KR102571909B1 - Lox1에 특이적인 결합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Lox1에 특이적인 결합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102571909B1
KR102571909B1 KR1020177011186A KR20177011186A KR102571909B1 KR 102571909 B1 KR102571909 B1 KR 102571909B1 KR 1020177011186 A KR1020177011186 A KR 1020177011186A KR 20177011186 A KR20177011186 A KR 20177011186A KR 102571909 B1 KR102571909 B1 KR 102571909B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lox1
antibody
seq
amino acid
binding protein
Prior art date
Application number
KR1020177011186A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170062502A (ko
Inventor
앤드류 부캐넌
마태오 초도지
피터 카뤽
조한나 휴스마크
클라레 발렌드란
디페쉬 팬디
푸민 챙
다니엘 베르코비츠
루이스 로머
Original Assignee
메디뮨 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메디뮨 리미티드 filed Critical 메디뮨 리미티드
Publication of KR20170062502A publication Critical patent/KR20170062502A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102571909B1 publication Critical patent/KR102571909B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0695—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

본 발명은 렉틴-유사 산화 저밀도 리포단백질 수용체-1 (Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1; LOX1) 결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체, 및 이러한 결합 단백질의 제조를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본원에서 제공된 LOX1-결합 단백질은 LOX1 활성을 저해하거나 길항한다. 게다가, 본 발명은 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, 관상 동맥 질환 (CAD), 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증 (예를 들어, 만성 염증), 혈관 형성, 자간전증, 암 및 기타 LOX1-매개 질환 및 병태와 연관된 병태를 진단 및 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

LOX1에 특이적인 결합 단백질 및 이의 용도{BINDING PROTEINS SPECIFIC FOR LOX1 AND USES THEREOF}
관련 출원과의 교차 참조
본 특허 출원은 2014년 10월 1일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/058,254호의 이득을 청구하는데, 상기 미국 가특허 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
전자 제출된 서열 목록의 언급
본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일 형태의 전자 제출된 서열 목록 (명칭: LOX1-100WO1_SequenceListing_ascii.txt; 크기: 50,926 바이트; 및 생성일: 2015년 9월 30일)의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 렉틴-유사 산화 저밀도 리포단백질 수용체-1 (Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1; LOX1) 결합 단백질 및 예를 들어, 예컨대 혈관 기능 장애, 아테롬성 동맥 경화증 (경화반 (plaque) 진행, 파열 및/또는 혈전증) 관상 동맥 질환 (coronary artery disease; CAD), 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 뇌졸중 및 급성 관동맥 증후군 (acute coronary syndrome; ACS)을 포함하는, LOX1과 연관된 질환 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 개선을 위한 그러한 결합 단백질의 사용 방법을 제공한다.
아테롬성 동맥 경화증은 지질, 대식 세포 및 섬유 요소의 병변으로서의 동맥 벽에서의 축적에서 생기는 복합 질환이다. 상기 병변은 동맥 관강을 좁아지게 하는 복합 경화반으로 발전하며, 만성 염증의 병소이다. 경화반은 파열되기 쉬워서 혈전증을 트리거링하며 (triggering), 상기 혈전증은 뇌졸중 및 심근 경색을 포함하는 심혈관 유해 사건 (cardiovascular adverse event)을 야기한다. 아테롬성 동맥 경화증은 관상 동맥 질환, 뇌졸중 및 말초 혈관 질환의 주요 원인이며, 따라서 세계적으로 병적 상태의 가장 일반적인 원인을 대표한다 (세계 보건 기구 (World Health Organization) 2011).
렉틴-유사 산화 저밀도 리포단백질 수용체-1 (LOX1)은 디술피드 결합된 제II형 막관통 단백질이다. 이것은 처음에, 산화 저밀도 리포단백질 (oxLDL)의 주요 수용체로서 확인되었다 (문헌[Kume et al., 70th Scientific Sessions of the American Heart Association Ser. 96, 1997]). 상기 수용체는 짧은 N 말단 세포질 도메인, 막관통 도메인, 넥 도메인 (neck domain) 및 C-타입 렉틴 도메인 (C-type lectin domain CTLD))으로 이루어지며, 이때 CTLD의 구조는 풀려졌다 (문헌[Ohki et al., Structure 13:905-917 (2005)]). 게다가, LOX1은 넥 도메인에서 단백질 분해적으로 절단되어 용해성 LOX1 (soluble LOX1; sLOX1)을 방출할 수 있다. LOX1은 클래스 E 스캐빈저 수용체 (scavenger receptor)이며, oxLDL, C-반응성 단백질 (C-reactive protein; CRP), 포스파티딜세린, 어드밴스드 당화 최종 산물 (advanced glycation end product; AGE), 미세 고밀도 리포단백질 (small dense lipoprotein; sdLDL), 산화 HDL, N4-옥소노나노일 라이신 (oxononanoyl lysine; ONL), 열충격 단백질 (heat shock protein; hsp), 클라미디아 뉴모니애 (Chlamydia pneumoniae), 혈소판, 백혈구 및 아폽토시스성 세포 (apoptotic cell)를 포함하는 다수의 리간드에 결합한다. 이러한 리간드 중 다수, 특히 oxLDL은 아테롬성 동맥 경화증과 연관된다. RhoA/Rac1, 일산화질소, p38MAPK, 단백질 키나아제 B 및 C, ERK1/2, 및 NFκB를 비롯하여 다수의 신호 전달 경로가 LOX1 활성화와 연관되어 있다. 예를 들어, 문헌[Taye et. al., Eur J Clin Invest. 43(7):740-5 (2013)]을 참조한다.
전임상 증거는 LOX1을 혈관 기능 장애, 경화반 진행, 파열 및 혈전증, 아테롬성 동맥 경화증 및 염증성 병태의 촉진에 연루시킨다. 예를 들어, 문헌[Ulrich-Merzenich et al., Expert Opin Ther Targets. 17(8):905-19 (2013)]를 참조한다. 예를 들어, LOX1 넉아웃 (knockout) 마우스는 감소된 대동맥 아테롬성 동맥 경화증 및 감소된 혈관벽 콜라겐 침착을 가지며 (문헌[Mehta et al.,Circ . Res. 100:1634-1642 (2007)]), LOX1 과발현은 아테롬성 동맥 경화증 경화반 형성을 증가시켰으며 (문헌[Inoue et al., Circ . Res. 97:176-84 (2005)]; 및 문헌[White et al., Cardiovascular pathology 20:369-73 (2011)]), 이때 LOX1 발현이 취약성 경화반 숄더 (shoulder) 상에서 관찰되고, 이는 대식 세포 축적, 아폽토시스 (apoptosis), 및 MMP-9 발현과 연관된다 (문헌[Li et al., Cir . Cardio . Imaging 3:464-72 (2010)]). 중화 LOX1 항체는 아세틸콜린 유도된 관상 세동맥 확장을 회복시켰으며 (문헌[Xu et al., Arterioscler . Thromb . Vasc . Biol . 27(4) 871-877 (2007)]), 래트에서 벌룬 상해 (balloon injury) 후 내막 비후를 감소시켰다 (문헌[Hinagata et al., Cardiovasc . Res. 69:263-71 (2006)]). 인간에서의 LOX1 발현은 항시적이지 않으며, 전염증성 (proinflammatory) 자극에 의해 동적으로 유도가능하다. 아테롬성 동맥 경화증 경화반에서 LOX1은 내피 세포, 평활근 세포 및 대식 세포 상에서 발현된다. 흥미롭게도, 혈청 sLOX1은 급성 관동맥 증후군 (ACS) 환자에서 경화반 불안정성 및 파열을 진단하고 (문헌[Nakamura et al., J. Pharm . Biomed. Anal. 51:158-163 (2010)]); ACS 재발 또는 사망을 예측하는 것으로 제안되었으며 (문헌[Kume et al., 70th Scientific Sessions of the American Heart Association Ser. 96, 1997]); 이는 증가하는 수의 복합 병변과 연관되어 있다 (문헌[Zhao et al., Clin . Cardiol . 34:172-177 (2011)]).
아테롬성 동맥 경화증과 관련된 사망률은 아테롬성 동맥 경화증에 대한 위험 인자인 고혈압, 당뇨병, 이상 지질 혈증 및 생활 방식 특징 (예컨대 흡연 및 비만)의 증가하는 유병률로 인하여 계속하여 상승하고 있다. 혈소판 저해제, 항고혈압제, HMG CoA 리덕타아제 저해제 (스타틴), 혈전 용해제, 경피적 동맥 확장, 스텐팅 (stenting) 또는 관상 동맥 우회술을 포함하는 케어 치료의 기준에 의한 개입은 상당한 임상적 이점을 가졌었다. 그러나, 예방 전략 및 치료의 이용에도 불구하고, 여전히 이차 주요 심혈관 유해 사건 (major adverse cardiovascular event; MACE)으로 고통 받고 있는 다수의 환자가 있다. 따라서, 단독으로 또는 케어 기준과 조합되어 사용될 수 있는 새로운 치료제에 대한 필요성이 있다.
본 발명은 LOX1-결합 단백질 및 그의 사용 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 LOX1-결합 단백질은 그의 리간드 중 하나 이상에의 LOX1-결합을 감소시키거나, 저해하거나 차단한다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 산화 저밀도 리포단백질(oxLDL), C-반응성 단백질 (CRP) 및/또는 어드밴스드 당화 최종 산물 (AGE)과의 LOX1-결합을 감소시키거나, 저해하거나 차단한다. 일부 측면에서, 본 발명은 LOX1 발현 및/또는 감소된 HDL-매개된 시그널링 (signaling)과 연관된 질환 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 개선을 위한 LOX1-결합 단백질의 사용 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 급성 관동맥 증후군 (ACS), 심근 경색 (MI) 또는 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 ACS, MI 또는 CAD와 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선을 위한 LOX1-결합 단백질의 사용 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 군으로부터 선택되는 질환 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 개선을 위한 LOX1-결합 단백질의 사용 방법을 제공한다: 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, 관상 동맥 질환 (CAD), 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증, 혈관 형성 (angiogenesis), 자간전증 및 암.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 중쇄 가변 영역 (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 및 경쇄 가변 영역 (VL)-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 상보성 결정 영역 (complementary determining region; CDR)의 세트를 포함하며, 여기서, 상기 CDR의 세트는 (a) VH-CDR1이 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖고; (b) VH-CDR2가 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (c) VH-CDR3이 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖고; (d) VL-CDR1이 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖고; (e) VL-CDR2가 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖고; (f) VL-CDR3이 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 기준 CDR 세트와 동일하거나, 또는 상기 기준 CDR 세트로부터의 총 18개 이하의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의) 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 갖는다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 중쇄 가변 영역 (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 및 경쇄 가변 영역 (VL)-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 6개의 상보성 결정 영역 (CDR)의 세트를 포함하며, 여기서, 상기 CDR의 세트는 (a) VH-CDR1이 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖고; (b) VH-CDR2가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖고; (c) VH-CDR3이 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖고; (d) VL-CDR1이 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖고; (e) VL-CDR2가 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖고; (f) VL-CDR3이 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 기준 CDR 세트와 동일하거나, 또는 상기 기준 CDR 세트로부터의 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 갖는다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 중쇄 가변 영역 (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 및 경쇄 가변 영역 (VL)-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 상보성 결정 영역 (CDR)의 세트를 포함하며, 여기서, 상기 CDR의 세트는 (a) VH-CDR1이 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖고; (b) VH-CDR2가 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖고; (c) VH-CDR3이 서열 번호 40의 아미노산 서열을 갖고; (d) VL-CDR1이 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖고; (e) VL-CDR2가 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖고; (f) VL-CDR3이 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖는 기준 CDR 세트와 동일하거나, 또는 상기 기준 CDR 세트로부터의 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 갖는다.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 (a) VH-CDR1이 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖고; (b) VH-CDR2가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖고; (c) VH-CDR3이 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖고; (d) VL-CDR1이 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖고; (e) VL-CDR2가 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖고; (f) VL-CDR3이 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 6개의 CDR의 세트를 포함한다.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 (a) VH-CDR1이 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖고; (b) VH-CDR2가 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖고; (c) VH-CDR3이 서열 번호 44의 아미노산 서열을 갖고; (d) VL-CDR1이 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖고; (e) VL-CDR2가 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖고; (f) VL-CDR3이 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 6개의 CDR의 세트를 포함한다.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 (a) VH-CDR1이 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖고; (b) VH-CDR2가 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖고; (c) VH-CDR3이 서열 번호 40의 아미노산 서열을 갖고; (d) VL-CDR1이 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖고; (e) VL-CDR2가 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖고; (f) VL-CDR3이 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 6개의 CDR의 세트를 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 4의 서열에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 서열 번호 33에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 41의 서열에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 VH 및/또는 서열 번호 58에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 4, 19 내지 29, 41, 또는 48 내지 54의 서열에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 33, 36, 37, 58 또는 65 내지 70의 서열에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 하기로부터 선택되는 VH 및 VL에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다: (a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (b) 서열 번호 29의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (c) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VL; 및 (d) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 VH 서열이 서열 번호 4, 19 내지 28, 또는 29의 기준 VH 서열과 동일하거나 이로부터의 총 15개 이하의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의) 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 VL 서열이 서열 번호 33, 36 또는 37의 기준 VL 서열과 동일하거나 이로부터의 총 6개 이하의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의) 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 4, 19 내지 29, 41, 또는 48 내지 54의 서열을 포함하는 VH로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열 번호 33, 36, 37, 58 또는 65 내지 70의 서열을 포함하는 VL로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다: (a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (b) 서열 번호 29의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (c) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VL; 및 (d) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1, 서열 번호 2, 5 내지 12, 또는 13의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열 번호 3, 14 내지 17 또는 18의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함하는 VH로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2, 및 서열 번호 32, 34 또는 35의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함하는 VL로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 VH 서열이 서열 번호 41, 48 내지 53 또는 54의 기준 VH 서열과 동일하거나 이로부터의 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 VL 서열이 서열 번호 58, 65 내지 69 또는 70의 기준 VL 서열과 동일하거나 이로부터의 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1, 서열 번호 39, 42, 또는 43의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열 번호 40, 44 내지 46 또는 47의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함하는 VH로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열 번호 55 또는 59의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1, 서열 번호 56 또는 60의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2, 및 서열 번호 57, 61 내지 63, 또는 64의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함하는 VL로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 표 1, 도 4 또는 도 5에 기술된 바와 같은 하기의 CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR3 및 VL-CDR3 (예를 들어 Lox514, LX5140011, LX5140014, LX5140016, LX5140038, LX5140094, LX5140108, LX5140110, LX5140092, LX5140092_D, LX5140093, LX5140093_D, Lox696, LX6960067_ngl1, LX6960071_ngl1, LX6960073_ngl1, LX6960086_ngl1, LX6960094_ngl1, LX6960101_ngl1, LX6960102_ngl1, LX6960116_ngl1, LX6960073_gl, 또는 LX6960073_G82bs_gl로부터의 CDR의 세트)을 포함한다.
일부 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 표 1, 도 4 또는 도 5에 기술된 바와 같은 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL) (예를 들어 Lox514, LX5140011, LX5140014, LX5140016, LX5140038, LX5140094, LX5140108, LX5140110, LX5140092, LX5140092_D, LX5140093, LX5140093_D, Lox696, LX6960067_ngl1, LX6960071_ngl1, LX6960073_ngl1, LX6960086_ngl1, LX6960094_ngl1, LX6960101_ngl1, LX6960102_ngl1, LX6960116_ngl1, LX6960073_gl, 또는 LX6960073_G82bs_gl로부터의 VH 및 VL)을 포함한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 상보성 결정 영역 (CDR(의 세트: 중쇄 가변 영역 (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 및 경쇄 가변 영역 (VL)-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하며, 여기서, (a) VH-CDR1은 아미노산 서열: E L S M H (서열 번호 1)를 포함하고; (b) VH-CDR2는 아미노산 서열: G F D P E D HX1 HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 Q K F Q G (여기서, HX1은 G, W, Y 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX2는 E, T, Q, K, A, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 T, Y, I, 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX4는 I, A, R 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX5는 Y, V, T, L 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX6은 A, D, G, S 및 H로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 번호 71)를 포함하며; (c) VH-CDR3은 아미노산 서열: HX7 HX8 G HX9 HX10 HX11 HX12 G V R G W D Y Y Y G M D V (여기서, HX7은 P, S 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX8은 N, W, D, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 Q, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX10은 Q 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX11은 G 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX12는 K 및 G로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 번호 72)를 포함하고; (d) VL-CDR1은 아미노산 서열: T G S S S N I G A G Y D V H (서열 번호 30)를 포함하며; (e) VL-CDR2는 아미노산 서열: G N S N R P S (서열 번호 31)를 포함하고; (f) VL-CDR3은 아미노산 서열: Q S Y D S LX1 LX2 LX3 LX4 LX5 LX6 (여기서, LX1은 M 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며, LX2는 L, Y 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX3은 S 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되며, LX4는 A 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 누락되고 (아미노산 없음), LX5는 W 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX6은 V, G 및 A로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 번호 73)을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 4의 VH 서열 및 서열 번호 33의 VL 서열을 포함하는 LOX-1 결합 단백질 (예를 들어 LOX-1 항체 또는 이의 단편)을 포함하는, 표 1, 도 4 또는 도 5에 기술된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 LOX-1 결합 단백질 (예를 들어 LOX-1 항체 또는 이의 단편)과 동일한 에피토프에 결합한다.
다른 측면에서, 본 발명은 LOX1에의 결합에 대하여, 서열 번호 4의 VH 서열 및 서열 번호 33의 VL 서열을 포함하는 LOX-1 결합 단백질 (예를 들어 LOX-1 항체 또는 이의 단편)을 포함하는, 표 1, 도 4 또는 도 5에 기술된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 LOX-1 결합 단백질 (예를 들어 LOX-1 항체 또는 이의 단편)과 경쟁하거나 교차-결쟁하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 제공한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 4의 VH 서열 및 서열 번호 33의 VL 서열을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
다른 측면에서, 본 발명은 LOX1에의 결합에 대하여 서열 번호 4의 VH 서열 및 서열 번호 33의 VL 서열을 포함하는 항체와 경쟁하거나 교차-경쟁하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 제공한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 LOX1-결합 단백질은 LOX1 활성을 감소시키거나, 저해하거나, 길항시킨다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1가지의 특성을 갖는다: (a) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 1, 2 및/또는 3 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 LOX1에의 oxLDL, C-반응성 단백질 (CRP) 및/또는 어드밴스드 당화 최종 산물 (advanced glycation end product; AGE)의 결합을 감소시키거나 저해함; (b) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 세포 표면 LOX1을 발현하는 내피 세포에서의 RhoA/Rac1, 일산화질소 (NO), p38MAPK, 단백질 키나아제 B 및 C, ERK1/2, 및/또는 NFκB 시그널링 (signaling)을 감소시키거나 저해함; (c) 본원에 개시된 분석법을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 세포 표면 LOX1을 발현하는 내피 세포에서의 카스파아제 (caspase)-8, 카스파아제-9, 및/또는 BAX 활성을 감소시키거나 저해함; (d) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 1, 2 및/또는 3 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 단일 뉴클레오티드 다형성 K167N을 갖는 LOX1에 결합함; (e) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 4 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 oxLDL 내재화를 감소시키거나 저해함; (f) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 5 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 oxLDL-유도된 LOX1 시그널링을 감소시키거나 저해함; (g) 비아코어 (BIACORE) 또는 키넥사 (KinExA)에 의해 결정할 때 약 150 pM 내지 약 600 pM (예를 들어 약 400 pM)의 해리 상수 (KD)로 LOX1에 결합함; (h) 비아코어에 의해 결정할 때 약 1 x 105 M- 1 s-1 내지 약 6 x 106 M- 1 s-1 (예를 들어 약 5 x105 M-1 s- 1)의 Kon 속도로 LOX1에 결합함; 및 (i) 비아코어에 의해 결정할 때 약 1 x 10-4 s-1 내지 약 3 x 10-4 s-1 (예를 들어 약 2.3 x 10-4 s- 1)의 Koff 속도로 LOX1에 결합함.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 항체이다. 일부 측면에서, 항체는 단클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 2특이성 항체, 다중특이성 항체, 또는 LOX1-결합 항체 단편이다. 일부 측면에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 LOX1 결합 항체 단편이다: Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디 (diabody), 및 단쇄 항체 분자.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 IgG1 중쇄 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 항체이다. 일부 측면에서, IgG1 불변 영역은 이펙터 (effector) 기능을 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 추가의 측면에서, IgG1 불변 영역은 삼중 돌연변이 L234F/L235E/P331S를 포함하며, 이는 이펙터 널 (null) IgG1로 이어진다.
본 발명은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어 LOX-1 항체 또는 이의 단편)을 코딩하는 단리된 핵산 또는 핵산의 세트를 제공한다. 또한, 이 핵산 또는 핵산의 세트를 포함하는 벡터 또는 벡터의 세트, 및 이 단리된 핵산 또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 일부 측면에서, 숙주 세포는 포유류 숙주 세포, 예컨대 NS0 쥐과 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포, 또는 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary; CHO) 세포이다. LOX1-결합 단백질 (예를 들어, LOX-1 항체 또는 이의 단편)을 생성하는 숙주 세포 및 하이브리도마가 또한 제공된다.
또한 본 발명은 본원에 개시된 LOX1-결합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 방법은 적합한 조건 하에 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, LOX-1 항체 또는 이의 단편)을 발현할 수 있는 숙주 세포 또는 하이브리도마를 배양하는 단계를 포함하며, 임의로, 숙주 세포 또는 하이브리도마로부터 분비된 LOX1-결합 단백질의 단리 방법을 제공한다. 그리고, 본 발명은 부가적으로, 이러한 방법을 이용하여 단리된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어 LOX-1 항체 또는 이의 단편)을 제공한다.
LOX1-결합 단백질 (예를 들어 LOX-1 항체 또는 이의 단편) 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다. 대상체에서 예를 들어 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, 관상 동맥 질환 (CAD), 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증 (예를 들어, 만성 염증), 혈관 형성, 자간전증 및/또는 암을 포함하는, LOX1, 상승된 LOX1 활성 및/또는 상승된 LOX1 발현 수준과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 본원에서 또한 제공된다. 일부 측면에서, 본 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 LOX1-결합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 단독으로 투여된다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질은 병용 요법제로서 투여된다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 케어 치료/치료법의 기준에 대한 병용 요법제로서 투여된다.
대상체에서 LOX1 활성을 감소시키는 방법이 또한 제공되며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 LOX1-결합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
부가적으로, 아테롬성 동맥 경화증의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 아테롬성 동맥 경화증에 걸린 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 아테롬성 동맥 경화증이 발병할 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 전죽종형성 (proatherogenic) 병태를 갖는다. 추가의 측면에서, 전죽종형성 병태는 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus; SLE), 당뇨병, 고혈압, 고혈당증, 심부전, 혈관 손상, 장기 이식, 이상 지질 혈증 (예를 들어, 고지혈증), 염증 (예를 들어, 만성 염증 및 내독소 유도성 염증) 및/또는 세균 감염이다. 아테롬성 동맥 경화증의 감소 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 발명은 아테롬성 동맥 경화증을 갖는 대상체에게 LOX1-결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서의 아테롬성 동맥 경화증의 감소 방법을 제공한다.
혈전증의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 혈전증을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 혈전증의 발병 위험성이 있다. 일부 측면에서, 혈전증은 동맥 혈전증이다. 추가의 측면에서, 혈전증은 동맥 혈전증이다.
또한 본 발명은 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 CAD와 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 CAD를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)이 투여되는 대상체는 CAD의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 전죽종형성 병태를 갖는다. 추가의 측면에서, 전죽종형성 병태는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 당뇨병, 고혈압, 고혈당증, 심부전, 혈관 손상, 장기 이식, 이상 지질 혈증 (예를 들어, 고지혈증), 염증 (예를 들어, 만성 염증 및 내독소 유도성 염증) 및/또는 세균 감염이다.
또한 본 발명은 허혈 또는 허혈과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 허혈을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)이 투여되는 대상체는 허혈의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 심근 허혈을 갖는다. 다른 측면에서, 대상체는 심근 허혈의 발병 위험이 있다. 추가의 측면에서, 대상체는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 당뇨병, 고혈압, 고혈당증, 심부전, 혈관 손상, 장기 이식, 이상 지질 혈증 (예를 들어, 고지혈증), 염증 (예를 들어, 만성 염증 및 내독소 유도성 염증) 및/또는 세균 감염을 갖는다.
경색 또는 경색과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 경색을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)이 투여되는 대상체는 경색의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 심근 경색을 갖는다. 다른 측면에서, 대상체는 심근 경색의 발병 위험이 있다. 추가의 측면에서, 대상체는 허혈, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 당뇨병, 고혈압, 고혈당증, 심부전, 혈관 손상, 장기 이식, 이상 지질 혈증 (예를 들어, 고지혈증), 염증 (예를 들어, 만성 염증 및 내독소 유도성 염증) 및/또는 세균 감염을 갖는다.
또한 본 발명은 급성 관동맥 증후군 (ACS) 또는 ACS와 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 ACS를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)이 투여되는 대상체는 ACS의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 용해성 LOX1 (sLOX1)의 혈청중 수준 또는 상승된 LOX1 활성을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 아테롬성 동맥 경화증을 갖는다.
또한 본 발명은 뇌졸중 또는 뇌졸중과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 뇌졸중을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 뇌졸중을 가질 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 sLOX의 혈청중 수준 및/또는 상승된 LOX1 활성을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 아테롬성 동맥 경화증을 갖는다.
재관류 손상 또는 재관류 손상과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 재관류 손상을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)이 투여되는 대상체는 재관류 손상의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 곧 수술을 받으려고 한다. 다른 측면에서, 대상체는 수술을 받았다. 일부 측면에서, 수술은 이식 또는 관상동맥 우회술이다. 추가의 측면에서, 환자는 심근 허혈-재관류 손상을 갖거나, 심근 허혈-재관류 손상의 발병 위험이 있다. 추가의 측면에서, 본 방법은 심근 손상을 감소시키고/시키거나, 혈청중 크레아틴 키나아제-MB 아이소엔자임 (isoenzyme) (CK-MB) 수준 및 혈청중 말론디알데히드 (MDA) 수준을 감소시키고/시키거나, 심근 세포 크기를 감소시키고/시키거나, 손상 부위에서 백혈구 침윤을 감소시키고/시키거나, 심장 기능 장애를 감소시킨다 (예를 들어, 좌심실 압력 (left ventricular pressure; LVP)을 감소시키고 좌심실 이완기말 압력 (left ventricular end-diastolic pressure; LVEDP)을 증가시킨다). 추가의 측면에서, 본 방법은 일회심박출량 (heart stroke volume), 단축률, 및/또는 인젝션 프랙션 (injection fraction)을 증가시킨다.
또한 본 발명은 재협착 또는 재협착과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 재협착을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 재협착의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 곧 수술을 받으려고 한다. 다른 측면에서, 대상체는 수술을 받았다. 일부 측면에서, 수술은 혈관내 시술이 혈관 수술, 심장 수술 또는 혈관형성술인 것이다. 추가의 측면에서, 재협착에서, 시술은 이식 또는 관상동맥 우회술이다. 추가의 측면에서, 치료되고/되거나, 예방되고/되거나, 개선되는 재협착은 스텐트내 (in-stent) 재협착 또는 혈관형성술 후 재협착이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 말초 혈관 질환 (PVD) 또는 PVD와 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 PVD를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 PVD의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 sLOX의 혈청중 수준 및/또는 상승된 LOX1 활성을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 아테롬성 동맥 경화증을 갖는다.
또한 본 발명은 염증 또는 염증과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 염증을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 측면에서, 대상체는 만성 염증을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 oxLDL 및/또는 sLOX의 혈청중 수준 및/또는 상승된 LOX1 활성을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 아테롬성 동맥 경화증을 갖는다.
또한 본 발명은 자간전증 또는 자간전증과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 자간전증 또는 자간을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 측면에서, 대상체는 고혈압 및 다량의 요단백을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 oxLDL 및/또는 sLOX의 혈청중 수준 및/또는 상승된 LOX1 활성을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 족부, 다리 및/또는 수부 부종을 갖는다.
추가의 측면에서, 본 발명은 대상체에서의 아테롬성 동맥 경화증 경화반의 안정화 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 본 방법은 상기 경화반에서 RhoA/Rac1, 일산화질소, p38MAPK, 단백질 키나아제 B 및 C, ERK1/2, 및/또는 NFκB 신호 전달 경로의 시그널링을 감소시킨다. 다른 측면에서, 본 방법은 상기 경화반에서 아폽토시스를 감소시킨다. 추가의 측면에서, 본 방법은 상기 경화반에서 카스파아제 8, 카스파아제 9 및/또는 BAX 활성을 감소시키고/시키거나 BCL-2 활성을 증가시킨다. 다른 측면에서, 본 방법은 상기 경화반에 의해 생성되는 부착 분자 또는 사이토카인의 수준을 감소시킨다. 추가의 측면에서, 본 방법은 상기 경화반에 의한 E-셀렉틴 (selectin), P-셀렉틴, ICAM-1, VCAM-1, MCP1 및/또는 CD40/CD40L 발현을 감소시킨다. 추가의 측면에서, 본 방법은 아테롬성 동맥 경화증 경화반의 크기 또는 형성, 아테롬성 동맥 경화증 경화반에서의 대식 세포 축적 및/또는 MMP (예를 들어, MMP9) 발현을 감소시킨다. 추가의 측면에서, 본 방법은 상기 경화반의 진행 또는 퇴행을 감소시킨다.
대상체에서의 혈관 긴장도 상실의 감소 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 본 방법은 혈관 긴장도 상실을 감소시킨다. 추가의 측면에서, 본 방법은 HDL 구동되는 NO 생성의 조절 (항체가 내피 NO 생성을 촉진하는 능력)을 통하여 대상체에서 혈관 긴장도 상실을 감소시킨다. 부가적으로, 대상체에서의 혈관 긴장도의 향상 방법이 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
부가적으로, 암의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 제공된다. 일부 예에서, 본 발명은 암을 갖는 대상체에게 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서의 암의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 대상체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 갖는다: 유방암, 결장암, 난소암, 흑색종, 자궁경부암, 폐암, 자궁암, 신장암, 및 췌장암.
종양 세포의 증식, 이동 또는 침윤의 저해 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 발명은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 LOX1을 발현하는 종양 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 LOX1 활성의 길항 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 종양 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 암으로부터 유래된다: 유방암, 결장암, 난소암, 흑색종, 자궁경부암, 폐암, 자궁암, 신장암, 및 췌장암. 일부 측면에서, 종양 세포는 암 주 (line)로부터 유래된다.
부가적으로, 본 발명은 혈관 형성의 감소 또는 저해 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 혈관 형성의 감소 또는 저해 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 대상체는 병리학적 혈관 형성과 연관된 병태를 갖는다. 추가의 측면에서, 본 발명은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 LOX1을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 혈관 형성의 저해 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 세포는 내피 세포이다. 추가의 측면에서, 내피 세포는 관상동맥 내피 세포이다. 일부 측면에서, 본 방법은 시험관 내에서 수행된다. 다른 측면에서, 본 방법은 생체 내에서 수행된다.
부가적으로, LOX1 활성의 차단 또는 감소 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 본 발명은 LOX1과 LOX1-결합 단백질, 예컨대 oxLDL, AGE, 및/또는 CRP 사이의 상호작용을 감소시키거나 저해하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 투여하는 단계를 포함하는 LOX1 활성의 차단 방법을 제공한다. 일부 측면에서, LOX1은 내피 세포, 대식 세포, 혈관 평활근 세포 및/또는 혈소판의 표면 상에서 발현된다. 일부 측면에서, 세포는 내피 세포, 예컨대 관상동맥 내피 세포이다. 추가의 측면에서, 세포는 혈관 평활근 세포, 대식 세포, 또는 혈소판이다. 다른 측면에서, 세포는 아테롬성 동맥 경화증 조직의 일부이다. 일부 측면에서, 본 방법은 생체 내에서 수행된다. 다른 측면에서, 본 방법은 시험관 내에서 수행된다. 일부 측면에서, 차단된 또는 감소된 LOX1 활성은 oxLDL의 결합 및/또는 흡수 (taking up) (예를 들어 내재화)이다. 추가의 측면에서, 차단된 또는 감소된 LOX1 활성은 p38 (MAPK), p44/42 MAPK, 단백질 키나아제 C (PKC), 단백질 키나아제 B (PKB), 단백질 타이로신 키나아제 (PTK), 전사 인자 NF-KB 및/또는 AP1 시그널링 경로의 유도이다. 추가의 측면에서, 차단된 또는 감소된 LOX1 활성은 아폽토시스의 유도이다. 추가의 실시 양태에서, 아폽토시스의 유도는 카스파아제-9, 카스파아제-3 및/또는 Bcl-2에 의해 매개된다. 추가의 측면에서, 차단된 또는 감소된 LOX1 활성은 LOX1을 발현하는 내피 세포에서의 헤파린-결합 EGF-유사 단백질 (heparin-binding EGF-like protein; HB-EGF) 및/또는 PDFG의 A 및 B 사슬의 발현이다. 일부 측면에서, 차단된 또는 감소된 LOX1 활성은 LOX1에의 oxLDL의 결합에 의해 유도되는 LOX1 활성이다.
부가적으로, 증가된 LOX1 활성 수준 또는 LOX1 발현 수준 (예를 들어 sLOX1의 혈청중 단백질 수준)과 연관된 병리학적 병태에서의 LOX1 활성의 차단 또는 감소 방법이 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 증가된 LOX1 활성 또는 LOX1 발현 수준 (예를 들어 sLOX1의 혈청중 단백질 수준)을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 병리학적 병태는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 당뇨병, 고혈압, 고혈당증, 심부전, 혈관 손상, 이식, 이상 지질 혈증 (고지혈증), 염증, (예를 들어, 만성 염증 및 내독소 유도성 염증) 또는 세균 감염이다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 혈청중 수준의 OxLDL을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 혈청중 수준의 OxLDL, 15 리포옥시게나아제 변형 LDL, 15 리포옥시게나아제 변형 HDL, 글리옥시다이즈드 (glyoxidized) LDL, 라이소포스파티딜콜린에스테라아제 (lysophosphatidylcholinesterase; LPC) 및/또는 팔미트산을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 상승된 혈청중 수준의 TNF 알파, IL1, 인터페론 감마, LPS (리포다당류 (lipopolysaccharide)), CRP, 안지오텐신 (angiotensin) II, 엔도텔린 (endothelin) I, 및/또는 AGE를 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 상승된 혈청중 수준의 용해성 LOX1 (sLOX1)을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 LOX1 유전자에서 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 갖는다. 일부 측면에서, LOX1 유전자에서의 SNP는 LOX1 K167N 변이체이다.
고밀도 리포단백질 (HDL) 활성의 작동 또는 증가 방법이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 본 발명은 HDL 활성의 증가 또는 작동 방법을 제공하며, 이는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함에 의한 것이다. 일부 측면에서, 증가된 HDL 활성은 HDL-매개된 내피 NO 생성의 촉진이다. 일부 측면에서, 증가된 HDL 활성은 내피 세포의 NFKB 시그널링 활성의 저해이다. 일부 측면에서, 증가된 HDL 활성은 내피 세포 복구의 촉진이다. 일부 측면에서, 증가된 HDL 활성은 염증의 감소이다.
도 1은 항체 LOX514 및 LOX696에 의한 인간 LOX1 (hLOX1)에의 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP 결합의 저해를 나타낸다. hLOX1 트랜스펙션된 세포에의 다이라이트 (DyLight) 649 표지된 ox-LDL (도 1a) 또는 다이라이트 649 표지된 AGE-BSA의 결합 (도 1b) 또는 재조합 hLOX1에의 비오틴 표지된 C-반응성 단백질 (CRP)의 결합 (도 1c)을 구매가능한 마우스 항-LOX-1 항체인 LOX514 ("LOX10514-IgG1-TM") (마름모), LOX696 ("LOX10696-IgG1-TM") (원) 또는 23C11 (정사각형)의 존재 하에 측정하였다. 대표적인 그래프가 도 1a, 도 1b 및 도 1c에 도시되어 있으며, 이는 각각 LOX514 및 LOX696에 의한 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP의 용량-의존적 저해를 도시한다. 게다가, LOX514 및 LOX696은 또한 hLOX1 K167N 트랜스펙션된 세포에의 다이라이트 649 표지된 ox-LDL의 결합을 차단하며 (도 1d), 이는 이러한 항체가 LOX1 SNP K167N 변이체에 결합하여 LOX1 SNP K167N 변이체에의 oxLDL의 결합을 차단함을 확인해 주는 것이다. 이러한 결과는 항체 LOX514 및 LOX696에 의한 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP에의 LOX1 결합의 특이적, 다중-리간드 저해를 입증하며; LOX514 및 LOX696이 보통의 LOX1 SNP K167N 변이체와 기능적으로 교차 반응함을 입증한다. M= 항체의 몰 농도; 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 2는 항체 LOX514 및 LOX696에 의한 oxLDL 내재화 및 oxLDL-의존성 반응성 산호 화학종 (reactive oxygen species; ROS) 생성의 저해를 나타낸다. 인간 LOX1 트랜스펙션된 세포에서의 사이퍼 (Cypher) 5E 표지된 ox-LDL의 내재화 (도 2a) 또는 oxLDL-의존적 ROS 생성 (도 2b)을 구매가능한 마우스 항-LOX-1 항체인 LOX514 ("LOX10514-IgG1-TM") (마름모), LOX696 ("LOX10696-IgG1-TM") (원) 또는 23C11 (정사각형)의 존재 하에 측정하였다. 대표적인 그래프가 도 2a 및 도 2b에 도시되어 있으며, 이는 각각 LOX514 및 LOX696에 의한 oxLDL 내재화 및 oxLDL-의존적 시그널링의 용량-의존적 저해를 도시한다. hLOX1 트랜스펙션된 세포에서의 oxLDL-의존적 ROS 생성에 있어서, LOX514, LOX696 및 23C11을 이용한 분석법에서 생성된 카르복시-디클로로플루오레세인 (DCF)의 양의 상대적 형광 단위 (relative fluorescent unit; RFU)가 3회 반복에 대하여 평균한 것으로서 도시되어 있다 (도 2b). 이러한 결과는 항체 LOX514 및 LOX696이 oxLDL 내재화 및 oxLDL-의존적 LOX-1 시그널링을 저해함을 입증한다. M= 항체의 몰 농도; 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 3은 항-LOX1 항체, LOX514 및 LOX696의 종 교차 반응성을 나타낸다. 다양한 LOX1 종 오르소로그 (ortholog)에 대한 항-인간 LOX1 항체의 교차 반응성을 scFv 결합 ELISA를 이용하여 평가하였다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, LOX514 ("LOX10514") 및 LOX696 ("LOX10696")은 인간 및 시노몰구스 (cynomolgus) LOX1에는 결합하지만 마우스, 래트 또는 토끼 LOX1 오르소로그 또는 소 혈청 알부민 (음성 대조구)에는 결합하지 않는다. 또한, LOX-1과 관련된 다른 인간 C 타입 렉틴 및 스캐빈저 수용체에 대한 LOX514 및 LOX696의 특이성을 IgG 결합 ELISA를 이용하여 평가하였다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, LOX514 ("LOX10514 IgG1-TM") 및 LOX696 ("LOX10696 IgG1-TM")은 단지 인간 LOX1에 결합하며, 인간 CLEC-7A, CLEC-1A, CLEC-4L, CLEC-1B, SR-A1 또는 SR-B3에는 결합하지 않는다. 예상되는 바와 같이, 아이소타입 (isotype) 대조 항체인 CAT252 IgG1-TM은 테스트한 인간 C 타입 렉틴 및 스캐빈저 수용체 중 어떠한 것에도 결합하지 않았다. CLEC-7A= C-타입 렉틴 도메인 패밀리 7 멤버 A (덱틴 (Dectin)-1로도 공지됨); CLEC-1A= C-타입 렉틴 도메인 패밀리 1 멤버 A; CLEC-4L = C-타입 렉틴 도메인 패밀리 4 멤버 L (DC-SIGN으로도 공지됨); CLEC-1B= C-타입 렉틴 도메인 패밀리 1 멤버 B (CLEC-2로도 공지됨); SR-A1 = 대식 세포 스캐빈저 수용체 제I형 및 제II형 (MSR로도 공지됨); SR-B3= 혈소판 당단백질 4 (CD36으로도 공지됨). 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 4는 LOX514와 몇몇 최적화된 LOX514 항체 사이의 비교를 나타낸다. LOX514와 최적화된 LOX514 항체 사이의 중쇄 가변 영역 (VH) (도 4a) 또는 경쇄 가변 영역 (VL) (도 4b)의 아미노산 서열 정렬이 예시되어 있다. LOX514 VH 또는 VL과의 차이가 하이라이트 표시되어 있다. FW = 프레임워크 (framework); CDR = 상보성 결정 영역.
도 5는 LOX696과 몇몇 최적화된 LOX696 항체 사이의 비교를 나타낸다. LOX696과 최적화된 LOX696 항체 사이의 중쇄 가변 영역 (VH) (도 5a) 또는 경쇄 가변 영역 (VL) (도 5b)의 아미노산 서열 정렬이 예시되어 있다. LOX696 VH 또는 VL과의 차이가 하이라이트 표시되어 있다. FW = 프레임워크; CDR = 상보성 결정 영역.
도 6은 LOX-1과 관련된 몇몇 인간 C 타입 렉틴 및 스캐빈저 수용체와 비교하여 인간 LOX1에 대한 항-LOX1 항체의 특이성을 나타낸다. 인간 LOX-1 및 LOX-1과 관련된 다른 인간 C 타입 렉틴 및 스캐빈저 수용체에 대한 IgG1-TM 포맷 (format)의 항-LOX1 항체 LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl ("LX6960073") 및 LX6960073_G82bS_gl ("LX6960073G82bS")의 특이성을 IgG 결합 ELISA를 이용하여 평가하였다. LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl 및 LX6960073_G82bS_gl은 단지 인간 LOX1에 결합하며, 인간 CLEC-7A, CLEC-1A, CLEC-4L, CLEC-1B, SR-A1 또는 SR-B3에는 결합하지 않는다. 아이소타입 인간 IgG1-TM 대조 항체인 NIP228은 테스트한 인간 LOX-1 또는 임의의 인간 C 타입 렉틴 및 스캐빈저 수용체에 결합하지 않았다. CLEC-7A= C-타입 렉틴 도메인 패밀리 7 멤버 A (덱틴-1로도 공지됨); CLEC-1A= C-타입 렉틴 도메인 패밀리 1 멤버 A; CLEC-4L = C-타입 렉틴 도메인 패밀리 4 멤버 L (DC-SIGN으로도 공지됨); CLEC-1B= C-타입 렉틴 도메인 패밀리 1 멤버 B (CLEC-2로도 공지됨); SR-A1 = 대식 세포 스캐빈저 수용체 제I형 및 제II형 (MSR로도 공지됨); SR-B3= 혈소판 당단백질 4 (CD36으로도 공지됨). 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 7은 다양한 LOX1 종 오르소로그에 대한 항-LOX1 항체의 교차 반응성을 나타낸다. 다양한 LOX1 종 오르소로그에 대한 IgG1-TM 포맷의 항-LOX1 항체 LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl 및 LX6960073_G82bS_gl의 교차 반응성을 IgG 결합 ELISA를 이용하여 평가하였다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, 항-LOX1 항체 LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl 및 LX6960073_G82bS_gl은 인간 및 시노몰구스 LOX1에는 결합하지만 마우스 또는 래트 LOX1 오르소로그 또는 CD86 (음성 대조구)에는 결합하지 않는다. 단지 LX5140108, LX5140110 및 LX5140092_N>D가 토끼 LOX-1에 또한 결합한다. 아이소타입 인간 IgG1-TM 대조 항체인 NIP228은 테스트한 CD86 또는 임의의 LOX-1 오르소로그에 결합하지 않았다. 게다가, 인간 (huLOX) 및 시노몰구스 (cyLOX) LOX1 사이의 교차 반응성 특성화를 경쟁 ELISA를 이용하여 항-LOX1 IgG1-TM 항체 LX5140108, LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl ("LX6960073_G82bS")에 대하여 수행하였다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, LX5140108 (원), LX5140110 (정사각형) 및 LX6960073_G82bS_gl (삼각형)은 시노몰구스 LOX1 및 인간 LOX1 둘 모두와 경쟁하며, 이는 항-LOX1 항체 LX5140108, LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl의 시노몰구스 교차 반응성을 추가로 확인해 준다. 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 8은 항체 LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl에 의한 인간 LOX1 (hLOX1)에의 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP의 결합의 저해, oxLDL 내재화의 저해 및 oxLDL-의존적 LOX-1 시그널링의 저해를 나타낸다. hLOX1 트랜스펙션된 세포에의 다이라이트 649 표지된 ox-LDL (도 8a) 또는 다이라이트 649 표지된 AGE-BSA (도 8b)의 결합 또는 재조합 hLOX1 (도 8c)에의 비오틴 표지된 C-반응성 단백질 (CRP)의 결합을 LX5140110-IgG1-TM ("LOX514_110"; 원, 도 8a 및 도 8c, 정사각형, 도 8b), 또는 LX6960073_G82bS_gl-IgG1-TM ("LX6960073_G82bS"; 정사각형, 도 8a 및 도 8c, 원, 도 8b)의 존재 하에 측정하였다. 대표적인 그래프가 도 8a, 도 8b 및 도 8c에 도시되어 있으며, 이는 각각 LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl에 의한 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP의 용량-의존적 저해를 도시한다. 게다가, LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl은 또한 hLOX1 K167N 트랜스펙션된 세포에의 다이라이트 649 표지된 ox-LDL의 결합을 차단하며 (도 8d), 이는 이러한 항체가 LOX1 SNP K167N 변이체에 결합하여 LOX1 SNP K167N 변이체에의 oxLDL의 결합을 차단함을 확인해 주는 것이다. LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl이 oxLDL 내재화 및 oxLDL-의존적 LOX-1 시그널링을 차단하는 능력을 조사하기 위하여, 인간 LOX1 트랜스펙션된 세포에서의 사이퍼 5E 표지된 ox-LDL의 내재화 (도 8e) 또는 oxLDL-의존적 ROS 생성 (도 8f)을 LX5140110-IgG1-TM ("514_110", 원, 도 8e; &"LOX10514_110", 마름모, 도 8f), 또는 LX6960073_G82bS_gl-IgG1-TM ("LX6960073_G82bS", 정사각형, 도 8e; 및 "LOX10696_73", 정사각형, 도 8f)의 존재 하에 측정하였다. 대표적인 그래프가 도 8e 및 도 8f에 도시되어 있으며, 이는 각각 LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl에 의한 oxLDL 내재화 및 oxLDL-의존적 ROS 생성의 용량-의존적 저해를 도시한다. 이러한 결과는 하기를 입증한다: (1) 항체 LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl에 의한 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP에의 LOX1의 결합의 특이적, 다중-리간드 저해; (2) LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl은 보통의 LOX1 SNP K167N 변이체와 기능적으로 교차 반응함; 및 (3) LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl은 oxLDL 내재화 및 oxLDL-의존적 LOX-1 시그널링을 저해함. M= 항체의 몰 농도; 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 9a는 LX5140110에 의한 인간 대동맥 내피 세포 (HAEC)에서의 OxLDL 흡수의 저해를 나타낸다. 0, 0.5, 1, 5, 또는 10 nM의 항-LOX1 항체 LX5140110 ("514") 또는 10 nM의 대조 항체 (NIP)와 함께 인큐베이션한 HAEC에 의한 알렉사플루오르568 (AlexaFluor568)-OxLDL의 흡수를 형광 현미경법을 이용하여 측정하여 HAEC에 의한 산화 저밀도 리포단백질 (OxLDL)의 결합 및 내재화를 차단하는 LX5140110의 능력을 테스트하였다. 각각의 세트에 있어서 대략 12개의 영상을 분석하고, 1시간의 인큐베이션 후 각각의 세포에서의 알렉사플루오르-568-콘쥬게이션된 (conjugated)-OxLDL의 적색 형광 소포의 평균 개수를 결정하였다. 표준 편차가 1인 세포당 소포의 수를 보고한다. 이러한 결과는 5 nM 또는 10 nM의 LX5140110이 HAEC에 의한 OxLDL 흡수를 유의하게 저해함을 입증한다 (각각 5 nM 및 10 nM의 경우 p=0.0003 또는 p=0.0002). *는 비처리 대조구 (단지 알렉사-플루오르 태그된 (tagged) OxLD와 함께, 그리고 항체 없이 인큐베이션한 세포)와 비교하여 P<0.05임을 나타내며; 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 9b는 NFκB-루시퍼라아제를 공동 발현하는 LX5140110.HAEC에 의한 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)에서의 OxLDL-의존적 NFκB 시그널링의 감소를 나타내며, GFP를 24시간 동안 혈청 기아 (serum starvation)를 주고, 비히클 (대조구); OxLDL 단독 (50 μg/ml); OxLDL (50 μg/ml) + LX5140110 ("514") (10 nM); 또는 OxLDL (50 μg/ml) + NIP (10 nM)와 함께 8시간 동안 인큐베이션하였다. 루시퍼라아제 활성 및 발광을 측정하는 한편, GFP 형광을 정규화 대조구로서 이용하였다. 이러한 결과는 10 mM LX5140110의 첨가가 HAEC에서의 OxLDL-의존적 NFkB 시그널링을 유의하게 감소시키지만 NIP (대조 항체)는 그렇지 않음을 입증한다. 각각의 군에 있어서 N=5이며; *는 (비히클 단독의 대조구와 비교하여) P<0.05임을 나타내며; #는 (OxLDL 단독과 비교하여) P<0.05임을 나타내며; 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 9c는 LX5140110에 의한 인간 대동맥 내피 세포 (HAEC)에서의 아르기나아제 활성의 OxLDL-의존적 증대의 저해를 나타낸다. HAEC를 24시간 동안 혈청 기아를 주고, 비히클 단독 (대조구); OxLDL (50 μg/ml); OxLDL (50 μg/ml) + LX5140110 ("514") (1 nM); OxLDL (50 μg/ml) + LX5140110 ("514") (3 nM); OxLDL (50 μg/ml) + LX5140110 ("514") (10 nM); 또는 OxLDL (50 μg/ml) + NIP (10 nM)와 함께 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 용해시키고, 아르기나아제 활성을 우레아 분석법을 이용하여 결정하였다. 이러한 결과는 3 nM 또는 10 nM LX5140110의 첨가가 HAEC에서의 OxLDL-의존적 아르기나아제 활성을 용량-의존적 방식으로 유의하게 감소시키지만 10 nM NIP (대조 항체)는 그렇지 않음을 입증한다. 각각의 군에 있어서 N=3이며; *는 비히클 단독의 대조구와 비교하여 P<0.05임을 나타내며; #는 OxLDL (50 μg/ml) 대조구 (항체 없음)와 비교하여 P<0.05임을 나타내며; 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 9d는 LX5140110이 HAEC에 의한 산화질소 생성의 OxLDL-의존적 감소를 차단함을 나타낸다. HAEC를 하룻밤 혈청 기아를 주고 (1% 혈청), 비히클 (대조구); OxLDL (50 μg/ml); OxLDL (50 μg/ml) + LX5140110 ("514") (0.5 nM); OxLDL (50 μg/ml) + LX5140110 ("514") (1 nM); OxLDL (50 μg/ml) + LX5140110 ("514") (5 nM); OxLDL (50 μg/ml) + LX5140110 ("514") (10 nM); 또는 OxLDL (50 μg/ml) + NIP (10 nM)와 함께 24시간 동안 인큐베이션시킨 후, 신선 배지 중 DAF-FM DA (5 μM)를 첨가하고, DAF-FM DA의 총 형광을 측정하였다. 이러한 결과는 5 nM 또는 10 nM LX5140110의 첨가가 HAEC의 산화질소 생성의 OxLDL-의존적 감소를 용량-의존적 방식으로 유의하게 저해하지만 10 nM NIP (대조 항체)는 그렇지 않음을 입증한다. 산화질소 (NO)가 eNOS에 의해 생성됨을 확인하기 위하여, NOS 저해제 L-NAME를 대조구로서 사용하였다 (데이터는 예시되어 있지 않음). 각각의 군에 있어서 N=5이며; *는 (비히클 단독의 대조구와 비교하여) P<0.05임을 나타내며; 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 9e는 LX5140110이 HAEC에 의한 반응성 산소 화학종 (ROS) 생성의 OxLDL-의존적 증가를 차단함을 나타낸다. HAEC를 하룻밤 혈청 기아를 주고 (1% 혈청), 비히클 (대조구); OxLDL (50 μg/ml); OxLDL (50 μg/ml) + LX5140110 ("514") (0.5 nM); OxLDL (50 μg/ml) +LX5140110 ("514") (1 nM); OxLDL (50 μg/ml) +LX5140110 ("514") (5 nM); OxLDL (50 μg/ml) +LX5140110 ("514") (10 nM); 또는 OxLDL (50 μg/ml) +NIP (10 nM)와 함께 24시간 동안 인큐베이션한 후, 상기 세포를 400 μM의 루미놀 유사체 L-012를 포함하는 페놀 무함유 신선 배지와 함께 인큐베이션하였다. 루미놀 유사체 L-012의 발광으로부터 정량화된 상대적 광 단위 (RLU)는 ROS의 생성의 변화를 나타낸다. 이러한 결과는 0.5 nM, 1 nM, 5 nM 또는 10 nM LX5140110의 첨가가 HAEC에서의 OxLDL-의존적 ROS 생성을 저해하지만, 10 nM NIP (대조 항체)는 그렇지 않음을 입증한다. 수퍼옥시드 (superoxide)가 eNOS에 의해 생성됨을 확인하기 위하여, NOS 저해제 L-NAME를 대조구로서 사용하였다 (데이터는 현재 예시되어 있음). 각각의 군에 있어서 N=5이며; *는 비히클 단독의 대조구와 비교하여 P<0.05임을 나타내며; #는 OxLDL (50 μg/ml) 대조구 (항체 없음)와 비교하여 P<0.05임을 나타내며; 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 9f는 루미놀 유사체 L-012가 반응성 산소 화학종 (ROS)에 특이적임을 나타낸다. HAEC를 하룻밤 혈청 기아를 주고 (1% 혈청), 비히클 (Veh) 또는 수퍼옥시드 스캐빈저 SOD (5 mM)와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 나타낸 바와 같이, 도 9e에서 수퍼옥시드 스캐빈저 SOD의 첨가는 실질적으로 검출불가능한 발광 수준을 생성함으로써 수퍼옥시드 (ROS) 측정에 있어서의 L-012의 특이성을 확인해 주었다. *는 (비히클과 비교하여) P<0.05임을 나타내며; 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 9g 및 도 9h는 LX5140110이 타이로신 (Y) 397에서의 초점 유착 키나아제 (Focal Adhesion Kinase; FAK)의 OxLDL-매개된 포스포릴화를 차단함을 나타낸다. HAEC를 18시간 동안 혈청 기아를 주고, 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 또는 10 nM의 항-LOX1 항체 LX5140110 (514) 또는 10 nM의 대조 항체 (NIP)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후, 50 μg/ml의 OxLDL을 포함하는 신선 배지에서 1시간 동안 세포를 인큐베이션하고, 4%에서 15%까지의 구배의 폴리아크릴아미드 겔 상에서 10 μg의 단백질 용해물을 러닝 (running)시켰다. SDS-PAGE를 받은 단백질 샘플을 웨스턴 블로팅 (Western blotting)을 위하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. Tyr397에서의 FAK 포스포릴화의 변화 및 GAPDH의 발현의 변화를 나타내는 대표적인 블롯이 도 9g에 예시되어 있는 반면, GAPDH 발현에 대하여 정규화한 Tyr397에서의 FAK 포스포릴화 (pY397-FAK)의 증가 백분율의 정량화가 도 9h에 예시되어 있다. 이러한 결과는 5 nM 또는 10 nM LX5140110의 첨가가 HAEC에서의 Tyr397에서의 OxLDL-매개된 FAK 포스포릴화를 저해함을 입증한다. *는 (비처리된 대조구와 비교하여) P<0.05임을 나타내며; #는 0 nM LX5140110 (514)과 비교하여 P<0.05임을 나타내며; 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 9i는 LOX1이 HAEC에서의 OxLDL 시그널링에 필요함을 나타낸다. 인간 대동맥 내피 세포 (HAEC)를 NFKB-LUC와, 비-표적화 shRNA (Ad-NTsh) 또는 Lox-1 shRNA (Ad-Lox-1sh) 중 어느 하나를 코딩하는 아데노바이러스들로 공동 형질도입시켜서 LOX1 발현을 특이적으로 저해하였다. 형질도입한지 24시간 후, 세포를 OxLDL (50 μg/ml)을 이용하거나 이용하지 않고서 처리하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 화학발광을 이용하여 세포 용해물에서 측정하였다. Ad-LOX-1sh는 대조, 비-표적화 shRNA (Ad-NTsh) 바이러스와 함께 인큐베이션한 세포와 비교하여 HAEC에서의 OxLDL-매개된 NFkB 시그널링을 유의하게 저해하였다. *는 (비처리된 대조구와 비교하여) P<0.05임을 나타내며; #는 OxLDL + Ad-NTsh와 비교하여 P<0.05임을 나타낸다.
도 9j는 인간 LOX1 유전자의 5'UTR 영역에 대한 짧은 간섭 헤어핀 (interfering short hairpin) RNA (shRNA)를 발현하는 바이러스 벡터 (LOX1-shRNA)가 LOX1 단백질 발현을 감소시킴을 나타낸다. LOX1 단백질 발현을 하기 샘플로부터의 항-Lox1 (IB:LOX-1) 및 항-GAPDH (IB:GAPDH, 여기서 단백질 로딩 대조구로서 사용됨) 항체를 이용한 면역블로팅에 의해 모니터링하였다: 비-표적화 shRNA (NTshRNA)로 형질도입된 HAEC의 용해물 (레인 1 및 2), 또는 Lox-1 shRNA로 형질도입된 HAEC의 용해물 (레인 3). 레인 2 및 3의 용해물을 OxLDL (50 μg/ml)로 처리한 반면, 레인 1의 용해물은 OxLDL에 노출시키지 않았다. LOX1-shRNA의 첨가는 비-표적화 shRNA로 처리한 세포로부터의 용해물 (레인 1 및 2)에서 측정한 수준과 비교하여 LOX1 단백질 발현 (레인 3)을 유의하게 감소시켰다. 이러한 데이터는 LOX1-shRNA가 HAEC에서의 LOX1 발현을 효과적으로 저해함을 확인해 준다.
도 9k는 인간 LOX1 유전자의 5'UTR 영역에 대한 짧은 간섭 헤어핀 RNA (shRNA)를 발현하는 바이러스 벡터 (Ad-LOX-1shRNA)가 LOX1 단백질 발현을 용량-의존적 방식으로 감소시킴을 나타낸다. 증가하는 농도의 Lox-1 shRNA (Ad-LOX-1shRNA) (각각 레인 1 내지 5에 있어서 0, 10, 20, 30 및 100 MOI)로 형질도입된 HAEC를 OxLDL (50 μg/ml)로 자극하였다 (레인 1에 나타낸 비자극된 대조 샘플은 제외함). 세포 용해물을 수득하고, 항-Lox-1 항체로 면역블로팅하였다. 데이터는 3회 이상의 독립 실험을 대표한다. Ad-LOX-1shRNA는 LOX1 단백질 발현을 용량-의존적 방식으로 유의하게 감소시켰다.
도 10은 LX5140110 ("514Ab")을 포함하는 본원에 개시된 항-LOX1 항체에 의해 차단되는 LOX1 수용체 시그널링에 연루된 시그널링 경로들 중 일부를 나타낸다.
본 발명은 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체인 LOX1 활성의 길항제를 제공한다. 관련된 핵산, LOX1-결합 단백질을 포함하는 조성물, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 방법이 또한 제공된다. 대상체에서 예를 들어, LOX1-결합 단백질 연관된 질환 또는 병태, 예컨대 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, 관상 동맥 질환 (CAD), 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증 (예를 들어, 만성 염증), 혈관 형성, 자간전증 또는 암을 개선시킴에 있어서의 그리고 진단 용도에서의 LOX1-결합 단백질의 사용 방법이 추가로 제공된다.
본 발명이 더 쉽게 이해될 수 있게 하기 위하여, 먼저 특정 용어가 정의된다. 추가의 정의는 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용] 전체에 걸쳐 개시되어 있다.
I. 정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 그 문맥이 명백히 달리 진술하지 않으면 복수형 지시 대상을 포함한다. 단수형 용어 ("a" 또는 "an")와, "하나 이상" 및 "적어도 하나"라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 "약"이라는 용어는 대략적으로, ~ 정도, 거의 또는 ~쯤을 의미하도록 사용된다. "약"이라는 용어를 수치 값 또는 수치 범위와 함께 사용할 때, 이것은 개시된 수치 값 또는 수치 범위의 상하의 경계를 연장시킴으로써 그 값 또는 범위를 변경시킨다. 일반적으로, "약"이라는 용어는 본원에서 수치 값 또는 수치 범위를 진술된 값 또는 범위의 상하로 10%의 변동률만큼 변경하도록 사용된다.
더욱이, "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2가지의 특정된 특징 또는 구성요소 각각의 특정한 개시 내용으로서 취하려는 것이다. 따라서, "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어는 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어는 하기 측면 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명과 관련된 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; 문헌[The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 문헌[Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]에는 이러한 개시 내용에서 사용되는 용어들 중 많은 것에 대한 일반 사전을 숙련자에게 제공한다.
단위, 접두어 및 부호를 그의 국제 단위계 (; SI) 용인된 형태로 나타낸다. 수치 범위는 그 범위를 정의하는 수를 포함한다. 달리 표시되지 않으면, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 좌측에서 우측으로 표기된다. 본원에 제공된 제목은 본 발명의 다양한 측면을 제한하는 것이 아니며, 이는 전체로서의 본 명세서의 참고에 의한 것일 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 본 명세서를 전체적으로 참고함으로써 더 충분히 정의된다.
측면이 "포함하는"이라는 언어를 이용하여 기술되는 곳이라면 어디든지, 달리 "~로 이루어진" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어진"의 용어로 기술된 유사한 측면이 또한 제공된다.
본원에서 아미노산은 그의 일반적으로 공지된 3문자 부호로 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회 (IUPAC-IUB)에 의해 권고되는 1문자 부호로 언급된다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 그의 일반적으로 용인되는 1문자 코드로 언급된다.
본원에서 "LOX1" 및 "렉틴-유사 산화 저밀도 리포단백질 수용체-1"이라는 용어는 상호교환가능하게 사용되며, LOX1 및/또는 LOX1의 생물학적 활성 단편을 나타낸다. 3가지의 hLOX1 아이소형의 cDNA 및 아미노산 서열은 젠뱅크 (GenBank) 등록 번호 NP_002534.1, NP_001166103.1, 및 NP_001166104.1로 제공되며, 이들 각각은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
"저해하다", "차단하다" "감소시키다" 및 "억제하다"라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 활성의 충분한 차단을 포함하는 생물학적 활성의 임의의 통계학적으로 유의한 감소를 나타낸다. 예를 들어, "저해"는 LOX1의 생물학적 활성의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 감소를 나타낼 수 있다. 따라서, "저해" 또는 "억제"라는 용어가 예를 들어 세포 표면 LOX1을 발현하는 세포 (예를 들어, 내피 세포, 평활근 세포, 대식 세포 및 혈소판)에서의 그리고 LOX1 리간드 (예를 들어, oxLDL, CRP 및 AGE)의 존재 하에서의 LOX1-매개된 신호 전달 경로에 대한 영향을 기술하기 위하여 적용될 때, 상기 용어는 상기 세포에서 LOX1-결합 단백질, 예를 들어, 항-LOX1 항체가 LOX1-매개된 유도된 신호 전달을 통계학적으로 유의한 수준으로 (예를 들어, p 값을 0.05 이하로 함) 감소시키는 능력을 나타낸다. 일부 측면에서, LOX1-매개된 신호 전달 경로는 RhoA/Rac1, 일산화질소, p38MAPK, 단백질 키나아제 B 및 C, ERK1/2, 및/또는 NFκB로부터 선택되는 멤버이다. 추가의 측면에서, 저해된 또는 차단된 LOX1-매개된 생물학적 활성은 세포 예정사 (programmed cell death) (즉, 아폽토시스)이다. 추가의 실시 양태에서, 감소된, 저해된 또는 차단된 LOX1-매개된 생물학적 활성은 LOX1-매개된 증가된 카스파아제 8, 카스파아제 9, 및/또는 감소된 BAX 활성이다. 세포 표면 LOX1을 발현하는 세포는 천연 발생 세포 (예를 들어, 인간 내피 세포, 평활근 세포, 및 대식 세포), 세포주로부터의 세포 또는 LOX1을 코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 도입함으로써 생성된 재조합 세포 일 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "항체" 또는 "면역글로불린"이라는 용어는 전체 항체 및 이의 임의의 항원-결합 단편 또는 단쇄를 포함한다. 전형적인 하에는 적어도 2개의 중쇄 (H chain) 및 2개의 경쇄 (L hain)가 디술피드 결합에 의해 상호연결된 것을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2, 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, Cl로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 더 보존된, 프레임워크 영역 (FW)으로 칭해지는 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 초가변성의 영역들로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FW로 구성된다: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포), 및 고전적 보체계 (classical complement system)의 첫 번째 구성요소 (C1q)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 본 발명의 예시적인 항체는 전형적인 항체, scFv, 및 예를 들어 scFv가 전형적인 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단에 (예를 들어, 펩티드 결합을 통하여 또는 화학적 링커를 통하여) 공유 결합되거나 전형적인 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 내에 삽입된 이들의 조합을 포함한다.
"항체"라는 용어는 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 전술한 것의 조합을 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통하여 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 나타낼 수 있다. "항체"라는 용어는 단클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 2특이성 항체, 다중특이성 항체 또는 이들의 항체 단편을 포함한다.
"항체"라는 용어는 온전한 다클론 항체, 온전한 단클론 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편), 단쇄 Fv (scFv) 돌연변이체, 다중특이성 항체, 예컨대 적어도 2가지의 온전한 항체로부터 생성된 2특이성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자 (항체가 요망되는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면)를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 칭해지는 중쇄 불변 도메인의 아이덴티티 (identity)를 기반으로 하면, 하기의 면역글로불린의 임의의 5가지 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 하위클래스 (아이소타입 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 것일 수 있다. 상이한 면역글로불린 클래스는 상이한 그리고 잘 알려진 서브유닛 구조 및 3차원 배열을 갖는다. 항체는 네이키드형 (naked)이거나 다른 분자, 예컨대 독소, 방사성 동위 원소 등에 콘쥬게이션될 수 있다.
"생식 세포 계열화 (germlining)"라는 용어는 항체에서 특정 위치의 아미노산이 생식 세포 계열 (germ line)에서 발견되는 것과 동일한 위치에 나타나는 아미노산으로 역돌연변이됨을 의미한다.
"항원-결합 항체 단편" 또는 "LOX1-결합 항체 단편"이라는 용어는 온전한 항체의 일부분을 나타내며 온전한 항체의 상보성 결정 가변 영역을 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 단쇄 항체 (예를 들어, ScFv), 및 다중특이성 항체 (항체 단편으로부터 형성됨)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가로 본 발명은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디, 또는 단쇄 항체 분자인 LOX1-결합 항체 단편을 제공한다.
"단클론 항체"는 단일 항원 결정자, 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 연루된 균질한 하에 집단을 나타낸다. 이것은 전형적으로 상이한 항원 결정자들에 대하여 유도된 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 대조적이다. "단클론 항체"라는 용어는 온전한 단클론 항체 및 전장 단클론 항체 둘 모두와, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 더욱이, "단클론 항체"는 하이브리도마, 파지 선발, 재조합 발현, 및 트랜스제닉 (transgenic) 동물에 의한 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 수많은 방식으로 만들어진 그러한 항체를 나타낸다.
"인간화 항체"라는 용어는 최소 비-인간 (예를 들어, 쥐과) 서열을 포함하도록 엔지니어링된 비-인간 (예를 들어, 쥐과) 면역글로불린으로부터 유래된 항체를 나타낸다. 전형적으로, 인간화 항체는 상보성 결정 영역 (CDR)로부터의 잔기가 요망되는 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다 (문헌[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]). 일부 예에서,인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FW) 잔기는 요망되는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체에서의 상응하는 잔기로 대체된다.
인간화 항체는 항체 특이성, 친화성, 및/또는 능력을 개량 및 최적화하기 위하여 Fv 프레임워크 영역 내에서의 및/또는 대체되는 비-인간 잔기 내에서의 추가의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함하는 적어도 1개, 그리고 전형적으로 2개 또는 3개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함하며, 반면에 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 콘센서스 (consensus) 서열의 것이다. 또한 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc), 전형적으로 인간 변역글로불린의 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 인간화 항체의 생성에 사용되는 방법의 예가 미국 특허 제5,225,539호 또는 미국 특허 제5,639,641호에 기술되어 있다.
항체의 "가변 영역"은 단독의 또는 조합된 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역은 4개의 프레임워크 영역 (FW)이 초가변 영역으로도 공지된 3개의 상보성-결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 것으로 이루어진다. 각각의 사슬에서의 CDR은 FW 영역에 의해, 그리고 다른 사슬로부터의 CDR에 의해 근접하게 결합되어 있으며, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하는 적어도 2가지 기술이 있다: (1) 종 전체에 걸친 서열 가변성을 기반으로 한 접근법 (즉, 문헌[Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기반으로 한 접근법 (문헌[Al-lazikani et al., J. Molec . Biol . 273:927-948 (1997)]). 게다가, 당업계에서 이러한 두 접근법의 조합을 때때로 이용하여 CDR을 결정한다.
일반적으로 카바트 (Kabat) 넘버링 시스템 (numbering system)은 가변 도메인에서의 잔기 (대략적으로 경쇄의 잔기 1 내지 107 및 중쇄의 잔기 1 내지 113)를 나타낼 때 사용된다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). 카바트에서와 같은 아미노산 위치의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서 항체의 컴필레이션 (compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 넘버링 시스템을 나타낸다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 단축 또는 가변 도메인의 FW 또는 CDR 내로의 삽입에 상응하는 더 많은 또는 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤의 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따라 잔기 52a) 및 중쇄 FW 잔기 82 ENLDML 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따라 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다.
잔기의 카바트 넘버링은 주어진 항체와 "기준" 카바트 넘버링 서열과의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 주어진 항체에 대하여 결정될 수 있다. 대신 초티아 (Chothia)는 구조적 루프의 위치를 나타낸다 (문헌[Chothia and Lesk, J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)]). 카바트 넘버링 협약 (convention)을 이용하여 넘버링될 때 초티아 CDR-H1 루프의 말단은 그 루프의 길이에 따라 H32와 H32 사이에서 변한다 (이는 카바트 넘버링 스킴 (scheme)이 삽입을 H35A 및 H35B에 두며; 35A도 존재하지 않고 35B도 존재하지 않을 경우, 루프는 32에서 끝나고; 단지 35A가 존재할 경우, 루프는 33에서 끝나며; 35A 및 35B 둘 모두가 존재할 경우, 루프는 34에서 끝나기 때문이다). AbM 초가변 영역은 카바트 CER과 초티아의 구조적 루프 사이의 타협을 나타내며, 옥스포드 몰레큘라즈 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (Oxford Molecular's AbM antibody modeling software)에 의해 사용된다.
IMGT (임뮤노제네틱스 (ImMunoGeneTics))는 또한 CDR을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 위한 넘버링 시스템을 제공한다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌[Lefranc, M.P. et al., Dev . Comp. Immunol. 27: 55-77(2003)]을 참조한다. IMGT 넘버링 시스템은 초가변 루프의 5,000개 초과의 서열의 정렬, 구조 데이터, 및 특성화를 기반으로 하였으며, 모든 종에 있어서 가변 및 CDR 영역의 용이한 비교를 허용한다. IMGT 넘버링 스킴에 따르면, VH-CDR1은 위치 26 내지 35에 있으며, VH-CDR2은 위치 51 내지 57에 있으며, VH-CDR3은 위치 93 내지 102에 있으며, VL-CDR1은 위치 27 내지 32에 있으며, VL-CDR2는 위치 50 내지 52에 있으며, VL-CDR3은 위치 89 내지 97에 있다.
명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 기술된 VH CDR 서열은 고전적인 카바트 넘버링 위치에 상응하며, 즉, 카바트의 H-CDR1은 위치 31 내지 35에 있고, VH-CDR2는 위치 50 내지 65에 있으며, VH-CDR3은 위치 95 내지 102에 있다. 또한 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3은 고전적 카바트 넘버링 위치, 즉, 각각 위치 24 내지 34, 50 내지 56 및 89 내지 97에 상응한다.
"인간 항체"라는 용어는 인간에 의해 생성된 항체 또는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 만들어진, 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 이러한 인간 항체의 정의는 온전한 항체 또는 전장 항체, 이의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체, 예컨대 쥐과 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.
"키메라 항체"라는 용어는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2가지 이상의 종으로부터 유래된 항체를 나타낸다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 요망되는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 하나의 포유류 종 (예를 들어, 마우스, 래트 등)으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 반면, 불변 영역은 또 다른 것 (일반적으로 인간)으로부터 유래된 항체에서의 서열에 대하여 상동성이어서 그 종에서 면역 반응을 유발하는 것을 회피한다.
"TM" 또는 "TM 돌연변이체"라는 용어는 IgG1 불변 영역에서의 돌연변이를 나타내며, 이는 그 돌연변이를 갖는 항체의 이펙터 기능 (예를 들어, ADCC)을 감소시킨다. TM 돌연변이체는 IgG1의 중쇄 내로 도입된 3개의 돌연변이 L234F/L235E/P331S의 조합을 포함하며, 이는 이펙터 널 인간 IgG1을 생성한다 (문헌[EU numbering Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.]).
"YTE" 또는 "YTE 돌연변이체"라는 용어는 IgG1 Fc에서의 돌연변이를 나타내는데, 이는 그 돌연변이를 갖는 항체의 혈청중 반감기를 향상시키고 인간 FcRn에의 결합을 증가시킨다. YTE 돌연변이체는 IgG1의 중쇄 내로 도입된 3개의 돌연변이 M252Y/S254T/T256E의 조합을 포함한다 (문헌[EU numbering Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.]). 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제7,658,921호를 참조한다. YTE 돌연변이체는 항체의 혈청중 반감기를 상기 항체의 야생형 버전과 비교하여 대략 4배 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌[Dall'Acqua et al., J. Biol . Chem . 281:23514-24 (2006)]). 본원에 그 전체가 참고로 포함된 미국 특허 제7,083,784호를 또한 참조한다.
"LOX1-결합 단백질", "항-LOX1 항체", 또는 "LOX1에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어는 LOX1을 표적화함에 있어서 항-LOX1 항체가 치료제 또는 진단 시약으로 유용해지게 하기에 충분한 친화도로 LOX1에 결합할 수 있는 항-LOX1 항체와 같은 LOX1-결합 단백질을 나타낸다. 관련되지 않은 비-LOX1 단백질에의 항-LOX1 항체의 결합 정도는 예를 들어, 방사성면역분석법 (radioimmunoassay; RIA), 비아코어® (분석물로서 재조합 LOX1, 그리고 리간드로서 항체를 사용하거나 그 반대로 사용함), 동적 배제 분석법 (Kinetic Exclusion Assay) (키넥사®), 또는 당업계에 공지된 다른 결합 분석법에 의해 측정할 때 LOX1에의 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 측면에서, LOX1-결합 단백질은 해리 상수 (KD)가 ≤1 nM, ≤ 0.5 nM, ≤0.1 nM, ≤10 pM, 또는 ≤1 pM이거나, 일부 예에서 KD가 약 150 pM 내지 약 600 pM 또는 약 400 pM 내지 약 600 pM인 전장 항체 또는 LOX1-결합 항체 단편이다. 특정 측면에서, LOX1-결합 단백질은 해리 상수 (KD)가 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤10 pM, ≤1 pM, 또는 ≤0.1 pM이거나, 일부 예에서 KD가 약 150 pM 내지 약 600 pM인 전장 항체 또는 LOX1-결합 항체 단편이다.
"길항" 또는 "차단성" LOX1-결합 단백질은 LOX1의 생물학적 활성을 저해하거나 감소시키는 것이다. 일부 측면에서, 길항 LOX1-결합 단백질은 LOX1이 oxLDL, AGE, 및/또는 CRP에 결합하는 능력을 저해한다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 LOX1이 oxHDL, HSP60, 백혈구 및/또는 활성화된 혈소판에 결합하는 능력을 저해한다. 특정 측면에서, LOX1-결합 단백질은 LOX1의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 저해한다. 바람직하게는, LOX1의 생물학적 활성은 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 100%만큼 감소된다. 특정한 측면에서, LOX1-결합 단백질은 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항체 또는 LOX1-결합 항체 단편이다. 추가의 측면에서, 항-LOX1 항체는 LOX1의 생물학적 활성을 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 100%만큼 저해하거나 감소시킨다.
일반적으로 "결합 친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비-공유적 상호작용들의 총 합계의 강도를 나타낸다. 달리 표시되지 않으면, 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합하는 쌍 (예를 들어, 항체와 항원)의 멤버들 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 비롯하여 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 일반적으로 저-친화성 항체는 항원에 서서히 결합하며 쉽게 해리되는 경향이 있고, 반면에, 일반적으로 고-친화성 항체는 항원에 더 빠르게 결합하며 더 오랫동안 결합된 채로 남아있는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것을 본 발명의 목적을 위하여 사용할 수 있다.
"효력"은 보통은 달리 진술되지 않으면 nM 또는 pM 단위의 IC50 값으로서 표현된다. IC50은 항체 분자의 중간 저해 농도이다. 기능 분석법에서, IC50은 생물학적 응답을 그의 최대치의 50%만큼 감소시키는 농도이다. 리간드-결합 연구에서, IC50은 수용체 결합을 최대의 특이적 결합 수준의 50%만큼 감소시키는 농도이다. IC50은 당업계에 공지된 수단에 의해 계산될 수 있다.
기준 항체와 비교할 때 본원에 개시된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 하에, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)의 효력의 향상 배수는 적어도 약 2배, 적어도 약 4배, 적어도 약 6배, 적어도 약 8배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 또는 적어도 약 180배이거나 이보다 더 클 수 있다.
"항체 의존성 세포 매개성 세포독성 (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구 및 대식 세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR) 상에 결합된 분비형 Ig에 의해 이러한 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하여 후속적으로 그 표적 세포를 세포독소로 사멸시키는 것이 가능해지는 세포독성의 형태를 나타낸다. 표적 세포의 표면에 대하여 유도된 특이적 고-친화성 IgG 항체는 세포독성 세포를 "무장"시키며 그러한 사멸에 절대적으로 요구된다. 표적 세포의 용해는 세포외 용해이며, 직접적인 세포-세포 접촉을 요구하며, 보체를 포함하지 않는다. 항체에 더하여, Fc 영역을 포함하는 다른 단백질, 구체적으로 Fc 융합 단백질 (항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하는 능력을 가짐)이 세포-매개성 세포독성을 초래할 수 있음이 고려된다. 단순함을 위하여, Fc 융합 단백질의 활성에서 생기는 세포 매개성 세포독성은 본원에서 ADCC 활성으로도 칭해진다.
"단리된" LOX1-결합 단백질 (예를 들어, LOX1 항체 (이의 항원-결합 단편, 변이체, 및 유도체를 포함함)), 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태인 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드류 (예를 들어, 전장 항체 및 LOX1-결합 항체 단편을 포함하는 항-LOX1 항체), 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리뉴클레오티드류, 벡터류, 세포류 또는 조성물류는 이들이 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것을 포함한다. 일부 측면에서, 단리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류는 진단, 예후, 또는 치료법이 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 스포츠 동물 및 동물원 동물을 포함하며, 이는 예를 들어 인간, 비-인간 영장류 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 곰 등을 포함한다.
"제약 조성물"이라는 용어는 활성 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 LOX1-결합 단백질)의 생물학적 활성이 유효해지는 것을 가능케 하도록 하는 그러한 형태로 존재하는, 그리고 이 조성물이 투여되는 대상체에게 허용가능하지 않게 유독한 추가 성분을 전혀 함유하지 않는 제제를 나타낸다.
LOX1-결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체, 또는 또 다른 치료제의 "유효량" 또는 "제약상 유효량"은 특정하게 진술된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 진술된 목적과 관련하여 경험적으로 그리고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 본 발명은 LOX1 및/또는 감소된 HDL-매개 시그널링과 연관된 질환 및 병태를 치료, 예방 또는 개선하기 위한 치료제를 제공한다. 이러한 질환 및 병태는 예를 들어 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, CAD, 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증 (예를 들어, 만성 염증), 혈관 형성, 자간전증 및 암을 포함한다.
본원에서 사용될 때 "표지체"라는 용어는 "표지된" 항체를 생성하도록 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬게이션된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 표지체는 혼자서 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지체 또는 형광 표지체), 효소 표지체의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "개선시키는" 또는 "개선시키기 위한"과 같은 용어는 (1) 진단된 질환 또는 병태와 연관된 상태를 치유하고/하거나, 늦추고/늦추거나, 줄이고/줄이거나, 진단된 질환 또는 병태의 진행을 중단시키는 치료적 처치 (therapeutic measures) 및 (2) 표적화된 질환 또는 병태의 발병을 예방하고/하거나 늦추는 예방적 또는 방지적 처치 둘 모두를 나타낸다. 따라서, 치료를 필요로 하는 이들은 당해 질환 또는 병태를 이미 갖고 있는 이들; 당해 질환 또는 병태의 발병 위험이 있는 이들; 및 당해 질환 또는 병태가 예방되어야 할 이들을 포함한다. 특정 측면에서, 대상체가 예를 들어 당해 질환 또는 병태와 연관된 증상의 전적인, 부분적인, 또는 일시적인 개선 또는 제거를 나타낼 경우 대상체는 본원에 제공된 방법에 따라 성공적으로 "치료된" 것이다. 그러한 질환 또는 병태는 예를 들어 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, CAD, 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증 (예를 들어, 만성 염증), 혈관 형성, 자간전증 및 암을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 하나 이상의 "폴리뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 분자", 또는 "폴리뉴클레오티드 서열"을 포함할 수 있으며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 나타내며, DNA (게놈 DNA 또는 cDNA) 및 RNA를 포함한다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제에 의해 중합체 내에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 변형 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA (게놈 DNA 또는 cDNA)를 비롯하여 본원에서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
"벡터"라는 용어는 숙주 세포에서 관심 대상의 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있는, 그리고 일부 측면에서 발현할 수 있는 구성물 (contruct)을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제 (condensing agent)와 결부된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산 세포 (producer cell) 내에 봉지화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 나타내도록 상호교환가능하게 사용된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 이것은 변형 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 이것에 개재될 수 있다. 또한 상기 용어는 자연적으로 또는 개입에 의해, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 콘쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)와, 당업계에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드가 또한 상기 정의 내에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기반으로 하기 때문에, 특정 측면에서 폴리펩티드는 단쇄로서 또는 결부된 사슬로서 나타날 수 있음이 이해된다.
2가지 이상의 핵산 또는 단백질의 맥락에서 "동일한" 또는 서열 "동일성" 퍼센트라는 용어는, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 아미노산 치환도 고려하지 않고서, 최대 상응도 (correspondence)를 위하여 비교되고 정렬될 (필요할 경우, 갭을 도입함) 때 동일하거나 또는 특정된 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2가지 이상의 서열 또는 하위서열 (subsequence)을 나타낸다. 동일성 퍼센트는 서열 비교용 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용하여 또는 시각적 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열들의 정렬을 수득하는 데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 당업계에 공지되어 있다.
서열 정렬 알고리즘의 1가지 그러한 비제한적 예로는 문헌[Karlin et al., Proc . Natl. Acad . Sci . 90:5873-5877 (1993)]에서 변형된 바와 같은 문헌[Karlin et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:2264-2268 (1990)]에 기술된, 그리고 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1991)]) 내에 포함된 알고리즘이 있다. 특정 측면에서, 갭드 BLAST (Gapped BLAST)가 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]에 기술된 바와 같이 사용될 수 있으며, BLAST-2, WU-BLAST-2 (문헌[Altschul et al., 방법 in Enzymology 266:460-480 (1996)]), ALIGN, ALIGN-2 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 (Genentech)) 또는 멕얼라인 (Megalign) (디엔에이스타 (DNASTAR))이 서열들의 정렬에 사용될 수 있는 추가의 공개적으로 이용가능한 소프트웨어 프로그램이다. 특정 측면에서, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트를 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 이용하여 (예를 들어, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 90의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 이용하여) 결정한다. 대안적인 특정 측면에서, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol . (48):444-453 (1970)]의 알고리즘을 포함하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 이용하여 두 아미노산 사이의 동일성 퍼센트를 결정할 수 있다 (예를 들어, BLOSUM 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 어느 하나, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5의 길이 가중치를 이용함). 대안적으로, 특정 측면에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이의 동일성 퍼센트는 문헌[Myers and Miller, CABIOS, 4:11-17 (1989)]의 알고리즘을 이용하여 결정된다. 예를 들어, 동일성 퍼센트는 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 (penalty) 및 4의 갭 페널티를 이용하여 PAM120을 사용하여 그리고 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 결정될 수 있다. 당업자라면 특정한 정렬 소프트웨어에 의해 최대 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 특정 측면에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 (default) 파라미터가 사용된다.
특정 측면에서, 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 서열 동일성 퍼센트 "X"는 100 x (Y/Z)로서 계산되며, 여기서, Y는 (시각적 검사 또는 특정한 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬될 때) 제1 및 제2 서열의 정렬에서 동일한 매치 (match)로서 스코어링되는 (scored) 아미노산 잔기의 개수이며, Z는 제2 서열에서의 잔기의 총 개수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 더 길 경우, 제2 서열에 대한 제1 서열의 동일성 퍼센트는 제1 서열에 대한 제2 서열의 동일성 퍼센트보다 더 높을 것이다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에서 정의되었으며, 이는 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 예를 들어, 타이로신을 페닐알라닌으로 치환하는 것은 보존적 치환이다. 특정 측면에서, 본 발명의 LOX1-결합 단백질의 서열에서의 보존적 치환은 치환된 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 LOX1에 결합하는 것을 방해하지 않는다. 항원-결합성을 없애지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산의 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌[Brummell et al., Biochem .32: 1180-1 187 (1993)]; 문헌[Kobayashi et al., Protein Eng . 12(10):879-884 (1999)]; 및 문헌[Burks et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:412-417 (1997)] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "에피토프"라는 용어는 본 발명의 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항체)에 결합할 수 있는 단백질 결정자, LOX1, 예를 들어, 인간 LOX1 (hLOX1) 또는 원숭이 LOX1 (예를 들어 엠. 시노몰구스 (M. cynomolgus))을 나타낸다. 에피토프는 일반적으로 당 측쇄 또는 아미노산과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑 (grouping)으로 이루어지며 일반적으로 특정한 3차원 구조 특성과, 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 전자에의 결합성이 변성 용매의 존재 하에서 상실되지만 후자의 것은 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 그러한 LOX1-결합 단백질은 표준 항원-결합 또는 활성 분석법에서 예를 들어, 서열 번호 4의 VH 서열 및 서열 번호 33의 VL 서열, 또는 서열 번호 41의 VH 서열 및 서열 번호 58의 VL 서열을 포함하는 항체와 교차 경쟁하는 (예를 들어, 상기 항체의 결합을 통계학적으로 유의한 방식으로 경쟁적으로 저해하는) 그의 능력을 기반으로 하여 확인될 수 있다.
LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항체)은, 이것이 LOX1에의 기준 분자의 결합을 어느 정도까지 차단한다면 이것이 LOX1에 결합할 경우 LOX1에의 결합에 대하여 기준 분자와 "경쟁한다"고 한다. LOX1에의 결합에 대하여 경쟁하는 단백질의 능력은 예를 들어 경쟁 ELISA 분석법을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, LOX1-결합 단백질은 LOX1에의 기준 분자의 결합을 예를 들어 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%만큼 경쟁적으로 저해한다고 할 수 있다.
II. LOX1-결합 단백질
본 발명은 LOX1에 특이적으로 결합하는 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 항체 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 항원-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)이다. 추가의 측면에서, 항체는 단클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 2특이성 항체, 다중특이성 항체, 또는 이들의 항체 단편이다. 특정 측면에서, LOX1-항체는 전장 항체이다.
일부 측면에서, LOX1-항체는 LOX1-결합 항체 단편이다. 일부 측면에서, LOX1-결합 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디아바디, 또는 단쇄 항체 분자이다. 추가의 측면에서, LOX1-항체는 Fd, 단쇄 Fv (scFv), 디술피드 결합된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디 (intrabody), IgGΔCH2, 미니바디 (minibody), F(ab')3, 테트라바디 (tetrabody), 트리아바디 (triabody), 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc이다
추가의 측면에서, LOX1 결합 단백질은 VH 및 VL을 포함하는 항체이다. 일부 측면에서, LOX1 결합 단백질 (예를 들어 LOX1 항체 또는 이의 단편)은 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 면역글로불린 불변 영역을 포함한다: (a) 인간 IgA 불변 영역, 또는 이의 단편; (b) 인간 IgD 불변 영역, 또는 이의 단편; (c) 인간 IgE 불변 도메인, 또는 이의 단편; (d) 인간 IgG1 불변 영역, 또는 이의 단편; (e) 인간 IgG2 불변 영역, 또는 이의 단편; (f) 인간 IgG3 불변 영역, 또는 이의 단편; (g) 인간 IgG4 불변 영역, 또는 이의 단편; 및 (h) 인간 IgM 불변 영역, 또는 이의 단편. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어 LOX1 항체 또는 이의 단편)은 감소된 ADCC 활성을 갖거나 감소된 ADCC 활성을 갖도록 돌연변이된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 특정한 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어 LOX1 항체 또는 이의 단편)은 이펙터 기능을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 측면에서, IgG1 불변 영역은 위치 234, 235 및 331에서의 돌연변이를 포함하며, 여기서, 위치 넘버링은 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 추가의 측면에서, IgG1 불변 영역은 삼중 돌연변이 L234F/L235E/P331S (TM)를 포함하여서 이펙터 널 인간 IgG1을 생성하며, 여기서, 위치 넘버링은 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 일부 측면에서, IgG1 불변 영역은 정의 섹션에서 상기에 개시된 바와 같이 삼중 돌연변이 돌연변이체 YTE를 포함한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 삼중 돌연변이 TM 및 삼중 돌연변이 YTE 둘 모두를 포함하는 IgG1 불변 영역을 포함하는 항체이다.
특정 측면에서, 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편, 예를 들어, 인간 IgG 불변 영역 또는 이의 단편은 야생형 IgG 불변 도메인과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 여기서, 변형된 IgG는 야생형 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 반감기와 비교하여 증가된 반감기를 갖는다. 예를 들어, IgG 불변 도메인은 위치 251 내지 257, 285 내지 290, 308 내지 314, 385 내지 389, 및 428 내지 436의 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 넘버링은 카바트에서 개시된 바와 같이 EU 인덱스에 따른다. 특정 측면에서, IgG 불변 도메인은 카바트 위치 252의 아미노산이 타이로신 (Y), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 또는 트레오닌 (T)으로 치환된 것, 카바트 위치 254의 아미노산이 트레오닌 (T)으로 치환된 것, 카바트 위치 256의 아미노산이 세린 (S), 아르기닌 (R), 글루타민 (Q), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 또는 트레오닌 (T)으로 치환된 것, 카바트 위치 257의 아미노산이 류신 (L)으로 치환된 것, 카바트 위치 309의 아미노산이 프롤린 (P)으로 치환된 것, 카바트 위치 311의 아미노산이 세린 (S)으로 치환된 것, 카바트 위치 428의 아미노산이 트레오닌 (T), 류신 (L), 페닐알라닌 (F), 또는 세린 (S)으로 치환된 것, 카바트 위치 433의 아미노산이 아르기닌 (R), 세린 (S), 아이소류신 (I), 프롤린 (P), 또는 글루타민 (Q)으로 치환된 것, 또는 카바트 위치 434의 아미노산이 트립토판 (W), 메티오닌 (M), 세린 (S), 히스티딘 (H), 페닐알라닌 (F), 또는 타이로신으로 치환된 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 더 구체적으로, IgG 불변 도메인은 야생형 인간 IgG 불변 도메인과 비교하여, 카바트 위치 252의 아미노산이 타이로신 (Y)으로 치환된 것, 카바트 위치 254의 아미노산이 트레오닌 (T)으로 치환된 것, 및 카바트 위치 256의 아미노산이 글루탐산 (E)으로 치환된 것으로서의 것을 포함하는 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어 LOX1 항체 또는 이의 단편)은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다: (a) 인간 Ig 카파 불변 도메인; 및 (b) 인간 Ig 람다 불변 도메인. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어 LOX1 항체 또는 이의 단편)은 이펙터 널 인간 IgG1을 생성하는 삼중 돌연변이 L234F/L235E/P331S를 포함하는 인간 중쇄 IgG1 불변 도메인 ("IgG-TM") 및 인간 경쇄 람다 불변 도메인을 포함한다.
본 발명은 본원에 개시된 기준 VH 또는 VL로부터의 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 갖는 VH 및/또는 VL을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 표 1에 예시된 VH 및/또는 VL을 갖는다.
예시적인 LOX-1 결합 단백질이 표 1에 제공되어 있다.
[표 1]
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 서열 번호 4의 기준 VH 서열로부터의, 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 서열 번호 4의 VH를 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 서열 번호 33의 기준 VL 서열로부터의 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 서열 번호 33의 VL을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1, 서열 번호 2, 5 내지 12 또는 13의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열 번호 3, 14 내지 17 또는 18의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함하는 VH로부터 선택되는 VH; 및 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2, 및 서열 번호 32, 34, 또는 35의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함하는 VL로부터 선택되는 경쇄 VL을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본원에 개시된 기준 VH 및 VL LOX1-결합 단백질로부터의, 각각 각각 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 갖는 VH 및 VL 서열을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 서열 번호 4, 19 내지 28, 또는 29의 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 33, 36, 또는 37의 서열을 포함하는 VL을 갖는다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 하기: 중쇄 가변 영역 (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 및 경쇄 가변 영역 (VL)-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 상보성 결정 영역 (CDR)의 세트를 포함하며, 여기서, CDR의 세트는 (a) VH-CDR1이 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖고; (b) VH-CDR2가 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (c) VH-CDR3이 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖고; (d) VL-CDR1이 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖고; (e) VL-CDR2가 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖고; (f) VL-CDR3이 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 기준 CDR 세트와 동일하거나 상기 기준 CDR 세트로부터의 총 18개 이하의 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의) 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 갖는다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 하기: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 CDR의 세트를 포함하며, 여기서, (a) VH-CDR1은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖고; (b) VH-CDR2는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖고; (c) VH-CDR3은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖고; (d) VL-CDR1은 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖고; (e) VL-CDR2는 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖고; (f) VL-CDR3은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본원에 개시된 기준 VH 서열에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 본원에 개시된 기준 VL 서열에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL) (예를 들어, 표 1, 도 4 또는 도 5에 개시된 VH 및 VL 서열)을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 서열 번호 4의 서열에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 VH 및/또는 서열 번호 33의 서열에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 및 VL에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다: (a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (b) 서열 번호 29의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (c) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VL; 및 (d) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 및 VL에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 VH 및 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다: (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (c) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (f) 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (g) 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (h) 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VL; (i) 서열 번호 27의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 갖는 VL; (j) 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 갖는 VL; (k) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VL; (l) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VL; (m) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VL; (n) 서열 번호 51의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VL; (o) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL; (p) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VL; (q) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL; (r) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VL; 및 (s) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VL. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열 번호 5 내지 12 또는 13의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 3, 14 내지 17 또는 18의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 3, 14 내지 17 또는 18의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열 번호 2, 5 내지 12 또는 13의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 3, 14 내지 17 또는 18의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열 번호 2, 5 내지 12 또는 13의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VLH-CDR3을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2 및 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1을 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 32, 34, 또는 35의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2를 포함한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 32, 34, 또는 35의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2 및 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 1개, 2개, 또는 3개의 VH-CDR, 예컨대 서열 번호 1의 서열과 동일하거나 서열 번호 1의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VH-CDR1, 서열 번호 2, 5 내지 12 또는 13의 서열과 동일하거나 서열 번호 2, 5 내지 12 또는 13의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VH-CDR2, 또는 서열 번호 3, 14 내지 17 또는 18의 서열과 동일하거나 서열 번호 3, 14 내지 17 또는 18의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VH-CDR3을 포함한다.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 1개, 2개, 또는 3개의 VL-CDR, 예컨대 서열 번호 30의 서열과 동일하거나 서열 번호 30의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VL-CDR1, 서열 번호 31의 서열과 동일하거나 서열 번호 31의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VL-CDR2, 또는 서열 번호 32, 34, 또는 35의 서열과 동일하거나 서열 번호 32, 34, 또는 35의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VL-CDR3을 포함한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 서열 번호 41의 기준 VH 서열로부터의 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 서열 번호 41의 VH를 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 서열 번호 58의 기준 VL 서열로부터의 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 서열 번호 58의 VL을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1, 서열 번호 39, 42 또는 43의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열 번호 40, 44 내지 46 또는 47의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함하는 VH로부터 선택되는 VH; 및 서열 번호 55 또는 59의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1, 서열 번호 56 또는 60의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2, 및 서열 번호 57, 61 내지 63, 또는 64의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함하는 VL로부터 선택되는 경쇄 VL을 포함한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 서열 번호 41, 48 내지 53, 또는 54의 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 58, 65 내지 69, 또는 70의 서열을 포함하는 VL을 갖는다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 하기: 중쇄 가변 영역 (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 경쇄 가변 영역 (VL)-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 상보성 결정 영역 (CDR)의 세트를 포함하며, 여기서, CDR의 세트는 (a) VH-CDR1이 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖고; (b) VH-CDR2가 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖고; (c) VH-CDR3이 서열 번호 44의 아미노산 서열을 갖고; (d) VL-CDR1이 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖고; (e) VL-CDR2가 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖고; (f) VL-CDR3이 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 기준 CDR 세트와 동일하거나 상기 기준 CDR 세트로부터의 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 갖는다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 하기: 중쇄 가변 영역 (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 경쇄 가변 영역 (VL)-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 상보성 결정 영역 (CDR)의 세트를 포함하며 여기서, 상기 CDR의 세트는 (a) VH-CDR1이 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖고, (b) VH-CDR2가 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖고; (c) VH-CDR3이 서열 번호 40의 아미노산 서열을 갖고; (d) VL-CDR1이 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖고; (e) VL-CDR2가 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖고; (f) VL-CDR3이 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖는 기준 CDR 세트와 동일하거나 상기 기준 CDR 세트로부터의 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 갖는다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 (a) VH-CDR1이 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖고; (b) VH-CDR2가 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖고; (c) VH-CDR3이 서열 번호 40의 아미노산 서열을 갖고; (d) VL-CDR1이 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖고; (e) VL-CDR2가 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖고; (f) VL-CDR3이 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖는 하기: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 CDR의 세트를 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 서열 번호 40의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 40의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 40의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열 번호 42 또는 43의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 40, 44 내지 46, 또는 47의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열 번호 39의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 40, 44 내지 46, 또는 47의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열 번호 39, 42, 또는 43의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 40, 44 내지 46, 또는 47의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열 번호 39, 42, 또는 43의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VLH-CDR3을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3 및 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3, 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2 및 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1을 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3, 서열 번호 56 또는 60의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2 및 서열 번호 55 또는 59의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 1개, 2개, 또는 3개의 VH-CDR, 예컨대 서열 번호 38의 서열과 동일하거나 서열 번호 38의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VH-CDR1, 서열 번호 39, 42 또는 43의 서열과 동일하거나 서열 번호 39, 42 또는 43의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VH-CDR2, 또는 서열 번호 40, 44 내지 46 또는 47의 서열과 동일하거나 서열 번호 40, 44 내지 46 또는 47의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VH-CDR3을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 1개, 2개, 또는 3개의 VL-CDR, 예컨대 서열 번호 55 또는 59의 서열과 동일하거나 서열 번호 55 또는 59의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VL-CDR1, 서열 번호 56 또는 60의 서열과 동일하거나 서열 번호 56 또는 60의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VL-CDR2, 또는 서열 번호 57, 61 내지 63 또는 64의 서열과 동일하거나 서열 번호 57, 61 내지 63 또는 64의 서열에 대하여 총 1개, 2개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 VL-CDR3을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 표 1, 도 4 또는 도 5에 개시된 하기: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR3 및 VL-CDR3의 CDR의 세트를 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 표 1, 도 4 또는 도 5에 개시된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 G F D P E D HX1HX2HX3HX4HX5HX6 Q K F Q G (Gly Phe Asp Pro Glu Asp HX1 HX2 HX3 HX4 HX5 HX6Gln Lys Phe Gln Gly) (여기서, HX1은 Gly, Trp, Tyr, 또는 Phe이며; HX2는 Glu, Thr, Gln, Ser, Lys, 또는 Ala이고; HX3은 Thr, Tyr, Ile, 또는 Asn이며; HX4는 Ile, Ala, Arg, 또는 His이고; HX5는 Tyr, Val, Thr, Leu, 또는 Gln이며, HX6은 Ala, Asp, Gly, Ser, 또는 His임) (서열 번호 71)의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다.
추가의 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 HX7 HX8 G HX9 HX10 HX11 HX12 G V R G W D Y Y Y G M D V (HX7 HX8Gly HX9 HX10 HX11 HX12Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp) (여기서, HX7은 Pro, Ser, 또는 Val이며; HX8은 Asn, Thr, Trp, 또는 Asp이고; HX9는 Gln, Arg, 또는 Thr이며; HX10은 Gln 또는 His이고; HX11은 Gly 또는 Gln이며; HX12는 Lys 또는 Gly임) (서열 번호 72)의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함한다.
다른 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 Q S Y D S LX1 LX2 LX3 LX4 LX5 LX6 (Gln Ser Tyr Asp Ser LX1 LX2 LX3 LX4 LX5 LX6) (여기서, LX1은 Ser 또는 Met이며; LX2는 Leu, Tyr, 또는 His이고; LX3은 Ser 또는 Arg이며; LX4는 Gly, Ala이거나 아미노산이 부재하고; LX5는 Trp 또는 Phe이며; LX6은 Val, Gly, 또는 Ala임) (서열 번호 73)의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 하기: 중쇄 가변 영역 (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 및 경쇄 가변 영역 (VL)-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 상보성 결정 영역 (CDR)의 세트를 포함하며, 여기서, (a) VH-CDR1은 아미노산 서열: E L S M H (서열 번호 1)를 포함하고; (b) VH-CDR2는 아미노산 서열: G F D P E D HX1 HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 Q K F Q G (여기서, HX1은 G, W, Y 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX2는 E, T, Q, K, A, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 T, Y, I, 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX4는 I, A, R 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX5는 Y, V, T, L 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX6은 A, D, G, S 및 H로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 번호 71)를 포함하고; (c) VH-CDR3은 아미노산 서열: HX7 HX8 G HX9 HX10 HX11 HX12 G V R G W D Y Y Y G M D V (여기서, HX7은 P, S 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX8은 N, W, D, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 Q, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX10은 Q 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX11은 G 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX12는 K 및 G로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 번호 72)를 포함하고; (d) VL-CDR1은 아미노산 서열: T G S S S N I G A G Y D V H (서열 번호 30)를 포함하며; (e) VL-CDR2는 아미노산 서열: G N S N R P S (서열 번호 31)을 포함하고; (f) VL-CDR3은 아미노산 서열: Q S Y D S LX1 LX2 LX3 LX4 LX5 LX6 (여기서, LX1은 M 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며, LX2는 L, Y 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX3은 S 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되며, LX4는 A 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되거나 누락되고 (아미노산 없음), LX5는 W 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되며, LX6은 V, G 및 A로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 번호 73)을 포함한다.
추가의 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 G HX1 S HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 D S V K G (Gly HX1 Ser HX2HX3HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 Asp Ser Val Lys Gly) (여기서, HX1은 Ile 또는 Val이고; HX2는 Trp 또는 Leu이며; HX3은 Asn 또는 Gln이고; HX4는 Ser 또는 Glu이며; HX5는 Gly, Leu, 또는 Pro이고; HX6은 Ser, Tyr, 또는 Asp이며; HX7은 Ile, Thr, 또는 Arg이고; HX8은 Gly 또는 Tyr이며; HX9는 Tyr 또는 Met이고; HX10은 Ala 또는 Asp임) (서열 번호 74)의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다.
추가의 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 E G HX11 W N Y D A HX12 D HX13 (Glu Gly HX11 Trp Asn Tyr Asp Ala HX12 Asp HX13) (여기서, HX11은 Asn 또는 Ser이며; HX12는 Phe 또는 Leu이고; HX13은 Ile 또는 Val임) (서열 번호 75)의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함한다.
추가의 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 T G T S LX1 D V G G Y N Y V S (Thr Gly Thr Ser LX1 Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser) (여기서, LX1은 Ser 또는 Asn임) (서열 번호 76)의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1을 포함한다.
추가의 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 D V S LX2 R P S (Asp Val Ser X4 Arg Pro Ser) (여기서, LX2는 Asn 또는 Lys임) (서열 번호 77)의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2를 포함한다.
추가의 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 LX3 LX4 LX5 LX6 LX7 LX8 S T N W V (LX3 LX4 LX5 LX6 LX7 LX8 Ser Thr Asn Trp Val) (여기서, LX3은 Ser, Leu, Met, 또는 Ala이며; LX4는 Ser, Gly, 또는 Gln이고; LX5는 Tyr, Arg, Ser, 또는 Gly이며; LX6은 Thr 또는 Met이고; LX7은 Ser, Trp, Gly, 또는 Val이며; LX8은 Ser 또는 Arg임) (서열 번호 78)의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함한다.
일부 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질은 하기: 중쇄 가변 영역 (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 및 경쇄 가변 영역 (VL)-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 상보성 결정 영역 (CDR)의 세트를 포함하며, 여기서, (a) VH-CDR1은 아미노산 서열: D Y A M H (서열 번호 38)를 포함하고; (b) VH-CDR2는 아미노산 서열: G HX1 S HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 D S V K G (여기서, HX1은 I 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX2는 W 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 N 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX4는 S 및 E로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX5는 G, L 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX6은 S, Y 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 I, T 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX8은 G 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 M 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX10은 A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 번호 74)를 포함하며; (c) VH-CDR3은 아미노산 서열: E G HX11 W N Y D A HX12 D HX13 (여기서, HX11은 N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며, HX12는 F 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX13은 I 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 번호 75)을 포함하고; (d) VL-CDR1은 아미노산 서열: T G T S LX1 D V G G Y N Y V S (여기서, LX1은 N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 번호 76)을 포함하며; (e) VL-CDR2는 아미노산 서열: D V S LX2 R P S (여기서, LX2는 N 및 K로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 번호 77)을 포함하고; (f) VL-CDR3은 아미노산 서열: LX3 LX4 LX5 LX6 LX7 LX8 S T N W V (여기서, LX3은 L, M, A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며, LX4는 S, Q 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX5는 Y, S, G 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되며, LX6은 T 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX7은 S, W, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX8은 S 및 R로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 번호 78)를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 LOX1-결합 단백질의 CDR의 세트는 항체 프레임워크 영역 또는 당업계에 공지된 다른 단백질 스캐폴드 (scaffold) 내에 제공된다. 예시적인 항체 프레임워크 영역은 하기를 포함한다: 생식 세포 계열 프레임워크 영역, 예컨대 중쇄의 항체 프레임워크 영역에 있어서 VH1-24 (DP-5), JH6, VH3-09 (DP-31), 및 JH3, 및 경쇄의 항체 프레임워크 영역에 있어서 Vλ1e (DPL-8), Vλ2a2 (DPL-11), 및 JL3 및/또는 당업자에게 잘 알려진 임의의 적합한 프레임워크 영역.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 생식 세포 계열 프레임워크인 중쇄 가변 영역 (VH) 및/도는 경쇄 가변 영역 (VL)으로부터의 하나 이상의 프레임워크 영역을 포함한다. 중쇄 도메인의 프레임워크 영역은 VH1-24 (DP-5), JH6, VH3-09 (DP-31), JH3 프레임워크 및/또는 당업계에 잘 알려진 임의의 적합한 프레임워크 영역 또는 단백질 스캐폴드로부터 선택될 수 있다. 경쇄의 프레임워크 영역은 Vλ1e (DPL-8), Vλ2a2 (DPL-11), 및 JL3 프레임워크, 및/또는 당업계에 잘 알려진 임의의 적합한 프레임워크 영역 또는 단백질 스캐폴드로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 CDR이 본원에 개시된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어 표 1, 도 4 또는 도 5에 개시된 LOX1-결합 단백질)로부터 취해질 수 있고, 이는 적합한 프레임워크 및/또는 단백질 스캐폴드 내에 포함될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 각각 서열 번호 4 및 서열 번호 33의 VH 및 VL을 포함하는 항체와 동일한 LOX1 에피토프에 결합하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 LOX1에의 결합에 대하여 서열 번호 4의 VH 서열 및 서열 번호 33의 VL 서열을 포함하는 항체와 경쟁하거나 교차 경쟁하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 제공한다. 특정한 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 4의 VH 및 서열 번호 33의 VL을 포함하는 항체가 LOX1에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해할 수 있다.
서열 번호 29의 VH 및 서열 번호 33의 VL을 포함하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어 LOX1 항체 또는 이의 단편)보다 더 큰 친화도로 LOX1에 결합할 수 있는 LOX1-결합 단백질, 예컨대 LOX1 항체 (예를 들어, 전장 항-LOX1 항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체, 및 유도체)가 또한 제공된다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 각각 서열 번호 41 및 서열 번호 58의 VH 및 VL을 포함하는 항체와 동일한 LOX1 에피토프에 결합하는 단리된 LOX1-결합 단백질을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 LOX1에의 결합에 대하여 서열 번호 41의 VH 서열 및 서열 번호 58의 VL 서열을 포함하는 항체와 경쟁하거나 교차 경쟁하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 제공한다. 특정한 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 41의 VH 및 서열 번호 58의 VL을 포함하는 항체가 LOX1에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해할 수 있다.
서열 번호 54의 VH 및 서열 번호 70의 VL을 포함하는 전장 항체보다 더 큰 친화도로 LOX1에 결합할 수 있는 LOX1-결합 단백질, 예컨대 LOX1 항체 (예를 들어, 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체, 및 유도체)가 또한 제공된다. 또한 본 발명은 이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 LOX1-결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 항-LOX1 항체는 쥐과 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 2특이성 항체, 다중특이성 항체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 측면에서, 항-LOX1 항체는 Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, dsFv 단편, scFv 단편, 또는 sc(Fv)2 단편이다.
본 발명은 종 전체에 걸쳐 LOX1 분자에 결합할 수 있는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 단리된 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 제공한다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 인간 LOX1 (hLOX1) 및 시노몰구스 LOX1 (cynoLOX1)에 결합한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 인간 LOX1 (hLOX1) 및 토끼 LOX1에 결합한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 hLOX1, cynoLOX1 및 토끼 LOX1에 결합한다. 본원에 제공된 특정 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체)은 특이적으로 LOX1 (예를 들어, hLOX1, cynoLOX1 및/또는 토끼 LOX1)에 결합하며, 하기 중 하나 이상에는 결합하지 않는다: CLEC-7A, CLEC-1A, CLEC-4L, CLEC-1B, SR-A1 및/또는 SR-B3. 예를 들어, 도 3, 도 6 및 도 7을 참조한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 단리된 항-LOX1 항체 또는 이의)은 인간 IgG1 TM 돌연변이 중쇄를 추가로 포함하며, 여기서, 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열 번호 4, 19 내지 28 또는 29의 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 단리된 항-LOX1 항체 또는 이의)은 인간 IgG1 TM 돌연변이 중쇄를 추가로 포함하며, 여기서, 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열 번호 41, 48 내지 53 또는 54의 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)에 더하여 그리고 임의로 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편, 경쇄 불변 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 측면에서, 경쇄 불변 영역은 카파 람다 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 카파 불변 영역 또는 인간 람다 불변 영역이다. 특정한 측면에서, 경쇄 불변 영역은 인간 카파 불변 영역이다.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 인간 카파 불변 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 가지며, 예를 들어, VL은 서열 번호 33, 36, 또는 37의 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VL 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 인간 IgG1 TM 돌연변이 중쇄 및 인간 카파 경쇄를 추가로 포함하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 제공하며, 여기서, 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)은 각각 하기를 포함한다: 서열 번호 4의 서열 및 서열 번호 33의 서열; 서열 번호 29의 서열 및 서열 번호 33의 서열; 서열 번호 41의 서열 및 서열 번호 58의 서열; 또는 서열 번호 54의 서열 및 서열 번호 70의 서열.
추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 인간 카파 불변 영역을 추가로 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 가지며, 예를 들어, 경쇄는 서열 번호 58, 65 내지 69 또는 70의 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명은 인간 IgG1 TM 돌연변이 중쇄 및 인간 카파 경쇄를 추가로 포함하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 제공하며, 여기서, 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)은 각각 하기를 포함한다: 서열 번호 41의 서열 및 서열 번호 58의 서열, 서열 번호 48의 서열 및 서열 번호 65의 서열, 서열 번호 49의 서열 및 서열 번호 66의 서열, 서열 번호 50의 서열 및 서열 번호 67의 서열, 또는 서열 번호 53의 서열 및 서열 번호 58의 서열.
일부 측면에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1가지의 특성을 갖는 단리된 LOX1-결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 제공한다: (a) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 1, 2 및/또는 3 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 LOX1에의 oxLDL, C-반응성 단백질 (CRP) 및/또는 어드밴스드 당화 최종 산물 (AGE)의 결합을 감소시키거나 저해함; (b) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 세포 표면 LOX1을 발현하는 내피 세포에서의 RhoA/Rac1, 일산화질소 (NO), p38MAPK, 단백질 키나아제 B 및 C, ERK1/2, 및/또는 NFκB 시그널링을 감소시키거나 저해함; (c) 본원에 개시된 분석법을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 세포 표면 LOX1을 발현하는 내피 세포에서의 카스파아제-8, 카스파아제-9, 및/또는 BAX 활성을 감소시키거나 저해함; (d) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 1, 2 및/또는 3 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 단일 뉴클레오티드 다형성 K167N을 갖는 LOX1에 결합함; (e) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 4 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 oxLDL 내재화를 감소시키거나 저해함; (f) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 5 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 oxLDL-유도된 LOX1 시그널링을 감소시키거나 저해함; (g) 비아코어 또는 키넥사에 의해 결정할 때 약 150 pM 내지 약 600 pM (예를 들어 약 400 pM)의 해리 상수 (KD)로 LOX1에 결합함; (h) 비아코어에 의해 결정할 때 약 1 x 105 M-1 s-1 내지 약 6 x 106 M- 1 s-1 (예를 들어 약 5 x105 M-1 s- 1)의 Kon 속도로 LOX1에 결합함; 및 (i) 비아코어에 의해 결정할 때 약 1 x 10-4 s-1 내지 약 3 x 10-4 s-1 (예를 들어 약 2.3 x 10-4 s-1)의 Koff 속도로 LOX1에 결합함.
특정 측면에서, 본원에 개시된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)에 의한 LOX1의 생물학적 활성의 차단은 아테롬성 동맥 경화증을 감소시키고/시키거나 아테롬성 동맥 경화증과 연관된 1가지 이상의 병태를 감소시킨다. 특정한 측면에서, LOX1 길항제 (예를 들어 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)는 아테롬성 동맥 경화증 병변, 관상 동맥 질환, 뇌졸중, 허혈, 경색, 말초 혈관 질환, 재관류, 상해, 또는 아테롬성 동맥 경화증의 발병과 연관된 다른 임상 증상의 LOX1-매개된 발병을 저해하거나 감소시킨다.
특정 측면에서, 예를 들어, 키넥사® 또는 비아코어®에 의해 측정할 때, LOX1-결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)는 LOX1, 예를 들어, 인간 LOX1 (hLOX1) 및/또는 시노몰구스 LOX1 (cynoLOX1), 및 이의 항원성 단편에 10-6 M 미만, 또는 10-7 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 또는 10-10 M 미만, 또는 10-11 M, 10-12 M 미만, 10-13 M 미만, 10-14 M 미만, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 KD로 특이적으로 결합할 수 있다. 일 측면에서, 비아코어®에 의해 측정할 때, 항-LOX1 항체는 hLOX1 및 cynoLOX1에 약 1 x 10-8 M 미만 내지 약 1 x 10-10M의 KD로 결합할 수 있다.
또 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)는 LOX1에 1x10-3 s-1 미만, 또는 2x10-3 s-1 미만의 Koff로 결합할 수 있다. 다른 측면에서, 예를 들어, 키넥사® 또는 비아코어®에 의해 측정할 때, LOX1-결합 단백질은 LOX1에 10-3 s-1 미만, 5x10-3 s-1 미만, 10-4 s-1 미만, 5x10-4 s-1 미만, 10-5 s-1 미만, 5x10-5 s-1 미만, 10-6 s-1 미만, 5x10-6 s-1 미만, 5x10-7 s-1 미만 미만, 10-8 s-1 미만, 5x10-8 s-1 미만, 10-9 s-1 미만, 5x10-9 s-1 미만, 또는 10-10 s- 1 미만의 Koff로 결합한다. 일 측면에서, 비아코어®에 의해 측정할 때, 항-LOX1 항체는 hLOX1 및 cynLOX1에 1 내지 10x10-4 s-1의 Koff로 결합할 수 있다.
또 다른 측면에서, 예를 들어, 키넥사® 또는 비아코어®에 의해 측정할 때, LOX1-결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)는 LOX1, 예를 들어, 인간 LOX1 (hLOX1) 및/또는 시노몰구스 LOX1에 적어도 105 M- 1 s-1, 적어도 5x105 M-1 s-1, 적어도 106 M- 1 s-1, 적어도 5x106 M-1 s-1, 적어도 107 M- 1 s-1, 적어도 5x107 M-1 s-1, 또는 적어도 108 M- 1 s-1, 또는 적어도 109 M- 1 s-1의 결합 속도 상수 또는 kon 속도로 결합할 수 있다. 일 측면에서, 비아코어®에 의해 측정할 때, 항-LOX1 항체는 hLOX1 및 cynLOX1에 약 1x105 M-1 s-1 내지 약 20x105 M-1 s-1의 kon 속도로로 결합할 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, LOX1에 결합하는 VH 및/또는 VL 아미노산을 포함하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 본원에 개시된 서열 (예를 들어, 표 1, 도 4 또는 도 5 참조)에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 측면에서, LOX1에 결합하는 VH 및/또는 VL 아미노산 서열(들)은 본원에 개시된 서열과 비교하여 15개 이하의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의) 아미노산 부가, 치환 (예를 들어, 보존적 치환) 또는 결실을 포함한다. 일부 측면에서, LOX1에 결합하는 VH 및/또는 VL 아미노산 서열(들)은 본원에 개시된 서열과 비교하여 8개 이하의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의) 아미노산 부가, 치환 (예를 들어, 보존적 치환) 또는 결실을 포함한다. 추가의 측면에서, LOX1에 결합하는 VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 본원에 개시된 서열과 비교하여 5개 이하의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의) 아미노산 부가, 치환 (예를 들어, 보존적 치환) 또는 결실을 포함한다. 소정의 VH 영역 또는 VL 영역에 대하여 특정한 유사성 퍼센트를 갖거나, 1개 이상의 치환, 결실 및/또는 삽입 (예를 들어, 보존적 치환)을 갖는 VH 및 VL 영역을 포함하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)은 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 영역을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이 유발 (예를 들어, 부위 지정 (site-directed) 또는 PCR-매개 돌연변이 유발), 이어서 LOX1에의 결합에 대한 상기 코딩된 변경 항체의 테스트 및 임의로, 본원에 개시된 기능 분석법 또는 기능의 유지를 테스트하도록 일상적으로 변경될 수 있는 당업계에 공지된 분석법을 이용한 기능의 유지에 대한 테스트에 의해 수득될 수 있다.
LOX1에 대한 LOX1-결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)의 친화도 또는 친화력은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 유세포 분석법, 효소-결합된 면역흡착 분석법 (ELISA), 또는 방사성면역분석법 (RIA), 또는 동역학적 방법 (예를 들어, 키넥사® 또는 비아코어® 분석)을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 직접적 결합 분석법과, 경쟁적 결합 분석 포맷이 쉽게 이용될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984)]; 문헌[Kuby, Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 본원에 설명된 방법 참조). 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건들 (예를 들어, 염 농도, pH, 온도) 하에 측정될 경우, 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 LOX1-결합 파라미터 (예를 들어, KD 또는 Kd, Kon, Koff)의 측정은 본원에 기술된 완충제와 같은 당업계에 공지된 바와 같은 표준화된 완충제와, LOX1-결합 단백질 및 LOX1의 표준화된 용액을 이용하여 이루어진다.
본 발명은 본원에 개시된 LOX1-결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체) (예를 들어, 표 1, 도 4 또는 도 5 참조)로서, 항체가 이질적 에이전트 (heterologous agent)에 콘쥬게이션된 것을 추가로 제공한다. 특정 측면에서, 상기 에이전트는 항미생물제, 치료제, 프로드러그, 펩티드, 단백질, 효소, 지질, 생물학적 응답 조절제, 의약품, 림포카인, 이종 항체 또는 항체 단편, 검출가능한 표지체, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 헤테로콘쥬게이트 (heteroconjugate) LOX1-결합 단백질은 본원의 다른 곳에서 더 상세하게 논의된다.
특정 측면에서, LOX1-결합 단백질은 항-LOX1 항체가 아니다. 단백질 표적에 고 친화도로 결합하는 비-항체 폴리펩티드의 확인 및 생성을 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Skerra, Curr . Opin . Biotech. 18:295-304 (2007)], 문헌[Hosse et al., Protein Science 15:14-27 (2006)], 문헌[Gill et al., Curr . Opin . Biotechnol. 17:653-658 (2006)], 문헌[Nygren, FEBS J. 275:2668-76 (2008)], 및 문헌[Skerra, FEBS J. 275:2677-83 (2008)]을 참조하며, 이들 각각은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다. 특정 측면에서, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 LOX1-결합 단백질을 확인/생성할 수 있다. 특정 측면에서, 폴리펩티드는 안키린, 단백질 A, 리포칼린, 피브로넥틴 도메인, 안키린 콘센서스 반복 도메인, 및 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유형의 단백질 스캐폴드를 포함한다.
LOX1-결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 단백질
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 하나 이상의 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 표 1, 도 4 또는 도 5 참조)과 동일한 에피토프에 결합하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "에피토프"라는 용어는 본 발명의 항체에 결합할 수 있는 표적 단백질 결정자를 나타낸다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑으로 이루어지며, 일반적으로 특정한 3차원 구조 특성과, 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 전자에의 결합성이 변성 용매의 존재 하에서 상실되지만 후자의 것은 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 그러한 항체는 표준 항원-결합 또는 활성 분석법에서 서열 번호 4의 VH 서열 및 서열 번호 33의 VL 서열을 포함하는 항체, 및/또는 서열 번호 41의 VH 서열 및 서열 번호 58의 VL 서열을 포함하는 항체와 교차 경쟁하는 (예를 들어, 상기 항체의 결합을 통계학적으로 유의한 방식으로 경쟁적으로 저해하는) 그의 능력을 기반으로 하여 확인될 수 있다.
또한 본 발명은 본원에 개시된 단리된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 표 1, 도 4 또는 도 5 참조)과 동일한 에피토프에 결합하는 LOX1-결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)를 제공한다.
테스트 LOX1-결합 단백질이, 예를 들어, 서열 번호 4의 VH 서열 및 서열 번호 33의 VL 서열을 포함하는 항체 및/또는 서열 번호 41의 VH 서열 및 서열 번호 58의 VL 서열을 포함하는 항체의 결합을 저해하는 능력은 상기 테스트 LOX1-결합 단백질이 LOX1에의 결합에 대하여 그 항체와 경쟁할 수 있고; 그러한 LOX1-결합 단백질은 비제한적 이론에 따르면 이것이 경쟁하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)과 동일하거나 관련된 (예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한) LOX1 상의 에피토프에 결합할 수 있음을 입증한다. 일 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 4의 VH 서열 및 서열 번호 33의 VL 서열을 포함하는 항체와 동일한 LOX1 상의 에피토프에 결합한다. 또 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질은 서열 번호 41의 VH 서열 및 서열 번호 58의 VL 서열을 포함하는 항체와 동일한 LOX1 상의 에피토프에 결합한다.
일 측면에서, 본 발명은 LOX1에의 결합에 대하여 서열 번호 4의 VH 서열 및 서열 번호 33의 VL 서열을 포함하는 항체와 경쟁하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 LOX1에의 결합에 대하여 서열 번호 41의 VH 서열 및 서열 번호 58의 VL 서열을 포함하는 항체와 경쟁하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 제공한다.
IV. LOX1-결합 단백질의 활성
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1가지의 특성을 갖는다: (a) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 1, 2 및/또는 3 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 LOX1에의 oxLDL, C-반응성 단백질 (CRP) 및/또는 어드밴스드 당화 최종 산물 (AGE)의 결합을 감소시키거나 저해함; (b) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 세포 표면 LOX1을 발현하는 내피 세포에서의 RhoA/Rac1, 일산화질소 (NO), p38MAPK, 단백질 키나아제 B 및 C, ERK1/2, 및/또는 NFκB 시그널링을 감소시키거나 저해함; (c) 본원에 개시된 분석법을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 세포 표면 LOX1을 발현하는 내피 세포에서의 카스파아제-8, 카스파아제-9, 및/또는 BAX 활성을 감소시키거나 저해함; (d) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 1, 2 및/또는 3 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 단일 뉴클레오티드 다형성 K167N을 갖는 LOX1에 결합함; (e) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 4 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 oxLDL 내재화를 감소시키거나 저해함; (f) 본원에 개시된 분석법 (예를 들어, 실시예 10, 분석법 5 또는 실시예 11 참조)을 포함하는 임의의 적합한 분석법에 의해 결정할 때 oxLDL-유도된 LOX1 시그널링을 감소시키거나 저해함; (g) 비아코어 또는 키넥사에 의해 결정할 때 약 150 pM 내지 약 600 pM (예를 들어 약 400 pM)의 해리 상수 (KD)로 LOX1에 결합함; (h) 비아코어에 의해 결정할 때 약 1 x 105 M- 1 s-1 내지 약 6 x 106 M- 1 s-1 (예를 들어 약 5 x105 M-1 s- 1)의 Kon 속도로 LOX1에 결합함; 및 (i) 비아코어에 의해 결정할 때 약 1 x 10-4 s-1 내지 약 3 x 10-4 s-1 (예를 들어 약 2.3 x 10-4 s- 1)의 Koff 속도로 LOX1에 결합함.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 LOX1을 발현하는 세포에서 LOX1-매개된 신호 전달을 억제하거나, 저해하거나 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 예를 들어 본원에 기술된 세포-기반 분석법을 이용하여 측정할 때 RhoA/Rac1, 일산화질소, p38MAPK, 단백질 키나아제 B 및 C, ERK1/2, 및/또는 NFκB 신호 전달 경로의 LOX1-매개된 활성화를 억제하거나, 저해하거나 감소시킬 수 있으며, 이때 IC50은 약 500 pM 미만, 약 450 pM 미만, 약 450 pM 미만, 약 350 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 250 pM 미만, 약 150 pM 미만, 약 100 pM 미만, 약 75 pM 미만, 약 100 nM 미만, 약 75 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 30 nM 미만, 약 20 pM 미만, 약 10 nM 미만, 또는 약 5 nM 미만이다.
특정 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 LOX1을 발현하는 시노몰구스 내피 세포, 평활근 세포, 및/또는 대식 세포에서 RhoA/Rac1, 일산화질소, p38MAPK, 단백질 키나아제 B 및 C, ERK1/2, 및/또는 NFκB 시그널링 경로의 시노몰구스 LOX1-매개된 활성화를 억제하거나, 저해하거나 감소시킬 수 있으며, 이때 IC50 은 약 700 pM, 약 550 pM, 약 500 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 220 pM, 약, 100 pM, 약 1 pM, 약 0.1, 약 1 nM, 약 10 nM, 약 20 nM, 약 30 nM, 약 50 nM 또는 약 100 nM이다. 특정 측면에서, LOX1-결합 단백질은 LOX1을 발현하는 시노몰구스 내피 세포, 평활근 세포, 및/또는 대식 세포에서 시노몰구스 LOX1-매개된 활성화를 억제하거나, 저해하거나 감소시킬 수 있으며, 이때 IC50은 약 1 nM 내지 약 500 pM이다.
추가의 측면에서, 길항 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 예를 들어 본원에 기술된 세포-기반 분석법을 이용하여 측정할 때 LOX1을 발현하는 내피 세포, 평활근 세포, 및/또는 대식 세포에서 RhoA/Rac1, 일산화질소, p38MAPK, 단백질 키나아제 B 및 C, ERK1/2, 및/또는 NFκB 신호 전달 경로의 인간 LOX1-매개된 활성화를 억제하거나, 저해하거나 감소시킬 수 있으며, 이때 IC50은 약 300 pM, 약 250 pM, 약 100 pM, 약 55 pM, 약 44 pM, 약 1 pM, 약 0.1 pM, 약 100 nm, 약 50 nm 약 44 nM, 약 10 nM, 또는 약 3 nM이다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 oxLDL에의 LOX1-결합을 저해하거나 감소시킨다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 다수의 LOX1 리간드에의 LOX1-결합을 저해하거나 감소시킨다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 oxLDL 및 AGE에의 LOX1-결합을 저해하거나 감소시킨다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 oxLDL 및 CRP에의 LOX1-결합을 저해하거나 감소시킨다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 oxLDL, AGE 및 CRP에의 LOX1-결합을 저해하거나 감소시킨다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 oxLDL, CRP, 포스파티딜세린, 어드밴스드 AGE, 미세 고밀도 리포단백질 (sdLDL), 산화 HDL, N4-옥소노나노일 라이신 (ONL), 열충격 단백질 (hsp, 예를 들어, HSP60), 클라미디아 뉴모니애, 혈소판, 백혈구 및/또는 아폽토시스성 세포에의 LOX1-결합을 저해하거나 감소시킨다. 1가지 이상의 리간드에의 LOX-1 결합의 저해 또는 감소의 측정 방법은 본원에서 실시예에 기술된 것 및 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 방법을 포함한다.
V. 항-LOX1 항체의 제조
특정 측면에서, LOX1-결합 단백질은 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체, 및 유도체이다.
단클론 항-LOX1 항체는 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)]에 기술된 것과 같은 하이브리도마법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마법을 이용하여, 마우스, 햄스터, 또는 다른 적절한 숙주 동물을 상기에 기술된 바와 같이 면역화하여 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구에 의한 생성을 유발한다. 림프구는 또한 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리하고, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 적합한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성하고, 그 후 이것을 비융합된 림프구 및 골수종 세포로부터 선발해낼 수 있다. 그 후, 면역침전법, 면역블로팅에 의해, 또는 시험관 내 결합 분석법 (예를 들어, 방사성면역분석법 (RIA); 효소-결합된 면역흡착 분석법 (ELISA))에 의해 결정할 때 LOX1, 예컨대 hLOX1에 대하여 특이적으로 유도된 단클론 항체를 생성하는 하이브리도마는 표준 방법을 이용하여 시험관 내 배양에서 (문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986]) 또는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 증식될 수 있다. 그 후, 단클론 항체는 상기에서 다클론 항체에 대하여 기술된 바와 같이 배양 배지 또는 복수액으로부터 정제될 수 있다.
대안적으로, 항-LOX1 단클론 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 바와 같이 재조합 DNA법을 이용하여 제조될 수 있다. 단클론 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 성숙 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의한 것과 같은 것에 의해 단리되고, 그의 서열은 통상적인 절차를 이용하여 결정된다. 그 후, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 적합한 발현 벡터 내로 클로닝하는데, 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 시미안 (simian) COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, Per.C6 세포, 또는 골수종 세포 (예를 들어 NS0 세포) (이는 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않음)를 트랜스펙션시킬 때, 단클론 항체가 숙주 세포에 의해 생성된다. 또한, 재조합 항-LOX1 단클론 항체는 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]; 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]; 및 문헌[Marks et al., J. Mol . Biol. 222:581-597 (1991)]에 기술된 바와 같이 요망되는 종의 CDR을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체를 코딩하는 핵산(들)을 재조합 DNA 기술을 이용하여 다수의 상이한 방식으로 추가로 변형시켜 대안적인 항체를 생성할 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 마우스 단클론 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인을 (1) 예를 들어 인간 항체의 상기 영역으로 치환하여 키메라 항체를 생성하거나 (2) 비-면역글로불린 폴리펩티드로 치환하여 융합 항체를 생성할 수 있다. 일부 측면에서, 불변 도메인을 절두하거나 제거하여 단클론 항체의 요망되는 항체 단편을 생성한다. 가변 영역의 부위 지정 또는 고밀도 돌연변이 유발을 이용하여 단클론 항체의 특이성, 친화성 등을 최적화할 수 있다.
특정 측면에서, 항-LOX1-결합 단백질은 인간 LOX1, 예컨대 전장 항-hLOX1 항체 및 이의 hLOX1-결합 인간 항체 단편, 및 변이체, 및 유도체에 결합한다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 직접적으로 제조될 수 있다. 표적 항원에 대하여 유도된 항체를 생성하는 면역화된 개체로부터 단리되거나 시험관 내에서 면역화된 불멸화 인간 B 림프구가 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; 문헌[Boemer et al., J. Immunol . 147 (1):86-95(1991)]; 및 미국 특허 제5,750,373호 참조).
또한, 항-LOX1 인간 항체 (예를 들어, LOX1-결합 인간 항체 단편)는 파지 라이브러리로부터 선발될 수 있으며, 여기서 상기 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현하고, 이는 예를 들어 문헌[Vaughan et al., Nat. Biotech., 14:309-314 (1996)], 문헌[Sheets et al., Proc . Nat'l . Acad . Sci . 95:6157-6162 (1998)], 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol . 227:381 (1991)], 및 문헌[Marks et al., J. Mol . Biol. 222:581 (1991)]에 기술된 바와 같다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 사용을 위한 기술은 또한 미국 특허 제5,969,108호, 미국 특허 제6,172,197호, 미국 특허 제5,885,793호, 미국 특허 제6,521,404호; 미국 특허 제6,544,731호; 미국 특허 제6,555,313호; 미국 특허 제6,582,915호; 미국 특허 제6,593,081호; 미국 특허 제6,300,064호; 미국 특허 제6,653,068호; 미국 특허 제6,706,484호; 및 미국 특허 제7,264,963호; 및 문헌[Rothe et al., J. Mol . Biol. 376(4): 1182-200 (2008)] (이들 각각은 본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.
친화도 성숙 전략 및 사슬 셔플링 (shuffling) 전략 (문헌[Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)], 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)은 당업계에 공지되어 있으며, 이를 이용하여 고 친화도 항-LOX1 인간 항체를 생성할 수 있다.
일부 측면에서, LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체는 인간화 항체일 수 있다. 비-인간 또는 인간 항체의 엔지니어링, 인간화 또는 재표면화 (resurfacing) 방법이 또한 사용될 수 있으며 이는 당업계에 공지되어 있다. 인간화된, 재표면화된 또는 유사하게 엔지니어링된 항체는 비-인간인 소스 (source), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 또는 다른 포유류 (그러나 이에 한정되는 것은 아님)로부터의 1개 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는, 공지된 인간 서열의 "임포트 (import)" 가변, 불변 또는 기타 도메인으로부터 전형적으로 취해지는 "임포트" 잔기로 흔히 칭해지는 잔기로 대체된다. 그러한 임포트된 서열을 이용하여 면역원성을 감소시키거나, 또는 결합성, 친화성, 온 (on)-속도, 오프 (off)-속도, 친화력, 특이성, 반감기, 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소시키거나, 증강시키거나, 또는 변경시킬 수 있으며, 이는 당업계에 공지된 바와 같다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로, LOX1 결합에 영향을 주는 것에 연루되어 있다. 따라서, 비-인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는 유지되는 반면, 가변 및 불변 영역의 비-인간 서열은 인간 아미노산 또는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.
항-LOX1 항체는 또한 임의로, 항원 LOX1에 대한 고 친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 엔지니어링된 인간 항체, 엔지니어링된 항체, 재표면화 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위하여, 인간화 (또는 인간) 또는 엔지니어링된 LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체, 및 유도체, 예컨대 재표면화 항체가 모 서열, 엔지니어링된 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용한 모 서열 및 다양한 구상적 인간화 생성물 및 엔지니어링된 생성물의 분석 과정에 의해 임의로 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용가능하며, 당업자에게 친숙하다. 선발된 후보 면역글로불린 서열의 유망한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서의 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 그의 항원, 예컨대 LOX1에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능케 한다. 이러한 방식으로, 프레임워크 (FW) 잔기는, 요망되는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 친화성의 증가가 달성되도록 콘센서스 및 임포트 서열로부터 선발되고 조합될 수 있다.
본 발명의 항-LOX1 항체의 인간화, 재표면화 또는 엔지니어링은 문헌[Jones et al., Nature 321:522 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)], 문헌[Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)]; 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901 (1987)], 문헌[Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 89:4285 (1992)]; 문헌[Presta et al., J. Immunol .151:2623 (1993)], 미국 특허 제5,639,641호, 미국 특허 제5,723,323호; 미국 특허 제5,976,862호; 미국 특허 제5,824,514호; 미국 특허 제5,817,483호; 미국 특허 제5,814,476호; 미국 특허 제5,763,192호; 미국 특허 제5,723,323호; 미국 특허 제5,766,886호; 미국 특허 제5,714,352호; 미국 특허 제6,204,023호; 미국 특허 제6,180,370호; 미국 특허 제5,693,762호; 미국 특허 제5,530,101호; 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제5,225,539호; 미국 특허 제4,816,567호, 미국 특허 제7,557,189호; 미국 특허 제7,538,195호; 및 미국 특허 제7,342,110호; 국제 특허 출원 제PCT/US98/16280호; 국제 특허 출원 제PCT/ US96/18978호; 국제 특허 출원 제PCT/US91/09630호; 국제 특허 출원 제PCT/US91/05939호; 국제 특허 출원 제PCT/US94/01234호; 국제 특허 출원 제PCT/GB89/01334호; 국제 특허 출원 제PCT/GB91/01134호; 국제 특허 출원 제PCT/GB92/ 01755호; 국제 공개 제90/14443호; 국제 공개 제90/14424호; 국제 공개 제90/14430호; 및 유럽 특허 공개 공보 제229246호 (이들 각각은 그 안에 인용된 참고 문헌을 비롯하여 본원에 전적으로 참고로 포함됨)에 기술된 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 임의의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
길항 인간 항-LOX1 항체는 또한 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 면역화시에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 트랜스제닉 마우스에서 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,545,807호; 미국 특허 제5,545,806호; 미국 특허 제5,569,825호; 미국 특허 제5,625,126호; 미국 특허 제5,633,425호; 및 미국 특허 제5,661,016호에 기술되어 있다.
특정 측면에서, 항-LOX1 항체는 LOX1-결합 항체 단편이다. 다양한 기술이 항체 단편의 생성에 대하여 공지되어 있다. 전통적으로, 이러한 단편은 온전한 항체의 단백질 분해적 소화를 통하여 유래된다 (예를 들어, 문헌[Morimoto et al., J. Biochem. Biophys . Meth . 24:107-117 (1993)]; 문헌[Brennan et al., Science 229:81 (1985)]). 특정 측면에서, LOX1-결합 항체 단편은 재조합적으로 생성된다. Fab, Fv, 및 scFv 항체 단편을 모두 이. 콜라이 또는 다른 숙주 세포에서 발현시킴으로써 다량의 이러한 단편의 생성을 허용할 수 있다. 그러한 LOX1-결합 항체 단편은 또한 상기에 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. LOX1-결합 항체 단편은 또한 미국 특허 제5,641,870호에 기술된 바와 같이 선형 항체일 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술이 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 당업계에 공지된 기술은 LOX1에 특이적인 단쇄 항체의 생성에 맞게 수정될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호 참조). 게다가, LOX1에 대한 요망되는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편의 빠르고 효과적인 확인을 허용하기 위하여 Fab 발현 라이브러리의 구성에 맞게 방법을 수정할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)] 참조). 하기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 항-LOX1-결합 항체 단편이 당업계에 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다: (a) 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성되는 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 디술피드 가교체의 환원에 의해 생성되는 Fab 단편, (c) 파파인 및 환원제를 이용한 항-LOX1 항체의 처리에 의해 생성되는 Fab 단편, 및 (d) Fv 단편.
특정 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 그의 혈청중 반감기를 증가시키기 위하여 변형될 수 있다. 이것은 예를 들어 LOX1-결합 단백질에서의 적절한 영역의 돌연변이에 의한 LOX1-결합 단백질 내로의 구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프의 포함에 의해, 또는 상기 에피토프를 펩티드 태그 내로 포함시키고 그 후 이를 말단에서 또는 중간에서 (예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의해) LOX1-결합 단백질에 융합시키는 것에 의해, 또는 YTE 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. LOX1-결합 단백질 (예를 들어, LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체, 및 유도체)의 혈청중 반감기를 증가시키는 다른 방법, 예를 들어, 이질적 분자, 예컨대 PEG에의 콘쥬게이션이 당업계에 공지되어 있다.
헤테로콘쥬게이트 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)이 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 헤테로콘쥬게이트 LOX1-결합 단백질은 2가지의 공유 결합된 단백질로 구성된다. 그러한 단백질들은 예를 들어 면역 세포를 원하지 않는 세포로 표적화하기 위하여 제안되었다 (예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호 참조). 헤테로콘쥬게이트 LOX1-결합 단백질은 가교결합제를 포함하는 것을 비롯하여, 합성 단백질 화학에서의 공지된 방법을 이용하여 시험관 내에서 제조될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 면역독소가 디술피드 교환 반응을 이용하여 또는 티오에테르 결합의 형성에 의해 제작될 수 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
본원에서 제공된 변형된 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체, 및 유도체는 항체와 LOX1을 회합시키는 임의의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 가변 영역은 LOX1 항원에 대하여 체액성 반응을 증가시키고 면역글로불린을 생성하도록 유도될 수 있는 포유류의 임의의 유형을 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다. 이와 같이, 항-LOX1 항체의 가변 영역은 예를 들어 인간, 쥐과, 비-인간 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 마카크 등) 또는 이리 기원의 것일 수 있다. 일부 측면에서, 변형된 항-LOX1 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 모두는 인간의 것이다. 다른 측면에서, 양립가능한 항체 (일반적으로, 비-인간 소스로부터 유래됨)의 가변 영역은 그 분자의 결합 특성을 개선시키거나 그 분자의 면역원성을 감소시키도록 엔지니어링되거나 특정적으로 맞추어질 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 유용한 가변 영역은 임포트된 아미노산 서열의 포함을 통하여 인간화되거나 또는 달리 변경될 수 있다.
특정 측면에서, 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)의 중쇄 및 경쇄 둘 모두에서의 가변 도메인은 1개 이상의 CDR의 적어도 부분적인 대체에 의해 및/또는 부분적인 프레임워크 영역의 대체 및 서열 변화에 의해 변경된다. CDR은 프레임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 클래스 또는 심지어 하위클래스의 항체로부터 유래될 수 있지만, CDR은 상이한 클래스의 항체로부터, 그리고 특정 측면에서 상이한 종으로부터의 항체로부터 유래됨이 예상된다. 하나의 가변 도메인의 항원-결합능을 또 다른 것으로 옮기기 위하여 모든 CDR을 도너 (donor) 가변 영역으로부터의 전 CDR로 대체하는 것은 필요하지 않다. 오히려, 항원-결합 부위의 활성을 유지하는 데 필요한 잔기들을 옮기는 것이 단지 필요하다. 미국 특허 제5,585,089호, 미국 특허 제5,693,761호 및 미국 특허 제5,693,762호에 개시된 설명이 주어진다면, 이것은 감소된 면역원성을 갖는 기능성 항체를 수득하기 위하여 일상적인 실험을 실시함에 의해 또는 시행 착오적 테스트에 의해 충분히 당업자의 능력 내에 있을 것이다.
가변 영역에 대한 변경에도 불구하고, 당업자라면, 본 발명의 변형된 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)가 천연 또는 비변경 불변 영역을 포함하는 대략적으로 동일한 면역원성의 항체와 비교할 때 증가된 종양 국소화 또는 감소된 혈청중 반감기와 같은 요망되는 생화학적 특성을 제공하도록 불변 영역 도메인들 중 하나 이상의 적어도 일부분은 결실되거나 또는 달리 변경된 항체를 포함함을 알 것이다. 일부 측면에서, 변형된 항-LOX1 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함한다. 불변 영역에 대한 변형은 하나 이상의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 즉, 본원에 개시된 변형된 항-LOX1 항체는 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인 (CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 변형된 항-LOX1 항체는 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전적으로 결실된 불변 영역을 포함한다는 것이 고려된다. 일부 측면에서, 변형된 항-LOX1 항체는 도메인 결실된 구성물 또는 변이체를 포함하며, 여기서, 전체 CH2 도메인이 제거되었다 (ΔCH2 구성물). 일부 측면에서, 누락된 불변 영역 도메인은 그 부재 불변 영역에 의해 전형적으로 부여되는 분자 가요성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (예를 들어, 10개의 잔기)로 대체될 수 있다.
불변 영역은 그의 배열 외에, 몇몇 이펙터 기능을 매개함이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체에의 보체의 C1 구성요소의 결합은 보체계를 활성화시킨다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 (opsonization) 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 촉진하며, 자가면역 과민증 (autoimmune hypersensitivity)에 또한 연루될 수 있다. 또한, 항체는 Fc 영역을 통하여 세포에 결합하며, 이때 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위가 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)에 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (에타 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)을 포함하는 상이한 클래스의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 있다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에의 항체의 결합은 항체-코팅된 입자의 탐식 (engulfment) 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 살해 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해 (항체 의존성 세포 매개성 세포독성 또는 ADCC로 칭해짐), 염증성 매개자의 방출, 태반 전달 및 면역글로불린 생성의 제어를 포함하는 다수의 중요한 그리고 다양한 생물학적 응답을 트리거한다.
특정 측면에서, 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)는 변경된 이펙터 기능을 가지며, 이는 다시, 투여된 항-LOX1 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 준다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화 (점 돌연변이 또는 기타 수단을 통한 것)는 순환 변형 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시킬 수 있다. 다른 경우에, 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시키고 따라서 콘쥬게이션된 세포독소의 혈청중 반감기 및 비특이적 회합을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 또 다른 변형을 이용하여 디술피드 결합 또는 올리고당 모이어티 (이는 증가된 항원 특이성 또는 항체 가요성으로 인하여 향상된 국소화를 허용함)를 제거할 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명에 따른 불변 영역에의 변형은 충분히 당업자의 범위내인 잘 알려진 생화학 또는 분자 엔지니어링 기술을 이용하여 용이하게 이루어질 수 있다.
일부 측면에서, 본원에서 제공된 LOX1-결합 단백질은 하나 이상의 이펙터 기능을 갖지 않는 LOX1 항체 (예를 들어, 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체, 및 유도체)이다. 예를 들어, 일부 측면에서, 항-LOX1-항체는 항체-의존성 세포 독성 (ADCC) 활성을 갖지 않고/않고나 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖지 않는다. 특정 측면에서, 항-LOX1 항체는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 측면에서, 항-LOX1 항체는 이펙터 기능을 갖지 않는다.
일부 측면에서, 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)는 각각의 변형 항체의 힌지 영역에 직접적으로 CH3 도메인을 융합시키도록 엔지니어링된다. 다른 구성물에서, 펩티드 스페이서가 힌지 영역과 변형 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 삽입된다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되었고 남아있는 CH3 도메인 (변형되거나 비변형됨)이 5 내지 20개 아미노산의 스페이서에 의해 힌지 영역에 연결되어 있는 양립가능한 구성물이 발현될 수 있다. 그러한 스페이서는 예를 들어, 불변 도메인의 조절 요소가 자유롭게 그리고 접근가능하게 남아있거나 힌지 영역이 가요성인 채로 남아있는 것을 보장하기 위하여 부가될 수 있다. 일부의 경우에, 아미노산 스페이서는 면역원성이어서 상기 구성물에 대하여 원하지 않는 면역 반응을 초래하는 것으로 입증될 수 있다. 따라서, 특정 측면에서, 구성물에 부가되는 임의의 스페이서는, 변형된 항-LOX1의 요망되는 생화학적 품질을 유지하도록 상대적으로 비-면역원성이거나 심지어 완전히 생략될 수 있다.
전체 불변 영역 도메인의 결실 외에, 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)는 불변 영역에서의 몇 개의 또는 심지어 1개의 아미노산의 부분적 결실 또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서의 단일 아미노산의 돌연변이는 그에 의해 Fc 결합을 실질적으로 감소시키기에 충분할 수 있다. 이와 유사하게, 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 C1Q 결합)을 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인이 완전히 또는 부분적으로 결실될 수 있다. 불변 영역의 그러한 부분적인 결실은, 상응하는 불변 영역 도메인과 연관된 다른 바람직한 기능은 온전하게 남겨두면서 길항 항-LOX1 항체의 선택된 특성 (예를 들어, 혈청중 반감기)을 개선시킬 수 있다. 게다가, 본원에서 제공된 항-LOX1 항체의 불변 영역은 생성된 구성물의 프로파일을 향상시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통하여 변형될 수 있다. 이와 관련하여, 변형된 항-LOX1 항체의 배열 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지하면서 보존된 결합 부위에 의해 제공되는 활성 (예를 들어, Fc 결합)을 파괴하는 것이 가능하다. 또한 본 발명은 이펙터 기능의 증가 또는 감소 또는 더 많은 세포독소, 표지 또는 탄수화물 모이어티를 위한 부착 부위의 제공과 같은 바람직한 특성을 향상시키기 위하여 불변 영역에 하나 이상의 아미노산이 부가된 것을 포함하는 항-LOX1 항체를 제공한다. 그러한 측면에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특정 서열을 삽입하거나 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 항-LOX1 항체 (예를 들어, 쥐과, 키메라, 인간화 및 인간 LOX1-결합 단백질)에 대하여 구조 면에서 실질적으로 상동성이고/이거나 하나 이상의 기능 면에서 유사한 변이체 및 등가물에 관한 것이다. 이러한 변이체는 예를 들어 보존적 아미노산 잔기 치환 돌연변이를 포함할 수 있다. 당업계에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, 보존적 아미노산 잔기 치환은 소정 아미노산 잔기를 동일한 일반적인 부류 내의 또 다른 것으로 치환하는 것, 예를 들어, 하나의 산성 아미노산을 또 다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 또 다른 염기성 아미노산으로 또는 하나의 중성 아미노산을 또 다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 나타낸다. 보존적 아미노산 치환이 의도하는 것은 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 제공된 항-LOX1 항체와 같은 LOX1-결합 단백질은 보통은 이 단백질의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티를 포함하도록 유도체화될 수 있다. 그러한 유도체화 모이어티는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 LOX1-결합 단백질의 용해도, 생물학적 반감기, 생체이용성을 개선시키는 기능을 할 수 있고, 달리, LOX1-결합 단백질의 안정성, 제형화 및/또는 치료적 특성을 향상시키는 기능을 할 수 있다. 그러한 모이어티에 대한 철저하지 않은 개관이 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)]에서 발견될 수 있다.
VI. LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산 및 그의 발현
본 발명은 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체를 포함하는 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다 (예를 들어, 표 1, 도 4 또는 도 5에 기술된 것을 참조). 본원에 개시된 핵산 분자는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하며; 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 단일 가닥일 경우 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티센스 (anti-sense)) 가닥일 수 있다. 특정 측면에서, 핵산 분자는 단리된다. 추가의 측면에서, 핵산 분자는 실질적으로 순수하다. 일부 측면에서, 핵산은 cDNA이거나 cDNA로부터 유래된다. 일부 측면에서, 핵산은 재조합적으로 생성된다.
일부 측면에서, 핵산 분자는 숙주 세포에서 또는 시험관 내에서 코딩 서열의 발현을 제어하는 제어 서열에 작동가능하게 연결된 LOX1-결합 단백질 코딩 서열을 포함한다. 특정한 측면에서, 코딩 서열은 cDNA이다. 본 발명은 또한 숙주 세포에서 또는 시험관 내에서 코딩 서열의 발현을 제어하는 제어 서열에 작동가능하게 연결된 LOX1-결합 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
일부 측면에서, 핵산 분자는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열에 동일 리딩 프레임 (reading frame)으로 융합된 성숙 LOX1-결합 단백질의 코딩 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 LOX1-코딩 핵산 분자로 형질전환된 숙주 세포로부터의 발현 단백질의 분비를 용이하게 하는 리더 펩티드 서열을 코딩한다. 리더 서열을 포함하는 단백질은 단백질전구체 (preprotein)로 칭해지며, 성숙 형태의 폴리펩티드를 형성하도록 숙주 세포에 의해 절단되는 리더 서열을 가질 수 있다. 그러한 리더 펩티드 서열 및 숙주 세포에서의 재조합 단백질의 분비를 용이하게 하는 그의 사용은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 추가의 측면에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 재조합적으로 발현된 LOX1-결합 단백질의 정제를 용이하게 하거나, 이의 단백질 안정성 및/또는 치료적 또는 진단적 특성을 부가하거나 개선시키는 기능을 할 수 있는 추가의 5' 및/또는 3' 아미노산 잔기를 코딩한다.
일부 측면에서, 본 발명은 혼성화 프로브, PCR 프라이머 또는 서열결정용 프라이머로서 사용하기에 충분한 cDNA 분자와 같은 단리된 핵산을 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 (VL)을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 여기서, VL은 각각 서열 번호 30; 서열 번호 31; 또는 서열 번호 32, 34 또는 35의 서열과 동일하거나, 이에 대하여 VL-CDR 중 하나 이상에서 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환을 갖는 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 다른 측면에서, 특정 측면에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 (VL)을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 여기서, VL은 각각 서열 번호 55 또는 59; 서열 번호 56 또는 60; 또는 서열 번호 57, 61 내지 63 또는 64의 서열과 동일하거나, 이에 대하여 VL-CDR 중 하나 이상에서 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환을 갖는 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
추가로 본 발명은 중쇄 가변 영역 (VH)을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 여기서, VH는 각각 서열 번호 1; 서열 번호 2, 5 내지 12 또는 13; 및 서열 번호 3, 14 내지 17 또는 18의 서열과 동일하거나, 이에 대하여 VH-CDR 중 하나 이상에서 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환을 갖는 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 (VH)을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 여기서, VH는 각각 서열 번호 38; 서열 번호 39, 42 또는 43; 및 서열 번호 40, 44 내지 46 또는 47의 서열과 동일하거나, 이에 대하여 VH-CDR 중 하나 이상에서 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 또는 이보다 더 적은 아미노산 치환을 갖는 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
추가로 본 발명은 경쇄 가변 영역 (VL)을 코딩하는 cDNA와 같은 단리된 핵산을 제공하며, 여기서, VL은 서열 번호 33, 서열 번호 36, 및 서열 번호 37의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 분자는 상기 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 코딩한다.
게다가, 본 발명은 중쇄 가변 영역 (VH)을 코딩하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서, VH는 서열 번호 4, 19 내지 28 및 29의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 분자는 상기 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 코딩한다.
특정 측면에서, 본 발명은 LOX1에 특이적으로 결합하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어 표 1, 도 4 또는 도 5에 기술된 LOX-1 결합 단백질)을 코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자들의 조합을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이 cDNA와 같은 핵산 분자 또는 핵산 분자들의 조합을 포함하는 벡터가 추가로 제공된다. 적합한 벡터는 본원의 다른 곳에 기술되어 있으며 당업계에 공지되어 있다.
특정 측면에서, 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)은 각각 서열 번호 4 및 서열 번호 33, 서열 번호 23 및 서열 번호 36, 또는 서열 번호 27 및 서열 번호 37의 서열을 코딩하는 기준 핵산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정한 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)은 각각 서열 번호 4 및 서열 번호 33의 서열을 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
추가로 본 발명은 경쇄 가변 영역 (VL)을 코딩하는 cDNA와 같은 단리된 핵산을 제공하며, 여기서, VL은 서열 번호 58, 65 내지 69 및 70의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 분자는 상기 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 코딩한다.
또한 본 발명은 중쇄 가변 영역 (VH)을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 여기서, VH는 서열 번호 41, 48 내지 53 및 54의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 단리된 핵산 분자는 상기 기준 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)은 각각 서열 번호 54 및 서열 번호 70, 서열 번호 41 및 서열 번호 58, 서열 번호 48 및 서열 번호 65, 서열 번호 49 및 서열 번호 66, 서열 번호 50 및 서열 번호 67, 또는 서열 번호 53 및 서열 번호 58의 서열을 코딩하는 기준 핵산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정한 측면에서, 단리된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)은 각각 서열 번호 41 및 서열 번호 58의 서열을 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
일부 측면에서, 단리된 핵산은 표 1, 도 4 또는 도 5에 기술된 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR3 및 VL-CDR3의 CDR의 세트를 포함하는 LOX1-결합 단백질을 코딩한다. 일부의 추가의 측면에서, 단리된 핵산은 표 1, 도 4 또는 도 5에 기술된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 LOX1-결합 단백질을 코딩한다.
상기에 기술된 핵산 분자 조성물에서, VH를 코딩하는 핵산 및 VL을 코딩하는 핵산은 단일 벡터 내에 존재할 수 있거나 별개의 벡터 상에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기에 기술된 핵산 분자 조성물 또는 핵산 분자들의 조합을 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공한다.
일부의 경우에, 상기에 기술된 바와 같은 VH 및 VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 조성물은 LOX1, 예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX1에 특이적으로 결합하는 항체 (LOX1-결합 항체 단편을 포함함)를 코딩할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 조성물은 각각 서열 번호 4 및 서열 번호 33의 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩한다. 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드 조성물은 각각 서열 번호 41 및 서열 번호 58의 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩한다. 일부의 추가의 측면에서, 폴리뉴클레오티드 조성물은 표 1, 도 4 또는 도 5에 기술된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 LOX1-결합 단백질D과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 상기에 제공된 핵산(들) 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 여기서, 숙주 세포는 일부의 경우에, LOX1에 특이적으로 결합하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 발현할 수 있다. 그러한 숙주 세포는 본원에서 제공되는 LOX1-결합 단백질의 제조 방법에서 이용될 수 있으며, 여기서, 본 방법은 (a) 숙주 세포를 배양하는 단계 및 (b) 숙주 세포로부터 발현된 LOX1-결합 단백질을 단리하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 적합한 조건 하에 LOX1-결합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포 또는 하이브리도마를 배양하는 단계를 포함하는 LOX1-결합 단백질의 제조 방법을 제공하며, 임의로, 이 숙주 세포 또는 하이브리도마로부터 분비된 LOX1-결합 단백질의 단리 방법을 제공한다. 게다가, 본 발명은 부가적으로, 개시된 방법을 이용하여 숙주 세포 또는 하이브리도마로부터 분비된 후 단리된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 제공한다.
특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 코딩된 폴리펩티드의 정제를 허용하는 마커 서열에 동일 리딩 프레임으로 융합된 성숙 LOX1-결합 단백질(들) (예를 들어, LOX1-항체, 예컨대 전장 항체 및 LOX1-결합 항체 단편)의 코딩 서열(들)을 포함한다. 예를 들어, 마커 서열은 세균 숙주의 경우 마커에 융합된 성숙 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위하여 pQE-9 벡터에 의해 공급되는 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 마커 서열은 포유류 숙주 (예를 들어, COS-7 세포)가 사용될 경우 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 헤마글루티닌 (HA) 태그일 수 있다.
LOX1-결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체 및 LOX1-결합 항체 단편을 코딩하는 핵산 변이체가 또한 제공된다. 핵산 변이체는 코딩 영역 내에, 비-코딩 영역 내에 또는 이들 둘 모두에 변경을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 핵산 변이체는 침묵 (silent) 치환, 부가, 또는 결실을 생성하지만 코딩된 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 변경시키지 않는 변경을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 변이체는 유전자 코드의 축퇴성으로 인한 침묵 치환에 의해 생성된다. 핵산 변이체는 다양한 이유로, 예를 들어, 특정한 숙주를 위한 코돈 발현을 최적화하기 위하여 (인간 mRNA에서의 코돈을 세균 숙주, 예컨대 이. 콜라이가 선호하는 것으로 바꾸기 위하여) 생성될 수 있다. 본원에 개시된 핵산을 포함하는 벡터 및 세포가 또한 제공된다.
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항체 및 LOX1-결합 항체 단편)을 코딩하는 핵산 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 화학적 합성에 의해 구성된다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 숙주 세포 선호도를 기반으로 한 코돈 최적화 및 요망되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로 하여 설계될 수 있다. 표준 방법이 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열의 합성에 일상적으로 적용될 수 있다.
(합성, 부위 지정 돌연변이 유발 또는 또 다른 방법에 의해) 일단 조립되면, LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 요망되는 숙주에서의 LOX1-결합 단백질의 발현에 적절한 제어 서열에 일상적으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 발현 벡터 내로 삽입되며 요망되는 숙주에서의 이 단백질의 발현에 적절한 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포에서의 트랜스펙션된 유전자의 고 발현 수준을 수득하기 위하여, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능성인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되거나 이와 결부될 수 있다.
특정 측면에서, 재조합 발현 벡터를 이용하여 LOX1-결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체 또는 LOX1-결합 항체 단편을 코딩하는 DNA를 증폭시키고 발현시킨다. 재조합 발현 벡터는 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항체 및 LOX1-결합 항체 단편)의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 합성 또는 cDNA-유래된 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 구성물이다. 전사 단위는 일반적으로 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 유전 요소(들), 예를 들어, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되어 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 어셈블리를 포함하며, 이는 하기에 상세하게 기술된 바와 같다. 그러한 조절 요소는 전사를 제어하기 위한 오퍼레이터 (operator) 서열을 포함할 수 있다. 복제 원점에 의해 일반적으로 부여되는 숙주에서의 복제 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하기 위한 선발 유전자가 추가로 포함될 수 있다. DNA 영역들이 서로와 기능적으로 관련되어 있을 경우 이들은 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 신호 펩티드 (분비 리더)에 대한 DNA는 이것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현될 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이거나; 프로모터는 이것이 코딩 서열의 전사를 제어할 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 리보좀 결합 부위는 이것이 번역을 가능케 하도록 위치화될 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 효모 발현 시스템에서 사용하고자 하는 구조적 요소는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 대안적으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현될 경우, 이 단백질은 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 임의로, 발현된 재조합 단백질로부터 후속적으로 절단되어 최종 단백질을 제공할 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명은 본원에서 상기에 또는 다른 곳에서 기술된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 포함하며, 임의로, 1가지 이상의 담체, 희석제, 부형제 또는 기타 첨가제를 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다.
본원에 개시된 핵산 분자 또는 cDNA 분자 및/또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 또한 제공된다. 또한 본 발명은 제어 서열에 작동가능하게 연결되고 임의로 벡터 내로 삽입된 개시된 핵산 분자(들)로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 일부 측면에서, 숙주 세포는 포유류 숙주 세포이다. 추가의 측면에서, 포유류 숙주 세포는 NS0 쥐과 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포, 또는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 다른 측면에서, 숙주 세포는 하이브리도마이다.
부가적으로, 본원에 개시된 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 핵산을 발현하는 숙주 세포는 LOX1-결합 단백질을 생성하는 하이브리도마이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에서 제공된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)의 제조 방법을 제공하며, 이는 본원에 개시된 형질전환된 숙주 세포 또는 하이브리도마를 LOX1-결합 단백질을 생성하기에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함한다. 임의로 본 발명은 숙주 세포 또는 하이브리도마로부터 분비된 LOX1-결합 단백질을 단리하는 것을 제공한다. 또한 본 발명은 임의로, 이 방법을 이용하여 생성된 LOX1-결합 단백질과, LOX1-결합 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 의존적이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는 예를 들어 SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 세균 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 세균 플라스미드, 예컨대 pCR 1, pBR322, pMB9 및 그의 유도체를 포함하는 이. 콜라이로부터의 플라스미드와, 또한 더 넓은 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대 M13 및 사상 (filamentous) 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다.
LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)의 발현에 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 제어 하의 원핵 생물, 효모, 곤충 또는 더 고등한 진핵 세포를 포함한다. 원핵 생물은 그람 (gram) 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실루스 (bacillus)를 포함한다. 더 고등한 진핵 세포는 하기에 기술된 바와 같이 포유류 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 무세포 번역 시스템이 또한 이용될 수 있다. 항체 생성을 포함하는 단백질 생성 방법에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공개 제2008/0187954호, 미국 특허 제6,413,746호 및 미국 특허 제6,660,501호 및 국제 공개 제04009823호에서 발견될 수 있으며, 이들 각각은 본원에서 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
다양한 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)의 발현에 또한 유리하게 이용될 수 있다. 포유류 세포에서의 재조합 LOX1-결합 단백질의 발현은 그러한 단백질이 일반적으로 올바르게 폴딩되고, 적절하게 변형되고 완전히 기능성이기 때문에 수행될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예는 HEK-293 및 HEK-293T, 원숭이 신장 세포의 COS-7 주 (문헌[Gluzman (Cell 23:175 (1981))]에 기술됨), 및 예를 들어 L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소 (CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 포함하는 기타 세포주를 포함한다. 포유류 발현 벡터는 비전사 요소, 예를 들어, 복제 원점, 발현될 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 기타 5' 또는 3' 측면 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 (splice) 도너 및 억셉터 (acceptor) 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서의 이종성 단백질의 생성을 위한 바큘로 바이러스 (Baculovirus) 시스템이 문헌[Luckow and Summers, BioTechnology 6:47 (1988)]에 개관되어 있다.
형질전환된 숙주 또는 하이브리도마에 의해 생성된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 그러한 표준 방법은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성 및 크기화 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별 용해도 (differential solubility), 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의한 것을 포함한다. 친화성 태그, 예컨대 헥사 히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라아제를 단백질에 부착시켜 적절한 친화성 컬럼에서의 통과에 의한 용이한 정제를 허용할 수 있다. 단리된 LOX1-결합 단백질은 또한, 단백질 분해, 핵 자기 공명 및 x선 크리스탈로그래피와 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특성화될 수 있다.
예를 들어, 재조합 LOX1-결합 단백질을 배양 배지 내로 분비하는 시스템으로부터의 상청액은 먼저 구매가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 이용하여 농축될 수 있다. 농축 단계 후, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어, 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기를 갖는 매트릭스 도는 기재가 이용될 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 단백질 정제에서 일반적으로 이용되는 기타 유형일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계가 이용될 수 있다. 적합한 양이온 교환 장치는 술포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매체, 예를 들어 펜던트 메틸 또는 기타 지방족 기를 갖는 실리카 겔을 이용한 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계를 이용하여 LOX1-결합 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 다양한 조합의, 전술한 정제 단계들의 일부 또는 전부는 또한 균질한 재조합 LOX1-결합 단백질을 제공하기 위하여 일상적으로 이용될 수 있다.
세균 배양에서 생성된 재조합 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 예를 들어, 처음에 세포 펠렛으로부터의 추출, 이어서 하나 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 최종 정제 단계에 이용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에서 이용되는 미생물 세포는 냉동-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제의 이용을 포함하는 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다.
또한, 표적 결합 단백질, 예컨대 전장 항체 및 항원-결합 항체 단편을 정제하기 위한 당업계에 공지된 방법은 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2008/0312425호, 미국 특허 출원 공개 제2008/0177048호, 및 미국 특허 출원 공개 제2009/0187005호에 기술된 것을 포함하는데, 상기 미국 특허 출원 공개 각각은 본원에서 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
VII. 치료용 LOX1-결합 단백질을 이용한 치료 방법
LOX1, LOX1 활성, 및/또는 LOX1 발현과 연관된 질환을 갖는 대상체를 치료하기 위하여 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 사용하는 방법이 제공된다. LOX1 발현의 검출 방법은 당업계에 공지되어 있으며, PCR 기술, 면역조직화학, 유세포 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에서 제공된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편) 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 측면에서 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 LOX1-결합 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 LOX1, LOX1 활성, LOX1 발현 및/또는 감소된 HDL-매개 시그널링과 연관된 질환 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 개선을 위한 제약 조성물의 용도를 제공한다. 일부 측면에서, 본원에서 제공된 제약 조성물을 사용하여 치료되는 질환 또는 병태는 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, CAD, 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증 (예를 들어, 만성 염증), 혈관 형성, 자간전증 및/또는 암이다.
일부 측면에서, 제약 조성물은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체), 제약상 허용가능한 담체를 포함하며, 표지 그룹 또는 이펙터 그룹을 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "표지체"는 스크린에서의 검출을 가능하게 하도록 부착된 하나 이상의 요소, 동위원소, 또는 화합물을 나타낸다. 일반적으로 표지체는 하기의 3가지 부류로 나뉘어진다: (a) 방사성 또는 중 (heavy) 동위원소일 수 있는 동위원소 표지체, (b) 형광 및 비색 염료, 또는 다른 표지 방법을 가능하게 하는 비오틴과 같은 분자를 포함할 수 있는 소분자 표지체, 및 (c) 항체에 의해 인식되는 융합 파트너로서 포함되는 에피토프일 수 있는 면역 표지체. "표지 그룹"은 임의의 검출가능한 표지체를 나타낸다. 일부 측면에서, 표지 그룹은 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위하여 스페이서 (예를 들어, 펩티드 스페이서)를 통하여 LOX1-결합 단백질에 커플링될 수 있다. 표지체는 임의의 위치에서 화합물 내로 포함될 수 있으며 단백질 발현 동안 시험관 내에서 또는 생체 내에서 포함될 수 있다. 단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이는 제공된 방법의 수행에서 이용될 수 있다. 추가의 측면에서, 표지 그룹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 동위원소 표지체, 자성 표지체, 산화환원 활성 모이어티, 광학 염료, 비오티닐화 그룹, 및 이차 리포터에 의해 인식되는 폴리펩티드 에피토프. 일부 측면에서, 표지 그룹은 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (Green Fluorescent Protein) 또는 이의 유도체 (예를 들어, 증강된 GFP), 청색 형광 단백질 또는 이의 유도체 (예를 들어, EBFP (증강된 청색 형광 단백질 (Enhanced Blue Fluorescent Protein)), EBFP2, 아주라이트 (Azurite), 엠칼라말 (mKalama1), 시안 형광 단백질 또는 이의 유도체 (예를 들어, ECFP (증강된 시안 형광 단백질 (Enhanced Cyan Fluorescent Protein), 세룰레안 (Cerulean), 사이펫 (CyPet)), 황색 형광 단백질 또는 이의 유도체 (예를 들어, YFP, 시트린 (Citrine), 비너스 (Venus), 와이펫 (YPet))이다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 에피토프는 비오틴 시그널링 펩티드, 히스티딘 펩티드 (his), 헤마글루티닌 (HA), 플래그 (Flag), 금 결합 펩티드로부터 선택되는 멤버이다. 추가의 측면에서, 이펙터 그룹은 방사성 동위원소, 방사성 핵종, 독소, 치료제 및 화학요법제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 측면에서, 이펙터 그룹은 방사성 동위원소, 방사성 핵종, 독소, 치료제 및 화학요법제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하기 논의는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 이용한 다양한 질환 및 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법 및 진단 방법을 나타낸다. 일부 측면에서, LOX1-결합 단백질은 인간, 쥐과 또는 인간화 항체이다.
일 측면에서, 본 발명은 LOX1과 연관된 질환 또는 병태를 갖거나 LOX1과 연관된 질환 또는 병태의 발병 위험이 있는 대상체에게 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 병태의 치료법, 예방법 또는 개선법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 치료법은 LOX1과 연관된 질환 또는 병태를 갖거나 LOX1과 연관된 질환 또는 병태의 발병 위험이 있는 대상체로부터의 단리된 조직 또는 세포에 LOX1-결합 단백질을 투여하는 것을 포함한다.
또한 본 발명은 대상체에서의 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, CAD, 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증 (예를 들어, 만성 염증), 혈관 형성, 자간전증 및 암과 연관된 질환 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 측면에서, LOX1-결합 단백질은 단독으로 또는 병용 요법제로서 투여된다.
또한 본 발명은 대상체에서 LOX1 활성을 감소시키거나 저해하고/하거나 HDL-매개된 시그널링을 촉진하거나 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 방법은 이를 필요로 하는 대상체 (예를 들어 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, CAD, 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증 (예를 들어, 만성 염증), 혈관 형성, 자간전증 및/또는 암으로 진단된 대상체)에게 유효량의 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 투여하는 단계를 포함한다.
부가적으로, 아테롬성 동맥 경화증의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 아테롬성 동맥 경화증을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)이 투여되는 대상체는 아테롬성 동맥 경화증의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 전죽종형성 병태를 갖는다. 추가의 측면에서, 전죽종형성 병태는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 당뇨병, 고혈압, 고혈당증, 심부전, 혈관 손상, 장기 이식, 이상 지질 혈증 (예를 들어, 고지혈증), 염증 (예를 들어, 만성 염증 및 내독소 유도성 염증) 및/또는 세균 감염. 아테롬성 동맥 경화증의 감소 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 발명은 아테롬성 동맥 경화증을 갖는 대상체에게 LOX1-결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서의 아테롬성 동맥 경화증의 감소 방법을 제공한다.
혈전증의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 혈전증을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 혈전증의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 혈전증은 동맥 혈전증이다. 추가의 측면에서, 혈전증 심부 정맥 혈전증이다.
또한 본 발명은 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 CAD와 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 CAD를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 CAD의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 전죽종형성 병태를 갖는다. 추가의 측면에서, 전죽종형성 병태는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 당뇨병, 고혈압, 고혈당증, 심부전, 혈관 손상, 장기 이식, 이상 지질 혈증 (예를 들어, 고지혈증), 염증 (예를 들어, 만성 염증 및 내독소 유도성 염증) 및/또는 세균 감염이다.
또한 본 발명은 허혈 또는 허혈과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 허혈을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 허혈의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 심근 허혈을 갖는다. 다른 측면에서, 대상체는 심근 허혈의 발병 위험이 있다. 추가의 측면에서, 대상체는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 당뇨병, 고혈압, 고혈당증, 심부전, 혈관 손상, 장기 이식, 이상 지질 혈증 (예를 들어, 고지혈증), 염증 (예를 들어, 만성 염증 및 내독소 유도성 염증) 및/또는 세균 감염을 갖는다.
경색 또는 경색과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 경색을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 경색의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 심근 경색을 갖는다. 다른 측면에서, 대상체는 심근 경색의 발병 위험이 있다. 추가의 측면에서, 대상체는 허혈, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 당뇨병, 고혈압, 고혈당증, 심부전, 혈관 손상, 장기 이식, 이상 지질 혈증 (예를 들어, 고지혈증), 염증 (예를 들어, 만성 염증 및 내독소 유도성 염증) 및/또는 세균 감염을 갖는다.
또한 본 발명은 급성 관동맥 증후군 (ACS) 또는 ACS와 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 ACS를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 ACS의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 sLOX의 혈청중 수준 또는 상승된 LOX1 활성을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 아테롬성 동맥 경화증을 갖는다.
또한 본 발명은 뇌졸중 또는 뇌졸중과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 뇌졸중을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 뇌졸중을 가질 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 sLOX의 혈청중 수준 및/또는 상승된 LOX1 활성을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 아테롬성 동맥 경화증을 갖는다.
재관류 손상 또는 재관류 손상과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 재관류 손상을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)이 투여되는 대상체는 재관류 손상의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 곧 수술을 받으려고 한다. 다른 측면에서, 대상체는 수술을 받았다. 일부 측면에서, 수술은 이식 또는 관상동맥 우회술이다. 추가의 측면에서, 환자는 심근 허혈-재관류 손상을 갖거나, 심근 허혈-재관류 손상의 발병 위험이 있다. 추가의 측면에서, 본 방법은 심근 손상을 감소시키고/시키거나, 콜라겐 축적을 감소시키고/시키거나, 혈청중 CK-MB 수준 및 혈청중 MDA 수준을 감소시키고/시키거나, 심근 세포 크기를 감소시키고/시키거나, 백혈구 침윤을 감소시키고/시키거나, 심장 기능 장애를 감소시킨다 (예를 들어, 감소된 LVP 및 증가된 LVEDP). 추가의 측면에서, 본 방법은 일회심박출량, 단축률, 및/또는 인젝션 프랙션을 증가시킨다.
또한 본 발명은 재협착 또는 재협착과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 재협착을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 재협착의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 곧 수술을 받으려고 한다. 다른 측면에서, 대상체는 수술을 받았다. 일부 측면에서, 수술은 혈관내 시술이다. 추가의 실시 양태에서, 수술은 혈관 수술, 심장 수술 또는 혈관형성술이다. 추가의 측면에서, 시술은 이식 또는 관상동맥 우회술이다. 추가의 측면에서, 치료되고/되거나, 예방되고/되거나, 개선되는 재협착은 스텐트내 재협착 또는 혈관형성술 후 재협착이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 말초 혈관 질환 (PVD) 또는 PVD와 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 PVD를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, LOX1-결합 단백질이 투여되는 대상체는 PVD의 발병 위험이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 sLOX의 혈청중 수준 및/또는 상승된 LOX1 활성을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 아테롬성 동맥 경화증을 갖는다.
또한 본 발명은 염증 또는 염증과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 염증을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 측면에서, 대상체는 만성 염증을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 oxLDL 및/또는 sLOX의 혈청중 수준 및/또는 상승된 LOX1 활성을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 아테롬성 동맥 경화증을 갖는다.
또한 본 발명은 자간전증 또는 자간전증과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 제약 조성물 중 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 자간전증 또는 자간을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 측면에서, 대상체는 고혈압 및 다량의 요단백을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 oxLDL 및/또는 sLOX의 혈청중 수준 및/또는 상승된 LOX1 활성을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 족부, 다리 및/또는 수부 부종을 갖는다.
추가의 측면에서, 본 발명은 대상체에서의 아테롬성 동맥 경화증 경화반의 안정화 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 본 방법은 상기 경화반에서 RhoA/Rac1, 일산화질소, p38MAPK, 단백질 키나아제 B 및 C, ERK1/2, 및/또는 NFκB 신호 전달 경로의 시그널링을 감소시킨다. 다른 측면에서, 본 방법은 상기 경화반에서 아폽토시스를 감소시킨다. 추가의 측면에서, 본 방법은 상기 경화반에서 카스파아제 8, 카스파아제 9 및/또는 BAX 활성을 감소시키고/시키거나 BCL-2 활성을 증가시킨다. 다른 측면에서, 본 방법은 상기 경화반에 의해 생성되는 부착 분자 또는 사이토카인의 수준을 감소시킨다. 추가의 측면에서, 본 방법은 상기 경화반에 의한 E-셀렉틴, P-셀렉틴, ICAM-1, VCAM-1, MCP1 및/또는 CD40/CD40L 발현을 감소시킨다. 추가의 측면에서, 본 방법은 아테롬성 동맥 경화증 경화반의 크기 또는 형성, 아테롬성 동맥 경화증 경화반에서의 대식 세포 축적 및/또는 MMP (예를 들어, MMP9) 발현을 감소시킨다. 추가의 측면에서, 본 방법은 상기 경화반의 진행 또는 퇴행을 감소시킨다.
대상체에서의 혈관 긴장도 상실의 감소 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 본 방법은 혈관 긴장도 상실을 감소시킨다. 추가의 측면에서, 본 방법은 HDL 구동되는 산화 질소 (NO) 생성의 조절 (항체가 내피 NO 생성을 촉진하는 능력)을 통하여 대상체에서 혈관 긴장도 상실을 감소시킨다.
부가적으로, 대상체에서의 혈관 긴장도의 향상 방법이 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 고혈당증 또는 고혈압과 연관된 병태의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질을 고혈당증 또는 고혈압을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
부가적으로, 암의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 제공된다. 일부 예에서, 본 발명은 암을 갖는 대상체에게 LOX1-결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서의 암의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 대상체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 갖는다: 유방암, 결장암, 난소암, 흑색종, 자궁경부암, 폐암, 자궁암, 신장암, 및 췌장암.
종양 세포의 증식, 이동 또는 침윤의 저해 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 본 발명은 LOX1-결합 단백질을 LOX1을 발현하는 종양 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 LOX1 활성의 길항 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 종양 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 암으로부터 유래된다: 유방암, 결장암, 난소암, 흑색종, 자궁경부암, 폐암, 자궁암, 신장암, 및 췌장암. 일부 측면에서, 종양 세포는 암 주로부터 유래된다.
부가적으로, 본 발명은 혈관 형성의 감소 또는 저해 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 혈관 형성의 감소 또는 저해 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 대상체는 병리학적 혈관 형성과 연관된 병태를 갖는다. 추가의 측면에서, 본 발명은 LOX1-결합 단백질을 LOX1을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 혈관 형성의 저해 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 세포는 내피 세포이다. 추가의 측면에서, 내피 세포는 관상동맥 내피 세포이다. 일부 측면에서, 본 방법은 시험관 내에서 수행된다. 다른 측면에서, 본 방법은 생체 내에서 수행된다.
부가적으로, LOX1 활성의 차단 또는 감소 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 본 발명은 LOX1과 LOX1 리간드, 예컨대 oxLDL, AGE, 및/또는 CRP 사이의 상호작용을 감소시키거나 저해하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 투여하는 단계를 포함하는 LOX1 활성의 차단 방법을 제공한다. 일부 측면에서, LOX1은 내피 세포, 대식 세포, 혈관 평활근 세포 및/또는 혈소판의 표면 상에서 발현된다. 일부 측면에서, 세포는 내피 세포, 예컨대 관상동맥 내피 세포이다. 추가의 측면에서, 세포는 혈관 평활근 세포, 대식 세포, 또는 혈소판이다. 다른 측면에서, 세포는 아테롬성 동맥 경화증 조직의 일부이다. 일부 측면에서, 본 방법은 생체 내에서 수행된다. 다른 측면에서, 본 방법은 시험관 내에서 수행된다. 일부 측면에서, 차단된 또는 감소된 LOX1 활성은 oxLDL의 결합 및/또는 흡수 (예를 들어 내재화)이다. 추가의 측면에서, 차단된 또는 감소된 LOX1 활성은 p38 (MAPK), p44/42 MAPK, 단백질 키나아제 C (PKC), 단백질 키나아제 B (PKB), 단백질 타이로신 키나아제 (PTK), 전사 인자 NF-KB 및/또는 AP1 시그널링 경로의 유도이다. 추가의 측면에서, 차단된 또는 감소된 LOX1 활성은 아폽토시스의 유도이다. 추가의 실시 양태에서, 아폽토시스의 유도는 카스파아제-9, 카스파아제-3 및/또는 Bcl-2에 의해 매개된다. 추가의 측면에서, 차단된 또는 감소된 LOX1 활성은 LOX1을 발현하는 내피 세포에서의 헤파린-결합 EGF-유사 단백질 (HB-EGF) 및/또는 PDFG의 A 및 B 사슬의 발현이다. 일부 측면에서, 차단된 또는 감소된 LOX1 활성은 LOX1에의 oxLDL의 결합에 의해 유도되는 LOX1 활성이다.
부가적으로, 증가된 LOX1 활성 수준 또는 LOX1 발현 수준 (예를 들어 sLOX1의 혈청중 단백질 수준)과 연관된 병리학적 병태에서의 LOX1 활성의 차단 또는 감소 방법이 제공된다. 일부 예에서, 본 방법은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 증가된 LOX1 활성 또는 LOX1 발현 수준 (예를 들어 sLOX1의 혈청중 단백질 수준)을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 병리학적 병태는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 당뇨병, 고혈압, 고혈당증, 심부전, 혈관 손상, 이식, 이상 지질 혈증 (고지혈증), 염증, (예를 들어, 만성 염증 및 내독소 유도성 염증) 또는 세균 감염이다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 혈청중 수준의 OxLDL을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 상승된 혈청중 수준의 OxLDL, 15 리포옥시게나아제 변형 LDL, 15 리포옥시게나아제 변형 HDL, 글리옥시다이즈드 LDL, 라이소포스파티딜콜린에스테라아제 (LPC) 및/또는 팔미트산을 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 상승된 혈청중 수준의 TNF 알파, IL1, 인터페론 감마, LPS (리포다당류), CRP, 안지오텐신 II, 엔도텔린 I, 및/또는 AGE를 갖는다. 추가의 측면에서, 대상체는 상승된 혈청중 수준의 용해성 LOX1 (sLOX1)을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 LOX1 유전자에서 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 갖는다. 일부 측면에서, LOX1 유전자에서의 SNP는 LOX1 K167N 변이체이다.
고밀도 리포단백질 (HDL) 활성의 작동 또는 증가 방법이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 본 발명은 HDL 활성의 증가 또는 작동 방법을 제공하며, 이는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함에 의한 것이다. 일부 측면에서, 증가된 HDL 활성은 HDL-매개된 내피 NO 생성의 촉진이다. 일부 측면에서, 증가된 HDL 활성은 내피 세포의 NFKB 시그널링 활성의 저해이다. 일부 측면에서, 증가된 HDL 활성은 내피 세포 복구의 촉진이다. 일부 측면에서, 증가된 HDL 활성은 염증의 감소이다.
예를 들어 주어진 치료 섭생법의 효능을 결정하기 위한, 임상 시험 절차의 일부로서 혈중 또는 조직중 단백질 수준 (예를 들어, LOX1 수준)의 진단적 모니터링에 있어서의 본원에 제공된 LOX1-결합 단백질과 같은 LOX1-결합 단백질의 용도가 또한 제공된다. 예를 들어, 검출은 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체)을 검출가능한 물질에 커플링시킴으로써 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 분자단 (prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하며; 적합한 보결 분자단 복합체의 예는 엔프타비딘 (nptavidin)/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하며; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하며; 생물발광 물질의 예는 루시퍼라아제, 루시페린, 및 에쿼린 (aequorin)을 포함하며; 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 또는 3H를 포함한다.
VIII. 제약 조성물 및 투여 방법
본원에 제공된 LOX1-결합 단백질의 제조 방법 및 본원에 제공된 LOX1-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 당업자에 의해 쉽게 결정된다. LOX1-결합 단백질의 투여 경로는 예를 들어 경구, 비경구 투여, 흡입에 의한 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 비경구라는 용어는 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여를 포함한다. 모든 이러한 형태의 투여가 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 명백히 고려되지만, 투여 형태의 또 다른 예로는 주사용, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사용 또는 점적용 용액이 있다. 일반적으로, 적합한 제약 조성물은 완충제 (예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제 (예를 들어 폴리소르베이트), 임의로, 안정화제 (예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 본원의 교시와 양립가능한 다른 방법에서, 본원에 제공된 LOX1-결합 단백질을 아테롬성 동맥 경화증 또는 종양의 부위 및/또는 기관으로 직접적으로 전달함으로써 질환에 걸린 조직의 치료제에의 노출을 증가시킬 수 있다. 일 측면에서, 투여는 예를 들어 흡입 또는 비강내 투여에 의해 기도로 직접적으로 한다.
본원에서 논의된 바와 같이, LOX1-결합 단백질은 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, CAD, 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증 (예를 들어, 만성 염증), 혈관 형성, 자간전증 및 암과 같은 LOX1-매개된 질환 및 병태의 생체 내 치료를 위한 제약상 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 개시된 LOX1-결합 단백질은 활성제의 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 촉진하도록 제형화될 수 있음이 인정된다. 본 발명에 따른 제약 조성물은 제약상 허용가능한 비독성, 살균 담체, 예컨대 생리식염수, 비독성 완충제, 방부제 등을 포함할 수 있다. 본 출원의 목적상, 콘쥬게이션되거나 비콘쥬게이션된 LOX1-결합 단백질의 제약상 유효량은 LOX1에의 효과적인 결합을 달성하고 이익을 달성하기에 충분한, 예를 들어 질환 또는 병태의 증상을 개선시키거나 물질 또는 세포를 탐지하기에 충분한 양을 의미한다. 본원에 개시된 치료 방법에서 사용하기에 적합한 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)]에 기술되어 있다.
본원에 제공된 특정 제약 조성물은 예를 들어 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는 허용가능한 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 또한 특정 제약 조성물은 비강용 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 그러한 조성물은 벤질 알코올 또는 다른 적합한 방부제, 생체이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 및/또는 다른 통상적인 가용화제 또는 분산제를 이용하여 염수 중 용액으로 제조될 수 있다.
단회 투여 형태를 생성하도록 담체 물질과 배합될 수 있는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)의 양은 치료되는 대상체 및 특정한 투여 양식에 따라 달라진다. 조성물은 단회 용량, 다회 용량으로서 또는 확립된 시간 기간에 걸쳐 주입액으로 투여될 수 있다. 투여 섭생법은 또한 최적의 요망되는 응답 (예를 들어, 치료적 또는 예방적 응답)을 제공하도록 조정될 수 있다.
본 발명의 개시 내용의 범주와 일치하도록, LOX1-결합 단백질은 치료 효과를 생성하기에 충분한 양으로 전술한 치료 방법에 따라 인간 또는 기타 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에서 제공된 LOX1-결합 단백질은 공지된 기술에 따라 LOX1-결합 단백질을 통상적인 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제와 배합함으로써 제조되는 통상적인 투여 형태로 그러한 인간 또는 기타 동물에게 투여될 수 있다. 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특징은 이것과 배합될 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 잘 알려진 변수에 의해 지시될 수 있다. 1가지 이상의 상이한 LOX1-결합 단백질을 포함하는 칵테일 (cocktail)이 또한 이용될 수 있다.
"치료적 유효 용량 또는 유효량" 또는 "유효량은 투여될 때 치료될 질환 또는 병태를 갖는 대상체의 치료와 관련하여 긍정적인 치료 응답을 야기하는 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)의 양을 의도한다.
아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, CAD, 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증 (예를 들어, 만성 염증), 혈관 형성, 자간전증 및 암과 같은 LOX1-매개된 질환 또는 병태의 치료를 위한 LOX1-결합 단백질 조성물의 치료적 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 인간이든지 동물이든지 간에 대상체의 생리학적 상태, 투여되는 다른 약물, 및 치료가 예방적인지 치료적인지를 포함하는 많은 상이한 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 대상체는 인간이지만, 트랜스제닉 포유류를 포함하는 비-인간 포유류가 또한 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위하여 당업자에게 공지된 일상적인 방법을 이용하여 적정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, LOX1-결합 단백질의 투여에 의한 특정한 질환 또는 병태의 증상의 개선은 LOX1-결합 단백질의 투여에 기인하거나 LOX1-결합 단백질의 투여와 연관될 수 있는, 영구적이든지 일시적이든지, 지속되든지 순간적이든지 간에 임의의 감소를 나타낸다.
투여될 적어도 1가지의 LOX1-결합 단백질, 예를 들어 항체 또는 결합 단편의 양은 본 발명의 개시 내용이 주어진다면 과도한 실험 없이 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 적어도 1가지의 LOX1-결합 단백질의 투여 양식 및 각각의 양에 영향을 주는 요인은 질환의 중증도, 병력, 및 치료법을 받고 있는 개체의 연령, 키, 체중, 건강, 및 신체 상태를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 유사하게, 투여될 LOX1-결합 단백질의 양은 투여 양식 및 대상체가 이 에이전트의 단회 용량을 받을 것인지 다회 용량을 받을 것인지에 의존적이다.
또한 본 발명은 예를 들어 HDL 활성을 개선시키기 위한 의약의 제조, 및 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, CAD, 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 염증 (예를 들어, 만성 염증), 혈관 형성, 자간전증 및 암의 치료, 예방 및/또는 개선 방법에서의 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)와 같은 LOX1-결합 단백질의 용도를 제공한다.
병용 요법
일부 측면에서, LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)은 1가지 이상의 다른 치료법과 조합되어 투여된다. 그러한 치료법은 추가의 치료제와, 다른 의학적 개입을 포함한다. 본원에서 제공된 LOX1-결합 단백질과 배합되어 투여될 수 있는 예시적인 치료제는 혈소판 저해제, 항-응고제, 항고혈압제, 당단백질 IIb/IIIa 수용체 저해제, 베타 차단제, 칼슘 채널 차단제, HMG CoA 리덕타아제 저해제 (스타틴), 에제티미베, 피브레이트 (예를 들어, 게미피브로질 (Gemifibrozil) 및 페노피브레이트 (Fenofibrate)), 제티아 (Zetia), 담즙산 격리제 (bile acid sequestrant), 니트레이트 및 혈전 용해제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다양한 측면에서, LOX1-결합 단백질은 수술 절차 전, 수술 절차 동안 및/또는 수술 절차 후 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 수술은 혈관내 시술이다. 추가의 실시 양태에서, 수술은 혈관 수술, 심장 수술 또는 혈관형성술이다. 추가의 측면에서, 상기 절차는 이식 또는 관상동맥 우회술이다.
IX. 진단법
추가로 본 발명은 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, 관상 동맥 질환 (CAD), 허혈 (예를 들어, 심근 허혈), 경색 (예를 들어, 심근 경색), 급성 관동맥 증후군 (ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증, 혈관 형성, 자간전증 및 암과 같은 LOX1-매개된 질환 및 병태의 진단 동안 유용한 진단 방법을 제공하며, 이는 개체로부터의 혈청과 같은 체액 또는 조직 중 LOX1 (sLOX1을 포함함) 단백질의 발현 수준을 측정하는 것 및 측정된 발현 수준을 정상 조직 또는 체액 중 표준 LOX1 발현 수준과 비교하는 것을 포함하는데, 이에 의하면 상기 표준과 비교하여 상기 발현 수준이 증가하는 것은 본원에서 제공된 LOX1-결합 단백질, 예컨대 본원에서 제공된 전장 항-LOX1 항체 및 항원-결합 항체 단편에 의한 장애의 치료를 나타낸다.
본원에서 제공된 LOX1-결합 단백질, 예컨대 항-LOX1 항체 (예를 들어, 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)는 당업자에게 공지된 고전적인 면역조직학적 방법을 이용하여 생물학적 샘플 중 LOX1 단백질 수준을 분석하는 데 이용될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Jalkanen, et al., J. Cell. Biol . 101:976-985 (1985)]; 문헌[Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)] 참조). LOX1 단백질 발현의 검출에 유용한 다른 항체-기반 방법은 면역분석법, 예컨대 효소 결합된 면역흡착 분석법 (ELISA), 면역침전법 또는 웨스턴 블로팅을 포함한다.
"LOX1 단백질의 발현 수준의 분석"은 제1 생물학적 샘플 중 LOX1 단백질의 수준을 직접적으로 (예를 들어, 절대 단백질 수준의 결정 또는 개산에 의해) 또는 상대적으로 (예를 들어, 제2 생물학적 샘플 중의 질환 연관될 폴리펩티드의 수준과의 비교에 의해) 정성적으로 또는 정량적으로 측정하거나 개산하는 것을 의도한다. 제1 생물학적 샘플 중 LOX1 단백질 발현 수준은 측정되거나 개산되고 표준 LOX1 단백질 수준과 비교될 수 있으며, 상기 표준은 장애를 갖지 않는 개체로부터 수득되는 제2 생물학적 샘플로부터 취해지거나 장애를 갖지 않는 개체의 집단으로부터의 수준의 평균에 의해 결정된다. 당업계에서 인정되는 바와 같이, 일단 "표준" LOX1 단백질 수준이 공지되어 있으면, 이것은 비교를 위하여 표준으로서 반복적으로 사용될 수 있다.
"생물학적 샘플"은 개체, 세포주, 조직 배양물, 또는 기타 세포 소스 (LOX1을 잠재적으로 발현함)로부터 수득되는 임의의 생물학적 샘플을 의도한다. 포유류로부터의 조직 생검체 및 체액의 수득 방법은 당업계에 공지되어 있다.
X. LOX1-결합 단백질을 포함하는 키트
추가로 본 발명은 적합한 패키징 (packaging) 중 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체, 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체), 및 명기된 물질을 포함하고 본원에 기술된 방법을 수행하는 데 이용될 수 있는 키트를 제공한다.
명기된 물질은 하기 정보 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 사용 설명서, 임상 연구의 논의, 부작용의 목록, 과학 문헌 참고물, 패키지 인서트 (insert) 물질, 임상 실험 결과, 및/또는 이들의 요약 등. 명기된 물질은 조성물의 활성 및/또는 강점을 표시하거나 확립하고/하거나 투약, 투여, 부작용, 약물 상호작용, 또는 건강 관리 제공자에게 유용한 다른 정보를 설명할 수 있다. 그러한 정보는 다양한 연구, 예를 들어, 생체 내 모델을 포함하는 실험 동물을 이용한 연구 및/또는 인간 임상 실험을 기반으로 한 연구의 결과를 기반으로 할 수 있다. 키트는 또 다른 요법제 (예를 들어, 또 다른 에이전트) 및/또는 명기된 물질, 예컨대 다른 요법제 (예를 들어, 다른 에이전트)에 관한 정보를 제공하는 역할을 하는 상기에 기술된 것을 추가로 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 키트는 1개 이상의 용기 내에 적어도 1가지의 정제된 LOX1-결합 단백질을 포함한다. 일부 측면에서, 키트는 모든 대조구, 분석 수행에 대한 지시, 및 결과의 분석 및 제시를 위한 임의의 필요한 소프트웨어를 포함하여, 검출 분석을 수행하는 데 필요하고/하거나 검출 분석을 수행하기에 충분한 모든 구성요소를 포함한다.
XI. 면역분석법
LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 및 이의 LOX1-결합 단편, 변이체 또는 유도체)은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 면역특이적 결합에 대하여 분석될 수 있다. 사용될 수 있는 면역분석법은, 몇 가지만 말하자마녀, 웨스턴 블롯, 방사성면역분석법, ELISA (효소 결합된 면역흡착 분석법), "샌드위치 (sandwich)" 면역분석법, 면역침전 분석법, 침강 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체-고정 분석법, 면역방사계측 분석법, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법과 같은 기술을 이용한 경쟁적 및 비-경쟁적 분석법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러한 분석법은 일상적인 것이며, 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1] 참조).
본원에 제공된 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체 또는 이의 LOX1-결합 단편, 변이체, 또는 유도체)은 LOX1 또는 이의 보존된 변이체 또는 펩티드 단편의 원위치 검출을 위하여, 면역형광, 면역전자 현미경법 또는 비-면역학적 분석법에서와 같이, 조직학적으로 이용될 수 있다. 원위치 검출은 조직학적 시편을 대상체로부터 제거하고, 표지된 LOX1-결합 단백질을 생물학적 샘플 상에 놓음으로써 표지된 LOX1-결합 단백질에 적용함으로써 성취될 수 있다. 그러한 절차의 이용을 통하여, LOX1, 또는 보존된 변이체 또는 펩티드 단편의 존재 뿐만 아니라 조사된 조직에서의 그의 분포도 결정할 수 있다. 본 발명의 개시 내용을 이용하여, 당업자라면 임의의 매우 다양한 조직학적 방법 (예컨대 염색 절차)이 그러한 원위치 검출의 달성을 위하여 변형될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다.
주어진 로트의 LOX1-결합 단백질 (예를 들어, 항-LOX1 항체, 예컨대 전장 LOX1-항체 및 이의 LOX1-결합 항체 단편, 및 변이체 및 유도체)의 결합 활성은 당업계에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 당업자라면 일상적인 실험을 이용하여 각각의 결정을 위한 가동 조건 및 최적 분석 조건을 결정할 수 있다.
단리된 LOX1-결합 단백질의 결합 특성의 결정에 적합한 방법 및 시약은 당업계에 공지되어 있고/있거나 구매가능하다. 그러한 동역학적 분석용으로 설계된 장비 및 소프트웨어가 구매가능하다 (예를 들어, 비아코어®, 비아이밸류에이션 (BIAevaluation)® 소프트웨어, 지이 헬스케어 (GE Healthcare); 키넥사® 소프트웨어, 사피다인 인스트루먼츠 (Sapidyne Instruments)).
달리 표시되지 않으면, 본 발명의 실행에서 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기술이 이용되며, 이는 당업계의 기술 이내에 있다. 그러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; 문헌[Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)]; 문헌[D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II]; 문헌[Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis]; 물리스 (Mullis) 등의 미국 특허 제4,683,195호; 문헌[Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization]; 문헌[Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation]; 문헌[Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)]; 문헌[Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)]; 문헌[Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, 방법 In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; 문헌[Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)]; 문헌[Wu et al., eds., 방법 In Enzymology, Vols. 154 and 155]; 문헌[Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical 방법 In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)]; 문헌[Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV]; 문헌[Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)]; 및 문헌[Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)]을 참조한다.
항체 엔지니어링의 일반적인 원리가 문헌[Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)]에 개시되어 있다. 단백질 엔지니어링의 일반적인 원리가 문헌[Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)]에 개시되어 있다. 항체 및 항체-합텐 결합의 일반적인 원리가 문헌[Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.)]; 및 문헌[Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)]에 개시되어 있다. 부가적으로, 문헌[Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.)] 및 문헌[Mishell et al., (eds) (1980) Selected 방법 in Cellular Immunology (W.H. Freeman & Co., NY)]에서와 같이, 당업계에 공지된 그러나 구체적으로 설명되지 않은 면역학에서의 표준 방법을 일반적으로 따른다.
면역학의 일반 원리가 개시되어 있는 표준 참고서는 문헌[Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY)]; 문헌[Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyzes (Plenum Press, NY)]; 문헌[Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevere, Amsterdam)]; 문헌[Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunnology (4th ed.; H. Freemand & Co.)]; 문헌[Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby)]; 문헌[Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division)]; 문헌[Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan)]; 문헌[Sambrook (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)]; 문헌[Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003)]; 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)]; 문헌[Dieffenbach et al., (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)]을 포함한다.
하기 실시예는 예시로 제공되며, 한정하는 것으로 제공되는 것이 아니다.
실시예
본 명세서의 측면은 하기의 비제한적 실시예를 참고하여 추가로 정의될 수 있으며, 실시예는 본 발명의 일부 항체의 제조 및 본 발명의 항체를 이용하는 방법을 상세히 개시한다. 재료 및 방법 둘 모두에 대한 많은 변형이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 실시될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1. 항-LOX1 scFv 항체의 단리 및 확인
성체 나이브 () 공여체로부터의 골수로부터 유래되고 사상 파지 M13을 기반으로 한 파지미드 벡터 내로 클로닝된 대형 단쇄 Fv (scFv) 인간 항체 라이브러리를 선발을 위해 이용하였다 (문헌[Hutchings, C., Generation of Naive Human Antibody Libraries, in Antibody Engineering, R. Kontermann and S. Dubel, Editors. 2001, Springer Laboratory Manuals, Berlin. p. 93]). LOX1-특이적 scFv 항체를 본질적으로 이전에 개시된 바와 같이 (문헌[Vaughan et al., Nat. Biotechnol. 14:309 (1996)]) 재조합 포유류 발현 인간 LOX1 (알앤디 시스템즈 (R&D Systems))에서의 일련의 반복된 선발 사이클에서 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하였다. 이 프로토콜의 상이한 변형으로부터 몇몇 항원-특이적 ScFv를 수득하는 한편, 모 클론 LOX514 (서열 번호 29 (VH) 및 서열 번호 33 (VL); 본원에서 "LOX10514"로 불림) 및 LOX696 (서열 번호 54 (VH) 및 서열 번호 70 (VL); 본원에서 "LOX10696"로 불림)을 하기와 같이 단리하였다: 10 μg/ml의 인간 LOX1을 맥시소르프 (MAXISORP)™ 플레이트 (넝크(Nunc)) 상에 고정시키고 파지 디스플레이 라이브러리와 함께 인큐베이션하였다. 미결합 파지는 일련의 세척 사이클에서 세척하여 제거하였다. 항원에 보유된 파지 입자를 용출하고, 세균 내로 감염시키고 다음 선발 라운드를 위해 구조하였다 (rescued). 3개의 라운드의 선발을 이러한 방식으로 수행하였다. 제2 라운드 및 제3 라운드 선발 결과로부터 개별 클론의 대표적 번호를 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. ScFv를 세균 주변세포질에서 발현시키고 실시예 10, 분석 1에 개시된 인간 LOX1:oxLDL 결합 분석에서 그들의 저해 활성에 대해 스크리닝하였다.
스크리닝 히트, 즉, 조 주변세포질 추출물로서, LOX1:oxLDL 상호작용에 저해 효과를 나타낸 scFv 클론을 DNA 서열결정하였다 (문헌[Vaughan et al., Nat. Biotechnol. 14:309 (1996)], 및 문헌[Osbourn et al., Immunotechnology 2:181 (1996)]). 독특한 ScFv를 세균에서 재발현시키고 (국제 공개 제01/66754호의 실시예 3에 개시된 바와 같이) 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, 상기 분석에서 정제된 ScFv의 희석 시리즈를 테스트하여 IC50 값을 결정하였다.
가장 강력한 scFv 클론을 하기의 변형을 가지고 본질적으로 문헌[Persic et al.,Gene 187:9 (1997)]에 개시된 전체 면역글로불린 G1 삼중 돌연변이 (IgG1-TM, 돌연변이 L234F, L235E 및 P331S를 포함하는 인간 IgG1 Fc 서열) 항체 포맷으로 전환시켰다. CHO 세포에서 사용하는 것을 촉진하고 에피좀 복제를 허용하기 위하여 OriP 단편을 발현 벡터에 포함시켰다. 포유류 세포에서 전체 IgG1-TM 중쇄를 발현시키기 위하여 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 포함하는 벡터 내로 VH 도메인을 클로닝하였다. 이와 유사하게, 포유류 세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현하기 위하여 인간 경쇄 불변 도메인 및 조절 요소의 발현을 위한 벡터 내로 VL 도메인을 클로닝하였다. IgG를 수득하기 위하여, 중쇄 및 경쇄 IgG 발현 벡터로 CHO 포유류 세포를 트랜스펙션시켰다. IgG를 발현시키고 배지 내로 분비시켰다. 수확물을 모으고 여과하고 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 IgG를 정제하였다. 배양 상청액을 적절한 크기의 세라믹 단백질 A (바이오세프라 (BioSepra)) 컬럼 상에 로딩하고 50 mM 트리스 (Tris)-HCl pH 8.0, 250 mM NaCl로 세척하였다. 0.1 M 시트르산나트륨 (pH 3.0)을 이용하여 결합된 IgG를 컬럼으로부터 용출시키고 트리스-HCl (pH 9.0)을 첨가하여 중화시켰다. 용출된 물질을 Nap10 컬럼 (아머샴 (Amersham), #17-0854-02)을 이용하여 PBS 내로 완충제 교환하고 IgG의 아미노산 서열을 기반으로 한 흡광 계수를 이용하여 IgG의 농도를 분광학적으로 결정하였다 (문헌[Mach et al., Anal Biochem, 200:74 (1992)]). 정제된 IgG를 SEC-HPLC를 이용하고 그리고 SDS-PAGE에 의해 응집 및 분해에 대해 분석하였다.
실시예 2 - 항-LOX1 항체는 다중-리간드 결합, oxLDL 내재화 및 oxLDL 유도된 시그널링을 저해한다
정제된 IgG를 실시예 10, 분석 1, 2 및 3에 개시된 바와 같이 산화 저밀도 리포단백질 ("oxLDL"), 소 혈청 알부민의 어드밴스드 당화 최종 산물 ("AGE-BSA") 및 C-반응성 단백질 ("CRP")의 LOX1에의 결합을 특이적으로 저해하는 그들의 능력에 대해 테스트하였다. LOX10514 및 LOX10696을 비롯한 많은 단리된 클론 및 구매가능한 마우스 항-LOX1 항체 (23C11)를 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP의 LOX1에의 결합을 차단하는 그의 능력에 대해 테스트하였다. 대표적인 그래프가 각각 LOX514 및 LOX696에 의한 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP 결합의 저해를 보여주는 도 1a, 1b 및 1c에 도시되어 있다. 항체가 교차반응하며 LOX1 SNP K167N에 대한 기능적 활성을 가짐을 확인하기 위하여, 항체를 LOX1 SNP K167N에의 oxLDL 결합을 차단하는 그의 능력에 대해 테스트하였다. LOX1 SNP K167N (젠뱅크 기탁 번호 AB102861)은 원래 허혈성 심장 질환을 가진 환자의 가족에서 발견된 자연 발생 인간 LOX1 변이체이며 심근 경색 위험 증가와 연관된 것으로 생각된다. 예를 들어, 문헌[Tatsuguchi et al., Biochem Biophys Res Commun. 28;303(1):247-50(2003)]을 참조한다. LOX514 및 LOX696 둘 모두가 LOX1 SNP K167N 변이체에의 oxLDL 결합을 차단함을 보여주는 도 1d에 대표적인 그래프가 예시되어 있다. 결합 저해에 더하여, LOX10514 및 LOX10696을 비롯한 많은 단리된 클론을 LOX1 발현 세포 상에서의 oxLDL 내재화 (실시예 10, 분석 4에 개시됨) 및 oxLDL 유도된 LOX1 시그널링 (실시예 10, 분석 5에 개시됨)을 차단하는 그의 능력에 대해 테스트하였다. 각각 oxLDL 내재화 및 시그널링의 저해에 대한 도 2a 및 2b에 대표적인 그래프가 예시되어 있다. 이들 연구로부터의 결과는 표 2에 요약되어 있다.
[표 2]
이들 결과는 하기를 입증한다: (1) 항체 LOX514 및 LOX696에 의한 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP에의 LOX1 결합의 특이적 저해; (2) LOX514 및 LOX696 둘 모두는 공통된 LOX1 SNP K167N 변이체와 기능적으로 교차 반응함; (3) LOX514 및 LOX696은 oxLDL 내재화를 저해함; 및 (4)LOX514 및 LOX696은 oxLDL-유도된 LOX1 시그널링을 저해함.
실시예 3 - 인간 관련 패밀리 멤버 패널에 대한, 인간 LOX1에 대한 항-LOX1 항체의 종 교차-반응성 및 특이성
다양한 LOX1 종 오르소로그에 대한 항-인간 LOX1 항체의 교차-반응성을 scFv 결합 ELISA에 의해 평가하였다. 인간 (유니프로트 (Uniprot): P78380), 마우스 (유니프로트: Q9EQ09), 래트 (유니프로트: O70156), 토끼 (유니프로트: Q9XTA8) 및 시노몰구스 원숭이 LOX1의 세포외 도메인 구성물을 N 또는 C 말단 플래그 및 히스티딘 태그를 이용하여 설계하고 게이트웨이 데스티네이션 (Gateway destination) 벡터 (인비트로겐 (Invitrogen)) 내로 클로닝하였다. 이어서 단백질 발현을 위하여 포유류 HEK293 EBNA 세포를 이 구성물로 트랜스펙션시켰다. 그 후 단백질을 표준 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피 정제하였다. 요약하면, 인간 (HisFlag)-LOX1, 시노몰구스 LOX1-(FlagHis), 마우스 LOX1-(FlagHis), 래트 LOX1-(FlagHis) 및 토끼 LOX1-(FlagHis)를 각각 맥시소르프™ 플레이트 상에 PBS 완충제 중에 10, 10, 5, 5 및 5 μg/ml로 코팅하였다. 그러한 농도를 이용한 효율적인 항원 코팅은 먼저 시판되는 항-인간 LOX1 (하이컬트 (Hycult)로부터의 23C11) 또는 항-His (유로퓸-표지됨, 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer)) 항체를 이용하여 ELISA에 의해 체크하였다. 웰을 3% 분유를 함유한 PBS로 차단한 후, PBS 및 3% 분유 중의 정제된 항-LOX1 ScFv를 1시간 동안 상이한 코팅된 항원과 함께 인큐베이션하였다. 결합된 scFv 분자를 100 ng/mL의 이차 유로퓸 표지 항-Myc 태그 항체 (퍼킨 엘머)를 이용하여 검출하였다. 340 nm 여기 및 615 nM 방출을 이용하여 플레이트를 형광에 대해 판독하였다. 비-특이적 결합은 10 μg/ml로 코팅된 소 혈청 알부민 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs))에서 결정하였다.
도 3a에 예시된 바와 같이, LOX514 ("LOX10514") 및 LOX696 ("LOX10696")은 인간 및 시노몰구스 LOX1에 결합하지만, 마우스, 래트 또는 토끼 LOX1 오르소로그에 결합하지 않는다. 마우스 LOX1에의 항체 교차-반응성의 부재는, 이들 종 간에 C 타입 렉틴 도메인 전체에 걸친 낮은 상동성을 고려할 때 (인간과 마우스 사이에 대략 62%) 놀랍지 않다.
다른 인간 C 타입 렉틴 및 스캐빈저 수용체 관련 분자에 대한 항-인간 LOX1 항체 분자의 특이성은 실시예 10, 분석 6에 개시된 바와 같이 IgG 결합 ELISA에 의해 평가하였다. 도 3b에 예시된 바와 같이, LOX514 ("LOX10514") 및 LOX696 ("LOX10696")은 인간 LOX1에만 결합하며 인간 CLEC-7A, CLEC-1A, CLEC-4L, CLEC-1B, SR-A1 및 SR-B3에는 결합하지 않는다. 그 결과는 LOX514 및 LOX696의 LOX1에 대한 특이성을 입증한다.
실시예 4 - 표적화된 CDR 무작위화 및 LOX514의 재조합에 의한 효력 최적화 항-LOX1 scFv 항체의 단리 및 확인
LOX514는 친화성-기반 파지 선발을 이용하여 최적화하였다. LOX514 scFv 서열로부터 유도된 대형 scFv 라이브러리는 개시된 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 (문헌[Clackson, T. and Lowman, H.B. Phage Display - A Practical Approach, 2004. Oxford University Press]) 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 2 또는 3 (VH-CDR2 또는 VH-CDR3) 또는 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 3 (VL-CDR3)의 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발에 의해 생성하였다. 인간 LOX1에 더 높은 친화성을 가진 변이체를 선발하기 위하여 라이브러리를 친화성-기반 파지 디스플레이 선발을 하였다. 이들은 oxLDL 및 기타 LOX1 리간드에의 LOX1 결합에 대한 개선된 저해 활성을 나타낼 것으로 예상되었다. 선발은 본질적으로 이전에 개시된 바와 같이 수행하였다 (문헌[Thompson et al., J Mol Biol. 256(1):77-88, (1996)]). 요약하면, scFv-파지 입자를 용액 중의 재조합 비오티닐화 인간 LOX1 (이지 링크 (EZ LINK)™ 술포 (Sulfo)-NHS-LC-비오틴 (써모/피어스 (Thermo/Pierce), 제품: 21335)을 이용하여 자유 아민을 통해 비오티닐화됨)과 함께 인큐베이션하였다. 이어서 항원에 결합된 ScFv를 제조업자의 권고에 따라 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드 (다이나비즈 (DYNABEADS)® M-280) 상에 포획시켰다. 그 후 선발된 scFv-파지 입자를 이전에 개시된 바와 같이 수득하고 (문헌[Osbourn et al., Immunotechnology, 2(3):181-96, (1996)]), 감소하는 농도의 비오티닐화된 인간 LOX1의 존재 하에서 (전형적인 예는 4개의 라운드에 걸쳐서 50 nM 내지 20 pM임) 선발 과정을 반복하였다.
조 scFv-함유 주변세포질 추출물을 CDR-표적화 선발 결과물로부터의 개별 ScFv의 대표 번호를 위해 제조하고, 실시예 10, 분석 7에 개시된 바와 같이 모 항체 LOX514에 대해 에피토프 경쟁 HTRF® (균질 시분해 형광) 분석 포맷에서 스크리닝하였다. 스크린 히트, 즉, 모 LOX514와 비교할 때 상당히 개선된 저해 효과를 나타낸 scFv 변이체를 DNA 서열결정하고, 가변 중쇄 CDR2 또는 CDR3 및 가변 경쇄 라이브러리 CDR3 결과물로부터의 독특한 변이체를 정제된 scFv로서 생성하고 테스트하였다. 그 후 일부 ScFv를 선발하고 추가 특성화를 위하여 IgG1-TM으로 전환하였다. 이 접근법에 따라 수득한 최적화된 LOX514 항체의 전형적인 예는 LX5140011, LX5140014, LX5140016 및 LX5140038를 포함한다 (표 1 또는 도 4에 개시됨).
추가 개선을 생성하기 위하여, 인간 LOX1에의 모 LOX514의 결합을 저해는 능력을 가진 많은 scFv 변이체를 포함하는 CDR-무작위화된 선발 결과물을 재조합하여, 클론이 VH 또는 VL CDR3 서열을 가진 무작위로 쌍을 이룬 개별 무작위화 VH CDR2를 함유하는 라이브러리를 형성하였다.
조 scFv-함유 주변세포질 추출물을 에피토프 경쟁 HTRF® 분석에서 재조합된 VH2/VH3 또는 VH2/VL3 라이브러리로부터 개별 ScFv의 대표 번호로 제조하였다. 스크린 히트, 즉, 모 scFv 및 재조합 전에 생성된 선두에 비교할 때 상당히 개선된 저해 효과를 나타낸 scFv 변이체를 DNA 서열결정하고, 독특한 재조합된 변이체를 정제된 scFv로서 생성하고 테스트하였다. 그 후 가장 활성인 ScFv를 선발하고 추가 특성화를 위하여 IgG1 TM으로 전환하였다. 이들 재조합된 라이브러리로부터 수득한 최적화된 LOX514 항체의 전형적인 예는 LX5140092, LX5140093, LX5140094, LX5140108 및 LX5140110이었다 (표 1 또는 도 4에 개시됨).
LOX514 계통으로부터의 선발된 항체를 위한 최적화된 중쇄의 아미노산 서열의 배열이 도 4a에 예시되어 있다. LOX514 계통으로부터의 선발된 항체를 위한 최적화된 경쇄의 아미노산 서열의 배열이 도 4b에 예시되어 있다.
실시예 5 - LOX696으로부터 유도된 효력 최적화된 항-LOX1 scFv 변이체의 단리 및 확인
LOX696을 본질적으로 유럽 특허 제494955호, 미국 특허 제5658754호 및 문헌[Hanes et al (Thompson et al., J. Mol. Biol. 256(1):77-88 (1996)]에 의해 개시된 바와 같이 친화성-기반 리보좀 디스플레이 선발을 이용하여 먼저 최적화하였다.
리보좀 디스플레이 포맷의, LOX696 scFv 서열로부터 유도된 대형 scFv 라이브러리를 개시된 바와 같이 (문헌[Thompson et al., J. Mol . Biol . 256(1):77-88 (1996)]) 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 2 또는 3 (VH-CDR2 또는 VH-CDR3) 또는 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 3 (VL-CDR3)의 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발에 의해 생성하였다. DNA 수준에서, mRNA로의 효율적인 전사를 위해 5'-말단에 T7 프로모터를 부가하였다. mRNA 수준에서, 구성물은 원핵 리보좀-결합 부위 (샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열)을 함유하였다. 단쇄의 3'-말단에서, 중지 코돈을 제거하고 M13 박테리오파지 gIII (유전자 III)의 일부를 초기 scFv 폴리펩티드와 리보좀 사이의 스페이서로 작용하도록 부가하였다 (문헌[Thompson et al., J. Mol. Biol. 256(1):77-88 (1996)]).
인간 LOX1에 더 높은 친화성을 가진 변이체를 선발하기 위하여 라이브러리를 친화성-기반 리보좀 디스플레이 선발시켰다. 이들은 oxLDL 및 다른 LOX1 리간드에의 LOX1 결합에 대해 개선된 저해 활성을 나타낼 것으로 예상되었다. ScFv는 제조업자의 프로토콜에 따라 리보맥스 (RIBOMAX)™ 대규모 RNA 생산 시스템 (T7) (프로메가 (Promega)) 및 무세포 번역 시스템을 이용하여 시험관 내에서에서 발현시켰다. 생성된 scFv 항체-리보좀-mRNA (ARM) 복합체를 용액에서 비오티닐화된 인간 LOX1 (이지 링크™ 술포-NHS-LC-비오틴 (써모/피어스, 제품: 21335)을 이용하여 자유 아민을 통해 비오티닐화됨)과 함께 인큐베이션하였다. 특이적으로 결합된 삼원 복합체 (LOX1:ARM)를 제조업자의 권고 (다이날 (Dynal))에 따라 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드 (다이나비즈® M-280) 상에 포획시키는 한편, 미결합 ARM을 세척하여 제거하였다. 이어서 결합된 ScFv를 코딩하는 mRNA를 역전사-PCR (RT-PCR)에 의해 회수하였다. LOX1에 대해 더 높은 친화성을 가진 클론을 농축하기 위하여, 감소하는 농도의 비오티닐화된 인간 LOX1 (4 라운드에 걸쳐 1 μM에서 최소 2 nM까지)를 이용하는 추가의 선발 라운드를 위해, 수득된 집단에서 선발 과정을 반복하였다. 선발 라운드 2, 3 및 4로부터의 결과물을 ScFv로서 세균 발현을 위해 pCantab6 (1)내로 서브클로닝하고, 개선된 클론은 실시예 4에 개시된 바와 같이 LOX696 에피토프 경쟁 (실시예 10, 분석 7 참고)에서 주변세포질 추출물로서 확인하였다.
LOX696 CDR 무작위화 리보좀 디스플레이 결과물 또는 변이체를 기반으로 하여 2세대 파지 디스플레이 라이브러리를 제작하였다. 총 4개의 라이브러리가 생성되었다: (1) 둘 모두 라운드 결과물로부터 수득한, VH CDR2 서열을 VL CDR3 서열과 재조합함으로써; (2) 추가의 서열 다양성을 포함시키기 위하여, 제조업자의 권고에 따라 다이버시파이 (DIVERSIFY)™ PCR 무작위 돌연변이 유발 키트 (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences))를 이용하여, 재조합된 VH CDR2 X VL CDR3 라이브러리 (상기 참고)에서 추가의 오류 유발 PCR을 수행함으로써; (3) 초기 리보좀 디스플레이 라이브러리로부터 유래되는 9가지의 scFv DNA 히트 및 LOX696의 모 scFv DNA의 동몰 비의 집단을 주형으로 이용하는 상기에 개시된 오류 유발 PCR을 이용한, 전체 scFv 서열에서의 무작위 돌연변이 유발에 의해; (4) 초기 리보좀 디스플레이 라이브러리로부터 유래되는 9가지의 scFv DNA 히트 및 LOX696의 모 scFv DNA의 동몰비의 집단을 주형으로 이용하여, 문헌[Gallop MA et al., J Med Chem, 37(9):1233-51 (1994)]에 개시된 바와 같이 전체 VH CDR3의 약한 무작위화에 의해.
감소하는 농도의 비오티닐화된 인간 LOX1 (4 라운드에 걸쳐 100 nM에서 2 pM까지)를 이용하여 실시예 4에 개시된 바와 같이 파지 디스플레이 선발을 수행하였다. 상이한 2세대 라이브러리로부터의 개별 ScFv의 대표 번호의 조 scFv-함유 주변세포질 추출물을 제조하고 (실시예 10, 분석 7에 개시된 바와 같이) 에피토프 경쟁 HTRF®에서 테스트하였다. 최대 경쟁 결합을 제공하는 ScFv 변이체를 다시 서열결정하고, 테스트를 위해 실시예 1에서와 같이 정제된 ScFv를 준비하였다. 이들 2세대 라이브러리로부터의 가장 강력한 ScFv를 이후의 실시예에 개시된 바와 같이 추가의 특성화를 위해 IgG1 TM 포맷으로 전환시켰다.
이들 2세대 라이브러리로부터 수득한 최적화된 LOX696 항체의 전형적인 예 LX6960067_ngl1, LX6960071_ngl1, LX6960073_ngl1, LX6960086_ngl1, LX6960094_ngl1, LX6960101_ngl1, LX6960102_ngl1 및 LX6960116_ngl1 (표 1 또는 도 5에 개시됨)를 포함한다.
LOX696 계통으로부터의 선발된 항체를 위한 최적화된 VH의 아미노산 서열의 배열이 도 5a에 예시되어 있다. LOX696 계통으로부터의 선발된 항체를 위한 최적화된 VL의 아미노산 서열의 배열이 도 5b에 예시되어 있다.
실시예 6 - IgG1-TM으로서의 항-LOX1 항체의 생식 세포 계열화 및 안정성 조작
LOX514 VH 및 VL의 아미노산 서열을 VBASE 데이터베이스 (문헌[Tomlinson, I., VBASE. 1997, MRC Centre of Protein Engineering, Cambridge, UK]) 내의 공지의 인간 생식 세포 계열 서열에 대하여 정렬하고 가장 가까운 생식 세포 계열을 서열 유사성에 의해 확인하였다. VH 도메인의 경우, 이것은 VH1-24 (DP-5) 및 JH6이었으며, VL 도메인의 경우, 이것은 Vλ1-e (DPL-8) 및 JL3이었다. 중쇄의 프레임워크 4에 위치한 두 정렬에 단 한가지 차이만 있다. 그 단일 잔기 (R105 - 카바트 넘버링)는 표준 분자 생물학에 의한 IgG 전환 과정 동안 복귀되며, 이는 LOX514 계통으로부터의 모든 최적화된 IgG는 생식 세포 계열 포맷에서 사실상 생성되었음을 의미한다. 부가적으로 중쇄 N96D 돌연변이 유발 (카바트 넘버링)을 수행하여 LX5140092 및 LX5140093 둘 모두의 CDR3에서 잠재적인 N-탈아미드화 모티프를 제거하였다. 변이체는 각각 LX5140092_N>D 및 LX5140093_N>D로 명명하였다 (표 1 또는 도 4 참고). LX5140092_N>D 및 LX5140093_N>D를 위한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열의 정렬은 각각 도 4a 및 4b에 제공된다.
이와 유사하게, LOX696 항체의 생식 세포 계열 분석을 또한 수행하였다. 가장 가까운 생식 세포 계열은 중쇄의 경우 VH3-09 (DP-31) 및 JH3로 그리고 경쇄의 경우 Vλ2a2 (DPL-11) 및 JL3으로 확인되었다. 베르니에 잔기를 제외하고 (문헌[Foote, et al., J Mol . Biol ., 224:487 (1992)]), 모두 VH에 있는 총 5개의 차이가 검출되었다: 프레임워크 1에 둘, 프레임워크 3에 하나 그리고 프레임워크 4에 둘. 최적화된 LOX696 IgG1-TM 서열에서의 차이를 표준 분자 생물학 기술에 의해 V89의 예외를 가지고 가장 가까운 생식 세포 계열 잔기로 복귀시켰다: Q1E, Q6E, R105Q 및 T108M. 부가적으로, 중쇄 G82bS 돌연변이 유발 (카바트 넘버링)을 수행하여 생식 세포 계열 LX6960073_gl의 프레임워크 3에서 잠재적 N-탈아미드화 모티프를 제거하였다 (표 1 또는 도 5 참고). 변이체는 LX6960073_G82bS_gl로 명명하였다 (표 1 또는 도 5 참고). 비생식 세포 계열 LX6960073_ngl1, 생식 세포 계열 LX6960073_gl 및 LX6960073_G82bS_gl을 위한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열의 정렬은 각각 도 5a 및 5b에 제공된다.
실시예 7- 최적화된 항-LOX1 항체의 특이성 및 종 교차 반응성
IgG1-TM으로서 최적화된 항-인간 LOX1 항체의 다른 인간 C 타입 렉틴 및 스캐빈저 수용체 관련 분자에 대한 특이성은 (실시예 10, 분석 7에 개시된 바와 같이) IgG 결합 ELISA에 의해 평가하였다. 관련 분자의 패널은 인간 CLEC-7A (덱틴 (Dectin)-1), 인간 CLEC-1A, 인간 CLEC-4L (DC-SIGN), 인간 CLEC-1B (CLEC-2), 인간 SR-A1 및 인간 SR-B3 (CD36)을 포함하였다. 인간 LOX1은 또한 결합을 위한 양성 대조구로서 코팅시켰다. 하기의 최적화된 항체를 테스트하였다: LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl 및 LX6960073_G82bS_gl. 아이소타입 인간 IgG1-TM 대조 항체 NIP228을 비특이적 배경 수준을 결정하기 위해 테스트하는 항체 패널에 포함시켰다.
도 6에 예시된 바와 같이, 모든 최적화된 항-LOX1 항체는 인간 LOX1에 결합하지만, 인간 CLEC-7A, CLEC-1A, CLEC-4L, CLEC-1B, SR-A1 또는 SR-B3에는 결합하지 않으며, 이는 인간 LOX1에 대한 LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl 및 LX6960073_G82bS_gl의 특이성을 입증한다.
다양한 LOX1 종 오르소로그에 대한 항-인간 LOX1 항체의 교차반응성은 (실시예 10, 분석 7에 개시된 바와 같이) IgG 결합 ELISA에 평가하였다. 요약하면, 인간 (HisFlag)-LOX1, 시노몰구스 LOX1-(FlagHis), 마우스 LOX1-(FlagHis), 래트 LOX1-(FlagHis) 및 토끼 LOX1-(FlagHis)를 맥시소르프™ 플레이트 상에 PBS 완충제 중에 5 μg/ml로 코팅하였다. 3% 분유를 함유한 PBS로 차단한 후, 차단 완충제 중의 10μg/ml의 정제된 항-LOX1 IgG1-TM을 상이한 코팅된 항원으로 인큐베이션하였다. 결합된 IgG 분자를 100ng/mL의 2차 유로퓸 표지된 항-인간 IgG 항체 (퍼킨 엘머)를 이용하여 검출하였다. 340 nm 여기 및 615 nM 방출을 이용하여 플레이트를 형광에 대해 판독하였다. 비-특이적 결합은 5 μg/ml로 코팅된 CD86 FlagHis 항원에서 결정하였다. 음성 대조구로서 NIP228 인간 IgG1-TM 및 하기의 최적화된 LOX1 항체를 테스트하였다: LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl 및 LX6960073_ G82bS_gl. 도 7a에 나타낸 바와 같이, 테스트한 모든 항체 (LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl 및 LX6960073_ G82bS_gl)가 인간 및 시노몰구스 LOX1에 결합하지만 마우스 또는 래트 LOX1 단백질에는 결합하지 않는다. 이들 항체 중 일부 (LX5140108, LX5140110 및 LX5140092_N>D)는 또한 토끼 LOX1에 결합하지만 더 작은 형광 카운트에 의해 입증되는 바와 같이 인간 또는 시노몰구스 LOX1에 대해서보다 정도가 덜하다.
인간 및 시노몰구스 LOX1 사이의 추가의 교차 반응성 특성화는 경쟁 ELISA에 의해 최적화된 항-LOX1 IgG1-TM 항체 LX5140108, LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl에 대해 수행하였다.
요약하면, 비오티닐화된 인간 LOX1을 스트렙타비딘 플레이트 (앱젠 (Abgene)) 상에 PBS 중에 0.125 μg/ml로 코팅하였다. 3% 분유를 함유한 PBS로 차단한 후, 차단 완충제 중의 12.5 ng/mL의 정제된 항-LOX1 IgG1-TM을 경쟁자 인간 또는 시노몰구스 LOX1 단백질과 함께 공동인큐베이션하였다. 차단 완충제 중의 경쟁자의 1:3 적정을 LX5140108 및 LX5140110를 위해서는 400 nM에서 그리고 LX6960073_G82bS_gl을 위해서는 2 μM에서 출발하여 이용하였다. 결합된 항-LOX1 IgG 분자는 100 ng/mL의 이차 유로퓸 표지된 항-인간 IgG 항체 (퍼킨 엘머)를 이용하여 검출하였다. 340 nm 여기 및 615 nM 방출을 이용하여 플레이트를 형광에 대해 판독하였다.
도 7b 및 하기 표 3에 예시된 바와 같이, 모든 세 가지의 최적화된 항-LOX1 IgG1-TM (LX5140108, LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl)이 시노몰구스 LOX1과 경쟁하며 인간 LOX1 경쟁에 대한 IC50의 5배 이내의 IC50을 나타내며, 이는 항-LOX1 항체 LX5140108, LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl의 시노몰구스 교차반응성이 강함을 입증한다.
[표 3]
실시예 8 - 비아코어™ 및 키넥사TM에 의해 결정된, hLOX1에 대한 최적화된 항-LOX1 항체의 친화성
재조합 인간 및 시노몰구스 오르소로그 LOX1 세포외 도메인 (ECD)에 대한 항-LOX1 항체의 친화성은 비아코어에 의한 실시간 상호작용 모니터링을 이용하여 37℃에서 (인간 및 시노몰구스의 경우) 그리고 키넥사를 이용하여 평형에서 (인간 LOX1 친화성 측정) 결정하였다.
비아코어 분석에서는 재조합 단백질 G + 단백질 G에 의해 포획된 항-LOX1 항체를 CM5 칩 표면에의 아민 연결을 통해 고정시키고, 표면을 통과하는 LOX1 오르소로그의 결합 및 해리 프로파일을 수집하였다. 분석을 37℃에 설정된 IFC 온도를 이용하여 수행하고, 샘플 구획은 주위 온도에 남겨 두었다. 모든 실험은 일정한 30 ul/분으로 IFC를 통과하는 HBSEP 러닝 완충제로 수행하였다. 각 LOX1 적용의 마지막에 임의의 결합된 항체 및 항체-복합체를 10 mM 글리신 (pH 1.5)의 두 번의 40초 펄스에 의해 단백질 G로부터 제거하였다. 단백질 G 표면 상에 포획된 항-LOX1 항체의 양은 먼저 대량 수송 제한을 피하기 위하여 그리고 두 번째로는 정확한 모델링을 위해 충분한 해리가 관찰될 수 있음을 보장하도록 맞추어졌다. LOX1 상호작용물의 농도 범위는 항체의 포화에서 검출가능한 결합이 없는 것까지의 전체 결합 범위가 관찰됨을 보장하기에 충분하였다. 데이터는 항체 단독 프로파일의 이중 기준 차감 후 비아에발 (BiaEval) 평가 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
용액내 (in-solution) 평형 분석을 항 LOX1 항체의 단일 농도에서 수행하였으며 이때 재조합 인간 LOX1 ECD의 적정은 항체 농도 위로 100배 내지 아래로 100배로 만들어졌다. 자유 항체 농도는 형광 표지된 인간-Fc 특이적 프로브에 의해 후속하여 검출되는 비점유 항체의 포획을 통해 결정되었다. 표 4는 관찰된 속도-상수 및 전체 친화성을 상술한다.
[표 4]
실시예 9. 최적화된 항-LOX1 항체는 다중-리간드 결합, oxLDL 내재화 및 oxLDL 유도된 시그널링의 저해를 보여준다.
정제된 IgG를 LOX1에의 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP 결합을 특이적으로 저해하는 그의 능력에 대해 테스트하였다 (실시예 10; 분석 1, 2 및 3 참고). LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl을 비롯한 많은 단리된 클론을 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP의 LOX1에의 결합을 차단하는 그의 능력에 대해 테스트하였다. 대표적인 그래프가 각각 LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl에 의한 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP 결합의 저해를 보여주는 도 8a, 8b 및 8c에 예시되어 있다. 항체가 교차반응하며 LOX1 SNP K167N에 대한 기능적 활성을 가짐을 확인하기 위하여, 항체를 LOX1 SNP K167N에의 oxLDL 결합을 차단하는 그의 능력에 대해 테스트하였다. 대표적인 그래프가 LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl 둘 모두가 LOX1 SNP K167N 변이체에의 oxLDL 결합을 차단함을 보여주는 도 8d에 예시되어 있다. 결합 저해에 더하여, LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl을 비롯한 많은 단리된 클론을 LOX1 발현 세포 상에서의 oxLDL 내재화 (실시예 10, 분석 4 참고) 및 oxLDL 유도된 LOX1 시그널링 (실시예 10, 분석 5 참고)을 차단하는 그의 능력에 대해 테스트하였다. 대표적인 그래프가 각각 LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl에 의한 oxLDL 내재화 및 oxLDL 유도된 LOX1 시그널링의 억제를 보여주는 도 8a 및 8b에 예시되어 있다. 이들 연구로부터의 결과는 표 5에 요약되어 있다.
[표 5]
이들 결과는 항체 LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl에 의한 oxLDL, AGE-BSA 및 CRP에의 LOX1 결합의 특이적 다중-리간드 저해 및 LX5140110 및 LX6960073_G82bS_gl 둘 모두는 공통된 LOX1 SNP K167N 변이체와 기능적으로 교차 반응하며 oxLDL 내재화 및 oxLDL-유도된 LOX1 시그널링을 저해함을 입증한다.
실시예 10 분석 및 방법
하기의 재료와 방법을 실시예 1 내지 9에서 개시된 실험에서 사용하였다.
재료
독시사이클린 하이클레이트 (시그마 (Sigma) #D9891-1G); 카르복시H2DCFDA (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes) #C400); 훽스트 (Hoechst) 착색제 (몰레큘라 프로브스 #33342); AGE-BSA (바이오비젼 (Biovision) #2221-10); PBS (깁코 (Gibco) # 14190); 재조합 C-반응성 단백질 (R&D #1707-CRCF); BSA 30% (시그마 #A9576); 라이트닝 링크 (Lightning Link) 비오틴 콘쥬게이션 키트 (이노바 바이오사이언시즈 (Innova Biosciences) #704-0010); 다이라이트 649 NHS 에스테르 (ESTER) (서모 사이언티픽 (Thermo Scientific) #46416); 사이퍼 5E 모노 NHS; 에스테르 (지이 헬스케어 #PA15401); HBSS (1X) (깁코 #14025); 코닝 (Corning) 384 세포; 바인드 블랙 (Bind black) 분석 플레이트 (코닝 코스타 (Corning Costar) #3683); 델피아 인핸스먼트 (Delfia Enhancement) 용액 (퍼킨 엘머 #4001-0010); 유로퓸 스트렙타비딘 (퍼킨 엘머 #1244-360); 0.5 mL 제바 (Zeba) 탈염 컬럼 (피어스 #89883); CHO-TREx (인비트로겐 (Invitrogen) #R718-07); oXLDL (인트라셀 (Intracel) #RP-173); 항-LOX1 항체 (바이오비젼 #3659); 훽스트 착색제 (몰레큘라 프로브스 #33342); PBS (깁코 #14190); 성장 배지: Hams:F12-GlutaMax-I (깁코 # 31765-027); 10% 태아 소 혈청 (인비트로겐 # 16000-044)로 보충; 블라스티시딘 (Blasticidin) (인비트로겐 # 46-1120); 제오신 (Zeocin) (인비트로겐 # R25001);리포펙타민 (인비트로겐 #11668-019); 독시사이클린 하이클레이트 (시그마 #D9891-1G).
시약 변형
oxLDL의 사이퍼 5E 표지
ox-LDL (1mg/mL)의 pH를 1/10 부피의 0.5M 붕산나트륨 완충제를 이용하여 pH 8.5까지 조정하고 40:1의 단백질: 염료의 몰비로 제조업자의 키트 설명서에 따라 oxLDL을 표지하였다 (암소에서 실온에서 1시간). 제조업자의 설명서에 따라 제바 스핀 컬럼을 이용하여 (지이 헬스케어로부터의 사이퍼 5E 모노 NHS 에스테르) 미반응 염료를 제거하고 PBS로 완충제 교환하였다. 표지된 단백질을 암소에서 4℃에서 유지하였다. 계산 목적을 위하여 95% 이상의 단백질이 회수되었다고 가정하며, 고려할 희석 인자는 없다.
oxLDL 및 AGE-BSA의 다이라이트 649 표지
ox-LDL 또는 AGE-BSA (1mg/mL)의 pH를 1/10 부피의 0.5M 붕산나트륨 완충제를 이용하여 pH 8.5까지 조정하고 제조업자의 설명서에 따라 (암소에서 실온에서 1시간 동안 서모 사이언티픽으로부터의 다이라이트 649 NHS 에스테르) 표지하였다. 제조업자의 설명서에 따라 제바 스핀 컬럼을 이용하여 미반응 염료를 제거하고 PBS로 완충제 교환하였다. 계산 목적을 위하여 95% 이상의 단백질이 회수되었다고 가정하며, 고려할 희석 인자는 없다.
인간 항-LOX1 항체의 다이라이트 649 표지
인간 항-LOX1 항체 (1 mg/mL)의 pH를 1/10 부피의 0.5 M 붕산나트륨 완충제를 이용하여 pH 8.5까지 조정하고 제조업자의 설명서에 따라 (암소에서 실온에서 1시간 동안 서모 사이언티픽으로부터의 다이라이트 649 NHS 에스테르) 표지하였다. 제조업자의 설명서에 따라 제바 스핀 컬럼을 이용하여 미반응 염료를 제거하고 PBS로 완충제 교환하였다. 계산 목적을 위하여 95% 이상의 단백질이 회수되었다고 가정하며, 고려할 희석 인자는 없다.
CRP의 비오틴 표지
C-반응성 단백질 CRP (알앤디 시스템즈; 무담체)를 4 mg/mL의 농도까지 증류수에서 재구성하고 라이트닝-링크™ 비오틴 콘쥬게이션 키트 (타입 A)와 공급되는 키트 설명서에 따라 비오티닐화하였다.
인간 LOX1 CHO-TREX 세포주 3A9
인간 LOX1 유전자 (NM 002543)를 재조합 플라스미드 pcDNA4/TO-LOX1 (pAM2037)를 생성하기 위하여 이용하였으며, 상기 플라스미드는 진아트 (Geneart)에 의해 합성되고 전달되었다. LOX1 유전자는 Afl II 제한 부위 및 5'-말단의 코작 (Kozak) 서열, 및 3'-말단의 EcoRI 제한 부위를 부가하여 합성하였다. 이어서 pAM2037을 리포펙타민 2000을 이용하여 테트라사이클린 억제자를 발현하는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO-TREx 세포)를 트랜스펙션시켰다. CHO-TREx는 테트라사이클린 (Tet) 억제자를 위한 유전자를 가지며 pcDNA4/TO 내로 클로닝된 유전자의 발현을 차단할, pcDNA6/TR을 함유하는 CHO-K 세포주이다. 이들 세포가 테트라사이클린으로 처리되면, 억제가 해제되고 LOX1 유전자가 발현될 것이다.
FACS 기계를 이용하여 트랜스펙션된 혼합 세포 집단을 96웰 플레이트 내로 분류하여 각 웰 내에서 단일 세포를 수득하였다. pcDNA6/TR을 10 μg/ml 블르스티시딘으로 선발하고, 300 μg/ml 제오신을 이용하여 pcDNA4TO-LOX1 플라스미드에 대해 선발하였으며 유지를 위하여 200 μg/ml을 이용하였다. 개별 세포를 증식시키고, 세포에 의해 흡수된 형광을 정량하는 고 함량 분석 접근법을 이용하여 DiI-표지된 oxLDL에 결합하여 내재화하는 능력에 의해 안정한 클론을 선발하였다. DiI-oxLDL 흡수 및 여러 성장 계대에 걸친 안정성에 대하여 하나의 클론을 선발하였다. LOX1 단백질 표면 발현은 바이오비젼으로부터의 항-LOX1 특이적 항체를 이용한 면역염색에 의해 확인하였다. LOX1 단백질의 기능적 활성은 oxLDL 흡수 및 CHO-TREx-LOX1 세포에서 oxLDL 매개 ROS 반응의 생성에 의해 입증되었다.
분석 1 및 2 - LOX1: oxLDL 및 LOX1:AGE-BSA 결합 분석
포화 결합 곡선
다이라이트 649 표지된 oxLDL 및 AGE-BSA (1mg/mL) 둘 모두를 HBSS에서 1:50 희석시키고 삼중으로 16개의 지점에 걸쳐 1+1 연속 희석을 이용하여 384웰 플레이트에서 적정하였다. 총 결합의 결정을 위하여, 10 μL의 HBSS를 모든 웰에 첨가하고, 이어서 10 μL의 인간 LOX1 트랜스펙션된 CHO TREX 세포 (4000개의 세포/웰)를 첨가하였다. 비특이적 결합의 결정을 위하여, 10 μL의 HBSS를 10 μL의 비표지 oxLDL (1 mg/mL)로 교체하였다. 분석 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 10으로 설정된 최소 카운트; 색상<0.4 및 FL1<5600으로 422의 PMT1 설정을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 8200 세포 검출 시스템 (FMAT 플레이트 판독기)에서 판독하였다. 특이적 결합은 평균 비특이적 결합 신호로부터 평균 총 결합 신호를 차감하고, 얻어진 결합 등온선을 1 부위 특이적 결합 알고리즘을 이용하는 프리즘 그래프패드 (Prism Graphpad) 소프트웨어에서 도시함으로써 결정하였다. KD가 결정된 계산 농도를 후속 고처리 스크리닝 및 항체 경쟁 실험을 위해 이용하였다.
항-hLOX1 단클론 항체의 평가
CHO TREX 세포 상에 발현된 LOX1 수용체에의 결합에 대한 항-LOX1 항체와 다이라이트 649 표지된 리간드 (oxLDL; AGE-BSA) 사이의 경쟁을 하기와 같이 수행하였다.
경쟁 항체를 사전희석없이 이용하였으며 이중으로 24개의 지점에 걸쳐서 분석 완충제 (HBSS)에서의 1+1 연속 희석을 이용하여 384웰 플레이트에서 적정하였다 (10 μL/웰). (그들의 각 KD 농도의) 다이라이트 649 표지된 리간드를 모든 항체 함유 웰에 첨가하고 (10 μL/웰) 이어서 인간 LOX1 트랜스펙션된 CHO TREX 세포 (10 μL중에 4000개의 세포/웰) 또는 K167N SNP 트랜스펙션된 CHO TREX 세포를 첨가하였다.
분석 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 10으로 설정된 최소 카운트; 색상<0.4 및 FL1<5600으로 422의 PMT1 설정을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 8200 세포 검출 시스템 (FMAT 플레이트 판독기)에서 판독하였다. 겉보기 IC50 값을 결정하기 위하여 그래프패드™ 프리즘 버젼 5 (그래프패드 인크(GraphPad Inc), 미국 캘리포니아주)에서 4-파라미터 로지스틱 방정식을 이용하여 데이터를 분석하였다. Y= 최저 (Bottom) + (최고 (Top)-최저)/ (1+10^ ((Log IC50-X)* 힐슬로프(HillSlope))) (이때, X는 농도의 로그이고 Y는 % 특이적 결합이다). IC50은 특이적 결합의 50% 저해를 생성하는 샘플 농도이다.
[표 6]
분석 3 - LOX1:CRP 결합 분석
포화 결합 곡선
LOX1 (알앤디 시스템즈)을 하룻밤 4℃에서 PBS 중의 3 μg/ml의 농도로 384웰 넝크 맥시소르프 플레이트 표면 상에 고정시켰다 (25 μL/웰). 다음날 분석 플레이트를 (칼슘과 마그네슘이 없는) PBS에서 12X 세척하였다. 비오티닐화된 CRP의 작업 용액을 PBS/0.1%BSA/0.01% 트윈 (tween) 20 중의 20 μg/ml (769 nM)로 제조하고, 삼중으로 16개의 지점에 걸쳐 1+1 연속 희석을 이용하여 384웰 플레이트에서 적정하였다 (12.5 μL/웰). 추가의 (PBS/0.1%BSA/0.01% 트윈 20 중의) 12.5 μL 분석 완충제를 각 웰에 첨가하고, 분석 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.01% 트윈 20에서 16x 세척하고, 50 μL의 유로퓸 표지된 스트렙타비딘 (1:1000 희석)을 첨가하였다. 분석 플레이트를 실온에서 추가 1시간동안 인큐베이션한 후 PBS/0.01% 트윈 20에서 16x 세척하였다. 100 μL/웰의 델피아 인핸스먼트 용액을 첨가하여 플레이트를 현상하고, 공장 설치된 델피아 유로퓸 프로토콜을 이용하여 월락 빅토르 (Wallac Victor) V 플레이트 판독기에서 판독하였다. 얻어진 결합 등온선을 1 부위 특이적 결합 알고리즘을 이용하는 프리즘 그래프패드 소프트웨어에서 그렸다. 겉보기 KD가 결정된 계산 농도를 후속 고처리 스크리닝 및 항체 경쟁 실험을 위해 이용하였다.
항-인간 LOX1 단클론 항체의 평가
재조합 인간 LOX1에의 결합에 대한 항체와 비오틴 표지된 CRP 사이의 경쟁은 다음과 같이 수행하였다: LOX1 (알앤디 시스템즈)을 PBS 중의 3 μg/ml 농도로 하룻밤 4℃에서 384웰 넝크 맥시소르프 분석 플레이트 표면 상에 고정시켰다 (25 μL/웰). 다음날 분석 플레이트를 (칼슘과 마그네슘이 없는) PBS에서 12X 세척하였다. 경쟁 항체를 사전 희석없이 이용하였으며 이중으로 24개의 지점에 걸쳐 분석 완충제 (PBS/0.1%BSA/0.01% 트윈 20)에서의 1+1 연속 희석을 이용하여 384웰 희석 플레이트에서 적정하였다 (30 μL/웰). 비오틴 표지된 CRP (KD 농도에서 30 μL/웰)를 모든 항체 함유 웰에 첨가하였다. 이어서 샘플 (50 μL)을 384 미니트랙 (MiniTrak) 액체 취급 로봇을 이용하여 희석 플레이트에서 고정된 재조합 인간 LOX1을 함유한 분석 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.01% 트윈 20에서 16x 세척하고, 50 μL의 유로퓸 표지된 스트렙타비딘 (1:1000 희석)을 첨가하였다. 분석 플레이트를 실온에서 추가 1시간동안 인큐베이션한 후 PBS/0.01% 트윈 20에서 16x 세척하였다. 100 μL/웰의 델피아 인핸스먼트 용액을 첨가하여 플레이트를 현상하고, 공장 설치된 델피아 유로퓸 프로토콜을 이용하여 월락 빅토르 V 플레이트 판독기에서 판독하였다. 겉보기 IC50 값을 결정하기 위하여 그래프패드™ 프리즘 버젼 5 (그래프패드 인크, 캘리포니아주)에서 4-파라미터 로지스틱 방적식을 이용하여 데이터를 분석하였다. Y= 최저 + (최고-최저)/ (1+10^ ((Log IC50-X)* 힐슬로프))(이때, X는 농도의 로그이고 Y는 % 특이적 결합이다). IC50은 특이적 결합의 50% 저해를 생성하는 샘플 농도이다.
[표 7]
분석 4 - LOX1:oxLDL 내재화 분석
포화 결합 곡선
사이퍼 5E 표지된 oxLDL (1 mg/mL에서 40:1 몰비)을 HBSS에서 1:50 희석하고 삼중으로 16개의 지점에 걸쳐 1+1 연속 희석을 이용하여 384웰 플레이트에서 적정하였다. 총 결합의 결정을 위하여, 10 μL의 HBSS를 모든 웰에 첨가하고, 10 μL의 인간 LOX1 트랜스펙션된 CHO TREX 세포를 첨가하였다 (4000개의 세포/웰). 비특이적 결합의 결정을 위하여, 10 μL의 HBSS를 10 μL의 비표지 oxLDL (1 mg/mL)로 교체하였다.
분석 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 내재화가 대사적으로 활성인 과정임을 입증하기 위하여 모든 시약이 4℃에서 유지되는 병행 실험을 수행하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 10으로 설정된 최소 카운트; 색상<0.4 및 FL1<5600으로 422의 PMT1 설정을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 8200 세포 검출 시스템 (FMAT 플레이트 판독기)에서 판독하였다. 특이적 결합은 평균 비특이적 결합 신호로부터 평균 총 결합 신호를 차감하고, 얻어진 결합 등온선을 1 부위 특이적 결합 알고리즘을 이용하는 프리즘 그래프패드 소프트웨어에서 도시함으로써 결정하였다. KD가 결정된 계산 농도를 후속 고처리 스크리닝 및 항체 경쟁 실험을 위해 이용하였다.
항-hLOX1 단클론 항체의 평가
LOX1 수용체를 발현하는 CHO TREX 세포에서 내재화에 대한 항-LOX1 항체와 사이퍼5E 표지된 ox-LDL 사이의 경쟁을 하기와 같이 수행하였다.
경쟁 항체를 사전희석없이 이용하였으며 이중으로 24개의 지점에 걸쳐서 분석 완충제 (HBSS)에서의 1+1 연속 희석을 이용하여 384웰 플레이트에서 적정하였다 (10 μL/웰). (그들의 각 KD 농도의) 다이라이트 649 표지된 리간드를 모든 항체 함유 웰에 첨가하고 (10 μL/웰) 이어서 인간 LOX1 트랜스펙션된 CHO TREX 세포 (10 μL 중에 4000개의 세포/웰) 또는 K167N SNP 트랜스펙션된 CHO TREX 세포를 첨가하였다.
분석 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 10으로 설정된 최소 카운트; 색상<0.4 및 FL1<5600으로 422의 PMT1 설정을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 8200 세포 검출 시스템 (FMAT 플레이트 판독기)에서 판독하였다. 겉보기 IC50 값을 결정하기 위하여 그래프패드™ 프리즘 버젼 5 (그래프패드 인크, 캘리포니아주)에서 4-파라미터 로지스틱 방적식을 이용하여 데이터를 분석하였다. Y= 최저 + (최고-최저)/ (1+10^ ((Log IC50-X)* 힐슬로프)) (이때, X는 농도의 로그이고 Y는 % 특이적 결합이다). IC50은 특이적 결합의 50% 저해를 생성하는 샘플 농도이다.
[표 8]
분석 5 - 재조합 CHO-LOX1 세포에서 ROS 유도
세포의 준비
인간 LOX1 트랜스펙션된 CHO TREX 세포를 1 μg/ml (최종 농도)의 독시사이클린으로 실험을 수행하기 24시간 전에 유도하였다. 실험 당일에, 세포를 긁어서 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 50 mL의 PBS에서 재현탁시키고 5분 동안 1200 rpm에서 원심분리하였다. 이 절차를 두번 반복하였다. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 5 mL의 HBSS에서 재현탁하였다. 세포를 트리판 블루 배제법을 이용하여 혈구계산기에서 계수하였다. 세포의 수를 총 4x105개의 세포가 되도록 조정하였다. 세포를 사용할 때까지 얼음에서 유지하였다.
포화 결합 곡선
사이퍼 5E 표지된 oxLDL (1 mg/mL에서 40:1 몰비)을 HBSS에서 1:50 희석하고 삼중으로 16개의 지점에 걸쳐 1+1 연속 희석을 이용하여 384웰 플레이트에서 적정하였다. 총 결합의 결정을 위하여, 10 μL의 HBSS를 모든 웰에 첨가하고, 10 μL의 인간 LOX1 트랜스펙션된 CHO TREX 세포를 첨가하였다 (4000개의 세포/웰). 비특이적 결합의 결정을 위하여, 10 μL의 HBSS를 10 μL의 비표지 oxLDL (1 mg/mL)로 교체하였다.
분석 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 내재화가 대사적으로 활성인 과정임을 입증하기 위하여 모든 시약이 4℃에서 유지되는 병행 실험을 수행하였다.
인큐베이션 후, 플레이트를 10으로 설정된 최소 카운트; 색상<0.4 및 FL1<5600으로 422의 PMT1 설정을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 8200 세포 검출 시스템 (FMAT 플레이트 판독기)에서 판독하였다.
특이적 결합은 평균 비특이적 결합 신호로부터 평균 총 결합 신호를 차감하고, 얻어진 결합 등온선을 1 부위 특이적 결합 알고리즘을 이용하는 프리즘 그래프패드 소프트웨어에서 도시함으로써 결정하였다. KD가 결정된 계산 농도를 후속 고처리 스크리닝 및 항체 경쟁 실험을 위해 이용하였다.
CHO-TREx-LOX1 트랜스펙션된 세포를 7000개의 세포/웰로 분석 플레이트에 접종하고 (배지+10%FCS (테트라사이클린 없음) 중에 100 ㎕/웰), 하룻밤 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 다음날 LOX 발현을 유도하기 위하여 웰 당 50 ng/ml의 최종 농도로 독시사이클린을 첨가하고 플레이트를 95% O2/5%CO2 분위기에서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 각각의 스크리닝 실험을 위하여, 세 개의 별도의 플레이트를 준비하였으며, 항-LOX 항체를 플레이트 당 한 벌의 복제물로 세 벌에서 시행하였다. 다음날, 별도의 희석 플레이트에서 2x 농축 용액으로서 따뜻한 세포 배양 배지에서 항체를 연속 희석하여 항 LOX1 항체를 준비하였다. 분석 플레이트로부터 모든 배지를 제거하고, 항-LOX1 항체 (2x 농축 용액)의 희석 시리즈의 25μL 분액을 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하고 95% O2/5%CO2 분위기에서 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 웰 당 25 μL의 oxLDL (25μg/ml의 고정 최종 농도)을 첨가하고 95% O2/5%CO2에서 37℃에서 60분 동안 플레이트를 인큐베이션하였다.
이어서 웰을 1x 100 μl의 따뜻한 HBSS/Ca/Mg로 조심스럽게 세척하고 50 μl/웰의 카르복시-H2DCFDA (따뜻한 HBSS/Ca/Mg 중에 1.5 μM)를 그 후 첨가하고, 분석 플레이트를 30분 동안 인큐베이션하였다. 카르복시-H2DCFDA와의 인큐베이션의 마지막 5분 동안, 웰에 이미 존재하는 카르복시-H2DCFDA에 따뜻한 HBSS/Ca/Mg 중의 10 ㎕ 50μg/ml 훽스트를 첨가하여, 따뜻한 HBSS/Ca/Mg 중의 훽스트 착색제 (8.3 μg/ml의 최종 농도)로 세포를 카운터 염색하였다.
이어서 분석 플레이트를 따뜻한 HBSS+Ca/Mg로 2x 세척하고 XF53-훽스트 (Ch1) 및 XF53-FITC (Ch2) 세팅을 이용하여 어레이스캔 (Arrayscan) 고함량 플레이트 판독기 (테르노피셔사이언티픽 (ThernoFischerScientific), 셀로믹스 (Cellomics))에서 즉시 판독하였다. 이미지 분석을 위하여, 구획 생물응용 알고리즘 (Compartemental BioApplication Algorithm)을 이용하고, ROS 프로브에 의해 생성된 형광을 서크스팟 평균 강도 (CircSpotAvgIntensity) 파라미터에 의해 정량하였다. 경쟁 데이터 및 생성된 IC50을 그래프로 그리고 4 파라미터 로지스틱 모델(모델 903)을 이용하여 S자형 용량-응답 1-부위-제로 모델을 이용하여 엑셀핏 (ExcelFit) v.5.1에서 계산하였다.
분석 6 - LOX1 특이성 ELISA
IgG 특이성 ELISA를 하기 표 9에 열거된 LOX1-관련 분자 및 LOX1에서 본질적으로 하기와 같이 수행하였다. 10 μg/ml을 인간 SR-B3에 사용한 것을 제외하고는, 맥시소르브™ (넝크) 플레이트를 PBS 중 5 μg/ml의 항원으로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 3x 세척하고, 200 μL/웰의 차단 완충제 (PBS + 3% 분유)로 1시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 PBS로 3x 세척한 후, IgG를 차단 용출제 중에 0.2 μg/ml까지 희석시키고, 50 μL/웰에 첨가하고, 1시간 동안 1 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 PBS-트윈으로 3x 세척하고, 검출 시약 (항-인간 IgG 람다 경쇄 퍼옥시다아제 콘쥬게이트 (시그마 A5175, 0.23 μg/ml로 희석) 또는 카파 경쇄 (시그마 A7164, 0.8 μg/ml로 희석))를 첨가하고 (차단 완충제 중 50 μL/웰), 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-트윈으로 3x 세척하고, 웰당 50 μL의 TMB를 첨가하고, 플레이트를 5 내지 15분 동안 현상되게 두었다. 반응물을 웰당 50 μL의 0.1 M H2SO4로 켄칭하고, 플레이트를 엔비전 (ENVISION)™ 플레이트 판독기 또는 유사 장비에서 450 nm에서 판독하였다.
[표 9]
분석 7 - 에피토프 경쟁
LOX514 및 LOX696을 단백질 변형 섹션에서 상기에 설명한 바와 같이 다이라이트 649로 표지하고, 리간드 결합 분석법과 함께 고 처리량 스크리닝 및 프로파일링 둘 모두에 있어서 경쟁 분자로서 사용하였다. 표지된 항체를 그의 각각의 KD 농도 위의 몇몇 농도에서 사용하여 더 큰 친화성의 비표지된 항체가 경쟁하는 것을 더 어렵게 하였다.
다이라이트 649 표지된 LOX514 및 LOX696의 KD의 결정
다이라이트 649 표지된 인간 항-LOX1 항체를 삼중으로 16개의 지점에 걸쳐 1+1 연속 희석을 이용하여 384웰 플레이트에서 적정하였다. 총 결합의 결정을 위하여, 10 μL의 HBSS를 모든 웰에 첨가하고, 이어서 10 μL의 인간 LOX1 트랜스펙션된 CHO TREX 세포 (4000개의 세포/웰)를 첨가하였다. 비특이적 결합의 결정을 위하여, 10 μL의 HBSS를 10 μL의 비표지 항-LOX1 항체 (1 mg/mL)로 교체하였다.
분석 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 플레이트를 10으로 설정된 최소 카운트; 색상<0.4 및 FL1<5600으로 422의 PMT1 설정을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 8200 세포 검출 시스템 (FMAT 플레이트 판독기)에서 판독하였다.
특이적 결합은 평균 비특이적 결합 신호로부터 평균 총 결합 신호를 차감하고, 얻어진 결합 등온선을 1 부위 특이적 결합 알고리즘을 이용하는 프리즘 그래프패드 소프트웨어에서 도시함으로써 결정하였다. 항체를 계산된 KD 위의 배수로 사용하였다.
[표 10]
실시예 11 - 조직 배양물 및 인간 혈관에서 내피 지질 흡수, 세포 시그널링 및 산화질소 항상성에 대한 항-LOX1 항체의 영향
LOX1 수용체는 다수의 세포내 신호 전달 캐스케이드 (cascade)의 후속적인 활성화를 이용한 OxLDL의 특정한 라이게이션 및 내재화에 의한 죽종형성 과정의 직접적인 원인들 중 하나로 작용한다. 예를 들어, 문헌[Twigg et al., Cardiol Res Pract. 2012:632408 (2012)]을 참조한다. 내피 세포에서의 LOX1 수용체의 활성화는 부분적으로는 아르기나아제 2 상향조절에 의해 유도되는 증가된 ROS 생성 및 손상된 산화질소 (NO) 시그널링을 포함하는 내피 기능 이상에 기여한다 (예를 들어, 문헌[Ryoo et al., Atherosclerosis 214(2):279-287 (2011)], 문헌[Ryoo et al., Circ Res. 102(8):923-932 (2008)]; 및 문헌[Ryoo et al., Circ Res. 99(9):951-60 (2006)]을 참조한다. 부가적으로, LOX1 수용체 활성화는 혈관벽에서 염증 과정의 개시 및 영구화를 초래하며, 이때 사이토카인 생성 및 부착 분자 발현이 증가된다. 따라서, LOX1 수용체의 생물학적 저해제의 개발은 죽종형성 과정의 발달을 약화시키는 효과적인 방법이 될 가능성이 있다. 여기서, 본 발명자는 LX5140110이 인간 대동맥 내피 세포 (HAEC)에 의한 OxLDL의 흡수를 용량-의존적 방식으로 차단함을 입증한다. 부가적으로, LX5140110은 이전에 입증된 과정인 아르기나아제 2 활성화가 LOX1 의존적이 되는 것을 방지한다. 더욱이, LX5140110은 Ox-LDL-의존적인, NO 생성의 감소 및 수퍼옥시드 (ROS) 생성의 증가를 방지한다. 부가적으로, NFkB 루시퍼라아제 리포터 구성물을 이용하여, 본 발명자는 죽종형성에서 마스터 염증 조절자인 NFkB의 활성화를 LX5140110이 유의하게 약화시킴을 입증한다. 예를 들어, 문헌[Pamukcu et al., Thrombosis Res. 128(2):117-23 (2011)]을 참조한다. 마지막으로, LX5140110 항체는 내피 세포에서 장벽 기능에서 결정적인 과정인 초점 유착 키나아제 (FKA)의 포스포릴화 및 활성화를 방지한다. 따라서, 본 발명자는 내피의 활성화를 초래하고 죽종형성을 개시 및 촉진하는 다수의 LOX1-의존적 과정을 LX5140110이 차단함을 보여준다. 이들 실험의 결과가 다시 논의된다.
A. LX5140110은 HAEC에서 OxLDL의 흡수를 차단한다 (도 9a)
방법:
알렉사 플루오르-568과의 OxLDL 콘쥬게이션
500 마이크로리터의 인간 산화 LDL (1 mg/ml, 미국 메릴랜드주 프레더릭 소재의 인트라셀 (Intracel))을 제조업자의 프로토콜에 따라 알렉사플루오르-568 단백질 표지 키트 (미국 오레곤주 유진 소재의 몰레큘라 프로브즈)를 이용하여 알렉사플루오르-568로 표지하였다. 간략하게는, OxLDL을 0.1 M 중탄산염 (pH 8.3) 중 알렉사플루오르-568과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 알렉사플루오르-568-콘쥬게이션된-OxLDL을 정제용 수지 컬럼으로 정제하였다.
HAEC에 의한 알렉사 플루오르-568- 콘쥬게이션된 - OxLDL의 흡수
HAEC를 혈청-함유 배지 중 피브로넥틴 코팅된 (10 μg/ml) 커버슬립 (coverslip) 상에 8시간 동안 접종한 후, 혈청 기아를 18시간 동안 주었다.
이어서 세포를 0, 0.5, 1, 5, 도는 10 nM의 LX5140110 ("514") 또는 10 nM의 대조 항체 NIP와 함께 무혈청 배지에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 항체를 신선 무혈청 배지로 완전히 세척한 후, 대략 50 ng/ml의 알렉사플루오르568-OxLDL을 1시간 동안의 흡수를 위하여 배지에 첨가하였다. 이어서 세포는 3% 파라포름알데히드 (시그마) 중 0.5% 트리톤 (Triton) X-100 (피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific))을 2분 동안 침투시키고, 이어서 3% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 플루오레세인 팔로이딘 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 라이프 테크놀로지즈 (Life Technologies)으로 표지하고, 에피플루오레센스 (epifluorescence) 니콘 (Nikon) TE-200 현미경에서 관찰하였다. 영상을 벨로시티 (Velocity) 소프트웨어 (미국 매사추세츠주 렉신턴 소재의 퍼킨엘머)를 갖춘 로렐라 (Rolera) EMCCD 카메라 (캐나다 밴쿠버 소재의 큐이미징 (QImaging))로 포착하였다. HAEC 세포 내부의 알렉사플루오르-568-콘쥬게이션된-OxLDL의 적색 형광 입자 (크기가 0.1 μM2 미만인 입자는 배제함)를 계수함으로서 영상을 벨로시티 소프트웨어로 추가로 분석하였다 (영상은 예시되어 있지 않음). 각각의 세트에 있어서 대략 12개의 영상을 획득하고, 각각의 세포에서 알렉사플루오르-568-콘쥬게이션된-OxLDL의 적색 형광 입자의 평균 개수에 대하여 분석하였다. 용량 응답 데이터가 도 9a에 예시되어 있다 (표준 유도에 의한 세포당 소포의 수). 도 9a에 나타낸 바와 같이, 5 nM 또는 10 nM LX5140110은 HAEC에 의한 OxLDL 흡수를 유의하게 저해하였다 (각각 p=0.0003 또는 p=0.0002).
B. LX5140110은 HAEC에서 NFkB 시그널링을 약화시킨다 (도 9b)
방법: NFκB-루시퍼라아제 및 GFP를 공동 발현하는 HAEC의 융합성 6웰 플레이트를 24시간 동안 혈청 기아를 준 후 상기 플레이트에 하기 조건을 가하였다 (수는 좌측으로부터 우측으로 도 9b에서의 막대를 나타냄): 1. 대조구; 2. OxLDL 단독 (50 μg/ml); 3. OxLDL+ LX5140110 ("514") (10 nM); 4. OxLDL+ NIP (대조 항체) (10 nM).
항체를 OxLDL (50 μg/ml) 1시간 전에 첨가하였다. OxLDL과 함께 추가로 8시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 용해시키고, 루시퍼라아제 활성 분석 (프로메가 (Promega))을 하고, 발광을 플렉스스테이션 (FlexStation) 3 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈)를 이용하여 결정하였다. 간략하게는, HAEC를 프로메가 5x 용해 완충제로 용해시키고, 상청액을 각각의 웰 중 50 μl의 프로메가 기질을 포함하는 백색 플레이트에 도말하였다. 트랜스펙션한지 48시간 후, 세포를 pH 7.5의 20 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 1 mM Na3VO4, 2.5mM 피로인산나트륨, 1 mM β-글리세로포스페이트, 1 μg/ml의 류펩틴, 및 1:1000으로 희석시킨 프로테아제 저해제 칵테일 (시그마)로 이루어진 빙냉 변형 용해 완충제에서 용해시켰다. 로딩 완충제를 2x의 최종 농도까지 첨가하고, 5분 동안 비등시키고, 3분 동안 스핀하고, 겔에 로딩하였다. GFP 형광을 정규화용 대조구로 사용하였다. 각각의 군에 있어서 N=5이며; *는 (비처리 대조구와 비교하여) P<0.05임을 나타내며; #는 (OxLDL + 0 nM ab 514 (LX5140110)와 비교하여) P<0.05임을 나타낸다. 도 9b에 나타낸 바와 같이, 10 mM LX5140110의 첨가는 HAEC에서 OxLDL-의존적 NFkB 시그널링을 유의하게 감소시켰지만 NIP (대조 항체)는 그렇지 않았다. 이는 LOX-1 수용체의 하류인 것으로 잘 확립된 시그널링 경로인 LOX1-의존적 NFkB 활성화를 LX5140110이 저해할 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 문헌[Zhao W, et al., "Lipopolysaccharide induced LOX-1 expression via TLR4/MyD88/ROS activated p38MAPK-NF-κB pathway." Vascul Pharmacol. (2014)]을 참조한다.
C. LX5140110은 HAEC에서 아르기나아제의 활성화를 저해한다 (도 9c).
방법: HAEC의 융합성 6웰 플레이트를 24시간 동안 혈청 기아를 준 후 상기 플레이트에 하기 조건을 가하였다 (수는 좌측으로부터 우측으로 도 9c에서의 막대를 나타냄):1. 대조구; 2. OxLDL (50 μg/ml); 3. OxLDL + LX5140110 ("514") (1 nM); 4. OxLDL + LX5140110 ("514") (3nM); 5. OxLDL + LX5140110 ("514") (10 nM); 6. OxLDL + NIP (10 nM). 항체를 첨가한지 1시간 후에 HAEC를 OxLDL (50 μg/ml)에서 추가로 3시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 용해시키고, 아르기나아제 활성을 우레아 분석법을 이용하여 α-아이소니트로소프로피오페논을 이용하여 결정하였다. 간략하게는, 추출된 세포 용해물의 상청액을 용해 완충제 (50 mM 트리스-HCl, pH7.5, 0.1 mM EDTA 및 프로테아제 저해제)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고 4℃에서 14,000 x g에서 20분 동안 원심분리한 후 제조하였다. 이어서 상청액을 150 mM L-아르기닌과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후, 400 μl의 산 용액 혼합물 (H2SO:H3PO4:H2O 1:3:7)을 이용하여 반응을 중지시키고, 그 후 25 μl의 9% α-아이소니트로소프로피오페논 (100% EtOH 중)을 첨가하고, 95℃에서 30분 동안 가열하고, 10분 후 540 nm에서 판독하였다. 각각의 군에 있어서 N=3이며; *는 비처리 대조구와 비교하여 P<0.05임을 나타내며; #는 0 nM ab 514 (LX5140110)와 비교하여 P<0.05임을 나타낸다. 도 9c에 나타낸 바와 같이, 3 nM 또는 10 nM LX5140110의 첨가는 HAEC에서 OxLDL-의존적 아르기나아제 활성을 용량-의존적 방식으로 유의하게 감소시키지만, 10 nM NIP (대조 항체)는 그렇지 않았다. 이는 혈관 내피에서 LOX-1에 커플링된 것으로 최근에 밝혀진 하류 시그널링 경로인 아르기나아제 2의 LOX-1의존적 활성화를 LX5140110이 저해함을 시사한다. 예를 들어, 문헌[Ryoo et al., Atherosclerosis 214:279-87 (2011)].
D. LX5140110은 산화질소 생성의 OxLDL -의존적 감소를 차단한다 (도 9d)
방법: NO 생성을 DAF 형광을 이용하여 측정하였다. 간략하게는, NO 측정을 위하여, HAEC 세포를 웰당 대략 5x104개의 세포의 밀도로 백색 96웰 플레이트 (서모랩시스템즈 (ThermoLabsystems))에 도말하고, 혈청 기아 (1% 혈청)를 하룻밤 주었다. 세포를 7개의 실험군에서 조사하였다 (수는 좌측으로부터 우측으로 도 9d에서의 막대를 나타냄): 1. 대조구; 2. OxLDL (50 μg/ml); 3. OxLDL + LX5140110 ("514") (0.5 nM); 4. OxLDL + LX5140110 ("514") (1 nM); 5. OxLDL + LX5140110 ("514") (5 nM); 6. OxLDL + LX5140110 ("514") (10 nM); 7. OxLDL + NIP (10 nM). 항체를 첨가한지 1시간 후에 HAEC를 OxLDL (50 μg/ml)에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 배지를 제거하고, 세포를 37℃에서 30분 동안 DAF-FM DA (5 μM)를 포함하는 EBM2 배지에서 37℃에서 두었다. 이어서 배지를 신선 배지로 교체하고, 세포를 추가로 20분 동안 인큐베이션한 후 495 nM에서의 여기 및 515 nM에서의 방출에서 플렉스스테이션 3 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈)를 이용하여 총 형광을 측정하였다. NO가 eNOS에 의해 생성되었음을 확인하기 위하여, NOS 저해제 L-NAME를 대조구로서 사용하였다 (데이터는 예시되어 있지 않음). 각각의 군에 있어서 N=5이며; *는 (비처리 대조구와 비교하여) P<0.05임을 나타낸다. 도 9d에 나타낸 바와 같이, 5 nM 또는 10 nM LX5140110의 첨가는 HAEC의 산화질소 생성의 OxLDL-의존적 감소를 용량-의존적 방식으로 유의하게 저해하였지만, 10 nM NIP (대조 항체)는 그렇지 않았다.
E. LX5140110은 ROS 생성의 OxLDL -의존적 증가를 차단한다 (도 9e 및 9f).
방법: 수퍼옥시드 생성을 루미놀 유사체 L-012를 이용하여 결정하였다. 수퍼옥시드 (ROS)를 측정하기 위하여, HAEC를 웰당 대략 5x104개의 세포의 밀도로 백색 TC-처리 96웰 플레이트 (서모랩시스템즈)에 도말하고, 혈청 기아 (1% 혈청)를 하룻밤 주었다. 7개의 연구 집단은 하기와 같았다 (수는 좌측으로부터 우측으로 도 9e에서의 막대를 나타냄): 1. 대조구; 2. OxLDL (50 μg/ml); 3. OxLDL+ LX5140110 ("514") (0.5 nM); 4. OxLDL+LX5140110 ("514") (1 nM); 5. OxLDL+LX5140110 ("514") (5 nM); 6. OxLDL+LX5140110 ("514") (10 nM); 7. OxLDL+NIP (10 nM). 항체를 첨가한지 1시간 후 HAEC를 OxLDL (50 μg/ml)에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 배지를 제거하고, 세포를 400 μM의 루미놀 유사체 L-012 (와코 (Wako))를 포함하는 페놀 무함유 DMEM (시그마)에서 37℃에서 최소 20분 동안 추가로 인큐베이션한 후 작동제를 첨가하였다. 발광을 플렉스스테이션 3 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈)를 이용하여 시간에 지남에 따라 정량화하였다. 반응성 산소종에 대한 L-012의 특이성을 수퍼옥시드 스캐빈저 SOD (5 mM)와 함께 공동 인큐베이션시킴으로써 확인하였으며, 이는 대조구 또는 OxLDL-자극된 조건 하에서 실제로 검출불가능한 수준의 발광을 생성하였다 (도 9f 참조). 따라서, L-012의 발광으로부터 정량화한 상대적 광 단위 (RLU)는 수퍼옥시드의 생성의 변화를 나타낸다. 수퍼옥시드가 eNOS에 의해 생성되었음을 확인하기 위하여, NOS 저해제 L-NAME를 대조구로서 사용하였다. 각각의 군에 있어서 N=5이다. 도 9e 및 9f에 나타낸 바와 같이, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM 또는 10 nM LX5140110의 첨가는 HAEC에서 OxLDL-의존적 ROS 생성을 저해하였지만 10 nM NIP (대조 항체)는 그렇지 않았다. 따라서, LX5140110은 LOX-1 활성화 및 하류의 아르기나아제 2의 활성화를 방지함으로써 ROS 생성에 있어서 OxLDL-매개된 eNOS 해제 및 후속적인 증가를 방지한다. 예를 들어, 문헌[Ryoo et al., Atherosclerosis 214:279-87 (2011)]을 참조한다.
F. LX5140110은 초점 유착 키나아제 (FKA), Y397의 OxDL 매개된 포스포릴화를 차단한다 (도 9g 및 9h).
방법: HAEC를 5% 혈청을 포함하는 ECM 배지 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 사이언셀 (ScienCell)로 1일 동안 배양한 후, 혈청 기아를 18시간 동안 주었다. 이어서 LX5140110 또는 대조 항체 NIP를 도 9g에 표시된 농도로 세포에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 신선 배지로 세척하여 항체를 제거한 후, 세포를 50 μg/ml의 OxLDL과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 빙냉 PBS 완충제로 세척하고, 이어서 단백질을 변형 RIPA 완충제 (0.1% DOC, 0.1% 트리톤 X-100, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2 mM 소듐 바나데이트, 20 mg/ml 류펩틴, 및 20 mg/ml 아프로티닌 (PBS 중))를 사용하여 추출하였다. 세포 용해물을 15,000 x g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리함으로써 청징시켰다. 이어서 단백질 농도를 비신코닌 분석법 (bicinchoninic assay) (미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 (Pierce))에 의해 정량화하였다. 10 μg의 단백질 용해물을 2X 램믈리 (Laemmli) 샘플용 완충제와 혼합하고, 비등시키고, 이어서 4%에서 15%까지의 구배의 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 SDS-PAGE를 하고, 이어서 웨스턴 블로팅을 위하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다.
도 9g 및 9h에서 설명한 실험에서 사용한 일차 항체는 항-pY397-FAK (토끼, 다클론, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 라이프 테크놀로지즈) 및 항-GAPDH (마우스, 단클론, 미국 콜로라도주 리틀턴 소재의 노부스 바이올로지칼즈 (Novus Biologicals))를 포함한다. 서양 고추냉이 퍼옥시다아제-콘쥬게이션된 항-마우스 및 항-토끼 이차 항체를 아이씨엔 바이오케미칼즈, 인크. (ICN Biochemicals, Inc.) (미국 캘리포니아주 메사 코스타)로부터 획득하였다.
스튜던트 t-검정 (Student t-test)을 이용하여 대조구, OxLDL-처리 세포, 및 항체-사전인큐베이션 세포에서의 FAK 포스포릴화의 차이를 분석하였다. p 값이 도 9h에 제공되어 있으며, 유의도 (*)는 모든 데이터에 있어서 0.05 미만의 p 값으로 존재하도록 판단을 내렸다. 도면은 표준 오차 막대를 포함한다. HAEC에서 GAPDH의 발현 및 Tyr397에서의 FAK 포스포릴화에 있어서의 변화를 나타내는 대표적인 블롯이 도 9g에 예시되어 있는 반면, GAPDH 발현에 대하여 정규화된 Tyr397에서의 FAK 포스포릴화 (pY397-FAK)의 증가 백분율의 정량화는 도 9h에 예시되어 있다. 이들 결과는 5 nM 또는 10 nM LX5140110의 첨가가 HAEC에서 Tyr397에서의 OxLDL-의존적 매개 FAK 포스포릴화를 유의하게 저해하였지만 10 nM NIP (대조 항체)는 그렇지 않았음을 입증한다. *는 (비처리 대조구와 비교하여) P<0.05임을 나타내며; #는 0 nM LX5140110 (514)과 비교하여 P<0.05임을 나타낸다. 이러한 데이터는 내피 장벽 기능에 후속적으로 영향을 주면서 세포-세포 및 세포-매트릭스 유착을 포함하는 내피 세포골격 기능을 조절하는 과정인 LOX-1 의존적 FAK 포스포릴화의 OxLDL-매개된 유도를 LX5140110이 저해함을 시사한다.
G. LOX1은 HAEC에서 OxLDL 시그널링에 책임이 있는 일차 수용체이다 (도 9i, 9j 및 9k).
방법: LOX1 shRNA 아데노바이러스의 구성:
Ad-shNontargeted- 및 Ad shLOX1-코딩된 바이러스를 pAdBLOCK-iT 키트 (라이프 사이언시즈)를 이용하여 생성하였다. 간략하게는, 비표적화된 올리고뉴클레오티드, 및 인간 LOX1의 5'UTR 영역을 표적화하는 다른 것을 라이프 사이언시즈로부터의 독점 소프트웨어를 이용하여 설계하고, pU6-ENTR 내로 클로닝하였다. 사용한 서열은 하기와 같았다. 비표적화: 탑 (Top), 5'-CAC CGA TGG ATT GCA CGC AGG TTC TCG AAA GAA CCT GCG TGC AAT CCA TC-3' (서열 번호 79); 바텀 (Bottom), 5'-AAA AGA TGG ATT GCA CGC AGG TTC TTT CGA GAA CCT GCG TGC AAT CCA TC-3' (서열 번호 80). LOX1sh: 탑, 5'-CAC CGC TTC ACT CTC TCA TTC TTA GCG AAC TAA GAA TGA GAG AGT GAA GC-3' (서열 번호 81); 바텀, 5'-AAA AGC TTC ACT CTC TCA TTC TTA GTT CGC TAA GAA TGA GAG AGT GAA GC -3' (서열 번호 82).
얻어진 pU6-sh-Nontargeted 및 pU6-LOX1shRNA 플라스미드를 HAEC 세포를 이용한 일시적 트랜스펙션 실험에서 기능에 대하여 테스트하였다. 최대 저해를 나타내는 구성물을 pAD/BLOCK-iTDEST (인비트로겐)와 재조합시켜 pAd-Nontargeted 및 Ad-shLOX1을 생성하였다. 바이러스를 밀리포어 키트를 이용하여 증폭시키고, 정제하고, 농축시켰다.
HAEC에서 LOX1이 OxLDL 시그널링에 필요함을 확인하기 위하여, 인간 LOX1 유전자의 5'UTR에 대하여 유도된 짧은 간섭 헤어핀 RNA (shRNA) (LOX1shRNA)를 발현하는 바이러스 벡터를 이용하여 LOX1 RNA 발현을 저해하였다. 간략하게는, 60% 융합성 HAEC를 LOX1 shRNA ("LOX1-shRNA" 또는 "Ad-LOX-1shRNA")를 발현하는 25 MOI (감염 다중도, 독력의 척도)의 아데노바이러스로 형질도입시켰다. 24시간 후, 배지를 NFKB-LUC 코딩 바이러스를 포함하는 저 혈청 배지 (1%)로 교체하였다. 바이러스 형질도입한 다음 날, 세포를 50 μg/ml의 OxLDL로 처리하고, 추가로 8시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 루시퍼라아제 활성을 화학발광에 의해 측정하였다. 이어서 세포 용해물을 항-Lox-1 또는 항-GAPDH 항체를 이용하여 면역블로팅하였다. 도 9j 및 9k에 나타낸 바와 같이, LOX1shRNA의 첨가는 LOX1 단백질 발현을 유의하게 감소시켰으며 (예를 들어, 레인 1 및 2와 비교하여 도 9j의 레인 3츨 참조), 이는 LOX1shRNA가 HAEC에서 LOX1 발현을 효과적으로 저해하였음을 확인해 주는 것이었다. 게다가, 도 9i에 나타낸 바와 같이, AdshLOX1은 OxLDL 및 대조구, 비-표적화 shRNA (Ad-NTsh) 구성물과 함께 인큐베이션한 세포와 비교하여 HAEC에서 OxLDL-매개된 NFkB 시그널링을 유의하게 저해하였다. *는 (비처리 대조구와 비교하여) P<0.05임을 나타내며; #는 OxLDL + Ad-NTsh와 비교하여 P<0.05임을 나타낸다.
LOX1 수용체 시그널링에 연루된 그리고 본원에 개시된 항-LOX1 항체 (예를 들어 LX5140110; "514 Ab"를 포함함)에 의해 차단된 시그널링 경로의 요약이 도 10에 예시되어 있다.
특정한 측면의 전술한 설명은 다른 이들이 당업계의 기술 이내의 지식의 적용에 의해 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않고서, 과도한 실험 없이, 그러한 특정한 측면을 다양한 응용을 위하여 쉽게 변형시키고/시키거나 수정할 수 있도록 그렇게 충분히 본 발명의 일반적인 성질을 나타낸다. 따라서, 그러한 수정 및 변형은 본원에 제시된 교시 및 지침을 기반으로 하여, 개시된 측면의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원에서의 어구 또는 용어는 설명하기 위한 것으로서 제한하는 것이 아니어서, 본 명세서의 용어 또는 어구는 교시 및 지침을 고려하여 당업자에 의해 해석됨이 이해되어야 한다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문헌은 마치 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문헌이 개별적으로 모든 목적을 위하여 참고로 포함되는 것으로 표시되는 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE LTD and THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY <120> LOX1-BINDING PROTEINS AND METHODS OF USE BASED THEREON <130> LOX1-100WO1 <140> 62/058,254 <141> 1 October 2014 <160> 82 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox514 CDR-1 Heavy Chain sequence <400> 1 Glu Leu Ser Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140110 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 2 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Phe Lys Tyr His Thr His Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140110 CDR-3 Heavy Chain sequence <400> 3 Val Trp Gly Thr Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 4 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140110 Heavy Chain sequence <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Phe Lys Tyr His Thr His Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Leu Val Trp Gly Thr Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox514 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 5 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140011 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 6 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Glu Tyr Ala Tyr Asp Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140014 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 7 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Tyr Thr Ile Arg Val Gly Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140016 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 8 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Thr His Thr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140038 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 9 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Thr Ile His Val Asp Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140094 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 10 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Tyr His Val Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140108 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 11 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ser Asn His Val Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140092 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 12 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Lys Tyr His Leu Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140093 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 13 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ala Tyr His Gln Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140011 CDR-3 Heavy Chain sequence <400> 14 Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140108 CDR-3 Heavy Chain sequence <400> 15 Ser Thr Gly Arg Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140092_D CDR-3 Heavy Chain sequence <400> 16 Pro Asp Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140092_N CDR-3 Heavy Chain sequence <400> 17 Pro Asn Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140093_D CDR-3 Heavy Chain sequence <400> 18 Pro Asp Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 19 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140011 Heavy Chain sequence <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Glu Tyr Ala Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 20 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140014 Heavy Chain sequence <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Tyr Thr Ile Arg Val Gly Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 21 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140016 Heavy Chain sequence <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Thr His Thr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 22 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140038 Heavy Chain sequence <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Thr Ile His Val Asp Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 23 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140094 Heavy Chain sequence <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Tyr His Val Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 24 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140108 Heavy Chain sequence <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ser Asn His Val Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Leu Thr Ser Thr Gly Arg Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 25 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140092_D Heavy Chain sequence <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Lys Tyr His Leu Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Asp Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 26 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140092_N Heavy Chain sequence <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Lys Tyr His Leu Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Asn Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 27 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140093_D Heavy Chain sequence <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ala Tyr His Gln Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Asp Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 28 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140093_N Heavy Chain sequence <400> 28 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ala Tyr His Gln Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 29 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox514 Heavy Chain sequence <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox514 CDR-1 Light Chain sequence <400> 30 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox514 CDR-2 Light Chain sequence <400> 31 Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox514 CDR-3 Light Chain sequence <400> 32 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Val 1 5 10 <210> 33 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140110 Light Chain sequence <400> 33 Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140094 CDR-3 Light Chain sequence <400> 34 Gln Ser Tyr Asp Ser Met Tyr Arg Phe Gly 1 5 10 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140093 CDR-3 Light Chain sequence <400> 35 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser His Arg Ala Trp Ala 1 5 10 <210> 36 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140094 Light Chain sequence <400> 36 Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Met 85 90 95 Tyr Arg Phe Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 37 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX5140093 Light Chain sequence <400> 37 Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 His Arg Ala Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 CDR-1 Heavy Chain sequence <400> 38 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 39 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960073_G82bS_gl CDR-3 Heavy Chain sequence <400> 40 Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile 1 5 10 <210> 41 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960073_G82bS_gl Heavy Chain sequence <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960067_ngl1 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 42 Gly Val Ser Leu Gln Glu Leu Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960086_ngl1 CDR-2 Heavy Chain sequence <400> 43 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Pro Asp Arg Tyr Met Asp Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 CDR-3 Heavy Chain sequence <400> 44 Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960067_ngl1 CDR-3 Heavy Chain sequence <400> 45 Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960073_ngl1 CDR-3 Heavy Chain sequence <400> 46 Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile 1 5 10 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960101_ngl1 CDR-3 Heavy Chain sequence <400> 47 Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Val 1 5 10 <210> 48 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960067_ngl1 Heavy Chain sequence <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Val Ser Leu Gln Glu Leu Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 49 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960071_ngl1 Heavy Chain sequence <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960073_ngl1 Heavy Chain sequence <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960086_ngl1 Heavy Chain sequence <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Pro Asp Arg Tyr Met Asp Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960101_ngl1 Heavy Chain sequence <400> 52 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 53 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960073_gl Heavy Chain sequence <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 54 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 Heavy Chain sequence <400> 54 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960073_G82bS_gl CDR-1 Light Chain sequence <400> 55 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960073_G82bS_gl CDR-2 Light Chain sequence <400> 56 Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960073_G82bS_gl CDR-3 Light Chain sequence <400> 57 Met Gly Gly Met Gly Arg Ser Thr Asn Trp Val 1 5 10 <210> 58 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960073_G82bS_gl Light Chain sequence <400> 58 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Pro Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Gly Met Gly Arg 85 90 95 Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 59 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960116_ngl1 CDR-1 Light Chain sequence <400> 59 Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 CDR-2 Light Chain sequence <400> 60 Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 CDR-3 Light Chain sequence <400> 61 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Asn Trp Val 1 5 10 <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960067_ngl1 CDR-3 Light Chain sequence <400> 62 Leu Gly Arg Thr Trp Ser Ser Thr Asn Trp Val 1 5 10 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960071_ngl1 CDR-3 Light Chain sequence <400> 63 Met Gly Ser Met Gly Arg Ser Thr Asn Trp Val 1 5 10 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960094_ngl1 CDR-3 Light Chain sequence <400> 64 Ala Gln Arg Thr Val Ser Ser Thr Asn Trp Val 1 5 10 <210> 65 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960067_ngl1 Light Chain sequence <400> 65 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gly Arg Thr Trp Ser 85 90 95 Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 66 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960071_ngl1 Light Chain sequence <400> 66 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Pro Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Ser Met Gly Arg 85 90 95 Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 67 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960073_ngl1 Light Chain sequence <400> 67 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Pro Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Gly Met Gly Arg 85 90 95 Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 68 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960094_ngl1 Light Chain sequence <400> 68 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Gln Arg Thr Val Ser 85 90 95 Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 69 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LX6960116_ngl1 Light Chain sequence <400> 69 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Ser Met Gly Arg 85 90 95 Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 70 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 Light Chain sequence <400> 70 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox514 VH CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Gly, Trp, Tyr, or Phe <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Glu, Thr, Gln, Ser, Lys, or Ala <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Thr, Tyr, Ile, or Asn <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is Ile, Ala, Arg, or His <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Tyr, Val, Thr, Leu, or Gln <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ala, Asp, Gly, Ser, or His <400> 71 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 72 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox514 VH CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Pro, Ser, or Val <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is Asn, Thr, Trp, or Asp <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Gln, Arg, or Thr <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Gln or His <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Gly or Gln <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Lys or Gly <400> 72 Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox514 VL CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ser or Met <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Leu, Tyr, or His <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Ser or Arg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Gly, Ala, or no amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is Trp or Phe <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Val, Gly, or Ala <400> 73 Gln Ser Tyr Asp Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 VH CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is Ile or Val <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Trp or Leu <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ser or Glu <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Gly, Leu, or Pro <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Ser, Tyr, or Asp <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Ile, Thr, or Arg <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is Gly or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Tyr or Met <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ala or Asp <400> 74 Gly Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 VH CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Asn or Ser <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Phe or Leu <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Ile or Val <400> 75 Glu Gly Xaa Trp Asn Tyr Asp Ala Xaa Asp Xaa 1 5 10 <210> 76 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 VL CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ser or Asn <400> 76 Thr Gly Thr Ser Xaa Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 VL CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asn or Lys <400> 77 Asp Val Ser Xaa Arg Pro Ser 1 5 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox696 VL CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ser, Leu, Met, or Ala <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is Ser, Gly, or Gln <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Tyr, Arg, Ser, or Gly <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Thr or Met <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ser, Trp, Gly, or Val <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ser or Arg <400> 78 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Thr Asn Trp Val 1 5 10 <210> 79 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Top Ad-shNontargeted synthetic primer <400> 79 caccgatgga ttgcacgcag gttctcgaaa gaacctgcgt gcaatccatc 50 <210> 80 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bottom Ad-shNontargeted synthetic primer <400> 80 aaaagatgga ttgcacgcag gttctttcga gaacctgcgt gcaatccatc 50 <210> 81 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Top LOX1sh synthetic primer <400> 81 caccgcttca ctctctcatt cttagcgaac taagaatgag agagtgaagc 50 <210> 82 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bottom LOX1sh synthetic primer <400> 82 aaaagcttca ctctctcatt cttagttcgc taagaatgag agagtgaagc 50

Claims (44)

  1. 중쇄 가변 영역(VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 및 경쇄 가변 영역(VL)-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 상보성 결정 영역(CDR)의 세트를 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질로서,
    (a) (i) VH-CDR1은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖고;
    (ii) VH-CDR2는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖고;
    (iii) VH-CDR3은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖고;
    (iv) VL-CDR1은 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖고;
    (v) VL-CDR2는 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖고;
    (vi) VL-CDR3은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 것인 단리된 LOX1-결합 단백질.
  2. 제1항의 CDR의 세트를 포함하고, 서열 번호 4의 서열에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열 번호 33의 서열에 대하여 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질.
  3. 제1항의 CDR의 세트를 포함하고, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 33의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, LOX1 활성을 감소시키거나, 저해하거나, 길항하는 단리된 LOX1-결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체인 단리된 LOX1-결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 항체는 단클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 2특이성 항체, 다중특이성 항체, 또는 LOX1-결합 항체 단편인 단리된 LOX1-결합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, LOX1-결합 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디, 또는 단쇄 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 LOX1-결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, LOX1-결합 단백질은 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 및 인간 람다 경쇄 불변 도메인을 추가로 포함하는 단리된 LOX1-결합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, IgG1 불변 Fc 영역 도메인은 위치 234, 235 및 331에서 돌연변이를 포함하며, 위치 넘버링은 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따른 것인 단리된 LOX1-결합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, IgG1 Fc 도메인은 돌연변이 L234F, L235E 및 P331S를 포함하며, 위치 넘버링은 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따른 것인 단리된 LOX1-결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 LOX1-결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 핵산 분자들의 세트.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 LOX1-결합 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, LOX1과 연관된 질환 또는 병태 치료용 제약 조성물로서,
    질환 또는 병태는 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, 관상 동맥 질환(CAD), 허혈, 경색, 급성 관동맥 증후군(ACS), 뇌졸중, 재관류 손상, 재협착, 말초 혈관 질환, 고혈압, 심부전, 염증, 혈관 형성, 자간전증 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, LOX1-결합 단백질은 단독으로 또는 병용 요법제로서 투여되는 것인 제약 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
KR1020177011186A 2014-10-01 2015-09-30 Lox1에 특이적인 결합 단백질 및 이의 용도 KR102571909B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462058254P 2014-10-01 2014-10-01
US62/058,254 2014-10-01
PCT/EP2015/072644 WO2016050889A1 (en) 2014-10-01 2015-09-30 Binding proteins specific for lox1 and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170062502A KR20170062502A (ko) 2017-06-07
KR102571909B1 true KR102571909B1 (ko) 2023-08-28

Family

ID=54352455

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177011186A KR102571909B1 (ko) 2014-10-01 2015-09-30 Lox1에 특이적인 결합 단백질 및 이의 용도

Country Status (17)

Country Link
US (3) US10117889B2 (ko)
EP (1) EP3201233A1 (ko)
JP (2) JP6709212B2 (ko)
KR (1) KR102571909B1 (ko)
CN (2) CN108064243B (ko)
AU (2) AU2015326891B2 (ko)
BR (1) BR112017006609A2 (ko)
CA (1) CA2962731A1 (ko)
CL (1) CL2017000757A1 (ko)
CO (1) CO2017003777A2 (ko)
IL (1) IL250796B (ko)
MX (1) MX2017004103A (ko)
MY (1) MY188292A (ko)
NZ (1) NZ729600A (ko)
RU (1) RU2764993C2 (ko)
SG (2) SG10202001114PA (ko)
WO (1) WO2016050889A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR096601A1 (es) 2013-06-21 2016-01-20 Novartis Ag Anticuerpos del receptor 1 de ldl oxidado similar a lectina y métodos de uso
UY35620A (es) 2013-06-21 2015-01-30 Novartis Ag Anticuerpos del receptor 1 de ldl oxidado similar a lectina y métodos de uso
MA43342A (fr) 2015-09-30 2018-08-08 Medimmune Ltd Compositions et procédé d'inhibition de cellules souches cancéreuses
WO2021193870A1 (ja) * 2020-03-26 2021-09-30 デンカ株式会社 Ｆｃ領域の一部を欠損した抗体を含む試薬
JP2023534923A (ja) 2020-07-06 2023-08-15 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的にする抗原結合分子
WO2022047033A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Antigen binding molecules targeting sars-cov-2
TW202306991A (zh) 2021-04-30 2023-02-16 英商梅迪繆思有限公司 用於治療血管炎症、動脈粥樣硬化和相關障礙之方法
CN115477704B (zh) * 2021-06-16 2024-02-23 四川大学华西医院 一种基于lox1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用
WO2023172699A1 (en) * 2022-03-10 2023-09-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of coronary artery disease

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080241134A1 (en) * 2000-03-02 2008-10-02 Abgenix, Inc. Uses of human monoclonal antibodies against oxidized ldl receptor
US20090311271A1 (en) 2008-05-29 2009-12-17 Wyeth Methods and Compositions for Selective Inhibition of Ligand Binding to the Lectin-Like Receptor for Oxidized Low Density Lipoprotein (LOX-1)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5232818B2 (ja) * 1998-08-06 2013-07-10 達也 沢村 酸化ｌｄｌ受容体に対する抗体を含んでなる医薬組成物
ES2535637T3 (es) 2006-10-27 2015-05-13 Genentech, Inc. Anticuerpos e inmunoconjugados y usos para los mismos
TWI556826B (zh) * 2007-02-23 2016-11-11 貝勒研究協會 經由樹突狀細胞凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體－１（ｌｏｘ－１）之人類抗原呈現細胞活化
JPWO2010147171A1 (ja) 2009-06-18 2012-12-06 株式会社広島バイオメディカル ニワトリ由来抗ｌｏｘ−１抗体
AR096601A1 (es) * 2013-06-21 2016-01-20 Novartis Ag Anticuerpos del receptor 1 de ldl oxidado similar a lectina y métodos de uso
UY35620A (es) * 2013-06-21 2015-01-30 Novartis Ag Anticuerpos del receptor 1 de ldl oxidado similar a lectina y métodos de uso

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080241134A1 (en) * 2000-03-02 2008-10-02 Abgenix, Inc. Uses of human monoclonal antibodies against oxidized ldl receptor
US20090311271A1 (en) 2008-05-29 2009-12-17 Wyeth Methods and Compositions for Selective Inhibition of Ligand Binding to the Lectin-Like Receptor for Oxidized Low Density Lipoprotein (LOX-1)

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017531426A (ja) 2017-10-26
MX2017004103A (es) 2017-07-07
NZ729600A (en) 2023-09-29
US11078284B2 (en) 2021-08-03
US20190262368A1 (en) 2019-08-29
AU2021204798A1 (en) 2021-08-05
JP2020188765A (ja) 2020-11-26
IL250796A0 (en) 2017-04-30
US20170304343A1 (en) 2017-10-26
MY188292A (en) 2021-11-25
SG10202001114PA (en) 2020-03-30
RU2764993C2 (ru) 2022-01-24
CN113583130A (zh) 2021-11-02
AU2015326891A1 (en) 2017-03-23
AU2015326891B2 (en) 2021-04-08
CN108064243B (zh) 2021-08-27
WO2016050889A1 (en) 2016-04-07
CN108064243A (zh) 2018-05-22
CA2962731A1 (en) 2016-04-07
RU2017115071A (ru) 2018-11-07
CL2017000757A1 (es) 2018-04-20
CO2017003777A2 (es) 2017-07-11
SG11201702385TA (en) 2017-04-27
EP3201233A1 (en) 2017-08-09
JP6709212B2 (ja) 2020-06-10
KR20170062502A (ko) 2017-06-07
US20210347900A1 (en) 2021-11-11
BR112017006609A2 (pt) 2017-12-12
RU2017115071A3 (ko) 2019-04-29
IL250796B (en) 2022-04-01
US10117889B2 (en) 2018-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102571909B1 (ko) Lox1에 특이적인 결합 단백질 및 이의 용도
JP6907380B2 (ja) プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ｐａｉ−１）に対する抗体及びその使用
JP6678627B2 (ja) 治療的低密度リポタンパク質関連タンパク質６（ｌｒｐ６）多価抗体の組成物および使用方法
CA3018235C (en) Carrier immunoglobulins and uses thereof
TW201741340A (zh) Cd47抗體及使用其之方法
AU2014306564B2 (en) Antibodies against frizzled proteins and methods of use thereof
CA2977621C (en) Antibody binding to tfpi and composition comprising the same
JP7034499B2 (ja) 線維症の治療のための抗ｆａｍ１９ａ５抗体の用途
CN105492462B (zh) 凝集素样氧化的ldl受体1抗体和使用方法
RU2735639C2 (ru) Антитела, которые связываются с сортилином и подавляют связывание програнулина
US11000565B2 (en) Methods of increasing muscle mass by administration of activin type 2 receptor antibodies
KR20190002644A (ko) FcγRIIA에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
JP2019531762A (ja) Ｖｅｇｆに対する合成の抗体およびそれらの使用
AU2012293646A1 (en) New antibodies against phosphorylcholine
WO2022228364A1 (zh) 抗masp2抗体、其抗原结合片段及医药用途
WALKER et al. Patent 3018235 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant