JP5987822B2 - 癌胎児性抗原に対する抗体及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するヒト化キメラ抗体、該抗体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む宿主細胞並びに腫瘍を診断及び／若しくは治療するための薬剤又は医薬の調製におけるそれらの使用に関する。

１９６５年に、カナダのＧｏｌｄ及びＦｒｅｄｍａｎは、ヒト結腸がんからの抽出物を用いてウサギを免疫し、得られた血清を用いて様々なヒト組織を調べた。このときに、ヒト内胚葉を起源とする消化管腫瘍の染色が強陽性であることが見出され、２〜６カ月齢の胎児の消化管組織も陽性であることも見出され、よって、消化管腫瘍において発現が陽性であるこのような抗原分子が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と命名された。後に、内胚葉細胞から分化した腫瘍細胞におけるＣＥＡ抗原の発現が、正常細胞のものより１００倍高く、よって、これは様々なヒト悪性腫瘍についての重要な抗原及びマーカーであることが見出された。ＣＥＡは、約１８０〜２００ｋＤの分子量を有する糖鎖及びペプチド鎖で構成される糖タンパク質である。糖鎖の組成及び起源の違いにより、ＣＥＡの生化学的特性及び免疫原性は非常に異質性、多様性及び不均質性を示し、よって巨大分子の比較的大きいファミリーを形成する。ＣＥＡ分子は、多くの異なる抗原エピトープを有し、これらの異なるエピトープは、成体、胎児器官の異なる正常組織及び様々な悪性腫瘍組織において異なって発現され、その特異性も異なる。Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍらは、１９８９年に、ＣＥＡ抗原エピトープを５つの群、すなわちＧｏｌｄ１〜５（Ｇｏｌｄ分類）に分割できることを提案した。Ｇｏｌｄ１〜５群の抗原エピトープがそれぞれＣＥＡ分子のドメインＡ３、Ｂ２、Ｂ３、Ａ１及びＮにあり、Ａ３及びＢ３ドメインは他のＣＥＡ関連分子との相同性が低く、これらは、ＣＥＡ分子の比較的ユニークなドメインであることが研究において示されている。

ＣＥＡは、細胞の細胞膜上及び細胞質中で主に発現され、８週齢の胚の様々な胚葉組織においても発現される。３カ月を超える胚の組織では、ＣＥＡは、胃腸上皮組織において主に発現されるが、成体組織におけるＣＥＡの発現は著しく低減又は減じられ、結腸上皮細胞の表面上で痕跡量が発現されるのみである。しかし、ＣＥＡは、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚がん、前立腺がん、膀胱がん、胆嚢がん及び食道がんを含む多くの悪性腫瘍において５０〜９０％までの陽性率で高発現される。ＣＥＡは、これらの悪性腫瘍の転移巣においても高発現され、発現レベルは原発巣よりも高い。これらの腫瘍のうち、結腸直腸がんにおけるＣＥＡ発現は、陽性率（９５％より高い）及び強度の両方の点で最も高い。ＣＥＡは、結腸直腸がん組織のほぼ全てで高発現され、肝臓転移巣のような転移巣におけるＣＥＡの発現レベル及び陽性率は、原発巣よりも著しく高い。悪性腫瘍におけるＣＥＡの発現は、腫瘍の量、段階、転移及び予後と密接に関係することも多くの研究において証明されている。よって、ＣＥＡは、悪性腫瘍についての特異的分子マーカーとして広く認識され、このことにより、腫瘍の標的治療及び診断についての最良の標的の１つとなっている。

ＣＥＡ陽性悪性腫瘍は高い罹患率を有し、非常に多数の患者に影響を与え、世界中の人々の健康について最も驚異となる疾患の１つになっている。例えば、ＣＥＡを高発現する結腸がんは、最も一般的に見られる悪性腫瘍の１つである。欧州及びアメリカの先進国における結腸直腸がんの罹患率は、全ての悪性腫瘍のうちで第３位であり、死亡率は第２位である。新しく発生した事例は世界中で毎年１００万件を超え、５２９，０００名を超える患者が結腸直腸がんで死亡する。毎年、中国において４００，０００名近くの結腸直腸がん患者が新しく発生し、結腸直腸がん患者の２００，０００名近くが、治療に不応性であることにより死亡する。現在までに、ＦＤＡは、結腸がんについての４つの一般的に用いられる化学療法医薬：フルオロウラシル、イリノテカン、オキサリプラチン及びカペシタビンのみを承認している。これらの現在利用可能な術後の補助的治療としての化学療法医薬及び化学療法レジメンは、結腸直腸がんの再発率を約１５％にまで低減でき、５年生存率を約１０〜１３％にまで改善及び増加できる。抗体標的医薬は、悪性腫瘍を治療するために最近１０年間の間に開発されている別の型の新しい医薬である。非ホジキンリンパ腫などのいくつかの血液系腫瘍の臨床的治療において、これは著しい治療効果を示し、患者の５年生存率を増加できる。ＣＥＡ抗原を標的として用いる放射活性抗体標的治療剤として、ＣＥＡ抗体医薬は現在のところ臨床的使用について承認されていない。しかし、２つのＣＥＡ抗体放射性免疫治療剤が、第Ｉ相、第ＩＩ相の臨床試験について承認されている。１つは^１３１Ｉ−ｈＭＮ−１４抗体医薬、すなわち^１３１Ｉとカップリングした組換えヒト化抗ＣＥＡ抗体ｈＭＮ−１４であり、これは、１９９９年に米国のＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．により開発され、現在、進行結腸直腸がんにおける薬物耐性転移を治療するための第ＩＩ相臨床試験がほぼ終了し、第ＩＩＩ相臨床試験に入っている。別の抗ヒトＣＥＡ抗体医薬は、放射活性核種^９０ｙとカップリングしたｃＴ８４．６６ヒト／マウスキメラ抗体であり、これは米国のＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒによりＦＤＡの承認のもとで開発されている。現在、進行悪性腫瘍を治療するための第Ｉ相臨床試験が終了した。しかし、これらの２つのＣＥＡ抗体医薬は、特異性をさらに改良する必要がある、毒性及び副作用をさらに低減する必要がある、抗体の親和性が過剰に高く、このことにより、標的放射性免疫治療中に親和性バリアの発生を引き起こす傾向があり、それにより治療効果に著しく影響するなどのいくつかの問題をまだ有している。従来技術の抗ＣＥＡ抗体の問題を克服するための新しい抗ＣＥＡ抗体に対する必要性が存在する。

抗体の結合特異性及び親和性はともに、軽鎖及び重鎖の超可変領域（相補性決定領域、略してＣＤＲともよばれる）のアミノ酸配列により主に決定されることが多くの従来の研究において結論付けられている。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、その教育的原理の中で、同じ相補性決定領域を有する同じ型の全ての抗体は１つの抗体に属すると断言している。よって、臨床的な治療価値を有する１つの抗体のＣＤＲを得た後に、その非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、様々な確立された知られている技術により容易に変化させて、同じ又はよりよい生物活性を有する変異体を得ることができる。

本発明は、顕著なＣＥＡ結合特異性及び適度な親和性を有する親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体に基づく。

該抗体のＣＤＲ領域の配列は、クローニング、同定及び遺伝子構造分析により決定されている。対応するヒト化キメラ抗体及びその真核細胞発現ベクターが構築され、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を発現して分泌する細胞株が得られた。
本発明は、元のマウスモノクローナル抗体のものと同等である適度な親和性に加えて、前記ヒト化キメラ抗体が、優れたＣＥＡ結合特異性及びｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的特性も有し、結腸がんの増殖を多くの動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで著しく阻害できることをさらに実証する。該抗体はヒト化されているので、抗体の毒性及び副作用は、ヒトに用いた場合に低減できる。本発明は、動物モデル及び放射性免疫イメージングのような実験をさらに採用して、前記ヒト化キメラ抗体が、ＣＥＡ陽性腫瘍についての優れた標的特性を有し、よって、ＣＥＡ陽性腫瘍についてのｉｎ ｖｉｖｏ診断剤を調製するために用いることができることをｉｎ ｖｉｖｏにおいて十分に証明する。さらに、本発明は、放射性免疫治療などの実験も採用して、いくつかの動物モデルの体内において、前記ヒト化キメラ抗体がＣＥＡ陽性腫瘍の増殖を阻害するための優れた能力を有し、よって、ＣＥＡ陽性腫瘍のための治療用医薬の調製において用いることができることを実証する。

よって、本発明は、以下の態様に主に関する。
第１の態様では、本発明は、モノクローナル抗体の重鎖が、配列番号７〜９に示すＣＤＲ領域を含み、モノクローナル抗体の軽鎖が、配列番号１０〜１２に示すＣＤＲ領域を含む、癌胎児性抗原に対するヒト化キメラモノクローナル抗体又はその機能的変異体に関する。

第２の態様では、本発明は、抗ＣＥＡヒト化キメラモノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号１であり、重鎖のアミノ酸配列が、配列番号２である、抗ＣＥＡヒト化キメラモノクローナル抗体又はその機能的変異体に関する。

第３の態様では、本発明は、前記ヒト化キメラ抗体のＣＤＲ領域と同一であるＣＤＲ領域を有するポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、前記ヒト化キメラ抗体の生物活性と同等又はそれより高い生物活性を有する。抗体の結合特異性及び親和性がともに、ＣＤＲ領域により主に決定されることが当技術分野において知られている。様々な確立された知られている従来技術に基づいて、非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を容易に変化させて、同等又はそれより高い生物活性を有する変異体を得ることができる。

第４の態様では、本発明は、第１若しくは第２の態様によるモノクローナル抗体又はその変異体をコードするか又は第３の態様によるポリペプチドをコードする核酸に関する。核酸の配列が変化しても、トリプレットコドンの遺伝子ドグマに従って配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体タンパク質に最終的に翻訳できる限りは、それはやはり前記抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体をコードするポリヌクレオチドであることが当技術分野において知られている。前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。

第５の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関し、好ましくは、該発現ベクターは、真核細胞において高発現される。好ましくは、前記真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。好ましい実施形態では、前記発現ベクターは、図４に示すｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡ又は図５に示すｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡである。

第６の態様では、本発明は、第５の態様による発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、特に寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０３号の細胞である。

第７の態様では、本発明は、治療有効量の態様１〜３の１つによる前記抗体若しくはポリペプチド又はその機能的変異体（例えば複合体、融合タンパク質）の、或いは第４の態様による前記核酸の、或いは第５の態様による前記ベクターの、或いは第６の態様による前記宿主細胞の、抗腫瘍医薬の調製における使用に関する。前記腫瘍は、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚がん、前立腺がん、膀胱がん、胆嚢がん及び食道がん、好ましくは結腸直腸がんからなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記抗腫瘍医薬は、活性成分として放射性物質とカップリングした態様１〜３のいずれか１つによる前記抗体又はポリペプチドを含み、好ましくは、前記放射性物質は、^１３１Ｉである。

第８の態様では、本発明は、態様１〜３の１つによる前記抗体若しくはポリペプチド又はその機能的変異体（例えば複合体、融合タンパク質）の、或いは第４の態様による前記核酸の、或いは第５の態様による前記ベクターの、或いは第６の態様による前記宿主細胞の、腫瘍診断剤の調製における使用に関する。前記腫瘍は、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚がん、前立腺がん、膀胱がん、胆嚢がん及び食道がん、好ましくは結腸直腸がんからなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記腫瘍診断医薬は、活性成分として放射性免疫イメージング剤とカップリングした態様１〜３のいずれか１つによる前記抗体又はポリペプチドを含み、好ましくは、前記放射性免疫イメージング剤は、^１８８Ｒｅである。

親のマウスモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞の抽出した全ＲＮＡについてのアガロースゲル電気泳動を用いた分析を示す。レーン１．分子量マーカー、λＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ。レーン２．親のマウスモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡ。 親のマウスモノクローナル抗体ＶＬ、ＶＨ遺伝子のＰＣＲ産物についてのアガロースゲル電気泳動を用いた分析を示す。レーン１．分子量マーカー、λＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ。レーン２．親のマウスモノクローナル抗体ＶＬ遺伝子のＰＣＲ産物。レーン３．親のマウスモノクローナル抗体ＶＨ遺伝子のＰＣＲ産物。 増幅により得られた親のマウスモノクローナル抗体ＶＬ、ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列及びそのアミノ酸配列並びにＣＤＲ配列を示す。 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体軽鎖真核発現ベクターｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡの構造についての概略図を示す。Ｐｗ、減弱化真核プロモーター；Ｎｅｏ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子；ＰｈＣＭＶ−ＩＥ、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター及びエンハンサー；ＶＬ遺伝子、リーダーペプチド配列及び５’端イントロンスプライシング部位配列を有する軽鎖可変領域の遺伝子断片；Ｃκ遺伝子、ヒト抗体軽鎖のκ鎖定常領域遺伝子断片；ＢＧＨポリＡ、ウシ成長ホルモンポリＡテイル付加部位；Ａｐ、アンピシリン耐性遺伝子。 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体重鎖真核発現ベクターｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡの構造についての概略図を示す。Ｐｗ、減弱化真核プロモーター；ｄｈｆｒ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子；ＰｈＣＭＶ−ＩＥ、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター及びエンハンサー；ＶＨ遺伝子、リーダーペプチド配列及び５’端イントロンスプライシング部位配列を有する重鎖可変領域の遺伝子断片；Ｃγ１遺伝子、ヒト抗体重鎖のγ１鎖定常領域遺伝子断片；ＢＧＨポリＡ、ウシ成長ホルモンポリＡテイル付加部位；Ａｐ、アンピシリン耐性遺伝子。 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を高レベルで発現及び分泌する細胞株についての構築及びスクリーニングプロセスを示す。 ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を発現及び分泌するＣＨＯ細胞株の上清中のキメラ抗体含量を示す。ここで、ＣＨＯ上清（１：１０００）、ＯＤ４９０＝１．５２０は、０．０８μｇ／ｍｌ、上清ストック溶液の濃度：０．０８×１０００＝８０μｇ／ｍｌに相当する。 ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の抗原特異性を示す。レーン１．λＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ。レーン２．３２０ｂｐマーカー。レーン３．抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体ＶＬ遺伝子のＰＣＲ増幅産物。レーン４．抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体ＶＨ遺伝子のＰＣＲ増幅産物。レーン５、６．陰性対照。 免疫蛍光を用いて分析した、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の抗原特異性を示す。 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、いくつかのＣＥＡ発現がん細胞上のＣＥＡ抗原を認識できることを示す。 ウェスタンブロッティングを用いて分析した、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体のヒト化特性を示す。レーン１．分子量マーカー。レーン２．キメラ抗体、２次抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ。レーン３．マウスモノクローナル抗体、２次抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ。レーン４．キメラ抗体、１次抗体として抗ヒトκ鎖。レーン５．マウスモノクローナル抗体、１次抗体として抗ヒトκ鎖。 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の組織１グラムあたりのパーセント（ＩＤ％／ｇ）として表した、放射活性線量取り込み分析の結果を示す。 腫瘍組織と正常組織との間（Ｔ／ＮＴ）の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の放射線比率の結果を示す。 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体によるＣＥＡ陽性結腸がんの腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫イメージングを示す。 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とＩ−１３との複合体の単回投与によるヒト結腸がんを有するヌードマウス移植腫瘍モデルの治療の結果を示す（増殖曲線）。 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とＩ−１３との複合体の複数回投与によるヒト結腸がんを有するヌードマウス移植腫瘍モデルの治療の結果を示す（増殖曲線）。

本発明の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の抗体可変領域は、抗マウスモノクローナル抗体Ｃ２４由来であり、これは、本発明者らがＣＥＡを用いてマウスを免疫することにより以前に調製及び取得し、２０１０年５月４日に寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０２号の下で寄託されたハイブリドーマ細胞から得ることができる。いくつかの以前の研究（Ｌｕ，Ｂａｏｌａｎ．Ｃｈｅｎｇ，Ｍｉｎｇ．Ｑｉａｎｇ，Ｌａｉｙｉｎｇ．ら「Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９８６、１５（２）：３７頁）は、このマウスモノクローナル抗体が、特に高い特異性及び適度な親和性を含む、標的治療に適切ないくつかの優れた生物学的特性を有することを示す。該モノクローナル抗体は、ＣＥＡ抗原と高い特異性で結合し、胃がん、肺がん、結腸がん、直腸がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がんなどを含むいくつかのヒト腫瘍とｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に結合できるが、正常ヒト組織細胞と高い特異性ではほとんど結合しない。数千の試料の免疫組織化学的分析は、抗体が、上記のいくつかの腫瘍組織と、６０％〜９０％までの陽性率で結合するが、正常組織との結合についての陽性率は５％〜１０％の間のみであることを実証する。さらに、高い特異性に加えて、標的治療についての別の利点は、モノクローナル抗体が適度な親和性を有することである。抗原−抗体結合力学によると、標的治療に用いる場合、過剰に高い親和性を有する抗体は、標的抗体が腫瘍表面に吸着し、腫瘍の内部にさらに浸透してよりよい治療効果を奏することが妨げられる結果となる。よって、適度な親和性を有する抗体が、腫瘍の標的治療のためにより適切である。本発明の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体は、適度な親和性を有し、親和性定数は約１×１０^−９Ｍ^−１である。そのヒト化抗体は、腫瘍の臨床治療においてよりよい治療効果及び展望を有すると期待できる。

定義
モノクローナル抗体
本明細書で用いる場合、用語「モノクローナル抗体」は、本質的に相同な抗体の群から得られる抗体のことをいい、すなわち、この群に含まれる抗体のそれぞれが、いくつかの自発的突然変異体が非常に少量で存在し得ることを除いて同一である。モノクローナル抗体は、単独標的部位に対して高度に特異的な抗体である。さらに、従来の（ポリクローナル）抗体調製（これは、異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含有する）とは対照的に、各モノクローナル抗体は、標的上の１つの単独決定因子に対する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体の利点は、ハイブリドーマ培養により合成でき、他の免疫グロブリンが混入しないことである。修飾語「モノクローナル」は、抗体が、本質的に均質な抗体集団から得られるという特徴のことをいうが、何らかの特別なプロセスにより抗体を生成する必要があることを意味しない。例えば、本発明で用いるモノクローナル抗体は、従来の技術によりファージ抗体ライブラリーから単離できる。本発明に従って用いる親のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６、４９５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により生成できるか、又は組換え法により生成できる。

相補性決定領域（ＣＤＲ）
本明細書で用いる場合、用語「相補性決定領域」は、免疫グロブリンのような結合分子の可変領域中の配列のことをいう。典型的に、相補性決定領域は、抗原上の認識されるエピトープに相補的（形状及び電荷分布の点で）な抗原結合部位を主にもたらす。ＣＤＲ領域は、タンパク質若しくはタンパク質断片の直鎖状エピトープ、不連続エピトープ又は立体構造エピトープに特異的であり得る。これらのエピトープは、それらの天然の立体構造でタンパク質上に存在するか、又は変性形（例えばＳＤＳ中での可溶化により）でタンパク質上に存在する場合もある。エピトープは、翻訳後修飾タンパク質で構成されることもできる。

ポリヌクレオチド
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」は、ストリンジェントな条件下で本質的に同一のヌクレオチド配列とハイブリダイズでき（天然ヌクレオチドと全く同じように）、及び／又は天然ヌクレオチドと全く同じように同一アミノ酸に翻訳できる限り、デオキシリボ−ポリヌクレオチド、リボ−ポリヌクレオチド又は天然のリボヌクレオチドの本質的な特性を有するそれらの類似体を含む。ポリヌクレオチドは、天然若しくは異種構造又は調節遺伝子の全長配列若しくはサブシークエンスであり得る。そうでないと明記しない限り、この用語は、特定の配列及びその相補配列を含む。よって、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、安定性又は他の理由のために改変された原則的な鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。

ポリペプチド
本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーのことをいう「ペプチド」及び「タンパク質」と交換可能に用いることができる。この用語は、１若しくは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的類似体であるアミノ酸ポリマーのために用いられ、天然アミノ酸ポリマーのために用いられる。天然アミノ酸のこのような類似体の本質的な特性は、該類似体をタンパク質に組み込んだ場合に、タンパク質が、同一であるが完全に天然のアミノ酸で構成されるタンパク質により刺激される抗体と特異的に反応できることである。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、それらに限定されないがリン酸化、グリコシル化、脂質付加、硫化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ−リボシル化を含む改変も含む。

特異的結合
本明細書で用いる場合、抗体と抗原のようなその結合パートナーとの間の相互作用に関して言及する用語「特異的結合」は、上記の相互作用が、抗原決定因子又はエピトープの存在のような結合パートナー上の特定の構造の存在に依存することを意味する。言い換えると、上記の結合パートナーが他の分子又は生物の混合物中に存在しても、上記の抗体が、上記の結合パートナーとまだ優先的に結合又は認識する。上記の結合は、共有相互作用若しくは非共有相互作用又は２つの相互作用の両方により媒介できる。つまり、用語「特異的結合」は、抗原又はその断片との免疫特異的結合及び他の抗原との非免疫特異的結合のことをいう。免疫特異的結合の結合分子は、放射性免疫分析（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ又は当技術分野において既知のアッセイにより決定されるより低い親和性で他のペプチド又はポリペプチドと結合できる。結合分子又は抗原と免疫特異的に結合するその断片は、関連抗原と交差反応できる。好ましくは、結合分子又は抗原と免疫特異的に結合するその断片は、他の抗原と交差反応しない。

機能的変異体
本明細書で用いる場合、用語「機能的変異体」は、親の結合分子のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列と比較した場合に１若しくは複数のヌクレオチド及び／又はアミノ酸を改変するヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を含むが、親の結合分子の結合パートナー（例えばＣＥＡ）とまだ競合的に結合できる結合分子のことをいう。言い換えると、親の結合分子のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列における改変が、上記のヌクレオチド配列によりコードされるか又は上記のアミノ酸配列を含む結合分子の結合特異性に著しく影響しないか又はそれを変化させない、すなわち上記の結合分子が、その標的部位をまだ認識し、それと結合できる。上記の機能的変異体は、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、付加及び欠失を含む保存配列改変を有することができる。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発及びランダムＰＣＲ媒介突然変異誘発のような当技術分野において既知の標準的な技術により導入でき、天然及び非天然のヌクレオチド並びにアミノ酸を含むことができる。

保存アミノ酸置換は、同様の構造又は化学的特異性を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置き換えを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが決定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。当業者は、上記以外のアミノ酸残基ファミリー分類も用いることができることを理解している。さらに、変異体は、異なる構造又は化学的特性を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置き換えのような非保存アミノ酸置換も有することができる。同様の小さい変化は、アミノ酸の欠失若しくは挿入又は両方も含み得る。アミノ酸残基を、その免疫学的活性を消去することなく置換、挿入又は欠失できることを決定するための指示は、当技術分野において既知のコンピュータプログラムを用いて見出すことができる。

ヌクレオチド配列中の変異は、トランジション変異若しくはトランスバージョン変異のような遺伝子座において生じる単独変異（部位変異）であり得るか、又は単独の座における複数のヌクレオチドの挿入、欠失若しくは変化であり得る。さらに、１又は複数の変化を、ヌクレオチド配列内の任意の数の座において作製できる。変異は、当技術分野において既知の適当な方法により行うことができる。

キメラ抗体
キメラ抗体を生成するための方法は、当業者により得ることができる。例えば、軽鎖及び重鎖はそれぞれ、例えば免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖を用いて別々のプラスミドにおいて発現できる。次いで、これらを精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて完全抗体としてアセンブリする。このようなアセンブリを遂行するための方法は、記載されている。例えばＳｃｈａｒｆｆ，Ｍ．、Ｈａｒｖｅｙ Ｌｅｃｔｕｒｅｓ ６９：１２５頁（１９７４）を参照されたい。Ｏｉら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（４）：２１４〜２２１頁（１９８６）；及びＳｕｎら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ５（１９８６）Ｓｕｐｐｌ １：５１７〜２０頁も参照されたい。

回収した単離軽鎖及び重鎖からＩｇＧ抗体を形成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応パラメータも記載されている。例えばＢｅｙｃｈｏｋ，Ｓ．、Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、６９頁、１９７９を参照されたい。軽鎖と重鎖との細胞内会合を遂行するように同じ細胞内で軽鎖と重鎖とを同時発現させ、次いでそれらを連結して完全Ｈ_２Ｌ_２ＩｇＧ抗体を形成することも可能である。このような同時発現は、同じ宿主細胞内で同じ又は異なるプラスミドを用いて達成できる。

ヒト化抗体
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するその断片（例えば抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２断片又は標的と結合する他の配列）である。一般的に、ヒト化抗体は、全て又は本質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、全て又は本質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域のものである、ほぼ完全な可変領域の少なくとも１つ、及び通常２つである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含有でき、これは、通常、選択されたヒト免疫グロブリン鋳型の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分である。

ベクター
用語「ベクター」は、別の核酸を宿主細胞に導入して複製し、あるいくつかの場合には発現させるために別の核酸を挿入できる核酸分子のことをいう。言い換えると、ベクターは、連結された核酸分子を移動させることができる。クローニングベクター及び発現ベクターはともに、本発明で用いる用語「ベクター」に包含される。ベクターは、それらに限定されないが、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）並びに植物若しくは動物（ヒトを含む）のファージ又はウイルスに由来するベクターを含む。ベクターは、所定の宿主により認識される複製起点を含有する。発現ベクターの場合、ベクターは、プロモーター及び宿主により認識される他の調節領域も含有する。別の核酸分子を含有するベクターは、形質転換、トランスフェクションにより又はウイルス侵入機構を用いることにより細胞に導入できる。いくつかのベクターは、宿主細胞内で自律複製できる（例えば細菌複製起点を有するベクターは、細菌内で複製できる）。他のベクターは、宿主に導入された場合に宿主のゲノムに組み込まれ、そのことにより宿主のゲノムと一緒に複製できる。

作動可能に連結した
用語「作動可能に連結した」とは、２つ以上の核酸要素が物理的に通常連結され、互いに機能的関係を有することを意味する。例えば、プロモーターが、コード配列の転写若しくは発現を開始又は調節できるならば、プロモーター及び上記のコード配列は、作動可能に連結しており、この場合、コード配列は、プロモーターの「制御」下であると解釈される。

宿主
本明細書で用いる場合、用語「宿主」は、発現ベクターのようなベクターが導入された生物又は細胞のことをいう。上記の生物又は細胞は、原核若しくは真核の生物又は細胞であり得る。この用語は、ある対象の生物又は細胞のみに言及するのではなく、この生物又は細胞の子孫にも言及すると理解される。変異又は環境の影響により、いくつかの改変が後続の世代に生じ、よって、このような子孫は、親の生物又は細胞と実際上異なるが、これらは、本明細書で用いる場合の用語「宿主」の範囲内にまだ含まれる。

薬学的に許容される賦形剤
「薬学的に許容される賦形剤」は、医薬、活性剤又は結合分子のような活性分子と組み合わせて適度な又は簡便な剤形を調製する任意の不活性な薬剤のことをいう。「薬学的に許容される賦形剤」は、用いられる投与量及び濃度にて宿主にとって非毒性であり、医薬、薬又は結合分子を含有する調製物の他の成分と適合できる賦形剤である。

治療有効量
用語「治療有効量」は、がんを効果的に予防、改善及び／又は治療できる本発明の抗体の量を意味する。

治療
用語「治療」は、疾患を治癒又は疾患を予防若しくは疾患の進行を少なくとも遅らせるために用いる治療的治療或いは予防的措置のことをいう。治療される対象は、がんに罹患している対象及びがんの予防を必要とする対象を含む。がんから部分的又は完全に回復した対象も治療を必要とする。予防は、がんの進行を阻害若しくは遅くすること或いはがんに関連する１若しくは複数の症状の発症、発生又は進行を阻害又は低減することを含む。

本記載では、用語「含む」は、言及した要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップの群を含むが、他の要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップの群を排除しないことを意味する。

一態様では、本発明は、モノクローナル抗体の重鎖が、配列番号７〜９に示すＣＤＲ領域を含み、モノクローナル抗体の軽鎖が、配列番号１０〜１２に示すＣＤＲ領域を含む、癌胎児性抗原に対するヒト化キメラモノクローナル抗体又はその機能的変異体を提供する。

一態様では、本発明は、抗体の軽鎖タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１を含むか又は配列番号１からなり、重鎖タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２を含むか又は配列番号２からなる抗ＣＥＡ抗体又はその機能的変異体を提供する。本発明の好ましい実施形態では、抗ＣＥＡ抗体は、組換え又はモノクローナル抗体である。別の好ましい実施形態では、前記抗体は、キメラ又はヒト化抗体である。

本出願では、用語「本発明の抗体」は、モノクローナル抗体の重鎖が、配列番号７〜９に示すＣＤＲ領域を含み、モノクローナル抗体の軽鎖が、配列番号１０〜１２に示すＣＤＲ領域を含む、本発明による抗ＣＥＡヒト化キメラモノクローナル抗体又はその機能的変異体のことをいう。具体的に、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の軽鎖タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１を含むか又は配列番号１からなり、重鎖タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２を含むか又は配列番号２からなる。

本発明は、前記ヒト化キメラ抗体のものと同一であるＣＤＲ配列を有するポリペプチドにも関し、これは、本発明による前記ヒト化キメラ抗体の生物活性と同等又はそれより高い生物活性を有する。用語「本発明のポリペプチド」は、前記ヒト化キメラ抗体のものと同一であるＣＤＲ配列を有するポリペプチドのことをいい、前記ポリペプチドは、本発明による前記ヒト化キメラ抗体の生物活性と同等又はそれより高い生物活性を有する。

別の態様では、本発明は、本発明の抗体若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補配列を含む本発明の抗体をコードする核酸に関する。前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。ヌクレオチド配列が変化しても、トリプレットコドンの遺伝子ドグマに従って配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体タンパク質に最終的に翻訳できる限りは、それはやはり前記抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体をコードするポリヌクレオチドであることが当技術分野において知られている。

別の態様では、本発明は、前記抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を調製するために用いることができる組換え発現ベクターを提供する、前記ベクターは、本発明の抗体をコードする核酸を含む。ベクターは、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴＯＬ、Ｔｉなどのプラスミド；コスミド；λ、ラムドイド、Ｍ１３、Ｍｕ、Ｐ１、Ｐ２２、Ｑ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ−ｏｄｄ、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ７などのファージ；植物ウイルス；又は動物ウイルスに由来できる。ベクターは、クローニング及び／又は発現の目的のため及び遺伝子治療の目的のために用いることができる。１若しくは複数の発現調節核酸分子と作動可能に連結した本発明の抗体をコードする１又は複数の核酸分子を含むベクターも、本発明に含まれる。ベクターの選択は、組換え手順及び用いる宿主に依存する。ベクターを宿主細胞に導入することは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−グルカン媒介トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクション又はエレクトロポレーションにより達成できる。ベクターは、自律複製できるか又はベクターが組み込まれた染色体と一緒に複製できる。好ましくは、前記ベクターは、１又は複数の選択マーカーを含有する。前記マーカーの選択は、選択される宿主細胞に依存でき、本発明にとって重要でなく、当業者に知られている。前記マーカーは、それらに限定されないが、カナマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、ヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を含む。具体的に、本発明では、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ真核プロモーターを有する２つのベクターに組換えによりクローニングされる。得られる発現ベクターを、真核宿主細胞に導入する。抗体を高い収率で発現する真核宿主細胞をスクリーニングにより得て、前記宿主細胞の培養物の上清は、細胞により分泌された抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体タンパク質を多量に含有する。抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体タンパク質は、当技術分野において既知の技術的方法に従って簡便に抽出及び調製できる。好ましい実施形態では、前記発現ベクターは、それぞれｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡ及びｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡであり、これらは、前記抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の遺伝子と、メトトレキセートストレス増幅発現選択マーカー遺伝子（ｄｈｆｒ）とを含有し、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現できる。好ましい実施形態では、前記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯである。

本発明は、前記ベクターの１又は複数のコピーを含有する宿主も提供する。好ましくは、前記宿主は、宿主細胞である。宿主細胞は、それらに限定されないが、哺乳動物、植物、昆虫、真菌又は細菌を起源とする細胞を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞を用いる発現系は、本発明において好ましい。好ましい実施形態では、本発明は、ｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡ及びｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡを含有するチャイニーズハムスター卵巣細胞である組換え宿主細胞（Ｒｃｃ２４）を提供する。前記組換え宿主細胞は、段階的メトトレキセートストレス増幅発現、発現収率によりスクリーニングした高発現株のサブクローニング及び血清フリー培養における最終的な馴化により得られる。前記宿主細胞は、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒに、２０１０年５月４日に寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０３号で寄託された。

本発明の一態様によると、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体タンパク質は、ヒトＣＥＡ陽性腫瘍を診断及び／又は治療するための医薬の調製において用いることができる。追跡分子を本発明の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とカップリングさせることにより、ヒトＣＥＡ陽性腫瘍を診断するための医薬を調製できる。前記追跡分子は、放射活性核種（例えば^１２５Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｅなど）であり得る。代わりに、ナノ蛍光物質又は遠赤外物質などの臨床的に許容される技術的手段により検出できる他の型の分子を用いることもできる。本発明の好ましい実施形態では、追跡分子は、放射活性核種レニウム−１８８である。追跡分子を抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とカップリングさせた後に、ＣＥＡ陽性腫瘍は、γカメラ又はイメージャーによる放射性免疫イメージングにより、比較的良好なシグナルノイズ比、標的特性及びイメージング品質で正確に診断できる。

本発明の抗体は、腫瘍の治療のための医薬組成物の調製において用いることもできる。さらに、放射活性核種などのある治療剤を、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とカップリングさせて、ヒトＣＥＡ陽性腫瘍の治療のための医薬組成物を調製できる。本明細書で記載する場合、「抗体複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、放射活性核種のような治療用物質を本発明の抗体と、当業者に既知の様々なカップリング法によりカップリングさせることにより得られる複合体のことをいう。前記放射活性核種は、^１３１Ｉ及び^９０Ｙを含む。本発明の好ましい実施形態では、前記治療用物質は、放射活性核種ヨウ素−１３１である。治療用物質を抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とカップリングさせた後に、放射性免疫治療をＣＥＡ陽性腫瘍について行うことができ、これは、腫瘍の増殖を著しく阻害でき、優れた治療効果を有し、明らかな毒性及び副作用を本質的に有さない。好ましい実施形態では、抗体又は抗体複合体は、卵巣がん、乳がん、肺がん及び他のＣＥＡ陽性腫瘍を含むＣＥＡを発現する腫瘍の診断又は治療のために用いることができる。好ましい具体的な実施形態では、ＣＥＡを発現する前記腫瘍は、結腸直腸がんである。現存する臨床的診断技術に基づいて、当業者は、患者の血清中のＣＥＡ含量を検出でき、患者の腫瘍がＣＥＡ陽性であるかを決定でき、治療すべき適度な腫瘍の型を容易に選択できる。当業者は、前記医薬組成物が、薬学的に許容される賦形剤も含み得ることも理解している。

前記抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体は、それらに限定されないが、非経口投与、例えば経静脈、注入、局部投与などを含む従来の投与経路により、患者に医薬として投与できる。適度な用量は、投与の方法並びに治療される対象及び耐容能レベルを含むいくつかのパラメータに依存する。^１３１Ｉ標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、用量依存的にヒト結腸直腸がんの増殖を著しく阻害できることが明確である。好ましい用量は、１２．５ｍＣｉ／ｋｇであり、治療は、１０日間隔で２回行った。

本発明を、以下の実施例によりさらに説明するが、いずれの実施例又はそれらの組み合わせも、本発明の範囲又は実施形態を限定すると解釈されない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。当技術分野における常識と組み合わせた本明細書の記載に基づいて、当業者は、特許請求の範囲により定義される範囲を明確に理解できる。

生物材料の寄託情報
親のマウスモノクローナル抗体を生成するマウスハイブリドーマ細胞株Ｃ２４は、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＭＣＣ、Ｂｅｉｃｈｅｎｘｉ Ｒｏａｄ １−３ ｉｎ Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇ、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、２０１０年５月４日に寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０２号で寄託した。

ヒト化キメラモノクローナル抗体を生成するＣＨＯ細胞株Ｒｃｃ２４は、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＭＣＣ、Ｂｅｉｃｈｅｎｘｉ Ｒｏａｄ １−３ ｉｎ Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇ、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、２０１０年５月４日に寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０３号で寄託した。

実施例１：キメラ抗体についての遺伝子のクローニング及び配列決定
遺伝子クローニング法を用いて、親の抗ＣＥＡマウスのモノクローナル抗体中の軽鎖及び重鎖可変領域についての遺伝子をクローニングし、ヌクレオチド配列分析を行った。

親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の可変領域についての遺伝子を増幅するための方法：マウスモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞Ｃ２４からの全ＲＮＡの抽出を、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（Ｇｉｂｃｏ）の使用説明に従って次のようにして行った。１×１０^７マウスモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞を回収し、１００００ｒｐｍにて１分間遠心分離した。ピペット操作で上清を捨てた後に、１ｍｌのトリゾールを加えて細胞を十分に溶解させた。室温にて３〜５分間静置した後に、０．２ｍｌのクロロホルムを加えた。転倒させて混和した後に、試料を４℃、１２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、次いで０．６ｍｌの上清を新しい遠心分離チューブに移し、０．５ｍｌのイソプロパノールを加えた。転倒させて混和した後に、試料を室温にて５〜１０分間静置し、次いで４℃、１２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。上清を捨てた後に、試料を７５％エタノールで１回洗浄し、風乾し、次いで５０μｌのｄｄＨ_２Ｏを加えて沈殿物を溶解した。マウスモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞ｃＤＮＡの第１鎖の合成を、製造業者により提供される使用説明に従ってＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を用いて行った。４μｌの５×緩衝液、１０ｍＭのＤＤＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０μｇの全ＲＮＡ、０．５ｍＭの最終濃度のｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０μｇ／ｍｌの最終濃度のオリゴｄ（Ｔ）１５（Ｐｒｏｍｅｇａ）、４０ｕのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２００ｕ（Ｕ）のＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を２０μｌの系に加え、これらを次いで混和した。試料を３７℃にて１時間、次いで沸騰した水で５分間インキュベートして逆転写酵素を不活性化させた。マウスモノクローナル抗体軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子の増幅を、高正確性ＤＮＡポリメラーゼＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）＋Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、１０×緩衝液１０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、ｃＤＮＡ ２０μｌ、各増幅プライマー５０ｐｍｏｌを含有する１００μｌの反応系において行った。反応系の表面を、混和の後にパラフィン油で覆った。９５℃の水浴中で５分間インキュベートした後に、１〜２ｕのＴａｑ＋Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを、パラフィン油を通して加え、以下のサイクルを開始した：９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で１分間を３０サイクル、並びに最後のサイクルにおいて７２℃で１０分間。ＰＣＲプライマー：軽鎖可変領域の増幅用プライマー：ＰＶＬ５：５’−ＧＡＣＡＴ ＴＣＡＧＣ ＴＧＡＣＣ ＣＡＧＴＣ ＴＣＣＡ−３’（配列番号３）；ＰＶＬ３：５’−ＧＴＴＡＧ ＡＴＣＴＣ ＣＡＧＣＴ ＴＧＧＴＣ ＣＣ−３’（配列番号４）。重鎖可変領域の増幅用プライマー：ＰＶＨ５：５’−ＡＧＧＴＳ ＭＡＲＣＴ ＧＣＡＧＳ ＡＧＴＣＷ ＧＧ−３’（Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ）（配列番号５）；ＰＶＨ３：５’−ＴＧＡＧＧ ＡＧＡＣＧ ＧＴＧＡＣ ＣＧＴＧＧ ＴＣＣＣＴ ＴＧＧＣＣ ＣＣＡＧ−３’（配列番号６）。

０．７％非変性アガロースゲル電気泳動を行って、全ＲＮＡを分析した。１８Ｓ ＲＮＡ及び２８Ｓ ＲＮＡのサイズは正しく、明度比率は約１：２であり、バンドは明確であり、これらのことは、抽出した全ＲＮＡが比較的完全であったことを示した（図１）。オリゴｄ（Ｔ）１５をプライマーとして用いて、ｃＤＮＡの第１鎖を合成し、このｃＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行った。軽鎖プライマーＰＶＬ５及びＰＶＬ３を用いることにより、約３２０ｂｐの軽鎖可変領域の遺伝子断片を増幅し、重鎖プライマーＰＶＨ５及びＰＶＨ３を用いることにより、約３６０ｂｐの重鎖可変領域の遺伝子断片を増幅した。鋳型を含まないブランク対照は、増幅バンドを示さなかった（図２）。増幅された可変領域遺伝子断片のサイズは、通常の抗体の可変領域遺伝子のサイズと一致した。

親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体軽鎖、重鎖可変領域の遺伝子のクローニング、配列決定及び遺伝子構造分析：親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域の遺伝子断片を、大量に増幅した。グラスミルク吸着法を用いて単離及び回収した後に、断片を、ＰｖｕＩＩ及びＢｇｌＩＩ二重消化に供し、次いで、クローニングベクターｐＲＧＷＬの対応する部位にクローニングした。１５３個全ての形質転換クローンのうち、２４個のクローンをスクリーニングのためにランダムに採取し、６個の組換えクローンを得た。３個のＶＬ遺伝子組換えクローンをヌクレオチド配列分析のために選択した。ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を図３に示した。３個のクローンの配列は同一であり、クローニングされた抗体軽鎖可変領域遺伝子が、実際に親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域遺伝子であったことを示した。１個のクローンを３個のクローンからランダムに採取し、ｐＲＧＷＬ−Ｃ５０２と命名した。Ｋａｂａｔのデータとの比較から、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のＶＬ（配列番号２）がマウスκ軽鎖ＶＩサブグループに属することがわかる。軽鎖ＣＤＲ１〜３配列（配列番号１０〜１２）を図３に示した。親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体重鎖可変領域の遺伝子断片を、大量に増幅した。グラスミルク吸着法を用いて単離及び回収した後に、断片を、ＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩ二重消化に供し、次いで、クローニングベクターｐＲＧＷＨの対応する部位にクローニングした。３６４個全ての形質転換クローンのうち、２４個のクローンをスクリーニングのためにランダムに採取し、１８個の組換えクローンを得た。３個のＶＨ遺伝子組換えクローンをヌクレオチド配列分析のために選択した。ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を図３に示した。３個のクローンの配列は同一であり、クローニングされた抗体重鎖可変領域遺伝子が、実際に親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体重鎖可変領域遺伝子であったことを示した。１個のクローンを３個のクローンからランダムに採取し、ｐＲＧＷＨ−Ｃ５０４と命名した。Ｋａｂａｔのデータとの比較から、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のＶＨ（配列番号１）が、マウス重鎖ＩＩ（Ｂ）サブグループに属することがわかる。重鎖ＣＤＲ１〜３配列（配列番号７〜９）を図３に示した。具体的に、配列番号７〜１２の配列は、次のとおりである：
配列番号７−Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ
配列番号８−Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
配列番号９−Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ
配列番号１０−Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ
配列番号１１−Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ
配列番号１２−Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｓｅｒ

実施例２：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体についての遺伝子及び発現ベクターの構築
遺伝子クローニング及びＤＮＡ組換え法を用いて、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の可変領域遺伝子を、調節配列及びヒト抗体定常領域遺伝子を含有するベクターに組み換えて、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の遺伝子及び前記遺伝子を含有する真核発現ベクターを構築した。

調節配列を有する可変遺伝子断片のＰＣＲ増幅：ＰＣＲ増幅を、高正確性ＤＮＡポリメラーゼ、すなわちＴａｑ＋Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを、１０×緩衝液１０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、プラスミド１μｇ、５０ｐｍｏｌの各増幅プライマーを含有する１００μｌ反応系において行った。混和の後に、反応系の表面をパラフィン油で覆った。９５℃の水浴中で５分間インキュベートした後に、１〜２ｕのＴａｑ＋Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを、パラフィン油を通して加え、以下のサイクルを開始した：９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で１分間を２０サイクル、並びに最後のサイクルにおいて７２℃で１０分間。

抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の真核発現ベクターの構築及び同定：実施例１において取得及び同定した組換えクローニングプラスミドｐＲＧＷＬ−Ｃ５０２及びｐＲＧＷＨ−Ｃ５０４を鋳型として用いて、クローニングの目的のためにＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限部位を有するプライマーＰＶＬＳ及びＰＶＮＰ（軽鎖について）並びにＰＶＨＳ及びＰＶＮＰ（重鎖について）をＰＣＲ増幅のために用いて、リーダーペプチド配列と５’端スプライシング部位とを有する親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のＶＬ及びＶＨ配列を増幅した。ＰＣＲ増幅により、リーダーペプチド配列と５’端スプライシング部位とを有する親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のＶＬ断片を、軽鎖についての組換えプラスミドから増幅し、ＶＬ断片のサイズは約５００ｂｐであった。リーダーペプチド配列と５’端スプライシング部位とを有する親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のＶＨ断片を、重鎖についての組換えプラスミドから増幅し、サイズは約７００ｂｐであった。ＰＣＲ産物を、グラスミルク法を用いて単離及び回収し、次いで、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いて消化した。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」に記載される従来のＤＮＡ組換え手順に従って、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体遺伝子の完全真核発現ベクターを得るように、ＶＬ断片をｐＳＲＮＣ−Ｃκの対応する部位にクローニングし、ＶＨ断片をｐＳＲＤＣ−Ｃγ１の対応する部位にクローニングした。ＶＬ及びＶＨ断片をそれぞれ発現ベクターｐＳＲＮＣ−Ｃκ及びｐＳＲＤＣ−Ｃγ１に連結した後に、１２個のクローンをそれぞれスクリーニングのために採取した。酵素消化により、９個の軽鎖及び７個の重鎖組換えクローンを得た。ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩによる酵素消化の後に、対応するＶＬ及びＶＨ断片を同定し、このことにより、完全抗癌胎児性抗原モノクローナル抗体遺伝子及びその真核発現ベクターの構築が成功したことが実証された。２回のヌクレオチド配列決定により、抗癌胎児性抗原モノクローナル抗体真核発現ベクターｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡ及びｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡ中の可変領域遺伝子配列が、それぞれｐＲＧＷＬ−Ｃ５０２及びｐＲＧＷＨ−Ｃ５０４中に含まれる可変領域遺伝子配列と完全に同一であることが証明された。

抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体真核発現ベクターの構造：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体真核発現ベクター系は、２つの別々の発現ベクター、すなわち軽鎖真核発現ベクターｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡと重鎖真核発現ベクターｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡとを含有するが、これらの構造の概略図を図４及び５に示した。

実施例３：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞による発現
ＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻細胞（本発明者らの実験室にて保管）を、１０％ＦＢＳ、０．０３ｍｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン（Ｈ）、０．００３ｍｍｏｌ／Ｌチミジンデオキシヌクレオシド（Ｔ）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌプロリン（Ｐｒｏ）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌグリシン（Ｇｌｙ）、１００ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミンを含むＤＭＥＭ完全成長培地中で、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で培養した。継代を、１：１０の比率で３〜４日毎に常法通り行った。上記の細胞培養試薬は、Ｇｉｂｃｏ社から購入した。遺伝子トランスフェクション法を用いて、リポフェクタミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）試薬（Ｇｉｂｃｏ）をトランスフェクションのために用いた。細胞に抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の発現ベクターをトランスフェクトし、次いで、Ｈ、Ｔ、Ｇｌｙを含まない培地で培養することによりスクリーニングした。クローンが形成された後に、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含有する選択培地を培養のために用いて、スクリーニングを行った。その結果、４μｇの軽鎖及び重鎖キメラ抗体遺伝子発現ベクターのそれぞれを用いて、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻細胞をトランスフェクトした。クローンの形成は、約１０日後に観察され、全て一緒に約３５０個のクローンが計数された。プールした耐性クローンの培養物の上清は、間接ＥＬＩＳＡ法を用いることによりＯＤ_４９０＝１．６２２として測定され（陰性対照ＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻上清のＯＤ_４９０は０．０６３のみであった）、このことは、トランスフェクトした細胞の上清中に抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体発現が存在したことを示した。

実施例４：ストレス下での発現増幅により抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を高発現できる株のスクリーニング
形質転換ＣＨＯ細胞を、１０％ＦＢＳ、１００ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミンを含むＤＭＥＭ完全成長培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で培養した。継代を、１：１０の比率で３〜４日毎に常法通り行った。メトトレキセート（ＭＴＸ）のストレス下での発現増幅のスクリーニング法を用いて、高発現株をスクリーニングした。上清中の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を発現する細胞クローンを、ストレス下で発現を増幅するために、３×１０^−８Ｍ及び１０^−７Ｍのメトトレキセート（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ含有する完全培地中で逐次的に培養した。各回の増幅発現の後に、サブクローニングを限界希釈により行って、最高の収率を有するクローンを選択した（図６）。

抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体発現ベクターをＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻細胞にトランスフェクトした後の１回目のスクリーニングで得られ、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を高効率で発現できるクローン１Ｃ５（０．４１μｇ／ｍｌまでのキメラ抗体の収率）を、３×１０^−８Ｍのメトトレキセート（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中で培養した。約３０日間の連続した培養の後に、細胞モダリティ及び成長速度は通常に回復したことが観察され、細胞は、３×１０^−８ＭのＭＴＸに適応した。キメラ抗体の発現収率は、１０．４μｇ／ｍｌであった。サブクローニングの後に、最高のキメラ抗体収率を有するクローン２Ｂ２を選択し、キメラ抗体の収率は、１６μｇ／ｍｌであった。１：５の比率での継代の後に、クローン２Ｂ２を、１０^−７ＭのＭＴＸを含有する完全培地中で次いで培養した。細胞が適応した後に、キメラ抗体の収率は、３２μｇ／ｍｌであった。サブクローニングの後に、最高のキメラ抗体収率を有するクローン３Ｂ２を選択し、予備的検出により、キメラ抗体収率は、８０μｇ／ｍｌほどの高さであった（図７）。

実施例５：血清フリー懸濁培養に適応し、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を生成できる細胞株の馴化及び調製
血清を減少させる方法を用いて細胞株（血清フリー懸濁培養に適応されている）を馴化して、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を高レベルで発現及び分泌できる細胞株（血清フリー懸濁培養に適応されている）を得た。

血清を含有する培地で培養した場合に接着して成長し、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を高効率で発現及び分泌するｒＣＨＯ ＲＣＣ−２４細胞（すなわちクローン３Ｂ２）を、まず、５％血清を含有するＤＭＥＭ完全成長培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養フラスコにおいて培養した。細胞が適応し、安定な成長を示した後に、培地を、２％、１％、０．５％、０．２５％の血清をそれぞれ同じように含有する完全成長培地に逐次的に置き換えた。細胞が適応し、安定な成長を示した後に、培地を、血清フリー培地、すなわちＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ成長培地（Ｇｉｂｃｏ）に最終的に置き換えた。このときに、細胞のほとんどは接着成長の特性を喪失し、培養物は本質的に半懸濁になった。細胞が適応し、安定な成長を示した後に、細胞を、次いで、８０〜１００ｒｐｍにて振とうフラスコ中で培養し、細胞を強制的に懸濁で成長させた。細胞が適応し、安定な成長を示した後に、血清フリー懸濁培養で成長でき、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を効果的に発現及び分泌する、得られた新しい細胞を、ｒＣＨＯ ＲＣＣ−２４（ＳＦ）細胞株と命名した。

実施例６：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の特異性、ヒト化特性及びｉｎ ｖｉｖｏ標的特性の同定
１．抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の特異性の同定：
ＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ここでは、トリゾール試薬の使用説明に従って、具体的には実施例１に記載したようにして細胞の全ＲＮＡの抽出を行った。ｃＤＮＡの第１鎖の合成を、製造業者の使用説明に従って、具体的には実施例１に記載するようにしてＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ＰＣＲ増幅実験において、細胞のｃＤＮＡからの可変領域遺伝子を増幅する方法は、実施例に記載したとおりであった。結果は、配列決定の後に、ｒＣＨＯ ＲＣＣ−２４（ＳＦ）細胞株から増幅された軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子（図８）が、元の親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子と同一であり、よって、抗癌胎児性抗原モノクローナル抗体が、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の特異性を維持し、ＣＥＡと特異的に結合できることを示した。

ＥＬＩＳＡ法を行い、ここでは、１μｇ／ｍｌのＣＥＡを用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。試料を反応のために加えた後に、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰＥＬＩＳＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）（マウスＩｇと交差反応しない）又はヤギ−抗マウスＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰ ＥＬＩＳＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）（ヒトＩｇと交差反応しない）を加えた。インキュベーション及び発色の後に、ＯＤ４９０値を測定した。その後、ヒトＣＥＡ抗原を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、次いで、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰを２次抗体として用いて直接ＥＬＩＳＡを行った。形質転換細胞の上清中の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体及びプロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムにより精製された抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体はともに、コーティングのために用いたＣＥＡ抗原と結合でき、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片ポリクローナル抗体により認識でき、強い陽性反応を示した。非形質転換ＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻細胞培養上清及び親のマウスモノクローナル抗体は、陰性の反応を示した。ヤギ−抗マウスＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰを２次抗体として用いた場合、非形質転換ＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻細胞培養上清及び精製抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体はともに陰性の反応を示したが、親のマウスモノクローナル抗体は陽性の反応を示した。無関係の抗体ヒトＩｇＧ１は、両方の場合について陰性であった。発現された抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体がＣＥＡ抗原と特異的に結合でき、親のマウスモノクローナル抗体と同じ抗原結合特異性を有したことが実証された。

競合阻害実験を行い、ここでは、１μｇ／ｍｌのＣＥＡ抗原を用いてＥＬＩＳＡプレート（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）をコーティングした。２．５ｎｇ／ウェルの無関係のマウスモノクローナル抗体（本発明者らで調製した）又は２．５ｎｇ／ウェルの親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ５０（本発明者らで調製した）及び異なる濃度の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を加えた。３７℃でのインキュベーションの後に、次いで、ヤギ−抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ ＥＬＩＳＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）を加えた。ＯＤ４９０値を反応の後に測定し、その競合阻害率を計算した。競合阻害率は、以下の式に従って計算し、無関係の抗体ヒトＩｇＧ１対照も用いた。

競合阻害実験の結果を以下の表に示し、陰性対照である無関係の抗体ヒトＩｇＧ１及び親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の反応は、競合阻害効果を示さなかった（競合阻害率は−１２．８０％であった）。抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体と親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体との間の比率が２：１である場合、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体と抗原との間の結合について著しい競合阻害が起こり得る。キメラ抗体の濃度が増加すると、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体と抗原との間の結合産物の量が減少し、そのＯＤ４９０が徐々に減少し、競合阻害率が増加した。比率が３２：１の場合、競合阻害率は４０．８５％まで到達できる。このことは、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体及び親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体がともに、ＣＥＡ抗原の同じエピトープと結合できることを示し、このことにより、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体及び親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体が同じ抗原結合特異性を有することが証明された。

免疫蛍光試験を行い、ここでは、ＣＥＡを高レベルで発現できる結腸がん細胞ＬＳ１８０（ＡＴＣＣから購入）を標的細胞として用い、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を加えた。３７℃でのインキュベーションの後に、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ蛍光２次抗体（Ｓｉｇｍａ）を次いで加え、蛍光顕微鏡を用いて、反応後の観察を行い、無関係の抗体対照を対照として用いた。図９における結果は、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、ＣＥＡを高レベルで発現できる結腸がん細胞ＬＳ１８０上のＣＥＡ抗原を認識できることを示した。
免疫蛍光試験を行い、ここでは、いくつかのＣＥＡ発現がん細胞ＳＷ１１１６、ＬＯＶＯ（ＡＴＣＣから購入）を標的細胞として用い、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を加えた。３７℃でのインキュベーションの後に、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ５蛍光２次抗体（Ｓｉｇｍａ）を次いで加えた。蛍光顕微鏡を用いて反応後の観察を行い、無関係の抗体対照を対照として用いた。結果（図１０）は、癌胎児性抗原に対するモノクローナル抗体が、ＣＥＡ発現がん細胞上のＣＥＡ抗原を認識できることを示した。

２．抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体のヒト化特性の同定：
ＥＬＩＳＡ実験において、ＣＥＡ、ヤギ−抗ヒトκ鎖（Ｓｉｇｍａ）又はヤギ−抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）をＥＬＩＳＡ抗体として用いた。ＥＬＩＳＡの結果（表４）は、精製抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が強い陽性反応を示したが、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体モノクローナル抗体の親のマウスモノクローナル抗体は陰性の反応を示したことを示した。このことは、精製抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、ヒトＩｇＧの軽鎖及び重鎖定常領域を含有することを実証した。

ウェスタンブロッティング実験を行い、ここでは、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体についての還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。抗体をメンブレンに移した後に、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰ又はヤギ−抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体をそれぞれ用いてウェスタンブロッティングを行った。結果（図１１）は、５５ｋＤでのタンパク質バンドが、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰにより認識され、染色された単独の特異的バンドを形成し、バンドが示すサイズが、抗体の重鎖に相当したことを示した。対照マウスモノクローナル抗体は、その位置にバンドを示さず、このことは、発現された抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体重鎖がヒト定常領域を含有することを実証した。２５ｋＤでのタンパク質バンドがヤギ−抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体により認識され、染色された単独の特異的バンドを表し、このバンドが示すサイズは、抗体の軽鎖に相当した。対照マウスモノクローナル抗体はここでは陰性の反応を示し、このことは、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体がヒトκ鎖定常領域を含むことを示した。

ヤギ−抗ヒトＩｇＧ、ヤギ−抗ヒトＩｇＭ及びヤギ−抗ヒトＩｇＡを用いて血清を免疫し、二重免疫拡散試験を、検査のために行った。結果は、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、ヒトＩｇＧ型の免疫グロブリンに属することを示した。マウス−抗ヒトＩｇＧ１、マウス−抗ヒトＩｇＧ２、マウス−抗ヒトＩｇＧ３及びマウス−抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ試験を行い、結果は、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体がヒトＩｇＧ１であったことを示した。

３．抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ標的特性の同定：
ｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫取り込み実験、ｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫生体分布実験を含むいくつかのｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫実験を行って、腫瘍をｉｎ ｖｉｖｏで特異的に標的にする特性について抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を調べた（ＣＥＡ陽性腫瘍結腸がん細胞ＬＳ１７４Ｔの腫瘍を有するマウスをモデルとして用いた）。結果は、核種^１２５Ｉ標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の注射の後に、腫瘍が、全ての組織のうちで最も多く標識抗体を取り込み、他の正常組織よりもかなり高く、これは、最大で３３％まで達し、２６％が７ｄ後まで残ることができることを示した。標識抗体は、腫瘍によく蓄積し、長期間残ることができる。正常組織における取り込み量は低く、これらは残らず、全て時間経過とともに迅速に減少した（図１２）。Ｔ／Ｎ比率研究の結果は、標識抗体が、注射の２４時間後に腫瘍に主に分布し、血液プールにはそれらのわずかが分布したことを示した。しかし、９６時間後に、標識抗体は、腫瘍にのみ優勢的に分布し、このことは、核種標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が腫瘍に特異的に分布できるが、正常組織には分布しないことを示した（図１３）。上記の結果は、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、優れたｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的特性を有し、動物においてＣＥＡ陽性腫瘍細胞と特異的に結合でき、腫瘍中に特異的に蓄積されて残るが、血液プール以外の正常組織には分布せず残らなかったことを示した。

実施例７：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を用いるｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫イメージング診断のための診断用医薬の調製
Ｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫イメージング実験を採用して、ｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫イメージング診断についての診断用医薬（本発明の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を用いて調製した）の効力を評価した。図１４に示す結果は、本発明の核種^１８８Ｒｅ標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の注射の２４時間後に、腫瘍を明確に画像化できることを示した。腫瘍は、５〜７日後にさらにより明確になり、画像化できる最小の腫瘍のサイズは、０．５ｃｍであった。結果は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断への非常に良好な応用の可能性を示す。

実施例８：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を用いるＣＥＡ陽性腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫治療のための治療用医薬の調製
核種Ｉ−１３１を用いて抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を標識した（ｒｃｈ２４と略す、約２０ｍＣｉ／ｍｇタンパク質）。結腸がん腫瘍を死滅させるｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫治療の有効性を、ヒトＣＥＡ陽性結腸がん細胞ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ、ＵＳＡから購入）の移植腫瘍を有するマウスにおいて研究し、ここでは、１００万個のＬＳ１８０を前記マウスの右側の背中にｓ．ｃ．注射し、腫瘍のサイズが適度になった後に治療を行った。結果は、形成された腫瘍について（腫瘍のサイズが０．５ｃｍ^３を超えた後に治療を行った）、２５０μＣｉ／用量の高い免疫活性及び特異的放射活性を有する標識抗体を用いる単回治療が、形成された腫瘍について８１．１％の腫瘍阻害率を示した（表５、図１５）が、１２５μＣｉ／マウスを１ｗ間隔で３回投与した治療群について（腫瘍のサイズが約０．１ｃｍ^３になったときに治療を行った）、腫瘍阻害率は９３％であり（表６、図１６）、腫瘍の増殖はほぼ停止したことを示した。両方の場合において、ヒト結腸がんの増殖は、著しく阻害できる。末梢血液像分析及び体重変動についての予備的毒性研究は、^１３１Ｉ標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体をヒト結腸がんのｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫治療のために用いる場合、末梢血液像及びマウスの体重の各成分は、治療群と対照群との間で著しく異ならず、このことは、明らかな毒性がないことを示した。

ヒト大腸がんを有するヌードマウスモデルにおいて、試験試料（すなわち１３１Ｉ標識抗ＣＥＡキメラ抗体ｒｃｈ２４）のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を観察した。方法：ヒト大腸がん細胞ＬＳ１８０、ＬＳ１７４Ｔ及びＳＷ１１１６をそれぞれＢＡＢＬ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウスにｓ．ｃ．接種した８〜１０日後に、異なる群にそれぞれ投与した。腫瘍のサイズによる均衡の原則に基づいて、群を、対照群；「ヌード」抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体ｒｃｈ２４群（１５６．２μｇ／ｋｇ群及び６２５．０μｇ／ｋｇ群）；同一の特異的放射活性で標識した無関係のヒトＩｇＧ群（３．１ｍＣｉ／ｋｇ群及び１２．５ｍＣｉ／ｋｇ群）；１３１Ｉ標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体ｒｃｈ２４群（３．１ｍＣｉ／ｋｇ群、６．２５ｍＣｉ／ｋｇ群及び１２．５ｍＣｉ／ｋｇ群）；並びに陽性化学療法医薬対照群に分割した。試験試料及び適切な対照試料を尾静脈中の注射により１０日毎に１回、合計で２回投与した。規則的に、動物の全身の状態を観察し、体重を測定し、腫瘍のサイズを測定し、血清ＣＥＡレベル及び末梢血指標を測定し、腫瘍組織及び非腫瘍組織中の同位体の分布を決定した。腫瘍を有するヌードマウスを実験の最後に屠殺し、腫瘍の重量を測定した。結果：高用量の試験試料群（１３１Ｉ標識抗ＣＥＡキメラ抗体ｒｃｈ２４）の１匹のヌードマウスが死亡し、同一の特異的放射活性で標識した無関係のヒトＩｇＧの高用量群の１匹のヌードマウスが死亡した。投与後に、試験試料の全ての群において、腫瘍のサイズは対照群のものよりも小さく、相対的腫瘍増殖率は、対照群のものよりも低かった。３つの腫瘍株ＬＳ１８０、ＬＳ１７４、ＳＷ１１１６についての腫瘍阻害率は、低用量群において４７．８〜７１．４％であり、中程度用量群において５２．２〜７５．０％であり、高用量群において６５．２〜８６．２％であった。試験試料の全ての群においてヌードマウスの血清ＣＥＡレベルは、対照群のものよりも明確に低かった。「ヌード」抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体及び１３１Ｉ標識無関係ヒトＩｇＧの異なる用量群を比較した場合に、腫瘍阻害効果は、試験試料の対応する群より著しかった。３つの腫瘍株についての腫瘍阻害効果について、試験試料１３１Ｉ標識抗ＣＥＡキメラ抗体ｒｃｈ２４は、ＬＳ１８０腫瘍の増殖の阻害について最も効力があった。１回目の投与の４８時間及び９６時間後に、腫瘍組織中の同位体の分布は、非腫瘍組織におけるものよりも明確に高かった。投与の３０日後に、投与群のヌードマウスにおける末梢血白血球総数などの指標は、対照群のものと著しくは異ならなかった。結論：試験試料１３１Ｉ標識抗ＣＥＡキメラ抗体ｒｃｈ２４は、マウスが有するヒト大腸がんの増殖を投与量依存的に著しく阻害でき、腫瘍を有するヌードマウスにおける血清ＣＥＡレベルを同時に減少でき、腫瘍組織におけるその標的分布は著しかった。投与は１０日間隔で２回行い、投与群における腫瘍を有するヌードマウスの造血機能は明確には変化しなかった。

Claims (9)

1. ヒト化キメラモノクローナル抗体であって、
   前記モノクローナル抗体は、寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０３号を有するチャイニーズハムスター卵巣細胞によって生成され、
   配列番号７に示す重鎖ＣＤＲ１、配列番号８に示す重鎖ＣＤＲ２及び配列番号９に示す重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖と、配列番号１０に示す軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１に示す軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２に示す軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖とを含み、
   癌胎児性抗原に特異的に結合する、抗体。
2. 配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、請求項１に記載の抗体。
3. 請求項１又は２に記載のヒト化キメラ抗体をコードするポリヌクレオチド又はその相補配列を含む核酸。
4. ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項３に記載の核酸。
5. チャイニーズハムスター卵巣細胞において高発現される、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
6. 治療有効量の請求項１又は２に記載の抗体の、又は請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補配列の、又は請求項５に記載のベクターの抗腫瘍医薬の調製における使用であって、
   前記抗腫瘍医薬が、活性成分として放射性免疫治療剤とカップリングした請求項１又は２に記載の前記抗体を含み、前記放射性免疫治療剤が ^１３１ Ｉである、使用。
7. 請求項１又は２に記載の抗体の、腫瘍診断剤の調製における使用。
8. 前記腫瘍が、結腸直腸がんである、請求項６又は７に記載の使用。
9. 前記腫瘍診断剤が、活性成分として放射性免疫イメージング剤とカップリングした請求項１又は２に記載の前記抗体を含み、前記放射性免疫イメージング剤が^１８８Ｒｅである、請求項７に記載の使用。