MX2008013705A

MX2008013705A - Anticuerpos que se enlazan al dominio extracelular de la cinasa de linfoma anaplastico del receptor tirosina cinasa.

Info

Publication number: MX2008013705A
Application number: MX2008013705A
Authority: MX
Inventors: Alcide Barberis; Adrian Auf Der Maur; Peter Lichtlen
Original assignee: Esbatech Ag
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2008-11-06
Also published as: AU2007246144A1; JP2009535021A; CA2650822C; DK2013236T3; CN101443361B; EP2013236A1; RU2008146922A; RU2460540C2; IL194752A0; KR20080113261A; CN101443361A; US20080118512A1; US8945563B2; EP2604627A1; EP2013236B1; CA2650822A1; JP2013226144A; NZ572248A; US7902340B2; US9512411B2

Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo específico para ALK humana (Cinasa de Linfoma Anaplástico) en particular un scFv, una secuencia de ácido nucleico que la codifica, su producción y su uso como un propósito farmacéutico o para fines de diagnóstico. El anticuerpo es adecuado para el tratamiento local de tumores, en particular glioblastoma.

Description

ANTICUERPOS QUE SE ENLAZAN AL DOMINIO EXTRACELULAR DE LA CINASA DE LINFOMA ANAPLASICO DEL RECEPTOR TIROSINA CINASA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un anticuerpo especifico para ALK humana (cinasa de linfoma anaplásico) , en particular una scFv, una secuencia de ácido nucleico que codifica, su producción y su uso como un producto farmacéutico o para fines de diagnóstico. El anticuerpo es adecuado para el tratamiento local de los tumores o el cáncer, en particular el glioblastoma .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION ALK (cinasa de linfoma anaplástico ; CD246) es un miembro de la familia del receptor tirosina-cinasa (RTK) . Como un miembro típico de esta familia, ésta es una proteína transmembral tipo I que consiste esencialmente de tres dominios. El dominio extracelular de enlace al ligando (aal9-1038), que contiene un dominio de la clase A LDL-receptor y dos dominios MAM (MAM: Meprina, antígeno A5, proteína tirosina-fosfatasa µ) , un dominio transmembranal (aal039-1059) y un dominio citoplásmico (aa 1060-1620), que contiene el dominio de tirosina-cinasa . Un péptido de señal está presente en el extremo N de la proteína naciente (aa 1-18), que es escindida después de la secreción. Re : 197302 ALK humano y de ratón de longitud completa fueron clonadas en 1997 por dos grupos independientes (Iwahara 1997; Morris 1997) . ALK es altamente similar a la Tirosina-Cinasa Leucocitaria (LTK) llamada RTK y pertenece a la superfamilia de receptores de insulina. ALK muestra 57% de identidad de aminoácidos y 71% de similitud de aminoácidos con LTK en sus regiones de traslape (Morris 2001) . ALK es altamente N-glucosilada y contiene 21 sitios de N-glucosilación putativa. Los aminoácidos 687 al 1034 tienen similitud significativa (50% de identidad de aminoácidos) a LTK. No obstante, la secuencia de 686 aminoácidos proximal en el extremo N no muestra homología a ninguna de las proteínas conocidas, con la excepción de una secuencia muy corta también encontrada en el receptor LDL (Duyster 2001/S ISSPROT) . Además, ésta contiene dos dominios MAM en aa264-427 y aa478-636 (Meprina, antígeno A5, proteína tirosina fosfatasa µ) . Se piensa que estos dominios tienen una función adhesiva, ya que éstos están muy difundidos entre diversas proteínas adhesivas implicadas en la interacción célula a célula (De Juan 2002) . Además, existe un sitio de enlace para los ligandos putativos de ALK correspondientes a los aminoácidos 396-406 (Stoica 2001; ver más adelante) . La secuencia de aminoácidos del dominio de cinasa de ALK murino muestra 98% de identidad de aminoácidos al ALK humana, 78% de identidad a LTK de ratón, 52% a ros de ratón, 47% al receptor del factor de crecimiento similar a insulina humano y 46% al receptor de insulina humana (Iwahara 1997; Ladanyi 2000) . No han sido descritas variantes de empalme de ALK descritas hasta la fecha. No obstante, ALK está a menudo asociada con translocaciones cromosómicas (ver más adelante) . El gen de ALK abarca aproximadamente 315 kb y tiene 26 exones. La mayor parte del gen consiste de dos intrones grandes que abarcan aproximadamente 170 kb . El transcripto de ALK es de 6.5 kb de longitud (Kutok 2002) . De acuerdo a Morris, el cADN abarca 6226 pares de bases (Morris 2001) . La expresión de ALK en ratones comienza durante la embriogénesis alrededor de la etapa de desarrollo Ell y está persistiendo en los periodos neonatales del desarrollo donde éste es expresado en el sistema nervioso. En el adulto, su expresión fisiológica está restringida a ciertas regiones neuronales (células neurales y gliales y probablemente células endoteliales ) del Sistema Nervioso Central a bajos niveles (Morris 1997; Duyster 2001; Stoica 2001) . Efectivamente, la abundancia de ALK disminuye en el periodo postnatal (Morris 2001) . Con base en su patrón de expresión, es sugerido un papel para el receptor en el desarrollo cerebral (Duyster 2001) . La expresión de ALK restringida a las neuronas sugiere que ésta sirve como un receptor para los factores neurotróficos (ver más adelante) . Consistente con esto, su patrón de expresión se traslapa con los genes que codifican para la familia TRK de los receptores de neuro-trofina (Morris 2001) . No obstante, los ratones suprimidos en el gen de ALK no muestran ningún fenotipo obvio (datos no publicados), lo cual puede ser debido a alguna redundancia funcional con los miembros de la familia TRK y otros receptores de neurotrofina . Notablemente, los tejidos hematopoyéticos no muestran expresión detectable de ALK (ver más adelante) (Morris 2001) . Dos ligandos potenciales para ALK han sido recientemente descritos, "pleyotrofina" (PTN) y "midquina" (MK) (Stoica 2001; Duyster 2001; Stoica 2002) . La interacción PTN-ALK fue identificada mediante el uso de la proteina pleyotrofina humana purificada para seleccionar una biblioteca peptidica de visualización de fago. Mediante este método, una secuencia de ALK presente en su dominio extracelular (aa 396-406) fue identificada. De manera importante, esta secuencia no es compartida con LTK, el RTK más estrechamente relacionada a ALK. Esta región de enlace al ligando está también conservada en el homólogo potencial de ALK en drosofila (Loren 2001) . ALK es fosforilada rápidamente después del enlace a PTN (Bowden 2002) . Además, se ha mostrado que ALK es estimulada por la pleyotrofina en el cultivo celular. Esto hace particularmente interesante a la interacción pleyotrofina/ALK a la luz de las implicaciones patológicas que la pleyotrofina tiene (Stoica 2001) . Las lineas celulares que carecen de expresión de ALK también fallan en mostrar una respuesta de crecimiento a la pleyotrofina y viceversa (Stoica 2001) . In vivo, los niveles elevados de pleyotrofina en el suero de pacientes que sufren de diversos tumores sólidos han sido demostrados, y los estudios en animales han sugerido una contribución de la pleyotrofina al crecimiento tumoral (Stoica 2001) . El papel de PTN como factor angiogénico limitante de la velocidad en el crecimiento tumoral es bien establecido en modelos animales (Choudhuri 1997) . En 1996 Czubayko et al. (Czubayko 1996) demostraron la importancia de PTN en la angiogénesis tumoral, en la prevención de la apoptosis y la metástasis mediante la modulación de los niveles de PTN con un procedimiento de dirección a la ribozima. Las mediciones de los niveles séricos de PTN en ratones demostraron una correlación clara con el tamaño del tumor. PTN juega un papel significativo en algunos de los tipos de cáncer más agresivos tales como melanoma y cáncer pancreático dando de este modo perspectivas interesantes para aplicaciones posteriores potenciales de un inhibidor de ALK (Weber 2000; Stoica 2001) . En pacientes humanos, fueron encontrados niveles elevados de pleyotrofina en suero en pacientes con cáncer pancreático (n = 41; P<.0001) y cáncer de colon (n = 65; P = .0079) . En individuos saludables, PTN es expresado de una manera fuertemente regulada durante el desarrollo de los órganos peritoneales y en poblaciones selectivas de neuronas y la glia en el adulto. La coexpresión de PTN y ALK, como se encuentra en varias lineas de células cancerígenas, indica que éstos podrían forman un bucle autócrino de estimulación del crecimiento (Stoica 2001) . A pesar de todos estos datos, la literatura dice que esto todavía no es claro si los efectos de PTN son mediados por ALK solo y/o por otros receptores de PTN no identificados (Duyster 2001) . Al menos otros dos receptores potenciales de PTN han sido sugeridos: la t irosina-fosfatasa del receptor RPTP y la heparin-sulfato proteoglicano N-sindecano. No obstante, ?????ß puede actuar como un modulador de señalización de la señalización de PTN/ALK y el N-sindecano como una chaperona para el ligando (Bowden 2002) . Recientemente, otro factor de crecimiento secretado, relacionado a la pleyotrofina llamada midquina (MK) ha sido identificado como un segundo ligando para ALK. Similarmente a PTN, las funciones de enlace y de activación (por ejemplo, la inducción de la formación de colonia de agar suave en cultivo celular) de MK puede ser bloqueada por el mismo anticuerpo surgido contra ALK-ECD (Stoica 2001) . Como la pleyotrofina, la midquina es suprarregulada en muchos tumores, aunque su expresión fisiológica está muy restringida en tejidos normales adultos (Stoica 2002) . El análisis de 47 muestra el tumor de vejiga revelaron que la expresión de MK es significativamente (aproximadamente cuatro veces) aumentada en comparación a los tejidos de vejiga normales. Además, la sobreexpresión pronunciada correlacionada con la pobre supervivencia de los pacientes (O'Brien 1996) . No obstante, la afinidad de MK por ALK es aproximadamente 5 veces menos que aquella de la pleyotrofina (Stoica 2002) . De manera interesante, como con la pleyotrofina, la inhibición de ALK vía las ribozimas también inhibe los efectos de MK en el cultivo celular (Stoica 2002) . Los autores de estos estudios también llegan a la conclusión de que la inhibición de la vía de PTK/MK/ALK abre posibilidades muy atractivas para el tratamiento de diversas enfermedades, algunas de ellas teniendo opciones de tratamiento muy limitadas hasta ahora, tales como, por ejemplo, el glioblastoma y el cáncer pancreático. (Stoica 2002) . En individuos saludables, la expresión del ARNm de ALK se eleva al máximo dentro del periodo neonatal y persiste en adultos en unas pocas porciones seleccionadas del sistema nervioso. Recientemente, la expresión de la proteina ALK fue también detectada en células endoteliales que estaban asociadas a las células neuronales y gliales. La evidencia de que al menos una parte de las actividades malignas descritas para la pleyotrofina son mediadas a través de ALK, vino de los experimentos en los cuales la expresión de ALK fue agotada por un procedimiento de dirección a la ribozima. Tal agotamiento de ALK previno la fosforilación medida por pleyotrofina de la proteina Akt ant i-apoptótica y condujo a una supervivencia prolongada de ratones que habían recibido xenoinj ertos . Por su puesto, el número de células apoptóticas en los injertos tumorales fue significativamente incrementada, cuando la expresión de ALK fue agotada (Powers 2002) . La evidencia de que las actividades malignas descritas para MK son mediadas a través de ALK vinieron de los experimentos con anticuerpos monoclonales dirigidos contra ALK ECD. La adición de una dilución 1:25 del sobrenadante de células hibridomas proveniente de dos anticuerpos anti-ALK ECD, conduce a una disminución significativa en la formación de colonias de las células SW-13 en agar suave (Stoica 2002) . El análisis de diez diferentes líneas celulares reveló que la habilidad para una respuesta de crecimiento a PTN correlacionó perfectamente con la expresión del ARNm de ALK (la siguiente línea celular correspondieron a PTN y se encontró que expresan el ARNm de ALK: HUVEC, NTH3T3, SW-13, Colo357, ME-180, U87, MD-MB 231; Stoica 2001) . De manera interesante, en algunas líneas de cáncer (el cáncer pancreático Colo357, cáncer de mama Hs578T, y glioblastoma U87), PTN y ALK son co-expresados , indicando que PTN y ALK forman un bucle autócrino de estimulación del crecimiento (Stoica 2001) . De manera interesante, PTN y MK han mostrado que provocan suprarregulación transcripcional de la proteina bcl-2 anti-apoptótica (Stoica 2002) . La adición de Akt activado (el cual es un objetivo crucial con dirección 3' de la señalización de ALK aberrante) fosforila el factor pro-apoptótico llamado malo, conduciendo de este modo la disociación de bcl-xl, el cual, cuando es liberado del malo, puede suprimir la apoptosis al bloquear la liberación del citocromo c (ver Bowden 2002 para referencias) . La expresión aberrante de ALK puede ser involucrada en el desarrollo de varios cánceres. No obstante, éste fue primeramente asociado con un subgrupo de linfomas no Hodgkin altamente malignos (NHLs, por sus siglas en inglés), los denominados linfomas de células grandes anaplásicas (ALCLs) . Los linfomas no Hodgkin representan neoplasias clónales que se originan de varias células de origen linfático. La mayoría de los pacientes con subtipo clínico sistémico primario de ALCL tienen la traslocación t2, 5 expresando una proteína de fusión que se une al extremo N de la nucleofosmina (NPM) al extremo C de ALK. La fusión consiste de los aminoácidos 1-117 de NPM fusionado a aa 1058-1620 de ALK y el rompimiento cromosómico está localizado en un intrón localizado entre los exones que codifican para TM y el dominio yuxtamembranal de ALK (Duyster 2001) . NPM-ALK es un transcripto que contiene un ORF de 2040 pares de bases que codifica para una proteina de 680 aminoácidos (Morris 2001) . Este corresponde a un rompimiento en el intrón 4 de NPM, que abarca 911 pares de bases y el intrón 16 de ALK que abarca 2094 pares de bases (Kutok 2002) . Más probablemente la secuencia ALK en esta proteina de fusión es la secuencia mínima requerida para que la proteína conduzca a ALCL (Duyster 2001) . La fusión inversa (ALK-NPM) no es expresada, al menos no en células linfoides (Kutok 2002) . La proteína NPM de tipo silvestre demuestra la expresión ubicua y funciona como un portador de proteínas desde el citoplasma hacia el nucléolo. Como un asunto de hecho, NPM es una proteína nuclear de 38 kDa codificada sobre el cromosoma 5, que contiene un NLS, se enlaza a las proteínas nucleares y se compromete en el tráfico del citoplasma/núcleo (Duyster 2001) NPM es una de las proteínas nucleolares más abundantes y está normalmente presente como un hexámero (Morris 2001) . Lo más importante, NPM sufre normalmente auto-oligomerización (hexámeros) así como hetero-oligomerización con NPM-ALK (Duyster 2001) . La translocación 2; 5 pone la porción del gen ALK que codifica para la tirosina-cinasa del cromosoma 2, bajo el control del promotor NPM fuerte sobre el cromosoma 5, produciendo expresión permanente de la proteína quimérica NPM-ALK (p80) (Duyster 2001) . Por lo tanto, la cinasa ALK es desregulada y ectópica, en términos de tipo celular (linfoide) y de compartimientos celular (núcleo/nucléolo y citoplasma) (Ladanyi 2000) . La localización (citoplasma o núcleo) de NPM parece no afectar su efecto sobre la linfomagénesis (Duyster 2001) . La actividad de tirosina-cinasa aberrante, resultante, dispara la transformación maligna por medio de la fosforilación constitutiva de los objetivos intracelulares . Otras diversas proteínas de fusión de ALK comunes, están asociadas con ALCL . Todas las variantes demuestran el enlace del dominio de la tirosina-cinasa ALK a un promotor alternativo que regula su expresión. Se ha reportado que ALK de longitud completa es también expresado en aproximadamente 92% de las células de neuroblastoma primario y en algunos rabdomiosarcomas (Lamant 2000) . No obstante, no ha sido demostrada hasta ahora ninguna correlación entre la expresión de ALK y la biología tumoral. Este hecho, tomado con untamente con la falta de evidencia respecto a los niveles indicativos de ALK endógenamente fosforilado en estos tumores, sugiere que la expresión de ALK en neuroblastoma refleja su expresión normal en células normales inmaduras en vez de un papel oncogénico primario y ALK en estos tumores no es constructivamente fosforilado, cuestionando de este modo un papel importante para ALK en estos tumores (Duyster 2001; Pulford 2001) . No obstante, la señalización de ALK puede ser importante en al menos algunos neuroblastomas , como es sugerido por Miyake et al., quien encontró la sobreexpresión y la fosforilación constitutiva de ALK debido a la amplificación del gen en las lineas celulares derivadas de neuroblastoma (Miyake 2002) . No obstante, otras lineas celulares derivadas de neuroblastoma no muestran activación constitutiva de ALK, arguyendo de esto modo contra un involucramiento patológico general de ALK (Dirks 2002; Pulford 2004) . De manera más interesante, ALK parece ser importante para el crecimiento del glioblastoma multiforme, un tumor cerebral altamente maligno que ofrece opciones terapéuticas muy limitadas (Powers 2002) . Se ha mostrado que ocurren múltiples alteraciones genéticas en estos tumores devastadores, incluyen la pérdida o las mutaciones de PTEN, p53 e INK4a-ARF. Además, la señalización de RTK juega un papel particularmente importante en el crecimiento y el desarrollo de estos tumores, que sobreexpresan diversos factores de crecimiento tales como PDGF, HGF, NGF y VEGF sugiriendo bucles de señalización de RTK autócrinos. Powers y colaboradores han mostrado la expresión del ARNm y de proteina ALK en muestras tumorales de pacientes con glioblastoma, mientras que las señales no fueron detectables en tejidos cerebral adyacente normal (Powers 2002) . Además, las células de glioblastoma humano U87MG (las cuales son derivadas de un paciente y representan un sistema modelo bien caracterizado para estudiar la tumorigénesis y la señalización en el glioblastoma) muestran comportamiento anti-apoptótico dependiente de ALK en estudios de xenoinjerto. Cuando ALK es agotado en estas células tumorales por el uso de ribozimas, los ratones inyectados con estas células tumorales sobreviven al menos dos veces más que cuando son inyectados con las células tumorales de tipo silvestre, y éstas células tumorales muestran apoptósis drásticamente incrementada. De este modo, ALK y su o sus ligandos proporcionan una señal de supervivencia esencial que es limitante de la velocidad para el crecimiento tumoral de las células U87MG in vivo (Powers 2002) . Estos hallazgos indican que la inhibición de la señalización de ALK podría ser un procedimiento promisorio para mejorar la expectativa de vida de los pacientes con glioblastoma. El glioblastoma multiforme es hasta ahora el tumor glial primario más común y maligno con una incidencia de aproximadamente 2/100' 000/año (aproximadamente 15' 000 casos en los Estados Unidos y en Europa Occidental cada año) . Esto afecta preferentemente los hemisferios cerebrales, pero también puede afectar el daño cerebral (principalmente en niños) o la médula espinal. Los tumores puede manifestarse de novo (glioblastoma primario) o pueden desarrollarse de astrocitomas grado inferior (glioblastoma secundario) . Los glioblastomas primarios y secundarios muestran poco traslape molecular y constituyen diferentes entidades de la enfermedad a nivel molecular. Estas contienen ambas muchas anormalidades genéticas incluyendo la afección de p53, EGFR, MDM2, PDGF, PTEN, pl6, RB . No ha ocurrido ningún avance terapéutico significativo en los últimos 25 años. Las terapias son solamente paliativas y pueden prolongar la expectativa de vida de 3 meses a 1 año. Los pacientes usualmente presentes con déficit neurológico lentamente progresivo, por ejemplo, debilidad motora, síntomas de presión intracraneal, por ejemplo, dolor de cabeza, náusea, vomito, deterioro cognoscitivo o ataques. Los cambios en la personalidad pueden ser también signos tempranos. La etiología de glioblastoma es conocida, los casos familiares representan menos del 1%. El único factor de riesgo consistente identificado es la exposición a productos petroquímicos . El diagnóstico es realizado principalmente por estudios de formación de imagen (CT, NMR) y biopsia. Delimitar completamente la mayoría de los glioblastomas no es ni práctico ni posible debido a que estos tumores no tienen márgenes claramente definidos. Más bien, éstos muestran dependencias bien conocidas a invadir localmente y a dispersarse a lo largo de las vías compactas de la materia blanca. La razón principal por la que no es posible ningún tratamiento curativo es debido a que el tumor está más allá del alcance del control local, cuando es diagnosticado. Los agentes quimioterapéut icos primarios son la carmustina (un agente alquilante) y el cisplatino, pero únicamente 40% de los pacientes muestran cierta respuesta. Aunque existen algunas incert idumbres respecto al papel de ALK en el glioblastoma, esta enfermedad ofrece diversos procedimientos para fármacos dirigidos a ALK. De hecho, para esta enfermedad devastadora incluso un mejoramiento pequeño de las opciones de terapia actuales podría servir una enorme necesidad quimérica. Es importante hacer notar que ya que las células de glioblastoma expresan el ALK de longitud completa, para tratar este cáncer ALK debería ser considerado como un objetivo no solamente para los inhibidores de cinasa de molécula pequeña sino también para los anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo tales como scFvs, por ejemplo, para inducir la apoptosis de las células tumorales. La localización estricta del glioblastoma al Sistema Nervioso Central apoya el uso de scFvs, si éstos pueden ser distribuidos eficientemente al Sistema Nervioso Central (ninguna depuración rápida debida a la compartimentalización, pero mejor penetración del tumor en comparación a los IgGs debido a su tamaño más pequeño) . Los anticuerpos y/o los fragmentos de anticuerpo podrían ser dirigidas contra las secuencias de enlace al ligando de ALK (aa 396-406) o contra otras partes de las partes extracelulares del receptor. La expresión muy limitada de ALK en tejidos saludables bajo condiciones fisiológicas indica que los tumores que expresan ALK pueden ser un objetivo excelente para el tratamiento de la enfermedad utilizando anticuerpos marcados con toxina o marcador radioactivo, y/o fragmentos de anticuerpo, independientemente de si ALK está o no involucrado en la patogénesis de estos tumores. Además de las células de glioblastoma , se ha encontrado que la expresión de ALK con alta significancia en linea celular de melanoma y lineas celulares de carcinoma de mama (sin estar constitutivamente fosforilados ) (Dirks 2002) . El hecho de que una porción grande del dominio extracelular de ALK parezca ser más bien único en el proteoma humano, debería hacer a este procedimiento altamente específico. Los documentos 09515331/US5529925 describen la clonación de secuenciamiento de las secuencias de ácido nucleico humano, que están reacomodadas en la translocación cromosómica t(2;5) (p23,-q35) evento que ocurre en el linfoma humano t(2;5) . Se encontró que el reacomodo pone a las secuencias provenientes del gen de la fosfoproteína nucleolar (el gen NPM) sobre el cromosoma 5q35 a aquellos provenientes de un gen de la tirosina-cinasa proteica previamente no identificada (de aquí en adelante el gen ALK) sobre el cromosoma 2p23. Las secuencias del gen de fusión de la proteína de fusión (gen de fusión NPM/ALK o la proteína, respectivamente) fueron también descritos. La secuencia ALK de longitud completa es patentada en US5770421, titulada "proteína t irosina-cinasa de ALK humana". Además, la patente de los Estados Unidos US6174674B1 titulada "método para detectar un reacomodo cromosómico que involucra un punto de rompimiento en el gen ALK o WPM", describe los cebadores para detectar la secuencia de fusión NPM-ALK en muestras de pacientes. En otra solicitud de patente, US6696548 titulada "proteína tirosina-cinasa ALK/receptor y ligandos de la misma", el uso de ALK para la detección de ligandos de ALK ligandos y anticuerpos que se enlazan a secuencias específicas de ALK, es descrito. Se describe también un método para identificar un agente capaz de enlazarse al polipéptido ALK aislado. Los documentos WO019S394/US2002O034768 describen ALK como receptor de la pleyotrofina . La patente de los Estados Unidos US20040234519 describe los anticuerpos anti-pleyotrofina, y el documento WO200S020684 describe la detección de la pleyotrofina .

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Por tanto, es un objetivo general de la invención proporcionar un anticuerpo o derivado de anticuerpo estable y soluble el cual se enlace a la proteína ALK humana in vitro e in vivo. Más preferentemente, el anticuerpo está específicamente dirigido contra el dominio de enlace al ligando de ALK (aminoácidos 396-406) y por lo tanto bloqueará los efectos biológicos de MK, que tiene una Kd para ALK de aproximadamente 170 pM, así como los efectos biológicos de PTN, que tiene una Kd para ALK de aproximadamente 20-30 pM (Stoica 2002; Stoica 2001). En una modalidad preferida el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo scFv o un fragmento Fab . En lo subsiguiente, el término anticuerpo comprende los anticuerpos de longitud completa así como otros derivados de anticuerpo. Ahora, con el fin de implementar estos y otros objetivos adicionales de la invención, los cuales se volverán más claramente aparentes conforme proceda a la descripción, dicho anticuerpo es manifestado por las características de que éste comprende una cadena pesada variable CDR3 de una secuencia de al menos 50% de identidad a las secuencias de la SEQ. ID. No.: 2. Preferentemente, la identidad secuencial es al menos 60%, 65%, 75%, 85%, o más preferentemente al menos 92%. Lo más preferentemente, el anticuerpo tiene una CDR3 de VH de la secuencia SEQ. ID. No.: 2. En una modalidad, el anticuerpo o la porción del enlace al antígeno del mismo de la invención, se enlaza específicamente a un epitopo particular de la proteína ALK. Tales epitopos residen, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350- 400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650- 700, 700-750, 750-800, 800-900, 900-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, ó 1500-1620 de la proteina ALK, o cualquier intervalo, porción o rango de los mismos. En una modalidad, el anticuerpo o la porción de enlace al antigeno del mismo se enlaza específicamente a un epitopo que comprende, que consiste esencialmente de o un fragmento de la región que abarca los residuos de aminoácidos 391 ± 3 y 406 ± 3 (la SEQ. ID No.: 91 muestra los residuos de aminoácidos 388 al 409 de la proteína ALK humana), preferentemente los aminoácidos 391-406 (SEQ. ID. No.: 1) de la proteína ALK (SEQ ID No.: 1). Se entiende que el intervalo indicado no debe ser considerado como poseedor de límites agudos, sino que el anticuerpo o la porción de enlace al antígeno del mismo, puede enlazarse o enlazarse parcialmente en una región cercanamente situada a o dentro del dominio de enlace al ligando de ALK. Preferentemente, los anticuerpos o los derivados de anticuerpo se enlazan un epitopo de la proteína ALK de 10 a 20 aminoácidos de longitud. En otra modalidad, el anticuerpo o la porción de enlace al antígeno del mismo, puede ser caracterizada como que se enlaza específicamente a una proteína ALK con una KD de al menos aproximadamente 10 x 10"6 M. En una modalidad particular, el anticuerpo o la porción de enlace al antígeno del mismo se enlaza específicamente a una proteína ALK (o fragmento de la misma) con una KD de al menos aproximadamente 10 x 10"7 M, al menos aproximadamente 10 x 10"8 M, al menos aproximadamente 10 x 10"9 M, al menos aproximadamente 10 x 10" 10 M, al menos aproximadamente 10 x 10"11 M, o al menos aproximadamente 10 x 10~12 M o una KD aún más favorable. En otras diversas modalidades, el anticuerpo o la porción de enlace al antígeno del mismo, incluye una región de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o más preferentemente al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable como se describe en la SEQ ID No. : 4. En otras modalidades, el anticuerpo o la porción de enlace al antígeno del mismo incluye una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más preferentemente al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable como se describe en la SEQ ID NO. : 5. En otras modalidades adicionales, el anticuerpo o la porción de enlace al antígeno del mismo incluye una región de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o más preferentemente al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable como se describe en la SEQ ID No. : 4 y una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más preferentemente al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable como se describe en la SEQ ID NO. : 5. En otras ciertas modalidades, el anticuerpo o la porción de enlace al antigeno del mismo se enlaza específicamente a un epitopo que se traslapa con un epitopo enlazado por un anticuerpo o derivado de anticuerpo de ESBA521 (SEQ. ID. No.: 19) y/o compite por el enlace de una proteína ALK, o porción de la misma, con un anticuerpo o derivado de anticuerpo de ESBA521. En una modalidad relacionada, el anticuerpo o la porción de enlace al antígeno del mismo, se enlaza específicamente a un epitopo que incluye los residuos 391-406 (SEQ ID NO: 1) de una proteína ALK, o porción de la misma. Las regiones de cadena pesada y ligera variables de los anticuerpos o las porciones de enlace al antígeno de los mismos, incluyen típicamente una o más regiones de determinación de la complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) . Estas incluyen las regiones CDR1, CDR2, y CDR3. En modalidades particulares, las CDRs de cadena pesada variable son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, o más preferentemente 100% idénticas a una CDR de un anticuerpo ESBA521. En otras modalidades particulares, las CDRs de cadena ligera variable son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, o más preferentemente 100%, idénticas a una CDR de una región de cadena ligera variable del anticuerpo ESBA521. En consecuencia, los anticuerpos particulares o fragmentos de la invención comprenden una región de cadena pesada o variable que incluye una o más regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, o más preferentemente 100%, idénticas a una CDR de una región de cadena pesada variable del ESBA521, y una región de cadena ligera variable que incluye una o más CDRs que son al menos 80%, 85%, 90%, 95% o más preferentemente 100%, idénticas a una CDR de una región de cadena ligera variable del anticuerpo ESBA521. La región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de enlace al antigeno de los mismos, pueden también incluir las tres CDRs que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, o más preferentemente 100%, idénticas a las CDRs de la región de cadena pesada variable del anticuerpo ESBA521 y/o las tres CDRs que son al menos 80%, 85%, 90%, 95% o más preferentemente 100%, idénticas a las CDRs de la región de cadena ligera variable del anticuerpo ESBA521. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos o las porciones de enlace al antigeno de los mismos, (a) incluyen una región variable de cadena pesada que es codificada por o derivada de (por ejemplo, es el producto de) un gen VH humano (por ejemplo, tipo H3); y/o (b) incluyen una región variable de cadena ligera que es codificada por o derivada de un gen kappa o lambda V humano (por ejemplo, tipo lambda 1) . Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, anticuerpos monoclonales que incluyen un dominio efector, (por ejemplo, un dominio Fe) , asi como las porciones de anticuerpo o fragmentos, tales como los anticuerpos de cadena simple y fragmentos Fab . Los anticuerpos pueden también ser enlazados a una variedad de agentes terapéuticos (por ejemplo, agentes anticancerigenos , quimioterapéuticos o toxinas), y/o un marcador (por ejemplo, un radiomarcador) . En otro aspecto más, la invención caracteriza los ácidos nucleicos aislados que incluyen una secuencia que codifica para una región variable de la cadena pesada del anticuerpo, que es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o más preferentemente al menos 99%, idéntica a la SEQ ID No.: 22. La invención también caracteriza los ácidos nucleicos asilados que incluyen una secuencia que codifica para una región variable de la cadena ligera del anticuerpo, que es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o más preferentemente al menos 99%, idéntica a la SEQ ID No.: 21. La invención también caracteriza los vectores de expresión que incluyen cualquiera de los ácidos nucleicos anteriores, ya sea solos o en combinación (por ejemplo, expresados a partir de uno o más vectores), así como las células hospederas que comprenden tales vectores de expresión. Las células hospederas adecuadas para los anticuerpos de expresión de la invención incluyen una variedad de células eucarióticas, por ejemplo, células de levadura, células de mamífero, por ejemplo, células de ovario de hámster Chino (CHO) , células NSO, células de mieloma, o células vegetales. Las moléculas de la invención pueden también ser expresadas en células procarióticas , por ejemplo E. coli. La invención también caracteriza los métodos para elaborar los anticuerpos o porciones de enlace al antígeno de los mismos mediante expresión de los ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos en una célula hospedera (por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican para la porción de la región de enlace al antígeno de un anticuerpo) . En otro aspecto más, la invención caracteriza un hibridoma o transfectoma que incluye los ácidos nucleicos anteriormente mencionados. En otra modalidad más, la invención proporciona un antígeno que comprende un epitopo de la proteína ALK, preferentemente del dominio de enlace al ligando de PTN, más preferentemente un fragmento que comprende, que consiste esencialmente de o un fragmento de la región que abarca los residuos de aminoácidos 391 ± 3 y 406 ± 3 (ver SEQ. ID No. : 91 que muestra los residuos de aminoácidos 388 al 409 de la proteina ALK humana), lo más preferentemente los aminoácidos 391-406 (SEQ. ID. No. : 1) . El antigeno puede ser utilizado para elevar, seleccionar o detectar la presencia de un anticuerpo anti-ALK o puede ser utilizado como un agente en inmunoterapia activa, por ejemplo, como una vacuna. Como una vacuna, el antigeno puede ser utilizado solo o en combinación con un adyuvante o hapteno apropiado, por ejemplo, mezclado, conjugado, ya sea químicamente o genéticamente. El antígeno, cuando se utiliza para la inmunoterapia activa puede ser también utilizado en combinación con la inmunoterapia pasiva, por ejemplo, con cualquiera de los anticuerpos anti-ALK descritos en la presente, o en combinación con una preparación monoclonal o policlonal de los anticuerpos anti-ALK, por ejemplo, la gammaglobulina sérica proveniente de un donador seropositivo . En otra modalidad más, las moléculas de anticuerpo (o las regiones de enlace a VL y VH) son completamente humanas. El tratamiento de los humanos con anticuerpos monoclonales humanos ofrece varias ventajas. Por ejemplo, es próbable que los anticuerpos sean menos inmunogénicos en humanos que los anticuerpos no humanos. La terapia es también rápida debido a que la inactivación de ALK puede ocurrir tan pronto como el anticuerpo llega a un sitio de cáncer (donde ALK es expresado) . Por lo tanto, en una modalidad relacionada, el anticuerpo es un anticuerpo scFv, por ejemplo, ?3???21 o un anticuerpo que comprende una o varias regiones VL y/o VH (o las CDRs de las mismas; por ejemplo, VL CDR3 (SEQ ID No.:3) y/o VH CDR3 (SEQ ID No.: 2)) de ESBA52 1 . Los anticuerpos humanos también se localizan en sitios apropiados en humanos más eficientemente que los anticuerpos no humanos. Además, el tratamiento es especifico para ALK, es recombinante y altamente purificado y, de manera contraria a las terapias tradicionales, evita el potencial de ser contaminado con agentes adventicios. Alternativamente, los anticuerpos y derivados de anticuerpo de la presente invención pueden ser producidos mediante síntesis química. En otra modalidad más, la invención proporciona las composiciones para tratar el cáncer (o la elaboración de un medicamento adecuado) que puede prevenir la neoplasia en un sujeto, mediante competencia con los ligandos de ALK tales como la midquina (MK) y/o la pleyotrofina (PTN) y con esto bloquea la señalización de ALK mediada por tales ligandos. Tal composición puede ser administrada sola o en combinación con los agentes anticancerígenos reconocidos en la técnica, por ejemplo, el metotrexato, y similares. El anticuerpo de la invención y/o la vacuna de ALK puede ser utilizado solo o en combinación con un agente terapéutico conocido, por ejemplo, un agente anticancerigeno, por ejemplo, metotrexato y similares. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La invención será mejor comprendida y los objetivos diferentes a aquellos descritos anteriormente se volverán aparentes cuando se dé consideración a la siguiente descripción detallada de la misma. Tal descripción hace referencia a las figuras anexas, en donde: Figura 1 muestra un esquema de la proteína ALK humana utilizada. Un péptido de 16 aminoácidos del sitio de enlace a PTN (con líneas discontinuas) es utilizada como el epitopo en una selección de dos híbridos para los enlazadores de scPv. Figura 2 muestra la repartición aleatoria gradual de las porciones CDR3 de VH, CDR 3 de VL y CDR 2 de VH para obtener ESBA521 como enlazador secundario, y un grupo de scFvs como enlazadores terciarios (ver Tabla 1) . X significa cualquier residuo de aminoácido. La figura 3 muestra un experimento de ELISA en donde las características de enlace de los scFvs mejorados son comparadas a aquella de la estructura de la que se originan . La figura 4 muestra la inmunotinción de células HeLa transitoriamente transíectadas , con ESBA521 (paneles izquierdo) y un anticuerpo específico de ALK policlonal (paneles derechos). Panel intermedio: las mismas células visualizadas mediante microscopía de luz. La figura 5 muestra un experimento de ELISA que compara el ESBA512 a los enlazadores terciarios mejorados.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Con el fin de que la presente invención pueda ser más fácilmente entendida, son primeramente definidos ciertos términos .

DEFINICIONES El término "ALK" y "Alk-1" incluye la proteína ALK humana codificada por el gen de ALK (cinasa de linfoma anaplástico) que es una proteína tirosina cinasa (PTK) que abarca la membrana/receptor. El término "anticuerpo" se refiere a los anticuerpos enteros y cualquier fragmento de enlace al antígeno (por ejemplo, "la porción de enlace al antígeno", "el polipéptido de enlace al antígeno" o "el inmuno-enlazador") o la cadena simple de los mismos. Un "anticuerpo" se refiere a una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlace disulfuro, o una porción de enlace al antigeno de los mismos. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden ser además subdivididas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones de determinación de la complementariedad (CDR) , intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR) . Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y de cuatro FRs, acomodadas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de enlace que interactúa con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedero, incluyendo las diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, las células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento.

El término "porción de enlace al antigeno" de un anticuerpo (o simplemente la "porción del anticuerpo") se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la habilidad para enlazarse específicamente a un antígeno (por ejemplo, ALK) . Se ha mostrado que la función de enlace al antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término "porción de enlace al antígeno" de un anticuerpo, incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente, que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo simple de un anticuerpo, (v) un dominio simple o fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región de determinación de la complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinación de dos o más CDRs aisladas que pueden ser opcionalmente unidas por un ligador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, éstos pueden ser unidos, utilizando métodos recombinantes , por un ligador sintético que hace posible que éstos sean hechos como una cadena de proteína simple en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como cadena simple Fv (scFv) ; ver por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 85:5879-5883) . Tales anticuerpos de cadena simple están también destinados a ser abarcados dentro del término "porción de enlace al antigeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos son obtenidos utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellos de experiencia en la materia, y los fragmentos son seleccionados para utilidad de la misma manera que son los anticuerpos intactos. Las porciones de enlace al antigeno pueden ser producidas mediante técnicas de ADN recombinantes , o mediante escisión enzimática o química de las inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden ser de isotipo diferentes, por ejemplo, una IgG (por ejemplo, un subtipo IgGl, IgG2, IgG3, ó IgG4, o el anticuerpo IgAl, IgA2, IgD, IgE, ó IgM. El término "estructuras" se refiere a las porciones reconocidas en la técnica de una región variable del anticuerpo que existen entre las regiones CDR más divergentes. Tales regiones estructurales son típicamente denominadas como estructuras 1 a la 4 (FR1, FR2, FR3, y FR4 ) y proporcionan un andamiaje para la retención, en el espacio tridimensional, de las tres CDRs encontradas en una región variable del anticuerpo de cadena pesada o ligera, tal que las CDRs pueden formar una superficie de enlace al antigeno. Tales estructuras pueden ser también denominadas como andamiajes, ya que éstos proporcionan apoyo para la presentación de CDRs más divergentes. Otras CDRs y estructuras de la superfamilia de inmunoglobulina, tales como repeticiones de anquirina y fibronectina, pueden ser utilizadas como las moléculas de enlace al antigeno (ver también, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,300,064, 6,815,540 y Publicación de los Estados Unidos No. 20040132028) . El término "epitopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio sobre un antigeno al cual se enlaza específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo (por ejemplo, ALK, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 391-406 de ALK-1 humana (ver por ejemplo, la SEQ ID No.: 1). Un epitopo incluye típicamente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Ver por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Los términos "enlace específico", "enlace selectivo" "se enlaza específicamente" y "se enlaza específicamente" se refieren al enlace del anticuerpo a un epitopo sobre un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se enlaza por una afinidad (KD) de aproximadamente menos de 10~7 M, tal como aproximadamente menos de 10"8 M, 10~9 M ó 10"10 M o incluso menor.

El término "KD, " se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción anticuerpo-antigeno particular. Típicamente, los anticuerpos de la invención se enlazan a ALK con una constante de equilibrio de disociación (KD) de al menos aproximadamente 10~7 M, tal como menos de aproximadamente 1CT8 M, 10~9 M ó 10~10 M ó aún menos, por ejemplo, como es determinado utilizando tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento BIACORE. Los términos "neutraliza ALK", "inhibe ALK" y "bloquea ALK" son utilizados intercambiablemente para referirse a la habilidad de un anticuerpo de la invención para prevenir que ALK interactúe con uno o más ligandos objetivo y, por ejemplo, dispare la transduccion de la señal. El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a las moléculas de ADN y moléculas de ARN . Una molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero preferentemente es ADN de doble hebra. Un ácido nucleico está "operablemente enlazado" cuando éste es colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o aumentador está operablemente enlazado a una secuencia de codificación si éste afecta la transcripción de la secuencia. Para los ácidos nucleicos, el término "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando son óptimamente limpiados y comparados, son idénticos, con inserciones o supresiones nucleotidicas apropiadas, en al menos aproximadamente 80% de los nucleótidos, usualmente al menos aproximadamente 90% a 95%, y más preferentemente al menos aproximadamente 98% a 99.5% de los nucleótidos. Alternativamente, existe homología sustancial cuando los segmentos se hibridarán bajo condiciones de hibridación selectiva, al complemento de la hebra. Tales condiciones de hibridación son conocidas en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. infra . La identidad porcentual entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios vacíos, y la longitud de cada espacio vacío, que necesitan ser introducidos para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación de la identidad porcentual entre las dos secuencias puede ser lograda utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes siguientes . La identidad porcentual entre dos secuencias de nucleótidos puede ser determinada utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG, utilizando NWSgapdna. La matriz CMP y un peso de espacio vacío de 40, 50, 60, 70, ó 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. La identidad porcentual entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos puede ser también determinada utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989) ) que ha sido incorporado en el algoritmo ALIGN (versión 2.0), utilizando la tabla de residuo de peso PAM120, una penalidad de longitud gap de 12 y una penalidad gap de 4. Además, la identidad porcentual entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinada utilizando el algoritmo de Needle-man y Wunsch (J. Mol. Biol. (48) :444-453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, ya sea utilizando la matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso o ponderación por gap de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4 y un peso o ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. Las secuencias de ácido nucleico de proteina de la presente invención pueden además ser utilizadas como una "secuencia problema" para realizar una búsqueda contra las bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar las secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden ser realizadas utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et a.l. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótido BLAST pueden se realizadas con el programa NBLAST, calificación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias nucleot idicas homologas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteina BLAST pueden ser realizadas con el programa XBLAST, calificación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencia de aminoácidos homologas a las moléculas de proteina de la invención. Para obtener las alineaciones con espacio vacio para fines de comparación, BLAST con espacio vacio puede ser utilizado como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17) : 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST (BLAST con espacio vacio) , pueden ser utilizados los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) . La presente también abarca las "modificaciones de la secuencia conservadora" de las secuencias descritas en las SEQ ID Nos. de la presente invención, por ejemplo, las modificaciones de las secuencias nucleot idicas y de aminoácidos que no abrogan el enlace del anticuerpo codificado por la secuencia nucleot idica , o que contienen la secuencia de aminoácidos, al antigeno. Tales modificaciones de secuencia conservadora, incluyen sustituciones de nucleótidos y de aminoácidos, adiciones y supresiones de los mismos. Por ejemplo, las modificaciones pueden ser introducidas mediante técnicas estándares conocidas en la materia, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen una en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptofano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina , metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina , triptofano, histidina) . De este modo, un residuo de aminoácidos no esencial predicho en un anticuerpo anti-ALK humano, es preferentemente reemplazado con otro residuo de aminoácido proveniente de la misma familia de cadena lateral. Los métodos de identificación de las sustituciones conservadoras de nucleótidos y de aminoácidos que no eliminan el enlace al antigeno son bien conocidos en la materia (ver, por ejemplo Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993) ; Kobayashi et al. Proteina Eng. 12 (10) : 879-884 (1999) ; y Burks et al. Proc. Nati. Acad. Sci Estados Unidos 94:412-417 (1997) ) . Alternativamente, en otra modalidad más, las mutaciones son aleatoriamente introducidas a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación del anticuerpo anti-ALK tal como mediante mutagénesis de saturación, y los anticuerpos anti-ALK modificados, resultantes pueden ser seleccionados para la actividad de enlace. Una "secuencia de consenso" es una secuencia formada a partir de los aminoácidos que aparecen más frecuentemente (o nucleótidos) en una familia de secuencias relacionadas (Ver por ejemplo, innaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987) . En una familia de proteínas, cada posición en la secuencia de consenso es ocupada por el aminoácido que aparece más frecuentemente en esa posición en la familia. Si los dos aminoácidos aparecen de manera igualmente frecuente, pueden ser incluidos en la secuencia de consenso. Por referencia en las tablas y las Figuras proporcionadas en la presente, una secuencia de consenso para la región variable de cadena pesada/ligera de anticuerpo CDR(s) puede ser derivada por alineación óptima de las secuencias de aminoácidos de las CDRs de la región variable de los anticuerpos, que son reactivas contra el epitopo 390-406 de la proteína ALK-1 humana. El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligado. Un tipo de vector es un "plásmido" que se refiere a un bucle de AND de doble circular, dentro del cual pueden ser ligados segmentos de AND adicionales. Otro tipo más de vectores es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados dentro del genoma viral. Ciertos vectores son capaces de realizar la replicación autónoma en una célula hospedera dentro de la cual éstos son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episómicos) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episódicos) pueden ser integrados dentro del genoma de una célula hospedera después de la introducción dentro de la célula hospedera, y con esto son replicados junto con el genoma del hospedero. El término "célula hospedera" se refiere a una célula dentro de la cual ha sido introducido un vector de expresión. Las células hospederas pueden incluir células bacterianas microbianas vegetales y animales. Las bacterias, las cuales son susceptibles a la transformación, incluyen miembros de las enterobacteriaceae, tales como las cepas de Escherichia coli o Salmonella ; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis ; Pneumococcus ; Streptococcus , y Haemophilus influenzae . Los microbios adecuados incluyen Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris . Las líneas de células hospederas animales adecuadas incluyen células CHO (líneas de ovario de hámster Chino) y NSO. Los términos "tratar", "trato" y "tratamiento" se refieren a las medidas terapéuticas o preventivas descritas en la presente. Los métodos de "tratamiento" emplean la administración a un sujeto, en necesidad de tal tratamiento, de un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, un sujeto que tiene un trastorno mediado por ALK o un sujeto quien al final puede adquirir tal trastorno, con el fin de prevenir, curar, retardar, reducir la severidad de, o mejorar uno o más síntomas del trastorno o el trastorno recurrente, o con el fin de programar la supervivencia del sujeto más allá de lo que se espera en ausencia de tal tratamiento. El término "trastorno mediado por ALK" se refiere a los estados de enfermedades y/o los síntomas asociados con cánceres o tumores mediados por ALK. En general, el término "trastornos mediados por ALK" se refiere a cualquier trastorno, el inicio, progresión o la persistencia de los síntomas del cual requieren la participación de ALK. Los trastornos mediados por ALK ejemplares, incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, cáncer, en particular, glioblastoma . El término "dosis efectiva" o "dosificación efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcialmente el efecto deseado. El término "dosis terapéuticamente efectiva" es definido como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya sufre de la enfermedad. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad del trastorno que se trate y del estado general del sistema inmunitario del propio paciente. El término "sujeto" se refiere a cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los métodos y composiciones de la presente invención pueden ser utilizados para tratar a un sujeto con un cáncer, por ejemplo, glioblastoma . A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el que es comúnmente entendido por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden ser utilizados en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales adecuados son descritos más adelante. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se pretende que sean limitantes. Diversos aspectos de la invención son descritos con detalle adicional en las siguientes subsecciones . Se debe entender que las diversas modalidades, las preferencias y los intervalos pueden ser combinados a voluntad. Además, dependiendo de la modalidad específica, pueden no aplicar definiciones, modalidades o intervalos seleccionados. La presente invención proporciona, en un primer aspecto, un anticuerpo que se enlaza a la proteina ALK humana, el anticuerpo comprende una cadena pesada variable CDR3 de una secuencia con al menos 50% de identidad secuencial a la secuencia de la SEQ. ID. No. : 2. Preferentemente, la identidad secuencial es al menos 60%, 70%, 75%, 80%, o más preferentemente al menos 90%. Lo más preferentemente, la CDR3 tiene la secuencia precisa de la SEQ. ID. No. : 2. En una modalidad preferida de la presente invención, el anticuerpo se enlaza específicamente a la proteína ALK humana, por ejemplo, ésta no se enlaza a la proteína ALK de ratón, cuyo sitio de enlace a PTN difiere únicamente en 2 residuos de aminoácidos en comparación al sitio de enlace a PTN (SEQ. ID. No.: 1) de la proteína ALK humana. La isoleucina humana en la posición 3 es una valina y el aspartato es una alanina en la secuencia de ratón correspondiente . El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo de longitud completa, pero también un fragmento de anticuerpo, tal como por ejemplo, un fragmento scFv o Fab. Los fragmentos de enlace al antígeno son bien conocidos en la técnica. Preferentemente, es utilizado un anticuerpo scPv. La cadena pesada y la cadena ligera están compuestas de secuencias estructurales, cada una comprendiendo tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, las cuales están predominantemente involucradas en el enlace al antigeno. El anticuerpo de la presente invención comprende el dominio VH del tipo H3 y un dominio VL del tipo lambda 1. La estructura VH y VL del anticuerpo de la presente invención es estable y soluble para ser funcional en un ambiente reductor intracelular . Preferentemente, éste está en estructura 4.4, que ha sido previamente aislada por un sistema de selección de levadura denominado como el "sistema de control de calidad" (Auf der Maur et al., 2001; Auf der Maur et al. 2004) . La secuencia de la estructura puede ser deducida por ejemplo de la SEQ. ID. No. : 20 (ver más adelante) , donde las porciones estructurales son representadas por letras no subrayadas y rectas, mientras que las secuencias de CDR están subrayadas y las secuencias ligadoras están en cursivas. El anticuerpo de la presente invención es capaz de enlazarse a un péptido epitopo ALK de 16-aminoácidos de una secuencia que es al menos 75%, preferentemente 80%, 85%, 90%, 95%, o lo más preferentemente 100%, idéntica a la secuencia de la SEQ. ID. No.: 1. Esta secuencia es también denominada como sitio de enlace a PTN es una secuencia única en el genoma humano completo. La secuencia de ratón correspondiente varia en 2 de 16 aminoácidos, por ejemplo, V en la posición 3 y A en la posición 7 en vez de I ó D, respectivamente. Preferentemente, el anticuerpo de la presente invención se enlaza a la ALK humana pero no de ratón, por ejemplo, es especifico para la proteina humana. El epitopo de ALK que comprende aproximadamente los residuos 391-406 o que consiste de estos residuos es únicamente adecuado para seleccionar un anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno que puede enlazarse específicamente a ALK y bloquear o inhibir la actividad mediada por ALK. Este epitopo está bien adecuado para seleccionar o producir anticuerpos que bloquean específicamente la actividad de ALK. De este modo, este epitopo, especialmente un epitopo que comprende aproximadamente los residuos 391-406 o que consiste de aproximadamente estos residuos, es únicamente adecuado para el uso como un agente inmunoterapéutico activo o vacuna como se describe adicionalmente en la presente. El anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad para el péptido epitopo de ALK con una Kd de 30 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos, lo más preferentemente menos de 3 nM. En otra modalidad más de la presente invención, el anticuerpo que comprende una CDR3 de cadena ligera variable de una secuencia con al menos 50% de identidad secuencial a la secuencia SEQ. ID. No.: 3. Preferentemente, la identidad secuencial es al menos 60%, 70%, 80%, 85%, más preferentemente al menos 90%. Lo más preferentemente, la CDR3 es idéntica a la SEQ. ID. No.: 3. Nuevamente, este anticuerpo se enlaza a un péptido epitopo de ALK de 16 aminoácidos de una secuencia con al menos 75%, preferentemente 80%, 85%, 90%, 95%, o lo más preferentemente 100%, de identidad secuencial a la secuencia SEQ. ID. No. : 1. También, el anticuerpo tiene una afinidad para el péptido epitopo de ALK con una Kd de menos de 10 nM, preferentemente de menos de 7 nM. En una modalidad preferida de la presente invención, el anticuerpo comprende una secuencia VH de la SEQ. ID. No. : 4 y una secuencia VL de la SEQ. ID. No. : 5. Además, ésta puede comprender al menos una mutación en al menos una de las CDRs dando como resultado una mayor afinidad, caracterizada por una Kd de menos de aproximadamente 3 nM. Al menos una mutación está preferentemente en CDR1 ó CDR2 de VH y/o VL, lo más preferentemente en CDR2 de VH. En otra modalidad preferida de la presente invención, el anticuerpo comprende una CDR2 de cadena pesada variable que comprende una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ. ID. No. : 7, SEQ. ID. No. : 8, SEQ. ID. No. : 9, SEQ. ID. No.: 10, SEQ. ID. No. 11, SEQ. ID. No. : 12, o la SEQ. ID. No. : 13. Preferentemente, estas secuencias de CDR2 definidas son precedidas por los residuos de aminoácidos AI y seguido por las secuencias de la SEQ. ID. No. : 17, de modo que la CDR2 completa es definida.

Un anticuerpo preferido de la presente invención, comprende una secuencia VH de la SEQ. ID. No. : 4 y una secuencia VL de la SEQ. ID. No. : 5. En los anticuerpos scFv, la estructura de dominio puede ser NH2-VL-ligador-VH-COOH ó NH2-VH-ligador-VL- COOH; preferentemente, el ligador tiene la secuencia de la SEQ. ID. No. : 16. Alternativamente, las regiones variables representadas por las SEQ ID Nos. : 4 y 5 pueden ser manipulados por ingeniería genética en un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, IgG ó IgM. Las regiones constantes, adecuadas para combinarse con las regiones variables de la invención son conocidas en la técnica . Dentro del alcance de la presente invención, está el uso del anticuerpo o el derivado de anticuerpo como un medicamento o como una herramienta de diagnóstico. Preferentemente, la producción de un medicamento para el tratamiento de los cánceres o tumores es considerada. Para este propósito, un anticuerpo debe ser radiomarcado utilizando radionúclidos o marcación radiometálica . Esto es particularmente valioso para la dirección de tumores, la formación de imágenes y estudios de biodistribución . También, la tecnología de AND recombinante hace posible fusionar genéticamente las regiones de codificación de los genes V variables a los dominios de toxina modificados. Por ejemplo, una fusión de scPv-toxina en donde scFv es específico para una proteína marcadora tumoral, puede dirigir la toxina hacia el tumor, donde la toxina provoca citotoxicidad . Tal terapia dirigida da como resultado la concentración selectiva de agentes citotóxicos por radionúclidos en tumores, y debe disminuir la toxicidad a tejidos normales. En una modalidad preferida de la presente invención, el anticuerpo es utilizado para un tratamiento de los cánceres o tumores, preferentemente neuroblastoma , glioblastoma , rabdomiosarcoma , carcinoma de mama, melanoma, cáncer pancreático, linfoma no Hodgkin de células B, carcinoma de la tiroides, carcinoma pulmonar de células pequeñas, retinoblastoma , sarcoma de Ewing, cáncer de próstata, cáncer de colon o cáncer pancreático, preferentemente glioblastoma, neuroblastoma y rabdomiosarcoma. La expresión de ALK y la proteína ha sido detectada en muchos tumores de tejido suave (Li et al., 2004) . ALK de longitud completa ha sido encontrado en estos tumores humanos. Además, el anticuerpo es preferentemente utilizado para tratamientos locales. Lo más preferido es el tratamiento local del glioblastoma. Otro aspecto más de la presente invención, es proporcionar una secuencia de ADN que codifica para el anticuerpo de la presente invención. Un vector de expresión procariótico adecuado para ESBA512 (SEQ. ID. No.: 19) es pTFT74 (ver SEQ. ID. No. : 90 para la secuencia que incluye la secuencia de codificación de ESBA512) . En la presente, la secuencia de codificación de ESBA512 está bajo el control del promotor T7 y el producto génico recombinante es usualmente purificado sobre cuerpos de inclusión. Otro vector de expresión procariótico preferido es pAK400, en donde la secuencia de ESBA512 está marcada con his para la purificación simplificada (ver la SEQ. ID. No: 89 para la secuencia que incluye la secuencia de codificación de ESBA512) . El producto génico es secretado por la célula hospedera hacia el periplasma. Además, el vector de expresión que comprende dicha secuencia de ADN y una célula hospedera adecuada, transformada con el vector de expresión, es proporcionada. Preferentemente, la célula hospedera es una célula de E. coli Otro aspecto más de la presente invención es la producción del anticuerpo de la presente invención, que comprende cultivar la célula hospedera que es transformada con el vector de expresión para el anticuerpo, bajo condiciones que permiten la síntesis del anticuerpo y la recuperación de éste a partir del cultivo. Otro aspecto más de la presente invención es proporcionar un epitopo de ALK, que comprende o que consiste esencialmente de los residuos 391-406 de la SEQ ID No. : 1. El epitopo es adecuado para identificar, seleccionar o producir anticuerpos anti-ALK o fragmentos de los mismos.

Preferentemente, el anticuerpo o el fragmento del antígeno del mismo que es capaz de enlazarse específicamente a los residuos 391-406 (SEQ ID No.: 1) de una proteína ALK aislado o fragmento de la misma. Lo más preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple (scFv), el fragmento Fab, IgG, ó IgM. En un aspecto adicional, una vacuna de ALK que comprende una proteína ALK aislada o un fragmento de la misma, o un ácido nucleico que codifica para un epitopo de ALK es proporcionada. Preferentemente, la vacuna comprende los residuos 391-406 de una proteína ALK aislada. Dicha vacuna es preferentemente formulada con un portador, adyuvante y/o hapteno para mejorar la respuesta inmunitaria. Las secuencias de la presente invención son las siguientes: SEQ. ID. No. : 1: GRIGRPDNPFRVALEY El péptido epitopo de ALK humana (aminoácidos 391-406 de la proteína ALK) ; los residuos subrayados son diferentes en el homólogo de ratón.

SEQ. ID. No.: 2: RDA LDVLSDGFDY CDR 3 de ESBA521 de VH . Los residuos obtenidos después de la aleatorización están subrayados.

SEQ. ID. No. : 3 ATWDNDKWGW CDR 3 de ESBA521 de VL. Los residuos obtenidos después de la aleatorización están subrayados.

SEQ. ID. No. : 4 : EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS VRQAPGKGLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAWLDVLSDGFDYWGQ GTLVTVSS VH de ESBA521. Las CDRs están subrayadas.

SEQ. ID. No. : 5 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPS GIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCATWDNDK VVFGGGTKLEVLG VL de ESBA521. Las CDRs están subrayadas.

SEQ. ID. No. : 6: AISGSGGSTYYADSVKG CDR 2 de VH de ESBA521 SEQ. ID. No. : 7 : AINMKGNDRYYADSVGK CDR 2 de VH de scFv 265.1 SEQ. ID. No. : 8 : AIRTNSKEYYADSVKG CDR 2 de VH de scFv 43.2 SEQ. ID. No. : 9 AIKTDGNHKYYADSVKG CDR 2 de VH de scFv 100.2 SEQ. ID. No. : 10 : RTDSKEQYYADSVKG CDR 2 de VH de scFv 2.11 SEQ. ID. No . : 11 : ETSSGSTYYADSVKG CDR 2 de VH de scPv 28.11 SEQ. ID. No.: 12: NTGGGSTYYADSVKG CDR 2 de VH de scFv 33.11 SEQ. ID. No. : 13: NTRGQNEYYADSVKG CDR 2 de VH de scFv 4.12 SEQ. ID. No. : 16: GGGGSGGGGSGGGGSSGGGS Ligador que conecta a VL y VH SEQ. ID. No. : 17 : YYADSVKG Mitad C-terrainal de CDR2 de ESBA521 y sus derivados.

SEQ. ID. No.: 18: DAGIAVAGTGFDY CDE3 de VH de PW .4 SEQ. ID. No.: 19: QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVS YQQLPGTAPQLLIYDNTKRPS GIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCATWDNDKWVVFGGGTKLEVLGGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS VRQA PGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDAWLDVLSDGFDYWGQGTLVTVSS scFv ESBA521, las CDRs subrayadas, ligadores en cursivas .

SEQ. ID. No. : 20 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPS GIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSGVVFGGGTKLTVLGGGG GSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS VRQA PGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDAGIAVAGTGFDYWGQGTLVTVSS FW4.4, las CDRs están subrayadas, ligadores en cursivas .

SEQ ID No. 21: cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccagga cagaaggtcaccatctcctgctccggaagcacctccaacattggcgataattatgta tcctggtaccaacaactcccaggaacagccccccaacccctcatttatgacaatact aaacgaccctcagggattcctgaccggttctctggctccaagtctggcacgtcagcc accctgggcatcaccggactccagactggggacgaggccgattattactgcgcgacc tgggataatgataagtggggtgtggttttcggcggagggaccaagctcgaggtcc-taggt La secuencia de ácido nucleico de CDRs de la ESBA521 VL están subrayadas.

SEQ ID No. 22: gaggtgcagctggtggagtccgggggaggcttggtacagcctggg gggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatg agctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggt agtggtggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaceatctccaga gacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacg gccgtatattactgcgcgcgtgatgcgtggttggatgtgctttcggatggctttgac tactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg La secuencia de ácido nucleico de CDRs de la ESBA521 VH están subrayadas.

SEQ ID No. 23: cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccagga cagaaggtcaccatctcctgctccggaagcacctccaacattggcgataattatgta tcctggtaccaacaactcccaggaacagccccccaactcctcatttatgacaabact aaacgaccctcagggattcctgaccggttctctggctccaagtctggcacgtcagcc accctgggcatcaccggaccccagactggggacgaggccgattattactgcgcgacc tgggataatgataagtggggtgtggttttcggcggagggaccaagctcgaggtccta ggtggtggtggtggttctggtggtggtggttctggcggcggcggctccagtggtggt ggatccga ggtgcagctggtggagtccgggggaggcttggtacagcctgggggg cc ctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgg gtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggt ggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaat tccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgta tattactgcgcgcgtgatgcgtggttggatgtgctttcggatggctttgactactgg ggccagggaaccctggccaccgtctcctcg La Secuencia de ácido nucleico de la CDRs de ESBA521 están subrayadas, el ligador está en cursivas La invención es ahora adicionalmente descrita por medio de los ejemplos.

Materiales y métodos En general, la práctica de la presente invención emplea, a no ser que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante , inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos) y técnicas estándares en la preparación de polipéptidos (ver por ejemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ; Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology) , 510, Paul, S., Humana Pr (1996) ; Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169) , McCafferty, Ed., Irl Pr (1996) ; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C. S. H. L. Press, Pub. (1999) ; and Current Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel et al., John iley & Sons (1992) .

Experimento 1: Selección para identificar scFvs que se enlazan a Alk En un cúmulo de estudios estructurales sobre interacciones ant icuerpo-ant ígeno se encontró que los residuos en la región 3 de determinación de la complementariedad (CDR-H3) de la cadena pesada contribuyen en general a los contactos más sustanciales para el antígeno (Chothia y Lesk, 1987; Chothia et al., 1985; Padlan, 1994) . Aplicamos nuestra tecnología de selección de interacción antígeno-anticuerpo de dos híbridos, de levadura, recientemente descrito, para aislar directamente los scFv que se enlazan al antígeno, por selección de cuatro bibliotecas de scFvs de secuencias CDR-H3 sintéticas aleatorizadas (Auf der Maur et al., 2002) . Las cuatros bibliotecas están basadas en cuatro diferentes estructuras de scFv humanas, estables, en las cuales 7 aminoácidos dentro del tercer bucle de CDR de la cadena pesada variable (VH-CDR3) fueron repartidos aleatoriamente (aleatorizados ) . Las partes aleatorizadas fueron introducidas mediante técnica de clonación por PCR estándares. Las bibliotecas de scFv fueron seleccionadas contra un péptido de 16 aminoácidos derivado del dominio extracelular de la cinasa receptora de tirosina humana, Cinasa de Linfoma Anaplástico (ALK) por un sistema de selección en levadura llamado "Control de calidad" (Auf der Maur et al., 2001; Auf der Maur et al., 2004) . En resumen, la tecnología de Control de Calidad es un sistema de selección intracorporal independiente del antígeno, para identificar a partir de un combinado natural de cadenas ligera-variable (VL) y pesada-variable (VH) aquellas combinaciones de VL y VH con propiedades biofísicas favorables, tales como la estabilidad, solubilidad y rendimiento de expresión. Un enlazador promisorio y específico proveniente de una de las cuatro bibliotecas de scPv fue aislado después de la primera ronda de selección.

Este scFv particular fue derivado de la biblioteca de estructuras FW4.4. F . (SEQ. ID. No. : 20) consiste de un dominio VL (lambda 1) conectado por un ligador de glicina-ser ina flexible, clásico (GGGGS)4 para un dominio VH3. La CDR3 de VH de FW4.4 comprende 13 aminoácidos (DAGIAVAGTGFDY; SEQ. ID. NO. : IB) . Para construir la biblioteca, la parte central de la CDR3 de VH (DAXXXXXXXGFDY) fue repartida aleatoriamente por métodos de clonación por PCR estándares utilizando un oligonucleót ido degenerado. Los últimos dos residuos (Asp y Tyr) fueron mantenidos constantes, debido a que su importancia estructural fue demostrada en muchos casos (Chothia y Lesk, 1987) . Los residuos remanentes no fueron modificados con el fin de mantener la complejidad de la biblioteca en dimensiones manejables. La biblioteca de scFv fue clonada en un vector de expresión de levadura (pLibl) como la fusión C-terminal al dominio de activación transcripcional de Gal4 (Auf der Maur et al. , 2002) . El dominio de enlace al ligando (LBD) de Alk humana fue elegido como el antigeno para la selección por interacción (Stoica et al., 2001) . Este péptido de 16 aminoácidos fue clonado dentro de otro vector de expresión de levadura (pBaitl) como la fusión C-terminal a la proteina LexA de enlace al ADN .

La cepa YDE173 de levadura reportera (Auf der Maur et al., 2002) que contiene los genes reporteros HIS3 y lacZ establemente integrados, bajo el control de seis sitios de enlace a LexA fue transformada con el vector de cebo que expresa LBD de Alk fusionado a LexA junto con la biblioteca de scFv de CDR-H3 aleatoria, fusionada al dominio de activación de Gal4. Las células transformadas son seleccionadas sobre placas que carecían de histidina y que contenían 3-amino-triazol 2.5 mM (3-AT) , que es un inhibidor competitivo del producto del gen HIS3. Las colonias en desarrollo fueron recogidas en un periodo de seis días y los plásmidos de la biblioteca fueron aislados. La misma cepa reportera fue transformada con los plásmidos rescatados para confirmar la activación del gen, dependiente del antígeno. Fue realizado un ensayo de ß-galactosidasa líquido, cuantitativo para medir la fuerza del enlace entre LBD de Alk, por ejemplo, el péptido Alk de 16 aminoácidos y el scFv seleccionado. El scFv con la activación del gen reportero más alta también demostró mejor afinidad (~ 31 nM) para el péptido LBD de Alk en ELISA (datos no mostrados) . Las secuencias de otras secuencias de CDF3 de VH identificadas como contribuyentes al enlace de ALK fueron proporcionadas más adelante en la Tabla la.

Clon CDR3 de VH (residuos mutados) T FW4.4 DAGIAVAGTGFDY (SEQ. ID. No.: 24) H5 SH 2.1 DAKFMSDGIGFDY (SEQ. ID. No.:25) H5 SH 4.1 DAWGWTILSGFDY (SEQ. ID. No.:26) H5 SH 5.1 DAAYMTRYEGFDY (SEQ. ID. No.:27) H5 SH 2.3 DAWTYWAREGFDY (SEQ. ID. No.: 28) H5 SH 3.3 DACMTYSREGFDY (SEQ. ID. No.:29) H5 SH 5.3 DAWLDVLSDGFDY (SEQ. ID. No.:30) H5 SH 14.3 DAPSVNDREGFDY (SEQ. ID. No.:31) Las secuencias de otras estructuras adecuadas son proporcionadas en seguida en la Tabla Ib.

Experimento 2: Maduración por afinidad Con el fin de obtener un scFv con mayor afinidad, este enlazador primario fue sometido a un proceso de maduración por afinidad, adicional, mediante mutagénesis y una segunda ronda de selección en levadura. Haciendo posible la maduración por afinidad, el nivel de expresión de la proteina de fusión del péptido LexA Alk LBD fue reducida con el fin de aminorar la activación del gen reportero impulsado por la interacción del enlazador primario con el péptido LBD de Alk. El promotor de actina fuerte sobre el vector pBaitl fue intercambiado con la versión truncada y de este modo menos activa del promotor ADH (alcohol-deshidrogenasa) dando como resultado pBait3. Esta reducción del nivel de expresión del cebo, en presencia del enlazador primario, fue suficiente para inhibir el crecimiento sobre placas que carecen de histidina y que contienen 3-AT 5 mM. La mutagénesis del enlace primario para la maduración por afinidad fue lograda mediante aleatorización de las partes de CDR3 dentro de la cadena ligera variable. Esto fue realizado directamente en levadura por la recombinación homologa ( Schaerer-Brodbeck y Barberis, 2004) . La CDR3 de VL de FW4.4 comprende 11 aminoácidos (SEQ. ID. No.: 14: GT DSSLSGW) . Las primeras dos posiciones fueron parcialmente aleatori zadas , tal que la primera posición codifica ya sea para Gly, Ala o Gln, y la segunda posición para Thr, Ser ó Ala. En las posiciones 5 a 8 dentro de CDR3 de VL, todos los residuos de aminoácidos fueron permitidos. Las posiciones remanentes fueron mantenidas constantes. La aleatorización o repartición aleatoria fue introducida por PCR. El producto de PCR resultante tuvo un tamaño de 356 pares de bases y comprendió el cásete CDR aleatori zado con 267 pares de bases con dirección 5' y 27 pares de bases con dirección 3' de las secuencias estructurales. Este producto es el denominado fragmento de PCR donador, el cual posee homologías para el vector objetivo. El vector objetivo es el plásmido de levadura (pLibl) que codifica para el enlazador primario fusionado al dominio de activación de Gal4. Con el fin de mejorar la eficiencia de la recombinación homologa y excluir los falsos positivos en la selección subsiguiente, la CDR-L3 en el vector objetivo fue ligeramente modificada. Un sitio de restricción SacI humano único fue introducido en la parte intermedia de la CDR3 de VL, lo cual conduce a un desplazamiento estructural en la parte que codifica para scFv de la proteína de fusión, y da como resultado una proteína truncada incapaz de enlazarse a LBD de Alk. Además, el sitio Sad hace posible la linearización del vector objetivo, lo cual aumenta la eficiencia de recombinación en la levadura. La selección fue lanzada por pre-transformación de la cepa de levadura reportera YDE173 con el plásmido (pBait3) que expresa LexA Alk LBD a partir del promotor de ADH truncado. Estas células de levadura pre-transformadas fueron hechas competentes nuevamente y co-transformadas con el vector objetivo linearizado y con el fragmento de PCR donador, el cual posee homologías con dirección 5' y con dirección 3' de la CDR3 de VL . Después de la recombinación homologa entre el producto de PCR y el vector objetivo, la nueva secuencia CDR3 de VL es integrada dentro del sitio correspondiente del vector objetivo. Como un resultado neto de este evento, la CDR3 de VL primordial se llega a intercambiar con la CDR3 de VL aleatorizada . Esto permite la reconstitución de un plásmido circular que expresa una proteina de fusión completamente funcional con una secuencia de CDR3 de VL, la cual activará la expresión del gen reportero y hará posible el crecimiento de placas selectivas después de la interacción con el péptido LBD de Alk. Un total de 119 clones crecieron sobre placas selectivas en un periodo de activación de 6 días. Estos clones fueron recogidos y los plásmidos de la biblioteca fueron aislados y r e t r a n s f o rmado s dentro de la misma cepa de levadura reportera. Se realizó un ensayo cuantitativo de ß - ga 1 a c t o s i da s a en liquido, para medir la fuerza del enlace entre el LBD de Alk (antigeno) y el scFv madurado por afinidad. Fueron también probados 20 clones con la más alta activación de lacZ en ELISA con el péptido LBD de Alk. El mejor candidato reveló una KD de aproximadamente 7 nM (Figura 3) y fue nombrado ESBA521. La secuencia de otra secuencia de CDR3 de VL identificadas como contribuyentes al enlace de ALK, son proporcionadas en seguida en la Tabla le.

Clon CDR 3 de VL WT FW4.4 GTWDSSLSGVV (SEQ. ID. No. : 32) .3-9.1 AAWDSVKHGVV (SEQ. ID. No. : 33) .3-21.1 AAWDNS RGVV (SEQ. ID. No. : 34) .3-22.1 AAWDTMRYGVV (SEQ. ID. No. : 35) .3-25.1 AA DTTRVGVV (SEQ. ID. No. : 36) .3-27.1 ASWDTMLKGVV (SEQ. ID. No. : 37) .3-28.1 ASWDTPTCGVV (SEQ. ID. No. : 38) .3-29.1 AT DISRCGVV (SEQ. ID. No. : 39) .3-46.1 ATWDTVCAGVV (SEQ. ID. No. : 40) .3-53.1 AT DVDVFGVV (SEQ. ID. No . : 41) .3-57.1 ATWDDVVGGVV (SEQ. ID. No. : 42) .3-86.1 AAWDSFYNGVV (SEQ. ID. No. : 43) .3-94.1 ASWDTLIEGVV (SEQ. ID. No. : 44) .3-107.1 ATWDNDKWGVV (SEQ. ID. No. : 45) .3-112.1 AAWDSTTCGVV (SEQ. ID. No. : 46) .3-113.1 ATWDMWMKGVV (SEQ. ID. No. : 47) .3-117.1 GTWDSSLSGVV (SEQ. ID. No. : 48) .3-118.1 AAWDWVLGGVV (SEQ. ID. No. : 49) 14.3-6.1 ATWDNPGQGVV (SEQ. ID. No. : 50) 14.3-7.1 ATWDDWVIGVV (SEQ. ID. No. : 51) 14.3-8.1 ASWDDQKWGVV (SEQ. ID. No. : 52) 14.3-9.1 ATWDTNRHGVV (SEQ. ID. No. : 53) 14.3-12.1 ASWDDLRIGVV (SEQ. ID. No . : 54) 14.3-13.1 ASWDEEAWGVV (SEQ. ID. No. : 55) 14.3-21.1 AT DYIRIGVV (SEQ. ID. No. : 56) 14.3-48.1 ATWDTFERGVV (SEQ. ID. No. : 57) 14.3-49.1 ATWDSNLIGVV (SEQ. ID. No. : 58) 5.3-24. ,1 ATWDNNTCGVV (SEQ. ID. No. : 59) 5.3-3.1 AAWDCDINGVV (SEQ. ID. No. : 60) 5.3-8.1 ASWDSMKIGVV (SEQ. ID. No. : 61) 5.3-19.1 ATWDCTRAGVV (SEQ. ID. No. : 62) Experimento 3: ESBA521 de scFv se en específicamente a la forma transmembranal de ALK humana Con el fin de probar si el scFv recién identificado era capaz de reconocer también la proteína ALK humana transmembranal sobre la superficie de las células vivas, los experimentos de inmunot inción de las células HELA transitoriamente transíectadas fueron realizadas. ESBA521 reacciona con la proteína ALK de una manera comparable como un anticuerpo policlonal (Figura 4) . En un experimento control, se mostró que la estructura 4.4 scFv no reacciona con ALK humana. Sorprendentemente, ESBA521 únicamente se enlaza a la proteína Alk humana, pero no a la proteína de ratón correspondiente, aunque el péptido antigénico de ratón únicamente difiere en dos posiciones de aminoácidos a partir de la secuencia del péptido humano. En contraste, el anticuerpo ALK policlonal reconoce la proteína humana y de ratón. Por lo tanto, el enlace de ESBA521 es específico para la proteína ALK humana en la superficie celular.

Experimento 4: Aislamiento de enlazadores mejorados mediante mutagénesis con PCR de la CDR 2 de VH Para mejorar adicionalmente en enlace al antígeno, se utilizó ESBA521 como el scFv inicial en una ronda adicional de maduración por afinidad utilizado el mismo procedimiento de dos híbridos que se describe para la primera ronda de maduración por afinidad, excepto que en este caso se cambió CDR2 de VH por la mutagénesis de PCR y se transformó dentro del recipiente de levadura, en donde la recombinación homologa en CDR2 es puesta en vigor de una manera análoga. Nuevamente, se introdujo un sitio de restricción en CDR2 para hacer posible la linearización del plásmido objetivo. Las mutaciones obtenidas en CDR2 son dadas en la Tabla 2. scFv (mejor CDR 3 de VH (residuos mutados) funcionamiento) WT (ESBA521) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ. ID. No.: 63) 1.1 AI-KTDGQNYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 64) 17.1 AIRSDGNERYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 65) .1 AINTNGNEKYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 66) 64.1 ISTNGKERYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 67) 130.1 AIRTQSQEEYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 68) 152.1 AIKSRSQEQYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 69) 167.1 AIKSHSQQQYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 70) 214.1 AINSEGQQRYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 71) 225.1 AIKSKCQNKYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 72) 262.1 AIRTNSEEKYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 73) 265.1 AINMKGNDRYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 74) 43.2 AI-RTNSKEYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 75) 70.2 AIKTESQQRYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 76) 99.2 AINSNGKQDYYADSVKG (SEQ. ID. No . : 77) 100.2 AIKTDGNHKYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 78) 109. AI DTKGNGQYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 79) 146.2 AIRDSSHKYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 80) 173.2 AINTHSNEQYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 81) 199.2 AIRTDSKNSYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 82) 2.11 AIRTDSKEQYYADSVFG (SEQ. ID. No. : 83) 19.11 AIRTNSKEEYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 84) 28.11 AIETSSGSTYYADVSVKG (SEQ . ID. No . : 85) 33.11 AINTGGGSTYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 86) 4.12 AINTRGQNEYYADSVKG (SEQ. ID. No. : 87) 6.12 AISTSG-STYYADSVGK (SEQ. ID. No. : 88) Entre los scFvs aislados obtenidos después de este procedimiento, se constató que siete tenían afinidad significativamente mejorada con una Kd en el intervalo de 2-3 nM (Figura 5), siendo el mejor de ellos de 28.11.

Experimento 5: Prevención del crecimiento tumoral después de la administración del anticuerpo anti-ALK Los progenitores del anticuerpo ESBA521 fueron seleccionados para enlazarse a los aminoácidos 391-406 de ALK, el cual comprende los aminoácidos (396-406) que se sabe se enlazan a la pleyotrofina (Stoica 2001) . ESBA521 fue obtenido mediante aleatorización de los aminoácidos adicionales en las CDRs de su progenitor, y mediante selección para los enlazadores que se enlazan al tramo de los aminoácidos 391-406 contenido en su contexto natural del dominio extracelular de ALK (ECD) . Estos procedimientos dieron como resultado un anticuerpo, el cual se enlaza a la ECD ALK con alta afinidad al mismo sitio que se enlaza a la PTN . A nuestro conocimiento, éste es el primer anticuerpo monoclonal que se dirige específicamente al sitio de enlace PTN de ALK. En consecuencia, se predice que ESBA521 tiene alta afinidad para ECD ALK y compite eficientemente con la pleyotrofina (PTN) y la midquine (MK) para la enlace al receptor de ALK, y de este modo, el anticuerpo ESBA521 es adecuado para la inhibición del ligando MK y PTN que se enlaza a la proteína ALK.

Debido a que ALK y sus ligandos están involucrados en la neoplasia, la invasión tumoral y la angiogénesis , la inhibición de la interacción entre ALK y sus ligandos cognados, perturba la tumorgénesis mediada por ALK. El efecto de ESBA521 sobre un tumor especifico puede ser determinado por los siguientes dos ensayos descritos en seguida. En un primer ensayo, los experimentos de xenoinjerto son preparados con el fin de determinar el papel limitante de la velocidad de crecimiento del cáncer, de ALK (Powers 2002). En resumen, una suspensión de células U87MG de 20 millones de células/ml, con medio suplementado con 10% de suero fetal de ternera, fue preparada. Estas se inyectaron dentro de ratones NU/NU y los tumores resultantes fueron medidos. Los anticuerpos de prueba, preferentemente anticuerpos de longitud completa, más preferentemente anticuerpos pegilados, fueron introducidos y se evaluó el crecimiento tumoral. Mientras que se ha mostrado y descrito las modalidades actualmente preferidas de la invención, se debe entender distintamente que la invención no está limitada a éstas sino que pueden ser de otro modo diversamente ejemplificadas y practicadas dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.

Referencias : Auf der Maur, A. , Escher, D. , and Barberis, A. (2001). Antigen-independent selection of stable intracellular single-chain antibodies. FEBS Lett 508, 407-412. Auf der Maur, A., Tissot, K., and Barberis, A. (2004) . Antigen-independent selection of intracellular stable antibody frameworks. Methods 34, 215-224. Auf der Maur, A. , et al . , Direct in vivo screening of intrabody librarles constructed on a highly stable single-chain framework. J Biol Chem, 277(47): p. 45075-85, 2002. Bai RY. et al . Nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase associated with anaplastic large-cell lymphoma activates the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt an-tiapoptotic signalling pathway. Blood 96(13), 4319-4327, 2000. Bowden et . et al. Anti-apoptotic signaling of pleiotrophin through its receptor, anaplastic lymphoma kinase. The Journal of Biological Chemistry 277(39), 35862-35868, 2002. Chothia, C, and Lesk, A. M. (19B7) . Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins . 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Barberis, Coupling homologous recombination with growth selection in yeast: a tool for construct ion of random DNA sequence libraries. Biotechniques, 37(2) : p. 202-206, 2004. Stoica GE. et al. Identification of anaplastic lymphoma kinase as a receptor for the growth factor pleiotrophin . The Journal of Biological Chemistry 275(20), 16772-15779, 2001. Stoica GE. et al. Midkine binds to anaplastic lymphoma kinase (ALK) and acts as a growth factor for different cell types. The Journal of Biological Chemistry 277 (39), 35990-35998, 2002. Weber D. et al . Pleiotrophin can be rate- limiting for pancreatic cáncer cell growth. Cáncer Research 60, 5284-5288, 2000. ellstein et al., A Heparin-binding Growth Factor Secreted from Breast Cáncer Cells Homologous to a Developmentally Regulated Cytokine. JBC Vol 267, p2582, 1992. SWISSPROT : www.expasy.org www. emedicine. com/med/topic2692, htm (glioblastoma) www.emedicine.com/MED/topic3205.htm (ALCL) Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un anticuerpo que se enlaza a la proteina ALK humana, caracterizado porque comprende una cadena pesada variable CDR3 de una secuencia con al menos 50% de identidad secuencial, preferentemente al menos 60%, 70%, 75%, 85%, más preferentemente al menos 90%, a la secuencia SEQ. ID. No. : 2. 2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una CDR3 de cadena pesada variable de la secuencia SEQ. ID. No. :
2.
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el enlace de la proteina ALK humana es especifico.
4. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo scFv o un fragmento Fab.
5. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un anticuerpo scFv,
6. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende un dominio VH H3 y un dominio VL lambda 1.
7. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la estructura de VH y VL es estable y soluble para ser funcional en un ambiente reductor intracelular .
8. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende la estructura 4.4.
9. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a un péptido de epitopo de ALK de 16 aminoácidos de una secuencia de al menos 75% de identidad secuencial a la secuencia SEQ. ID. No.: 1.
10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido epitopo de ALK tiene la secuencia SEQ. ID. No. : 1.
11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, cuya afinidad para el péptido epitopo de ALK está caracterizada porque comprende una Kd de 30 nM o menor, preferentemente 10 nM o menor, lo más preferentemente menor de 3 nM.
12. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una cadena ligera variable CDR3 de una secuencia con al menos 50% de identidad secuencial, preferentemente al menos 60%, 70%, 80%, 85%, o más preferentemente al menos 90%, a la secuencia de la SEQ. ID. No. : 3.
13. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una cadena ligera variable CDR3 de la secuencia SEQ. ID. No. : 3.
14. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se enlaza a un péptido epitopo de ALK de 16 aminoácidos de una secuencia con al menos 75%, preferentemente 100%, de identidad de aminoácidos a la secuencia de la SEQ. ID. No. : 1.
15. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la afinidad para el péptido epitopo de ALK es dada por una Kd de menos de 10 nM, preferentemente de menos de 7 nM.
16. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia VH de la SEQ. ID. No. : 4 y una secuencia de VL de la SEQ. ID. No. : 5.
17. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende al menos una mutación en al menos una de las CDRs que da como resultado una mayor afinidad que se caracteriza por una Kd de menos de aproximadamente 3 nM.
18. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la mutación está en CDRl ó CDR2 de VH y/o VL.
19. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la mutación o las mutaciones están en CDR2 de VH .
20. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una CDR2 de cadena pesada variable que comprende una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ. ID. No.: 7, SEQ. ID. No. : 8, SEQ. ID. No. : 9, SEQ. ID. No. : 10, SEQ. ID. No. : 11, SEQ-ID. No. 12, ó SEQ. ID. No.: 13.
21. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque las secuencias definidas de CDR2 son precedidas por los residuos de aminoácidos AI y seguidas por las secuencias de la SEQ. ID. No. : 17.
22. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una secuencia VH de la SEQ. ID. No. : 14 y una secuencia VL de la SEQ. ID. No. : 15.
23. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 22, caracterizado porque comprende la estructura NH2-VL-ligador-VH- COOH ó NH2-VH-ligador-VL-COOH, en donde el ligador tiene la secuencia de la SEQ. ID. No. : 16.
24. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo es radiomarcado o marcado con toxina.
25. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un medicamento o una herramienta de diagnóstico.
26. El uso del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para la producción de un medicamento para el tratamiento de cánceres o tumores.
27. El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el medicamento es adecuado para la inhibición de MK y/o el enlace de PTN a ALK y/o la señalización mediada por ALK.
28. El uso de conformidad con la reivindicación 26 ó 27, en donde el medicamento es un medicamento combinado adecuado para la administración del anticuerpo en combinación con un agente ant icancer igeno , por ejemplo, metotrexato.
29. El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el tratamiento es un tratamiento de neuroblas toma , g 1 i ob 1 a s t orna , rabdomiosarcoma , carcinoma de mama, melanoma, cáncer pancreático, NHL de células B, carcinoma de tiroides, carcinoma pulmonar de células pequeñas, ret inoblas toma , sarcoma de Ewing, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer pancreático, lipoma, liposarcoma, f ibrosarcoma , en particular g 1 i ob 1 a s t orna , neuroblas toma y rabdomiosarcoma .
30. Una secuencia de AND, caracterizada porque codifica para el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.
31. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 30.
32. Una célula hospedera adecuada, caracterizada porque es transformada con un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 31, en particular una célula de E. coli.
33. Un método para la producción de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque comprende el cultivo de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32, bajo condiciones que permiten la síntesis del anticuerpo y la recuperación desde éste a partir del cultivo.
34. Una vacuna de ALK, caracterizada porque comprende una proteína ALK aislada o un fragmento de la misma, o un ácido nucleico que codifica para un epitopo de ALK.
35. La vacuna de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la vacuna comprende los residuos 391-406 de una proteina ALK aislada.
36. La vacuna de conformidad con la reivindicación 34 ó 35, caracterizada porque consiste de los residuos 391-406 de una proteina ALK aislada formulada con un portador, adyuvante y/o hapteno, para aumentar la respuesta inmunitaria a la proteina ALK o el fragmento de la misma.
37. Un anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno del mismo, caracterizado porque es capaz de enlazarse específicamente a los residuos de la región que abarca los residuos de aminoácidos 391 ± 3 y 406 ± 3 (SEQ. ID. No: 91) , lo más preferentemente los aminoácidos 391-406 (SEQ. ID. No: 1) , de una proteína ALK aislada o el fragmento de la misma.
38. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple (scFv) , fragmento Fab, IgG, o IgM.
39. Un epitopo de ALK, adecuado para identificar, seleccionar, o producir anticuerpos anti-ALK o fragmentos de los mismos, caracterizado porque es un fragmento de, comprende o consiste esencialmente de la región que abarca los residuos de aminoácidos 391 ± 3 y 406 ± 3 (SEQ. ID No: 91) , lo más preferentemente los aminoácidos 391-406 (SEQ. ID. No : 1 ) .
40. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 8, caracterizado porque el anticuerpo que se enlaza a un epitopo que es fragmento de, comprende o consiste esencialmente de la región que abarca los residuos de aminoácidos 391 ± 3 y 406 ± 3 (SEQ. ID No.: 91) , lo más preferentemente los aminoácidos 391-406 (SEQ. ID. No: 1) .