CN101443361A - 与受体酪氨酸激酶alk的胞外域结合的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对人ALK(间变性淋巴瘤激酶)的特异性抗体，特别涉及scFv、编码scFv的核酸序列、scFv的制备方法以及scFv作为药物或诊断目的的用途。所述抗体适用于肿瘤、特别是成胶质细胞瘤的局部治疗。
Description
相关信息
本申请要求于2006年4月28日提交的美国临时专利申请No.60/795,831的优先权，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
在此，在本说明书的全文中所引用的任何专利、专利申请以及参考文献的内容均以引用方式全文并入本文。
技术领域
本发明涉及人ALK(间变性淋巴瘤激酶)的特异性抗体，特别涉及scFv、编码scFv的核酸序列、scFv的制备方法以及scFv作为药物或诊断目的的用途。所述抗体适用于肿瘤或癌症、特别是成胶质细胞瘤的局部治疗。
背景技术
ALK(间变性淋巴瘤激酶，CD246)是受体酪氨酸激酶(RTK)家族中的一员。作为该家族中具有代表性的一员，ALK是一种基本上由3个结构域构成的I型跨膜蛋白，所述的3个结构域为：胞外配体结合结构域(氨基酸19-1038)，其包含1个LDL受体A类结构域和2个MAM结构域(MAM：跨膜肽酶、A5抗体、蛋白质酪氨酸磷酸酶μ)；跨膜结构域(氨基酸1039-1059)；以及细胞质结构域(氨基酸1060-1620)，其包含酪氨酸激酶结构域。信号肽存在于新生蛋白质的N-末端(氨基酸1-18)，其在分泌时被切断。
在1997年，由2个独立的研究组(Iwahara 1997和Morris 1997)克隆出了人和小鼠的ALK全长序列。ALK与被称为白细胞酪氨酸激酶(LTK)的RTK高度相似，并且属于胰岛素受体超家族。在ALK与LTK的重叠区域中，表现出57％的氨基酸一致性，71％的氨基酸相似性(Morris 2001)。ALK是高度N-糖基化的，并且包含21个公认的N-糖基化位点。氨基酸687-1034与LTK具有明显的相似性(其中氨基酸的一致性达到50％)。但是，在N-末端的第686位附近的氨基酸序列中，除了一段非常短的序列曾在LDL受体中发现以外，其他序列都没有显示出与任何已知的蛋白质具有同源性(Duyster2001/SWISSPROT)。此外，ALK在氨基酸264-427和氨基酸478-636处含有2个MAM结构域(跨膜蛋白、A5抗体、蛋白质酪氨酸磷酸酶μ)。由于这些结构域广泛分布在涉及细胞与细胞间的相互作用中的多种附着蛋白质中，所以被认为具有附着功能(De Juan 2002)。此外，在对应于氨基酸396-406处为推定的ALK的配体结合位点(Stoica2001，参见下文)。鼠ALK的激酶结构域的氨基酸序列与人ALK的氨基酸具有98％的一致性，与小鼠LTK的氨基酸具有78％的一致性，与小鼠ros具有52％的一致性，与人胰岛素样生长因子受体具有47％的一致性，与人胰岛素受体具有46％的一致性(Iwahara 1997和Ladanyi 2000)。到目前为止，还没有关于ALK剪接变体的描述。但是，ALK通常与染色体的易位有关(参见下文)。
ALK基因跨越大约315kb，并具有26个外显子。该基因的大部分由2大段内含子构成，该内含子跨越大约170kb。ALK转录本的长度为6.5kb(Kutok 2002)。根据Morris，ALK的cDNA跨越6226bp(Morris 2001)。
在小鼠胚胎发育过程中的发育阶段的大约E11天，开始了ALK的表达，并且持续到发育的新生儿时期，在新生儿时期，ALK在神经系统中表达。在成人中，ALK的生理学表达局限于CNS的某些神经元(神经及神经胶质细胞以及可能的内皮细胞)区域低水平表达(Morris 1997，Duyster 2001，Stoica 2001)。事实上，ALK的富集程度在出生后发生降低(Morris 2001)。基于ALK的表达模式，提示了在脑发育过程中的受体的作用(Duyster 2001)。ALK的神经限制性表达提示，其起到了神经营养因子的受体的作用(参见下文)。与上文所述的情况相一致，ALK的表达模式与编码神经营养蛋白受体的TRK家族的基因重叠(Morris 2001)。但是，敲除了ALK基因的小鼠没有显示出任何明显的表现型(没有公开的数据)，这可能是由于与TRK家族的成员或其他神经营养受体具有某些功能上的冗余所致。明显的是，造血组织显示出无可检测到的ALK的表达(参见下文)(Morris 2001)。
最近，已经描述了2种可能的ALK配体：“多效生长因子”(PTN)和“中期因子”(MK)(Stoica 2001，Duyster 2001，Stoica 2002)。通过使用纯化的人多效生长因子蛋白来筛选噬菌体展示肽文库来鉴定了PTN-ALK间的相互作用。通过这种方法，确定了ALK存在于胞外结构域中的序列(氨基酸396-406)。重要的是，该序列并非与LTK(其为与ALK最密切相关的RTK)共有。此外，在果蝇的ALK的潜在的同源染色体中，所述的配体结合区域是保守的(Loren 2001)。ALK通过与PTN结合而被快速磷酸化(Bowden 2002)。此外，已经表明，在细胞培养中使用多效生长因子来刺激ALK。根据多效生长因子所具有的病理含义，使用该多效生长因子来刺激ALK使得多效生长因子/ALK间的相互作用特别引人关注(Stoica 2001)。此外，缺少ALK表达的细胞系未能显示出对多效生长因子产生生长应答，反之亦然(Stoica 2001)。在体内，已经证明在患有各种固体肿瘤的患者血清中，多效生长因子的含量增高，并且动物研究表明，多效生长因子有助于肿瘤的生长(Stoica 2001)。在动物模型中，充分地确定了PTN作为肿瘤生长中起限速作用的血管生成因子的作用(Choudhuri1997)。1996年，Czubayko等人(Czubayko 1996)证明了PTN在肿瘤血管发生以及在防止凋亡和转移(通过采用核酶靶向方法来调节PTN的含量而实现)中的重要性。小鼠PTN的血清含量测量值证明了其与肿瘤的大小之间存在着明显的关系。PTN在最恶性的人类癌症种类(例如黑色素瘤和胰腺癌)的某些癌症中具有重要的作用，因此对ALK抑制剂的其他潜在的应用产生了另人关注的前景(Weber2000，Stoica 2001)。在人类患者中，在患有胰腺癌(n＝41，P<.0001)和结肠癌(n＝65，P＝.0079)的患者中，发现血清多效生长因子的水平增高。在健康个体中，在围生期的器官生长过程中以及在成人的神经元和神经胶质的选择性群体中，PTN以严格受调节的方式被表达出来。
如在多种癌症的细胞系中发现的那样，PTN与ALK共表达，这表明它们可以形成刺激生长的自分泌环(Stoica 2001)。尽管获得了全部这些数据，但是文献说明，对于PTN的作用是否只受到ALK的调节和/或受到其他未确定的PTN受体的调节，仍然还不清楚(Duyster2001)。已经提出了至少2种其他可能的PTN受体：受体酪氨酸磷酸酶RPTPβ和N-多配体硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。但是，RPTPβ可能起到PTN/ALK信号传导的信号传导调节剂的作用，而N-多配体蛋白聚糖起到了用于配体的分子伴侣的作用(Bowden 2002)。
最近，与多效生长因子相关的被称为中期因子(MK)的另一种分泌型生长因子已经被鉴定出作为用于ALK的第二配体。与PTN相似，MK的结合和活化功能(例如，在细胞培养中诱导软琼脂上的菌落形成)能够被抗ALK-ECD的相同的抗体所阻断(Stoica 2001)。类似于多效生长因子，中期因子在许多肿瘤中是受到正调控的，尽管其生理表达非常局限于成人的正常组织中(Stoica 2002)。对47例膀胱肿瘤样品的分析表明，其MK的表达比正常的膀胱组织中MK的表达显著增强(大约4倍)。此外，这种显著的过表达与低的患者生存率有关(O′Brien 1996)。
然而，MK与ALK的亲和力比多效生长因子之一与ALK的亲和力低大约5倍(Stoica 2002)。有趣的是，如与多效生长因子，通过核酶抑制ALK还会抑制MK在细胞培养中的作用(Stoica 2002)。这些研究的作者还得出这样的结论：对PTK/MK/ALK途径的抑制作用开创了用于治疗多种疾病的非常值得关注的可能，其中所述多种疾病中的一些疾病(例如，成胶质细胞瘤和胰腺癌)到目前为止还具有极其有限的治疗选择(Stoica 2002)。
在健康个体中，ALK mRNA的表达在新生儿时期达最高峰，并且在成人神经系统的一些有选择的部分中持续。最近，还在与神经元和配体细胞相关的内皮细胞中检测到了ALK蛋白质的表达。所描述的多效生长因子的至少一部分恶性活性是通过ALK来调节的证据得自通过核酶靶向方法排除ALK的表达的实验。这种ALK的排除阻止了多效生长因子刺激的抗凋亡蛋白Akt的磷酸化，并使得接受了异种移植物的小鼠的存活期延长。事实上，当ALK的表达被排除后，肿瘤移植物中的凋亡细胞的数目显著增多(Powers 2002)。
所描述的MK的恶性活性是通过ALK调节的证据得自使用了针对ALK ECD的单克隆抗体的实验。加入得自2种抗ALK ECD抗体的杂交瘤细胞上清液的1:25的稀释液导致SW-13细胞在软琼脂上的菌落形成显著减少(Stoica 2002)。对10种不同的细胞系进行分析表明，对PTN产生生长应答的能力完全与ALK mRNA的表达有关(以下细胞系对PTN产生应答并发现有ALK mRNA表达：HUVEC、NIH3T3、SW-13、Colo357、ME-180、U87、MD-MB 231，Stoica 2001)。有趣的是，在一些癌细胞系(Colo357胰腺癌、Hs578T乳癌和U87成胶质细胞瘤)中，PTN和ALK共表达，这表明PTN和ALK形成了刺激生长的自分泌环(Stoica 2001)。
有趣的是，PTN和MK都已经显示出能引起抗凋亡的bcl-2蛋白质产生转录正调控(Stoica 2002)。此外，活化的Akt(其为异常ALK信号传导的重要的下游靶物)使被称为bad的促凋亡因子磷酸化，由此导致从bc1 x 1分离，当从bad上释放下来时，其能够通过阻断细胞色素c的释放来抑制凋亡(参见Bowden 2002以用于参考)。
ALK的异常表达可能涉及若干种癌症的发生。但是，其首先与高度恶性的非霍奇金淋巴瘤(NHL)的亚类(即，所谓的间变性大细胞淋巴瘤(ALCL))有关。非霍奇金淋巴瘤代表了源于淋巴源的多种细胞的克隆性瘤形成。
大多数患有ALCL的原发性全身性临床亚型的患者具有t2，5易位，从而表达出将核磷蛋白(NPM)的N-末端连接到ALK的C-末端的融合蛋白。所述的融合蛋白由NPM的氨基酸1-117与ALK的氨基酸1058-1620融合形成，并且染色体的断裂位点位于编码TM与ALK的近膜结构域的外显子之间的内含子中(Duyster 2001)。NPM-ALK是含有2040bp的ORF的转录本，其编码了含有680个氨基酸的蛋白质(Morris 2001)。这与NPM的跨越911bp的内含子4和ALK的跨越2094bp的内含子16的断裂位点相应(Kutok 2002)。最可能的是，所述融合蛋白中的ALK序列是导致ALCL的蛋白质所需的最短序列(Duyster 2001)。反转的融合蛋白(即，ALK-NPM)不能被表达，至少不能在淋巴细胞中表达(Kutok 2002)。野生型NPM蛋白质显示出普遍存在的表达情况，并且起到了蛋白质在由细胞质进入核仁过程中的载体的作用。事实上，NPM为染色体5编码的38kDa的核内蛋白，其含有NLS，能够与核内蛋白质结合并进行细胞质/细胞核的运输(Duyster 2001)。NPM是最丰富的核仁蛋白质之一，并且通常以六聚体的形式存在(Morris 2001)。最重要的是，NPM通常发生自寡聚化(形成六聚体)，以及与NPM-ALK发生异源寡聚化(Duyster 2001)。2，5易位使得在染色体2上编码酪氨酸激酶的ALK基因部分处于染色体5上强的NPM启动子的控制之下，从而使得嵌合的NPM-ALK蛋白质(p80)永久表达(Duyster 2001)。因此，ALK激酶失去调控，并且在细胞种类(淋巴细胞)和细胞的各部分(细胞核/核仁以及细胞质)中产生异位(Ladanyi 2000)。NPM的定位(细胞质或细胞核)似乎不会影响其对淋巴瘤生成的影响(Duyster2001)。所得的异常的酪氨酸激酶活性通过对细胞内靶物的组成型磷酸化而引发恶变。其他多种稀有的ALK融合蛋白也与ALCL有关。所有的变体都表明ALK酪氨酸激酶结构域与调节其表达的备择的启动子相连。
已经报道，全长的ALK还在大约92％的初级成神经细胞瘤细胞以及一些横纹肌肉瘤中被表达出来(Lamant 2000)。但是，到目前为止，已经证明ALK的表达与肿瘤生物学之间不具有相关性。上述这些事实，以及缺乏关于这些肿瘤中内源磷酸化的ALK的有效水平的证据，提示ALK在成神经细胞瘤中的表达反映了其在未成熟神经细胞中的正常表达，而非主要的致瘤作用，并且在这些肿瘤中ALK没有被组成型磷酸化，因此对ALK在这些肿瘤中的重要作用提出质疑(Duyster 2001，Pulford 2001)。然而，如Miyake等人(其曾经发现在由成神经细胞瘤衍生出的细胞系中，由于基因扩增而导致ALK过表达以及组成型磷酸化)提出的那样，ALK信号传导可能在至少某些成神经细胞瘤中是重要的(Miyake 2002)。但是，其他由成神经细胞瘤衍生出的细胞系没有显示出ALK的组成型活化，由此对ALK的普通病理牵连产生争论(Dirks 2002，Pulford 2004)。
最有趣的是，ALK对于多形性成胶质细胞瘤的生长似乎是重要的，所述的多形性成胶质细胞瘤是一种高度恶性的脑肿瘤，对于该疾病，仅提出了极其有限的治疗选择(Powers 2002)。在这些破坏性的肿瘤中，已经显示出发生了多种基因改变，包括PTEN、p53和INK4a-ARF的缺失或突变。此外，RTK信号传导在所述这些肿瘤的生长和形成过程中起到了特别重要的作用，这种RTK信号传导使得诸如PDGF、HGF、NGF和VBGF之类的多种生长因子过表达，提示存在自分泌RTK信号传导环。Powers等人已经示出，在成胶质细胞瘤患者的肿瘤样品中存在ALK的mRNA和蛋白质表达，但在正常的邻近的脑组织中没有检测到所述的信号(Powers 2002)。此外，在异种移植物的研究中，人U87MG成胶质细胞瘤细胞(该细胞得自患者，并且代表了经良好表征的、用于研究成胶质细胞瘤中的肿瘤发生和信号传导的模型系统)显示出ALK依赖的抗凋亡行为。当通过使用核酶来排除所述肿瘤细胞中的ALK时，注入所述这些肿瘤细胞的小鼠存活的时间是注入野生型肿瘤细胞的小鼠的存活时间的至少2倍，并且所述这些肿瘤细胞显示出急剧加快的凋亡过程。因此，ALK及其配体提供了基本的生存信号，该生存信号用于对体内U87MG细胞的肿瘤生长进行限速(Powers 2002)。这些发现表明，对ALK信号传导进行抑制能够成为用于改善成胶质细胞瘤患者的预期寿命的有前途的方法。
多形性成胶质细胞瘤是到目前为止最常见且最恶性的原发性神经胶质肿瘤，其发生率为约2/100’000/y(在美国和西欧每年大约15′000例)。多形性成胶质细胞瘤最先影响大脑半球，而且还能影响脑干(主要见于儿童中)或脊髓。所述肿瘤可以从头(原发性成胶质细胞瘤)显现或者可以从低级星形细胞瘤(继发性成胶质细胞瘤)发展而来。原发性成胶质细胞瘤和继发性成胶质细胞瘤显示出很少的分子重复，并且在分子水平上构成了不同的疾病实体。它们都含有许多基因异常，包括p53、EGFR、MDM2、PDGF、PTEN、p16和RB的影响。
近25年来，没有取得明显的治疗进步。多种治疗方法仅仅起缓解作用，并可以将患者的预期寿命延长3个月至1年。患者通常呈现出进程缓慢的神经功能缺损(例如运动障碍)、以及颅内压症状(例如，头痛、恶心、呕吐、认知障碍或癫痫)。性格改变也可能是早期征兆。成胶质细胞瘤的病原学是未知的，家族性病例仅代表了不到1％的情况。所确定的唯一一致的危险因素是暴露于石化产品。其诊断主要通过成像研究(CT，NMR)和活组织检查来进行。将大多数的成胶质细胞瘤完全分期是不切实际的也是不可能的，这是因为这些肿瘤不具有被清楚定义的边界。更好的是，这些成胶质细胞瘤在发生局部入侵以及在沿着致密的脑白质途径扩散时呈现出熟知的趋势。不可能进行根治的主要原因是因为当这些肿瘤被诊断出来时其已经超出了进行局部控制的范围。主要的化学治疗剂为卡莫司汀(一种烷基化试剂)和顺铂，但是仅有40％的患者显示出一定程度的反应。
虽然关于ALK在成胶质细胞瘤中的作用具有相当的不确定性，但是这种疾病为定向于ALK的药物提供了不同的途径。事实上，对于这种破坏性的疾病，即使在当前的治疗选择中取得一小步的进步，也能够为大量的医疗需要提供服务。重要的是，应该注意由于成胶质细胞瘤细胞表达了全长的ALK，所以为了治疗这种癌症，ALK不仅可被认为是用于诱导肿瘤细胞凋亡的小分子的激酶抑制剂的靶物，而且被认为是用于诱导肿瘤细胞凋亡的抗体和/或抗体片段(例如，scFv)的靶物。如果成胶质细胞瘤能够被有效地传递到CNS中(由于区室化而使得成胶质细胞瘤没有被快速清除，此外，由于与IgG相比，成胶质细胞瘤的体积更小，使得肿瘤的渗透情况更好)，那么成胶质细胞瘤向CNS的精确定位便支持scFv的用途。抗体和/或抗体片段能够定向于ALK的配体结合序列(氨基酸396-406)，或者定向于受体胞外部分的其他部分。
ALK在处于生理条件下的健康组织中的非常有限的表达表明，不管ALK是否涉及这些肿瘤的发病机理，表达ALK的肿瘤都可能是使用放射性或毒素标记的抗体和/或抗体片段来对所述疾病进行治疗的优异的靶物。除了成胶质细胞瘤细胞外，已经在黑色素瘤细胞系和乳癌细胞系中发现了ALK(其没有被组成型磷酸化)的表达，这具有重大意义(Dirks 2002)。ALK胞外域的大部分在人类的蛋白质组中是相当独特的事实会使所述方法具有高度的特异性。
WO 9515331/US5529925公开了对人核酸序列的克隆和测序，其中所述人核酸序列在人t(2；5)淋巴瘤中发生的t(2；5)(p23；q35)染色体易位事件中被重排。发现，所述重排过程将位于染色体5q35上的核仁磷蛋白基因(NPM基因)序列重排到位于染色体2p23上的之前未确定的蛋白酪氨酸激酶基因(以下简称ALK基因)序列上。也公开了融合基因和融合蛋白(分别为NPM/ALK融合基因或融合蛋白)的序列。
全长的ALK序列在题为“Human ALK Protein Tyrosine Kinase”的US5770421中被授予专利权。此外，题为“Method of detecting achromosomal rearrangement involving a breakpoint in the ALK orNPM gene”的专利US6174674B1公开了用于检测患者样品中的NPM-ALK融合序列的引物。在另一份专利申请中，题为“ALK proteintyrosine kinase/receptor and ligands thereof”的US6696548公开了ALK用于检测ALK配体和与ALK的特定序列结合的抗体的用途。该专利文献还公开了鉴定能够与分离的ALK多肽相结合的试剂的方法。WO 0196394/US 20020034768公开了ALK作为多效生长因子的受体。US 20040234519公开了抗多效生长因子的抗体，WO2006020684描述了多效生长因子的检测。
发明内容
因此，本发明的总体目标是提供一种稳定且可溶的抗体或抗体衍生物，该抗体或抗体衍生物在体外和体内能够与人ALK蛋白质结合。最优选的是，所述抗体特异性地靶向ALK的配体结合结构域(氨基酸396-406)，因此将阻断MK(其与ALK的Kd为约170pM)的生物学作用和PTN(其与ALK的Kd为约20-30pM)的生物学作用(Stoica 2002，Stoica 2001)。在优选的实施方案中，所述抗体或抗体片段为scFv抗体或Fab片段。在下文中，术语抗体包括全长的抗体以及其他抗体衍生物。
目前，为了实现上述目标以及本发明的其他目标(这些目标将随着描述的进行而更容易变得显而易见)，所述抗体可通过以下特征来表征：所述抗体包含其序列与序列SEQ.ID.No.2具有至少50％的一致性的可变的重链CDR3。优选的是，所述的序列的一致性为至少60％、65％、75％和85％，或者更优选的为至少92％。最优选的是，所述的抗体具有序列SEQ.ID.No.2所示的VH CDR3.
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分特异性地与ALK蛋白质的独特的抗原表位结合。所述抗原表位位于ALK蛋白质的氨基酸(例如)1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500或1500-1620之间，或者在其任何间隔的部分或范围内。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原的结合部分特异性地与抗原表位结合，其中所述抗原表位包含跨越ALK蛋白质(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基391±3和406±3(SEQ.ID No：91，示出了人ALK蛋白质的氨基酸残基388-409)的、优选为跨越氨基酸残基391-406(SEQ ID NO：1)的区域；或者基本上由跨越ALK蛋白质(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基391±3和406±3(SEQ.ID No：91，示出了人ALK蛋白质的氨基酸残基388-409)的、优选为跨越氨基酸残基391-406(SEQ ID NO：1)的区域构成；或者为跨越ALK蛋白质(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基391±3和406±3(SEQ.ID No：91，示出了人ALK蛋白质的氨基酸残基388-409)的、优选为跨越氨基酸残基391-406(SEQ ID NO：1)的区域的片段。应该理解的是，所示出的范围不应该被认为是明确的界限，而应该被认为所述的抗体或其抗原结合部分可以结合或部分结合在与ALK的配体结合结构域邻近的区域内或在ALK的配体结合结构域内。优选的是，所述抗体或抗体衍生物与ALK蛋白质的、长度为10至20个氨基酸的抗原表位结合。
在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分可以表征为以小于约10 x 10-6M的KD与ALK蛋白质特异性地结合。在一个独特的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分以至少为约10 x 10-7M、至少为约10 x 10-8M、至少为约10 x 10-9M、至少为约10 x 10-10M、至少为约10 x 10-11M、或至少为约10 x 10-12M，或者甚至更为有利的KD与ALK蛋白质(或其片段)特异性地结合。
在多种其他实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分包含这样的可变的重链区域，该可变的重链区域包含与在SEQ ID NO：4中所列出的可变的重链区域的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％，或者更优选具有至少99％的一致性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分包含这样的可变的轻链区域，该可变的轻链区域包含与在SEQ ID NO：5中所列出的可变的轻链区域的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％，或者更优选具有至少99％的一致性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分既包含可变的重链区域又包含可变的轻链区域，其中所述的可变的重链区域包含与在SEQ ID NO：4中所列出的可变的重链区域的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或98％，或者更优选具有至少99％的一致性的氨基酸序列；所述的可变的轻链区域含有包含与在SEQ ID NO：5中所列出的可变的轻链的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或98％，或者更优选具有至少99％的一致性的氨基酸序列。
在某些其他实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分特异性地与抗原表位结合，其中所述的抗原表位与被ESBA521(Seq.ID.No.19)抗体或抗体衍生物结合的抗原表位相重叠，和/或所述的抗体或其抗原结合部分与ESBA521抗体或抗体衍生物竞争结合ALK蛋白质或其一部分。在相关的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分特异性地与抗原表位结合，其中所述的抗原表位含有ALK蛋白质的残基391-406(SEQ ID NO：1)，或ALK蛋白质的一部分。
所述抗体或其抗原结合部分的可变的重链和轻链区域通常含有一个或多个互补性决定区(CDR)。这些互补性决定区包括CDR1、CDR2和CDR3区域。在独特的实施方案中，所述的可变的重链CDR与ESBA521抗体的CDR具有至少80％、85％、90％、95％，或更优选具有100％的一致性。在其他独特的实施方案中，可变的轻链CDR与ESBA521抗体的可变的轻链区域的CDR具有至少80％、85％、90％、95％，或更优选具有100％的一致性。
因此，本发明的独特的抗体或其片段含有：可变的重链区域，其含有与ESBA521的可变的重链区域的CDR具有至少80％、85％、90％和95％，或更优选具有100％的一致性的一个或多个互补性决定区(CDR)；可变的轻链区域，其含有与ESBA521抗体的可变的轻链区域的CDR具有至少80％、85％、90％、95％，或更优选具有100％的一致性的一个或多个CDR。
所述的抗体或其抗原结合部分的可变的重链区域还可以含有与ESBA521抗体的可变的重链区域的CDR具有至少80％、85％、90％和95％，或更优选具有100％的一致性的所有3个CDR；和/或与ESBA521抗体的可变的轻链区域的CDR具有至少80％、85％、90％、95％，或更优选具有100％的一致性的所有3个CDR。
在本发明的另一个实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分含有(a)由人VH基因(例如，H3类型)编码或得到(即，基因的产物)的重链可变区；和/或含有(b)由人Vκ或λ基因(例如，γ型)编码或得到的轻链可变区。
本发明的抗体包括全长的抗体(例如，单克隆抗体，其含有效应结构域(例如，Fc结构域))以及抗体部分或其片段(例如单链抗体和Fab片段)。所述抗体还可以与多种治疗剂(例如，抗癌剂、化疗剂或毒素)和/或标记(例如，放射性标记)连接。
在另一个方面中，本发明的特征在于这样的分离的核酸，该核酸含有编码与SEQ ID NO：22具有至少75％、80％、85％、90％、95％，或更优选具有至少99％的一致性的抗体重链可变区的序列。本发明的特征还在于这样的分离的核酸，该核酸含有编码与SEQ ID NO：21具有至少75％、80％、85％、90％和95％，或更优选具有至少99％的一致性的抗体轻链可变区的序列。
本发明的特征还在于表达载体，该表达载体包括之前所述的单独的核酸或者这些核酸的组合(例如，由1个载体或多个载体表达)中的任何一种形式，以及含有所述这些表达载体的宿主细胞。
用于表达本发明的抗体的合适的宿主细胞包括多种真核细胞(例如，酵母细胞)、哺乳动物的细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞和骨髓瘤细胞)或植物细胞。本发明的分子还可以在原核细胞(例如，E.coli)中表达出来。
本发明的特征还在于用于通过在宿主细胞中使编码抗体的核酸(例如，编码抗体的抗原结合部分的核酸)表达来制备所述抗体或其抗原结合部分的方法。在另一方面中，本发明的特征在于含有上文所述核酸的杂交瘤或转染瘤。
在另一实施方案中，本发明提供了这样的抗原，该抗原含有ALK蛋白质的抗原表位，优选PTN配体结合结构域，更优选包含跨越氨基酸残基391±3和406±3(见SEQ ID NO：91，显示人ALK蛋白的氨基酸残基388-409)最优选氨基酸391-406(SEQ ID NO：1)的区域的片段；或基本上由跨越氨基酸残基391±3和406±3(见SEQ ID NO：91，显示人ALK蛋白的氨基酸残基388-409)最优选氨基酸391-406(SEQ ID NO：1)的区域构成的片段；或为跨越氨基酸残基391±3和406±3(见SEQ ID NO：91，显示人ALK蛋白的氨基酸残基388-409)最优选氨基酸391-406(SEQ ID NO：1)的区域的片段的片段。所述抗原可用于引起抗ALK的抗体的产生、对抗ALK的抗体进行筛选或对抗ALK的抗体的存在情况进行检测，或者可以在主动免疫治疗中用作试剂，即，用作疫苗。
所述抗原可以作为疫苗单独使用或者与合适的佐剂或半抗原组合(例如，混合的或以化学或基因工程方法接合的)使用。当将所述抗原用于主动免疫治疗时，该抗原还可以与被动免疫治疗组合(例如，与本文所公开的任何抗ALK的抗体组合)使用，或者与抗ALK的抗体的单克隆或多克隆制剂(例如，得自血清反应阳性供应者的血清丙种球蛋白)组合使用。
在另一实施方案中，所述的抗体分子(或VL和VH的结合结构域)是完全人源的。使用人单克隆抗体对人进行治疗具有许多优点。例如，所述抗体在人体中可能要比非人源抗体在人体中具有更小的免疫原性。所述的治疗方法还是快速的，这是因为一旦所述抗体到达癌症位点(在该位点处，ALK被表达出来)，可发生ALK失活。因此，在相关的实施方案中，所述抗体为scFv抗体(即，ESBA521)，或含有ESBA521的VL和/或VH区域(或其CDR，例如，VL CDR3(SEQID NO：3)和/或VH CDR3(SEQ ID NO：2))的抗体。
与非人抗体相比，人抗体在人体中还可以更有效地定位于合适的位点。此外，所述治疗剂是特异性地针对ALK的，是经过重组及高度纯化，与传统的治疗不同，所述治疗剂能够避免被外来试剂污染的可能。可供选用的是，本发明的抗体和抗体衍生物可以通过化学合成方法制备。
在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症(或是用于制备起所述作用的药物)的组合物，该组合物通过与诸如中期因子(MK)和/或多效生长因子(PTN)之类的ALK配体竞争并由此阻断由所述配体介导的ALK信号传导来预防受试者的瘤形成。所述组合物可单独给药，或者与本领域认可的抗癌剂(例如，甲氨蝶呤等)组合给药。
本发明的抗体和/或ALK疫苗可单独使用或者与已知的治疗剂(例如，抗癌剂，如氨甲蝶呤等)组合使用。
本发明的其他特征和优点将通过以下的发明详述和权利要求而变得显而易见。
附图简要说明
在思考了下文给出的发明详述后，将会更好地理解本发明，并且除了上文列出的目标以外的其他目标也将变得显而易见。所述的发明详述参考了附图，其中：
图1示出了所用的人ALK蛋白质的图。PTN结合位点(虚线所示)的16个氨基酸肽在用于scFv结合体的双杂交筛选中被用作抗原表位。
图2示出了为了获得作为第二结合体的ESBA521和作为第三结合体的一组scFv而对VH CDR3、VL CDR3和VH CDR2部分所进行的逐步随机化(参见表1)。X代表任意的氨基酸残基。
图3示出了ELISA实验，其中将经改良的scFv的结合特征与它们所发源而来的框架的结合特征做比较。
图4示出了用ESBA521(左图)和多克隆ALK特异性抗体(右图)瞬时转染的HeLa细胞的免疫染色图。中图：光学显微镜下的同一细胞。
图5示出了将ESBA521与经改良的第三结合体相比较的ELISA实验。
发明详述
为了可以更容易地理解本发明，首先定义一些术语。
定义
术语“ALK”和“Alk-1”包括由ALK(间变性淋巴瘤激酶)基因编码的人ALK蛋白质，该蛋白质为跨膜蛋白酪氨酸激酶(PTK)/受体。
术语“抗体”是指全抗体和任意的抗原结合片段(即，“抗原结合部分”、“抗原结合多肽”或“免疫结合体”)或其单链。“抗体”是指包含由二硫键相连接的至少2条重链(H)和2条轻链(L)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链都由重链可变区(在本文中简写为VH)和重链恒定区。重链恒定区由3个结构域构成，分别为CH1、CH2和CH3。每条轻链都由轻链可变区(在本文中简写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区由1个结构域构成，其为CL。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补性决定区(CDR)的高变区，该高变区分散在更保守的被称为框架区(FR)的区域中。每条VH和VL都由3个CDR和4个FR构成，并从氨基末端向羧基末端按照以下的次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区都含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主的组织或因子的结合，其中所述的宿主的组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一成分(Clq)。
术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指一个或多个保持了与抗原(例如，ALK)的特异性结合能力的抗体片段。已经表明，全长抗体的片段可执行抗体的抗原结合功能。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”范围内的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域构成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，其为包含由二硫键在铰链区连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域构成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂上的VL和VH结构域构成；(v)单个结构域或dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域构成；以及(vi)分离的互补性决定区(CDR)或(vii)可以可选地由合成的连接子连接的2个或多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的2个结构域(VL和VH)由单独的基因所编码，但是可以采用重组方法通过合成的连接子将它们连接起来，其中所述的合成的连接子能够将所述的2个结构域被制备成单一一条蛋白质链，在该蛋白质链中，VL和VH区成对，从而形成单价分子(已知为单链Fv(scFv)；例如参见Bird et al.(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。认为，这种单链抗体也被涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中。可以采用本领域的技术人员已知的常规技术来获得上述这些抗体的片段，并且与完整的抗体相同的方式对这些片段进行筛选来以进行利用。可以通过重组DNA技术或对完整的免疫球蛋白进行酶切或化学裂解来制备抗原结合部分。抗体可以是不同型的，例如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。
术语“框架”是指本领域的技术人员所公认的存在于更加趋异的CDR区域之间的抗体可变区的部分。所述的框架区域通常是指框架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)，并且在三维空间中提供了用于支持在重链或轻链抗体可变区中发现的3个CDR的支架结构，这样CDR能够形成抗原结合表面。当这种框架提供了用于呈递更加趋异的CDR的支持时，其还可以被称为支架。诸如锚蛋白重复序列和纤连蛋白之类的免疫球蛋白超家族的其他CDR和框架也可以用作抗原结合分子(还可参见例如美国专利No.6,300,064和6,815,540，以及美国专利公开No.20040132028)。
术语“抗原表位”或“抗原决定簇”是指在抗原上免疫球蛋白或抗体特异性地结合的位点(例如，ALK，如人ALK-1的氨基酸残基391-406(参见例如SEQ ID NO：1))。抗原表位在独特的空间构象中通常包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。例如参见Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特定地结合”是指抗体与预定抗原上的抗原表位结合。通常，抗体以大约小于10-7M(例如大约小于10-8M、10-9M或10-10M，或者更小)的亲和力(KD)结合。
术语“KD”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于约10-7M(例如小于约10-8M、10-9M或10-10M，或者更小)的解离平衡常数(KD)来与ALK结合，其中所述的解离平衡常数可以利用(例如)表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE装置中测定。
术语“中和ALK”、“抑制ALK”和“阻断ALK”可互换使用，这些术语是指本发明的抗体防止ALK与1种或多种目标配体相互作用的能力以及(例如)防止ALK引发信号转导的能力。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选双链DNA。当核酸与另一核酸序列处于功能关系中时，所述核酸可被“可操作地连接”。例如，当启动子或增强子影响编码序列的转录时，其使启动子或增强子与所述序列可操作地连接。
就核酸而言，术语“基本同源”是指当将2段核酸或其指定的序列进行最佳比对和对比时，这2段核酸或其指定的序列都具有适当的核苷酸插入或缺失，并且它们的核苷酸的一致性至少为约80％、通常至少为约90％至95％、更优选至少为约98％至99.5％。可供选用的其他方式是，当所述片段在选择性杂交条件下与互补链发生杂交时，则存在基本的同源性。所述的杂交条件是本领域已知的，并且在(例如)Sam-book等人的文献中有所描述，参见下文。
考虑到为了对2条序列进行最佳比对而需要引入的间隙的数量以及每个间隙的长度，则2条序列之间所达到的一致性的百分比为相同位置被所述的2条序列所共有的数量的函数。可以采用数学算法来进行序列的对比和2条序列之间所达到的一致性的百分比的确定，这将在下文的非限定性实施例中进行描述。
利用NWSgapdna.CMP矩阵，以及为40、50、60、70或80的间隙权值和为1、2、3、4、5或6的长度权值，利用GCG软件包中的GAP程序，可以确定2条核苷酸序列之间所达到的一致性的百分比。此外，还可以利用被引入到ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法，再利用PAM120残基权值表(weight residue table)并采用间隙长度罚12分、间隙罚4分，来确定2条核苷酸或核酸序列之间所达到的一致性的百分比。此外，可以利用被并入GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法，再利用Blossum62矩阵或PAM250矩阵并采用为16、14、12、10、8、6或4的间隙权值以及为1、2、3、4、5或6的长度权值，来确定2条氨基酸序列之间所达到的一致性的百分比。
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，从而对照公共数据库进行搜索，以便(例如)识别相关序列。可以利用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行所述的搜索。可以使用NBLAST程序、分值＝100且字长＝12来进行BLAST核苷酸搜索，从而得到与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序、分值＝50且字长＝3来进行BLAST蛋白质搜索，从而得到与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了得到带有间隙的比对以用于进行对比，按照Altschul等人的(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述的方式来使用GappedBLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
本发明还涵盖了在本发明的SEQ ID NO中列出序列的“保守序列的修改序列”，即，核苷酸和氨基酸序列的修改序列，该修改序列没有消除由所述的核苷酸序列编码或含有所述氨基酸序列的抗体与抗原的结合能力。所述的这种保守序列的修改序列包括核苷酸和氨基酸的取代、加入和删除。例如，所述的修改序列可以通过诸如定点突变和PCR介导的突变之类的本领域已知的标准技术来引入。保守的氨基酸的取代包括这样的取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替。在本领域中，已经对具有相似侧链的氨基酸残基家族做出定义。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β侧枝的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选的是，人抗ALK的抗体中的预知的非必须氨基酸残基被来自具有相同侧链家族的另一氨基酸残基所代替。用于鉴别其不会消除抗原结合能力的核苷酸和氨基酸保守取代基的方法是本领域的技术人员所公知的(例如参见：Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人.Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417(1997))。
可供选用的其他方式是，在另一实施方案中，(例如)通过饱和诱变方法沿着抗ALK的抗体的编码序列的全长或一部分随机引入突变，并且可以对所得的经修饰的抗ALK的抗体的结合活性进行筛选。“共有序列”是指由相关序列的家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)所形成的序列(例如参见：Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987))。在蛋白质家族中，共有序列中的每个位点都由所述家族中该位点处最频繁出现的氨基酸所占据。如果2个氨基酸出现的频率相等，则任何1个氨基酸都可以被包含在所述的共有序列中。
通过参考本文所提供的表格和附图，可以通过对所述抗体的可变区CDR的氨基酸序列进行优化比对来得到所述抗体的重链/轻链可变区CDR的共有序列，其中所述抗体对人ALK-1蛋白质的氨基酸390-406的抗原表位具有反应性。
术语“载体”是指能够对与其连接的另一段核酸进行转运的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，其是指其中可以连接有其他DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体为病毒载体，其中其他DNA片段可以被连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入的宿主细胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)中自主复制。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以通过在引入到宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，并由此随着宿主基因组进行复制。
术语“宿主细胞”是指其中已经引入了表达载体的细胞。宿主细胞可以包括细菌、微生物、植物或动物细胞。容易进行转化的细菌包括：肠杆菌科(enterobacteriaceae)中的成员，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株或沙门氏菌(Salmonella)菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)中的成员，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)；以及流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。合适的微生物包括酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)。合适的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
术语“治疗”是指本文所述的治疗或预防措施。为了预防和治疗由ALK介导的紊乱、或延缓和减轻由ALK介导的紊乱的严重程度，或者改善由ALK介导的紊乱的一种或多种症状或改善这种复发的紊乱，或者为了将受试者的生命延长至在没有进行治疗时所期望的时间，“治疗”的方法采用了向受试者实施本发明的抗体，其中所述的受试者需要进行上述治疗，并且所述的受试者是例如有患有ALK介导的紊乱的受试者或最终可能会患有这种紊乱的受试者。
术语“ALK介导的紊乱”是指与ALK介导的癌症或肿瘤有关的疾病状态和/或症状。术语“ALK介导的紊乱”一般是指需要ALK参与的任何紊乱，以及需要ALK参与的症状的发生、进行或持续。示例性的ALK介导的紊乱包括(但不限于)(例如)癌症，特别是成胶质细胞瘤。
术语“有效剂量”是指足以取得或至少部分取得所需效果的量。术语“治疗有效剂量”被定义为足以治愈或至少部分抑制所述疾病，以及足以治愈或至少部分抑制已经患有所述疾病的患者的并发症。用于所述用途的有效量将取决于所述的待治疗的紊乱的严重程度，以及患者本身的免疫系统的总体状态。
术语“受试者”是指任何人或非人的动物。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗患有癌症(例如，成胶质细胞瘤)的受试者。
除非另作说明，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都与本发明所属技术领域的任一普通技术人员通常所理解的意义相同。虽然在实施本发明或对本发明进行检验的过程中可以使用与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但是在下文中对合适的方法和材料还有所描述。在发生分歧的情况下，将以本说明书(包括定义)为主。此外，材料、方法和实施例仅是示例性的，并且无意于限定本发明。
在以下部分中将进一步详细地描述本发明的各个方面。应该理解的是，各种实施方案、优选条件和范围可以随意结合。此外，根据具体的实施方案，可以不使用所选的定义、实施方案或范围。
在第一方面中，本发明提供了一种与人ALK蛋白质结合的抗体，所述抗体包含其序列与SEQ.ID.No.2所示的序列具有至少50％的序列一致性的可变重链CDR3。优选的是，所述的序列一致性为至少60％、70％、75％、80％，或者更优选的为至少90％。最优选的是，CDR3就具有SEQ.ID.No.2所示的序列。
在本发明的优选的实施方案中，所述抗体特异性地与人ALK蛋白质结合，即，该抗体不与小鼠ALK蛋白质结合，其中与人ALK蛋白质的PTN结合位点(SEQ.ID.No.1)相比，小鼠的ALK蛋白质的PTN结合位点只有2个氨基酸残基不同。在位置3处，人为异亮氨酸，而在相应的小鼠序列中，位置3为缬氨酸；而在人为天冬氨酸的相应位置小鼠序列为丙氨酸。
本发明的抗体可以为全长的抗体，但也可以为抗体片段，例如scFv或Fab片段。抗原结合片段是本领域公知的。优选使用scFv抗体。
所述的重链和轻链由框架序列构成，每个框架序列都包含3个CDR，分别是CDR1、CDR2和CDR3，它们主要涉及抗原结合。本发明的抗体包含H3类型的VH结构域和λ类型的VL结构域。
本发明抗体的VH和VL框架是稳定的并且是可溶的，从而在细胞内的还原环境中是具有功能的。所述的框架优选为之前已经通过被称为“质量控制系统”的酵母筛选系统分离出来的框架4.4.(Auf derMaur et al.，2001；Auf der Maur et al.2004)。所述框架的序列可以由(例如)SEQ.ID.No.20(参见下文)推出，其中所述的框架部分由无下划线的并且是正体字母表示，而所述的CDR序列具有下划线，并且连接序列为斜体字。
本发明的抗体能够与具有16个氨基酸的ALK抗原表位肽结合，其中所述具有16个氨基酸的ALK抗原表位肽与SEQ.ID.No.1所示的序列具有至少75％、优选80％、85％、90％、95％，或更优选的100％的一致性。该序列还被称为PTN结合位点，并且在整个人基因组中是特有序列。在相应的小鼠的序列中，16个氨基酸中有2个氨基酸发生变化，即，即在位置3V代替I，且在位置7的A代替D。本发明的抗体优选与人ALK结合，但不与小鼠ALK结合，即，本发明的抗体对人的蛋白质具有特异性。含有约残基391-406或者由残基391-406构成的ALK抗原表位特别适用于选择抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够特异性地与ALK结合，并且阻断或抑制ALK介导的活性。所述的抗原表位还适用于筛选或产生特异性地阻断ALK活性的抗体。因此，此抗原表位，特别是含有约残基391-406或者由残基391-406构成的抗原表位，特别适用于作为主动免疫治疗剂或疫苗，这将在本文中进一步说明。
本发明的抗体与ALK抗原表位肽具有Kd为30nM或更小，优选为10nM或更小，最优选为小于3nM的亲和力。
在本发明的另一实施方案中，所述抗体含有其序列与SEQ.ID.No.3所示的序列具有至少50％的序列一致性的可变轻链CDR3。优选的是，所述的序列一致性为至少60％、70％、80％、85％，更优选至少为90％。最优选的是，CDR3与SEQ.ID.No.3一致。此外，所述抗体能够与具有16个氨基酸的ALK抗原表位肽结合，其中所述具有16个氨基酸的ALK抗原表位肽与SEQ.ID.No.1所示的序列具有至少75％、优选80％、85％、90％、95％，或最优选的100％的氨基酸一致性。此外，所述抗体与ALK抗原表位肽具有Kd小于10nM，优选小于7nM的亲和力。
在本发明优选的实施方案中，所述抗体含有如SEQ.ID.No.4所示的VH序列和如SEQ.ID.No.5所示的VL序列。此外，所述抗体在至少1个CDR中可以具有至少1个突变，由此产生更高的亲和力，该亲和力可表征为Kd小于约3nM。所述的至少1个突变优选存在于VH和/或VL的CDR1或CDR2中，最优选存在于VH的CDR2中。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗体含有可变的重链CDR2，其含有选自SEQ.ID.No.7、SEQ.ID.No.8、SEQ.ID.No.9、SEQ.ID.No.10、SEQ.ID.No.11、SEQ.ID.No.12、或SEQ.ID.No.13中的序列。如此定义的CDR2序列优选在氨基酸残基AI之后，在如SEQ.ID.No.17所示的序列之前，这样定义出完整的CDR2。
本发明的优选抗体含有SEQ.ID.No.4所示的VH序列以及SEQ.ID.No.5所示的VL序列。在scFV抗体中，所述结构域的结构可以是NH2-VL-连接子-VH-COOH或NH2-VH-连接子-VL-COOH；优选的是，所述连接子具有序列SEQ.ID.No.16。可供选用的其他方式是，由SEQ ID NOS：4和5所示的可变区可以采用基因工程的方法整合到诸如IgG或IgM之类的全长抗体中。适用于与本发明的可变区结合的恒定区是本领域已知的。
所述抗体或抗体衍生物作为药物或作为诊断工具的用途也在本发明的范围内。优选包含用于治疗癌症或肿瘤的药物的制备进行设想。为了达到这一目的，将抗体采用放射性核素或放电金属标记法来进行放射性标记。这对于肿瘤靶向、成像以及生物分布研究是特别有价值的。此外，重组DNA技术使得将可变V基因的编码区基因融合到经修饰的毒素结构域中成为可能。例如，scFv-毒素融合蛋白(其中scFv对肿瘤标志物蛋白是特异性的)可以使毒素靶向肿瘤，其中所述毒素会引起细胞毒性。这种靶向性的治疗可以对肿瘤中的细胞毒性剂或放射性核素的浓度进行选择，从而能够减轻对正常组织产生的毒性。
在本发明的优选实施方案中，所述抗体用于治疗癌症或肿瘤，优选用于治疗成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、横纹肌肉瘤、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、B细胞非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、前列腺癌、结肠癌、或胰腺癌，优选用于治疗成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤和横纹肌肉瘤。在许多软组织肿瘤中，已经检测到ALK的表达以及ALK蛋白质(Li等人，2004)。已经在所述这些人类肿瘤中发现了全长的ALK。此外，所述抗体优选用于局部治疗。最优选用于成胶质细胞瘤的局部治疗。
本发明的另一方面提供了编码本发明抗体的DNA序列。用于ESBA512(SEQ.ID.No：19)的合适的原核表达载体为pTFT74(参见SEQ.ID.No：90，其为含有ESBA512编码序列的序列)。其中，ESBA512编码序列处于T7启动子的控制之下，并且所得的重组基因产物通常通过包涵体进行纯化。另一优选的原核表达载体为pAK400，其中ESBA512序列为his-标签的，以用于简化的纯化(参见SEQ.ID.No：89，其为含有ESBA512编码序列的序列)。该基因产物被宿主细胞分泌到外周胞质中。
此外，本发明提供了含有所述DNA序列的表达载体以及用所述表达载体转化的合适的宿主细胞。优选的是，所述宿主细胞为E.coli细胞。
本发明的另一方面为本发明抗体的制备方法，该方法包括：在允许合成所述抗体的条件下，对所述宿主细胞进行培养，其中所述的宿主细胞被用于所述抗体的表达载体所转化；以及从所得培养物中回收所述的抗体。
本发明的另一方面提供了ALK的抗原表位，其基本上含有如SEQID NO：1所示的残基391-406，或基本上由SEQ ID NO：1所示的残基391-406组成。所述的抗原表位适用于鉴定、筛选或产生抗ALK的抗体或其片段。优选的是，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地与分离的ALK蛋白质或其片段的残基391-406(SEQ ID No：1)结合。更优选的是，所述抗体为单链抗体(scFv)、Fab片段、IgG或IgM。
在另一方面中，本发明提供了ALK疫苗，其含有分离的ALK蛋白质或其片段、或者编码ALK的抗原表位的核酸。优选的是，所述疫苗含有分离的ALK蛋白质的残基391-406。所述疫苗优选与载体、佐剂和/或半抗原配制形成，以增强免疫应答。
本发明的序列如下所示：
SEQ.ID.No.1：GRIGRPDNPFRVALEY
人ALK抗原表位肽(所述ALK蛋白质的氨基酸391-406)；带有下划线的残基为小鼠同源序列中不同的氨基酸残基。
SEQ.ID.No.2：RDAWLDVLSDGFDY
VH的ESBA521 CDR3。带有下划线的残基为经过随机化后所得的残基。
SEQ.ID.No.3：ATWDNDKWGVV
VL的ESBA521 CDR3。带有下划线的残基为经过随机化后所得的残基。
SEQ.ID.No.4：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGS
TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAWLDVLSDGFDYWGQ
GTLVTVSS
ESBA521的VH。带有下划线的为CDR。
SEQ.ID.No.5：
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPS
GIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCATWDNDKWGVVFGGGTKLEVLG
ESBA521的VL。带有下划线的为CDR。
SEQ.ID.No.6：
AISGSGGSTYYADSVKG
ESBA521的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.7：
AINMKGNDRYYADSVGK
scFv 265.1的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.8：
AIRTNSKEYYADSVKG
scFv43.2的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.9
AIKTDGNHKYYADSVKG
scFv 100.2的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.10：
RTDSKEQYYADSVKG
scFv 2.11的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.11：
ETSSGSTYYADSVKG
scFv 28.11的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.12：
NTGGGSTYYADSVKG
scFv 33.11的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.13：
NTRGQNEYYADSVKG
scFv 4.12的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.16
GGGGSGGGGSGGGGSSGGGS
连接VL和VH的连接子
SEQ.ID.No.17
YYADSVKG.
ESBA521及其衍生物的CDR2的C-末端部分。
SEQ.ID.No.18
DAGIAVAGTGFDY
FW4.4的VH CDR3
SEQ.ID.No.19
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPS
GIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCATWDNDKWGVVFGGGTKLEVLGGGG
GSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA
PGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RDAWLDVLSDGFDYWGQGTLVTVSS
scFv ESBA521，带有下划线的是CDR，斜体的部分为连接子。
SEQ.ID.No.20
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPS
GIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSGVVFGGGTKLTVLGGGG
GSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA
PGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RDAGIAVAGTGFDYWGQGTLVTVSS
FW4.4，带有下划线的是CDR，斜体的部分为连接子。
SEQ ID No.21
cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccagga
cagaaggtcaccatctcctgctccggaagcacctccaacattggcgataattatgta
tcctggtaccaacaactcccaggaacagccccccaactcctcatttatgacaatact
aaacgaccctcagggattcctgaccggttctctggctccaagtctggcacgtcagcc
accctgggcatcaccggactccagactggggacgaggccgattattactgcgcgacc
tgggataatgataagtggggtgtggttttcggcggagggaccaagctcgaggtcc-
taggt
ESBA521 VL的核酸序列。
带有下划线的为CDR。
SEQ ID No.22
gaggtgcagctggtggagtccgggggaggcttggtacagcctggg
gggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatg
agctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggt
agtggtggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccaga
gacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacg
gccgtatattactgcgcgcgtgatgcgtggttggatgtgctttcggatggctttgac
tactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg
ESBA521 VH的核酸序列。
带有下划线的为CDR。
SEQ ID No.23
cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccagga
cagaaggtcaccatctcctgctccggaagcacctccaacattggcgataattatgta
tcctggtaccaacaactcccaggaacagccccccaactcctcatttatgacaatact
aaacgaccctcagggattcctgaccggttctctggctccaagtctggcacgtcagcc
accctgggcatcaccggactccagactggggacgaggccgattattactgcgcgacc
tgggataatgataagtggggtgtggttttcggcggagggaccaagctcgaggtccta
ggtggtggtggtggttctggtggtggtggttctggcggcggcggctccagtggtggt
ggatccgaggtgcagctggtggagtccgggggaggcttggtacagcctggggggtcc
ctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgg
gtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggt
ggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaat
tccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgta
tattactgcgcgcgtgatgcgtggttggatgtgctttcggatggctttgactactgg
ggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg
ESBA521的核酸序列。
带有下划线的为CDR，斜体的部分为连接子。
现在通过实施例来进一步描述本发明。
材料和方法
总体而言，除非另作说明，否则本发明的实施过程采用了化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫(特别是例如抗体技术)和多肽制备中的标准技术的常规技术。例如，参见Sambrook、Fritsch和Maniatis的《Molecular Cloning》：Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；Antibody Engineering Protocols(分子生物学方法)，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A PracticalApproach(实施方法系列，169)，McCafferty，Ed.，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow et al.，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；以及Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel et al.，John Wiley & Sons(1992)。
实验1：进行筛选以鉴定出与ALK结合的scFv
在对抗体-抗原相互作用的大量结构研究中，发现，重链的互补性决定区3(CDR-H3)中的残基通常与抗原发生最实质性的接触(Chothia and Lesk，1987；Chothia et al.，1985；Padlan，1994)。我们采用我们最近描述过的酵母双杂交抗原-抗体相互作用筛选技术，通过筛选随机合成的CDR-H3序列的4个scFv文库来直接分离与抗原结合的scFv(Auf der Maur et al.，2002)。所述的4个文库基于4种不同的、稳定的人scFv框架，其中可变重链的第3个CDR(VH-CDR3)环中的7个氨基酸是随机化的。通过标准的PCR克隆技术引入随机化的部分。采用被称为“质量控制”的酵母筛选系统，针对由人酪氨酸受体激酶间变性淋巴瘤激酶(ALK)的胞外结构域衍生的含有16个氨基酸的肽来筛选scFv文库(Auf der Maur等人.，2001；Auf der Maur等人.，2004)。简言之，所述的质量控制技术是用于从人可变轻链(VL)和可变重链(VH)的天然集合物中鉴定具有有利的生物物理学性质的(例如，稳定性、可溶性和表达产率)VL和VH组合的抗原依赖性胞内抗体选择系统。在经过第1次筛选循环之后，从所述的4种scFv文库之一分离出一种有希望的特异性结合体。这种特别的scFv衍生自框架FW4.4文库。FW4.4(SEQ.ID.No.20)由VL结构域(λ)通过传统的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子(GGGGS)4与VH3结构域连接而成。FW4.4的VH CDR3包含13个氨基酸(DAGIAVAGTGFDY；SEQ.ID.NO.18)。为了构建所述的文库，VH CDR3的中心部分(DAXXXXXXXGFDY)是通过标准的PCR克隆方法使用简并寡核苷酸而随机构成的。最后的2个残基(Asp和Tyr)保持不变，这是因为在许多情况中已经证实了这2个残基在结构上的重要性(Chothiaand Lesk，1987)。其余残基没有被修饰，以将文库的复杂性保持在可控的范围内。将scFv文库作为融合到Gal4的转录活化结构域的C末端克隆到酵母表达载体(pLibl)中(Auf der Maur et al.，2002)。
选择人AlK的配体结合结构域(LBD)作为所述的相互作用的筛选中的抗原(Stoica et al.，2001)。将该含有16个氨基酸的肽作为融合到DNA结合蛋白LexA的C末端克隆到另一酵母表达载体(pBait1)中。
使用表达与LexA融合的AlK LBD以及与Gal4活化结构域融合的随机化CDR-H3 scFv文库的诱饵载体来转化报告酵母菌株YDE173，该报告酵母菌株YDE173含有处于6个LexA结合位点控制下的、稳定整合的报告基因HIS3和lacZ(Auf der Maur et al.，2002)。在不含有组氨酸但含有2.5mM的3-氨基三唑(3-AT)的平板上选择转化细胞，其中所述的3-氨基三唑是HIS3基因产物的竞争性抑制剂。经过6天，挑出生长克隆，并分离文库质粒。用回收的质粒转化相同的报告菌株，从而证实了抗原依赖性的基因活化。进行液态β-半乳糖苷酶的定量检测，以测量AlK LBD(即，16个氨基酸的ALK肽)与所选的scFv之间的结合强度。并且在ELISA中scFv具有报告基因的最大活化也证实了对AlK LBD肽的最大亲和力(-31nM)(数据未示出)。
在下表1a中，提供了被确定为有助于ALK结合的其他VH CDR3序列的序列。
| 克隆 | VH CDR 3(突变残基) |
| WT FW 4.4 | DAGIAVAGTGFDY(SEQ.ID.No.24) |
| H5 SH 2.1 | DAKFMSDGIGFDY(SEQ.ID.No.25) |
| H5 SH 4.1 | DAWGWTILSGFDY(SEQ.ID.No.26) |
| H5 SH 5.1 | DAAYMIRYEGFDY(SEQ.ID.No.27) |
| H5 SH 2.3 | DAWIYWAREGFDY(SEQ.ID.No.28) |
| H5 SH 3.3 | DACMTYSREGFDY(SEQ.ID.No.29) |
| H5 SH 5.3 | DAWLDVLBDGFDY(SEQ.ID.No.30) |
| H5 SH 14.3 | DAPSVNDREGFDY(SEQ.ID.No.31) |
在下表1b中，提供了其他合适的框架的序列。
| FW | 序列 |
| 5.2 | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTLTHYLAWYQQKPGQAPRLLIYDTSKRATGTPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDSALYYCQQRNSWPHTFGGGTKLEIKRGGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGVAQPGGSLRVSCAASGFSFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAVISNDGRIEHYADAVRGRFTISRDNSQNTVFLQMNSLRSDDTALYYCAREIGATGYLDNWGQGTLVTVSS(SEQ.ID.No.15) |
实验2：亲和力成熟
为了得到亲和力更高的scFv，通过突变和在酵母中的第二次筛选循环来对初级结合体进行进一步的亲和力成熟过程。为了能够进行亲和力成熟，需降低LexA AlK LBD肽融合蛋白的表达水平，以降低由于初级结合体与AlK LBD肽的相互作用而驱动的报告基因的活化。将pBait1载体上的强的肌动蛋白基因启动子用截短的并由此活性降低的ADH(醇脱氢酶)启动子替换，从而得到pBait3。在初级结合体存在的条件下，这种诱饵表达水平的降低足以抑制细胞在不含有组氨酸但含有5mM的3-AT的平板上的生长。通过对可变轻链中的部分CDR3进行随机化来完成用于亲和力成熟的、初级结合体的突变。通过同源重组直接在酵母中实施上述过程(Schaerer-Brodbeck and Barberis，2004)。FW4.4的VL CDR3含有11个氨基酸(SEQ.ID.No.14：GTWDSSLSGVV)。最开始的2个位置被部分随机化，这样第1个位置处编码Gly、Ala或Gln，而第2个位置处编码Thr、Ser或Ala。在VL CDR3的位置5至8处，所有氨基酸残基允许被随机化。其他位置处保持不变。通过PCR引入随机化。所得的PCR产物的大小为356bp，并且含有上游为267bp且下游为27bp的框架序列的、经随机化的CDR盒。该产物即为所谓的供体PCR片段，其与目标载体具有同源性。所述的目标载体为酵母质粒(pLib1)，该酵母质粒编码与Ga14的活化结构域融合的初级结合体。为了提高同源重组的效率以及排除随后筛选中的假阳性结果，对所述目标载体中的CDR-L3稍微进行修饰。在VL CDR3的中部引入独特的SacI限制性酶切位点，这会导致在所述融合蛋白的scFv编码部分中发生移码，并导致被截短的蛋白质不能与AlK LBD结合。此外，SacI位点能够使目标载体发生线性化，这会增强在酵母中的重组效率。
通过用表达LexA AlK LBD(其处于截短的ADH启动子的控制之下)的质粒(pBait3)对报告酵母菌株YDE173进行预转化，从而开始筛选过程。使这种经预转化的酵母细胞再一次处于感受态，并用线性化的目标载体以及供体PCR片段进行共转化，其中所述的供体PCR片段与VL CDR3的上游和下游具有同源性。在PCR产物与目标载体之间发生同源重组之后，将新的VL CDR3序列整合到目标载体的相应位点处。上述过程的最终结果是，原始VL CDR3与随机化的VLCDR3互换。这将重新构成环状质粒，该质粒表达具有新的VL CDR3序列的全功能性融合蛋白，该全功能性融合蛋白将活化报告基因的表达并能够通过与AlK LBD肽发生相互作用而使细胞在选择性平板上生长。
通过6天的观察，在选择性平板上共生长出119个克隆。挑出这些克隆，并分离出文库质粒，然后将其再次转化到相同的报告酵母菌株中。进行液态β-半乳糖苷酶的定量检测，从而测量出AlK LBD(抗原)与亲和力成熟的scFv之间的结合强度。也用ALK-LBD肽通过ELISA方法测定了具有最大lacZ活化的20个克隆。最佳候选显示出KD为约7nM(参见图3)，并被命名为ESBA521。
在下表1c中，提供了被确定为有助于ALK结合的其他VL CDR3序列的序列。
| 克隆 | VL CDR3 |
| WTFW4.4 | GTWDSSLSGVV(SEQ.ID.No.32) |
| 5.3-9.1 | AAWDSVKEGVV(SEQ.ID.No.33) |
| 5.3-21.1 | AAWDNSMRGVV(SEQ.ID.No.34) |
| 5.3-22.1 | AAWDTMRYGVV(SEQ.ID.No.35) |
| 5.3-25.1 | AAWDTTRVGVV(SEQ.ID.No.36) |
| 5.3-27.1 | ASWDTMLKGVV(SEQ.ID.No.37) |
| 5.3-28.1 | ASWDTPTCGVV(SEQ.ID.No.38) |
| 5.3-29.1 | ATWDISRCGVV(SEQ.ID.No.39) |
| 5.3-46.1 | ATWDTVCAGVV(SEQ.ID.No.40) |
| 5.3-53.1 | ATWDVDVFGVV(SEQ.ID.No.41) |
| 5.3-57.1 | ATWDDVVGGVV(SEQ.ID.No.42) |
| 5.3-86.1 | AAWDSFYNGVV(SEQ.ID.No.43) |
| 5.3-94.1 | ASWDTLIEGVV(SEQ.ID.No.44) |
| 5.3-107.1 | ATWDNDKWGVV(SEQ.ID.No.45) |
| 5.3-112.1 | AAWDSTTCGVV(SEQ.ID.No.46) |
| 5.3-113.1 | ATWDMWMKGVV(SEQ.ID.No.47) |
| 5.3-117.1 | GTWDSSLSGVV(SEQ.ID.No.48) |
| 5.3-118.1 | AAWDWVLGGVV(SEQ.ID.No.49) |
| 14.3-6.1 | ATWDNPGQGVV(SEQ.ID.No.50) |
| 14.3-7.1 | ATWDDWVIGVV(SEQ.ID.No.51) |
| 14.3-8.1 | ASWDDQKWGVV(SEQ.ID.No.52) |
| 14.3-9.1 | ATWDTNRHGVV(SEQ.ID.No.53) |
| 14.3-12.1 | ASWDDLHIGVV(SEQ.ID.No.54) |
| 14.3-13.1 | ASWDEEAWGVV(SEQ.ID.No.55) |
| 14.3-21.1 | ATWDYIKIGVV(SEQ.ID.No.56) |
| 14.3-48.1 | ATWDTFERGVV(SEQ.ID.No.57) |
| 14.3-49.1 | ATWDSNLIGVV(SEQ.ID.No.58) |
| 5.3-24.,1 | ATWDNNTCGVV(SEQ.ID.No.59) |
| 5.3-3.1 | AAWDCDINGVV(SEQ.ID.No.60) |
| 5.3-8.1 | ASWDSMKIGVV(SEQ.ID.No.61) |
| 5.3-19.1 | ATWDCTRAGVV(SEQ.ID.No.62) |
实验3：scFv ESBA521与跨膜形式的人ALK特异性结合
为了检测新确定的scFv是否也能够识别活细胞表面上的跨膜人ALK蛋白质，要对瞬时转染的HELA细胞进行了免疫染色实验。ESBA521与ALK蛋白质反应，并以多克隆抗体作为对照(参见图4)。在对照实验中，显示出框架4.4scFv没有与人ALK发生反应。另人惊奇的是，虽然小鼠ALK抗原肽序列与人ALK抗原肽序列只有2个位置处的氨基酸不同，但是ESBA521只与人AlK蛋白质结合，而不与相应的小鼠的AlK蛋白质结合。与此不同的是，多克隆ALK抗体既识别人的ALK蛋白质，又识别小鼠的ALK蛋白质。因此，在细胞表面，ESBA521与人ALK蛋白质的结合是特异性的。
实验4：分离通过VH CDR2的PCR突变而得以改善的结合体
为了进一步改进与抗原的结合，ESBA521被用作亲和力成熟的进一步循环中的起始scFv，其中所述的亲和力成熟的进一步循环使用了与在亲和力成熟的第一个循环中所述的相同的双杂交方法，不同之处在于，在这种情况下，VH的CDR2是通过PCR突变来改变的并且被转化到酵母受体中，其中CDR2的同源重组以类似的方式增强。此外，将限制性酶切位点引入到CDR2中，以能够使目标质粒线性化。CDR2中引入的突变在表2中给出。
| scFv(表现最佳的) | VH CDR 2(突变残基) |
| WT(ESBAS21) | AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ.ID.No.63) |
| 1.1 | AI-KTDGQNYYADSVKG(SEQ.ID.No.64) |
| 17.1 | AIRSDGNERYYADSVKG(SEQ.ID.No.65) |
| 35.1 | AINTNGNEKYYADSVKG(SEQ.ID.No.66) |
| 64.1 | AISTNGKERYYADSVKG(SEQ.ID.No.67) |
| 130.1 | AIRTQSQEEYYADSVKG(SEQ.ID.No.68) |
| 152.1 | AIKSRSQEQYYADSVKG(SEQ.ID.No.69) |
| 167.1 | AIKSHSQQQYYADSVKG(SEQ.ID.No.70) |
| 214.1 | AINSEGQQRYYADSVKG(SEQ.ID.No.71) |
| 225.1 | AIKSKGQNKYYADSVKG(SEQ.ID.No.72) |
| 262.1 | AIRTNSEEKYYADSVKG(SEQ.ID.No.73) |
| 265.1 | AINMKGNDRYYADSVKG(SEQ.ID.No.74) |
| 43.2 | AI-RTNSKEYYADSVKG(SEQ.ID.No.75) |
| 70.2 | AIKTESQQRYYADSVKG(SEQ.ID.No.76) |
| 99.2 | AINSNGKQDYYADSVKG(SEQ.ID.No.77) |
| 100.2 | AIKTDGNHKYYADSVKG(SEQ.ID.No.78) |
| 109.2 | AIDTKGNGQYYADSVKG(SEQ.ID.No.79) |
| 146.2 | AIRSDSSHKYYADSVKG(SEQ.ID.No.80) |
| 173.2 | AINTKSNEQYYADSVKG(SEQ.ID.No.81) |
| 199.2 | AIRTDSKNSYYADSVKG(SEQ.ID.No.82) |
| 2.11 | AIRTDSKEQYYADSVKG(SEQ.ID.No.83) |
| 19.11 | AIRTNSKEEYYADSVKG(SEQ.ID.No.84) |
| 28.11 | AIETSSGSTYYADSVKG(SEQ.ID.No.85) |
| 33.11 | AINTGGGSTYYADSVKG(SEQ.ID.No.86) |
| 4.12 | AINTRGQNEYYADSVKG(SEQ.ID.No.87) |
| 6.12 | AISTSG-STYYADSVKG(SEQ.ID.No.88) |
在上述过程之后得到的分离的scFv中，其中的7种表现为亲和力显著增强，其Kd为2-3nM(参见图5)，其中最佳的是28.11。
实验5：通过实施抗ALK的抗体来预防肿瘤生长
选择抗体ESBA521的祖蛋白(progenitor)来与ALK的氨基酸391-406结合，其中所述的ALK包含已知与多效生长因子结合的氨基酸(396-406)(Stoica 2001)。通过使ESBA521的祖蛋白的CDR中的其他氨基酸随机化并通过选择与由天然ALK的胞外结构域(ECD)所含有的氨基酸391-406的序列相结合的结合体，来得到ESBA521。这些程序得到了这样的抗体，该抗体在与PTN结合的相同的位点处以高的亲和力与ALK的ECD结合。据我所知，这是第一个特异性地靶向ALK的PTN结合位点的单克隆抗体。因此，预测ESBA521与ALK的ECD具有高亲和力，并且能够高效地与多效生长因子(PTN)和中期因子(MK)竞争来结合ALK受体，由此，ESBA521抗体适用于抑制MK和PTN配体与ALK蛋白质结合。
由于ALK及其配体涉及瘤形成、肿瘤侵袭和血管发生，所以抑制ALK与其关联配体间的相互作用会破坏ALK介导的肿瘤发生。
可以通过以下描述的2种检测方法来确定ESBA521对特定肿瘤的效果。
在第一种检测方法中，准备异种移植，以便确定ALK在限制癌的生长速率中的作用(Powers 2002)。简言之，以2千万个细胞/ml介质的量制备U87MG细胞的悬浮液，其中所述介质含有10％的牛血清。将该悬浮液注入NU/NU小鼠中，并测量所得的肿瘤。引入测试抗体，优选为全长的抗体，更优选为聚乙二醇(pegylated)修饰的抗体，并评价肿瘤的生长。
在目前对本发明的优选实施方案进行示出以及描述的同时，应该清楚地理解，本发明不限于这些实施方案，而且在以下权利要求的范围内，除了上述的实施方案以外，本发明还可以具有多种实施方案和实施方式。
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<212>PRT
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<212>PRT
<213>人工的
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<223>ESBA512的重链可变区
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
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<212>PRT
<213>人工的
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<213>人工的
<220>
<223>scFv 28.11的重链可变区的CDR2
<400>11
<210>12
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 33.11的重链可变区的CDR2
<400>12
<210>13
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 4.12的重链可变区的CDR2
<400>13
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>框架4.4的轻链可变区的CDR3
<400>14
<210>15
<211>248
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>框架5.2的序列
<400>15
<210>16
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>ESBA512中连接VH和VL的连接子
<400>16
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>ESBA512的CDR2的C-末端部分及其衍生物
<400>17
<210>18
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>框架4.4的重链可变序列的CDR3
<400>18
<210>19
<211>253
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>单链抗体片段ESBA512
<400>19
<210>20
<211>253
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv用作框架
<400>20
<210>21
<211>333
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ESBA512的轻链可变区
<400>21
<210>22
<211>366
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ESBA512的重链可变区
<400>22
<210>23
<211>759
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>单链抗体
<400>23
<210>24
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>框架4.4的重链可变区的CDR3
<400>24
<210>25
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 2.1的重链可变区的CDR3
<400>25
<210>26
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 4.1的重链可变区的CDR3
<400>26
<210>27
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 5.1的重链可变区的CDR3
<400>27
<210>28
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 2.3的重链可变区的CDR3
<400>28
<210>29
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 3.3的重链可变区的CDR3
<400>29
<210>30
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 5.3的重链可变区的CDR3
<400>30
<210>31
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 14.3的重链可变区的CDR3
<400>31
<210>32
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>WT FW4.4的轻链可变区的CDR3
<400>32
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-9.1的轻链可变区的CDR3
<400>33
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-21.1的轻链可变区的CDR3
<400>34
<210>35
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-22.1的轻链可变区的CDR3
<400>35
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-25.1的轻链可变区的CDR3
<400>36
<210>37
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-27.1的轻链可变区的CDR3
<400>37
<210>38
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-28.1的轻链可变区的CDR3
<400>38
<210>39
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-29.1的轻链可变区的CDR3
<400>39
<210>40
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-46.1的轻链可变区的CDR3
<400>40
<210>41
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-53.1的轻链可变区的CDR3
<400>41
<210>42
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-57.1的轻链可变区的CDR3
<400>42
<210>43
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-86.1的轻链可变区的CDR3
<400>43
<210>44
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-94.1的轻链可变区的CDR3
<400>44
<210>45
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-107.1的轻链可变区的CDR3
<400>45
<210>46
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-112.1的轻链可变区的CDR3
<400>46
<210>47
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-113.1的轻链可变区的CDR3
<400>47
<210>48
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-117.1的轻链可变区的CDR3
<400>48
<210>49
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-118.1的轻链可变区的CDR3
<400>49
<210>50
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-6.1的轻链可变区的CDR3
<400>50
<210>51
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-7.1的轻链可变区的CDR3
<400>51
<210>52
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-8.1的轻链可变区的CDR3
<400>52
<210>53
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-9.1的轻链可变区的CDR3
<400>53
<210>54
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-12.1的轻链可变区的CDR3
<400>54
<210>55
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-13.1的轻链可变区的CDR3
<400>55
<210>56
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-21.1的轻链可变区的CDR3
<400>56
<210>57
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-48.1的轻链可变区的CDR3
<400>57
<210>58
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-49.1的轻链可变区的CDR3
<400>58
<210>59
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-24.，1的轻链可变区的CDR3
<400>59
<210>60
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-3.1的轻链可变区的CDR3
<400>60
<210>61
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-8.1的轻链可变区的CDR3
<400>61
<210>62
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-19.1的轻链可变区的CDR3
<400>62
<210>63
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv WT(ESBA521)的重链可变区的CDR2
<400>63
<210>64
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 1.1的重链可变区的CDR2
<400>64
<210>65
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 17.1的重链可变区的CDR2
<400>65
<210>66
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 35.1的重链可变区的CDR2
<400>66
<210>67
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 64.1的重链可变区的CDR2
<400>67
<210>68
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 130.1的重链可变区的CDR2
<400>68
<210>69
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 152.1的重链可变区的CDR2
<400>69
<210>70
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 167.1的重链可变区的CDR2
<400>70
<210>71
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 214.1的重链可变区的CDR2
<400>71
<210>72
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 225.1的重链可变区的CDR2
<400>72
<210>73
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 262.1的重链可变区的CDR2
<400>73
<210>74
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 265.1的重链可变区的CDR2
<400>74
<210>75
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 43.2的重链可变区的CDR2
<400>75
<210>76
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 70.2的重链可变区的CDR2
<400>76
<210>77
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 99.2的重链可变区的CDR2
<400>77
<210>78
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 100.2的重链可变区的CDR2
<400>78
<210>79
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 109.2的重链可变区的CDR2
<400>79
<210>80
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 146.2的重链可变区的CDR2
<400>80
<210>81
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 173.2的重链可变区的CDR2
<400>81
<210>82
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 199.2的重链可变区的CDR2
<400>82
<210>83
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 2.11的重链可变区的CDR2
<400>83
<210>84
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 19.11的重链可变区的CDR2
<400>84
<210>85
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 28.11的重链可变区的CDR2
<400>85
<210>86
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 33.11的重链可变区的CDR2
<400>86
<210>87
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 4.12的重链可变区的CDR2
<400>87
<210>88
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 6.12的重链可变区的CDR2
<400>88
<210>89
<211>2520
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>含有ESBA521编码序列的表达载体pAK400
<400>89
<210>90
<211>3319
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>含有ESBA521编码序列的pTFT74表达载体
<400>90
<210>91
<211>22
<212>PRT
<213>智人
<400>91
Claims (40)
1.与人ALK蛋白质结合的抗体，所述抗体包含可变重链CDR3，所述可变重链CDR3的序列与SEQ.ID.No.2所示的序列具有至少50％的序列一致性，优选具有至少60％、70％、75％、85％的序列一致性，更优选具有至少90％的序列一致性。
2.权利要求1所述的抗体，其包含序列SEQ.ID.No.2的可变重链CDR3。
3.权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体与人ALK蛋白质的结合是特异性的。
4.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，其为抗体片段、scFv抗体或Fab片段。
5.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，其为scFv抗体。
6.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，其包含H3 VH结构域以及λ VL结构域。
7.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，其中VH和VL的框架是稳定的并且是可溶的，从而在细胞内的还原环境中是具有功能的。
8.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，其包含框架4.4。
9.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，所述抗体与16个氨基酸的ALK表位肽结合，所述ALK表位肽的序列与SEQ.ID.No.1所示的序列具有至少75％的序列一致性。
10.权利要求9所述的抗体，其中所述的ALK抗原表位肽具有SEQ.ID.No.1所示的序列。
11.权利要求9或10所述的抗体，所述抗体与ALK抗原表位肽的亲和力的特征在于Kd为30nM或更小，优选为10nM或更小，最优选为小于3nM。
12.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，其包含可变轻链CDR3，所述可变轻链CDR3的序列与SEQ.ID.No.3所示的序列具有至少50％的序列一致性，优选具有至少60％、70％、80％、85％的序列一致性，或者更优选具有至少90％的序列一致性。
13.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，其包含序列为SEQ.ID.No.3的可变轻链CDR3。
14.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，其与16个氨基酸的ALK抗原表位肽结合，所述ALK抗原表位肽的序列与SEQ.ID.No.1所示的序列具有至少75％，优选100％的氨基酸一致性。
15.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，所述抗体与ALK抗原表位肽的亲和力为Kd小于10nM，优选小于7nM。
16.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，所述抗体包含SEQ.ID.No.4所示的VH序列以及SEQ.ID.No.5所示的VL序列。
17.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，其在至少1个所述CDR的中具有至少1个突变，从而得到以Kd小于约3nM为特征的更高的亲和力。
18.权利要求17所述的抗体，其中所述突变在VH和/或VL的CDR1或CDR2中。
19.权利要求17所述的抗体，其中所述的一个突变或多个突变在VH的CDR2中。
20.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，其包含可变重链CDR2，所述可变重链CDR2包含选自SEQ.ID.No.7、SEQ.ID.No.8、SEQ.ID.No.9、SEQ.ID.No.10、SEQ.ID.No.11、SEQ.ID.No.12、或SEQ.ID.No.13的序列。
21.权利要求20所述的抗体，其中所述定义的CDR2的序列在氨基酸残基AI之后，且在SEQ.ID.No.17所示的序列之前。
22.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，所述抗体包含SEQ.ID.No.14所示的VH序列和SEQ.ID.No.15所示的VL序列。
23.权利要求5至22的任意一项中所述的抗体，所述抗体包含NH2-VL-连接子-VH-COOH或NH2-VH-连接子-VL-COOH这样的结构，其中所述连接子具有SEQ.ID.No.16所示的序列。
24.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，所述抗体经放射性标记或毒素标记。
25.上述权利要求的任意一项中所述的抗体，其作为药物或诊断工具。
26.上述权利要求的任意一项中所述的抗体在制备用于治疗癌症或肿瘤的药物中的用途。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述药物适用于抑制MK和/或PTN与ALK的结合和/或抑制ALK介导的信号传导。
28.权利要求26或27所述的用途，其中所述药物为联合药物，其适用于将所述抗体与抗癌剂例如氨甲蝶呤联合给药。
29.权利要求26所述的用途，其中所述治疗为治疗成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、横纹肌肉瘤、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、B细胞非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、脂肪瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤，特别是成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤和横纹肌肉瘤。
30.编码权利要求1至23的任意一项中所述的抗体的DNA序列。
31.包含权利要求30所述的DNA序列的表达载体。
32.用权利要求31所述的表达载体转化的合适的宿主细胞，特别是埃希氏大肠杆菌(E.coli)细胞。
33.制备权利要求1至23的任意一项中所述的抗体的方法，所述方法包括：在允许合成所述抗体的条件下，对权利要求32所述的宿主细胞进行培养；以及从所述培养物中回收所述的抗体。
34.一种ALK疫苗，其包含分离的ALK蛋白质或其片段、或者编码ALK的抗原表位的核酸。
35.权利要求34所述的疫苗，其中所述疫苗包含经分离的ALK蛋白质的残基391-406。
36.权利要求34或35所述的疫苗，其中所述疫苗由经分离的ALK蛋白质的残基391-406与载体、佐剂和/或半抗原配制形成，以增强对ALK蛋白质或其片段的免疫应答。
37.抗体或其抗原结合片段，其能够特异性地与跨越经分离的ALK蛋白质或其片段的第391±3位和第406±3位氨基酸残基(SEQ.ID.No：91)的区域的残基结合，最优选与跨越经分离的ALK蛋白质或其片度的第391-406位氨基酸(SEQ.ID.No：1)的区域的残基结合。
38.权利要求37所述的抗体，其中所述抗体为单链抗体(scFv)、Fab片段、IgG或IgM。
39.ALK抗原表位，其适用于鉴定、筛选或产生抗ALK的抗体或其片段，其中所述的ALK抗原表位为跨越第391±3位和第406±3位(SEQ.ID.No：91)的氨基酸残基区域、最优选跨越第391-406(SEQ.ID.No：1)的氨基酸区域的片段；包含跨越第391±3位和第406±3位(SEQ.ID.No：91)的氨基酸残基的区域、最优选跨越第391-406位(SEQ.ID.No：1)的氨基酸的区域；或者基本上由跨越第391±3位和第406±3位(SEQ.ID.No：91)的氨基酸残基的区域、最优选跨越第391-406位(SEQ.ID.No：1)的氨基酸的区域构成。
40.权利要求1至8的任意一项中所述的抗体，所述抗体与抗原表位结合，其中所述的抗原表位为跨越第391±3位和第406±3位(SEQ.ID.No：91)的氨基酸残基区域、最优选跨越第391-406位(SEQ.ID.No：1)的氨基酸区域的片段；包含跨越第391±3位和第406±3位(SEQ.ID.No：91)的氨基酸残基的区域、最优选跨越第391-406位(SEQ.ID.No：1)的氨基酸的区域；或者基本上由跨越第391±3位和第406±3位(SEQ.ID.No：91)的氨基酸残基的区域、最优选跨越第391-406位(SEQ.ID.No：1)的氨基酸的区域构成。
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