BR112020021061A2 - anticorpos, polinucleotídeo isolado, vetor, kit ou composição, célula hospedeira e método de produção de um anticorpo - Google Patents

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Abstract

''anticorpos, polinucleotídeo isolado,vetor, kit ou composição, célula hospedeira e método de produção de um anticorpo''. o presente pedido refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a radionuclídeos quelatados, incluindo anticorpos biespecíficos. o pedido refere-se ainda ao uso de tais anticorpos biespecíficos, em aplicações como radioimunoimagem e radioimunoterapia. além disso, o presente pedido refere-se a agentes de remoção e composições úteis em tais métodos.

Description

“ANTICORPOS, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR, KIT OU COMPOSIÇÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO” CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] O presente pedido refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a radionuclídeos quelatados, incluindo anticorpos biespecíficos. O pedido refere-se ainda ao uso de tais anticorpos biespecíficos em aplicações como radioimunoimagem e radioimunoterapia. Além disso, o presente pedido refere-se a agentes de remoção e composições úteis em tais métodos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Os anticorpos monoclonais têm sido desenvolvidos para direcionar fármacos para células cancerosas. Ao conjugar um agente tóxico a um anticorpo que se liga a um antígeno associado ao tumor, existe o potencial de fornecer morte mais específica ao tumor com menos danos aos tecidos circundantes.
[0003] A radioimunoterapia pré-direcionada (PRIT), utiliza uma construção de anticorpo que tem afinidade para o antígeno associado a um tumor, por um lado, e um composto radiomarcado, por outro. Em uma primeira etapa, o anticorpo é administrado e se situa dentro do tumor.
Subsequentemente, o composto marcado é administrado radioativamente.
Como o composto radiomarcado é pequeno, ele pode ser rapidamente administrado ao tumor e é eliminado rapidamente, o que reduz a exposição à radiação fora do tumor (Goldenberg et al Theranostics 2012, 2 (5), 523-540).
Além do efeito direto de morte celular, a PRIT também pode atuar como um indutor de morte celular imunogênica e um potencial parceiro de combinação para imunoterapia contra câncer e abordagens de vacinação endógena. Um procedimento semelhante também pode ser usado para imagiologia. O pré-
direcionamento pode fazer uso de um anticorpo biespecífico ou sistemas usando avidina - biotina, embora o último tenha a desvantagem da avidina/estreptavidina ser imunogênica.
[0004] Os radionuclídeos para uso na PRIT estão comumente na forma de um quelato carregado com o radionuclídeo de interesse.
[0005] Su et al. (Nucl Med Biol 2005 32: 741-747) avaliaram um sistema de pré-direcionamento por anticorpos com anticorpo monoclona (mAb)- estreptavidina e DOTA-biotina. Verificou-se que a 212Pb-DOTA-biotina radiomarcada não era estável, com mais de 30% de 212Bi livre (um produto de decaimento do 212Pb) liberado a partir do 212Pb-DOTA.
[0006] O documento WO 2010/099536 descreve um anticorpo biespecífico que é capaz de ligar-se a complexos DOTA de ítrio, lutécio e gadolínio. Entretanto, o DOTA não se liga de forma estável a todos os radionuclídeos e pode exibir taxas de formação de complexos lentas (Yong e Brechbiel, Dalton Trans. 21 de junho de 2001; 40 (23) 6068-6076). A falha do quelante em se ligar de maneira estável a um radionuclídeo cria o risco de reduzir a liberação de radiação para o tumor e, ao mesmo tempo, aumentar a toxicidade.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[0007] A presente invenção fornece anticorpos que se ligam a um quelato de metal compreendendo DOTAM e chumbo (Pb). DOTAM é capaz de quelar Pb de maneira estável, para formar um complexo de Pb[DOTAM].
[0008] Os anticorpos da presente invenção ligam-se a um quelato compreendendo DOTAM e Pb, onde o Pb pode ser um isótopo estável (não radioativo) ou um radioisótopo. Os radioisótopos de chumbo são úteis em aplicações como radioimunoimagem e radioimunoterapia.
[0009] Preferencialmente, os anticorpos da presente invenção têm afinidade extremamente alta para o quelato Pb-DOTAM, na faixa do pM a fM.
[0010] Os anticorpos ligam-se, adicionalmente, ao bismuto (Bi) quelatado por DOTAM. O 212Pb é o radionuclídeo parental do 212Bi e pode servir como um gerador in vivo de 212Bi. A capacidade dos anticorpos em ligar ao Bi quelatado, bem como ao Pb quelatado, aumenta sua utilidade em aplicações como a radioimunoterapia, onde um isótopo Bi é gerado como um produto do decaimento a partir de um isótopo de Pb. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos podem ligar-se a ambos quelatos Bi-DOTAM e Pb- DOTAM com afinidade muita alta, no intervalo de pM e fM.
[0011] Alem disso, os anticorpos da presente invenção são opcionalmente ou preferencialmente seletivos para um quelato Bi-DOTAM e um quelato Pb-DOTAM, em comparação com outros quelatos ou complexos metálicos, tais como quelato Cu-DOTAM.
[0012] Em um exemplo de realização, a presente invenção provê um anticorpo que compreende um sítio de ligação específico para o antígeno de um quelato Pb-DOTAM, em que o referido sítio de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada compreendendo, pelo menos, uma, duas ou três sequências CDR de cadeia pesada: em que: a) a CDR1 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1); b) a CDR2 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2); c) a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3); - e/ou em que o sítio de ligação ao antígeno compreende uma cadeia leve compreendendo, pelo menos, uma, duas ou três sequências CDR de cadeia leve: em que: d) a CDR1 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4);
e) a CDR2 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos QASKLAS (SEQ ID NO: 5); e f) a CDR3 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6).
[0013] Em alguns exemplos de realização, o sítio de ligação ao antígeno compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, conforme definido acima.
[0014] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um sítio de ligação ao antígeno específico para um quelato Pb-DOTAM, em que o referido sítio de ligação ao antígeno compreende pelo menos: a) a CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2), ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 2, em que essas substituições não incluem Phe50, Asp56 e/ou Tyr58, e opcionalmente também não incluem Gly52 e/ou Arg54; b) a CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3), ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 3, em que essas substituições não incluem Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, e opcionalmente também não incluem Ala100C, Tyr100D, e/ou Pro100E e/ou opcionalmente também não incluem Tyr99; c) a CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4) ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 4, em que essas substituições não incluem Tyr28 e Asp32; e d) a CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6) ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 6, em que essas substituições não incluem Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c e Tyr96.
[0015] A numeração dos resíduos está de acordo com a numeração de Kabat.
[0016] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo inclui adicionalmente uma CDR1 de cadeia pesada e uma CDR2 de cadeia leve que são opcionalmente: i) CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1) ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 1; e ii) CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QASKLAS (SEQ ID NO: 5) ou uma variante da mesma possuindo pelo menos 1, 2 ou 3 substituições na SEQ ID NO: 5, opcionalmente não incluindo Gln50.
[0017] Em quaisquer exemplos de realização da presente invenção que se relacionam com variantes de uma sequência compreendendo as CDRs conforme estabelecido acima, a proteína pode ser invariante em um ou mais dos resíduos conforme estabelecido acima.
[0018] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de acordo com a presente invenção liga-se ao mesmo epítopo, ou a um epítopo de sobreposição, de um radionuclídeo quelatado como aquele ligado por um anticorpo divulgado no presente documento.
[0019] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo, ou a um epítopo de sobreposição, como o epítopo ligado por Fab PRIT-0213 ou PRIT-0214. Por exemplo, o anticorpo pode ligar-se ao mesmo epítopo ou a um epítopo sobreposto, como: i) um anticorpo possuindo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou ii) um anticorpo possuindo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
[0020] Em um exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas a partir de: a) CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1); b) CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2); c) CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3); d) CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4); e) CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QASKLAS (SEQ ID NO: 5); e f) CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6).
[0021] Opcionalmente, o anticorpo de qualquer um dos aspectos descrito acima é humano, quimérico ou humanizado.
[0022] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno pode compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9, ou uma variante desta, compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
97, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9.
[0023] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10, ou uma variante desta, compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 ou 10.
[0024] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM pode compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9, ou uma variante da mesma conforme definido acima, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10, ou uma variante da mesma conforme definido acima. Por exemplo, o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM pode compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou uma variante da mesma. Em outro exemplo de realização, ele pode compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou uma variante da mesma.
[0025] O anticorpo pode estar em qualquer formato, incluindo anticorpos completos e fragmentos de anticorpos. O anticorpo pode ser monoespecífico. Nesta forma, o anticorpo encontra utilidade, por exemplo, em esquemas de classificação e purificação, por exemplo, para separar porções radiomarcadas com sucesso.
[0026] Em alguns aspectos, o anticorpo que se liga especificamente ao quelato Pb-DOTAM é acoplado a um agente de ligação celular/porção de direcionamento para a produção de um agente direcionado.
Esse agente é útil, por exemplo, na radioimunoterapia pré-direcionada ou radioimunoimagem pré-direcionada.
[0027] O acoplamento pode ser preferencialmente por expressão como um polipeptídeo ou proteína de fusão. A fusão pode ser direta ou feita por meio de um ligante. O polipeptídeo ou proteína de fusão pode ser produzido de forma recombinante, evitando qualquer necessidade de conjugação química.
[0028] Em alguns exemplos de realização, a porção de direcionamento (compreendendo o sítio de ligação ao antígeno para o alvo) é um anticorpo ou fragmento do mesmo. Isto é, em alguns exemplos de realização, o anticorpo descrito acima pode estar na forma de um anticorpo multiespecífico (por exemplo, biespecífico), conforme discutido abaixo.
[0029] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ainda a um complexo multiespecífico anticorpo/anticorpo adequado para direcionar um quelato Pb-DOTAM para uma célula alvo.
[0030] Consequentemente, em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo biespecífico ou multiespecífico que se liga especificamente tanto ao quelato Pb-DOTAM quanto a um antígeno alvo, por exemplo, um antígeno expresso sobre a superfície de uma célula alvo. O anticorpo biespecífico compreende pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para chumbo quelatado por DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno para o antígeno alvo.
[0031] Em alguns exemplos de realização, o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM pode ser de acordo com qualquer um dos exemplos de realização descritos acima.
[0032] O antígeno alvo pode ser qualquer antígeno conforme discutido mais adiante no presente documento, por exemplo, qualquer antígeno tumor-específico. Em alguns exemplos de realização, ele pode ser uma proteína ou polipeptídeo expresso por um patógeno, tal como um procariota ou vírus.
[0033] Em alguns exemplos de realização, o antígeno associado ao tumor pode ser CEA (antígeno carcinoembrionário). Ou seja, em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico pode compreender pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para CEA. O CEA é vantajoso no contexto da presente invenção porque é internalizado de forma relativamente lenta e, portanto, uma alta porcentagem de anticorpo biespecífico permanecerá disponível na superfície da célula após o tratamento inicial, para ligação ao radionuclídeo. Outros antígenos associados à baixa internalização no alvo/tumor também podem ser preferidos e estão descritos na presente invenção. Outros exemplos de antígenos associados a tumores que podem ser úteis na presente invenção incluem CD20 ou HER2.
[0034] Em alguns exemplos de realização, onde o antígeno alvo é CEA, o sítio de ligação ao antígeno específico para CEA pode compreender uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma, duas ou três CDRs de cadeia pesada, em que: d) a CDR1 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e) a CDR2 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; f) a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; - e/ou o sítio de ligação ao antígeno específico para CEA pode compreender uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, duas ou três CDRs de cadeia leve, em que: a) a CDR1 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14; b) a CDR2 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15; e c) a CDR3 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 16.
[0035] Em alguns exemplos de realização, o sítio de ligação ao antígeno para CEA pode compreender pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis (ou seja, todas) as CDRs selecionadas a partir de: a) CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; b) CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; c) CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; e) CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e f) CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
[0036] Em alguns exemplos de realização, o sítio de ligação ao antígeno para CEA pode compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17.
[0037] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno pode compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18.
[0038] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno específico para CEA pode compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou uma variante da mesma, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou uma variante da mesma.
[0039] Diversos formatos possíveis para os anticorpos biespecíficos ou anticorpos multiespecíficos são conhecidos no estado da técnica, incluindo aqueles descritos adicionalmente na presente invenção. Os anticorpos da invenção podem adotar qualquer um desses formatos. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico pode ser bivalente, trivalente ou tetravalente.
[0040] Pode ser preferido que os anticorpos da presente invenção incluam uma região Fc. A presença de uma região Fc tem benefícios no contexto de radioimunoterapia e radioimagem, por exemplo, prolongando a meia-vida na circulação de proteína e/ou resultando em maior captação pelo tumor do que pode ser observado com fragmentos menores.
[0041] Em alguns exemplos de realização, quando a região Fc está presente, pode ser preferido que a região Fc seja projetada/modificada para ter a função efetora reduzida. Isso pode incluir a substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 e/ou 329, por exemplo, um ou mais dos resíduos 234, 235 e/ou 329. Em alguns exemplos de realização, a região Fc pode ser projetada para incluir a substituição da Pro 329 por Gly, Leu 234 por Ala e/ou Leu 235 por Ala (numeração de acordo com o índice EU).
[0042] Diversos formatos de anticorpos multiespecíficos que incluem um domínio Fc são conhecidos.
[0043] Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico ou multiespecífico pode compreender i) um domínio Fc, ii) pelo menos um fragmento Fab, Fab cruzado (cross-Fab), Fv, scFab ou scFv ou um anticorpo de domínio único (VHH) compreendendo um sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM e iii) pelo menos um Fab, Fab cruzado (cross-Fab), Fv, scFab ou fragmento scFv ou um anticorpo de domínio único (VHH) compreendendo um sítio de ligação ao antígeno específico para o antígeno alvo.
[0044] Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que o anticorpo biespecífico ou multiespecífico seja multivalente, por exemplo, bivalente, para o antígeno alvo (por exemplo, o antígeno associado ao tumor).
Isso tem a vantagem de aumentar a avidez.
[0045] Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que o anticorpo biespecífico ou multiespecífico seja monovalente para Pb-DOTAM.
Isso reduz o risco de formação de complexo de alto peso molecular quando um agente de remoção (clearing agent) é usado (consulte a discussão adicional abaixo).
[0046] Assim, em alguns exemplos de realização, o anticorpo pode ser trivalente: ou seja, bivalente para o antígeno alvo e monovalente para Pb-DOTAM.
[0047] Em um formato exemplar, o anticorpo biespecífico ou multiespecífico pode compreender um anticorpo de comprimento total (completo) (por exemplo, uma IgG) compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada de anticorpo e uma primeira e segunda cadeia leve de anticorpo, em que a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve são montadas para formarem um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno, e em que a segunda cadeia pesada e a segunda cadeia leve são montadas para formarem um sítio de ligação ao antígeno para o segundo antígeno. Opcionalmente, outras frações de ligação ao antígeno podem ser fundidas, por exemplo, através de um ligante polipeptídico ao N-terminal ou C- terminal da primeira e/ou segunda cadeia pesada, para aumentar a valência para um ou ambos os antígenos. Por exemplo, outra porção de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno pode ser fundida ao N-terminal de uma ou ambas as moléculas de cadeia pesada.
[0048] Em outro formato exemplar, o anticorpo biespecífico ou multiespecífico pode compreender um anticorpo de comprimento total (por exemplo, uma IgG) compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para um primeiro antígeno (por exemplo, que pode ser divalente para o primeiro antígeno), e compreende ainda pelo menos uma porção de ligação ao antígeno específica para o segundo antígeno. Em vários exemplos de realização, a porção de ligação ao antígeno pode ser um fragmento Fab, uma molécula cross-Fab, um scFab, uma molécula Fv, um scFv ou um anticorpo de domínio único (VHH) ou pode ser parte de um segundo anticorpo de comprimento total.
Por exemplo, o anticorpo pode compreender um anticorpo de comprimento total compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno e compreender ainda pelo menos um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio variável de cadeia leve que juntos formam um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno. Tanto o primeiro quanto o segundo antígeno é o quelato Pb-DOTAM, e o outro antígeno é o antígeno alvo.
[0049] Em alguns exemplos de realização dos formatos descritos na presente invenção, o segundo antígeno é o quelato Pb-DOTAM e o primeiro antígeno é o alvo, por exemplo, um antígeno associado a tumor (em alguns exemplos de realização CEA, CD20 ou ERBB2).
[0050] Em outro formato exemplar, o anticorpo biespecífico ou multiespecífico pode compreender um anticorpo de comprimento total compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno (por exemplo, que pode ser divalente para o primeiro antígeno), em que o N- terminal ou C-terminal de uma das cadeias pesadas são ligadas por meio de um ligante polipeptídico a um primeiro polipeptídeo e em que o primeiro polipeptídeo se associa a um segundo polipeptídeo para formar um Fab ou um cross-Fab compreendendo um sítio de ligação para o segundo antígeno. Por exemplo, este formato pode incluir: i) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VH e um domínio CH1, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio a VL e CL; ou ii) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VL e um domínio CH1, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio CL e VH; ou iii) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VH e um domínio CL, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio VL e CH1; e - de modo que o primeiro e o segundo polipeptídeo juntos formam um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno.
[0051] Em alguns exemplos de realização, a fusão pode ser no N- terminal de uma das cadeias pesadas do anticorpo de comprimento total.
[0052] Em outro exemplo de realização específico, o anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico compreendendo: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente a um primeiro antígeno e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo; b) um polipeptídeo consistindo em i) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH); ou - um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); ou iii) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VH através de um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; c) um polipeptídeo consistindo em: i) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL); ou ii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; - e em que o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo do peptídeo em (b), e o domínio variável de cadeia leve do anticorpo do peptídeo sob (c) em conjunto formam um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno.
[0053] Neste formato, o primeiro ou o segundo antígeno pode ser o quelato Pb-DOTAM. O outro será o antígeno alvo, por exemplo, um antígeno associado a tumor.
[0054] Em alguns exemplos de realização, o segundo antígeno é o quelato Pb-DOTAM e o primeiro antígeno é o alvo, por exemplo, um antígeno associado a tumor (em alguns exemplos de realização CEA, CD20 ou ERBB2).
[0055] O anticorpo descrito acima pode ser trivalente. Em outro exemplo de realização possível, outras frações de ligação ao antígeno podem ser fundidas para aumentar a valência para um ou ambos os antígenos, como discutido mais adiante no presente documento.
[0056] Opcionalmente o referido ligante (e qualquer ligante, tal como discutido na presente invenção) pode ser um peptídeo com pelo menos 5 aminoácidos, de preferência entre 25 e 50 amino ácidos. O ligante pode ser um ligante rígido ou um ligante flexível. Em alguns exemplos de realização, ele é um flexível que compreende ou consiste nos resíduos Thr, Ser, Gly e/ou Ala.
Por exemplo, ele pode compreender ou consistir nos resíduos Gly e Ser. Em alguns exemplos de realização, ele pode ter um motivo de repetição, tal como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, onde n é, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em alguns exemplos de realização, o ligante pode ser ou pode compreender a sequência GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26). Outros ligantes podem ser usados e podem ser identificados pelo especialista.
[0057] Detalhes adicionais deste formato de anticorpo são fornecidos no documento WO 2010/115589 A1 (Roche Glycart AG), que é integralmente incorporado ao presente por referência.
[0058] Opcionalmente: i) no domínio constante CL da primeira cadeia leve do anticorpo de comprimento total em a) o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido independentemente por lisina (K) ou arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira cadeia pesada em a) o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); ou ii) no domínio constante CL da segunda cadeia leve em b) o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido independentemente por lisina (K) ou arginina (R)), e no domínio constante CH1 da segunda cadeia pesada em b) o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[0059] Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico da presente invenção pode ter a estrutura trivalente conforme estabelecido acima e pode compreender: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente ao CEA e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo; - em que as cadeias pesadas possuem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada dos aminoácidos 1- 450 (inclusive, usando a numeração sequencial) de SEQ ID NO: 22 ou 23 (ou seja, para a porção da sequência que precede o ligante); - e em que as cadeias leves possuem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21; e/ou b) um polipeptídeo consistindo:
i) em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7; ou ii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID
NO: 7 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); ou iii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID
NO: 7 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo;
- em que o referido polipeptídeo está fundido no N-terminal do domínio VH por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total (completo); e/ou c) um polipeptídeo consistindo:
i) em um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL)
possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8; ou ii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo
(VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:
8 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo
(VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:
8 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; e - em que o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo do peptídeo em (b) e o domínio variável de cadeia leve de anticorpo do peptídeo em (c) formam juntos um sítio de ligação ao antígeno para o quelato Pb- DOTAM.
[0060] Em um exemplo, uma das cadeias pesadas do anticorpo de comprimento total compreende as chamadas “mutações knob” (T366W e opcionalmente uma dentre S354C ou Y349C, preferencialmente S354C) e a outra compreende as chamadas “mutações hole” (T366S, L368A e Y407V e, opcionalmente, Y349C ou S354C, preferencialmente Y349C) (vide, por exemplo, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2(1996)73) de acordo com o sistema de numeração índice EU.
[0061] Em um exemplo de realização, as duas cadeias pesadas de anticorpo em (a) compreendem: i) uma primeira cadeia pesada de anticorpo que tem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 1-450 (inclusive, utilizando a numeração sequencial) da cadeia pesada de SEQ ID NO: 23 (ou seja, a sequência que precede o ligante), e que tem C na posição 349, S na posição 366, A na posição 368 e V na posição 407 (numeração EU); e ii) uma segunda cadeia pesada de anticorpo que tem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com os aminoácidos 1-450 da cadeia pesada (inclusive, usando numeração sequencial) de SEQ ID NO: 22, que tem C na posição 354 e W na posição 366 (numeração EU).
[0062] Conforme mencionado na presente invenção resíduos “fixos” são mutações “knob-into-hole” em CH3 ou são outros resíduos tais como resíduos que formam ligações dissulfídicas, cujos pares com resíduos correspondentes na CH3 da outra cadeia pesada favorecem a formação da molécula desejada. Os resíduos possíveis que podem estar presentes na outra cadeia pesada podem ser derivados das sequências da tabela 2 (por exemplo, sequências 19 e 20 ou 22 e 23). Por exemplo, em um exemplo de realização, se a cadeia pesada do primeiro anticorpo tem C na posição 349, então a cadeia pesada do segundo anticorpo tem C na posição 354.
[0063] Opcionalmente, o ligante é conforme descrito acima.
[0064] Em outro exemplo de realização, o anticorpo biespecífico da presente invenção pode ter a estrutura trivalente conforme estabelecido acima e pode compreender: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente ao CEA e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo; - em que as cadeias pesadas possuem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada dos aminoácidos 1 ao 450 de SEQ ID NO: 19 ou 20 (inclusive e com base na numeração sequencial: ou seja, a sequência que precede o ligante); - e em que as cadeias leves possuem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21; b) um polipeptídeo consistindo: i) em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9; ou ii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); ou iii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo; - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VH através de um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; c) um polipeptídeo consistindo: i) em um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10; ou ii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; - e em que o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo do peptídeo em (b) e o domínio variável de cadeia leve de anticorpo do peptídeo em (c) formam juntos um sítio de ligação ao antígeno para o quelato Pb- DOTAM.
[0065] Conforme descrito acima, em qualquer um dos exemplos de realização acima, uma das cadeias pesadas do anticorpo completo (de comprimento total) pode compreender as chamadas “mutações knob” (T366W e opcionalmente uma dentre S354C ou Y349C, preferencialmente S354C) e a outra compreende as chamadas “mutações hole” (T366S, L368A e Y407V e, opcionalmente, Y349C ou S354C, preferencialmente Y349C) (vide, por exemplo, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2(1996)73) de acordo com o sistema de numeração índice EU.
[0066] Em um exemplo de realização, as duas cadeias pesadas de anticorpo em (a) podem compreender i) uma primeira cadeia pesada de anticorpo que tem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com os aminoácidos 1-450 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 22, que tem C na posição 354 e W na posição 366 (numeração EU); e ii uma segunda cadeia pesada de anticorpo que tem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com os aminoácidos 1-450 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 23 e que tem C na posição 349, S na posição 366, A na posição 368 e V na posição 407 (numeração EU).
[0067] Opcionalmente, o ligante é conforme descrito acima.
[0068] Em outro exemplo de realização, os anticorpos biespecíficos compreendem: i) uma primeira cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 22, ii) uma segunda cadeia pesada possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 23, e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21.
[0069] Em outro exemplo de realização, o anticorpo biespecífico é a molécula referida na presente invenção como PRIT-0213, compreendendo: i) uma primeira cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ii) uma segunda cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
[0070] Em outro exemplo de realização, os anticorpos biespecíficos compreendem: i) uma primeira cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 19, ii) uma segunda cadeia pesada possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 20, e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21.
[0071] Em outro exemplo de realização, o anticorpo biespecífico é a molécula referida na presente invenção como PRIT-0214, compreendendo: i) uma primeira cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; ii) uma segunda cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
[0072] Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico da presente invenção pode ter a estrutura trivalente conforme estabelecido acima e pode compreender:
a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente ao ERBB2 e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo;
- em que as cadeias pesadas possuem pelo menos 90, 91, 92, 93,
94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada dos aminoácidos 1- 449 (inclusive, usando a numeração sequencial) de
SEQ ID NO: 36 ou 37 (ou seja, para a porção da sequência que precede o ligante);
- e em que as cadeias leves possuem pelo menos 90, 91, 92, 93,
94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 38; e/ou b) um polipeptídeo consistindo:
i) em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 ou 9
(em alguns exemplos de realização, preferencialmente 7); ou ii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID
NO: 7 ou 9 (em alguns exemplos de realização, preferencialmente 7) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); ou iii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 ou 9 (em alguns exemplos de realização, preferencialmente 7) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL),
- em que o referido polipeptídeo está fundido no N-terminal do domínio VH por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total (completo); e/ou c) um polipeptídeo consistindo: i) em um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8 ou 10 (em alguns exemplos de realização, preferencialmente 8); ou ii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8 ou 10 (em alguns exemplos de realização, preferencialmente 8) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8 ou 10 (em alguns exemplos de realização, preferencialmente 8) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; e - em que o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo do peptídeo em (b) e o domínio variável de cadeia leve de anticorpo do peptídeo em (c) formam juntos um sítio de ligação ao antígeno para o quelato Pb- DOTAM.
[0073] Em um exemplo, uma das cadeias pesadas do anticorpo de comprimento total compreende as chamadas “mutações knob” (T366W e opcionalmente uma dentre S354C ou Y349C, preferencialmente S354C) e a outra compreende as chamadas “mutações hole” (T366S, L368A e Y407V e, opcionalmente, S354C ou Y349C, preferencialmente Y349C) (vide, por exemplo, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2(1996)73) de acordo com o sistema de numeração índice EU.
[0074] Em um exemplo de realização, as duas cadeias pesadas de anticorpo em (a) compreendem: i) uma primeira cadeia pesada de anticorpo que tem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 1-449 (inclusive, utilizando a numeração sequencial) da cadeia pesada de SEQ ID NO: 37 (ou seja, a sequência que precede o ligante), e que tem C na posição 349, S na posição 366, A na posição 368 e V na posição 407 (numeração EU); e ii) uma segunda cadeia pesada de anticorpo que tem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com os aminoácidos 1-449 da cadeia pesada (inclusive, usando numeração sequencial) de SEQ ID NO: 36, que tem C na posição 354 e W na posição 366 (numeração EU).
[0075] Opcionalmente, o ligante é conforme descrito acima.
[0076] Em outro exemplo de realização, os anticorpos biespecíficos compreendem: i) uma primeira cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 36, ii) uma segunda cadeia pesada possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 37, iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 38.
[0077] Em outro exemplo de realização, o anticorpo biespecífico é a molécula referida na presente invenção como P1AD9827, compreendendo: i) uma primeira cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; ii) uma segunda cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.
[0078] Em outro exemplo de realização, o anticorpo biespecífico da presente invenção pode ter a estrutura trivalente conforme estabelecido acima e pode compreender: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente ao CD20 e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo; - em que as cadeias pesadas possuem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada dos aminoácidos 1- 448 (inclusive, usando a numeração sequencial) de SEQ ID NO: 47 ou 48 (ou seja, para a porção da sequência que precede o ligante); - e em que as cadeias leves possuem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 49; e/ou b) um polipeptídeo consistindo: i) em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 ou 9 (em alguns exemplos de realização, preferencialmente 7); ou ii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 ou 9
(em alguns exemplos de realização, preferencialmente 7) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1),
iii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 ou 9
(em alguns exemplos de realização, preferencialmente 7) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL),
- em que o referido polipeptídeo está fundido no N-terminal do domínio VH por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total (completo); e/ou c) um polipeptídeo consistindo:
i) em um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL)
possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8 ou 10 (em alguns exemplos de realização, preferencialmente 8); ou ii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo
(VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:
8 ou 10 (em alguns exemplos de realização, preferencialmente 8) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo; ou iii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo
(VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8 ou 10 (em alguns exemplos de realização, preferencialmente 8) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo;
- em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; e - em que o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo do peptídeo em (b) e o domínio variável de cadeia leve de anticorpo do peptídeo em (c) formam juntos um sítio de ligação ao antígeno para o quelato Pb- DOTAM.
[0079] Em um exemplo, uma das cadeias pesadas do anticorpo de comprimento total compreende as chamadas “mutações knob” (T366W e opcionalmente uma dentre S354C ou Y349C, preferencialmente S354C) e a outra compreende as chamadas “mutações hole” (T366S, L368A e Y407V e, opcionalmente, Y349C ou S354C, preferencialmente Y349C) (vide, por exemplo, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2(1996)73) de acordo com o sistema de numeração índice EU.
[0080] Em um exemplo de realização, as duas cadeias pesadas de anticorpo em (a) compreendem: i) uma primeira cadeia pesada de anticorpo que tem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 1-448 (inclusive, utilizando a numeração sequencial) da cadeia pesada de SEQ ID NO: 48 (ou seja, a sequência que precede o ligante), e que tem C na posição 349, S na posição 366, A na posição 368 e V na posição 407 (numeração EU); e ii) uma segunda cadeia pesada de anticorpo que tem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com os aminoácidos 1-448 da cadeia pesada (inclusive, usando numeração sequencial) de SEQ ID NO: 47, que tem C na posição 354 e W na posição 366 (numeração EU).
[0081] Opcionalmente, o ligante é conforme descrito acima.
[0082] Em outro exemplo de realização, os anticorpos biespecíficos compreendem: i) uma primeira cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 47, ii) uma segunda cadeia pesada possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 48, e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 49.
[0083] Em outro exemplo de realização, o anticorpo biespecífico é a molécula referida na presente invenção como P1AD9826, compreendendo: i) uma primeira cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; ii) uma segunda cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49.
[0084] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos que codificam qualquer um dos anticorpos descritos no presente documento. Em outros exemplos de realização, a presente invenção refere-se a um vetor ou conjunto de vetores de expressão compreendendo o referido polinucleotídeo ou polinucleotídeos, opcionalmente um vetor de expressão. Em outros objetos, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica que compreende um vetor da presente invenção. Além disso, é fornecido um método para produzir um anticorpo compreendendo o cultivo da célula hospedeira de modo que o anticorpo é produzido.
[0085] Os anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos, conforme descritos na presente invenção, podem encontrar uso em uma variedade de aplicações, incluindo aplicações terapêuticas e de diagnóstico, tais como radioimunoterapia pré-direcionada e radioimunoimagem pré-direcionada.
[0086] Assim, em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a qualquer anticorpo biespecífico ou multiespecífico como descrito no presente documento para uso em radioimagiologia pré-direcionada. Em tais exemplos de realização, o Pb quelatado é preferencialmente 203Pb.
[0087] Um método para direcionar um radioisótopo a um tecido ou órgão para geração de imagens pode compreender: i) administrar ao sujeito um anticorpo multiespecífico ou biespecífico como descrito na presente invenção, em que o anticorpo liga-se ao antígeno alvo e se localiza na superfície de uma célula que expressa o antígeno alvo; e ii) subsequentemente, administrar um radionuclídeo Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo para o indivíduo, em que o radionuclídeo de Pb quelatado com DOTAM e o referido variante funcional liga-se ao anticorpo localizado na superfície da célula alvo.
[0088] Opcionalmente, entre as etapas (i) e (ii) é administrado um agente de remoção, em que o agente de remoção liga-se ao sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM. O agente de remoção bloqueia é o sítio de ligação ao antígeno para o Pb-DOTAM, impedindo que o anticorpo circulante ligue-se ao radionuclídeo Pb quelatado. Alternativamente ou adicionalmente, o agente de remoção pode aumentar a taxa de eliminação do anticorpo do corpo. O “agente remoção” pode, alternativamente, ser referido como um “agente de bloqueio”: estes termos podem ser substituídos entre si na discussão a seguir.
[0089] O agente de remoção pode compreender um complexo de um íon metálico com DOTAM ou um variante funcional do mesmo, em que o referido complexo é reconhecido pelo sítio de ligação ao antígeno para Pb- DOTAM. Preferencialmente, o íon metálico é um isótopo estável ou isótopo essencialmente estável. Por “isótopo estável” queremos dizer um isótopo que não sofre decaimento radioativo. Por “isótopo essencialmente estável”, queremos dizer um isótopo que sofre decaimento radioativo com uma meia- vida muito longa, tornando-o seguro para uso. Preferencialmente, o íon metálico é selecionado a partir de íons de Pb, Ca e Bi. Por exemplo, o agente de remoção pode compreender um isótopo estável de Pb complexado com DOTAM ou um variante funcional deste, Ca complexado com DOTAM ou um variante funcional deste, ou 209Bi (um isótopo essencialmente estável com uma meia-vida de 1,9 x 1019 anos) complexado com DOTAM ou um variante funcional deste. O Pb pode ser chumbo que ocorre naturalmente, que é uma mistura dos isótopos estáveis (não radioativos) 204Pb, 206Pb, 207Pb e 208Pb.
[0090] O DOTAM ou variante funcional deste é conjugado com uma porção de remoção. Esta porção fornece ao agente de remoção uma baixa absorção no tumor, por exemplo, em virtude de seu tamanho e/ou alto raio hidrodinâmico. Porções de remoção adequadas são discutidas adicionalmente abaixo. Em alguns exemplos de realização, o agente de remoção pode compreender DOTAM ou um variante funcional do mesmo conjugado com dextrano ou um derivado do mesmo.
[0091] Em outro exemplo de realização dos métodos de imagem, o anticorpo multiespecífico ou biespecífico pode ser ligado ao radionuclídeo Pb quelatado no momento da administração.
[0092] Opcionalmente, em qualquer exemplo de realização, o método pode compreender ainda: iii) a imagiologia do tecido ou órgão onde o radionuclídeo Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo ficou situado.
[0093] Em alguns exemplos de realização, o antígeno alvo pode ser um antígeno específico do tumor e a imagem pode ser um método de imagiologia de tumor ou tumores.
[0094] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se ao anticorpo, tal como descrito na presente invenção para uso em um método de radioimunoterapia pré-direcionada. Em tais exemplos de realização, o Pb quelatado é preferencialmente 212Pb.
[0095] Um método de direcionamento de um radioisótopo para um tecido ou órgão para a terapia pode compreender: i) administrar ao sujeito um anticorpo multiespecífico ou biespecífico como descrito na presente invenção, em que o anticorpo liga-se ao antígeno alvo e se localiza na superfície de uma célula que expressa o antígeno alvo; e ii) subsequentemente, administrar um radionuclídeo de Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo para o indivíduo, em que o radionuclídeo de Pb quelatado com DOTAM ou o referido variante funcional liga-se ao anticorpo localizado na superfície da célula alvo.
[0096] Opcionalmente, entre as etapas (i) e (ii) é administrado um agente de remoção conforme descrito acima.
[0097] Em alguns exemplos de realização, o antígeno alvo é um antígeno associado a tumor e o método é um método de tratamento do câncer.
Em outros exemplos de realização, o antígeno alvo pode ser um antígeno associado à infecção, por exemplo, uma proteína expressa por um procariota ou por uma célula infectada por vírus.
[0098] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos descritos na presente invenção podem ser administrados como parte de uma terapia combinada. Por exemplo, eles podem ser administrados em combinação com um ou mais radiossensibilizadores e/ou agentes quimioterápicos: o radiossensibilizador ou agente quimioterápico e o anticorpo podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem.
[0099] Os métodos de radioimagem e radioimunoterapia descritos na presente invenção podem ser opcionalmente combinados, por exemplo, pela administração do anticorpo e 203Pb-DOTAM e 212Pb-DOTAM, por exemplo, como uma mistura.
[0100] A presente invenção também refere-se a composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo da presente invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0101] Em outros exemplos de realização, a presente invenção refere-se a um kit que compreende um anticorpo da presente invenção e um, dois, três, quatro ou todos de: i) um excipiente farmaceuticamente aceitável; ii) um radionuclídeo de Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo; iii) um agente de remoção conforme descrito no presente documento; iv) um ou mais agentes quimioterápicos adicionais; e/ou v) um ou mais radiossensibilizadores.
[0102] Ainda em um aspecto adicional da invenção, os presentes inventores desenvolveram um novo agente de remoção. Esse agente de remoção pode ser usado em qualquer um dos métodos de diagnóstico, imagem ou tratamento, conforme descrito no presente documento.
[0103] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um agente de remoção que compreende dextrano ou um derivado do mesmo conjugado a um quelante selecionado a partir de DOTAM e uma variante funcional de DOTAM, em que o referido quelante forma um complexo com Pb,
Zn, Ca ou Bi. O agente de remoção inclui, tipicamente, um íon metálico quelatado, tal como um íon de Pb, Zn, Ca ou Bi.
[0104] O agente de remoção pode compreender aminodextrano acoplado a DOTAM ou um variante funcional de DOTAM. Por exemplo, o agente de remoção pode compreender DOTAM acoplado a aminodextrano com acoplamento de isotiocianato (por exemplo, um composto obtido pela reação de aminodextrano com p-SCN-Bn-TCMC).
[0105] Uma dificuldade potencial com o uso de agentes de remoção é a possibilidade de que eles possam entrar nos tumores, afetando negativamente a ligação subsequente dos radioligantes.
[0106] Os presentes inventores descobriram ainda que uma boa depuração sanguínea pode ser alcançada juntamente com baixa penetração do agente de remoção em tumores, quando um agente de remoção à base de dextrano é usado que tem i) um alto peso molecular médio e ii) foi submetido a um corte de peso molecular, de modo que fragmentos abaixo de um certo tamanho foram removidos.
[0107] Assim, um agente de remoção preferido pode ser aquele em que i) o peso molecular médio do dextrano ou um seu derivado no agente de remoção é de 200-800 kDa, opcionalmente maior do que 300, 350, 400 ou 450 kDa, e, opcionalmente, menor que 700, 650, 600 ou 550kDa, opcionalmente cerca de 500 kDa, e ii) dextrano, e derivados de dextrano ou agentes de remoção com peso molecular inferior a um limite especificado foram removidos, de modo que o peso molecular limite é 50 kDa ou superior, 100kDa ou superior ou 200kDa ou superior, opcionalmente na faixa de 50kDa- 250kDa ou 50kDa-200kDa, opcionalmente de 100kDa a 200kDa e opcionalmente cerca de 100kDa, 150kDa ou 200kDa.
[0108] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a métodos de preparar o agente de remoção, e ao uso dos agentes de remoção em métodos de radioimunoterapia ou radioimunoimagem.
[0109] Estes e outros aspectos da invenção são discutidos baixo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0110] A Figura 1 mostra uma representação esquemática de um possível formato de anticorpo biespecífico. Este formato compreende dois sítios de ligação ao antígeno para um alvo (A) e um sítio de ligação ao antígeno para um segundo alvo (B) (formato 2:1).
[0111] A Figura 2 mostra a estrutura de PRIT-0213 em complexo com Pb-DOTAM.
[0112] A Figura 3 mostra a vista no sítio de interação, do PRIT- 0213 em complexo com Pb-DOTAM, numerado conforme Kabat.
[0113] A Figura 4 mostra a distribuição de 212Pb 24 horas após a injeção de DOTAM radiomarcado (%ID/g ± DP, n = 3). PRIT-0206, -0207, -0208 e -0165 têm como alvo T84.66, enquanto PRIT-0186, -0187 e -0156 têm como alvo CH1A1A. PRIT-0175 é um controle de ligação não CEA.
[0114] A Figura 5 mostra a distribuição de 203Pb expresso como contagens por minuto (CPM) 96 h após a injeção de anticorpos PRIT pré- ligados com DOTAM radiomarcado (CPM ± DP, n = 3). PRIT-0205, -0206, - 0207, -0208 e -0209 são construções totalmente humanizadas, enquanto PRIT- 0165 e -0175 são controles positivos e negativos, respectivamente.
[0115] A Figura 6 mostra o acúmulo/depuração de 203Pb-DOTAM- bsAb em tumores BxPC3 e sangue expresso como CPM ± DP (n = 3) em vários pontos no tempo após a injeção de anticorpos PRIT pré-ligados com DOTAM radiomarcado. PRIT-0206 é uma versão totalmente humanizada de PRIT-0165; PRIT-0175 é um controle de ligação não CEA.
[0116] A Figura 7 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 2 horas após a injeção de agentes de remoção marcados com 212Pb em camundongos MKN45 com tumor (%ID/g ± DP, n = 3).
[0117] A Figura 8 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos e urina selecionados 24 horas após a injeção de agentes de remoção marcados com 212Pb em camundongos MKN45 com tumor (%ID/g ± DP, n = 3).
[0118] A Figura 9 mostra a distribuição de radioatividade por órgãos em tecidos e urina selecionados 24 horas após a injeção de agentes de remoção marcados com 212Pb em camundongos MKN45 com tumor (%ID/g ± DP, n = 3).
[0119] A Figura 10 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 1 semana após a injeção de agentes de remoção marcados com 203Pb em camundongos sem tumores (%ID/g ± DP, n = 3).
[0120] A Figura 11 mostra a distribuição de radioatividade por órgãos em tecidos selecionados 1 semana após a injeção de agentes de remoção marcados com 203Pb em camundongos sem tumores (%ID/g ± DP, n = 3).
[0121] A Figura 12 mostra o teor de radioatividade no sangue 4 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3). A barra listrada representa o controle sem CA (sem agente de remoção), com o qual todos os reagentes candidatos foram comparados. Os asteriscos marcam o nível de significância estatística, do inferior (*) ao superior (***).
[0122] A Figura 13 mostra o teor médio de radioatividade no sangue 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3). A barra listrada representa o controle sem CA (sem agente de remoção), com o qual todos os reagentes candidatos foram comparados.
[0123] A Figura 14 mostra o teor de radioatividade no sangue e tumores 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3).
[0124] A Figura 15 mostra a distribuição de 212Pb 24 horas após a injeção de DOTAM radiomarcado (%ID/g ± DP, n = 3), usando 30 ou 100 µg de anticorpo biespecífico e 10-100 µg de agentes de remoção com 100- ou 30-
cortes de filtração de kDa ou nenhum agente de remoção (PBS).
[0125] A Figura 16 mostra o efeito na concentração de atividade de 212Pb no sangue e no tumor com quantidades crescentes de agente de remoção (0-100 µg). Os tumores foram pré-direcionados usando 100 µg de PRIT-0165, seguido 4 dias depois por Dex500 diafiltrado com um corte de peso de 100 kDa, ou PBS. O 212Pb-DOTAM foi administrado 2 horas após o agente de remoção. Os símbolos representam a %ID/g 24 horas após a injeção radioativa e a linha a regressão linear dos dados do tumor.
[0126] A Figura 17 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3). As barras cinza escuro e preta representam controles positivos sem CA (sem agentes de remoção), com os quais os reagentes candidatos foram comparados.
[0127] A Figura 18 mostra o teor de 212Pb no sangue e tumores 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3) e as proporções tumor/sangue correspondentes. As barras cinza escuro e preta representam controles positivos sem CA (sem agentes de remoção), com os quais os reagentes candidatos foram comparados.
[0128] A Figura 19 mostra a razão tumor-sangue 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM em função da quantidade de agente de remoção (CA) (PJRD08-46) e saturação TCMC (9-, 20-, 39-, ou 84 -para-1). As linhas tracejadas representam a regressão linear (R2 = 0,82) e o ajuste da curva não linear (R2 = 0,74) dos respectivos dados.
[0129] A Figura 20 mostra a distribuição de 212Pb 24 horas após a injeção de DOTAM radiomarcado (%ID/g ± DP, n = 3). Barras com fundo branco e cinza representam o direcionamento para T84.66 e CH1A1A, respectivamente; a barra preta representa o controle sem ligação ao CEA.
[0130] A Figura 21 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± EPM, n = 3), para os ciclos de tratamento 1 e 2 no modelo BxPC3.
[0131] A Figura 22 mostra uma média de pesos corporais nos grupos A – G (n = 8) após CEA-PRIT no modelo BxPC3. As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0132] A Figura 23 mostra a variação média do peso nos grupos A – G (n = 8) após CEA-PRIT no modelo BxPC3, expressa como porcentagem de peso corporal inicial. As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb- DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0133] A Figura 24 mostra as médias do crescimento tumoral com erro padrão para os grupos A – G no modelo BxPC3 (n = 8). As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0134] A Figura 25 mostra curvas de crescimento tumoral individuais para os grupos A – G no modelo BxPC3. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM.
[0135] A Figura 26 mostra as curvas de Kaplan-Meier mostrando a sobrevida nos grupos A – G no modelo BxPC3 (n = 8). As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM.
[0136] A Figura 27 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3), para os ciclos de tratamento 1 e 2 no modelo LS174T.
[0137] A Figura 28 mostra uma média de pesos corporais nos grupos A – G (n = 8) após CEA-PRIT no modelo LS174T. As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0138] A Figura 29 mostra a variação média do peso nos grupos A – G (n = 8) após CEA-PRIT no modelo LS174T, expressa como porcentagem de peso corporal inicial. As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb- DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0139] A Figura 30 mostra as médias do crescimento tumoral com erro padrão para os grupos A – G (n = 8) no modelo LS174T. As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0140] A Figura 31 mostra curvas de crescimento tumoral individuais para os grupos A – G no modelo LS174T. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM.
[0141] A Figura 32 mostra as curvas de Kaplan-Meier mostrando a sobrevida nos grupos A – G no modelo LS174T (n = 8). As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM.
[0142] A Figura 33 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3). As barras em cinza representam o acúmulo no tecido após a injeção de várias quantidades de Dex500- (50%) agente de remoção (CA); a barra preta representa o controle sem CA (sem agente de remoção).
[0143] A Figura 34 mostra o teor de 212Pb no sangue e tumores 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3) e as relações tumor/sangue correspondentes. As barras em cinza representam o acúmulo no tecido após a injeção de várias quantidades de Dex500- (50%) agente de remoção (CA); a barra preta representa o controle sem CA (sem agente de remoção).
[0144] A Figura 35 mostra o teor de radioatividade no sangue 4 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3).
[0145] A Figura 36 mostra a ligação de um anticorpo (PRIT-0165) às células MKN-45, detectando-o usando a detecção secundária (painel direito, Alexa 488) ou DOTAM FITC (painel esquerdo, FITC-A).
[0146] A Figura 37 mostra os formatos possíveis para anticorpos biespecíficos, usando CEA como um exemplo de antígeno alvo. Outros antígenos alvo também podem ser usados.
[0147] A Figura 38 mostra a ligação de P1AD8927 às células KPL- 4 para demonstrar competência de ligação ao Her2: Detecção de anticorpos usando anticorpos secundários específicos para IgG humana.
[0148] A Figura 39 mostra a ligação de P1AD8927 às células KPL- 4 para demonstrar a competência de ligação DOTAM: Detecção corrigida isótopo usando Pb-DOTAM-FITC.
[0149] A Figura 40 mostra a ligação de P1AD8926 às células Raji para demonstrar competência de ligação ao CD20: Detecção de anticorpos usando anticorpos secundários específicos para IgG humana.
[0150] A Figura 41 mostra a ligação de P1AD8926 às células Raji para demonstrar a competência de ligação DOTAM: Detecção corrigida isótopo usando Pb-DOTAM-FITC.
[0151] A Figura 42 mostra o desenho do estudo do protocolo 103, avaliando CEA-PRIT de tumores s.c. BxPC3 em camundongos SCID (h = horas, d = dias, w = semanas).
[0152] A Figura 43: O painel A mostra o acúmulo médio de 212Pb em tecidos coletados após dois ciclos de tratamento, expressos como %ID/g ± DP (n = 3). O painel B mostra a absorção individual de 212Pb no tumor para cada camundongo, juntamente com os volumes tumorais (mm 3) correspondentes na eutanásia.
[0153] A Figura 44 mostra o crescimento tumoral médio com erro padrão para os grupos A – G no modelo BxPC3 (n = 10). As curvas foram truncadas em n <5. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM (30 ou 10 μCi) para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0154] A Figura 45 mostra curvas de crescimento tumoral individuais para os grupos A – G no modelo BxPC3 (n=10). As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM (30 ou 10 µCi).
[0155] A Figura 46 mostra as curvas de Kaplan-Meier mostrando a sobrevida nos grupos A – G no modelo BxPC3 (n = 10). As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM (30 ou 10 µCi).
[0156] A Figura 47 mostra uma média de pesos corporais nos grupos A – G (n = 10) após CEA-PRIT no modelo BxPC3. As curvas foram truncadas em n <5. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0157] A Figura 48 mostra a distribuição de 203Pb-BsAb (20 µCi, 100 µg) em camundongos SCID com tumores s.c. BxPC3. Os camundongos foram injetados com 20 µCi de 203Pb-DOTAM-CEA-DOTAM pré-ligado ou 203Pb-DOTAM-DIG-DOTAM (controle negativo) seguido pela coleta dos órgãos no dia 1, 4, 7 ou 10 após a injeção para avaliar a radioatividade acumulada nos tecidos coletados (%ID/g ± DP, n = 5).
[0158] A Figura 49 mostra o acúmulo de 203Pb-BsAb em tumores s.c. BxPC3 1-10 dias após a injeção de 20 µCi/100 µg de 203Pb-DOTAM-CEA- DOTAM pré-ligado ou 203Pb-DOTAM-DIG-DOTAM (controle negativo) (%ID/g ± DP, n = 5).
[0159] A Figura 50 mostra a distribuição de 212Pb em camundongos SCID com tumores s.c. BxPC3. Os camundongos foram injetados com BsAb CEA-DOTAM e CA antes da administração de 212Pb- DOTAM, 5 min a 48 h após a injeção radioativa (%ID/g ± DP, n = 5). * Teor cumulativo de 212Pb na urina e fezes ao longo do tempo, ou seja, cada momento incluindo o valor do anterior. A %ID/g estimada na urina foi baseada em 1/5 (10 mL) de uma solução de urina/lavagem combinada de 5 camundongos (50 mL).
[0160] A Figura 51 mostra o esboço do estudo do protocolo 131, avaliando a distribuição in vivo de 212Pb após PRIT usando BsAb CEA-DOTAM, Pb-DOTAM-dextrano-500 CA e 212Pb-DOTAM extinto (quenched) com qualquer um dos 5 metais diferentes (Zn, Gd, Cu, Ca ou Pb) em camundongos SCID portadores de tumores subcutâneos (s.c.) BxPC3 (d = dias, h = horas).
[0161] A Figura 52 mostra a distribuição de 212Pb em camundongos SCID com tumores 2 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM pré- direcionado por CEA-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 4).
[0162] A Figura 53 mostra a distribuição de 212Pb em tecidos normais selecionados de camundongos SCID portadores de tumores 2 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM, extinto com metais diferentes (%ID/g).
[0163] A Figura 54 mostra a distribuição de programas de 212Pb em camundongos SCID com tumores 24 horas após a injeção de 212Pb- DOTAM, pré-direcionado por BsAb CD20-DOTAM ou controle negativo DIG- DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3).
[0164] A Figura 55 mostra a distribuição de programas de 212Pb em camundongos SCID com tumores 24 horas após a injeção de 212Pb- DOTAM, pré-direcionado por BsAb HER2-DOTAM ou controle negativo DIG- DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3).
[0165] A Figura 56 mostra o desenho do estudo do Protocolo 154,
avaliando a biodistribuição de 212Pb-DOTAM após CEA-PRIT usando várias construções de BsAb em camundongos SCID portadores de tumores subcutâneos (s.c.) HPAF-II (h = horas, d = dias).
[0166] A Figura 57 mostra a distribuição de 212Pb em camundongos SCID portadores de tumores 6 horas após a injeção de 212Pb- DOTAM, pré-direcionado pelo controle negativo DIG-DOTAM, por BsAb CEA- DOTAM padrão ou por uma das construções alternativas de anticorpos biespecíficos (BsAb) (%ID/g ± DP, n = 3).
[0167] A Figura 58 mostra o teor sanguíneo e acúmulo no tumor de 212Pb em camundongos SCID portadores de tumores 6 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM, pré-direcionado pelo controle negativo DIG-DOTAM, por BsAb CEA-DOTAM padrão ou por uma das construções alternativas de anticorpos biespecíficos (BsAb) (%ID/g ± DP, n = 3).
[0168] A Figura 59 mostra o cronograma experimental do protocolo 162. CD20-PRIT foi realizado usando BsAb CD20-DOTAM, Ca- DOTAM-dextrano-500 CA e 212Pb-DOTAM em camundongos SCID portadores de tumores s.c. WSU-DLCL2; A RIT de 1 etapa foi realizada usando BsAb CD20-DOTAM pré-ligado com 212Pb-DOTAM (212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM) em camundongos SCID portadores de tumores s.c. WSU-DLCL2.
[0169] A Figura 60 mostra a distribuição de 212Pb em camundongos SCID com tumores 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM pré-direcionado por CD20-DOTAM ou 212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM pré-ligado.
O teor radioativo em órgãos e tecidos é expresso como%ID/g e desvio padrão (DP; n = 3).
[0170] A Figura 61 mostra o crescimento médio do tumor s.c.
WSU-DLCL2 para os grupos A – G, expresso em mm3 ± EPM (n = 10).
[0171] A Figura 62 mostra a alteração média no peso corporal do camundongo após os vários tratamentos, expresso como % do peso corporal inicial ± EPM. As linhas pontilhadas indicam injeção de 212Pb ou anticorpo, dependendo do esquema de tratamento.
DEFINIÇÕES
[0172] Uma “região estrutural aceptora humana” (acceptor human framework) para os propósitos da presente invenção é uma região estrutural ou arcabouço (framework) que compreende a sequência de aminoácidos de uma região estrutural do domínio variável de cadeia leve (VL) ou uma região estrutural do domínio variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma região estrutural de imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano, tal como definido abaixo. Uma região estrutural ou região de arcabouço (framework) aceptora humana “derivada de” uma região estrutural de uma imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácido destas ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em alguns exemplos de realização, o número de alterações de aminoácidos é de 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em alguns exemplos de realização, a região de arcabouço humana aceptora VL é idêntica em sua sequência com a sequência da região de arcabouço da imunoglobulina humana VL ou sequência da região estrutural de consenso humano.
[0173] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação único de uma molécula (tal como anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A “afinidade de ligação” a menos que indicado de outro modo, refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do par ligante (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade da molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida através de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção. Exemplos de realização específicos ilustrativos e exemplares para mensurar a afinidade de ligação são descritos a seguir.
[0174] Um anticorpo “maturado por afinidade” refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs), em comparação com um anticorpo parental que não possui tais alterações, e estas modificações resultam em uma melhoria na afinidade do anticorpo ao antígeno.
[0175] Os termos “anticorpo anti-Pb-DOTAM”, “um anticorpo que se liga a Pb-DOTAM”, “um anticorpo que se liga a um quelato Pb-DOTAM” e termos equivalentes referem-se a um anticorpo que é capaz de ligar-se ao quelato Pb-DOTAM com afinidade suficiente de modo que o anticorpo seja útil em um esquema de classificação e/ou purificação para separar frações marcadas com Pb-DOTAM e/ou de modo que o anticorpo seja capaz de localizar Pb-DOTAM no local do anticorpo, por exemplo, com o objetivo de direcionar Pb-DOTAM para uma célula. Os termos “anticorpo antialvo” e “um anticorpo que se liga ao alvo” se refere a um anticorpo que é capaz de se ligar ao alvo com afinidade suficiente de tal forma que o anticorpo seja útil em aplicações terapêuticas e/ou diagnósticas envolvendo a localização do anticorpo para o alvo, por exemplo, conforme expresso na superfície de uma célula. Em um exemplo de realização, a extensão da ligação do anticorpo a uma fração não relacionada e/ou uma proteína alvo não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao Pb-DOTAM ou ao alvo conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certos exemplos de realização, um anticorpo tem uma constante de dissociação (K d) para Pb- DOTAM e/ou o alvo de ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M).
[0176] O termo “anticorpo” na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange diferentes estruturas de anticorpo, incluindo, mas não se limitando, a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.
[0177] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a Fv, Fab, Fab’, Fab’- SH, F(ab’)2, diacorpos (diabodies), anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFV); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[0178] Um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo” como um anticorpo de referência pode referir-se a um anticorpo que bloqueia em 50% ou mais a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição, e inversamente, os anticorpos de referência bloqueiam a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais.
Um ensaio de competição exemplar é fornecido na presente invenção.
[0179] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma determinada fonte ou espécie, enquanto que o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.
[0180] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante presente em sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de , , , , e , respectivamente.
[0181] O termo “agente citotóxico”, da forma como é utilizado no presente, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função celular e/ou causa a destruição ou morte celular. Os agentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, isótopos radioativos (por exemplo, 225Ac, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 213Bi, 32P, 212Pb e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos (por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides da vinca (vincristina, vinblastina, etoposida), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucila, daunorubicina ou outros agentes intercalantes); agentes inibidores do crescimento; enzimas e fragmentos destes como, por exemplo, enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas como, por exemplo, pequenas moléculas de toxina ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas, e os diversos agentes antitumorais ou anticâncer divulgados abaixo.
[0182] “Funções efetoras” referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras incluem: ligação de C1q; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B), e ativação de células B.
[0183] Uma “quantidade eficaz” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático ou terapêutico desejado.
[0184] O termo “região Fc” é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina contendo pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões de Fc de sequências nativas e regiões Fc variantes. Em um exemplo de realização, uma região Fc de cadeia pesada da IgG humana estende-se desde da Cys226, ou desde a Pro230, até a extremidade carboxi-terminal da cadeia pesada.
Entretanto, a lisina C-terminal (Lis447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra maneira, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado o índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[0185] As expressões “região estrutural”, “região de arcabouço” ou “FR” (do inglês framework region) referem-se aos resíduos de domínios variáveis que não são resíduos da região hipervariável (HVR) A FR de um domínio variável consiste geralmente em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Assim, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência na VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)-FR4.
[0186] Os termos “anticorpo completo”, “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo inteiro” são utilizados na presente invenção de forma alternada para se referirem a um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura do anticorpo nativo ou possuindo as cadeias pesadas que contem uma região Fc conforme definido no presente. Um anticorpo de comprimento total pode ser, por exemplo, uma IgG.
[0187] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de célula hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de maneira alternada e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e progênie dela derivada sem levar em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica quanto a conteúdo de ácido nucleico em relação à célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica, conforme triado ou selecionado na célula transformada inicial, é abrangida pela presente invenção.
[0188] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde ao de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificantes de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno.
[0189] Uma “região estrutural (ou de arcabouço) de consenso humano” é uma região estrutural que representa os resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências da região estrutural VH ou VL da imunoglobulina humana. De modo geral, a seleção das sequências VH ou VL da imunoglobulina humana ocorre a partir de um subgrupo de sequências de domínios variáveis. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como o de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-
3. Em um exemplo de realização, para a VL, o subgrupo é subgrupo kappa I como em Kabat et al. supra. Em um exemplo de realização, para a VL, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat et al. supra.
[0190] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado compreenderá de substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere- se a um anticorpo que foi submetido à humanização.
[0191] O termo “região hipervariável” ou “HVR” conforme utilizado no presente refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que é hipervariável na sequência (“região determinante de complementaridade” ou “CDRs”) e/ou forma alças (loops) estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”) e/ou contém resíduos de contanto ao antígeno (“contato ao antígeno”). De modo geral, os anticorpos compreendem seis HVRs; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). HVRs exemplares incluem: (a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), e 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos ao antigênio que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), e 93- 101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996); e (d) combinações de (a), (b) e/ou (c), incluindo resíduos de aminoácidos HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1),
26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) e 94-102 (H3).
[0192] Por outro lado, ao invés do exposto acima, a sequência da CDR-H1 aqui descrita pode se estender de Kabat26 a Kabat35.
[0193] Em um exemplo de realização, os resíduos de HVR ou CDR compreendem aqueles identificados na Tabela 2 em outras partes do relatório descritivo.
[0194] Salvo quando indicado de outra forma, os resíduos HVR/CDR e outros resíduos do domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados na presente invenção de acordo com Kabat et al., Supra.
[0195] Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado com uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), incluindo, mas não se limitando a um agente citotóxico.
[0196] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cachorros e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em determinados exemplos de realização, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.
[0197] As moléculas descritas na presente invenção podem ser “isoladas”. Um anticorpo “isolado” é aquele que foi identificado e separado a partir de um componente de seu ambiente natural. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo é purificado a mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por métodos eletroforéticos (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou por cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica ou HPLC de fase inversa). Para uma revisão de métodos para a avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
[0198] O termo “molécula de ácido nucleico” ou “polinucleotídeo”
inclui qualquer composto e/ou substância que compreenda um polímero de nucleotídeos.
Cada nucleotídeo é composto de uma base, especificamente uma base de purina ou pirimidina (ou seja, citosina (C), guanina (G), adenina
(A), timina (T) ou uracila (U)), um açúcar (ou seja, desoxirribose ou ribose) e um grupo fosfato.
Frequentemente, a molécula de ácido nucleico é descrita pela sequência de bases, em que as referidas bases representam a estrutura primária (estrutura linear) de uma molécula de ácido nucleico.
A sequência de bases é tipicamente representada de 5' a 3'. No presente documento, o termo molécula de ácido nucleico abrange ácido desoxirribonucleico (DNA) incluindo,
por exemplo, DNA complementar (cDNA) e DNA genômico, ácido ribonucleico
(RNA), em particular RNA mensageiro (mRNA), e formas sintéticas de DNA ou
RNA, e polímeros mistos compreendendo duas ou mais dessas moléculas.
A molécula de ácido nucleico pode ser linear ou circular.
Além disso, o termo molécula de ácido nucleico inclui fitas sense com sentido positivo e antisense com sentido negativo, bem como formas de fita simples e de fita dupla.
Além disso, a molécula de ácido nucleico descrita na presente invenção pode conter nucleotídeos de ocorrência natural ou não natural.
Exemplos de nucleotídeos de ocorrência não natural incluem bases de nucleotídeos modificadas com açúcares derivatizados ou ligações de fosfato na estrutura ou resíduos quimicamente modificados.
As moléculas de ácido nucleico também abrangem moléculas de DNA e RNA que são adequadas como um vetor para a expressão direta de um anticorpo da invenção em uma abordagem in vitro e/ou in vivo, por exemplo, em um hospedeiro ou paciente.
Esses vetores de DNA
(por exemplo, cDNA) ou RNA (por exemplo, mRNA) podem ser não modificados ou modificados.
Por exemplo, o mRNA pode ser modificado quimicamente para aumentar a estabilidade do vetor de RNA e/ou a expressão da molécula codificada para que o mRNA possa ser injetado em um sujeito para gerar o anticorpo in vivo (consulte, por exemplo, Stadler et al, Nature Medicine 2017, publicado online em 12 de junho de 2017, doi: 10.1 038/nm.4356 ou EP 2101823 B1).
[0199] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada a partir de um componente de seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que normalmente expressam a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomalmente ou está em uma localização cromossômica que é diferente de sua localização cromossômica natural.
[0200] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo” refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos (ou fragmentos dos mesmos), incluindo tais moléculas de ácido nucleico em um único vetor ou em vetores separados, e a(s) dita(s) molécula(s) de ácido nucleico estão presentes em pelo menos um ou mais local(ais) de uma célula hospedeira.
[0201] O termo “anticorpo monoclonal” conforme utilizado no presente refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao(s) mesmo(s) epítopo(s), exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estão presentes em pequenas quantidades. Ao contrário das preparações com anticorpo policlonal, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre um antígeno. Portanto, o adjetivo
“monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como uma necessidade de se produzir o anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando aos métodos de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo a totalidade ou parte dos loci de imunoglobulinas humanas, e tais métodos e outros métodos exemplares para produzir anticorpos monoclonais descritos na presente divulgação.
[0202] Um “anticorpo nu” refere-se a um anticorpo não conjugado a uma molécula heteróloga (tal como uma fração citotóxica) ou um radiomarcador. O anticorpo nu pode estar presente em uma formulação farmacêutica.
[0203] “Anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulinas de ocorrência natural com diferentes estruturas. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 Daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por ligações de bissulfeto. A partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também denominada de domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Do mesmo modo, a partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também denominada de domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante (CL). A “cadeia leve” de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.
[0204] O termo “bula” da forma como é utilizado no presente refere-se a instruções habitualmente incluídas nos recipientes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, posologia, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas à utilização de tais produtos terapêuticos.
[0205] O “percentual (%) de identidade da sequência de aminoácidos” com relação a uma sequência polipeptídica é definido no presente como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos (gaps), se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para propósitos da determinação da porcentagem de identidade de sequências de aminoácidos pode ser obtido de várias formas que estão dentro do conhecimento da técnica, por exemplo, o uso de softwares de computador publicamente disponíveis, tais como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Para os propósitos da presente invenção, no entanto, os valores da % de identidade da sequência de aminoácido são gerados usando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2 é de autoria da Genentech, Inc. e o código fonte foi apresentado com a documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington, DC, 20559, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível pela Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[0206] Em situações onde o ALIGN-2 é empregado para a comparação de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A, com, ou contra, uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma determinada sequência de aminoácido A que contenha certa % de identidade de sequência de aminoácidos com, ou contra, uma dada sequência de aminoácidos B) é calculado da seguinte forma: 100 vezes a fração X/Y - em que, X é a quantidade de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondentes idênticos pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento A e B do programa e em que Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Será compreendido que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos de A para B não é igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos de B para A. A menos que especificamente indicado em contrário, todos os valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos, tal como descrito no parágrafo anterior, pelo uso do programa ALIGN-2.
[0207] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo contida nela seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação deveria ser administrada.
[0208] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica que não seja um ingrediente ativo e que não seja tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[0209] Conforme utilizado no presente, o termo “tratamento” (e variações gramaticais deste como “tratar” ou “tratando”) refere-se a intervenções clínicas em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo que está sendo tratado, e pode ser realizado para profilaxia ou durante o desenvolvimento da patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquer consequência patológica direta ou indireta da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença, e remissão ou prognóstico melhorado. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos da presente invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença, ou para retardar a progressão de uma doença.
[0210] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões conservadas denominadas regiões estruturais ou arcabouços (frameworks - FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6ª ed., W.H.
Freeman & Co., página 91 (2007)). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL a partir de um anticorpo que se liga ao antígeno para pesquisar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J.
Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al, Nature 352:624-628 (1991).
[0211] O termo “vetor”, da forma utilizada na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual ele foi ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual ele foi introduzido.
Determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos no presente como “vetores de expressão”.
[0212] Os termos “Pb” ou “chumbo”, conforme usados no presente documento, incluem íons dos mesmos, por exemplo, Pb(II).
Assim, o leitor experiente compreende que, por exemplo, os termos chumbo, Pb, 212 Pb ou 203Pb destinam-se a abranger formas iônicas do elemento, em particular, Pb(II). Em vários aspectos da invenção, Pb pode ser um radioisótopo (por exemplo, quando usado em um método de radioimunoterapia ou radioimunoimagem) ou pode ser um não radioisótopo estável (por exemplo, como pode ser preferido no contexto de um agente de remoção).
[0213] “DOTAM” tem o nome químico: 1,4,7,10-Tetraquis(carbamoilmetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecano, - que é um composto da seguinte fórmula: - 212Pb-DOTAM tem a seguinte estrutura:
[0214] A presente invenção pode, em certos aspectos e exemplos de realização, também fazer uso de variantes funcionais ou derivados de DOTAM incorporando um íon metálico. Variantes/derivados adequados de DOTAM têm uma estrutura que difere até certo ponto da estrutura de DOTAM e retêm a capacidade de funcionar (ou seja, reter atividade suficiente para ser usado para um ou mais dos propósitos descritos na presente invenção). Em tais aspectos e exemplos de realização, o DOTAM ou variante/derivado funcional do DOTAM pode ser um dos variantes ativos divulgados no documento WO 2010/099536.
[0215] Os variantes/derivados funcionais adequados podem ser um composto com a seguinte fórmula:
- ou um sal farmaceuticamente aceitável deste; onde:
- RN é H, alquila C 1-6, haloalquila C 1-6, alquenila C 2-6, alquinila
C2-6, cicloalquila C 3-7, cicloalquil C 3-7-alquila C1-4, heterocicloalquila C 2-7,
heterocicloalquil C 2-7-alquila C1-4, fenila, fenil-alquila-C1-4, heteroarila C 1-7, e heteroaril C 1-7-alquila C 1-4; em que cada alquila C 1-6, haloalquila C1-6,
alquenila C2-6, e C 2-6 alquinila são opcionalmente substituídas por 1, 2, 3,
ou 4 grupos R w selecionados independentemente; e em que as referidas cicloalquila C 3-7, cicloalquil C 3-7-alquila C 1-4, heterocicloalquila C 2-7,
heterocicloalquil C 2-7-alquila C1-4, fenila, fenil-alquila-C1-4, heteroarila C 1-7, e heteroaril C1-7-alquila C1-4 são, cada uma, opcionalmente substituídas por
1, 2, 3, ou 4 grupos R x selecionados independentemente; - L 1 é independentemente alquileno C 1-6, alquenileno C 1-6, ou alquinileno C 1-6, cada um dos quais sendo opcionalmente substituído por 1,
2, ou 3 grupos independentemente selecionados de grupos R 1;
- L2 é alquileno C 2-4 de cadeia linear, que é opcionalmente substituído por um grupo R 1 independentemente selecionado; e que é opcionalmente substituído por 1, 2, 3, ou 4 grupos independentemente selecionados a partir de alquila C 1-4 e ou haloalquila C 1-4;
- R1 é independentemente selecionado a partir de D 1-D2-D3,
halogênio, ciano, nitro, hidroxil, alcoxi C 1-6, haloalcoxi C 1-6, alquiltio C1-6,
alquilsulfinila C 1-6, alquilsulfonila C 1-6, amino, alquilamino C 1-6, di-
alquilamino C 1-6, alquilcarbonila C 1-4, carboxi, alcoxicarbonila C 1-6,
alquilcarbonilamino C 1-6, di-alquilcarbonilamino C 1-6, alcoxicarbonilamino
C1-6, alcoxicarbonil C 1-6-(alquil C 1-6)amino, carbamila, alquilcarbamila C 1-6,
e di-alquilcarbamila C 1-6;
- cada D 1 é independentemente selecionado a partir de aril C 6-
10 -alquila C 1-4, heteroaril C 1-9-alquila C 1-4, cicloalquil C 3-10-alquila C 1-4,
heterocicloalquil C 2-9-alquila C1-4, alquileno C 1-8, alquenileno C 1-8, e alquinileno C 1-8; em que o referido alquileno C 1-8, alquenileno C 1-8, e alquinileno C1-8 são opcionalmente substituídos por 1, 2, 3, ou 4 grupos R 4 independentemente selecionados; e em que cada aril C 6-10-alquila C 1-4,
heteroaril C 1-9-alquila C 1-4, cicloalquil C3-10-alquila C1-4, heterocicloalquil C 2-
9 -alquila C1-4 referida são opcionalmente substituídas por 1, 2, 3, ou 4 grupos R5 selecionados independentemente;
- cada D2 é independentemente ausente ou alquileno C 1-20 de cadeia linear, em que de 1 a 6 grupos metileno não adjacentes do referido alquileno C 1-20 de cadeia linear são opcionalmente substituídos por uma porção -D4- independentemente selecionada, desde que pelo menos uma unidade de metileno no referido alquileno C 1-20 de cadeia linear não seja opcionalmente substituído por uma porção –D4-; em que o referido alquileno C1-20 de cadeia linear é opcionalmente substituído por um ou mais grupos independentemente selecionados a partir de halogênio, ciano,
nitro, hidroxila, alquila C1-4, haloalquila C 1-4, alcoxi C 1-4, haloalcoxi C 1-4,
amino, alquilamino C 1-4, di-alquilamino C 1-4, alquilcarbonila C 1-4, carboxi,
alcoxicarbonila C 1-4, alquilcarbonilamino C 1-4, di-alquilcarbonilamino C 1-4, alcoxicarbonilamino C 1-4, alcoxicarbonil (alquil C 1-4)amino C 1-4, carbamila,
alquilcarbamila C 1-4, e di-alquilcarbamila C1-4;
- cada D 3 é independentemente selecionado a partir de H,
halogênio, ciano, nitro, hidroxila, alquila C 1-6, haloalquila C 1-6, alquenila C 2-
6, alquinila C 2-6, cicloalquila C 3-14, cicloalquil C 3-14-alquila C1-4,
heterocicloalquila C 2-14, heterocicloalquil C 2-14-alquila C 1-4, arila C6-14, aril
C6-14-alquila C 1-4, heteroarila C 1-13, heteroaril C 1-13-alquila C 1-4; em que as referidas alquila C 1-6, haloalquila C 1-6, alquenila C 2-6, alquinila C2-6 são,
cada uma, opcionalmente substituídas por 1, 2, 3, ou 4 grupos R 6 independentemente selecionados; e em que as referidas cicloalquila C 3-14,
cicloalquil C3-14-alquila C1-4, heterocicloalquila C 2-14, heterocicloalquil C 2-14-
alquila C 1-4, arila C 6-14, aril C 6-14-alquila C 1-4, heteroarila C 1-13, heteroaril C 1-
13 -alquila C 1-4 são, cada uma, opcionalmente substituídas por 1, 2, 3 ou 4 grupos R7 independentemente selecionados;
- cada D4 é independentemente selecionado a partir de –O-, -
S-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=S)-, -NRbC(=O)NRc -, -NR bC(=S)NRc-, -S(=O)-, -
S(=O) 2-, -S(=O)NR a-, -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=O)O-, -OC(=O)NRa-, -
OC(=S)NR a-, -NRa-, -NRbS(=O)NRc -, e NRbS(=O)2NRO-;
- cada R 4 e R6 é independentemente selecionado a partir de halogênio, ciano, nitro, hidroxila, alcoxi C1-4, haloalcoxi C 1-4, alquiltio C 1-4,
alquilsulfinila C 1-4, alquilsulfonila C 1-4, amino, alquilamino C 1-4, di-
alquilamino C 1-4, alquilcarbonila C 1-4, carboxi, alcoxicarbonila C 1-4,
alquilcarbonilamino C 1-4, di-alquilcarbonilamino C 1-4, alcoxicarbonilamino
C1-4, alcoxicarbonil (alquil C 1-4)amino C 1-4, carbamila, alquilcarbamila C 1-4, e di-alquilcarbamila C 1-4;
- cada R5 é independentemente selecionado a partir de halogênio, ciano, cianato, isotiocianato, nitro, hidroxila, alquila C 1-4,
alquenila C2-4, alquinila C 2-4, alcoxi C1-4, haloalcoxi C 1-4, alquiltio C 1-4, alquilsulfinila C 1-4, alquilsulfonila C 1-4, amino, alquilamino C 1-4, di-
alquilamino C 1-4, alquilcarbonila C 1-4, carboxi, alcoxicarbonila C 1-4,
alquilcarbonilamino C 1-4, di-alquilcarbonilamino C 1-4, alcoxicarbonilamino
C1-4, alcoxicarbonil (alquil C 1-4)amino C1-4, carbamil, alquilcarbamila C 1-4, e di-alquilcarbamila C 1-4;
- cada R7 é independentemente selecionado a partir de halogênio, ciano, nitro, hidroxila, alquila C 1-6, alquenila C 2-6, alquinila C 2-6,
cicloalquila C3-7, cicloalquil C 3-7-alquila C 1-4, heterocicloalquila C 2-7,
heterocicloalquil C 2-7-alquila C 1-4, fenila, fenil-alquila C1-4, heteroarila C 1-7,
heteroaril C1-7-alquila C1-4, -ORO, -SRO, -S(=O)RP, -S(=O)2RP, -S(=O)NRs Rt,
-C(=O)RP, -C(=O)ORP, -C(=O)NRs Rt, -OC(=O)RP, -OC(=O)NRsRt, -NRsRt , -
NRqC(=O)R r, -NRqC(=O)ORr, -NRqC(=O)NR r, -NRqS(=O) 2Rr, e –
NRP S(=O) 2NRs Rt; em que as referidas alquila C 1-6, alquenila C 2-6, alquinila
C2-6 são opcionalmente substituídas por 1, 2, 3, ou 4 grupos R’
independentemente selecionados; e em que as referidas cicloalquila C 3-7,
cicloalquil C 3-7-alquila C 1-4, heterocicloalquila C 2-7, heterocicloalquil C 2-7-
alquila C 1-4, fenila, fenil-alquila C 1-4, heteroarila C 1-7, heteroaril C 1-7-alquila
C1-4 são, cada uma, opcionalmente substituídas por 1, 2, 3, ou 4 grupos R’’
independentemente selecionados;
- cada R a, Rb, e Rc é independentemente selecionado a partir de H, alquila C 1-6, haloalquila C 1-6, alquenila C 2-6, alquinila C 2-6, cicloalquila
C3-7, cicloalquil C 3-7-alquila C 1-4, heterocicloalquila C2-7, heterocicloalquil C 2-
7 -alquila C1-4, fenila, fenil-alquila C 1-4, heteroarila C 1-7, heteroaril C 1-7-alquila
C1-4; em que as referidas alquila C 1-6, haloalquila C 1-6, alquenila C 2-6,
alquinila C 2-6 são, cada uma, opcionalmente substituídas por 1, 2, 3, ou 4 grupos R w independentemente selecionados; e em que as referidas cicloalquila C 3-7, cicloalquil C 3-7-alquila C 1-4, heterocicloalquila C 2-7,
heterocicloalquil C 2-7-alquila C 1-4, fenila, fenil-alquila C1-4, heteroarila C1-7, heteroaril C1-7-alquila C1-4 são, cada uma, opcionalmente substituídas por
1, 2, 3, ou 4 grupos R x independentemente selecionados;
- cada Ro, Rp, Rq, Rr, Rs e Rt é independentemente selecionado a partir de H, alquila C 1-6, haloalquila C 1-6, alquenila C2-6, alquinila C 2-6, cicloalquila C3-7, cicloalquil C 3-7-alquila C 1-4, heterocicloalquila C 2-7, heterocicloalquil C 2-7-alquila C1-4, fenila, fenil-alquila C1-4, heteroarila C 1-7, heteroaril C 1-7-alquila C 1-4; em que as referidas alquila C1-6, haloalquila C1-6, alquenila C 2-6, alquinila C2-6 são, cada uma, opcionalmente substituídas por 1, 2, 3, ou 4 grupos R y independentemente selecionados; e em que as referidas cicloalquila C 3-7, cicloalquil C 3-7-alquila C1-4, heterocicloalquila C 2-7, heterocicloalquil C 2-7-alquila C1-4, fenila, fenil- alquila C 1-4, heteroarila C 1-7, heteroaril C 1-7-alquila C1-4 são, cada uma, opcionalmente substituídas por 1, 2, 3, ou 4 grupos R z independentemente selecionados; - cada R’, R w e Ry é independentemente selecionado a partir de hidroxila, ciano, nitro, alcoxi C1-4, haloalcoxi C 1-4, amino, alquilamino C 1- 4, e di-alquilamino C 1-4; e - cada R’’, Rx, e Rz é independentemente selecionado a partir de hidroxila, halogênio, ciano, nitro, alquila C 1-4, haloalquila C 1-4, alcoxi C 1- 4, haloalcoxi C 1-4, amino, alquilamino C 1-4, e di-alquilamino C 1-4; e - desde que a valência de cada átomo nas porções opcionalmente substituídas não seja excedida.
[0216] As formas variantes/derivadas funcionais adequadas da fórmula acima têm uma afinidade para um anticorpo da presente invenção que é comparável ou maior do que a do DOTAM, e têm uma força de ligação para o Pb que é comparável a ou maior do que a do DOTAM (sendo a “afinidade” medida pela constante de dissociação, conforme descrito acima). Por exemplo, a constante de dissociação do derivado funcional/variante com o anticorpo da presente invenção ou/Pb pode ser 1,1 vezes ou menos, 1,2 vezes ou menos, 1,3 vezes ou menos, 1,4 vezes ou menos, 1,5 vezes ou menos, ou 2 vezes ou menos do que a constante de dissociação do DOTAM com o mesmo anticorpo/Pb.
[0217] Cada R N pode ser H, alquila C 1-6, ou haloalquila C 1-6; preferivelmente H, alquila C 1-6, ou haloalquila C 1-6. Mais preferencialmente, cada R N é H.
[0218] Para variantes de DOTAM, é preferível que 1, 2, 3 ou, mais preferencialmente, cada L2 represente alquileno C 2. De um modo vantajoso, as variantes de alquileno C2 de DOTAM podem ter particularmente alta afinidade para Pb. Os substituintes opcionais para L 2 podem ser R1, alquila C 1-4 ou haloalquila C 1-4. Adequadamente, substituintes opcionais para L 2 podem ser alquila C1-4 ou haloalquila C 1-4.
[0219] Opcionalmente, cada L 2 pode ser não alquileno C 2 – CH2CH2- não substituído.
[0220] Cada L 1 é preferencialmente alquileno C 1-4, mais preferencialmente alquileno C 1-4, tal como -CH2-.
[0221] Os variantes/derivados funcionais também podem incluir DOTAM ou um composto como descrito acima conjugado com uma ou mais porções adicionais, por exemplo, uma molécula pequena, um polipeptídeo ou um carboidrato. Essa ligação pode ocorrer por meio de um dos carbonos da estrutura do anel macrociclo. Uma pequena molécula pode ser, por exemplo, um corante (tal como Alexa 647 ou Alexa 488), biotina ou uma porção de biotina. Um polipeptídeo pode ser, por exemplo, um oligopeptídeo, por exemplo, um peptídeo terapêutico ou polipeptídeo tal como um anticorpo. Carboidratos exemplares incluem dextrano, polímeros lineares ou ramificados ou copolímeros (por exemplo, polialquileno, poli(etileno-lisina), polimetacrilato, poliaminoácidos, poli- ou oligossacarídeos, dendrímeros).
[0222] O variante/derivado funcional de DOTAM pode ser um composto com a seguinte fórmula: - em que cada Z é independentemente R1 conforme definido acima; p, q, r, e s são 0, 1 ou 2; e p+q+r+s é 1 ou maior Preferencialmente, p, q, r e s são 0 ou 1 e/ou p+q+r+s é 1. Por exemplo, o composto pode ter p+q+r+s = 1, onde Z é uma fração p--SCN-benzila - esse composto está comercialmente disponível pela Macrocyclics, Inc. (Plano, Texas).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO COMPOSIÇÕES E MÉTODOS ANTICORPOS
[0223] Em um aspecto, a invenção é baseada, em parte, no fornecimento de anticorpos que se ligam especificamente ao Pb-DOTAM (isto é, um quelato compreendendo DOTAM complexado com Pb, também referido aqui como “quelato Pb-DOTAM”).
[0224] Em certos exemplos de realização, um anticorpo que se liga especificamente a Pb-DOTAM pode ter uma ou mais das seguintes propriedades: - liga-se especificamente ao Pb-DOTAM e Bi-DOTAM; - é seletivo para Pb-DOTAM quando comparado a outros metais quelatados, como Cu-DOTAM; - liga-se ao Pb DOTAM com uma afinidade muito alta; e
- liga-se ao mesmo epítopo em Pb-DOTAM que os anticorpos descritos no presente documento, por exemplo, PRIT-0213 ou PRIT- 0214 e/ou tem os mesmos resíduos de contato que os referidos anticorpos.
[0225] Os radioisótopos de Pb são úteis em métodos de diagnóstico e terapia. Nomeadamente, os radioisótopos de chumbo que podem ter uso na invenção incluem 212Pb e 203Pb. Os isótopos estáveis de chumbo também podem ser usados em agentes de remoção, por exemplo, 204Pb, 206Pb, 207Pb ou 208Pb. O Pb pode ser chumbo que ocorre naturalmente, que é uma mistura dos isótopos estáveis (não radioativos) 204Pb, 206Pb, 207Pb e 208Pb.
[0226] Os radionuclídeos que são emissores de partículas α têm o potencial de matar células tumorais de forma mais específicas com menos danos ao tecido circundante do que os emissores β devido à combinação de comprimento de caminho curto e alta transferência de energia linear. O 212Bi é um emissor de partícula α, mas sua meia-vida curta dificulta seu uso direto. 212Pb é o radionuclídeo parental de 212Bi e pode servir como um gerador in vivo de 212Bi, superando assim de maneira eficaz a meia-vida curta do 212Bi (Yong e Brechbiel, Dalton Trans. 21 de junho 2001; 40 (23) 6068- 6076).
[0227] 203Pb é útil como um isótopo para imagiologia. Assim, um anticorpo ligado a 203Pb-DOTAM pode ter uso na radioimunoimagiologia (RII).
[0228] Geralmente, radiometais são utilizados na forma quelatada.
Em aspectos da presente invenção, DOTAM é usado como o agente quelante.
DOTAM é um quelante estável de Pb(II) (Yong e Brechbiel, Dalton Trans. 21 de junho de 2001; 40(23) 6068-6076; Chappell et al. Nuclear Medicine and Biology, Vol. 27, págs. 93-100, 2000). Assim, DOTAM é particularmente útil na conjugação com isótopos de chumbo conforme discutido acima, tal como 212Pb e 203Pb.
[0229] Conforme discutidos acima, os anticorpos de acordo com a presente invenção ligam-se ao Pb-DOTAM. Em alguns exemplos de realização,
pode ser preferido que os anticorpos liguem-se ao Pb-DOTAM com um valor Kd da afinidade de ligação de 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM ou menos, por exemplo, 0,9pM ou menos, 0,8pM ou menos, 0,7pM ou menos, 0,6pM ou menos ou 0,5pM ou menos.
[0230] Os anticorpos ligam-se adicionalmente a Bi quelatado por DOTAM. Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que os anticorpos liguem-se ao Bi-DOTAM (ou seja, um quelato compreendendo DOTAM complexado com bismuto, também designado na presente invenção como “quelato Bi-DOTAM”) com um valor Kd da afinidade de ligação de 1 nM, 500 pM, 200pM, 100pM, 50pM, 10pM ou menos, por exemplo, 9pM, 8pM, 7pM, 6pM, 5pM ou menos.
[0231] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos podem ligar-se ao Bi-DOTAM e ao Pb-DOTAM com uma afinidade semelhante. Por exemplo, pode ser preferido que a razão de afinidade, por exemplo, a razão dos valores de Kd, para Bi-DOTAM/Pb-DOTAM esteja na faixa de 0,1-10, por exemplo, 1-10.
[0232] Os valores de afinidade suficiente para um anticorpo exemplar de acordo com a invenção (PRIT-0213) são fornecidos abaixo: AFINIDADES DO QUELATO DE METAL-DOTAM DO BSAB CEA-DOTAM Antígeno KD [pM] 95% CI[pM] Pb-DOTAM 0,84 0,44-1,4 Ca-DOTAM 0,95 0,43-1,7 Bi-DOTAM 5,7 4,6–6,2 Cu-DOTAM 122000 60000 – 206000
[0233] As finidades foram determinadas por medições de equilíbrio KinExA.
[0234] Além disso, os anticorpos da presente invenção são preferencialmente seletivos para Bi-DOTAM e/ou Pb-DOTAM, em comparação com outros metais quelatados, tais como Cu-DOTAM. Por exemplo, a razão de afinidade, por exemplo, a razão dos valores Kd, para Pb-DOTAM/Cu-DOTAM pode ser de pelo menos 100.000.
[0235] Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que os anticorpos se liguem ao Pb-DOTAM e/ou Bi-DOTAM com uma afinidade (por exemplo, valor Kd da finidade) igual ou maior do que a de um anticorpo biespecífico (denominado na presente invenção de PRIT-0213) possuindo: i) uma primeira cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ii) uma segunda cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
[0236] Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que os anticorpos se liguem a Pb quelatado por DOTAM e/ou Bi quelatado por DOTAM com uma afinidade (por exemplo, valor Kd da finidade) igual ou maior do que a de um anticorpo biespecífico (denominado na presente invenção de PRIT-0214) possuindo: i) uma primeira cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; ii) uma segunda cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
[0237] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de acordo com a presente invenção liga-se ao mesmo epítopo, ou a um epítopo de sobreposição, de um radionuclídeo quelatado como um anticorpo divulgado no presente pedido.
[0238] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo, ou a um epítopo de sobreposição, do quelato Pb-DOTAM (Pb- DOTAM) como o Fab PRIT-0213, possuindo: i) uma primeira cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ii) uma segunda cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
[0239] O epítopo de um radionuclídeo quelatado (por exemplo, Pb-DOTAM) ligado por um determinado anticorpo pode ser determinado, e isso pode ser comparado ao epítopo do radionuclídeo quelatado que está ligado por um anticorpo divulgado na presente invenção (por exemplo, Fab PRIT-0213).
[0240] A presente divulgação no Exemplo 14 descreve a caracterização da interação de ligação entre Fab PRIT-0213 para Pb-DOTAM, com base na determinação da estrutura cristalina de Fab PRIT-0213 em complexo com Pb-DOTAM em resolução de 1,40 Å e análise deste estrutura utilizando o programa de superfícies e montagens de proteínas (PISA) (Krissinel e Henrick, J Mol Biol (2007) 372 (3): 774-97).
[0241] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de acordo com a presente invenção pode exibir interação com um ou mais dos seguintes sítios em relação a Pb-DOTAM, por exemplo, conforme determinado por análise PISA da estrutura do anticorpo em complexo com Pb-DOTAM: borda à face para a região do anel azaciclododecano abaixo do anel azaciclododecano (por exemplo, o anel tetraciclododecano), N6, N7, N8, N5 e/ou C12. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo pode exibir interação com um ou mais dos seguintes sítios em relação ao Pb-DOTAM: N7, N8, da borda à face para o anel de azaciclododecano, o anel de tetraciclododecano e/ou N6.
[0242] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo pode exibir uma ou mais das seguintes interações em relação ao Pb-DOTAM, por exemplo, conforme determinado pela análise de PISA da estrutura do anticorpo em complexo com Pb-DOTAM: interação apolar borda à face para o anel azaciclododecano, interação polar com N8, ligação de hidrogênio com N7, ligação de hidrogênio com N8, interação polar com N5, interação apolar com C12, interação polar com N7, ligação polar (de hidrogênio) com N6, e/ou interação apolar com o anel tetraciclododecano.
[0243] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo pode exibir uma ou mais das seguintes interações com relação ao Pb-DOTAM, por exemplo, tal como determinado por análise de PISA da estrutura do anticorpo em complexo com Pb-DOTAM: ligação de hidrogênio entre um ou mais resíduos de anticorpo da CDR3 de cadeia pesada e N7, ligação de hidrogênio entre um ou mais resíduos de anticorpo da CDR3 de cadeia pesada e N8, interação apolar entre um ou mais resíduos de anticorpo da CDR2 de cadeia pesada da borda-à-face para o anel azaciclododecano, interação apolar entre a CDR3 de cadeia leve do anticorpo e o anel de tetraciclododecano e/ou interação apolar entre a CDR1 de cadeia leve do anticorpo e N6.
[0244] Em outros exemplos de realização, os anticorpos podem compartilhar os mesmos resíduos de contato descritos no presente documento: por exemplo, esses resíduos podem ser invariantes. Esses resíduos podem incluir os seguintes: a) na CDR2 de cadeia pesada: Phe50, Asp56 e/ou Tyr58, e também opcionalmente Gly52 e/ou Arg 54; b) na CDR3 de cadeia pesada: Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99, Ala100C e/ou Tyr100D e também opcionalmente Pro100E; c) na CDR1 de cadeia leve: Tyr28 e/ou Asp32;
d) na CDR3 de cadeia leve: Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c e/ou Tyr96; e) na CDR2 de cadeia leve: opcionalmente Gln50.
[0245] Certos aspectos e exemplos de realização de anticorpos de acordo com a presente invenção são discutidos acima. Outros aspectos e exemplos de realização adequados de acordo com a invenção são discutidos a seguir. Em todos os exemplos de realização, os anticorpos retêm a capacidade de se ligar ao Pb-DOTAM e, preferencialmente, também ao Bi-DOTAM, ainda mais preferencialmente com a afinidade e/ou seletividade conforme discutido acima.
[0246] Em um exemplo de realização, a invenção pode fornecer um anticorpo anti-Pb-DOTAM compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e)CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (f) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0247] Em um exemplo de realização, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VH selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e
CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0248] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VL selecionadas a partir de (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0249] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VH selecionadas a partir de (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VL selecionadas a partir de (i) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0250] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (f) CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 6.
[0251] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos podem compreender uma ou mais das CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3 possuindo substituições quando comparadas com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-6, respectivamente, por exemplo, 1, 2 ou 3 substituições. Pode ser preferido que estas substituições não ocorram nas posições invariantes, tal como estabelecido acima.
[0252] Por exemplo, em alguns exemplos de realização, uma CDR-H2 pode compreender a sequência de aminoácidos FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2), ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 2, em que essas substituições não incluem Phe50, Asp56 e/ou Tyr58, e opcionalmente também não incluem Gly52 e/ou Arg 54, todas numeradas de acordo com o sistema de Kabat.
[0253] Em alguns exemplos de realização, a CDR-H2 pode ser substituída em uma ou mais posições, como mostrado abaixo. Aqui e nas tabelas de substituição que se seguem, as substituições são baseadas nos resíduos da linhagem germinativa (sublinhado) ou por aminoácidos que teoricamente se ajustam estericamente e também ocorrem no repertório cristalizado no sítio. Em alguns exemplos de realização, os resíduos mencionados acima podem ser fixos e outros resíduos podem ser substituídos de acordo com a tabela abaixo: em outros exemplos de realização, as substituições de qualquer resíduo podem ser feitas de acordo com a tabela abaixo. WolfGuy Kabat AA Substituição 251 50 F Y, H 252 51 I 253 52 G 254 53 S A, G, T, I, N 288 54 R A, D, G, N, S, T, F, Y 289 55 G D, S, Y, T, A, N, R, V 290 56 D 291 57 T K, I, A, P, S 292 58 Y F, W, H 293 59 Y N, F, H, L, S 294 60 A G, N, S, T 295 61 S A, G, N, Q, T 296 62 W K, P, S, A, T, D, N, R, Q 297 63 A F, L, V, M, I 298 64 K N, Q, R, E 299 65 G S, T, D, N, A
[0254] Opcionalmente, a CDR-H3 pode compreender a sequência de aminoácidos ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3), ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 3, em que essas substituições não incluem Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, e opcionalmente também não incluem Ala100C, Tyr100D, e/ou Pro100E e/ou opcionalmente também não incluem Tyr99; Por exemplo, em alguns exemplos de realização, as substituições não incluem Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99 Ala100C e
Tyr100D.
[0255] Em certos exemplos de realização, a CDR-H3 pode ser substituída em uma ou mais posições, como mostrado abaixo. Em alguns exemplos de realização, os resíduos mencionados acima podem ser fixos e outros resíduos podem ser substituídos de acordo com a tabela abaixo: em outros exemplos de realização, as substituições de qualquer resíduo podem ser feitas de acordo com a tabela abaixo. WolfGuy Kabat AA Substituição 351 95 E 352 96 R K, E 353 97 D 354 98 P 355 99 Y F, G, S, T, D 356 100 G 392 100A G 393 100B G 394 100C A S, T 395 100D Y F 396 100E P 397 100F P 398 101 H A, T, V, D 399 102 L Y, V, I, H, F
[0256] Opcionalmente, a CDR-L1 pode compreender a sequência de aminoácidos QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4) ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 4, em que essas substituições não incluem Tyr28 e/ou Asp32 (numeração de Kabat).
[0257] Em certos exemplos de realização, a CDR-L1 pode ser substituída em uma ou mais posições, como mostrado abaixo. Novamente, em alguns exemplos de realização, os resíduos mencionados acima podem ser fixos e outros resíduos podem ser substituídos de acordo com a tabela abaixo: em outros exemplos de realização, as substituições de qualquer resíduo podem ser feitas de acordo com a tabela abaixo. WolfGuy Kabat AA Substituição 551 24 Q R, K
WolfGuy Kabat AA Substituição 552 25 S A, G 554 26 S T 555 27 H Q, S, R, K 556 27A S Q 557 27B V I, D, N 561 28 Y F 562 29 S T, V 571 30 D R, S, N, G 572 31 N K 597 32 D 598 33 L I, V, M 599 34 A S
[0258] Opcionalmente, CDR-L1 pode compreender a sequência de aminoácidos LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6) ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 6, em que essas substituições não incluem Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c e/ou Tyr96 (Kabat).
[0259] Em certos exemplos de realização, a CDR-L3 pode ser substituída nas seguintes posições, como mostrado abaixo. (Uma vez que a maioria dos resíduos está exposta ao solvente e sem contato com o antígeno, muitas substituições são concebíveis). Novamente, em alguns exemplos de realização, os resíduos mencionados acima podem ser fixos e outros resíduos podem ser substituídos de acordo com a tabela abaixo: em outros exemplos de realização, as substituições de qualquer resíduo podem ser feitas de acordo com a tabela abaixo. WolfGuy Kabat AA Substituição 751 89 L A, V, Q 752 90 G A 753 91 G 754 92 Y A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V 755 93 D A, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y 756 94 D A, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y 794 95 E A, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y 795 95A S A, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, Y
WolfGuy Kabat AA Substituição 796 95B D A, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, Y 797 95C T S 798 96 Y F, H, R 799 97 G A, E, I, K, L, M, N, Q, S, T, V
[0260] O anticorpo pode compreender ainda CDR-H1 e CDR-L2, opcionalmente com a sequência da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5, respectivamente, ou uma variante da mesma tendo pelo menos 1, 2 ou 3 substituições em relação às mesmas, opcionalmente substituições conservadoras.
[0261] Em qualquer um dos exemplos de realização acima, um anticorpo anti-Pb-DOTAM pode ser humanizado. Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-Pb-DOTAM compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda uma região de arcabouço humana aceptora, por exemplo, um arcabouço (framework) de imunoglobulina humana ou arcabouço de consenso humano.
Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Pb-DOTAM compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização acima, e compreende ainda regiões estruturais derivadas de vk 139 e/ou vh 226. Para vk 139, em alguns exemplos de realização pode não haver retromutação (back mutation). Para vh 226, o resíduo Ala49 da linhagem germinal pode ser retro mutada para Gly49.
[0262] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno pode compreender um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9, ou uma variante desta, compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9. Em determinados exemplos de realização, uma sequência VH possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo anti-Abeta compreendendo tal sequência ainda mantém a capacidade de se ligar ao Pb-DOTAM, preferencialmente com uma afinidade como descrito na presente invenção. A sequência VH pode reter os resíduos invariantes conforme estabelecido acima. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das CDRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9, incluindo modificações pós-traducionais da referida sequência. Em um exemplo de realização específico, a VH compreende uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0263] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Pb- DOTAM, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10. Em alguns exemplos de realização, uma sequência VL possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-Pb-DOTAM compreendendo tal sequência retém a capacidade de se ligar ao Pb-DOTAM, preferencialmente com uma afinidade conforme descrita na presente invenção. A sequência VL pode reter os resíduos invariantes tal como estabelecido acima. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 ao 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das CDRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-Pb-DOTAM compreende a sequência VL de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em um exemplo de realização específico, a VL compreende uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0264] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Pb- DOTAM, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima, e uma VL como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende a sequência VH e VL de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais destas sequências.
Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende a sequência VH e VL de SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais destas sequências.
[0265] Em um aspecto adicional da invenção, um anticorpo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima é um anticorpo monoclonal, incluindo um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em um exemplo de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fv, Fab, Fab’, scFab, scFv, diacorpo (diabody)ou F(ab')2. Os fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, scFv, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, vide Hudson et al. Nat.
Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv vide, por exemplo, Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Eds Rosenburg & Moore., (Springer-Verlag, Nova Iorque), págs. 269-315 (1994); vide também a publicação WO 93/16185; e as Patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Para uma discussão sobre os fragmentos Fab e F(ab’) 2 compreendendo os resíduos do epítopo de ligação aos receptores de recuperação (salvage) e possuindo uma meia-vida in vivo aumentada, vide a Patente US 5.869.046.
[0266] Os diacorpos (diabodies) são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos.
Vide, por exemplo, a Patente EP 404.097; o documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Os triacorpos (triabodies) e tetracorpos (tetrabodies) também estão descritos em Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-
134.
[0267] Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em determinadas realizações, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA, vide, por exemplo, Patente US 6.248.516 B1).
[0268] Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por diversas técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, Escherichia coli ou fagos), conforme descrito na presente invenção.
[0269] Em outro exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total, por exemplo, um anticorpo IgG intacto ou anticorpo de outra classe ou isotipo, conforme definido no presente.
AGENTES DIRECIONADOS
[0270] Em alguns aspectos, um anticorpo que se liga especificamente ao Pb quelatado por DOTAM é acoplado a um agente de ligação celular/fração de direcionamento para produzir um agente direcionado.
Opcionalmente, o anticorpo que se liga especificamente ao Pb quelatado por DOTAM pode ser um anticorpo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização descritos acima.
[0271] O acoplamento pode ser preferencialmente por expressão como um polipeptídeo ou proteína de fusão. A fusão pode ser direta ou feita por meio de um ligante. O polipeptídeo ou proteína de fusão pode ser produzido de forma recombinante, evitando qualquer necessidade de conjugação química. Opcionalmente o referido ligante pode ser um peptídeo com pelo menos 5 aminoácidos, de preferência entre 25 e 50 amino ácidos. O ligante pode ser um ligante rígido ou um ligante flexível. Em alguns exemplos de realização, ele é um flexível que compreende ou consiste nos resíduos Thr, Ser, Gly e/ou Ala. Por exemplo, ele pode compreender ou consistir nos resíduos Gly e Ser. Em alguns exemplos de realização, ele pode ter um motivo de repetição, tal como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, onde n é, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em alguns exemplos de realização, o ligante pode ser ou pode compreender a sequência GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26). Outros ligantes podem ser usados e podem ser identificados pelo especialista.
[0272] Assim, é fornecido um complexo de anticorpo multiespecífico (por exemplo, biespecífico) que se liga especificamente a um quelato Pb-DOTAM e a outro antígeno alvo, por exemplo, um antígeno presente na superfície de uma célula-alvo.
[0273] Na medida em que a invenção diz respeito a métodos de tratamento e a produtos para uso em métodos de tratamento, ela é aplicável a qualquer condição tratável por atividade citotóxica direcionado às células doentes do paciente. O tratamento é preferencialmente de um tumor ou câncer (por exemplo, câncer de pâncreas, mama ou próstata). Entretanto, a aplicabilidade da invenção não está limitada a tumores e cânceres. Por exemplo, o tratamento também pode ser da uma infecção viral. As imunotoxinas dirigidas contra antígenos virais expressas na superfície das células infectadas têm sido investigadas para uma variedade de infecções virais, como HIV, raiva e EBV. Cai e Berger 2011 Antiviral Research 90 (3): 143-50 usaram uma imunotoxina contendo PE38 para matar células infectadas por herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi. Além disso, Resimmune® (A- dmDT390-bisFv (UCHT1)) mata seletivamente as células T malignas humanas e depleta transitoriamente as células T normais e é considerado como tendo potencial para o tratamento de doenças autoimunes induzidas por células T, como esclerose múltipla e doença do enxerto contra o hospedeiro, bem como cânceres de células T sanguíneas para os quais está sendo submetido a ensaios clínicos.
[0274] Assim, os antígenos alvo adequados podem incluir antígenos de células cancerosas, particularmente antígenos de células cancerosas humanas, antígenos virais ou antígenos microbianos.
[0275] Os anticorpos direcionados descritos na presente invenção destinam-se a ligar-se às células doentes, tais como células tumorais, através dos seus antígenos de superfície celular. Os antígenos são geralmente antígenos de superfície celular normais que são superexpressos ou expressos em momentos anormais. Idealmente, o antígeno alvo é expresso apenas em células doentes (como células tumorais), entretanto, isso raramente é observado na prática. Como resultado, os antígenos alvo são geralmente selecionados com base na expressão diferencial entre o tecido doente e o saudável.
[0276] Assim, o anticorpo direcionado pode ligar-se especificamente a qualquer marcador de superfície celular adequado. A escolha de uma porção de direcionamento particular e/ou marcador de superfície celular pode ser escolhida dependendo da população de células particular a ser alvejada. Os marcadores de superfície celular são conhecidos no estado da técnica (consulte, por exemplo, Mufson et al., Front. Biosci., 11: 337-43 (2006); Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6: 326-334 (2000); e Kreitman et al., AAPS Journal, 8 (3): E532-E551 (2006)) e pode ser, por exemplo, uma proteína ou um carboidrato. Em um exemplo de realização da invenção, a porção de direcionamento (agente de ligação à célula) é um ligante que se liga especificamente a um receptor na superfície da célula. Ligantes exemplares incluem, mas não estão limitados a, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), Fas, ligante indutor da apoptose relacionada à TNF (TRAIL), uma citocina (por exemplo, IL-2, IL-15, IL-4, IL- 13), uma linfocina, um hormônio e um fator de crescimento (por exemplo, fator de crescimento transformador (TGFα), fator de crescimento neuronal, fator de crescimento epidérmico).
[0277] O marcador de superfície celular pode ser, por exemplo, um antígeno associado a tumor.
[0278] A expressão “antígeno associado ao tumor” ou “antígeno tumor-específico”, tal como utilizada na presente invenção, refere-se a qualquer molécula (por exemplo, proteína, peptídeo, lipídio, carboidrato, etc.) expressa ou predominantemente expressa ou superexpressa por células tumorais e/ou células cancerosas, de modo que o antígeno esteja associado ao(s) tumor(es) e/ou câncer(es). O antígeno associado ao tumor pode, adicionalmente, ser expresso por células normais, não tumorais ou não cancerosas. Entretanto, em tais casos, a expressão do antígeno associado ao tumor por células normais, não tumorais ou não cancerosas não é tão robusta quanto a expressão por células tumorais ou cancerosas. A este respeito, o tumor ou células cancerosas podem superexpressar o antígeno ou expressar o antígeno em um nível significativamente mais alto, em comparação com a expressão do antígeno por células normais, não tumorais ou não cancerosas. Além disso, o antígeno associado ao tumor pode, adicionalmente, ser expresso por células de um estado diferente de desenvolvimento ou maturação. Por exemplo, o antígeno associado ao tumor pode ser adicionalmente expresso por células do estágio embrionário ou fetal, células essas que normalmente não são encontradas em um hospedeiro adulto. Alternativamente, o antígeno associado ao tumor pode ser adicionalmente expresso por células-tronco ou células precursoras, cujas células não são normalmente encontradas em um hospedeiro adulto.
[0279] O antígeno associado ao tumor pode ser um antígeno expresso por qualquer célula de qualquer câncer ou tumor, incluindo os cânceres e tumores descritos na presente invenção. O antígeno associado ao tumor pode ser um antígeno associado ao tumor de apenas um tipo de câncer ou tumor, de modo que o antígeno associado ao tumor esteja associado ou seja característico apenas de um tipo de câncer ou tumor. Alternativamente, o antígeno associado ao tumor pode ser um antígeno associado ao tumor (por exemplo, pode ser característico) de mais de um tipo de câncer ou tumor. Por exemplo, o antígeno associado ao tumor pode ser expresso por células de câncer de mama e próstata e não expresso por células normais, não tumorais ou não cancerosas.
[0280] Antígenos associados a tumores exemplares ao qual o agente de ligação celular pode ligar-se especificamente incluem, mas não estão limitados a, mucina 1 (MUCL; mucina epitelial associada a tumor), antígeno preferencialmente expresso de melanoma (PRAME), antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), PSCA, EpCAM, Trop2, receptor de fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSFR), CD56, receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2/neu) (também conhecido como erbB-2), CDS,
CD7, proteína relacionada à tirosinase (TRP) I e TRP2. Em um exemplo de realização preferido, o marcador de superfície celular, ao qual a fração de direcionamento (agente de ligação celular) liga-se especificamente, é selecionado a partir do grupo que consiste nos clusters de diferenciação
(CD)19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33 (ácido siálico que liga lectina
3 semelhante a Ig, antígeno de superfície de célula mieloide), CD79b, CD123
(receptor alfa de interleucina 3), receptor de transferrina, receptor de EGF,
mesotelina, caderina, Lewis Y, Glypican-3, FAP (proteína alfa de ativação de fibroblastos), PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), CA9 =
CAIX (anidrase carbônica IX), LlCAM (molécula de adesão de células neurais L
1), endosialina, HER3 (conformação ativada do membro da família de receptores do fator de crescimento epidérmico 3), complexo Alkl/BMP9
(quinase 1 de linfoma anaplásico/proteína morfogenética óssea 9), TPBG =
5T4 (glicoproteína trofoblástica), ROR1 (antígeno de superfície semelhante ao receptor de tirosina quinase), HER1 (conformação ativada do receptor do fator de crescimento epidérmico) e CLL1 (família de domínios de lectina tipo C) 12,
membro A). A mesotelina é expressa, por exemplo, no câncer de ovário,
mesotelioma, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma de pulmão, câncer de trompa de Falópio, câncer de cabeça e pescoço, câncer cervical e câncer pancreático.
CD22 é expresso, por exemplo, na leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia prolinfocítica (PLL),
linfoma não-Hodgkin, linfoma linfocítico pequeno (SLL) e leucemia linfática aguda (ALL). O CD25 é expresso, por exemplo, em leucemias e linfomas,
incluindo leucemia de células pilosas e linfoma de Hodgkin.
O antígeno Lewis Y é expresso, por exemplo, no câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de pulmão e câncer pancreático. O CD33 é expresso, por exemplo, em leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielomonocítica crônica (CML) e distúrbios mieloproliferativos.
[0281] Em um exemplo de realização da invenção, a porção de direcionamento é um anticorpo (incluindo um fragmento de anticorpo) que se liga especificamente ao alvo, por exemplo, o antígeno associado ao tumor. Em tais exemplos de realização, o agente pode ser referido como um anticorpo biespecífico ou multiespecífico.
[0282] Anticorpos exemplares que ligam-se especificamente a antígenos associados a tumores incluem, mas não estão limitadas a, anticorpos contra o receptor de transferrina (por exemplo, HB21 e suas variantes), os anticorpos contra CD22 (por exemplo, RFB4 e as suas variantes), os anticorpos contra CD25 (por exemplo, anti-Tac e variantes), anticorpos contra mesotelina (por exemplo, SS 1, MORAb-009, SS, HN1, HN2, MN, MB e variantes dos mesmos) e anticorpos contra o antígeno Y de Lewis (por exemplo, B3 e variantes dos mesmos). A este respeito, a fração de direcionamento (agente de ligação celular) pode ser um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em B3, RFB4, SS, SS1, MN, MB, HN1, HN2, HB21 e MORAb-009, e porções de ligação ao antígeno dos mesmos. Outras porções de direcionamento exemplares adequadas para uso nas moléculas quiméricas da presente invenção são divulgadas, por exemplo, nas Patentes US 5.242.824 (receptor antitransferrina); US 5.846.535 (anti-CD25); US
5.889.157 (anti-Lewis Y); US 5.981.726 (anti-Lewis Y); US 5.990.296 (anti- Lewis Y); US 7.081.518 (antimesotelina); US 7.355.012 (anti-CD22 e anti- CD25); US 7.368.110 (antimesotelina); US 7.470.775 (anti-CD30); US
7.521.054 (anti-CD25); e US 7.541.034 (anti-CD22); Publicação do Pedido de Patente US 2007/0189962 (anti-CD22); Frankel et al, Clin. Cancer Res., 6: 326- 334 (2000), e Kreitman et al., AAPS Journal, 8 (3): E532-E551 (2006), sendo cada deles incorporado ao presente por referência.
[0283] Os anticorpos foram criados para direcionar antígenos relacionados a tumores específicos, incluindo: Cripto, CD30, CD19, CD33, Glicoproteína NMB, CanAg, Her2 (ErbB2/neu), CD56 (MACN), CD22 (Siglec2), CD33 (Siglec3), CD79, CD138, PSCA, PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), BCMA, CD20, CD70, E-seletina, EphB2, Melanotransferina, Muc16 e TMEFF2.
[0284] Em alguns exemplos de realização da presente invenção, pode ser preferido que o antígeno associado ao tumor seja o antígeno carcinoembrionário (CEA). O CEA pode ter a sequência de aminoácidos do CEA humano, em particular a molécula 5 de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário (CEACAM5), que é mostrada na UniProt (www.uniprot.org) no. P06731 (versão 119) ou NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004354.2. Os anticorpos que foram produzidos contra CEA incluem T84.66 e suas versões humanizadas e quiméricas, tais como T84.66- LCHA como descrito nos documentos WO2016/075278 A1 e/ou WO2017/055389, CH1A1a, um anticorpo anti-CEA como descrito no documento WO2011/034660 e CEA hMN-14 conforme descrito na tabela 2 abaixo (consulte também US 6.676.924 e US 5.874.540).
[0285] O CEA é vantajoso no contexto da presente invenção porque é internalizado de forma relativamente lenta e, portanto, uma alta porcentagem de anticorpo permanecerá disponível na superfície da célula após o tratamento inicial, para ligação ao radionuclídeo. Outros alvos de baixa internalização/antígenos associados a tumor também podem ser preferidos.
Por exemplo, em alguns exemplos de realização, o antígeno associado a tumor pode ser CD20 ou HER2. Os números de acesso do GenBank: NP_001005862, NP_004439, XP_005257196 e XP_005257197 divulgam sequências de proteínas Her2, conforme fornecidas pelo GenBank em 4 de outubro de 2013, e a entrada do banco de dados SwissProt P11836 revela uma sequência CD20. Em outros exemplos de realização, o alvo pode ser EGP-1 (glicoproteína-1 epitelial, também conhecida como trofoblasto-2), antígeno p específico do cólon (CSAp) ou uma mucina pancreática MUC1. Vide, por exemplo, Goldenberg et al 2012 (Theranostics 2(5)), que é incorporado ao presente pela referência. Esta referência também descreve anticorpos como Mu-9 que se liga ao CSAp (vide também Sharkey et al Cancer Res. 2003; 63: 354-63), hPAM4 que se liga a MUC1 (vide também Gold et al Cancer Res.
2008: 68: 4819- 26), ligação de valtuzumabe ao CD20 (consulte também Sharkey et al Cancer Res. 2008; 68: 5282-90) e hRS7 que se liga ao EGP-1 (vide também Cubas et al Biochim Biophys Acta 2009; 1796: 309-14). Qualquer uma destes ou porções de ligação ao antígeno podem ser úteis na presente invenção, isto é, podem ser incorporados nos anticorpos descritos na presente invenção.
ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS
[0286] Conforme discutido acima, em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo total ou fragmentos de anticorpo.
[0287] Uma ampla variedade de formatos de anticorpos recombinantes foi desenvolvida no passado recente, por exemplo, anticorpos biespecíficos tetravalentes pela fusão de, por exemplo, uma forma de anticorpo IgG e domínios de cadeia única (vide, por exemplo, Coloma, M.J., et. al. Nature Biotech.15 (1997) 159-163; WO 2001/077342, e Morrison, SL, Nature Biotech.25 (2007) 1233-1234).
[0288] Além disso, vários outros novos formatos foram desenvolvidos em que a estrutura do núcleo dos anticorpos (IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) não é mais retida, como as formas de dia, tria ou tetracorpos, minicorpos, ou várias formas de cadeia única (scFv, Bis-scFv), que são capazes de se ligarem a dois ou mais antígenos, (Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3- 14; Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297).
[0289] Todas as formas usam ligantes tanto para a fusão do núcleo do anticorpo (IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) a uma proteína com maior capacidade de ligação (por exemplo, scFv) como para fundir, por exemplo, dois fragmentos Fab ou scFvs (Fischer, N., Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14).
Tem que se ter em mente que pode ser desejável manter as funções efetoras, tal como, por exemplo, a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), que são mediadas através da ligação ao receptor de Fc, mantendo um alto grau de similaridade com os anticorpos de ocorrência natural.
[0290] No documento WO 2007/024715 são divulgadas imunoglobulinas de domínio variável duplo como proteínas de ligação multivalentes e multiespecíficas modificadas. Um processo para a preparação de dímeros de anticorpos biologicamente ativos é divulgado na US 6.897.044.
As construções de anticorpo Fv multivalente possuindo pelo menos quatro domínios variáveis que estão ligados por ligantes peptídicos são divulgadas na Patente US 7.129.330. Estruturas de ligação ao antígeno diméricas e multiméricas são divulgadas o US 2005/0079170. Uma proteína de ligação ao antígeno monoespecífica tri- ou tetravalente que compreende três ou quatro fragmentos Fab ligados um ao outro de forma covalente por uma estrutura de conexão, que é uma proteína não imunoglobulina natural, é divulgada na US
6.511.663. No documento WO 2006/020258 são divulgados anticorpos biespecíficos tetravalentes que podem ser eficientemente expressos em células procarióticas e eucarióticas, e são úteis em métodos terapêuticos e de diagnóstico. Um método de separação ou preferencialmente de síntese de dímeros que estão ligados por pelo menos uma ligação de bissulfeto intercadeias a partir de dímeros que não estão ligados por meio de pelo menos uma ligação de bissulfeto intercadeias a partir de uma mistura compreendendo os dois tipos de dímeros polipeptídicos é divulgado na publicação US 2005/0163 782. Receptores tetravalentes biespecíficos são divulgados na Patente US 5.959.083. Os anticorpos manipulados com três ou mais sítios de ligação ao antígeno funcionais são divulgados no documento WO 2001/077342.
[0291] Polipeptídeos de ligação ao antígeno multiespecíficos e multivalentes são divulgados no documento WO 1997/001580. O documento WO 1992/004053 divulga homoconjugados, tipicamente preparados a partir de anticorpos monoclonais da classe IgG que se ligam ao mesmo determinante antigênico ligados de forma covalente por reticulação sintética. Anticorpos monoclonais oligoméricos com elevada avidez para o antígeno são divulgados no WO 1991/06305 em que os oligômeros, geralmente da classe IgG, são secretados possuindo dois ou mais monômeros de imunoglobulina associados em conjunto para formar moléculas tetravalentes ou hexavalentes de IgG.
Anticorpos derivados de ovinos e construções de anticorpos modificados são divulgados na US 6.350.860, que podem ser utilizados para tratar doenças em que a atividade do interferon gama é patogênica. Na publicação 2005/0100543 são divulgadas construções direcionáveis que são portadores multivalentes de anticorpos biespecíficos, ou seja, cada molécula de uma construção direcionável pode servir como um transportador de dois ou mais anticorpos biespecíficos. Anticorpos tetravalentes biespecíficos geneticamente manipulados são divulgados na WO 1995/009917. Na WO 2007/109254 são divulgadas moléculas de ligação estabilizadas que consistem ou compreendem um scFv estabilizado.
[0292] Os anticorpos multiespecíficos também podem ser fornecidos em uma forma assimétrica com um cruzamento de domínio em um ou mais braços de ligação da mesma especificidade de antígeno, ou seja, trocando os domínios VH/VL (consulte, por exemplo, WO 2009/080252 e WO 2015/150447), os domínios CH1/CL (consulte, por exemplo, WO 2009/080253) ou os braços Fab completos (consulte, por exemplo, WO 2009/080251, WO 2016/016299, vide também Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, e Klein et al., MAbs 8 (2016) 1010-20). Em um aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um fragmento cross-Fab. O termo “fragmento cross-Fab” ou “fragmento xFab” ou “fragmento Fab crossover” (ou ainda Fab cruzado) refere-se a um fragmento Fab em que as regiões variáveis e regiões constantes da cadeia pesada e leve estão trocadas. Um fragmento cross-Fab compreende uma cadeia polipeptídica composta pela região variável de cadeia leve (VL) e a região constante de cadeia pesada 1 (CH1), e uma cadeia polipeptídica composta pela região variável de cadeia pesada (VH) e a região constante de cadeia leve (CL). Os braços Fab assimétricos também podem ser projetados através da introdução de mutações de aminoácidos carregadas ou não carregadas em interfaces de domínio para direcionar o pareamento correto de Fab. Vide, por exemplo, o documento WO 2016/172485.
[0293] Qualquer um dos formatos acima pode ser usado para anticorpos multiespecíficos de acordo com a presente invenção.
[0294] Em um formato exemplar, o anticorpo biespecífico é um “trimerizador”, por exemplo, conforme descrito no documento WO214/180754. Isto refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno trimérico compreendendo três polipeptídeos de fusão, cada um compreendendo pelo menos uma porção de ligação ao antígeno fundida a um domínio de trimerização derivado da proteína da matriz de cartilagem humana (CMP), em que o referido domínio de trimerização é capaz de mediar a associação estável da molécula de ligação ao antígeno trimérica. As porções de ligação ao antígeno podem ser, por exemplo, uma molécula Fab, uma molécula cross-Fab, um scFab, uma molécula Fv, um scFv ou um anticorpo de domínio único (VHH). Em alguns exemplos de realização, cada uma das proteínas de fusão compreende duas (uma primeira e uma segunda) porções de ligação ao antígeno, por exemplo, onde a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida ao aminoácido N-terminal do referido domínio de trimerização e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida ao aminoácido C-terminal do referido domínio de trimerização, ambos opcionalmente através de um ligante peptídico. Nesse formato, a primeira ou a segunda porção de ligação ao antígeno pode ligar-se o quelato Pb-DOTAM. O outro se ligará ao antígeno alvo, por exemplo, um antígeno associado ao tumor. As três moléculas de ligação ao antígeno fundidas ao C-terminal podem, cada uma, ser específicas para o mesmo antígeno; as três moléculas de ligação ao antígeno fundidas ao N-terminal podem ser cada uma específica para a outra.
[0295] O domínio de trimerização CMP útil na presente invenção foi derivado da proteína da cartilagem humana como mostrado abaixo e em um exemplo de realização compreende uma sequência com pelo menos 95% de identidade e mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a sequência do domínio de trimerização mostrado abaixo. Em um exemplo de realização, o referido domínio de trimerização compreende a sequência do referido domínio de trimerização.
[0296] Sequência da proteína da cartilagem humana (496aa): - MRVLSGTSLM LCSLLLLLQA LCSPGLAPQS RGHLCRTRPT DLVFVVDSSR;
- SVRPVEFEKV KVFLSQVIES LDVGPNATRV GMVNYASTVK QEFSLRAHVS; - KAALLQAVRR IQPLSTGTMT GLAIQFAITK AFGDAEGGRS RSPDISKVVI; - VVTDGRPQDS VQDVSARARA SGVELFAIGV GSVDKATLRQ IASEPQDEHV; - DYVESYSVIE KLSRKFQEAF CVVSDLCATG DHDCEQVCIS SPGSYTCACH; - EGFTLNSDGK TCNVCSGGGG SSATDLVFLI DGSKSVRPEN FELVKKFISQ; - IVDTLDVSDK LAQVGLVQYS SSVRQEFPLG RFHTKKDIKA AVRNMSYMEK; - GTMTGAALKY LIDNSFTVSS GARPGAQKVG IVFTDGRSQD YINDAAKKAK; - DLGFKMFAVG VGNAVEDELR EIASEPVAEH YFYTADFKTI NQIGKKLQKK; - ICVEEDPCAC ESLVKFQAKV EGLLQALTRK LEAVSKRLAI LENTVV.
[0297] Sequência exemplar do domínio de trimerização (39aa): - CACESLVKFQ AKVEGLLQAL TRKLEAVSKR LAILENTVV.
[0298] Outro formato exemplar compreende um anticorpo de comprimento total (por exemplo, uma IgG) compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada de anticorpo e uma primeira e segunda cadeia leve de anticorpo, em que a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve se unem para formar um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno, e em que a segunda cadeia pesada e a segunda cadeia leve se unem para formar um sítio de ligação ao antígeno para o segundo antígeno.
[0299] A montagem correta das cadeias pesadas heterodiméricas pode ser assistida, por exemplo, pelo uso de mutações knob into hole e/ou outras modificações conforme discutido abaixo.
[0300] A montagem correta das cadeias leves com a sua respectiva cadeia pesada pode ser auxiliada pela utilização da tecnologia cross-mAb. Nesta abordagem, a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve, ou a segunda cadeia pesada e a segunda cadeia leve, podem ser montadas para formar um fragmento cross-Fab (cruzado) (enquanto as outras se montam para formar um Fab convencional). Assim, em um exemplo de realização, a primeira cadeia pesada pode compreender um domínio VL no lugar do domínio VH (por exemplo, VL-CH1-dobradiça-CH2-CH3) e a primeira cadeia leve pode compreender um domínio VH trocado pelo domínio VL (por exemplo, VH-CL), ou a primeira cadeia pesada pode compreender um domínio CL no lugar do domínio HC1 (por exemplo, VH-CL-dobradiça-CH2-CH3) e a primeira cadeia leve pode compreender um domínio CH1 no lugar do domínio CL (por exemplo, VL-CH1). Neste exemplo de realização, a segunda cadeia pesada e a segunda cadeia leve têm a estrutura de domínio convencional (por exemplo, VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3 e VL-CL, respectivamente). Em um exemplo de realização alternativa, a segunda cadeia pesada pode compreender um domínio VL no lugar do domínio VH (por exemplo, VL-CH1- dobradiça-CH2-CH3) e a segunda cadeia leve pode compreender um domínio VH trocado pelo domínio VL (por exemplo, VH-CL), ou a segunda cadeia pesada pode compreender um domínio CL no lugar do domínio HC1 (por exemplo, VH-CL-dobradiça-CH2-CH3) e a segunda cadeia leve pode compreender um domínio CH1 no lugar do CL domínio (por exemplo, VL-CH1).
Neste exemplo de realização, a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve têm a estrutura de domínio convencional.
[0301] Em alguns exemplos de realização, a montagem correta das cadeias leves com suas respectivas cadeias pesadas pode, adicional ou alternativamente, ser auxiliada pelo uso de modificação de carga, conforme discutido mais abaixo.
[0302] Tal anticorpo é mostrado na Figura 37 como P1AE1768.
Aqui, a segunda cadeia pesada compreende um domínio CL no lugar do domínio HC1 (por exemplo, VH-CL-dobradiça-CH2-CH3) e a segunda cadeia leve compreende um domínio CH1 no lugar do domínio CL (por exemplo, VL- CH1); a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve têm a estrutura de domínio convencional. O Fab com estrutura convencional compreende modificação de carga. Assim, em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção compreende uma primeira e segunda cadeia pesada de SEQ ID NO: 59 e 58 respectivamente, e uma primeira e segunda cadeia leve de SEQ ID NO: 57 e 60, respectivamente.
[0303] Em alguns exemplos de realização do formato acima, o formato pode ser bivalente. Em outro exemplo de realização possível, outras frações de ligação ao antígeno podem ser fundidas, por exemplo, à primeira e/ou segunda cadeia pesada para aumentar a valência para um ou ambos os antígenos. Por exemplo, outra porção de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno pode ser fundida ao N-terminal de uma ou ambas as moléculas de cadeia pesada. O anticorpo pode ser multivalente, por exemplo, bivalente, para o primeiro antígeno (por exemplo, o antígeno associado ao tumor) e monovalente para o segundo antígeno (por exemplo, Pb quelatado com DOTAM).
[0304] A outra porção de ligação ao antígeno pode ser, por exemplo, um scFab, por exemplo, compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno (por exemplo, o antígeno associado ao tumor). O scFab compreende um domínio VH e CH1, ligado por meio de um ligante polipeptídico a um domínio VL e CL, de modo a ser expresso como uma única cadeia. Em outras palavras, o scFab compreende um ligante polipeptídico entre o Fd e a cadeia leve.
[0305] Em outro exemplo de realização, a outra porção de ligação ao antígeno é um Fab ou um cross-Fab. Por exemplo, o N-terminal ou C- terminal de uma das cadeias pesadas pode ser ligado por meio de um ligante polipeptídico a um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VH e um domínio CH1, que se associa a um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio VL e CL para formar um Fab. Em outro exemplo de realização, o N- terminal ou C-terminal de uma das cadeias pesadas pode ser ligado por meio de um ligante polipeptídico a um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VL e um domínio CH1, que se associa a um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio VH e CL. Em outro exemplo de realização, o N- terminal ou C-terminal de uma das cadeias pesadas pode ser ligado por meio de um ligante polipeptídico a um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VH e um domínio CL, que se associa a um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio VL e CH1.
[0306] Neste formato, pode ser preferido que os braços de ligação da mesma especificidade do antígeno sejam formados por associação com a mesma cadeia leve. Assim, as porções/braços de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno podem ser Fabs cruzados e a(s) porções(s)/braço(s) de ligação ao segundo antígeno podem ser Fabs convencionais. Alternativamente, as porções/braços de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno podem ser Fabs convencionais e a(s) porções(s)/braço(s) de ligação para o segundo antígeno podem ser cross-Fabs.
[0307] O formato também pode incorporar modificação de carga, conforme discutido mais adiante.
[0308] Em um exemplo de realização deste formato, é fornecido um anticorpo multivalente que compreende: - um anticorpo de comprimento total compreendendo uma primeira e segunda cadeia pesada de anticorpo e uma primeira e segunda cadeia leve de anticorpo, em que a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve se reúnem para formar um Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno (por exemplo, um antígeno tumor-específico, por exemplo, CEA), e em que a segunda cadeia pesada e a segunda cadeia leve se reúnem para formar um cross-Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o segundo antígeno (por exemplo, Pb quelatado por DOTAM) (por exemplo, a segunda cadeia pesada tem um domínio VL no lugar de um domínio VH, e a segunda cadeia leve tem um domínio VH no lugar do domínio VL); - e em que a cadeia pesada do primeiro ou do segundo anticorpo é fundida através de um ligante a um polipeptídeo compreendendo um domínio CH1 e VH, e o referido primeiro polipeptídeo é montado com um segundo polipeptídeo compreendendo um CL e VL, de modo que o primeiro e o segundo polipeptídeo se montam para formar um Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno.
[0309] A fusão pode ser no N-terminal de uma das cadeias pesadas do anticorpo de comprimento total, opcionalmente, a segunda cadeia pesada.
[0310] Opcionalmente, também pode ser usada a modificação de carga. Por exemplo, os Fabs que compreendem um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno podem compreender substituições de modificação de carga conforme discutido abaixo.
[0311] Um exemplo de tal formato é P1AE1769 mostrado na Figura 37. Assim, em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção compreende uma primeira e segunda cadeia pesada de SEQ ID NO: 64 e 63 respectivamente, e uma primeira e segunda cadeia leve de SEQ ID NO: 62 e 61, respectivamente.
[0312] Outro formato exemplar compreende um anticorpo de comprimento total, tal como uma IgG compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno (por exemplo, que pode ser divalente para o primeiro antígeno), ligado a uma porção de ligação ao antígeno para o segundo antígeno.
[0313] Por exemplo, a porção de ligação ao antígeno para o segundo antígeno pode ser um scFab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o segundo antígeno (por exemplo, o quelato Pb-DOTAM). Em alguns exemplos de realização, o scFab pode ser fundido ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do anticorpo de comprimento total, por exemplo, no C-terminal de seu domínio CH3. A montagem correta das cadeias pesadas heterodiméricas pode ser assistida, por exemplo, pelo uso de mutações knob into hole e/ou outras modificações conforme discutido abaixo.
Tal anticorpo é exemplificado na Figura 37 como P1AE1770. Assim, em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção compreende cadeias pesadas de SEQ ID NO: 66 e 67, e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 65.
[0314] Outro formato exemplar compreende um anticorpo de comprimento total compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno (por exemplo, que pode ser divalente para o primeiro antígeno), em que o N-terminal ou C-terminal de uma das cadeias pesadas são ligadas por meio de um ligante polipeptídico a um primeiro polipeptídeo e em que o primeiro polipeptídeo se associa a um segundo polipeptídeo para formar um Fab ou um cross-Fab compreendendo um sítio de ligação para o segundo antígeno. Por exemplo, este formato pode incluir: i) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VH e um domínio CH1, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio a VL e CL; ou ii) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VL e um domínio CH1, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio CL e VH; ou iii) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VH e um domínio CL, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio VL e CH1; e - de modo que o primeiro e o segundo polipeptídeo juntos formam um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno.
[0315] A montagem correta das cadeias pesadas heterodiméricas pode ser assistida, por exemplo, pelo uso de mutações knob into hole e/ou outras modificações conforme discutido abaixo, incluindo modificações de carga. Por exemplo, os domínios Fab do anticorpo de comprimento total podem incluir modificações de carga.
[0316] Em um exemplo de realização, o primeiro polipeptídeo está ligado por meio de um ligante polipeptídico ao C-terminal de uma das cadeias pesadas, por exemplo, no C-terminal de seu domínio CH3. O primeiro polipeptídeo pode compreender um domínio VL N-terminal e um domínio CH1 C-terminal. Assim, a cadeia pesada com a fusão pode compreender do N- para o C-terminal; VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3-ligante-VL-CH1. A cadeia leve pode compreender VH-CL. Os Fabs do anticorpo de comprimento total podem incluir substituições de modificação de carga. Uma desses exemplos de realização é mostrado na Figura 37 como P1AE1767. Assim, em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção compreende cadeias pesadas de SEQ ID NO: 63 e 64, e cadeias leves de SEQ ID NO: 61 e 62.
[0317] Em outro exemplo de realização, o primeiro polipeptídeo é ligado por meio de um ligante polipeptídico ao N-terminal do domínio VH da cadeia pesada. O primeiro polipeptídeo pode compreender um domínio VL N- terminal e um domínio CH1 C-terminal. Assim, a cadeia pesada com a fusão pode compreender do N- para o C-terminal: VL-CH1-ligante-VH-CH1-
dobradiça-CH2-CH3. A cadeia leve pode compreender VH-CL.
[0318] Em outro formato exemplar, o anticorpo pode compreender um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente a um primeiro antígeno e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo, em que o C-terminal de cada uma das cadeias pesadas é fundido a uma porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao segundo antígeno.
[0319] Em um exemplo de realização, o primeiro antígeno é o alvo, por exemplo, o antígeno específico do tumor e o segundo é o quelato Pb- DOTAM, mas estes também podem ser revertidos.
[0320] Em outro formato exemplar, o anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico compreendendo: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente a um primeiro antígeno e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo; b) um polipeptídeo consistindo em: i) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH); ou ii) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); ou iii) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VH através de um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; c) um polipeptídeo consistindo em: i) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL); ou ii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; - e em que o domínio variável de cadeia pesada VH do anticorpo do peptídeo em (b), e o domínio variável de cadeia leve do anticorpo do peptídeo sob (c) em conjunto formam um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno.
[0321] Neste formato, se o primeiro polipeptídeo é tal como definido em b (i), em seguida, o segundo polipeptídeo é tal como definido em C(i); se o primeiro polipeptídeo é conforme estabelecido em b(ii), então o segundo polipeptídeo é conforme estabelecido em c(ii); e se o primeiro polipeptídeo é conforme estabelecido em b(iii), então o segundo polipeptídeo é conforme estabelecido em c(iii). As substituições de modificação de carga também podem ser usadas, por exemplo, nos Fabs do anticorpo de comprimento total.
[0322] Neste formato, o primeiro ou o segundo antígeno pode ser DOTAM-Pb quelatado. O outro pode ser alvo, por exemplo, um antígeno associado a tumor, por exemplo, CEA, CD20 ou ERBB2. Em alguns exemplos de realização, o segundo antígeno é Pb quelatado por DOTAM e o primeiro antígeno é o alvo.
[0323] O anticorpo descrito acima pode ser trivalente. Em outro exemplo de realização possível, outras frações de ligação ao antígeno podem ser fundidas para aumentar a valência para um ou ambos os antígenos. Por exemplo, outra porção de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno pode ser fundida ao carboxi-terminal de qualquer uma ou ambas as cadeia pesada do anticorpo de comprimento total (por exemplo, o antígeno associado ao tumor), por exemplo, de modo que o anticorpo tenha um valência de 4 para o primeiro antígeno (onde é fundido ao carboxi-terminal de ambas as cadeias pesadas) e uma valência de 1 para o segundo antígeno.
[0324] Exemplos do formato acima, no qual o anticorpo de (b) consiste de um domínio VH e o anticorpo de (c) consiste de um domínio VL é PRIT-213 e PRIT214. Um exemplo do formato acima em que (b) consiste em um domínio VH e um domínio CL, e (c) consiste em um domínio VL e um domínio CH1 é P1AE1766, como mostrado na Figura 37. Assim, em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção compreende uma primeira e segunda cadeia pesada de SEQ ID NO: 51 e 52 respectivamente, e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 50.
[0325] Opcionalmente, o formato utilizado para os anticorpos multiespecíficos da presente invenção pode ser o formato trivalente tal como descrito no documento WO2010/115589 A1 (Roche Glycart AG), que é integralmente incorporado ao presente pedido por referência.
[0326] O documento WO 2010/115589 descreve a estabilização opcional da estrutura, em que a região variável de cadeia pesada do anticorpo (VH) do polipeptídeo na alínea (b) e o domínio de anticorpo variável de cadeia leve (VL) do polipeptídeo na alínea (c) estão ligados e estabilizados através uma ligação dissulfídica intercadeia, por exemplo, por introdução de uma ligação dissulfídica entre as seguintes posições: i) posição 44 do domínio variável de cadeia pesada com a posição 100 do domínio variável de cadeia leve; ii) posição 105 do domínio variável de cadeia pesada com a posição 43 do domínio variável de cadeia leve; ou iii) posição 101 do domínio variável de cadeia pesada com a posição 100 do domínio variável de cadeia leve (numerando sempre de acordo com o índice EU de Kabat).
[0327] O documento WO 2010/115589 descreve também que os domínios CH3 do referido anticorpo de comprimento total, de acordo com a invenção, podem ser alterados pela tecnologia “knob-into-holes” que está descrita em detalhes com alguns exemplos, por exemplo, no documento WO 96/027011 e Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621, e Merchant, A.M., et al, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681.
[0328] Assim, em alguns exemplos de realização, o referido anticorpo biespecífico trivalente é caracterizado adicionalmente por: o domínio CH3 de uma cadeia pesada do anticorpo de comprimento total e o domínio CH3 da outra cadeia pesada do anticorpo de comprimento total se encontram cada um em uma interface que compreende um interface original entre os domínios CH3 do anticorpo; em que a referida interface é alterada para promover a formação do anticorpo biespecífico trivalente, em que a alteração é caracterizada pelo fato de que: a) o domínio CH3 de uma cadeia pesada é alterado, - de modo que dentro da interface original o domínio CH3 de uma cadeia pesada que encontra a interface original do domínio CH3 da outra cadeia pesada dentro do anticorpo biespecífico trivalente; - um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral de maior volume, gerando uma protuberância dentro da interface do domínio CH3 de uma cadeia pesada que é posicionável em uma cavidade dentro da interface do domínio CH3 da outra cadeia pesada; e; b) o domínio CH3 da outra cadeia pesada é alterado, - de modo que, dentro da interface original do segundo domínio CH3 que encontra a interface original do primeiro domínio CH3 dentro do anticorpo biespecífico trivalente um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido possuindo um volume de cadeia lateral menor, gerando assim uma cavidade dentro da interface do segundo domínio CH3 dentro do qual uma protuberância dentro da interface do primeiro domínio CH3 é posicionável.
[0329] O referido resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral de volume maior pode ser opcionalmente selecionado a partir do grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W). O referido resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral de volume menor pode ser ocpionalmente selecionado a partir do grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).
[0330] Opcionalmente, em alguns exemplos de realização, ambos os domínios CH3 são adicionalmente alterados pela introdução de cisteína (C) como aminoácido nas posições correspondentes de cada domínio CH3, de modo que uma ponte de bissulfeto entre os dois domínios CH3 pode ser formada.
[0331] Estes e outros detalhes do formato de anticorpo biespecífico, trivalente, tal como descrito no documento WO2010/115589 A1 podem ser utilizados na presente invenção.
[0332] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “anticorpo de comprimento total” ou “anticorpo completo” denota um anticorpo que consiste em duas “cadeias pesadas de anticorpo de comprimento total” e duas “cadeias leves de anticorpo de comprimento total”. Uma “cadeia pesada de anticorpo de comprimento total” pode ser um polipeptídeo constituído na direção N-terminal para C-terminal de; um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH), um domínio constante 1 de cadeia pesada de anticorpo (CH1), uma região da dobradiça do anticorpo (HR), um domínio constante 2 de cadeia pesada de anticorpo (CH2), e um domínio constante 3 de cadeia pesada de anticorpo (CH3), abreviado como VH-CH1-HR-CH2-CH3; e, opcionalmente, um domínio constante de cadeia pesada 4 de anticorpo (CH4) em caso de um anticorpo da subclasse IgE. Preferencialmente a “cadeia pesada de anticorpo de comprimento total” é um polipeptídeo que consiste da direção N-terminal para C-terminal de: VH, CH1, HR, CH2 e CH3. A possibilidade de formação de cross-Mab não pretende ser excluída pela referência a “comprimento total” - assim, a cadeia pesada pode ter o domínio VH trocado por um domínio VL ou o domínio CH1 trocado por um domínio CL.
Uma “cadeia leve de anticorpo de comprimento total” pode ser um polipeptídeo que consiste na direção N-terminal para C-terminal de um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL), abreviado como VL-CL. Alternativamente, no caso de um cross- Mab, o domínio VL pode ser trocado por um domínio VH ou o domínio CL pode ser trocado por um domínio CH1. O domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL) pode ser κ (kappa) ou λ (lambda). As duas cadeias de anticorpo de comprimento total estão ligadas entre si por meio de ligações dissufídicas interpolipeptídicas entre o domínio CL e o domínio CH1 e entre as regiões de dobradiça das cadeias pesadas de anticorpo de comprimento total. Exemplos de anticorpos típicos de comprimento total são anticorpos naturais como IgG (por exemplo IgG1 e IgG2), IgM, IgA, IgD, e IgE). Os anticorpos de comprimento total de acordo com a invenção podem ser de uma única espécie, por exemplo, de humanos, ou eles podem ser anticorpos quimerizados ou humanizados. Os anticorpos de comprimento total, como aqueles descritos na presente invenção, compreendem dois sítios de ligação ao antígeno, cada um formado por um par de VH e VL. O C-terminal da cadeia pesada ou leve do dito anticorpo de comprimento total denota o último aminoácido no C-terminal da referida cadeia pesada ou leve.
[0333] O N-terminal do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo (VH) do polipeptídeo em b) e o domínio variável de cadeia leve do anticorpo (VL) do polipeptídeo em c) denota o último aminoácido no N-terminal do domínio VH ou VL.
[0334] Em qualquer um dos formatos descritos acima, o primeiro antígeno pode ser um antígeno associado ao tumor e o segundo antígeno pode ser Pb-DOTAM, (mas estes também podem ser revertidos em alguns exemplos de realização).
[0335] Em qualquer um dos formatos descritos acima, a montagem correta de heterodímeros de cadeia pesada pode ser auxiliada por modificações na sequência da cadeia pesada. Em um exemplo de realização, é utilizada a tecnologia knob-into-hole. As superfícies de interação dos dois domínios CH3 podem ser alteradas para aumentar a heterodimerização de ambas as cadeias pesadas contendo esses dois domínios CH3. Cada um dos dois domínios CH3 (das duas cadeias pesadas) pode ser “knob” (protuberância), enquanto o outro é “hole” (cavidade). Por exemplo, uma das cadeias compreende as chamadas “mutações knob” (T366W e opcionalmente uma dentre S354C ou Y349C, preferencialmente Y349C) e a outra compreende as chamadas “mutações hole” (T366S, L368A e Y407V e, opcionalmente, Y349C ou S354C, preferencialmente Y349C) (vide, por exemplo, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2(1996)73) de acordo com o sistema de numeração índice EU.
[0336] A introdução de uma ligação de bissulfeto (ponte de bissulfeto) pode adicionalmente ou alternativamente estabilizar os heterodímeros (Merchant, A.M. et al., Nature Biotech 16(1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) e aumenta o rendimento. Os exemplos incluem a introdução de uma ligação dissulfídica entre as seguintes posições: i) posição 44 do domínio variável de cadeia pesada com a posição 100 do domínio variável de cadeia leve;
ii) posição 105 do domínio variável de cadeia pesada com a posição 43 do domínio variável de cadeia leve; ou iii) posição 101 do domínio variável de cadeia pesada com a posição 100 do domínio variável de cadeia leve (numerando sempre de acordo com o índice EU de Kabat).
MODIFICAÇÕES DE CARGA
[0337] Os anticorpos multiespecíficos da invenção podem compreender substituições de aminoácidos nas moléculas Fab compreendidas nelas que são particularmente eficientes na redução do pareamento incorreto de cadeias leves com cadeias pesadas não correspondentes (subprodutos do tipo Bence-Jones), que pode ocorrer na produção de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas/multiespecíficas baseadas em Fab com uma troca VH/VL em um (ou mais, no caso de moléculas que compreendem mais de duas moléculas Fab de ligação ao antígeno) de seus braços de ligação (veja também a Publicação PCT WO 2015/150447, particularmente os exemplos aí descritos, integralmente incorporados ao presente como referência). A proporção de anticorpos multiespecíficos desejados em comparação com subprodutos indesejados, em particular subprodutos do tipo Bence Jones que ocorrem em um de seus braços de ligação, pode ser melhorada pela introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos nos domínios CH1 e CL da molécula Fab (por vezes referido como “modificações de carga”).
[0338] Por esse motivo, em alguns exemplos de realização, os anticorpos da presente invenção, compreendendo moléculas Fab, compreende, pelo menos, um Fab com um domínio CH1 de domínio constante de cadeia pesada que compreende modificações de carga, tal como descrito na presente invenção, e um domínio CL de domínio constante de cadeia leve compreendendo modificações de carga, tal como descrito na presente invenção.
[0339] As modificações de carga são feitas nas moléculas Fab convencionais compreendidas nos anticorpos da presente invenção (tal como mostrado, por exemplo, na Figura 37: P1AE1766, P1AE1767 P1AE1768, P1AE1769), ou na(s) molécula(s) Fab crossover (cruzadas) compreendidas nos anticorpos da presente invenção (mas não em ambos). Em exemplos de realização específicos, as modificações de carga são feitas na(s) moléculas) Fab convencional(ais) compreendidas nos anticorpos da presente invenção (que em exemplos de realização específicos ligam-se especificamente ao antígeno da célula alvo).
[0340] Consequentemente, em alguns exemplos de realização os anticorpos da presente invenção, que compreende a) uma primeira ligação de um primeiro antígeno (por exemplo, um antígeno associado a um tumor) e b) uma segunda porção de ligação a um segundo antígeno (por exemplo, ligação DOTAM-Pb) em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno biespecífica são ambas moléculas Fab e uma das porções de ligação ao antígeno (em alguns exemplos de realização, particularmente a segunda porção de ligação ao antígeno) é um fragmento cross-Fab, uma das moléculas Fab compreende um domínio CH1 compreendendo modificações de carga como descrito na presente invenção, e um domínio CL compreendendo modificações de carga como descrito na presente invenção. Pode ser preferido que o Fab compreendendo as modificações de carga seja o Fab convencional (não cruzado), por exemplo, em alguns exemplos de realização é a porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno.
[0341] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem compreender ainda uma terceira molécula Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno. Em exemplos de realização específicos, a referida terceira molécula Fab é idêntica à primeira molécula Fab em a). Nestes exemplos de realização, as substituições de aminoácidos de acordo com os seguintes exemplos de realização (modificações de carga) podem ser feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 de cada uma da primeira molécula Fab e da terceira molécula Fab. Alternativamente, as substituições de aminoácidos de acordo com os seguintes exemplos de realização podem ser feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da segunda molécula Fab em b), mas não no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da primeira molécula Fab e a terceira molécula Fab.
[0342] Em alguns exemplos de realização, em uma molécula Fab compreendendo um domínio constante de cadeia leve CL compreendendo modificações de carga e um domínio constante de cadeia pesada CH1 compreendendo modificações de carga, as modificações de carga no domínio constante de cadeia leve CL estão na posição 124 e opcionalmente na posição 123 (numeração de acordo com Kabat), e as modificações de carga no domínio constante de cadeia pesada CH1 estão na posição 147 e/ou 213 (numeração de acordo com Kabat).
[0343] Em alguns exemplos de realização, no domínio constante de cadeia leve CL, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido é substituído independentemente por lisina (K)), e - no domínio constante de cadeia pesada CH1 o aminoácido na posição 147 e/ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por um ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[0344] Em outro exemplo de realização, no domínio constante de cadeia leve CL, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido é substituído independentemente por lisina (K) ou arginina (R)), e no domínio constante de cadeia pesada CH1, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat).
[0345] Em um exemplo de realização adicional, no domínio constante de cadeia leve CL, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), (em um exemplo de realização preferido é substituído independentemente por lisina (K) ou arginina (R)), e no domínio constante de cadeia pesada CH1, o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[0346] Em outro exemplo de realização, no domínio constante de cadeia leve CL do aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (em um exemplo de realização preferido é substituído independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante de cadeia pesada CH1 o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat).
[0347] Em outro exemplo de realização, no domínio constante de cadeia leve, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido é substituído independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e o aminoácido na posição 123 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido é substituído independentemente por lisina (K) ou arginina (R)), - e no domínio constante de cadeia pesada CH1 o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice de Kabat UE) e o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por glutâmico ácido (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[0348] Em outro exemplo de realização, no domínio constante de cadeia leve CL, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), - e no domínio constante de cadeia pesada CH1 o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com índice de Kabat UE) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com índice EU de Kabat).
[0349] Em outro exemplo de realização, no domínio constante de cadeia leve CL, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat), - e no domínio constante de cadeia pesada CH1 o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com índice de Kabat UE) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com índice EU de Kabat).
[0350] Em outro exemplo de realização, no domínio constante de cadeia leve CL, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), - e em um domínio constante de cadeia pesada CH1 o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com índice de Kabat UE) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat).
[0351] Em outro exemplo de realização, no domínio constante de cadeia leve CL, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat), - e no domínio constante de cadeia pesada CH1 o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com índice de Kabat UE) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat).
[0352] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada e uma primeira cadeia leve que se liga especificamente a um primeiro antígeno e uma segunda cadeia pesada e uma segunda cadeia leve que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que a) o domínio constante CL da primeira cadeia leve e o domínio constante CH1 da primeira cadeia pesada compreendem substituições de variantes de carga descritas na presente invenção; e b) o domínio constante de cadeia leve CL e o domínio constante de cadeia pesada CH1 da segunda cadeia leve e a segunda cadeia pesada são substituídos um pelo outro (formando assim um cross-Fab). Um exemplo de tal arranjo é mostrado para P1AE1768.
[0353] Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende: - um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente a um primeiro antígeno e consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que os dois domínios constantes de cadeia pesada CH1 e os dois domínios constantes de cadeia leve CL do anticorpo de comprimento total compreendem modificações de carga conforme descrito na presente invenção; e - um scFab compreendendo um domínio VH e CH1 ligado por meio de um polipeptídeo ligante a um domínio a VL e CL (VH-CH1-ligante-VL- CL), em que scFab fundido ao N-terminal de uma das cadeias pesadas, e em que o scFab forma um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno.
Um exemplo de tal arranjo é P1AE1770.
[0354] Em outro exemplo de realização, o anticorpo multiespecífico compreende um anticorpo de comprimento total compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno (por exemplo, que pode ser bivalente para o primeiro antígeno), em que os dois domínios constantes de cadeia pesada CH1 e os dois domínios constantes de cadeia leve CL do anticorpo de comprimento total compreendem as modificações de carga conforme descrito na presente invenção, - e em que o C-terminal de uma das cadeias pesadas (por exemplo, o C-terminal de seu domínio CH3) está ligado por meio de um polipeptídeo ligante a um primeiro polipeptídeo e em que o primeiro polipeptídeo se associa com um segundo polipeptídeo para formar um cross- Fab compreendendo um sítio de ligação para o segundo antígeno.
[0355] O primeiro polipeptídeo pode compreender um domínio VL N-terminal e um domínio CH1 C-terminal. Assim, a cadeia pesada com a fusão pode compreender do N- para o C-terminal; VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3- ligante-VL-CH1. A cadeia leve pode compreender VH-CL. Um exemplo de tal arranjo é P1AE1767.
[0356] Em um exemplo de realização adicional, anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico compreendendo: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente a um primeiro antígeno e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo, em que o domínio CH1 das cadeias pesadas e o domínio CL das cadeias leves compreendem modificações de carga conforme descrito na presente invenção; b) um polipeptídeo consistindo em: i) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH); ou ii) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); ou iii) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VH através de um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; c) um polipeptídeo consistindo em: i) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL); ou ii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; - e em que o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo do peptídeo em (b), e o domínio variável de cadeia leve do anticorpo do peptídeo sob (c) em conjunto formam um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno. Exemplos de tais arranjos são PRIT-213 e p1AE1766.
[0357] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo da invenção compreende a) um primeira porção de ligação ao antígeno liga-se a um primeiro antígeno, b) uma segunda porção de ligação ao antígeno liga-se a um segundo antígeno, e c) uma terceira porção de ligação ao antígeno liga-se ao primeiro antígeno, em que a primeira, segunda e terceira porção de ligação ao antígeno do anticorpo são todas moléculas Fab, e em uma das porções de ligaçaõ ao antígeno (particularmente a segunda porção de ligação ao antígeno) os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e a cadeia pesada Fab, respectivamente são substituídas entre si, em que: i) as substituições de aminoácidos de acordo com os exemplos de realização acima são feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 de cada uma da primeira molécula Fab e da terceira molécula Fab, mas não no domínio constante CL e no domínio constante CH1 do segunda molécula Fab em b); ou ii) as substituições de aminoácidos de acordo com os exemplos de realização acima são feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da segunda molécula Fab em b), mas não no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da primeira molécula Fab e a terceira molécula Fab. Em alguns exemplos de realização, as modificações de carga estão presentes no Fab convencional (não trocado/cruzado): assim, por exemplo, quando a segunda porção de ligação ao antígeno é um cross-Fab, a opção (i) é preferida.
[0358] Em um exemplo de realização específico, um anticorpo multivalente da invenção compreende: - um anticorpo de comprimento total compreendendo uma primeira e segunda cadeia pesada de anticorpo e uma primeira e segunda cadeia leve de anticorpo, em que a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve se reúnem para formar um Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno (por exemplo, um antígeno tumor-específico,
por exemplo, CEA), e em que a segunda cadeia pesada e a segunda cadeia leve se reúnem para formar um cross-Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o segundo antígeno (por exemplo, Pb quelatado por DOTAM) (por exemplo, a segunda cadeia pesada tem um domínio VL no lugar de um domínio VH, e a segunda cadeia leve tem um domínio VH no lugar do domínio VL); - e em que a cadeia pesada do primeiro ou do segundo anticorpo é fundida através de um ligante a um polipeptídeo compreendendo um domínio CH1 e VH, e o referido primeiro polipeptídeo é montado com um segundo polipeptídeo compreendendo um CL e VL, de modo que o primeiro e o segundo polipeptídeo se montam para formar um Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno; e - em que o domínio CH1 da primeira cadeia pesada e o domínio CL da primeira cadeia leve compreendem modificações de carga como descrito na presente invenção.
[0359] O domínio CH1 do primeiro polipeptídeo e o domínio CL do segundo polipeptídeo também podem compreender modificações de carga como descrito na presente invenção.
[0360] A fusão pode ser no N-terminal de uma das cadeias pesadas do anticorpo de comprimento total, opcionalmente, a segunda cadeia pesada. Um exemplo de tal arranjo é P1AE1769.
ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS QUE SE LIGAM AO PB-DOTAM E CEA
[0361] Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que os anticorpos da presente invenção sejam multiespecíficos, por exemplo, anticorpos biespecíficos, que se ligam ao Pb-DOTAM e ao CEA. Assim, eles compreendem um sítio de ligação ao antígeno para o quelato Pb-DOTAM e um sítio de ligação ao antígeno para o CEA. Em tais exemplos de realização, o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM pode estar de acordo com qualquer um dos exemplos de realização descritos na presente divulgação. O formato pode ser qualquer um dos formatos descritos na presente divulgação.
[0362] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CEA pode ligar-se com um valor Kd de 1 nM ou menos, 500 pM ou menos, 200 pM ou menos, 100 pM ou menos para ligação monovalente.
[0363] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CEA pode compreender pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas a partir de (a): - CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (e) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e (f) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
[0364] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CEA pode compreender pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VH selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
[0365] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CEA compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDRs VL selecionadas a partir de (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
[0366] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CEA compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VH selecionadas a partir de (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, e (iii) CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 13; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VL selecionadas a partir de (i) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, (ii) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
[0367] Em outro aspecto, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CEA compreende (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (e) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e (f) CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 16.
[0368] Em qualquer um dos exemplos de realização acima, o anticorpo multiespecífico pode ser humanizado. Em um exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno anti-CEA compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização acima, e compreende ainda uma região estrutural aceptora humana, por exemplo, uma região estrutural de imunoglobulina humana ou uma região estrutural de consenso humano.
[0369] Em outro exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CEA compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) sequência possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Em alguns exemplos de realização, uma sequência VH possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas o sítio de ligação ao antígeno compreendendo tal sequência retém a capacidade de ligar-se ao CEA, preferencialmente com a afinidade tal como estabelecido acima. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 17. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CEA compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 17, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em um exemplo de realização específico, a VH compreende uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
[0370] Em outro exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CEA compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em alguns exemplos de realização, uma sequência VL possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas o sítio de ligação ao antígeno compreendendo tal sequência retém a capacidade de ligar-se ao CEA, preferencialmente com a afinidade tal como estabelecido acima. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 18. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno para o CEA compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 18, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em um exemplo de realização específico, a VL compreende uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
[0371] Em outro exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CEA compreende uma VH como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima, e uma VL como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende a sequência VH e VL de SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais destas sequências.
[0372] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico pode ligar-se ao mesmo epítopo CEA como um anticorpo PRIT- 0213 ou PRIT-0214 fornecido na presente invenção.
ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS QUE SE LIGAM AO PB-DOTAM E ERBB2
[0373] Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que os anticorpos da presente invenção sejam multiespecíficos, por exemplo, anticorpos biespecíficos, que se ligam ao Pb-DOTAM e ao ERBB2. Assim, eles compreendem um sítio de ligação ao antígeno para o quelato Pb-DOTAM e um sítio de ligação ao antígeno para o ERBB2. Em tais exemplos de realização, o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM pode estar de acordo com qualquer um dos exemplos de realização descritos na presente divulgação. O formato pode ser qualquer um dos formatos descritos na presente divulgação.
[0374] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao ERBB2 pode ligar-se com um valor Kd de 1 nM ou menos, 500 pM ou menos, 200 pM ou menos, 100 pM ou menos para ligação monovalente.
[0375] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao ERBB2 pode compreender pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas a partir de (a): - CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NO: 28; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (e) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; e (f) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
[0376] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao ERBB2 pode compreender pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VH selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, e CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.
[0377] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao ERBB2 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDRs VL selecionadas a partir de (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
[0378] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao ERBB2 compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VH selecionadas a partir de (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e (iii) CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 30; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VL selecionadas a partir de (i) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, (ii) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
[0379] Em outro aspecto, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao ERBB2 compreende (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (e) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; e (f) CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 33.
[0380] Em qualquer um dos exemplos de realização acima, o anticorpo multiespecífico pode ser humanizado. Em um exemplo de realização,
o sítio de ligação ao antígeno anti-ERBB2 compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização acima, e compreende ainda uma região estrutural aceptora humana, por exemplo, uma região estrutural de imunoglobulina humana ou uma região estrutural de consenso humano.
[0381] Em outro exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao ERBB2 compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) sequência possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. Em alguns exemplos de realização, uma sequência VH possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas o sítio de ligação ao antígeno compreendendo tal sequência retém a capacidade de ligar-se ao ERBB2, preferencialmente com a afinidade tal como estabelecido acima. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 34. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao ERBB2 compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 34, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em um exemplo de realização específico, a VH compreende uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.
[0382] Em outro exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao ERBB2 compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Em alguns exemplos de realização, uma sequência VL possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas o sítio de ligação ao antígeno compreendendo tal sequência retém a capacidade de ligar-se ao ERBB2, preferencialmente com a afinidade tal como estabelecido acima. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 35. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs).
Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno para o CEA compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 35, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em um exemplo de realização específico, a VL compreende uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
[0383] Em outro exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao ERBB2 compreende uma VH como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima, e uma VL como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende a sequência VH e VL de SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 35, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais destas sequências.
[0384] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico pode ligar-se ao mesmo epítopo do ERBB2 com um anticorpo
P1AD9827 fornecido na presente invenção.
ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS QUE SE LIGAM AO PB-DOTAM E CD20
[0385] Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que os anticorpos da presente invenção sejam multiespecíficos, por exemplo, anticorpos biespecíficos, que se ligam ao Pb-DOTAM e ao CD20. Assim, eles compreendem um sítio de ligação ao antígeno para o quelato Pb-DOTAM e um sítio de ligação ao antígeno para o CD20. Em tais exemplos de realização, o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM pode estar de acordo com qualquer um dos exemplos de realização descritos na presente divulgação. O formato pode ser qualquer um dos formatos descritos na presente divulgação.
[0386] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD20 pode ligar-se com um valor Kd de 1 nM ou menos, 500 pM ou menos, 200 pM ou menos, 100 pM ou menos para ligação monovalente.
[0387] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD20 pode compreender pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas a partir de (a): - CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (e) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; e (f) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
[0388] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD20 pode compreender pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VH selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41. Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44. Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, e CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.
[0389] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD20 compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDRs VL selecionadas a partir de (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
[0390] Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD20 compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VH selecionadas a partir de (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
39, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, e (iii) CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 41; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências CDR-VL selecionadas a partir de (i) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, (ii) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
[0391] Em outro aspecto, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD20 compreende (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (e) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; e (f) CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 44.
[0392] Em qualquer um dos exemplos de realização acima, o anticorpo multiespecífico pode ser humanizado. Em um exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno anti-CD20 compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização acima, e compreende ainda uma região estrutural aceptora humana, por exemplo, uma região estrutural de imunoglobulina humana ou uma região estrutural de consenso humano.
[0393] Em outro exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD20 compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) sequência possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45. Em alguns exemplos de realização, uma sequência VH possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%,
94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas o sítio de ligação ao antígeno compreendendo tal sequência retém a capacidade de ligar-se ao CD20, preferencialmente com a afinidade tal como estabelecido acima. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 45. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD20 compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 45, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em um exemplo de realização específico, a VH compreende uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; e (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.
[0394] Em outro exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD20 compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. Em alguns exemplos de realização, uma sequência VL possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas o sítio de ligação ao antígeno compreendendo tal sequência retém a capacidade de ligar-se ao CD20, preferencialmente com a afinidade tal como estabelecido acima. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID
NO: 46. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o sítio de ligação ao antígeno para o CD20 compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 46, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em um exemplo de realização específico, a VL compreende uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (b) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; e (c) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
[0395] Em outro exemplo de realização, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD20 compreende uma VH como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima, e uma VL como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende a sequência VH e VL de SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais destas sequências.
[0396] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico pode ligar-se ao mesmo epítopo do CD20 com um anticorpo P1AD9826 fornecido na presente invenção.
ANTICORPOS VARIANTES
[0397] Em determinados exemplos, são contempladas sequências de aminoácidos variantes dos anticorpos fornecidos na presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As sequências de aminoácidos variantes de um anticorpo podem ser preparadas pela introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica o anticorpo ou pela síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para se chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.
VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E DELEÇÃO
[0398] Em certos exemplos de realização, são fornecidos variantes de anticorpos possuindo uma ou mais substituições de aminoácidos.
Os sítios de interesse para mutagênese de substituição incluem as HVRs (CDRs) e FRs. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 1 sob o título de “substituições preferidas”. Alterações mais substanciais são fornecidas na Tabela 1 sob o título de “substituições exemplares”, e conforme descrito abaixo em referência às classes de cadeias laterais de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, uma ligação ao antígeno melhorada/mantida, diminuição da imunogenicidade, ou ADCC ou CDC melhorada. TABELA 1 Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu
Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu
[0399] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns da cadeia lateral: (1) Hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação de cadeia: Gly, Pro; e (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
[0400] Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[0401] Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano e humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para um estudo mais aprofundado terá(ão) modificações (por exemplo, melhorias) em certas propriedades biológicas (por exemplo, aumento da afinidade,
imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental e/ou terá(ão) certas propriedades biológicas do anticorpo parental substancialmente retidas.
Uma variante de substituição exemplar é um anticorpo de afinidade maturada que pode ser facilmente gerado, por exemplo, usando técnicas de maturação de afinidade baseadas na exibição por fagos, tal como aquelas descritas no presente. Resumidamente, um ou mais resíduos da HVR está mutado e os anticorpos variantes são apresentados no fago e rastreados por uma atividade biológica específica (por exemplo, a afinidade de ligação).
[0402] As alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para melhorar a afinidade do anticorpo. Tais alterações podem ser feitas em “hotspots” da HVR, ou seja, os resíduos codificados pelos códons que são submetidos à mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (vide, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol.
207:179-196 (2008)), e/ou resíduos que contatam o antígeno, com a variante de VH ou VL resultante testada pela afinidade de ligação. A maturação por afinidade através da construção e reseleção a partir de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., Ed., Human Press, Totowa, NJ (2001)). Em alguns exemplos de realização de maturação de afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidos para a maturação por qualquer um dentre uma variedade de métodos (por exemplo, PCR sujeito a erros, embaralhamento (shuffling) de cadeias, ou mutagênese dirigida de oligonucleotídeos). Uma biblioteca secundária é então criada. A biblioteca é então pesquisada para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens dirigidas à HVR, nas quais vários resíduos HVR (por exemplo, 4 a 6 resíduos de cada vez) são distribuídos aleatoriamente. Os resíduos HVR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, utilizando a mutagênese por scanning de alanina (Ala-scan) ou modelação. Particularmente a CDR-H3 e CDR-L3 são alvos frequentes.
[0403] Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade dos anticorpos de se ligarem ao antígeno. Por exemplo, podem ser feitas alterações conservadoras (por exemplo, substituições conservadoras conforme previsto na presente invenção) nas HVRs que não reduzam substancialmente a afinidade de ligação. Tais alterações podem, por exemplo, estar fora dos resíduos de contato ao antígeno nas HVRs. Em certos exemplos de realização das sequências VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR está inalterada, ou não possui mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.
[0404] Um método útil para a identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser direcionados para mutagênese é denominado de “mutagênese de varredura de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells, (1989) Science, 244: 1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvos (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp, His, Lys e Glu) é identificado e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativamente ou adicionalmente, uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno pode ser analisada. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser selecionados ou eliminados como candidatos a substituição. As variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.
[0405] As inserções de sequências de aminoácidos incluem:
fusões carbóxi- e/ou amino-terminais que variam de comprimento desde um resíduo, até polipeptídeos que possuem cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequências de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos.
Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo com uma enzima (por exemplo, ADEPT) ou um polipeptídeo que aumente a meia vida do anticorpo no soro.
VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO
[0406] Em determinadas realizações, um anticorpo previsto na invenção é alterado para aumentar ou diminuir o grau em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação em um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de modo que um ou mais sítios de glicosilação é criado ou removido.
[0407] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, os carboidratos ligados a estes podem ser alterados. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos geralmente compreendem um oligossacarídeo ramificado, biantenário que geralmente está ligado por uma ligação N a um Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Os oligossacarídeos podem incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetilglicosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em alguns exemplos de realização, as modificações dos oligossacarídeos em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.
[0408] Em um exemplo de realização, são fornecidos variantes de anticorpos possuindo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose anexa
(direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose no dito anticorpo pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada pelo cálculo do valor médio de fucose dentro da cadeia de açúcar na Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e com alto teor de manose) tal como mensurado por espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito no documento WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado na posição 297 na região Fc (numeração EU dos resíduos da região Fc), no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a variações menores de sequência nos anticorpos. Essas variantes de fucosilação podem ter a função ADCC melhorada. Vide, por exemplo, as Publicações de Patente US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relacionadas com variantes de anticorpos “defucosilados” ou “com deficiência de fucose” (fucose- deficiente) incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane- Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens de células capazes de produzir anticorpos defucosilados incluem células Lec13 CHO deficientes da fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem.
Biophys. 249:533-545 (1986); Pedido de Patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., Especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares nocautes (knockout), tais como células CHO nocautes para o gene o alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8 (vide, por exemplo,
Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87 : 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); e documento WO2003/085107).
[0409] Variantes de anticorpos são fornecidos adicionalmente com oligossacarídeos divididos, por exemplo, onde um oligossacarídeo bianternário anexado a região Fc do anticorpo é cortado pela GlcNAc. Tais variantes de anticorpos podem possuir fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada.
Exemplos de tais anticorpos variantes são descritos, por exemplo, no documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al); (Umana et al) na Patente US
6.602.684, e US 2005/0123546 (Umana et al.). Também são fornecidos variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Essas variantes de anticorpos podem ter a função CDC melhorada. Tais variantes de anticorpos estão descritos, por exemplo, no documento WO 1997/30087 (Patel et al.); documento WO 1998/58964 (Raju, S.) e documento WO 1999/22764 (Raju, S.).
[0410] Pode ser preferido que o anticorpo seja modificado para reduzir a extensão da glicosilação. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo pode ser aglicosilado ou desglicosilado. O anticorpo pode incluir uma substituição em N297, por exemplo, N297D/A.
VARIANTES DE REGIÃO FC
[0411] Em certos exemplos de realização, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido na presente invenção, gerando assim um variante da região Fc. A região Fc variante humana pode compreender uma sequência da região Fc (por exemplo, sequência da região Fc da IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em um ou mais posições de aminoácidos.
[0412] Em determinados exemplos de realização, a invenção contempla uma variante de anticorpo com função efetora reduzida, por exemplo, ligação de CDC, ADCC e/ou FcγR reduzida ou eliminada. Em determinados aspectos, a invenção contempla um anticorpo variante que possuí algumas, mas não todas, das funções efetoras, que o torna um candidato desejável para muitas aplicações no qual a meia vida do anticorpo in vivo é importante, ainda que certas funções efetoras (tal como a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e citotoxicidade mediada por célula dependente de complemento (ADCC)) sejam desnecessárias ou prejudiciais.
[0413] Um ensaio de citotoxicidade in vitro ou in vivo pode ser conduzido para confirmar a redução/depleção dos CDC e/ou atividades ADCC.
Por exemplo, ensaios de ligação com o receptor Fc (FcR) podem ser realizados a fim de garantir que o anticorpo careça de ligação ao FcγR (e portanto careça de atividade ADCC). As principais células mediadoras da ADCC, as células NK, expressam apenas FcγRIII, enquanto os monócitos expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII. A expressão FcR em células hematopoiéticas é resumida na tabela 3, página 464 de Ravetch et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991).
Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse estão descritos na Patente US 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, I., et al. Proc. Nat Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) e Hellstrom, I et al., Proc. Nat Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); US
5.821.337 (vide Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)).
Alternativamente, podem ser utilizados métodos de ensaio não radioativos (vide, por exemplo, ACTI™ ensaio de citotoxicidade não radioativo por citometria de fluxo (CellTechnology, Inc., Mountain View, CA, e CyTotox 96 ® ensaio de citotoxicidade não radioativo (Promega, Madison, WI). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (Natural Killer ou NK). Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como descrito em Clynes et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998).
Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar à C1q e, portanto, carece de atividade CDC.
Vide, por exemplo, o ensaio ELISA de ligação C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio CDC (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); e Cragg, M.S. e M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929 A1).
[0414] Os anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com a substituição de um ou mais dos seguintes resíduos da região Fc: 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US 6.737.056), por exemplo, P329G. Tais Fc mutantes incluem Fc mutantes com substituições em duas ou mais das seguintes posições de aminoácidos: 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o Fc mutante então denominado de “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US 7.332.581).
[0415] Em determinados aspectos, um anticorpo variante compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que diminuem a ligação ao FcγR, por exemplo, substituições nas posições 234 e 235 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em um aspecto, as substituições são L234A e L235A (LALA). Em certos aspectos, o anticorpo variante compreende ainda D265A e/ou P329G em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana. Em um aspecto, as substituições são L234A, L235A e P329G (LALA-PG) em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana. (Vide, por exemplo, o documento WO 2012/130831). Em outro aspecto, as substituições são L234A, L235A e D265A (LALA-DA) em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana.
[0416] Em outros exemplos de realização, pode ser possível usar um subtipo de IgG com função efetora reduzida, como IgG 4 ou IgG2.
[0417] Certos variantes de anticorpos com ligação a FCRs melhorada ou diminuída são descritos. (vide, por exemplo, a Patente US
6.737.056; WO 2004/056312, e Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).
[0418] Em alguns exemplos de realização, as alterações são feitas na região Fc, que resultam na alteração da ligação ao C1q (isto é, melhorada ou diminuída, preferencialmente diminuída) e/ou da Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na Patente US
6.194.551, WO 99/51642, e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[0419] Em alguns exemplos de realização, a ligação de FcRn pode ser reduzida, por exemplo, para uma meia-vida mais curta. Em outros exemplos de realização, a ligação de FcRn pode ser normal. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, a ligação normal ao FcRn pode ser usada em métodos que envolvem um agente de remoção.
[0420] Em determinados aspectos, um anticorpo variante compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação ao FcγR, por exemplo, substituições nas posições 253 e/ou 310, e/ou 435 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em certos aspectos, o anticorpo variante compreende uma região Fc com as substituições de aminoácidos nas posições 253, 310 e 435. Em um aspecto, as substituições são I253A, H310A e H435A em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana. Vide, por exemplo, Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.
[0421] Em certos aspectos, um anticorpo variante compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação ao FcRn, por exemplo, substituições nas posições 310 e/ou 433, e/ou 436 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em certos aspectos, o anticorpo variante compreende uma região Fc com as substituições de aminoácidos nas posições 310, 433 e 436. Em um aspecto, as substituições são H310A, H433A e Y436A em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana. (Vide, por exemplo, o documento WO 2014/177460 A1). Por exemplo, em alguns exemplos de realização, a ligação normal ao FcRn pode ser usada.
[0422] Vide também Duncan e Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente US 5648260; Patente US. 5624821, e documento WO 94/29351 relativas a outros exemplos de região Fc variantes.
[0423] A porção C-terminal da cadeia pesada do anticorpo, como divulgado na presente invenção, pode ser um porção C-terminal completa terminando com os resíduos de aminoácidos PGK. O C-terminal da cadeia pesada pode ser um C-terminal encurtado no qual um ou dois dos resíduos de aminoácido do C-terminal foram removidos. Em um aspecto preferido, o C- terminal da cadeia pesada é uma porção C-terminal encurtada que termina em PG.
[0424] Em um aspecto de todos os aspectos divulgados na presente invenção, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 C-terminal, tal como especificado na presente invenção, compreende o resíduo glicina C-terminal (G446, posições de aminoácidos com numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Isso ainda está explicitamente abrangido pelo termo “anticorpo de comprimento total” ou “cadeia pesada de comprimento total”, conforme usado no presente documento.
DERIVADOS DE ANTICORPOS
[0425] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo da fornecido na presente invenção pode ser adicionalmente modificado para conter moléculas adicionais não proteináceas que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As moléculas adequadas para a derivatização do anticorpo incluem, mas não estão limitadas a polímeros solúveis em água.
Exemplos não limitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não se limitando a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etileno-glicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/maleico anidrido, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli (n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co- polímeros de óxido de prolipropileno óxido de etileno, poliálcool polióis (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. O propionaldeído polietilenoglicol pode ter vantagens no processo de fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros acoplados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se anexo, os polímeros podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a ser melhorado, se o anticorpo derivado será utilizado em uma terapia sob condições definidas, etc.
[0426] Em outro exemplo de realização, são fornecidos conjugados de anticorpo e porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecida por exposição à radiação. Em um exemplo de realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não se limita a, comprimento de ondas que não prejudicam células normais, mas que aquece a porção não proteinácea a uma temperatura no qual as células próximas ao conjugado anticorpo-porção não proteinácea são mortas.
MÉTODOS E COMPOSIÇÕES RECOMBINANTES
[0427] Os anticorpos podem ser produzidos utilizando métodos e composições recombinantes, por exemplo, conforme descrito na Patente US
4.816.567. Em um exemplo de realização, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo conforme descrito na presente invenção. Tais ácidos nucleicos podem codificar uma sequência de aminoácidos compreendendo VL e/ou a sequência de aminoácidos compreendendo VH do anticorpo (por exemplo, cadeias leve e/ou pesadas do anticorpo). Em um exemplo de realização adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo tal ácido nucleico é(são) fornecido(s). Em um exemplo de realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo o referido ácido nucleico. Em tal exemplo de realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo.
[0428] No caso de anticorpos multiespecíficos, os ácidos nucleicos podem ser fornecidos codificando cada um dos componentes da cadeia pesada e leve do formato de anticorpo particular. Um vetor ou conjunto de vetores compreendendo tais ácidos nucleicos também são fornecidos.
[0429] Em um exemplo de realização, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, SP20). Em um exemplo de realização, é fornecido um método de produzir um anticorpo de acordo com a presente invenção, em que o método compreende a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo, tal como estabelecido acima, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo, e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura de células hospedeiras).
[0430] Para a produção recombinante de um anticorpo, o ácido nucleico codificante de um anticorpo, por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem adicional e/ou para a expressão em uma célula hospedeira. O referido ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo).
[0431] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores codificantes de anticorpos incluem células procarióticas ou eucarióticas descritas na presente invenção. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, particularmente quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, as Patentes US
5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523. (Vide também Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, Ed., Humana Press, Fairfield, NJ, 2003 ), págs. 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpos em E.
coli). Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta celular de bactérias em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.
[0432] Além dos procariotos, os micróbios eucariotos como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vetores codificantes de anticorpos, incluindo as cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Vide, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), e Li et al., Nat.
Biotech. 24:210-215 (2006).
[0433] Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas cepas de baculovírus que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células Spodoptera frugiperda.
[0434] Culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiros. Vide, por exemplo, as Patentes US 5.959.177, US
6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIES® para produção de anticorpos em plantas transgênicas).
[0435] As células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros. Por exemplo, a linhagem de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão pode ser útil. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são; linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7); linhagem de rim embriônico humano (293 ou células 293 conforme descrito em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células rim de hamster neonato (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol.
Reprod 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células humanas de carcinoma cervical (HeLa); células de rim de cão (MDCK); células do fígado de rato búfalo (BRL
3A); células pulmonares humanas (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562);. células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al, Annals NY Acad.Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem a célula de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR- (Urlaub et al, Proc Acad Nat. Sci USA 77:4216 (1980)) e linhagem de células de mieloma, como T0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, Ed., Humana Press, Fairfield, NJ, págs. 255-268 (2003).
ENSAIOS
[0436] Os anticorpos fornecidos pela presente invenção podem ser identificados, rastreados, ou caracterizados por suas propriedades físicas, químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na arte.
ENSAIOS DE LIGAÇÃO E OUTROS ENSAIOS
[0437] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é testado quanto à sua atividade de ligação ao antígeno, por exemplo, por métodos conhecidos, como o ELISA, Western blot, e etc.
[0438] Em outro aspecto, os ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete com, por exemplo, PRIT- 0213 ou PRIT-0214 pela ligação ao Pb-DOTAM ou CEA. Em determinados exemplos de realização, tal anticorpo competidor se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, uma cadeia linear ou um epítopo conformacional) que é ligado pelo PRIT-0213 ou PRIT-0214: Métodos exemplares detalhados para o mapeamento de um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” Em Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
[0439] Em um ensaio de competição exemplar, o antígeno imobilizado é incubado com uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga ao antígeno (por exemplo, PRIT-0213 e PRIT- 0214) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado quanto à sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo para se ligar ao antígeno.
O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma.
Como controle, o antígeno imobilizado é incubado com uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação, sob condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo ao antígeno, o excesso de anticorpo não ligado é removido, e a quantidade de marcador associada com antígeno imobilizado é mensurada.
Se a quantidade de marcador associado com antígeno imobilizado for substancialmente reduzida na amostra teste em relação à amostra controle, então isso indica que o segundo anticorpo compete com o primeiro anticorpo pela ligação ao antígeno. Vide Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
AFINIDADE DE ANTICORPO
[0440] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido no presente documento tem uma constante de dissociação (Kd) de 1 nM ou menos, 500pM ou menos, 200pM ou menos, 100pM ou menos, 50pM ou menos, 20pM ou menos, 10pM ou menos, 5pM ou menos ou 1pM ou menos, ou conforme indicado de outra forma na presente invenção.
[0441] Em um exemplo de realização, a Kd é mensurada por um ensaio de ligação ao antígeno marcado radioativamente (RIA). Em um exemplo de realização, um ensaio RIA é realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno. Por exemplo, a afinidade de ligação em solução dos Fabs pelos antígenos é mensurada equilibrando o Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com I125 na presença de uma titulação seriada de antígeno não marcado e, em seguida, capturando os antígenos com uma placa revestida com anticorpos anti-Fab (vide, por exemplo, Chen, et al., J. Mol Biol 293:865-881).865-881 (1999)). Para estabelecer as condições do ensaio, placas de múltiplos poços MICROTITER® (Thermo Scientific) são revestidas durante a noite com 5 μg/ml de anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs), em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e, em seguida, é feito o bloqueio com albumina bovina 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 °C). Em uma placa não adsorvente (Nunc # 269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno–[I125] são misturados com diluições seriadas de um Fab de interesse (por exemplo, coerente com a avaliação do anticorpo anti- VEGF, Fab-12 em Presta et al., Cancer res. 57:4593-4599 (1997)). O Fab de interesse é, em seguida, incubado durante a noite, no entanto, a incubação pode continuar por um longo período (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja alcançado. Posteriormente, as misturas são transferidas para a placa de captura para a incubação à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então retirada e a placa lavada oito vezes com 0,1% de polissorbato-20 (Tween-20®) em PBS. Após as placas estarem secas, 150 μL/poço de cintilante (MicroScint-20®; Packard) é adicionado, e as placas são contadas em um contador TOPCOUNT gamma (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que resultam em uma ligação menor ou igual a 20% da ligação máxima são escolhidas para a utilização em ensaios de ligação competitivos.
[0442] De acordo com outro exemplo de realização, a K d é mensurada utilizando um ensaio de ressonância plasmônica de superfície BIAcore®. Por exemplo, um ensaio utilizando um BIAcore ®-2000 ou BIAcore®- 3000 (BIAcore. Inc., Piscataway, NJ) é realizado a 25 ºC, com o antígeno imobilizado em chips CM5 a ~ 10 unidades de resposta (RU). Em um exemplo de realização, os chips biossensores de dextrano carboximetilados (CM5,
BIAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida (EDC) e N-hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, para 5 μg/ml (~ 0,2 μM) antes de ser injetado a uma velocidade de fluxo de 5 μL/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do antígeno, etanolamina 1 M é adicionada para bloquear grupos que não reagiram. Para a mediação cinética, diluições seriadas em duplicatas de Fab (0,78 nM e 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de tensoativo polissorbato-20 (Tween-20®) (PBST) a 25 °C em uma velocidade de fluxo de cerca de 25 μL/min. A velocidade de associação (kon) e a velocidade de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para-um de Langmuir (BIAcore Evaluation Software version
3.2) pelo ajuste simultâneo de sensogramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a relação koff/kon.
Vide, por exemplo., Chen, et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Se a medida for superior a 106 M-1 S-1 pelo ensaio de ressonância plasmônica descrito acima, então a taxa pode ser determinada por uma técnica de inibição (quenching) de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição das emissões de intensidade de fluorescência (excitação= 295 nm; Emissão = 340 nm, banda de passagem=16 nm) a 25 ºC de 20 nM de um anticorpo anti- antígeno (na forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes do antígeno mensurado em espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com válvula do tipo stop-flow (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic), com agitador de cuveta.
[0443] Em outro exemplo de realização, o Kd é medido usando um ensaio SET (titulação de equilíbrio em solução). De acordo com este ensaio, os anticorpos de teste são normalmente aplicados em uma concentração constante e misturados com diluições em série do antígeno teste. Após a incubação para estabelecer um equilíbrio, a porção de anticorpos livres é capturada em uma superfície revestida com antígeno e detectada com anticorpo anti-espécie marcado, geralmente usando eletroquimioluminescência (por exemplo, como descrito em Haenel et al Analytical Biochemistry 339 (2005) 182 -184).
[0444] Por exemplo, em um exemplo de realização, placas de estreptavidina de 384 poços (Nunc, Microcoat # 11974998001) são incubadas durante a noite a 4ºC com 25 µL/poço de uma mistura de antígeno-biotina- isômero em tampão PBS a uma concentração de 20 ng/mL. Para o equilíbrio de amostras de anticorpos com antígeno livre: 0,01 nM - 1 nM de anticorpo é titulado com o antígeno relevante em etapas de diluição 1:3, 1:2 ou 1:1,7 começando em uma concentração de 2500 nM, 500 nM ou 100 nM de antígeno. As amostras são incubadas a 4ºC durante a noite em microplacas seladas de polipropileno de armazenamento REMP (Brooks). Após incubação durante a noite, as placas de estreptavidina são lavadas 3x com 90 µL de PBST por poço. 15 µL de cada amostra da placa de equilíbrio são transferidos para a placa de ensaio e incubados durante 15 min à temperatura ambiente, seguido por etapas de lavagem com tampão PBST (3x 90 µL). A detecção é realizada pela adição de 25 µL de um conjugado de anticorpo de cabra anti-IgG humana-POD (Jackson, 109-036-088, 1: 4000 em OSEP), seguido por etapas de lavagem com tampão PBST (6x 90 µL). 25 µL de substrato TMB (Roche Diagnostics GmbH, Cat. No: 11835033001) são adicionados a cada poço. A medição ocorre em 370/492 nm em um leitor Safire2 (Tecan).
[0445] Em outro exemplo de realização, a Kd é medida usando um ensaio KinExA (exclusão cinética). De acordo com este ensaio, o antígeno é tipicamente titulado em uma concentração constante de sítios de ligação de anticorpo, as amostras são permitidas a se equilibrar e, em seguida, extraídas rapidamente através de uma célula de fluxo onde sítios de ligação de anticorpo livres são capturados em esferas revestidas com antígeno, enquanto o complexo antígeno-anticorpo saturado é lavado. O anticorpo capturado por esferas é então detectado com um anticorpo anti espécie marcado, por exemplo, marcado com fluorescência (Bee et al PloS One, 2012; 7 (4): e36261). Por exemplo, em um exemplo de realização, os experimentos KinExA são realizados à temperatura ambiente (RT) usando PBS pH 7,4 como tampão de corrida. As amostras são preparadas em tampão de corrida suplementado com 1 mg/mL BSA (“tampão de amostra”). É usada uma velocidade de fluxo de 0,25 mL/min. Uma quantidade constante de anticorpo com concentração no sítio de ligação de 5 pM é titulada com antígeno por diluição em série dupla começando em 100 pM (faixa de concentração de 0,049 pM - 100 pM). Uma amostra de anticorpo sem antígeno serve como sinal 100% (ou seja, sem inibição). Os complexos antígeno-anticorpo são incubados em temperatura ambiente por pelo menos 24 horas para permitir que o equilíbrio seja alcançado. As misturas equilibradas passam através de uma coluna de esferas com antígenos acoplados no sistema KinExA a um volume de 5 mL que permitam o anticorpo não ligado a ser capturado pelas esferas sem perturbar o estado de equilíbrio da solução. O anticorpo capturado é detectado usando 250 ng/mL de anticorpo secundário específico do fragmento Fc anti-humano conjugado com Dylight 650© em tampão de amostra. Cada amostra é medida em duplicatas para todos os experimentos de equilíbrio. O K D é obtido a partir da análise de regressão não linear dos dados usando um modelo de ligação homogêneo de um local contido no software KinExA (Versão 4.0.11) usando o método de “análise padrão”.
COMPOSIÇÕES E MÉTODOS TERAPÊUTICOS
[0446] Conforme discutido acima, os anticorpos multiespecíficos de acordo com a presente invenção são adequados para qualquer tratamento em que ele é desejado para proporcionar um radionuclídeo para ser direcionado. De acordo, a presente invenção fornece um anticorpo direcionado, tal como um anticorpo multiespecífico ou biespecífico, conforme descrito no presente documento, para uso em um método de tratamento. Mais particularmente, é fornecido um anticorpo direcionado (por exemplo, anticorpo multiespecífico ou biespecífico) como descrito no presente documento para uso em um método de radioimunoterapia pré-direcionada. Em tais exemplos de realização, o Pb quelatado é preferencialmente 212Pb.
[0447] Como observado acima, o tratamento pode ser de qualquer condição que seja tratável por atividade citotóxica direcionada às células doentes do paciente. O tratamento é preferencialmente de um tumor ou câncer.
Entretanto, a aplicabilidade da invenção não está limitada a tumores e cânceres. Por exemplo, o tratamento também pode ser de infecção viral ou infecção por outro organismo patogênico, por exemplo, um procarioto.
Opcionalmente, o direcionamento também pode ser para células T para o tratamento de doenças autoimunes induzidas por células T ou cânceres de células T. Assim, as condições a serem tratadas podem incluir infecções virais, como HIV, raiva, EBV e herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi e doenças autoimunes, como esclerose múltipla e drogas para doenças do enxerto contra hospedeiro.
[0448] O termo “câncer”, tal como utilizado na presente invenção, inclui cânceres sólidos e hematológicos, tais como linfomas, leucemias linfocítica, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), câncer de pulmão de células bronquioalveolar, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio,
carcinoma de colo do útero, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, Doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer de uretra, câncer de pênis, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer das vias biliares, neoplasias do sistema nervoso central (SNC), tumores do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitoma, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisário e sarcoma de Ewing, incluindo as versões refratárias de qualquer um dos cânceres descritos acima, ou uma combinação de um ou mais cânceres descritos acima.
[0449] Um método de direcionamento de um radioisótopo para um tecido ou órgão para a terapia pode compreender: i) administrar ao sujeito um anticorpo multiespecífico ou biespecífico como descrito na presente invenção, em que o anticorpo liga-se ao antígeno alvo e se localiza na superfície de uma célula que expressa o antígeno alvo; e ii) subsequentemente administrar ao indivíduo um radionuclídeo Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo, em que um radionuclídeo Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo liga-se ao anticorpo localizado na superfície celular.
[0450] Opcionalmente, entre as etapas (i) e (ii) é administrado um agente de remoção/bloqueio conforme descrito acima. O agente de remoção/bloqueio pode ligar-se ao sítio de ligação ao antígeno específico para Pb-DOTAM e bloquear a ligação subsequente pelo radionuclídeo quelatado. O agente de remoção pode compreender DOTAM ou um variante funcional do mesmo, quelatado com um íon metálico e conjugado com uma porção de remoção.
[0451] Exemplos de porções de remoção/bloqueio adequadas podem incluir porções que aumentam o tamanho e/ou o raio hidrodinâmico da molécula, dificultando a capacidade da molécula em acessar ao tumor, sem interferir com a capacidade da molécula de se ligar ao anticorpo na circulação.
Porções exemplares incluem polímeros hidrofílicos. O radical pode ser um polímero ou copolímero, por exemplo, de dextrano, dextrina, PEG, ácidos polisiálico (PSA), ácido hialurônico, hidroxietil-amido (HES) ou poli (2-etil-2- oxazolina) (PEOZ). Em outros exemplos de realização, a porção pode ser um peptídeo não estruturado ou proteína, como polipeptídeos XTEN (polímeros de proteínas hidrofílicos não estruturados), polímero de homoaminoácido (HAP), polímero de prolina-alanina-serina (PAS), peptídeo semelhante à elastina (ELP), ou semelhante a gelatina proteína (GLK). Pesos moleculares adequados para os polímeros podem estar na faixa, por exemplo, de pelo menos 50 kDa, por exemplo, entre 50 kDa a 2000 kDa. Por exemplo, o peso molecular pode ser 200-800kDa, opcionalmente maior que 300, 350, 400 ou 450 kDa, e opcionalmente menor que 700, 650, 600 ou 550kDa, opcionalmente cerca de 500kDa.
[0452] Em alguns exemplos de realização, o agente de remoção pode ser DOTAM ou um variante funcional do mesmo (quelatado com um metal), conjugado com dextrano ou um derivado deste, por exemplo, conforme descrito abaixo.
[0453] Em alguns exemplos de realização, a proporção em peso de anticorpo para agente de remoção pode estar na faixa de 1:1, 2:1, 3:1 ou 4:1 até 20:1, 15:1, 10:1, 8:1, 6:1 ou 5:1, por exemplo, no intervalo de 1:1 a 20:1, 1:1 a 10:1, 2:1 a 8:1 ou 2:1 a 6:1.
[0454] Em alguns exemplos de realização, o agente de remoção pode ser administrado algumas horas ou dias após o tratamento com o anticorpo multiespecífico. Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que o agente de remoção seja administrado pelo menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 22 ou 24 horas após o anticorpo multiespecífico, ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias. Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que o agente de remoção seja administrado não mais do que 14 dias após o anticorpo, por exemplo, não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 dias.
[0455] Opcionalmente, o agente de remoção é administrado no período entre 4 e 10 dias, 4 e 7 dias, 2 e 7 dias, ou de 2 a 4 dias após o anticorpo multiespecífico.
[0456] Em alguns exemplos de realização, o radionuclídeo de Pb é administrado em questão de minutos, horas ou dias após o agente de remoção. Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que o radionuclídeo de Pb seja administrado pelo menos 30 minutos após o agente de remoção e, opcionalmente, dentro de 48 horas, 24 horas, 8 horas ou 4 horas após a administração do agente de remoção. Em alguns exemplos de realização, o radionuclídeo de Pb pode ser administrado no dia após a administração do agente de remoção.
[0457] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos descritos na presente invenção podem ser administrados como parte de uma terapia combinada. Por exemplo, eles podem ser administrados em combinação com um ou mais agentes quimioterápicos: o agente quimioterápico e o anticorpo podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem.
[0458] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos descritos na presente invenção podem, adicionalmente ou alternativamente, ser administrados em combinação com radiossensibilizadores. O radiossensibilizador e o anticorpo podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem.
FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[0459] As formulações farmacêuticas de um anticorpo anti-Pb- DPTAM conforme descrito na presente invenção, por exemplo, anticorpo multiespecífico ou biespecífico, são preparadas pela mistura do anticorpo possuindo o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são em geral atóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, mas não estão limitados a: tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, ácool butílico ou benzilíco; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açucares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como polietileno glicol (PEG). Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem ainda agentes de dispersão intersticial de fármacos, tais como glicoproteínas hialuronidase neutro-ativas solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH-20 humana solúvel, como a rHuPH20
(HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de utilização, incluindo a rHuPH20, estão descritos nas Publicações de Patente US 2005/0260186 e US 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.
[0460] Formulações de anticorpos liofilizados exemplares estão descritas na Patente US 6.267.958. As formulações aquosas de anticorpos incluem as descritas na Patente US 6.171.586 e no documento WO 2006/044908, sendo que as formulações deste último incluem um tampão histidina-acetato.
[0461] A presente formulação também pode conter mais de um ingrediente ativo de acordo com a necessidade para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não sejam prejudiciais entre si. Por exemplo, pode ser desejável fornecer ainda agentes quimioterápicos e/ou radiossensibilizadores como discutido acima.
Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[0462] Os ingredientes ativos podem ser retidos (encapsulados) em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de coacervação ou por meio de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Edição, Osol, A. Ed.
(1980).
[0463] Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o anticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas.
[0464] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilização pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio da filtragem através de membranas de filtração estéreis.
MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA DIAGNÓSTICO E DETECÇÃO
[0465] A presente invenção fornece ainda o anticorpo alvo, por exemplo, anticorpo multiespecífico como descrito na presente invenção, para uso em um método de diagnóstico realizado em um sujeito. O método de diagnóstico pode ser um método de radioimunoimagem pré-direcionado, por exemplo, com o propósito de diagnosticar um sujeito suspeito de ter um distúrbio proliferativo ou uma doença infecciosa. Em tais exemplos de realização, o Pb quelatado é preferencialmente 203Pb.
[0466] Um método para direcionar um radioisótopo a um tecido ou órgão para geração de imagens pode compreender: i) administrar ao sujeito um anticorpo multiespecífico ou biespecífico como descrito na presente invenção, em que o anticorpo liga-se a um antígeno alvo e se localiza na superfície de uma célula que expressa o antígeno alvo; e ii), subsequentemente, administrar um radionuclídeo de Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo para o indivíduo, em que o radionuclídeo de Pb quelatado com DOTAM ou o referido variante funcional liga-se ao anticorpo localizado na superfície da célula.
[0467] Em outro exemplo de realização, o anticorpo multiespecífico ou biespecífico, conforme descrito no presente documento, pode ser ligado ao radionuclídeo de Pb quelatado no momento da administração.
[0468] Opcionalmente, o método pode compreender ainda: iii) a imagiologia do tecido ou órgão onde o radionuclídeo Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo ficou localizado, ou espera-se que esteja localizado.
[0469] Em outro exemplo de realização, o método da invenção pode compreender um exame de imagem de um tecido ou órgão de um sujeito, em que o sujeito foi previamente administrado com: i) um anticorpo multiespecífico ou biespecífico como descrito na presente invenção, em que o anticorpo liga-se ao antígeno alvo e se localiza na superfície de uma célula que expressa o antígeno alvo; e ii) um radionuclídeo de Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo para o indivíduo, em que o radionuclídeo de Pb quelatado com DOTAM ou o referido variante funcional liga-se ao anticorpo localizado na superfície da célula.
[0470] Opcionalmente, entre as etapas (i) e (ii) é administrado um agente de remoção/bloqueio conforme descrito acima. O agente de remoção, o regime de administração para o agente de remoção e a proporção em peso de anticorpo para agente de remoção podem ser conforme descrito acima.
[0471] O antígeno alvo pode ser qualquer antígeno alvo como discutido na presente invenção. Em alguns exemplos de realização, o antígeno alvo pode ser um antígeno específico do tumor conforme discutido acima e a imagem pode ser um método de imagiologia de tumor ou tumores. O indivíduo pode ser conhecido ou suspeito de ter um tumor.
[0472] Por exemplo, o método pode ser um método de imagiologia de tumores em um indivíduo com ou com suspeita de ter câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), câncer de pulmão de células bronquioalveolar, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino,
câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma de colo do útero, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, Doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer de uretra, câncer de pênis, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer das vias biliares, neoplasias do sistema nervoso central (SNC), tumores do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitoma, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisário e sarcoma de Ewing, incluindo as versões refratárias de qualquer um dos cânceres descritos acima, ou uma combinação de um ou mais cânceres descritos acima.
AGENTES DE REMOÇÃO (CLEARING AGENT)
[0473] Ainda em um aspecto adicional da invenção, os presentes inventores desenvolveram um novo agente de remoção. Esse agente de remoção pode ser usado em qualquer um dos métodos de diagnóstico, imagem ou tratamento, conforme descrito no presente documento.
[0474] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um agente de remoção à base de dextrano que compreende dextrano ou um derivado deste, conjugado com M-DOTAM ou um variante funcional deste.
[0475] Em alguns exemplos de realização, o agente de remoção pode ser um composto da seguinte fórmula: dextrano - (ligante-(M-DOTAM))x - em que: - dextrano é dextrano ou derivado deste;
- ligante é uma porção de ligação; - M-DOTAM é DOTAM ou um variante funcional do mesmo incorporando um íon de metal; e - x ≥ 1.
[0476] Em alguns exemplos de realização, a porção ligante pode ser ou compreende um ou mais grupos funcionais bivalentes selecionados a partir de um grupo ureia (-NH-C(O)-NH-), um grupo ureia substituído (-NRX- C(O)-NRX-, onde um ou ambos grupos RX não são H), um grupo tioureia (-NH- C(S)-NH-), um grupo tioureia substituído (-NRX-C(S)-NRX-, onde um ou ambos grupos RX não são H), um grupo amida (-C(O)-NH-), um grupo amida substituído (-C(O)-NRX-, onde RX não é H), um grupo tioamida (-C(S)-NH-), um grupo amida substituído (-C(S)-NRX-, onde RX não é H), um grupo triazol, ou triazol substituído. Nesses exemplos de realização, a porção ligante pode compreender opcionalmente um ou mais grupos funcionais bivalentes adicionais, tal como um grupo alquileno, um grupo arileno, um grupo heteroarileno, um grupo aralquileno e um grupo heteroaralquileno. O substituinte de RX não é particularmente limitado. Em exemplos de realização particulares, RX, quando presente, é selecionado a partir do grupo que consiste em alquila C1-C6, arila C5-C12, heteroarila C5-C12 e grupos halo.
[0477] Em exemplos de realização particulares, a porção ligante pode ser ou compreende um ou mais grupos funcionais bivalentes selecionados a partir de um grupo ureia, um grupo tioureia, um grupo amida, um grupo tioamida, ou um grupo triazol.
[0478] Em um exemplo de realização preferido, a porção ligante compreende um grupo funcional tioureia bivalente ou um grupo funcional tioamida bivalente.
[0479] Em alguns exemplos de realização, a porção ligante compreende um grupo funcional tioureia bivalente e um grupo arileno opcionalmente substituído. Em alguns exemplos de realização, a porção ligante compreende um grupo funcional tioureia bivalente, um grupo arileno opcionalmente substituído e um grupo alquileno opcionalmente substituído. Em exemplos de realização particulares, a porção ligante compreende um grupo funcional tioureia bivalente é covalentemente ligada através de seus átomos de nitrogênio a um grupo arileno opcionalmente substituído. Em exemplos de realização adicionais, a porção ligante compreende um grupo funcional tioureia bivalente é covalentemente ligada através de seus átomos de nitrogênio a um grupo arileno opcionalmente substituído e o grupo arileno opcionalmente substituído é covalentemente ligado a um grupo alquileno opcionalmente substituído. Em exemplos de realização preferidos, o grupo arileno é não substituído. Em exemplos de realização particulares, o grupo arileno é um grupo fenileno. Em exemplos de realização preferidos, o grupo alquileno é não substituído. Em exemplos de realização particulares, o grupo alquileno é um grupo alquileno C1-C6. Em exemplos de realização particularmente preferidos, o grupo alquileno é selecionado a partir de metileno e etileno. Quando presente na porção ligante, o grupo arileno e grupo alquileno pode ser não substituído.
Em exemplos de realização particulares, a porção ligante consiste em um grupo funcional tioureia bivalente covalentemente ligado através de seus átomos de nitrogênio a um grupo arileno e o grupo arileno é covalentemente ligado a um grupo alquileno.
[0480] Em alguns exemplos de realização, a porção ligante compreende um grupo funcional tioamida bivalente e um grupo arileno opcionalmente substituído. Em alguns exemplos de realização, a porção ligante compreende um grupo funcional tioamida bivalente, um grupo arileno opcionalmente substituído e um grupo alquileno opcionalmente substituído. Em exemplos de realização particulares, a porção ligante compreende um grupo funcional tioamida bivalente covalentemente ligado através de seu átomo de nitrogênio a um grupo arileno opcionalmente substituído. Em exemplos de realização adicionais, a porção ligante compreende um grupo funcional tioamida bivalente covalentemente ligado através de seus átomos de nitrogênio a um grupo arileno opcionalmente substituído e o grupo arileno opcionalmente substituído é covalentemente ligado a um grupo alquileno opcionalmente substituído. Em exemplos de realização preferidos, o grupo arileno é não substituído. Em exemplos de realização particulares, o grupo arileno é um grupo fenileno. Em exemplos de realização preferidos, o grupo alquileno é não substituído. Em exemplos de realização particulares, o grupo alquileno é um grupo alquileno C1-C6. Em exemplos de realização particularmente preferidos, o grupo alquileno é selecionado a partir de metileno e etileno. Quando presente na porção ligante, o grupo arileno e grupo alquileno pode ser não substituído.
Em exemplos de realização particulares, a porção ligante consiste em um grupo funcional tioamida bivalente covalentemente ligado através de seus átomos de nitrogênio a um grupo arileno e o grupo arileno é covalentemente ligado a um grupo alquileno.
[0481] Em alguns exemplos de realização, a porção ligante pode ser ou compreende um grupo da seguinte fórmula: y ** * - onde y é de 1 a 6 (preferencialmente 1 ou 2), * representa o ponto de fixação ao dextrano ou um derivado deste, e ** representa o ponto de fixação a um átomo do anel do DOTAM ou um variante funcional deste.
[0482] Em alguns exemplos de realização, a porção ligante pode ser formada a partir da conjugação de uma amina (preferencialmente uma amina primária) e um isocianato ou isotiocianato. Tal conjugação forma um grupo funcional ureia bivalente e um grupo funcional tioureia, respectivamente. Em tais exemplos de realização quando um isocianato é um dos reagentes, a porção ligante pode ser considerada como compreendendo um grupo funcional ureia bivalente ou um grupo funcional amida bivalente, conforme apropriado. Em tais exemplos de realização quando um isotiocianato é um dos reagentes, a porção de ligação pode ser considerada como compreendendo um grupo funcional tioureia bivalente ou um grupo funcional tioamida bivalente, conforme apropriado.
[0483] Preferencialmente, x é maior do que 1, de modo que cada dextrano tem uma média maior do que 1 M-DOTAM ou um variante funcional do mesmo por molécula. Por exemplo, x pode ser 2 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais, 40 ou mais, ou preferencialmente 50 ou mais. Os presentes inventores descobriram que uma remoção melhorada pode ser alcançada usando dextrano marcado com vários grupos M-DOTAM.
[0484] O DOTAM ou um variante funcional do mesmo pode incorporar apenas um ligante, de modo a prevenir a reticulação de dextrano.
[0485] Derivados de dextrano, que pode encontrar uso no agente de remoção incluem aminodextranos, em que o dextrano é substituído por um ou mais aminas. De uso particular são aminodextranos nos quais um ou mais grupos hidroxila do dextrano são substituídos com um grupo carboximetil amida amino- substituído. Tais compostos podem ser produzidos modificando o dextrano com um grupo carboximetila (por exemplo, reagindo com ácido cloroacético) e, em seguida, reagindo adicionalmente com uma diamina opcionalmente substituída
(preferencialmente uma alquildiamina, como uma α, ω-alquilenodiamina, por exemplo, etilenodiamina).
[0486] O grupo amino fornece um ponto de ligação para o ligante. Pelo menos 30% dos grupos aminos disponíveis podem ser substituídos com DOTAM ou um variante funcional, preferencialmente pelo menos 40%, mais preferencialmente pelo menos 50%.
[0487] Preferencialmente, “dextrano” na fórmula acima é um aminodextrano, correspondendo a um dextrano substituído com um ou mais grupos carboximetila que são substituídos por etilenodiamina.
[0488] O dextrano pode ser substituído com um ou mais grupos de fórmula –CH2C(=O)NH(CH-2)f NHRF , onde RF denota hidrogênio ou o ligante para DOTAM, e f é 1-6, mais preferencialmente 2. Por exemplo, os grupos podem ter a seguinte fórmula: - onde a linha ondulada indica o ponto de ligação ao oxigênio no dextrano.
[0489] O aminodextrano pode ter uma estrutura de unidades de repetição de glucopiranosil predominantemente ligadas a α(1,6), opcionalmente com ramificações de outras unidades de glucopiranosil ligadas, por exemplo, via ligações glicosídicas α(1,2), α(1,3) ou α(1,4). Pelo menos alguns dos grupos hidroxila são substituídos com um grupo carboximetil amida amino-substituído, tal como discutido acima (em particular, um grupo de fórmula –CH2C(=O)NHCH-2CH2NHRF ). Em outras palavras, o aminodextrano pode compreender unidades da seguinte fórmula:
- em que cada RG é H, um grupo carboximetil amida amino- substituído (tal como –CH2C(=O)NHCH-2CH2NHRF), ou uma ligação com uma outra unidade glucopiranosila, predominantemente através da ligação α(1,6) e em que a linha tracejada indica ligação a uma unidade adjacente.
[0490] O agente de remoção pode incluir uma ou mais unidades da fórmula abaixo: y
- onde ** representa o ponto de ligação ao DOTAM ou um variante funcional do mesmo e y é conforme definido acima.
[0491] Os derivados de dextrano podem incluir dextrano ou aminodextrano modificado com um ou mais grupos selecionados a partir de um aminoácido, ou um sacarídeo diferente de glicose. Por exemplo, o dextrano pode ser modificado (por exemplo, coberto) com uma ou mais unidades de ácido glutâmico ou ácido poliglutâmico, incluindo Glu, (Glu)2, (Glu)3 ou (Glu)4.
Adicionalmente, ou alternativamente, o dextrano pode ser modificado (por exemplo, coberto) com um sacarídeo diferente de glicose, como N- acetilgalactosamina (GalNAc), ou um polissacarídeo formado a partir de tais sacarídeos, como tri-GalNAc.
[0492] Em alguns exemplos de realização, o peso molecular do componente dextrano pode ser de pelo menos 50 kDa, por exemplo, entre 50 kDa a 2000 kDa. Por exemplo, o peso molecular pode ser 200-800kDa, opcionalmente maior que 300, 350, 400 ou 450 kDa, e opcionalmente menor que 700, 650, 600 ou 550kDa, opcionalmente cerca de 500kDa.
[0493] De modo preferido o número de grupos amino como uma percentagem do número de unidades de glicose do dextrano ou derivado do mesmo (a “saturação” das unidades de glicose com grupos amino) pode ser pelo menos 0,5%, pelo menos 1 %, pelo menos 2, pelo menos 5%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou é 100%. Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que a saturação de dextrano com grupos amino seja pelo menos ou cerca de 1% ou 10%, por exemplo, 1% -10%.
[0494] Pode ser preferido que o número de grupos DOTAM como uma percentagem do número de amino unidades do derivado de dextrano (a “saturação” do componente amino dextrano com DOTAM) pode ser pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou é de 100%. Em alguns exemplos de realização, pode ser preferido que a saturação dos grupos amino disponíveis do derivado de dextrano com DOTAM seja pelo menos ou cerca de 40% ou 50%, por exemplo, 40% - 60%.
[0495] Uma dificuldade potencial com o uso de agentes de remoção é a possibilidade de que eles possam entrar nos tumores, e se ligarem a anticorpos associados a tumores, afetando negativamente a ligação subsequente dos radioligantes.
[0496] Os presentes inventores descobriram ainda que uma boa depuração sanguínea pode ser alcançada juntamente com baixa penetração do agente de remoção em tumores, quando um agente de remoção à base de dextrano é usado que tem i) um alto peso molecular médio e ii) foi submetido a um corte de peso molecular, de modo que fragmentos abaixo de um certo tamanho foram removidos. O (valor de) corte (cut-off) pode ser aplicado ao dextrano ou derivado de dextrano antes da etapa de conjugação; e/ou aplicado ao agente de remoção após a conjugação; e/ou aplicado ao agente de remoção após complexação com o metal.
[0497] Assim, um agente de remoção útil na presente invenção pode ser um agente de remoção à base de dextrano compreendendo dextrano ou um derivado deste (por exemplo, conforme definido acima, preferencialmente um aminodextrano), conjugado a um quelato de metal, em que i) o peso molecular médio do dextrano ou seu derivado é preferencialmente de 200-800kDa, opcionalmente maior do que 300, 350, 400 ou 450 kDa, e opcionalmente menor do que 700, 650, 600 ou 550kDa, opcionalmente cerca de 500kDa, e ii) dextrano, derivados de dextrano ou agentes de remoção com um peso molecular menor do que o ‘de corte’ (cut-off) foram removidos, em que o peso molecular de corte é 50kDa ou superior, 100kDa ou superior ou 200kDa ou superior, opcionalmente na faixa de 50kDa-250kDa ou 50kDa-200kDa, opcionalmente 100kDa-200kDa, opcionalmente em torno de 100kDa ou 150kDa ou 200kDa. (Para evitar dúvidas, notamos que se o corte for declarado como 50kDa ou superior, isso significa que o corte pode ser 50kDa ou qualquer valor acima de 50kDa, mas continua a ser dextrano, derivados de dextrano ou agentes de remoção de com pesos menores do que o corte que são removidos).
[0498] A quantidade de espécies com um peso molecular abaixo do limite pode ser, por exemplo, 5% em peso ou menos, 4% em peso ou menos, 3% em peso ou menos, 2% em peso ou menos, 1% em peso ou menos, 0,5% em peso ou menos, 0,4% em peso ou menos, 0,3% em peso ou menos, 0,2% em peso ou menos, 0,1% em peso ou menos ou 0,01% em peso ou menos, como um percentual em peso do agente de remoção. Preferencialmente, o agente de remoção é essencialmente isento de espécies com um peso molecular abaixo do limite.
[0499] O peso molecular de corte pode ser alcançado por filtração, por exemplo, por diafiltração, ultrafiltração, filtração de fluxo tangencial ou filtração de fluxo cruzado. Preferencialmente, são realizadas pelo menos 2 etapas de filtração, opcionalmente, pelo menos, 3. O termo “peso molecular médio” indica a massa molecular ponderal média, conforme determinada por análise SEC-MALS.
[0500] Será compreendido que, quando incorporado no DOTAM ou um variante funcional do mesmo, os metais estarão presentes como íons metálicos, e que os estados de oxidação irão variar dependendo do elemento específico. Assim, o leitor experiente compreende que, por exemplo, os termos chumbo, Pb, ou 206Pb destinam-se a abranger formas iônicas do elemento, em particular, Pb(II).
[0501] O metal presente no agente de remoção pode ser um isótopo estável (não radioativo) de chumbo, ou um isótopo estável ou essencialmente estável de outro íon metálico, desde que o complexo íon metálico-DOTAM seja reconhecido com alta afinidade pelo anticorpo. Por exemplo, outros metais adequados podem ser Zn (Zn 2+), Ca (Ca 2+) ou 209Bi (Bi2+), sendo o último radioativo, mas considerado como sendo praticamente estável devido à sua meia-vida longa.
[0502] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de preparação de um agente de remoção, compreendendo a conjugação de um dextrano ou um derivado de dextrano a DOTAM ou um variante funcional ou derivado do mesmo, em que o método envolve a quelação de DOTAM com Pb ou outro íon de metal conforme descrito acima [por exemplo, Pb (II)] antes e/ou após a conjugação de DOTAM ou um variante funcional deste ao dextrano.
[0503] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de preparação de um agente de remoção, que compreende: - A formação de um conjugado por conjugação DOTAM ou um variante funcional ou derivado deste a um dextrano ou derivado de dextrano; - em que antes da conjugação a dextrano ou derivados de dextrano é submetido a uma etapa de filtração para remover as espécies de peso molecular abaixo de um valor de corte/limiar, por exemplo, de 50 kDa ou superior, 100 kDa ou 200 kDa ou superior, opcionalmente no intervalo de 50kDa-250kDa ou 50kDa-200kDa, opcionalmente 100kDa- 200kDa, por exemplo, espécies abaixo de 100kDa, 150Kda ou 200kDa, ou em que; - o método compreende ainda sujeitar o conjugado a uma etapa de filtração para remover as espécies de peso molecular abaixo de um valor de corte/limiar, por exemplo, de 50 kDa ou superior, 100 kDa ou 200 kDa ou superior, opcionalmente no intervalo de 50kDa-250kDa ou 50kDa-200kDa, opcionalmente 100kDa-200kDa, por exemplo, espécies abaixo de 100kDa, 150Kda ou 200kDa.
[0504] Conforme descrito acima, os presentes inventores descobriram que é benéfico para aplicar um valor de corte (cut-off) de peso molecular para remover fragmentos abaixo de um determinado tamanho. O método de filtração pode ser, por exemplo, diafiltração. O leitor experiente reconhecerá que a palavra “remover” em “remover espécies abaixo de um limite/corte de peso molecular” é sinônimo de “reduzir em número” e que algumas espécies residuais de baixo peso molecular podem permanecer, dependendo do método de filtração específico empregado. A quantidade de espécies com um peso molecular abaixo do limite pode ser, por exemplo, 5% em peso ou menos, 4% em peso ou menos, 3% em peso ou menos, 2% em peso ou menos, 1% em peso ou menos, 0,5% em peso ou menos, 0,4% em peso ou menos, 0,3% em peso ou menos, 0,2% em peso ou menos, 0,1% em peso ou menos ou 0,01% em peso ou menos, como um percentual em peso do agente de remoção. Preferencialmente, o agente de remoção é essencialmente isento de espécies com um peso molecular abaixo do corte/limiar após a filtração.
[0505] O DOTAM variante ou derivado funcional deste pode ser conforme definido acima, em que pelo menos um dos grupos R 1 serve como a porção de ligação. Por exemplo, um grupo adequado (ligante -(M- DOTAM)) pode ser formado pela reação de um composto da seguinte fórmula com um aminodextrano como descrito acima:
[0506] A síntese deste composto é descrita em Chappell et al.
Nuclear Medicine and Biology, vol. 27, págs. 93-100, 2000, e os derivados DOTAM estão disponíveis comercialmente pela Macrocyclics, Inc. (Plano, Texas).
[0507] O DOTAM ou seu variante funcional pode ser adicionado em excesso, de modo que cada dextrano derivado tem uma média de mais do que 1 DOTAM. O número médio de DOTAM ou variantes funcionais do mesmo em cada dextrano pode ser maior do que 1, por exemplo, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais, 40 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais ou preferencialmente 40 ou mais. Os presentes inventores descobriram que uma remoção melhorada pode ser alcançada usando dextrano conjugado a vários grupos M-DOTAM.
[0508] Preferencialmente, o dextrano tem um peso molecular médio de 200-800kDa, opcionalmente, maior que 300, 350, 400 ou 450 kDa, e opcionalmente menor que 700, 650, 600 ou 550kDa, opcionalmente cerca de 500kDa.
[0509] O método de preparação de um agente de remoção também pode compreender uma etapa de quelação, envolvendo a quelação do DOTAM ou um variante funcional do mesmo com um íon metálico. O íon metálico pode ser um isótopo não radioativo, por exemplo, um isótopo não radioativo de Pb, Ca, Zn, ou um isótopo virtualmente estável, como 209Bi.
[0510] A etapa de quelação é realizada antes da conjugação do DOTAM ou um variante funcional do mesmo com o dextrano e/ou após a conjugação do DOTAM ou um variante funcional do mesmo com o dextrano, mas opcionalmente antes da etapa de filtração. A quelação do íon metálico pelo DOTAM ou variante funcional do mesmo pode ser necessária para garantir a ligação adequada do anticorpo biespecífico ao agente de remoção, por exemplo, para garantir que o DOTAM ou variante funcional do mesmo adote a conformação correta para se engajar/ligar com o anticorpo.
[0511] Quando o método compreende uma etapa de quelação, preferencialmente, o método envolve também uma etapa subsequente de eliminação de metal não ligado. Isto pode ser conseguido adicionando mais agente quelante que pode ser subsequentemente separado do DOTAM ligado ao dextrano ou variante funcional do mesmo durante a etapa de filtração. O outro agente quelante é preferencialmente diferente de DOTAM ou de um variante funcional deste. Preferencialmente, o outro agente quelante tem um peso molecular mais baixo do que o conjugado de dextrano-agente quelante, para facilitar a separação baseada no tamanho. Por exemplo, o outro agente quelante pode ser um ácido poliaminocarboxílico, tal como ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) ou um sal deste.
[0512] Preferencialmente, o método de preparação de um agente de remoção envolve: i) a formação de um conjugado por conjugação DOTAM ou um variante funcional ou derivado deste a um dextrano ou derivado de dextrano; ii) opcionalmente, a remoção de espécies de baixo peso molecular do produto da etapa (i); iii) a quelação do conjugado com um íon metálico, por exemplo, um íon de Pb, Bi, Zn ou Ca;
iv) a adição de outro agente quelante para quelar o íon metálico não ligado; e v) a realização de uma etapa de filtração para remover espécies abaixo de um peso molecular de corte/limiar.
RADIONUCLÍDEO DE PB QUELATADO COM DOTAM
[0513] Um radionuclídeo de Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo pode ser usado em qualquer um dos métodos de diagnóstico, imagem ou tratamento como descrito na presente invenção. Será compreendido que, quando usado em tais métodos, o radionuclídeo de Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo está compreendido em uma composição. Em um exemplo de realização particular, a composição compreende o radionuclídeo Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo e DOTAM ou um variante funcional deste que não está quelatado com o radionuclídeo Pb. Assim, em outro aspecto, a presente invenção refere-se a tal composição e/ou a tal composição para uso em qualquer um dos métodos de imagem ou tratamento descritos na presente invenção. Um radionuclídeo de Pb quelatado com DOTAM como referido em tais métodos pode estar na forma de uma composição como descrito na presente invenção.
[0514] O DOTAM ou um variante funcional deste que não está quelatado com o radionuclídeo de Pb pode ser DOTAM não quelatado ou uma variante funcional deste. Quando usado in vivo, o DOTAM não quelatado ou um variante funcional do mesmo pode formar complexos com íons metálicos do ambiente, por exemplo, com íons de cálcio. Tais íons de cálcio quelatados com DOTAM ou um variante funcional do mesmo são farmacologicamente inativos e podem bloquear potencialmente o radionuclídeo Pb quelatado com DOTAM ou variante do mesmo farmacologicamente ativo a partir do alvo no tumor e, portanto, pode reduzir a eficácia do tratamento, e/ou valor de captação padronizado da imagem e diagnóstico.
[0515] Os presentes inventores descobriram que extinguindo o DOTAM não quelatado ou seu variante funcional sob condições definidas, o controle da formulação in vivo do radionuclídeo Pb quelatado pode ser aumentado e/ou a competição potencial entre o quelato farmaceuticamente ativo e o quelato farmaceuticamente inativo pode ser evitado ou reduzido.
Portanto, em alguns exemplos de realização, o DOTAM ou um variante funcional do mesmo que não é quelatado com o radionuclídeo Pb é DOTAM ou um variante funcional que está quelatado com um íon metálico não radioativo.
[0516] Em algum exemplo de realização, o radionuclídeo de Pb quelatado é 212Pb. Em alguns exemplos de realização, o radionuclídeo de Pb quelatado é 203Pb.
[0517] Será compreendido que, quando incorporado no DOTAM ou um variante funcional do mesmo, o radionuclídeo de Pb estarão presentes como íons metálicos, e que os estados de oxidação irão variar dependendo do elemento específico. Assim, o leitor experiente compreende que, por exemplo, os termos chumbo, Pb, ou 206Pb destinam-se a abranger formas iônicas do elemento, em particular, Pb(II).
[0518] O metal não radioativo presente na composição pode ser um isótopo estável (não radioativo) de chumbo, ou um isótopo estável ou essencialmente estável de outro íon metálico. Por exemplo, outros metais adequados podem ser Gd (Gd2+), Cu (Cu2+), Zn (Zn2+), Ca (Ca2+) ou 209Bi (Bi2+), sendo esse último radioativo, mas considerado virtualmente estável devido ao sua meia-vida muito longa. Em alguns exemplos de realização, o metal é Ca ou Cu. Em alguns exemplos de realização, o metal é Ca.
[0519] O variante ou derivado funcional do DOTAM pode ser conforme definido acima.
[0520] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de preparação de uma composição compreendendo radionuclídeo Pb quelatado com DOTAM ou um variante funcional do mesmo, compreendendo: i) o fornecimento de radionuclídeos de Pb; ii) a quelação do radionuclídeo Pb com DOTAM ou um variante funcional do mesmo; e iii) a quelação do DOTAM não quelatado ou uma variante funcional do mesmo com um íon de metal não radioativo.
[0521] O DOTAM não quelatado ou variante funcional do mesmo na etapa iii) é DOTAM ou um variante funcional do mesmo que não foi quelatado com o radionuclídeo de Pb na etapa ii).
[0522] O íon metálico não radioativo pode ser um íon de Pb, Ca, Zn, Gd ou Cu. Em alguns exemplos de realização, o íon de metal é um íon de Ca ou Cu. Em alguns exemplos de realização, o íon de metal é um íon de Ca, particularmente Ca2+.
[0523] Em algum exemplo de realização, o DOTAM não quelatado ou seu variante funcional remanescente após a etapa ii) é pelo menos 90 mol%, pelo menos 95 mol%, pelo menos 99 mol% do DOTAM ou variante funcional do mesmo adicionado ao radionuclídeo de Pb. Em um exemplo de realização particular, o DOTAM não quelatado ou variante funcional do mesmo remanescente após a etapa ii) é de pelo menos 99 mol%.
[0524] Em alguns exemplos de realização, o DOTAM não quelatado ou variante funcional do mesmo remanescente após a etapa iii) é inferior a 5 mol%, inferior a 2 mol%, inferior a 1 mol%, inferior a 0,1 mol%, inferior a 0,01 mol% do DOTAM ou um variante funcional do mesmo adicionada ao radionuclídeo de Pb. Em um exemplo de realização particular, o DOTAM não quelatado ou variante funcional do mesmo remanescente após a etapa iii) é inferior a 1 mol%, inferior a 0,1 mol%, inferior a 0,01 mol%.
[0525] Os radionuclídeos de Pb fornecidos na etapa a) pode ser gerado pela colocação de material radioativo que decai para o radionuclídeo Pb de interesse em um gerador, em que o material radioativo está ligado a um material sólido. Por exemplo, tal material radioativo na produção de 212Pb pode ser Rádio 224. O radionuclídeo de interesse é então extraído do gerador em uma solução aquosa que pode conter impurezas radiológicas e químicas. A solução aquosa contendo o radionuclídeo Pb de interesse e as impurezas é purificada por meio de cromatografia líquida em coluna. A cromatografia líquida em uma coluna pode ser uma cromatografia de extração ou uma cromatografia de partição. Uma cromatografia de extração ou partição é baseada na distribuição dos elementos que devem ser separados entre uma fase orgânica, ou extratora, e uma fase aquosa, em que o extratante é ligado a um suporte inerte formando com ele a fase estacionária, enquanto o a fase aquosa representa a fase móvel.
[0526] A cromatografia de extração pode usar uma fase estacionária que inclui uma coroa de éter como extratante e, em particular, um diciclohexano-1 8-coroa-6 ou um dibenzo-1 8-coroa-6 cujos grupos ciclohexila ou benzila são substituídos por um ou mais grupos C [ a C] 2 alquila, com uma cadeia linear ou ramificada, em solução em um diluente orgânico não miscível com água, tipicamente um álcool de hidrocarboneto de cadeia longa, em outras palavras, uma cadeia Cx e superior.
[0527] Em particular, pode ser usada uma fase estacionária que compreende 4,4'(5')-di-er-butilciclohexano-1 8-coroa-6 como o extratante, preferencialmente diluído em octan-1-ol. Tal fase estacionária tem a vantagem de reter seletivamente mais de 99% de 212Pb presente em uma solução aquosa contendo de 1,5 a 2,5 moles/L de um ácido forte, o que normalmente corresponde aos tipos de soluções aquosas que são usadas para extrair 212Pb a partir de um gerador de rádio-224. Este tipo de fase estacionária está disponível, por exemplo, em frascos, mas também embalados em colunas prontas para uso ou cartuchos para cromatografia, da empresa TRISKEM International com o nome comercial “Pb resin”.
[0528] Alternativamente, a solução compreendendo o radionuclídeo desejado e as impurezas também pode ser purificada com uma cromatografia de troca iônica, por exemplo, cromatografia de troca catiônica.
[0529] Um método de produção e purificação de 212Pb é descrito no documento WO2013174949.
SEQUÊNCIAS
[0530] Algumas sequências aqui referidas são fornecidas na tabela abaixo.
TABELA 2 SEQ ID NO Descrição Sequência CDR1 de cadeia pesada 1 gfslstysms <Pb- Dotam> PRIT-213 CDR2 de cadeia pesada 2 figsrgdtyyaswakg <Pb- Dotam> PRIT-213 CDR3 de 3 erdpygggaypphl cadeia
SEQ ID NO Descrição Sequência pesada
<Pb-
Dotam>
PRIT-213
CDR1 de cadeia leve
4 <Pb- qsshsvysdndla
Dotam>
PRIT-213
CDR2 de cadeia leve
5 <Pb- qasklas
Dotam>
PRIT-213
CDR3 de cadeia leve
6 <Pb- lggyddesdtyg
Dotam>
PRIT-213 domínio variável de vtlkesgpvl vkptetltlt ctvsgfslst cadeia ysmswirqpp gkalewlgfi gsrgdtyyas wakgrltisk 7 pesada 1 dtsksqvvlt de <Pb- mtnmdpvdta tyycarerdp ygggaypphl wgrgtlvtvs s Dotam>
PRIT-213
SEQ ID NO Descrição Sequência domínio variável de iqmtqspssl sasvgdrvti tcqsshsvys cadeia leve dndlawyqqk pgkapklliy qasklasgvp srfsgsgsgt 8 <Pb- dftltisslq
Dotam> pedfatyycl ggyddesdty gfgggtkvei k
PRIT-213 domínio variável de vqlqqwgagl lkpsetlslt cavygfslst cadeia ysmswirqpp gkglewigfi gsrgdtyyas wakgrvtisr 9 pesada dtsknqvslk <Pb- lssvtaadta vyycarerdp ygggaypphl wgrgtlvtvs s Dotam>
PRIT-214 domínio variável de iqmtqspssl sasvgdrvti tcqsshsvys cadeia leve dndlawyqqk pgkapklliy qasklasgvp srfsgsgsgt 10 <Pb- dftltisslq
Dotam> pedfatyycl ggyddesdty gfgggtkvei k
PRIT-214
CDR1 de cadeia 11 GFNIKDTYMH pesada
<CEA>
CDR2 de 12 RIDPANGNSKYVPKFQG cadeia
SEQ ID NO Descrição Sequência pesada <CEA> CDR3 de cadeia 13 FGYYVSDYAMAY pesada <CEA> CDR1 de 14 cadeia leve RAGESVDIFGVGFLH <CEA> CDR2 de 15 cadeia leve RASNRAT <CEA> CDR3 de 16 cadeia leve QQTNEDPYT <CEA> domínio
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDT variável de
YMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKY cadeia 17 VPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAV pesada
YYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS <CEA>
84.66 Domínio
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFG variável de
VGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPA 18 cadeia leve
RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTN <CEA>
EDPYTFGQGTKLEIK
84.66
SEQ ID NO Descrição Sequência
1 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgfnik dtymhwvrqa pgqglewmgr
51 idpangnsky vpkfqgrvti tadtststay melsslrsed tavyycapfg
101 yyvsdyamay wgqgtlvtvs sastkgpsvf plapssksts ggtaalgclv
151 kdyfpepvtv swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv tvpssslgtq cadeia 201 tyicnvnhkp sntkvdkkve pkscdkthtc pesada 1 ppcpapeaag gpsvflfppk do 251 pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn <CEA/Pb- wyvdgvevhn aktkpreeqy 19 Dotam> 301 nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk algapiekti trivalente, skakgqprep biespecífic 351 qvytlppcrd eltknqvslw clvkgfypsd o PRIT-214 iavewesngq pennykttpp VH_84.66 401 vldsdgsffl yskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg
451 ggggsggggs ggggsggggs vqlqqwgagl lkpsetlslt cavygfslst
501 ysmswirqpp gkglewigfi gsrgdtyyas wakgrvtisr dtsknqvslk
551 lssvtaadta vyycarerdp ygggaypphl wgrgtlvtvs s cadeia 1 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgfnik 20 pesada 2 dtymhwvrqa pgqglewmgr
SEQ ID NO Descrição Sequência do 51 idpangnsky vpkfqgrvti tadtststay melsslrsed <CEA/Pb- tavyycapfg Dotam> 101 yyvsdyamay wgqgtlvtvs sastkgpsvf trivalente, plapssksts ggtaalgclv biespecífic 151 kdyfpepvtv swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv o PRIT-214 tvpssslgtq VL_84.66 201 tyicnvnhkp sntkvdkkve pkscdkthtc ppcpapeaag gpsvflfppk 251 pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn wyvdgvevhn aktkpreeqy 301 nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk algapiekti skakgqprep 351 qvctlppsrd eltknqvsls cavkgfypsd iavewesngq pennykttpp 401 vldsdgsffl vskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg 451 ggggsggggs ggggsggggs iqmtqspssl sasvgdrvti tcqsshsvys 501 dndlawyqqk pgkapklliy qasklasgvp srfsgsgsgt dftltisslq 551 pedfatyycl ggyddesdty gfgggtkvei k 1 eivltqspat lslspgerat lscragesvd ifgvgflhwy cadeia leve qqkpgqaprl 21 <CEA> 51 liyrasnrat giparfsgsg sgtdftltis slepedfavy
84.66 ycqqtnedpy 101 tfgqgtklei krtvaapsvf ifppsdeqlk sgtasvvcll
SEQ ID NO Descrição Sequência nnfypreakv
151 qwkvdnalqs gnsqesvteq dskdstysls stltlskady ekhkvyacev
201 thqglsspvt ksfnrgec
1 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgfnik dtymhwvrqa pgqglewmgr
51 idpangnsky vpkfqgrvti tadtststay melsslrsed tavyycapfg
101 yyvsdyamay wgqgtlvtvs sastkgpsvf plapssksts ggtaalgclv cadeia 151 kdyfpepvtv swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv pesada 1 tvpssslgtq do 201 tyicnvnhkp sntkvdkkve pkscdkthtc
<CEA/Pb- ppcpapeaag gpsvflfppk
Dotam> 251 pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn 22 trivalente, wyvdgvevhn aktkpreeqy biespecífic 301 nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk algapiekti o PRIT-213 skakgqprep
VH_84.66 351 qvytlppcrd eltknqvslw clvkgfypsd
→ knob iavewesngq pennykttpp
401 vldsdgsffl yskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg
451 ggggsggggs ggggsggggs vtlkesgpvl vkptetltlt ctvsgfslst 501 ysmswirqpp gkalewlgfi gsrgdtyyas wakgrltisk dtsksqvvlt
SEQ ID NO Descrição Sequência
551 mtnmdpvdta tyycarerdp ygggaypphl wgrgtlvtvs s
1 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgfnik dtymhwvrqa pgqglewmgr
51 idpangnsky vpkfqgrvti tadtststay melsslrsed tavyycapfg
101 yyvsdyamay wgqgtlvtvs sastkgpsvf plapssksts ggtaalgclv
151 kdyfpepvtv swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv cadeia tvpssslgtq pesada 2 201 tyicnvnhkp sntkvdkkve pkscdkthtc do ppcpapeaag gpsvflfppk <CEA/Pb- 251 pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn Dotam> 23 wyvdgvevhn aktkpreeqy trivalente, 301 nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk algapiekti biespecífic skakgqprep o PRIT-213 351 qvctlppsrd eltknqvsls cavkgfypsd VL_84.66 iavewesngq pennykttpp → hole 401 vldsdgsffl vskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg
451 ggggsggggs ggggsggggs iqmtqspssl sasvgdrvti tcqsshsvys
501 dndlawyqqk pgkapklliy qasklasgvp srfsgsgsgt dftltisslq 551 pedfatyycl ggyddesdty gfgggtkvei k
24 cadeia 1 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgfnik
SEQ ID NO Descrição Sequência pesada 1 dtymhwvrqa pgqglewmgr do 51 idpangnsky vpkfqgrvti tadtststay melsslrsed
<CEA/Pb- tavyycapfg
Dotam> de 101 yyvsdyamay wgqgtlvtvs sastkgpsvf coelho, plapssksts ggtaalgclv biespecífic 151 kdyfpepvtv swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv o Dotam tvpssslgtq
_84.66 201 tyicnvnhkp sntkvdkkve pkscdkthtc ppcpapeaag gpsvflfppk
251 pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn wyvdgvevhn aktkpreeqy
301 nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk algapiekti skakgqprep
351 qvctlppsrd eltknqvsls cavkgfypsd iavewesngq pennykttpp 401 vldsdgsffl vskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg
451 ggggsggggs ggggsggggs avltqtpspv spavggtvti scqsshsvys
501 dndlawyqqk lgqppklliy qasklasgvs srfsgsgsgt qftltisgvq
551 sddaatyycl ggyddesdty gfgggtevvv k cadeia 1 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgfnik pesada 2 dtymhwvrqa pgqglewmgr 25 do 51 idpangnsky vpkfqgrvti tadtststay melsslrsed
<CEA/Pb- tavyycapfg
SEQ ID NO Descrição Sequência
Dotam> de 101 yyvsdyamay wgqgtlvtvs sastkgpsvf coelho plapssksts ggtaalgclv tetravalent 151 kdyfpepvtv swnsgaltsg vhtfpavlqs sglyslssvv e, tvpssslgtq biespecífic 201 tyicnvnhkp sntkvdkkve pkscdkthtc o ppcpapeaag gpsvflfppk
Dotam_84. 251 pkdtlmisrt pevtcvvvdv shedpevkfn
66 wyvdgvevhn aktkpreeqy
301 nstyrvvsvl tvlhqdwlng keykckvsnk algapiekti skakgqprep
351 qvytlppcrd eltknqvslw clvkgfypsd iavewesngq pennykttpp
401 vldsdgsffl yskltvdksr wqqgnvfscs vmhealhnhy tqkslslspg
451 ggggsggggs ggggsggggs qsveesggrl vtpgtpltlt ctvsgfslst
501 ysmswvrqap gkglewigfi gsrgdtyyas wakgrftvsr tsttvdlkit
551 spttedtaty fcarerdpyg ggaypphlwg pgtlvtvss
26 Ligante GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
1 evqlvesggg vvqpgrslrl scsasgfdft tywmswvrqa pgkglewige Immunome 51 ihpdsstiny apslkdrfti srdnakntlf lqmdslrped 27 dics tgvyfcasly hNM14 101 fgfpwfaywg qgtpvtvssa stkgpsvfpl apsskstsgg taalgclvkd
SEQ ID NO Descrição Sequência
151 yfpepvtvsw nsgaltsgvh tfpavlqssg lyslssvvtv pssslgtqty
201 icnvnhkpsn tkvdkkvepk scdkthtcpp cpapeaaggp svflfppkpk
251 dtlmisrtpe vtcvvvdvsh edpevkfnwy vdgvevhnak tkpreeqyns
301 tyrvvsvltv lhqdwlngke ykckvsnkal gapiektisk akgqprepqv
351 ytlppcrdel tknqvslwcl vkgfypsdia vewesngqpe nnykttppvl
401 dsdgsfflys kltvdksrwq qgnvfscsvm healhnhytq kslslspggg
451 ggsggggsgg ggsggggsqs veesggrlvt pgtpltltct vsgfslstys
501 mswvrqapgk glewigfigs rgdtyyaswa kgrftvsrts ttvdlkitsp
551 ttedtatyfc arerdpyggg aypphlwgpg tlvtvss
1 evqlvesggg vvqpgrslrl scsasgfdft tywmswvrqa pgkglewige
51 ihpdsstiny apslkdrfti srdnakntlf lqmdslrped tgvyfcasly
101 fgfpwfaywg qgtpvtvssa stkgpsvfpl apsskstsgg taalgclvkd 151 yfpepvtvsw nsgaltsgvh tfpavlqssg lyslssvvtv pssslgtqty
SEQ ID NO Descrição Sequência
201 icnvnhkpsn tkvdkkvepk scdkthtcpp cpapeaaggp svflfppkpk
251 dtlmisrtpe vtcvvvdvsh edpevkfnwy vdgvevhnak tkpreeqyns
301 tyrvvsvltv lhqdwlngke ykckvsnkal gapiektisk akgqprepqv
351 ctlppsrdel tknqvslsca vkgfypsdia vewesngqpe nnykttppvl
401 dsdgsfflvs kltvdksrwq qgnvfscsvm healhnhytq kslslspggg
451 ggsggggsgg ggsggggsav ltqtpspvsp avggtvtisc qsshsvysdn
501 dlawyqqklg qppklliyqa sklasgvssr fsgsgsgtqf tltisgvqsd
551 daatyyclgg yddesdtygf gggtevvvk
1 diqltqspss lsasvgdrvt itckasqdvg tsvawyqqkp gkapklliyw
51 tstrhtgvps rfsgsgsgtd ftftisslqp ediatyycqq yslyrsfgqg
101 tkveikrtva apsvfifpps deqlksgtas vvcllnnfyp reakvqwkvd
151 nalqsgnsqe svteqdskds tyslsstltl skadyekhkv yacevthqgl 201 sspvtksfnr gec
SEQ ID NO Descrição Sequência CDR1 de cadeia 28 DTYIH pesada <ERBB2> CDR2 de cadeia 29 RIYPTNGYTRYADSVKG pesada <ERBB2> CDR3 de cadeia 30 WGGDGFYAMDY pesada <ERBB2> CDR1 de 31 cadeia leve RASQDVNTAVA <ERBB2> CDR2 de 32 cadeia leve SASFLYS <ERBB2> CDR3 de 33 cadeia leve QQHYTTPPT <ERBB2> Domínio
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDT variável de
YIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSV 34 cadeia
KGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC pesada
SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS <ERBB2>
SEQ ID NO Descrição Sequência Domínio DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTA variável de VAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG 35 cadeia leve SRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPT <ERBB2> FGQGTKVEIK
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDT YIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSV KGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGP
SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT Cadeia
VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT pesada 1
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS (knob) do
CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL ERbB2/Pb-
MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE Dotam 36 VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN trivalente,
GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV biespecífic
YTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE o
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV (P1AD982
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL 7)
SPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVTLKES GPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQP PGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKD TSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYG
GGAYPPHLWGRGTLVTVSS Cadeia EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDT 37 pesada 2 YIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSV (hole) do KGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC
SEQ ID NO Descrição Sequência ERbB2/Pb- SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGP Dotam SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT trivalente, VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT biespecífic VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS o CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL (P1AD982 MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE 7) VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN
GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQ QKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFG GGTKVEIK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTA Cadeia VAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG Leve SRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPT 38 <ErbB2> FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA (P1AD982 SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE 7) SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC CDR1 de 39 cadeia YSWIN pesada
SEQ ID NO Descrição Sequência <CD20> CDR2 de cadeia 40 RIFPGDGDTDYNGKFKG pesada <CD20> CDR3 de cadeia 41 NVFDGYWLVY pesada <CD20> CDR1 de 42 cadeia leve RSSKSLLHSNGITYLY <CD20> CDR2 de 43 cadeia leve QMSNLVS <CD20> CDR3 de 44 cadeia leve AQNLELPYT CD20> Domínio
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSY variável de
SWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYN 45 cadeia
GKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVY pesada
YCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSS <CD20> Domínio DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSN 46 variável de GITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPD cadeia leve RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNL
SEQ ID NO Descrição Sequência <CD20> ELPYTFGGGTKVEIK
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSY SWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYN GKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVY YCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGP
SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT Cadeia
VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT pesada 1
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS (knob) do
CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL CD20/Pb-
MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE Dotam 47 VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN trivalente,
GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV biespecífic
YTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE o
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV (P1AD982
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL 6)
SPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVTLKES GPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQP PGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKD TSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYG
GGAYPPHLWGRGTLVTVSS Cadeia QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSY pesada 2 SWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYN (hole) do GKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVY 48 CD20/Pb- YCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGP Dotam SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT trivalente, VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
SEQ ID NO Descrição Sequência biespecífic VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS o CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL (P1AD982 MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE 6) VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN
GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQ QKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFG GGTKVEIK
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSN Cadeia GITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPD Leve RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNL 49 <CD20> ELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKL (P1AD982 KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS 6) GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK
HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYV P1AE1766
AWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGS >CEA
GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFT 50 Cadeia
FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTA Leve RK
SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
SEQ ID NO Descrição Sequência
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEF GMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVE EFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEP
KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD P1AE1766
TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG CEA
VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD Cadeia
WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR 51 Pesada
EPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD com
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS DOTAM VL
KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK / CH1
SLSLSPGGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQ MTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDL AWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDT YGFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC
NVNHKPSNTKVDKKVEPKSC P1AE1766 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEF 52
CEA GMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVE
SEQ ID NO Descrição Sequência Cadeia EFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY Pesada YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTK com GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP
DOTAM VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VH / CK VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVTL KESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWI RQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTI SKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERD PYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSM P1AE1767
SWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKG >DOTAM 53 RLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR “LC” com
ERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASVAAP VH / CK SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV
SEQ ID NO Descrição Sequência
QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYV
AWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGS P1AE1767
GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFT
CEA 54 FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTA Cadeia
SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE Leve RK
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEF GMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVE EFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY
YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTK P1AE1767 GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP
CEA VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV Cadeia VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEP Pesada KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD 55 com TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG
DOTAM VL VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD / CH1 WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR (knob) EPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQ MTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDL
SEQ ID NO Descrição Sequência
AWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDT YGFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEF GMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVE EFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTK
GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP P1AE1767 VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
CEA VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEP 56 Cadeia KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD Pesada TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG (hole) VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYV 57 P1AE1768 AWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGS >CEA LC GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFT
FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTA
SEQ ID NO Descrição Sequência
SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDN DLAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDE
SDTYGFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSS P1AE1768
KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT > DOTAM
SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ Cadeia
TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP 58 Pesada
CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC com VL /
VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR CH1
EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV (hole)
SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRD ELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEF
GMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVE P1AE1768 EFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY
CEA YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTK 59 Cadeia GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP pesada VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV (knob) VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEP
KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG
SEQ ID NO Descrição Sequência
VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSM
SWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKG P1AE1768 RLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR
DOTAM ERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASVAAP 60 “LC” VH / SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV
CK QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSM
SWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKG P1AE1769 RLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR
DOTAM ERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASVAAP 61 “LC” com SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV VH / CK QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYV P1AE1769 AWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGS 62
CEA LC GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTA
SEQ ID NO Descrição Sequência
SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEF GMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVE EFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEP
KSCDGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDR P1AE1769
VTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIY CEA HC
QASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE com CEA
DFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIKSSA 63 VH / CH1 /
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF DOTAM VL
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL / CH1
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK (hole)
VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK 64 P1AE1769 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEF
SEQ ID NO Descrição Sequência
CEA HC GMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVE (knob) EFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY
YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYV AWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGS
GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFT P1AE1770 65 FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTA
CEA LC SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC P1AE1770 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEF
CEA HC GMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVE 66 com EFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY
DOTAM YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTK scFab: GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP
SEQ ID NO Descrição Sequência
DOTAM VL VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV / Ck / VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEP Ligante / KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD VH CH1 TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG (knob) VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQ MTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDL AWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDT YGFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGVTLKE SGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQ PPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISK DTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPY GGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 67 P1AE1770
SEQ ID NO Descrição Sequência
CEA HC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEF (hole) GMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVE
EFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK
[0531] As divulgações de todas as patentes e literaturas científicas citadas são expressamente e integralmente incorporadas ao presente pela referência.
[0532] A invenção é agora descrita com referência a exemplos específicos. Será entendido que diversas outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
DESCRIÇÃO DA IMUNIZAÇÃO IMUNIZAÇÃO DE COELHOS
[0533] Uma mistura 1:1 das 2 frações enantioméricas Pb-
DOTAM-alquil-PEG 4 -KLH (MS2-DOTAM KLH Fração 1 e MS2-DOTAM KLH Fração 2) foi usada para a imunização de coelhos brancos da Nova Zelândia (NZW) ou coelhos transgênicos compreendendo um locus de imunoglobulina humana conforme relatado nos documentos WO 2000/46251, WO 2002/12437, WO 2005/007696, WO 2006/047367, US 2007/0033661 e WO 2008/027986. Cada coelho foi imunizado com 500 μg da mistura imunogênica, emulsionada com adjuvante de Freund completo, no dia 0 por aplicação intradérmica e 500 μg cada nos dias 7, 14, 28, 56 por alternância de aplicações intramuscular e subcutânea. Posteriormente, os coelhos receberam imunizações subcutâneas mensais de 500 μg, e pequenas amostras de sangue foram coletadas 7 dias após a imunização para a determinação dos títulos séricos. Uma amostra de sangue maior (10% do volume de sangue total estimado) foi coletada durante o terceiro e durante o nono mês de imunização (em 5-7 dias após a imunização), e as células mononucleares periféricas foram isoladas, as quais foram usadas como fonte de antígeno células B específicas no processo de clonagem de células B (Exemplo 2).
DETERMINAÇÃO DE TÍTULOS SÉRICOS (ELISA)
[0534] Cada uma das 2 frações enantioméricas Pb-DOTAM (PJRD05.133F1 ou PJRD05.133F2) foi imobilizada em uma placa de 96 poços NUNC Maxisorp a 1 μg/mL, 100 μL/poço, em PBS, seguido pelo bloqueio da placa com 2% Proteína C em PBS, 200 μL/poço; aplicação de diluições seriadas de antissoros, em duplicatas, em 0,5% Proteína C em PBS, 100 μL/poço; detecção com anticorpo de burro anti-IgG coelho conjugado com HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152; 1/16 000) e estreptavidina-HRP; cada um diluído em 0,5% de proteína C em PBS, 100 µL/poço. Para todas as etapas, as placas foram incubadas durante 1 h a 37 ºC. Entre todas as etapas, as placas foram lavadas 3 vezes com 0,05% de Tween 20 em PBS. O sinal foi desenvolvido por adição de substrato solúvel BM Blue POD Substrate soluble (Roche), 100 μL/poço; e a reação foi interrompida pela adição de HCl 1 M, com 100 μL/poço. A absorbância foi lida a 450 nm, contra 690 nm como referência. Título foi definido como a diluição do antissoro resultante no sinal de semimáximo.
EXEMPLO 2
CLONAGEM DE CÉLULAS B A PARTIR DE COELHOS ISOLAMENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO (PBMCS) DE COELHO
[0535] Amostras de sangue foram coletada de coelhos imunizados. O sangue total contendo EDTA foi diluído duas vezes com PBS 1x (PAA, Pasching, Áustria) antes da centrifugação de densidade usando Lympholyte® mamífero (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontário, Canadá) de acordo com as especificações do fabricante. As PBMCs foram lavadas duas vezes com PBS 1x.
MEIO B5 EL-4
[0536] RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Alemanha) suplementado com 10% de SBF (Hyclone, Logan, UT, EUA), glutamina 2 mM, solução de penicilina / estreptomicina a 1% (PAA, Pasching, Áustria), piruvato de sódio 2 mM, HEPES 10 mM (PAN Biotech, Aidenbach, Alemanha) e b- mercaptoetanol 0,05 mM (Gibco, Paisley, Escócia).
REVESTIMENTO DE PLACAS
[0537] Placas estéreis de 6 poços para cultura de células foram revestidas com 2 μg/mL de KLH em tampão carbonato (0,1 M de bicarbonato de sódio, 34 mM de hidrogenocarbonato de sódio, pH 9,55) durante a noite a 4ºC. As placas foram lavadas em PBS estéril três vezes antes do uso. As placas estéreis de 6 poços revestidas com estreptavidina (Microcoat, Bernried, Alemanha) foram revestidas com uma mistura de enantiômero 1+1 de TCMC- Pb-dPEC3-Biotina Isômero A biotinilado (1 µg/mL) e B (1 µg/mL) em PBS por 3 h em temperatura ambiente. Antes da etapa de seleção, essas placas de 6 poços foram lavadas três vezes com PBS estéril.
DEPLEÇÃO DE MACRÓFAGOS/MONÓCITOS
[0538] As PBMCs foram semeadas em placas de 6 poços revestidas com KLH estéreis para depletar macrófagos e monócitos por meio de adesão inespecífica e para remover as células que se ligam a KLH. Cada poço foi preenchido com no máximo 4 mL de meio e até 6 x 10 6 PBMCs de coelhos imunizados e foram deixados ligar por 1 h a 37ºC e 5% de CO 2. As células no sobrenadante (linfócitos do sangue periférico (PBLs)) foram utilizadas para a etapa de seleção de antígeno.
ENRIQUECIMENTO DE CÉLULAS B NO ENANTIÔMERO TCMC CONTENDO PB
[0539] Placas de 6 poços revestidas com a mistura de enantiômero de TCMC-Pb-dPEC3-Biotina Isômero A e B foram semeadas com até 6 x 106 PBLs por 4 mL de meio e a ligação foi permitida por 1 h a 37ºC e 5% de CO2. As células não aderentes foram cuidadosamente removidas por lavagem dos poços por 1-3 vezes com PBS 1x. As células aderentes remanescentes foram desprendidas utilizando tripsina durante 10 min a 37 ºC sob 5% de CO2. A tripsinização foi interrompida com meio EL-4 B5. As células foram mantidas em gelo até a coloração por imunofluorescência.
COLORAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA E CITOMETRIA DE FLUXO
[0540] O anti-IgG FITC (AbD Serotec, Düsseldorf, Alemanha) foi utilizado para separação de células única. Para a coloração de superfície, as células a partir da etapa de depleção e enriquecimento foram incubadas com o anticorpo anti-IgG FITC em PBS e incubadas durante 45 minutos no escuro a 4 ºC. Após a coloração as PBMCs foram lavadas duas vezes com PBS gelado. Finalmente, as PBMCs foram novamente suspensas em PBS gelado e imediatamente submetidas a análises FACS. O iodeto de propídio em uma concentração de 5 μg/mL (BD Pharmingen, Sa N Diego, CA, EUA) foi adicionado antes da FACS para discriminar entre células mortas e vivas.
[0541] Um FACSAria da Becton Dickinson equipado com um computador e software FACSDiva (BD Biosciences, EUA) foram utilizados para classificar célula única.
CULTIVO DE CÉLULAS B
[0542] O cultivo das células B de coelho foi preparado por um método descrito por Lightwood et al (J Immunol Methods, 2006, 316: 133-143).
Resumidamente, as células B de coelho separadas individuais foram incubadas em placas de 96 poços com 200 μL/poço de meio EL-4 B5 contendo células Pansorbina (1:100000) (CALBiochem (Merck), Darmstadt, Alemanha), 5% de sobrenadante de timócito de coelho (MicroCoat, Bernried, Alemanha) e células de timoma EL-4-B5 murinas gama-irradiadas (5 × 104/poço) durante 7 dias a 37 ºC em uma incubadora. Os sobrenadantes da cultura de células B foram removidos por triagem e as células restantes foram imediatamente coletadas e congeladas a - 80 ºC em 100 μL de tampão RLT (Qiagen, Hilden, Alemanha).
EXEMPLO 3
EXPRESSÃO DE ANTICORPO DE COELHO AMPLIFICAÇÃO DE DOMÍNIOS V POR PCR
[0543] O RNA total foi preparado a partir de lisado de células B (ressuspenso em tampão RLT - Qiagen - Cat. Nº 79216) usando o kit RNA NucleoSpin 8/96 (Macherey & Nagel; 740709.4, 740698) de acordo com o protocolo do fabricante. RNA foi fluido com 60 μL de água livre de RNase. 6 μL de RNA foram utilizados para gerar cDNA pela reação da transcriptase reversa utilizando a mistura comercial Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen 18080-400) e um primer oligo-dT de acordo com as instruções do fabricante. Todas as etapas foram realizadas em um Hamilton ML Star System. 4 μL de cDNA foram utilizados para amplificar as regiões variáveis de cadeia pesada e leve (VH e VL) de imunoglobulina utilizando o AccuPrime Supermix (Invitrogen 12344-040) em um volume final de 50 μL usando os primers rbHC.up e rbHC.do para a cadeia pesada e os primers rbLC.up e rbLC.do para as cadeias leves (Tabela 3). Todos os iniciadores diretos eram específicos para o peptídeo sinal (respectivamente VH e VL), enquanto os iniciadores reversos eram específicos para as regiões constantes (respectivamente VH e VL). As condições de PCR para o RbVH + RbVL foram as seguintes: aq. inicial a 94 ºC durante 5 min; 35 ciclos de 20 segundos a 94ºC, 20 segundos a 70ºC, 45 segundos a 68ºC, e uma extensão final a 68ºC durante 7 min.
TABELA 3 rbHC.up AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTC rbHCf.do CCATTGGTGAGGGTGCCCGAG rbLC.up AAGCTTGCCACCATGGACAYGAGGGCCCCCACTC rbLC.do CAGAGTRCTGCTGAGGTTGTAGGTAC
[0544] 8 μL da solução de PCR de 50 μL foram carregados em um gel E-48 a 2% (Invitrogen G8008-02). As reações de PCR positivas foram limpas utilizando o kit NucleoSpin Extract II (Macherey & Nagel; 740609250) seguindo o protocolo do fabricante e eluídas em 50 μL de tampão de eluição.
Todas as etapas foram realizadas em um sistema Hamilton ML Starlet.
EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE ANTICORPOS MONOCLONAIS BIVALENTES DE COELHO
[0545] Para a expressão recombinante de anticorpos monoclonais bivalentes de coelho, produtos da PCR que codificam VH ou VL foram clonados como cDNA em vetores de expressão pelo método de clonagem em saliência (overhang) (RS Haun et al, Biotechniques (1992) 13, 515-518;. MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256). Os vetores de expressão continham um cassete de expressão consistindo em um promotor 5’ CMV incluindo o íntron A e uma sequência de poliadenilação 3’ BGH. Além do cassete de expressão, o plasmídeo continha uma origem de replicação derivada de pUC18 e um gene de beta-lactamase que confere resistência à ampicilina para amplificação de plasmídeo em E. coli. Foram utilizadas três variantes do plasmídeo básico: um plasmídeo contendo a região constante de IgG de coelho projetado para aceitar as regiões VH enquanto dois plasmídeos adicionais contendo a região constante LC kappa humana ou de coelho para aceitar as regiões VL. Plasmídeos de expressão linearizados que codificam a região constante kappa ou gama e inserções VL / VH foram amplificados por PCR utilizando iniciadores (primers) que se sobrepõem. Os produtos da PCR purificados foram incubados com T4 DNA-polimerase que gerou saliências de fita simples. A reação foi interrompida pela adição de dCTP. Na próxima etapa, o plasmídeo e inserção foram combinados e incubados com recA que induziu a recombinação sítio-específica. Os plasmídeos recombinantes foram transformados em E. coli. No dia seguinte, as colônias que cresceram foram coletadas e testadas para o plasmídeo recombinado correto pela preparação de plasmídeo, análise de restrição e sequenciamento de DNA. Para a expressão do anticorpo, os plasmídeos HC e LC isolados foram transitoriamente cotransfectados em 2mL (placa de 96 poços) de células FreeStyle HEK293-F (Invitrogen R790-07) usando 239-Free Transfection Reagent (Novagen) seguindo o procedimento sugerido pelo fornecedor do reagente. Os sobrenadantes foram coletados após 1 semana e entregues para purificação.
EXEMPLO 4
SELEÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS DE COELHO
[0546] A tabela abaixo mostra as propriedades de vários anticorpos monoclonais bivalentes de coelho. PRIT-0128 foi selecionado como o candidato principal, pois tem ligação comparável para Pb e Bi quelatados, ligação reduzida para outros metais quelatados e alta afinidade (<100pM).
[0547] O ensaio SET (titulação de equilíbrio em solução) foi realizado como descrito abaixo.
[0548] Preparação da placa de ensaio: placas de estreptavidina de 384 poços (Nunc, Microcoat # 11974998001) foram incubadas durante a noite a 4ºC com 25 µL/poço de uma mistura de isômero de biotina-DOTAM em tampão PBS a uma concentração de 20 ng/mL.
[0549] Equilíbrio de amostras de anticorpo anti-DOTAM com quelatos de metal DOTAM livres (Pb, Bi, Ca, Cu, Zn, Mg, Fe): 0,01 nM - 1 nM de anticorpo foram titulados com os quelatos de metal DOTAM relevantes em etapas de diluição de 1:3, 1:2 ou 1:1,7 começando em uma concentração de 2500 nM, 500 nM ou 100 nM de quelato DOTAM-metal. As amostras foram incubadas a 4ºC durante a noite em microplacas seladas de polipropileno de armazenamento REMP (Brooks).
[0550] Após incubação durante a noite, as placas de estreptavidina foram lavadas 3x com 90 µL de PBST por poço. 15 µL de cada amostra da placa de equilíbrio foram transferidos para a placa de ensaio e incubados durante 15 min à temperatura ambiente, seguido por etapas de lavagem com tampão PBST (3x 90 µL). A detecção foi realizada pela adição de 25 µL de um conjugado de anticorpo de cabra anti-IgG humana-POD (Jackson, 109-036-088, 1: 4000 em OSEP), seguido por etapas de lavagem com tampão PBST (6x 90 µL). 25 µL de substrato TMB (Roche Diagnostics GmbH, Cat. No: 11835033001) foram adicionados a cada poço. A medição ocorreu em 370/492 nm em um leitor Safire2 (Tecan).
MATERIAIS:
[0551] 1. Mistura DOTAM-BiotinaA-Isômero: - Mistura dos seguintes componentes, conc. = 20 ng/ml: - Pb-Dotam-Bn-biotina/ TCMC-Pb-dPEG3-Biotina, isômero A; - Pb-Dotam-Bn-biotina/ TCMC-Pb-dPEG3-Biotina, isômero B; - Pb-Dotam-alquil-biotina isômero A; e - Pb-Dotam-alquil-biotina isômero B.
[0552] 2. PBS: DPBS, PAN, P04-36500.
[0553] 3. BSA: Roche, 10735086001.
[0554] 4. Tween 20: Polissorbato 20 (usb, #20605, 500ml).
[0555] 5. PBST: 10x, Roche, #11666789001/0,1% Tween 20.
[0556] 6. OSEP: PBS (10x, Roche, # 11666789001)/0,5% BSA (Albumina de Soro Bovino Fração V, sem ácido graxo, Roche, # 10735086001)/0,05% Tween 20.
TABELA 4 Nome Espécies KD [SET-Títulação] Pb Bi Ca Zn PRIT-0135 WTRa 0,000 0,000 0,001 0,285 PRIT-0129 WTRa 0,001 0,024 0,013 9,251 PRIT-0128 WTRa 0,002 0,003 0,003 8,152 PRIT-0132 WTRa 0,002 0,046 0,002 0,217 PRIT-0134 WTRa 0,002 0,059 0,003 0,443 PRIT-0136 WTRa 0,004 0,029 0,014 131,926 PRIT-0127 WTRa 0,014 0,092 0,015 222,339 PRIT-0107 TgRa 1,1 51,0 48,0 >1000 WTRa: Coelhos tipo selvagem; TgRa: coelhos transgênicos EXEMPLO 5
BIOLOGIA MOLECULAR TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE
[0557] Foram usados métodos padronizados para manipular o DNA conforme descrito em Sambrook, J. et al, “Molecular cloning: A laboratory manual”; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Os reagentes para a biologia molecular foram utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes.
SÍNTESE DE GENES E OLIGONUCLEOTÍDEOS
[0558] Os segmentos de genes desejados foram preparados por síntese química na Geneart GmbH (Regensburg, Alemanha). Os fragmentos de gene sintetizados foram clonados em um plasmídeo de E. coli para propagação/amplificação. As sequências de DNA dos fragmentos de genes subclonados foram verificadas pelo sequenciamento de DNA. Alternativamente, fragmentos de DNA sintéticos curtos foram montados pelo anelamento de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente ou via PCR. Os respectivos oligonucleotídeos foram preparados pela metabion GmbH (Planegg- Martinsried, Alemanha).
DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS
[0559] A concentração de proteína de polipeptídeos purificados foi determinada por meio da medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo.
GERAÇÃO DE PLASMÍDEOS PARA A EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE CADEIAS PESADAS OU LEVES DE ANTICORPO
[0560] As proteínas desejadas foram expressas por transfecção transitória de células de rim embrionário humano (HEK 293). Para a expressão de um gene/proteína desejada (por exemplo, cadeia pesada de anticorpo de comprimento total, cadeia leve de anticorpo de comprimento total ou uma cadeia pesada de anticorpo de comprimento total) contendo um domínio adicional (por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina em seu C-terminal) foi usada uma unidade de transcrição compreendendo os seguintes elementos funcionais: - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato a partir do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o íntron A, - uma região 5' não traduzida (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina murina (SS), - um gene/proteína a ser expresso, e - a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH pA).
[0561] Além disso, a unidade de expressão/cassete incluindo o gene desejado a ser expresso no plasmídeo de expressão de mamífero de base/padrão continha uma origem de replicação a partir do vetor pUC18, que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli, e um gene da beta lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli.
A) PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO PARA CADEIAS PESADAS DE ANTICORPOS
[0562] Os genes codificantes de uma cadeia pesada de anticorpo incluindo genes de fusão C-terminal compreendendo uma cadeia pesada de anticorpo completa e funcional, seguida por um domínio V pesado ou V leve de anticorpo adicional foram montados pela fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência (V- pesado ou V-leve) separados por um ligante G4Sx4 ao C-terminal do domínio CH3 de uma molécula de IgG humana (VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3-ligante-VH ou VH-CH1-dobradiça-CH2- CH3-ligante-VL). As moléculas de anticorpos recombinantes que carregam um domínio VH e um domínio VL nos C-terminais dos dois domínios CH3, respectivamente, foram expressas usando a tecnologia knob-into-hole.
[0563] Os plasmídeos de expressão para a expressão transitória de uma cadeia pesada de anticorpo com um domínio VH ou VL C-terminal em células HEK293 compreendiam além do fragmento de cadeia pesada de anticorpo com VH ou cassete de expressão de domínio VL C-terminal, uma origem de replicação a partir do vetor pUC18, que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli, e um gene de beta-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli. A unidade de transcrição do fragmento de cadeia pesada do anticorpo com o gene de fusão de domínio VH ou VL C-terminal compreende os seguintes elementos funcionais: - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato a partir do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o íntron A, - uma região 5' não traduzida (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina murina, - - um ácido nucleico codificante da cadeia pesada de anticorpo (VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3-ligante-VH ou VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3-ligante- VL), e - a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH pA).
[0564] Os plasmídeos de expressão que codificam todos polipeptídeos/proteínas de cadeia pesada mencionados na Tabela 2 foram construídos de acordo com os métodos como descrito anteriormente.
B) PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO PARA CADEIAS LEVES DE ANTICORPO
[0565] Os genes que coficam uma cadeia leve de anticorpo compreendendo uma cadeia leve de anticorpo completa e funcional foram montados por fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência.
[0566] O plasmídeo de expressão para a expressão transitória de uma cadeia leve de anticorpo além do fragmento de cadeia leve de anticorpo, uma origem de replicação do vetor pUC18 que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli, e um gene da beta-lactamase que confere resistência a ampicilina em E.
coli. A unidade de transcrição do fragmento de cadeia leve de anticorpo compreende os seguintes elementos funcionais: - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato a partir do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o íntron A, - uma região 5' não traduzida (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina murina,
- - uma cadeia leve de anticorpo (VL-CL) que codifica o ácido nucleico, e - a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH pA).
[0567] Os plasmídeos de expressão que codificam todos polipeptídeos/proteínas de cadeia leve mencionados na Tabela 2 foram construídos de acordo com os métodos descritos anteriormente.
[0568] Uma representação esquemática do formato usado é ilustrada na Figura 1. A estrela refere-se às substituições PGLALA: 1 refere-se ao ligante DOTAM e 2 e 3 referem-se ao ligante antialvo (aqui CEA).
EXEMPLO 6
EXPRESSÃO TRANSITÓRIA DE MOLÉCULAS PRIT EXPRESSÃO TRANSITÓRIA DE MOLÉCULAS DE ANTICORPO
[0569] As moléculas de anticorpo foram produzidas pela transfecção transitória de células HEK293 (linhagem de células derivadas de rim embrionário humano 293) cultivadas em meio F17 (Invitrogen Corp.). Para a transfecção foi utilizado o reagente de transfecção “293-Free” (Invitrogen). As respectivas moléculas de cadeia pesada e leve do anticorpo, conforme descrito acima, foram expressas a partir de plasmídeos de expressão individuais. As transfecções foram efetuadas seguindo as instruções do fabricante. Os sobrenadantes da cultura de células contendo imunoglobulina foram coletados três a sete (3-7) dias após a transfecção. Os sobrenadantes foram armazenados em baixa temperatura (por exemplo, -80 ºC ) até a purificação.
[0570] Informações gerais sobre a expressão recombinante de imunoglobulinas humanas em células HEK293 são fornecidas, por exemplo, em: Meissner, P., et al, Biotechnol.. Bioeng. 75(2001) 197-203. EXEMPLO 7
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
[0571] O sobrenadante da cultura de células coletado foi aplicado em uma coluna (1,1 cm de diâmetro 5 cm de comprimento) cheia com 5 mL de resina de Proteína A (Mab Select Sure) a uma velocidade de fluxo de 5 mL/min.
Após lavagem com 20 mL de tampão PBS, o anticorpo foi eluído com 25 mL de citrato de Na, pH 3,0.
[0572] O eluato foi então ajustado para pH 5,0 com Tris 1 M, pH 9,0 e incubado a 4ºC durante a noite.
[0573] Após a centrifugação por 10 min a 10000 x g e filtração através de um filtro de 0,2 μm o filtrado foi, em seguida, aplicado em uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho (2,6 cm de diâmetro e 60 cm de comprimento) Superdex 200 previamente equilibrada em um tampão contendo 20 mM de Histidina, 140 mM de NaCl a pH 6,0 e eluída com o mesmo tampão.
[0574] O pico de eluição principal contendo o anticorpo purificado foi coletado e a pureza final foi analisada.
TABELA 5 - MATERIAL conc. do Fornecedor estoque nº de Ident. nº do Lote [mg/mL] produzido RS-CEA_Il2v 10,5 R06895882 GMP-batch 1 internamente Jackson Immuno Chrome Pure Human IgG 12,0 009-000-003 116598 Research Pb-DOTAM-FITC Macrocyclics 1,0 FRRD04-37 cabra <hu IgG(H+L)> - Invitrogen 2,0 A11013 1173476 AlexaFluor 488 PBS sem Mg e Ca PAN Biotech P04-36500 4780114 FKS Gibco Gibco 10500-064 07Q1416K 5 mL Tubo de fundo BD Falcon 352054 1094065 redondo (tubo FACS) Placa PP de 96 poços Costar 3357 10113004 Fundo em V
EXEMPLO 8
FACS
[0575] Células MKN-45 foram destacadas do frasco de cultura usando tripsina e foram contadas usando um contador de células Casy. Após a peletização a 4ºC, 300g as células foram ressuspensas em tampão FACS (2,5% SBF em PBS), ajustado para 2,0E+06 células/mL dispensado em placas de 96 poços PP com fundo em V (25 µL/poço = 5,0 E+04células/poço).
- COLORAÇÃO FACS USANDO DOTAM-FITC
[0576] Os anticorpos específicos do CEA primários foram ajustados para 40 µg/mL em tampão FACS, resultando em uma concentração final de 10 µg/mL. RS-CEA-Il2v foi usado como referência. Pb-DOTAM marcado com FITC e os anticorpos primários foram usados em razões equimolares. Eles foram misturados e incubados por 10 min em temperatura ambiente para permitir a ligação dos anticorpos a Pb-DOTAM.
Subsequentemente, 20 µL da mistura preparada foram adicionados a 25 µL de suspensão de células e incubados durante 1 h a 4ºC. As células foram então lavadas duas vezes em tampão FACS e ressuspensas em tampão FACS 70 µL/poço para medição usando um FACS Canto (BD, Pharmingen).
- COLORAÇÃO FACS USANDO <HU KAPPA>
[0577] Os anticorpos específicos do CEA primários foram ajustados para 20 µg/mL em tampão FACS, resultando em uma concentração final de 10 µg/mL. RS-CEA-Il2v foi usado como referência. 20 µL foram adicionados a 25 µL de suspensão de células e incubados durante 1 h a 4ºC.
As células foram então lavadas duas vezes em tampão FACS. Após a lavagem, as células foram ressuspensas em 50 µL de tampão FACS contendo anticorpo secundário (<huIgG>-Alexa488, c = 10 µg/mL) e incubadas 1h a 4ºC. As células foram então lavadas duas vezes em tampão FACS e ressuspensas em tampão FACS 70 µL/poço para medição usando um FACS Canto (BD,
Pharmingen).
[0578] Na Figura 36 é ilustrado um exemplo que mostra a ligação de um anticorpo (PRIT-0165) às células MKN-45, detectando-o usando a detecção secundária (painel direito, Alexa 488) ou DOTAM FITC (painel esquerdo, FITC-A).
EXEMPLO 9
HUMANIZAÇÃO
[0579] Para a identificação de uma estrutura aceptora humana adequada durante a humanização do ligante DOTAM PRIT-0128, foi usada uma combinação de duas metodologias. Por um lado, foi adotada uma abordagem clássica procurando uma estrutura aceptora com alta homologia de sequência com o anticorpo parental e enxerto subsequente das regiões CDR nesta estrutura aceptora. Cada diferença de aminoácidos das estruturas identificadas para o anticorpo parental foi avaliada quanto ao impacto na integridade estrutural do ligante e as retromutações em relação à sequência parental foram introduzidas sempre que apropriado.
[0580] Por outro lado, uma ferramenta in silico desenvolvida internamente foi usada para prever a orientação dos domínios VH e VL das versões humanizadas entre si (vide o documento WO2016/062734). Isso foi realizado para os enxertos virtuais das CDRs em todas as possíveis combinações de linhagens germinativas humanas. Os resultados foram comparados com a orientação do domínio VH-VL dos ligantes parentais para selecionar combinações de regiões estruturais que são próximas em geometria em relação aos anticorpos originais.
[0581] Em cada caso, as seguintes regiões CDR do anticorpo parental foram enxertadas na estrutura aceptora (numeração de acordo com Kabat): - VH_CDR1: 31-35;
- VH_CDR2: 50-65; - VH_CDR3: 95-102; - VL_CDR1: 24-34; - VL_CDR2: 50-56; e - VL_CDR3: 89-97.
[0582] As variantes de humanização foram produzidas no formato final com o ligante DOTAM fundido ao C-terminal do Fc da IgG direcionada ao tumor como uma fusão VH/VL Fv (sem CH1 e Ck respectivamente). A molécula derivada de ligante DOTAM parental (não humanizado) PRIT-0128 no formato final é chamada de PRIT-0156.
[0583] A região estrutural (framework) do Herceptin também foi incluída devido à adequação em termos de previsão de VH/VL e ao aumento de estabilidade da região estrutural. Para todas as variantes humanizadas de VH, o elemento J humano hJH2 foi usado. Para todas as variantes humanizadas VK, foi usado o elemento J humano hJK4.
[0584] O HC4 é um enxerto de PRIT-128 na linha germinal humana IGHV3-30-02 com uma retromutação A49G (kabat ).
[0585] Para obter o HC5 de cadeia pesada variável, as CDRs foram enxertadas na linhagem germinal humana hVH_2_26 com A49G como uma retromutação e a deleção do primeiro aminoácido para refletir o N-terminal original do coelho.
[0586] A região V do Herceptin enxertada (derivada da linhagem germinal humana hVH3_66), a HC7 variante é caracterizada por algumas modificações na estrutura aceptora: deleção de E N-terminal, A49G, A71R, e S93A.
[0587] Para HC10, as CDRs do PRIT-128 foram enxertadas na linhagem germinal humana IGHV4_34_01.
[0588] Aqui, o N-terminal foi modificado, começando com V2, de modo a refletir o anticorpo de coelho originais começando com Q2. Além disso, G29F e F31L foram considerados como retromutação na nomenclatura de Kabat, bem como V71R e F78V na região estrutural 3 (framework 3).
[0589] Para a cadeia leve LC1, as CDRs foram enxertadas na linhagem germinativa humana IGKV1_39_01 sem qualquer retromutação. O início foi escolhido como I2 para refletir o Ab de coelho original começando com A2.
[0590] A cadeia leve variante LC3 foi obtida por enxerto dos CDRs na linhagem germinativa humana hVK1_5. D1 foi deletado e uma retromutação I2A foi considerada como um novo N-terminal. Como retromutações adicionais, K42Q e A43P foram levadas em consideração.
[0591] Nem todas as possíveis combinações da matriz de humanização foram produzidas, mas uma seleção de combinações definidas foi escolhida com base em considerações como a predição VH/VL e a sequência de riscos da combinação fornecida.
[0592] O objetivo da humanização era obter ligantes humanizados que não perdessem mais do que um fator de 10 em termos de afinidade para DOTAM e apresentassem estabilidade aumentada, se possível. Isto foi conseguido com vários ligantes de afinidade comparável ou ainda melhor para DOTAM, bem como um aumento da estabilidade térmica medida por DLS de cerca de 10-15ºC. Veja as tabelas 7 e 8, abaixo.
EXEMPLO 10
DETERMINAÇÃO DA KD BASEADA NO EQUILÍBRIO EM SOLUÇÃO
[0593] Para rastrear uma quantidade maior de candidatos a humanização quanto à afinidade destes para Pb-DOTAM, foi utilizada a titulação de equilíbrio de solução (SET).
[0594] A Tabela 6 detalha a determinação de afinidade baseada em SET de ligantes DOTAM humanizados selecionados contra Pb-DOTAM.
Todos os anticorpos na Tabela 6 são anticorpos biespecíficos que compreendem a ligação bivalente ao CEA e a ligação monovalente ao Pb-
Dotam (formato 2:1, vide a Figura 1):
TABELA 6 Nome da molécula Combinação HC / LC SET Pb-DOTAM (pM) humanizada
PRIT-0187-0002 HC10 LC1 0,03 PRIT-0193-0002 HC5 LC3 0,36 PRIT-0195-0004 HC10 LC3 0,40 PRIT-0156-0004 Molécula Parental 0,43 PRIT-0182-0002 HC8 LC7 5,54 PRIT-0189-0002 HC7 LC2 5,81 PRIT-0185-0002 HC 2 LC1 5,87 PRIT-0192-0002 HC2 LC3 8,04 PRIT-0183-0004 HC2 LC2 8,11 PRIT-0197-0002 HC7 LC1 8,69 PRIT-0198-0002 HC7 LC3 9,09 PRIT-0182-0004 HC8 LC7 17,14 PRIT-0183-0002 HC2 LC2 22,45 PRIT-0180-0004 HC9 LC6 26,10 PRIT-0190-0002 HC9 LC2 33,83 PRIT-0194-0002 HC8 LC3 34,63 PRIT-0199-0002 HC9 LC1 43,91 PRIT-0180-0002 HC9 LC6 47,70 PRIT-0188-0002 HC4 LC2 54,34 PRIT-0178-0004 HC1 LC6 60,06 PRIT-0179-0004 HC4 LC6 64,92 PRIT-0181-0002 HC4 LC7 65,11 PRIT-0179-0002 HC4 LC6 65,81 PRIT-0178-0002 HC1 LC6 66,68 PRIT-0187-0004 HC10 LC1 78,09 PRIT-0184-0002 HC1 LC1 80,56 PRIT-0200-0002 HC9 LC3 83,24
Nome da molécula Combinação HC / LC SET Pb-DOTAM (pM) humanizada PRIT-0191-0002 HC1 LC3 111,10 EXEMPLO 11
DETERMINAÇÃO DE KD BASEADA EM KINEXA
[0595] Para uma análise mais detalhada e um método ortogonal para determinação da afinidade, foi usado o Kinexa.
INSTRUMENTAÇÃO E MATERIAIS
[0596] Foi usado um instrumento KinExA 3200 da Sapidyne Instruments (Boise, ID) com amostrador automático. Esferas de polimetilmetacrilato (PMMA) foram adquiridas da Sapidyne, enquanto o PBS (solução salina tamponada com fosfato), BSA (albumina sérica bovina fração V) e os anticorpos anti-DOTAM foram preparados internamente (Roche). O anticorpo de cabra Anti-fragmento Fc de IgG humana de afinidade purificada conjugado com Dylight650® absorvido de forma cruzada foi adquirido pela Bethyl Laboratories (Montgomery, TX). Os antígenos Pb-DOTAM biotinilados (Pb-DOTAM-alquil-biotina isômero A e B, Pb-DOTAM-Bn-biotina/TCMC-Pb- dPEG3-Biotina, isômero A e B) e o Pb-DOTAM não biotinilado foram obtidos da AREVA Med (Bethesda, MD).
PREPARAÇÃO DE ESFERAS REVESTIDAS COM ANTÍGENO
[0597] As esferas PMMA foram revestidas de acordo com o protocolo do manual KinExA para moléculas biotiniladas (Sapidyne).
Resumidamente, primeiro, foram adicionados 10 µg de Biotina-BSA (Thermo Scientific) em 1 mL de PBS (pH 7,4) por frasco (200 mg) de esferas para revestimento de adsorção. Após rotação durante 2 h em temperatura ambiente, o sobrenadante foi removido e as esferas foram lavadas 5 vezes com 1 mL de PBS. Depois, 1 mL de 100 µg de NeutrAvidin Biotin-Binding Protein (Thermo
Scientific) em PBS contendo 10 mg/mL de BSA foi adicionado às esferas e incubado em temperatura ambiente por mais 2 h para acoplar NeutrAvidin às esferas e fornecer biotina adicional sítios de ligação para ligação subsequente de proteínas biotiniladas. As esferas revestidas com NeutrAvidin foram então enxaguadas 5 vezes com 1 mL de PBS. Finalmente, as esferas foram revestidas com 200 ng/mL de mistura de isômero Pb-DOTAM biotinilado (50 ng para cada isômero) em PBS e incubadas por mais 2 h em temperatura ambiente. As esferas foram então ressuspensas em 30 mL de PBS e usadas imediatamente.
ENSAIOS DE EQUILÍBRIO KINEXA
[0598] Todos os experimentos KinExA foram realizados à temperatura ambiente (TA) utilizando PBS pH 7,4 como tampão de corrida. As amostras foram preparadas em tampão de corrida suplementado com 1 mg/mL BSA (“tampão de amostra”). Foi usada uma velocidade de fluxo de 0,25 mL/min. Uma quantidade constante de anticorpo anti-DOTAM com concentração no sítio de ligação de 5 pM foi titulada com antígeno Pb-DOTAM por diluição em série dupla começando em 100 pM (faixa de concentração de 0,049 pM - 100 pM). Uma amostra de anticorpo sem antígeno serviu como sinal 100% (ou seja, sem inibição). Os complexos antígeno-anticorpo foram incubados em temperatura ambiente por pelo menos 24 horas para permitir que o equilíbrio seja alcançado. As misturas equilibradas passaram através de uma coluna de esferas acopladas com Pb-DOTAM no sistema KinExA a um volume de 5 mL que permitam o anticorpo não ligado a ser capturado pelas esferas sem perturbar o estado de equilíbrio da solução. O anticorpo capturado foi detectado usando 250 ng/mL de anticorpo secundário específico do fragmento Fc anti-humano conjugado com Dylight 650© em tampão de amostra. Cada amostra foi medida em duplicatas para todos os experimentos de equilíbrio.
[0599] O KD foi obtido a partir da análise de regressão não linear dos dados usando um modelo de ligação homogêneo de um local contido no software KinExA (Versão 4.0.11) usando o método de “análise padrão”. O software calcula o valor de KD e determina o intervalo de confiança de 95% ajustando os pontos de dados a uma curva K D teórica. O intervalo de confiança de 95% (Sapidyne TechNote TN207R0) é fornecido como KD baixo e KD alto.
[0600] Outros exemplos para valores de afinidade, tal como determinado por Kinexa são fornecidos abaixo, para PRIT-213. PRIT-0213 é a mesma molécula que PRIT-0186, exceto por outra VH/VL de ligação ao CEA, consulte a Tabela 8.
PRIT-213 AFINIDADES DO QUELATO DE METAL-DOTAM DO BSAB CEA-DOTAM Antígeno KD [pM] 95% CI[pM] Pb-DOTAM 0,84 0,44-1,4 Ca-DOTAM 0,95 0,43-1,7 Bi-DOTAM 5,7 4,6–6,2 Cu-DOTAM 122000 60000 – 206000 OS VALORES ADICIONAIS SÃO MOSTRADOS ABAIXO: Intervalo de confiança de 95% Nome TheraPS Antígeno KD [pM] [pM] PRIT-0213-0005 0,95 0,43 - 1,7* Ca - DOTAM PRIT-0214-0005 0,52 0,34 – 0,74 PRIT-0213-0005 5,7 4,6 – 6,2* Bi - DOTAM PRIT-0214-0005 6,0 5,5 – 6,4 PRIT-0213-0005 122000 60000 – 206000*° Cu - DOTAM PRIT-0214-0005 38000 19000 – 63000*° * amplo intervalo de confiança, indicando que o KD medido não é tão preciso.
° ensaio não totalmente otimizado para nM – afinidade.
EXEMPLO 12
MEDIÇÕES DE TERMOESTABILIDADE PARA MOLÉCULAS PRIT HUMANIZADAS MÉTODO E ANÁLISE DE DADOS
[0601] Diferentes variantes das moléculas pRIT humanizadas no formato final (em 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, pH 6,0) foram diluídos no mesmo tampão a 1 mg/mL. 30 µL de cada amostra foram transferidos para um dispositivo de filtro de placa de 384 poços (ao lado de um anticorpo anti- HER3 como referência). Após a centrifugação a 1.000 g durante 1 minuto, os poços foram cobertos com 10 µL de óleo de parafina. A placa foi novamente centrifugada (1000 g, durante 1 min) e transferida para o leitor de placas DLS (Dyna Pro PlateReader-II, Wyatt). Começando a 25ºC, a temperatura foi aumentada a uma velocidade de 0,05ºC/min para 79,9ºC. A luz dispersa foi registrada usando o software Dynamics (V7.0).
[0602] Os dados foram transferidos para o programa Excel (Microsoft), classificados por amostra e temperatura e um software add-in usado para criar curvas de fusão. A temperatura, onde ocorreu um claro desvio da linha basal foi definida como “início da agregação” e o ponto de inflexão da curva de fusão como “temperatura de fusão”.
RESULTADOS - TABELA 7 Amostra início da agregação (em ºC) temperatura de fusão (em ºC) Her 3 63 ±1 67,5 ±1 PRIT-0156 (molécula 45 ±1 51 ±1 parental com ligante DOTAM de coelho) PRIT 205 51 ±1 51,5 ±1 PRIT 206 51 ±1 58,1 ±1 PRIT 207 49 ±1 58,1 ±1 PRIT 208 54 ±1 57,7 ±1 PRIT 209 54 ±1 57,7 ±1 PRIT-0213 54 ±1 57,7 ±1
EXEMPLO 13
SELEÇÃO DE CANDIDATOS
[0603] O PRIT-0156 é um anticorpo 2:1 compreendendo o ligante DOTAM de coelho PRIT-0128 combinado com o ligante de CEA ‘CH1A1A’.
PRIT-0178 a PRIT-0204 são variantes humanizadas no mesmo formato com o mesmo ligante CEA. PRIT-0205 até PRIT-0221 correspondem às variantes de humanização de PRIT-0178 a PRIT-0204 na parte de ligação ao DOTAM, mas têm o ligante CEA alterado para ‘T84.66’.
[0604] A tabela abaixo compara as propriedades de várias moléculas PRIT. Os compostos preferidos foram PRIT-213 e PRIT-214.
Anticorpo Ligante de CEA Ligante de Dotam Formato PRIT- nenhum WT anticorpo de coelho 0218 PRIT- CH1A1A PRIT-0218 2:1 anticorpo com ligante de dotam PRIT 0128 0156 HC5/LC1 (PRIT- PRIT- CH1A1A 0218 formato 2:1 0186 humanizado) HC5/LC1 (PRIT- PRIT- T84,86 0218 formato 2:1 0213 humanizado) HC10/LC1 (PRIT- PRIT- CH1A1A 0218 formato 2:1 0187 humanizado) HC10/LC1 (PRIT- PRIT- T84,86 0218 formato 2:1 0214 humanizado) HC5/LC3 (PRIT- PRIT- T84,86 0218 formato 2:1 0206 humanizado) HC5/LC3 (PRIT- PRIT- T84,86 0218 formato 2:1 0216 humanizado) HC5/LC3 (PRIT- PRIT- T84,86 0218 formato 2:1 0217 humanizado) HC7/LC1 (PRIT- PRIT- T84,86 0218 formato 2:1 0208 humanizado)
Ligant Ligante de SET Kinexa Rend. T Humanizaçã Biodistribuiçã e de DOTAM PbDOT PbDOTA [mg/l] Agreg o o CEA AM [pM] M [pM] . 266n m PRI CH1A1 Coelho WT 0,01 0,25 25 45 --- --- Ok T- A 015 6 PRI CH1A1 HC5 / LC1 0,4 0,92 38 50 HC LC Ok T- A 58% 57% 018 6 PRI T84,66 HC5/LC1 0,4 0,84 4,0 54 HC LC Ok T- 58% 57% 021 3 PRI CH1A1 HC10/ LC1 0,03 0,99 17,8 57 HC LC Ok T- A 40% 57% 018 7 PRI T84,66 HC10/LC1 0,03 0,84 6,0 55 HC LC Ok T- 40% 57% 021 4 PRI T84,66 HC5/LC3 0,36 1,0 1,32 50 HC LC Ok T- 58% 55% 020 6 PRI T84,66 HC5/LC3 --- 51 7,0 50 HC LC Ok T- 58% 55% 021 6 PRI T84,66 HC5/LC3 --- 3 10,0 54 HC LC Ok T- 58% 55% 021 7 PRI T84,66 HC7/LC1 8,7 8,3 7,6 59 HC LC Ok T- 51% 57% 020 8 (A) TABELA 8: SELEÇÃO DE CANDIDATOS
[0605] Sequências: - HC5:
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGF IGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPP HLWGRGTLVTVSS;
- LC1:
SIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLL
IYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTK VEIK; - LC3: aqmtqspstl sasvgdrvti tcqsshsvys; 501 dndlawyqqk pgqppklliy qasklasgvp srfsgsgsgt eftltisslq; 551 pddfatyycl ggyddesdty gfgggtkvei k; - HC7: vqlvesgggl vqpggslrls caasgfslst; 501 ysmswvrqap gkglewvgfi gsrgdtyyas wakgrftisr dtskntaylq; 551 mnslraedta vyycarerdp ygggaypphl wgrgtlvtvs s - HC10: vqlqqwgagl lkpsetlslt cavygfslst; 501 ysmswirqpp gkglewigfi gsrgdtyyas wakgrvtisr dtsknqvslk; 551 lssvtaadta vyycarerdp ygggaypphl wgrgtlvtvs s; - T84.66 VH 1 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgfnik dtymhwvrqa pgqglewmgr; 51 idpangnsky vpkfqgrvti tadtststay melsslrsed tavyycapfg; 101 yyvsdyamay wgqgtlvtvs s; - T84.66 VL:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPR
LLIYRASNRATGIPA; RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIK; - CH1A1A VH: qvqlvqsgae vkkpgasvkv sckasgytft efgmnwvrqa pgqglewmgw; 51 intktgeaty veefkgrvtf ttdtststay melrslrsdd tavyycarwd; 101 fayyveamdy wgqgttvtvs s; - CH1A1A VL: 1 diqmtqspss lsasvgdrvt itckasaavg tyvawyqqkp gkapklliys; 51 asyrkrgvps rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyychq yytyplftfg; 101 qgtkleik.
EXEMPLO 14 CRISTALIZAÇÃO, COLETA DE DADOS E DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA DO COMPLEXO PB-DOTAM FAB P1AA1227
[0606] Para formação de complexo, o Fab derivado do VH/VL humanizado em PRIT-0213, denominado P1AA1227 a 26 mg/mL, foi misturado com Pb-DOTAM em pó em uma razão molar de 1:4,2. Após 2 horas de incubação a 4ºC, os ensaios de cristalização iniciais foram realizados em configurações de difusão de vapor por “sitting drop” (gota sentada) a 21ºC usando a tela JCSG + (Qiagen, Hilden). Os cristais apareceram em 5 dias de (NH4)2SO4 0,2 M, BIS-TRIS 0,1 M, pH 5,5, 25% p/v PEG3350. Os cristais foram coletados diretamente da placa de peneiramento sem mais nenhuma etapa de otimização.
[0607] Coleta de dados e determinação da estrutura. Para a coleta de dados, os cristais foram congelados a 100K em solução precipitante contendo 10% de etilenoglicol. Os dados de difração foram coletados no comprimento de onda de 1.0000 Å, usando um detector PILATUS 6M no feixe de luz X10SA da Swiss Light Source (Villigen, Suíça). Os dados foram processados com XDS (Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010)) e redimensionados com SADABS (BRUKER). Os cristais do complexo pertencem ao grupo espacial C2 com eixos celulares de a = 135,63 Å, b = 56,42 Å, c = 64,52 Å e β = 108,36º e difratam até uma resolução de 1,40 Å. A estrutura foi determinada por substituição molecular com PHASER (McCoy, AJ, Grosse- Kunstleve, RW, Adams, PD, Storoni, LC e Read, RJ. J. Appl. Cryst. 40, 658- 674 (2007)) usando as coordenadas de uma estrutura Fab desenvolvida internamente como modelo de pesquisa. A densidade de elétrons das diferenças foi usada para colocar o Pb-DOTAM e alterar os aminoácidos de acordo com as diferenças de sequência por refinamento do espaço real. As estruturas foram refinadas com os programas da suíte CCP4 (Collaborative Computational Project, Número 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)) e BUSTER (Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P., Sharff, A., Smart, O.S., Vonrhein, C., Womack, T.O . (2011).
versão Buster 2.9.5 Cambridge, Reino Unido: global Phasing Ltd). A reconstrução manual foi feita com COOT (Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG e Cowtan, K. Acta Cryst D66, 486-501 (2010)).
[0608] A coleta de dados e refinamento estatístico estão resumidos na Tabela 9.
[0609] Todas as apresentações gráficas foram preparadas com PYMOL (The Pymol Molecular Graphics System, Versão 1.7.4. Schrödinger, LLC.).
TABELA 9 COLETA E REFINAMENTO ESTATÍSTICO DE DADOS PARA O COMPLEXO PB-DOTAM FAB P1AA1227
P1AA1227-Pb-DOTAM Coleta de dados Grupo espacial C2 Dimensões da célula a, b, c (Å) 135,63, 56,42, 64,52 α, β, γ() 90, 108,36, 90 Resolução (Å) 1,40 Fator R (Rsym ou Rmerge) 0,041 I / δI 10,3 (0,94) Completeza (%) 94,4 (86,1) Redundância 3,37 (3,33) Refinamento Resolução (Å) 48,9 – 1,40 Nº. reflexões 81631 Rwork / Rfree 19,21/22,38 Nº. átomos Proteína 3342 Água 523 Pb-Dotam 29 Fatores-B Proteína 14,81 Água 37,46 Pb-Dotam 21,09 Desvios R.m.s. Comp. das ligações (Å) 0,011 Ângulo das ligações() 1,57 * Os valores entre parênteses são para shell de alta resolução.
ESTRUTURA DE FAB P1AA1227 EM COMPLEXO COM PB-DOTAM
[0610] A fim de caracterizar os detalhes de interação do Pb-Dotam com Fab P1AA1227 determinou-se a estrutura cristalina do complexo com uma resolução de 1,40 Å. A estrutura revela que o Fab P1AA1227 liga-se ao Pb- DOTAM principalmente pelas contribuições do CDR1 e CDR3 de cadeia leve e pela CDR2 e CDR3 da cadeia pesada.
[0611] A análise da interface de ligação com o programa PISA revela um padrão de interação do Fab P1AA1227 com o Pb-DOTAM através de 3 ligações de hidrogênio, interações polares e contatos de van der Waals. O Pb-DOTAM é ligado em um bolso formado por cadeias pesada e leve. Este bolso tem a forma de uma caixa aberta de um lado. As paredes laterais e o fundo da bolsa contribuem com interações apolares, enquanto interações polares dominam a borda das paredes. As ligações de hidrogênio da cadeia lateral são formadas entre os resíduos Glu95 e Asp97 da CDR3 de cadeia pesada com átomos de nitrogênio carbamoil DOTAM N7 e N8. Uma ligação de hidrogênio adicional é estabelecida por meio do átomo de carbonila da cadeia principal da Arg96 com o átomo N7 de DOTAM. O complexo é adicionalmente estabilizado através de interações apolares da Phe50 da CDR2 de cadeia pesada e Tyr58 da cadeia lateral que são orientadas de ponta a ponta para o anel azaciclododecano. A cadeia leve contribui principalmente com o “fundo” da bolsa com resíduos da CDR3 Gly91-Tyr96 fornecendo contatos apolares para o anel de tetraciclododecano. Asp32 possui uma ligação de hidrogênio ao átomo de nitrogênio carbamoila N6 do DOTAM. (Numeração de acordo com Kabat).
[0612] A Figura 2 mostra a estrutura de P1AA1227 em complexo com Pb-DOTAM.
[0613] A Figura 3 mostra a visualização no sítio de interação.
[0614] A tabela abaixo mostra os resíduos do parátopo da cadeia pesada, com base na análise com o programa PISA.
TABELA 10 Resíduos de Tipo de interação Pb-DOTAM cadeia pesada (Numeração de Kabat) Phe50 apolar Borda à face ao anel azaciclododecano Asp56 polar N8 Tyr58 apolar Borda à face ao anel azaciclododecano Glu95 Ligação-H N7
Resíduos de Tipo de interação Pb-DOTAM cadeia pesada (Numeração de Kabat) Arg96 Ligação-H (carbonila mc) N7 Asp97 Ligação-H N8 Pro98 Borda-face Acima de Pb-Dotam, distância de 4Å Tyr99 polar (mas distância 6A) N5 Ala100C apolar C12 Tyr100D polar (átomos mc) N7
[0615] A tabela abaixo mostra os resíduos do parátopo da cadeia leve, com base na análise com o programa PISA.
TABELA 11 Cadeia Leve resíduos Tipo de interação Pb-DOTAM (Numeração de Kabat) Borda à face ao anel Tyr28 apolar azaciclododecano Asp32 polar, Ligação-H N6 abaixo do anel Gly91 apolar azaciclododecano abaixo do anel Tyr92 apolar azaciclododecano abaixo do anel Asp93 apolar azaciclododecano
Cadeia Leve resíduos Tipo de interação Pb-DOTAM (Numeração de Kabat) abaixo do anel Thr95C apolar azaciclododecano Borda à face ao anel Tyr96 apolar azaciclododecano
[0616] Os resíduos do parátopo também estão sublinhados nas sequências abaixo: > P1AA1227_HC
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGF IGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPP
HLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC; > P1AA1227_LC
SIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLL IYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
EXEMPLO 15 BIODISTRIBUIÇÃO E EFICÁCIA IN VIVO: MATERIAL E MÉTODOS
GLOSSÁRIO PARA OS EXEMPLOS A SEGUIR BD Biodistribuição bsAb Anticorpo biespecífico CA Agente de remoção CEA Antígeno Carcinoembrionário Dex500 Dextrano500-TCMC-Pb Dex[n] Dextrano[n]-TCMC-Pb
BD Biodistribuição DOTAM 1,4,7,10-Tetraquis(carbamoilmetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecano, H&E Hematoxilina e eosina ID Dose injetada ELISA Ensaio imunoadsorvente enzima-associado i.p. Intraperitoneal i.v. Intravenoso MIRD Sistema de dosimetria interna de radiação (Medical Internal Radiation Dose) MW Massa Molecular NBF Formalina tamponada neutra OCT Temperatura de corte ótima OS Sobrevida global PBS Salina tamponada com fosfato p.i. Pós-injeção PK Farmacocinética PRIT Radioimunoterapia pré-direcionada RBE Eficácia biológica relativa RT Temperatura ambiente PSCA Antígeno de células tronco da próstata s.c. Subcutâneo SCID Imunodeficiência grave combinada DP Desvio padrão SOPF Livre de agentes patogênicos específicos e oportunistas SPF Livre de agentes patogênicos específicos TA Antígeno alvo TCMC 1,4,7,10-Tetraquis(carbamoilmetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecano, TGI Inibição do crescimento do tumor TR Regressão do tumor
MATERIAL E MÉTODOS DE PROTOCOLOS GERAL
[0617] Todos os protocolos experimentais foram analisados e aprovados pelas autoridades locais (Comité Régional d'Ethique de l'Experimentação Animal du Limousin (CREEAL), Laboratoire Départemental d'Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne). Camundongos fêmeas com imunodeficiência combinada severa (SCID) (Charles River) foram mantidos em condições livres de patógenos específicos com ciclos diários de luz e escuro (12 h/12 h), de acordo com as diretrizes éticas. Nenhuma manipulação foi realizada durante a primeira semana após a chegada, para permitir que os animais se adaptassem ao novo ambiente. Todos os camundongos foram monitorados diariamente para avaliação da condição física e bem-estar geral.
[0618] Os volumes tumorais foram estimados utilizando um paquímetro, calculando de acordo com a fórmula: volume = 0,5 × comprimento x largura2. O sangue foi coletado na terminação do seio venoso usando sangramento retro-orbital, seguido por coleta de tecido adicional para medições radioativas e/ou análise histológica, conforme exigido pelos protocolos.
Condições inesperadas ou anormais foram documentadas.
[0619] A análise estatística foi realizada utilizando o programa GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc.) e JMP 8 (SAS Institute Inc.).
REAGENTES
[0620] Os anticorpos biespecíficos foram fornecidos pela Roche Diagnostics GmbH, Pharma Research Penzberg (Penzberg, Alemanha) e armazenados a –80ºC até o dia da injeção. Eles foram então descongelados e diluídos em tampão de veículo padrão (20 mM de Histidina/Histidina - HCl, 140 mM de NaCl; pH 6,0). Anticorpos biespecíficos Composto Alvo Protocolos Fornecedor PRIT-0155 PSCA 83, 87 Roche Pharma Research PZ PRIT-0156 CH1A1A 80, 91 Roche Pharma Research PZ PRIT-0165 T84,66 80, 85, 90, 91, 95 Roche Pharma Research PZ PRIT-0175 Digoxigenina 80, 91, 93 Roche Pharma Research PZ PRIT-0186 CH1A1A 80 Roche Pharma Research PZ PRIT-0187 CH1A1A 80 Roche Pharma Research PZ PRIT-0205 T84,66 80 Roche Pharma Research PZ PRIT-0206 T84,66 80 Roche Pharma Research PZ PRIT-0207 T84,66 80 Roche Pharma Research PZ PRIT-0208 T84,66 80 Roche Pharma Research PZ PRIT-0209 T84,66 80 Roche Pharma Research PZ PRIT-0213 = T84,66 93, 105, 106 Roche Pharma Research PZ CEA-PRIT PRIT-0214 T84,66 93 Roche Pharma Research PZ
[0621] Os reagentes de inoculação foram fornecidos pela Macrocyclics (Plano, TX, EUA). Eles foram armazenados a -80ºC até o dia da injeção, quando foram descongelados e diluídos em PBS até a concentração desejada.
AGENTES DE REMOÇÃO Composto Substituição Protocolos Fornecedor de TCMC Dex500-TriGalNAc 3:1† 81-1 44 Macrocyclics Dex500-TriGalNAc 9:1† 101-1 44, 70 Macrocyclics Dex20 14-1 83, 85, 87 Macrocyclics Dex20† 16-1 70 Macrocyclics Dex70 8-1 83, 85, 87 Macrocyclics Dex70† 10-1 44, 70 Macrocyclics Dex70-TriGalNac† 70 Macrocyclics Dex250 19-1 83, 87 Macrocyclics Dex250† 24-1 44, 70 Macrocyclics Dex500†* 70 Macrocyclics Dex500* 84-1 80, 83, 85, 87, Macrocyclics 90, 91 CDex500-(Glu)3* 95-1 83, 87 Macrocyclics CDex500-(Glu)2* 84-1 83, 87 Macrocyclics CDex500-(Glu)4* 78-1 83, 85, 87 Macrocyclics Dex500-M(Glu)2* 11-1 83, 85, 87 Macrocyclics Dex20-M(Glu)2 2-1 83, 87 Macrocyclics Dex500-(10%)** 9-1 95 Macrocyclics Dex500-(20%)** 20-1 95 Macrocyclics Dex500-(40%)** 39-1 95 Macrocyclics Dex500-(100%)** 84-1 90, 95 Macrocyclics Dex500-(50%)** 47-1 105, 106 Macrocyclics †No Pb-extinção; *30-kDa de valor de corte da filtr.; **100-kDa de valor de
AGENTES DE REMOÇÃO corte da filtr.
[0622] Os quelatos DOTAM para radiomarcação foram fornecidos pela Macrocyclics e mantidos a –20ºC antes da radiomarcação. A marcação subsequente com chumbo-203 (203Pb) ou chumbo-212 (212Pb) foi realizada pela AREVA Med (Razès, França). Os camundongos foram injetados por via intravenosa (i.v.) com 100 µL das respectivas soluções de Pb-DOTAM, diluídas com PBS para obter a dose de Pb/concentração de atividade desejada. 203Pb- DOTAM foi usado pré-ligado com anticorpos biespecíficos, enquanto 212Pb- DOTAM foi administrado após PRIT e agente de remoção. As medições radioativas foram realizadas usando um contador gama automático 2470 WIZARD2 (PerkinElmer). Quelatos radiomarcados Composto Tampão de formulação Fornecedor 212Pb-DOTAM PBS Macrocyclics, AREVA Med 203Pb-DOTAM PBS Macrocyclics, AREVA Med
[0623] A BxPC3 é uma linhagem de células de adenocarcinoma pancreático primário humano, expressando CEA naturalmente. As células BxPC3 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, Ref. 42401-018) enriquecido com 10% de soro bovino fetal e 1% de GlutaMAX (Gibco, ref. No.
35050-061). LS174T é uma linhagem de células de adenocarcinoma colorretal humano, expressando CEA naturalmente. As células LS174T foram cultivadas em meio DMEM (Gibco, ref. No. 42430-082) enriquecido com 10% de soro bovino fetal. MKN45 é uma linhagem de células de adenocarcinoma gástrico humano, expressando CEA naturalmente. As células MKN45 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, ref. No. 42401-018) enriquecido com soro bovino fetal a 20%. Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos por injeção subcutânea de células em meio RPMI ou DMEM, misturados 1:1 com matriz de membrana basal Corning® Matrigel® (fator de crescimento reduzido; nº de cat.
354230), no flanco direito. Linhagens de células Linhagem de células Células por camundongo Volume injetado Fornecedor BxPC3 5×106 100 µL ECACC* LS174T 1×10 6 100 µL ATCC** MKN45 0,5×106 100 µL DSMZ *** *Coleção Europeia de Culturas de Células Autenticadas (Salisbury, Reino Unido) **Coleção Americana de Culturas de Células (ATCC) (Manassas, VA, EUA) ***Leibniz-Institut DSMZ - Coleção Alemã de Microrganismos e Células (Braunschweig, Alemanha) EXEMPLO 16 PRÉ-DIRECIONAMENTO COM DIVERSOS ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE DIRECIONAMENTO PARA CEA (PROTOCOLO 80 (A, B, C))
[0624] Este estudo teve como objetivo avaliar o acúmulo de Pb em xenoenxertos de adenocarcinoma pancreático em camundongos após pré- direcionamento com vários anticorpos biespecíficos direcionados ao CEA, a fim de otimizar o regime e selecionar o candidato mais adequado para a transição para os ensaios clínicos. Os experimentos foram divididos em três protocolos distintos, realizados na ordem i) 80b, ii) 80c e iii) 80a. O protocolo 80b avaliou a absorção tumoral de cinco construções de anticorpos biespecíficos totalmente humanizados, pré-ligados com 203Pb-DOTAM. O protocolo 80c avaliou a absorção pelo tumor de construções de anticorpos biespecíficos pré-ligados com 203Pb-DOTAM em três pontos de tempo diferentes após a injeção, para otimizar o tempo entre a injeção de PRIT e a injeção de CA/quelato em regimes de pré-direcionamento. Finalmente, o protocolo 80a avaliou a captação tumoral de 212Pb-DOTAM em um cenário de pré-direcionamento padrão, usando cinco construções de anticorpo biespecífico totalmente humanizados, visando tanto T84.66 quanto CH1A1A. Desenho do estudo, protocolo 80a Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2016-02-10 Injeção s.c.* de células BxPC3 6 2016-02-15 Injeção i.v.* de bsAb PRIT
Desenho do estudo, protocolo 80a 9 2016-02-18 Injeção i.v.* de CA 9 2016-02-18 Eluição de 212Pb-DOTAM 9 2016-02-18 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM 10 2016-02-19 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos *Volume de injeção 100 µL Desenho do estudo, protocolo 80b Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2016-01-13 Injeção s.c.* de células BxPC3 6 2016-01-18 Eluição de 203Pb-DOTAM e pré-ligação com bsAb
PRIT 6 2016-01-18 Injeção i.v.* de 203Pb-DOTAM-bsAb 10 2016-01-22 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos *Volume de injeção 100 µL Desenho do estudo, protocolo 80c Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2016-01-20 Injeção s.c.* de células BxPC3 6 2016-01-25 Eluição de 203Pb-DOTAM e pré-ligação com bsAb
PRIT 6 2016-01-25 Injeção i.v.* de 203Pb-DOTAM-bsAb 7 2016-01-26 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos 9 2016-01-28 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos 13 2016-02-01 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos *Volume de injeção 100 µL
[0625] Cada camundongo (idade 6-7 semanas) foi injetado por via subcutânea (s.c.) com células BxPC3 (passagem 30) em 100 μL de RPMI/Matrigel no flanco direito. Cinco dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 160-170 mm3. Os anticorpos foram diluídos para uma concentração final de 30 µg por 100 µL e, subsequentemente, administrados i.v., isoladamente (80a) ou pré-ligados com 203Pb-DOTAM (80b, 80c). PRIT- 0165 e PRIT-0156 foram usados como controles positivos de ligação ao CEA,
visando T84.66 e CH1A1A, respectivamente. PRIT-0175 foi usado como um controle de ligação não CEA.
[0626] No protocolo 80a, um agente de remoção foi injetado por via intravenosa a uma concentração de 30 µg por 100 µL três dias após o anticorpo biespecífico, seguido duas horas depois por 212Pb-DOTAM. Grupos de estudo, protocolo 80a (ntot = 24) Grupo A B C D E F G H bsAb PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- 0206 0207 0208 0165 0186 0187 0156 0175 * ** *** dose de bsAb 30 30 30 30 30 30 30 30 (µg) CA Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 dose de CA 30 30 30 30 30 30 30 30 (µg) Quelato 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb-
DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM Atividade de 13 13 13 13 13 13 13 13 Pb (µCi) n 3 3 3 3 3 3 3 3 *Controle positivo (T84,66); **Controle positivo (CH1A1A); ***Controle negativo Grupos de estudo, protocolo 80b (ntot = 21) Grupo A B C D E F G bsAb PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT-0175 0205 0206 0207 0208 0209 0165 ** * dose de 30 30 30 30 30 30 30 bsAb (µg) CA — — — — — — — dose de — — — — — — — CA (µg) Quelato 203Pb- 203Pb- 203Pb- 203Pb- 203Pb- 203Pb- 203Pb-DOTAM pré-ligado DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM Atividade 4 4 4 4 4 4 4 de Pb (µCi) n 3 3 3 3 3 3 3 *Controle positivo (T84,66); **Controle negativo Grupos de estudo, protocolo 80c (ntot = 27) Grupo A B C
Grupos de estudo, protocolo 80a (ntot = 24) bsAb PRIT-0206 PRIT-0165 PRIT-0175 * ** dose de bsAb 30 30 30 (µg) CA — — — dose de CA — — — (µg) 203 203 203 Quelato pré-ligado Pb- Pb- Pb-
DOTAM DOTAM DOTAM Atividade de Pb 1–2 1–2 1–2 (µCi) Pontos no tempo da 24, 72, 168 24, 72, 168 24, 72, 168 necropsia (h p.i.) n 9 9 9 (ponto por tempo) (3) (3) (3) *Controle positivo (T84,66); **Controle negativo
[0627] Os camundongos foram sacrificados para fins de biodistribuição após 24 horas (80a); 96 h (80b); ou 24, 72 ou 168 h (80c). De todos os camundongos no protocolo 80a foram colhidos: sangue, bexiga, baço, rins, fígado, pulmão, coração, músculo e tumor. De todos os camundongos nos protocolos 80b e 80c foram colhidos: sangue, bexiga, intestino delgado, cólon, baço, pâncreas, rins, fígado, pulmão, coração, osso femoral, músculo e tumor.
As amostras coletadas foram pesadas e colocadas em tubos plásticos para medição imediata da radioatividade. A porcentagem da dose injetada por grama de tecido (%ID/g) foi então calculada, incluindo correções para decaimento radioativo e fundo.
RESULTADOS, 80A
[0628] Todos os anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente ao CEA resultaram no direcionamento tumor-específico de 212Pb-DOTAM, com pouca ou nenhuma absorção em tecidos normais 24 horas após a injeção de DOTAM. Para PRIT-0206, PRIT-0207 e PRIT-0208, a captação média do tumor ± DP foi de 8,62 ± 1,05, 7,30 ± 3,84 e 7,75 ± 2,61%ID/g, respectivamente, com seu controle positivo PRIT-0165 de ligação ao T84.66 correspondente a 9,13 ± 1,82%ID/g. Os ligantes de CH1A1A, PRIT- 0186 e PRIT-0187, resultaram em valores no tumor de 17,44 ± 1,39 e 16,50 ± 3,25%ID/g, seu controle positivo PRIT-0156 a 18,98 ± 1,89%ID/g. O PRIT-0175 sem ligação ao CEA resultou em 0,41 ± 0,42%ID/g no tumor.
[0629] No geral, os anticorpos biespecíficos direcionados a CH1A1A resultaram em captação tumoral significativamente maior do que aqueles direcionados a T84.66 (teste t não pareado, p <0,0001); CH1A1A e T84.66 resultaram em captação significativamente maior em comparação com o controle negativo (ANOVA unidirecional, p <0,0001). Os resultados são exibidos na Figura 4.
RESULTADOS, 80B
[0630] O direcionamento específico de tumores foi alcançado com todos os anticorpos biespecíficos de ligação ao CEA pré-ligados, embora a %ID/g tenha sido ligeiramente inferior para as versões totalmente humanizadas em comparação com o controle positivo PRIT-0165. O controle sem ligação ao CEA resultou em um acúmulo no tumor comparativamente insignificante.
[0631] No geral, a %ID/g calculada neste cenário experimental pré-ligado atingiu níveis que eram aproximadamente dez vezes mais altos do que aqueles dos regimes com PRIT correspondentes; no entanto, os dados de saída refletiram as medições de atividade do contador gama e nenhum erro de cálculo foi encontrado. É importante ressaltar que as proporções entre o tumor e o tecido normal permaneceram dentro da faixa esperada. Especificamente, a razão tumor-para-sangue (± DP, n = 3) foi de 6,76 ± 2,95 para PRIT-0205, 7,56 ± 2,27 para PRIT-0206, 9,33 ± 0,91 para PRIT-0207, 10,77 ± 0,84 para PRIT- 0208, 11,71 ± 0,84 para PRIT-0209, 10,78 ± 0,88 para PRIT-0165 e 0,85 ± 0,12 para PRIT-0175. Os resultados são exibidos na Figura 5.
RESULTADOS, 80C
[0632] Ambos os anticorpos de ligação ao CEA resultaram em um acúmulo no tumor significativo em comparação com o controle negativo. A análise estatística não mostrou nenhuma diferença significativa entre o direcionamento do tumor usando PRIT-0206 ou PRIT-0165 para qualquer um dos pontos de tempo estudados, nem houve qualquer diferença significativa na %ID/g entre os dias 3 e 7 para qualquer um dos anticorpos estudados (ANOVA bidirecional, p <0,05). Análogo ao protocolo 80b, os valores de %ID/g calculados foram altos no geral; no entanto, as proporções tumor/sangue permaneceram dentro do intervalo esperado. Não foram observadas diferenças significativas nas proporções tumor/sangue entre os dias 1 e 3, mas para PRIT- 0165 e PRIT-0206, após 7 dias aumentou significativamente a proporção de PRIT-0213 (ANOVA bidirecional, p <0,05). Os resultados são exibidos na Figura 6. RAZÕES TUMOR/SANGUE (± DP; N=3) DE 203PB-DOTAM-BSAB EM DIVERSOS PONTOS DE TEMPO APÓS A INJEÇÃO. Dias após a injeção PRIT-0206 PRIT-0165 PRIT-0175 1 4,48 ± 0,38 4,28 ± 1,31 0,84 ± 0,22 3 8,73 ± 4,07 7,13 ± 0,33 0,75 ± 0,30 7 29,67 ± 10,52 17,87 ± 12,15 0,76 ± 0,25
RESUMO E CONCLUSÃO
[0633] Os anticorpos biespecíficos completamente humanizados que visam T84.66 ou CH1A1A resultaram em um acúmulo significativo de radioatividade em tumores BxPC3, de modo comparável aos dos seus respectivos controles positivos.
[0634] A %ID/g de 203Pb-DOTAM-bsAb no tumor não diferiu significativamente entre 3 e 7 dias, mas a razão tumor/sangue correspondente favoreceu o ponto de tempo posterior devido à diminuição na radioatividade no sangue.
EXEMPLO 17 BIODISTRIBUIÇÃO DE AGENTES DE REMOÇÃO (PROTOCOLO 44)
[0635] O objetivo deste estudo foi abordar a biodistribuição de uma seleção de agentes de remoção com propriedades diferentes (por exemplo, estrutura molecular, tamanho e carga) e, mais especificamente, sua presença e/ou acúmulo em tumores. Isso foi interessante, visto que os agentes de remoção podem potencialmente entrar nos tumores, ligar-se a anticorpos ligados ao tumor e/ou puxá-los para fora do tumor, afetando negativamente a ligação subsequente de radioligantes. Desenho do estudo, protocolo 44 Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2015-03 Injeção i.v.* de CA marcado com 212Pb 1 2015-03 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos (2 h p.i.) 2 2015-03 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos (24 h p.i.) *Volume de injeção 100 µL Grupos de estudo, protocolo 44 (ntot = 24) Grupo CA† dose de CA Atividade de Ponto de n (µg) 212Pb tempo (µCi) (h p.i.) A Dex70 30 5 2 3 B Dex250 30 5 2 3 C Dex500-TriGalNAc 3:1 30 5 2 3 D Dex500-TriGalNAc 9:1 30 5 2 3 E Dex70 30 5 24 3 F Dex250 30 5 24 3
Desenho do estudo, protocolo 44 G Dex500-TriGalNAc 3:1 30 5 24 3 H Dex500-TriGalNAc 9:1 30 5 24 3 †Todos agentes de remoção sem extinção de Pb antes da marcação com 212Pb
[0636] 30 µg de Dex70, Dex250 e agentes de remoção modificados com TriGalNac foram extintos com 5 µCi de 212Pb e diluídos em PBS para obter 30 µg por 100 µL de volume total para injeção i.v..
[0637] Os camundongos foram sacrificados e necropsiados 2 ou 24 horas após a injeção de 212Pb-CA. Sangue, bexiga urinária, coração, pulmão, fígado, baço, rins, intestino (duodeno, jejuno, íleo), cólon, pâncreas, estômago, ovários, cérebro, fêmur com medula óssea e tumor foram coletados, pesados e medidos para conteúdo de radioatividade, e a %ID e%ID/g foram subsequentemente calculadas. Além disso, a urina foi coletada no ponto de tempo de 24 horas.
RESULTADOS, 44
[0638] Todos os agentes de remoção foram rapidamente eliminados da corrente sanguínea, acumulando principalmente no fígado e cólon já às 2 horas após a injeção. Cerca de 50% do 212Pb injetado foi encontrado no fígado 24 horas após a injeção, conforme demonstrado pela distribuição de radioatividade em órgãos (%ID). Os agentes de remoção modificados por TriGalNAc também se acumularam até certo ponto no baço, explicado pela presença de moléculas TriGalNAc. Em geral, pouca radioatividade foi encontrada na urina após 24 horas. Entretanto, o menor agente de remoção (Dex70) foi excretado mais lentamente do que o esperado.
[0639] Figura 7 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 2 horas após a injeção de agentes de remoção marcados com 212Pb em camundongos MKN45 com tumor (%ID/g ± DP, n = 3).
[0640] A Figura 8 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos e urina selecionados 24 horas após a injeção de agentes de remoção marcados com 212Pb em camundongos MKN45 com tumor (%ID/g ± DP, n = 3).
[0641] A Figura 9 mostra a distribuição de radioatividade por órgãos em tecidos e urina selecionados 24 horas após a injeção de agentes de remoção marcados com 212Pb em camundongos MKN45 com tumor (%ID/g ± DP, n = 3).
RESUMO E CONCLUSÃO
[0642] Nenhum do CAs radiomarcados resultou na absorção tumoral de 212Pb, administrado a uma dose de 30 μg por camundongo. A modificação do Dex500 com TriGalNac não foi benéfica em comparação com os agentes de remoção Dex70 e Dex250 não modificados.
EXEMPLO 18 BIODISTRIBUIÇÃO EM LONGO PRAZO DE AGENTES DE REMOÇÃO (PROTOCOLO 70)
[0643] Este estudo comparou a biodistribuição em longo prazo de seis diferentes agentes de remoção. O rastreamento in vivo foi realizado por radiomarcação com 203Pb. Desenho do estudo, protocolo 70 Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2015-09 Injeção i.v.* de CA marcado com 203Pb 8 2015-09 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos *Volume de injeção 100 µL Grupos de estudo, protocolo 70 (ntot = 18) Grupo CA† dose de CA 203Atividade de Pb n (µg) (µCi) A Dex500 30 50 3 B Dex500-TriGalNAc 9:1 30 50 3 C Dex250 30 50 3 D Dex70 30 50 3
Desenho do estudo, protocolo 70 E Dex70-TriGalNac 30 50 3 F Dex20 30 50 3 †Todos agentes de remoção sem extinção de Pb antes da marcação com 203Pb RESULTADOS, 70
[0644] Figura 10 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 1 semana após a injeção de agentes de remoção marcados com 203Pb em camundongos sem tumores (%ID/g ± DP, n = 3).
[0645] Figura 11 mostra a distribuição de radioatividade por órgãos em tecidos selecionados 1 semana após a injeção de agentes de remoção marcados com 203Pb em camundongos sem tumores (%ID/g ± DP, n = 3).
EXEMPLO 19 AGENTE DE REMOÇÃO NO SANGUE (PROTOCOLOS 83 E 87)
[0646] Essa parte abrange dois estudos, o primeiro inclui uma triagem inicial comparando nove agentes de remoção diferentes à base de dextrano com PBS, em termos de tempo de residência no sangue. O objetivo foi identificar candidatos promissores para futuros experimentos de pré- direcionamento, permitindo tratamentos repetidos separados por três semanas.
A hipótese era que os agentes de remoção que permanecem em circulação por um tempo prolongado se ligam aos anticorpos biespecíficos administrados, bloqueando efetivamente a ligação do DOTAM radiomarcado injetado subsequentemente. Os reagentes de remoção variaram em termos de tamanho, carga e carga de 1,4,7,10-tetraquis (carbamoilmetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecano (TCMC).
[0647] O segundo estudo avaliou os nove agentes de eliminação em termos de eficiência de remoção de anticorpos. O experimento foi projetado como um regime PRIT de injeção única padrão em camundongos sem tumor,
avaliando a retenção de 212Pb-DOTAM no sangue como uma indicação de bsAb retido após a administração de CA.
Desenho do estudo, protocolo 83
Dia do estudo Data Procedimento experimental
1 2016-01-19 Injeção i.v.* de bsAb PRIT
2 2016-01-20 Injeção i.v.* de CA ou PBS
24 2016-02-11 Injeção i.v.* de bsAb PRIT
25 2016-02-12 Eluição de 212Pb-DOTAM
25 2016-02-12 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM
25 2016-02-12 Eutanásia e amostragem de sangue + contagem gama
*Volume de injeção 100 µL Desenho do estudo, protocolo 87
Dia do Data Procedimento experimental estudo 6 2016-02-29 Injeção i.v.* de bsAb PRIT
9 2016-03-01 Injeção i.v.* de CA ou PBS
9 2016-03-01 Eluição de 212Pb-DOTAM
9 2016-03-01 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM
10 2016-03-02 Eutanásia e amostragem de sangue + contagem gama
*Volume de injeção 100 µL Grupos de estudo nos protocolos 83 e 87 (ntot = 30 por protocolo)
Grupo bsAb dose CA dose de Quelato Atividade de n de CA 83/87 Pb bsAb (µg) (µCi) (µg)
A PRIT-0155 30 Dex20 30/60 212Pb-DOTAM 10 3/3
B PRIT-0155 30 Dex70 30/60 212Pb-DOTAM 10 3/3
C PRIT-0155 30 Dex250 30/60 212Pb-DOTAM 10 3/3
D PRIT-0155 30 Dex500 30/60 212Pb-DOTAM 10 3/3
J PRIT-0155 30 CDex500- 30/60 212Pb-DOTAM 10 3/3 (Glu)3 K PRIT-0155 30 CDex500- 30/60 212Pb-DOTAM 10 3/3 (Glu)2
Desenho do estudo, protocolo 83 L PRIT-0155 30 CDex500- 30/60 212Pb-DOTAM 10 3/3 (Glu)4 M PRIT-0155 30 Dex500- 30/60 212Pb-DOTAM 10 3/3 M(Glu)2 N PRIT-0155 30 Dex20- 30/60 212Pb-DOTAM 10 3/3 M(Glu)2 O PRIT-0155 30 — 0/0 212Pb-DOTAM 10 3/3
[0648] No momento da primeira injeção de PRIT, os camundongos tinham de 7 a 9 semanas de idade. Todos os camundongos no estudo estavam livres de tumores; portanto, qualquer anticorpo biespecífico de ligação a DOTAM pode ser usado para fins de triagem. Os agentes de remoção foram administrados por via intravenosa um dia após PRIT-0155, diluídos em PBS para uma concentração final de 30 (protocolo 83) ou 60 (protocolo 87) µg por 100 µL. O Grupo O recebeu PBS em vez de agente de remoção. Os compostos nos grupos A – D foram baseados em tamanhos de dextrano de 20, 70, 250 ou 500 kDa, com substituição de TCMC variável. Os compostos nos grupos J – N foram baseados em dextrano-500 capeado (capped) (ou seja, com neutralização do excesso de aminas) (CDex) com carga variável (Glu), ou dextrano-500 e dextrano-20 com versões mono de Glu (M(Glu)). O dextrano capeado com -(Glu)4, -(Glu)3 e -(Glu)2 correspondiam a uma carga líquida muito negativa, negativa e neutra, respectivamente; a versão mono -M(Glu)2 correspondeu a uma carga líquida negativa a ligeiramente positiva.
RESULTADOS, 83
[0649] As médias por grupo do teor de radioatividade (%ID/g) no sangue que eram significativamente diferentes do grupo de controle de PBS (41,1 ± 1,4%ID/g) indicaram retenção do agente de remoção em circulação, três semanas após a administração. Três compostos não diferiram significativamente do controle: Dex500 capeado -(Glu)4, Dex500-mono-(Glu)2 e Dex20-mono-(Glu)3; outros diferiam em graus variáveis.
[0650] A Figura 12 mostra o teor de radioatividade no sangue 4 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3). A barra listrada representa o controle sem CA, com o qual todos os reagentes candidatos foram comparados. Os asteriscos marcam o nível de significância estatística, do inferior (*) ao superior (***).
RESULTADOS, 87
[0651] Os agentes de remoção testados tiveram um bom desempenho em geral, com uma exceção: Dex500-M(Glu)2, que se destacou com 8,07 ± 0,61%ID/g remanescente no sangue após 24 horas.
[0652] A Figura 13 mostra o teor de radioatividade médio no sangue 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3). A barra listrada representa o controle sem CA, com o qual todos os reagentes candidatos foram comparados.
RESUMO E CONCLUSÃO
[0653] Os reagentes selecionados tiveram um bom desempenho geral em termos de autodepuração e conseguiram remover anticorpos da circulação. Tratamentos repetidos com três semanas entre as injeções de CA provaram ser viáveis sem arriscar a ligação do 212Pb-DOTAM aos anticorpos biespecíficos. Além disso, os anticorpos biespecíficos foram depurados dentro de 2 horas após a injeção de CA usando a maioria dos compostos testados.
EXEMPLO 20 PENETRAÇÃO TUMORAL DE AGENTES DE REMOÇÃO (PROTOCOLO 85)
[0654] A penetração no tumor do agente de remoção é um problema potencial em regimes PRIT, uma vez que os fragmentos de CA ligados a DOTAM penetrantes competiriam com 212Pb-DOTAM pela ligação às células tumorais pré-direcionadas com anticorpos. Neste estudo, seis agentes de remoção diferentes foram comparados em termos de inibição da associação de 212Pb-DOTAM a tumores. Os candidatos foram escolhidos com base nos resultados da triagem de CA basal (protocolo 83), a fim de avaliar o impacto na radioatividade associada ao tumor a partir do i) tamanho de dextrano e ii) carga da molécula. Desenho do estudo, protocolo 85 Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2016-02-17 Injeção i.v.* de células BxPC3 6 2016-02-22 Injeção i.v.* de bsAb PRIT 9 2016-02-25 Injeção i.v.* de CA ou PBS 9 2016-02-25 Eluição de 212Pb-DOTAM 9 2016-02-25 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM 10 2016-02-26 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos *Volume de injeção 100 µL Grupos de estudo no protocolo 85 (ntot = 18) Grupo bsAb dose de CA dose de Quelato Atividade n bsAb CA (µg) de Pb (µg) (µCi) A PRIT-0165 30 Dex20 30 212Pb-DOTAM 10 3 B PRIT-0165 30 Dex70 30 212Pb-DOTAM 10 3 D PRIT-0165 30 Dex500 30 212Pb-DOTAM 10 3 E PRIT-0165 30 CDex500- 30 212Pb-DOTAM 10 3 (Glu)4 F PRIT-0165 30 Dex500- 30 212Pb-DOTAM 10 3 M(Glu)2 G PRIT-0165 30 — 0 212Pb-DOTAM 10 3
[0655] Cada camundongo (7 semanas de idade) recebeu injeções por via subcutânea (s.c.) com células BxPC3 (passagem 33) em 100 μL de RPMI/Matrigel no flanco direito. Cinco dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 200 mm3.
[0656] Os agentes de remoçaõ foram baseados em tamanhos de dextrano de 20, 70 ou 500 kDa, com substituição de TCMC variável. CDex500- (Glu)4 foi baseado em dextrano-500 (CDex) capeado (ou seja, com neutralização de aminas em excesso) com uma carga líquida negativa; Dex500-M(Glu)2 tinha a versão mono de Glu(M(Glu)) e carga líquida neutra a ligeiramente positiva. Todos foram administrados por via intravenosa, 30 µg por 100 µL, três dias após PRIT-0165. O Grupo G recebeu PBS em vez de agente de remoção.
[0657] Os camundongos foram sacrificados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM. O sangue e tumores foram coletados, e suas respectivas %ID/g calculadas a partir do peso da amostra e teor de radioatividade.
RESULTADOS, 85
[0658] Três dos candidatos exibiram muito pouca ou nenhuma absorção tumoral: Dex20 (0,26 ± 0,03 %ID/g), Dex70 (4,06 ± 2,06 %ID/g), e CDex500-(Glu)4 (2,98 ± 0,73 %ID/g), indicando extensa penetração do CA nos tumores. Em contraste, Dex500-M(Glu)2 resultou em alta radioatividade no tumor (69,39 ± 9,70 %ID/g) e no sangue (20,68 ± 1,22 %ID/g), em níveis que eram semelhantes aos do controle com PBS (59,02 ± 15,53 e 27,92 ± 2,38 %ID/g no tumor e sangue, respectivamente), interpretado como uma falha na depuração de bsAb. Dex500 exibiu um considerável acúmulo de radioatividade no tumor (20,78 ± 3,76 %ID/g), indicando pouca penetração no tumor, enquanto a depuração do sangue foi essencialmente completa (0,17 ± 0,01 %ID/g). No entanto, a captação de tumor alcançada no controle sem CA indicou que certo grau de fragmentos de DOTAM-dextrano de baixo peso molecular (MW) estavam presentes também no lote Dex500.
[0659] A Figura 14 mostra o teor de radioatividade no sangue e tumores 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3).
RESUMO E CONCLUSÃO
[0660] Este experimento confirmou a noção de que a presença de espécies de CA de baixo MW pode interferir substancialmente com o acúmulo de 212Pb-DOTAM no tumor. Ele também demonstrou a ampla faixa de MW de moléculas que estão presentes em qualquer lote de CA, independentemente do tamanho especificado. Por isso, quanto maior o tamanho de CA especificado, menor o risco de introdução de fragmentos de baixo MW que podem penetrar nos tumores. Entretanto, mesmo para Dex500, certo nível de penetração foi revelado, indicado pela diferença na captação do tumor em comparação com o controle sem CA. Consequentemente, esta solução deve ser diafiltrada usando um corte de MW mais alto no futuro, para remover o máximo possível desses fragmentos interferentes. Foi tomada a decisão de aumentar o corte de MW de 30 para 100 kDa para o Dex500.
EXEMPLO 21 PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE AGENTE DE REMOÇÃO PARA DEX500
[0661] Um aminodextrano (20,0 g) foi dissolvido em uma mistura de 0,1 M de Na2CO3 em H2O (400 mL) e 0,1 M de NaHCO3 em H2O (400 mL).
Após a obtenção de uma solução incolor límpida, p-SCN-Bn-DOTAM 4HCl (sal tetracloridrato de S-2-(4-isotiocianatobenzil)-1,4,7,10-tetra-aza-1,4,7,10-tetra(2- carbamoilmetil) ciclododecano, 2,03 g) foi adicionado sob agitação. A solução ligeiramente turva resultante foi agitada em temperatura ambiente durante 4 horas antes da mistura da reação ser neutralizada para pH 6-7 por adição de HCl 2M. A solução resultante foi purificada por filtração de fluxo tangencial com um corte de 100 kDa (Sartorius Hydrosart, Slice 200 100 kDa 0,02 m 2, membrana à base de celulose estabilizada, Ultrafiltration Cassette) para remover impurezas de baixo peso molecular. A solução resultante foi liofilizada sob pressão reduzida para formar 17,9 g do intermediário desejado.
[0662] 16,1 g do sólido obtido a partir da liofilização foi dissolvido em uma mistura de AcOH 0,1 M em H2O (60 mL) e 0,1 M de NaOAc 3H2O (540 mL). Na solução límpida e incolor foi adicionado de Pb(OAc) 2 3H2O (744 mg) como um sólido. A solução límpida incolor foi agitada durante 60 minutos seguida pela adição de uma solução de laranja de xilenol (1% em H2O, 250 μL). A cor roxa indicava a presença de Pb(II) livre na solução. Uma solução de EDTA (0,01 M em H2O) foi adicionada até que uma mudança de cor para amarelo fosse observada (65,2 mL). A solução resultante foi purificada por filtração de fluxo tangencial com um corte de 100 kDa (Sartorius Hydrosart, Slice 200 100 kDa 0,02 m2, membrana à base de celulose estabilizada, Ultrafiltration Cassette) para remover impurezas de baixo peso molecular. A solução resultante foi liofilizada sob pressão reduzida para formar 14,0 g do agente de remoção desejado.
[0663] O agente de remoção resultante é substituído por múltiplas frações Pb-DOTAM da forma mostrada esquematicamente abaixo: EXEMPLO 22 DOSE DO AGENTE DE REMOÇÃO NO ACÚMULO EM TUMORES (PROTOCOLO 90)
[0664] Este estudo teve como objetivo investigar o impacto da dose do agente de remoção no acúmulo tumoral em um modelo de tumor subcutâneo, hipotetizando que uma quantidade maior de agente de remoção poderia levar a um maior grau de penetração do agente de remoção nos tumores, diminuindo assim a captação subsequente do quelato pelo bloqueio do braço de ligação ao DOTAM de anticorpos biespecíficos ligados ao tumor.
No entanto, uma dose muito baixa levaria a um acúmulo menos eficiente de radioatividade associada ao tumor, devido a níveis mais elevados de anticorpos biespecíficos de ligação ao DOTAM circulantes.
[0665] Além disso, foi feita uma comparação entre lotes agente de remoção que foram diafiltrados para remover os componentes de baixo MW, com corte a 30 ou 100 kDa, em um esforço para diminuir a penetração tumoral de fragmentos de dextrano DOTAM-ligados. Desenho do estudo, protocolo 90 Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2016-03-21 Injeção s.c.* de células BxPC3 6 2016-03-26 Injeção i.v.* de bsAb PRIT 10 2016-03-30 Injeção i.v.* de Dex500 10 2016-03-30 Eluição de 212Pb-DOTAM 10 2016-03-30 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM 11 2016-03-31 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos *Volume de injeção 100 µL Grupos de estudo no protocolo 90 (ntot = 24) Grupo A B C D E F G H bsAb PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- 0165 0165 0165 0165 0165 0165 0165 0165 dose de 100 100 100 100 30 30 30 100 bsAb (µg) CA Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 0 0 * * * * * ** dose de CA 10 25 50 100 30 30 0 0 (µg) Quelato 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb-
DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM Atividade de 10 10 10 10 10 10 10 10 Pb (µCi)
Desenho do estudo, protocolo 90 n 3 3 3 3 3 3 3 3 *100-kDa valor de corte da filtr.; **30-kDa valor de corte da filtr.
[0666] Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos por injeção subcutânea de células BxPC3 (passagem 30) em meio RPMI misturado 1:1 com matriz de membrana basal Corning® Matrigel® (fator de crescimento reduzido; nº de cat. 354230). Cada camundongo (11 semanas de idade) recebeu injeções por via subcutânea (s.c.) com 5x106 células em 100 μL de RPMI/Matrigel no flanco direito. Cinco dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 150 mm3.
[0667] PRIT-0165 foi injetado i.v. a uma concentração de 30 ou 100 µg por 100 µL, seguido quatro dias depois por agente de remoção (grupos A – F) a uma concentração de 10, 25, 30, 50 ou 100 µg por 100 µL. 212Pb- DOTAM foi injetado duas horas após o CA. Os grupos G e H não receberam agente de remoção entre as administrações de anticorpo biespecífico e quelato radiomarcado.
[0668] Os camundongos foram sacrificado para fins de biodistribuição 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM, e sangue, bexiga, baço, rins, fígado, pulmão, músculo, cauda e tumor foram coletados. As amostras foram pesadas e medidas quanto à radioatividade, e a %ID/g foi subsequentemente calculada para cada órgão, incluindo correções para decaimento e fundo.
RESULTADOS, 90
[0669] Os dados de acúmulo 212Pb em tecidos normais foi baixo para todos os grupos aos quais foi administrado um agente de remoção; em contrapartida, os grupos que não receberam agente de remoção apresentaram níveis significativos de radioatividade em geral.
[0670] Os dados de biodistribuição demonstram o efeito da variação da quantidade de agente de remoção (corte de 100 kDa). A regressão linear dos dados de tumor individuais produziu uma inclinação significativa, indicando a absorção tumoral maior com quantidades decrescentes de Dex500 (p = 0,03, R2 = 0,31). O efeito sobre o teor de radioatividade no sangue foi drástico, indo de 31,5 ± 0,2 %ID/g usando PBS para 1,6 ± 0,5 %ID/g usando 10 µg de Dex500.
[0671] Dois grupos receberam PRIT-0165 e Dex500 em proporção igual (1:1); 100 ou 30 µg de cada agente. A %ID/g resultante no tumor não foi significativamente diferente entre os dois grupos (teste t não pareado, p = 0,726). É importante ressaltar que a comparação entre quantidades iguais de Dex500 com diferentes pontos de corte de filtração mostrou um ganho significativo no acúmulo tumoral usando o ponto de corte de MW superior: 54,9 ± 6,9 em vez de 32,5 ± 4,4 %ID/g (teste t não pareado, p = 0,009).
[0672] A Figura 15 mostra a distribuição de 212Pb 24 horas após a injeção de DOTAM radiomarcado (%ID/g ± DP, n = 3), usando 30 ou 100 µg de anticorpo biespecífico e 10-100 µg de agentes de remoção com 100- ou 30- cortes de filtração de kDa ou nenhum agente de remoção (PBS).
[0673] A Figura 16 mostra o efeito na concentração de atividade de 212Pb no sangue e no tumor com quantidades crescentes de agente de remoção (0-100 µg). Os tumores foram pré-direcionados usando 100 µg de PRIT-0165, seguido 4 dias depois por Dex500 diafiltrado com um corte de peso de 100 kDa, ou PBS. 212Pb-DOTAM foi injetado duas horas após o CA. Os símbolos representam a %ID/g 24 horas após a injeção radioativa e a linha a regressão linear dos dados do tumor.
RESUMO E CONCLUSÃO
[0674] O estudo demonstrou um aumento radical no acúmulo tumoral de 212Pb, mantendo baixos níveis de radioatividade circulante. Duas descobertas principais foram concluídas: 1) a diafiltração com um corte de 100 kDa diminuiu significativamente a penetração de fragmentos de dextrana ligados a DOTAM no tumor e 2) a proporção de CA para anticorpo biespecífico (bsAb) impactou o resultado mais do que a quantidade absoluta de CA. Uma excelente proporção de tumor para sangue foi alcançada usando uma proporção de anticorpo:CA de 10:1 após a administração de 100 µg de anticorpo biespecífico. Além disso, concluiu-se que todos os estudos futuros usando agentes de remoção à base de Dex500 devem usar reagentes diafiltrados usando um corte de 100 kDa.
EXEMPLO 23 IMPACTO NA RADIOATIVIDADE ASSOCIADA AO TUMOR (PROTOCOLO 95)
[0675] Neste estudo, nove agentes de remoção diferentes baseados no dextrano-500 foram comparados em termos de inibição da associação de 212Pb-DOTAM aos tumores. Mais especificamente, o experimento avaliou o impacto na radioatividade associada ao tumor de i) saturação de TCMC, ii) razão entre agente de remoção e anticorpo, e iii) método de produção/purificação. Além disso, a captação tumoral foi comparada após a injeção com 10 ou 30 µCi de 212Pb-DOTAM, sem pré-direcionamento ou CA, para avaliar se a saturação de radioatividade no tumor foi alcançada já na dose mais baixa. Desenho do estudo, protocolo 95 Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2016-06-14 Injeção i.v.* de células BxPC3 13 2016-06-26 Injeção i.v.* de bsAb PRIT 16 2016-06-29 Injeção i.v.* de CA ou PBS 16 2016-06-29 Eluição de 212Pb-DOTAM 16 2016-06-29 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM 17 2016-06-30 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos *Volume de injeção 100 µL Grupos de estudo no protocolo 95 (ntot = 27)
Desenho do estudo, protocolo 95 dose de Atividade dose de Grupo bsAb bsAb CA Quelato de Pb n CA (µg) (µg) (µCi) C PRIT-0165 100 Dex500-(10%) 10 212Pb-DOTAM 10 3 D PRIT-0165 100 Dex500-(10%) 25 212Pb-DOTAM 10 3 E PRIT-0165 100 Dex500-(10%) 50 212Pb-DOTAM 10 3 F PRIT-0165 100 Dex500-(10%) 100 212Pb-DOTAM 10 3 G PRIT-0165 100 Dex500-(20%) 40 212Pb-DOTAM 10 3 H PRIT-0165 100 Dex500-(40%) 20 212Pb-DOTAM 10 3 I PRIT-0165 100 Dex500-(100%) 10 212Pb-DOTAM 10 3 J PRIT-0165 100 — 0 212Pb-DOTAM 10 3 K PRIT-0165 100 — 0 212Pb-DOTAM 30 3
[0676] Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos por injeção subcutânea de células BxPC3 (passagem 20) em meio RPMI misturado 1:1 com matriz de membrana basal Corning® Matrigel® (fator de crescimento reduzido; nº de cat. 354230). Cada camundongo (8 semanas de idade) recebeu injeções por via subcutânea (s.c.) com 5x106 células em 100 μL de RPMI/Matrigel no flanco direito. Quinze dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 210 mm3.
[0677] PRIT-0165 (100 µg por 100 µL) foi administrado i.v., seguido três dias depois por reagentes de remoção à base de dextrano-500 (10-170 µg por 100 µL) com substituição de TCMC variável (10-100%). Os grupos J e K receberam PBS em vez de agente de remoção. Duas horas depois, os camundongos foram injetados i.v. com 100 µL das respectivas soluções de 212Pb-DOTAM (10 ou 30 µCi).
[0678] Os camundongos foram sacrificados e necropsiados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM. Sangue, bexiga, baço, rins, fígado, pulmão, músculo, cauda e tumores foram coletados, pesados e medidos quanto ao teor de radioatividade, e a %ID/g foi subsequentemente calculada.
RESULTADOS, 95
[0679] Os dados de biodistribuição revelaram uma tendência aparente no teor de radioatividade médio (%ID/g ± DP) em tecidos coletados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM dependendo da quantidade administrada, com maior concentração de 212Pb no sangue e tecidos normais com menor quantidade de CA. Além disso, a maior atividade de 212Pb resultou em maior acúmulo de 212Pb no tumor, sem um aumento correspondente na captação em tecido normal.
[0680] A Figura 17 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3). As barras cinza escuro e preta representam controles positivos sem CA, com os quais os reagentes candidatos foram comparados.
[0681] ANOVA unidirecional com correção para comparações múltiplas revelou que apenas Dex500-(40%) (76,79 ± 33,28, p <0,0001) e Dex500-(100%) (43,26 ± 24,66, p = 0,0115) diferiu significativamente do controle negativo 10-µCi (2,26 ± 0,25) em termos da relação tumor/sangue. A diferença percebida entre o reagente de remoção com a maior proporção tumor/sangue (Dex500-(40%)) e o padrão anterior (Dex500- (100%)) não foi estatisticamente significativa (teste t não pareado, p = 0,2336).
[0682] A Figura 18 mostra o teor de 212Pb no sangue e tumores 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3) e as proporções tumor-para-sangue correspondentes. As barras cinza escuro e preta representam controles positivos sem CA, com os quais os reagentes candidatos foram comparados.
[0683] Uma curva de ajuste de regressão linear e polinomial (cúbica) foi realizada para analisar o impacto do aumento agente de remoção (Dex500-(10%)) e carga TCMC (sem CA, Dex500-(10%), Dex500-(20%), Dex500-(40%), Dex500-(100%)) na relação tumor/sangue. A inclinação da curva linear foi estatisticamente significativa (p <0,0001) a favor de maiores quantidades de Dex500-(10%) para aumento da relação tumor/sangue, enquanto para certa quantidade de TCMCs injetada, com base em 100 µg de Dex500-(10%), foi indicado um máximo em uma relação TCMC para Dex500 em torno de 60. É importante notar que esses resultados não devem ser retirados de seu contexto para produzir conclusões gerais sobre as quantidades de reagentes ou saturação de TCMC; eles são válidos apenas para as configurações aplicadas.
[0684] A Figura 19 mostra a razão tumor-sangue 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM em função da quantidade de CA (PJRD08-46) e saturação TCMC (9-, 20-, 39-, ou 84 -para-1). As linhas tracejadas representam a regressão linear (R2 = 0,82) e o ajuste da curva não linear (R2 = 0,74) dos respectivos dados.
[0685] O teste final comparou 10 contra 30 µCi de 212Pb-DOTAM, sem injeção de anticorpos ou agentes de remoção. O teor no sangue foi semelhante para os dois grupos de estudo, mas o grupo que recebeu 30 µCi resultou em maior acúmulo tumoral do que o grupo que recebeu 10 µCi: 107,74 ± 14,71 versus 72,38 ± 10,83 %ID/g (± DP, n = 3). As relações tumor/sangue resultantes foram significativamente diferentes: 3,20 ± 0,20 versus 2,26 ± 0,25 para 30 e 10 µCi, respectivamente (teste t não pareado, p = 0,007).
RESUMO E CONCLUSÃO
[0686] Em conclusão, 20 µg de Dex500 com 39 TCMCs por molécula (Dex500-(40%)) gerou um acúmulo muito alto de 212Pb nos tumores pré-direcionados combinados com baixa retenção no sangue, 24 horas após a administração de 212Pb-DOTAM. Foi o agente de remoção com melhor desempenho, lado a lado com 10 µg do CA padrão anterior, Dex500-(100%), com 84 TCMCs por molécula. Devido à considerável variabilidade intragrupo e ao pequeno tamanho da amostra, a diferença na proporção tumor/sangue não foi estatisticamente diferente entre os dois reagentes, mas as médias indicaram que Dex500-(100%) pode ser favorável. Além disso, concluiu-se que 30 µCi de 212Pb-DOTAM pode resultar em acúmulo tumoral superior ao com 10 µCi, ou seja, a saturação não foi atingida com a dose mais baixa.
EXEMPLO 24
IMPACTO DA DOSE DE ANTICORPO BIESPECÍFICO SOBRE O ACÚMULO NO TUMOR (PROTOCOLO 91)
[0687] Este estudo teve como objetivo investigar o impacto da dose de anticorpo biespecífico no acúmulo tumoral em um modelo de tumor subcutâneo. A hipótese era que uma quantidade maior de anticorpo biespecífico poderia saturar mais facilmente os sítios de ligação disponíveis nas células tumorais, aumentando assim a captação subsequente de quelato marcado. Por outro lado, o aumento excessivo da dose pode levar a um acúmulo menos eficiente da radioatividade associada ao tumor, devido aos níveis mais elevados de anticorpos biespecíficos circulantes. Desenho do estudo, protocolo 91 Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2016-03-29 Injeção s.c.* de células BxPC3 6 2016-04-03 Injeção i.v.* de bsAb PRIT 10 2016-04-07 Injeção i.v.* de Dex500 10 2016-04-07 Eluição de 212Pb-DOTAM 10 2016-04-07 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM 11 2016-04-08 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos *Volume de injeção 100 µL Grupos de estudo no protocolo 91 (ntot = 21) Grupo A B C D E F G bsAb PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- PRIT- 0165 0165 0165 0156 0156 0156 0175 * dose de bsAb 30 100 200 30 100 200 100 (µg) CA Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500 Dex500
Desenho do estudo, protocolo 91 dose de CA 3 10 20 3 10 20 10 (µg) Quelato 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb- 212Pb-
DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM Atividade de 10 10 10 10 10 10 10 Pb (µCi) n 3 3 3 3 3 3 3 *controle sem ligação ao CEA
[0688] Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos por injeção subcutânea de células BxPC3 (passagem 34) em meio RPMI misturado 1:1 com matriz de membrana basal Corning® Matrigel® (fator de crescimento reduzido; nº de cat. 354230). Cada camundongo (7-12 semanas de idade) recebeu injeções por via subcutânea (s.c.) com 5x106 células em 100 μL de RPMI/Matrigel no flanco direito. Cinco dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 220 mm3.
[0689] Os camundongos foram administrados i.v. com anticorpos biespecíficos de ligação ao CEA PRIT-0165 ou PRIT-0156 a uma concentração de 30–200 µg por 100 µL, ou 100 µg do anticorpo controle que não se liga ao CEA, PRIT-0175. Após quatro dias, todos os grupos foram injetados i.v. com um agente de remoção a uma concentração de 3, 10 ou 20 µg por 100 µL (1/10 da dose de anticorpo injetada), em seguida, duas horas mais tarde, com 10 µCi de 212Pb-DOTAM. Os camundongos foram sacrificados após 24 horas e as necropsias foram realizadas. Foram coletados sangue, bexiga, baço, rins, fígado, pulmão, músculo, cauda e tumor. As amostras foram pesadas e tiveram a radioatividade mensurada, e a %ID/g foi calculada para cada órgão.
RESULTADOS, 91
[0690] O pré-direcionamento usando 100 µg de qualquer anticorpo biespecífico de ligação ao CEA resultou em um acúmulo significativo de 212Pb nos tumores, em comparação com 100 µg do controle sem ligação ao CEA
(teste t não pareado, p = 0,027 e 0,008 para comparação com PRIT-0156 e PRIT-0165, respectivamente). Nenhuma diferença significativa foi observada na absorção do tumor ao aumentar a dose de anticorpo de 30 para 200 µg para qualquer uma das construções de ligação ao CEA. Entretanto, os níveis gerais de radioatividade foram ligeiramente elevados na maioria dos tecidos normais para doses de anticorpos acima de 30 µg. É importante ressaltar que a %ID/g no sangue aumentou significativamente para cada incremento de dose, exceto entre 100 e 200 µg de PRIT-0156 (teste t não pareado, p <0,05).
[0691] A Figura 20 mostra a distribuição de 212Pb 24 horas após a injeção de DOTAM radiomarcado (%ID/g ± DP, n = 3). Barras com fundo branco e cinza representam o direcionamento para T84.66 e CH1A1A, respectivamente; a barra preta representa o controle sem ligação ao CEA.
RESUMO E CONCLUSÃO
[0692] Os três níveis de dose de anticorpo (30, 100, e 200 μg) resultaram em alta captação especifica de radioatividade em tumores para ambas as construções biespecíficas testadas. A falta de diferença no acúmulo tumoral com o aumento da dose indicou que os sítios de ligação já estavam saturados na dosagem mais baixa, ou que o tempo entre a administração de PRIT e a injeção do agente de remoção (quatro dias) foi muito curto para permitir maior acúmulo no tumor. Como esperado, os níveis de radioatividade no sangue aumentaram com o aumento da dose, estreitando ligeiramente a janela terapêutica do tratamento.
EXEMPLO 25 EFICÁCIA DO CEA-PRIT (PROTOCOLO 93 (A, B))
[0693] Neste estudo, a eficácia do CEA-PRIT usando dois BsAb candidatos clínicos (pRIT-0213 e PRIT-0214) foi avaliada em dois modelos de tumores subcutâneos paralelos: BxPC3 e LS174T. Os anticorpos biespecíficos foram comparados lado a lado em regimes de tratamento de ciclo único e duplo. Desenho do estudo, protocolo 93a (BxPC3) Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2016-04-13 Injeção i.v.* de células BxPC3 13 2016-04-25 Injeção i.v.* de bsAb PRIT 17 2016-04-29 Injeção i.v.* de CA 17 2016-04-29 Eluição de 212Pb-DOTAM 17 2016-04-29 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM 18 2016-04-30 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos 41 2016-05-23 Injeção i.v.* de bsAb PRIT 45 2016-05-24 Injeção i.v.* de CA 45 2016-05-24 Eluição de 212Pb-DOTAM 45 2016-05-24 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM 46 2016-05-25 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos *Volume de injeção 100 µL Desenho do estudo, protocolo 93b (LS174T) Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2016-04-25 Injeção i.v.* de LS174T cells 5 2016-04-29 Injeção i.v.* de bsAb PRIT 9 2016-05-03 Injeção i.v.* de CA 9 2016-05-03 Eluição de 212Pb-DOTAM 9 2016-05-03 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM 10 2016-05-04 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos 33 2016-05-27 Injeção i.v.* de bsAb PRIT 37 2016-05-31 Injeção i.v.* de CA 37 2016-05-31 Eluição de 212Pb-DOTAM 37 2016-05-31 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM 38 2016-06-01 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos *Volume de injeção 100 µL
[0694] Os grupos A – G representam os camundongos tratados que foram acompanhados para avaliação da eficácia, enquanto os grupos H - L compreendem camundongos que foram sacrificados para fins de biodistribuição 24 horas após sua última injeção de 212Pb-DOTAM.
Grupos de estudo no protocolo 93a (BxPC3; ntot = 71) dose de Atividade dose de Grupo bsAb bsAb CA Quelato de Pb Ciclos n CA (µg) (µg) (µCi) A PRIT-0213 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/10 2 8
B PRIT-0213 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/30 2 8
C PRIT-0214 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/10 2 8
D PRIT-0214 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/30 2 8
E PRIT-0175 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/30 2 8
F — 0 — 0 212Pb-DOTAM 30/30 2 8
G — 0 — 0 — 0 2 8
H PRIT-0213 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30 1 3
I PRIT-0213 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/30 2 3
J PRIT-0214 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30 1 3
K PRIT-0214 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/30 2 3
L PRIT-0175 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30 1 3
Grupos de estudo no protocolo 93b (LS174T; ntot = 71) dose de Atividade dose de Grupo bsAb bsAb CA Quelato de Pb Ciclos n CA (µg) (µg) (µCi) A PRIT-0213 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30 1 8
B PRIT-0213 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/30 2 8
C PRIT-0214 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30 1 8
D PRIT-0214 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/30 2 8
E PRIT-0175 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/30 2 8
F — 0 — 0 212Pb-DOTAM 30/30 2 8
G — 0 — 0 — 0 2 8
H PRIT-0213 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30 1 3
I PRIT-0213 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/30 2 3
J PRIT-0214 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30 1 3
K PRIT-0214 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30/30 2 3
L PRIT-0175 100 Dex500 25 212Pb-DOTAM 30 1 3
[0695] Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos por injeção subcutânea de células em meio RPMI (BxPC3) ou DMEM (LS174T) misturado 1:1 com matriz de membrana basal Corning® Matrigel® (fator de crescimento reduzido; nº de cat. 354230).
[0696] Para o protocolo 93a, camundongos (idade 7 semanas) foram injetados s.c. no flanco direito com 5x106 células BxPC3 (passagem 33) em 100 µL de RPMI/Matrigel. Doze dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 235 mm3.
[0697] Para o protocolo 93b, camundongos (idade 9 semanas) foram injetados s.c. no flanco direito com 5x106 células LS174T (passagem 26) em 100 µL de DMEM/Matrigel. Três dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 150 mm3.
[0698] Cada ciclo de tratamento começou com injeção de BsAb humanizados (PRIT-0213, PRIT-0214, ou PRIT-0175). Após quatro dias, o agente de remoção (Dex500) foi administrado, seguido duas horas mais tarde por 212Pb-DOTAM. Para minimizar a reingestão de urina/fezes radioativas após o ciclo de tratamento 1, as gaiolas foram trocadas 4 horas após a administração de 212Pb-DOTAM e, em seguida, novamente 24 horas p.i. Para o ciclo 2, os camundongos foram colocados em gaiolas com piso grelhado por 4 horas após Administração de 212Pb-DOTAM, antes de ser transferido para novas gaiolas com piso padrão. Todas as gaiolas foram trocadas às 24 horas p.i., assim como após o ciclo 1.
[0699] O desenvolvimento do tumor nos camundongos foi seguido por medição com paquímetro repetida três vezes por semana. Se necessário, uma medição adicional era realizada nos intervalos entre as medições programadas. O peso corporal dos animais foi medido repetidamente da mesma maneira. Os camundongos cujo volume tumoral atingiu 3000 mm 3 foram imediatamente sacrificados. Outros fatores levados em consideração para a eutanásia por razões éticas foram perda de peso corporal, estado do tumor (por exemplo, ulceração) e aparência geral do animal. Alimento úmido foi fornecido a todos os animais a partir de cinco dias após a injeção radioativa, se exigido por uma perda aguda de peso corporal (coletiva ou individual) devido à toxicidade induzida pela radiação, até que todos os indivíduos tivessem se recuperado suficientemente.
[0700] Os seguintes órgãos e tecidos foram coletados a partir dos grupos A – G no momento da eutanásia: bexiga, ovários, fígado, baço, rins, fêmur (incluindo medula óssea), cólon, jejuno, estômago e tumor. Condições inesperadas ou anormais foram observadas e fotografadas. Os tecidos foram imediatamente colocados em formalina tamponada neutra a 10% (4ºC) e depois transferidos para PBS (4ºC) após 5 dias. As amostras fixadas em formalina foram então enviadas para a Roche Pharma Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel, para posterior processamento e análise.
[0701] Os camundongos nos grupos H, J e L foram sacrificados e necropsiados 24 horas após sua primeira e única injeção de 212Pb-DOTAM; os grupos I e K foram sacrificados e necropsiados 24 horas após a segunda injeção de 212Pb-DOTAM. Os seguintes órgãos e tecidos foram coletados: sangue, bexiga, intestino delgado, cólon, baço, pâncreas, rins, fígado, pulmão, coração, osso femoral, músculo, cauda e tumor. As amostras coletadas foram pesadas e medidas quanto à radioatividade, e a porcentagem de dose injetada por grama de tecido (%ID/g) foi subsequentemente calculada, incluindo correções para decaimento e fundo. RESULTADOS, 93A
[0702] Os resultados após o ciclo de tratamento 1 corresponderam bem com a absorção de tecido previamente alcançada neste modelo, com alto acúmulo tumoral (25,0 ± 9,7 e 19,5 ± 6,4 %ID/g para PRIT-0213 e PRIT-0214, respectivamente) e baixo acúmulo no normal tecidos. Entretanto, o ciclo 2 resultou em um perfil de distribuição de 212Pb diferente, com aumento do teor radioativo em todos os tecidos coletados.
[0703] Figura 21 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± EPM, n = 3), para os ciclos de tratamento 1 e 2 no modelo BxPC3.
[0704] Todos os camundongos que foram injetados com 30 μCi de 212Pb-DOTAM experenciaram uma queda inicial no peso corpóreo, que foi atenuada 10 dias após a primeira injeção radioativa. Os grupos que receberam uma segunda injeção de 30 µCi sofreram uma perda de peso aguda mais pronunciada, provavelmente devido à eliminação mais lenta da radioatividade e o acúmulo resultante de 212Pb em tecidos normais observado na biodistribuição associada ao ciclo 2. Esse efeito não foi observado para os grupos que receberam um segundo ciclo com 10 µCi, após o qual a perda de peso foi moderada.
[0705] A Figura 22 mostra uma média de pesos corporais nos grupos A – G (n = 8) após CEA-PRIT no modelo BxPC3. As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0706] A Figura 23 mostra a variação média do peso nos grupos A – G (n = 8) após CEA-PRIT no modelo BxPC3, expressa como porcentagem de peso corporal inicial. As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb- DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0707] Todos os grupos duplicaram o volume tumoral no dia 14-19 em comparação com os valores basais. O primeiro tratamento com 212Pb- DOTAM foi dado no dia 16, após o qual os tumores nos grupos PRIT-0213 e PRIT-0214 continuaram a crescer por cerca de uma semana antes de exibirem uma regressão no volume. Nenhum tumor regrediu completamente, mas os volumes permaneceram relativamente constantes no nível baixo até o dia 40- 47, quando mais uma vez atingiram o dobro do volume em comparação com o valor basal. A segunda injeção de 30 µCi de 212Pb-DOTAM foi administrada neste ponto (dia 44), que, como discutido anteriormente, resultou em perda de peso aguda e subsequente eutanásia para a maioria dos camundongos afetados na semana seguinte. Os camundongos que receberam um segundo ciclo de tratamento com 10 em vez de 30 µCi de 212Pb-DOTAM (dia 55) apresentaram menos toxicidade induzida por radiação. A injeção de 10 µCi resultou em uma segunda fase de regressão tumoral, durando aproximadamente entre os dias 58 e 75. PRIT com o bsAb não específico resultou em inibição significativa, mas limitada do crescimento do tumor em comparação com 212Pb-DOTAM sozinho ou PBS. As comparações de médias usando o método de Dunnet revelaram que todos os regimes de tratamento usando PRIT-0213 e PRIT-0214 resultaram em proporções iguais de tratamento para controle, todas significativamente diferentes em comparação com qualquer grupo de controle do dia 23-26 em diante.
[0708] No dia 47, o último dia em que todos os grupos de tratamento ainda estavam representados, a inibição do crescimento tumoral (TGI) foi 87,3, 88,8, 84,1, 88,7, 57,5 e 15,8% para os grupos “PRIT-0213, 30 + 10 µCi”, “PRIT-0213, 30 + 30 µCi”, “PRIT-0214, 30 + 10 µCi”, “PRIT-0214, 30 + 30 µCi”, “PRIT-0175, 30 + 30 µCi” e “DOTAM sozinho, 30 + 30 µCi”, respectivamente, em comparação com PBS. O último camundongo no grupo de controle tratado com veículo foi contabilizado no dia 66, momento em que a TGI foi de 87,8, 84,5 e 87,3% para os três grupos restantes: “PRIT-0213, 30 +
10 µCi”, “PRIT-0214, 30 + 10 µCi” e “PRIT-0214, 30 + 30 µCi”, respectivamente. Um total de seis camundongos sobreviveram até o final do experimento (dia 84): um do grupo “PRIT-0213, 30 + 10 µCi”, três do grupo “PRIT-0214, 30 + 10 µCi” e dois do grupo “ PRIT-0214, 30 + 30 µCi”.
[0709] A Figura 24 mostra as médias do crescimento tumoral com erro padrão para os grupos A – G no modelo BxPC3 (n = 8). As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0710] A Figura 25 mostra curvas de crescimento tumoral individuais para os grupos A – G no modelo BxPC3. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM.
[0711] A Figura 26 mostra as curvas de Kaplan-Meier mostrando a sobrevida nos grupos A – G no modelo BxPC3 (n = 8). As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM.
[0712] Os testes pareados foram realizados para especificar quais grupos eram significativamente diferentes em termos de sobrevida: o teste Log- Rank (mais peso em eventos de sobrevida posteriores) e o teste de Wilcoxon (mais peso em tempos de sobrevivência iniciais), ambos usando correção de Bonferroni para múltiplas testagens. Devido à toxicidade induzida por radiação, “PRIT-0213, 30 + 30 µCi” teve desempenho igual ou pior do que os grupos controle. O tratamento PRIT-0214 correspondente alcançou resultados ligeiramente melhores, aumentando a sobrevida em comparação com PBS e o anticorpo não específico. Os dois grupos com 10 µCi de 212Pb-DOTAM no segundo ciclo aumentaram significativamente a sobrevida em comparação com todos os grupos, exceto entre si e “PRIT-0214, 30 + 30 µCi”. Teste Log-Rank Pareado (nível de teste múltiplo = 0,00238)
PRIT- DOTAM PRIT-0175 PRIT-0213 PRIT-0213 PRIT-0214 Veículo 0214 Grupo sozinho 30 + 30 30 + 10 30 + 30 30 + 30 (PBS) 30 + 10 30 + 30 µCi µCi µCi µCi µCi µCi Veículo 1,0000 0,5271 0,9420 0,0002* 0,6178 0,0003* 0,0425* (PBS)
DOTAM sozinho 0,5271 1,0000 0,0032* 0,0001* 0,8474 <,0001* 0,0685 30 + 30 µCi PRIT-0175 0,9420 0,0032* 1,0000 0,0001* 0,0007* 0,0001* 0,0001* 30 + 30 µCi PRIT-0213 0,0002* 0,0001* 0,0001* 1,0000 <,0001* 0,6377 0,2894 30 + 10 µCi PRIT-0213 0,6178 0,8474 0,0007* <,0001* 1,0000 <,0001* 0,0302* 30 + 30 µCi PRIT-0214 0,0003* <,0001* 0,0001* 0,6377 <,0001* 1,0000 0,1392 30 + 10 µCi PRIT-0214 0,0425* 0,0685 0,0001* 0,2894 0,0302* 0,1392 1,0000 30 + 30 µCi Teste de Wilcoxon pareado (nível de teste múltiplo = 0,00238) PRIT- DOTAM PRIT-0175 PRIT-0213 PRIT-0213 PRIT-0214 Veículo 0214 Grupo sozinho 30 + 30 30 + 10 30 + 30 30 + 30 (PBS) 30 + 10 30 + 30 µCi µCi µCi µCi µCi µCi Veículo 1,0000 0,1439 0,6563 0,0004* 0,1290 0,0006* 0,0219* (PBS)
DOTAM sozinho 0,1439 1,0000 0,0042* 0,0004* 0,8704 0,0002* 0,0827 30 + 30 µCi PRIT-0175 0,6563 0,0042* 1,0000 0,0002* 0,0008* 0,0002* 0,0002* 30 + 30 µCi PRIT-0213 0,0004* 0,0004* 0,0002* 1,0000 0,0002* 0,7489 0,0790 30 + 10 µCi PRIT-0213 0,1290 0,8704 0,0008* 0,0002* 1,0000 0,0002* 0,0648 30 + 30 µCi PRIT-0214 0,0006* 0,0002* 0,0002* 0,7489 0,0002* 1,0000 0,0350* 30 + 10 µCi PRIT-0214 0,0219* 0,0827 0,0002* 0,0790 0,0648 0,0350* 1,0000 30 + 30 µCi RESULTADOS, 93B
[0713] Ambos os ciclos de tratamento resultaram em elevado acúmulo de 212Pb nos tumores e baixo acúmulo de 212Pb em tecidos normais. A captação do tumor após o ciclo 1 foi de 30,9 ± 2,9 e 21,4 ± 1,9 %ID/g para PRIT-0213 e PRIT-0214, respectivamente; após o ciclo 2, os números correspondentes foram 33,2 ± 0,7 e 40,1 ± 6,5 %ID/g.
[0714] Figura 27 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3), para os ciclos de tratamento 1 e 2 no modelo LS174T.
[0715] Todos os camundongos que foram injetados com 212Pb- DOTAM experimentaram um decréscimo moderado no peso corporal, de forma semelhante depois de ambos os ciclos de tratamento com 30 μCi. Entretanto, muitos animais foram sacrificados prematuramente por razões éticas devido ao mau estado do tumor.
[0716] A Figura 28 mostra uma média de pesos corporais nos grupos A – G (n = 8) após CEA-PRIT no modelo LS174T. As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0717] A Figura 29 mostra a variação média de peso nos grupos A – G (n = 8) após CEA-PRIT no modelo LS174T, expressa como porcentagem de peso corporal inicial. As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb- DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0718] O primeiro tratamento com 212Pb-DOTAM foi dado no dia 8.
Nenhum tumor regrediu em comparação com a linha basal, mas as médias dos grupos PRIT-0213 e PRIT-0214 permaneceram relativamente constantes, aumentando muito lentamente. A segunda injeção com 30 µCi de 212Pb- DOTAM foi administrada no dia 36; no entanto, devido ao rápido crescimento tumoral nos grupos controle e ao problema discutido anteriormente com o mal estado do tumor em todos os grupos, muitos camundongos já haviam sido sacrificados nessa época. Aqueles que receberam uma segunda injeção de 30 µCi de 212Pb-DOTAM recuperaram ou mantiveram o controle do tumor, mas nenhum tumor regrediu completamente. As comparações de médias usando o método de Dunnet revelaram que todos os regimes de tratamento usando PRIT-0213 e PRIT-0214 resultaram em proporções tratamento/controle significativamente diferentes em comparação com o grupo tratado com PBS, a partir do dia 14. Além disso, os controles PRIT-0175 e DOTAM diferiram significativamente do controle com veículo, a partir do dia 16 e 22, respectivamente.
[0719] No dia 22, o último dia em que todos os grupos de tratamento ainda estavam representados, a inibição do crescimento tumoral (TGI) foi 83,1, 88,8, 87,5, 91,0, 53,0, e 64,7% para grupos “PRIT-0213, 30 µCi”, “PRIT-0213, 30 + 30 µCi”, “PRIT-0214, 30 µCi”, “PRIT-0214, 30 + 30 µCi”, “PRIT-0175, 30 + 30 µCi”, e “DOTAM sozinho, 30 + 30 µCi”, respectivamente, em comparação com PBS. O último camundongo no grupo de controle tratado com veículo foi contabilizado no dia 30, momento em que a TGI foi de 92,5, 89,5, 90,8, 92,6, e 79,9% para os grupos remanescentes “PRIT-0213, 30 µCi”, “PRIT-0213, 30 + 30 µCi”, “PRIT-0214, 30 µCi”, “PRIT-0214, 30 + 30 µCi”, e “PRIT-0175, 30 + 30 µCi”, respectivamente. Dois camundongos sobreviveram até o final do experimento (dia 101), ambos do grupo “PRIT-0214, 30 + 30 µCi”.
[0720] A Figura 30 mostra as médias do crescimento tumoral com erro padrão para os grupos A – G (n = 8) no modelo LS174T. As curvas foram truncadas na primeira morte em cada grupo. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM para alguns ou todos os grupos, de acordo com o desenho do estudo.
[0721] A Figura 31 mostra curvas de crescimento tumoral individuais para os grupos A – G no modelo LS174T. As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM.
[0722] A Figura 32 mostra as curvas de Kaplan-Meier mostrando a sobrevida nos grupos A – G no modelo LS174T (n = 8). As linhas verticais pontilhadas indicam a administração de 212Pb-DOTAM.
[0723] Os testes Log-Rank e Wilcoxon foram realizados com correção de Bonferroni, para especificar quais grupos eram significativamente diferentes em termos de sobrevida. Os principais achados foram que “PRIT- 0214, 30 + 30 µCi” aumentou significativamente a sobrevida em comparação com todos os grupos, exceto “PRIT-0213, 30 µCi”. No entanto, a sobrevida global no grupo “PRIT-0213, 30 + 30 µCi” não foi significativamente diferente daquela de “PRIT-0213, 30 µCi”, diferindo apenas ligeiramente daquela de “PRIT-0214, 30 + 30 µCi”. Teste Log-Rank Pareado (nível de teste múltiplo = 0,00238) PRIT- PRIT- PRIT- DOTAM PRIT- PRIT- Veículo 0175 0213 0214 Grupo sozinho 0213 0214 (PBS) 30 + 30 30 + 30 30 + 30 30 + 30 µCi 30 µCi 30 µCi µCi µCi µCi Veículo 1,0000 0,0034* 0,4728 0,0002* <,0001* <,0001* 0,0399* (PBS)
DOTAM sozinho 0,0034* 1,0000 0,0090* <,0001* <,0001* <,0001* 0,0091* 30 + 30 µCi PRIT-0175 0,4728 0,0090* 1,0000 0,0051* <,0001* <,0001* 0,3974 30 + 30 µCi PRIT-0213 0,0002* <,0001* 0,0051* 1,0000 0,9883 0,0353* 0,0357* 30 + 30 µCi PRIT-0213 <,0001* <,0001* <,0001* 0,9883 1,0000 0,1428 0,0002* 30 µCi PRIT-0214 <,0001* <,0001* <,0001* 0,0353* 0,1428 1,0000 <,0001* 30 + 30 µCi PRIT-0214 0,0399* 0,0091* 0,3974 0,0357* 0,0002* <,0001* 1,0000 30 µCi Teste de Wilcoxon pareado (nível de teste múltiplo = 0,00238) Grupo Veículo DOTAM PRIT-0175 PRIT-0213 PRIT-0213 PRIT-0214 PRIT-0214 (PBS) sozinho 30 + 30 30 + 30 30 µCi 30 + 30 30 µCi 30 + 30 µCi µCi µCi µCi Veículo 1,0000 0,0111* 0,8734 0,0005* 0,0002* 0,0002* 0,1330 (PBS) DOTAM 0,0111* 1,0000 0,0417* 0,0002* 0,0002* 0,0002* 0,0160* sozinho 30 + 30 µCi PRIT-0175 0,8734 0,0417* 1,0000 0,0047* 0,0002* 0,0002* 0,3994 30 + 30 µCi PRIT-0213 0,0005* 0,0002* 0,0047* 1,0000 0,5630 0,0193* 0,0541 30 + 30 µCi PRIT-0213 0,0002* 0,0002* 0,0002* 0,5630 1,0000 0,1100 0,0004* 30 µCi PRIT-0214 0,0002* 0,0002* 0,0002* 0,0193* 0,1100 1,0000 0,0002*
Teste Log-Rank Pareado (nível de teste múltiplo = 0,00238) PRIT- PRIT- PRIT- DOTAM PRIT- PRIT- Veículo 0175 0213 0214 Grupo sozinho 0213 0214 (PBS) 30 + 30 30 + 30 30 + 30 30 + 30 µCi 30 µCi 30 µCi µCi µCi µCi 30 + 30 µCi PRIT-0214 0,1330 0,0160* 0,3994 0,0541 0,0004* 0,0002* 1,0000 30 µCi
RESUMO E CONCLUSÃO
[0724] CEA-PRIT usando qualquer um dos dois anticorpos biespecíficos PRIT-0213 e PRIT-0214, com um ou dois ciclos de tratamento, resultou na inibição significativa do crescimento tumoral e aumento na sobrevida para ambos os modelos tumorais estudados. Os esforços de solução de problemas após a inesperada biodistribuição de 212Pb do segundo ciclo e subsequente toxicidade induzida por radiação no estudo BxPC3 concluiu que a situação foi provavelmente causada por um problema não identificado relacionado à injeção. O estudo de eficácia do BxPC3 deve ser repetido para confirmar que o problema não é inerente ao regime de tratamento.
Experimentos futuros no modelo LS174T não devem ser realizados até que o problema do mau estado do tumor seja resolvido. Para aumentar a eficiência do segundo ciclo de tratamento, é proposto que o tempo entre os dois ciclos seja encurtado para evitar o novo crescimento do tumor. Além disso, adicionar um terceiro ciclo de tratamento ao regime também pode ser uma opção para avaliação posterior.
[0725] Por fim, estudos dos mecanismos subjacentes ao crescimento do tumor são de grande interesse para esclarecer por que, embora seu crescimento seja claramente inibido, os tumores não regridem completamente, mas em vez disso começam a crescer novamente após determinado período.
EXEMPLO 26 DOSES DO AGENTE DE REMOÇÃO (PROTOCOLO 105)
[0726] Neste estudo, um intervalo de doses de agente de remoção baseada em dextrano-500 com 50% de saturação TCMC foi avaliada em termos de efeito sobre associação de 212Pb-DOTAM para tumores pré- direcionados. Desenho do estudo, protocolo 105 Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2016-08-30 Injeção i.v.* de células BxPC3 13 2016-09-12 Injeção i.v.* de bsAb PRIT 16 2016-09-15 Injeção i.v.* de CA ou PBS 16 2016-09-15 Eluição de 212Pb-DOTAM 16 2016-09-15 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM 17 2016-09-16 Eutanásia e necropsia; contagem gama em tecidos *Volume de injeção 100 µL Grupos de estudo no protocolo 105 (ntot = 18) Grupo bsAb dose de CA dose Quelato Atividade n bsAb de CA de Pb (µg) (µg) (µCi) A CEA-DOTAM 100 Dex500-(50%) 5 212Pb-DOTAM 10 3 B CEA-DOTAM 100 Dex500-(50%) 10 212Pb-DOTAM 10 3 C CEA-DOTAM 100 Dex500-(50%) 30 212Pb-DOTAM 10 3 D CEA-DOTAM 100 Dex500-(50%) 75 212Pb-DOTAM 10 3 E CEA-DOTAM 100 Dex500-(50%) 250 212Pb-DOTAM 10 3 F CEA-DOTAM 100 — 0 212Pb-DOTAM 10 3
[0727] Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos por injeção subcutânea de células BxPC3 (passagem 26) em meio RPMI misturado 1:1 com matriz de membrana basal Corning® Matrigel® (fator de crescimento reduzido; nº de cat. 354230). Cada camundongo (6 semanas de idade) recebeu injeções por via subcutânea (s.c.) com 5x106 células em 100 μL de RPMI/Matrigel no flanco direito. Quinze dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 222 mm3. CEA-PRIT (100 µg per 100 µL) foi administrado i.v., seguido pela administração de Dex500-(50%) após três dias (5–250 µg por 100 µL). O grupo F recebeu PBS ao invés de agente de remoção. Após duas horas, os camundongos receberam injeções i.v. com 100 µL de 212Pb-DOTAM (10 µCi).
[0728] Os camundongos foram sacrificados e necropsiados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM. Sangue, bexiga, baço, rins, fígado, pulmão, músculo, cauda e tumores foram coletados, pesados e medidos quanto ao teor de radioatividade, e a %ID/g foi subsequentemente calculada.
RESULTADOS, 105
[0729] O acúmulo tumoral de 212Pb foi geralmente alto para todas as doses de CA, exceto 250 µg. A depuração do sangue do anticorpo biespecífico CEA-PRIT foi mais eficiente para doses de CA de 30, 75 e 250 µg.
Consequentemente, as maiores proporções de tumor para sangue foram alcançadas para 30, 75 e 250 µg de CA: 187,7, 180,2 e 243,5, respectivamente. A captação tumoral correspondente de 212Pb foi 91,8 ± 18,9, 70,5 ± 11,1 e 35,2 ± 17,0 %ID/g (± DP, n = 3).
[0730] A Figura 33 mostra a distribuição de radioatividade em tecidos selecionados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3). As barras em cinza representam o acúmulo no tecido após a injeção de várias quantidades de Dex500- (50%) CA; a barra preta representa o controle sem CA.
[0731] A Figura 34 mostra o teor de 212Pb no sangue e tumores 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3) e as proporções de tumor para sangue (tumor/sangue) correspondentes. As barras em cinza representam o acúmulo no tecido após a injeção de várias quantidades de Dex500- (50%) CA; a barra preta representa o controle sem CA.
RESUMO E CONCLUSÃO
[0732] Com base no acúmulo de 212Pb alcançado em tumores, a depuração do sangue e a razão tumor/sangue subsequente, uma dose de 30 µg de Dex500-(50%) pareceu favorável para CEA-PRIT no modelo BxPC3.
EXEMPLO 27
TEMPO DE RESIDÊNCIA NO SANGUE DO AGENTE DE REMOÇÃO À BASE DE DEXTRANO-500 (PROTOCOLO 106)
[0733] Neste estudo, o agente de remoção à base de dextrano- 500 com 50% de saturação de TCMC foi avaliado em termos de tempo de residência no sangue. O objetivo era identificar um período de tempo adequado para tratamentos repetidos (1–4 semanas), garantindo que pouco ou nenhum agente de remoção permanecesse em circulação que pudesse se ligar aos anticorpos biespecíficos administrados, bloqueando efetivamente a ligação de DOTAM radiomarcado subsequentemente injetado. Desenho do estudo, protocolo 106 Dia do Data Procedimento experimental estudo 1 2016-09-19 Injeção i.v.* de bsAb PRIT 2 2016-09-12 Injeção i.v.* de CA ou PBS 9 2016-09-27 Injeção i.v.* de bsAb PRIT (1 semana) 10 2016-09-28 Eluição de 212Pb-DOTAM 10 2016-09-28 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM (1 semana) 10 2016-09-28 Eutanásia e amostragem de sangue + contagem gama (1 semana) 16 2016-10-04 Injeção i.v.* de bsAb PRIT (2 semanas) 17 2016-10-05 Eluição de 212Pb-DOTAM 17 2016-10-05 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM (2 semanas) 17 2016-10-05 Eutanásia e amostragem de sangue + contagem gama (2 semanas) 23 2016-10-11 Injeção i.v.* de bsAb PRIT (3 semanas) 24 2016-10-12 Eluição de 212Pb-DOTAM 24 2016-10-12 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM (3 semanas) 24 2016-10-12 Eutanásia e amostragem de sangue + contagem gama (3 semanas) 30 2016-10-18 Injeção i.v.* de bsAb PRIT (4 semanas)
Desenho do estudo, protocolo 106 31 2016-10-19 Eluição de 212Pb-DOTAM 31 2016-10-19 Injeção i.v.* de 212Pb-DOTAM (4 semanas) 31 2016-10-19 Eutanásia e amostragem de sangue + contagem gama (4 semanas) *Volume de injeção 100 µL Grupos de estudo no protocolo 106 (ntot = 24) Grupo bsAb dose CA dose Intervalo Quelato Atividade n de de CA (semana) de Pb bsAb (µg) (µCi) (µg) A CEA-DOTAM 100 Dex500-(50%) 25 1 212Pb-DOTAM 10 3 B CEA-DOTAM 100 — 0 1 212Pb-DOTAM 10 3 C CEA-DOTAM 100 Dex500-(50%) 25 2 212Pb-DOTAM 10 3 D CEA-DOTAM 100 — 0 2 212Pb-DOTAM 10 3 E CEA-DOTAM 100 Dex500-(50%) 25 3 212Pb-DOTAM 10 3 F CEA-DOTAM 100 — 0 3 212Pb-DOTAM 10 3 G CEA-DOTAM 100 Dex500-(50%) 25 4 212Pb-DOTAM 10 3 H CEA-DOTAM 100 — 0 4 212Pb-DOTAM 10 3
[0734] Os camundongos (9 semanas) foi administrado i.v. com CEA-PRIT (100 µg por 100 µL), seguido um dia depois por Dex500-(50%) (25 µg por 100 µL). Os grupos B, D, F e H receberam PBS em vez de agente de remoção. Após 1, 2, 3 ou 4 semanas, os camundongos foram reinjetados i.v.
com CEA-PRIT (100 µg por 100 µL), seguido um dia depois por 100 µL de 212Pb-DOTAM (10 µCi).
[0735] Os camundongos foram sacrificados 4 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM. O sangue foi coletado no momento da eutanásia, e as amostras foram pesadas e medidas quanto ao teor de radioatividade. A porcentagem da dose injetada por grama de sangue (%ID/g) foi então calculada, incluindo correções para decaimento radioativo e fundo.
RESULTADOS, 106
[0736] Não houve nenhuma diferença estatisticamente significativa no teor médio de radioatividade entre os camundongos que receberam Dex500-(50%) ou PBS por qualquer um dos pontos de tempo estudado (ANOVA unidirecional, teste de comparações múltiplas de Sidak, p> 0,05).
[0737] A Figura 35 mostra o teor de radioatividade no sangue 4 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM (%ID/g ± DP, n = 3).
RESUMO E CONCLUSÃO
[0738] Os resultados mostram que um ciclo de tratamento CEA- PRIT repetido pode ser iniciado já uma semana após a última injeção de Dex500-(50%), sem bloquear a ligação do 212Pb-DOTAM administrado posteriormente ao bsAb CEA-DOTAM.
EXEMPLO 28
FORMATOS ADICIONAIS DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS GERAÇÃO DE PLASMÍDEOS PARA A EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE CADEIAS PESADAS OU LEVES DE ANTICORPO
[0739] As proteínas desejadas foram expressas por transfecção transitória de células de rim embrionário humano (HEK 293). Para a expressão de um gene/proteína desejada (por exemplo, cadeia pesada de anticorpo de comprimento total, cadeia leve de anticorpo de comprimento total ou uma cadeia pesada de anticorpo de comprimento total) contendo um domínio adicional (por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina em seu C-terminal) foi usada uma unidade de transcrição compreendendo os seguintes elementos funcionais: - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato a partir do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o íntron A, - uma região 5' não traduzida (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina murina (SS), - um gene/proteína a ser expresso, e - a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH pA).
[0740] Além da unidade/cassete de expressão incluindo o gene que se deseja que seja expresso, o plasmídeo de expressão em mamífero básico/padrão continha: - uma origem de replicação a partir do vetor pUC18 que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli; e - um gene beta-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli.
P1AE1766
[0741] Os genes codificantes de uma cadeia pesada de anticorpo incluindo genes de fusão C-terminal compreendendo uma cadeia pesada de anticorpo completa e funcional, seguida por um domínio VL-CH1 ou VH-C- Kappa de anticorpo adicional foram montados pela fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência separados por um ligante G4Sx4 ao C-terminal do domínio CH3 de uma molécula de IgG humana (VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3-ligante-VL-CH1 ou ou VH-CH1-dobradiça-CH2- CH3-ligante-CH-Ck). As moléculas de anticorpos recombinantes que carregam um domínio VL-CH1 e um VH-Ck nos C-terminais dos dois domínios CH3, respectivamente, foram expressas usando a tecnologia knob-into-hole.
[0742] Os genes de codificam uma cadeia leve de anticorpo compreendendo uma cadeia leve de anticorpo completa e funcional foram montados por fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência.
P1AE1768
[0743] Os genes codificantes da cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de anticorpo completa e funcional direcionada ao CEA ou DOTAM, foram montados usando a tecnologia knob- into-hole.
[0744] Os genes que codificam a cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma cadeia leve de anticorpo completa e funcional foram montados por fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência. A correta associação foi assegurada usando a tecnologia CrossMab (trocando os domínios CL e CH1 para um dos braços).
P1AE1769
[0745] Um gene de fusão foi montado pela fusão de um fragmento de DNA que codifica um domínio VH-CH1 através de um ligante G4Sx4 ao N- terminal do domínio VL de uma molécula de IgG humana contendo uma troca de domínio VL por domínio VH (assim, tornando um gene de fusão que codifica a estrutura VH-CH1-Ligante-VL-CH1-dobradiça-CH2-CH3). Moléculas de anticorpos recombinantes portando um VH -CH1 e nenhuma fusão no N- terminal, respectivamente, foram expressas usando a tecnologia knob-into- hole.
[0746] Os genes que codificam o VH-C kappa de anticorpo compreendendo uma cadeia leve de anticorpo completa e funcional foram montados por fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência.
[0747] Os genes que coficam uma cadeia leve de anticorpo compreendendo uma cadeia leve de anticorpo completa e funcional foram montados por fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência.
[0748] A associação correta foi assegurada usando a tecnologia
CrossMab.
P1AE1767
[0749] Os genes codificantes de uma cadeia pesada de anticorpo incluindo genes de fusão C-terminal compreendendo uma cadeia pesada de anticorpo completa e funcional, seguida por um domínio V Leve-CH1 de anticorpo adicional foram montados pela fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência separados por um ligante G4Sx4 ao C-terminal do domínio CH3 de uma molécula de IgG humana (VH- CH1-dobradiça-CH2-CH3-ligante-VL-CH1). As moléculas de anticorpos recombinantes que carregam um domínio VL-CH1 e nenhuma fusão nos C- terminais dos dois domínios CH3, respectivamente, foram expressas usando a tecnologia knob-into-hole.
[0750] Os genes que codificam o VH-C kappa de anticorpo compreendendo uma cadeia leve de anticorpo completa e funcional foram montados por fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência.
[0751] Os genes que coficam uma cadeia leve de anticorpo compreendendo uma cadeia leve de anticorpo completa e funcional foram montados por fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência.
[0752] A associação correta foi assegurada usando a tecnologia CrossMab.
P1AE1770
[0753] Os genes codificantes de uma cadeia pesada de anticorpo incluindo genes de fusão C-terminal compreendendo uma cadeia pesada de anticorpo completa e funcional, seguida por um domínio V-leve-C-Kappa- Ligante-V-pesada-CH1 de anticorpo adicional foram montados pela fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência separados por um ligante G4Sx4 ao C-terminal do domínio CH3 de uma molécula de IgG humana (VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3-ligante-VL-Ck-Ligante- VH-CH1). As moléculas de anticorpos recombinantes que carregam uma cadeia Fab única e nenhuma fusão nos C-terminais dos dois domínios CH3, respectivamente, foram expressas usando a tecnologia knob-into-hole.
[0754] Os genes que coficam uma cadeia leve de anticorpo compreendendo uma cadeia leve de anticorpo completa e funcional foram montados por fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência.
EXPRESSÃO TRANSITÓRIA DAS MOLÉCULAS DE ANTICORPO
[0755] As moléculas de anticorpo foram produzidas pela transfecção transitória de células HEK293 (linhagem de células derivadas de rim embrionário humano 293) cultivadas em meio F17 (Invitrogen Corp.). Para a transfecção foi utilizado o reagente de transfecção “293-Free” (Novagen). As respectivas moléculas de cadeia pesada e leve do anticorpo, conforme descrito acima, foram expressas a partir de plasmídeos de expressão individuais. As transfecções foram efetuadas seguindo as instruções do fabricante. Os sobrenadantes da cultura de células contendo imunoglobulina foram coletados três a sete (3-7) dias após a transfecção. Os sobrenadantes foram armazenados em baixa temperatura (por exemplo, -80 ºC ) até a purificação.
[0756] Informações gerais sobre a expressão recombinante de imunoglobulinas humanas em células HEK293 são fornecidas, por exemplo, em: Meissner, P., et al, Biotechnol.. Bioeng. 75(2001) 197-203. Volume de TapirID Rendimento [mg] Teor de Monômero (SEC) Expressão P1AE1766 2l 2,5 >98% P1AE1767 2l 2 >98% P1AE1768 2l 20 >95% P1AE1769 2l 2 >96% P1AE1770 2l 0,4 >96%
[0757] As moléculas foram purificadas por uma coluna MabSelect Sure (cromatografia de afinidade) seguido por Superdex 200 (cromatografia de exclusão por tamanho).
AVALIAÇÃO KINEXA DAS PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO DO DOTAM DOS DIFERENTES FORMATOS
[0758] Para uma análise detalhada da determinação da afinidade, foi usado Kinexa.
INSTRUMENTAÇÃO E MATERIAIS
[0759] Foi usado um instrumento KinExA 3200 da Sapidyne Instruments (Boise, ID) com amostrador automático. Esferas de polimetilmetacrilato (PMMA) foram adquiridas da Sapidyne, enquanto o PBS (solução salina tamponada com fosfato), BSA (albumina sérica bovina fração V) e os anticorpos anti-DOTAM foram preparados internamente (Roche). O anticorpo de cabra Anti-fragmento Fc de IgG humana de afinidade purificada conjugado com Dylight650® absorvido de forma cruzada foi adquirido pela Bethyl Laboratories (Montgomery, TX). Os antígenos Pb-DOTAM biotinilados (Pb-DOTAM-alquil-biotina isômero A e B, Pb-DOTAM-Bn-biotina/TCMC-Pb- dPEG3-Biotina, isômero A e B) e o Pb-DOTAM não biotinilado foram obtidos da AREVA Med (Bethesda, MD).
PREPARAÇÃO DE ESFERAS REVESTIDAS COM ANTÍGENO
[0760] As esferas PMMA foram revestidas de acordo com o protocolo do manual KinExA para moléculas biotiniladas (Sapidyne).
Resumidamente, primeiro, foram adicionados 10 µg de Biotina-BSA (Thermo Scientific) em 1 mL de PBS (pH 7,4) por frasco (200 mg) de esferas para revestimento de adsorção. Após rotação durante 2 h em temperatura ambiente, o sobrenadante foi removido e as esferas foram lavadas 5 vezes com 1 mL de PBS. Depois, 1 mL de 100 µg de NeutrAvidin Biotin-Binding Protein (Thermo Scientific) em PBS contendo 10 mg/mL de BSA foi adicionado às esferas e incubado em temperatura ambiente por mais 2 h para acoplar NeutrAvidin às esferas e fornecer biotina adicional sítios de ligação para ligação subsequente de proteínas biotiniladas. As esferas revestidas com NeutrAvidin foram então enxaguadas 5 vezes com 1 mL de PBS. Finalmente, as esferas foram revestidas com 200 ng/mL de mistura de isômero Pb-DOTAM biotinilado (50 ng para cada isômero) em PBS e incubadas por mais 2 h em temperatura ambiente. As esferas foram então ressuspensas em 30 mL de PBS e usadas imediatamente.
ENSAIOS DE EQUILÍBRIO KINEXA
[0761] Todos os experimentos KinExA foram realizados à temperatura ambiente (TA) utilizando PBS pH 7,4 como tampão de corrida. As amostras foram preparadas em tampão de corrida suplementado com 1 mg/mL BSA (“tampão de amostra”). Foi usada uma velocidade de fluxo de 0,25 mL/min. Uma quantidade constante de anticorpo anti-DOTAM com concentração no sítio de ligação de 5 pM foi titulada com antígeno Pb-DOTAM por diluição em série dupla começando em 100 pM (faixa de concentração de 0,049 pM - 100 pM). Uma amostra de anticorpo sem antígeno serviu como sinal 100% (ou seja, sem inibição). Os complexos antígeno-anticorpo foram incubados em temperatura ambiente por pelo menos 24 horas para permitir que o equilíbrio seja alcançado. As misturas equilibradas passaram através de uma coluna de esferas acopladas com Pb-DOTAM no sistema KinExA a um volume de 5 mL que permitam o anticorpo não ligado a ser capturado pelas esferas sem perturbar o estado de equilíbrio da solução. O anticorpo capturado foi detectado usando 250 ng/mL de anticorpo secundário específico do fragmento Fc anti-humano conjugado com Dylight 650© em tampão de amostra. Cada amostra foi medida em duplicatas para todos os experimentos de equilíbrio.
[0762] O KD foi obtido a partir da análise de regressão não linear dos dados usando um modelo de ligação homogêneo de um local contido no software KinExA (Versão 4.0.11) usando o método de “análise padrão”. O software calcula o valor de KD e determina o intervalo de confiança de 95% ajustando os pontos de dados a uma curva KD teórica. O intervalo de confiança de 95% (Sapidyne TechNote TN207R0) é fornecido como KD baixo e KD alto. Amostra KD ( pM) Intervalo de Confiança (pM) P1AE1766 1,4 0,4-3 P1AE1767 1,0 0,8-1,4 P1AE1768 0,8 0,5-1,3 P1AE1769 0,9 0,4-1,5 P1AE1770 1,3 0,9-1,8 PRIT-213 1,0 0,6-1,5
[0763] Todas as construções são comparáveis em KD uma vez que os intervalos de confiança se sobrepõem.
SEQUÊNCIAS DE MOLÉCULAS EM DIFERENTES FORMATOS:
[0764] Modificações de carga opcionais são mostradas em negrito e sublinhado: EQ->RK, ou KK->EE.
[0765] P1AE1766: >Cadeia leve CEA RK:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIY SASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC; >CAdeia pesada CEA com DOTAM VL / CH1:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAM DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIY QASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVE
IKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC; > Cadeia pesada CEA com DOTAM VH / CK:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAM DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFI GSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPH LWGRGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C.
[0766] P1AE1767: >DOTAM “LC” com VH / CK
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGF IGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPP HLWGRGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC; > Cadeia leve CEA RK:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIY SASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC; > Cadeia pesada CEA com DOTAM VL / CH1:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAM DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIY QASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVE
IKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC; >Cadeia pesada CEA:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAM DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[0767] P1AE1768: >CEA LC:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIY SASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC; > Cadeia pesada DOTAM com VL / CH1:
IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLI YQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKV EIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV
YTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK; > Cadeia pesada CEA:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAM DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK
GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK; >DOTAM “LC” VH / CK:
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGF IGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPP HLWGRGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC.
[0768] P1AE1769: DOTAM “LC” com VH / CK:
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGF IGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPP HLWGRGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC; > CEA LC:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIY SASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC; > CEA HC com CEA VH / CH1 / DOTAM VL / CH1:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAM DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDG GGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIY QASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVE IKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK; >CEA HC:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAM DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[0769] P1AE1770: > CEA LC:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIY SASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC; > CEA HC com DOTAM scFab: DOTAM VL / Ck / Ligante / VH CH1:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAM DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIY QASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVE IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWI RQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCA RERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSC; > CEA HC:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAM DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
EXEMPLO 29 ANTICORPOS BIESPECÍFICOS QUE SE LIGAM AO PB-DOTAM E CD20 OU HER2
GERAÇÃO DE PLASMÍDEOS PARA A EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE CADEIAS PESADAS OU LEVES DE ANTICORPO
[0770] As proteínas desejadas foram expressas por transfecção transitória de células de rim embrionário humano (HEK 293). Para a expressão de um gene/proteína desejada (por exemplo, cadeia pesada de anticorpo de comprimento total, cadeia leve de anticorpo de comprimento total ou uma cadeia pesada de anticorpo de comprimento total) contendo um domínio adicional (por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina em seu C-terminal) foi usada uma unidade de transcrição compreendendo os seguintes elementos funcionais: - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato a partir do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o íntron A, - uma região 5' não traduzida (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana,
- uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina murina (SS), - um gene/proteína a ser expresso, e - a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH pA).
[0771] Além da unidade/cassete de expressão incluindo o gene que se deseja que seja expresso, o plasmídeo de expressão em mamífero básico/padrão continha: - uma origem de replicação a partir do vetor pUC18 que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli; e - um gene beta-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli.
A) PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO PARA CADEIAS PESADAS DE ANTICORPOS
[0772] Os genes codificantes de uma cadeia pesada de anticorpo incluindo genes de fusão C-terminal compreendendo uma cadeia pesada de anticorpo completa e funcional, seguida por um domínio V pesado ou V leve de anticorpo adicional foram montados pela fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência (V- pesado ou V-leve) separados por um ligante G4Sx4 ao C-terminal do domínio CH3 de uma molécula de IgG humana (VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3-ligante-VH ou VH- CH1-dobradiça-CH2-CH3-ligante-VL). As moléculas de anticorpos recombinantes que carregam um domínio VH e um domínio VL nos C-terminais dos dois domínios CH3, respectivamente, foram expressas usando a tecnologia knob-into-hole.
[0773] Os plasmídeos de expressão para a expressão transitória de uma cadeia pesada de anticorpo com um domínio VH ou VL C-terminal em células HEK293 compreendiam além do fragmento de cadeia pesada de anticorpo com VH ou cassete de expressão de domínio VL C-terminal, uma origem de replicação a partir do vetor pUC18, que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli, e um gene de beta-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli. A unidade de transcrição do fragmento de cadeia pesada do anticorpo com o gene de fusão de domínio VH ou VL C-terminal compreende os seguintes elementos funcionais: - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato a partir do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o íntron A, - uma região 5' não traduzida (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina murina, - - um ácido nucleico codificante da cadeia pesada de anticorpo (VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3-ligante-VH ou VH-CH1-dobradiça- CH2-CH3-ligante-VL), e - a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH pA).
[0774] A sequência de aminoácidos do fragmento de cadeia pesada do anticorpo maduro com a proteína de fusão do domínio VH ou VL C- terminal é: - P1AD9826 → CD20-DOTAM:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMG RIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQ PREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQAS KLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIK; QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMG RIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSR
GDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWG RGTLVTVSS; - P1AD9827 → ERBB2-DOTAM:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVA RIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKG QPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQA
SKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIK ; e
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVA RIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGS RGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLW GRGTLVTVSS. B) PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO PARA CADEIAS LEVES DE ANTICORPO
[0775] Os genes que coficam uma cadeia leve de anticorpo compreendendo uma cadeia leve de anticorpo completa e funcional foram montados por fusão de um fragmento de DNA que codifica os respectivos elementos de sequência.
[0776] O plasmídeo de expressão para a expressão transitória de uma cadeia leve de anticorpo além do fragmento de cadeia leve de anticorpo, uma origem de replicação do vetor pUC18 que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli, e um gene da beta-lactamase que confere resistência a ampicilina em E. coli. A unidade de transcrição do fragmento de cadeia leve de anticorpo compreende os seguintes elementos funcionais: - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato a partir do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o íntron A, - uma região 5' não traduzida (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina murina, - - uma cadeia leve de anticorpo (VL-CL) que codifica o ácido nucleico, e - a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH pA).
[0777] P1AD9827 → ERBB2-DOTAM:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
[0778] P1AD9826 → CD20-DOTAM:
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSP QLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC. EXPRESSÃO TRANSITÓRIA DAS MOLÉCULAS DE ANTICORPO
[0779] As moléculas de anticorpo foram produzidas pela transfecção transitória de células HEK293 (linhagem de células derivadas de rim embrionário humano 293) cultivadas em meio F17 (Invitrogen Corp.). Para a transfecção foi utilizado o reagente de transfecção “293-Free” (Novagen). As respectivas moléculas de cadeia pesada e leve do anticorpo, conforme descrito acima, foram expressas a partir de plasmídeos de expressão individuais. As transfecções foram efetuadas seguindo as instruções do fabricante. Os sobrenadantes da cultura de células contendo imunoglobulina foram coletados três a sete (3-7) dias após a transfecção. Os sobrenadantes foram armazenados em baixa temperatura (por exemplo, -80 ºC ) até a purificação.
[0780] Informações gerais sobre a expressão recombinante de imunoglobulinas humanas em células HEK293 são fornecidas, por exemplo, em: Meissner, P., et al, Biotechnol.. Bioeng. 75(2001) 197-203.
PURIFICAÇÃO DAS MOLÉCULAS DE ANTICORPO P1AD8926 E P1AD8927
[0781] As moléculas PRIT foram purificadas por uma coluna MabSelect Sure (cromatografia de afinidade) seguido por Superdex 200
(cromatografia de exclusão por tamanho). Pool de Volume de Quantidade de Teor de TapirID concentração Pureza Expressão pool [mg] monômero [mg/mL] P1AD8926 2l 2,03 22 > 99% > 95% P1AD8927 2l 2,07 69 > 99% > 95% ANÁLISE DE MASSA:
[0782] Para confirmar a identidade das moléculas PRIT, foi usado ESI-MS. TapirID Identidade Pureza Comentário P1AD8926 confirmado Subprodutos A, A2C2 Oxilação (peq) detectada P1AD8927 confirmado Subprodutos A, A2C2 Oxilação detectada (peq) ANÁLISE POR FACS DA FUNCIONALIDADE DE P1AD8927
[0783] Para avaliar a funcionalidade de P1AD8927, células KPL-4 foram descoladas do frasco de cultura utilizando Accutase a 37ºC durante 10 minutos. Subsequentemente, as células foram lavadas duas vezes em PBS e semeadas em placas de 96 poços de fundos planos a uma densidade final de 4x106 células/poço.
[0784] O anticorpo foi pré-marcado com Zenon<IgG humana>A488, adicionado às células nas concentrações indicadas na Fig. 38.
Subsequentemente, as células foram lavadas duas vezes em PBS e semeadas em placas de fundo em V de 96 poços até uma densidade final de 4x10 6 células/poço.
[0785] Os resultados são exibidos na Figura 38.
[0786] Para avaliar a capacidade de ligação do anticorpo ao DOTAM, após ligação às células KPL-4, as células foram lavadas para remover anticorpos não ligados. Subsequentemente, Pb-DOTAM-FITC foi adicionado para detectar anticorpos ligados às células competentes de ligação ao DOTAM (Figura 39). P1AD8927 mostra um sinal FITC dose-dependente que foi corrigido por isotipo. Este experimento mostra que a ligação ao DOTAM é funcional neste anticorpo.
ANÁLISE POR FACS DA FUNCIONALIDADE DE P1AD8926
[0787] Para avaliar a funcionalidade de P1AD8926, células Raji foram lavadas duas vezes em PBS e semeadas em placas de 96 poços de fundos planos a uma densidade final de 4x106 células/poço.
[0788] O anticorpo foi pré-marcado com Zenon<IgG humana>A488, adicionado às células nas concentrações indicadas na Fig. 40.
Subsequentemente, as células foram lavadas duas vezes em PBS e semeadas em placas de fundo em V de 96 poços até uma densidade final de 4x10 6 células/poço.
[0789] Para avaliar a capacidade de ligação do anticorpo ao DOTAM, após ligação às células Raji, as células foram lavadas para remover anticorpos não ligados. Subsequentemente, Pb-DOTAM-FITC foi adicionado para detectar anticorpos ligados às células competentes de ligação ao DOTAM (Figura 41). P1AD8927 mostra um sinal FITC dose-dependente que foi corrigido por isotipo. Este experimento mostra que a ligação ao DOTAM é funcional neste anticorpo.
EXEMPLO 30 MATERIAIS E MÉTODOS DOS EXEMPLOS 31 A 37
[0790] Este exemplo apresenta materiais e métodos para os estudos dos exemplos 31-37.
PRIT DE TRÊS ETAPAS (UM CICLO)
[0791] Etapa 1: Administração de um BsAb (i.v. ou i.p.): O BsAb utilizado nos estudos liga-se ao Pb-DOTAM com elevada afinidade e visa o tumor, por exemplo, através de CEA.
[0792] Etapa 2: Administração de CA (i.v. ou i.p.): Para permitir o acúmulo tumoral eficiente de 212Pb-DOTAM, o BsAb circulante precisa ser neutralizado no sangue usando um CA que bloqueia a ligação de 212Pb- DOTAM ao BsAb não ligado, sem penetrar no tumor e, consequentemente, bloquear os sítios pré-direcionados. O CA é administrado quando o BsAb se acumula em um grau suficiente no tumor, geralmente após 4 a 10 dias. O Pb- DOTAM-dextrano-500 CA foi desenvolvido com base em um amino dextrano com peso molecular médio de 500 kDa, ao qual DOTAM é conjugado por meio de um ligante tioureia, conforme mostrado abaixo.
[0793] Etapa 3: Administração de 212Pb-DOTAM (IV): A injeção radioativa é realizada na última etapa, geralmente de 24 a 48 horas após a injeção do AC, permitindo que o 212Pb-DOTAM ligue-se preferencialmente aos sítios pré-direcionados no tumor, reduzindo eficientemente a exposição à radiação sistêmica.
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS
[0794] Os protocolos experimentais realizados no ARCoLab foram revistos e aprovados pelas autoridades locais (Comité Régional d'Ethique de l'Experimentação Animal du Limousin (CREEAL), Laboratoire Départemental d'Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne). Camundongos fêmeas com imunodeficiência combinada severa (SCID) e CD1 foram adquiridos da Charles River e mantidos em condições livres de patógenos específicos com ciclos diários de luz e escuro (12 h/12 h), de acordo com as diretrizes éticas. O Estudo 121 utilizou condições livres de patógenos específicos (SPF), com camundongos fornecidos pela Envigo. Nenhuma manipulação foi realizada durante os primeiros 5 dias após a chegada do animais, para permitir que os animais se adaptassem ao novo ambiente. Todos os animais foram controlados diariamente quanto aos sintomas clínicos e detecção de eventos adversos.
[0795] Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos por injeção subcutânea (s.c.) de células tumorais expressando CEA em meio de cultura misturado 1:1 com matriz de membrana basal Corning ® Matrigel® (fator de crescimento reduzido; nº de cat. 354230). Os volumes tumorais foram estimados pela medição manual utilizando um paquímetro, calculando de acordo com a fórmula: volume = 0,5 × comprimento x largura2.
[0796] Para minimizar a reingestão de urina/fezes radioativas, todos os camundongos do estudo de eficácia foram colocados em gaiolas com piso grelhado por 4 horas após a administração de 212Pb-DOTAM, antes de ser transferido para novas gaiolas com piso padrão. Todas as gaiolas foram trocadas 24 horas após a injeção (p.i.). Esse procedimento não foi realizado em camundongos submetidos à eutanásia para fins de biodistribuição até 24 horas após a injeção radioativa.
[0797] O peso corporal (BW) dos animais do estudo foi medido por menos 3 vezes por semana, com medições adicionais conforme necessário, dependendo do estado de saúde. Os camundongos cuja perda de peso corporal excedeu 25% de seu peso corporal inicial ou cujo volume do tumor atingiu 3.000 mm3 foram sacrificados imediatamente. Outros fatores levados em consideração para a eutanásia por razões éticas foram o estado do tumor (por exemplo, áreas necróticas, vazamento de sangue/líquido, sinais de automutilação) e a aparência geral do animal (por exemplo, pelos, postura, movimento). Alimento úmido foi fornecido a todos camundongos a partir de 5 dias após a injeção radioativa, se exigido por uma perda aguda de peso corporal (coletiva ou individual) até que todos os indivíduos tivessem se recuperado suficientemente.
[0798] O sangue foi coletado na terminação do seio venoso usando sangramento retro-orbital, seguido por coleta de tecido adicional para medições radioativas e/ou análise histológica, conforme exigido pelos protocolos. Condições inesperadas ou anormais foram documentadas. Os tecidos coletados para a fixação em formalina foram imediatamente colocados em formalina tamponada neutra a 10% (4ºC) e depois transferidos para salina tamponada com fosfato PBS (4ºC) após 5 dias. Órgãos e tecidos coletados para fins de biodistribuição foram pesados e medidos quanto à radioatividade usando um contador gama automático 2470 WIZARD2 (PerkinElmer), e a porcentagem de dose injetada por grama de tecido (%ID/g) foi subsequentemente calculada, incluindo correções para o decaimento e fundo.
[0799] A análise estatística foi realizada utilizando o programa GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc.) e JMP 8 (SAS Institute Inc.). A análise da curva de inibição do crescimento tumoral (TGI) foi realizada com base nos volumes tumorais médios usando a fórmula: - onde d indica o dia de tratamento e 0 o valor basal. Veículo (PBS) foi selecionado como o grupo de referência. A regressão do tumor (TR) foi calculada de acordo com a fórmula: - onde os valores positivos indicaram regressão do tumor, e valores abaixo de -1 crescimento além do valor basal duplo.
[0800] Os testes pareados foram realizados para especificar quais grupos eram significativamente diferentes em termos de sobrevida: o teste Log-Rank (mais peso em eventos de sobrevida posteriores) e o teste de Wilcoxon (mais peso em tempos de sobrevivência iniciais), ambos usando correção de Bonferroni para múltiplas testagens.
COMPOSTOS TESTES
[0801] Os compostos utilizados nos estudos descritos são apresentados nas tabelas intituladas “anticorpos biespecíficos” (BsAb), “agentes de remoção” (CA) e “quelatos radiomarcados”, abaixo.
[0802] CEA-DOTAM (PRIT-0213) é um BsAb totalmente humanizado direcionado ao epítopo T84.66 do CEA, enquanto DIG-DOTAM (PRIT-0175) é um BsAb sem ligação ao CEA usado como controle negativo. P1AE1766, P1AE1767, P1AE1768, P1AE1769 e P1AE1770 são BsAbs humanizados CEA-DOTAM direcionados ao epítopo CH1A1A do CEA, conforme descrito no exemplo 28 acima. As construções de anticorpo foram armazenadas a -80ºC até o dia da injeção, quando foram descongeladas e diluídas em tampão de veículo padrão (20 mM de histidina, 140 mM de NaCl; pH 6,0) ou 0,9% de NaCl em suas respectivas concentrações finais para administração intravenosa (i.v.) ou administração intraperitoneal (i.p.).
[0803] Os CA, Ca-DOTAM-dextrano-500 e Pb-DOTAM- dextrano-500, foram armazenados a -20ºC até ao dia da injeção quando eles foram descongelados e diluídos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para a administração i.v. ou i.p..
[0804] Os quelatos DOTAM para radiomarcação foram fornecidos pela Macrocyclics e mantidos a –20ºC antes da radiomarcação.
O 212Pb-DOTAM foi gerado por eluição com DOTAM de um gerador de tório e, subsequentemente, extinto com Cu, Ca, Zn, Gd ou Pb após a marcação.
A solução de 212 Pb-DOTAM foi diluída com PBS ou NaCl a 0,9% para obter a concentração de atividade de 212 Pb desejada para injeção i.v.
[0805] Os camundongos em grupos de controle tratados com veículo receberam múltiplas injeções de PBS em vez de BsAb, CA e 212Pb- DOTAM.
ANTICORPOS BIESPECÍFICOS Composto Alvo Protocolos CEA-DOTAM T84,66 103, 116, 131, 146, 154 (PRIT-0213) DIG-DOTAM Digoxigenina 103, 151, 152, 154 (PRIT-0175) CD20-DOTAM CD20 151, 162 (P1AD9826) HER2-DOTAM HER2 152 (P1AD9827) P1AE1766 CH1A1A 154 P1AE1767 CH1A1A 154 P1AE1768 CH1A1A 154 P1AE1769 CH1A1A 154 P1AE1770 CH1A1A 154 AGENTES DE REMOÇÃO: Composto Protocolos Pb-DOTAM-dextrano-500 103, 116, 131, Ca-DOTAM-dextrano-500 146, 151, 152, 154, 162 QUELATOS RADIOMARCADOS (FORNECEDOR: ORANO MED) Composto Extinção Protocolos 212Pb-DOTAM Cu 103, 116, 131 212Pb-DOTAM Ca 131, 146, 151, 152, 154, 162 212Pb-DOTAM Zn 131 212Pb-DOTAM Gd 131 212Pb-DOTAM Pb 131 203Pb-DOTAM-CEA-DOTAM Cu 121 203Pb-DOTAM-DIG-DOTAM Cu 121 212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM Ca 162
MODELOS DE TUMORES
[0806] As linhagens de células tumorais utilizadas e a quantidade injetada para inoculação em camundongos são descritas na tabela “linhagens de células tumorais” abaixo. BxPC3 é uma linhagem de células de adenocarcinoma pancreático primário humano, expressando CEA naturalmente. As células BxPC3 foram cultivadas em meio RPMI-1640, suplemento GlutaMAX®, HEPES (Gibco, ref. 72400-021) enriquecido com 10% de soro bovino fetal (GE Healthcare Hyclone SH30088.03). HPAF-II (CRL- 1997) é uma linhagem de células de adenocarcinoma pancreático humano, expressando CEA naturalmente. As células HPAF-II foram cultivadas em meio EMEM (Gibco 31095-029) enriquecido com 10% de soro bovino fetal padrão, 1% de GlutaMAX 100X, 1% de MEM NEAA (Aminoácidos não essenciais de meio essencial mínimo) 100X (Gibco 11140-035), e piruvato de sódio a 1% (100 mM; Gibco 11360-070). WSU-DLCL2 é uma linhagem de células de linfoma de células B humanas, expressando CD20 naturalmente. As células WSU-DLCL2 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, ref. 72400-021) enriquecido com 10% de soro bovino fetal. NCI-N87 é uma linhagem de células de câncer gástrico, expressando HER2 naturalmente. As células NCI-N87 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, ref. 72400-021) enriquecido com 10% de soro bovino fetal. Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos em cada camundongo SCID no dia 0 por injeção subcutânea de células em meio RPMI ou DMEM, misturados 1:1 com matriz de membrana basal Corning ® Matrigel® (fator de crescimento reduzido; nº de cat. 354230), no flanco direito.
Linhagem de Células Tumorais Células por Volume Linhagem de células Protocolos Fornecedor camundongo injetado BxPC3 5×106 100 µL 103, 116, 121, 131, 146 ECACC*
HPAF-II (CRL-1997) 1×106 100 µL 114, 154 ATCC** WSU-DLCL2 1,5×106 100 µL 151, 162 DSMZ*** NCI-N87 1,5×106 100 µL 152 ATCC** *Coleção Europeia de Culturas de Células Autenticadas (Salisbury, Reino Unido) **Coleção Americana de Culturas de Células (ATCC) (Manassas, VA, EUA) ***Leibniz-Institut DSMZ - Coleção Alemã de Microrganismos e Células (Braunschweig, Alemanha)
ESTUDOS EXEMPLO 31 EFICÁCIA DE CEA-PRIT EM MODELO DE TUMOR (PROTOCOLO 103)
[0807] Este estudo avaliou a eficácia do CEA-PRIT usando o BsAb CEA-DOTAM para o tratamento de tumores s.c. BxPC3 em camundongos. A terapia foi administrada como um único tratamento com 10 ou 30 µCi de 212Pb-DOTAM, ou em três ciclos repetidos para cada um dos dois níveis de radioatividade. As comparações foram feitas com PRIT usando um anticorpo de controle que não se liga ao CEA (DIG-DOTAM), o BsAb CEA- DOTAM sozinho (sem radioatividade) e sem tratamento (PBS). As biodistribuições foram realizadas após o primeiro e segundo ciclo para confirmar o direcionamento e eliminação do 212Pb-DOTAM, e a eficácia do tratamento foi avaliada em termos de TGI, TR e sobrevida. Os camundongos foram monitorados cuidadosamente ao longo do estudo para avaliar a tolerabilidade dos diferentes esquemas de tratamento. O esboço do estudo é mostrado na Figura 42.
DESENHO DO ESTUDO
[0808] O curso de tempo e o design do protocolo 103 são mostrados nas tabelas abaixo.
CURSO DE TEMPO DO PROTOCOLO 103 Dia do Procedimento experimental estudo 0 Injeção s.c. de células BxPC3
Dia do Procedimento experimental estudo 20 Injeção i.v. de BsAb PRIT (grupos C–G, J–L) 21 Injeção i.v. de BsAb PRIT (grupos A, B, H, I) 24 Injeção i.v. de CA (grupos C–G, J–L) 24 Eluição de 212Pb-DOTAM 24 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM (grupos C–G, J–L) 25 Eutanásia e coleta de tecido + contagem gama (grupo J) 25 Injeção i.v. de CA (grupos A, B, H, I) 25 Eluição de 212Pb-DOTAM 25 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM (grupos A, B, H, I) 26 Eutanásia e coleta de tecido + contagem gama (grupo H) 34 Injeção i.v. de BsAb PRIT (grupos B, D–G, I, K, L) 38 Injeção i.v. de CA (grupos B, D–G, I, K, L) 38 Eluição de 212Pb-DOTAM 38 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM (grupos B, D–G, I, K, L) 39 Eutanásia e coleta de tecido + contagem gama (grupos I, K, L) 48 Injeção i.v. de BsAb PRIT (grupos B, D–G) 52 Injeção i.v. de CA (grupos B, D–G) 52 Eluição de 212Pb-DOTAM 52 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM (grupos B, D–G) GRUPOS DO ESTUDO NO PROTOCOLO 103 dose de Pb- dose de Atividade DOTAM- Grupo n BsAb BsAb Quelato de 212Pb Ciclos Dextrano-500 (µg) (µCi) (µg) 212Pb- A 10 CEA-DOTAM 100 25 10 1
DOTAM 212Pb- B 10 CEA-DOTAM 100 25 10 3
DOTAM 212Pb- C 10 CEA-DOTAM 100 25 30 1
DOTAM 212Pb- D 10 CEA-DOTAM 100 25 30 3
DOTAM E 10 CEA-DOTAM 100 0 — 0 3 212Pb- F 10 DIG-DOTAM 100 25 30 3
DOTAM G 10 — 0 0 — 0 3 212Pb- H 3 CEA-DOTAM 100 25 10 1
DOTAM 212Pb- I 3 CEA-DOTAM 100 25 10 2
DOTAM dose de Pb- dose de Atividade DOTAM- Grupo n BsAb BsAb Quelato de 212Pb Ciclos Dextrano-500 (µg) (µCi) (µg) 212Pb- J 3 CEA-DOTAM 100 25 30 1
DOTAM 212Pb- K 3 CEA-DOTAM 100 25 30 2
DOTAM 212Pb- L 3 DIG-DOTAM 100 25 30 2
DOTAM
[0809] Xenoenxertos sólidos foram estabelecidos em cada camundongo SCID no dia 0 do estudo por injeção s.c. de 5 x 10 6 células (passagem 24) em RPMI/Matrigel no flanco direito. Vinte dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 290 mm3.
[0810] Por razões logísticas, os tratamentos foram iniciados ao longo de 2 dias, com injeção de BsAb ou PBS dos grupos C, D, E, F, G, J, K e L no primeiro dia, conforme descrito na tabela acima, seguido por injeções de BsAb dos grupos A, B, H e I no dia seguinte. Quatro dias depois, o CA foi injetado, seguido 2 horas depois por 212Pb-DOTAM ou PBS. Os grupos que receberam 30 ou 0 µCi foram injetados primeiro, seguidos no dia seguinte por aqueles que receberam 10 µCi. Os grupos B, D, E, F, G, I, K e L receberam tratamentos múltiplos com 2 semanas entre as injeções radioativas. Todos os ciclos de tratamento repetidos (2º e 3º) foram iniciados simultaneamente, ou seja, todos os camundongos receberam a injeção de BsAb ou PBS no mesmo dia, seguido de CA e 212Pb-DOTAM ou PBS, depois de 4 dias. Os seguintes órgãos e tecidos foram coletados a partir dos grupos A – G no momento da eutanásia: bexiga, ovários, fígado, baço, rins, fêmur (incluindo medula óssea), cólon, jejuno, estômago e tumor.
[0811] Os camundongos nos grupos H e J foram sacrificados e necropsiados 24 horas após sua primeira e única injeção de 212Pb-DOTAM; os grupos I, K e L foram sacrificados e necropsiados 24 horas após a segunda injeção de 212Pb-DOTAM. Sangue, bexiga, intestino delgado, cólon, baço, pâncreas, rins, fígado, pulmão, coração, osso femoral, músculo, cauda e tumor foram coletados para medição radioativa na eutanásia.
RESULTADOS
[0812] A distribuição in vivo de 212Pb 24 horas p.i. demonstrou alta captação em tumores BxPC3 subcutâneos e baixo acúmulo em tecidos normais, como pode ser observado na Figura 43. A diferença significativa entre os tumores pré-direcionados por CEA-DOTAM e aqueles pré-direcionados por BsAb DIG-DOTAM que não se liga ao CEA confirmou a alta especificidade do tratamento. A análise de variância unilateral (ANOVA) com o teste de comparações múltiplas de Sidak mostrou que não houve diferença significativa na captação média do tumor de 212Pb, nem entre 1 (50,3 %ID/g) e 2 (43,0 %ID/g) injeções de 10 µCi, nem entre 1 (37,6 %ID/g) e 2 (24,1 %ID/g) injeções de 30 µCi. Da mesma forma, não houve diferença significativa entre a administração de 1 ciclo de 10 µCi e 1 ciclo de 30 µCi (p> 0,05). No entanto, a captação do tumor foi significativamente menor após 2 ciclos de 30 µCi em comparação com 2 ciclos de 10 µCi, assim como a captação do tumor após 2 ciclos de 30 µCi em tumores pré-direcionados com DIG-DOTAM (2,9 %ID/g) em comparação com qualquer Tratamento CEA-DOTAM. O painel B da Figura 43 mostra que a %ID/g foi comparável para tumores de tamanhos diferentes, dentro dos vários grupos de tratamento.
[0813] O desenvolvimento médio do tumor e as curvas de crescimento do tumor individuais são mostrados na Figura 44 e Figura 45, respectivamente. Todos os grupos dobraram o volume do tumor no dia 20-24.
O primeiro tratamento com 212Pb-DOTAM foi administrado no dia 24, após o qual os tumores nos grupos CEA-DOTAM continuaram a crescer por aproximadamente 1 semana antes de começarem a encolher. Nenhum tumor regrediu completamente, mas os volumes para os grupos tratados com múltiplos (B e D) permaneceram relativamente constantes até o último tratamento no dia 52. Os tumores em camundongos injetados apenas uma vez com 10 ou 30 µCi começaram a crescer novamente no dia 44, embora aqueles recebendo a atividade mais alta tiveram uma taxa de crescimento ligeiramente mais lenta. PRIT não específico com DIG-DOTAM resultou em TGI estatisticamente significativo, mas limitado, em comparação com CEA-DOTAM sozinho ou veículo. Os dois últimos grupos de controle exibiram desenvolvimento tumoral idêntico.
[0814] No dia 63, último dia em que todos os grupos de tratamento puderam ser analisados com base nas médias, a TGI foi de 57,2, 89,8, 77,7, 96,6, -6,2 e 67,3% para os grupos A, B, C, D, E e F, respectivamente, em comparação com nenhum tratamento. O último camundongo no grupo controle tratado apenas com veículo foi contabilizado no dia 74, momento em que a TGI foi de 48,5, 83,3, 63,5 e 95,7% para os quatro grupos restantes: A, B, C e D, respectivamente. O estudo foi encerrado no dia 118 após a injeção de células, por eutanásia do último camundongo remanescente (grupo D).
[0815] Os testes de Log-Rank e Wilcoxon foram realizados para especificar quais grupos eram significativamente diferentes em termos de sobrevida, os resultados são apresentados nas duas tabelas abaixo. Todos os regimes PRIT CEA-DOTAM aumentaram significativamente a sobrevida em comparação com os três grupos controle. A sobrevida global foi ligeiramente melhor após 3 ciclos de 10 µCi do que após um único ciclo de 10 µCi (p = 0,0110), mas não houve diferença significativa entre 3 ciclos de 10 µCi e qualquer um dos regimes de 30 µCi com pré-direcionamento CEA-DOTAM. As curvas de sobrevida de Kaplan-Meier são mostradas na Figura 46. TESTE DE LOG-RANK PAREADO (NÍVEL DE TESTE MÚLTIPLO = 0,00238)
CEA- CEA- CEA- CEA- CEA- DIG- Veículo Grupo DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM (PBS) sozinho 10 µCi ×1 10 µCi ×3 30 µCi ×1 30 µCi ×3 30 µCi ×3 Veículo 1,0000 0,3197 0,0005* <,0001* <,0001* 0,0043* 0,5588 (PBS) CEA-DOTAM 0,3197 1,0000 <,0001* <,0001* <,0001* 0,0024* 0,8491 sozinho CEA-DOTAM 0,0005* <,0001* 1,0000 0,0110* 0,1114 0,1562 0,0002* 10 µCi ×1 CEA-DOTAM <,0001* <,0001* 0,0110* 1,0000 0,0980 0,8798 <,0001* 10 µCi ×3 CEA-DOTAM <,0001* <,0001* 0,1114 0,0980 1,0000 0,3839 <,0001* 30 µCi ×1 CEA-DOTAM 0,0043* 0,0024* 0,1562 0,8798 0,3839 1,0000 0,0034* 30 µCi ×3 DIG-DOTAM 0,5588 0,8491 0,0002* <,0001* <,0001* 0,0034* 1,0000 30 µCi ×3 TESTE DE WILCOXON PAREADO (NÍVEL DE TESTE MÚLTIPLO = 0,00238) CEA- CEA- CEA- CEA- CEA- DIG- Veículo Grupo DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM DOTAM (PBS) sozinho 10 µCi ×1 10 µCi ×3 30 µCi ×1 30 µCi ×3 30 µCi ×3 Veículo 1,0000 0,3792 0,0009* <,0001* <,0001* 0,0255* 0,4931 (PBS) CEA-DOTAM 0,3792 1,0000 0,0001* <,0001* <,0001* 0,0130* 1,0000 sozinho CEA-DOTAM 0,0009* 0,0001* 1,0000 0,0033* 0,0370* 0,3590 0,0005* 10 µCi ×1 CEA-DOTAM <,0001* <,0001* 0,0033* 1,0000 0,1007 0,5963 <,0001* 10 µCi ×3 CEA-DOTAM <,0001* <,0001* 0,0370* 0,1007 1,0000 0,8797 <,0001* 30 µCi ×1 CEA-DOTAM 0,0255* 0,0130* 0,3590 0,5963 0,8797 1,0000 0,0122* 30 µCi ×3 DIG-DOTAM 0,4931 1,0000 0,0005* <,0001* <,0001* 0,0122* 1,0000 30 µCi ×3
EVENTOS ADVERSOS E TOXICIDADE
[0816] Os eventos adversos observados que motivam o sacrifício de camundongos por razões éticas podem ser classificados em dois grupos: 1) estado do tumor e 2) toxicidade induzida por radiação. O primeiro refere-se a tumores necróticos e/ou ulcerativos, levando os ratos a “limpar” a área do tumor em si mesmos ou em seus companheiros de gaiola. Os camundongos que alcançaram esse estágio foram imediatamente sacrificados para evitar sofrimento.
[0817] O segundo grupo de eventos adversos compreendeu sintomas típicos de toxicidade induzida por radiação, por exemplo, perda de peso corporal, diarreia e letargia. A Figura 47 mostra o desenvolvimento de BW nos grupos de tratamento. Todos os camundongos que foram injetados com 30 µCi de 212Pb-DOTAM experienciaram uma queda inicial de BW que foi mitigada no dia 8 após a primeira injeção radioativa. Os grupos que receberam várias injeções de 30 µCi (D e F) sofreram uma perda de peso corporal mais prolongada. A perda de peso corporal foi leve nos grupos que receberam 10 µCi (A e B), mesmo em múltiplas injeções. Uma clara diferença foi percebida entre os camundongos que receberam 10 e 30 µCi de 212Pb-DOTAM. Mesmo após tratamentos repetidos de 10 µCi, os camundongos não exibiram, em geral, sinais importantes de toxicidade adversa. Os camundongos tratados com um ciclo de 30 µCi expressaram perda de peso transitória, mas se recuperaram. Entretanto, o segundo e o terceiro ciclos de 30 µCi resultaram em toxicidade adversa mais extensa, resultando em vários animais sacrificados devido a uma combinação de perda de peso corporal e sinais de dor e/ou desconforto. A partir disto pode-se concluir que 10 µCi é um nível de radioatividade seguro nas condições aplicadas, enquanto 30 µCi está se aproximando da atividade máxima tolerada.
CONCLUSÃO
[0818] Nós concluímos que dado como um regime de monoterapia, CEA PRIT repetido com 10 ou 30 μCi de 212Pb-DOTAM fornece um aumento significativo na sobrevida e TGI, mas sem a erradicação completa do tumor e sem controle do tumor sustentado neste esquema. Para evitar a toxicidade induzida por radiação, mantendo o controle do tumor ao longo do tempo, esses resultados sugerem o uso de menos de 30, mas mais do que 10 µCi de 212Pb-DOTAM.
EXEMPLO 32
SELEÇÃO DE UM TEMPO APROPRIADO ENTRE A INJEÇÃO DE BSAB E CA PARA CEA-PRIT (PROTOCOLOS 116 E 121)
[0819] Os protocolos 116 e 121 foram projetados para orientar a seleção de um tempo apropriado entre a injeção de BsAb e CA para CEA- PRIT, com base na alta captação tumoral e distribuição homogênea de BsAb intratumoral. O protocolo 116 avaliou a distribuição intratumoral de BsAb em comparação com a expressão de CEA no modelo BxPC3 no dia 4, 7 e 14 após a injeção i.v., detectada por coloração de imunofluorescência. O protocolo 121 avaliou o acúmulo de BsAb diretamente marcado com chumbo-203 (203Pb) em tumores BxPC3 após 1, 4, 7 e 10 dias. O BsAb foi marcado com o isótopo de Pb 203Pb (meia-vida de 2,2 dias), para ser capaz de acompanhar o desenvolvimento por um período de tempo mais longo em comparação com o 212Pb (meia-vida de 10,6 horas).
DESENHO DO ESTUDO
[0820] Os cursos de tempo e dos protocolos 116 e 121 são mostrados nas quatro tabelas abaixo.
CURSO DE TEMPO DO PROTOCOLO 116 Dia do Procedimento experimental estudo 0 Injeção s.c. de células BxPC3 (grupos A, B, C, D, E) 0* Injeção s.c. de células BxPC3 (grupos F, G) 20 Injeção i.v. de BsAb PRIT (grupos A, B, C, D, E) 18* Injeção i.v. de BsAb PRIT (grupos F, G) 24 Injeção i.v. de CA (grupo C) 24 Eutanásia e necropsia (grupos A, B, C; 4 d p.i.) 22* Injeção i.v. de CA e 212Pb-DOTAM (grupos F, G) 27 Eutanásia e necropsia (grupo D; 7 d p.i.) 34 Eutanásia e necropsia (grupo E; 14 d p.i.) 32* Injeção i.v. de BsAb PRIT (grupo F) 36* Eutanásia e necropsia (grupos F, G) GRUPOS DO ESTUDO NO PROTOCOLO 116
212 Tempo BsAb Tempo CA Tempo Pb Ciclos Grupo n BsAb amostra (µg) (d) (µg) (h) (µCi) PRIT (d) A 2 — 0 — 0 — 0 — 4 CEA- B 3 100 — 0 — 0 — 4
DOTAM CEA- C 3 100 4 25 2 0 — 4
DOTAM CEA- D 3 100 — 0 — 0 — 7
DOTAM CEA- E 3 100 — 0 — 0 — 14
DOTAM CEA- F 3 100 4 25 2 10 2 4*
DOTAM CEA- G 3 100 4 25 2 10 1 4*
DOTAM *Dias após a segunda injeção de BsAb (iniciado 1,5 semanas após 212Pb-DOTAM) CURSO DE TEMPO DO PROTOCOLO 121 Dia do estudo Procedimento experimental 0 Injeção s.c. de células BxPC3 20 Injeção i.v. de 203Pb-DOTAM-BsAb Eutanásia e necropsia (grupo A; 1 d p.i.); 21 contagem gama em tecidos 24 Eutanásia e necropsia (grupos B, E; 4 d p.i.); contagem gama em tecidos Eutanásia e necropsia (grupo C; 7 d p.i.); 27 contagem gama em tecidos 30 Eutanásia e necropsia (grupo D; 10 d p.i.); contagem gama em tecidos GRUPOS DO ESTUDO NO PROTOCOLO 121 Tempo 203 BsAb Tempo CA Tempo 203Pb Grupo n Pb-BsAb amostra (µg) (d) (µg) (h) (µCi) (d) A 5 CEA-DOTAM 100 — 0 — 20 1 B 5 CEA-DOTAM 100 — 0 — 20 4 C 5 CEA-DOTAM 100 — 0 — 20 7 D 5 CEA-DOTAM 100 — 0 — 20 10 E 5 DIG-DOTAM 100 — 0 — 20 4
[0821] Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos por meio da injeção s.c. de células BxPC3. Dezenove dias após a inoculação, os camundongos no protocolo 116 foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 227 mm 3. No protocolo 121, o volume médio do tumor foi de 203 mm3 após 20 dias.
COLORAÇÃO POR IMUNOFLUORESCÊNCIA
[0822] Os camundongos no protocolo 116 foram necropsiados após a eutanásia, e baço, rins, fígado, músculo e tumor foram coletados. Os tecidos coletados foram divididos em duas partes: uma foi colocada em um criomolde contendo composto de incorporação/emblocamento de temperatura de corte ideal (OCT) Tissue-Tek® e colocada em gelo seco para congelamento rápido e a outra parte foi fixada em formalina tamponada neutra a 10% (NBF) por 24 horas e então transferido para PBS para armazenamento até a inclusão em parafina. As amostras congeladas em OCT foram mantidas a –80ºC antes do corte. A coloração histológica foi realizada usando reagentes listados na tabela abaixo.
REGENTES USADOS PARA COLORAÇÃO HISTOLÓGICA NO PROTOCOLO 116 Composto Lot/Ref. No. Conc./ Fornecedor diluição IgG coelho anti-CEA humano (clone T84,66) P1AD5732 1 µg/mL Roche Glycart Cabra anti-IgG coelho (H+L) Anticorpo A11034 1/400 Fisher secundário com alta absorção cruzada, Alexa Fluor 488 Cabra anti-IgG humana (H+L) Anticorpo A21433 1/300 Fisher secundário com adsorção cruzada, Alexa Fluor 555 Soro de bloqueio (cabra) G9023-10ML 5% Sigma corante Hoechst 94403-1ML 1/1000 Sigma
COLORAÇÃO PARA CEA
[0823] Os tumores congelados foram seccionados em cortes histológicos de 12 µm usando um criôtomo Leica CM1850 UV e as lâminas armazenadas a –20ºC. Antes da coloração, as lâminas foram descongeladas por 1 hora em temperatura ambiente (TA) e, em seguida, lavadas por 5 minutos com PBS (1X, pH 7,4), seguido por 5 minutos em acetona fria (–20ºC), e mais uma vez com PBS por 5 minutos. As lâminas foram secas com um pedaço de papel ao redor do tecido e um círculo desenhado ao redor do tecido usando uma caneta hidrofóbica (Dako; Agilent). A incubação dos cortes foi realizada com 400 µL de soro bloqueador (cabra) durante 1 hora à temperatura ambiente. O soro bloqueador foi removido e 200 µL de anticorpo primário (IgG de coelho anti-CEA humano) foi adicionado aos cortes, seguido de incubação durante a noite a 4ºC em uma câmara escura. No dia 2, os cortes foram lavados duas vezes com PBS por 10 minutos, e 400 µL de soro bloqueador foram adicionados. Após a incubação durante 1 hora em temperatura ambiente, o soro bloqueador foi removido e 200 µL de anticorpo secundário (cabra anti-IgG de coelho marcado com Alexa Fluor 488) e contracoloração (Hoechst) foram adicionados aos cortes, seguido por incubação em uma câmara escura por 2 horas em RT. As lâminas foram então lavadas duas vezes com PBS por 10 minutos. Por fim, o meio de montagem de fluorescência (Dako S3023; Agilent) e a lamínula foram adicionados às lâminas, que foram posteriormente secas ao ar e armazenadas no escuro a –20ºC. A análise das lâminas coradas foi realizada usando um microscópio modular Zeiss Axio Scope.A1.
COLORAÇÃO PARA CEA-DOTAM
[0824] Cortes congelados de tumores foram armazenados e processados tal como descrito para a coloração CEA acima, mas com PBS em vez de anticorpo primário. O anticorpo secundário era um anticorpo de cabra anti-IgG humana marcado com Alexa Fluor 555.
COLORAÇÃO H&E
[0825] A coloração com hematoxilina e eosina (H&E) de cortes histológicos de tumores congelados a partir do protocolo 116 foi realizada usando um dispositivo automático de coloração Leica Autostainer XL.
BIODISTRIBUIÇÃO
[0826] Os camundongos no protocolo 121 foram sacrificados para fins de biodistribuição e o sangue dos animais foi coletado por meio de sangramento retro-orbital do sacrifício. Além disso, a bexiga, intestino delgado, cólon, baço, pâncreas, rins, estômago, fígado, pulmão, coração, cérebro, osso femoral, músculo, pele, cauda e tumor foram coletados após a eutanásia e medidos quanto à radioatividade.
RESULTADOS COLORAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA - PROTOCOLO 116
[0827] O controle não tratado exibiu altos níveis de CEA uniformemente distribuídos nos tumores coletados. A coloração de controle para BsAb CEA-DOTAM resultou em nenhum sinal, como esperado.
[0828] Os tumores de ratos injetados com BsAb CEA-DOTAM foram coletados em 4, 7, e 14 dias p.i. Ao fim de 4 dias, o BsAb foi cobrindo totalmente os limites dos nódulos de células de tumor no interior do tecido, mas não penetrou inteiramente nos nódulos maiores. Isso é mostrado pela presença de áreas mais escuras, coradas com Hoechst, rodeadas por camadas de células bordeadas em vermelho vivo. Após 7 dias, o sinal da coloração CEA- DOTAM apareceu mais homogeneamente distribuído e havia menos estruturas de células tumorais com áreas interiores escuras. Uma semana depois, 14 dias p.i., a distribuição do sinal fluorescente permaneceu semelhante no ponto de tempo de 7 dias, mas com sinal geral inferior.
[0829] As amostras de tumores dos dois grupos que receberam todo o ciclo de PRIT, incluindo irradiação com 212Pb-DOTAM, exibiu áreas de necrose devido a morte celular induzida por radiação. Os resultados incluíram edema celular, perda de detalhes celulares (células fantasmas), alguma atipia nuclear e um aumento potencial de fibrose intersticial. Os tumores de camundongos do grupo F que receberam uma segunda dose de CEA-DOTAM 2 semanas após a primeira injeção de BsAb mantiveram uma alta expressão de CEA e homogênea, e a distribuição de CEA-DOTAM 4 dias após a segunda injeção de BsAb assemelhou-se ao de tumores não irradiados, ou seja, o BsAb distribuído por todas as partes do tumor que expressam CEA, mas com penetração limitada em certas estruturas maiores, resultando em áreas mais escuras nas imagens. As amostras de controle correspondentes foram adquiridas ao mesmo tempo do grupo G, que não recebeu uma segunda injeção de BsAb após o ciclo inicial de PRIT. Nesses cortes de tumor, um sinal fraco pode ser visto para a coloração CEA-DOTAM, indicando que certa quantidade de BsAb ainda estava ligada ao tumor 18 dias após a injeção.
BIODISTRIBUIÇÃO - PROTOCOLO 121
[0830] O acúmulo médio de 203Pb e a depuração em camundongos SCID com tumor BxPC3 são exibidos na Figura 48. A depuração do sangue foi lenta, como esperado de um anticorpo sem o auxílio de um CA.
Nenhuma captação inesperada do BsAb marcado foi revelada em órgãos ou tecidos normais. O acúmulo no tumor ao longo do tempo é mostrado na Figura 49, começando em uma média de 49 %ID/g 1 dia após a injeção, aumentando para 130, 189 e 197 %ID/g nos dias 4, 7 e 10, respectivamente. O controle negativo marcado não resultou em acúmulo no tumor, com 3 %ID/g no dia 4 após a injeção.
[0831] A análise estatística foi realizada por análise de uma via da variância (ANOVA) utilizando o teste de comparações múltiplas de Sidak, para avaliar se as diferenças percebidas em absorção do tumor em diferentes pontos de tempo foram significativas. De acordo com o teste, um aumento significativo no acúmulo de 203Pb foi alcançado apenas entre os dias 1 e 7 e entre 1 e 10; nenhum outro momento foi significativamente diferente um do outro. Testando apenas 4 versus 7 dias usando um teste t não pareado resultou em um aumento estatisticamente significativo em 7 dias (p = 0,0468), enquanto a realização do teste correspondente por 7 versus 10 dias não (p =
0,8316).
CONCLUSÃO
[0832] Os resultados mostraram um aumento geral na captação de 203Pb-BsAb no tumor entre 4 e 7 dias após a injeção, mas nenhuma melhora adicional foi alcançada ao estender o intervalo de tempo para 10 dias.
Microscopicamente, a penetração de BsAb nos tumores foi melhorada após 7 dias em comparação com 4. Nenhum benefício foi observado no ponto de tempo de 14 dias, momento em que o sinal fluorescente geral parecia diminuir, sem melhorar a distribuição intratumoural. Os estudos suportam a escolha de um intervalo de tempo BsAb-CA de 7 dias durante 4 dias.
EXEMPLO 33 BIODISTRIBUIÇÃO (DADOS DE DISTRIBUIÇÃO IN VIVO DE 212PB-DOTAM PARA ESTIMATIVAS DA DOSE RADIOATIVA ABSORVIDA EM TECIDOS TUMORAIS E NORMAIS) (PROTOCOLO 146)
[0833] O protocolo 146 foi projetado para fornecer dados de distribuição de 212Pb-DOTAM in vivo após PRIT para estimativas da dose radioativa absorvida em tecidos tumorais e normais, em camundongos SCID portadores de tumores s.c. BxPC3. A extinção de 212Pb-DOTAM foi realizada usando Ca (vide o exemplo 34).
[0834] O pré-direcionamento foi realizado por injeção de BsAb CEA-DOTAM, seguido 7 dias depois pelo CA. Após 24 horas, o 212Pb-DOTAM foi administrado. Grupos de camundongos foram sacrificados em vários pontos de tempo de 5 minutos a 48 horas após a injeção radioativa, e sangue e órgãos coletados para medição radioativa. Os excrementos foram amostrados em momentos selecionados por meio de gaiolas metabólicas para avaliar a taxa de excreção do composto radioativo. As doses absorvidas foram finalmente calculadas através de métodos estabelecidos usando as curvas de tempo- atividade resultantes.
DESENHO DO ESTUDO
[0835] O curso de tempo e o design do protocolo 146 são mostrados nas duas tabelas abaixo.
CURSO DE TEMPO DO PROTOCOLO 146 Dia do estudo Procedimento experimental 0 Injeção s.c. de células BxPC3 21 Injeção i.v. de BsAb PRIT 28 Injeção i.v. de CA 29 Eluição de 212Pb-DOTAM 29 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM 29 Eutanásia e necropsia (5 min–6 h p.i.); contagem gama em tecidos 30 Eutanásia e necropsia (24 h p.i.); contagem gama em tecidos 31 Eutanásia e necropsia (48 h p.i.); contagem gama em tecidos GRUPOS DO ESTUDO NO PROTOCOLO 146 212 BsAb Tempo CA Tempo Pb Extiç. do Tempo de Grupo n (µg) (d) (µg) (h) (µCi) DOTAM amostra A 5 100 7 25 24 20 Ca 5 min B 5 100 7 25 24 20 Ca 30 min C 5 100 7 25 24 20 Ca 2h D 5 100 7 25 24 20 Ca 6h E 5 100 7 25 24 20 Ca 24 h F 5 100 7 25 24 20 Ca 48 h
[0836] Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos por injeção s.c. de células BxPC3 em camundongos SCID (Envigo) com 8 semanas de idade. Vinte e oito dias após a inoculação, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 310 mm 3.
[0837] Os camundongos nos grupos E e F foram alojados individualmente (ou seja, um camundongo por gaiola) em gaiolas metabólicas com piso grelhado. A urina e as fezes foram coletadas de cada gaiola 2, 6 e 24 horas após a injeção radioativa, e as amostras individuais subsequentemente medidas para radioatividade. Os camundongos do grupo F foram transferidos para uma gaiola regular 24 horas p.i.
[0838] O sangue/soro foi coletado de todos os camundongos por meio de sangramento retro-orbital antes do término. Após a eutanásia, os seguintes órgãos e tecidos adicionais foram coletados para medição de radioatividade e cálculo de %ID/g: bexiga, útero, intestino delgado, cólon, baço, pâncreas, rins, estômago, fígado, pulmão, coração, cérebro, osso femoral, pele, músculo, gordura abdominal, cauda e tumor.
DOSIMETRIA DE RADIAÇÃO
[0839] As doses absorvidas foram calculadas seguindo o formalismo descrito no Panfleto No. 21 do Comitê de Dose Médica de Radiação Interna (MIRD) (Bolch WE, Eckerman KF, Sgouros G e Thomas SR.
J Nucl Med 2009; 50: 477-484). Formalmente, a dose absorvida em um tecido ou região alvo é calculada como o tempo integral da atividade multiplicado pela taxa de dose absorvida por unidade de atividade , somada em todas as regiões de origem . Dado que a grande maioria da energia liberada pela cadeia de decaimento de 212Pb vem da radiação alfa e, além disso, pela eficácia biológica muito maior da radiação alfa (caracterizada pela eficácia biológica relativa, RBE), duas aproximações foram feitas:
1. a energia é absorvida localmente devido ao curto intervalo das partículas alfa, o que significa que apenas o termo é considerado, e
2. a contribuição da radiação beta e gama é negligenciada.
[0840] Com sendo a energia libertada pelos decaimentos alfa, ou melhor, a soma das energias médias libertadas por decaimentos alfa na cadeia de decaimento do 212Pb, aqui expressa em unidades , a dose absorvida em um tecido ou região alvo é calculada pela fórmula:
[0841] Os cálculos são baseados na concentração radioativa corrigida de decaimento (média) composta no tempo , expressa como . Em uma primeira etapa, estes são transformados em concentrações radioativas com por de acordo com o peso de tecido para o tecido alvo :
[0842] é a atividade injetada e é a taxa de decaimento exponencial para 212Pb, (correspondendo à meia-vida de 10,6 horas).
[0843] Em uma segunda etapa, a concentração radioativa foi integrada ao longo do tempo para cada tecido. Isso foi alcançado usando o “método de cálculo Linear Log Trapezoidal” no software farmacocinético Phoenix WinNonlin 6.4 (Certara USA, Inc., 100 Overlook Center, Suite 101, Princeton, NJ 08540 EUA). O modelo tipo “Plasma” foi utilizado com ponderação uniforme.
[0844] Na etapa final, doses absorvidas foram calculadas pela multiplicação dos integrais de tempo da concentração radioativa pela libertação de energia . Além disso, as doses absorvidas ponderadas por RBE foram calculadas usando um RBE de 5, como sugerido no Panfleto MIRD nº 22 (Sgouros G, Roeske JC, McDevitt MR, et al. J Nucl Med 2010; 51: 311-328).
RESULTADOS BIODISTRIBUIÇÃO
[0845] As médias do acúmulo e depuração de 203Pb em camundongos SCID com tumor são exibidas na Figura 50. O acúmulo de radioatividade foi maior no tumor, com 17 %ID/g já 5 minutos após a injeção, aumentando para mais de 40% por 6 horas p.i. e permanecendo nesse nível por pelo menos 48 horas. Nenhuma diferença significativa foi descoberta em tecidos normais em comparação com a condição livre de tumor.
DOSES ABSORVIDAS
[0846] As doses médias absorvidas em Gy calculadas para o protocolo 146 são apresentadas na Tabela 24, tanto em valores absolutos (RBE = 1) quanto corrigidos para a maior citotoxicidade dos emissores alfa (RBE = 5). Para os camundongos SCID, o peso médio foi de 18,5 g; com uma atividade 212Pb injetada de 20 uCi isso resultou em atividades injetadas normalizados de 1,1 μCi/g de peso corporal.
[0847] Uma dose absorvida de aproximadamente 20 Gy foi alcançada no tumor, enquanto a dose absorvida permaneceu bem abaixo de 2 Gy na maioria dos tecidos normais, exceto a bexiga. O teor de 212Pb na bexiga diferiu significativamente entre os camundongos individuais, indicando uma alta variabilidade para este tecido. Doses corrigidas de RBE foram fornecidas para permitir a comparação com a radioterapia usando radiação gama externa, resultando em uma dose absorvida estimada no tumor de aproximadamente 100 Gy por 20 µCi de 212Pb-DOTAM injetado.
MÉDIAS DAS DOSES ABSORVIDAS (GY) PARA ÓRGÃOS E TECIDOS COLETADOS APÓS A INJEÇÃO DE 20 ΜCI DE 212PB-DOTAM Protocolo 146 212 Pb-DOTAM Pré-direcionado Órgão/tecido (SCID com tumor) RBE = 1 RBE = 5 Gordura abdominal 1,25 6,25 Bexiga 6,53 32,64 Sangue 0,72 3,60 Cérebro 0,04 0,19 Cólon 0,43 2,17 Osso Femoral 0,27 1,33 Coração 0,33 1,63 Rins 1,43 7,14 Fígado 0,22 1,09
Protocolo 146 212 Pb-DOTAM Pré-direcionado Órgão/tecido (SCID com tumor) RBE = 1 RBE = 5 Pulmão 1,34 6,69 Músculo 0,29 1,47 Pâncreas 0,36 1,80 Soro 1,64 8,20 Pele 0,47 2,33 Intestino delgado 0,22 1,08 Baço 0,27 1,36 Estomago 0,24 1,20 Cauda 0,54 2,69 Útero 0,61 3,04 Tumor (BxPC3) 19,91 99,55
CONCLUSÃO
[0848] Uma dose absorvida de aproximadamente 20 Gy foi alcançada no tumor, enquanto a dose absorvida na maioria dos tecidos normais permaneceu bem abaixo de 2 Gy. No geral, o estudo não indicou riscos importantes de toxicidade limitante da dose usando o regime PRIT avaliado.
EXEMPLO 34 EXTINÇÃO DE DOTAM NÃO QUELATADO (PROTOCOLO 131)
[0849] O emissor alfa 212Pb é quelatado ao DOTAM após eluição de uma resina contendo tório, produzindo o 212Pb-DOTAM farmacologicamente ativo. Após a radiomarcação, um excesso (> 99%) de DOTAM livre não quelatado permanece na solução, capturando prontamente os íons metálicos do ambiente. Após a injeção em um paciente, ele se ligaria rapidamente ao Ca2+ circulante, formando o Ca-DOTAM farmacologicamente inativo. Embora o BsAb CEA-DOTAM seja projetado para ligar preferencialmente Pb-DOTAM, ele também formará complexos estáveis com Ca-DOTAM em um grau comparável.
Como consequência, o bloqueio de 212Pb-DOTAM a partir de locais tumores pré-direcionados pode ocorrer em condições saturadas, potencialmente diminuindo a eficácia do tratamento com PRIT. Para evitar competição potencial, uma etapa de extinção é, portanto, adicionada ao processo de eluição do 212Pb-DOTAM, no qual um íon metálico (“X”) é introduzido para controlar a formação de “X-DOTAM” com uma constante de dissociação significativamente maior (Kd). A afinidade do ligante DOTAM para vários quelatos X-DOTAM, conforme determinado por medições de equilíbrio KinExA (ensaio de exclusão cinética), é mostrada na tabela abaixo.
AFINIDADES DO QUELATO DE METAL-DOTAM DO BSAB CEA-DOTAM Kd 95% CI Quelato [pM] [pM] Pb-DOTAM 0,84 0,44–1,4 Ca-DOTAM 0,95 0,43–1,7 Cu-DOTAM 122 000 60 000–206 000 Zn-DOTAM 15 000 9 000–19 000
[0850] A escolha inicial para a extinção foi o Cu, substituindo assim o DOTAM não quelatado por Cu-DOTAM extinto e não competitivo, e um grande número de estudos dentro do programa CEA-PRIT foram executados usando esta condição. No entanto, foi descoberto mais tarde que o complexo Cu-DOTAM não era, de fato, estável in vivo, e um estudo foi realizado para avaliar sua estabilidade em comparação com íons de extinção alternativos em soro, plasma e sangue humano e de camundongo. Os íons selecionados foram, por um lado, Pb e Ca, com afinidade semelhante, e, por outro lado, Zn e Cu, com afinidade significativamente menor. O estudo demonstrou estabilidade significativamente maior de Zn-DOTAM em comparação com Cu-DOTAM em sangue humano e de camundongo, conforme medido pela formação espontânea de Ca-DOTAM 35 minutos p.i., atingindo aproximadamente 25% e 30% no sangue de camundongo e humano, respectivamente, para Cu-DOTAM inicialmente injetado, em comparação com 0% e 0% para Zn-DOTAM, e 4% e 4% para Pb-DOTAM.
[0851] O protocolo 131 foi projetado para avaliar os metais de extinção de DOTAM in vivo candidatos, comparando o efeito destes no tumor e sobre o acúmulo tecidual normal de 212Pb-DOTAM após pré-direcionamento com CEA-DOTAM e depuração com Pb-DOTAM-dextrano-500. Zn e Gd, que têm estabilidade do complexo in vitro razoável com DOTAM, foram avaliados lado a lado com Cu. Além disso, Ca e Pb estável foram usados como controles.
O esboço do estudo é mostrado na Figura 51.
[0852] O curso de tempo e o design do protocolo 131 são mostrados nas duas tabelas abaixo.
CURSO DE TEMPO DO PROTOCOLO 131 Dia do estudo Procedimento experimental 0 Preparação de células BxPC3 e enchimento de seringas 0 Injeção s.c. de células BxPC3 18 Injeção i.v. de BsAb 25 Injeção i.v. de CA 26 Eluição de 212Pb-DOTAM e enchimento de seringas 26 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM 26 Eutanásia e coleta de tecido (2 h p.i.) + contagem gama GRUPOS DO ESTUDO NO PROTOCOLO 131 BsAb Tempo CA Tempo 212Pb BD Grupo n BsAb Ext. (µg) (d) (µg) (h) (µCi) (h p.i.) A 4 CEA-DOTAM 100 7 25 24 10 Zn 2 B 4 CEA-DOTAM 100 7 25 24 10 Gd 2 C 4 CEA-DOTAM 100 7 25 24 10 Cu 2 D 4 CEA-DOTAM 100 7 25 24 10 Ca 2 E 4 CEA-DOTAM 100 7 25 24 10 Pb 2
[0853] Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos por injeção s.c. de células BxPC3 no flanco direito de camundongos SCID com 5-7 semanas de idade. Dezoito dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 200 mm3. O 212Pb-DOTAM foi injetado no dia 26 após a inoculação, ponto em que o volume médio do tumor era de 350 mm 3.
[0854] O anticorpo foi diluído em His/His-HCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 para uma concentração final de 100 µg por 100 µL para administração i.v. de acordo com a tabela “Grupos de estudo no Protocolo 131” e a Figura 51. O CA foi descongelado e diluído em PBS para uma concentração final de 25 µg por 100 µL para administração i.v., 7 dias após a injeção de BsAb. Após outras 24 horas, 212Pb-DOTAM, extinto usando qualquer um dos 5 metais diferentes, foi injetado i.v. (10 µCi em 100 µL de NaCl a 0,9%).
[0855] Os camundongos foram sacrificado para fins de biodistribuição 2 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM, e os seguintes tecidos e órgãos foram coletados: sangue, bexiga, baço, rins, fígado, pulmão, músculo, cauda e tumor.
RESULTADOS
[0856] O acúmulo médio e depuração de 212Pb em todos os tecidos coletados 2 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM é exibido na Figura
52. Não houve diferenças estatisticamente significativas na média de %ID/g entre qualquer um dos metais de extinção, em comparação com o controle Pb (ANOVA bidirecional com teste de comparações múltiplas de Dunnett). Os valores individuais para tumores e tecidos normais selecionados são mostrados na Figura 53. Uma variação individual maior no teor de 212Pb foi observada no baço e no músculo após a extinção com Zn e Gd em comparação com os outros metais, embora a diferença na %ID/g média entre os diferentes grupos de tratamento não tenha sido significativa (ANOVA unidirecional com teste de comparações múltiplas de Tukey).
CONCLUSÃO
[0857] O protocolo 131 avaliou o efeito sobre o acúmulo no tumor e tecido normal de 212Pb-DOTAM pré-direcionado a partir da extinção por Zn,
Gd ou Cu de DOTAM, em comparação com Ca ou Pb. Nenhuma diferença na captação tumoral de 212Pb foi observada, indicando que não houve bloqueio significativo de sítios de ligação pré-direcionados usando os controles Ca e Pb sob as condições experimentais aplicadas. Uma variação aumentada no teor de 212Pb no baço e músculo foi observada após a extinção com Zn e Gd, indicando que os complexos de metal-DOTAM que competem com 212Pb- DOTAM podem contribuir para a neutralização de CEA-DOTAM não ligado ao CA em tecidos não alvo. A extinção com Cu resultou em resultados comparáveis à extinção com Ca, confirmando ainda mais a instabilidade in vivo indicada de Cu-DOTAM. O Ca foi eventualmente escolhido para extinção de DOTAM, por três razões principais: maior controle da formulação in vivo da solução de 212Pb-DOTAM, em comparação com a extinção de Cu; o potencial para aumentar a neutralização de BsAb não ligado a CA, reduzindo a variabilidade na captação de 212Pb pelo tecido normal; e o potencial para reduzir o efeito do fenômeno hipotético de “barreira de sítio de ligação”, pelo qual a penetração de moléculas com alta afinidade para um antígeno é restrita devido à ligação imediata a alvos facilmente acessíveis em condições de subsaturação.
EXEMPLO 35 AVALIAÇÃO DE CD20-DOTAM E HER2-DOTAM PARA PRIT (PROTOCOLOS 151 E 152)
[0858] Os protocolos 151 e 152 objetivaram avaliar a ligação de 212Pb-DOTAM a tumores subcutâneos em camundongos pré-direcionados pelos BsAbs CD20-DOTAM totalmente humanizados e HER2-DOTAM, respectivamente. PRIT de três etapas foi realizada por injeção das construções de anticorpo, seguido após 7 dias pelo CA Ca-DOTAM-dextrano-500 e, finalmente, 212Pb-DOTAM após 24 horas. Os camundongos foram sacrificados 24 horas após a injeção radioativa, e sangue e órgãos foram coletados para medição radioativa.
DESENHO DO ESTUDO
[0859] Os cursos de tempo e desenhos dos protocolos 151 e 152 são mostrados nas quatro tabelas a seguir.
CURSO DE TEMPO DO PROTOCOLO 151 Dia do estudo Procedimento experimental 0 Preparação de células WSU-DLCL2 e enchimento de seringas 0 Injeção s.c. de células WSU-DLCL2 5 Injeção i.v. de BsAb CD20-DOTAM 12 Injeção i.v. de CA (grupos A, B) 12 Coleta do tumor e fixação em formalina (grupos C, D) 13 Eluição de 212Pb-DOTAM e enchimento de seringas 13 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM (grupos A, B) 14 Eutanásia e coleta de tecido (24 h p.i.) + contagem gama (grupos A, B) GRUPOS DO ESTUDO NO PROTOCOLO 151 212 BsAb Tempo CA Tempo Pb BD Grupo n BsAb (µg) (d) (µg) (h) (µCi) (h p.i.) CD20- A 3 100 7 25 24 20 6
DOTAM DIG- B 3 100 7 25 24 20 6
DOTAM CD20- C 2 100 7 0 — 0 —
DOTAM DIG- D 2 100 7 0 — 0 —
DOTAM E 5 — 0 — 0 — 0 — CURSO DE TEMPO DO PROTOCOLO 152 Dia do estudo Procedimento experimental 0 Preparação de células NCI-N87 e enchimento de seringas 0 Injeção s.c. de células NCI-N87 14 Injeção i.v. de BsAb HER2-DOTAM 21 Injeção i.v. de CA (grupos A, B) 21 Coleta do tumor e fixação em formalina (grupos C, D) 22 Eluição de 212Pb-DOTAM e enchimento de seringas 22 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM (grupos A, B) 23 Eutanásia e coleta de tecido (24 h p.i.) + contagem gama (grupos A, B) GRUPOS DO ESTUDO NO PROTOCOLO 152
BsAb Tempo CA Tempo Pb BD Grupo n BsAb (µg) (d) (µg) (h) (µCi) (h p.i.) A 3 HER2-DOTAM 100 7 25 24 20 6 B 3 DIG-DOTAM 100 7 25 24 20 6 C 2 HER2-DOTAM 100 7 0 — 0 — D 2 DIG-DOTAM 100 7 0 — 0 — E 5 — 0 — 0 — 0 —
[0860] Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos no protocolo 151 por injeção s.c. de células de linfoma de células B humanas WSU-DLCL2 que expressam CD20 em meio DMEM em camundongos SCID com idade de 9 semanas. Quatro dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 105 mm3. O 212Pb-DOTAM foi injetado no dia 13 após a inoculação, ponto em que o volume médio do tumor era de 242 mm3.
[0861] No protocolo 152, camundongos SCID com 10 semanas de idade foram xenoenxertados por injeção s.c. de células de carcinoma gástrico humano NCI-N87 que expressam HER2 em meio RPMI 1640. Quatorze dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 74 mm 3. O 212Pb- DOTAM foi injetado no dia 22 após a inoculação; o volume médio do tumor era de 61 mm3 no dia 21.
[0862] Os camundongos para o ensaio de biodistribuição foram sacrificados 24 horas após a injeção radioativa. O sangue foi coletado antes do término por meio de sangramento retro-orbital sob anestesia. Todos os camundongos foram necropsiados após a eutanásia, com coleta adicional de pele, bexiga, estômago, intestino delgado, cólon, baço, pâncreas, rins, fígado, pulmão, coração, osso femoral, músculo, cauda e tumor.
RESULTADOS BIODISTRIBUIÇÃO - PROTOCOLO 151
[0863] O teor médio de 212Pb em todos os tecidos coletados 24 horas após a injeção é exibido na Figura 54. O controle negativo BsAb DIG- DOTAM não resultou em acúmulo de radioatividade em tumores WSU-DLCL2 (0,4 ± 0,3 %ID/g), enquanto o BsAb CD20-DOTAM resultou em 25,0 ± 3,7 %ID/g. Nenhuma captação significativa de 212Pb foi observada em tecidos/órgãos normais, exceto para bexiga (12,5 ± 4,5 %ID/g), rins (3,1 ± 0,3 %ID/g) e pulmão (2,2 ± 0,2 %ID/g).
BIODISTRIBUIÇÃO - PROTOCOLO 152
[0864] O teor médio de 212Pb em todos os tecidos coletados 24 horas após a injeção é exibido na Figura 55. O controle negativo BsAb DIG- DOTAM não resultou em acúmulo de radioatividade em tumores NCI-N87 (0,8 ± 0,3 %ID/g), enquanto o BsAb HER2-DOTAM resultou em 24,6 ± 3,7 %ID/g.
Não foi obsevada captação significativa de 212Pb em tecidos/órgãos normais, exceto em valores muito baixos nos rins (1,6 ± 0,1 %ID/g) e pulmão (1,4 ± 0,2 %ID/g).
CONCLUSÃO
[0865] Os resultados dos Protocolos 151 e 152 demonstraram direcionamento específico e a prova de conceito in vivo de CD20-PRIT e HER2-PRIT usando a abordagem de pré-direcionamento de três etapas desenvolvida para CEA-PRIT.
EXEMPLO 36
DISTRIBUIÇÃO IN VIVO E DADOS DE ACÚMULO TUMORAL PARA OUTROS FORMATOS (PROTOCOLO 154)
[0866] O protocolo 154 teve como objetivo avaliar o uso de 5 novas construções de BsAb CEA-DOTAM para PRIT. Ele foi projetado para fornecer distribuição in vivo e dados de acúmulo tumoral de 212Pb-DOTAM em camundongos SCID portadores de xenoenxertos HPAF-II subcutâneos. PRIT de três etapas foi realizada por injeção das construções CEA-DOTAM, seguido
7 dias depois por um CA Ca-DOTAM-dextrano-500 e finalmente 212Pb-DOTAM após 24 horas da administração de CA. Os camundongos foram sacrificados 6 horas após a injeção radioativa, e sangue e órgãos foram coletados para medição radioativa. As comparações foram feitas com PRIT usando o padrão BsAb CEA-DOTAM e um BSAb que não se liga ao CEA. O esboço do estudo é mostrado na Figura 56.
DESENHO DO ESTUDO
[0867] O curso de tempo e o desenho do protocolo 154 são mostrados nas duas tabelas abaixo.
CURSO DE TEMPO DO PROTOCOLO 154 Dia do estudo Procedimento experimental 0 Preparação de células HPAF-II e enchimento de seringas 0 Injeção s.c. de células HPAF-II 12 Injeção i.v. de BsAb 19 Injeção i.v. de CA 19 Eluição de 212Pb-DOTAM e enchimento de seringas 20 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM 20 Eutanásia e coleta de tecido (6 h p.i.) + contagem gama GRUPOS DO ESTUDO NO PROTOCOLO 154 212 BsAb Tempo CA Tempo Pb BD Grupo n BsAb (µg) (d) (µg) (h) (µCi) (h p.i.) A 3 DIG-DOTAM 100 7 25 24 10 6 B 3 CEA-DOTAM 100 7 25 24 10 6 C 3 P1AE1766 100 7 25 24 10 6 D 3 P1AE1767 100 7 25 24 10 6 E 3 P1AE1768 100 7 25 24 10 6 F 3 P1AE1769 100 7 25 24 10 6 G 3 P1AE1770 100 7 25 24 10 6
[0868] Os xenoenxertos sólidos foram estabelecidos por injeção s.c. de células HPAF-II no flanco direito de camundongos com 9 semanas de idade. Onze dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 79 mm3. O 212Pb-DOTAM foi injetado no dia 20 após a inoculação, ponto em que o volume médio do tumor era de 230 mm3.
[0869] Todos os anticorpo foram diluídos em His/His-HCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 para uma concentração final de 100 µg por 100 µL para administração i.v. de acordo com a tabela “Grupos de estudo no Protocolo 154” e a Figura 56. O CA foi descongelado e diluído em PBS para uma concentração final de 25 µg por 100 µL para administração i.v., 7 dias após a injeção de BsAb. Após outras 24 horas, 212Pb-DOTAM extinto com Ca foi injetado i.v. (10 µCi em 100 µL de NaCl a 0,9%).
[1000] Os camundongos foram sacrificado para fins de biodistribuição 6 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM, e os seguintes tecidos e órgãos foram coletados: sangue, pele, bexiga, estômago, intestino delgado, cólon, baço, pâncreas, rins, fígado, pulmão, coração, osso femoral, músculo, cérebro, cauda e tumor.
RESULTADOS
[1001] O acúmulo médio e depuração de 212Pb em todos os tecidos coletados 6 horas após a injeção é exibido na Figura 57. O teor sanguíneo e o acúmulo no tumor são mostrados em maiores detalhes na Figura 58. O controle negativo BsAb DIG-DOTAM não resultou em acúmulo de radioatividade em tumores (1,4 ± 0,1 %ID/g), enquanto o BsAb CEA-DOTAM resultou em 36,8 ± 3,4 %ID/g. Para as novas construções, os números correspondentes foram 31,8 ± 3,1 %ID/g (P1AE1766), 35,0 ± 8,5 %ID/g (P1AE1767), 14,2 ± 6,7 %ID/g (P1AE1768), 38,8 ± 10,1 %ID/g (P1AE1769) e 39,5 ± 6,8 %ID/g (P1AE1770). O acúmulo tumoral significativamente menor de P1AE1768 pode ser explicado pela monovalência de CEA desta construção de anticorpo.
[1002] Nenhuma captação significante de 212Pb foi observada em tecidos/órgãos normais, com exceção da bexiga, onde a radioatividade atingiu níveis geralmente vistos em 6 h p.i. para este regime PRIT.
CONCLUSÃO
[1003] Os resultados do estudo demonstraram a prova de conceito in vivo de todas as construções de anticorpos CEA-DOTAM testadas (P1AE1766, P1AE1767, P1AE1768, P1AE1769 e P1AE1770) para PRIT de três etapas.
EXEMPLO 37 EFICÁCIA DE CD20-PRIT (PROTOCOLO 162)
[1004] O objetivo deste estudo foi apresentar uma prova de conceito do regime de tratamento desenvolvido para o CEA-PRIT direcionado contra um alvo alternativo: cluster de diferenciação 20 (CD20). A eficácia terapêutica foi avaliada após 3 ciclos de CD20-PRIT em camundongos com tumores WSU-DLCL2 subcutâneos. As comparações também foram feitas com: CD20-RIT de 1 etapa, usando BsAbs que foram pré-incubados com 212Pb-DOTAM antes da injeção; com rituximabe, um anticorpo monoclonal tipo I que visa CD20 e uma referência no tratamento de doenças CD20 +; e com GA101, um anticorpo monoclonal tipo II também direcionado contra CD20. Desenho do estudo, protocolo 162 Dia do Procedimento experimental estudo 0 Preparação de células WSU-DLCL2 e enchimento de seringas 0 Injeção s.c. de células WSU-DLCL2 7 Injeção i.p. de BsAb PRIT ou tampão histidina (grupos A, B, C, E, H, I, J, K) 14 Injeção i.p. de CA ou tampão histidina (grupos A, B, C, H, I, J, K) 15 Eluição de 212Pb-DOTAM e enchimento de seringas 15 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM (grupos D, L) 15 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM ou 0,9% NaCl (grupos A, B, C, H, I, J, K) 15 Injeção i.v. de GA101 ou rituximabe (grupos F, G) 16 Eutanásia e coleta de tecido (24 h p.i.) + contagem gama (grupos H, I, L) 21 Injeção i.p. de BsAb PRIT ou tampão histidina (grupos A, B, C, E, J, K) 28 Injeção i.p. de CA ou tampão histidina (grupos A, B, C, J, K)
Desenho do estudo, protocolo 162 29 Eluição de 212Pb-DOTAM e enchimento de seringas 29 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM (grupo D) 29 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM ou 0,9% NaCl (grupos A, B, C, J, K) 29 Injeção i.v. de GA101 ou rituximabe (grupos F, G) 30 Eutanásia e coleta de tecido (24 h p.i.) + contagem gama (grupo J) 35 Injeção i.p. de BsAb PRIT ou tampão histidina (grupos A, B, C, E, K) 42 Injeção i.p. de CA ou tampão histidina (grupos A, B, C, K) 43 Eluição de 212Pb-DOTAM e enchimento de seringas 43 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM (grupo D) 43 Injeção i.v. de 212Pb-DOTAM ou 0,9% NaCl (grupos A, B, C, K) 43 Injeção i.v. de GA101 ou rituximabe (grupos F, G) 44 Eutanásia e coleta de tecido (24 h p.i.) + contagem gama (grupo K) Grupos de estudo no protocolo 162 (ntot = 85) 212 Grupo BsAb BsAb CA Pb- Ciclos de n por ciclo por DOTAM tratamento (camund.) (µg) ciclo por ciclo (#) (µg) (µCi) A — 0 0 0 3 10 B DIG-DOTAM 100 25 20 3 10 C CD20-DOTAM 100 25 20 3 10 D 212Pb-DOTAM- 20 0 10 3 10 CC20-DOTAM E CD20-DOTAM 100 0 0 3 10 F GA101 600 0 0 3 10 G Rituximabe 600 0 0 3 10 H DIG-DOTAM 100 25 20 1 3 I CD20-DOTAM 100 25 20 1 3 J CD20-DOTAM 100 25 20 2 3 K CD20-DOTAM 100 25 20 3 3 L 212Pb-DOTAM- 20 0 10 1 3 CEA-DOTAM
[1005] Os animais foram tratados de acordo com o cronograma experimental ilustrado na Figura 59. Xenoenxertos sólidos WSU-DLCL2 foram estabelecidos em camundongos SCID com 8 semanas de idade no dia de estudo 0 por injeção subcutânea de 1,5 × 10 5 células no flanco direito. Sete dias após a injeção de células tumorais, os camundongos foram classificados em grupos experimentais com um volume tumoral médio de 144 mm 3. O 212Pb- DOTAM foi injetado no dia 15 após a inoculação; o volume médio do tumor foi de 306 mm3 no dia 14.
[1006] Os camundongos nos grupos A – G foram seguidos para avaliar a eficácia dos tratamentos. Para PRIT, a atividade administrada foi de 20 µCi por ciclo, enquanto a atividade correspondente para RIT de 1 etapa foi de 10 µCi, para evitar toxicidade aguda induzida por radiação após o maior tempo de retenção no sangue e tecidos normais usando este regime.
[1007] Os camundongos nos grupos H, I e L foram sacrificados e necropsiados para fins de biodistribuição 24 horas após sua primeira e única injeção de 212Pb-DOTAM ou 212Pb-DOTAM-BsAb; os grupos J e K foram sacrificados e necropsiados 24 horas após a segunda e terceira injeção de 212Pb-DOTAM, respectivamente. Os seguintes órgãos e tecidos foram colhidos desses camundongos: sangue, bexiga, baço, rins, fígado, pulmão, músculo, cauda, pele e tumor. As amostras coletadas foram pesadas e, em seguida, tiveram a radioatividade medida usando um contador gama automático 2470 WIZARD2 (PerkinElmer), e a porcentagem de dose injetada por grama de tecido (%ID/g) foi subsequentemente calculada, incluindo correções para o decaimento e fundo.
[1008] Para PRIT, BsAb CEA-DOTAM ou DIG-DOTAM (BsAb de controle negativo) foi diluído em 20 mM de Histidina, 140 mM de NaCl (pH 6,0) para uma concentração final de 100 µg por 200 µL para administração i.p. O CA Ca-DOTAM-dextrano-500 foi administrado i.p. (25 µg por 200 µL) 7 dias após a injeção de BsAb, seguido 24 horas mais tarde por 212Pb-DOTAM extinto com Ca (20 µCi em 100 µL).
[1009] Os camundongos tratados com RIT de 1 etapa receberam 212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM pré-ligado, preparado por incubação do 212Pb- DOTAM com o BsAb CD20-DOTAM por 10 minutos a 37ºC antes da injeção i.v.
(20 µCi/20 µg de BsAb em 100 µL de NaCl a 0,9%).
[1010] Os camundongos tratados com Rituximabe (MabThera®) ou GA101 (obinutuzumabe) foram injetados i.v. com os respectivos anticorpos, diluídos em Histidina 20 mM, NaCl 140 mM (pH 6,0) para uma concentração final de 600 µg em 200 µL. As injeções foram realizadas no mesmo dia que as injeções radioativas para os grupos tratados com PRIT e RIT.
RESULTADOS PRELIMINARES, 162
[1011] O estudo ainda está em andamento no momento em que este exemplo foi escrito, mas os resultados preliminares podem ser divulgados.
[1012] O acúmulo médio e depuração de 212Pb em todos os tecidos coletados 24 horas após a injeção de 212Pb-DOTAM é exibido para o primeiro ciclo de tratamento na Figura 60. O controle PRIT negativo não resultou em captação (0,7 %ID/g) no tumor. A captação no tumor foi de 22 %ID/g para CD20-PRIT e CD20-RIT.
[1013] A média do desenvolvimento do tumor para os tratamentos avaliados é mostrada na Figura 61. Os tumores no grupo não tratado (tratado apenas com veículo), no grupo DIG-DOTAM e nos grupos de tratamento baseados em anticorpo cresceram de forma constante. Em contraste, os tumores nos grupos CD20-RIT e CD20-PRIT diminuíram de tamanho após o primeiro ciclo de tratamento.
[1014] O desenvolvimento do peso corporal em todos os grupos de tratamento é mostrado na Figura 62. As múltiplas injeções de 20 µCi de 212Pb-DOTAM foram bem toleradas, mas 10 µCi de 212Pb-DOTAM-CD20- DOTAM pré-ligado resultaram em uma queda significativa no peso corporal.
RESUMO E CONCLUSÃO
[1015] O estudo mostrou prova de conceito do CD20-PRIT, com indicações de inibição do crescimento tumoral comparável àquela demonstrada anteriormente para CEA-PRIT. O tratamento com CD20-PRIT foi bem tolerado,
o que não foi o caso para o tratamento com CD20-RIT de 1 etapa.
EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO ADICIONAIS DA INVENÇÃO
[1016] As seguintes declarações numeradas representam certos aspectos e exemplos de realização adicionais da invenção:
1. Agente de remoção compreendendo dextrano ou um derivado deste conjugado com um agente quelante selecionado a partir de DOTAM e um variante funcional de DOTAM, em que o referido agente quelante é complexado com um íon metálico;
2. O agente de remoção do parágrafo 1, que é um composto da seguinte fórmula: dextrano - (ligante-(M-DOTAM))x - em que: - dextrano é dextrano ou derivado deste; - ligante é uma porção de ligação; - M-DOTAM é DOTAM ou um variante funcional do mesmo incorporando um íon de metal; e x ≥ 1;
3. O agente de remoção do parágrafo 1, em que x é 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais, 40 ou mais, ou 50 ou mais;
4. O agente de remoção do parágrafo 2 ou parágrafo 3, em que a porção de ligação é um grupo bivalente da seguinte fórmula: y ** * onde y é de 1 a 6, * representa o ponto de fixação ao dextrano, e ** representa o ponto de fixação a um átomo do anel do DOTAM ou um variante funcional deste;
5. O agente de remoção de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o derivado de dextrano é um aminodextrano, opcionalmente substituído com um ou mais grupos selecionados a partir de um aminoácido e um sacarídeo diferente de glicose;
6. O agente de remoção de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o número de grupos DOTAM como uma porcentagem do número de unidades de glicose do dextrano ou derivado de dextrano é pelo menos 1%, pelo menos 1,5%, pelo menos 2%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3%, pelo menos 5%;
7. O agente de remoção de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o peso molecular médio do dextrano é de 200-800kDa, opcionalmente maior do que 300, 350, 400 ou 450 kDa, e opcionalmente menor do que 700, 650, 600 ou 550 kDa, opcionalmente cerca de 500kDa;
8. O agente de remoção do parágrafo 7, em que: - os componentes dextrano ou agentes de remoção com peso molecular menor do que o peso molecular de corte foram removidos, em que o peso molecular de corte é 50 kDa ou superior, 100 kDa ou superior ou 200 kDa ou superior;
9. O agente de remoção do parágrafo 8, em que o peso molecular de corte está na faixa de 50kDa-250kDa ou 50kDa-200kDa, opcionalmente 100kDa-200kDa e opcionalmente cerca de 100kDa, 150kDa ou 200kDa;
10. O agente de remoção de qualquer um parágrafo do parágrafo 7 ao parágrafo 9, em que o peso molecular médio é de 450kDa- 550kDa, por exemplo, cerca de 500kDa;
11. O agente de remoção de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o íon metálico é um isótopo estável ou um isótopo essencialmente estável;
12. O agente de remoção de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o íon metálico é um íon de Pb, Bi ou Ca;
13. Método de preparação de um agente de remoção, caracterizado por compreender: - a conjugação de um dextrano ou derivado de dextrano ao DOTAM ou um variante funcional ou derivado do mesmo, em que o método envolve a quelação de DOTAM com um íon metálico antes e/ou após a conjugação de DOTAM ao dextrano;
14. O método do parágrafo 13, em que o íon de metal é um íon de metal estável ou essencialmente estável;
15. O método do parágrafo 13 ou 14, em que o íon metálico é um íon de Pb, Bi ou Ca;
16. O método de qualquer um dos parágrafos de 13 a 15, em que antes da conjugação o dextrano ou derivado de dextrano é submetido a uma etapa de filtração para remover espécies abaixo de um peso molecular de corte/limite de 50kDa ou superior, 100kDa ou superior ou 200kDa ou superior, e/ou em que: - o método compreende submeter o conjugado a uma etapa de filtração para remover espécies abaixo de um peso molecular de corte/limiar de 50 kDa ou acima, 100 kDa ou acima ou 200 kDa ou acima;
17. O agente de remoção de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 12, para uso em um método de radioimunoterapia ou radioimunoimagem;
18. O agente de remoção de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 12, para uso em um método de radioimagem pré- direcionada, caracterizado por compreender: i) a administração a um sujeito de um anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreendendo pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno alvo, em que após a administração o anticorpo liga-se ao antígeno alvo e se localiza na superfície de uma célula que expressa o antígeno alvo; ii) a administração de um agente de remoção de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 11, em que o agente de remoção é capaz de ligar-se ao anticorpo no sítio de ligação para o quelato Pb-DOTAM e aumentar a depuração e/ou bloquear o sítio de ligação ao antígeno do anticorpo não localizado na superfície da célula; - opcionalmente, o método compreende ainda: iii) a administração subsequente de um complexo compreendendo DOTAM quelatado com um radioisótopo Pb, em que o referido complexo liga-se ao anticorpo localizado na superfície da célula; opcionalmente o método compreende ainda; iv) a imagiologia do tecido ou órgão onde o radionuclídeo quelatado foi localizado;
19. O agente de remoção de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 12, para uso em um método de radioimunoterapia pré- direcionada, caracterizado por compreender: i) a administração a um sujeito de um anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreendendo pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno alvo, em que após a administração o anticorpo liga-se ao antígeno alvo e se localiza na superfície de uma célula que expressa o antígeno alvo; ii) a administração de um agente de remoção de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 12, em que o agente de remoção é capaz de ligar-se ao anticorpo no sítio de ligação para o quelato Pb-DOTAM e aumentar a depuração do anticorpo e/ou bloquear o sítio de ligação ao antígeno do anticorpo não localizado na superfície da célula; - opcionalmente, o método compreende ainda: iii) a administração subsequente de um complexo compreendendo DOTAM quelatado com um radioisótopo Pb, em que o referido complexo liga-se ao anticorpo localizado na superfície da célula;
20. Método de radioimagem pré-direcionada, caracterizado por compreender: i) a administração a um sujeito de um anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreendendo pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno alvo, em que após a administração o anticorpo liga-se ao antígeno alvo e se localiza na superfície de uma célula que expressa o antígeno alvo; ii) a administração de um agente de remoção de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 12, em que o agente de remoção é capaz de ligar-se ao anticorpo no sítio de ligação para o quelato Pb-DOTAM e aumentar a depuração do anticorpo e/ou bloquear o sítio de ligação ao antígeno do anticorpo não localizado na superfície da célula; opcionalmente compreendendo ainda; iii) a administração subsequente de um complexo compreendendo DOTAM ou variante funcional do mesmo quelatado com um radioisótopo Pb, em que o referido complexo liga-se ao anticorpo localizado na superfície da célula, e opcionalmente compreende ainda; iv) a imagiologia do tecido ou órgão onde o radionuclídeo quelatado foi localizado;
21. Método de radioimunoterapia pré-direcionada, caracterizado por compreender:
i) a administração a um sujeito de um anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreendendo pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno alvo, em que após a administração o anticorpo liga-se ao antígeno alvo e se localiza na superfície de uma célula que expressa o antígeno alvo; ii) a administração de um agente de remoção de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 12, em que o agente de remoção é capaz de ligar-se ao anticorpo no sítio de ligação para o quelato Pb-DOTAM e aumentar a depuração do anticorpo e/ou bloquear o sítio de ligação ao antígeno do anticorpo não localizado na superfície da célula; opcionalmente compreendendo ainda; iii) a administração subsequente de um complexo compreendendo DOTAM ou variante funcional do mesmo quelatado com um radioisótopo Pb, em que o referido complexo liga-se ao anticorpo localizado na superfície da célula;
22. O agente de remoção para uso de acordo com o parágrafo 18 ou 19 ou do método de acordo com o parágrafo 20 ou 21, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM compreende pelo menos: a) CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2), ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 2, em que essas substituições não incluem Phe50, Asp56 e Tyr58, e opcionalmente também não incluem Gly52 e/ou Arg54; b) CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3), ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 3, em que essas substituições não incluem Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, e opcionalmente também não incluem Ala100C, Tyr100D, e/ou Pro100E e/ou opcionalmente também não incluem Tyr99; c) CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4) ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 4, em que essas substituições não incluem Tyr28 e Asp32; d) CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6) ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 6, em que essas substituições não incluem Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c e Tyr96, - em que a numeração está de acordo com a numeração de Kabat;
23. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 22, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM compreende ainda uma CDR1 de cadeia pesada e uma CDR2 de cadeia leve;
24. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 23, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM compreende: i) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1) ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 1, opcionalmente substituições conservadoras; e/ou ii) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QASKLAS (SEQ ID NO: 5) ou uma variante da mesma possuindo pelo menos 1, 2 ou 3 substituições na SEQ ID NO: 5, opcionalmente substituições conservadoras;
25. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 24, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas a partir de: a) a CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1); b) CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos FIGSRGDTYYASWAKWG (SEQ ID NO: 2); c) a CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3); d) a CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4); e) a CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QASKLAS (SEQ ID NO: 5); f) a CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6);
26. O agente de remoção para uso ou para o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 25, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM liga-se ao mesmo epítopo, ou a um epítopo de sobreposição, do quelato Pb-DOTAM como: i) um anticorpo possuindo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou ii) um anticorpo possuindo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;
27. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 26, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM é humano, quimérico ou humanizado;
28. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 27, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9;
29. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 28, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o Pb-DOTAM compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 ou 10;
30. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 29, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 8;
31. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 30, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 10;
32. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 30, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM liga-se ao quelato Pb-DOTAM com um valor Kd de 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM ou menos;
33. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 32, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM liga-se ao quelato Pb-DOTAM e a um quelato Bi-DOTAM, e em que a razão dos valores de Kd para o quelato Bi-DOTAM/quelato Pb-DOTAM está no intervalo de 0,1-10 ou 1-10;
34. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 33, em que o antígeno alvo é um antígeno específico de tumor;
35. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 34, em que o antígeno específico de tumor é selecionado a partir do grupo que consiste em CEA, HER2 e CD20;
36. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 35, em que o antígeno específico de tumor é o antígeno carcinoembrionário (CEA);
37. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 36, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende pelo menos pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o CEA, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o CEA compreende uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma, duas ou três CDRs de cadeia pesada: em que: d) a CDR1 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e) a CDR2 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; f) a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e/ou o sítio de ligação ao antígeno específico para o CEA compreende uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, duas ou três CDRs de cadeia leve, em que: a) a CDR1 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14; b) a CDR2 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15; c) a CDR3 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 16.
38. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 37, em que o sítio de ligação ao antígeno para CEA compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis (ou seja, todas) as CDRs selecionadas a partir de: a) CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; b) CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; c) CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14; e) CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; f) CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;
39. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 38, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o CEA, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o CEA compreende: i) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17; e/ou ii) um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18;
40. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 39, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para CEA compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e/ou um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18;
41. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 35, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para ErbB2, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para ERBB2 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (e) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; e (f) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33;
42. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 35 ou 41, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para ERBB2, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o ERBB2 compreende: i) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 34; e/ou ii) um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 35;
43. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 42, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para ERBB2 compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e/ou um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35;
44. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 35, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para CD20, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para CD20 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (e) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; e (f) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44;
45. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 35 ou 44, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para CD20, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para CD20 compreende: i) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91,
92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; e/ou ii) um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46;
46. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 45, em que o sítio de ligação ao antígeno específico para CD20 compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e/ou um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46;
47. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 18 a 46, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende uma região Fc;
48. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 47, em que a região Fc é modificada para reduzir a função efetora;
49. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 48, em que a região Fc é modificada/manipulada por substituição de um ou mais dos resíduos 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 e/ou 329;
50. O agente de remoção para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos de 47 a 49, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende um anticorpo de comprimento total compreendendo uma primeira e segunda cadeia pesada de anticorpo e uma primeira e segunda cadeia leve de anticorpo, em que a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve são montadas para formarem um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno, e em que a segunda cadeia pesada e a segunda cadeia leve são montadas para formarem um sítio de ligação ao antígeno para o segundo antígeno, - em que tanto o primeiro quanto o segundo antígeno é o quelato Pb-DOTAM, e o outro antígeno é o antígeno alvo;
51. O agente de remoção para uso de acordo com o parágrafo 50, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende ainda uma porção de ligação ao antígeno adicional para o primeiro antígeno;
52. O agente de remoção para uso de acordo com o parágrafo 51, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende: - um anticorpo de comprimento total compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada de anticorpo e uma primeira e segunda cadeia leve de anticorpo, em que a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve se unem para formar um Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno, e em que a segunda cadeia pesada e a segunda cadeia leve se unem para formar um cross-Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o segundo antígeno; - e em que a cadeia pesada do primeiro ou do segundo anticorpo é fundida através de um ligante a um polipeptídeo compreendendo um domínio CH1 e VH, e o referido primeiro polipeptídeo é montado com um segundo polipeptídeo compreendendo um CL e VL, de modo que o primeiro e o segundo polipeptídeo se montam para formar um Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno;
53. O agente de remoção para uso de acordo com o parágrafo 52, em que o N-terminal da cadeia pesada do segundo anticorpo é fundido através de um ligante ao referido primeiro polipeptídeo;
54. O agente de remoção para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos de 47 a 49, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende: i) um anticorpo de comprimento total compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para um primeiro antígeno; e ii) pelo menos um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio variável de cadeia leve que juntos formam um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno, em que o primeiro ou o segundo antígeno é o quelato Pb-DOTAM e o outro é o antígeno alvo;
55. O agente de remoção para uso de acordo com o parágrafo 54, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende um anticorpo de comprimento total que compreende um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno, em que o N- ou C-terminal de uma das cadeias pesadas está ligado por um ligante polipeptídico a um primeiro polipeptídeo e em que o primeiro polipeptídeo se associa com um segundo polipeptídeo para formar um Fab ou um cross-Fab compreendendo um sítio de ligação para o segundo antígeno;
56. O agente de remoção para uso de acordo com o parágrafo 55, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende: i) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VH e um domínio CH1, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio a VL e CL; ou ii) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VL e um domínio CH1, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio CL e VH; ou iii) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VH e um domínio CL, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio VL e CH1; - de modo que o primeiro e o segundo polipeptídeo juntos formam um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno;
57. O agente de remoção para uso de acordo com o parágrafo 56, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende um anticorpo de comprimento total compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno, em que o C-terminal de uma das cadeias pesadas está ligado através de um ligante polipeptídico a um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VL e um domínio CH1, que está associado a um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio VH e CL;
58. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 44, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente a um primeiro antígeno e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo; b) um polipeptídeo consistindo em; i) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH); ou ii) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); ou iii) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL), em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VH através de um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; c) um polipeptídeo consistindo em: i) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL); ou ii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; - e em que o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo do peptídeo em (b), e o domínio variável de cadeia leve do anticorpo do peptídeo sob (c) em conjunto formam um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno, - em que tanto o primeiro quanto o segundo antígeno é o quelato Pb-DOTAM, e o outro antígeno é o antígeno alvo;
59. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 50 a 58, em que o primeiro antígeno é o antígeno alvo e o segundo antígeno é o quelato Pb-DOTAM;
60. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 59, em que o o primeiro antígeno é CEA;
61. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 60, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente ao CEA e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo; - em que as cadeias pesadas têm pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 1- 450 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 22 ou 23; - e em que as cadeias leves possuem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21; e/ou b) um polipeptídeo consistindo:
i) em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7; ou ii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID
NO: 7 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); ou iii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID
NO: 7 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL);
em que o referido polipeptídeo está fundido no N-terminal do domínio VH por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total (completo); e/ou c) um polipeptídeo consistindo:
i) em um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL)
possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8; ou ii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo
(VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:
8 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo
(VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1);
- em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; - em que o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo do peptídeo em (b) e o domínio variável de cadeia leve de anticorpo do peptídeo em (c) formam juntos um sítio de ligação ao antígeno para o quelato Pb- DOTAM;
62. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 60, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente ao CEA e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo; - em que as cadeias pesadas têm pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 1 a 450 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 19 ou 20; - e em que as cadeias leves possuem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21; b) um polipeptídeo consistindo: i) em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9; ou ii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); ou iii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VH através de um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; c) um polipeptídeo consistindo: i) em um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10; ou ii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; - e em que o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo do peptídeo em (b) e o domínio variável de cadeia leve de anticorpo do peptídeo em (c) formam juntos um sítio de ligação ao antígeno para o quelato Pb- DOTAM.
63. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 62, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende: i) uma primeira cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 22, ii) uma segunda cadeia pesada possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 23, iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21;
64. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 62, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende: i) uma primeira cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ii) uma segunda cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;
65. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 62, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende: i) uma primeira cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 19, ii) uma segunda cadeia pesada possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 20, iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21; e
66. O agente de remoção para uso ou o método de acordo com o parágrafo 62, em que o anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreende: i) uma primeira cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; ii) uma segunda cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

Claims (57)

REIVINDICAÇÕES
1. ANTICORPO, compreendendo um sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato DOTAM-chumbo (Pb), caracterizado pelo referido sítio de ligação ao antígeno compreender pelo menos: a) CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2), ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 2, em que essas substituições não incluem Phe50, Asp56 e Tyr58, e opcionalmente também não incluem Gly52 e/ou Arg54; b) CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3), ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 3, em que essas substituições não incluem Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, e opcionalmente também não incluem Ala100C, Tyr100D, e/ou Pro100E e/ou opcionalmente também não incluem Tyr99; c) CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4) ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 4, em que essas substituições não incluem Tyr28 e Asp32; d) CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6) ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 6, em que essas substituições não incluem Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c e Tyr96, - em que a numeração está de acordo com a numeração de Kabat.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda uma CDR1 de cadeia pesada e uma CDR2 de cadeia leve.
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender: i) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1) ou uma variante da mesma possuindo até 1, 2, ou 3 substituições na SEQ ID NO: 1, opcionalmente substituições conservadoras; e/ou ii) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QASKLAS (SEQ ID NO: 5) ou uma variante da mesma possuindo pelo menos 1, 2 ou 3 substituições na SEQ ID NO: 5, opcionalmente substituições conservadoras.
4. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno compreender pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas a partir de: a) CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1); b) CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos FIGSRGDTYYASWAKWG (SEQ ID NO: 2); c) CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3); d) CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4); e) CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QASKLAS (SEQ ID NO: 5); e f) CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6).
5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se ligar ao mesmo epítopo, ou a um epítopo de sobreposição, do quelato Pb-DOTAM como: i) um anticorpo possuindo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou ii) um anticorpo possuindo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
6. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser um anticorpo humano, quimérico ou humanizado.
7. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9, ou uma variante desta, compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9.
8. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10, ou uma variante desta, compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 ou 10.
9. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 7 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 8.
10. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 9 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 10.
11. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno ligar- se ao quelato Pb-DOTAM com um valor Kd de 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM ou menos.
12. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno ligar- se ao quelato Pb-DOTAM e a um quelato Bi-DOTAM, e em que a relação de valores Kd para o quelato Bi-DOTAM/quelato Pb-DOTAM está na faixa de 0,1- 10 ou 1-10.
13. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser um anticorpo completo, ou fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em um Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab’)2, diacorpo, anticorpo linear ou molécula de anticorpo de cadeia única.
14. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo estar acoplado a uma porção que se liga especificamente a um antígeno alvo.
15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo antígeno-alvo ser um antígeno específico de tumor.
16. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado por ser um anticorpo multiespecífico ou biespecífico, opcionalmente um anticorpo multiespecífico ou anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 51.
17. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico caracterizado por compreender pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para chumbo quelatado por DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno para um antígeno alvo.
18. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM ser conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12.
19. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo antígeno alvo ser um antígeno específico de tumor.
20. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo antígeno específico de tumor ser selecionado a partir do grupo que consiste em CEA, HER2 e CD20.
21. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo antígeno específico de tumor ser o antígeno carcinoembrionário (CEA).
22. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 21, caracterizado por compreender pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o CEA, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o CEA compreende uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma, duas ou três CDRs de cadeia pesada: em que:
d) a CDR1 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e) a CDR2 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; f) a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; - e/ou o sítio de ligação ao antígeno específico para o CEA compreende uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, duas ou três CDRs de cadeia leve, em que: a) a CDR1 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14; b) a CDR2 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15; e c) a CDR3 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 16.
23. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno para o CEA compreender pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis (ou seja, todas) as CDRs selecionadas a partir da: a) CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; b) CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; c) CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14; e) CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e f) CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
24. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 23, caracterizado por compreender pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o CEA, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para o CEA compreende: i) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17; e/ou ii) um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18.
25. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno específico para CEA compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e/ou um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
26. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 20, caracterizado pelo anticorpos multiespecíficos ou biespecífico compreenderem pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para ErbB2, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para ERBB2 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (e) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; e (f) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
27. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 20 ou 26, caracterizado pelo anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreender pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM e, pelo menos, um sítio de ligação ao antígeno específico para ERBB2, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para ERBB2 compreende: i) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 34; e/ou ii) um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 35.
28. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno específico para ERBB2 compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e/ou um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
29. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 20, caracterizado pelo anticorpos multiespecíficos ou biespecífico compreenderem pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um quelato Pb-DOTAM e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para CD20, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para CD20 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas a partir de (a) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (b) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (c) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (d) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (e) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; e (f) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
30. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 20 ou 29, caracterizado pelo anticorpo multiespecífico ou biespecífico compreender pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para o quelato Pb-DOTAM e, pelo menos, um sítio de ligação ao antígeno específico para CD20, e em que o sítio de ligação ao antígeno específico para CD20 compreende: i) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; e/ou ii) um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, ou uma variante da mesma compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46.
31. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo sítio de ligação ao antígeno específico para CD20 compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e/ou um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.
32. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 31, caracterizado por compreender uma região Fc.
33. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela região Fc ser modificada para reduzir a função efetora.
34. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pela região Fc ter substituição em um ou mais dos resíduos 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 e/ou 329 da região Fc.
35. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 32 a 34, caracterizado por compreender um anticorpo um anticorpo de comprimento total (completo) compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada de anticorpo e uma primeira e segunda cadeia leve de anticorpo, em que a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve são montadas para formarem um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno, e em que a segunda cadeia pesada e a segunda cadeia leve são montadas para formarem um sítio de ligação ao antígeno para o segundo antígeno, e - em que tanto o primeiro quanto o segundo antígeno é o quelato Pb-DOTAM, e o outro antígeno é o antígeno alvo.
36. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por compreender ainda uma porção de ligação ao antígeno adicional para o primeiro antígeno.
37. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por compreender: - um anticorpo de comprimento total compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada de anticorpo e uma primeira e segunda cadeia leve de anticorpo, em que a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve se unem para formar um Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno, e em que a segunda cadeia pesada e a segunda cadeia leve se unem para formar um cross-Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o segundo antígeno, e - em que a cadeia pesada do primeiro ou do segundo anticorpo é fundida através de um ligante a um polipeptídeo compreendendo um domínio CH1 e VH, e o referido primeiro polipeptídeo é montado com um segundo polipeptídeo compreendendo um CL e VL, de modo que o primeiro e o segundo polipeptídeo se montam para formar um Fab compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno.
38. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo N-terminal da cadeia pesada do segundo anticorpo estar fundido por meio de um ligante ao referido primeiro polipeptídeo.
39. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 32 a 34, caracterizado por compreender; i) um anticorpo de comprimento total compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para um primeiro antígeno; e ii) pelo menos um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio variável de cadeia leve que, juntos, formam um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno, e - em que tanto o primeiro quanto o segundo antígeno é o quelato Pb-DOTAM, e o outro antígeno é o antígeno alvo.
40. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por compreender um anticorpo de comprimento total compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno, em que o N- ou C-terminal de uma das cadeias pesadas está ligado por um ligante polipeptídico a um primeiro polipeptídeo e em que o primeiro polipeptídeo se associa a um segundo polipeptídeo para formar um Fab ou um cross-Fab compreendendo um sítio de ligação para o segundo antígeno.
41. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por compreender: i) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VH e um domínio CH1, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio a VL e CL; ou ii) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VL e um domínio CH1, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio CL e VH; ou iii) um primeiro polipeptídeo consistindo em um domínio VH e um domínio CL, que está associado com um segundo polipeptídeo consistindo em um domínio VL e CH1; e - de modo que o primeiro e o segundo polipeptídeo juntos formam um sítio de ligação ao antígeno para o segundo antígeno.
42. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por compreender um anticorpo de comprimento total compreendendo um sítio de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno, em que o C-terminal de uma das cadeias pesadas está ligado por meio de um ligante polipeptídico a um primeiro polipeptídeo que consiste em um VL e um domínio CH1 que está associado a um segundo polipeptídeo que consiste em um domínio VH e CL.
43. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por compreender: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente a um primeiro antígeno e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo; b) um polipeptídeo consistindo em: i) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH); ou ii) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); ou iii) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VH através de um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; c) um polipeptídeo consistindo em: i) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL); ou ii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; - e em que o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo do peptídeo em (b), e o domínio variável de cadeia leve do anticorpo do peptídeo sob (c) em conjunto formam um sítio de ligação ao antígeno para um segundo antígeno, - em que tanto o primeiro quanto o segundo antígeno é o quelato Pb-DOTAM, e o outro antígeno é o antígeno alvo.
44. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações de 35 a 43, caracterizado pelo primeiro antígeno ser o antígeno alvo e o segundo antígeno ser o quelato Pb-DOTAM.
45. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo primeiro antígeno ser o CEA.
46. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por compreender: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente ao CEA e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo; - em que as cadeias pesadas têm pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 1-450 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 22 ou 23; - e em que as cadeias leves possuem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21; b) um polipeptídeo consistindo: i) em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7; ou ii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID
NO: 7 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); e iii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo
(VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID
NO: 7 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL);
- em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VH através de um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; e c) um polipeptídeo consistindo:
i) em um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL)
possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8; ou ii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo
(VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:
8 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo
(VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:
8 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1);
- em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total;
- em que o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo do peptídeo em (b) e o domínio variável de cadeia leve de anticorpo do peptídeo em (c) formam juntos um sítio de ligação ao antígeno para o quelato Pb- DOTAM.
47. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por compreender: a) um anticorpo de comprimento total que se liga especificamente ao CEA e consiste em duas cadeias pesadas de anticorpo e duas cadeias leves de anticorpo; - em que as cadeias pesadas têm pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 1 a 450 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 19 ou 20; - e em que as cadeias leves possuem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21; b) um polipeptídeo consistindo: i) em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9; ou ii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); ou iii) no referido domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VH através de um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; c) um polipeptídeo consistindo: i) em um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10; ou ii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL); ou iii) no referido domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo (CH1); - em que o referido polipeptídeo é fundido no N-terminal do domínio VL através de um ligante peptídico ao C-terminal da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento total; - e em que o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo do peptídeo em (b) e o domínio variável de cadeia leve de anticorpo do peptídeo em (c) formam juntos um sítio de ligação ao antígeno para o quelato Pb- DOTAM.
48. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por compreender: i) uma primeira cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 22, ii) uma segunda cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 23, e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21.
49. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por compreender: i) uma primeira cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ii) uma segunda cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
50. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por compreender: i) uma primeira cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 19, ii) uma segunda cadeia pesada possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 20, e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a cadeia leve de SEQ ID NO: 21.
51. ANTICORPO multiespecífico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por compreender: i) uma primeira cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; ii) uma segunda cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; e iii) duas cadeias leves de anticorpo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
52. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO ou um conjunto isolado de polinucleotídeos caracterizado por codificar um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
53. VETOR, caracterizado por compreender o polinucleotídeo ou o conjunto de polinucleotídeos de acordo com a reivindicação 52.
54. KIT OU COMPOSIÇÃO, caracterizado por compreender um conjunto de vetores, juntamente com um conjunto de polinucleotídeos de acordo com a reivindicação 52.
55. VETOR, de acordo com a reivindicação 53 ou o conjunto de vetores de acordo com a reivindicação 54, caracterizados por serem vetores de expressão.
56. CÉLULA HOSPEDEIRA procariótica ou eucariótica, caracterizada por compreender um polinucleotídeo isolado ou um conjunto isolado de polinucleotídeos de acordo com a reivindicação 52, opcionalmente o vetor de acordo com a reivindicação 53 ou o conjunto de vetores de acordo com a reivindicação 54.
57. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, de qualquer uma das reivindicações de 1 a 51, caracterizado por compreender a expressão do anticorpo a partir da célula hospedeira da reivindicação 56.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3070446A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Immutics, Inc. Treating cancer by blocking the interaction of tim-3 and its ligand
AR119382A1 (es) * 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
US12281166B2 (en) 2020-05-26 2025-04-22 Truebinding, Inc. Methods of treating inflammatory diseases by blocking Galectin-3
PH12023550019A1 (en) 2020-07-10 2024-03-11 Hoffmann La Roche Antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
KR20230131204A (ko) 2021-01-12 2023-09-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 암 세포에 결합하여 방사성핵종을 상기 세포에 표적화하는분할 항체
WO2022152701A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy
CA3238399A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Torben LUND-HANSEN Scfv and antibodies with reduced multimerisation
IL320432A (en) 2022-11-08 2025-06-01 Y Mabs Therapeutics Inc Bispecific antibody compounds

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HK1232127A1 (zh) * 2014-04-11 2018-01-05 Medimmune, Llc 雙特異性her2抗體
US10736937B2 (en) 2014-12-23 2020-08-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of bacterial superinfections post-influenza
ES2856457T3 (es) * 2015-02-05 2021-09-27 Molecular Templates Inc Moléculas de unión a CD20 multivalentes que comprenden regiones efectoras de una subunidad de toxina shiga y composiciones enriquecidas de estas
US10988534B2 (en) * 2015-02-09 2021-04-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Multi-specific antibodies with affinity for human A33 antigen and DOTA metal complex and uses thereof
BR112018000835A2 (pt) * 2015-10-02 2018-09-11 Hoffmann La Roche molécula, um ou mais polinucleotídeos, um ou mais vetores, célula, método de produção da molécula, composição, uso da molécula, método de tratamento de uma doença e método para induzir a lise de uma célula-alvo
EP3243836A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
JP7582867B2 (ja) 2018-04-16 2024-11-13 オラノ メド エスアエス キレート化された放射性核種に対する抗体および除去剤

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