JP2021520832A - キレート化された放射性核種に対する抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
a)重鎖CDR1がアミノ酸配列GFSLSTYSMS(配列番号1)を含む;
b)重鎖CDR2がアミノ酸配列FIGSRGDTYYASWAKG(配列番号2)を含む;
c)重鎖CDR3がアミノ酸配列ERDPYGGGAYPPHL(配列番号3)を含む;
ならびに/または抗原結合部位が、少なくとも1、2もしくは3つの軽鎖CDR配列を含む軽鎖を含み:
d)軽鎖CDR1がアミノ酸配列QSSHSVYSDNDLA(配列番号4)を含む;
e)軽鎖CDR2がアミノ酸配列QASKLAS(配列番号5)を含む;
f)軽鎖CDR3がアミノ酸配列LGGYDDESDTYG(配列番号6)を含む、抗体を提供する。
a)アミノ酸配列FIGSRGDTYYASWAKG(配列番号2)を含む重鎖CDR2、または配列番号2中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がPhe50、Asp56、および/Tyr58を含まず、必要に応じて、Gly52および/もしくはArg54も含まない、その変異体;
b)アミノ酸配列ERDPYGGGAYPPHL(配列番号3)を含む重鎖CDR3、または配列番号3中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がGlu95、Arg96、Asp97、Pro98を含まず、必要に応じて、Ala100C、Tyr100D、および/もしくはPro100Eも含まない、ならびに/または必要に応じて、Tyr99も含まない、その変異体;
c)アミノ酸配列QSSHSVYSDNDLA(配列番号4)を含む軽鎖CDR1、または配列番号4中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がTyr28およびAsp32を含まない、その変異体;
d)アミノ酸配列LGGYDDESDTYG(配列番号6)を含む軽鎖CDR3、または配列番号6中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がGly91、Tyr92、Asp93、Thr95cおよびTyr96を含まない、その変異体
を含む、抗体を提供する。
i)アミノ酸配列GFSLSTYSMS(配列番号1)を含む重鎖CDR1または配列番号1中に1、2、もしくは3個までの置換を有するその変異体;
ii)アミノ酸配列QASKLAS(配列番号5)を含む軽鎖CDR2または配列番号5中に少なくとも1、2、もしくは3個の置換を有し、必要に応じて、Gln50を含まない、その変異体
である重鎖CDR1と軽鎖CDR2とを含む。
i)配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体;または
i)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体
と同じエピトープ、または重複するエピトープに結合してもよい。
a)アミノ酸配列GFSLSTYSMS(配列番号1)を含む重鎖CDR1;
b)アミノ酸配列FIGSRGDTYYASWAKG(配列番号2)を含む重鎖CDR2;
c)アミノ酸配列ERDPYGGGAYPPHL(配列番号3)を含む重鎖CDR3;
d)アミノ酸配列QSSHSVYSDNDLA(配列番号4)を含む軽鎖CDR1;
e)アミノ酸配列QASKLAS(配列番号5)を含む軽鎖CDR2;
f)アミノ酸配列LGGYDDESDTYG(配列番号6)を含む軽鎖CDR3
から選択される少なくとも1、2、3、4、5、または6つのCDRを含む。
d)重鎖CDR1が、配列番号11のアミノ酸配列を含む;
e)重鎖CDR2が、配列番号12のアミノ酸配列を含む;
f)重鎖CDR3が、配列番号13のアミノ酸配列を含む、
少なくとも1、2、もしくは3つの重鎖CDRを含んでもよく;
および/またはCEAに特異的な抗原結合部位は、
a)軽鎖CDR1が、配列番号14のアミノ酸配列を含む;
b)軽鎖CDR2が、配列番号15のアミノ酸配列を含む;
c)軽鎖CDR3が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
少なくとも1、2、もしくは3つの軽鎖CDRを含んでもよい。
a)配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;
b)配列番号12のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;
c)配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;
d)配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;
e)配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;
f)配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
から選択される少なくとも1、2、3、4、5、または6つ(すなわち、全部)のCDRを含んでもよい。
i)VLおよびCLドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VHドメインおよびCH1ドメインからなる第1のポリペプチド;または
ii)VHおよびCLドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VLドメインおよびCH1ドメインからなる第1のポリペプチド;または
iii)VLおよびCH1ドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VHドメインおよびCLドメインからなる第1のポリペプチド
を含んでもよい。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体;
b)
i)抗体重鎖可変ドメイン(VH);または
ii)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1);または
iii)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;
c)
i)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);または
ii)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);または
iii)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチド
を含み;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になって第2の抗原に対する抗原結合部位を形成する、二重特異性抗体であってもよい。
i)a)の下の完全長抗体の第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸は、リジン(K)、アルギニン(R)もしくはヒスチジン(H)(カバットによる番号付け)によって独立して(1つの好ましい実施形態では、リジン(K)もしくはアルギニン(R)によって独立して)置換され、a)の下の第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸もしくは213位のアミノ酸は、グルタミン酸(E)もしくはアスパラギン酸(D)(カバットのEUインデックスによる番号付け)によって独立して置換される;または
ii)b)の下の第2の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸は、リジン(K)、アルギニン(R)もしくはヒスチジン(H)(カバットによる番号付け)によって独立して(1つの好ましい実施形態では、リジン(K)もしくはアルギニン(R)によって独立して)置換され、b)の下の第2の重鎖の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸もしくは213位のアミノ酸は、グルタミン酸(E)もしくはアスパラギン酸(D)(カバットのEUインデックスによる番号付け)によって独立して置換される。
a)CEAに特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号22もしくは23のアミノ酸1〜450(両端の値を含み、連続する番号付けに基づく)の重鎖に対する(すなわち、リンカーの前の配列の部分に対する)少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有し;
軽鎖が配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する、完全長抗体;ならびに/または
b)
i)配列番号7の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン(VH);もしくは
ii)配列番号7の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1);もしくは
iii)配列番号7の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;ならびに/または
c)
i)配列番号8の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン(VL);もしくは
ii)配列番号8の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);もしくは
iii)配列番号8の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチドを含んでもよく;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインは、一緒になってPb−DOTAMキレートに対する抗原結合部位を形成する。
a)CEAに特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号19もしくは20のアミノ酸1〜450(両端の値を含み、連続する番号付けに基づく:すなわち、リンカーの前の配列)の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有し;
軽鎖が配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する、完全長抗体;
b)
i)配列番号9の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン(VH);もしくは
ii)配列番号9の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1);もしくは
iii)配列番号9の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;
c)
i)配列番号10の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン(VL);もしくは
ii)配列番号10の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);もしくは
iii)配列番号10の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチド
を含んでもよく;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインは、一緒になってPb−DOTAMキレートに対する抗原結合部位を形成する。
i)配列番号22の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する第1の重鎖、
ii)配列番号23の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する第2の重鎖、
iii)配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する2つの抗体軽鎖
を含む。
i)配列番号22のアミノ酸配列を有する第1の重鎖;
ii)配列番号23のアミノ酸配列を有する第2の重鎖;および
iii)配列番号21のアミノ酸配列を有する2つの抗体軽鎖
を含む、PRIT−0213と本明細書で呼ばれる分子である。
i)配列番号19の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する第1の重鎖、
ii)配列番号20の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する第2の重鎖、
iii)配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する2つの抗体軽鎖
を含む。
i)配列番号19のアミノ酸配列を有する第1の重鎖;
ii)配列番号20のアミノ酸配列を有する第2の重鎖;および
iii)配列番号21のアミノ酸配列を有する2つの抗体軽鎖
を含む、PRIT−0214と本明細書で呼ばれる分子である。
a)ERBB2に特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号36もしくは37のアミノ酸1〜449(両端の値を含み、連続する番号付けに基づく)の重鎖に対する(すなわち、リンカーの前の配列の部分に対する)少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有し;
軽鎖が配列番号38の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する、完全長抗体;ならびに/または
b)
i)配列番号7もしくは配列番号9(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号7)の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン(VH);もしくは
ii)配列番号7もしくは配列番号9(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号7)の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1);もしくは
iii)配列番号7もしくは配列番号9(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号7)の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;ならびに/または
c)
i)配列番号8もしくは配列番号10(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号8)の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン(VL);もしくは
ii)配列番号8もしくは配列番号10(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号8)の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);もしくは
iii)配列番号8もしくは配列番号10(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号8)の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチドを含んでもよく;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインは、一緒になってPb−DOTAMキレートに対する抗原結合部位を形成する。
i)配列番号36の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する第1の重鎖、
ii)配列番号37の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する第2の重鎖、
iii)配列番号38の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する2つの抗体軽鎖
を含む。
i)配列番号36のアミノ酸配列を有する第1の重鎖;
ii)配列番号37のアミノ酸配列を有する第2の重鎖;および
iii)配列番号38のアミノ酸配列を有する2つの抗体軽鎖
を含む、P1AD9827と本明細書で呼ばれる分子である。
a)CD20に特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号47もしくは48のアミノ酸1〜448(両端の値を含み、連続する番号付けに基づく)の重鎖に対する(すなわち、リンカーの前の配列の部分に対する)少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有し;
軽鎖が配列番号49の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する、完全長抗体;ならびに/または
b)
i)配列番号7もしくは配列番号9(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号7)の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン(VH);もしくは
ii)配列番号7もしくは配列番号9(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号7)の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)、
iii)配列番号7もしくは配列番号9(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号7)の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;ならびに/または
c)
i)配列番号8もしくは配列番号10(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号8)の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン(VL);もしくは
ii)配列番号8もしくは配列番号10(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号8)の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン;
iii)配列番号8もしくは配列番号10(一部の実施形態では、好ましくは、配列番号8)の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチド
を含んでもよく;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインは、一緒になってPb−DOTAMキレートに対する抗原結合部位を形成する。
i)配列番号47の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する第1の重鎖、
ii)配列番号48の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する第2の重鎖、
iii)配列番号49の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する2つの抗体軽鎖
を含む。
i)配列番号47のアミノ酸配列を有する第1の重鎖;
ii)配列番号48のアミノ酸配列を有する第2の重鎖;および
iii)配列番号49のアミノ酸配列を有する2つの抗体軽鎖
を含む、P1AD9826と本明細書で呼ばれる分子である。
i)対象に、本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体であって、標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、前記抗体を投与すること;および
ii)続いて、DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種であって、標的細胞の表面に局在化された抗体に結合する、DOTAMまたはその前記機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種を個体に投与すること
を含んでもよい。
iii)DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種が局在化された組織または臓器をイメージングすること
をさらに含んでもよい。
i)対象に、本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体であって、標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、前記抗体を投与すること;および
ii)続いて、DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種であって、細胞の表面に局在化された抗体に結合する、DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種を投与すること
を含んでもよい。
i)薬学的に許容される添加物;
ii)DOTAMもしくはその機能的変異体によってキレート化されたPb放射性核種;
iii)本明細書に記載の除去剤;
iv)1つもしくは複数のさらなる化学療法剤;および/または
v)1つもしくは複数の放射線増感剤
のうちの1、2、3、4つもしくは全部を含むキットに関する。
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワークまたは重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含んでもよいか、またはそれはアミノ酸配列変化を含有してもよい。一部の実施形態では、アミノ酸変化の数は、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、または2個以下である。一部の実施形態では、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)に存在する超可変ループ(ChothiaおよびLesk、J.Mol.Biol.196:901〜917頁(1987));
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)、および95〜102(H3)に存在するCDR(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Puclic Health Service、National Institutes of Health、Bethesda MD(1991));
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、および93〜101(H3)に存在する抗原接触(MacCallumら、J.Mol.Biol.262:732〜745頁(1996));ならびに
(d)HVRアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)、および94〜102(H3)
を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せを含む。
画分X/Yの100倍
[式中、Xは、AとBとの配列アラインメントプログラムALIGN−2のアラインメントにおける、そのプログラムによる同一の一致としてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である]。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対するアミノ酸配列同一性%は、BのAに対するアミノ酸配列同一性%と等しくないことが理解されるであろう。別途具体的に記述されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性%の値は、ALIGN−2コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されたように得られる。
の化合物、またはその薬学的に許容される塩
[式中、
RNは、H、C1〜6アルキル、C1〜6ハロアルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜7シクロアルキル、C3〜7シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキル、フェニル、フェニル−C1〜4−アルキル、C1〜7ヘテロアリール、およびC1〜7ヘテロアリール−C1〜4−アルキルであり;C1〜6アルキル、C1〜6ハロアルキル、C2〜6アルケニル、およびC2〜6アルキニルは、1、2、3、または4個の独立して選択されるRW基でそれぞれ置換されていてもよく;前記C3〜7シクロアルキル、C3〜7シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキル、フェニル、フェニル−C1〜4−アルキル、C1〜7ヘテロアリール、およびC1〜7ヘテロアリール−C1〜4−アルキルは、1、2、3、または4個の独立して選択されるRX基でそれぞれ置換されていてもよく;
L1は、独立してC1〜6アルキレン、C1〜6アルケニレン、またはC1〜6アルキニレンであり、それぞれ、1、2または3個の独立して選択されるR1基で置換されていてもよく;
L2は、C2〜4直鎖アルキレンであり、独立して選択されるR1基で置換されていてもよく;C1〜4アルキルおよび/またはC1〜4ハロアルキルから独立して選択される1、2、3または4個の基で置換されていてもよく;
R1は、D1−D2−D3、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、C1〜6アルコキシ、C1〜6ハロアルコキシ、C1〜6アルキルチオ、C1〜6アルキルスルフィニル、C1〜6アルキルスルホニル、アミノ、C1〜6アルキルアミノ、ジ−C1〜6アルキルアミノ、C1〜4アルキルカルボニル、カルボキシ、C1〜6アルコキシカルボニル、C1〜6アルキルカルボニルアミノ、ジ−C1〜6アルキルカルボニルアミノ、C1〜6アルコキシカルボニルアミノ、C1〜6アルコキシカルボニル−(C1〜6アルキル)アミノ、カルバミル、C1〜6アルキルカルバミル、およびジ−C1〜6アルキルカルバミルから独立して選択され、
D1はそれぞれ、C6〜10アリール−C1〜4アルキル、C1〜9ヘテロアリール−C1〜4アルキル、C3〜10シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜9ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキル、C1〜8アルキレン、C1〜8アルケニレン、およびC1〜8アルキニレンから独立して選択され;前記C1〜8アルキレン、C1〜8アルケニレン、およびC1〜8アルキニレンは、1、2、3または4個の独立して選択されるR4基で置換されていてもよく;前記C6〜10アリール−C1〜4アルキル、C1〜9ヘテロアリール−C1〜4アルキル、C3〜10シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜9ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキルは、1、2、3、または4個の独立して選択されるR5基でそれぞれ置換されていてもよく;
D2はそれぞれ、独立して存在しないか、またはC1〜20直鎖アルキレンであり、前記C1〜20直鎖アルキレンの1〜6個の非隣接メチレン基は、独立して選択される−D4−部分でそれぞれ置き換えられていてもよいが、但し、前記C1〜20直鎖アルキレン中の少なくとも1個のメチレン単位は、必要に応じて−D4−部分で置き換えられていないことを条件とし;前記C1〜20直鎖アルキレンは、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、C1〜4アルキル、C1〜4ハロアルキル、C1〜4アルコキシ、C1〜4ハロアルコキシ、アミノ、C1〜4アルキルアミノ、ジ−C1〜4アルキルアミノ、C1〜4アルキルカルボニル、カルボキシ、C1〜4アルコキシカルボニル、C1〜4アルキルカルボニルアミノ、ジ−C1〜4アルキルカルボニルアミノ、C1〜4アルコキシカルボニルアミノ、C1〜4アルコキシカルボニル−(C1〜4アルキル)アミノ、カルバミル、C1〜4アルキルカルバミル、およびジ−C1〜4アルキルカルバミルから独立して選択される1つまたは複数の基で置換されていてもよく;
D3はそれぞれ、H、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、C1〜6アルキル、C1〜6ハロアルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜14シクロアルキル、C3〜14シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜14ヘテロシクロアルキル、C2〜14ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキル、C6〜14アリール、C6〜14アリール−C1〜4アルキル、C1〜13ヘテロアリール、C1〜13ヘテロアリール−C1〜4アルキルから独立して選択され;前記C1〜6アルキル、C1〜6ハロアルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニルは、1、2、3、または4個の独立して選択されるR6基でそれぞれ置換されていてもよく;前記C3〜14シクロアルキル、C3〜14シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜14ヘテロシクロアルキル、C2〜14ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキル、C6〜14アリール、C6〜14アリール−C1〜4アルキル、C1〜13ヘテロアリール、C1〜13ヘテロアリール−C1〜4アルキルは、1、2、3または4個の独立して選択されるR7基でそれぞれ置換されていてもよく;
D4はそれぞれ、−O−、−S−、−NRaC(=O)−、−NRaC(=S)−、−NRbC(=O)NRc−−NRbC(=S)NRc−、−S(=O)−、−S(=O)2−、−S(=O)NRa−、−C(=O)−、−C(=S)−、−C(=O)O−、−OC(=O)NRa−、−OC(=S)NRa−、−NRa−、−NRbS(=O)NRc−、およびNRbS(=O)2NRO−から独立して選択され;
R4およびR6はそれぞれ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、C1〜4アルコキシ、C1〜4ハロアルコキシ、C1〜4アルキルチオ、C1〜4アルキルスルフィニル、C1〜4アルキルスルホニル、アミノ、C1〜4アルキルアミノ、ジ−C1〜4アルキルアミノ、C1〜4アルキルカルボニル、カルボキシ、C1〜4アルコキシカルボニル、C1〜4アルキルカルボニルアミノ、ジ−C1〜4アルキルカルボニルアミノ、C1〜4アルコキシカルボニルアミノ、C1〜4アルコキシカルボニル−(C1〜4アルキル)アミノ、カルバミル、C1〜4アルキルカルバミル、およびジ−C1〜4アルキルカルバミルから独立して選択され;
R5はそれぞれ、ハロゲン、シアノ、シアネート、イソチオシアネート、ニトロ、ヒドロキシル、C1〜4アルキル、C2〜4アルケニル、C2〜4アルキニル、C1〜4アルコキシ、C1〜4ハロアルコキシ、C1〜4アルキルチオ、C1〜4アルキルスルフィニル、C1〜4アルキルスルホニル、アミノ、C1〜4アルキルアミノ、ジ−C1〜4アルキルアミノ、C1〜4アルキルカルボニル、カルボキシ、C1〜4アルコキシカルボニル、C1〜4アルキルカルボニルアミノ、ジ−C1〜4アルキルカルボニルアミノ、C1〜4アルコキシカルボニルアミノ、C1〜4アルコキシカルボニル−(C1〜4アルキル)アミノ、カルバミル、C1〜4アルキルカルバミル、およびジ−C1〜4アルキルカルバミルから独立して選択され;
R7はそれぞれ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜7シクロアルキル、C3〜7シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキル、フェニル、フェニル−C1〜4アルキル、C1〜7ヘテロアリール、C1〜7ヘテロアリール−C1〜4アルキル、−ORO、−SRO、−S(=O)RP、−S(=O)2RP、−S(=O)NRsRt、−C(=O)RP、−C(=O)ORP、−C(=O)NRsRt、−OC(=O)RP、−OC(=O)NRsRt、−NRsRt、−NRqC(=O)Rr、−NRqC(=O)ORr、−NRqC(=O)NRr、−NRqS(=O)2Rr、およびNRPS(=O)2NRsRtから独立して選択され;前記C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニルは、1、2、3、または4個の独立して選択されるR’基でそれぞれ置換されていてもよく;前記C3〜7シクロアルキル、C3〜7シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキル、フェニル、フェニル−C1〜4アルキル、C1〜7ヘテロアリール、C1〜7ヘテロアリール−C1〜4アルキルは、1、2、3、または4個の独立して選択されるR’’基でそれぞれ置換されていてもよく;
Ra、Rb、およびRcはそれぞれ、H、C1〜6アルキル、C1〜6ハロアルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜7シクロアルキル、C3〜7シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキル、フェニル、フェニル−C1〜4アルキル、C1〜7ヘテロアリール、C1〜7ヘテロアリール−C1〜4アルキルから独立して選択され;前記C1〜6アルキル、C1〜6ハロアルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニルは、1、2、3、または4個の独立して選択されるRW基でそれぞれ置換されていてもよく;前記C3〜7シクロアルキル、C3〜7シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキル、フェニル、フェニル−C1〜4アルキル、C1〜7ヘテロアリール、C1〜7ヘテロアリール−C1〜4アルキルは、1、2、3、または4個の独立して選択されるRX基でそれぞれ置換されていてもよく;
RO、Rp、Rq、Rr、RsおよびRtはそれぞれ、H、C1〜6アルキル、C1〜6ハロアルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜7シクロアルキル、C3〜7シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキル、フェニル、フェニル−C1〜4アルキル、C1〜7ヘテロアリール、C1〜7ヘテロアリール−C1〜4アルキルから独立して選択され;前記C1〜6アルキル、C1〜6ハロアルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニルは、1、2、3、または4個の独立して選択されるRy基でそれぞれ置換されていてもよく;前記C3〜7シクロアルキル、C3〜7シクロアルキル−C1〜4アルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル、C2〜7ヘテロシクロアルキル−C1〜4アルキル、フェニル、フェニル−C1〜4アルキル、C1〜7ヘテロアリール、C1〜7ヘテロアリール−C1〜4アルキルは、1、2、3、または4個の独立して選択されるRz基でそれぞれ置換されていてもよく;
R’、RwおよびRyはそれぞれ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、C1〜4アルコキシ、C1〜4ハロアルコキシ、アミノ、C1〜4アルキルアミノ、およびジ−C1〜4アルキルアミノから独立して選択され;
R’’、Rx、およびRzはそれぞれ、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、C1〜4アルキル、C1〜4ハロアルキル、C1〜4アルコキシ、C1〜4ハロアルコキシ、アミノ、C1〜4アルキルアミノ、およびジ−C1〜4アルキルアミノから独立して選択されるが;
但し、置換されていてもよい部分のそれぞれの原子の価数を超えないことを条件とする]
であってもよい。
[式中、Zはそれぞれ独立して、上で定義されたR1であり;p、q、r、およびsは、0、1または2であり;p+q+r+sは1以上である]
の化合物であってもよい。好ましくは、p、q、r、およびsは、0もしくは1である、および/またはp+q+r+sは1である。例えば、化合物は、p+q+r+s=1を有してもよく、Zはp−SCN−ベンジル部分であり、そのような化合物は、Macrocyclics,Inc.(Plano、Texas)から市販されている。
組成物および方法
抗体
一態様では、本発明は、部分的には、Pb−DOTAM(すなわち、本明細書では「Pb−SOTAMキレート」とも呼ばれる、Pbと複合体化したDOTAMを含むキレート)に特異的に結合する抗体の提供に基づく。
・Pb−DOTAMおよびBi−DOTAMに特異的に結合する;
・Cu−DOTAMなどの他のキレート化された金属と比較して、Pb−DOTAMに対して選択的である;
・非常に高い親和性でPb−DOTAMに結合する;
・本明細書に記載の抗体、例えば、PRIT−0213もしくはPRIT−0214と同じPb−DOTAM上のエピトープに結合する、および/または前記抗体と同じ接触残基を有する。
i)配列番号22のアミノ酸配列を有する第1の重鎖;
ii)配列番号23のアミノ酸配列を有する第2の重鎖;および
iii)配列番号21のアミノ酸配列を有する2つの抗体軽鎖
を有する、二重特異性抗体(本明細書ではPRIT−0213と呼ばれる)のものと等しいか、またはそれより高い親和性(例えば、親和性のKd値)で、Pb−DOTAMおよび/またはBi−DOTAMに結合することが好ましい。
i)配列番号19のアミノ酸配列を有する第1の重鎖;
ii)配列番号20のアミノ酸配列を有する第2の重鎖;および
iii)配列番号21のアミノ酸配列を有する2つの抗体軽鎖
を有する、二重特異性抗体(本明細書ではPRIT−0214と呼ばれる)のものと等しいか、またはそれより高い親和性(例えば、親和性のKD値)で、DOTAM−キレート化Pbおよび/またはDOTAM−キレート化Biに結合することが好ましい。
i)配列番号22のアミノ酸配列を有する第1の重鎖;
ii)配列番号23のアミノ酸配列を有する第2の重鎖;および
iii)配列番号21のアミノ酸配列を有する2つの抗体軽鎖
を有する、Fab PRIT−0213と同じか、または重複する、Pb−DOTAMキレート(Pb−DOTAM)のエピトープに結合する。
a)重鎖CDR2中に:Phe50、Asp56および/またはTyr58、必要に応じて、Gly52および/またはArg54も;
b)重鎖CDR3中に:Glu95、Arg96、Asp97、Pro98、Tyr99、Ala100Cおよび/またはTyr100D、必要に応じて、Pro100Eも;
c)軽鎖CDR1中に:Tyr28および/またはAsp32;
d)軽鎖CDR3中に:Gly91、Tyr92、Asp93、Thr95cおよび/またはTyr96;
e)軽鎖CDR2中に:必要に応じて、Gln50
を含んでもよい。
一部の態様では、DOTAM−キレート化されたPbに特異的に結合する抗体は、標的剤を生産するために細胞結合剤/ターゲティング部分にカップリングされている。必要に応じて、DOTAM−キレート化されたPbに特異的に結合する抗体は、上記の実施形態のいずれかに記載の抗体であってもよい。
上で考察されたように、ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。二重特異性抗体を、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
MRVLSGTSLM LCSLLLLLQA LCSPGLAPQS RGHLCRTRPT DLVFVVDSSR
SVRPVEFEKV KVFLSQVIES LDVGPNATRV GMVNYASTVK QEFSLRAHVS
KAALLQAVRR IQPLSTGTMT GLAIQFAITK AFGDAEGGRS RSPDISKVVI
VVTDGRPQDS VQDVSARARA SGVELFAIGV GSVDKATLRQ IASEPQDEHV
DYVESYSVIE KLSRKFQEAF CVVSDLCATG DHDCEQVCIS SPGSYTCACH
EGFTLNSDGK TCNVCSGGGG SSATDLVFLI DGSKSVRPEN FELVKKFISQ
IVDTLDVSDK LAQVGLVQYS SSVRQEFPLG RFHTKKDIKA AVRNMSYMEK
GTMTGAALKY LIDNSFTVSS GARPGAQKVG IVFTDGRSQD YINDAAKKAK
DLGFKMFAVG VGNAVEDELR EIASEPVAEH YFYTADFKTI NQIGKKLQKK
ICVEEDPCAC ESLVKFQAKV EGLLQALTRK LEAVSKRLAI LENTVV
三量体化ドメインの例示的配列(39aa)
CACESLVKFQ AKVEGLLQAL TRKLEAVSKR LAILENTVV
第1および第2の抗体重鎖と、第1および第2の抗体軽鎖とを含む完全長抗体であって、第1の重鎖と第1の軽鎖とが集合して、第1の抗原(例えば、腫瘍特異的抗原、例えば、CEA)に対する抗原結合部位を含むFabを形成し、第2の重鎖と第2の軽鎖とが集合して、第2の抗原(例えば、DOTAM−キレート化されたPb)に対する抗原結合部位を含む交差Fabを形成し(例えば、第2の重鎖がVHドメインの代わりにVLドメインを有し、第2の軽鎖がVLドメインの代わりにVHドメインを有する);
第1または第2の抗体重鎖のいずれかが、リンカーを介して、CH1およびVHドメインを含むポリペプチドに融合されており、第1および第2のポリペプチドが集合して、第1の抗原に対する抗原結合部位を含むFabを形成するように、前記第1のポリペプチドが、CLおよびVLを含む第2のポリペプチドと集合する、完全長抗体
を含む多価抗体が提供される。
i)VLおよびCLドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VHドメインおよびCH1ドメインからなる第1のポリペプチド;または
ii)VHおよびCLドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VLドメインおよびCH1ドメインからなる第1のポリペプチド;または
iii)VLおよびCH1ドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VHドメインおよびCLドメインからなる第1のポリペプチド
を含んでもよい。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体;
b)
i)抗体重鎖可変ドメイン(VH);または
ii)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1);または
iii)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;
c)
i)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);または
ii)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);または
iii)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチド
を含み;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になって第2の抗原に対する抗原結合部位を形成する、二重特異性抗体であってもよい。
i)重鎖可変ドメインの44位から軽鎖可変ドメインの100位、
ii)重鎖可変ドメインの105位から軽鎖可変ドメインの43位、または
iii)重鎖可変ドメインの101位から軽鎖可変ドメインの100位(カバットのEUインデックスによって常に番号付ける)
の間でのジスルフィド結合の導入によって安定化される。
a)三価の二重特異性抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の接触面に向かい会う一方の重鎖のCH3ドメインの元の接触面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられることによって、一方の重鎖のCH3ドメインの接触面内に、他方の重鎖のCH3ドメインの接触面内の空洞に位置し得る突起を生成するように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更されていること、
および
b)三価の二重特異性抗体内の第1のCH3ドメインの元の接触面に向かい会う第2のCH3ドメインの元の接触面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられることによって、第2のCH3ドメインの接触面内に、第1のCH3ドメインの接触面内の突起が位置し得る空洞を生成するように、他方の重鎖のCH3ドメインが変更されていること
を特徴とする。
i)重鎖可変ドメインの44位から軽鎖可変ドメインの100位、
ii)重鎖可変ドメインの105位から軽鎖可変ドメインの43位、または
iii)重鎖可変ドメインの101位から軽鎖可変ドメインの100位(カバットのEUインデックスによって常に番号付ける)
の間でのジスルフィド結合の導入が挙げられる。
本発明の多重特異性抗体は、1つ(または複数(2つを超える抗原結合Fab分子を含む分子の場合))のその結合アーム中にVH/VL交換を有するFabベースの二重/多重特異性抗原結合分子の生産において起こり得る、軽鎖と、非一致重鎖とのミスペアリング(Bence−Jones型副生成物)の低減において特に効率的である、そこに含まれるFab分子中にアミノ酸置換を含んでもよい(全体が参照により本明細書に組み込まれる、PCT公開番号WO2015/150447、特に、その中の実施例も参照されたい)。望ましくない副生成物、特に、その結合アームの一方において生じるBence Jones型副生成物と比較した、所望の多重特異性抗体の比率を、Fab分子のCH1およびCLドメイン中の特定のアミノ酸位置での反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入によって改善することができる(本明細書では「電荷修飾」と呼ばれることもある)。
a)第1の軽鎖の定常ドメインCLおよび第1の重鎖の定常ドメインCH1は、本明細書に記載の電荷変異置換を含み;
b)第2の軽鎖および第2の重鎖の軽鎖定常ドメインCLおよび重鎖定常ドメインCH1は互いに置き換えられる(かくして、公差Fabを形成する)。そのような配置の例は、P1AE1768について示される。
第1の抗原に特異的に結合し、2つの重鎖および2つの軽鎖からなる完全長抗体であって、完全長抗体の2つの重鎖定常ドメインCH1および2つの軽鎖定常ドメインCLが本明細書に記載の電荷修飾を含む、完全長抗体;ならびに
ポリペプチドリンカーを介してVLおよびCLドメインに連結されたVHおよびCH1ドメイン(VH−CH1−リンカー−VL−CL)を含むscFabであって、scFabが重鎖の一方のN末端に融合されており、scFabが第2の抗原に対する抗原結合部位を形成する、scFabを含む。そのような配置の例は、P1AE1770である。
重鎖の一方のC末端(例えば、そのCH3ドメインのC末端)が、ポリペプチドリンカーを介して、第1のポリペプチドに連結されており、第1のポリペプチドが、第2のポリペプチドと会合して、第2の抗原に対する結合部位を含む交差Fabを形成する、完全長抗体を含む。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、重鎖のCH1ドメインおよび軽鎖のCLドメインが本明細書に記載の電荷修飾を含む、完全長抗体;
b)
i)抗体重鎖可変ドメイン(VH);または
ii)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1);または
iii)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;
c)
i)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);または
ii)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);または
iii)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチド
を含み;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になって第2の抗原に対する抗原結合部位を形成する、二重特異性抗体であってもよい。そのような配置の例は、PRIT−213およびp1AE1766である。
i)上記実施形態によるアミノ酸置換は、b)の下の第2のFab分子の定常ドメインCLおよび定常ドメインCH1ではなく、第1のFab分子および第3のFab分子のそれぞれの定常ドメインCLおよび定常ドメインCH1において作製される;または
ii)上記実施形態によるアミノ酸置換は、第1のFab分子および第3のFab分子の定常ドメインCLおよび定常ドメインCH1ではなく、b)の下の第2のFab分子の定常ドメインCLおよび定常ドメインCH1において作製される。一部の実施形態では、電荷修飾は、従来の(非交換)Fabに存在する:かくして、例えば、第2の抗原結合部分が交差Fabである場合、選択肢(i)が好ましい。
第1および第2の抗体重鎖と、第1および第2の抗体軽鎖とを含む完全長抗体であって、第1の重鎖と第1の軽鎖とが集合して、第1の抗原(例えば、腫瘍特異的抗原、例えば、CEA)に対する抗原結合部位を含むFabを形成し、第2の重鎖と第2の軽鎖とが集合して、第2の抗原(例えば、DOTAM−キレート化されたPb)に対する抗原結合部位を含む交差Fabを形成し(例えば、第2の重鎖がVHドメインの代わりにVLドメインを有し、第2の軽鎖がVLドメインの代わりにVHドメインを有する);
第1または第2の抗体重鎖のいずれかが、リンカーを介して、CH1およびVHドメインを含むポリペプチドに融合されており、第1および第2のポリペプチドが集合して、第1の抗原に対する抗原結合部位を含むFabを形成するように、前記第1のポリペプチドが、CLおよびVLを含む第2のポリペプチドと集合し、
第1の重鎖のCH1ドメインおよび第1の軽鎖のCLドメインが、本明細書に記載の電荷修飾を含む、完全長抗体を含む。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、Pb−DOTAMとCEAの両方に結合する多重特異性、例えば、二重特異性抗体であることが好ましい場合がある。かくして、それらは、Pb−DOTAMキレートに対する抗原結合部位と、CEAに対する抗原結合部位とを含む。そのような実施形態では、Pb−DOTAMキレートに特異的な抗原結合部位は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるものであってもよい。この形式は、本明細書に記載の形式のいずれかであってもよい。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、Pb−DOTAMとERBB2の両方に結合する多重特異性、例えば、二重特異性抗体であることが好ましい場合がある。かくして、それらは、Pb−DOTAMキレートに対する抗原結合部位と、ERBB2に対する抗原結合部位とを含む。そのような実施形態では、Pb−DOTAMキレートに特異的な抗原結合部位は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるものであってもよい。この形式は、本明細書に記載の形式のいずれかであってもよい。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、Pb−DOTAMとCD20の両方に結合する多重特異性、例えば、二重特異性抗体であることが好ましい場合がある。かくして、それらは、Pb−DOTAMキレートに対する抗原結合部位と、CD20に対する抗原結合部位とを含む。そのような実施形態では、Pb−DOTAMキレートに特異的な抗原結合部位は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるものであってもよい。この形式は、本明細書に記載の形式のいずれかであってもよい。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合がある。抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって、抗体のアミノ酸配列変異体を調製することができる。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および/またはそれへの挿入、および/またはその置換が挙げられる。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有するという条件で、最終コンストラクトに到達するために、任意の組合せの欠失、挿入、および置換を作製することができる。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のための目的の部位としては、HVR(CDR)およびFRが挙げられる。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下で表1に示す。より実質的な変化は、「例示的な置換」の見出しの下で表1に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換を、目的の抗体に導入し、生成物を、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の低下、またはADCCもしくはCDCの改善についてスクリーニングすることができる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を与える残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体を変更して、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させる。1つまたは複数のグリコシル化部位が作出されるか、または除去されるように、アミノ酸配列を変更することによって、抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失を簡便に達成することができる。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸修飾を、本明細書に提供される抗体のFc領域中に導入することによって、Fc領域変異体を生成することができる。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域)を含んでもよい。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体をさらに修飾して、当業界で公知であり、容易に利用可能であるさらなる非タンパク質性部分を含有させることができる。抗体の誘導体化にとって好適な部分としては、限定されるものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸類(ホモポリマーまたはランダムコポリマー)、およびデキストランまたはポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー類、プロリプロピレン(prolypropylene)オキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにその混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分枝状または非分枝状であってもよい。抗体に結合したポリマーの数は変化してもよく、1つより多いポリマーが結合する場合、それらは同じか、または異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および/または型を、限定されるものではないが、改善しようとする抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下での治療において使用されるかどうかなどの考慮に基づいて決定することができる。
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されたような、組換え法および組成物を使用して、抗体を生産することができる。一実施形態では、本明細書に記載の抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/または抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードしてもよい。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。1つのそのような実施形態では、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、それを形質転換されている)。
本明細書で提供される抗体を、当業界で公知の様々なアッセイによって、その物理的/化学的特性および/または生物活性について同定、スクリーニング、または特性評価することができる。
一態様では、本発明の抗体は、例えば、ELISA、ウェスタンブロットなどの公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、1nM以下、500pM以下、200pM以下、100pM以下、50pM以下、20pM以下、10pM以下、5pM以下もしくは1pM以下の、またはそうでなければ本明細書に記述されるような解離定数(Kd)を有する。
上で考察された通り、本発明による多重特異性抗体は、放射性核種を標的に送達することが望ましい任意の治療にとって好適である。したがって、本発明は、治療方法における使用のための本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体などの標的化された抗体を提供する。より具体的には、プレターゲティングされた放射線免疫療法の方法における使用のための本明細書に記載の標的化された抗体(例えば、多重特異性または二重特異性抗体)が提供される。そのような実施形態では、キレート化されたPbは、好ましくは、212Pbである。
i)対象に、本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体であって、標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、前記抗体を投与すること;および
ii)続いて、DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種であって、細胞表面に局在化された抗体に結合する、DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種を個体に投与すること
を含んでもよい。
本明細書に記載の抗Pb−DOTAM抗体、例えば、多重特異性または二重特異性抗体の薬学的製剤を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有するそのような抗体と、1つまたは複数の任意選択の薬学的に許容される担体とを混合することによって調製する(Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol,A.(編)(1980))。薬学的に許容される担体は、一般的には、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して非毒性的であり、限定されるものではないが、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロライド;ベンザルコニウムクロライド;フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール;メチルもしくはプロピルパラベンなどのパラベン類;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類;ナトリウムなどの塩形成性対抗イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質複合体);および/またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)などのヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質薬分散剤をさらに含む。rHuPH20を含む、ある特定の例示的なsHASEGPおよび使用方法は、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。一態様では、sHASEGPを、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせる。
本発明は、対象に対して実行される診断方法における使用のための、標的抗体、例えば、本明細書に記載の多重特異性抗体をさらに提供する。診断方法は、例えば、増殖性疾患または感染症を有すると疑われる対象を診断するための、プレターゲティングされた放射線免疫イメージングの方法であってもよい。そのような実施形態では、キレート化されたPbは、好ましくは、203Pbである。
i)対象に、本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体であって、標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、前記抗体を投与すること;および
ii)続いて、DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種であって、細胞の表面に局在化された抗体に結合する、DOTAMまたはその前記機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種を個体に投与すること
を含んでもよい。
iii)DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種が局在化されるか、または局在化されると期待される組織または臓器をイメージングすること
をさらに含んでもよい。
i)標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体;および
ii)DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種であって、細胞の表面に局在化された抗体に結合する、DOTAMまたはその前記機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種
を個体に以前に投与された、対象の組織または臓器をイメージングすることを含んでもよい。
本発明のさらなる態様では、本発明者らは、新規除去剤を開発した。そのような除去剤を、本明細書に記載のような診断、イメージングまたは治療の方法のいずれかにおいて使用することができる。
デキストラン−(リンカー−(M−DOTAM))x
[式中、
デキストランは、デキストランまたはその誘導体であり;
リンカーは、連結部分であり;
M−DOTAMは、DOTAMまたは金属イオンが組み込まれたその機能的変異体であり;および
x≧1である]
の化合物であってもよい。
[式中、yは1〜6(好ましくは、1または2)であり、*はデキストランまたはその誘導体への結合点を表し、**はDOTAMまたはその機能的変異体の環原子への結合点を表す]
の基であってもよいか、またはそれを含んでもよい。
[式中、破線は、デキストラン上の酸素への結合点を示す]
を有してもよい。
[RGはそれぞれ、H、アミノ置換カルボキシメチルアミド基(−CH2C(=O)NHCH2CH2NHRFなど)、または主に、α(1,6)結合を介する、さらなるグルコピラノシル単位への結合であり、破線は隣接単位への結合を示す]
の単位を含んでもよい。
DOTAMまたはその機能的変異体もしくは誘導体をデキストランまたはデキストラン誘導体にコンジュゲートすることによって、コンジュゲートを形成すること
を含み;
コンジュゲーションの前に、デキストランまたはデキストラン誘導体を濾過工程にかけて、例えば、50kDa以上、100kDa以上もしくは200kDa以上、必要に応じて、50kDa〜250kDaもしくは50kDa〜200kDa、必要に応じて、100kDa〜200kDaの範囲の分子量カットオフ/閾値より下の種、例えば、100kDa、150kDaもしくは200kDaより下の種を除去するか、または
方法が、コンジュゲートを濾過工程にかけて、例えば、50kDa以上、100kDa以上もしくは200kDa以上、必要に応じて、50kDa〜250kDaもしくは50kDa〜200kDa、必要に応じて、100kDa〜200kDaの範囲の分子量カットオフ/閾値より下の種、例えば、100kDa、150kDaもしくは200kDaより下の種を除去することをさらに含む、除去剤を調製する方法に関する。
i)DOTAMまたはその機能的変異体もしくは誘導体をデキストランまたはデキストラン誘導体にコンジュゲートすることによって、コンジュゲートを形成すること;
ii)必要に応じて、工程(i)の生成物から低分子量種を除去すること;
iii)コンジュゲートを、金属イオン、例えば、Pb、Bi、ZnまたはCaのイオンでキレート化すること;
iv)さらなるキレート剤を添加して、未結合の金属イオンをキレート化すること;および
v)濾過工程を実行して、分子量カットオフ/閾値より下の種を除去すること
を含む。
DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種を、本明細書に記載の診断、イメージングまたは治療の方法のいずれかにおいて使用することができる。そのような方法において使用される場合、DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化されたPb放射性核種は、組成物中に含まれることが理解されるであろう。1つの特定の実施形態では、組成物は、DOTAMまたはその機能的変異体によってキレート化されたPb放射性核種と、Pb放射性核種でキレート化されていないDOTAMまたはその機能的変異体とを含む。かくして、別の態様では、本発明は、そのような組成物、および/または本明細書に記載のイメージングもしくは治療の方法のいずれかにおける使用のためのそのような組成物に関する。そのような方法において言及されるDOTAMでキレート化されたPb放射性核種は、本明細書に記載の組成物の形態にあってもよい。
i)Pb放射性核種を提供すること、
ii)Pb放射性核種を、DOTAMまたはその機能的変異体でキレート化すること、
iii)キレート化されていないDOTAMまたはその機能的変異体を、非放射性金属イオンとキレート化すること
を含む方法に関する。
ウサギの免疫化
2種のエナンチオマーPb−DOTAM−アルキル−PEG4−KLH画分(MS2−DOTAM KLH画分1およびMS2−DOTAM KLH画分2)の1:1ミックスを、WO2000/46251、WO2002/12437、WO2005/007696、WO2006/047367、US2007/0033661およびWO2008/027986に報告される通り、ニュージーランドホワイト(New Zealand White)ウサギまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックウサギの免疫化に使用した。各ウサギは、0日目に皮内適用により、完全フロイントアジュバントで乳化した500ugの免疫原ミックスで免疫化し、7、14、28、56日目に交互の筋肉内および皮下適用により、各500ugで免疫化した。その後、ウサギは、500ugの皮下免疫化を毎月受け、血清力価の決定のため、免疫化の7日後に少量の血液試料を採取した。免疫化の3番目の月および9番目の月に(免疫化後5〜7日目に)、より大量の血液試料(推定総血液体積の10%)を採取し、末梢単核細胞を単離し、これを、B細胞クローニングプロセス(実施例2)における抗原特異的B細胞の供給源として使用した。
2種のエナンチオマーPb−DOTAM画分(PJRD05.133F1またはPJRD05.133F2)のそれぞれを、PBS中の1ug/ml、100ul/ウェルで、96ウェルNUNC Maxisorpプレート上に固定化し、続いて:200ul/ウェルでPBS中の2%クロテイン(Crotein)Cによるプレートのブロッキング;100ul/ウェルでPBS中の0.5%クロテインCにおける2回複製した抗血清の段階希釈の適用;100ul/ウェルでPBS中の0.5%クロテインCにそれぞれ希釈した、HRPコンジュゲートロバ抗ウサギIgG抗体(Jackson Immunoresearch/Dianova 711−036−152;1/16000)およびストレプトアビジン−HRPによる検出を行った。全ステップのため、プレートを1時間37℃でインキュベートした。全ステップの間に、プレートをPBS中の0.05%Tween 20で3回洗浄した。100ul/ウェルのBM Blue POD基質可溶型(Roche)の添加によりシグナルを発色させ;100ul/ウェルの1M HClの添加により停止した。参照としての690nmに対し450nmで吸光度を読み取った。力価は、最大半量シグナルをもたらす抗血清の希釈として定義した。
ウサギ末梢血単核細胞(PBMC)の単離
免疫化されたウサギの血液試料を採取した。EDTA含有全血を1×PBS(PAA、オーストリア、パッシング)で2倍に希釈し、その後、製造業者の仕様書に従ってlympholyte mammal(Cedarlane Laboratories、カナダ、オンタリオ州バーリントン)を使用して密度遠心分離した。PBMCを1×PBSで2回洗浄した。
10%FCS(Hyclone、米国ユタ州ローガン)、2mMグルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA、オーストリア、パッシング)、2mMピルビン酸ナトリウム、10mM HEPES(PAN Biotech、ドイツ、アイデンバッハ)および0,05mM b−メルカプトエタノール(Gibco、スコットランド、ペーズリー)を補充したRPMI 1640(Pan Biotech、ドイツ、アイデンバッハ)を使用した。
滅菌細胞培養6ウェルプレートを、炭酸塩バッファー(0,1M重炭酸ナトリウム、34mM炭酸水素二ナトリウム(Disodiumhydrogencarbonate)、pH9,55)中の2μg/ml KLHで一晩4℃にてコーティングした。プレートを使用前に滅菌PBSにおいて3回洗浄した。滅菌ストレプトアビジン被覆6ウェルプレート(Microcoat、ドイツ、ベルンリート)を、PBS中のビオチン化TCMC−Pb−dPEC3−ビオチン異性体A(1μg/ml)およびB(1μg/ml)の1+1エナンチオマー混合物で3時間室温にてコーティングした。パニングステップに先立ち、このような6ウェルプレートを滅菌PBSで3回洗浄した。
滅菌KLH被覆6ウェルプレートにPBMCを播種して、非特異的接着によりマクロファージおよび単球を枯渇させ、KLHに結合する細胞を除去した。各ウェルに、4ml培地および免疫化されたウサギ由来の最大6×10e6個のPBMCを最大限に充填し、1時間、37℃および5%CO2で結合させた。上清中の細胞(末梢血リンパ球(PBL))を抗原パニングステップに用いた。
TCMC−Pb−dPEC3−ビオチン異性体AおよびBのエナンチオマー混合物でコーティングされた6ウェルプレートに、4ml培地あたり最大6×10e6個のPBLを播種し、1時間37℃および5%CO2で結合させた。ウェルを1×PBSで1〜3回慎重に洗浄することにより、非接着性細胞を除去した。残っている粘着性細胞を、10分間37℃および5%CO2のトリプシンによって剥離した。EL−4 B5培地によりトリプシン処理(Trypsination)を停止した。免疫蛍光染色まで細胞を氷上に維持した。
抗IgG FITC(AbD Serotec、ドイツ、デュッセルドルフ)を単一細胞選別に使用した。表面染色のため、枯渇および濃縮ステップ由来の細胞を、PBSにおいて抗IgG FITC抗体と共にインキュベートし、45分間暗所で4℃にてインキュベートした。染色後に、PBMCを氷冷PBSで2回洗浄した。最後に、PBMCを氷冷PBSに再懸濁し、FACS解析に直ちに付した。FACS解析に先立ち5μg/mlの濃度のヨウ化プロピジウム(BD Pharmingen、米国カリフォルニア州サンディエゴ)を添加して、死細胞と生細胞との間を識別した。
Lightwoodら(J Immunol Methods、2006、316:133〜143)によって記載された方法により、ウサギB細胞の培養物を調製した。簡潔に説明すると、単一の選別されたウサギB細胞を、インキュベーター内で、96ウェルプレートにおいてPansorbin細胞(1:100000)(Calbiochem(Merck)、ドイツ、ダルムシュタット)、5%ウサギ胸腺細胞上清(MicroCoat、ドイツ、ベルンリート)およびガンマ線照射されたマウスEL−4 B5胸腺腫細胞(5×10e5個の細胞/ウェル)を含有する200μl/ウェルEL−4 B5培地と共に7日間37℃でインキュベートした。B細胞培養物の上清をスクリーニングのために除去し、残っている細胞を直ちに採集し、100μl RLTバッファー(Qiagen、ドイツ、ヒルデン)において−80℃で凍結した。
V−ドメインのPCR増幅
製造業者のプロトコールに従ってNucleoSpin 8/96 RNAキット(Macherey&Nagel;740709.4,740698)を使用して、B細胞溶解物(RLTバッファー − Qiagen − Cat.N°79216に再懸濁)から全RNAを調製した。60μlのRNase不含水でRNAを溶出した。6μlのRNAを使用して、製造業者の説明書に従ってSuperscript III First−Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen 18080−400)およびオリゴdT−プライマーを使用した逆転写酵素反応によりcDNAを生成した。全ステップを、Hamilton ML Star Systemにおいて行った。4μlのcDNAを使用して、重鎖のためにプライマーrbHC.upおよびrbHC.doならびに軽鎖のためにrbLC.upおよびrbLC.do(表3)を使用した最終体積50μlにおけるAccuPrime Supermix(Invitrogen 12344−040)により免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域(VHおよびVL)を増幅した。全フォワードプライマーは、(それぞれVHおよびVLの)シグナルペプチドに特異的であった一方、リバースプライマーは、(それぞれVHおよびVLの)定常領域に特異的であった。RbVH+RbVLのためのPCR条件を次に示す:94℃5分間のホットスタート;35サイクルの20秒間94℃、20秒間70℃、45秒間68℃、および68℃7分間の最終伸長。
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現のため、オーバーハングクローニング方法(RS Haunら、Biotechniques(1992)13、515〜518;MZ Liら、Nature Methods(2007)4、251〜256)により、VHまたはVLをコードするPCR産物を、cDNAとして発現ベクターにクローニングした。発現ベクターは、イントロンAを含む5’CMVプロモーターおよび3’BGHポリアデニル化配列からなる発現カセットを含有した。発現カセットに加えて、プラスミドは、大腸菌(E.coli)におけるプラスミド増幅のためのpUC18由来複製開始点、およびアンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含有した。次の、基礎プラスミドの3種の変異体を使用した:VH領域を受け入れるように設計されたウサギIgG定常領域を含有する1種のプラスミド、一方、VL領域を受け入れるためのウサギまたはヒトカッパLC定常領域を含有する2種の追加的なプラスミド。カッパまたはガンマ定常領域およびVL/VHインサートをコードする直鎖化された発現プラスミドを、重複プライマーを使用したPCRにより増幅した。精製されたPCR産物をT4 DNAポリメラーゼと共にインキュベートし、これにより、一本鎖オーバーハングを生成した。dCTP添加により反応を停止した。次のステップにおいて、プラスミドおよびインサートを組み合わせ、部位特異的組換えを誘導するrecAと共にインキュベートした。組換えプラスミドを大腸菌に形質転換した。翌日、成長したコロニーを採取し、プラスミド調製、制限解析およびDNA配列決定により、正確な組換えプラスミドに関して試験した。抗体発現のため、試薬サプライヤーによって示唆される手順に従い239−Freeトランスフェクション試薬(Novagen)を使用することにより、単離されたHCおよびLCプラスミドを、2ml(96ウェルプレート)のFreeStyle HEK293−F細胞(Invitrogen R790−07)に一過性にコトランスフェクトした。1週間後に上清を採集し、精製のために送達した。
下表は、様々なモノクローナル二価ウサギ抗体の特性を示す。キレート化PbおよびBiへの匹敵する結合、他のキレート化金属への低下した結合、ならびに高い親和性(<100pM)を有することから、リード候補としてPRIT−0128を選択した。
1.DOTAM−ビオチン−異性体ミックス:
次の成分、濃度=20ng/mlの混合物、
− Pb−Dotam−Bn−ビオチン/TCMC−Pb−dPEG3−ビオチン、異性体A
− Pb−Dotam−Bn−ビオチン/TCMC−Pb−dPEG3−ビオチン、異性体B
− Pb−Dotam−アルキル−ビオチン異性体A
− Pb−Dotam−アルキル−ビオチン異性体B
2.PBS:DPBS、PAN、P04−36500
3.BSA:Roche、10735086001
4.Tween 20:ポリソルベート20(usb、#20605、500ml)
5.PBST:10×、Roche、#11666789001/0,1%Tween 20
6.OSEP:PBS(10×、Roche、#11666789001)/0,5%BSA(ウシ血清アルブミン画分V、脂肪酸不含、Roche、#10735086001)/0,05%Tween 20
組換えDNA技法
Sambrook、J.ら、Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989に記載されている通り、標準方法を使用してDNAを操作した。製造業者の説明書に従って、分子生物学的試薬を使用した。
Geneart GmbH(ドイツ、レーゲンスブルク)における化学合成により、所望の遺伝子セグメントを調製した。合成された遺伝子断片を、繁殖/増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定により検証した。あるいは、化学合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、またはPCRにより、短い合成DNA断片をアセンブルした。metabion GmbH (ドイツ、プラネック−マーティンスリード(Planegg-Martinsried))により、それぞれのオリゴヌクレオチドを調製した。
ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算されるモル消衰係数を使用して、280nmにおける光学濃度(OD)を決定することにより、精製されたポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。
ヒト胎児性腎細胞(HEK293)の一過性トランスフェクションにより、所望のタンパク質を発現させた。所望の遺伝子/タンパク質(例えば、完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、または追加的なドメイン(例えば、そのC末端における免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメイン)を含有する完全長抗体重鎖)の発現のため、次の機能的エレメントを含む転写単位を使用した:
− イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P−CMV)、
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列(SS)、
− 発現されるべき遺伝子/タンパク質、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
G4S×4リンカーによってそれぞれ分離されたそれぞれの配列エレメント(V−重またはV−軽)をコードするDNA断片をヒトIgG分子のCH3ドメインのC末端に融合することにより、完全かつ機能的な抗体重鎖に続く、追加的な抗体V−重またはV−軽ドメインを含むC末端融合遺伝子を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした(VH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VHまたはVH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VL)。それぞれ2個のCH3ドメインのC末端に1個のVHおよび1個のVLドメインを有する組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。
− イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P−CMV)、
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 抗体重鎖(VH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VHまたはVH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VL)コード化核酸、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
それぞれの配列エレメントをコードするDNA断片を融合することにより、完全かつ機能的な抗体軽鎖を含む抗体軽鎖コード化遺伝子をアセンブルした。
− イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P−CMV)、
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 抗体軽鎖(VL−CL)コード化核酸、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
抗体分子の一過性発現
F17培地(Invitrogen Corp.)において培養される、一過性にトランスフェクトされたHEK293細胞(ヒト胎児性腎細胞株293由来)において抗体分子を生成した。トランスフェクションのため、「293−Free」トランスフェクション試薬(Novagen)を使用した。上述のそれぞれの抗体重鎖および軽鎖分子は、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションは、製造業者の説明書に指定される通りに行った。トランスフェクションの3から7(3〜7)日後に、免疫グロブリン含有細胞培養上清を採集した。上清は、精製するまで、低下した温度(例えば、−80℃)で貯蔵した。
採集された細胞培養上清を、流量5ml/分で、5mlのプロテインA樹脂(Mab Select Sure)を充填したカラム(1.1cm直径、5cm長さ)にアプライした。20ml PBSバッファーによる洗浄後に、25mlクエン酸Na、pH3.0により抗体を溶出させた。
トリプシンを使用して培養ボトルからMKN−45細胞を剥離し、Casy細胞計数器を使用して計数した。4℃、300gでペレットにした後に、細胞をFACSバッファー(PBS中に2.5%FCS)に再懸濁し、2.0E+06個の細胞/mLとなるように調整し、96ウェルPP V字底型Platteに分配した(25μL/ウェル=5.0E+04Zellen/ウェル)。
一次CEA特異的抗体を、FACSバッファーにおいて40μg/mLとなるように調整し、最終濃度10μg/mLをもたらした。RS−CEA−Il2vを参照として用いた。FITCで標識されたPb−DOTAMおよび一次抗体は、等モル比で用いた。これらを混合し、10分間RTでインキュベートして、抗体をPb−DOTAMに結合させた。その後、20μlの調製されたミックスを25μl細胞懸濁液に添加し、1時間4℃でインキュベートした。次に、細胞をFACSバッファーにおいて2回洗浄し、FACS Canto(BD、Pharmingen)を使用した測定のために70μl/ウェルのFACSバッファーに再懸濁した。
一次CEA特異的抗体は、FACSバッファーにおいて20μg/mLとなるように調整し、最終濃度10μg/mLをもたらした。RS−CEA−Il2vを参照として用いた。20μlを25μl細胞懸濁液に添加し、1時間4℃でインキュベートした。次に、細胞をFACSバッファーにおいて2回洗浄した。洗浄後に、二次抗体(<huIgG>−Alexa488、c=10μg/mL)を含有する50μL FACSバッファーに細胞を再懸濁し、1時間4℃でインキュベートした。次に、細胞をFACSバッファーにおいて2回洗浄し、FACS Canto(BD、Pharmingen)を使用した測定のために70μl/ウェルのFACSバッファーに再懸濁した。
DOTAM結合剤PRIT−0128のヒト化における適したヒトアクセプターフレームワークの同定のため、2種の方法論の組合せを使用した。一方では、親抗体に対し高い配列相同性を有するアクセプターフレームワークを検索し、その後、このアクセプターフレームワークにCDR領域を移植することによる、古典的手法を採用した。親抗体に対する同定されたフレームワークの各アミノ酸差は、結合剤の構造的統合性における影響に関して判断し、適切であれば常に、親配列に向けた復帰突然変異(backmutation)を導入した。
VH_CDR1:31〜35
VH_CDR2:50〜65
VH_CDR3:95〜102
VL_CDR1:24〜34
VL_CDR2:50〜56
VL_CDR3:89〜97。
Pb−DOTAMに対するその親和性に関してより大量のヒト化候補をスクリーニングするために、溶解平衡滴定(SET)を使用した。
親和性決定に関するより詳細な解析および直交性方法のため、Kinexaを使用した。
オートサンプラーを備えるSapidyne Instruments(アイダホ州ボイシ)製のKinExA 3200機器を使用した。ポリメチルメタクリレート(PMMA)ビーズは、Sapidyneから購入し、一方、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、BSA(ウシ血清アルブミン画分V)および抗DOTAM抗体は、インハウス(Roche)で調製した。Dylight650(登録商標)コンジュゲートされたアフィニティー精製ヤギ抗ヒトIgG−Fc断片交差吸着(cross-adsorbed)抗体は、Bethyl Laboratories(テキサス州モントゴメリー)から購入した。ビオチン化Pb−DOTAM抗原(Pb−DOTAM−アルキル−ビオチン異性体AおよびB、Pb−DOTAM−Bn−ビオチン/TCMC−Pb−dPEG3−ビオチン、異性体AおよびB)および非ビオチン化Pb−DOTAMは、AREVA Med(メリーランド州ベセスダ)から得た。
ビオチン化分子のためのKinExAハンドブックプロトコール(Sapidyne)に従って、PMMAビーズをコーティングした。簡潔に説明すると、第一に、1mlのPBS(pH7.4)中の10μgのビオチン−BSA(Thermo Scientific)を、吸着コーティングのために1本のバイアル(200mg)のビーズにつき添加した。2時間室温で回転させた後に、上清を除去し、ビーズを1ml PBSで5回洗浄した。第二に、10mg/ml BSAを含有するPBS中の1mlの100μgのニュートラアビジン、ビオチン結合タンパク質(Thermo Scientific)をビーズに添加し、室温でさらなる2時間インキュベートして、ニュートラアビジンをビーズにカップリングさせ、ビオチン化タンパク質のその後の結合のための追加的なビオチン結合部位をもたらした。次に、ニュートラアビジンコーティングされたビーズを1ml PBSで5回リンスした。最後に、ビーズをPBS中の200ng/mlビオチン化Pb−DOTAM−異性体ミックス(異性体毎に50ng)でコーティングし、さらに2時間室温でインキュベートした。次に、ビーズを30ml PBSに再懸濁し、直ちに使用した。
全てのKinExA実験は、ランニングバッファーとしてPBS、pH7.4を使用して室温(RT)で行った。試料は、1mg/ml BSAを補充したランニングバッファー(「試料バッファー」)において調製した。0.25ml/分の流量を使用した。5pM結合部位濃度を有する一定量の抗DOTAM抗体を、100pMから開始する2倍段階希釈(濃度範囲0.049pM〜100pM)によりPb−DOTAM抗原で滴定した。抗原なし抗体の1種の試料は、100%シグナル(すなわち、阻害なし)とした。抗原−抗体複合体をRTで少なくとも24時間インキュベートして、平衡に達するようにした。次に、平衡した混合物を、体積5mlのKinExAシステムにおけるPb−DOTAMカップリングビーズのカラムに通して、溶液の平衡状態を乱すことなく、結合していない抗体をビーズによって捕捉させた。捕捉された抗体は、試料バッファーにおける250ng/ml Dylight 650(C)コンジュゲートされた抗ヒトFc断片特異的二次抗体を使用して検出した。各試料は、全平衡実験で2回複製して測定した。
方法およびデータ解析
最終形式でのヒト化PRIT分子の異なる変異体(20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0における)を、1mg/mlとなるように同じバッファーに希釈した。30μlの各試料を、384ウェルプレートフィルターデバイスに移した(参照としての抗HER3抗体と一緒に)。1,000g、1分間の遠心分離後に、ウェルを10μlのパラフィン油で覆った。プレートを再度遠心分離し(1,000gで1分間)、DLS pklateリーダー(Dyna Pro PlateReader−II、Wyatt)に移した。25℃から開始して、温度を0.05℃/分のスピードで79.9℃まで増加させた。Dynamicsソフトウェア(V7.0)を使用して散乱光を記録した。
PRIT−0156は、CEA結合剤CH1A1Aと組み合わせたウサギDOTAM結合剤PRIT−0128を含む2:1抗体である。PRIT−0178からPRIT−0204は、同じ形式で、同じCEA結合剤を有する、ヒト化変異体である。PRIT−0205からPRIT−0221までは、DOTAM結合部分においてPRIT−0178からPRIT−0204ヒト化変異体に対応するが、T84.66に変化されたCEA結合剤を有する。
HC5: VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSS
LC1: SIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIK
LC3: aqmtqspstl sasvgdrvti tcqsshsvys
501 dndlawyqqk pgqppklliy qasklasgvp srfsgsgsgt eftltisslq
551 pddfatyycl ggyddesdty gfgggtkvei k
HC7: vqlvesgggl vqpggslrls caasgfslst
501 ysmswvrqap gkglewvgfi gsrgdtyyas wakgrftisr dtskntaylq
551 mnslraedta vyycarerdp ygggaypphl wgrgtlvtvs s
HC10: vqlqqwgagl lkpsetlslt cavygfslst
501 ysmswirqpp gkglewigfi gsrgdtyyas wakgrvtisr dtsknqvslk
551 lssvtaadta vyycarerdp ygggaypphl wgrgtlvtvs s
T84.66 VH 1 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgfnik dtymhwvrqa pgqglewmgr
51 idpangnsky vpkfqgrvti tadtststay melsslrsed tavyycapfg
101 yyvsdyamay wgqgtlvtvs s
T84.66 VL:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPA
RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIK
CH1A1A VH:
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51 intktgeaty veefkgrvtf ttdtststay melrslrsdd tavyycarwd
101 fayyveamdy wgqgttvtvs s
CH1A1A VL:
1 diqmtqspss lsasvgdrvt itckasaavg tyvawyqqkp gkapklliys
51 asyrkrgvps rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyychq yytyplftfg
101 qgtkleik
複合体形成のため、26mg/mlのP1AA1227と呼ばれるPRIT−0213におけるヒト化VH/VLに由来するFabを、Pb−DOTAM粉末と1:4.2のモル比で混合した。4℃での2時間インキュベーション後に、JCSG+スクリーン(Qiagen、ヒルデン)を使用して、21℃でシッティングドロップ蒸気拡散(sitting drop vapor diffusion)装置において初期結晶化の試みを行った。結晶は、0.2M (NH4)2SO4、0.1Mビス−トリス、pH5.5、25%w/v PEG3350から5日以内に出現した。結晶は、いかなるさらなる最適化ステップも用いず、スクリーニングプレートから直接的に採集した。
Fab P1AA1227とPb−Dotamとの相互作用の詳細を特徴づけるため、本出願人らは、1.40Åの分解能で複合体の結晶構造を決定した。構造は、軽鎖のCDR1およびCDR3の主な寄与ならびに重鎖のCDR2およびCDR3によりPb−DOTAMに結合するFab P1AA1227を明らかにする。
>P1AA1227_HC
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
>P1AA1227_LC
SIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
一般
全ての実験プロトコールは、地方当局(Comite Regional d’Ethique de l’Experimentation Animale du Limousin (CREEAL)、Laboratoire Departemental d’Analyses et de Recherches de la Haute−Vienne)によって審査および承認された。雌重症複合免疫不全(SCID)マウス(Charles River)は、倫理指針に沿って、明暗の日周サイクル(12時間/12時間)により、特定の病原体がない条件下で維持した。到着後最初の1週間において操作は行わず、動物を新たな環境に順化させた。全てのマウスを、体調および全般的な健全性の評価に関して毎日モニターした。
二重特異性抗体は、Roche Diagnostics GmbH、Pharma Research Penzberg(ドイツ、ペンツベルク)によって提供され、注射日まで−80℃で貯蔵された。次に、二重特異性抗体を解凍し、標準ビヒクルバッファー(20mMヒスチジン/ヒスチジンHCl、140mM NaCl;pH6.0)に希釈した。
本試験は、レジメンを最適化し、臨床治験への移行に最も適した候補を選択するために、様々なCEA標的化二重特異性抗体によるプレターゲティング後のマウスにおける膵臓腺癌異種移植片におけるPb蓄積を評価することを目標とした。実験を3種の別々のプロトコールに分け、i)80b、ii)80cおよびiii)80aの順序で行った。プロトコール80bは、203Pb−DOTAMと予め結合させた、5種の完全にヒト化された二重特異性抗体コンストラクトの腫瘍取込みを評価した。プロトコール80cは、注射後の3つの異なる時点における、203Pb−DOTAMと予め結合させた二重特異性抗体コンストラクトの腫瘍取込みを評価して、プレターゲティングレジメンにおけるPRIT注射およびCA/キレート注射の間のタイミングを最適化した。最後に、プロトコール80aは、T84.66またはCH1A1Aのいずれかを標的とする5種の完全にヒト化された二重特異性抗体コンストラクトを使用して、標準プレターゲティング設定における212Pb−DOTAMの腫瘍取込みを評価した。
全てのCEA結合二重特異性抗体が、212Pb−DOTAMの特異的腫瘍標的化をもたらし、DOTAM注射24時間後に正常組織における取り込みは殆どなかったまたは全くなかった。PRIT−0206、PRIT−0207およびPRIT−0208に関して、平均腫瘍取込み±SDは、それぞれ8.62±1.05、7.30±3.84および7.75±2.61%ID/gであり、それらの対応するT84.66結合ポジティブコントロールPRIT−0165は、9.13±1.82%ID/gであった。CH1A1A結合剤PRIT−0186およびPRIT−0187は、17.44±1.39および16.50±3.25%ID/gの腫瘍値をもたらし、それらのポジティブコントロールPRIT−0156は、18.98±1.89%ID/gであった。非CEA結合PRIT−0175は、腫瘍において0.41±0.42%ID/gをもたらした。
腫瘍の特異的標的化は、全ての予め結合させたCEA結合二重特異性抗体により達成されたが、%ID/gは、ポジティブコントロールPRIT−0165と比較して、完全にヒト化型に関して僅かにより低かった。非CEA結合コントロールは、比較的無視できる腫瘍蓄積をもたらした。
両方のCEA結合抗体が、ネガティブコントロールと比較して、有意な腫瘍蓄積をもたらした。統計解析は、試験された時点のいずれに関しても、PRIT−0206またはPRIT−0165を使用した腫瘍標的化の間に有意差を示さず、試験された抗体のいずれに関しても、どちらにも、3および7日目の間で%ID/gにいかなる有意差もなかった(二方向ANOVA、p<0.05)。プロトコール80bと類似して、計算された%ID/g値は全体的に高かった;しかし、腫瘍対血液比は、予想される範囲内のままであった。1および3日目の間に、腫瘍対血液比に有意差は見られなかったが、PRIT−0165およびPRIT−0206に関して、7日間の待機は、比を有意に増加させる(二方向ANOVA、p<0.05)。結果を図6に示す。
T84.66またはCH1A1Aのいずれかを標的とする全ての完全にヒト化された二重特異性抗体が、これらそれぞれのポジティブコントロールのものに匹敵する、BxPC3腫瘍における放射能の有意な蓄積をもたらした。
本試験の目標は、異なる特性(例えば、分子骨格、サイズおよび電荷)を有する選択された除去剤の体内分布、より具体的には、腫瘍におけるそれらの存在および/または蓄積に取り組むことであった。除去剤が潜在的に、腫瘍内に進入する、腫瘍結合抗体に結合する、および/またはこれらを腫瘍から抜き出し、放射性リガンドのその後の結合にマイナスに影響を与える可能性があるため、このことを知ることは興味深かった。
全ての除去剤は、血流から急速に除去され、既に注射後2時間目には肝臓および結腸に主に蓄積する。臓器別の(%ID)放射能分布によって実証される通り、注射された212Pbの約50%は、注射24時間後に肝臓に見出された。トリGalNAc分子の存在によって説明される通り、トリGalNAc修飾除去剤も、ある程度まで脾臓に蓄積した。一般に、24時間後に尿に放射能は殆ど見出されなかった。しかし、最も小型の除去剤(Dex70)は、予想よりもゆっくりと排泄された。
放射標識されたCAのいずれも、マウス1匹あたり30μgの用量で投与された場合、212Pbの腫瘍取込みをもたらさなかった。トリGalNacによるDex500の修飾は、修飾されていないDex70およびDex250除去剤と比較して有益ではなかった。
図10は、腫瘍がないマウスにおける、203Pb標識された除去剤の注射1週間後の、選択された組織における放射能分布を示す(%ID/g±SD、n=3)。
このパートは、2つの試験を網羅し、そのうち第1の試験は、血液中の滞留時間の観点から、9種の異なるデキストランベースの除去剤をPBSと比較する初期スクリーニングを含む。目標は、3週間隔てた反復処置を可能にする、将来のプレターゲティング実験の有望な候補を同定することであった。延長した時間にわたり循環中に残る除去剤が、投与された二重特異性抗体に結合し、その後に注射される放射標識されたDOTAMの結合を有効にブロックするという仮説を立てた。除去試薬は、サイズ、電荷、および1,4,7,10−テトラキス(カルバモイルメチル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン(TCMC)ロードの観点から変動した。
PBSコントロール群のもの(41.1±1.4%ID/g)と有意に異なった血液における放射能含有量(%ID/g)の群平均は、投与3週間後の循環における除去剤の保持を示した。3種の化合物は、コントロールと有意に異ならなかった:キャッピングされたDex500−(Glu)4、Dex500−モノ−(Glu)2およびDex20−モノ−(Glu)3;その他は、変動する程度で異なった。
被験除去剤は、次の1つの例外を除いて、全般に良い成績を収めた:Dex500−M(Glu)2は際立っており、24時間後に8.07±0.61%ID/gが血液に残っていた。
スクリーニングした試薬は、自己クリアランスの観点から全体的に良い成績を収め、循環からの抗体クリアランスを達成した。CA注射間3週間による反復処置は、二重特異性抗体への212Pb−DOTAM結合にリスクを生じることなく実現可能と判明した。加えて、二重特異性抗体は、被験化合物の大部分を使用したCA注射後2時間以内に除去された。
浸透するDOTAM結合CA断片は、抗体でプレターゲティングされた腫瘍細胞への結合において212Pb−DOTAMと競合し得るため、除去剤の腫瘍浸透は、PRITレジメンにおける潜在的な問題である。本試験において、腫瘍への212Pb−DOTAM会合の阻害の観点から、6種の異なる除去剤を比較した。i)デキストランサイズおよびii)分子の電荷から、腫瘍会合性放射能における影響を評価するために、ベースラインCAスクリーニング(プロトコール83)の結果に基づき候補を選んだ。
候補のうち3種:Dex20(0.26±0.03%ID/g)、Dex70(4.06±2.06%ID/g)およびCDex500−(Glu)4(2.98±0.73%ID/g)が、腫瘍取込みを殆ど呈さずまたは全く呈さず、腫瘍への大規模CA浸透を示す。対照的に、Dex500−M(Glu)2は、bsAbクリアランス失敗として解釈される、PBSコントロールのもの(それぞれ腫瘍および血液における59.02±15.53および27.92±2.38%ID/g)と同様のレベルで、腫瘍(69.39±9.70%ID/g)および血液(20.68±1.22%ID/g)の両方において高い放射能をもたらした。Dex500は、腫瘍における放射能の相当の蓄積を呈し(20.78±3.76%ID/g)、僅かな腫瘍浸透を示し、一方、血液クリアランスは、基本的に完全であった(0.17±0.01%ID/g)。にもかかわらず、CAなしコントロールにおいて達成された腫瘍取込みは、ある程度の低分子量(MW)DOTAM−デキストラン断片が、Dex500バッチにも存在したことを示した。
本実験は、低MW CA種の存在が、212Pb−DOTAMの腫瘍蓄積に実質的に干渉し得るという概念を確認した。本実験は、指定されたサイズに関係なく、CAのいずれかのバッチに存在する分子の幅広いMW範囲も実証した。そのため、指定されたCAサイズが大きいほど、腫瘍に浸透し得る低MW断片を導入するリスクは低くなる。しかし、Dex500であっても、CAなしコントロールと比較した腫瘍取込みの差によって示される通り、あるレベルの浸透が明らかになった。結果的に、この溶液は、将来、より高いMWカットオフを使用してダイアフィルトレーションして、このような干渉断片を可能な限り多く除去するべきである。Dex500のために30から100kDaへとMWカットオフを増加させる判断を下した。
アミノデキストラン(20.0g)を、H2O(400mL)における0.1M Na2CO3およびH2O(400mL)における0.1M NaHCO3の混合物に溶解した。清澄な無色溶液が得られたら、p−SCN−Bn−DOTAM・4HCl(S−2−(4−イソチオシアナトベンジル)−1,4,7,10−テトラアザ−1,4,7,10−テトラ(2−カルバモイルメチル)シクロドデカン四塩酸塩、2.03g)を撹拌下添加した。その結果生じる僅かに濁りがある溶液を室温で4時間撹拌し、その後、2M HClを添加することにより反応混合物をpH6〜7に中和した。その結果生じる溶液を、100kDaカットオフによるタンジェント流濾過(Sartorius Hydrosart、Slice 200 100kDa 0.02m2、安定化されたセルロースベースの膜、限外濾過カセット)により精製して、低分子量不純物を除去した。その結果生じる溶液を減圧下で凍結乾燥して、17.9gの所望の中間体を得た。
本試験は、より多い量の除去剤が、腫瘍へのより高い程度の除去剤浸透をもたらし、これにより、腫瘍結合した二重特異性抗体のDOTAM結合アームをブロックすることにより標識されたキレートのその後の取り込みを減少させ得ることを仮定する、皮下腫瘍モデルにおける腫瘍蓄積における除去剤用量の影響を調査することを目標とした。しかし、低すぎる用量は、循環におけるより高いレベルのDOTAM結合二重特異性抗体のため、効率が低い腫瘍会合性放射能蓄積をもたらすであろう。
正常組織における212Pb蓄積は、除去剤が投与された全群で低かった;対照的に、除去剤を受けなかった群は、全体的に有意なレベルの放射能を呈した。
本試験は、低レベルの循環放射能を維持しながらの、212Pbの腫瘍蓄積の徹底的な増加を実証した。次の2つの鍵となる知見が結論付けられた:1)100−kDaカットオフによるダイアフィルトレーションは、DOTAM結合デキストラン断片の腫瘍浸透を有意に減少させたこと、および2)CAのbsAbに対する比が、絶対CA量を超えて成績に影響を与えたこと。優れた腫瘍対血液比は、100μgの二重特異性抗体の投与後に、10:1の抗体:CA比を使用して達成された。さらに、Dex500ベースの除去剤を使用した将来の試験は全て、100−kDaカットオフを使用してダイアフィルトレーションされた試薬を使用するべきであると結論付けられた。
本試験において、腫瘍への212Pb−DOTAM会合の阻害の観点から、デキストラン−500に基づく9種の異なる除去剤を比較した。より具体的には、実験は、i)TCMC飽和、ii)除去剤対抗体比およびiii)産生/精製方法から、腫瘍会合性放射能における影響を評価した。加えて、プレターゲティングまたはCAなしで、10または30μCiの212Pb−DOTAMの注射後に、腫瘍取込みを比較して、腫瘍の放射能飽和が低い方の用量で既に達成されたか評価した。
体内分布データは、投与された量に依存した、212Pb−DOTAM注射24時間後の収集された組織における平均放射能含有量(%ID/g±SD)における明らかな傾向を明らかにし、より低いCA量により、血液および正常組織におけるより高い212Pb濃度が得られた。加えて、より高い212Pb放射能は、対応する正常組織取り込み増加を伴わずに、腫瘍におけるより高い212Pb蓄積をもたらした。
結論として、1分子あたり39個のTCMCを有する20μgのDex500(Dex500−(40%))は、212Pb−DOTAMの投与24時間後に、低い血液中保持と組み合わせて、プレターゲティングされた腫瘍における212Pbの非常に高い蓄積を生成した。これは、1分子あたり84個のTCMCを有する、10μgの以前の標準CA、Dex500−(100%)によるサイド・バイ・サイドで、最も成績が良い除去剤であった。相当な群内可変性および小さい標本サイズにより、腫瘍対血液比における差は、2種の試薬の間で統計的に異ならなかったが、平均値は、Dex500−(100%)が好ましい可能性があることを示した。加えて、30μCiの212Pb−DOTAMが、10μCiよりも高い腫瘍蓄積を生じ得る、すなわち、低い方の用量で飽和に達しなかったことが結論付けられた。
本試験は、皮下腫瘍モデルにおける腫瘍蓄積における二重特異性抗体用量の影響を調査することを目標とした。より多い量の二重特異性抗体が、腫瘍細胞における利用できる結合部位をより容易に飽和させ、これにより、標識されたキレートのその後の取り込みを増加させることができるという仮説を立てた。他方では、用量の過度の増加は、より高いレベルの循環二重特異性抗体により、腫瘍会合性放射能の効率が低い蓄積をもたらすことができる。
100μgのいずれかのCEA結合二重特異性抗体を使用したプレターゲティングは、100μgの非CEA結合コントロールと比較して、腫瘍における212Pbの有意な蓄積をもたらした(独立t検定、それぞれPRIT−0156およびPRIT−0165との比較について、p=0.027および0.008)。いずれかのCEA結合コンストラクトのために30から200μgへと抗体用量を増加させた場合、腫瘍取込みに有意差は観察されなかった。しかし、全体的な放射能レベルは、30μgを上回る抗体用量に関して、大部分の正常組織において僅かに上昇した。重要なことに、PRIT−0156の100および200μgの間を除いて、血液における%ID/gは、用量増分毎に有意に増加した(独立t検定、p<0.05)。
全3種の抗体用量レベル(30、100および200μg)が、両方の被験二重特異性コンストラクトに関して、腫瘍における放射能の高い、特異的な取り込みをもたらした。増加した用量による腫瘍蓄積における差の欠如は、結合部位が、低い方の投薬量で既に飽和されたこと、またはPRIT投与および除去剤注射の間の時間(4日間)が、さらなる腫瘍蓄積を可能にするには短すぎたことを示した。予想通り、血液における放射能レベルが、漸増用量に伴い増加し、処置の治療ウィンドウが僅かに狭くなる。
本試験において、2種の臨床bsAb候補(PRIT−0213およびPRIT−0214)を使用したCEA−PRITの有効性を、2種の平行皮下腫瘍モデル:BxPC3およびLS174Tにおいて評価した。単一および二重サイクル処置レジメンにおいて、二重特異性抗体をサイド・バイ・サイドで比較した。
処置サイクル1後の結果は、このモデルにおける以前に達成された組織取り込みと良く対応し、高い腫瘍蓄積(それぞれPRIT−0213およびPRIT−0214で25.0±9.7および19.5±6.4%ID/g)および正常組織における低い蓄積であった。しかし、サイクル2は、異なる212Pb分布プロファイルをもたらし、全ての収集された組織において放射能含有量が増加した。
両方の処置サイクルが、高い212Pb腫瘍蓄積および正常組織における低い212Pb蓄積をもたらした。サイクル1の後の腫瘍取込みは、それぞれPRIT−0213およびPRIT−0214で30.9±2.9および21.4±1.9%ID/gであった;サイクル2の後に、対応する数値は、33.2±0.7および40.1±6.5%ID/gであった。
1または2処置サイクルで、2種の二重特異性抗体PRIT−0213およびPRIT−0214のいずれかを使用したCEA−PRITは、両方の試験された腫瘍モデルで、有意な腫瘍増殖阻害および生存増加をもたらした。BxPC3試験における予想外の第2サイクル212Pb体内分布およびその後の放射線誘発毒性後のトラブルシューティングの試みは、この状況が、未同定の注射関連の課題によって引き起こされた可能性があると結論付けた。BxPC3有効性試験を反復して、問題が処置レジメンに固有のものでないことを確認するべきである。LS174Tモデルにおける将来の実験は、不良な腫瘍状態の問題が解決されるまで行うべきではない。第2の処置サイクルの効率を増加させるために、2つのサイクルの間のタイミングが、腫瘍再増殖を回避するために短縮されることが提案される。加えて、レジメンに第3の処置サイクルを加えることも、さらなる評価のための選択肢となり得る。
本試験において、50%TCMC飽和を有するデキストラン−500ベースの除去剤の用量の範囲は、プレターゲティングされた腫瘍への212Pb−DOTAM会合における効果の観点から評価した。
212Pbの腫瘍蓄積は、250μgを除いて全CA用量で全般に高かった。CEA−PRIT二重特異性抗体の血液クリアランスは、30、75および250μgのCA用量で最も効率的であった。結果的に、最高の腫瘍対血液比は、30、75および250μgのCAで達成され、それぞれ187.7、180.2および243.5であった。212Pbの対応する腫瘍取込みは、91.8±18.9、70.5±11.1および35.2±17.0%ID/g(±SD、n=3)であった。
腫瘍における達成された212Pb蓄積、血液クリアランスおよびその後の腫瘍対血液比に基づき、30μgのDex500−(50%)の用量は、BxPC3モデルにおけるCEA−PRITに好ましいと思われた。
本試験において、50%TCMC飽和を有するデキストラン−500ベースの除去剤は、血液中の滞留時間の観点から評価した。目標は、反復処置に適した時間枠(1〜4週間)を同定し、投与された二重特異性抗体に結合し得る除去剤が循環中に殆どまたは全く残っておらず、その後に注射される放射標識されたDOTAMの結合を有効にブロックすることを確実にすることであった。
試験した時点のいずれにおいても、Dex500−(50%)またはPBSを受けたマウスの間に平均放射能含有量に統計的有意差はなかった(1方向ANOVA、シダックの多重比較検定、p>0.05)。
結果は、反復したCEA−PRIT処置サイクルが、CEA−DOTAM bsAbへのその後投与された212Pb−DOTAMの結合をブロックすることなく、Dex500−(50%)の最後の注射の1週間後に既に開始され得ることを示す。
抗体重鎖または軽鎖の組換え発現のためのプラスミドの生成
ヒト胎児性腎細胞(HEK293)の一過性トランスフェクションにより、所望のタンパク質を発現させた。所望の遺伝子/タンパク質(例えば、完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、または追加的なドメイン(例えば、そのC末端における免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメイン)を含有する完全長抗体重鎖)の発現のため、次の機能的エレメントを含む転写単位を使用した:
− イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P−CMV)、
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列(SS)、
− 発現されるべき遺伝子/タンパク質、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
− 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、および
− 大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有した。
G4S×4リンカーによってそれぞれ分離されたそれぞれの配列エレメントをコードするDNA断片をヒトIgG分子のCH3ドメインのC末端に融合することにより、完全かつ機能的な抗体重鎖に続く、追加的な抗体VL−CH1またはVH−C−カッパドメインを含むC末端融合遺伝子を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした(VH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VL−CH1またはVH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VH−Ck)。それぞれ2個のCH3ドメインのC末端に1個のVL−CH1および1個のVH−Ckドメインを有する組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。
ノブ・イントゥー・ホール技術を使用することにより、CEAまたはDOTAMのいずれかを標的とする完全かつ機能的な抗体重鎖を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした。
VH−CH1ドメインをコードするDNA断片を、G4S×4リンカーを介して、VHドメインに代えたVLドメインの交換を含有するヒトIgG分子のVLドメインのN末端に融合する(よって、構造VH−CH1−リンカー−VL−CH1−ヒンジ−CH2−CH3をコードする融合遺伝子を作製する)ことにより、融合遺伝子をアセンブルした。1個のVH−CH1を有し、それぞれのN末端に融合がない組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。
G4S×4リンカーによってそれぞれ分離されたそれぞれの配列エレメントをコードするDNA断片を、ヒトIgG分子のCH3ドメインのC末端に融合することにより、完全かつ機能的な抗体重鎖に続く、追加的な抗体V−軽−CH1ドメインを含むC末端融合遺伝子を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした(VH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VL−CH1)。1個のVL−CH1を有し、それぞれ2個のCH3ドメインのC末端に融合がない組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。
G4S×4リンカーによってそれぞれ分離されたそれぞれの配列エレメントをコードするDNA断片を、ヒトIgG分子のCH3ドメインのC末端に融合することにより、完全かつ機能的な抗体重鎖に続く、追加的な抗体V−軽−C−カッパ−リンカー−V−重−CH1ドメインを含むC末端融合遺伝子を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした(VH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VL−Ck−リンカー−VH−CH1)。1個の単鎖Fabを有し、それぞれ2個のCH3ドメインのC末端に融合がない組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。
F17培地(Invitrogen Corp.)において培養される、一過性にトランスフェクトされたHEK293細胞(ヒト胎児性腎細胞株293由来)において抗体分子を生成した。トランスフェクションのため、「293−Free」トランスフェクション試薬(Novagen)を使用した。上述のそれぞれの抗体重鎖および軽鎖分子は、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションは、製造業者の説明書に指定される通りに行った。トランスフェクションの3から7(3〜7)日後に、免疫グロブリン含有細胞培養上清を採集した。上清は、精製するまで、低下した温度(例えば、−80℃)で貯蔵した。
親和性決定の詳細な解析のため、Kinexaを使用した。
オートサンプラーを備えるSapidyne Instruments(アイダホ州ボイシ)製のKinExA 3200機器を使用した。ポリメチルメタクリレート(PMMA)ビーズは、Sapidyneから購入し、一方、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、BSA(ウシ血清アルブミン画分V)および抗DOTAM抗体は、インハウス(Roche)で調製した。Dylight650(登録商標)コンジュゲートされたアフィニティー精製ヤギ抗ヒトIgG−Fc断片交差吸着抗体は、Bethyl Laboratories(テキサス州モントゴメリー)から購入した。ビオチン化Pb−DOTAM抗原(Pb−DOTAM−アルキル−ビオチン異性体AおよびB、Pb−DOTAM−Bn−ビオチン/TCMC−Pb−dPEG3−ビオチン、異性体AおよびB)および非ビオチン化Pb−DOTAMは、AREVA Med(メリーランド州ベセスダ)から得た。
ビオチン化分子のためのKinExAハンドブックプロトコール(Sapidyne)に従って、PMMAビーズをコーティングした。簡潔に説明すると、第一に、1mlのPBS(pH7.4)中の10μgのビオチン−BSA(Thermo Scientific)を、吸着コーティングのために1本のバイアル(200mg)のビーズにつき添加した。2時間室温で回転させた後に、上清を除去し、ビーズを1ml PBSで5回洗浄した。第二に、10mg/ml BSAを含有するPBS中の1mlの100μgのニュートラアビジン、ビオチン結合タンパク質(Thermo Scientific)をビーズに添加し、室温でさらなる2時間インキュベートして、ニュートラアビジンをビーズにカップリングさせ、ビオチン化タンパク質のその後の結合のための追加的なビオチン結合部位をもたらした。次に、ニュートラアビジンコーティングされたビーズを1ml PBSで5回リンスした。最後に、ビーズを、PBS中の200ng/mlビオチン化Pb−DOTAM−異性体ミックス(異性体毎に50ng)でコーティングし、さらに2時間室温でインキュベートした。次に、ビーズを30ml PBSに再懸濁し、直ちに使用した。
全てのKinExA実験は、ランニングバッファーとしてPBS、pH7.4を使用して室温(RT)で行った。1mg/ml BSAを補充したランニングバッファー(「試料バッファー」)において試料を調製した。0.25ml/分の流量を使用した。5pM結合部位濃度を有する一定量の抗DOTAM抗体を、100pMから開始する2倍段階希釈(濃度範囲0.049pM〜100pM)によってPb−DOTAM抗原で滴定した。抗原なし抗体の1種の試料は、100%シグナル(すなわち、阻害なし)とした。抗原−抗体複合体をRTで少なくとも24時間インキュベートして、平衡に達するようにした。次に、平衡した混合物を、体積5mlのKinExAシステムにおけるPb−DOTAMカップリングビーズのカラムに通して、溶液の平衡状態を乱すことなく、結合していない抗体をビーズによって捕捉させた。試料バッファー中の250ng/ml Dylight 650(C)コンジュゲートされた抗ヒトFc断片特異的二次抗体を使用して、捕捉された抗体を検出した。各試料は、全平衡実験で2回複製して測定した。
必要に応じた電荷修飾は、太字文字列および下線で示す:EQ−>RKまたはKK−>EE
P1AE1766
>CEA軽鎖RK
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>CEA重鎖とDOTAM VL/CH1
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> CEA重鎖とDOTAM VH/CK
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P1AE1767
>DOTAM「LC」とVH/CK
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>CEA軽鎖RK
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>CEA重鎖とDOTAM VL/CH1
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>CEA重鎖
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P1AE1768
>CEA LC
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>DOTAM重鎖とVL/CH1
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>CEA重鎖
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>DOTAM「LC」VH/CK
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P1AE1769
>DOTAM「LC」とVH/CK
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>CEA LC
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>CEA HCとCEA VH/CH1/DOTAM VL/CH1
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>CEA HC
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P1AE1770
>CEA LC
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>CEA HCとDOTAM scFab:DOTAM VL/Ck/リンカー/VH CH1
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>CEA HC
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抗体重鎖または軽鎖の組換え発現のためのプラスミドの生成
ヒト胎児性腎細胞(HEK293)の一過性トランスフェクションにより、所望のタンパク質を発現させた。所望の遺伝子/タンパク質(例えば、完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、または追加的なドメイン(例えば、そのC末端における免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメイン)を含有する完全長抗体重鎖)の発現のため、次の機能的エレメントを含む転写単位を使用した:
− イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P−CMV)、
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列(SS)、
− 発現されるべき遺伝子/タンパク質、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
− 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、および
− 大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有した。
G4S×4リンカーによってそれぞれ分離されたそれぞれの配列エレメント(V−重またはV−軽)をコードするDNA断片を、ヒトIgG分子のCH3ドメインのC末端に融合することにより、完全かつ機能的な抗体重鎖に続く、追加的な抗体V−重またはV−軽ドメインを含むC末端融合遺伝子を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした(VH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VHまたはVH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VL)。それぞれ2個のCH3ドメインのC末端に1個のVHおよび1個のVLドメインを有する組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。
− イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P−CMV)、
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 抗体重鎖(VH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VHまたはVH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−VL)コード化核酸、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
P1AD9826 → CD20−DOTAM
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それぞれの配列エレメントをコードするDNA断片を融合することにより、完全かつ機能的な抗体軽鎖を含む抗体軽鎖コード化遺伝子をアセンブルした。
− イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P−CMV)、
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 抗体軽鎖(VL−CL)コード化核酸、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
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F17培地(Invitrogen Corp.)において培養される、一過性にトランスフェクトされたHEK293細胞(ヒト胎児性腎細胞株293由来)において抗体分子を生成した。トランスフェクションのため、「293−Free」トランスフェクション試薬(Novagen)を使用した。上述のそれぞれの抗体重鎖および軽鎖分子は、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションは、製造業者の説明書に指定される通りに行った。トランスフェクションの3から7(3〜7)日後に、免疫グロブリン含有細胞培養上清を採集した。上清は、精製するまで、低下した温度(例えば、−80℃)で貯蔵した。
MabSelect Sure(アフィニティークロマトグラフィー)およびそれに続くSuperdex 200(サイズ排除クロマトグラフィー)によって、PRIT分子を精製した。
P1AD8927の機能性を評価するため、37℃で10分間アキュターゼ(accutase)を使用して培養容器からKPL−4細胞を剥離した。その後(Subequently)、細胞をPBSにおいて2回洗浄し、4×106個の細胞/ウェルの最終密度となるように96ウェルv字底型プレートに播種した。
P1AD8926の機能性を評価するため、Raji細胞をPBSにおいて2回洗浄し、4×106個の細胞/ウェルの最終密度となるように96ウェルv字底型プレートに播種した。
本実施例は、実施例31〜37の試験のための材料および方法を設定する。
3段階PRIT(1サイクル)
ステップ1:BsAbの投与(Adminstration)(i.v.またはi.p.):試験で使用されるBsAbは、高い親和性でPb−DOTAMに結合し、例えばCEAを介して腫瘍を標的とする。
ステップ2:CAの投与(i.v.またはi.p.):212Pb−DOTAMの効率的な腫瘍蓄積を可能にするために、循環BsAbは、腫瘍へと浸透することなく、結合していないBsAbへの212Pb−DOTAM結合をブロックし、結果的に、プレターゲティングされた部位をブロックするCAを使用して血液中で中和される必要がある。BsAbが腫瘍に十分な程度まで蓄積したら、一般に、4〜10日後に、CAが投与される。Pb−DOTAM−デキストラン−500 CAは、下に示す通り、チオウレアリンカーを介してDOTAMがコンジュゲートされている、500kDaの平均分子量を有するアミノデキストランに基づき開発された。
ステップ3:212Pb−DOTAMの投与(i.v.):最後のステップにおいて、一般に、CA注射の24〜48時間後に、放射能注射を行って、212Pb−DOTAMが、プレターゲティングされた腫瘍部位に優先的に結合することを可能にし、全身性放射線曝露を効率的に低下させる。
ARCoLabで行われる実験プロトコールは、地方当局(Comite Regional d’Ethique de l’Experimentation Animale du Limousin (CREEAL)、Laboratoire Departemental d’Analyses et de Recherches de la Haute−Vienne)によって審査および承認された。重症複合免疫不全(SCID)およびCD1マウスは、Charles Riverによって提供され、倫理指針に沿って、明暗の日周サイクル(12時間/12時間)による特定のおよび日和見性の病原体がない(SOPF)条件下で維持された。試験121は、Envigoによって提供されたマウスにより、特定の病原体がない(SPF)条件を用いた。到着後の最初の5日間、操作は行わず、動物を新たな環境に順化させた。臨床症状および有害事象検出に関して全マウスを毎日管理した。
(式中、dは、処置日を示し、0は、ベースライン値を示す)。参照群としてビヒクル(PBS)を選択した。腫瘍縮小(TR)は、次式に従って計算した:
(式中、正の値は、腫瘍縮小を示し、−1を下回る値は、ベースライン値の二倍を越えた増殖を示す)。
記載の試験で利用されている化合物は、下の「二重特異性抗体」、「除去剤」および「放射標識キレート」という見出しの表に提示されている。
使用される腫瘍細胞株およびマウスにおける接種のための注射量は、下の表「腫瘍細胞株」に記載されている。BxPC3は、CEAを天然に発現するヒト初代膵臓腺癌細胞株である。BxPC3細胞は、10%ウシ胎仔血清(GE Healthcare Hyclone SH30088.03)を強化したRPMI−1640培地、GlutaMAX(商標)Supplement、HEPES(Gibco、参照番号72400−021)において培養した。HPAF−II(CRL−1997)は、CEAを天然に発現するヒト膵臓腺癌細胞株である。HPAF−II細胞は、10%標準ウシ胎仔血清、1%GlutaMAX 100×、1%MEM NEAA(最小必須培地非必須アミノ酸)100×(Gibco 11140−035)および1%ピルビン酸ナトリウム(100mM;Gibco 11360−070)を強化したEMEM培地(Gibco 31095−029)において培養した。WSU−DLCL2は、CD20を天然に発現するヒトB細胞リンパ腫細胞株である。WSU−DLCL2細胞は、10%ウシ胎仔血清を強化したRPMI−1640培地(Gibco、参照番号72400−021)において培養した。NCI−N87は、HER2を天然に発現する胃がん細胞株である。NCI−N87細胞は、10%ウシ胎仔血清を強化したRPMI−1640培地(Gibco、参照番号72400−021)において培養した。固形異種移植片は、Corning(登録商標)Matrigel(登録商標)基底膜マトリックス(増殖因子低下;カタログ番号354230)と1:1混合したRPMIまたはDMEM培地における細胞の右側腹部への皮下注射により、試験0日目に各SCIDマウスにおいて確立した。
実施例31:腫瘍モデルにおけるCEA−PRITの有効性(プロトコール103)
本試験は、マウスにおけるs.c.BxPC3腫瘍の処置のためにCEA−DOTAM BsAbを使用してCEA−PRITの有効性を評価した。治療法は、10もしくは30μCiの212Pb−DOTAMによる単一処置として、または2種の放射能レベルのいずれかのための3回の反復サイクルにおいて投与した。非CEA結合コントロール抗体(DIG−DOTAM)、CEA−DOTAM BsAb単独(放射能なし)および処置なし(PBS)を使用したPRITとの比較を行った。第1および第2のサイクル後に体内分布検査を行って、212Pb−DOTAM標的化およびクリアランスを確認し、TGI、TRおよび生存の観点から処置有効性を評価した。試験を通してマウスを慎重にモニターして、異なる処置スケジュールの忍容性を評価した。試験概要を図42に示す。
24時間p.i.の212Pbのin vivo分布は、図43から分かる通り、皮下BxPC3腫瘍における高い取り込みおよび正常組織における低い蓄積を実証した。CEA−DOTAMによってプレターゲティングされた腫瘍および非CEA結合BsAb DIG−DOTAMによってプレターゲティングされた腫瘍の間の有意差は、処置の高い特異性を確認した。シダックの多重比較検定による一方向分散分析(ANOVA)は、1(50.3%ID/g)および2(43.0%ID/g)回の10μCi注射の間にも、1(37.6%ID/g)および2(24.1%ID/g)回の30μCi注射の間にも、212Pbの平均腫瘍取込みに有意差がなかったことを示した。同様に、1サイクルの10μCiおよび1サイクルの30μCiの投与の間に有意差はなかった(p>0.05)。しかし、いずれかのCEA−DOTAM処置と比較したDIG−DOTAMによりプレターゲティングされた腫瘍における2サイクルの30μCi(2.9%ID/g)後の腫瘍取込みと同様に、腫瘍取込みは、2サイクルの10μCiと比較して、2サイクルの30μCiの後に有意により低かった。図43のパネルBは、%ID/gが、様々な処置群内で、異なるサイズの腫瘍に関して匹敵したことを示す。
倫理的な理由からマウスの屠殺を動機づける観察された有害事象は、2群に選別することができる:1)腫瘍状態および2)放射線誘発毒性。第1の群は、壊死性および/または潰瘍性腫瘍を指し、これは、マウスが、自身のまたはケージ仲間の腫瘍区域を「清潔にする」よう促す。このステージに達したマウスは、苦痛を回避するため直ちに安楽死させた。
本出願人らは、単剤療法レジメンとして与えると、反復CEA−PRITと10または30μCiの212Pb−DOTAMが、生存およびTGIの有意な増加をもたらしたが、この設定において、完全腫瘍根絶も持続性腫瘍制御ももたらさなかったと結論付ける。経時的な腫瘍制御を維持しつつ放射線誘発毒性を回避するために、これらの結果は、30μCi未満だが10μCiを超える212Pb−DOTAMの使用を示唆する。
プロトコール116および121は、高い腫瘍取込みおよび均一な腫瘍内BsAb分布に基づいて、CEA−PRITのためのBsAbおよびCA注射間の適切な時間の選択をガイドするように設計した。プロトコール116は、免疫蛍光染色によって検出される、i.v.注射後4、7および14日目に、BxPC3モデルにおけるCEA発現と比較して腫瘍内BsAb分布を評価した。プロトコール121は、1、4、7および10日後のBxPC3腫瘍における、鉛−203(203Pb)で直接的に標識したBsAbの蓄積を評価した。BsAbは、212Pb(半減期10.6時間)と比較してより長い期間にわたり発達を追跡することができるように、Pb同位体203Pb(半減期2.2日間)で標識した。
プロトコール116におけるマウスを安楽死の後に剖検し、脾臓、腎臓、肝臓、筋肉および腫瘍を採集した。収集された組織を2つの小片に分割した:一方は、Tissue−Tek(登録商標)最適切削温度(OCT)包埋化合物を含有する凍結用の型(cryomold)に入れ、急速凍結のためにドライアイスの上に置き、他方は、10%中性緩衝ホルマリン(NBF)中で24時間固定し、次いで、パラフィン包埋まで貯蔵のためにPBSに移した。OCT中の凍結した試料は、切片作製まで−80℃で維持した。下表に収載されている試薬を使用して、組織学的染色を行った。
プロトコール116における組織学的染色に使用される試薬
凍結した腫瘍は、Leica CM1850 UVクライオトーム(cryotome)を使用して、12μmスライスとなるよう切片作製し、−20℃でスライドを貯蔵した。染色前に、スライドを1時間室温(RT)で解凍し、次いで、PBS(1×、pH7.4)で5分間、続いて冷アセトン(−20℃)において5分間、もう一度PBSで5分間洗浄した。紙片を組織の周りに置いてスライドを乾燥させ、疎水性のペン(Dako;Agilent)を使用して組織を囲むように丸を描いた。1時間RTにおいて、400μLのブロッキング血清(ヤギ)と共に切片のインキュベーションを行った。ブロッキング血清を除去し、200μLの一次抗体(ウサギIgG抗ヒトCEA)を切片に添加し、続いて暗くしたチャンバー内で一晩4℃でインキュベーションした。2日目に、切片を10分間PBSで2回洗浄し、400μLのブロッキング血清を添加した。1時間RTにおけるインキュベーション後に、ブロッキング血清を除去し、200μLの二次抗体(Alexa Fluor 488標識ヤギ抗ウサギIgG)および対比染色(ヘキスト)を切片に添加し、続いて暗くしたチャンバー内で2時間RTでインキュベーションした。次に、スライドを10分間PBSで2回洗浄した。最後に、蛍光マウント用培地(Dako S3023;Agilent)およびカバーガラスをスライドに加え、その後これを風乾させ、−20℃の暗所に貯蔵した。染色したスライドの解析は、Zeiss Axio Scope.A1モジュラー顕微鏡を使用して行った。
凍結した腫瘍切片は、一次抗体の代わりにPBSを用いた以外は上のCEA染色について記載されている通りに、貯蔵および処理した。二次抗体は、Alexa Fluor 555で標識したヤギ抗ヒトIgGであった。
プロトコール116由来の凍結した腫瘍切片のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色は、Leica Autostainer XL自動スライド染色装置を使用して行った。
プロトコール121におけるマウスは、体内分布を調べる目的のため屠殺し、終結前に後眼窩出血によりその血液を収集した。加えて、膀胱、小腸、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、胃、肝臓、肺、心臓、脳、大腿骨、筋肉、皮膚、尾および腫瘍を安楽死後に採集し、放射能に関して測定した。
免疫蛍光染色 − プロトコール116
未処置コントロールは、収集した腫瘍に均一に分布した高レベルのCEAを呈した。CEA−DOTAM BsAbのコントロール染色は、予想通りシグナルをもたらさなかった。
BxPC3腫瘍を有するSCIDマウスにおける平均203Pb蓄積およびクリアランスを図48に示す。CAの助けなしの抗体から予想される通り、血液クリアランスはゆっくりであった。正常臓器または組織において、標識BsAbの予想外の取り込みがないことが明らかになった。注射1日後の49%ID/gの平均から開始し、それぞれ4、7および10日目に130、189および197%ID/gへと増加する、経時的な腫瘍蓄積を図49に示す。標識ネガティブコントロールは、注射後4日目に3%ID/gにより、腫瘍蓄積をもたらさなかった。
結果は、注射4および7日後の間で腫瘍における203Pb−BsAb取り込みの全体的な増加を示したが、時間間隔を10日間に拡張した場合に、さらなる改善は達成されなかった。顕微鏡下で、腫瘍へのBsAb浸透は、4日後と比較して、7日後に改善された。14日時点での利益は見られず、この時点までに、全体的な蛍光シグナルは、腫瘍内分布を改善することなく、減少するように思われる。本試験は、4日間よりも、7日間のBsAb−CA時間間隔を選ぶことを支持する。
プロトコール146は、s.c.BxPC3腫瘍を保有するSCIDマウスにおける、腫瘍および正常組織への吸収放射線量の推定のために、PRIT後のin vivo 212Pb−DOTAM分布データをもたらすように設計した。Caを使用して212Pb−DOTAMのクエンチングを行った(実施例34を参照)。
医療内部被ばく線量(Medical Internal Radiation dose)(MIRD)委員会のパンフレット21号(Bolch WE、Eckerman KF、Sgouros GおよびThomas SR. J Nucl Med 2009;50:477〜484)に概要が述べられている形式に従って、吸収線量を計算した。公式には、標的組織または領域rTにおける吸収線量D(rT)は、全ての供給源領域rSを合計した、単位放射能あたりの吸収線量率S(rT←rS)を乗じた、放射能A(rS,t)の時間積分として計算される。212Pb崩壊系列によって放出された圧倒的多数のエネルギーが、アルファ線に由来し、さらに、アルファ線のはるかにより高い生物学的有効性(相対生物学的有効性、RBEによって特徴づけられる通り)によると仮定すると、次の2つの見積もりが得られた:
1.エネルギーは、アルファ粒子の短い範囲により、局所的に吸収され、これは、項S(rT←rT)のみが考慮されることを意味し、
2.ベータおよびガンマ線からの寄与が無視される。
A0[μCi]は、注射された放射能であり、λは、212Pbの指数関数的崩壊速度0.0651h-1(10.6時間の半減期に対応)である。
体内分布
腫瘍を有するSCIDマウスにおける平均212Pb蓄積およびクリアランスを図50に示す。放射能蓄積は、腫瘍において高く、既に注射5分後に17%ID/gであり、6時間p.i.までに40%超に増加し、当該レベルで少なくとも48時間残っていた。腫瘍がない状態と比較して、正常組織において、大きな差は発見されなかった。
プロトコール146のために計算されたGy単位の平均吸収線量を表24に、絶対値として(RBE=1)、およびアルファ放射体のより高い細胞毒性に対する補正して(RBE=5)の両方で示す。SCIDマウスに関して、平均体重は、18.5gであった;20μCiの注射された212Pb放射能により、これは、1.1μCi/g体重の正規化された注射された放射能をもたらした。
およそ20Gyの吸収線量が、腫瘍において達成されたが、大部分の正常組織における吸収線量は、2Gyをはるかに下回ったままであった。全体的に見て、本試験は、評価されるPRITレジメンを使用した、用量規制毒性の主要リスクを示さなかった。
アルファ放射体212Pbは、トリウム含有樹脂からの溶出後にDOTAMにキレート化され、薬理学的に活性な212Pb−DOTAMを産生する。放射標識後に、過剰(>99%)な遊離非キレート化DOTAMが、溶液中に残り、環境から金属イオンを容易に捕捉する。患者への注射後に、これは、循環中のCa2+に急速に結合し、薬理学的に不活性なCa−DOTAMを形成するであろう。CEA−DOTAM BsAbは、Pb−DOTAMに優先的に結合するように設計されているが、匹敵する程度でCa−DOTAMとも安定した複合体を形成するであろう。結果として、プレターゲティングされた腫瘍部位からの212Pb−DOTAMのブロックが、飽和条件で起こり得、PRIT処置の有効性を潜在的に減少させる。したがって、潜在的な競合を回避するために、クエンチングステップが、212Pb−DOTAM溶出プロセスに加えられ、それによると、金属イオン(「X」)が、有意により高い解離定数(Kd)を有する「X−DOTAM」の形成を制御するために導入される。KinExA(動力学排除アッセイ)平衡測定によって決定される、様々なX−DOTAMキレートに対するDOTAM結合剤の親和性を下表に示す。
212Pb−DOTAM注射2時間後の全ての収集された組織における平均212Pb蓄積およびクリアランスを図52に示す。Pbコントロールと比較して、クエンチング金属のいずれかの間の平均%ID/gに統計的有意差はなかった(ダネットの多重比較検定による二方向ANOVA)。腫瘍および選択された正常組織の個々の値を図53に示す。212Pb含有量におけるより大きい個々の差異が、他の金属と比較して、ZnおよびGdによるクエンチング後の脾臓および筋肉において観察されたが、異なる処置群の間の平均%ID/gにおける差は、有意でなかった(チューキーの多重比較検定による一方向ANOVA)。
プロトコール131は、Ca−またはPb−クエンチングと比較して、DOTAMのZn−、Gd−またはCu−クエンチングからの、プレターゲティングされた212Pb−DOTAMの腫瘍および正常組織蓄積における効果を評価した。212Pbの腫瘍取込みにおける差は観察されず、適用された実験条件下でコントロールCaおよびPbを使用して、プレターゲティングされた結合部位の有意なブロックがないことを示す。ZnおよびGdによるクエンチング後に、脾臓および筋肉における212Pb含有量の差異増加が観察され、212Pb−DOTAMと競合する金属−DOTAM複合体が、非標的化組織における非CA結合CEA−DOTAMの中和に寄与し得ることを示す。Cuによるクエンチングは、Caクエンチングに匹敵する結果をもたらし、示されたCu−DOTAMのin vivo不安定性をさらに確認する。3つの主要な理由により、DOTAMのクエンチングのためにCaを最終的に選んだ:Cuクエンチングと比較した、212Pb−DOTAM溶液のin vivo製剤の制御増加;212Pbの正常組織取り込みにおける可変性を低下させる、非CA結合BsAbの中和を増大させる潜在力;および亜飽和条件下で容易に到達可能な標的への即時結合により、抗原に対し高い親和性を有する分子の浸透が制限される、仮定上の「結合部位障壁」現象の効果を低下させる潜在力。
プロトコール151および152は、それぞれ完全ヒト化BsAbのCD20−DOTAMおよびHER2−DOTAMによってプレターゲティングされたマウスにおける皮下腫瘍への212Pb−DOTAMの結合を評価することを目標とした。抗体コンストラクト、続いて7日間後にCa−DOTAM−デキストラン−500 CA、最後に24時間後に212Pb−DOTAMの注射により、3段階PRITを行った。放射能注射24時間後にマウスを屠殺し、放射能測定のために血液および臓器を採集した。
体内分布 − プロトコール151
注射24時間後の全ての収集された組織における平均212Pb含有量を図54に示す。ネガティブコントロールBsAb DIG−DOTAMは、WSU−DLCL2腫瘍に放射能蓄積を生じなかったが(0.4±0.3%ID/g)、CD20−DOTAM BsAbは、25.0±3.7%ID/gをもたらした。膀胱(12.5±4.5%ID/g)、腎臓(3.1±0.3%ID/g)および肺(2.2±0.2%ID/g)を除いて、正常組織/臓器に有意な212Pb取り込みは見られなかった。
注射24時間後の全ての収集された組織における平均212Pb含有量を図55に示す。ネガティブコントロールBsAb DIG−DOTAMは、NCI−N87腫瘍に放射能蓄積を生じなかったが(0.8±0.4%ID/g)、HER2−DOTAM BsAbは、24.6±1.5%ID/gをもたらした。非常に低い値の腎臓(1.6±0.1%ID/g)および肺(1.4±0.2%ID/g)を除いて、正常組織/臓器に有意な212Pb取り込みは見られなかった。
プロトコール151および152の結果は、CEA−PRITのために開発された3段階プレターゲティング手法を使用した、CD20−PRITおよびHER2−PRITの特異的標的化およびin vivo概念実証を実証した。
プロトコール154は、PRITのための5種の新規CEA−DOTAM BsAbコンストラクトの使用を評価することを目標とした。本プロトコールは、皮下HPAF−II異種移植片を保有するSCIDマウスにおける212Pb−DOTAMのin vivo分布および腫瘍蓄積データをもたらすように設計された。CEA−DOTAMコンストラクト、続いて7日後にCa−DOTAM−デキストラン−500 CA、最後にCAの24時間後に212Pb−DOTAMの注射により、3段階PRITを行った。放射能注射6時間後にマウスを屠殺し、放射能測定のために血液および臓器を採集した。標準CEA−DOTAM BsAbおよび非CEA結合BsAbを使用したPRITとの比較を行った。試験概要を図56に示す。
注射6時間後の全ての収集された組織における平均212Pb蓄積およびクリアランスを図57に示す。血液含有量および腫瘍蓄積を図58にさらに詳細に示す。ネガティブコントロールBsAb DIG−DOTAMは、腫瘍における放射能蓄積を生じなかったが(1.4±0.1%ID/g)、標準CEA−DOTAM BsAbは、36.8±3.4%ID/gをもたらした。新規コンストラクトに関して、対応する数値は、31.8±3.1%ID/g(P1AE1766)、35.0±8.5%ID/g(P1AE1767)、14.2±6.7%ID/g(P1AE1768)、38.8±10.1%ID/g(P1AE1769)および39.5±6.8%ID/g(P1AE1770)であった。P1AE1768の有意により低い腫瘍蓄積は、この抗体コンストラクトのCEA一価性によって説明することができる。
本試験の結果は、3段階PRITのために全ての被験CEA−DOTAM抗体コンストラクト(P1AE1766、P1AE1767、P1AE1768、P1AE1769およびP1AE1770)のin vivo概念実証を実証した。
本試験の目標は、代替標的:表面抗原分類20(CD20)に対して作製されたCEA−PRITのために開発された処置レジメンの概念実証を示すことであった。皮下WSU−DLCL2腫瘍を有するマウスにおける3サイクルのCD20−PRITの後に、治療有効性を評価した。次のものとの比較も行った:注射前に212Pb−DOTAMとプレインキュベートしたBsAbを使用した1段階CD20−RIT;CD20に対して作製されたI型モノクローナル抗体であるリツキシマブ、およびCD20+疾患の処置における参照;ならびに同様にCD20に対して作製されたII型モノクローナル抗体であるGA101。
本試験は、本実施例の執筆時にまだ進行中であるが、それ相応の予備的結果を報告することができる:
注射24時間後の全ての収集された組織における平均212Pb蓄積およびクリアランスを第1の処置サイクルに関して図60に示す。ネガティブPRITコントロールは、腫瘍における取り込みをもたらさなかった(0.7%ID/g)。腫瘍取込みは、CD20−PRITおよびCD20−RITの両方に関して22%ID/gであった。
本試験は、CEA−PRITのために以前に実証されたものに匹敵する腫瘍増殖阻害の指標により、CD20−PRITの概念実証を示した。CD20−PRIT処置は、良好な耐容性を示し、これは、1段階CD20−RIT処置には当てはまらなかった。
以下の番号付きの陳述は、本発明のある特定のさらなる態様および実施形態である。
デキストラン−(リンカー−(M−DOTAM))x
[式中、
デキストランは、デキストランまたはその誘導体であり;
リンカーは、連結部分であり;
M−DOTAMは、DOTAMまたは金属イオンが組み込まれたその機能的変異体であり;および
x≧1である]
の化合物である、段落1に記載の除去剤。
[式中、yは1〜6であり、*はデキストランへの結合点を表し、**はDOTAMまたはその機能的変異体の環原子への結合点を表す]
の二価の基である、段落2または3に記載の除去剤。
方法が、コンジュゲートを濾過工程にかけて、50kDa以上、100kDa以上または200kDa以上の分子量カットオフ/閾値より下の種を除去することを含む、段落13から15のいずれか1つに記載の方法。
ii)Pb−DOTAMキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および/またはその抗原結合部位をブロックする、段落1から11のいずれか1つに記載の除去剤を投与すること;
を含み、必要に応じて、
iii)その後、Pb放射性同位体とキレート化したDOTAMを含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
をさらに含み;必要に応じて、
iv)キレート化された放射性核種が局在化した組織または臓器をイメージングすること
をさらに含む、プレターゲティングされた放射線イメージングの方法における使用のための、段落1から12のいずれか1つに記載の除去剤。
ii)Pb−DOTAMキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および/またはその抗原結合部位をブロックする、段落1から12のいずれか1つに記載の除去剤を投与すること
を含み;
必要に応じて、
iii)その後、Pb放射性同位体とキレート化したDOTAMを含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
をさらに含む、プレターゲティングされた放射線免疫療法の方法における使用のための、段落1から12のいずれか1つに記載の除去剤。
ii)Pb−DOTAMキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および/またはその抗原結合部位をブロックする、段落1から12のいずれか1つに記載の除去剤を投与すること
を含み;必要に応じて、
iii)その後、Pb放射性同位体とキレート化したDOTAMまたはその機能的変異体を含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
をさらに含み;必要に応じて、
iv)キレート化された放射性核種が局在化した組織または臓器をイメージングすること
をさらに含む、プレターゲティングされた放射線イメージングの方法。
ii)Pb−DOTAMキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および/またはその抗体結合部位をブロックする、段落1から12のいずれか1つに記載の除去剤を投与すること
を含み;必要に応じて、
iii)その後、Pb放射性同位体とキレート化したDOTAMまたはその機能的変異体を含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
をさらに含む、プレターゲティングされた放射線免疫療法の方法。
a)アミノ酸配列FIGSRGDTYYASWAKG(配列番号2)を含む重鎖CDR2、または配列番号2中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がPhe50、Asp56、およびTyr58を含まず、必要に応じて、Gly52および/またはArg54も含まない、その変異体;
b)アミノ酸配列ERDPYGGGAYPPHL(配列番号3)を含む重鎖CDR3、または配列番号3中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がGlu95、Arg96、Asp97、Pro98を含まず、必要に応じて、Ala100C、Tyr100D、および/もしくはPro100Eも含まない、ならびに/または必要に応じて、Tyr99も含まない、その変異体;
c)アミノ酸配列QSSHSVYSDNDLA(配列番号4)を含む軽鎖CDR1、または配列番号4中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がTyr28およびAsp32を含まない、その変異体;
d)アミノ酸配列LGGYDDESDTYG(配列番号6)を含む軽鎖CDR3、または配列番号6中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がGly91、Tyr92、Asp93、Thr95cおよびTyr96を含まない、その変異体
を含み、
番号付けが、Kabatによるものである、段落18もしくは19に記載の使用のための除去剤または段落20もしくは21に記載の方法。
i)アミノ酸配列GFSLSTYSMS(配列番号1)を含む重鎖CDR1もしくは配列番号1中に1、2、もしくは3個までの置換、必要に応じて、保存的置換を有するその変異体;および/または
ii)アミノ酸配列QASKLAS(配列番号5)を含む軽鎖CDR2もしくは配列番号5中に少なくとも1、2、もしくは3個の置換、必要に応じて、保存的置換を有するその変異体
を含む、段落23に記載の使用のための除去剤または方法。
a)アミノ酸配列GFSLSTYSMS(配列番号1)を含む重鎖CDR1
b)アミノ酸配列FIGSRGDTYYASWAKWG(配列番号2)を含む重鎖CDR2
c)アミノ酸配列ERDPYGGGAYPPHL(配列番号3)を含む重鎖CDR3
d)アミノ酸配列QSSHSVYSDNDLA(配列番号4)を含む軽鎖CDR1
e)アミノ酸配列QASKLAS(配列番号5)を含む軽鎖CDR2
f)アミノ酸配列LGGYDDESDTYG(配列番号6)を含む軽鎖CDR3
から選択される少なくとも1、2、3、4、5、または6つのCDRを含む、段落18から24のいずれか1つに記載の使用のための除去剤または方法。
i)配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体;または
i)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体
と同じエピトープ、または重複するエピトープに結合する、段落18から25のいずれか1つに記載の使用のための除去剤または方法。
d)重鎖CDR1が、配列番号11のアミノ酸配列を含む
e)重鎖CDR2が、配列番号12のアミノ酸配列を含む
f)重鎖CDR3が、配列番号13のアミノ酸配列を含む;
および/またはCEAに特異的な抗原結合部位が、少なくとも1、2、もしくは3つの軽鎖CDRを含み、
a)軽鎖CDR1が、配列番号14のアミノ酸配列を含む;
b)軽鎖CDR2が、配列番号15のアミノ酸配列を含む;
c)軽鎖CDR3が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
段落18から36のいずれか1つに記載の使用のための除去剤または方法。
a)配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;
b)配列番号12のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;
c)配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;
d)配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;
e)配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;
f)配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
から選択される少なくとも1、2、3、4、5、または6つ(すなわち、全部)のCDRを含む、段落37に記載の使用のための除去剤または方法。
i)配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号17に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体;および/または
ii)配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号18に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体
を含む、段落18から38のいずれか1つに記載の使用のための除去剤または方法。
i)配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号34に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体;および/または
ii)配列番号35のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号35に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体
を含む、段落18から35または41のいずれか1つに記載の使用のための除去剤または方法。
i)配列番号45のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号45に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体;および/または
ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号46に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体
を含む、段落18から35または44のいずれか1つに記載の使用のための除去剤または方法。
第1および第2の抗体重鎖と、第1および第2の抗体軽鎖とを含む完全長抗体であって、第1の重鎖と第1の軽鎖とが集合して、第1の抗原に対する抗原結合部位を含むFabを形成し、第2の重鎖と第2の軽鎖とが集合して、第2の抗原に対する抗原結合部位を含む交差Fabを形成する、完全長抗体
を含み;
第1または第2の抗体重鎖のいずれかが、リンカーを介して、CH1およびVHドメインを含むポリペプチドに融合されており、第1および第2のポリペプチドが集合して、第1の抗原に対する抗原結合部位を含むFabを形成するように、前記第1のポリペプチドが、CLおよびVLを含む第2のポリペプチドと集合する、段落51に記載の使用のための除去剤。
i)第1の抗原に対する抗原結合部位を含む完全長抗体、および
ii)第2の抗原に対する抗原結合部位を一緒になって形成する、少なくとも第2の重鎖可変ドメインと第2の軽鎖可変ドメインを含み、第1または第2の抗原のいずれかがPb−DOTAMキレートであり、他方が標的抗原である、
段落47から49のいずれか1つに記載の使用のための除去剤。
i)VLおよびCLドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VHドメインおよびCH1ドメインからなる第1のポリペプチド;または
ii)VHおよびCLドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VLドメインおよびCH1ドメインからなる第1のポリペプチド;または
iii)VLおよびCH1ドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VHドメインおよびCLドメインからなる第1のポリペプチド
を含む、段落55に記載の使用のための除去剤。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体;
b)
i)抗体重鎖可変ドメイン(VH);または
ii)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体定常ドメイン(CH1);または
iii)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;
c)
i)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);または
ii)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);または
iii)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチド
を含み;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になって第2の抗原に対する抗原結合部位を形成し、
第1または第2の抗原のいずれかがPb−DOTAMキレートであり、他方が標的抗原である、段落44に記載の使用のための除去剤または方法。
a)CEAに特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号22もしくは23のアミノ酸1〜450の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有し;
軽鎖が配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する、完全長抗体;ならびに/または
b)
i)配列番号7の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン(VH);もしくは
ii)配列番号7の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1);もしくは
iii)配列番号7の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;ならびに/または
c)
i)配列番号8の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン(VL);もしくは
ii)配列番号8の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);もしくは
iii)配列番号8の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチド
を含み;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になってPb−DOTAMキレートに対する抗原結合部位を形成する、段落60に記載の使用のための除去剤または方法。
a)CEAに特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号19もしくは20のアミノ酸1〜450の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有し;
軽鎖が配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する、完全長抗体;
b)
i)配列番号9の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン(VH);もしくは
ii)配列番号9の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1);もしくは
iii)配列番号9の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;
c)
iii)配列番号10の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン(VL);もしくは
ii)配列番号10の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);もしくは
iii)配列番号10の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチド
を含み;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になってPb−DOTAMキレートに対する抗原結合部位を形成する、段落60に記載の使用のための除去剤または方法。
i)配列番号22の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する第1の重鎖、
ii)配列番号23の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する第2の重鎖、
iii)配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する2つの軽鎖
を含む、段落62に記載の使用のための除去剤または方法。
i)配列番号22のアミノ酸配列を有する第1の重鎖;
ii)配列番号23のアミノ酸配列を有する第2の重鎖;および
iii)配列番号21のアミノ酸配列を有する2つの抗体軽鎖
を含む、段落62のいずれか1つに記載の使用のための除去剤または方法。
i)配列番号19の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する第1の重鎖、
ii)配列番号20の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する第2の重鎖、
iii)配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する2つの抗体軽鎖
を含む、段落62に記載の使用のための除去剤または方法。
i)配列番号19のアミノ酸配列を有する第1の重鎖;
ii)配列番号20のアミノ酸配列を有する第2の重鎖;および
iii)配列番号21のアミノ酸配列を有する2つの抗体軽鎖
を含む、段落62に記載の使用のための除去剤または方法。
Claims (57)
- DOTAM−鉛(Pb)キレートに特異的な抗原結合部位を含む抗体であって、前記抗原結合部位が、少なくとも、
a)アミノ酸配列FIGSRGDTYYASWAKG(配列番号2)を含む重鎖CDR2、または配列番号2中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がPhe50、Asp56、およびTyr58を含まず、必要に応じて、Gly52および/もしくはArg54も含まない、その変異体;
b)アミノ酸配列ERDPYGGGAYPPHL(配列番号3)を含む重鎖CDR3、または配列番号3中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がGlu95、Arg96、Asp97、Pro98を含まず、必要に応じて、Ala100C、Tyr100D、および/もしくはPro100Eも含まない、ならびに/または必要に応じて、Tyr99も含まない、その変異体;
c)アミノ酸配列QSSHSVYSDNDLA(配列番号4)を含む軽鎖CDR1、または配列番号4中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がTyr28およびAsp32を含まない、その変異体;
d)アミノ酸配列LGGYDDESDTYG(配列番号6)を含む軽鎖CDR3、または配列番号6中に1、2、もしくは3個までの置換を有し、これらの置換がGly91、Tyr92、Asp93、Thr95cおよびTyr96を含まない、その変異体
を含み、
番号付けが、カバットによるものである、抗体。 - 重鎖CDR1と軽鎖CDR2とをさらに含む、請求項1に記載の抗体。
- i)アミノ酸配列GFSLSTYSMS(配列番号1)を含む重鎖CDR1もしくは配列番号1中に1、2、もしくは3個までの置換、必要に応じて、保存的置換を有するその変異体;および/または
ii)アミノ酸配列QASKLAS(配列番号5)を含む軽鎖CDR2もしくは配列番号5中に少なくとも1、2、もしくは3個の置換、必要に応じて、保存的置換を有するその変異体
を含む、請求項2に記載の抗体。 - 抗原結合部位が、
a)アミノ酸配列GFSLSTYSMS(配列番号1)を含む重鎖CDR1
b)アミノ酸配列FIGSRGDTYYASWAKWG(配列番号2)を含む重鎖CDR2
c)アミノ酸配列ERDPYGGGAYPPHL(配列番号3)を含む重鎖CDR3
d)アミノ酸配列QSSHSVYSDNDLA(配列番号4)を含む軽鎖CDR1
e)アミノ酸配列QASKLAS(配列番号5)を含む軽鎖CDR2
f)アミノ酸配列LGGYDDESDTYG(配列番号6)を含む軽鎖CDR3
から選択される少なくとも1、2、3、4、5、または6つのCDRを含む、請求項1から3のいずれかに記載の抗体。 - i)配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体;または
i)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体
と、Pb−DOTAMキレートの、同じエピトープ、または重複するエピトープに結合する、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。 - ヒト、キメラまたはヒト化されたものである、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗原結合部位が、配列番号7および配列番号9からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、または配列番号7もしくは配列番号9に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗原結合部位が、配列番号8および配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または配列番号8もしくは配列番号10に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗原結合部位が、配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗原結合部位が、配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗原結合部位が、100pM、50pM、20pM、10pM、5pM、1pM以下のKd値でPb−DOTAMキレートに結合する、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗原結合部位が、Pb−DOTAMキレートおよびBi−DOTAMキレートに結合し、Bi−DOTAMキレート/Pb−DOTAMキレートのKd値の比が、0.1〜10または1〜10の範囲にある、請求項1から11のいずれか一項に記載の抗体。
- 全抗体である、またはFv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、ダイアボディ、直鎖状抗体、もしくは単鎖抗体分子からなる群から選択される抗体断片である、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗体が、標的抗原に特異的に結合する部分にカップリングされている、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体。
- 標的抗原が、腫瘍特異的抗原である、請求項14に記載の抗体。
- 多重特異性または二重特異性抗体、必要に応じて、請求項17から51のいずれか一項に記載の多重特異性抗体または二重特異性抗体である、請求項14または15に記載の抗体。
- Pb−DOTAMキレートに特異的な少なくとも1つの抗原結合部位と、標的抗原に対する少なくとも1つの抗原結合部位とを含む多重特異性または二重特異性抗体。
- Pb−DOTAMキレートに特異的な抗原結合部位が、請求項1から12のいずれか一項に定義された通りである、請求項17に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- 標的抗原が、腫瘍特異的抗原である、請求項17または18に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- 腫瘍特異的抗原が、CEA、HER2およびCD20からなる群から選択される、請求項19に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- 腫瘍特異的抗原が、がん胎児性抗原(CEA)である、請求項20に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- 多重特異性または二重特異性抗体が、Pb−DOTAMキレートに特異的な少なくとも1つの抗原結合部位と、CEAに特異的な少なくとも1つの抗原結合部位とを含み、CEAに特異的な抗原結合部位が、少なくとも1、2もしくは3つの重鎖CDRを含む重鎖を含み、
d)重鎖CDR1が、配列番号11のアミノ酸配列を含む
e)重鎖CDR2が、配列番号12のアミノ酸配列を含む
f)重鎖CDR3が、配列番号13のアミノ酸配列を含む;
かつ/またはCEAに特異的な抗原結合部位が、少なくとも1、2、もしくは3つの軽鎖CDRを含み、
a)軽鎖CDR1が、配列番号14のアミノ酸配列を含む;
b)軽鎖CDR2が、配列番号15のアミノ酸配列を含む;
c)軽鎖CDR3が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
請求項17から21のいずれか一項に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - CEAに対する抗原結合部位が、
a)配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;
b)配列番号12のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;
c)配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;
d)配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;
e)配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;
f)配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
から選択される少なくとも1、2、3、4、5、または6つ(すなわち、全部)のCDRを含む、請求項22に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - 多重特異性または二重特異性抗体が、Pb−DOTAMキレートに特異的な少なくとも1つの抗原結合部位と、CEAに特異的な少なくとも1つの抗原結合部位とを含み、CEAに特異的な抗原結合部位が、
i)配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号17に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体;および/または
ii)配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号18に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体
を含む、請求項17から23のいずれか一項に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - CEAに特異的な抗原結合部位が、配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび/または配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項24に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- 多重特異性または二重特異性抗体が、Pb−DOTAMキレートに特異的な少なくとも1つの抗原結合部位と、ERBB2に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位とを含み、ERBB2に特異的な抗原結合部位が、(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される少なくとも1、2、3、4、5、または6つのCDRを含む、請求項17から20のいずれか一項に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- 多重特異性または二重特異性抗体が、Pb−DOTAMキレートに特異的な少なくとも1つの抗原結合部位と、ERBB2に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位とを含み、ERBB2に特異的な抗原結合部位が、
i)配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号34に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体;および/または
ii)配列番号35のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号35に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体
を含む、請求項17から20または26のいずれか一項に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - ERBB2に特異的な抗原結合部位が、配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび/または配列番号35のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項27に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- 多重特異性または二重特異性抗体が、Pb−DOTAMキレートに特異的な少なくとも1つの抗原結合部位と、CD20に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位とを含み、CD20に特異的な抗原結合部位が、(a)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される少なくとも1、2、3、4、5、または6つのCDRを含む、請求項17から20のいずれか一項に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- 多重特異性または二重特異性抗体が、Pb−DOTAMキレートに特異的な少なくとも1つの抗原結合部位と、CD20に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位とを含み、CD20に特異的な抗原結合部位が、
i)配列番号45のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号45に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体;および/または
ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号46に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体
を含む、請求項17から20または29のいずれか一項に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - CD20に特異的な抗原結合部位が、配列番号45のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび/または配列番号46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、段落30に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- Fc領域を含む、請求項17から31のいずれか一項に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- Fc領域がエフェクター機能を低下させるように操作されている、請求項32に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- Fc領域残基234、235、238、265、269、270、297、327および/または329のうちの1つまたは複数の置換によるFc領域、請求項33に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- 第1および第2の抗体重鎖と、第1および第2の抗体軽鎖とを含む完全長抗体を含み、第1の重鎖と第1の軽鎖とが集合して、第1の抗原に対する抗原結合部位を形成し、第2の重鎖と第2の軽鎖とが集合して、第2の抗原に対する抗原結合部位を形成し、
第1または第2の抗原のいずれかがPb−DOTAMキレートであり、他方が標的抗原である、請求項32から34のいずれか一項に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - 第1の抗原に対するさらなる抗原結合部分をさらに含む、請求項35に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- 第1および第2の抗体重鎖と、第1および第2の抗体軽鎖とを含む完全長抗体であって、第1の重鎖と第1の軽鎖とが集合して、第1の抗原に対する抗原結合部位を含むFabを形成し、第2の重鎖と第2の軽鎖とが集合して、第2の抗原に対する抗原結合部位を含む交差Fabを形成する、完全長抗体を含み;
第1または第2の抗体重鎖のいずれかが、リンカーを介して、CH1およびVHドメインを含むポリペプチドに融合されており、第1および第2のポリペプチドが集合して、第1の抗原に対する抗原結合部位を含むFabを形成するように、前記第1のポリペプチドが、CLおよびVLを含む第2のポリペプチドと集合する、請求項36に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - 第2の抗体重鎖のN末端が、リンカーを介して前記第1のポリペプチドに融合されている、請求項37に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- i)第1の抗原に対する抗原結合部位を含む完全長抗体;および
ii)第2の抗原に対する抗原結合部位を一緒になって形成する、少なくとも第2の重鎖可変ドメインと第2の軽鎖可変ドメインを含み、
第1または第2の抗原のいずれかがPb−DOTAMキレートであり、他方が標的抗原である、請求項32から34のいずれか一項に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - 第1の抗原に対する抗原結合部位を含む完全長抗体を含み、重鎖の1つのNまたはC末端が、ポリペプチドリンカーを介して、第1のポリペプチドに連結されており、第1のポリペプチドが、第2のポリペプチドと会合して、第2の抗原に対する結合部位を含むFabまたは交差Fabを形成する、請求項39に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- i)VLおよびCLドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VHドメインおよびCH1ドメインからなる第1のポリペプチド;または
ii)VHおよびCLドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VLドメインおよびCH1ドメインからなる第1のポリペプチド;または
iii)VLおよびCH1ドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VHドメインおよびCLドメインからなる第1のポリペプチドを含み;
第1および第2のポリペプチドが、一緒になって、第2の抗原に対する抗原結合部位を形成する、請求項40に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - 第1の抗原に対する抗原結合部位を含む完全長抗体を含み、重鎖の1つのC末端が、ポリペプチドリンカーを介して、VHおよびCLドメインからなる第2のポリペプチドと会合している、VLドメインおよびCH1ドメインからなる第1のポリペプチドに連結される、請求項41に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- a)第1の抗原に特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体;
b)i)抗体重鎖可変ドメイン(VH);または
ii)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体定常ドメイン(CH1);または
iii)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;
c)i)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);または
ii)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);または
iii)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチド
を含み;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になって第2の抗原に対する抗原結合部位を形成し、
第1または第2の抗原のいずれかがPb−DOTAMキレートであり、他方が標的抗原である、請求項39に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - 第1の抗原が標的抗原であり、第2の抗原がPb−DOTAMキレートである、請求項35から43のいずれか一項に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- 第1の抗原がCEAである、請求項44に記載の多重特異性または二重特異性抗体。
- a)CEAに特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号22もしくは23のアミノ酸1〜450の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有し;
軽鎖が配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する、完全長抗体;
b)i)配列番号7の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン(VH);もしくは
ii)配列番号7の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1);ならびに
iii)配列番号7の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;ならびに
c)i)配列番号8の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン(VL);もしくは
ii)配列番号8の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);もしくは
iii)配列番号8の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチドを含み;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインは、一緒になってPb−DOTAMキレートに対する抗原結合部位を形成する、請求項45に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - a)CEAに特異的に結合し、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号19もしくは20のアミノ酸1〜450の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有し;
軽鎖が配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する、完全長抗体;
b)i)配列番号9の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン(VH);もしくは
ii)配列番号9の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1);もしくは
iii)配列番号9の重鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなるポリペプチドであって、
VHドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の一方のC末端に融合されているポリペプチド;
c)i)配列番号10の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン(VL);もしくは
ii)配列番号10の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL);もしくは
iii)配列番号10の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖定常ドメイン(CH1)
からなるポリペプチドであって、
VLドメインのN末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の2つの重鎖の他方のC末端に融合されているポリペプチド
を含み;
(b)の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび(c)の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になってPb−DOTAMキレートに対する抗原結合部位を形成する、請求項45に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - i)配列番号22の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する第1の重鎖、
ii)配列番号23の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する第2の重鎖、および
iii)配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する2つの抗体軽鎖
を含む、請求項45に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - i)配列番号22のアミノ酸配列を有する第1の重鎖;
ii)配列番号23のアミノ酸配列を有する第2の重鎖;および
iii)配列番号21のアミノ酸配列を有する2つの抗体軽鎖
を含む、請求項48に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - i)配列番号19の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する第1の重鎖、
ii)配列番号20の重鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する第2の重鎖、
iii)配列番号21の軽鎖に対する少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する2つの抗体軽鎖
を含む、請求項45に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - i)配列番号19のアミノ酸配列を有する第1の重鎖;
ii)配列番号20のアミノ酸配列を有する第2の重鎖;および
iii)配列番号21のアミノ酸配列を有する2つの抗体軽鎖
を含む、請求項50に記載の多重特異性または二重特異性抗体。 - 請求項1から51のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセット。
- 請求項52に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含むベクター。
- 請求項52に記載のポリヌクレオチドのセットを一緒に含む、ベクターのセットを含むキットまたは組成物。
- 発現ベクターである、請求項53に記載のベクターまたは請求項54に記載のベクターのセット。
- 必要に応じて、請求項53に記載のベクターまたは請求項54に記載のベクターのセットを含む、請求項52に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセットを含む原核または真核宿主細胞。
- 請求項56に記載の宿主細胞から抗体を発現させることを含む、請求項1から51のいずれか一項に記載の抗体を生産する方法。
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