KR102037016B1

KR102037016B1 - 항 pd-l1 나노 항체 및 이의 응용

Info

Publication number: KR102037016B1
Application number: KR1020187016857A
Authority: KR
Inventors: 샤오닝 쉔; 샤오니우 미아오; 샤오린 리우
Original assignee: 이노벤트 바이오로직스 (쑤저우) 컴퍼니, 리미티드
Priority date: 2016-08-04
Filing date: 2017-08-03
Publication date: 2019-10-25
Also published as: JP2019528033A; ES2899036T3; EP3369745A1; EP3369745B1; US20190023793A1; CN107686520B; CN107686520A; BR112018068998A2; CA3007021C; CA3007021A1; AU2017305366B2; WO2018024237A1; KR20180069931A; US11274153B2; EP3369745A4; AU2017305366A1; JP6670935B2

Abstract

본 발명은 인간 프로그램화 사멸 인자PD-L1에 대한, PD-L1과 수용체 PD-1의 결합을 차단시키는 기능을 구비하는 나노 항체를 공개한다. 본 발명은 상기 나노 항체 및 상기 나노 항체를 코딩하는 유전자 서열, 상응한 발현 담체 및 상기 나노 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포, 및 나노 항체의 생산 방법을 공개한다. 아울러 인간화의 PD-L1 나노 항체 서열을 더 공개하고, 인간화 후의 나노 항체는 여전히 PD-L1과 PD-1의 결합을 차단하는 기능, 비교적 높은 친화력 및 비교적 우수한 특이성을 구비한다.

Description

항 PD-L1 나노 항체 및 이의 응용

본 발명은 생물 의학 또는 생물 제약 기술 분야에 관한 것으로, 더 구체적으로, PD-L1에 대한 나노 항체 및 이의 코딩 서열과 용도에 관한 것이다.

프로그램화 사멸 인자1 리간드1(programmed death 1 ligand 1, PD-L1)은 CD274라고도 불리우고, B7 패밀리 구성원이며, PD-1의 리간드이다. PD-L1은 I형 막관통 단백질에 속하고, 모두 290개의 아미노산(amino acid)이 있으며, 1개의 IgV형 영역, 1개의 IgC형 영역, 1개의 막 소수성 영역 및 1개의 30개의 아미노산으로 이루어진 세포 내 영역을 포함한다.

기타 B7 패밀리 분자와 달리, PD-L1은 면역 응답을 부정적으 조절하는 작용을 구비한다. 연구 결과, PD-L1은 주로 활성화된 T세포, B세포, 대식 세포 및 수지상 세포 등에 발현되고, PD-L1은 림프구 세포를를 제외한 흉선, 심장, 태반 등의 내피 세포와 같은 기타 다양한 조직, 및 흑색종, 간암, 위암, 신장 세포암, 난소암, 결장암, 유방암, 식도암, 두경부암 등과 같은 비림프성 유형에서도 발현된다. PD-L1은 자가 반응성 T, B세포 조절 및 면역 내성 면에서 일정한 일반성을 구비하고, 말초 조직 T세포 및 B세포의 응답에 작용을 한다. 종양 세포에서의 PD-L1의 높은 발현은 암 환자의 불량 예후와 관련된다.

PD-L1에 결합된 프로그램화 사멸 인자1(programmed death-1, PD-1)은 CD279라고도 불리우고, CD28 패밀리 구성원이며, 이의 세포질 영역에는 2개의 티로신(tyrosine) 잔기를 함유하고, N단에 접근하는 1개는 면역 수용체 티로신 억제 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)에 위치하며, C단에 접근하는 1개는 면역 수용체 티로신 형질 전환 모티프(immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM)에 위치한다. PD-1은 주로 활성화된 T림프구, B림프구 및 대식 세포 표면에서 발현된다. 정상인 경우에, PD-1은 T림프구의 기능을 억제하고, Treg의 기능을 촉진하여, 자가 면역 응답을 억제하며, 자가 면역성 질환의 발생을 방지할 수 있다. 그러나 종양의 발생에 있어서, 종양 세포에 의해 발현되는 PD-L은 PD-1과 결합한 후 림프구에 대한 억제 작용을 통해 종양의 면역 도피를 촉진할 수 있다. PD-L1과 PD-1의 결합은 림프구의 증식 및 활성화를 억제하고, CD4+ T세포가 Th1 및 Th17세포로 분화되는 것을 억제하며, 염증성 사이토카인(cytokine)의 방출을 억제하는 것과 같은 면역 조절을 일으키는 다양한 생물학적 변화를 야기할 수 있다.

단일 클론 항체는 암의 검출 및 생물 표적화 치료 면에서 성공적으로 적용되어, 종양 치료의 변혁을 일으켰다. 그러나, 기존의 단일 클론 항체(150kD)의 분자 질량은 너무 크고, 조직을 관통하기 어려우며, 종양 영역의 유효 농도가 비교적 낮고, 치료 효과가 불충분하며; 기존의 항체는 매우 높은 면역 원성을 구비하고, 개조된 항체는 원래의 친화력을 달성하기 매우 어렵다. 이 외에, 완전 인간화의 기존의 항체의 개발 주기가 길고, 생산 단가가 높으며, 안정성이 부족한 등 여러가지 요인으로 인해 임상에서의 이의 적용 및 보급이 제한된다.

나노 항체는 현재 가장 작은 항체 분자이고, 이의 분자량은 일반 항체의 1/10이다. 나노 항체는 단일 클론 항체의 항원 반응성 외에도, 분자 질량이 작고, 안정성이 강하며, 가용성이 우수하고, 발현이 쉬우며, 면역 원성이 약하고, 관통성이 강하며, 표적성이 강하고, 인간화가 간단하며, 제조 단가가 저렴한 등 일부 독특한 기능 특성을 구비하여, 기존의 항체의 개발 주기가 길고, 안정성이 비교적 낮으며, 보관 조건이 가혹한 등 흠결을 거의 완전히 극복하였다.

그러나, 현재 본 기술분야는 PD-L1에 대한 만족스러운 나노 항체가 부족하다. 따라서, 본 기술분야는 PD-L1에 효과적인 새로운 특이성 나노 항체를 개발하는 것이 절실히 수요된다.

본 발명의 목적은 PD-L1에 효과적인 특이성 나노 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 제1양태는, SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 CDR2, SEQ ID NO: 7로 표시되는 CDR3으로 이루어진 항 PD-L1 나노 항체 VHH 사슬의 상보성 결정 영역 CDR 영역을 제공한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 VHH 사슬의 프레임 워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4에 의해 이격된 것이다.

본 발명의 제2양태는, (a) SEQ ID NO: 1로 표시되는 FR1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 FR2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 FR3, SEQ ID NO: 4로 표시되는 FR4로 이루어지거나; 또는

(b) SEQ ID NO: 10으로 표시되는 FR1, SEQ ID NO: 11로 표시되는 FR2, SEQ ID NO: 12로 표시되는 FR3, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 FR4로 이루어진 프레임 워크 영역 FR 및 본 발명의 제1양태에 따른 상보성 결정 영역 CDR을 포함하는 항 PD-L1 나노 항체의 VHH 사슬을 제공한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 항 PD-L1 나노 항체의 VHH 사슬은 SEQ ID NO.: 8 또는 SEQ ID NO.: 14로 표시된다.

본 발명의 제3양태는, PD-L1 에피토프(epitope)에 대한 나노 항체이고, SEQ ID NO.: 8 또는 SEQ ID NO.: 14로 표시되는 아미노산 서열의 VHH 사슬을 구비하는 항 PD-L1 나노 항체를 제공한다.

본 발명의 제4양태는, 본 발명의 제1양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체 VHH 사슬의 CDR 영역, 본 발명의 제2양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체의 VHH 사슬, 또는 본 발명의 제3양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)를 제공한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO.: 9 또는 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 구비한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함한다.

본 발명의 제5양태는, 본 발명의 제4양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 담체를 제공한다.

본 발명의 제6양태는, 본 발명의 제5양태에 따른 발현 담체, 또는 게놈(Genome)에 통합된 본 발명의 제4양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 대장균, 효모 세포로부터 선택된다.

본 발명의 제7양태는, 나노 항체를 생성하기 적합한 조건 하에서, 본 발명의 제6양태에 따른 숙주 세포를 배양하여, 상기 항 PD-L1 나노 항체를 포함하는 배양물을 획득하는 단계(a); 및

상기 배양물로부터 상기 항 PD-L1 나노 항체를 분리 또는 회수하는 단계(b)를 포함하는 항 PD-L1 나노 항체를 생성하는 방법을 제공한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 항 PD-L1 나노 항체는 SEQ ID NO.: 8 또는 SEQ ID NO.: 14로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다.

본 발명의 제8양태는, (a) 본 발명의 제2양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체의 VHH 사슬, 또는 본 발명의 제3양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체; 및

(b) 검출 가능한 라벨, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 또는 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 커플링(Coupling) 부분을 포함하는 면역 접합체를 제공한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 커플링 부분은 약물 또는 독소이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 커플링 부분은 검출 가능한 라벨이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 접합체는 형광 또는 발광 라벨, 방사성 라벨, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(컴퓨터 단층 촬영 기술) 조영제, 또는 검출 가능한 산물을 생성할 수 있는 효소, 방사성 핵종, 생물 독소, 사이토카인(예컨대 IL-2 등), 항체, 항체 Fc세그먼트, 항체 scFv세그먼트, 골드 나노 입자/나노 로드, 바이러스 입자, 리포좀, 나노 자성 입자, 프로드러그(prodrug) 활성화 효소(예를 들어, DT-디아포라아제(DT-diaphorase, DTD) 또는 비페닐(biphenyl) 가수분해 효소 유사 단백질(BPHL)), 화학 치료제(예를 들어, 시스플라틴(cisplatin)) 또는 임의의 형태의 나노 입자 등으로부터 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 면역 접합체는 다가(예컨대 2가)의 본 발명의 제2양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체의 VHH 사슬, 본 발명의 제3양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체를 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 다가는, 상기 면역 접합체의 아미노산 서열에서 복수개의 중복되는, 본 발명의 제2양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체의 VHH 사슬, 본 발명의 제3양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체를 포함하는 것을 지칭한다.

본 발명의 제9양태는, (a) PD-L1 분자를 검출하기 위한 시약; (b) 종양을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한 본 발명의 제3양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체의 용도를 제공한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 검출은 유세포 검출, 세포 면역 형광 검출을 포함한다.

본 발명의 제10양태는, (i) 본 발명의 제1양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체 VHH 사슬의 상보성 결정 영역 CDR, 본 발명의 제2양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체의 VHH 사슬, 또는 본 발명의 제3양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체, 또는 본 발명의 제8양태에 따른 면역 접합체; 및

(ii) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물을 제공한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 약물 조성물은 주사 제형이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 약물 조성물은 위암, 간암, 백혈병, 신장 종양, 폐암, 소장암, 골암, 전립선암, 결장직장암, 유방암, 대장암, 전립선암, 자궁경부암, 림프종, 부신 종양, 또는 방광 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한 것이다.

본 발명의 제11양태는, 본 발명의 제3양태에 따른 항 PD-L1 나노 항체의 인간 PD-L1 분자를 검출을 위한 용도(i);

유세포 검출을 위한 용도(ii);

세포 면역 형광 검출을 위한 용도(iii);

종양을 치료하기 위한 용도(iv);

종양을 진단하기 위한 용도(v)인 하나 또는 여러가지 용도를 제공한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 용도는 비진단적인 것과 비치료적인 것이다.

본 발명의 제12양태는, (i) 본 발명의 제2양태에 따른 중쇄 가변 영역 VHH의 서열 또는 본 발명의 제3양태에 따른 나노 항체의 서열; 및

(ii) 발현 및/또는 정제를 선택적으로 협조하는 태그(tag) 서열을 구비하는 재조합 단백질을 제공한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 태그 서열은 6 His태그 및 HA태그를 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 재조합 단백질은 PD-L1 단백질에 특이적으로 결합된다.

본 발명의 제13양태는, 약품, 시약, 검출 플레이트 또는 키트 제조에 사용되는 본 발명의 제2양태에 따른 VHH 사슬, 본 발명의 제3양태에 따른 나노 항체, 또는 본 발명의 제8양태에 따른 면역 접합체의 용도를 제공하고;

여기서, 상기 시약, 검출 플레이트 또는 키트는 샘플 중 PD-L1 단백질을 검출하기 위한 것이며;

여기서, 상기 약품은 PD-L1단백질(즉 PD-L1양성)을 발현하는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 것이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 위암, 림프종, 간암, 백혈병, 신장 종양, 폐암, 소장암, 골암, 전립선암, 결장직장암, 유방암, 대장암, 전립선암, 또는 부신 종양을 포함한다.

본 발명의 제14양태는, 샘플을 본 발명의 제3양태에 따른 나노 항체와 접촉시키는 단계(1);

항원-항체 복합체 생성 여부를 검출하고, 여기서 복합체를 형성하면 샘플 중 PD-L1단백질이 존재함을 표시하는 단계(2)를 포함하는 샘플 중 PD-L1단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제15양태는, 필요한 대상에게 본 발명의 제3양태에 따른 나노 항체 또는 본 발명의 제8양태에 따른 면역 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 대상은 인간과 같은 포유 동물을 포함한다.

본 발명의 제16양태는, SEQ ID NO: 1로 표시되는 FR1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 FR2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 FR3, SEQ ID NO: 4로 표시되는 FR4로 이루어진 항 PD-L1 나노 항체 VHH 사슬의 프레임 워크 영역 FR을 제공한다.

본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 기술특징과 하기(예컨대 실시예)에서 구체적으로 서술하는 각 기술특징들을 서로 조합하여, 새롭거나 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있음을 이해하여야 한다. 편폭의 제한으로, 여기서 일일이 서술하지 않는다.

도1은 항원 단백질 및 나노 항체의 정제 SDS-PAGE 도면이고, 도면에서 A는 핵산 분자 표준이며, B는 정제된 hPD-L1(ECD)-Fc단백질이고, C는 TEV효소로 Fc태그 단백질을 절단하여 제거한 후 정제된 hPD-L1(ECD)단백질이며, D는 발현 정제된 PD-L1 Nb-Fc단백질이고, E는 비오틴화(Biotinylation)의 PD-1-Fc단백질이며, 상기 단백질은 모두 HEK293F세포에 의해 발현된다.
도2는 구축된 라이브러리의 라이브러리 용량 검출 도면이고, 구축된 라이브러리는 구배 희석된 후 플레이팅되며, 도면은 1/5의 구배로 104배, 105배, 106배 희석한 클론 개수를 나타내고, 단일 클론 개수를 산출하여 라이브러리 크기를 결정한다.
도3은 구축된 라이브러리의 삽입률 검출 도면으로, 구축된 나노 항체 라이브러리의 삽입률 검출 결과이고, 왼쪽으로부터 오른쪽의 겔 포어(gel pores)의 DNA 밴드는 각각 첫 번째 레인은 DNA 분자 마커이며, 나머지 레인은 세그먼트를 검출 삽입한 PCR 산물이고, PCR 산물 밴드는 약 500 bp이며; 검출을 거쳐, 상기 라이브러리의 삽입률은 95.8 %에 도달한다.
도4는 PD-L1 나노 항체의 선별 농축 과정이고, 1회 선별을 거친 후 농축이 일어나지 않으며, 2회 선별에서 4배 농축되고, 3회 선별에서 210배 농축되는 것을 나타낸다.
도5는 1개의 대장균으로부터 발현된 PD-L1 나노 항체의 정제도이고, SEQ ID NO.8 아미노산 서열의 나노 항체에 대응되며, 니켈 컬럼 수지 겔 친화 크로마토그래피(Nickel column resin gel affinity chromatography)에 의해 정제된 후, PD-L1 나노 항체의 SDS-PAGE의 전기 영동도이다. 결과, PD-L1 나노 항체 상기 정제 과정을 거쳐, 이의 순도가 90 % 이상에 도달하는 것을 나타낸다.
도6은 FACS로 PD-L1 나노 항체의 차단 효과를 검출하고, 인간 전체 길이 PD-L1 단백질을 일시적으로 발현하는 HEK293F 세포를 각 군의 나노 항체 및 비오틴화의 hPD-1-Fc단백질과 공동 반응시킨다.
도7은 진핵 발현 인간화의 PD-L1 나노 항체의 정제도이고, HEK293F세포에 의해 4가지 인간화의 PD-L1 나노 항체를 발현하며, 여기서 A는 단백질 분자 표준이고, B는 SEQ ID NO.10 아미노산 서열에 의해 코딩된 인간화의(humanized) PD-L1 Nb단백질이며, 발현된 상기 항체는 Fc태그 단백질을 함유하고, 단백질 순도는 90 % 이상에 도달한다.
도8은 FACS로 인간화의 PD-L1 나노 항체의 차단 효과를 검출하고, PD-L1단백질을 천연적으로 발현하는 EBC-1세포를 인간화의 나노 항체 및 비오틴화의 hPD-1-Fc 단백질과 공동 발현시키며, 샴대조군 및 음성 대조군의 PD-1-Fc-비오틴과 EBC-1세포의 결합률은 90 % 이상이고, PD-L1 나노 항체와 인간화의 나노 항체를 넣은 후, PD-1-Fc-비오틴과 EBC-1세포의 결합률은 단지 10 % 이하이며, 이는 넣은 나노 항체가 PD-1과 PD-L1의 상호 작용을 현저하게 차단하는 것을 나타낸다.
도9는 PD-L1 나노 항체 친화력 측정 결과이고, BiaCore T200으로 PD-L1 나노 항체의 친화력을 측정한 결과, 인간화 전의 나노 항체의 친화력은 2.34Х10^-9 M이고, 인간화 후의 나노 항체의 친화력은 2.26Х10^-9 M이다. 인간화 개조는 항체의 친화력에 영향을 미치지 않는다.
도10은 ELISA로 PD-L1 나노 항체의 특이성을 검출한 결과이고, 인간화 전, 후의 PD-L1 나노 항체는 단지 인간의 및 원숭이의 PD-L1과 상호 작용하며, 마우스의 및 PD-L1 패밀리의 기타 구성원과 상호 작용하지 않고, 두 개의 나노 항체는 비교적 우수한 특이성을 구비한다.
도11은 MOA방법을 사용하여 PD-1/PD-L1의 상호 작용에 대한 나노 항체의 억제 작용을 나타내고, 여기서 인간화 전의 나노 항체는 기본적으로 양성 대조군보다 활성이 강하고, 인간화 후의 본 발명의 나노 항체의 활성은 양성 대조군에 해당된다.
도12는 본 발명의 나노 항체 및 인간화 개조 후의 항체가 모두 T세포를 효과적으로 활성화시킬 수 있고, 활성화 효과는 양성 대조군 항체와 유사하다.
도13은 본 발명의 나노 항체의 종양 억제 활성 연구에서의 투여 방식을 나타낸다.
도14는 인간화의 Nb-Fc로 접종된 마우스에서 종양 체적은 대조군에 비해 매우 우수하게 제어되고, 유의하게 증가되는 경우가 나타나지 않았으며, 인간화의 Nb-Fc가 현저한 종양 억제 작용이 있음을 나타낸다.
도15는 본 발명의 인간화의 Nb-Fc가 대조군 항체에 대해 더 우수한 가용성을 구비하는 것을 나타낸다.
도16은 인간화의 Nb-Fc의 순도에 현저한 변화가 없음을 나타낸다.
도17은 인간화의 Nb-Fc 및 CHO-PDL1세포의 결합에서 현저한 변화가 없음을 나타낸다.

본 발명자는 광범위하고 깊은 연구를 통하고, 다량의 선별을 거쳐, 항 PD-L1 나노 항체를 성공적으로 획득하였으며, 실험 결과는 본 발명에서 획득한 PD-L1 나노 항체가 PD-L1과 PD-1 사이의 상호 작용을 효과적으로 차단할 수 있음을 나타내고, 본 발명의 인간화를 거친 후의 PD-L1 나노 항체는 PD-L1과 PD-1의 결합을 더 효과적으로 차단할 수 있으며, BiaCore T200 감정에 따르면, 인간화 후의 PD-L1 나노 항체의 친화력은 높고, 안정성은 좋으며, 종양 억제 작용이 현저한 것을 놀랍게도 발견하였다. 이 기초상에서 본 발명을 완성하였다.

구체적으로, 본 발명은 인간 유래의 PD-L1항원 단백질을 사용하여 낙타를 면역시키고, 고품질의 면역 나노 항체 유전자 라이브러리를 획득한다. 다음 PD-L1단백질 분자를 ELISA 플레이트에 결합시켜, PD-L1단백질의 정확한 공간 구조를 나타내고, 이 형태의 항원은 파지(phage) 디스플레이 기술을 이용하여 면역 나노 항체 유전자 라이브러리(낙타 중쇄 항체 파지 디스플레이 유전자 라이브러리)를 선별하여, PD-L1 특이성 나노 항체 유전자를 획득하였다. 다음 이 유전자를 대장균에 옮겨, 대장균에서 고효율적으로 발현되고, 특이성이 높은 나노 항체 균주를 획득하였다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "본 발명의 나노 항체”, "본 발명의 항 PD-L1 나노 항체”, "본 발명의 PD－L1나노 항체”를 서로 교환하여 사용할 수 있고, 모두 특이적으로 식별되고 PD-L1(인간 PD-L1 포함)에 결합되는 나노 항체를 지칭한다. 특히 바람직하게는 SEQ ID NO.:8 또는 14로 표시되는 나노 항체와 같은 VHH 사슬의 아미노산 서열이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체” 또는 "면역 글로불린”은 동일한 구조 특징을 갖는 약 150000달톤(Dalton)의 이소테트라글리코프로테인(Isotetra-glycoproteins)으로, 두 개의 동일한 경쇄(L) 및 두 개의 동일한 중쇄(H)로 구성된다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디설파이드(Disulfide) 결합을 통하여 중쇄에 연결되고, 상이한 면역 글로불린의 동종형의 중쇄간의 디설파이드 결합의 개수는 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬 내 디설파이드 결합을 갖는다. 각각의 중쇄의 일단에는 가변 영역(VH)이 있고, 그 후는 복수개의 불변 영역이다. 각각의 경쇄의 일단에는 가변 영역(VL)이 있고, 타단에는 불변 영역이 있으며; 경쇄의 불변 영역은 중쇄의 제1 불변 영역에 대향하고, 경쇄의 가변 영역은 중쇄의 가변 영역에 대향한다. 특수한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 사이에 계면을 형성한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "단일 도메인 항체(VHH)", "나노 항체”(nanobody)는 동일한 의미를 구비하고, 클론 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭하며, 단 하나의 중쇄 가변 영역으로 이루어진 단일 도메인 항체(VHH)를 구축하고, 이는 완전한 기능을 구비하는 가장 작은 항원 결합 세그먼트이다. 통상적으로 먼저 천연 결실 경쇄 및 중쇄 불변 영역1(CH1)의 항체를 획득한 후, 다시 항체 중쇄의 가변 영역을 클로닝하고, 단 하나의 중쇄 가변 영역으로 이루어진 단일 도메인 항체(VHH)를 구축한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "가변”은 항체의 가변 영역의 일부 부분이 서열에서 상이한 것을 나타내고, 이는 이의 특정된 항원에 대한 각종 특정 항체의 결합과 특이성을 형성한다. 그러나, 가변성은 전체 항체 가변 영역에 균일하게 분포되어 있지 않다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 영역에서 상보성 결정 영역(CDR) 또는 과가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 영역에서 비교적 보수적인 부분을 프레임 워크 영역(FR)이라고 부른다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 대체적으로 β-폴드 형태인 네 개의 FR영역을 포함하고, 연결링을 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결되며, 일부 경우에는 부분적인 β폴드 구조를 형성한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 단단히 함께 고정되고 다른 하나의 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성한다(Kabat 등, NIH Publ. No. 91-3242, 권I, 647-669페이지(1991)를 참조바람). 불변 영역은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 참여하지 않지만, 이들은 예를 들어 참여하는 항체의 항체 의존성 세포 독성과 같은 상이한 효과 기능을 나타낸다.

본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 면역 접합체 및 융합 발현 산물은 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소 및 기타 진단 또는 치료 분자가 본 발명의 항체 또는 이의 세그먼트에 결합되어 형성된 접합체를 포함한다. 본 발명은 상기 항 PD-L1 단백질 항체 또는 이의 세그먼트에 결합된 세포 표면 라벨 또는 항원을 더 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 가변 영역”과 "V_H"를 서로 교환하여 사용할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "가변 영역”과 "상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)"을 서로 교환하여 사용할 수 있다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 항체의 중쇄는 상기 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다.

본 발명에서, 용어 "본 발명의 항체”, "본 발명의 단백질”, 또는 "본 발명의 폴리펩티드"를 서로 교환하여 사용할 수 있고, 모두 PD-L1단백질에 특이적으로 결합되는 예를 들어 중쇄 가변 영역을 구비하는 단백질 또는 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드를 지칭한다. 이들은 시작 메티오닌(methionine)을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다.

본 발명은 본 발명의 항체를 구비하는 기타 단백질 또는 융합 발현 산물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역은 동일하거나 적어도 90 %의 상동성, 바람직하게는 적어도 95 %의 상동성이 있는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 구비하는 임의의 단백질 또는 단백질 접합체 및 융합 발현 산물(즉 면역 접합체 및 융합 발현 산물)을 포함한다.

일반적으로, 항체의 항원 결합 특성은 중쇄 가변 영역에 위치하는 3개의 특정된 영역으로 설명되되, 가변 영역(CDR)이라고 지칭하고, 상기 세그먼트를 4개의 프레임 워크 영역(FR)으로 간격을 두며, 4개의 FR의 아미노산 서열은 상대적으로 비교적 보수적이고, 직접적으로 결합 반응에 참여하지 않는다. 이러한 CDR은 환상 구조를 형성하되, 이 사이의 FR에 의해 형성된

폴드는 공간 구조 상에서 서로 가깝고, 중쇄 상의 CDR과 대응되는 경쇄 상의 CDR에 의해 항체의 항원 결합 부위를 구성한다. 동일한 유형의 항체의 아미노산 서열을 비교하여 어느 아미노산이 FR 또는 CDR 영역을 구성하는지를 확정할 수 있다.

본 발명의 항체의 중쇄의 가변 영역은 항체의 적어도 일부가 항원 결합에 관련되기 때문에 특히 흥미롭다. 따라서, 이의 CDR이 이 부위에서 감정된 CDR과 90 % 이상(바람직하게는 95 % 이상, 가장 바람직하게는 98 % 이상)의 상동성을 구비하면, 본 발명은 CDR를 갖는 항체 중쇄 가변 영역을 구비하는 분자를 포함한다.

본 발명은 완전한 항체를 포함할 뿐만 아니라, 면역 활성을 구비하는 항체의 세그먼트 또는 항체와 기타 서열로 형성된 융합 단백질을 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 항체의 세그먼트, 유도체 및 유사체를 더 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “세그먼트”, "유도체” 및 "유사체”는 본 발명의 항체와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 기본적으로 유지하는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명의 폴리펩티드 세그먼트, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 또는 복수개의 보수적이거나 비보수적인, 유전 암호에 의해 암호화되거나 암호화되지 않을 수도 있는 아미노산 잔기(바람직하게는 보수적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드, 또는 (ii) 하나 또는 복수개의 아미노산 잔기에 치환기를 구비하는 폴리펩티드, 또는 (iii) 성숙한 폴리펩티드와 다른 화합물(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리펩티드 반감기를 연장시키는 화합물)을 융합시켜 형성된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가된 아미노산 서열을 상기 폴리펩티드 서열에 융합시켜 형성된 폴리펩티드(예컨대 선도 서열 또는 분비 서열 또는 상기 폴리펩티드를 정제하기 위한 서열 또는 단백질 서열, 또는 6 His 태그와 형성된 융합 단백질)일 수 있다. 본 명세서의 교시에 따르면, 이러한 세그먼트, 유도체 및 유사체는 본 기술분야의 통상의 기술자가 공지하는 범위에 속한다.

본 발명의 항체는 PD-L1단백질 결합 활성을 갖는, 상기 CDR 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 용어는 본 발명의 항체와 동일한 기능을 갖는, 상기 CDR 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변이 형태를 더 포함한다. 이러한 변이 형태는 하나 또는 복수개의(통상적으로 1 ~ 50개, 바람직하게 1 ~ 30개, 더 바람직하게 1 ~ 20개, 가장 바람직하게 1 ~ 10개)아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환, 및 C말단 및/또는 N말단에 하나 또는 복수개의(통상적으로 20개 이내, 바람직하게는 10개 이내, 더 바람직하게는 5개 이내) 아미노산을 추가하는 것을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음). 예를 들어, 본 기술분야에서, 성능이 비슷하거나 유사한 아미노산으로 치환할 경우, 통상적으로 단백질의 기능을 변화시키지 않는다. 또한 예를 들어, C말단 및/또는 N말단에 하나 또는 복수개의 아미노산을 첨가하여도 통상적으로 단백질의 기능을 변화시키지 않는다. 상기 용어는 본 발명의 항체의 활성 세그먼트 및 활성 유도체를 더 포함한다.

상기 폴리펩티드의 변이 형태는 상동성 서열, 보수적 변이체, 대립 유전자, 천연 돌연변이체, 유도 돌연변이체, 높거나 낮은 엄격한 조건 하에서 본 발명의 항체의 코딩 DNA와 혼성화될 수 있는 DNA가 코딩한 단백질, 및 본 발명의 항체를 저항하는 항혈청을 이용하여 획득한 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.

본 발명은 나노 항체 또는 이의 세그먼트를 포함하는 융합 단백질과 같은 기타 폴리펩티드를 더 제공한다. 본 발명은 거의 전체 길이의 폴리펩티드를 제외한 본 발명의 나노 항체의 세그먼트를 더 포함한다. 통상적으로, 상기 세그먼트는 본 발명의 항체의 적어도 약 50개의 연속된 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 50개의 연속된 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 약 80개의 연속된 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 약 100개의 연속된 아미노산을 구비한다.

본 발명에서, "본 발명의 항체의 보수적 변이체”는 본 발명의 항체의 아미노산 서열 대비, 많아도 10개, 바람직하게는 많아도 8개, 더 바람직하게는 많아도 5개, 가장 바람직하게는 많아도 3개의 아미노산이 성질이 비슷하거나 유사한 아미노산에 의해 대체되어 폴리펩티드를 형성하는 것을 지칭한다. 이러한 보수적 변이 폴리펩티드는 바람직하게는 표1의 아미노산 치환에 따라 생성된다.

본 발명은 상기 항체 또는 이의 세그먼트 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 형태 또는 RNA 형태일 수 있다. DNA 형태는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인공 합성된 DNA를 포함한다. DNA는 단일 사슬 또는 이중 사슬일 수 있다. DNA는 코딩 사슬 또는 비코딩(non-coding) 사슬일 수 있다.

본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 성숙한 폴리펩티드만 코딩하는 코딩 서열; 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열 및 각종 부가 코딩 서열; 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열(및 임의의 부가 코딩 서열) 및 비코딩 서열을 포함한다.

용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드”는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 부가 코딩 및/또는 비코딩 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 서열에 혼성화되고 두 개의 서열 사이에 적어도 50 %, 바람직하게 적어도 70 %, 더 바람직하게 적어도 80 %의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건 하에서 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드와 혼성화 가능한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "엄격한 조건”은, (1) 0.2ХSSC, 0.1 %의 SDS, 60 ℃와 같은 비교적 낮은 이온 강도 및 비교적 높은 온도 하에서의 혼성화 및 용출; 또는 (2) 혼성화할 시 50 %(v/v)의 포름아미드(formamide), 0.1 %의 송아지 혈청/0.1 %의 Ficoll, 42 ℃의 온도 등과 같은 변성제를 첨가; 또는 (3) 두 가닥의 서열 사이의 상동성이 적어도 90 % 이상, 바람직하게는 95 % 이상일 경우에만 혼성화가 발생되는 것을 지칭한다. 또한, 혼성화 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 성숙한 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능과 활성을 구비한다.

본 발명의 항체의 뉴클레오티드 전체 길이 서열 또는 이의 세그먼트는 통상적으로 PCR 증폭 방법, 재조합 방법 또는 인공 합성 방법을 사용하여 획득할 수 있다. 가능한 방법으로는 인공 합성 방법을 사용하여 관련 서열을 합성하는 것이고, 특히 세그먼트 길이가 비교적 짧을 경우이다. 통상적으로, 복수개의 작은 세그먼트를 먼저 합성하고, 다음 다시 연결시킴으로써 서열이 매우 긴 세그먼트를 획득할 수 있다. 이 외에, 중쇄의 코딩 서열과 발현 태그(예컨대 6 His)를 함께 융합시켜, 융합 단백질을 형성할 수 있다.

일단 관련 서열을 획득하면, 재조합 방법을 사용하여 관련 서열을 대량으로 획득할 수 있다. 이는 통상적으로 이를 담체에 클로닝하고, 다시 세포에 옮긴 후, 통상적인 방법에 의해 증식 후의 숙주 세포로부터 분리하여 관련 서열을 획득하는 것이다. 본 발명에 관련된 생물 분자(핵산, 단백질 등)는 분리된 형태로 존재하는 생물 분자를 포함한다.

현재, 화학적 합성에 의해 본 발명의 단백질(또는 이의 세그먼트, 또는 이의 유도체)을 코딩하는 DNA 서열을 완전히 획득할 수 있다. 다음 상기 DNA 서열을 본 기술분야에 공지된 각종 기존의 DNA 분자(또는 예컨대 담체) 및 세포에 인입시킬 수 있다. 이 외에, 화학적 합성에 의해 돌연변이를 본 발명의 단백질 서열에 더 인입시킬 수 있다.

본 발명은 또한 상기 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 제어 서열을 포함하는 담체에 관한 것이다. 이러한 담체는 단백질을 발현할 수 있도록 적절한 숙주 세포의 형질 전환에 사용될 수 있다.

숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 또는 포유 동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 대표적인 예로 대장균, 스트렙토마이세스(Streptomyces); 살모넬라 티피무리움(salmonella typhimurium)의 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포; 초파리 S2 또는 Sf9의 곤충 세포; CHO, COS7, 293세포의 동물 세포 등일 수 있다.

재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질 전환은 본 기술분야의 통상의 기술자가 숙지하는 통상적인 기술을 사용하여 진행할 수 있다. 숙주가 대장균과 같은 원핵 생물인 경우, DNA를 흡수할 수 있는 컴피턴트 세포(competent cell)를 지수 성장기 후에 수확하고, CaCl₂방법으로 처리할 수 있으며, 사용되는 단계는 본 기술분야에서 공지된 것이다. 다른 하나의 방법은 MgCl₂를 사용한다. 필요한 경우, 형질 전환은 전기 천공 방법으로 진행할 수도 있다. 숙주가 진핵 세포인 경우, 인산칼슘(calcium phosphate) 공동 침전 방법 및 미세 주입, 전기 천공, 리포좀 포장 등 통상적인 기계적 방법과 같은 DNA 형질 감염 방법을 선택하여 사용할 수 있다.

획득한 형질 전환체는 통상적인 방법으로 배양하여, 본 발명의 유전자가 코딩하는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 사용된 숙주 세포에 따라, 배양에서 사용되는 배지는 각종 통상적인 배지로부터 선택될 수 있다. 숙주 세포 성장에 적합한 조건 하에서 배양한다. 숙주 세포가 적절한 세포 밀도로 성장된 후, 적절한 방법(예컨대 온도 변환 또는 화학적 유도)으로 선택된 프로모터를 유도하고, 세포를 일정한 시간 동안 재배양한다.

상기 방법에서 재조합 폴리펩티드는 세포 내, 또는 세포막에서 발현되거나, 세포 외로 분비될 수 있다. 필요한 경우, 이의 물리적, 화학적 및 기타 특성을 이용하여 각종 분리 방법을 통하여 재조합 단백질을 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 방법은 본 기술분야의 통상의 기술자가 숙지하고 있는 것이다. 이러한 방법의 예는 통상적인 재생 처리, 단백질 침전제로 처리(염석 방법), 원심 분리, 침투 파균, 초처리, 초원심 분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 기타 각종 액체 크로마토그래피 기술 및 이러한 방법의 결합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항체는 단독으로 사용되거나, 검출 가능한 라벨(진단 목적을 위해), 치료제, PK(단백질 키나아제(Protein kinase)) 변형 부분 또는 임의의 상기 이러한 물질의 조합과 결합 또는 접합될 수 있다.

진단 목적으로 검출 가능한 라벨은 형광 또는 발광 라벨, 방사성 라벨, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(컴퓨터 단층 촬영 기술) 조영제, 또는 검출 가능한 산물을 생성할 수 있는 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항체에 결합되거나 접합될 수 있는 치료제는 1. 방사성 핵종; 2. 생물학적 독; 3. IL-2 등의 사이토카인; 4. 골드 나노 입자/나노 로드(nanorod); 5. 바이러스 입자; 6. 리포좀; 7. 나노 자성 입자; 8. 프로드러그 활성화 효소(예를 들어, DT-디아포라아제(DTD) 또는 비페닐 가수분해 효소 유사 단백질(BPHL)); 10. 화학 치료제(예를 들어, 시스플라틴) 또는 임의의 형태의 나노 입자 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

약물 조성물

본 발명은 조성물을 더 제공한다. 바람직하게, 상기 조성물은 상기 항체 또는 이의 활성 세그먼트 또는 이의 융합 단백질, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약물 조성물이다. 통상적으로, 이러한 물질을 무독성의, 불활성의, 약학적으로 허용 가능한 수성 담체 매질에 조제할 수 있고, 여기서 pH는 통상적으로 약 5 ~ 8이며, 바람직하게, pH는 약 6 ~ 8이고, pH 값은 조제된 물질의 성질 및 치료할 증상에 따라 변화될 수 있다. 조제된 약물 조성물은 종양 내, 복강 내, 정맥 내 또는 국소 투여를 포함하는(하지만 이에 한정되지 않음) 통상적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 약물 조성물은 PD-L1단백질 분자에 직접 결합하여, 종양 치료에 사용될 수 있다. 이 외에, 기타 치료제도 동시에 사용할 수 있다.

본 발명의 약물 조성물은 안전 유효량(예를 들어 0.001 ~ 99 wt%, 바람직하게는 0.01 ~ 90 wt%, 더 바람직하게는 0.1 ~ 80 wt%)의 본 발명의 상기 나노 항체(또는 이의 접합체) 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유한다. 이러한 담체는 식염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세린(glycerin), 에탄올(ethanol), 및 이의 조합을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음). 약물 제제는 투여 방식과 매칭되어야 한다. 본 발명의 약물 조성물은 예를 들어 생리 식염수 또는 포도당 및 기타 보조제를 함유하는 수용액을 사용하는 통상적인 방법에 의해 제조되는 주사 형태로 제조될 수 있다. 주사, 용액과 같은 약물 조성물은 무균 조건 하에서 제조되는 것이 적합하다. 활성 성분의 투여량은 치료 유효량이고, 예를 들어 매일 약 10 ~ 50 mg/kg 체중이다. 이 외에, 본 발명의 폴리펩티드는 기타 치료제와 함께 사용될 수 있다.

약물 조성물을 사용할 경우, 안전 유효량의 면역 접합체를 포유 동물에게 투여하는 것으로, 여기서 상기 안전 유효량은 통상적으로 적어도 약 10 μg/kg 체중이며, 대부분의 경우 약 50 mg/kg 체중을 초과하지 않고, 바람직하게, 상기 투여량은 약 10 ~ 10 mg/kg 체중이다. 물론, 구체적인 투여량은 숙련된 의사의 기술 범위 내에 있는 투여 경로, 환자 건강 상태 등과 같은 요인을 고려하여야 한다.

라벨링(labeling)된 나노 항체

본 발명의 하나의 바람직한 예에서, 상기 나노 항체는 검출 가능한 라벨을 구비한다. 바람직하게, 상기 라벨은 동위 원소, 콜로이드금(Colloidal gold) 라벨, 착색 라벨 또는 형광 라벨로 이루어진 군으로부터 선택된다.

콜로이드금 라벨링은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 진행될 수 있다. 본 발명의 하나의 바람직한 수단에서, 항 PD-L1의 나노 항체는 콜로이드금으로 라벨링되어, 콜로이드금으로 라벨링된 나노 항체를 얻는다.

본 발명의 항 PD-L1 나노 항체는 매우 우수한 특이성 및 매우 높은 효과를 구비한다.

검출 방법

본 발명은 또한 PD-L1단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대체적으로 하기와 같다. 세포 및/또는 조직 샘플을 얻고; 샘플을 매질에 용해시키며; 상기 용해된 샘플의 PD-L1단백질의 수준을 검출한다.

본 발명의 검출 방법에서, 사용되는 샘플은 특별히 한정되지 않고, 대표적인 예로 세포 보존액에 존재하는 세포를 함유하는 샘플이다.

키트

본 발명은 본 발명의 항체(또는 이의 세그먼트) 또는 검출 플레이트를 포함하는 키트를 더 제공하고, 본 발명의 하나의 바람직한 예에서, 상기 키트는 용기, 사용 설명서, 버퍼(buffer) 등을 더 포함한다.

본 발명은 PD-L1수준을 검출하기 위한, PD-L1단백질을 식별하는 항체, 샘플을 용해하기 위한 용해 매질, 검출에 필요한 각종 완충액, 검출 라벨, 검출 기질 등과 같은 통상적인 시약 및 완충액을 포함하는 키트를 제공한다.

응용

상술한 바와 같이, 본 발명의 나노 항체는 광범위한 생물학적 응용 가치 및 임상 응용 가치가 있고, 이의 응용은 PD-L1과 관련된 질환의 진단 및 치료, 기초 의학 연구, 생물학적 연구 등 여러가지 분야에 관한 것이다. 하나의 바람직한 응용은 PD-L1의 임상 진단 및 표적화 치료를 위한 것이다.

본 발명의 주요한 장점은 하기와 같다.

(a) 본 발명의 나노 항체는 인간의 정확한 공간 구조의 PD-L1단백질에 대하여 고특이적이다.

(b) 본 발명의 나노 항체의 친화력은 강하다.

(c) 본 발명의 나노 항체의 생산은 간편하다.

아래 구체적인 실시예에 결부하여, 본 발명을 더 설명한다. 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아님을 이해하여야 한다. 하기 실시예에 구체적인 조건이 표기되지 않은 실험 방법은 통상적으로 예를 들어 Sambrook 등, 분자 클로닝, 실험실 지침(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)의 통상의 조건, 또는 제조업체에서 권장하는 조건에 따른다. 다른 설명이 없는 한, 백분율과 부수는 중량 백분비와 중량 부수이다.

실시예1: 인간 PD-L1 단백질의 발현 및 정제

(1) 인간 PD-L1의 뉴클레오티드 서열을 pCDNA3.1(-) 담체(Invivogen으로부터 구매함)에 합성시킨 후, 이의 세포 외 세그먼트 서열을 pFUSE-IgG1 담체(Invivogen으로부터 구매함)에 서브 클로닝하고, 여기서 hPD-L1(ECD)의 C단에 하나의 TEV 절단 부위를 인입하여, Fc 태그가 없는 hPD-L1(ECD) 단백질의 제조가 용이하도록 하며;

(2) Omega플라스미드 맥시 키트(plasmid maxi kit)를 사용하여 구축된 pF

SE-IgG1-hPD-L1(ECD) 플라스미드를 추출하고;

(3) HEK293F세포를 OD가 2.0Х10⁶개/mL까지 배양하며;

(4) 플라스미드와 형질 감염 시약 PEI를 1: 3으로 균일하게 혼합한 후 20분 동안 정치한 후, HEK293F세포에 넣어, 37 ℃, 6 %의 CO₂ 쉐이커(shaker) 인큐베이터에서 5 ~ 6일 배양하고;

(5) 세포 상등액을 수집하여, 실온 하에서 1시간 동안 Protein A 비드(bead)에 결합시키며;

(6) pH7.0의 인산염 완충액으로 비드를 세척한 후, 다시 0.1 M의 pH가 3.0인 글리신(Glycine)으로 단백질을 용출시키고;

(7) 용출된 단백질을 PBS로 한외 여과하여, 수율을 측정한 후 샘플을 취하여 SDS-PAGE 검출을 진행하며(검출 결과는 도1B에 도시된 바와 같음), 나머지 단백질은 -80 ℃의 냉장고에 보관하고;

(8) 발현된 hPD-L1(ECD)-Fc단백질을 효소로 절단하며, 0.1 mg의 TEV 효소로 1 mg의 hPD-L1(ECD)-Fc단백질을 절단하고, 4 ℃에서 16시간 동안 절단하며, 단백질액을 니켈 컬럼을 통과시키고, 다시 단백질(Protein) A 컬럼을 통과시키며, 유출액을 수집하고, 샘플을 취하여 SDS-PAGE검출을 진행한다(검출 결과는 도1C에 도시된 바와 같음).

실시예2: PD-L1 나노 항체 라이브러리의 구축

(1) 1 mg의 hPD-L1(ECD)-Fc항원을 프로인트(freund) 보조제와 같은 체적으로 혼합하고, 한 마리의 신강 쌍봉 낙타를 일주일에 한번 모두 7회 면역시켜, B세포가 항원 특이성의 나노 항체를 발현하도록 자극하고;

(2) 7회의 면역이 종료된 후, 100 mL의 낙타 말초 혈액 림프구를 추출하고 전체 RNA를 추출하며;

(3) cDNA를 합성하고 중첩 PCR를 이용하여 VHH를 증폭시키며;

(4) 제한 효소 PstI 및 NotI을 이용하여 20 μg의 pMECS 파지 디스플레이 담체(Biovector으로부터 구매함) 및 10 μg의 VHH를 절단하여 두 개의 세그먼트를 연결시키며;

(5) 연결 산물을 전기 천공 컴피턴트 세포 TG1에 형질 전환시키켜, PD-L1 나노 항체 라이브러리를 구축하고 저장 용량을 측정하며, 저장 용량의 크기는 1.3Х10⁹ CF M이다(결과는 도2에 도시된 바와 같음).

이와 동시에, 24개의 클론을 무작위로 선별하여 균락 PCR 검출을 진행한 결과, 구축된 라이브러리의 삽입률은 100 %이고, 도3은 균락 PCR 결과를 나타낸다.

실시예3: PD-L1 나노 항체의 선별 및 감정

항체 선별:

(1) pH가 8.2인 100 mM의 NaHCO₃ 에 용해된 10 μg의 hPD-L1(ECD) 항원을 NUNC ELISA 플레이트에 커플링시키고, 4 ℃에서 하룻밤 경과하고;

(2) 다음날 100 μL의 0.1 %의 BSA를 넣어, 실온에서 2 시간 동안 밀폐시키며;

(3) 2시간 후, 100 μL의 파지(2Х10¹¹ CF

의 면역 낙타 나노 항체 파지 디스플레이 유전자 라이브러리)를 넣어, 실온에서 1 시간 동안 작용시키고;

(4) 비특이적 파지를 세척하기 위하여, 0.05 %의 PBS+Tween-20으로 5번 세척하며;

(5) 100 mM의 트리에탄올아민(triethanolamine)을 사용하여 PD-L1에 특이적으로 결합된 파지를 해리시키고, 대수 성장기에 있는 대장균 TG1세포를 감염시키며, 37 ℃에서 1시간 동안 배양하고, 파지를 생성 및 정제하여 다음 선별에 사용하며, 동일한 선별 과정을 3번 반복하고, 이의 농축 결과는 도4에 도시된 바와 같다.

파지의 효소 면역 측정 방법(ELISA)을 사용하여 특이성 단일 양성 클론을 선별하는 방법은 하기와 같다.

(1) 상기 2 ~ 3회 선별후 파지가 함유된 세포 배양 접시에서, 96개의 단일 균락을 선택하여 100 μg/mL의 암피실린(ampicillin)이 함유된 TB배지(1 L의 TB배지에는 2.3 g의 KH₂PO₄, 12.52 g의 K₂HPO₄, 12 g의 펩톤(peptone), 24 g의 효모 추출물, 4 mL의 글리세린)에 접종시키고, 대수기까지 성장시킨 후, 최종 농도가 1 mM인 IPTG를 넣으며, 28 ℃에서 하룻밤 배양한다.

(2) 침투법을 이용하여 조제 항체를 획득하고, 항체를 항원에 의해 코팅된 ELISA 플레이트에 옮기며, 실온 하에서 1시간 동안 안착시킨다.

(3) PBST로 결합되지 않은 항체를 세척하고, 항 마우스 항HA 항체(북경캉워이세기생물과학기술유한회사로부터 구매함)를 넣으며, 실온 하에서 1시간 동안 안착시킨다.

(4) PBST로 결합되지 않은 항체를 세척하고, 염소 항 마우스 알칼리성 포스파타아제(phosphatase) 라벨 항체를 넣으며, 실온 하에서 1시간 동안 안착시킨다.

(5) PBST로 결합되지 않은 항체를 세척하고, 알칼리성 포스파타아제 발색액을 넣어, ELISA의 405 nm 파장에서, 흡수값을 판독한다.

(6) 샘플 웰의 OD값이 대조 웰의 OD값보다 3배 이상 클 경우(Ratio+/-＞3), 양성 클론 웰로 판정한다.

(7) 양성 클론 웰의 균주를 100 μg/mL의 LB액체에 옮기고 진탕시켜 플라스미드를 추출하며 시퀀싱(sequencing)한다.

실시예4: 숙주균인 대장균에서의 나노 항체의 발현, 정제:

(1) 상기에서 시퀸싱 분석하여 획득한 클론 균주의 플라스미드를 대장균WK6에 전기 천공시키고, 이를 LA+Glucose 즉 암피실린 및 포도당을 함유하는 배양 플레이트에 코팅하며, 37 ℃에서 하룻밤 배양하고;

(2) 단일 균락을 선택하여 5 mL의 암피실린이 함유된 LB배양액에 접종시키며, 37 ℃ 및 쉐이커에서 하룻밤 배양하고;

(3) 1 mL의 하룻밤을 경과한 균주를 330 mL의 TB배양액에 접종시키며, 37 ℃ 및 쉐이커에서 배양하고, OD값이 0.6 ~ 1에 도달할 경우, IPTG를 넣으며, 28 ℃ 및 쉐이커에서 하룻밤 배양하고;

(4) 원심 분리하여, 균주를 수집하며;

(5) 침투법을 이용하여, 항체 조추출액을 획득하고;

(6) 니켈 컬럼 이온 친화 크로마토그래피에 의해 순도가 90 % 이상에 도달하는 나노 항체를 제조하며, 정제 결과는 도5에 도시된 바와 같다.

실시예5: 유세포 기술에 의한 나노 항체의 차단 기능 검출

(1) hPD-1-Fc-Biotin단백질(hPD-1-Fc제조방법은 실시예1에서와 동일하고, SDS-PAGE 검출 결과는 도1E에 도시된 바와 같음)을 제조하고, 단백질 비오틴의 방법은 비오틴 시약 설명서를 참조하며;

(2) 각각의 샘플에서 1Х10⁶개의 인간 PD-L1 전체 길이 단백질을 일시적으로 발현하는 HEK293F세포를 0.5 %의 BSA-PBS완충액에 재부유시키고, 10 μg의 상기 정제된 PD-L1 나노 항체를 넣는 동시에 음성 대조군(hIgG1) 및 샴대조군(PBS)을 설정하며, 모든 샘플에 5μg의 hPD-1-Fc-비오틴을 넣고, 4 ℃에서 20분 동안 부화시키며;

(3) PBS로 세포를 2회 세척하고, eBioscience의 SA-PE를 넣으며, 4 ℃에서 20분 동안 부화시키고, PBS로 세포를 2회 세척한 후 유세포 분석기(BD FACS Calibur)로 검출하며 검출 결과는 도6에 도시된 바와 같다.

PD-L1의 나노 항체의 인간화 개조

(1) 먼저 SEQ ID NO.: 8로 표시되는 PD-L1 나노 항체 서열을 주형으로 구조 데이터베이스에서 상동 구조를 검색하여, 모두 1306개의 구조를 검색하고, 그 중 E value=0.0이고 서열 동일성≥70 %인 34개의 구조를 취하며;

(2) 이들 34개의 구조에 대하여 구조 비교를 진행하고, 결정체 구조의 해상도 크기 및 구축한 계통수(phylogenetic tree)에 따라, 최종적으로 3dwt를 포함한 9개의 단백질을 선택하여, SEQ ID NO.: 8로 표시되는 PD-L1 나노 항체 서열에 의한 다중 주형 상동 모델링(modeling)을 진행하며, 최종적으로 얻어진 10개의 구조를, 스코링(scoring) 함수의 순위에 따라, molpdf가 가장 낮은 구조를 선택하고, 다음 작업을 계속하며;

(3) 모델링된 최적 구조에 대하여, ProtSA 서버를 이용하여 잔기의 용매 접촉 가능성을 산출하고, 즉 폴드 형태가 제거된 용매에 대한 잔기의 폴드 형태의 접촉 가능한 면적의 비율을 기준으로, 40 %보다 큰 잔기를 용매 외부에 노출된 잔기로 취하며;

(4) 모델링된 최적 구조 및 DP-47에 대하여 서열 비교를 진행하고, 용매에 노출된 대응되는 잔기를 교체한다. 최종적으로 인간화의 PD-L1 나노 항체를 결정하고, SEQ ID NO.14로 표시되는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 인간화 전, 후의 항체 서열 대응은 하기 표2와 같다.

인간화 전, 후의 항체 골격 영역과 DP-47골격 영역의 상동성 비교는 표3과 같다.

실시예6: MOA 방법에 의한 항 PD-L1 나노 항체의 활성 검출

본 실험은 이미 출시된, 두 가지 시중에서 얻을 수 있는 항 PD-L1항체(Atezolizumab, ATE 및 Durvalumab, DUR)를 양성 대조 항체로 사용하고, MOA를 사용하여 세포주(Promega)를 검출하며, 형광 리포터 유전자의 발현을 검출하여 NFAT신호의 활성화 상황을 반영함으로써, PD-1/PD-L1 결합에 대한 항체(서열은 실시예5를 참조)의 억제 작용을 검출한다. 단계는 하기와 같다.

(1) 활성 검출 하루 전에 CHOK1-PDL1세포를 통과: CHOK1-PDL1전 1 ~ 2일에 계대한다. 배양 상등액을 버리고, PBS로 세척한다. 적절한 양의 트립신(trypsin)을 37 ℃/5 %의 CO₂에서 3 ~ 5분 동안 소화시킨다. 4배의 트립신 체적의 배지를 넣고, 세포를 50 ml의 원심 분리 튜브에 옮기고 계수한다. 230 g의 필요한 체적의 세포를 취하여, 10분 동안 원심 분리시킨다. 배지를 넣고, 세포를 4Х10⁵개 세포/mL에 재부유시킨다. 세포를 100 μL/웰이 되도록 96웰의 백색의 세포 배양 플레이트에 넣는다. 사이드 웰에 200 μL/웰이 되도록 PBS를 넣는다. 세포를 37 ℃/5 %의 CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 배양한다.

(2) Jurkat-PD1 세포를 처리: 활성 검출 2일 전에 세포 계대를 진행한다. 계수한 후 170 g의 필요한 체적의 세포를 취하여, 5분 동안 원심 분리시킨다. 시험 버퍼(assay buffer)로 세포를 1.25Х10⁶개 세포/ml에 재부유시킨다.

(3) 샘플 및 Jurkat-PD1세포를 검출 플레이트에 넣음: 95 μL/웰의 CHOK1-PDL1세포 상등액을 버린다. 40 μL의 샘플(혼성 세포 상등액 또는 구배 희석된 혼성 세포 상등액으로 항체를 정제함) 및 양성 대조, 음성 대조를 넣는다. 40 μL의 Jurkat-PD1세포를 넣는다. 37 ℃/5 %의 CO₂ 인큐베이터에서 6시간 동안 배양한다.

(4) 검출: Bio-GloTM 버퍼를 미리 녹이고, Bio-GloTM 기질(substrate)을 넣어, 균일하게 혼합한다. 6시간 후, 80 μL/웰의 Bio-GloTM 시약(Reagent)을 넣는다. 실온에서 5 ~ 10분 동안 안착시킨다. 수치를 읽는다.

실험 결과는 표4 및 도11에 도시된 바와 같이, 각 농도 하에서, 본 발명의 인간화 전의 나노 항체는 기본적으로 양성 대조군의 항체 활성보다 강하고, 인간화 후의 본 발명의 나노 항체의 활성은 양성 대조군에 해당된다. 따라서 Nb-Fc 및 인간화의 Nb-Fc항체는 모두 PD1/PD-L1의 상호 작용을 효과적으로 차단할 수 있다.

실시예7: 진핵 세포HEK293에서의 인간화의 PD-L1 나노 항체의 발현 및 정제

(1) 인간화 전 및 인간화 후의 PD-L1 Nb서열을 pFUSE-IgG1담체(Invivogen로부터 구매함)에 합성시키고, Omega 플라스미드 맥시 키트를 사용하여 pFUSE-IgG1-Nb(인간화의) 플라스미드를 추출하며;

(2) HEK293F세포를 OD가 2.0Х10⁶개/mL까지 배양하고;

(3) 플라스미드와 형질 감염 시약PEI를 1: 3으로 균일하게 혼합한 후 20분 동안 정치한 후, HEK293F세포에 넣어, 37 ℃, 6 %의 CO₂ 쉐이커 인큐베이터에서 5 ~ 6일 배양하며;

(4) 세포 상등액을 수집하여, 실온 하에서 1시간 동안 단백질A(Protein A) 비드에 결합시키고;

(5) pH가 7.0인 인산염 완충액으로 비드를 세척한 후, 다시 0.1 M의 pH가 3.0인 글리신으로 단백질을 용출시키며;

(6) 용출된 단백질을 PBS로 한외 여과하여, 수율을 측정한 후 샘플을 취하여 SDS-PAGE검출을 진행하고(검출 결과는 도1D 및 도7에 도시된 바와 같음), 나머지 단백질은 -80 ℃의 냉장고에 보관하며; 도7로부터 알 수 있다시피 정제된 인간화의 나노 항체의 순도는 90 % 이상에 도달한다.

실시예8: 유세포 기술에 의한 인간화의 PD-L1 나노 항체의 차단 기능 검출

방법은 실시예5에서와 같다.

(1) 각각의 샘플에서 2Х10⁵개의 PD-L1을 천연 발현하는 인간 폐암 세포계 EBC-1을 0.5 %의 BSA-PBS 완충액에 재부유시키고, 10 μg의 정제된 인간화의 PD-L1 나노 항체를 넣는 동시에 음성 대조군(hIgG1) 및 샴대조군(PBS)을 설정하며, 모든 샘플에 5 μg의 hPD-1-Fc-비오틴을 넣고, 4 ℃에서 20분 동안 부화시키고;

(2) PBS로 세포를 2회 세척하며, eBioscience의 SA-PE를 넣고, 4 ℃에서 20분 동안 부화시키며, PBS로 세포를 2회 세척한 후 기기로 검출하고, 검출 결과는 도8에 도시된 바와 같으며, 샴대조군 및 음성 대조군으로부터 알 수 있다시피 PD-1-Fc-비오틴과 EBC-1세포의 결합률은 90 % 이상이지만, PD-L1 나노 항체 및 인간화의 나노 항체를 넣은 후, PD-1-Fc-비오틴과 EBC-1세포의 결합률은 10 % 이하이고, 이는 추가된 나노 항체가 PD-1과 PD-L1의 상호 작용을 현저히 차단하는 것을 나타낸다.

실시예9: 나노 항체 친화력 측정

BiaCore T200을 사용하여 검출하고, (1)고정: 카르복시아미노기(Carboxyamino group) 반응을 이용하여 고정상의 항원을 CM-5 센서 칩 표면에 고정시키며;

(2) 결합: HBS 완충액을 사용하여 항체를 적절한 농도(5개의 농도 구배)로 희석하고, 항원 항체 결합 과정을 관찰하며;

(3) 칩 재생: 다음 항체 측정을 진행할 경우 10 mM의 글리신으로 세척하여 재생시킨다.

(4) 실험 결과를 분석하고, 측정 결과는 도9에 도시된 바와 같으며, 인간화 전 나노 항체의 친화력은 2.34Х10^-9M이고, 인간화 후의 나노 항체의 친화력은 2.26Х10^-9 M이다. 인간화의 개조는 항체의 친화력에 영향을 미치지 않는다.

실시예10: 효소면역측정방법(ELISA)에 의한 정제된 나노 항체의 특이성 검출

(1) 통상적인 방법을 통하여 인간화 전 및 인간화 후의 나노 항체에 대하여 비오틴화시키고;

(2) 항원 단백질PD-L1(인간), PD-L1(마우스), PD-L1(원숭이), PD-L2(인간), B7H4(인간), B7H3(인간)을 코팅하고, 각각의 웰은 0.5 μg(5 μg/mL, 100 μL)이며, IgG1을 코팅하여 대조로 하고, 4 ℃에서 하룻밤 경과하며;

(3) 다음날, PBST로 3회 세척하고, 200 μL의 1 %의 BSA를 넣어 실온에서 2시간 동안 밀폐시키고;

(4) 각각의 비오틴화된 나노 항체를 10 μg/mL로 희석하며, 각각 100 μL을 취하여 각 웰에 부화시키고, 실온 하에서 1시간 동안 반응시키며;

(5) PBST로 결합되지 않은 항체를 세척하고, 100 μL의 streptavidin-HRP(1:1000 희석), 실온 하에서 1시간 동안 안착시키며;

(6) 발색액을 넣어, ELISA의 450 nm 파장에서, 흡수값을 판독한다. 흡수값에 따라 나노 항체의 특이성을 판단하고, 검출 결과는 도10에 도시된 바와 같으며, 인간화 전, 후의 나노 항체는 모두 인간 유래 및 원숭이 유래의 PD-L1과 상호 작용할 수 있으나, 마우스 유래의 PD-L1과 상호 작용하지 않고, 두 개의 항체는 비교적 우수한 종속 특이성을 구비하며; 인간화 전, 후의 나노 항체는 모두 PD-L1 패밀리 구성원과 상호 작용하지 않고, 비교적 우수한 가족 특이성을 구비한다.

실시예11: 혼합 림프구 실험

본 실험은 항체를 체외 배양한, 상이한 공여자로부터 유래된 성숙한 DC세포 및 CD4+ T세포와 공동 부화시키고, 체계의 IL2 및 IFN-γ의 상대적인 발현량을 검출하여, T세포에 대한 상이한 항체의 활성화 작용을 반영한다. 단계는 하기와 같다.

(1) PBMC 분리: 50 ml의 기증자의 신선한 혈액을 취하여, 2.5배의 PBS를 첨가하여, 피콜(FiColl,Thermo)에 부드럽게 넣고, 12.5 ml를 4개의 튜브에 나누며, 400 g을 30분 동안 원심 분리시키고, 0 감속 정지한다. 중간 백색 밴드를 흡수하여 PBS(Gibco)에 넣고, PBS로 2회 세척한다.

(2) DC 세포 분리: 분리된 PBMC세포를 취하여 5 ml의 T세포 배지를 넣고, 37 ℃, 6 %의 CO₂에서 벽에 밀착되어 2시간 동안 배양하며, 현탁 세포액을 흡수하여 CD4+세포 분리를 진행하고, 나머지 세포에 3 ml의 DC배지를 첨가하며, 2일 동안 배양한 후 3 ml의 DC배지를 첨가하고, 5일 동안 배양한 후, rTNFa (R&D Systems)(1000 U/ml), IL-1b(R&D Systems)(5 ng/ml), IL-6 (R&D Systems)(10 ng/ml) 및 1 μM의 PGE2(Tocris)를 첨가하여 2일 동안 배양하며, 림프구 혼합 반응(MLR)의 DC세포로 사용한다.

(3) CD4+세포 분리: PBMC를 2시간 동안 정치 배양하고, 현탁된 세포액을 흡수하여 15 ml 원심 분리 튜브에 옮기며, 200 g을 10분 동안 원심 분리하고, 침전에 500 μl의 분리액, 100 μl의 AB형 혈청, 100 μl의 정제된 항체를 넣어 재부유하고, 4 ℃에서 20분 동안 부화시키며, 분리액으로 1회 세척하고, 다시 500 μl의 비드 버퍼를 넣어 15분 동안 부화시키며, 자기장에서 비드를 제거하고, T세포 배지를 1회 세척하며, 8 ml의 배지를 사용하여 재현탁시키고, 37 ℃, 6 %의 CO₂에서 배양한다.('Human CD4+ T cell Enrichment Kit'(19052, Stemcell) 설명서에 따라 조작함)

(3) MLR 실험: 성숙된 DC세포와 CD4+세포를 혼합하고, 각 웰 체적은 200 μL이며, DC세포는 10000개이고, CD4+세포는 100000개이며, 항체를 넣고, DC, T세포, MLR을 음성 대조로 하며, DC+ T세포 +anti-CD3/CD28 자성 비드를 양성 대조로 하고, 5일 동안 혼합 배양하며, cisbio키트(Human IL2 Kit 1000 Test, Human IFN gamma 1000test)로 IL2, IFN-gamma농도를 검출한다.

실험 결과는 도12에 도시된 바와 같이, 본 발명의 나노 항체(서열은 실시예5를 참조)가 공여자를 자극하여 생성된 사이토카인은 모두 양성 대조보다 높으나, 인간화 후, 생성된 사이토카인은 양성 대조와 같으므로 본 발명의 나노 항체 및 인간화 개조 후의 항체는 모두 T세포를 효과적으로 활성화시킬 수 있고, 활성화 효과는 양성 대조군의 항체와 유사하다.

실시예12: 항 PD-L1 나노 항체의 종양 억제 활성 연구

본 발명은 인간 PD-L1을 발현하는 MC38세포(MC38-PDL1)(남경인허회사)를 사용하여 PD-L1 유전자 변형 마우스에서 인간화의 Nb-Fc의 항 종양 작용을 측정한다. 먼저 피하 접종의 방식을 사용하여 MC38-PDL1 종양 보류 마우스 모델을 구축하고, 종양 형성 후 그룹을 나누며, 상이한 항체(서열은 실시예5를 참조) 및 상이한 투여량의 치료를 제공하고, 투여 기간의 각 군의 마우스의 종양 체적 및 체중 변화를 모니터링하며, 투여 빈도는 2회/주이고, 모니터링 빈도는 모두 2회/주이며, 연속 5주 동안 모니터링하고, 투여량 및 방식은 표5 및 도13에 도시된 바와 같다.

단계는 하기와 같다.

1) MC38/PD-L1 세포 현탁액의 제조: PBS(1Х)로 MC38세포를 분산시키고, 세포 밀도는 1Х10⁷개/ml이며, MC38세포 현탁액으로 제조하고;

2) 접종: 25마리의 C57Bl/6 배경의 PD-L1 마우스 우측 등을 제모하고, MC38/PD-L1세포 1Х10⁶개/0.1 ml/마리를 피하 주사한다. 종양 세포를 6일 동안 접종시킨 후 각 마우스의 종양 체적을 검출하고, 종양 체적이 87.4 mm³ ~ 228.4 mm³ 범위의 25마리 마우스를 선택하여 종양 체적에 따라 평균적으로 그룹을 나눈다.

3) 투여: 도13을 참조한다.

4) 검출: 매번 투여하기 전 체중 및 종양 체적을 측정하고, 중량을 기록한다. 전자 천칭을 사용하여 체중을 1주에 2회 측정한다.

5) 종양 체적 측정: 버니어 캘리퍼스(vernier caliper)를 사용하여 종양의 최대 장축(L) 및 최대 종축(W)을 측정하고, 종양 체적은 하기 공식으로 계산한다. V=LХW²/2.

실험 결과는 도14에 도시된 바와 같이, 시간에 따라, 인간화의 Nb-Fc를 접종한 마우스는, 대조군에 비해 종양 체적을 매우 우수하게 제어하여, 현저하게 증가하는 상황이 나타나지 않은 것은, 인간화의 Nb-Fc이 현저한 종양 억제 작용이 있음을 설명한다.

실시예13. PEG 침전 방법으로 항체의 가용성 검출

본 실험은 PEG 침전의 방법을 이용하여, 선별된 항체(서열은 실시예5를 참조)가 상이한 농도에서의 PEG 중 용해 상황을 검출하여, 항체의 가용성을 반영한다. 단계는 하기와 같다.

1) 항체 샘플을 5 mg/ml로 농축한다.

2) 샘플을 96웰의 세포 배양 플레이트에 넣고, 각 웰에 40 μl의 항체 샘플을, 최종 농도 1 mg/ml로 넣는다. 제1 열 내지 제12열에 각각 30 %의 PEG 26.7 μl, 40 μl, 46.7 μl, 53.3 μl, 60 μl, 66.7 μl, 73.3 μl, 80 μl, 86.7 μl, 93.3 μl, 100 μl, 106.7 μl를 넣고, IBI301 버퍼로 전체 체적 200 μl까지 보충한다. PEG 농도 구배는 각각 4 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %이다.

3) 실온에서 1시간 동안 안착시키고, OD500 nm를 측정한다.

연구 결과는 표6 및 도15에 도시된 바와 같이, 인간화의 Nb-Fc는 모두 8 %(w/v)의 PEG에서 혼탁되나, 대조 항체(이미 출시된 약물 Humira)는 6 %(w/v)의 PEG에서 혼탁되고, 본 발명의 인간화의 Nb-Fc가 대조 항체보다 더 우수한 가용성을 구비하는 것을 나타낸다.

실시예14. 가속 안정성 실험 측정

본 실험은 항체(서열은 실시예5를 참조)가 40 ℃에서 30일 동안 안착된 후의 순도 및 생물학적 활성의 변화를 검출하여, 상기 항체의 장기간 열안정성을 평가한다. SEC의 방법을 사용하여 목적 항체가 40 ℃에서 0일, 14일 및 30일 안착된 후의 순도를 측정하고, 실험 결과는 표7 및 도16에 도시된 바와 같으며, 인간화의 Nb-Fc의 순도는 현저한 변화가 없다. 본 실험은 FACS 방법을 이용하여 가속 안정성 실험 샘플 및 CHO-PDL1세포의 결합 상황을 검출하고, 단계는 하기와 같다.

1) 세포 준비: CHO-PDL1세포를 계수하고, 2Х10⁶개 세포/ml로 희석하며, U형 밑 96웰 플레이트에 100 μL/웰을 넣고, 제1 열에 50 μl 보충하며;

2) 검출 단계: 제1 웰에 항체를 넣고, 최종 농도 200 nM로 하며, 균일하게 혼합하고, 50 μl를 흡수하여 제2 웰에 옮기며, 이에 따라 유추하고, 음성 대조는 IgG 제어(Control)이다. 20분 동안 아이스 배스(ice bath)한다. 100 μl/웰의 PBS를 넣고, 400 g을 5분 동안 상등액을 제거하며, PBS로 세포를 1번 세척한다. 100 μl/웰의 1:100로 희석한 염소 항 인간(Goat anti-human) IgG-PE(eBioscience)를 넣고, 20분 동안 아이스 배스하며, 400 g을 5분 동안 원심 분리하여 상등액을 제고하고, 100 μl/웰의 PBS를 넣어 1회 세척하며, 100 μl의 PBS로 재부유시키고, FACS로 검출한다.

실험 결과는 도17에 도시된 바와 같이, 인간화의 Nb-Fc 및 CHO-PDL1세포의 결합은 현저한 변화가 없다. 연구 결과는 인간화의 Nb-Fc가 비교적 우수한 열안정성을 구비하는 것을 나타낸다.

본 발명에서 언급되는 모든 문헌은 각각의 참조 문헌이 단독으로 참고 문헌으로 인용된 것처럼, 본 출원에 참고 문헌으로 인용된다. 이 외에, 상기 교시를 읽은 후에, 본 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 대한 다양한 수정 및 변형을 진행할 수 있고, 이러한 등가의 형태는 또한 첨부된 청구 범위에서 정의된 범위 내에 속하는 것을 이해하여야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> INNOVENT BIOLOGICS(SUZHOU)CO. LTD <120> Anti-PD-L1 Nanobody and Use Thereof <130> P2017-1215 <150> CN201610634596.X <151> 2016-08-04 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Camelus Linnaeus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser 20 25 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Camelus Linnaeus <400> 2 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val Ala Ala 1 5 10 15 <210> 3 <211> 38 <212> PRT <213> Camelus Linnaeus <400> 3 Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Gly Asn 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 35 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Camelus Linnaeus <400> 4 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Camelus Linnaeus <400> 5 Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn Ser Met Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Camelus Linnaeus <400> 6 Ile Glu Ser Asp Gly Ser Thr 1 5 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Camelus Linnaeus <400> 7 Ala Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu Gly His Leu 1 5 10 15 Ala Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr 20 25 <210> 8 <211> 132 <212> PRT <213> Camelus Linnaeus <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Glu Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Gly Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu Gly His Leu Ala 100 105 110 Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 9 <211> 396 <212> DNA <213> Camelus Linnaeus <400> 9 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtacagg ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtcaag cctctgcata caccatcagt agaaactcca tgggctggtt ccgccaggct 120 ccagggaagc agcgcgaggg ggtcgcagct attgaaagtg atggcagcac aagttactca 180 gactccgtca agggccgatt caccatctcc ttaggcaacg ccaagaacac tctgtatctg 240 gaaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgcgcggc gccgaaggtg 300 ggcctgggcc ctaggactgc tttaggccat cttgcattta tgaccttacc agccctaaac 360 tactggggcc agggaaccca ggtcaccgtc tcctca 396 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized FR1 <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized FR2 <400> 11 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala 1 5 10 15 <210> 12 <211> 38 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized FR3 <400> 12 Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized FR4 <400> 13 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 132 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized VHH <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Glu Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu Gly His Leu Ala 100 105 110 Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 15 <211> 396 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> humanized VHH <400> 15 caggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60 agctgcgccg ccagcgccta caccatcagc aggaacagca tgggctggtt caggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggaggg cgtggccgcc atcgagagcg acggcagcac cagctacagc 180 gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc ctggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 240 gagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc ccccaaggtg 300 ggcctgggcc ccaggaccgc cctgggccac ctggccttca tgaccctgcc cgccctgaac 360 tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg agcagc 396

Claims

프레임 워크 영역(FR,frame region) 및 상보성 결정 영역(CDR, complementary determining region)을 포함하되,
상기 상보성 결정 영역(CDR)은 SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 7로 표시되는 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항 PD-L1 나노 항체 VHH 사슬.
(a) SEQ ID NO: 1로 표시되는 FR1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 FR2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 FR3, SEQ ID NO: 4로 표시되는 FR4로 이루어지거나;
(b) SEQ ID NO: 10으로 표시되는 FR1, SEQ ID NO: 11로 표시되는 FR2, SEQ ID NO: 12로 표시되는 FR3, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 FR4로 이루어진 프레임 워크 영역(FR,frame region); 및
SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 7로 표시되는 CDR3을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항 PD-L1 나노 항체의 VHH 사슬.
PD-L1 에피토프(epitope)에 대한 나노 항체이고, SEQ ID NO.: 8 또는 SEQ ID NO.: 14로 표시되는 아미노산 서열의 VHH 사슬을 구비하는 것을 특징으로 하는 항 PD-L1 나노 항체.
제1항에 따른 항 PD-L1 나노 항체 VHH 사슬, 제2항에 따른 항 PD-L1 나노 항체의 VHH 사슬, 및 제3항에 따른 항 PD-L1 나노 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotides).
제4항에 있어서, SEQ ID NO: 9 또는 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 구비하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제6항에 따른 발현 벡터 또는 게놈(Genome)에 통합된 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
나노 항체를 생성하기 적합한 조건 하에서, 제7항에 따른 숙주 세포를 배양하여, 상기 항 PD-L1 나노 항체를 포함하는 배양물을 획득하는 단계(a); 및
상기 배양물로부터 상기 항 PD-L1 나노 항체를 분리 또는 회수하는 단계(b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항 PD-L1 나노 항체를 생성하는 방법.
(a) 제2항에 따른 항 PD-L1 나노 항체의 VHH 사슬, 또는 제3항에 따른 항 PD-L1 나노 항체; 및
(b) 검출 가능한 라벨(label), 약물, 독소, 사이토카인(Cytokine), 방사성 핵종, 또는 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합(conjugating) 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 접합체.
PD-L1 분자를 검출하기 위한 시약으로서, 제3항에 따른 항 PD-L1 나노 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
종양을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한 조성물로서, 제3항에 따른 항 PD-L1 나노 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.