BRPI0710971A2

BRPI0710971A2 - anticorpos que se ligam ao domìnio extracelular do receptor tirosina cinase alk,seu uso, vetor de expressão,método para produção de um antcorpo, vacina e epìtodo de alk

Info

Publication number: BRPI0710971A2
Application number: BRPI0710971-7A
Authority: BR
Inventors: Der Maur Adrian Auf; Peter Lichtlen; Alcide Barberis
Original assignee: Esbatech Ag
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2011-05-31
Also published as: US9512411B2; CA2650822C; EP2013236A1; NZ572248A; RU2008146922A; KR101457228B1; CA2650822A1; RU2460540C2; JP5431920B2; MX2008013705A; US8945563B2; DK2013236T3; EP2013236B1; US20150203829A1; CN101443361A; CN101443361B; PL2013236T3; AU2007246144A1; US7902340B2; WO2007124610A1

Abstract

ANTICORPOS QUE SE LIGAM AO DOMìNIO EXTRA-CELULAR DO RECEPTOR TIROSINA CINASE ALK, SEU USO, VETOR DE EXPRESSãO, MéTODO PARA PRODUçãO DE UM ANTICORPO, VACINA E EPITODO DE ALK.A presente invenção refere-se a um anticorpo específico para ALK (Cinase de Linfoma Anaplásico) humana, particularmente um scFv, uma seqúência de ácidos nucléicos que o codifica, sua produção e seu uso como um produto farmacêutico ou com propósitos diagnósticos. O dito anticorpo é apropriado para o tratamento local de tumores, particularmente glioblastoma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOSQUE SE LIGAM AO DOMÍNIO EXTRACELULAR DO RECEPTOR TIROSINACINASE ALK, SEU USO, VETOR DE EXPRESSÃO, MÉTODO PARAPRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, VACINA E EPÍTODO DE ALK".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE AFINS

Este pedido de patente reivindica a prioridade para o pedido depatente provisório ns US 60/795.831, depositado em 28 de abril de 2006,cujo teor é aqui incorporado como referência em sua totalidade.

Os teores de quaisquer patentes, pedidos de patente, e referênciascitadas neste relatório descritivo inteiro são aqui incorporados como referên-cia em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um anticorpo específico para ALK(Cinase de Linfoma Anaplásico) humana, particularmente uma seqüência deácidos nucléicos que o codifica, sua produção e seu uso como um produtofarmacêutico ou com propósitos diagnósticos. O dito anticorpo é apropriadopara o tramento local de tumores ou câncer, particularmente glioblastoma.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

ALK (Cinase do Linfoma Anaplásico; CD246) é um membro dafamília de receptores tirosina cinase (RTK). Como um membro típico destafamília, ela é uma proteína transmembrana tipo I, que consiste essencial-mente em três domínios: o domínio de ligação a Iigante extracelular (aa19-1038),que contém um domínio da classe A de um receptor de LDL e dois domíniosMAM (MAM: Meprin, antígeno A5, proteína tirosina fosfatase μ), um domíniotransmembrana (aa1039-1059) e um domínio citoplasmático (aa 1060-1620),contendo o domínio de tirosina cinase. Um peptídeo de sinais está presente noterminal N da proteína nascente (aa 1-18), que é clivado após a secreção.

A ALK de comprimento inteiro humana e do camundongo foramclonadas em 1997 por dois grupos independentes (Iwahara 1997; Morris 1997).ALK é altamente similar ao RTK denominado Tirosina Cinase de leucócitos(LTK) e pertence à superfamília de receptores de insulina. ALK apresenta 57%aa de identidade e 71% aa de similaridade com LTK nas suas regiões desobreposição (Morris 2001). ALK é altamente N-glicosilada e contém 21 sí-tios de N-glicosilação putativos. Os aminoácidos 687 a 1034 têm significativasimilaridade (50% de identidade de aa) a LTK. Entretanto, a seqüência doterminal N proximal 686 aa não apresenta qualquer homologia a quaisquerproteínas conhecidas com a exceção de uma seqüência muito curta encon-trada também no receptor de LDL (Duyster 2001/SWISSPROT). Além disso,ela contém dois domínios MAM em aa264-427 e aa478-636 (Meprin, antíge-no A5, proteína tirosina fosfatase μ). Acredita-se que estes domínios tenhamuma função adesiva, pois eles estão disseminados entre várias proteínas ade-sivas implicadas na interação intercelular (De Juan 2002). Além disso, há umsítio de ligação para os Iigantes de ALK putativos correspondentes aos aminoá-cidos 396-406 (Stoica 2001; ver abaixo). A seqüência de aminoácidos do domí-nio de cinase de ALK murina apresenta 98% de identidade de aa à ALK huma-na, 78% de identidade à LTK do camundongo, 52% a ros do camundongo,47% ao receptor do fator de crescimento semelhante à insulina humana e46% ao receptor de insulina humana (Iwahara 1997; Ladanyi 2000). Nenhu-ma variante de divisão de ALK foi descrita até agora. Entretanto, ALK é fre-qüentemente associada a translocações cromossômicas (vide abaixo).

O gene de ALK cobre cerca de 315 kb e tem 26 éxons. Muito dogene consiste em dois grandes íntrons que cobrem cerca de 170 kb. Otranscrito de ALK tem 6,5 kb de comprimento (Kutok 2002). De acordo comMorris, o DNAc cobre 6.226 bp (Morris 2001).

A expressão de ALK no camundongo começa durante a embrio-gênese por volta do estágio de desenvolvimento E11 e é persistente nosperíodos neonatais nos quais ela é expressada no sistema nevoso. No adul-to, sua expressão fisiológica fica restrita a certas regiões de células neuro-nais (células neurais e gliais e provavelmente endoteliais) do SNC em baixosníveis (Morris 1997; Duyster 2001; Stoica 2001). Realmente, a abundânciade ALK diminui no período pós-natal (Morris 2001). Baseado no seu padrãode expressão, um papel para o receptor no desenvolvimento do cérebro ésugerido (Duyster 2001). A expressão restrita ao nível neural de ALK sugereque ela serve como um receptor para fatores neurotróficos (vide posterior-mente). Consistente com isto, seu padrão de expressão se sobrepõe aosgenes que codificam a família TRK de receptores de neurotrofina (Morris

2001). Entretanto, camundongos nocauteados de ALK não apresentamqualquer fenótipo óbvio (dados não-publicados), que poderiam se dever a

alguma redundância funcional com membros da família TRK ou outros re-ceptores de neurotrofina. Perceptivelmente, os tecidos hematopoiéticos nãoapresentam qualquer expressão detectável de ALK (vide posteriormente)(Morris 2001).

Dois Iigantes potenciais para ALK foram descritos recentemente,"pleiotrofina" (PTN) e "midquina" (MK) (Stoica 2001; Duyster 2001; Stoica

2002). A interação PTN-ALK foi identificada usando a proteína pleiotrofinahumana purificada para triar uma biblioteca peptídica de apresentação defagos. Por este método, uma seqüência de ALK presente em seu domínioextracelular (aa 396-406) foi identificada. O importante é que esta seqüêncianão é compartilhada com LTK, a RTK mais intimamente relacionada a ALK.Esta região de ligação de Iigante também é conservada no homólogo poten-cial de ALK em drosófilas (Loren 2001). ALK é fosforilada depois da ligaçãode PTN (Bowden 2002). Além disso, ALK demonstrou ser estimulada porpleiotrofina na cultura de células. Isto torna a interação pleiotrofina/ALK par-ticularmente interessante à luz das implicações patológicas que a pleiotrofinatem (Stoica 2001). As linhagens de células que carecem da expressão deALK deixam também de apresentar uma resposta de crescimento à pleiotro-fina e vice-versa (Stoica 2001). In vivo, níveis elevados de pleiotrofina nosoro de pacientes que sofrem de vários tumores sólidos foram demonstra-dos, e estudos com cobaias sugeriram uma contribuição da pleiotrofina parao crescimento de tumores (Stoica 2001). O papel de PTN como um fator an-giogênico limitador da taxa no crescimento de tumores está bem estabeleci-do em modelos com cobaias (Choudhuri 1997). Em 1996, Czubayko et al.(Czubayko 1996) demonstraram a importância de PTN na angiogênese detumores, na prevenção de apoptose e metástase por modular os níveis dePTN com uma abordagem de assestar ribozima. As medições dos níveisséricos de PTN em camundongos demonstraram uma clara correlação como tamanho do tumor. PTN desempenha um papel significativo em alguns dostipos mais agressivos de cânceres humanos, tais como melanoma e câncerpancreático, dando assim perspectivas interessantes para outras aplicaçõespotenciais de um inibidor de ALK (Weber 2000; Stoica 2001). Em pacienteshumanos, níveis séricos elevados de pleiotrofina foram encontrados em pa-cientes com câncer pancreático (n = 41; P<.0001) e câncer de cólon (n = 65;P = .0079). Em indivíduos sadios, PTN é expressada de uma maneira fir-memente regulada durante o desenvolvimento perinatal de órgãos e em po-pulações seletivas de neurônios e glia no adulto.

A co-expressão de PTN e ALK, como encontrada em várias li-nhagens de células cancerosas, indica que elas poderiam formar uma alçaautócrina de estímulo do crescimento (Stoica 2001). Apesar de todos estesdados, a literatura enuncia que ainda não está claro se os efeitos de PTNsão mediados por ALK sozinha e/ou por outros receptores de PTN não-identificados (Duyster 2001). Pelo menos dois outros receptores potenciaisde PTN foram sugeridos: o receptor tirosina fosfatase RPTPD e o proteogli-cano sulfato de heparano N-sindecano. However, RPTPD poderia atuar co-mo um modulador sinalizador da sinalização de PTN/ALK e N-sindecanocomo um acompanhante para o Iigante (Bowden 2002).

Recentemente, outro fator de crescimento secretado relacionadoà pleiotrofina, denominado midquina (MK) foi identificado como um segundoIigante para ALK. Similarmente a PTN, as funções Iigantes e ativadoras (porexemplo, indução da formação de colônias sobre ágar mole em culturas decélulas) de MK podem ser bloqueadas pelo mesmo anticorpo suscitado con-tra ALK-ECD (Stoica 2001). Similarmente à pleiotrofina, a midquina é regu-lada de forma ascendente em muitos tumores, embora sua expressão fisio-lógica seja muito restrita em muitos tecidos adultos normais (Stoica 2002). Aanálise de 47 amostras de tumores da bexiga revelou que a expressão deMK é significativamente (cerca de quatro vezes) intensificada em compara-ção com o tecido da bexiga normal. Além disso, uma correlação pronunciadase correlaciona com parca sobrevida de pacientes (0'Brien 1996).

Entretanto, a afinidade de MK por ALK é cerca de 5 vezes maisbaixa do que aquela de pleiotrofina (Stoica 2002). O interessante é que no casode pleiotrofina, a inibição de ALK por intermédio de ribozimas também inibe osefeitos de MK na cultura de células (Stoica 2002). Os autores destes estudostambém chegaram à concusão que a inibição da via de PTK/MK/ALK abrepossibilidades muito interessantes para o tratamento de várias doenças, al-gumas delas com opções de tratamento muito limitadas até agora, tais co-mo, por exemplo, glioblastoma e câncer pancreático (Stoica 2002).

Em indivíduos sadios, a expressão do RNAm de ALK atinge opico durante o período neonatal e persiste em adultos em poucas partes se-letas do sistema nervoso. Recentemente, a expressão da proteína ALK foidetectada também em células endoteliais que estavam associadas a célulasneuronais e gliais. As evidências de que pelo menos uma parte das ativida-des malignas descritas para pleiotrofina é mediada através de ALK vieramde experimentos nos quais a expressão de ALK foi depletada por uma abor-dagem que assestava ribozimas. Tal depleção de ALK impediu que a fosfori-lação estimulada por pleiotrofina da propteína antiapoptópica Akt e levasse auma sobrevida prolongada de camundongos que tinham recebido xenoen-xertos. Na realidade, o número de células apoptóticas nos enxertos de tumo-res era significativamente aumentado, quando a expressão de ALK foi deple-tada (Powers 2002).

As evidências de que as atividades malignas descritas para MKsão mediadas através de ALK vieram de experimentos com anticorpos mo-noclonais direcionados contra ALK ECD. A adição de uma diluição 1:25 dosobrenadante de células de hibridoma a partir de dois anticorpos anti-ALKECD leva a um decréscimo significativo na formação de colônias de célulasSW-13 em ágar mole (Stoica 2002). A análise de dez linhagens de célulasdiferentes revelou que a capacidade para uma resposta de crescimento aPTN se correlacionou perfeitamente com a expressão do RNAm de ALK (asseguintes linhagens de células responderam a PTN e demonstraram expres-sar o RNAm de ALK: HUVEC1 NIH3T3, SW-13, Colo357, ME-180, U87, MD-MB 231; Stoica 2001). O interessante é que em algumas linhagens de célu-las cancerosas (câncer pancreático Colo357, câncer mamário Hs578T e gli-oblastoma U87), PTN e ALK são co-expressadas, indicando que PTN e ALKformam uma alça autócrina de estimulação do crescimento (Stoica 2001).

O interessante é que PTN e também MK demonstraram causarregulação transcricional ascendente da proteína antiapoptótica bcl-2 (Stoica2002). Além disso, Akt ativada (que é um alvo crucial a jusante da sinaliza-ção aberrante de ALK) fosforila o fator pró-apoptótico denoominado "bad",levando assim à dissociação a partir de bcl-xl, que, quando liberada de"bad", pode suprimir a apoptose bloqueando a liberação do citocromo c (videBowden 2002 para obter referências).

A expressão aberrante de ALK poderia estar envolvida no de-senvolvimento de vários cânceres. Entretanto, ela foi primeiramente associ-ada a um subgrupo de Iinfomas não-Hodgkin altamente malignos (NHLs), osassim denominados Linfomas de Células Grandes Anaplásicas (ALCLs). OsLinfomas não-Hodgkin representam neoplasias clonais que se originam apartir de várias células de origem linfática.

A maioria dos pacientes com o subtipo clínico sistêmico primáriode ALCL tem a translocação t2,5, expressando uma proteína de fusão queune o terminal N de nucleofosmina (NPM) ao terminal de ALK. A fusão con-siste em aa 1-117 dê NPM fundidos aos aa 1058-1620 de ALK e o rompi-mento cromossômico fica localizado em um íntron localizado entre os éxonsque codificam TM e o domínio justamembrana de ALK (Duyster 2001). NPM-ALK é um transcrito que contém uma ORF de 2.040 pb que codifica umaproteína com 680aa (Morris 2001). Isto corresponde a um rompimento noíntron 4 de NPM, que cobre 911 pb e íntron 16 de ALK que cobre 2.094 pb(Kutok 2002). Muito possivelmente a seqüência de ALK nesta proteína defusão é a seqüência mínima necessária para a proteína levar a ALCL (Duys-ter 2001). A fusão inversa (ALK-NPM) não é expressada, pelo menos nãoem células linfóides (Kutok 2002). A proteína NPM do tipo selvagem de-monstra expresão ubiqüitária e funciona como um carreador de proteínas docitoplasma até dentro do nucléolo. Na realidade, NPM é uma proteína nucle-ar de 38kDa codificada no cromossoma 5 que contém uma NLS, se liga aproteínas nucleares e engata no tráfego citoplasma/núcleo (Duyster 2001).NPM é uma das proteínas nucleolares mais abundantes e está normalmentepresente como um hexâmetro (Morris 2001). O mais importante é que NPMnormalmente sofre auto-oligomerização (hexâmeros), bem como hetero-oligomerização com NPM-ALK (Duyster 2001). A translocação 2;5 leva aparte do gene de ALK que codifica a tirosina cinase no cromossoma 2 sob ocontrole do promotor forte de NPM no cromossoma 5, produzindo a expres-são permanente da proteína quimérica NPM-ALK (p80) (Duyster 2001). As-sim sendo, ALK cinase é desregulada e ectópica, em termos de tipo de célu-la (linfóide) e compartimento celular (núcleo/nucléolo e citoplasma) (Ladanyi2000). A localização (citoplasma ou núcleo) de NPM parece não afetar seuefeito sobre a linfomagênese (Duyster 2001). A atividade aberrante de tirosi-na cinase resultante dispara a transformação maligna por intermédio de fos-forilação constitutiva de alvos intracelulares. Várias outras proteínas de fu-são de ALK menos comuns estão associadas com ALCL. Todas variantesdemonstram ligação do domínio de ALK tirosina cinase a um promoter alter-nativo que regula sua expressão.

ALK de comprimento inteiro foi relatada como também sendoexpressada em cerca de 92% de células de neuroblastomas primários e emalguns rabdomiossarcomas (Lamant 2000). Entretanto, nenhuma correlaçãoentre a expressão de ALK e a biologia tumoral foi demonstrada até agora.

Este fato, em conjunto com a falta de evidências quanto aos níveis significa-tivos de ALK fosforilada de forma endógena nestes tumores, sugere que aexpressão de ALK em neuroblastoma reflete sua expressão normal em célu-las neurais imaturas em vez de em um papel oncogênico primário e ALKnestes tumores e não é fosforilada constitutivamente, questionando assimum papel importante para ALK nestes tumores (Duyster 2001; Pulford 2001).Contudo, a sinalização de ALK poderia ser importante em pelo menos al-guns neuroblastomas, como sugerido por Miyake et al., que encontraram asuperexpressão e fosforilação constitutiva de ALK devido à ampliação gêni-ca em linhagens de células derivadas de neuroblastomas (Miyake 2002).

Entretanto, outras linhagens de células derivadas de neuroblastomas nãoapresentam ativação constitutiva de ALK, questionando assim um envolvi-mento patalógico geral de ALK (Dirks 2002; Pulford 2004).

O mais interessante é que ALK parece ser importante para ocrescimento glioblastoma multiforme, um tumor cerebral altamente malignoque oferece opções terapêuticas muito limitadas (Powers 2002). Múltiplasalterações genéticas demonstraram ocorrer nestes tumores devastadores,incluindo perda ou mutações de PTEN, p53 e INK4a-ARF. Além disso, a si-nalização de RTK desempenha um papel particularmente importante nocrescimento e desenvolvimento destes tumores, que superexpressam váriosfatores de crescimento tais como PDGF, HGF1 NGF e VEGF, sugerindo al-ças sinalizadoras de RTK autócrina. Powers e outros demonstraram a ex-pressão do RNAm e proteína de ALK em amostras de tumores em pacientescom glioblastoma, enquanto que os sinais não eram detectáveis no tecidocerebral adjacente normal (Powers 2002). Além disso, células do glioblasto-ma U87MG humano (que são derivadas de um paciente e representam umsistema de modelo bem caracterizado para estudar a tumorigênese e sinali-zação em glioblastoma) apresentam comportamento antiapoptótico depen-dente de ALK em estudos de xenoenxertos. Quando ALK é depletada nestascélulas tumorosas pelo uso de ribozimas, os camundongos que receberaminjeção destas células tumorosas sobrevivem pelo menos duas vezes maisdo que, quando recebem injeção de de células tumorosas do tipo selvagem,e estas células tumorosas apresentam apoptose drasticamente aumentada.Assim sendo, ALK e seu(s) ligante(s) proporcionam um sinal de sobrevivên-cia essencial que é limitador da taxa para o crescimento de tumores de célu-las U87MG in vivo (Powers 2002). Estas descobertas indicam que a inibiçãoda sinalização de ALK poderia ser uma abordagem promissora para melho-rar a expectativa de vida de pacientes com glioblastoma.

O glioblastoma multiforme é de longe o tumor glial primário maiscomum e maligno com uma incidência de cerca de 2/100.000/ano (cerca de15.000 casos nos Estados Unidos e na Europa Ocidental por ano). Ele afetapreferencialmente os hemisférios cerebrais, mas pode afetar também o tron-co cerebral (principalmente em crianças) ou o cordão espinhal. Os tumorespodem se manifestar de novo (glioblastoma primário) ou podem se desen-volver a partir de astrocitomas de grau mais baixo (glioblatoma secundário).Os glioblastomas primários e secundários apresentam pouca sobreposiçãomolecular e constituem entidades diferentes de doenças no nível molecular.Eles podem conter muitas anormalidades genéticas, incluindo afecção dep53, EGFR, MDM2, PDGF1 PTEN, p16, RB.

Nenhum avanço terapêutico significativo ocorreu nos últimos 25anos. As terapias são apenas paliativas e podem prolongar a expectativa devida de 3 meses até 1 ano. Os pacientes usualmente se apresentam comdéficit neurológico lentamente progressivo, por exemplo, fraqueza motora,sintomas de pressão intracraniana, por exemplo, cefaléia, náusea, vômito,enfraquecimento cognitivo, ou convulsões.

As mudanças de personalidade também podem ser sinais pre-coces. A etilogia de glioblastoma é desconhecida, e os casos familiares re-presentam menos do que 1%. O único fator de risco consistente identificadoé a exposição a produtos petroquímicos. O diagnóstico é feito principalmentepor estudos de reprodução de imagens (TC, ressonância magnética nuclear(RMN)) e biópsia. Simular completamente a maioria dos glioblastomas não éprático nem possível porque estes tumores não têm margens claramentedefinidas. Ao invés disso, apresentam tendências bem conhecidas a invadirlocalmente e se disseminarem ao longo de vias de matéria branca compac-ta. A principal razão pela qual nenhum tratamento curativo é possível é por-que o tumor está fora do alcance de controle local quando diagnosticado. Osagentes quimioterápicos primários são carmustina (um agente alquilante) ecisplatina, mas apenas 40% dos pacientes apresentam alguma resposta.

Embora há algumas incertezas quanto ao papel de ALK em glio-blastoma, esta doença oferece várias abordagens para fármacos direciona-dos a ALK. De fato, para esta doença devastadora, mesmo uma pequenamelhora das opções atuais de terapia serviria como uma enorme necessida-de médica. É importante assinalar que, como as células de glioblastoma ex-pressam a ALK de comprimento inteiro, para tratar este câncer, ALK poderiaser considerada como um alvo não apenas para inibidores de cinases commoléculas pequenas, mas também para anticorpos e/ou fragmentos de anti-corpos, tais como scFvs , isto é, para induzir apoptose de células tumoro-sas. A localização estrita de glioblastoma para o sistema nervosa central(SNC) fundamenta o uso de scFvs, caso eles possam ser distribuídos efici-entemente para o sistema nervosa contrai (SNC) (nenhuma depuração rápi-5 da em virtude da compartimentalização, mas melhor penetração de tumoresem comparação com IgGs devido ao seu menor tamanho). Os anticorpose/ou fragmentos de anticorpos poderiam ser direcionados contra a seqüên-cia Iigante de Iigantes de ALK (aa 396-406) ou contra outras partes das par-tes extracelulares do receptor.

A expressão muito limitada de ALK em tecidos sadios sob condi-ções fisiológicas indica que os tumores que expressam ALK poderiam serum alvo excelente para o tratamento da doença usando anticorpos e/oufragmentos de anticorpos radioativos ou marcados com toxina, independen-temente de se ALK está ou não envolvida na patogênese destes tumores.Além de células de glioblastomas, a expressão de ALK se demonstrou comalta significância em linhagens de células de melanomas e linhagens de cé-lulas de carcinoma de mama (sem serem fosforiladas constitutivamente)(Dirks 2002). O fato de que uma grande parte do domínio extracelular deALK parece ser singular no proteoma humano deve tornar esta abordagemaltamente específica.

O documento n2 W09515331/US529925 descreve a clonagem eseqüenciamento de seqüências de ácidos nucléicos humanas, que são rear-ranjadas no episódio de translocação cromosômica t(2;5)(p23;q35) que ocor-re no Iinfoma humano t(2;5). O rearranjo demonstrou levar as seqüências dogene de fosfoproteína nucleolar (o gene de NPM) no cromossoma 5q35 paraaqueles de um gene de proteína tirosina cinase não identificado anterior-mente (aqui doravante o gene de ALK) no cromossoma 2p23. A seqüênciado gene de fusão e da proteína de fusão (gene ou protein de fusãoNPM/ALK, respectivamente) também forma descritos.

A seqüência de comprimento inteiro de ALK é patenteada napatente n- US 5.770.421, intitulada "Human ALK Protein Tyrosine Kinase".

Além disso, a patente n2 US 6.174.674 B1, intitulada "Method ofdetecting a chromosomal rearrangement involving a breakpoint in the ALK orNPM gene", descreve iniciadores para detector a seqüência de fusão NPM-ALK em amostras de pacientes.

Em outro pedido de patente, n2 US 6.696.548, intitulado "ALKprotein tyrosine kinase/receptor and Iigands thereof", está descrito o uso deALK para a detecção de Iigantes de ALK e anticorpos que se ligam a se-qüências específicas de ALK. Ele descreve também um método para identi-ficar um agente capaz de se ligar ao polipeptídeo ALK isolado.

O documento n2 W00196394/US20020034768 descreve ALKcomo um receptor de pleiotrofina. O documento n2 US20040234519 descre-ve anticorpos antipleiotrofina, e o documento n2 W02006020684 descreve adetecção de pleitrofina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Assim sendo, é um objetivo genérico da invenção fornecer umanticorpo ou derivado de anticorpo estável e solúvel, que se liga à proteínaALK humana in vitro e in vivo. Mais preferivelmente, o anticorpo é especifi-camente visado contra o domínio Iigante de ALK (aminoácidos 396-406), eassim sendo, bloqueará os efeitos biológicos de MK, que tem uma Kd paraALK de cerca de 170 pM, bem como os efeitos biológicos de PTN, que temuma Kd para ALK de cerca de 20 -30 pM (Stoica 2002; Stoica 2001). Emuma modalidade preferida, o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo é umanticorpo scFv ou um fragmento Fab. No texto que se segue, o termo "anti-corpo" compreende compreende anticorpos de comprimento inteiro, bemcomo outros derivados de anticorpos.

Agora, para implementar estes e outros objetos da invenção,que ficarão mais facilmente evidentes à medida que a descrição prossegue,o dito anticorpo é manifestado pelas características que ele compreendeuma cadeia pesada variável CDR3 de uma seqüência com pelo menos 50%de identidade à seqüência SEQ. ID. NO: 2. De preferência, a identidade deseqüência é pelo menos 60%, 65%, 75%, 85%, ou mais, de preferência pelomenos 92%. Mais preferivelmente, o dito anticorpo tem uma VH CDR3 daseqüência SEQ. ID. NO: 2.Em uma modalidade, o anticorpo ou sua parte de proteína Iigan-te de antígeno da invenção se liga especificamente a um epítoto específicoda poteína ALK. Tais epítopos residem, por exemplo, dentro dos aminoáci-dos 1-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400,400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800,800-900, 900-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, ou 1500-1620 da proteína ALK, ou qualquer intervalo, parte faixa dela.Em uma modalidade, o anticorpo ou sua parte Iigante de antígeno se ligaespecificamente a um epítopo que compreende, consiste essencialmente,em um fragmento da região que cobre os resíduos de aminoácidos 391 ± 3 e406 ± 3 (SEQ. ID NO: 91 apresenta os resíduos de aminoácidos 388 a 409da proteína ALK humana), de preferência os aminoácidos 391-406 (SEQ.ID.NO: 1) da proteína ALK protein (SEQ ID NO: 1). Deve-se entender que afaixa identificada não deve ser considerada como tendo limites exatos, masque o anticorpo ou sua parte Iigante de antígeno pode se ligar ou se ligarparcialmente em uma região situada perto ou dentro do domínio de ligação aligante da ALK. De preferência, os anticorpos ou derivados de anticorpos seligam a um epítopo da proteína ALK com um comprimento de 10 a 20 ami-noácidos.

Em outra modalidade, o anticorpo ou sua parte Iigante de antí-geno pode ser caracterizado como se ligando especificamente a uma proteí-na ALK com uma K0 menor do que cerca de 10 χ 10"6 Μ. Em uma modalidadeespecífica, o anticorpo ou sua parte Iigante de antígeno se liga especificamentea uma proteína ALK (ou fragmento dela) com uma K0 de pelo menos cerca de10 χ 10"7 M, pelo menos cerca de 10 χ 10"8 Μ, pelo menos cerca de 10 χ 10"9Μ, pelo menos cerca de 10 χ 10"10 Μ, pelo menos cerca de 10 χ 10"11 Μ, oupelo menos cerca de 10 χ 10"12 M ou uma Kd ainda mais favorável.

Em várias outras modalidades, o anticorpo ou sua parte Iigantede antígeno inclui uma região de cadeia pesada variável que compreende umaseqüência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou maispreferivelmente pelo menos 99% idêntica a uma seqüência de aminoácidosda região de cadeia pesada variável como enunciada em SEQ ID NO: 4.Em outras modalidades, o anticorpo ou sua parte Iigante de an-tígeno inclui uma região de cadeia leve variável que compreende uma se-qüência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou maispreferivelmente pelo menos 99% idêntica a uma seqüência de aminoácidosda região de cadeia leve variável como enunciada em SEQ ID NO: 5.

Em ainda outras modalidades, o anticorpo ou sua parte Iigantede antígeno inclui uma região de cadeia pesada variável que compreendeuma seqüência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oumais preferivelmente pelo menos 99% idêntica a uam seqüência de aminoá-cidos da região de cadeia pesada variável como enunciada em SEQ ID NO:4, e também uma região de cadeia leve variável que compreende uma se-qüência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou maispreferivelmente pelo menos 99% idêntica a uma seqüência de aminoácidosda cadeia leve variável como enunciada em SEQ ID NO: 5.

Em certas outras modalidades, o anticorpo ou sua parte Iigantede antígeno se liga especificamente a um epítopo que se sobrepõe a umepítopo ligado por um anticorpo ou derivado de anticorpo ESBA521 (SEA IDNO: 19) e/ou compete pela ligação a uma proteína ALK ou parte dela comum anticorpo ou derivado de anticorpo ESBA521. Em uma modalidade afim,o anticorpo ou sua parte Iigante de antígeno se liga especificamente a umepítopo que compreende os resíduos 391-406 (SEQ ID NO: 1) de uma prote-ína ALK ou parte dela.

As regiões de cadeias pesada e leve variáveis do anticorpo ousuas partes Iigantes de antígeno incluem tipicamente uma ou mais regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs). Elas incluem as regiões C-DR1, CDR2, e CDR3. Em modalidades específicas, as CDRs de cadeia pe-sada variável são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais preferivelmen-te 100% idênticas a uma CDR do anticorpo ESBA521. Em outras modalida-des específicas, as CDRs de cadeia leve variável são pelo menos 80%,85%, 90%, 95%, ou mais preferivelmente 100%, idênticas a uma CDR deuma região de cadeia leve variável do anticorpo ESBA521.

Conseqüentemente, os anticorpos ou fragmentos específicos dainvenção compreendem uma região de cadeia pesada variável que incluiuma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que sãopelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais preferivelmente 100%, idênticasa uma CDR de uma região de cadeia pesada variável de ESBA521, e umaregião de cadeia leve variável que inclui uma ou mais CDRs que são pelomenos 80%, 85%, 90%, 95% ou mais preferivelmente 100%, idênticas auma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo ESBA521.

A região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas par-tes ligantes de antígeno pode incluir também todas as três CDRs que sãopelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais preferivelmente 100%, idênticasàs CDRs da região de cadeia pesada variável do anticorpo ESBA521 e/outodas as três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou mais pre-ferivelmente 100%, idênticas às CDRs da região de cadeia leve variável doanticorpo ESBA521.

Em outra modalidade da invenção, os anticorpos ou suas partesligantes de antígeno (a) incluem uma região variável de cadeia pesada que écodificada por ou derivada de (isto é, o produto de) um gene de VH humano(por exemplo, tipo H3); e/ou (b) incluem uma região variável da cadeia leveque é codificado por ou derivada de um gene V capa ou lâmbda humano (poexemplo, do tipo lâmbda).

Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos de com-primento inteiro, por exemplo, anticorpos monoclonais, que incluem um do-mínio efetor (por exemplo, um domínio Fc), bem como partes ou fragmentosde anticorpos, tais como anticorpos de cadeia única e fragmentos Fab. Osanticorpos podem ser ligados também a uma série de agentes terapêuticos(por exemplo, agentes anticâncer, quimioterápicos ou toxinas) e/ou um mar-cador (por exemplo, um radiomarcador).

Em outro aspecto, a invenção refere-se a ácidos nucleícos isola-dos que incluem uma seqüência que codifica uma região variável da cadeiapesada de anticorpo, que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou maispreferivelmente pelo menos 99%, idêntica a SEQ ID NO: 22. A invenção re-fere-se também a ácidos nucléicos isolados que incluem uma seqüência quecodifica uma região variável da cadeia leve de anticorpo, que é pelo menos75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais preferivelmente pelo menos 99%, idên-tica a SEQ ID NO: 21.

A invenção refere-se também a vetores de expressão que inclu- em qualquer um dos ácidos nucléicos precedentes, seja isoladamente ou emcombinação (por exemplo, expressado a partir de um ou mais vetores), bemcomo células hospedeiras que compreendem tais vetores de expressão.

As células hospedeiras apropriadas para expressar os anticor-pos da invenção incluem uma série de células eucarióticas, por exemplo,células de levedura, células de mamíferos, por exemplo, células do ovário dohamster chinês (CHO), células NSO, células de mieloma, ou células vege-tais. As moléculas da invenção podem ser expressadas também em célulasprocarióticas, por exemplo, E. coli.

A invenção refere-se também a métodos para marcar os anticor-pos ou suas partes Iigantes de antígeno expressando ácidos nucléicos quecodificam anticorpos em uma célula hospedeira (por exemplo, ácidos nucléi-cos que codificam a parte da região Iigante de antígeno de um anticorpo).Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um hibridoma ou transfec-toma que inclui os ácidos nucléicos supramencionados.

Em outra modalidade, a invenção dornece um antígeno quecompreende um epítopo da proteína ALK, de preferência um domínio de li-gação de Iigante de PTN, mais preferivelmente um fragmento que compre-ende, consiste essencialmente em um fragmento da região que cobre osresíduos de aminoácidos 391 ± 3 e 406 ± 3 (vide SEQ. ID No: 91 que apre-senta os resíduos de aminoácidos 388 a 409 da proteína ALK humana),mais preferivelmente os aminoácidos 391-406 (SEQ. ID.No: 1). O antígenopode ser usado para levantar, triar ou detectar a presença de um anticorpoanti-ALK ou pode ser usado como um agente em imunoterapia ativa, isto é,como uma vacina.

Na qualidade de uma vacina, o antígeno pode ser usado isola-damente ou em combinação com um adjuvante ou haptenos apropriado, porexemplo, misturado ou conjugado quimicamente ou geneticamente. O antí-geno, quando usado para imunoterapia ativa, pode ser usado também emcombinação com imunoterapia passiva, por exemplo, com qualquer um dosanticorpos anti-ALK aqui descritos, ou em combinação com uma preparaçãomonoclonal ou policlonal de anticorpos anti-ALK, por exemplo, gamablobuli-na sérica de um doador soropositivo.

Em outra modalidade, as moléculas do anticorpo (ou regiõesIigantes VL e VH) são completamente humanas. O tratamento de humanoscom anticorpos monoclonais humanos proporciona várias vantagens. Porexemplo, os anticorpos são possivelmente menos imunogênicos em sereshumanos do que anticorpos não-humanos. A terapia é também rápida por-que a inativação de ALK pode ocorrer tão logo o anticorpo atinge um local decâncer (onde ALK está expressada). Portanto, em uma modalidade afim, oanticorpo é um anticorpo scFv, isto é, ESBA521 ou um anticorpo que com-preende uma ou mais regiões VL e/ou VH (ou suas CDRs; por exemplo, VLCDR3 (SEQ ID NO:3) e/ou VH CDR3 (SEQ ID NO: 2)) de ESBA521. Os an-ticorpos humanos podem se localizar também em sítios apropriados em se-res humanos mais eficientemente do que os anticorpos não-humanos. Alémdisso, o tratamento é específico para ALK, é recombinante e altamente puri-ficado e, diferentemente das terapias tradicionais, evita o potencial de seremcontaminados com agentes adventícios. Alternativamente, os anticorpos ederivados de anticorpos da presente invenção podem ser produzidos porsíntese química.

Em outra modalidade, a invenção fornece composições para tra-tar um câncer (ou a preparação de um medicamento assim apropriado) quepodem prevenir neoplasia em um indivíduo, competindo com Iigantes deALK, tais como midquina (MK) e/ou pleiotrofina (PTN), e desta forma, blo-queando a sinalização de ALK mediada por tais ligantes. Essa composiçãopode ser administrada isoladamente ou em combinação com agentes anti-câncer reconhecidos nessas técnicas, por exemplo, metotrexato, e similares.

O anticorpo da invenção e/ou a vacina de ALK pode ser usadaisoladamente ou em combinação com um agente terapêutico conhecido, porexemplo, um agente anticâncer, por exemplo, metotrexato e similares.Outras características e vantagens da invenção ficarão eviden-tes a partir de descrição detalhada que se segue e a partir das reivindica-ções.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção será mais bem entendida e os objetivos que não osenunciados acima ficarão evidentes quando se der consideração à sua des-crição detalhada que se segue. Tal descrição faz referência aos desenhosanexos, nos quais:

A Figura 1 ilustra um esquema da proteína ALK humana usada.Um peptídeo com 16 aminoácidos do sítio de ligação de PTN (tracejado) éusado como um epítopo em uma triagem de dois híbridos para Iigantes scFv.

A Figura 2 ilustra a randomização em etapas das partes VHCDR3, VL CDR 3 e VH CDR 2, para obter ESBA521 como Iigante secundá-rio e um conjunto de scFvs como Iigantes terciários (vide Tabela 1). X re-presenta qualquer resíduo de aminoácido.

A Figura 3 ilustra um experimento ELISA no qual as característi-cas de ligação dos scFvs aperfeiçoados são comparadas àquela da estrutu-ra da qual eles se originam.

A Figura 4 ilustra a imunocoloração de células HeLa transfecta-das de forma transiente com ESBA521 (quadros à esquerda) e um anticorpopoliclonal específico de ALK (quadros à direita). Quadro do meio: as mes-mas células visualizadas por microscopia óptica.

A Figura 5 ilustra um experimento ELISA que compara ESBA512com os Iigantes terciários aperfeiçoados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para que a invenção seja mais facilmente entendida, certos ter-mos são primeiramente definidos.Definições

O termo "ALK" e "Alk-1" inclui a proteína ALK humana codificadapelo gene de ALK (Cinase de Linfoma Anaplásico) que é um recep-tor/proteína tirosina cinase (PTK) que cobre a membrana.

O termo "anticorpo" refere-se a anticorpos inteiros e qualquerfragmento Iigante de antígeno (isto é, "parte Iigante de antígeno", "polipeptí-deo Iigante de antígeno", ou "imunoligante") ou sua única cadeia. Um "anti-corpo" refere-se a uma glicoproteína que compreende pelo menos duas ca-deias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissul-feto, ou uma sua parte Iigante de antígeno. Cada cadeia pesada compreen-de um região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e umaregião constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesadacompreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreendeuma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma regiãoconstante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende umdomínio, CL. As regiões Vh e Vl podem ser ainda subdivididas em regiõesde hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementa-ridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denomi-nadas regiões da estrutura (FR). Cada Vh e Vl é constituída de três CDRs equatro FRs, arranjadas a partir do terminal amino até o terminal carbóxi naseguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões vari-áveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio Iigante que interagecom um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar aligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo vá-rias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o pri-meiro componente (CIq) do sistema clássico de complementos.

O termo "parte Iigante de antígeno" de um anticorpo (ou sim-plesmente "parte do anticorpo") refere-se a um ou mais fragmentos de umanticorpo que retém a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno(por exemplo, ALK). Demonstrou-se que a função Iigante de antígeno de umanticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comrimentointeiro. Os exemplos de fragmentos Iigantes englobados pelo termo "parteligante de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, umfragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH) CL e CH1; (ii) umfragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentosFab ligados por uma ponte dissulfeto na região da articulação; (iii) um frag-mento Fd que consiste nos domínios Vh e CH1; (iv) um fragmento Fv queconsiste nos domínios Vl e Vh de um único braço de um anticorpo, (v) umúnico domínio ou fragmento dAb (Ward et ai, (1989) Nature 341:544-546),que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de comple-mentaridade isolada (CDR), ou (vii) uma combinação de duas ou mais CDRsisoladas que podem ser opcionalmente unidas por um Iigante sintético. Alémdisso, embora os dois domínios do fragmento Fv1 Vl and VH, sejam codifica-dos por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombi-nantes, por um Iigante sintético que permite que eles sejam preparados co-mo uma única cadeia de proteína na qual as regiões Vl e Vh formam parespara formar moléculas monovalentes (conhecidas como cadeia única Fv(scFv); vide, por exemplo, Bird et ai (1988) Science 242:423-426; e Hustonet al. (1988) Proc. Nati Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos decadeia única também estão englobados dentro do termo "parte Iigante deantígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos u-sando técnicas convencionais conhecidas pelos versados nessa área, e osfragmentos são triados quanto à utilidade da mesma maneira que os anti-corpos intactos. As partes Iigantes de antígenos podem ser produzidas portécnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química deimunoglobulinas intactas. Os anticorpos podem ser de isótipo diferente, porexemplo, um anticorpo IgG (por exemplo, um subtipo IgGI, lgG2, lgG3, oulgG4), IgAI, lgA2, IgD, IgE, ou IgM.

O termo "estrutura" refere-se às partes conhecidas nessas técni-cas de uma região variável de anticorpo, que existem entre regiões CDRmais divergentes. Taid regiões da estrutura são tipicamente referidas comoestruturas 1 até 4 (FR1, FR2, FR3, e FR4) e proporcionam uma armaçãopara manter, em espaço tridimensional, as três CDRs encontradas emu maregião variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo, de tal modo que asCDRs possam formar uma superfície Iigante de antígeno. Tais estruturaspodem ser referidas também como armações, pois eles proporcionam supor-te para a apresentação das CDRs mais divergentes. Outras CDRs e estrutu-ras da superfamília das imunoglobulinas, tais como repetições de anquirina efibronectina, podem ser usadas como moléculas Iigantes de antígenos (videtambém, por exemplo, patentes n- US 6.300.064, 6.815.540 e publicação n-US 20040132028).

O termo "epítopo" ou "determinante antigênico" refere-se a umsítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo que se ligaespecificamente (por exemplo, ALK, por exemplo, resíduos de aminoácidos391-406 de ALK-1 humana (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 1). Um epítopoinclui tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 ami-noácidos em uma conformação espacial singular. Vide, por exemplo, "Epito-pe Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology", Volume 66, G. E.Morris, Editor (1996).

Os termos "ligação específica", "sligação seletiva", "se liga sele-tivamente" e "se liga especificamente" referem-se à ligação de um anticorpoa um epítopo em um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticorpo seliga com uma afinidade (Kq) de aproximadamente menos do que 10"7 M, talcomo aproximadamente menos do que 10"8 Μ, 10"9 M ou 10"10 M ou mesmomais baixa.

O termo "KD" refere-se à constante de dissociação no equilíbriode uma interação anticorpo/antígeno específica. Tipicamente, os anticorposda invenção se ligam a ALK com uma constante de dissociação no equilíbrio(K0) menor do que aproximadamente 10"7 M, tal com o menor do que apro-ximadamente 10"8 Μ, 10"9 M ou 10"10 M ou mesmo mais baixa, determinada,por exemplo, usando a tecnologia de ressonância plasmônica superficial (S-PR) em um instrumento BIACORE.

Os termos "neutraliza ALK," "inhibe ALK," e "bloqueia ALK" sãoutilizados de forma intercambiável para se referir à capacidade de um anti-corpo da invenção para impedir que ALK interaja com um o mais Iigantes-alvo e, por exemplo, disparar a transdução de sinais.

O termo "molécula de ácido nucléico" refere-se a moléculas deDNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucléico pode ser de fi-lamento único ou filamento duplo, mas é de preferência DNA de filamentoduplo. Um ácido nucléico está "ligado operacionalmente" quando ele é colo-cado em uma relação functional com outra seqüência de ácido nucléico. Porexemplo, um promotor ou intensificador está ligado operacionalmente a umaseqüência codificadora caso ele afete a transcrição da seqüência.

No caso de ácidos nucléicos, o termo "homologia substancial"indica que dois ácidos nucléicos, ou suas seqüências designadas, quandootimamente alinhadas e comparadas, são idênticas, com inserções ou dele-ções de nucleotídeos apropriados, em pelo menos cerca de 80% dos nucleo-tídeos, usualmente pelo menos cerca de 90% a 95%, e mais preferivelmen-te, pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos nucleotídeos. Alternativamente, ahomologia substancial existe quando os segmentos hibridizarem sob condi-ções de hibridização seletivas, para o complemento do filamento. Tais con-dições de hibridização são conhecidas nessas técnicas, e estão descritas,por exemplo, em Sambook et ai infra.

A identidade percentual entre duas seqüências é função do nú-mero de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências, levando emconsideração o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, quenecessita ser introduzido para um alinhamento ótimo das duas seqüências.A comparação de seqüências e a determinação da identidade percentualentre duas seqüências podem ser realizadas usando um algoritmo matemá-tico, como descrito nos exemplos não-limitativos abaixo.

A identidade percentual entre duas seqüências de nucleotídeospode ser determinada usando o programa GAP do pacote de software GCG,usando uma matriz NWSgapdna. CMP e um peso de lacunas de 40, 50, 60,70, ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. A identidade per-centual entre duas seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos pode serdeterminada também usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS,4:11-17 (1989)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usan-do uma tabela de resíduos de pesos PAM120, uma penalidade de compri-mento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Além disso, a i-dentidade percentual entre duas seqüências de aminoácidos pode ser de-terminada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Moi Biol.(48):444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP do pacote desoftware GCG, usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, eum peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimentode 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

As seqüências de ácidos nucléicos e proteínas da presente in-venção podem ser usadas ainda como uma "seqüência de consulta" pararealizar uma busca contra bases de dados públicas, por exemplo, identificarseqüências afins. Tais buscas podem ser realizadas usando os programasNBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Moi Bioi215:403-10. As buscas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com oprograma NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 paraobter seqüências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácidos nucléi-cos da invenção. As buscas de proteínas BLAST podem ser realizadas como programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para ob-ter seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteínas dainvenção. Para obter alinhamentos com lacunas com o propósito de compa-ração, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et ai,(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Quando se está utilizando osprogramas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros de omissão dos respec-tivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados.

A presente invenção engloba também "modificações conservati-vas de seqüências" das seqüências enunciadas nas SEQ ID NOs da presen-te invenção, isto é, modificações das seqüências de nucleotídeos e aminoá-cidos que não anulam a ligação do anticorpo codificado pela seqüência denucleotídeos ou que contêm a seqüência de aminoácidos, para o antígeno.Tais modificações conservativas de seqüências incluem substituições, adi-ções e deleções de nucleotídeos e aminoácidos. Por exemplo, podem serintroduzidas modificações por técnicas conhecidas nessa área, tais comomutagênese direcionada a sítios e mutagênese mediada por PCR. As substi-tuições conservativas de aminoácidos incluem aquelas nas quais o resíduode aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem umacadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos que têm ca-deias laterais similares foram definidas nessas técnicas. Estas famílias in-cluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, argini-na, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácidoglutâmico), cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina,asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeiaslaterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo,treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tiro-sina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim sendo, um resíduo de aminoá-cido não-essencial previsto em um anticorpo anti-ALK humano é, de prefe-rência, substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família decadeia lateral. Os métodos para identificar substituições conservativas denucleotídeos e aminoácidos, que não eliminam a ligação de antígeno sãobem conhecidos nessas técnicas (vide, por exemplo, Brummell et al., Bio-chem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884(1999); e Burks et ai. Proc. Nati. Acad. Sei. USA 94:412-417 (1997)).

Alternativamente, em outra modalidade, são introduzidas muta-ções aleatoriamente ao longo da totalidade ou de parte de uma seqüênciaque codifica um anticorpo anti-ALK, tal como por mutagênese com satura-ção, e os anticorpos anti-ALK resultantes podem ser triados quanto à ativi-dade de ligação. Uma "seqüência de consenso" é uma seqüência formada apartir da maioria dos aminoácidos (ou nucleotídeos) de ocorrência freqüenteem uma família de seqüências relacionadas (vide, por exemplo, Winnaker,"From Genes to Clones" (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1987).Em uma família de proteínas, cada posição na seqüência de consenso éocupada pelo aminoácido que ocorre mais freqüentemente naquela posiçãona família. Caos dois amioácidos ocorram igualmente de forma freqüente,qualquer um deles pode ser incluído na seqüência de consenso.

Fazendo referência às tabelas e figuras aqui fornecidas, umaseqüência de consenso para a região da cadeia pesada/leve do anticorpoCDR(s) pode ser derivada pelo alinhamento ótimo das seqüências de ami-noácidos das CDRs da região variável dos anticorpos que são reativos con-tra o epítopo 390-406 da proteína ALK-1 humana.

O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucléico ca-paz de transporter outro ácido nucléico ao qual ela foi ligada. Um tipo de ve-tor é um "plasmídeo" que se refere a uma alça de DNA com filamento duplocircular, dentro do qual segmentos de DNA adicionais podem estar ligados.Outro tipo de vetor é um vetor viral, onde os segmentos de DNA adicionaispodem ser ligados dentro do genoma viral. Certos vetores são capazes dereplicação autônoma em uma célula hospedeira dentro da qual eles estãointroduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que têm origem de replicaçãobacteriana, e vetores epissômicos de mamíferos). Outros vetores (por e-xemplo, vetores não-epissômicos de mamíferos) podem ser integrados den-tro do genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospe-deira, e desta forma, replicado junto com o genoma do hospedeiro.

O termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula dentro daqual o vetor de expressão foi introduzido. As células hospedeiras podem in-cluir células bacterianas, microbianas, vegetais ou animais. As bacérias quesão suscetíveis à transformação incluem membros das enterobacteriáceas,tais como cepas de Escherichia coli ou salmonela; Baciláceas, tais comoBacillus subtilis; pneumococos; estreptococos, e Haemophilus influenzae. Osmicróbios apropriados incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.As linhagens de células hospedeiras animais apropriadas incluem célulasCHO (linhagens do ovário do hamster chinês) e células NSO.

Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a medi-das terapêuticas ou preventivas aqui descritas. Os métodos de "tratamento"empregam a administração a um indivíduo, que dele necessita, um anticorpoda presente invenção, por exemplo, um indivíduo que tem um distúrbio me-diado por ALK ou um indivíduo que ulteriormente pode adquirir tal distúrbio,para prevenir, curar, retardar, reduzir a gavidade ou melhorar um ou maissintomas do distúrbio, ou distúrbio recorrente, ou para prolongar a sobrevidade um indivíduo além daquela esperada na ausência desse tratamento.

O termo "distúrbio mediado por ALK" refere-se a estados doenti-os e/ou sintomas associados a cânceres ou tumores mediados por ALK. Ge-nericamente, o termo "distúrbio mediado por ALK" refere-se a qualquer dis-túrbio, cujo início, progressão ou persistência dos sintomas requer a partici-pação de ALK. Os distúrbios mediados por ALK exemplificativos incluem,porém sem limitações, por exemplo, câncer, particularmente, glioblastoma.

O termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" refere-se a umaquantidade suficiente para atingir ou pelo menos atingir parcialmente o efeitodesejado. O termo "dose terapeuticamente eficaz" é definido como. umaquantidade suficiente para curar ou pelo menos deter parcialmente a doençae suas complicações em um paciente que já sofre da doença. As quantida-des eficazes para este uso dependerão da gravidade do distúrbio que estásendo tratado e do estado geral do sistema imunológico próprio do paciente.

O termo "indivíduo" refere-se a qualquer animal humano ou não-humano. Por exemplo, os métodos e composições da presente invençãopodem ser usados para tratar um indivíduo com um câncer, por exemplo,glioblastoma.

A menos que diferentemente definido, todos os termos técnicose científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que aquele entendidocomumente pelos versados nas técnicas às quais esta invenção pertence.Embora métodos e materiais similares àqueles aqui descritos possam serusados na prática ou testes da presente invenção, os métodos e materiaisapropriados estão descritos abaixo. No caso de conflito, o presente relatóriodescritivo, incluindo as definições, prevalecerão. Além disso, os materiais,métodos,

e exemplos são raramente ilustrativos e não pretendem ser Iimi-tativos.

Vários aspectos da invenção estão descritos mais detalhada-mente nas subseções que se seguem. Deve-se entender que as várias mo-dalidades, preferências e faixas podem ser combinadas à vontade. Alémdisso, dependendo da modalidade específica, as definições, modalidades oufaixas selecionadas podem não se aplicar.

A presente invenção fornece em um primeiro aspecto um anti-corpo que se liga à proteína ALK humana, sendo que o dito anticorpo com-preende uma cadeia variável pesada CDR3 de uma seqüência com pelomenos 50% de identidade de seqüência à seqüência SEQ. ID. NO: 2. Depreferência, identidade de seqüência é de pelo menos 60%, 70%, 75%,80%, ou mais preferivelmente, pelo menos 90%. Mais preferivelmente, aCDR3 tem a seqüência precisa de SEQ. ID. NO: 2.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o anticorpose liga especificamente à proteína ALK humana, isto é, ele não se liga à pro-teína ALK do camundongo, cujo sítio de ligação de PTN difere em apenas 2resíduos de aminoácidos em comparação com o sítio de ligação de PTN(SEQ. ID. NO: 1) da proteína ALK humana. A isoleucina humana na posição3 é uma valina e o aspartato é uma alanina na seqüência do camundongocorrespondente.

O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo decomprimento inteiro, mas ode ser também um fragmento de anticorpo, talcomo, por exemplo, um fragmento scFv ou Fab. Os fragmentos Iigantes deantígeno são bem conhecidos nessas técnicas. De preferência, usa-se umfragmento scFv.

A cadeia pesada e a cadeia leve são constituídas de seqüênciasde estrutura, cada uma compreendendo três CDRs, CDR1, CDR2 e CDR3,que estão predominantemente envolvidas na ligação de antígenos. O anti-corpo da presente invenção compreende o domínio VH do tipo H3 e um do-mínio VL do tipo lâmbda 1.

A estrutura de VH e VL do anticorpo da presente invenção é es-tável e solúvel de modo a ser funcional em um ambiente redutor intracelular.De preferência, ele é a estrutura 4.4. que foi isolada anteriormente por umsistema de triagem de levedura referido como o "Quality control system" (Aufder Maur et ai., 2001; Auf der Maur et al. 2004). A seqüência da estruturapode ser deduzida, por exemplo, a partir de SEQ. ID. NO: 20 (vide abaixo),onde as partes da estrutura estão representadas por letras não-sublinhadase letras retas, enquanto que as seqüências das CDRs estão sublinhadas e aseqüência do Iigante está em itálico.

O anticorpo da presente invenção é capaz de se ligar a um pep-tídeo epítopo de ALK com 16 aminoácidos, que é pelo menos 75%, de prefe-rência 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais preferivelmente 100%, idêntico à se-qüência de SEQ ID NO: 1. Esta seqüência é referida também como sítio deligação de PTN e é uma seqüência singular nogenoma humano inteiro. Aseqüência do camundongo correspondente varia em 2 dos 16 aminoácidos,isto é, V na posição 3 e A na posição 7 em vez de I ou D, respectivamente.

De preferência, o anticorpo da presente invenção se liga à ALK humana,mas não do camundongo, isto é, é específico para a proteína humana. Oepítopo de ALK que compreende cerca de resíduos 391-406 ou que consistenestes resíduos é singularmente apropriado para selecionar um fragmentoligante de anticorpo ou antígeno, que pode se ligar especificamente a ALK ebloquear ou inibir a atividade mediada por ALK. Este epítopo é apropriadotambém para triar ou levantar anticorpos que bloqueiam especificamente aatividade de ALK. Assim sendo, este epítopo, especialmente um epítopo quecompreende cerca de resíduos 391-406 ou que consiste em cerca deste re-síduos, é singularmente apropriado para uso como um agente imunoterápicoativo ou vacina, como aqui descrito adicionalmente.

O anticorpo da presente invenção tem uma afinidade pelo peptí-deo epítopo de ALK com uma KcJ de 30 nM ou menos, de preferência 10 nMou menos, mais preferivelmente, abaixo de 3 nM.

Em outra modalidade da presente invenção, o anticorpo quecompreende uma cadeia leve variável CDR3 de uma seqüência com pelomenos 50% de identidade de seqüência à seqüência SEQ.ID NO: 3. De pre-ferência, a identidade de seqüência é pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, emais preferivlemente, pelo menos 90%. Mais preferivelmente, CDR3 [e idên-tica a SEQ ID NO: 3. Novamente, este anticorpo se liga a um peptídeo epí-topo de ALK com 16 aminoácidos de uma seqüência com pelo menos 75%,de preferência 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais preferivelmente, 100%, deidentidade de aminoácidos à seqüência SEQ ID NO: 1. Além disso, o anti-corpo tem uma finidade pelo peptídeo epítopo de ALK com uma KcJ menordo que 10 nM, de preferência menor do que 7 nM.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o anticorpocompreende uma seqüência VH de SEQ ID NO: 4 e uma seqüência VL deSEQ ID NO: 5. Adicionalmente, ele pode compreender pelo menos uma mu-tação em pelo menos uma das CDRs1 resultando em uma afinidade maisalta caracterizada por uma KcJ menor do que cerca de 3 nM. A dita pelo me-nos uma mutação é de preferência em CDR1 ou CDR2 de VH e/ou VL1 maispreferivelmente em CDR2 de VH.

Em outra modalidade preferida da presente invenção, o anticor-po compreende uma cadeia pesada variável CDR2 que compreende umaseqüência selecionada no grupo de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ IDNO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, ou SEQ ID NO: 13.De preferência, estas seqüências de CDR2 definidas são precedidas porresíduos de aminoácidos Al e seguidos das seqüências de SEQ ID NO: 17,de tal modo que a CDR2 inteira seja definida.

Um anticorpo preferido da presente invenção compreende umaseqüência de VH de SEQ ID NO: 4 e uma seqüência VL de SEQ ID NO: 5.Em anticorpos scFvs, a estrutura de domínio pode ser NH2-VL-ligante-VH-COOH ou NH2-VH-ligante-VL-COOH; de preferência, o Iigante tem a se-qüência SEQ ID NO: 16. Alternativamente, as regiões variáveis representa-das por SEQ ID NOS: 4 e 5 podem ser montadas em um anticorpo de com-primento inteiro, por exemplo, IgG ou IgM. As regiões constantes apropria-das para combiner com as regiões variáveis da invenção são conhecidasnessas técnicas.

Dentro do âmbito da presente invenção está o uso do anticorpoou derivado de anticorpo como um medicamento ou como uma ferramentadiagnostica. De preferência, visa-se à produção de um medicamento para otratamento de cânceres ou tumores. Com este propósito, um anticorpo podeser radiomarcado usando radionuclídeos ou marcação radiometálica. Isso éparticularmente valioso para marcar tumores, reprodução de imagens detumores e estudos de biodistribuição de tumores. Além disso, a tecnologiade DNA recombinante torna possível fundir geneticamente regiões codifica-doras de genes de V variáveis a domínios de toxinas modificados. Por e-xemplo, uma fusão scFv-toxina na qual o scFv é específico para uma proteí-na marcadora de tumor pode marcar a toxina para o tumor, onde a toxinacausa citotoxicidade. Tal terapia marcada resulta na concentração seletivade agentes citotóxicos ou radionuclídeos em tumores e deve diminuir a toxi-cidade para tecidos normais.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o anticorpoé usado para um tratamento de cânceres ou tumores, de preferência neuro-blastoma, glioblastoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de mama, melano-ma, câncer pancreático, Iinfoma não-Hodgkin de células B1 carcinoma tireói-deo, carcinoma pulmonar de células pequenas, retinoblastoma, sarcoma deEwing, câncer de próstata, câncer de cólon, ou câncer pancreático, de prefe-rência glioblastoma, neuroblastoma e rabdomiossarcoma. A expressão deALK e a proteína foram detectadas em muitos tumores de tecidos moles (Liet al., 2004). ALK de comprimento inteiro foi encontrada em nestes tumoreshumanos. Além disso, o anticcorpo é usado de preferência para tratamentoslocais. O mais preferido é o tratamento local de glioblastoma.

Outro aspecto da presente invenção é fornecer uma seqüênciade DNA que codifica o anticorpo da presente invenção. Um vetor de expres-são procariótico apropriado para ESBA512 (SEQ.ID NO: 19) é pTFT74 (videSEQ ID NO: 90 para a seqüência que inclui a seqüência codificadora deESBA512). Nesse caso, a seqüência codificadora de ESBA512 está sob ocontrole do promoter T7 e o produto gênico recombinante é usualmente puri-ficado sobre corpos de inclusão. Outro vetor de expressão procariótico prefe-rido é pAK400, onde a seqüência de ESBA512 é marcada com his para umapurificação simplificada (vide SEQ ID NO: 89 para a seqüência que inclui aseqüência codificadora de ESBA512). O produto gênico é secretado pelacélula hospedeira para dentro do periplasma.

Além disso, fornece-se um vetor de expressão que compreendea dita seqüência de DNA e uma célula hospedeira apropriada transformada como dito vetor. De preferência, a dita célula hospedeira é uma célula de E. coli.

Ainda outro aspecto da presente invenção é a produção do anti-corpo da presente invenção, compreendendo cultivar a célula hospedeiraque é transformada com o vetor de expressão para o dito anticorpo, sobcondições que permitem a síntese do dito anticorpo e recuperá-lo a partir dadita cultura.Outro aspecto da presente invenção é fornecer um epítopo deALK1 compreendendo ou consistendo essencialmente em resíduos 391-406de SEQ ID NO: 1. O dito epítopo é apropriado para identificar, triar ou Ievan-ter anticorpos anti-ALK ou fragmentos dele. De preferência, o anticorpo ouseu fragmento Iigante de antígeno que é capaz de se ligar especificamenteaos resíduos 391-406 (SEQ ID NO:1) de uma proteína ALK isolada ou frag-mento dela. Mais preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo de cadeia úni-ca (scFv), fragmento Fab1 IgG, ou IgM.

Em um outro aspecto, fornece-se uma vacina de ALK que com-preende uma proteína ALK isolada ou um fragmento dela, ou um ácido nu-cléico que codifica um epítopo de ALK is provided. De preferência, a vacinacompreende os resíduos 391-406 de uma proteína ALK isolada. A dita vaci-na é, de preferência, formulada com um carreador, adjuvante, e/ou haptenopara intensificar a resposta imune.

As seqüências da presente invenção são as seguintes:SEQ.ID. No. 1: GRIGRPDNPFRVALEY

Peptídeo epítopo de ALK humano (aminoácidos 391-406 da pro-teína ALK); os resíduos sublinhados são diferentes no homólogo do camun-dongo.

SEQ.ID. No. 2: RDAWLDVLSDGFDY

ESBA521 CDR 3 de VH. Os resíduos obtidos depois da rando-mização estão sublinhados.

SEQ.ID. No. 3: ATWDNDKWGVV

ESBA521 CDR 3 de VL. Os resíduos obtidos depois da rando-mização estão sublinhados.

SEQ.ID. No. 4:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAWLDVLSDGFDYWGQGTLVTVSS

VH de ESBA521. CDRs estão sublinhadas.SEQ.ID. No. 5:

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDntkrpsgipd rfsg sksgts atlgitg lqtg d eadyycatwdndkwgwfgggtklevlg

VL de ESBA521. CDRs estão sublinhadas.SEQ.ID. No. 6:AISGSGGSTYYADSVKGVH CDR 2 de ESBA521SEQ.ID. No. 7:AINMKGNDRYYADSVGKVH CDR 2 de scFv 265.1SEQ.ID. No. 8:

Al RTNSKEYYADSVKGVH CDR 2 de scFv 43.2SEQ.ID. No. 9AIKTDGNHKYYADSVKGVH CDR 2 de scFv 100.2SEQ.ID. No. 10:RTDSKEQYYADSVKG

VH CDR 2 de scFv2.11SEQ.ID. No. 11:ETSSGSTYYADSVKGVH CDR 2 de scFv 28.11SEQ.ID. No. 12:NTGGGSTYYADSVKGVH CDR 2 de scFv 33.11SEQ.ID. No. 13:

NTRGQNEYYADSVKGVH CDR 2 de scFv4.12SEQ.ID. No. 16

GGGGSGGGGSGGGGSSGGGSLigante que conecta VL e VHSEQ.ID. No. 17YYADSVKGMetade do terminal C da CDR2 de ESBA521 e seus derivados.SEQ.ID. No. 18DAGIAVAGTG FDYVH CDR3 de FW4.4SEQ.ID. No. 19

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPSGIPD RFSG SKSGTSATLGITG LQTG D EADYYCATWDN DKWGVVFGGGTKLEVLGGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAWLDVLSDGFDYWGQGTLVTVSSscFv ESBA521, CDRs sublinhadas, Iigante em itálicoSEQ. ID. No. 20QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPSG IPDR FSG S KSGTS ATLGITG LQTG D E ADYYCGTWDSSLSGVy FGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGfíFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGIAVAGTGFDYWGQGTLVTVSSFW4.4, CDRs estão sublinhadas, Iiante em itálicoSEQ ID No. 21cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccaggacagaaggtcaccatctcctgctççgqaaqcacctccaacattqqcqataattatqtatcctggtaccaacaactcccaqgaacagccccccaactcctcatttatqacaatactaaacqaccctcaqqqattcctgaccqqttctctggctccaagtctggcacgtcagccaccctgggcatcaccggactccagactggggacgaggccgattattactgcgcgacctgggataatgataagtggggtgtggttttcggcggagggaccaagctcgaggtcctaggtSeqüência de ácidos nucléicos de ESBA521 VLCDRs estão sublinhadasSEQ ID No. 22gaggtgcagctggtggagtccgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctqqattcacctttaqcaqctatqccatqaqctqqqtccqccaggctccaqqgaaggggctggagtgggtctcagctattaqtqqtaqtqqtqqtaqcacatactacqcaqactccqtqaaqqqccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactacQcacataatqcqtqqttaaatQtQctttcaaataactttqactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg

Seqüência de ácido nucléico de ESBA521 VHCDRs estão sublinhadasSEQ ID No. 23

cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccaggacagaaggtcaccatctcctgctççgqaaqcacctccaacattqqcqataattatqtatcctggtaccaacaactcccaggaacagccccccaactcctcatttatqacaatactaaacqaccctcaqggattcctgaccggttctctggctccaagtctggcacgtcagccaccctgggcatcaccggactccagactggggacgaggccgattattactgcgcgacctgggataatgataagXggggtgXggttttcggcggagggaccaagctcgaggtcclaggtggtggtggtggttctggtggtggtggttctggcggcggcggctccagtggtggtggatccgagg\gcagctgg\ggagtccgggggaggc\tggtgrggrrtr|gggQgtrrrtgagartntrrtgtgnagcctctqaattcaCCtttaqcaqCtatqCCatqaqrtgggtrrgrpaggrtr.ragggaaggggntggagtgqQtctcaqctattaqtqotaotqqtoqtaqcacatactacqcaqactccotqaaqqqccqqttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcagg*jggnar|^tgggagrpjflggarflrggnr.gtatattar.tncgCQCataatQCataattQaatQtqCtttcqqatqqctttqactactgqqgccagggaaccctggtcaccgtctcctcg

Seqüência de ácido nucléico de ESBA521

CDRs estão sublinhadas, Ligante em itálico

A invenção será agora descrita adicionalmente por meio de e-xemplos:

Materiais e Métodos

Geralmente, a prática da presente invenção emprega, a menosque diferentemente indicado, técnicas convencionais de química, biologiamolecular, tecnologia de DNA recombinante, imunologia (especialmente, porexemplo, recnologia de anticorpos), e técnicas padronizadas na preparaçãode polipeptídeos. Vide, por exemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Mole-cular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engi-neering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr(1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Se-ries, 169), McCafferty, Editor, Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual,Harlow et ai, C.S.H.L. Press, Pub. (1999); e Current Protocols in MolecularBiology, editores Ausubel etal., John Wiley & Sons (1992).

Experimento 1: Triagem para Identificar scFv's Ligantes de Alk

Em uma profusão de estudos estruturais sobre interações anti-corpos/antígenos descobriu-se que os resíduos na região determinante decomplementaridade 3 (CDR-H3) da cadeia pesada contribuem geralmentepara os contatos mais substanciais com o antígeno (Chothia and Lesk, 1987;Chothia et ai., 1985; Padlan, 1994). Foi aplicada a tecnologia de triagem porinteração de antígeno-anticorpo com dois híbridos de levedura recém-descritada presente invenção para isolar diretamente scFv s Iigantes de antígeno dasquarto bibliotecas de scFc's de seqüências CDR-H3 sintéticas randomizadas(Auf der Maur et al., 2002). As quatro bibliotecas baseiam-se em quatro es-truturas de scFvs humanos estáveis diferentes nos quais 7 aminoácidosdentro da alça da terceira CDR da cadeia pesada variável (VH-CDR3) foramrandomizadas. As partes randomizadas foram introduzidas por técnicas pa-dronizadas de clonagem por PCR. As bibliotecas de scFvs foram tríadascontra um peptídeo com 16 aminoácidos, derivado do domínio extracelularda tirosina cinase humana receptora Cinase de Linfoma Anaplásico (ALK)por um sistema de triagem em levedura denominado "Quality Contrai" (Aufder Maur et al., 2001; Auf der Maur et al., 2004). Resumidamente, a tecnolo-gia Quality Control é um sistema de seleção de intracorpos independente deantígeno para identificar entre uma coleção natural de cadeias humanas va-riável-leve (VL) e variável pesada (VH) aquelas combinações de VL e VHcom propriedades biofísicas favoráveis, tais como estabilidade, solubilidadee rendimento da expressão. Um Iigante promissor e específico entre umadas quatro bibliotecas de scFv's foi isolado depois da primeira etapa de tria-gem. Este scFv específico foi derivado a partir da biblioteca da estruturaFW4.4. FW4.4 (SEQ. ID. NO: 20) consiste em um domínio VL (IambdaI) co-nectado por um Iigante glicina-serina flexível clássico (GGGGS)4 a um domí-nio VH3. A VH CDR3 de FW4.4 compreende 13 aminoácidos (DAGIA-VAGTGFDY; SEQ.ID. No. 18). Para construir a biblioteca, a parte central daVH CDR3 (DAXXXXXXXGFDY) foi randomizada por métodos padronizadosde clonagem por PCR, usando um oligonucleotídeo degenerado. Os doisúltimos resíduos (Asp e Tyr) foram mantidos constantes porque sua importânciaestrutural foi demonstrada em muitos casos (Chothia e Lesk, 1987). Os resí-duos remanescentes não foram modificados para manter a complexidade dabiblioteca em dimensões controláveis. A biblioteca de scFvs foi clonada emum vetor de expressão em levedura (pLibl) como fusão do terminal C aodomínio de ativação transcricional de Gal4 (Auf der Maur et al., 2002).

O domínio de ligação do Iigante (LBD) de Alk humana foi esco-lhido como antígeno para a triagem quanto à interação (Stoica et al., 2001).Este peptídeo com 16 aminoácidos foi clonado dentro de outro vetor de ex-pressão em levedura (pBaitl) como fusão do terminal C à proteína Iigante deDNA, LexA.

A cepa de levedura repórter YDE173 (Auf der Maur et al., 2002)que contém os genes repórteres integrados de forma estável, HIS3 e IacZ,sob o controle de seis sítios de ligação de LexA foi transformada com o ve-tor-isca que expressa a Alk LBD fundida a LexA junto com a biblioteca descFvs aleatórios CDR-H3 fundidos ao domínio de ativação Gal4. As célulastransformadas foram selecionadas sobre placas sem histidina e contendo 3-amino-triazol 2,5 mM (3-AT), que é um inibidor competitivo do produto gêni-co HIS3. As colônias em crescimento foram colhidas durante um período deseis dias e os plasmídeos da bibloteca foram isolados. A mesma cepa-repórter foi transformada com os plasmídeos recuperados para confirmar aativação do gene dependente do antígeno. Um ensaio quantitativo com β-galactosidase líquida foi realizado para medir a intensidade da ligação entrea Alk LBD1 isto é, o peptídeo ALK com 16 aminoácidos, e o scFv selecionado.O scFv com ativação mais alta do gene-repórter também demonstrou a melhorafinidade (-31 nM) pelo peptídeo Alk LBD em ELISA (dados não ilustrados).

As seqüências de outras seqüências de VH CDR3 sidentificadascom contribuidoras para a ligação de ALK estão indicadas abaixo na Tabela 1 a.

<table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table>

As seqüências de outras estruturas apropriadas estão indicadasabaixo na Tabela 1 b.

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Experimento 2: Maturação da Afinidade

Para obter um scFv com afinidade mais alta, este Iigante primá-rio foi submetido a um outro processo de maturação da afinidade por muta-gênese e uma segunda rodada de triagem em levedura. Permitindo a matu-ração da afinidade, o nível de expressão da proteína de fusão do peptídeoLexA Alk LBD foi reduzido para diminuir a ativação do gene-repórter aciona-da pela interação do Iigante primário com o peptídeo Alk LBD. O promoterforte de actina no vetor pBaitl foi trocado pelo truncado, e assim sendo, umaversão menos ativa do promoter de ADH (álcool desidrogenase), resultandoem pBait3. Esta redução do nível de expressão da isca, na presença do Ii-gante primário, foi suficiente apra inibir o crescimento sobre placas sem his-tidina e contendo 3-AT 5 mM. A mutagênese do Iigante primário para matru-ação da afinidade foi realizada randomizando partes da CDR3 dentro da ca-deia variável leve. Isto foi realizado diretamente em levedura por recombina-ção homóloga (Schaerer-Brodbeck e Barberis, 2004). A VL CDR3 de FW4.4compreende 11 aminoácidos (SEQ. ID. No. 14: GTWDSSLSGVV). As duasprimeiras posições foram parcialmente randomizadas, de tal modo que aprimeira posição codifique Gly1 Ala ou Gln1 e a segunda posição, Thr, Ser ouAla. Nas posições 5 a 8 dentro da VL CDR3, todos resíduos de aminoácidosforam deixados. As posições remanescentes foram mantidas constantes. Arandomização foi introduzida por PCR. O produto da PCR resultante tinhaum tamanho de 356 pb e compreendia o cassete de CDR randomizado comas seqüências de estrutura de 267 pb a montante e 27 pb a jusante. Esteproduto é o denominado fragmento da PCR doador, que carrega homologiasao vetor-alvo. O vetor-alvo é o plasmídeo de levedura (pLibl) que codifica oIigante primário fundido ao domínio de ativação de Gal4. Para melhorar aeficiência da recombinação homóloga e para excluir falsos-positivos na tria-gem subseqüente, a CDR-L3 no vetor-alvo foi ligeiramente modificada. Umsítio de restrição singular Sacl foi introduzido no meio de VL CDR3, o queleva a um deslocamento de estrutura na parte codificadora de scFv da prote-ína de fusão e resulta em uma proteína truncada incapaz de se ligar a AlkLBD. Além disso, o sítio Sacl permite a linearização do vetor-alvo, o queaumenta a eficiência da recombinação em levedura.

A triagem foi iniciada por pré-transformaçao da cepa de levedurarepórter YDE173 com o plasmídeo (pBait3) que expressa LexA Alk LBD apartir do promotor de ADH truncado. Estas células de levedura pré-transformadas foram tornadas competentes novamente e co-transformadascom o vetor-alvo Iinearizado e com o fragmento da PCR doador, que carregahomologias a montante e a jusante da VL CDR3. Depois da recombinaçãohomóloga entre o produto da PCR e o vetor-alvo, a seqüência inusitada deVL CDR3 é integrada dentro do sítio correspondente do vetor-alvo. Comoresultado líquido deste episódio, a VL CDR3 primordial fica trocada com aVL CDR3 randomizada. Isto permite a reconstituição de um plasmídeo queexpressa uma proteína de fusão ompletamente funcional com uma seqüên-cia de VL CDR3 inusitada, que ativará a expressão do gene-repórter e per-mitirá o crescimento sobre placas seletivas depois da interação com o peptí-deo Alk LBD.

Um total de 119 clones cresceram sobre placas seletivas duran-te um período de observação de 6 dias. Estes clones foram coletados e osplasmídeos da biblioteca foram isolados e retransformados dentro da mesmacepa de levedura repórter. Um ensaio quantitativo de β-galactosidase líquidafoi realizado para medir a intensidade da ligação entre Alk LBD (antígeno) eo scFv maturado por afinidade. 20 clones com ativação de IacZ mais altatamém foram testados em ELISA com o peptídeo Alk LBD. O melhor candi-dato revelou uma K0 de cerca de 7 nM (Figura 3) e foi denominado ES-BA521.

As seqüências de outras seqüências de VL CDR3 identificadascomo contribuidoras para a ligação de ALK estão indicadas abaixo na Tabela 1c.

<table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table>

Experimento 3: O scFv ESBA521 se liga especificamente à forma trans-membrana da ALK humana

Para testar se o scFv recém-identificado foi capaz de reconhecertambém a proteína ALK humana transmembrana sobre a superfície de célu-las vivas, foram conduzidos experimentos de imunocoloração de célulasHELA transfectadas de forma transiente. ESBA521 reage com a proteínaALK de uma maneira comparável com um anticorpo policlonal (Figura 4). Emum experimento de controle, demonstrou-se que a estrutura 4.4 scFv nãoreage com ALK humana. Surpreendentemente, ESBA521 se liga apenas àproteína ALK humana, mas não com a proteína do camundongo correspon-dente, embora o peptídeo antigênico do camundongo difira apenas em duasposições de aminoácidos da seqüência do peptídeo humano. Em contraste,o anticorpo policlonal de ALK reconhece a proteína humana e do camun-dongo. Portanto, a ligação de ESBA521 é específica para a proteína ALKhumana na superfície celular.

Experimento 4: Isolamento de Iiqantes aperfeiçoados por mutagênese porPCR de VH CDR 2

Para melhorar ainda mais a ligação do antígeno, ESBA521 foiusado como o scFv de partida em uma outra rodada de maturação de afini-dade, usando a mesma abordagem com dois híbridos descrita para a primei-ra rodada de matruação de afinidade, exceto que neste caso a CDR2 de VHfoi mudada por mutagênese por PCR e transformada dentro de recipiente delevedura, onde a recombinação homóloga em CDR2 é forçada de maneiraanáloga. Novamente, um sítio de restrição foi introduzido em CDR2 parapermitira linearização do plasmídeo-alvo. As mutações introduzidas em C-DR2 estão indicadas na Tabela 2.

<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>

Entre os scFv's isolados obtidos depois deste procedimento,sete passaram a ter afinidade significativamente melhorada com uma KcI nafaixa de 2-3 nM (Figura 5), sendo o melhor deles o 28.11.Experimento 5: Prevenção do crescimento de tumores depois da administra-cão do anticorpo anti-ALK

Os progenitores do anticorpo ESBA521 foram selecionados parase ligarem aos aminoácidos 391-406 de ALK1 que compreende os aminoáci-dos (396-406) que reconhecidamente se ligam à pleiotrofina (Stoica 2001).ESBA521 foi obtido randomizando aminoácidos adicionais nas CDRs de seuprogenitor e selecionando quanto aos Iigantes que se ligam ao prolongamen-to de aminoácidos 391-406 contido em seu contexto natural do domínio ex-tracelular de ALK (ECD). Estes procedimentos resultaram em um anticorpoque se liga ao ECD de ALK com alta afinidade no mesmo sítio que liga PTN.Que seja do conhecimento dos autores desta invenção, este é o primeiroanticorpo monoclonal que marca especificamente o sítio Iigante de PTN deALK. Conseqüentemente, prevê-se que ESBA521 tenha alta afinidade peloECD de ALK ECD e compete eficientemente com pleiotrofina (PTN) e mid-quina (MK) pela ligação ao receptor ALK, e assim sendo, o anticorpo ES-BA521 é apropriado para inibir a ligação do Iigante de MK e PTN à proteínaALK.

Devido ao fato de que ALK e seus Iigantes estão envolvidos emneoplasia, invasão e angiogênese de tumores, a inibição da interação entreALK e seus cognates rompe a tumorigênese mediada por ALK.

O efeito de ESBA521 sobre um tumor específico pode ser de-terminado pelos dois ensaios que descritos abaixo.

Em um primeiro ensaio, experimentos com xenoenxertos sãopreparados para determinar o papel limitador da taxa de crescimento decâncer de ALK (Powers 2002). Resumidamente, é preparada uma suspen-são de células U87MG de 20 milhões de células/mL de meio suplementadacom 10% de soro fetal bovino. Ela é injetada em camundongos NU/NU e ostumores resultantes são medidos. Os anticorpos do teste, de preferênciaanticorpos de comprimento inteiro, mais preferivelmente anticorpos "peguila-dos", são introduzidos e o crescimento de tumores é avaliado.

Embora as modalidades atualmente preferidas da invenção te-nham sido ilustradas e descritas, deve-se entender distintamente que a in-venção não está limitada a elas, mas pode ser materializada variadamentede outra forma e praticada dentro do âmbito das reivindicações que se seguem.REFERÊNCIAS

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www.emedicine.com/med/topic2692,htm (glioblastoma)www.emedicine.com/MED/topic3205.htm (ALCL)LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> ESBATech AG

<120> Anticorpos que se ligam ao domínio extracelular do receptor tirosinacinase ALK

<130> P100661PC

<150> US 60/795,831<151> 2006-04-28

<160> 91

<170> Versão Patentin 3.3

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 'l

Gly Arg Ile Gly Arg Pro Asp Asn Pro Phe Arg Val Ala Leu Glu Tyr1 5 10 15

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia pesada de ESBA521<400> 2

Arg Asp Ala Trp Leu Asp Val Leu Ser Asp Gly Phe Asp Tyr1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve de ESBA521<400> 3

Ala Thr Trp Asp Asn Asp Lys Trp Gly Val Val1 5 10

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Região variável com cadeia pesada de ESBA521

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlySer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Ala Trp Leu Asp Val Leu Ser Asp Gly Phe Asp Tyr Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 5

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Região variável com cadeia leve de ESBA521<400> 5

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asp Asn20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Gln Leu Leu35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asn Asp Lys85 90 95

Trp Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Leu Gly100 105 110<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada de ESBA521<400> 6

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 265.1<400> 7

Ala Ile Asn Met Lys Gly Asn Asp Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gly15 10 15

Lys

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR2 CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 43.2<400> 8

Ala Ile Arg Thr Asn Ser Lys Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly15 10 15

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 100.2<400> 9

Ala Ile Lys Thr Asp Gly Asn His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 2.11<400> 10

Arg Thr Asp Ser Lys Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly1 5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 28.11<400> 11

Glu Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 33.11<400> 12

Asn Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly1 5 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 4.12<400> 13

Asn Thr Arg Gly Gln Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly1 5 10 15

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223>

CDR3 da região variável com cadeia leve da estrutura 4.4<400> 14Gly Thr Trp Asp Ser 1 5<210> 15<211> 248<212> PRT<213> Artificial<220> <223> seqüência da<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Leu Thr His Tyr20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Asp Thr Ser Lys Arg Ala Thr Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Ser Trp Pro His85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly115 120 125

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ala Gln Pro Gly130 135 140

Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser145 150 155 160

Tyr Ala Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp165 170 175

Val Ala Val Ile Ser Asn Asp Gly Arg Ile Glu His Tyr Ala Asp Ala180 185 190

Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Val195 200 205Phe Leu Gln Met Asn Ser210

Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr

215

220

Cys Ala Arg Glu225

Ile Gly230

Ala Thr Gly Tyr Leu Asp Asn Trp Gly Gln

235

240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser245

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Ligante que conecta VH e VL em ESBA521<400> 16

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser15 10 15

Gly Gly Gly Ser20

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Metade terminal de C de CDR2 de ESBA521 e seus derivados.

<400> 17

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly1 5

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da seqüência variável com cadeia pesada da estrutura 4.4 4.4<400> 18

Asp Ala Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr15 10

<210> 19

<211> 253

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> Fragmento de anticorpo com cadeia única ESBA521<400> 19

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln15 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asp Asn20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Gln Leu Leu35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asn Asp Lys85 90 95

Trp Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Leu Gly Gly100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly115 120 125

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln130 135 140

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe145 150 155 160

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu165 170 175

Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn195 200 205

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Trp Leu Asp Val Leu Ser Asp Gly Phe225 230 235 240

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser245 250

<210> 20<211> 253<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> scFv servindo como estrutura

<400> 20

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln15 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asp Asn20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Gln Leu Leu35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu85 90 95

Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly115 120 125

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln130 135 140

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe145 150 155 160

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu165 170 175

Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn195 200 205

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Gly Phe225 230 235 24054

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser245 250

<210> 21

<211> 333

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Região variável com cadeia leve de ESBA521<400> 21

cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60

tcctgctccg gaagcacctc caacattggc gataattatg tatcctggta ccaacaactc 120

ccaggaacag ccccccaact cctcatttat gacaatacta aacgaccctc agggattcct 180

gaccggttct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240

actggggacg aggccgatta ttactgcgcg acctgggata atgataagtg gggtgtggtt 300

ttcggcggag ggaccaagct cgaggtccta ggt 333

<210> 22

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Região variável com cadeia pesada de ESBA521<400> 22

gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgcgc gcgtgatgcg 300

tggttggatg tgctttcgga tggctttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 3 60

tcctcg 366

<210> 23<211> 759<212> DNA<213> Artificial<220> <223> Anticorpo ι

<400> 23

cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60

tcctgctccg gaagcacctc caacattggc gataattatg tatcctggta ccaacaactc 120

ccaggaacag ccccccaact cctcatttat gacaatacta aacgaccctc agggattcct 180gaccggttct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240actggggacg aggccgatta ttactgcgcg acctgggata atgataagtg gggtgtggtt 300ttcggcggag ggaccaagct cgaggtccta ggtggtggtg gtggttctgg tggtggtggt 360tctggcggcg gcggctccag tggtggtgga tccgaggtgc agctggtgga gtccggggga 420ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt 480agcagctatg ccatgagctg ggtccgccag gctccaggga aggggctgga gtgggtctca 540gctattagtg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc 600atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag 660gacacggccg tatattactg cgcgcgtgat gcgtggttgg atgtgctttc ggatggcttt 720gactactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcg 759

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR3 da região variável com cadeia pesada de framework 4.4

<400> 24

Asp Ala Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr1 .5 10

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR3 da região variável com cadeia pesada de H5 SH 2.1<400> 25

Asp Ala Lys Phe Met Ser Asp Gly Ile Gly Phe Asp Tyr15 10

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR3 da região variável com cadeia pesada de H5 SH 4.1<400> 26

Asp Ala Trp Gly Trp Thr Ile Leu Ser Gly Phe Asp Tyr15 10

<210> 27<211> 13<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia pesada de H5 SH 5.1<400> 27

Asp Ala Ala Tyr Met Ile Arg Tyr Glu Gly Phe Asp Tyr1 5 10

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia pesada de H5 SH 2.3<400> 28

Asp Ala Trp Ile Tyr Trp Ala Arg Glu Gly Phe Asp Tyr15 10

<210> 29

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia pesada de H5 SH 3.3<400> 29

Asp Ala Cys Met Thr Tyr Ser Arg Glu Gly Phe Asp Tyr15 10

<210> 30

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia pesada de H5 SH 5.3<400> 30

Asp Ala Trp Leu Asp Val Leu Ser Asp Gly Phe Asp Tyr15 10

<210> 31

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia pesada de H5 SH 14.3<400> 31

Asp Ala Pro Ser Val Asn Asp Arg Glu Gly Phe Asp Tyr15 10

<210> 32<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do WT FW4.4

<400> 32

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val1 5 10

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-9.1<400> 33

Ala Ala Trp Asp Ser Val Lys His Gly Val Val1 5 10

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-21.1<400> 34

Ala Ala Trp Asp Asn Ser Met Arg Gly Val Val1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-22.1<400> 35

Ala Ala Trp Asp Thr Met Arg Tyr Gly Val Val1 5 10

<210> 36

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-25.1<400> 36

Ala Ala Trp Asp Thr Thr Arg Val Gly Val Val1 5 10<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-27.1

<400> 37

Ala Ser Trp Asp Thr Met Leu Lys Gly Val Val15 10

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-28.1<400> 38

Ala Ser Trp Asp Thr Pro Thr Cys Gly Val Val15 10

<210> 39

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-29.1<400> 39

Ala Thr Trp Asp Ile Ser Arg Cys Gly Val Val15 10

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-46.1<400> 40

Ala Thr Trp Asp Thr Val Cys Ala Gly Val Val15 10

<210> 41

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-53.1

<400>

41Ala Thr Trp Asp Val Asp Val Phe Gly Val Val1 5 10

<210> 42<211> 11<212> PRT<213> Artificial<220> <223> CDR3 da região<400> 42

Ala Thr Trp Asp Asp Val Val Gly Gly Val Val1 5 10

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-86.1<400> 43

Ala Ala Trp Asp Ser Phe Tyr Asn Gly Val Val15 10

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-94.1<400> 44

Ala Ser Trp Asp Thr Leu Ile Glu Gly Val Val15 10

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-107.1<400> 45

Ala Thr Trp Asp Asn Asp Lys Trp Gly Val Val15 10

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-112.1<400> 46

Ala Ala Trp Asp Ser Thr Thr Cys Gly Val Val1 5 10

<210> 47<211> 11<212> PRT<213> Artificial<22 0> <223> CDR3 da região

<400> 47

Ala Thr Trp Asp Met Trp Met Lys Gly Val Val1 5 10

<210> 48<211> 11<212> PRT<213> Artificial<22 0> <223> CDR3 da região<400> 48

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val15 10

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-118.1<400> 49

Ala Ala Trp Asp Trp Val Leu Gly Gly Val Val15 10

<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 14.3-6.1<400> 50

Ala Thr Trp Asp Asn Pro Gly Gln Gly Val Val15 10

<210> 51<211> 11<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 14.3-7.1<400> 51

Ala Thr Trp Asp Asp Trp Val Ile Gly Val Val1 5 10

<210> 52<211> 11<212> PRT<213> Artificial<22 0> <223> CDR3 da região<400> 52

Ala Ser Trp Asp Asp Gln Lys Trp Gly Val Val15 10

<210> 53 <211> 11 <212> PRT ' <213> Artificial <22 0> <22 3> CDR3 da região variável com cadeia leve<400> 53 Ala Thr Trp Asp Thr Asn Arg His Gly Val Val1 5 10<210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 da região variável com cadeia leve<400> 54 Ala Ser Trp Asp Asp Leu His Ile Gly Val Val1 5 10<210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 da região variável com cadeia leve<400> 55

Ala Ser Trp Asp Glu Glu Ala Trp Gly Val Val1 5 10<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 14.3-21.1<400> 56

Ala Thr Trp Asp Tyr Ile Lys Ile Gly Val Val1 5 10

<210> 57

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 14.3-48.1<400> 57

Ala Thr Trp Asp Thr Phe Glu Arg Gly Val Val1 5 10

<210> 58

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 14.3-49.1<400> 58

Ala Thr Trp Asp Ser Asn Leu Ile Gly Val Val1 5 10

<210> 59

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-24., 1<400> 59

Ala Thr Trp Asp Asn Asn Thr Cys Gly Val Val1 5 10

<210> 60

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-3.1

<400> 60Ala Ala Trp Asp Cys Asp Ile Asn Gly Val Val1 5 10

<210> 61

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-8.1<400> 61

Ala Ser Trp Asp Ser Met Lys Ile Gly Val Val1 5 10

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR3 da região variável com cadeia leve do 5.3-19.1<400> 62

Ala Thr Trp Asp Cys Thr Arg Ala Gly Val Val15 10

<210> 63

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv WT (ESBA521)<400> 63

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15

Gly

<210> 64

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 1.1<400> 64

Ala Ile Lys Thr Asp Gly Gln Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly15 10 15

<210> 65<211> 17<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 17.1<400> 65

Ala Ile Arg Ser Asp Gly Asn Glu Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15

Gly

<210> 66

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 35.1<400> 66

Ala Ile Asn Thr Asn Gly Asn Glu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15

Gly

<210> 67

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 64.1<400> 67

Ala Ile Ser Thr Asn Gly Lys Glu Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15

Gly

<210> 68<211> 17<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 130.1<400> 68

Ala Ile Arg Thr Gln Ser Gln Glu Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15

Gly<210> 69

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 152.1

<400> 69

Ala Ile Lys Ser Arg Ser Gln Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly

<210> 70

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 167.1<400> 70

Ala Ile Lys Ser His Ser Gln Gln Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly

<210> 71

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 214.1<400> 71

Ala Ile Asn Ser Glu Gly Gln Gln Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly

<210> 72

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 225.1

<400> 72

Ala Ile Lys Ser Lys Gly Gln Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15Gly

<210> 73

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 262.1<400> 73

Ala Ile Arg Thr Asn Ser Glu Glu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly

<210> 74

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 265.1<400> 74

Ala Ile Asn Met Lys Gly Asn Asp Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly

<210> 75

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 43.2<400> 75

Ala Ile Arg Thr Asn Ser Lys Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly15 10 15

<210> 76

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 70.2<400> 76

Ala Ile Lys Thr Glu Ser Gln Gln Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15Gly

<210> 77

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 99.2<400> 77

Ala Ile Asn Ser Asn Gly Lys Gln Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15

Gly

<210> 78

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 100.2<400> 78

Ala Ile Lys Thr Asp Gly Asn His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15

Gly

<210> 79

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 109.2<400> 79

Ala Ile Asp Thr Lys Gly Asn Gly Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15

Gly

<210> 80

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 146.2<400> 80

Ala Ile Arg Ser Asp Ser Ser His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15

Gly

<210> 81

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 173.2<400> 81

Ala Ile Asn Thr Lys Ser Asn Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly

<210> 82

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 199.2<400> 82

Ala Ile Arg Thr Asp Ser Lys Asn Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly

<210> 83

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 2.11<400> 83

Ala Ile Arg Thr Asp Ser Lys Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly

<210> 84<211> 17<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 19.11<400> 84

Ala Ile Arg Thr Asn Ser Lys Glu Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15

Gly

<210> 85

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 28.11<400> 85

Ala Ile Glu Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly

<210> 86

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 33.11<400> 86

Ala Ile Asn Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly

<210> 87

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 4.12<400> 87

Ala Ile Asn Thr Arg Gly Gln Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15

Gly<210> 88

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 da região variável com cadeia pesada do scFv 6.12

<400> 88

Ala Ile Ser Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly1 5 10 15

<210> 89

<211> 2520

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> expression vector pAK400 with the ESBA521 coding seguence

<400> 89 acccgacacc atcgaatggc gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga 60gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc 120cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa 180aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc 240acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct 300gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag 360cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa 420tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc 480cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca 540gacacccatc aacagtatta ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca 600tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc 660ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat 720agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct 780gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc 840aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg cgttggtgcg gacatctcgg tagtgggata 900cgacgatacc gaagacagct catgttatat cccgccgtta accaccatca aacaggattt 960tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt 1020gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa 1080tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 1140ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcggt acccgataaa agcggcttcc tgacaggagg 1200ccgttttgtt ttgcagccca cctcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca 1260ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 1320caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgaat ttctagagaa ggagatatac 1380atatgaaata cctattgcct acggcagccg ctggattgtt attactcgcg gcccagccgg 1440ccatggcgga ctacaaagac cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc 1500caggacagaa ggtcaccatc tcctgctccg gaagcacctc caacattggc gataattatg 1560tatcctggta ccaacaactc ccaggaacag ccccccaact cctcatttat gacaatacta 1620aacgaccctc agggattcct gaccggttct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc 1680tgggcatcac cggactccag actggggacg aggccgatta ttactgcgcg acctgggata 1740atgataagtg gggtgtggtt ttcggcggag ggaccaagct cgaggtccta ggtggtggtg 1800gtggttctgg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccag tggtggtgga tccgaggtgc 1860agctggtgga gtccggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga ctctcctgtg 1920cagcctctgg attcaccttt agcagctatg ccatgagctg ggtccgccag gctccaggga 1980aggggctgga gtgggtctca gctattagtg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact 2040ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa 2100tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg cgcgcgtgat gcgtggttgg 2160atgtgctttc ggatggcttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcgg 2220cctcgggggc cgatcaccat catcaccatc attagtaagc ttgacctgtg aagtgaaaaa 2280tggcgcacat tgtgcgacat tttttttgtc tgccgtttac cgctactgcg tcacggatcc 2340ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 2400cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 2460cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggc atccctttag ggttccgatt 2520

<210> 90

<211> 3319

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Vetor de expressão PTFT74 com seqüência de ESBA521<400> 90

acccgacacc atcgaaatta atacgactca ctatagggag accacaacgg tttcccgaattgtgagcgga taacaataga aataattttg tttaacttta agaaggagat atatccatggcgcagtctgt gctgacgcag ccgccctcag tgtctgcggc cccaggacag aaggtcaccatctcctgctc cggaagcacc tccaacattg gcgataatta tgtatcctgg taccaacaactcccaggaac agccccccaa ctcctcattt atgacaatac taaacgaccc tcagggattcctgaccggtt ctctggctcc aagtctggca cgtcagccac cctgggcatc accggactccagactgggga cgaggccgat tattactgcg cgacctggga taatgataag tggggtgtgg

60120180240300360420ttttcggcgg agggaccaag ctcgaggtcc taggtggtgg tggtggttct ggtggtggtg 480

gttctggcgg cggcggctcc agtggtggtg gatccgaggt gcagctggtg gagtccgggg 540

gaggcttggt acagcctggg gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct 600

ttagcagcta tgccatgagc tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggtct 660

cagctattag tggtagtggt ggtagcacat actacgcaga ctccgtgaag ggccggttca 720

ccatctccag agacaattcc aagaacacgc tgtatctgca aatgaacagc ctgagagccg 780

aggacacggc cgtatattac tgcgcgcgtg atgcgtggtt ggatgtgctt tcggatggct 840

ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc gtagtaagct tcagtcccgg 900

gcagtggatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct 960

gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg 1020

aaaggaggaa ctatatccgg atcgagatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 1080

ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 1140

tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 1200

aaatcggggc atccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa 12 60

acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 1320

tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 1380

caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg 1440

gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt 1500

tacaatttca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 1560

ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 1620

atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 1680

tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 1740

tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 1800

ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 1860

atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 1920

ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 1980

catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 2040

cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 2100

ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 2160

cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 2220

cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 22 80

tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 2340

agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 2400

ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 2460gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 2520

atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagatcctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtcagaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg

258026402700

ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 2760

28202880294030003060

accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtccttctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacctcgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgggttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttcgtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc taçagcgtgagctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 3120

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 3180

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 3240

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 3300

ctggcctttt gctcacatg 3319

<210> 91

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 91

Val Leu Gln Gly Arg Ile Gly Arg Pro Asp Asn Pro Phe Arg Val Ala15 10 15

Leu Glu Tyr Ile Ser Ser20

Claims

1. Anticorpo que se liga à proteína ALK humana, caracterizadopelo fato de que compreende uma CDR3 da cadeia pesada variável de umaseqüência com pelo menos 50% de identidade de seqüência, de preferênciapelo menos 60%, 70%, 75%, 85%, e mais preferivelmente pelo menos 90%,à seqüência SEQ. ID. NO: 2.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende uma CDR3 da cadeia pesada variável da seqüênciaSEQ. ID. NO: 2.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a ligação à proteína ALK humana é específica.

4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de anticorpo, anticorposcFv ou um fragmento Fab.

5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo scFv.

6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio H3 VH e um do-mínio VL lâmbda 1.

7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a estrutura de VH e VL é estável e solúvel,de modo a ser funcional em um ambiente redutor intracelular.

8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende a estrutura 4.4.

9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo se liga a um peptídeo epí-topo de ALK com 16 aminoácidos de uma seqüência com pelo menos 75%de identidade de seqüência à seqüência SEQ. ID NO: 1.

10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que o peptídeo epítopo de ALK tem a seqüência SEQ ID NO:1.

11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracteri-zado pelo fato de que a afinidade pelo peptídeo epítopo de ALK se caracterizapor uma Kc] de 30 nM ou menos, de preferência 10 nM ou menos, e maispreferivelmente abaixo de 3 nM.

12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 11, caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR3 da cadeia levevariável de uma seqüência com pelo menos 50% de identidade de seqüên-cia, de preferência pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, ou mais preferivel-mente pelo menos 90%, à seqüência SEQ ID NO: 3.

13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 11, caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR3 da cadeia levevariável da seqüência SEQ ID NO: 3.

14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 13, caracterizado pelo fato de que se liga a um peptídeo epítopo de ALKcom 16 aminoácidos de uma seqüência com pelo menos 75% , de preferên-cia 100% de identidade de aminoácidos à seqüência SEQ ID NO: 1.

15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 14, caracterizado pelo fato de que a afinidade pelo peptídeo epítopo deALK é dada por uma Kd menor do que 10 nM, de preferência menor do que 7 nM.

16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 15, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência VH deSEQ ID NO: 4 e uma seqüência VL de SEQ ID NO: 5.

17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 16, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma mutaçãoem pelo menos das CDR s, resultando em uma afinidade mais alta caracte-rizada por uma KcJ menor do que cerca de 3 nM.

18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a dita mutação é em CDR1 ou CDR2 de VH e/ou VL.

19. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a dita mutação ou as ditas mutações são em CDR2 de VH.

20. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 19, caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR2 da cadeia pe-sada variável que compreende uma seqüência selecionada no grupo deSEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:-11, SEQ ID NO: 12, ou SEQ ID NO: 13.

21. Anticorpo de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que as ditas seqüências definidas de CDR2 são precedidas pe-los resíduos de aminoácidos Al e seguidas pelas seqüências de SEQ ID NO:-17.

22. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 21, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende uma se-qüência VH de SEQ ID NO: 14 e uma seqüência VL de SEQ ID NO: 15.

23. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5a 22, caracterizado pelo fato de que compreende a estrutura NH2-VL-ligante-VH-COOH ou NH2-VH-ligante-VL-COOH, onde o Iigante tem a se-qüência SEQ ID NO: 16.

24. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 23, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é radiomarcado ou mar-cado com toxina.

25. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 24, caracterizado pelo fato de ser como um medicamento ou uma ferra-menta diagnostica.

26. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivin-dicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de ser para a produção de um me-dicamento para o tratamento de cânceres ou tumores.

27. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de que o medicamento é apropriado para a inibição de MK e/ou PTNligando-se a ALK e/ou sinalização mediada por ALK.

28. Uso de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizadopelo fato de que o medicamento é um medicamento combinado apropriadopara administrar o dito anticorpo em combinação com um agente anticâncer,por exemplo, metotrexato.

29. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de que o tratamento é um tratamento de neuroblastoma, glioblastoma,rabdomiossarcoma, carcinoma de mama, melanoma, câncer pancreático,NHL de células B1 carcinoma tireóideo, carcinoma pulmonar de células pe-quenas, retinoblastoma, sarcoma de Ewing, câncer de próstata, câncer decólon, câncer pancreático, lipoma, lipossarcoma, fibrossarcoma, particular-mente glioblastoma, neuroblastoma e rabdomiossarcoma.

30. Seqüência de DNA, caracterizada pelo fato de que que codi-fica o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.

31. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compre-ende a seqüência de DNA, como definida na reivindicação 30.

32. Céula hospedeira apropriada, caracterizada pelo fato de queé transformada com um vetor de expressão, como definido na reivindicação-31, particularmente uma célula de E. coli.

33. Método para a produção de um anticorpo, como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de quecompreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 32,sob condições que permitem a síntese do ditto, e recuperá-lo a partir de ditacultura.

34. Vacina de ALK, caracterizada pelo fato de que compreendeuma proteína ALK isolada ou um seu fragmento, ou um ácido nucléico quecodifica um epítopo de ALK.

35. Vacina de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelofato de que a vacina compreende os resíduos 391-406 de uma proteína ALKisolada.

36. Vacina, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracteri-zada pelo fato de que a vacina consiste nos resíduos 391-406 de uma prote-ína ALK isolada, formulada com um carreador, adjuvante, e/ou haptenos,para intensificar a resposta imune à proteína ALK ou seu fragmento.

37. Anticorpo ou seu fragmento Iigante de antígeno, caracteriza-da pelo fato de que é capaz de se ligar especificamente aos resíduos da re-gião que cobre os resíduos de aminoácidos 391 ± 3 e 406 ± 3 (SEQ ID NO:-91), mais preferível mente os aminoácidos 391-406 (SEQ. ID. No: 1), de umaproteína ALK isolada ou seu fragmento.

38. Anticorpo de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato de que é um anticorpo de cadeia única (scFv), fragmento Fab, IgG1 ou IgM.

39. Epítopo de ALK apropriado para identificar, triar, ou levantaranticorpos anti-ALK ou seus fragmentos, caracterizado pelo fato de que oepítopo de ALK é um fragmento de, compreende ou consiste essencialmentena região que cobre os resíduos de aminoácidos 391 ± 3 e 406 ± 3 (SEQ. IDNo: 91), e mais preferivelmente os aminoácidos 391-406 (SEQ. ID.No: 1).

40. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 8, caracterizado pelo fato de que se liga a um epítopo que é um fragmentode, compreende ou consiste essencialmente na regiões que cobre os resí-duos de aminoácidos 391 ± 3 e 406 ± 3 (SEQ ID NO: 91), e mais preferivel-mente os aminoácidos 391-406 (SEQ IDNO: 1).