呈色试剂盒或者单通道或多通道的荧光试剂盒，优选为单通道红色/棕色呈色试剂盒或多通道的荧光试剂盒。
本发明中，所述多通道呈色试剂盒或多通道荧光试剂盒包括两通道或两通道以上的呈色试剂盒或荧光试剂盒，所述两通道的呈色试剂盒或多通道的荧光试剂盒可以使用两个印记基因探针或印记基因和其他基因的联合表达甚至多个印记基因和非印记基因的综合表达。
根据本发明，待判断的膀胱肿瘤的良恶性程度分为良性、膀胱癌潜能、早期膀胱癌、中期膀胱癌和晚期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均小于I级和/或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级中的任意一种情况，则为良性肿瘤；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为I级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为II级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级中的任意一种情况，则判断为膀胱癌潜能；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为II级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为III级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级中的任意一种情况，则为早期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为III级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期膀胱癌。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的模型或如第二方面所述的装置用于膀胱肿瘤的检测。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的模型在制备膀胱肿瘤检测和/或治疗的药物中的用途；
第五方面，本发明提供一种如第二方面所述的装置在制备膀胱肿瘤检测和/或治疗的器械中的用途。
根据本发明，待判断的膀胱肿瘤的良恶性程度分为良性、膀胱癌潜能、早期膀胱癌、中期膀胱癌和晚期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均小于I级和/或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级中的任意一种情况，则为良性肿瘤；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为I级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为II级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级中的任意一种情况，则判断为膀胱癌潜能；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为II级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为III级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级中的任意一种情况，则为早期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为III级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期膀胱癌。
与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：
(1)本发明所述检测模型和系统，以直观的方法表现了印记缺失在膀胱肿瘤病人的样本上的表现，通过对印记基因原位标记的方法，客观，直观，早期，精确地检测出印记(迹)基因的变化，并可以提供量化的模型，为膀胱肿瘤的诊断做出巨大贡献；
(2)本发明检测方法装置可以在膀胱肿瘤病人手术前得出膀胱肿瘤良恶性程度的判断，从而为手术及精准治疗提供依据，这是细胞分子领域诊断膀胱肿瘤的革命性突破；
(3)本发明可以精确的判断膀胱肿瘤的类型，通过印记基因的组合检测若极大地提高了对膀胱癌的早期，明确诊断，特别是用在早期普查和癌症术后随访，尤其是对于疑似复发病人的跟踪随访，可以争取时间，为挽救病人生命做出重大贡献；
(4)本发明可以准确地检测膀胱癌手术中癌旁组织的真正良恶性，指导手术范围的选取，减少由于癌组织未彻底切除而导致的复发，为病人的预后和生存期做出积极的贡献；
(5)本发明检测方法区别于免疫组化方法，减少了假阳性和其他负面作用，不仅如此，通过发现的膀胱肿瘤相关印记基因缺失位点的致该基因沉默、剔除、重排的靶向药物或技术方法，可用于指导后期的治疗和用药。
附图说明
图1是本发明苏木素染色细胞核的甲状腺癌的病理切片，其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常；
图2(a)为0级膀胱癌的病理切片中12个印记基因的表达状态，图2(b)为I级膀胱癌的病理切片中12个印记基因的表达状态，图2(c)为II级膀胱癌的病理切片中12个印记基因的表达状态，图2(d)为III级膀胱癌的病理切片中12个印记基因的表达状态，图2(e)为IV级膀胱癌的病理切片中12个印记基因的表达状态；
图3(a)为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4和Z5对膀胱癌的印记缺失的强度，图3(b)为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4和Z5对膀胱癌的拷贝数异常的强度，图3(c)为印记基因Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16对膀胱癌的印记缺失的强度，图3(d)为印记基因Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16对膀胱癌的拷贝数异常的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量；
图4(a)为印记基因Z1印记缺失和拷贝数异常的强度，图4(b)为印记基因Z2印记缺失和拷贝数异常的强度，图4(c)为印记基因Z3印记缺失和拷贝数异常的强度，图4(d)为印记基因Z4印记缺失和拷贝数异常的强度，图4(e)为印记基因Z5印记缺失和拷贝数异常的强度，图4(f)为印记基因Z6印记缺失和拷贝数异常的强度，图4(g)为印记基因Z8印记缺失和拷贝数异常的强度，图4(h)为印记基因Z9印记缺失和拷贝数异常的强度，图4(i)为印记基因Z10印记缺失和拷贝数异常的强度，图4(j)为印记基因Z11印记缺失和拷贝数异常的强度，图4(k)为印记基因Z15印记缺失和拷贝数异常的强度，图4(l)为印记基因Z16印记缺失和拷贝数异常的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量；
图5(a)为印记基因Z1应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图5(b)为印记基因Z2应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图5(c)为印记基因Z3应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图5(d)为印记基因Z4应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图5(e)为印记基因Z5应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图5(f)为印记基因Z6应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图5(g)为印记基因Z8应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图5(h)为印记基因Z9应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图5(i)为印记基因Z10应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图5(j)为印记基因Z11应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图5(k)为印记基因Z15应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图5(l)为印记基因Z16应用于62例膀胱癌病理切片中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量。
具体实施方式
为更进一步阐述本申请所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案，但本申请并非局限在实施例范围内。
实施例1膀胱癌的印记基因分析
本实施例提供一种采用印记基因检测膀胱肿瘤的方法，包括如下步骤：
(1)获取膀胱癌的组织细胞切片(10微米)，放入10％中性福尔马林溶液中进行固定，以防RNA降解，固定时间为24小时，石蜡包埋(FFPE)，所述玻片需要用正电荷脱载玻片，所述切片在40℃烤箱烘烤3h以上；
(2)按照RNASCope的样品处理方法进行脱蜡处理，封闭样本中内源性过氧化物酶活性，增强通透性并暴露出RNA分子；
(3)设计探针：根据印记基因序列设计特异性引物；
所述设计探针是根据印记基因Z1(Gnas)、Z2(Igf2)、Z3(Peg10)、Z4(Igf2r)、Z5(Mest)、Z6(Plagl1)、Z8(Dcn)、Z9(Dlk1)、Z10(Gatm)、Z11(Grb10)、Z15(Diras3)和Z16(Snrpn/Snurf)进行设计的，具体在每个基因的内旋子内选择一段序列作为探针，具体的探针由Advanced Cell Diagnostics公司设计；
(4)将步骤(3)的探针与待测样本通过试剂盒进行RNA SCope原位杂交；
(5)信号扩增和苏木精染色，用显微镜成像分析印记基因的表达情况；
所述模型中的计算印记基因表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
正常印记基因表达量＝b/(b+c+d)×100％；
印记基因缺失基因表达量(LOI)＝c/(b+c+d)×100％；
印记基因拷贝数异常的基因表达量(CNV)＝d/(b+c+d)×100％；
其中，a、b、c、d如图1所示，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核，其结果如图2(a)-图2(e)所示。
从图2(a)-图2(e)可以看出，从0级到IV级的样本中，印记缺失(细胞核内有两个信号点)和拷贝数异常(细胞核内有三个或以上信号点)的细胞比例随恶性程度的增加而逐渐增加。
实施例2膀胱镜活检样本的印记基因分析
在膀胱镜下取出可疑病变组织，10％中性福尔马林溶液固定24h，石蜡包埋(FFPE)，切成10微米厚的切片，其他检测方法同实施例1，结果如图3(a)-图3(d)和图4(a)-图4(j)所示。
从图3(a)-图3(d)可以看出，Z1，Z2，Z3，Z4，Z5，Z6，Z8，Z9，Z10，Z11，Z15，Z16每个基因对膀胱癌的反应敏感性或者说对应于膀胱癌表达的印记缺失的强度和状态是不同的。
具体每个印记基因对膀胱癌的敏感度如图4(a)-图4(l)：
从图4(a)可以看出，印记基因Z1的印记缺失在恶性潜能阶段开始出现，随膀胱癌的发展而逐渐增加到很高的水平，印记基因Z1的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，在早期膀胱癌中迅速上升，随膀胱癌的发展继续增加到很高的水平；
从图4(b)可以看出，印记基因Z2的印记缺失和拷贝数异常在恶性潜能阶段即达到很高的水平，在早期到晚期膀胱癌中维持很高的敏感度；
从图4(c)可以看出，印记基因Z3的印记缺失和拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，随膀胱癌的发展而逐渐增加到很高的水平；
从图4(d)可以看出，印记基因Z4的印记缺失在恶性潜能阶段明显上升，在早期膀胱癌中继续上升到很高的水平，并在中晚期膀胱癌中维持稳定，印记基因Z4的拷贝数异常在恶性潜能阶段明显上升，在早期到晚期膀胱癌中逐渐上升到很高的水平；
从图4(e)可以看出，印记基因Z5的印记缺失在恶性潜能和早期膀胱癌阶段迅速上升，在中期到晚期膀胱癌中维持稳定，印记基因Z5的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，随膀胱癌的进展而逐渐上升到较高的水平；
从图4(f)可以看出，印记基因Z6的印记缺失和拷贝数异常在早期膀胱癌中快速上升到较高水平，在中期到晚期膀胱癌中维持稳定；
从图4(g)可以看出，印记基因Z8的印记缺失和拷贝数异常在早期膀胱癌阶段开始出现，但是在中期到晚期膀胱癌阶段不再继续上升；
从图4(h)可以看出，印记基因Z9的印记缺失在早期膀胱癌阶段迅速上升，但是在中期到晚期膀胱癌阶段维持稳定，印记基因Z9的拷贝数异常在恶性潜能和早期膀胱癌阶段逐渐上升，但是在中期到晚期膀胱癌阶段维持稳定；
从图4(i)可以看出，印记基因Z10的印记缺失和拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，随膀胱癌的进展逐渐上升，到晚期膀胱癌阶段达到较高的水平；
从图4(j)可以看出，印记基因Z11的印记缺失在早期膀胱癌阶段开始出现，在中晚期膀胱癌中维持稳定，印记基因Z11的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，在早期膀胱癌阶段继续上升，在中晚期膀胱癌中维持稳定；
从图4(k)可以看出，印记基因Z15的印记缺失在早期膀胱癌阶段开始出现，在中晚期膀胱癌中维持稳定，印记基因Z15的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，在早期膀胱癌阶段继续上升，在中晚期膀胱癌中维持稳定；
从图4(l)可以看出，印记基因Z16的印记缺失在早期膀胱癌中明显上升，到晚期膀胱癌阶段逐渐上升到较高的水平，印记基因Z16的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，随膀胱癌的进展逐渐上升到较高的水平。
实施例3 62例膀胱肿瘤样本的印记基因分析
获取62例膀胱癌病人的组织包括膀胱镜活检样本(10微米)，其他检测方法同实施例1，检测结果如图5(a)-图5(l)所示。
从图5(a)-图5(l)可以看出，62例膀胱肿瘤组织样本中10个探针的印记缺失和拷贝数异常的比例呈现从低到高的分布，根据不同探针的分布趋势，我们计算得到了图中虚线所示的分级标准，可以将每个探针的印记缺失和拷贝数异常分别从低到高分成5个等级。
从图5(a)可以看出，对于所述印记基因Z1，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.5％为I级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.5-3.2％为II级，印记基因缺失表达量为25-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为3.2-5％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于5％为IV级；
从图5(b)可以看出，对于所述印记基因Z2，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.5％为I级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.5-3.2％为II级，印记基因缺失表达量为25-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为3.2-5％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于5％为IV级；
从图5(c)可以看出，对于所述印记基因Z3，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.5％为I级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.5-3.2％为II级，印记基因缺失表达量为25-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为3.2-5％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于5％为IV级；
从图5(d)可以看出，对于所述印记基因Z4，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.5％为I级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.5-3.2％为II级，印记基因缺失表达量为25-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为3.2-5％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于5％为IV级；
从图5(e)可以看出，对于所述印记基因Z5，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-15％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％为I级，印记基因缺失表达量为15-21％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％为II级，印记基因缺失表达量为21-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于4％为IV级；
从图5(f)可以看出，对于所述印记基因Z6，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-15％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％为I级，印记基因缺失表达量为15-21％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％为II级，印记基因缺失表达量为21-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于4％为IV级；
从图5(g)可以看出，对于所述印记基因Z8，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-15％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％为I级，印记基因缺失表达量为15-21％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％为II级，印记基因缺失表达量为21-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于4％为IV级；
从图5(h)可以看出，对于所述印记基因Z9，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-15％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％为I级，印记基因缺失表达量为15-21％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％为II级，印记基因缺失表达量为21-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于4％为IV级；
从图5(i)可以看出，对于所述印记基因Z10，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-15％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％为I级，印记基因缺失表达量为15-21％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％为II级，印记基因缺失表达量为21-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于4％为IV级；
从图5(j)可以看出，对于所述印记基因Z11，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-15％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％为I级，印记基因缺失表达量为15-21％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％为II级，印记基因缺失表达量为21-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于4％为IV级；
从图5(k)可以看出，对于所述印记基因Z15，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-15％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％为I级，印记基因缺失表达量为15-21％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％为II级，印记基因缺失表达量为21-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于4％为IV级；
从图5(l)可以看出，对于所述印记基因Z16，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％为0级，印记基因缺失表达量为10-15％和/或印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％为I级，印记基因缺失表达量为15-21％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％为II级，印记基因缺失表达量为21-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于4％为IV级。
从这62个膀胱癌肿瘤的样本综合分析可以得出：
所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度分为良性肿瘤、膀胱癌潜能、早期膀胱癌、中期膀胱癌和晚期膀胱癌：
所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均小于I级和/或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级中的任意一种情况，则为良性肿瘤；
所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为I级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为II级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级中的任意一种情况，则判断为膀胱癌潜能；
所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为II级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为III级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级中的任意一种情况，则为早期膀胱癌；
所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为III级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期膀胱癌；
所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期膀胱癌。
综上所述，本申请所述检测模型和装置，以直观的方法表现了印记缺失在肿瘤病人的样本上的表现，通过对印记基因原位标记的方法，客观，直观，早期，精确地检测出印记(迹)基因的变化，并可以提供量化的模型，为膀胱肿瘤的诊断做出巨大贡献。
申请人声明，本申请通过上述实施例来说明本申请的详细方法，但本申请并不局限于上述详细方法，即不意味着本申请必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本申请的任何改进，对本申请产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本申请的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于膀胱肿瘤的印记基因分级模型，其特征在于，其通过计算印记基因总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量在膀胱肿瘤中的变化对印记基因的表达状态进行分级；
其中，所述印记基因为Z1、Z2、Z3、Z4或Z5中的任意一个或至少两个的组合，所述印记基因Z1为Gnas，所述印记基因Z2为Igf2，所述印记基因Z3为Peg10，所述印记基因Z4为Igf2r，所述印记基因Z5为Mest。
2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于，所述模型计算印记基因的方法如下：
计算Z1、Z2、Z3、Z4或Z5中的任意一个印记基因，优选为计算Z1、Z2、Z4或Z5中的任意一个印记基因，进一步优选为计算Z2或Z4；
优选地，所述模型计算印记基因的方法为：计算Z1、Z2、Z3、Z4或Z5中的任意两个印记基因的组合，优选为计算Z1和Z2印记基因的组合或Z2和Z4印记基因的组合。
3.根据权利要求1或2所述的模型，其中，所述印记基因还包括Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15或Z16中的任意一个或至少两个的组合；其中，所述印记基因Z6为Plagl1，所述印记基因Z8为Dcn，所述印记基因Z9为Dlk1，所述印记基因Z10为Gatm，所述印记基因Z11为Grb10，所述印记基因Z15为Diras3，所述印记基因Z16为Snrpn/Snurf；
优选地，所述模型计算印记基因的方法为：计算印记基因的组合，所述印记基因为Z1-Z6、Z8-Z11、Z15-Z16的十二个印记基因的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的模型，其特征在于，所述计算印记基因表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
正常印记基因表达量＝b/(b+c+d)×100％；
印记基因缺失表达量＝c/(b+c+d)×100％；
印记基因拷贝数异常表达量＝d/(b+c+d)×100％；
其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的模型，其特征在于，所述印记基因缺失基因表达量、印记基因拷贝数异常基因表达量和总表达量分成五个不同的等级；
优选地，所述五个不同的等级为针对Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的十二个印记基因的印记基因缺失基因表达量、印记基因拷贝数异常基因表达量和总表达量分别进行划分的五个不同的等级；
优选地，所述针对Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量小于10％和/或所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％；
I级：所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量为10-20％和/或所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.5％；
II级：所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量为20-25％和/或所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因拷贝数异常表达量为1.5-3.2％；
III级：所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量为25-30％和/或所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因拷贝数异常表达量为3.2-5％；
IV级：所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因缺失表达量大于30％和/或所述印记基因Z1、Z2、Z3和Z4的印记基因拷贝数异常表达量大于5％；
优选地，所述针对Z5和Z6的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z5和Z6的印记基因缺失表达量小于10％和/或所述印记基因Z5和Z6的印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％；
I级：所述印记基因Z5和Z6的印记基因缺失表达量为10-15％和/或所述印记基因Z5和Z6的印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％；
II级：所述印记基因Z5和Z6的印记基因缺失表达量为15-21％和/或所述印记基因Z5和Z6的印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％；
III级：所述印记基因Z5和Z6的印记基因缺失表达量为21-30％和/或所述印记基因Z5和Z6的印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％；
IV级：所述印记基因Z5和Z6的印记基因缺失表达量大于30％和/或所述印记基因Z5和Z6的印记基因拷贝数异常表达量大于4％；
优选地，所述针对Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量小于10％和/或所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％；
I级：所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量为10-15％和/或所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1.3％；
II级：所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量为15-21％和/或所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为1.3-2.5％；
III级：所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量为21-25％和/或所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为2.5-4％；
IV级：所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量大于25％和/或所述印记基因Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于4％。
6.一种检测膀胱肿瘤良恶性程度的装置，其采用如权利要求1-6中任一项所述的模型，包括如下单元：
(1)取样单元：获取待测样本；
(2)探针设计单元：根据印记基因序列设计特异性引物；
(3)检测单元：将步骤(2)的探针与待测样本进行原位杂交；
(4)分析单元：显微镜成像分析印记基因的表达状态；
其中，所述分析单元通过计算印记基因总表达量、印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常基因表达量，通过权利要求1-5中任一项所述的模型，从而通过印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常基因表达量的等级来判断膀胱肿瘤的良恶性程度。
7.根据权利要求6所述的装置，其中，步骤(1)所述的待测样本来自于人的组织和/或细胞；
优选地，所述待测样本为内窥镜筛查样本、尿液脱落细胞涂片或膀胱冲洗液细胞涂片中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述原位杂交采用RNAscope原位杂交方法；
优选地，所述RNAscope原位杂交方法使用单通道或多通道的呈色试剂盒或者单通道或多通道的荧光试剂盒，优选为单通道红色/棕色呈色试剂盒或多通道的荧光试剂盒。
8.根据权利要求8-11中任一项所述的装置，其中，待判断的膀胱肿瘤的良恶性程度分为良性、膀胱癌潜能、早期膀胱癌、中期膀胱癌和晚期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均小于I级和/或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级中的任意一种情况，则为良性肿瘤；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为I级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为II级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级中的任意一种情况，则判断为膀胱癌潜能；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为II级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为III级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级中的任意一种情况，则为早期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为III级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期膀胱癌。
9.一种如权利要求1-5中任一项所述的模型在制备膀胱肿瘤检测和/或治疗的药物中的用途；
优选地，一种如权利要求6-8中任一项所述的装置在制备膀胱肿瘤检测和/或治疗的器械中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，待判断的膀胱肿瘤的良恶性程度分为良性、膀胱癌潜能、早期膀胱癌、中期膀胱癌和晚期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均小于I级和/或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级中的任意一种情况，则为良性肿瘤；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为I级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为II级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级中的任意一种情况，则判断为膀胱癌潜能；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为II级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为III级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级中的任意一种情况，则为早期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为III级，印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级且印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期膀胱癌；
优选地，所述判断膀胱肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级或印记基因Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z15和Z16中至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期膀胱癌。
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