CN112313345B - 一种通过活检细胞样本诊断癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种通过活检样本检测癌症的方法，其通过计算印记基因缺失基因表达量、印记基因拷贝数异常基因表达量和总表达量在肿瘤中的变化对印记基因的表达状态进行分级；其中，所述印记基因为Z1和/或Z16，所述印记基因Z1为Gnas，所述印记基因Z16为Snrpn/Snurf。本申请的方法检测了活检样本上的印记缺失，提供了量化模型，用于癌的早期诊断或筛查。

Description

一种通过活检细胞样本诊断癌症的方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，涉及基因诊断领域，具体涉及一种通过活检细胞样本诊断癌症的方法。
背景技术
癌症是威胁人类健康的主要疾病之一，每年全球新增约1400万癌症患者，820万患者死于癌症，并且这两个数字还在逐年增长。癌症有一个逐渐发展的过程，早期癌症的恶性程度较低，如果能够得到及时的手术治疗，通常能够达到较高的5年生存率。而晚期癌症恶性程度较高，容易发生转移，无法进行手术治疗，放疗和化疗也难以得到较好的疗效，因此5年生存率非常低。癌症治疗的关键在于早期发现，但是很多癌症在早期通常没有任何症状，或者症状不典型，容易造成漏诊和误诊。超声和CT等影像学技术能够在较早期发现实体肿瘤，但难以对肿瘤的良恶性进行判断，因此需要对可疑部位取样进行活检。目前常用的活检取样方式主要有细针穿刺，粗针穿刺，内镜引导下的组织活检，以及支气管、食道、口腔、子宫颈等部位的刷细胞检查。
细针穿刺(FNA)是一种用于检测硬块和肿块的取样方法，通过空心针对体表可触及的较大肿块进行直接穿刺，或者在超声和CT的引导下对位置较深或体积较小的肿块进行穿刺取样。细针穿刺广泛应用于甲状腺、乳腺、淋巴结、腮腺、胰腺、肝脏、肺、前列腺、卵巢等部位的肿瘤取样。传统病理学对细胞的良恶性诊断是基于细胞的大小，形态，侵润性和周边细胞组织的关系来作出判断的。由于细针穿刺所获得的样本量较少，难以反映组织学形态，同时早期癌症的细胞异型性程度也较低，因此穿刺细胞学病理诊断通常难以达到较高的准确率，而且对病理医生的经验依赖性非常高，有些癌症甚至到中晚期都无法确诊。
粗针穿刺与细针穿刺的取样方法较为类似，区别在于粗针穿刺使用较粗的针，因此可以获得较大的组织条，可以提供一定的组织学信息。但是由于取样量相对于整个肿瘤来说仍然很小，一些组织学特征，尤其是癌细胞对周围组织的侵犯关系较难判断，因此仍有一定的局限性。
内镜引导下的组织活检是在胃镜、肠镜、膀胱镜、宫腔镜、耳鼻咽喉镜等内镜引导下对可疑病变组织进行取样的方法，常用于食道癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、鼻咽癌的诊断。组织活检获得的样本量较多，但仍有一部分早期癌症患者的病例由于组织异型性较低而无法明确诊断。
刷细胞检查通常使用毛刷在支气管、口腔、食道、子宫颈获取细胞进行检查。使用这种方法获取的样本量也较少，难以反映组织学形态，因此病理学诊断准确率也较低。尿液脱落细胞检测是诊断泌尿系统癌症的常规检查项目，但主要是根据细胞的形态来进行判断，准确率较低，仍然要依靠膀胱镜和活检进行确诊，给患者带来较大的痛苦。
为了避免传统病理学在对早期癌症诊断中的局限性，人们开发了多种在细胞分子水平检测肿瘤的生物标志物，如用于甲状腺乳头状癌的BRAF，用于乳腺癌的BRAC，用于肺癌的CEA，用于前列腺癌的PSA等。但是目前已有的肿瘤标志物还存在一些不足，如BRAF的突变仅能用于甲状腺乳头状癌的检测，无法检测滤泡性肿瘤；PSA的灵敏度很高，但是特异性较低，造成较高的假阳性。目前也有一些在尿液中进行肿瘤抗原检测和原位杂交的检测技术，但是灵敏度和特异性都不太理想。
从癌症的发展过程分析，分子层面的改变(表观遗传学和基因学)远早于细胞形态和组织结构的变异，所以分子生物学检测对癌症早期的检测更敏感。基因组印记是表观遗传学中基因调控的一种方式。其特点是，通过甲基化来自特定亲代的等位基因，使某个基因只有一个等位基因表达，而另一个则陷入基因沉默状态。该种类的基因，被称为印迹(记)基因。印迹缺失是印迹基因去甲基化导致沉默状态的等位基因被激活并且开始基因表达的一种表观遗传改变。大量研究表明，该现象(印迹缺失)普遍存在于各类癌症并且发生时间早于细胞和组织形态改变。与此同时，在健康细胞中，印迹缺失比例极低，与癌细胞成鲜明对比。所以，印迹基因的甲基化状态可以作为病理标记，通过特定分子检测技术，对细胞异常状态进行分析。如图1所示，印迹基因原位检测敏感而有效地补足了形态病理的不足，使得形态病理的不确定区不再存在。
基于以上原因，印迹基因检测对组织形态没有要求，使用的样本量也较少，是一种非常适用于活检样本的癌症检测方法。通过印迹基因检测技术对甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌、口腔癌、卵巢癌、子宫内膜、宫颈癌、中枢神经系统肿瘤、腮腺恶性肿瘤、恶性淋巴瘤、白血病等癌症进行检测，可以提供更精确的预诊和诊断信息，彻底避免由于细胞或组织异型性不够明显而造成无法诊断的问题，极大提高癌症的早期诊断率，对提高患者生活质量、延长生存期具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本申请提供了一种通过活检细胞样本诊断癌症的方法，该检测方法可以通过活检细胞水平下早期直观地观察癌的印记(迹)基因的变化从而判断癌的良恶性及恶性程度。
为达到上述目的，本申请采用以下技术方案：
第一方面，本申请提供了一种通过活检样本检测癌症的方法，其通过计算印记基因缺失基因表达量(LOI)、印记基因拷贝数异常基因表达量(CNV)和总表达量(TE)在肿瘤中的变化对印记基因的表达状态进行分级；
其中，所述印记基因为Z1和/或Z16，所述印记基因Z1为Gnas，所述印记基因Z16为Snrpn/Snurf。
本申请中，发明人发现通过计算印记基因Z1的LOI、CNV和TE，对于甲状腺癌的诊断敏感度可以达到99.2％，对乳腺癌的敏感度可以达到99.8％，对胰腺癌的敏感度可以达到90.0％，对肺癌的敏感度可以达到99.8％，对泌尿系统癌症的敏感度可以达到89.0％。
此外，发明人发现通过计算印记基因Z16的LOI、CNV和TE，对于甲状腺癌的诊断敏感度可以达到99.8％，对乳腺癌的敏感度可以达到91.7％，对胰腺癌的敏感度可以达到90.0％，对肺癌的敏感度可以达到90.0％，对泌尿系统癌症的敏感度可以达到89.0％。
根据本申请，发明人发现通过计算Z1和Z16两个印记基因的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量可以进一步提高敏感度，使用Z1和Z16的组合，对甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、泌尿系统癌症的诊断敏感度可以达到99.9％以上。
在一些实施方式中，所述印记基因还包括Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14或Z15中的任意一个或至少两个的组合；其中，所述印记基因Z2为Igf2，印记基因Z3为Peg10，所述印记基因在Z4为Igf2r，所述印记基因Z5为Mest，所述印记基因Z6为Plagl1，所述印记基因Z7为Cdkn1c，所述印记基因Z8为Dcn，所述印记基因Z9为Dlk1，所述印记基因Z10为Gatm，所述印记基因Z11为Grb10，所述印记基因Z12为Peg3，所述印记基因Z13为Sgce，所述印记基因Z14为Slc38a4，所述印记基因Z15为Diras3。
在本申请中，发明人发现在使用Z1、Z16基因检测的基础上再增加Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14或Z15基因进行联合诊断，有助于增加检测的准确度，发明人发现印记基因Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14或Z15由于检测肿瘤的不同，其敏感度不同，可以在用于和别的印记基因组合辅助确诊癌症的良恶性程度，采用Z1-Z16这16个印记基因进行组合，可以完全实现肿瘤的精确诊断。
在一些实施方式中，所述计算印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常基因表达量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
正常印记基因表达量＝b/(b+c+d)×100％；
印记基因缺失基因表达量＝c/(b+c+d)×100％；
印记基因拷贝数异常的基因表达量＝d/(b+c+d)×100％；
其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核。
本申请中，所述印记基因缺失为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，所述印记基因拷贝数异常为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，所述拷贝数异常是由于癌细胞异常地进行基因复制，导致这个基因表达时呈现为三倍体甚至更高的多倍体的情况。
本申请中，所述苏木素染色后的标记选自但不限于红色或棕色，用其他颜色进行染色标记也可用于印迹基因表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的计算。
本申请中，所述印记基因与印迹基因同时一个概念，表示同一个意思，可以进行替换。
在一些实施方式中，所述印记基因缺失基因表达量、印记基因拷贝数异常基因表达量和总表达量分成五个不同的等级。
在一些实施方式中，所述五个不同的等级为针对Z1-Z16的十六个印记基因的印记基因缺失基因表达量、印记基因拷贝数异常基因表达量和总表达量分别进行划分的五个不同的等级。
在一些实施方式中，所述针对Z1和Z16的印记基因缺失基因表达量、印记基因拷贝数异常基因表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量小于2％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量小于25％中的任意一种或至少两种的组合；
I级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为2-4％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为25-30％中的任意一种或至少两种的组合；
II级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为20-25％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为4-8％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为30-40％中的任意一种或至少两种的组合；
III级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为25-35％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为8-12％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为40-50％中的任意一种或至少两种的组合；
IV级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量大于35％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于12％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量大于50％中的任意一种或至少两种的组合。
本申请中，所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量是相互独立的。
本申请中，针对不同的肿瘤各个印记基因的敏感性不同，不同肿瘤的各个指标会有上下20％的浮动。
在一些实施方式中，所述肿瘤包括甲状腺肿瘤、乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、肝脏肿瘤、结直肠肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤、食道肿瘤、鼻咽部肿瘤、口腔肿瘤、卵巢肿瘤、子宫内膜肿瘤、子宫颈肿瘤、泌尿系统肿瘤、中枢神经系统肿瘤、腮腺肿瘤、淋巴瘤或白血病中的任意一种或至少两种的组合。
在一些实施方式中，对于甲状腺肿瘤，印记基因Z1的缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z1的印记基因拷贝数异常表达量小于1.5％或所述印记基因Z1的总表达量小于40％；
I级：所述印记基因Z1的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z1的印记基因拷贝数异常表达量为1.5-4％或所述印记基因Z1的总表达量为40-45％；
II级：所述印记基因Z1的印记基因缺失表达量为20-30％、所述印记基因Z1的印记基因拷贝数异常表达量为4-8％或所述印记基因Z1的总表达量为45-60％；
III级：所述印记基因Z1的印记基因缺失表达量为30-40％、所述印记基因Z1的印记基因拷贝数异常表达量为8-15％或所述印记基因Z1的总表达量为60-65％；
IV级：所述印记基因Z1的印记基因缺失表达量大于40％、所述印记基因Z1的印记基因拷贝数异常表达量大于15％或所述印记基因Z1的总表达量大于65％；
对于甲状腺肿瘤，印记基因Z16缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z16的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z16的印记基因拷贝数异常表达量小于1.5％或所述印记基因Z16的总表达量小于30％；
I级：所述印记基因Z16的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z16的印记基因拷贝数异常表达量为1.5-4％或所述印记基因Z16的总表达量为30-35％；
II级：所述印记基因Z16的印记基因缺失表达量为20-30％、所述印记基因Z16的印记基因拷贝数异常表达量为4-8％或所述印记基因Z16的总表达量为35-50％；
III级：所述印记基因Z16的印记基因缺失表达量为30-40％、所述印记基因Z16的印记基因拷贝数异常表达量为8-15％或所述印记基因Z16的总表达量为50-55％；
IV级：所述印记基因Z16的印记基因缺失表达量大于40％、所述印记基因Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于15％或所述印记基因Z16的总表达量大于55％。
在一些实施方式中，发明人发现印记基因Z3、Z11、Z13与Z1、Z16的联合诊断可以提高对甲状腺癌的诊断敏感度，Z1和Z3联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z1和Z11联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z1和Z13联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z11和Z16联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z13和Z16联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上。
对于乳腺肿瘤，印记基因Z1和Z16的缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量小于1％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量小于25％；
I级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为1-3％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为25-30％；
II级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为20-25％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为3-7％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为30-40％；
III级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为25-30％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为7-10％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为40-50％；
IV级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量大于30％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于10％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量大于50％。
本申请中，所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量是相互独立的。
在一些实施方式中，发明人发现印记基因Z8、Z10、Z11、Z13、Z16与Z1的联合诊断可以提高对乳腺癌的诊断敏感度，Z1和Z8联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z1和Z10联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z1和Z11联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z1和Z13联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z1和Z16联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上。
对于胰腺肿瘤，印记基因Z1和Z16的缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量小于2％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量小于20％；
I级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为2-4％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为20-30％；
II级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为20-25％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为4-8％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为30-40％；
III级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为25-30％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为8-12％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为40-50％；
IV级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量大于30％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于12％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量大于50％。
本申请中，所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量是相互独立的。
在一些实施方式中，发明人发现印记基因Z5、Z10、Z11与Z1、Z16的联合诊断可以提高对胰腺癌的诊断敏感度，Z1和Z5联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z1和Z10联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z1和Z16联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z10和Z16联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上，Z11和Z16联合诊断的敏感度可以提高到99.9％以上。
对于肺肿瘤，印记基因Z1的缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z1的印记基因拷贝数异常表达量小于2％或所述印记基因Z1的总表达量小于30％；
I级：所述印记基因Z1的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z1的印记基因拷贝数异常表达量为2-4％或所述印记基因Z1的总表达量为30-40％；
II级：所述印记基因Z1的印记基因缺失表达量为20-25％、所述印记基因Z1的印记基因拷贝数异常表达量为4-8％或所述印记基因Z1的总表达量为40-50％；
III级：所述印记基因Z1的印记基因缺失表达量为25-30％、所述印记基因Z1的印记基因拷贝数异常表达量为8-12％或所述印记基因Z1的总表达量为50-60％；
IV级：所述印记基因Z1的印记基因缺失表达量大于30％、所述印记基因Z1的印记基因拷贝数异常表达量大于12％或所述印记基因Z1的总表达量大于60％；
对于肺肿瘤，印记基因Z16的缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z16的印记基因缺失表达量小于10％、所述印记基因Z16的印记基因拷贝数异常表达量小于1％、所述印记基因Z16的总表达量小于25％；
I级：所述印记基因Z16的印记基因缺失表达量为10-15％、所述印记基因Z16的印记基因拷贝数异常表达量为1-2％或所述印记基因Z16的总表达量为25-30％；
II级：所述印记基因Z16的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z16的印记基因拷贝数异常表达量为2-5％或所述印记基因Z16的总表达量为30-40％；
III级：所述印记基因Z16的印记基因缺失表达量为20-25％、所述印记基因Z16的印记基因拷贝数异常表达量为5-8％或所述印记基因Z16的总表达量为40-50％；
IV级：所述印记基因Z16的印记基因缺失表达量大于25％、所述印记基因Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于8％或所述印记基因Z16的总表达量大于50％。
在一些实施方式中，发明人发现印记基因Z3、Z8、Z11与Z1、Z16的联合诊断可以提高对肺癌的诊断敏感度，Z1和Z3联合诊断的敏感度可以达到99.9％以上，Z1和Z8联合诊断的敏感度可以达到99.9％以上，Z1和Z11联合诊断的敏感度可以达到99.9％以上，Z1和Z16联合诊断的敏感度可以达到99.9％以上，Z3和Z16联合诊断的敏感度可以达到99.9％以上。
对于泌尿系统肿瘤，印记基因Z1和Z16的缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量小于17％和/或所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量小于2％；
I级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为17-20％和/或所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为2-3％；
II级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为20-25％和/或所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为3-7％；
III级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为25-30％和/或所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为7-12％；
IV级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量大于30％和/或所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于12％。
本申请中，所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量是相互独立的。
在一些实施方式中，发明人发现印记基因Z2、Z3、Z4与Z1、Z16的联合诊断可以提高对泌尿系统癌症的诊断敏感度，Z1和Z3联合诊断的敏感度可以达到94.3％以上，Z1和Z4联合诊断的敏感度可以达到94.3％以上，Z1和Z16联合诊断的敏感度可以达到99.9％以上，Z2和Z16联合诊断的敏感度可以达到99.9％以上，Z3和Z16联合诊断的敏感度可以达到99.9％以上。
根据本申请，所述诊断癌症的方法包括如下步骤：
(1)获取待测样本；
(2)根据印记基因序列设计特异性引物；
(3)将步骤(2)的探针与待测样本进行原位杂交；
(4)显微镜成像分析印记基因的表达状态；
其中，所述分析单元通过计算印记基因缺失基因表达量、印记基因拷贝数异常基因表达量和印记基因总表达量，从而通过印记基因缺失基因表达量、印记基因拷贝数异常基因表达量和印记基因总表达量的等级来判断肿瘤的良恶性程度。
根据本申请，步骤(1)所述的待测样本为人的组织和/或细胞。
在一些实施方式中，所述待测样本包括穿刺活检细胞样本、活检细胞样本、脱落细胞样本、血液样本或刷检样本中的任意一种或至少两种的组合。
本申请中，所述活检样本的具体取样操作步骤为通过穿刺、取样钳、毛刷获取人体肿瘤组织细胞样本，或在尿液、痰液、粪便和胸腹腔积液中获取脱落细胞，及时用10％中性福尔马林或其他固定方法固定后粘附到玻片上。由于活检对病人伤害小，尿液、痰液和粪便的获得完全无创，取样过程简单，相较于血液的循环特性，活检样本还能定位，作为实验样本有其特殊的优势。所述血液样本的具体取样操作步骤为获取外周血后用红细胞裂解液去除红细胞，然后及时用10％中性福尔马林或其他固定方法固定后粘附到玻片上。
在一些实施方式中，所述穿刺活检细胞样本包括细针和/或粗针穿刺活检细胞样本，优选为甲状腺、乳腺、胰腺、肺、肝脏、前列腺、卵巢、淋巴结或腮腺的细针和/或粗针穿刺活检细胞样本中的任意一种或至少两种的组合。
在一些实施方式中，所述活检细胞样本包括胃镜、肠镜、膀胱镜、宫腔镜或耳鼻咽喉镜活检细胞样本中的任意一种或至少两种的组合。
在一些实施方式中，所述脱落细胞样本包括尿液、痰液、粪便或胸腹腔积液脱落细胞样本中的任意一种或至少两种的组合。
在一些实施方式中，所述刷检样本包括支气管、食道、口腔或子宫颈的刷检样本中的任意一种或至少两种的组合。
在一些实施方式中，所述原位杂交采用RNAscope原位杂交方法，所述RNAscope原位杂交方法使用单通道或多通道的呈色试剂盒或者单通道或多通道的荧光试剂盒，优选为单通道红色/棕色呈色试剂盒或多通道的荧光试剂盒；
本申请中，发明人通过在至少100个表达印记基因的细胞中计算LOI、CNV和TE，从而通过LOI、CNV和TE的等级来判断肿瘤的良恶性程度，待判断的肿瘤的良恶性程度分为良性、癌潜能、早期癌、中期癌和晚期癌。
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16的印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常基因表达量均小于I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级或印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的拷贝数表达量为I级中的任意一种情况则为良性肿瘤；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因缺失基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为I级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为II级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到II级中的任意一种情况，则为癌潜能；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失基因表达量为II级和/或印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级，印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为II级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为II级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为III级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到III级中的任意一种情况，则为早期癌；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为III级、印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为III级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量IV级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期癌；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为IV级和/或印记基因Z1和Z16的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期癌。
第二方面，本申请提供一种如第一方面所述的方法用于肿瘤检测和/或治疗中的用途。
与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：
(1)本申请所述方法以直观的方法表现了印记缺失在甲状腺、乳腺、胰腺、前列腺、淋巴结穿刺细胞样本，肺支气管毛刷细胞样本，尿液、痰液、粪便、胸水细胞样本和肠镜、膀胱镜活检细胞样本上的表现，通过对印记基因原位标记的方法，客观，直观，早期，精确地检测出印记(迹)基因的变化，并可以提供量化的模型，为甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、泌尿系统癌症的早期诊断做出巨大贡献；
(2)本申请方法可以提供定量的检测结果，精确的判断肿瘤的类型，对肿瘤的恶性程度进行明确地分级，解决了传统细胞和组织病理学对部分病例无法明确诊断的问题，填补了目前组织细胞形态学诊断的局限性，为后期的靶向性治疗提供帮助；
(3)本申请可以从分子层面精确地区分甲状腺嗜酸细胞肿瘤(HCT)的良恶性，为目前组织细胞形态学难以区分甲状腺嗜酸细胞肿瘤良恶性的问题提供了解决方案，对于滤泡性甲状腺瘤(FTA)和癌(FTC)的区分，也是形态学诊断的难点，本申请的方法可以在细胞层面进行区分；
(4)本申请可以与免疫组化方法同时检测，对胰腺肿瘤的良恶性进行准确的早期诊断，减少了假阴性和其他负面作用；
(5)对于乳腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤等可以通过淋巴道进行转移的肿瘤，本发明不但可以在早期通过穿刺细胞学进行良恶性判断，还可以对肿瘤位置附近的淋巴结进行穿刺，检测癌细胞是否通过淋巴道发生转移；
(6)本申请可以对黑痣和皮肤黑色素瘤以及其他皮肤病进行明确区分，特别是早期原位状态下的黑色素瘤鉴别诊断，解决形态学诊断难以区分的难题；
(7)本申请可以对乳腺的原位导管腺癌进行早期诊断，和乳腺良性病变进行准确区分；
(8)本申请可以准确诊断结肠息肉的早期恶性潜能及恶性表现状态，解决肠癌的早期诊断问题；
(9)本申请可以对胃炎、胃溃疡和早期胃癌进行明确区分，解决胃癌的早期诊断问题；
(10)本申请不依赖于组织形态，对于前列腺癌、卵巢癌、中枢神经系统肿瘤、腮腺恶性肿瘤、恶性淋巴瘤的穿刺活检样本，胃癌、食道癌、鼻咽癌、子宫内膜癌的内镜活检样本，肺癌、口腔癌、食道癌、宫颈癌的刷检样本、白血病的血液样本也可以使用本发明的技术进行肿瘤良恶性的诊断
(11)本发明可以用一滴外周血诊断白血病，解决了目前需要进行骨髓穿刺创伤较大的问题；
(12)本申请可以通过尿液、痰液、粪便中脱落的细胞对泌尿系统癌症、肺癌和肠癌进行早期筛查，样本收集方法简单，不需要专业人员操作，可由患者在家中自行收集，适用于大规模体检普查，以及泌尿系统癌症术后和药物疗效监测，特别是尿路脱落细胞术前和术后的检测，可以解决患者术后复发早期检测、及时治疗的问题；
(13)在外科手术中癌旁组织的真正良恶性判断是病人预后及生存期的重要因素，本申请的方法可以作为至关重要的指导；
(14)本申请检测方法中发现的疾病相关基因印记缺失位点的致该基因沉默、剔除、重排的靶向药物或技术方法，可用于指导后期的治疗和用药。
附图说明
图1是本发明所述的印记基因原位检测方法与传统形态学诊断的差异；
图2是本发明苏木素染色细胞核的甲状腺癌穿刺细胞压片，其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核；
图3为本申请实施例的16个基因中的9个基因在甲状腺肿瘤不同恶性程度的穿刺细胞压片中的表达状态，其中，图3(a)为0级甲状腺肿瘤的穿刺细胞压片中9个基因的表达状态，图3(b)为I级甲状腺癌的穿刺细胞压片中9个基因的表达状态，图3(c)为II级甲状腺癌的穿刺细胞压片中9个基因的表达状态，图3(d)为III级甲状腺癌的穿刺细胞压片中9个基因的表达状态，图3(e)为IV级甲状腺癌的穿刺细胞压片中9个基因的表达状态；
图4为Z1和Z16基因应用于177例甲状腺肿瘤穿刺细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，其中，图4(a)为印记基因Z1应用于177例甲状腺肿瘤穿刺细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，图4(b)为印记基因Z16应用于177例甲状腺肿瘤穿刺细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准；
图5(a)为Z1、Z4、Z11、Z13、Z16对甲状腺癌的印记缺失的强度，图5(b)为Z1、Z4、Z11、Z13、Z16对甲状腺癌的拷贝数异常的强度，图5(c)为Z1、Z4、Z11、Z13、Z16对甲状腺癌的总表达量的强度，图5(d)为Z2、Z3、Z5、Z6对甲状腺癌的印记缺失的强度，图5(e)为Z2、Z3、Z5、Z6对甲状腺癌的拷贝数异常的强度，图5(f)为Z2、Z3、Z5、Z6对甲状腺癌的总表达量的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量，TE为印记基因的总表达量；
图6(a)为印记基因Z1印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图6(b)为印记基因Z16印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图6(c)为印记基因Z4印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图6(d)为印记基因Z11印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图6(e)为印记基因Z13印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图6(f)为印记基因Z2印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图6(g)为印记基因Z3印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图6(h)为印记基因Z5印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图6(i)为印记基因Z6印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量，TE为印记基因的总表达量；
图7为Z1和Z16基因应用于18例乳腺肿瘤穿刺细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，其中，图7(a)为印记基因Z1应用于18例乳腺肿瘤穿刺细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，图7(b)为印记基因Z16应用于18例乳腺肿瘤穿刺细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准；
图8(a)为Z1、Z8、Z10、Z11、Z13、Z16对乳腺癌的印记缺失的强度，图8(b)为Z1、Z8、Z10、Z11、Z13、Z16对乳腺癌的拷贝数异常的强度，图8(c)为Z1、Z8、Z10、Z11、Z13、Z16对乳腺癌的总表达量的强度，图8(d)为Z3、Z4、Z5、Z6、Z9对乳腺癌的印记缺失的强度，图8(e)为Z3、Z4、Z5、Z6、Z9对乳腺癌的拷贝数异常的强度，图8(f)为Z3、Z4、Z5、Z6、Z9对乳腺癌的总表达量的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量，TE为印记基因的总表达量；
图9(a)为印记基因Z1印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图9(b)为印记基因Z16印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图9(c)为印记基因Z8印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图9(d)为印记基因Z10印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图9(e)为印记基因Z11印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图9(f)为印记基因Z13印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图9(g)为印记基因Z3印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图9(h)为印记基因Z4印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图9(i)为印记基因Z5印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图9(j)为印记基因Z6印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图9(k)为印记基因Z9印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量，TE为印记基因的总表达量；
图10为Z1和Z16基因应用于21例胰腺肿瘤穿刺细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，其中，图10(a)为印记基因Z1应用于21例胰腺肿瘤穿刺细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，图10(b)为印记基因Z16应用于21例胰腺肿瘤穿刺细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准；
图11(a)为Z1、Z3、Z10、Z11、Z16对胰腺癌的印记缺失的强度，图11(b)为Z1、Z3、Z10、Z11、Z16对胰腺癌的拷贝数异常的强度，图11(c)为Z1、Z3、Z10、Z11、Z16对胰腺癌的总表达量的强度，图11(d)为Z4、Z5、Z6、Z8、Z13对胰腺癌的印记缺失的强度，图11(e)为Z4、Z5、Z6、Z8、Z13对胰腺癌的拷贝数异常的强度，图11(f)为Z4、Z5、Z6、Z8、Z13对胰腺癌的总表达量的强度，图11(g)为Z2、Z9、Z12、Z14、Z15对胰腺癌的印记缺失的强度，图11(h)为Z2、Z9、Z12、Z14、Z15对胰腺癌的拷贝数异常的强度，图11(i)为Z2、Z9、Z12、Z14、Z15对胰腺癌的总表达量的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量，TE为印记基因的总表达量；
图12(a)为印记基因Z1印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(b)为印记基因Z16印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(c)为印记基因Z3印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(d)为印记基因Z10印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(e)为印记基因Z11印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(f)为印记基因Z4印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(g)为印记基因Z5印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(h)为印记基因Z6印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(i)为印记基因Z8印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(j)为印记基因Z13印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(k)为印记基因Z2印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(l)为印记基因Z9印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(m)为印记基因Z12印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(n)为印记基因Z14印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图12(o)为印记基因Z15印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量，TE为印记基因的总表达量；
图13为Z1和Z16基因应用于23例支气管毛刷细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，其中，图13(a)为印记基因Z1应用于23例支气管毛刷细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，图13(b)为印记基因Z16应用于23例支气管毛刷细胞样本中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准；
图14(a)为Z1、Z3、Z8、Z13、Z16对肺癌的印记缺失的强度，图14(b)为Z1、Z3、Z8、Z13、Z16对肺癌的拷贝数异常的强度，图14(c)为Z1、Z3、Z8、Z13、Z16对肺癌的总表达量的强度，图14(d)为Z4、Z10、Z11对肺癌的印记缺失的强度，图14(e)为Z4、Z10、Z11对肺癌的拷贝数异常的强度，图14(f)为Z4、Z10、Z11对肺癌的总表达量的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量，TE为印记基因的总表达量；
图15(a)为印记基因Z1印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图15(b)为印记基因Z16印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图15(c)为印记基因Z3印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图15(d)为印记基因Z8印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图15(e)为印记基因Z13印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图15(f)为印记基因Z4印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图15(g)为印记基因Z10印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图15(h)为印记基因Z11印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量，TE为印记基因的总表达量；
图16为Z1和Z16基因应用于70例尿液脱落细胞样本中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，其中，图16(a)为印记基因Z1应用于70例尿液脱落细胞样本中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准，图16(b)为印记基因Z16应用于70例尿液脱落细胞样本中，印记缺失和拷贝数异常的分布范围和分级标准；
图17(a)为Z1、Z2、Z3、Z10、Z16对泌尿系统癌症的印记缺失的强度，图17(b)为Z1、Z2、Z3、Z10、Z16对泌尿系统癌症的拷贝数异常的强度，图17(c)为Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z15对泌尿系统癌症的印记缺失的强度，图17(d)为Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z15对泌尿系统癌症的拷贝数异常的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量；
图18(a)为印记基因Z1印记缺失和拷贝数异常的强度，图18(b)为印记基因Z16印记缺失和拷贝数异常的强度，图18(c)为印记基因Z2印记缺失和拷贝数异常的强度，图18(d)为印记基因Z3印记缺失和拷贝数异常的强度，图18(e)为印记基因Z10印记缺失和拷贝数异常的强度，图18(f)为印记基因Z4印记缺失和拷贝数异常的强度，图18(g)为印记基因Z5印记缺失和拷贝数异常的强度，图18(h)为印记基因Z6印记缺失和拷贝数异常的强度，图18(i)为印记基因Z8印记缺失和拷贝数异常的强度，图18(j)为印记基因Z9印记缺失和拷贝数异常的强度，图18(k)为印记基因Z15印记缺失和拷贝数异常的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量；
图19(a)为良性结直肠肿瘤的肠镜活检样本中16个基因的表达状态，图19(b)为恶性潜能结直肠肿瘤的肠镜活检样本中16个基因的表达状态，图19(c)为结直肠癌的肠镜活检样本中16个基因的表达状态；
图20(a)为良性膀胱肿瘤的膀胱镜活检样本中16个基因的表达状态，图20(b)为恶性潜能膀胱肿瘤的膀胱镜活检样本中16个基因的表达状态，图20(c)为膀胱癌的膀胱镜活检样本中16个基因的表达状态；
图21(a)为良性肺肿瘤的痰液细胞样本中16个基因的表达状态，图21(b)为肺癌的痰液细胞样本中16个基因的表达状态；
图22(a)为良性肝脏肿瘤的穿刺细胞压片中16个基因的表达状态，图22(b)为肝癌的穿刺细胞压片中16个基因的表达状态；
图23(a)为良性前列腺肿瘤的穿刺细胞压片中16个基因的表达状态，图23(b)为前列腺癌的穿刺细胞压片中16个基因的表达状态；
图24(a)为未转移的良性乳腺肿瘤附近淋巴结的穿刺细胞压片中16个基因的表达状态，图24(b)为转移的乳腺癌附近淋巴结的穿刺细胞压片中16个基因的表达状态；
图25(a)为良性肺肿瘤的胸水细胞样本中16个基因的表达状态，图25(b)为肺癌的胸水细胞样本中16个基因的表达状态。
图26(a)为良性结直肠肿瘤患者的粪便脱落细胞样本中16个基因的表达状态，图26(b)为结直肠癌患者的粪便脱落细胞样本中16个基因的表达状态；
图27(a)为健康人的血液细胞样本中16个基因的表达状态，图27(b)为白血病癌患者的血液细胞样本中16个基因的表达状态。
具体实施方式
为更进一步阐述本申请所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案，但本申请并非局限在实施例范围内。
实施例1穿刺细胞的印记基因分析
所述的印记基因的检测方法，包括如下步骤：
(1)用活检穿刺针获取穿刺细胞，经10％中性福尔马林固定，以防RNA降解，固定时间为24小时，制作细胞压片；
(2)按照RNASCope的样品处理方法封闭样本中内源性过氧化物酶活性，增强通透性并暴露出RNA分子；
(3)设计探针：根据印记基因序列设计特异性引物；
所述设计探针是根据印记基因Z1(Gnas)、Z2(Igf2)、Z3(Peg10)、Z4(Igf2r)、Z5(Mest)、Z6(Plagl1)、Z7(Cdkn1c)、Z8(Dcn)、Z9(Dlk1)、Z10(Gatm)、Z11(Grb10)、Z12(Peg3)、Z13(Sgce)、Z14(Slc38a4)、Z15(Diras3)和Z16(Snrpn/Snurf)进行设计的，具体在每个基因的内旋子内选择一段序列作为探针，具体的探针由Advanced Cell Diagnostics公司设计。
(4)将步骤(3)的探针与待测样本通过试剂盒进行RNASCope原位杂交；
(5)信号扩增和苏木精染色，用显微镜成像分析印记基因的表达情况；
所述模型中的计算印记基因表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
正常印记基因表达量＝b/(b+c+d)×100％；
印记基因缺失基因表达量(LOI)＝c/(b+c+d)×100％；
印记基因拷贝数异常的基因表达量(CNV)＝d/(b+c+d)×100％；
其中，a、b、c、d如图2所示，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个棕色标记，印记基因存在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个棕色标记，印记基因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核。
以甲状腺癌为例，其检测结果如图3(a)-图3(e)所示，从图3(a)-图3(e)可以看出，从0级到IV级的样本中，印记缺失(细胞核内有两个信号点)和拷贝数异常(细胞核内有三个或以上信号点)的细胞比例随恶性程度的增加而逐渐增加。
实施例2 177例甲状腺穿刺细胞的印记基因分析
通过穿刺获取177例甲状腺穿刺细胞样本，其他检测方法同实施例1，结果如图4(a)-图4(b)、图5(a)-图5(f)和图6(a)-图6(i)所示。
从图4(a)可以看出，对于所述印记基因Z1，印记基因缺失表达量小于15％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于1.5％和/或印记基因总表达量小于40％为0级，印记基因缺失表达量为15-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.5-4％和/或印记基因总表达量为40-45％为I级，印记基因缺失表达量为20-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为4-8％和/或印记基因总表达量为45-60％为II级，印记基因缺失表达量为30-40％和/或印记基因拷贝数异常表达量为8-15％和/或印记基因总表达量为60-65％为III级，印记基因缺失表达量大于40％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于15％和/或印记基因总表达量大于65％为IV级。
从图4(b)可以看出，对于所述印记基因Z16，印记基因缺失表达量小于15％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于1.5％和/或印记基因总表达量小于30％为0级，印记基因缺失表达量为15-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1.5-4％和/或印记基因总表达量为30-35％为I级，印记基因缺失表达量为20-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为4-8％和/或印记基因总表达量为35-50％为II级，印记基因缺失表达量为30-40％和/或印记基因拷贝数异常表达量为8-15％和/或印记基因总表达量为50-55％为III级，印记基因缺失表达量大于40％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于15％和/或印记基因总表达量大于55％为IV级。
从图5(a)-图5(f)可以看出，Z1，Z2，Z3，Z4，Z5，Z6，Z7，Z8，Z9，Z10，Z11，Z12，Z13，Z14，Z15，Z16每个基因对甲状腺癌的反应敏感性或者说对应于甲状腺癌表达的印记缺失的强度和状态是不同的，Z1、Z16、Z4、Z11、Z13对甲状腺肿瘤敏感度高。
从这177例甲状腺穿刺细胞样本综合分析可以得出：
判断甲状腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16的印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常基因表达量均小于I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级或印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的拷贝数表达量为I级中的任意一种情况则为良性肿瘤；
判断甲状腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因缺失基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为I级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为II级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到II级中的任意一种情况，则为甲状腺癌潜能；
判断甲状腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失基因表达量为II级和/或印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级，印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为II级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为II级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为III级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到III级中的任意一种情况，则为早期甲状腺癌；
判断甲状腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为III级、印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为III级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量IV级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期甲状腺癌；
判断甲状腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为IV级和/或印记基因Z1和Z16的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期甲状腺癌。
具体每个印记基因对甲状腺癌的敏感度如图6(a)-图6(i)：
印记基因Z1的缺失、拷贝数异常和表达量增加在恶性潜能阶段迅速升高，在早期甲状腺癌阶段已经达到很高的敏感度，在中晚期甲状腺癌中敏感度维持在很高的水平；印记基因Z16的印记缺失在恶性潜能阶段迅速上升，随甲状腺癌的发展维持在很高的水平；印记基因Z16的拷贝数异常和表达量增加在早期甲状腺癌中迅速上升，在中晚期甲状腺癌中维持很高的水平。
印记基因Z4的印记缺失和拷贝数异常在早期甲状腺癌中开始上升，在中期和晚期甲状腺癌中逐渐上升到较高的水平；印记基因Z4的表达量增加在恶性潜能阶段开始出现，随着癌症的发展逐渐上升，到晚期甲状腺癌中达到较高的水平；印记基因Z11的印记缺失在恶性潜能阶段迅速上升，但是在早期到晚期甲状腺癌的发展过程中不再继续上升；印记基因Z11的拷贝数异常在恶性潜能阶段迅速上升，在早期甲状腺癌中维持稳定，到中晚期甲状腺癌阶段又继续上升；印记基因Z11的表达量增加在中期甲状腺癌阶段才开始出现，在晚期甲状腺癌中进一步上升。印记基因Z13的拷贝数异常在恶性潜能阶段迅速上升，印记缺失和表达量增加在早期甲状腺癌中开始上升，但是在中晚期甲状腺癌中都维持稳定。
印记基因Z2的印记缺失和表达量增加在恶性潜能阶段开始上升，在早期到晚期甲状腺癌的发展过程中上升比较缓慢；印记基因Z2的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，早期甲状腺癌阶段没有明显上升，到中期甲状腺癌阶段进一步上升，在晚期甲状腺癌中维持稳定。印记基因Z3的印记缺失和表达量增加从恶性潜能阶段开始出现，随甲状腺癌的发展而缓慢上升，到晚期甲状腺癌阶段敏感度仍然不高；印记基因Z3的拷贝数异常在中期甲状腺癌之前的阶段都处于很低的水平，在晚期甲状腺癌阶段迅速上升到较高的水平。印记基因Z5的印记缺失和拷贝数异常在早期甲状腺癌阶段迅速上升，在中晚期甲状腺癌中维持稳定；印记基因Z5的表达量增加在中期甲状腺癌中开始出现，在晚期甲状腺癌中维持稳定。印记基因Z6的印记缺失和表达量增加在恶性潜能阶段开始出现，在甲状腺癌发展过程中维持在较低的水平；印记基因Z6的拷贝数异常在早期甲状腺癌中开始出现，在中晚期甲状腺癌中维持在较低的水平。
实施例3 18例乳腺穿刺细胞的印记基因分析
通过穿刺获取乳腺穿刺细胞样本，其他检测方法同实施例1，结果如图7(a)-图7(b)、图8(a)-图8(f)和图9(a)-图9(k)所示。
从图7(a)可以看出，对于所述印记基因Z1，印记基因缺失表达量小于15％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于1％和/或印记基因总表达量小于25％为0级，印记基因缺失表达量为15-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1-3％和/或印记基因总表达量为25-30％为I级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为3-7％和/或印记基因总表达量为30-40％为II级，印记基因缺失表达量为25-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为7-10％和/或印记基因总表达量为40-50％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于10％和/或印记基因总表达量大于50％为IV级。
从图7(b)可以看出，对于所述印记基因Z16，印记基因缺失表达量小于15％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于1％和/或印记基因总表达量小于25％为0级，印记基因缺失表达量为15-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1-3％和/或印记基因总表达量为25-30％为I级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为3-7％和/或印记基因总表达量为30-40％为II级，印记基因缺失表达量为25-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为7-10％和/或印记基因总表达量为40-50％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于10％和/或印记基因总表达量大于50％为IV级。
从这18例乳腺穿刺细胞样本综合分析可以得出：
判断乳腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16的印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常基因表达量均小于I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级或印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的拷贝数表达量为I级中的任意一种情况则为良性肿瘤；
判断乳腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因缺失基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为I级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为II级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到II级中的任意一种情况，则为乳腺癌潜能；
判断乳腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失基因表达量为II级和/或印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级，印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为II级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为II级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为III级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到III级中的任意一种情况，则为早期乳腺癌；
判断乳腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为III级、印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为III级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量IV级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期乳腺癌；
判断乳腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为IV级和/或印记基因Z1和Z16的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期乳腺癌。
从图8(a)-图8(f)可以看出，Z1，Z2，Z3，Z4，Z5，Z6，Z7，Z8，Z9，Z10，Z11，Z12，Z13，Z14，Z15，Z16每个基因对乳腺癌的反应敏感性或者说对应于乳腺癌表达的印记缺失的强度和状态是不同的，Z1、Z16、Z8、Z10、Z11、Z13对乳腺肿瘤敏感度高。
具体每个印记基因对乳腺癌的敏感度如图9(a)-图9(k)：
印记基因Z1的缺失、拷贝数异常在恶性潜能阶段迅速升高，在早期乳腺癌阶段已经达到很高的敏感度，在中晚期乳腺癌中敏感度维持在很高的水平；印记基因Z1的表达量增加在恶性潜能阶段水平不高，但是在早期乳腺癌阶段迅速上升到较高水平，并且在中晚期乳腺癌中维持在较高的水平。印记基因Z16的印记缺失和拷贝数异常在早期乳腺癌中迅速上升，到中晚期乳腺癌阶段维持在很高的水平；印记基因Z16的表达量增加在早期乳腺癌阶段开始出现，在中晚期乳腺癌中继续上升到很高的水平。
印记基因Z8的印记缺失和拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，在早期乳腺癌阶段继续增加，并在中晚期乳腺癌中维持稳定；印记基因Z8的表达量增加恶性潜能阶段开始出现，但是不随乳腺癌的发展而继续上升。印记基因Z10的拷贝数异常和表达量增加在早期乳腺癌中快速上升，但是在中晚期乳腺癌中不在继续增加；印记基因Z10的印记缺失在中期乳腺癌阶段才开始出现，在晚期乳腺癌阶段略有上升。印记基因Z11的拷贝数异常和表达量增加在恶性潜能阶段开始出现，在早期乳腺癌中上升速度减缓，到中晚期乳腺癌阶段维持稳定；印记基因Z11的印记缺失在中期乳腺癌中才开始出现，在晚期乳腺癌中上升到较高的水平。印记基因Z13的印记缺失、拷贝数异常和表达量增加在早期乳腺癌阶段迅速上升，在中晚期乳腺癌中维持稳定。印记基因Z3的印记缺失、拷贝数异常和表达量增加在晚期乳腺癌阶段才出现，其中拷贝数异常水平较高，印记缺失和表达量增加水平较低。印记基因Z4和Z5的印记缺失、拷贝数异常和表达量增加在晚期乳腺癌阶段才出现，其中印记缺失和拷贝数异常水平较高，表达量增加水平较低。印记基因Z6的印记缺失、拷贝数异常和表达量增加在晚期乳腺癌阶段才出现，并且水平不高。印记基因Z9的拷贝数异常在中期乳腺癌阶段开始出现，在晚期乳腺癌中继续上升；印记基因Z9的印记缺失和表达量增加在晚期乳腺癌阶段才出现，但是水平都不高。
实施例4 21例胰腺穿刺细胞的印记基因分析
通过穿刺获取21例胰腺穿刺细胞样本，其他检测方法同实施例1，结果如图10(a)-图10(b)、图11(a)-图11(i)和图12(a)-图12(o)所示。
从图10(a)可以看出，对于所述印记基因Z1，印记基因缺失表达量小于15％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于2％和/或印记基因总表达量小于20％为0级，印记基因缺失表达量为15-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2-4％和/或印记基因总表达量为20-30％为I级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为4-8％和/或印记基因总表达量为30-40％为II级，印记基因缺失表达量为25-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为8-12％和/或印记基因总表达量为40-50％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于12％和/或印记基因总表达量大于50％为IV级。
从图10(b)可以看出，对于所述印记基因Z16，印记基因缺失表达量小于15％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于2％和/或印记基因总表达量小于20％为0级，印记基因缺失表达量为15-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2-4％和/或印记基因总表达量为20-30％为I级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为4-8％和/或印记基因总表达量为30-40％为II级，印记基因缺失表达量为25-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为8-12％和/或印记基因总表达量为40-50％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于12％和/或印记基因总表达量大于50％为IV级。
从这21例胰腺穿刺细胞样本综合分析可以得出：
判断胰腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16的印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常基因表达量均小于I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级或印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的拷贝数表达量为I级中的任意一种情况则为良性肿瘤；
判断胰腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因缺失基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为I级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为II级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到II级中的任意一种情况，则为胰腺癌潜能；
判断胰腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失基因表达量为II级和/或印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级，印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为II级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为II级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为III级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到III级中的任意一种情况，则为早期胰腺癌；
判断胰腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为III级、印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为III级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量IV级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期胰腺癌；
判断胰腺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为IV级和/或印记基因Z1和Z16的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期胰腺癌。
从图11(a)-图11(i)可以看出，Z1，Z2，Z3，Z4，Z5，Z6，Z7，Z8，Z9，Z10，Z11，Z12，Z13，Z14，Z15，Z16每个基因对胰腺癌的反应敏感性或者说对应于胰腺癌表达的印记缺失的强度和状态是不同的，Z1、Z16、Z3、Z10、Z11对胰腺肿瘤敏感度高。
具体每个印记基因对胰腺癌的敏感度如图12(a)-图12(o)：
印记基因Z1的印记缺失、拷贝数异常和表达量增加从恶性潜能阶段开始出现，其中拷贝数异常上升速度最快，在早期胰腺癌阶段就上升到很高的水平，并维持稳定，印记缺失上升速度较快，到中期胰腺癌阶段上升到很高的水平，表达量增加上升的速度较慢，在晚期胰腺癌中上升到较高的水平。印记基因Z16的印记缺失在恶性潜能阶段开始出现，随胰腺癌的发展逐渐上升，到晚期胰腺癌阶段达到较高的水平；印记基因Z16的拷贝数异常在早期胰腺癌阶段开始出现，在中期胰腺癌阶段迅速上升，到晚期胰腺癌阶段维持在很高的水平；印记基因Z16的表达量增加在早期胰腺癌阶段开始出现，在随胰腺癌的发展逐渐上升，到晚期胰腺癌阶段达到较高水平。
印记基因Z3的印记缺失在恶性潜能阶段开始出现，随胰腺癌的发展持续上升，到中晚期胰腺癌阶段上升速度减缓；印记基因Z3的拷贝数异常在早期胰腺癌阶段开始出现，在中期胰腺癌阶段没有明显上升，到晚期胰腺癌阶段继续上升到较高的水平；印记基因Z3的表达量增加在早期胰腺癌中开始出现，但是在中晚期胰腺癌中都维持在较低的水平。印记基因Z10的印记缺失和拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，在早期和中期胰腺癌中上升不明显，在晚期胰腺癌阶段继续上升到较高的水平；印记基因Z10的表达量增加在早期胰腺癌中开始出现，但是在中晚期胰腺癌中都维持在较低的水平。印记基因Z11的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，在早期和中期胰腺癌中逐渐上升，到晚期胰腺癌阶段维持在较高的水平；印记基因Z11的印记缺失和表达量增加在早期胰腺癌中开始出现，其中印记缺失水平上升较快，在中晚期胰腺癌阶段维持在较高水平，表达量增加上升较慢，在中晚期胰腺癌阶段水平仍然不高。印记基因Z4的印记缺失和拷贝数异常在早期胰腺癌阶段开始出现，在中期胰腺癌阶段迅速上升，到晚期胰腺癌阶段维持在很高的水平；印记基因Z4的表达量增加在早期胰腺癌阶段开始出现，在中期胰腺癌中没有显著上升，到晚期胰腺癌阶段又继续上升。印记基因Z5的印记缺失和拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，印记缺失在早期到晚期胰腺癌阶段上升不明显，拷贝数异常在早期到中期胰腺癌阶段没有明显上升，到晚期胰腺癌中继续上升到较高水平；印记基因Z5的表达量增加在中期胰腺癌阶段才开始出现，在晚期胰腺癌阶段继续上升但水平仍然不高。印记基因Z6的印记缺失和拷贝数异常在早期胰腺癌阶段开始出现，随胰腺癌的发展而逐渐上升，到晚期胰腺癌阶段达到较高的水平；印记基因Z6的表达量增加在早期胰腺癌中开始出现，但是在中晚期胰腺癌中都维持在较低的水平。印记基因Z8的印迹缺失在早期胰腺癌阶段开始出现，随胰腺癌的发展而缓慢上升，到晚期胰腺癌阶段达到较高水平；印记基因Z8的拷贝数异常在晚期胰腺癌中出现，水平较高；印记基因Z8的表达量增加在早期胰腺癌中开始出现，但是在中晚期胰腺癌中都维持在较低的水平。印记基因Z13的印记缺失和拷贝数异常在早期胰腺癌阶段开始出现，在中期胰腺癌阶段迅速上升，晚期胰腺癌阶段维持稳定；印迹基因Z13的表达量增加在中期胰腺癌阶段开始出现，但是在晚期胰腺癌中不继续上升。印记基因Z2的印记缺失和表达量增加在早期胰腺癌阶段开始出现，印记基因Z2的拷贝数异常在中期胰腺癌阶段开始出现，但是在中晚期胰腺癌中都维持在较低的水平。印记基因Z9的印迹缺失在中期胰腺癌阶段开始出现，随胰腺癌的发展缓慢上升，到晚期胰腺癌阶段水平仍然不高；印记基因Z9的拷贝数异常在中期胰腺癌阶段开始出现，在晚期胰腺癌中继续上升，但水平不高；印记基因Z9的表达量增加在中期胰腺癌阶段开始出现，但是在晚期胰腺癌中不继续上升。印记基因Z12的印记缺失、拷贝数异常和表达量增加在中期胰腺癌阶段开始出现，但是在晚期胰腺癌中不继续上升。印记基因Z14的印迹缺失在中期胰腺癌阶段开始迅速上升，到晚期胰腺癌阶段维持在较高的水平，印记基因Z14的拷贝数异常在中期胰腺癌阶段开始出现，在晚期胰腺癌中继续上升，但水平不高；在胰腺癌的发展过程中印记基因Z14没有出现明显的表达量增加。印记基因Z15的印记缺失在中期胰腺癌阶段开始出现，但是在晚期胰腺癌中不继续上升；印记基因Z15的拷贝数异常在晚期胰腺癌中才开始出现，并且水平不高；在胰腺癌的发展过程中印记基因Z15没有出现明显的表达量增加。
实施例5 23例支气管毛刷细胞的印记基因分析
通过支气管毛刷获取肺肿瘤细胞样本，其他检测方法同实施例1，结果如图13(a)-图13(b)、图14(a)-图14(f)和图15(a)-图15(h)所示。
从图13(a)可以看出，对于所述印记基因Z1，印记基因缺失表达量小于15％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于2％和/或印记基因总表达量小于30％为0级，印记基因缺失表达量为15-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2-4％和/或印记基因总表达量为30-40％为I级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为4-8％和/或印记基因总表达量为40-50％为II级，印记基因缺失表达量为25-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为8-12％和/或印记基因总表达量为50-60％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于12％和/或印记基因总表达量大于60％为IV级。
从图13(b)可以看出，对于所述印记基因Z16，印记基因缺失表达量小于10％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于1％和/或印记基因总表达量小于25％为0级，印记基因缺失表达量为10-15％和/或印记基因拷贝数异常表达量为1-2％和/或印记基因总表达量为25-30％为I级，印记基因缺失表达量为15-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2-5％和/或印记基因总表达量为30-40％为II级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为5-8％和/或印记基因总表达量为40-50％为III级，印记基因缺失表达量大于25％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于8％和/或印记基因总表达量大于50％为IV级。
从这23例支气管毛刷细胞样本综合分析可以得出：
判断肺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16的印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常基因表达量均小于I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级或印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的拷贝数表达量为I级中的任意一种情况则为良性肿瘤；
判断肺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因缺失基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为I级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为II级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到II级中的任意一种情况，则为肺癌潜能；
判断肺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失基因表达量为II级和/或印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级，印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为II级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为II级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为III级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到III级中的任意一种情况，则为早期肺癌；
判断肺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为III级、印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为III级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量IV级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期肺癌；
判断肺肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为IV级和/或印记基因Z1和Z16的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期肺癌。
从图14(a)-图14(f)可以看出，Z1，Z2，Z3，Z4，Z5，Z6，Z7，Z8，Z9，Z10，Z11，Z12，Z13，Z14，Z15，Z16每个基因对肺癌的反应敏感性或者说对应于肺癌表达的印记缺失的强度和状态是不同的，Z1、Z16、Z3、Z8、Z13对肺肿瘤敏感度高。
具体每个印记基因对肺癌的敏感度如图15(a)-图15(h)：
印记基因Z1的印记缺失和拷贝数异常在恶性潜能阶段迅速上升，在肺癌的发展过程中维持在很高的水平；印记基因Z1的表达量增加在恶性潜能阶段迅速上升，但是在早期到晚期肺癌中不继续增加。印记基因Z16的印迹缺失在早期肺癌中迅速上升，在中晚期肺癌中维持在很高的水平；印记基因Z16的拷贝数异常和表达量增加在中期肺癌中迅速上升，到晚期肺癌中维持在较高的水平。
印记基因Z3的印迹缺失在恶性潜能阶段开始出现，在早期和中期肺癌中没有明显上升，到晚期肺癌中迅速上升到很高的水平；印记基因Z3的拷贝数异常在中期肺癌中迅速上升到很高的水平，在晚期肺癌中维持稳定；印记基因Z3的表达量增加在中期肺癌中出现，但是在晚期肺癌中没有明显增加。印记基因Z8的印记缺失和拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，在早期肺癌中继续上升，中期肺癌中维持在很高的水平，但是在晚期肺癌中出现一定程度的下降；印记基因Z8的表达量增加在早期和中期肺癌中出现，晚期肺癌中Z8的表达量又恢复到较低水平。印记基因Z13的印记缺失和拷贝数异常在中期肺癌中迅速上升，并在晚期肺癌中维持很高的水平；印记基因Z13的表达量增加在晚期肺癌中出现轻微的增加。印记基因Z4的印记缺失在恶性潜能阶段迅速上升，在早期到晚期肺癌中维持很高的水平；印记基因Z4的拷贝数异常在早期肺癌中开始出现，中期肺癌中没有明显上升，到晚期肺癌阶段又继续上升到较高水平；印记基因Z4的表达量增加在恶性潜能阶段开始出现，但是随肺癌的发展没有显著增加。印记基因Z10的拷贝数异常在恶性潜能阶段迅速上升，在早期到晚期肺癌中维持较高的水平；印记基因Z10的印记缺失在中期肺癌中迅速上升，在晚期肺癌中达到较高的水平；在肺癌的发展过程中印记基因Z10没有出现明显的表达量增加。印记基因Z11的印记缺失和拷贝数异常在恶性潜能阶段迅速上升，在早期和中期肺癌中没有明显上升，但是晚期肺癌阶段又继续上升到较高的水平；印记基因Z11的表达量在晚期肺癌中才有轻微的上升。
实施例6 70例尿液脱落细胞的印记基因分析
从泌尿系统肿瘤患者的尿液中获取细胞样本，其他检测方法同实施例1，检测结果如图16(a)-图16(b)、图17(a)-图17(d)和图18(a)-图18(k)所示。
从图16(a)可以看出，对于所述印记基因Z1，印记基因缺失表达量小于17％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于2％为0级，印记基因缺失表达量为17-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2-3％为I级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为3-7％为II级，印记基因缺失表达量为25-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为7-12％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于12％为IV级。
从图16(b)可以看出，对于所述印记基因Z16，印记基因缺失表达量小于17％和/或印记基因拷贝数异常表达量小于2％为0级，印记基因缺失表达量为17-20％和/或印记基因拷贝数异常表达量为2-3％为I级，印记基因缺失表达量为20-25％和/或印记基因拷贝数异常表达量为3-7％为II级，印记基因缺失表达量为25-30％和/或印记基因拷贝数异常表达量为7-12％为III级，印记基因缺失表达量大于30％和/或印记基因拷贝数异常表达量大于12％为IV级。
从这70例尿液脱落细胞样本综合分析可以得出：
判断泌尿系统肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16的印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常基因表达量均小于I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级或印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的拷贝数表达量为I级中的任意一种情况则为良性肿瘤；
判断泌尿系统肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因缺失基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为I级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为I级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为II级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到II级中的任意一种情况，则为泌尿系统癌潜能；
判断泌尿系统肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失基因表达量为II级和/或印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级，印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为II级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为II级、印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因缺失基因表达量为III级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量达到III级中的任意一种情况，则为早期泌尿系统癌；
判断泌尿系统肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为III级、印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1和Z16中有1个印记基因的印记基因缺失基因表达量为III级并有1个印记基因的拷贝数异常基因表达量为III级、印记基因Z1或Z16中仅有1个印记基因的印记基因缺失表达量IV级或印记基因Z1或Z16中仅有1个基因的印记基因拷贝数表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期泌尿系统癌；
判断泌尿系统肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1和Z16中的2个基因的印记基因缺失表达量为IV级和/或印记基因Z1和Z16的2个基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期泌尿系统癌。
从图17(a)-图17(d)可以看出，Z1，Z2，Z3，Z4，Z5，Z6，Z7，Z8，Z9，Z10，Z11，Z12，Z13，Z14，Z15，Z16每个基因对泌尿系统癌症的反应敏感性或者说对应于膀胱癌表达的印记缺失的强度和状态是不同的，Z1、Z16、Z2、Z3、Z10对泌尿系统肿瘤的敏感度高。
具体每个印记基因对泌尿系统癌症的敏感度如图18(a)-图18(k)：
印记基因Z1的印记缺失在恶性潜能阶段开始出现，在早期泌尿系统癌症中继续上升，在中晚期泌尿系统癌症中维持在较高的水平；印记基因Z1的拷贝数异常在恶性潜能阶段迅速上升，在中期到晚期泌尿系统癌症中进一步上升到很高水平。印记基因Z16的印记缺失在早期泌尿系统癌症中开始出现，在中晚期泌尿系统癌症中不再明显增加；印记基因Z16的拷贝数异常在早期泌尿系统癌症阶段开始出现，随泌尿系统癌症的发展逐渐上升到很高水平。
印记基因Z2的印记缺失在中期泌尿系统癌症中开始出现，晚期泌尿系统癌症中达到较高水平；印记基因Z2的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，随泌尿系统癌症的发展逐渐上升到很高水平。印记基因Z3的印记缺失在中期泌尿系统癌症中开始出现，晚期泌尿系统癌症中继续上升，但水平不高；印记基因Z3的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，随泌尿系统癌症的发展逐渐上升到很高水平。印记基因Z10的印记缺失在中期泌尿系统癌症中开始出现，在晚期泌尿系统癌症中迅速上升到较高水平；印记基因Z10的拷贝数异常在早期泌尿系统癌症阶段开始出现，随泌尿系统癌症的发展逐渐上升到较高水平。印记基因Z4的印记缺失在中期泌尿系统癌症中开始出现，晚期泌尿系统癌症中继续上升，但水平不高；印记基因Z4的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，随癌症的发展逐渐上升到较高水平。印记基因Z5的印记缺失在中期泌尿系统癌症中开始出现，晚期癌症中继续上升，但水平不高；印记基因Z5的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，在早期癌症中迅速上升，在中晚期泌尿系统癌症中维持较高的水平。印记基因Z6的拷贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，到晚期癌症阶段才迅速上升到较高水平；印记基因Z6的印记缺失在晚期泌尿系统癌症中有轻微的上升。印记基因Z8和Z9的印记缺失和拷贝数异常在中期泌尿系统癌症中开始出现，在晚期泌尿系统癌症中迅速上升到较高的水平。印记基因Z15的拷贝数异常在中期泌尿系统癌症中开始出现，在晚期癌症中迅速上升到较高的水平；印记基因Z15的印迹缺失在晚期泌尿系统癌症中出现较高水平的增加。
实施例7肠镜活检细胞的印记基因分析
在肠镜下获取活检样本，其他检测方法同实施例1，结果如图图19(a)-图19(c)所示。
从图19(a)-图19(c)可以看出，图19(a)为良性结直肠息肉，图19(b)为恶性潜能的结直肠肿瘤，图19(c)为结直肠癌，随着肿瘤恶性程度的增加，印记缺失细胞比例和拷贝数异常细胞比例都逐渐上升。
实施例8膀胱镜活检细胞的印记基因分析
在膀胱镜下获取活检样本，其他检测方法同实施例1，结果如图20(a)-图20(c)所示。
从图20(a)-图20(c)可以看出，图20(a)为良性膀胱肿瘤，图20(b)为恶性潜能的膀胱肿瘤，图20(c)为膀胱癌，随着肿瘤恶性程度的增加，印记缺失细胞比例和拷贝数异常细胞比例都逐渐上升。
实施例9痰液脱落细胞的印记基因分析
从肺肿瘤患者的痰液中获取细胞样本，其他检测方法同实施例1，结果如图图21(a)-图21(b)所示。
从图21(a)-图21(b)可以看出，图21(a)为良性肺肿瘤，图21(b)为肺癌，随着肿瘤恶性程度的增加，印记缺失细胞比例和拷贝数异常细胞比例都逐渐上升。
实施例10肝穿刺活检细胞的印记基因分析
通过穿刺获取肝穿刺细胞样本，其他检测方法同实施例1，结果如图22(a)-图22(b)所示。
从图22(a)-图22(b)可以看出，图22(a)为良性肝肿瘤，图22(b)为肝癌，随着肿瘤恶性程度的增加，印记缺失细胞比例和拷贝数异常细胞比例都逐渐上升。
实施例11前列腺穿刺活检细胞的印记基因分析
通过穿刺获取前列腺活检样本，其他检测方法同实施例1，结果如图23(a)-图23(b)所示。
从图23(a)-图23(b)可以看出，图23(a)为良性前列腺肿瘤，图23(b)为前列腺癌，随着肿瘤恶性程度的增加，印记缺失细胞比例和拷贝数异常细胞比例都逐渐上升。
实施例12淋巴结穿刺活检细胞的印记基因分析
通过穿刺获取乳腺肿瘤附近的淋巴结穿刺细胞样本，其他检测方法同实施例1，结果如图24(a)-图24(b)所示。
从图24(a)-图24(b)可以看出，图24(a)为未转移的良性乳腺肿瘤附近的淋巴结穿刺细胞，图24(b)为转移的乳腺癌附近的淋巴结穿刺细胞，在良性肿瘤附近的淋巴结中只有个别印记缺失的细胞，没有发现拷贝数异常的癌细胞，在转移的乳腺癌附近的淋巴结中存在大量印记缺失和拷贝数异常的癌细胞。
实施例13胸水细胞的印记基因分析
通过穿刺获取胸水细胞样本，其他检测方法同实施例1，结果如图25(a)-图25(b)所示。
从图25(a)-图25(b)可以看出，图25(a)为良性肺肿瘤患者的胸水细胞，图25(b)为肺癌患者的胸水细胞，在良性肺肿瘤患者的胸水中只有个别印记缺失的细胞，没有发现拷贝数异常的癌细胞，在肺癌患者的胸水中存在大量印记缺失和拷贝数异常的癌细胞。
实施例14粪便脱落细胞的印记基因分析
从结直肠肿瘤患者的粪便中获取细胞样本，其他检测方法同实施例1，结果如图26(a)-图26(b)所示。
从图26(a)-图26(b)可以看出，图26(a)为良性结直肠肿瘤，图26(b)为结直肠癌，随着肿瘤恶性程度的增加，印记缺失细胞比例和拷贝数异常细胞比例都逐渐上升。
实施例15血液细胞的印记基因分析
从健康人和白血病患者的外周血中获取细胞样本，使用红细胞裂解液去除红细胞，其他检测方法同实施例1，结果如图27(a)-图27(b)所示。
从图27(a)-图27(b)可以看出，图27(a)为健康人的血液细胞，图27(b)为白血病患者的血液细胞，健康人的血液中只有个别印记缺失的细胞，没有发现拷贝数异常的细胞，白血病患者的血液中存在大量印记缺失和拷贝数异常的细胞。
综上所述，本申请所述方法以直观的方法表现了印记缺失在甲状腺、乳腺、胰腺、前列腺、淋巴结穿刺细胞样本，肺支气管毛刷细胞样本，尿液、痰液、粪便、胸水细胞样本和肠镜、膀胱镜活检细胞样本上的表现，通过对印记基因原位标记的方法，客观，直观，早期，精确地检测出印记(迹)基因的变化，并可以提供量化的模型，为甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、泌尿系统癌症的早期诊断做出巨大贡献。
申请人声明，本申请通过上述实施例来说明本申请的详细方法，但本申请并不局限于上述详细方法，即不意味着本申请必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本申请的任何改进，对本申请产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本申请的保护范围和公开范围之内。

Claims (3)

1.一种获取印记基因缺失基因表达量的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）获取穿刺细胞，制作细胞压片；
（2）按照RNASCope的样品处理方法封闭样本中内源性过氧化物酶活性，增强通透性并暴露出RNA分子；
（3）设计探针：根据印记基因序列设计特异性引物；
所述设计探针是根据印记基因Gnas、Igf2、Peg10、Igf2r、Mest、Plagl1、Cdkn1c、Dcn、Dlk1、Gatm、Grb10、Peg3、Sgce、Slc38a4、Diras3和Snrpn/Snurf进行设计的，在每个基因的内含子内选择一段序列作为探针，
（4）将步骤（3）的探针与待测样本进行RNASCope原位杂交；
（5）信号扩增和苏木精染色，用显微镜成像分析印记基因的表达情况；
通过如下公式获取所述印记基因缺失基因表达量：
印记基因缺失基因表达量＝c/（b+c+d）×100%；
其中，所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核，
所述方法用于非诊断目的。
2.一种获取印记基因拷贝数异常基因表达量的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）获取穿刺细胞，制作细胞压片；
（2）按照RNASCope的样品处理方法封闭样本中内源性过氧化物酶活性，增强通透性并暴露出RNA分子；
（3）设计探针：根据印记基因序列设计特异性引物；
所述设计探针是根据印记基因Gnas、Igf2、Peg10、Igf2r、Mest、Plagl1、Cdkn1c、Dcn、Dlk1、Gatm、Grb10、Peg3、Sgce、Slc38a4、Diras3和Snrpn/Snurf进行设计的，在每个基因的内含子内选择一段序列作为探针，
（4）将步骤（3）的探针与待测样本进行RNASCope原位杂交；
（5）信号扩增和苏木精染色，用显微镜成像分析印记基因的表达情况；
通过如下公式获取所述印记基因拷贝数异常基因表达量：
印记基因拷贝数异常基因表达量＝d/（b+c+d）×100%；
其中，所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核，
所述方法用于非诊断目的。
3.一种如权利要求1所述的获取印记基因缺失基因表达量的方法和/或如权利要求2所述的获取印记基因拷贝数异常基因表达量的方法用于检测印记基因表达状态中的用途，所述用途用于非疾病诊断目的。
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