CN104628859A - 抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和应用 - Google Patents

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CN104628859A CN201510039112.2A CN201510039112A CN104628859A CN 104628859 A CN104628859 A CN 104628859A CN 201510039112 A CN201510039112 A CN 201510039112A CN 104628859 A CN104628859 A CN 104628859A
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Ningbo shenghuada Technology Co., Ltd.
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Chu Qinliang
Canetech Capital Investment Management Co Ltd (bvi)
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Abstract

本发明公开了一种抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和应用,该抗人癌胚抗原抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为:GFAVSSNHRSGNVPGFSRGQYEESWYFDL;其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为RASQSIDSYLNGASNLRNHQAYSPFT。该抗体为全人源抗人癌胚抗原抗体,与人癌胚抗原具有高亲和力,能用于检测和治疗人体癌症疾病。

Description

抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及一种抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和应用。
背景技术
肿瘤标志物(Tumor Marker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织,或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量,它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质,借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能,以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。
在与恶性肿瘤的斗争中,医生、患者和家属往往最关心的是如何尽早发现肿瘤的产生、发展、转移。X线诊断机、CT机、MRI机等诊断仪器和技术的发展,使得目前已能够发现直径>5mm的肿瘤,对早期检出肿瘤和评价治疗效果、帮助医生修改治疗方案提供了有力的支持。但是,仍然有一部分肿瘤的“残渣余孽”因为其体积太小或位于体内特殊位置而难以被识别出来,这些“漏网之鱼”在暗处悄悄长大,导致肿瘤复发、转移,最终夺去了不少患者的生命。那么,有没有其他办法帮助识别出这些潜在的威胁呢?答案就是一类重要指标,即目前在临床诊治中广泛应用的“肿瘤标记物”。它们是一类能通过化验血液、尿液或肿瘤组织查出、并反映体内肿瘤情况的物质,与以上所述的影像学形态检查方法相比,可称之为“无形表象”,是对形态诊断的有力补充。
广义来说,肿瘤标记物是某些肿瘤细胞上存在或分泌、排出到体液中的物质,可大致分为肿瘤细胞分泌物和肿瘤细胞表达物两类。前者是肿瘤细胞在发生、发展中产生的物质,肿瘤生长越旺盛、其量越多,反之,肿瘤生长被压制、其产生量也减少。这些物质往往是糖蛋白,可以通过检验血等体液查出并进行监测。目前常用的有肺癌肿瘤标记物群(CEA、Cyfra21-1、NSE等)、消化道肿瘤标记物群(CEA、CA199、CA242、CA724等)、CA153(乳腺癌等)、CA125(卵巢癌等)、AFP(肝癌等)、PSA(前列腺癌等)、HCG(绒癌等)[Tannous BA,Teng J(2011)“Secreted blood reporters:Insights and applications”Biotechnol Adv.29(6):997-1003;Khunger M,Kumar U,Roy HK,Tiwari AK.(2014)“Dysplasia and cancer screening in21st century.”APMIS 122(8):674-682;Grunnet M,Mau-M.(2014)“Serum tumormarkers in bile duct cancer-a review.”Biomarkers 19(6):437-443;Napier KJ,Scheerer M,MisraS.(2014)“Esophageal cancer:A Review of epidemiology,pathogenesis,staging workup andtreatment modalities.”World J Gastrointest Oncol 6(5):112-120.]。它们往往在肿瘤很小时即可被检测出来,有助于早期发现病灶;则提示疗效可能不佳;如手术切除肿瘤一段时间后标记物进行性升高,则往往提示体内可能已经有肿瘤细胞增殖、生长,如在治疗后明显降低,则提示治疗有效,反之,需严密监视。
因此,有经验的肿瘤科医生往往会在对患者做影像检查、评估瘤体大小的同时抽血检查、动态观察相应标记物,以了解肿瘤生长是否仍然活跃、治疗后其活性是否被抑制等。它们的特点是反映灵敏、往往能早于CT、MRI等手段早期判断肿瘤生长状态,提醒医生是否需要更换治疗方案;弱点是准确性较低、不如影像学诊断可靠,所以,往往需要共同检验几个标记物、动态观察其变化、并结合其他临床表征做出判断。肿瘤标志物检测临床上常用于:(1)早期预警肿瘤发生、发展;(2)动态监测以反映治疗效果;(3)在无法取得肿瘤标本、明确病理诊断时对肿瘤性质做出某些提示、为试验性治疗提供参考依据。
人癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)是一种酸性糖蛋白,可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌,也存在于正常胚胎的消化管组织中,最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中,故名癌胚抗原。癌胚抗原是在胚胎时胃肠道、肝、胰腺合成的一种蛋白质。在成年人胃肠道中也有少量合成,但不进入血液系统而是通过胃肠道排出,因此,在正常成年人血清中只有微量的癌胚抗原。
癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物,它能向人们反映出多种肿瘤的存在,CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢、甲状腺髓样癌和泌尿系统的肿瘤[Grunnet M,Sorensen JB.(2012)“Carcinoembryonic antigen(CEA)as tumor marker inlung cancer.”Lung Cancer 76(2):138-43;Nagai Y,Beppu T,Sakamoto Y,et al.(2014)“Carcinoembryonic Antigen Half-life Is an Early Predictor of Therapeutic Effects in InductionChemotherapy for Liver Metastases from Colorectal Cancer.”Anticancer Res.34(10):5529-35;Chao YJ,Sy ED,Hsu HP,Shan YS.(2014)“Predictors for resectability and survival in locallyadvanced pancreatic cancer after gemcitabine-based neoadjuvant therapy.”BMC Surg.14:72.]。此外,对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预估计,CEA也是一个较好的肿瘤标志物。
癌旁正常粘膜CEA含量很少或为阴性。以胃癌为例,胃癌的CEA阳性率为85.58%;而其中胃粘液腺癌及印戒细胞癌(又称粘液细胞癌)的CEA阳性率为100%[Chung JK,Lee MC,Chung HK,Lim SM,Jang JJ,Koh CS(1995)“Concentration and distribution of tumor associatedantigens TAG-72and CEA in stomach cancer.”Ann Nucl Med.9(1):7-13.]。癌细胞质内CEA含量较多的原因与癌细胞CEA合成增加及CEA排出受阻有关。当癌细胞变性坏死时,细胞内膜结构受损破裂,CEA可出现在胞质的基质内。粘液细胞癌CEA分布在整个细胞膜和胞浆的膜结构中,CEA抗原决定基为糖蛋白,而肿瘤细胞的浸润和转移均与细胞膜糖蛋白的糖基化改变也有关。另外粘液细胞癌还能分泌释放大量蛋白水解酶,破坏癌细胞钙桥,溶解癌巢周围软组织。因此胃粘液细胞癌侵袭力强,转移率高。
目前,基于CEA的影像学诊断尚未报道和应用。因此,获得能检测CEA蛋白的抗体对于多种肿瘤的检测、影像学诊断和治疗显得非常有意义。
发明内容
本发明提供了一种抗人癌胚抗原抗体,该抗体为全人源抗人癌胚抗原抗体,与人癌胚抗原具有高亲和力,能用于检测和治疗人体癌症疾病。
一种抗人癌胚抗原抗体(简称抗人CEA蛋白抗体),包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为:GFAVSSNHRSGNVPGFSRGQYEESWYFDL其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为RASQSIDSYLNGASNLRNHQAYSPFT
其中,重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3分别位于重链可变区的第26~32位、第52~56位和第98~114位;轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3分别位于轻链可变区的第24~34位、第50~56位和第89~96位。
在抗体分子可变区上,三个高变区的氨基酸序列存在很大的变异性,而高变区之间的区域氨基酸序列则变化较小。这三个高变区在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补,因此又被称为互补决定区(CDR),不同重链轻链的CDR决定了抗体对抗原的特异性。
优选地,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
所述的抗人癌胚抗原抗体可以是全抗体或全抗体的抗原结合部分。所述的全抗体优选为IgG1型;所述的抗原结合部分优选为Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段或单链抗体,更优选为单链抗体。
抗原结合部分既保留了能与抗原特异结合的区域,又避免了Fc片段的抗原性而引起的副作用;其中单链抗体具有易渗透肿瘤组织中增加药物浓度,免疫原性小,在体内循环的半衰期短、易于清除,易于与毒素或酶基因连接从而直接获得免疫毒素或酶标抗体等优点。
抗原结合部分可以通过DNA重组技术或通过酶促/化学裂解全抗体来制备。本发明具体实施方式中以抗人癌胚抗原(CEA)单链抗体为例,其制备方法为:采用公开号为CN 1444651A的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库,并在该人单链抗体文库中筛选抗人CEA蛋白抗体。
本发明还提供了所述的抗人癌胚抗原抗体的编码基因,具体地,重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,轻链可变区编码基因如SEQ ID No.4所示。
本发明还提供了一种包含所述的编码基因的重组载体或表达系统。所述重组载体的原始载体为pACT2或pET27b。
本发明还提供了所述的抗人癌胚抗原抗体在制备肿瘤体外诊断试剂或肿瘤影像诊断试剂中的应用。本发明抗人癌胚抗原抗体能够特异性地结合人癌胚抗原,可用于肿瘤病人血清样本CEA肿瘤标志物的检测;也可将抗人癌胚抗原抗体注入人体内通过影像诊断对肿瘤进行影像检测。
其中,在上述两种应用中,所述人癌胚抗原是一种广谱性的肿瘤标志物,可用于多种肿瘤疾病的检测和预防,例如:大肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢、甲状腺髓样癌和泌尿系统的肿瘤等。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明抗人癌胚抗原抗体是一种既能用于检测多种肿瘤、也能治疗和预防人体疾病的全人源抗人癌胚抗原抗体,具有非常高的亲和力,能够特异性结合人癌胚抗原,有效检测多种肿瘤,对治疗相关肿瘤具有重要作用。
附图说明
图1为本发明抗人CEA蛋白单链抗体的结构示意图;
图2为本发明抗人CEA蛋白单链抗体#HCEA-A的特异性ELISA分析;
图3为本发明抗人CEA蛋白单链抗体#HCEA-A ELISA法检测多种肿瘤病人血清的结果;
图4为本发明抗人CEA蛋白单链抗体#HCEA-A检测小鼠肿瘤模型的影像结果;
A为白光条件下肿瘤模型裸鼠的照片;
B为在暗室中用620nm激发光观察人CEA的单链抗体hCEA-A与ICG偶联物在肿瘤模型裸鼠的影像(白色部分为抗体与肿瘤细胞结合产生的荧光)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1抗人CEA蛋白单链抗体的筛选
本实施例构建单链抗体库,并针对此单链抗体库进行抗人CEA蛋白单链抗体的筛选。
采用公开号为CN 1444651 A的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库,并在该人单链抗体文库中筛选抗人CEA蛋白单链抗体,具体实施过程如下:
1、扩增得到人抗体重链和轻链可变区DNA
以来自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白细胞的poly A+RNA(购自Clontech)为模板,利用oligo(dT)和随机引物(random primers),使用逆向转录酶试剂盒(购自Clontech),根据Clontech试剂盒所提供的方法指南,将poly A+RNA逆向转录成cDNA。
以上述cDNA为模板,利用一系列识别人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的引物,进行PCR扩增得到人抗体中所有的重链可变区和轻链可变区的DNA序列。一系列识别人抗体重链和轻链可变区基因的引物序列如下:
第一组为扩增人抗体重链可变区(VH)基因的5’-端引物(SEQ ID No.11~17),包括:
VH1b:5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(C/G)G-3’;
VH2b:5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA-3’;
VH3b:5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG G-3’;
VH4b:5’-CCATACGATGTTCCAGATTACGAGGTGCAGCTG(G/T)TGGAG(A/T)C(C/T)-3’;
VH5b:5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTCCAGCT(G/T)GT(A/G)CAGTCTGG-3’;
VH6b:5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTCTG-3’;
VH7b:5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGGTG(C/G)A(A/G)TCTGG-3’;
第二组为扩增人抗体重链可变区(VH)基因的3’-端引物(SEQ ID No.18~23),包括:
VH1f:5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGAC(A/G)GTGACCAGGGTG-3’;
VH2f:5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT-3’;
VH3f:5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGT-3’;
VH4f:5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3’;
VH5f:5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCGGTTGGGGCGGATGCACTCC-3’;
VH6f:5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA(A/G)GC-3’;
第三组为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的5’-端引物(SEQ ID No.24~32),包括:
VL1b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTGT(C/G)(C/G/T)TGACGCAGCCGCC-3’;
VL2b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATG(A/T)GCTGAC(A/T)CAGCCAC-3’;
VL3b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATGAGCTGA(C/T)(A/G)CAGC(C/T)ACC-3’;
VL4b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCCTGTGCTGACTCA(A/G)(C/T)C-3’;
VL5b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAG(A/G/T)CTGTGGTGAC(C/T)CAGGAGCC-3’;
VL6b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCC(A/T)G(G/T)GCTGACTCAGCC(A/C)CC-3’;
VL7b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTCTGAGCTGA(C/G)TCAGGA(C/G)CC-3’;
VL8b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTG(C/T)(C/T)CTGA(C/T)TCAGCCT-3’;
VL9b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTAATTTTATGCTGACTCAGCCCC-3’;
第四组为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的3’-端引物(SEQ IDNo.33~34),包括:
VL1f:5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATAGGACGGT(C/G)A(C/G)CTTGGTCC-3’;
VL2f:5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGAGAGGACGGTCAGCTGGGTGC-3’;
第五组为扩增人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的5’-端引物(SEQ ID No.35~38),包括:
VK1b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGACATCC(A/G)G(A/G/T)TGACCCAGTCTCC-3’;
VK2b:5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAATTGT(A/G)(A/T)TGAC(A/G)CAGTCTCC-3’;
VK3b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGATATTGTG(A/C)TGAC(C/G/T)CAG(A/T)CTCC-3’;
VK4b:5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAACGACACTCACGCAGTCTC-3’;
第六组为扩增人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的3’-端引物(SEQ ID No.39~42),包括:
VK1f:5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATTTCCACCTTGGTCC-3’;
VK2f:5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATCTCCA(C/G)CTTGGTCC-3’;
VK3f:5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATATCCACTTTGGTCC-3’;
VK4f:5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTAATCTCCAGTCGTGTCC-3’。
扩增人抗体中的重链可变区(VH)时,利用第一组引物与第二组引物的组合,即有42个PCR反应;扩增人抗体中的λ-轻链可变区(Vλ)时,利用第三组引物与第四组引物的组合,即有18个PCR反应;扩增人抗体中的k轻链可变区(Vk)时,利用第五组引物与第六组引物的组合,即有16个PCR反应。
第一组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2(Hua SB,Luo Y,Qiu M,Chan E,Zhou H,ZhuL.(1998)Gene.215:143-152.)(Hua SB,Qiu M,Chan E,Zhu L,Luo Y.(1997)Plasmid.38:91-96.)多克隆位点的上游同源序列(下划线部分);第四组和第六组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2多克隆位点的下游同源序列(下划线部分);而第二组、第三组和第五组引物中包含有连接肽序列(下划线部分),连接肽用于连接抗体的重链可变区和轻链可变区。
扩增时,PCR反应体系与反应条件均相同,PCR反应体系为:
将上述各组分混合均匀后置于PCR仪中进行反应。反应条件为:94℃解链1分钟,50℃退火1分钟,72℃延伸2.5分钟,循环30次。
2、连接载体多克隆位点的同源序列和连接肽序列
(1)以步骤1中PCR所得的人抗体重链可变区DNA为模板,分别以引物7和引物8为上游引物和下游引物,序列为:
上游引物(引物7,SEQ ID No.43,下划线部分为载体pACT2多克隆位点的上游同源序列):
5’-ACCCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCTGTATGGCTTACCCATACGATGTTCCAG ATTAC-3’;
下游引物(引物8,SEQ IDNo.44,下划线部分为连接肽反链序列):
5’-ACTGCCTCCACCACCGCTGCCACCTCCGCCAGATCCTCCGCCGCCTGATCCACCA CCGCC-3’;
进行PCR扩增,反应条件和体系同步骤1。反应完成后获得含5’-载体pACT2多克隆位点的上游同源序列和3’-连接肽反链序列的人抗体重链可变区DNA序列。
(2)以步骤1中PCR所得的人抗体轻链可变区DNA为模板,以引物9和引物10分别为下游引物和上游引物,序列如下:
上游引物(引物10,SEQ IDNo.45,下划线部分为连接肽顺链序列):
5’-GGCGGTGGTGGATCAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGCAGCGGTGGTGG AGGCAGT-3’;
下游引物(引物9,SEQ ID No.46,下划线部分为载体pACT2多克隆位点的下游同源序列):
5’-GAGATGGTGCACGATGCACAGTTGAAGTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTAC GA-3’;
进行PCR扩增,反应条件和体系同步骤1。反应完成后获得含3’-载体pACT2多克隆位点的下游同源序列和5’-连接肽顺链序列的人抗体轻链可变区DNA序列。
3、连接单链抗体(scFv)DNA
将步骤2中PCR扩增得到的含载体pACT2多克隆位点的同源序列和连接肽序列的人抗体重链可变区DNA和轻链可变区DNA混合,以该混合DNA为模板,分别以引物7和引物9为上游引物和下游引物,进行PCR扩增,反应条件和体系同步骤1。
如图1所示,反应完成后得到包括人抗体重链可变区DNA序列、轻链可变区DNA序列、载体pACT2多克隆位点同源序列以及连接肽DNA序列的单链抗体(scFv)DNA。
4、构建人单链抗体基因文库
将步骤3得到的单链抗体(scFv)DNA与经限制性内切酶(Bam HI和Eco RI)处理后的酵母双杂交载体pACT2按照原Clontech公司提供的方法(Yeast Protocol Handbook,PT3024-1)共同转入酵母菌株Y 187(MATα ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-901,leu2-3,112,gal4,gal80,met-,URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lac Z,MEL1)内,经细胞内同源重组后将单链抗体DNA整合到pACT2载体上,从而得到酵母双杂交单链抗体文库,单链抗体DNA片段与pACT2载体上的Gal4激活区域(Activation Domain,AD)融合在一起。
为检查该单链抗体基因文库的质量,从中随机挑出了21个克隆,对插入片段进行测序分析。分析结果表明,所有克隆都包括与Gal4融合在一起的单链抗体DNA片段,而且所有单链抗体DNA序列都是独特的。
经同源重组而得到的酵母双杂交单链抗体基因文库中抗体DNA拷贝数大约有1×108个,可应用于酵母双杂交技术筛选特定的抗体。
5、筛选抗体
(1)抗体筛选
使用编码人CEA蛋白的DNA作为抗原基因,对酵母双杂交单链抗体基因文库进行抗体筛选。
将编码人CEA成熟蛋白的DNA(序列见GenBank的ID号M15042,核苷酸92到2095)重组到载体pGBKT7中,构建pGBK-hCEA。pGBK-hCEA编码Gal4DNA结合区域(BindingDomain,简称BD)及在其C端融合了人CEA蛋白。
在编码人CEA蛋白的DNA序列得到验证后,将pGBK-hCEA质粒DNA转化入酵母菌株AH109(MATα,trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4,gal80,LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2,URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lac Z);带有pGBK-hCEA质粒的AH109酵母可在不含色氨酸的合成培养基(SD/-W)上生长。
将等量的含pGBK-hCEA的MATα型酵母细胞(AH109菌株)与含单链抗体基因文库的MAT型酵母细胞(Y187菌株)进行共同培养,使此二型细胞交配结合。由于载有单链抗体基因文库的pACT2载体含有Leu2基因,且pGBK-hCEA包含Trp1基因,因此,包含两种质粒的酵母细胞可以生长在不含亮氨酸和丝氨酸的酵母合成培养基(SD/-LW)。
存在单链抗体scFv与人CEA蛋白相互作用的酵母细胞会激活整合在菌株基因组中的报告基因ADE2和HIS3,从而使得酵母细胞可以生长在缺乏腺嘌呤,组氨酸,亮氨酸和色氨酸的培养基(SD/-AHLW)上,并在该平板培养基上形成菌落。
(2)特异性抗体筛选
1)半乳糖苷酶分析
由于存在scFv与人CEA蛋白相互作用的细胞也会激活整合在菌株基因组中的另一报告基因lac Z,因此检测酵母细胞内半乳糖苷酶是否表达可判断酵母细胞内scFv/CEA蛋白的存在。
在筛选培养基(SD/-AHLW)上总共挑选出67个菌落,使用半乳糖苷酶检测法检测lacZ表达。检测方法如下:
①将存在scFv/CEA蛋白相互作用的酵母接种到筛选培养基(SD/-AHLW)平板上生长;
②将酵母菌落转移到Whatman五号滤纸上;
③将带有酵母细胞菌落的滤纸浸入液氮之中,使细胞破裂;
④将滤纸从液氮中取出,并置于30℃的烘箱内;重复步骤(3)和(4)两次;
⑤将滤纸铺于适量的X-gal溶液中,并置于37℃的温箱内约15分钟;若菌落处显示蓝色,表明为半乳糖苷酶阳性,即lac Z基因被激活表达。
其中,X-gal溶液配方如下:
16.1g/L Na2HPO4·7H2O;
5.50g/L NaH2PO4·H2O;
0.75g/L KCl;
0.246g/L MgSO4·7H2O;
35mg/L X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside);
5mM-巯基乙醇;pH 7.0。
检测结果:上述挑选出的33个菌落中,有17个是半乳糖苷酶阳性,表明在这些菌落中报告基因lacZ被激活了。
2)特异结合分析
对上述17个半乳糖苷酶阳性菌落的scFv进行特异性分析,以验证单链抗体scFv是否特异性地与人CEA蛋白结合。
从上述17个半乳糖苷酶阳性的酵母中提取含有scFv的pACT2质粒DNA,再分别与pGBKT7空载体DNA、pGBK-hCEA质粒DNA、pGBK-Lam质粒DNA(编码Gal4DNA结合区域并在其C端融合有人核纤层蛋白C)共同转化到AH109酵母细胞内;转化后的酵母细胞先铺于SD/-LW平板培养基上生长,然后转移到SD/-AHLW平板培养基上;对长出的菌落作半乳糖苷酶分析,验证为阳性的菌落视为含有非特异性的scFv,将其剔除。
经上述特异性分析后,得到一个对人CEA蛋白具有特异性的单链抗体,编号为hCEA-A,使用ABI自动测序仪对该单链抗体进行测序分析,结果显示:
hCEA-A的重链可变区的DNA序列如SEQ ID No.3所示;
hCEA-A的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID No.1所示)为:QVQLVQSGGGLIQPGGSLRLSCAASGFAVSSNFMSWVRQAPGKGLEWVSTIHRSGNTHYADSVKGRFAISRDTSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRVPGFSRGQYEESWYFDLWGRGTLVTVSS
其中,下划线部分依次为三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3(SEQ ID No.5~7);
hCEA-A的轻链可变区的DNA序列如SEQ ID No.4所示;
hCEA-A的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID No.2)为:DIRVTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLRNGVPSRFSGSGSGAEFSLTISSLQPEDFATYYCHQAYSPFTFGPGTKVDIK
其中,下划线部分依次为三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3(SEQ ID No.8~10)。
实施例2特异性检测
本实施例将上述实施例筛选所得的单链抗体在细菌系统中表达、纯化,并测定其特异性。
1、单链抗体表达与纯化
将单链抗体hCEA-A的编码基因克隆到表达载体pET27b(+)中,构建得到pET27b-hCEAa;
将pET27b-hCEAa转化入表达细菌E.coli BL21(DE3),并按照Novagen公司提供的方法用IPTG(0.5mM)诱导表达;表达出的目标蛋白中,scFv的N端是pelB序列,pelB序列可将表达后的scFv分泌到BL21(DE3)的周质腔(periplasmic space)中;scFv的C端含有一个HSV标记物和一个6×His标记物,方便目标蛋白的纯化;应用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱分离纯化得到抗人CEA蛋白的单链抗体。
2、ELISA测试单链抗体对CEA蛋白的特异性
人CEA蛋白购自上海科兴生物科技有限公司。ELISA测试方法如下:
(1)用CEA蛋白包被96-孔板,在2-8℃过夜;
(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock作封闭处理;
(3)将单链抗体hCEA-A在0.02%BSA中作系列稀释后加入已包被有CEA蛋白的96-孔中,与CEA蛋白结合;
(4)将96-孔板清洗后,加入稀释5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体,用来检测结合了的单链抗体;
(5)将96-孔板清洗后,加入稀释10000倍的山羊抗鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶偶联物;
(6)将96-孔板最终清洗后,应用辣根过氧化物酶底物TMB试剂作显色处理;
(7)用0.5M的硫酸终止反应,并检测450nm的吸收光谱。
检测结果如图2所示,表明单链抗体#hCEA-A能有效地结合CEA蛋白。
实施例3抗人CEA蛋白单链抗体检测血清CEA
本实施例应用上述抗人CEA蛋白单链抗体检测肿瘤病人血清中CEA肿瘤标志物。
兔子抗人CEA的多克隆抗体(目录号sc-20131,H300)购自于美国Santa CruzBiotechnology公司。人CEA蛋白购自上海科兴生物科技有限公司。肿瘤病人血清样本和正常血清样本来自杭州武警医院。
ELISA测试方法如下:
(1)用兔子抗人CEA的多克隆抗体包被96-孔板,在2-8℃过夜;
(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock作封闭处理;
(3)将血清样本(100倍稀释)或人CEA蛋白在0.02%BSA-生理盐水中作稀释后加入上述已包被有兔子抗人CEA的多克隆抗体的96-孔中,多克隆抗体结合样本中的CEA蛋白;
(4)将96-孔板清洗后,将稀释在0.02%BSA-生理盐水中的单链抗体hCEA-A(0.1μg/ml)加入到上述的96-孔中;
(5)加入稀释5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体,用来检测结合了的单链抗体;
(6)将96-孔板清洗后,加入稀释10000倍的山羊抗鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶偶联物;
(7)将96-孔板最终清洗后,应用辣根过氧化物酶底物TMB试剂作显色处理;
(8)用0.5M的硫酸终止反应,并检测450nm的吸收光谱。
检测结果如图3所示,表明单链抗体hCEA-A能有效地结合CEA蛋白,用于肿瘤病人血清样本的CEA肿瘤标志物检测。
实施例4抗人CEA蛋白抗体对肿瘤影像检测
本实施例应用上述抗人CEA蛋白单链抗体对肿瘤进行影像检测。
吲哚青绿(Indocyanine green,ICG)在适当波长光源的激发下可发出绿色荧光。将ICG与单链抗体hCEA-A偶联后,由静脉注射有肿瘤的裸鼠动物模型。在激发光下观察肿瘤影像。
吲哚青绿(Indocyanine green,ICG)和偶联剂SMCC均购自Sigma公司;带有肝癌肿瘤的裸鼠动物模型由浙江大学提供。
纯化后的单链抗体hCEA-A(1.0mg/ml)与ICG(0.1mg/ml),根据Sigma公司提供的偶联反应条件,进行偶联,得到ICG-抗体hCEA-A偶联物;将该偶联物用无菌生理盐水稀释至0.2mg/ml;然后将0.1ml偶联物由尾静脉注射入带有肝癌肿瘤的裸鼠动物模型;三小时后在暗室中用620nm激发光观察人CEA的单链抗体hCEA-A与ICG偶联物在肿瘤的影像(图4B)。

Claims (10)

1.一种抗人癌胚抗原抗体,包括重链可变区和轻链可变区,其特征在于,所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为:GFAVSSNHRSGNVPGFSRGQYEESWYFDL;其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为RASQSIDSYLNGASNLRNHQAYSPFT
2.如权利要求1所述的抗人癌胚抗原抗体,其特征在于,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求2所述的抗人癌胚抗原抗体,其特征在于,所述抗人癌胚抗原抗体为全抗体或全抗体的抗原结合部分。
4.如权利要求3所述的抗人癌胚抗原抗体,其特征在于,所述的全抗体为IgG1型。
5.如权利要求3所述的抗人癌胚抗原抗体,其特征在于,所述的抗原结合部分为Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段或单链抗体。
6.一种如权利要求2所述的抗人癌胚抗原抗体的编码基因,其特征在于,重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,轻链可变区编码基因如SEQ ID No.4所示。
7.一种包含权利要求6所述的编码基因的重组载体。
8.一种包含权利要求6所述的编码基因的表达系统。
9.如权利要求1~5任一项所述的抗人癌胚抗原抗体在制备肿瘤体外诊断试剂中的应用。
10.如权利要求1~5任一项所述的抗人癌胚抗原抗体在制备肿瘤影像诊断试剂中的应用。
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