CN116813785A - 抗癌胚抗原的特异性抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗癌胚抗原的特异性抗体及其应用，所述特异性抗体包括第一可变区和第二可变区，其中所述第一可变区是抗体重链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所示；其中所述第二可变区是抗体轻链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：9，SEQ ID NO:10及SEQ ID NO：11所示。本发明还提供了编码本发明的抗体的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、宿主细胞、方法及应用。本发明还提供了包含本发明的抗体的产品、组合物和衍生物。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物技术、免疫学领域，涉及一种抗癌胚抗原的特异性抗体及其应用。
背景技术
癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是1965年由Gold和Freedman首先从结肠癌和胚胎组织中提取的一种肿瘤相关抗原，癌胚抗原是一种分子量为180～200kda的多糖蛋白复合物,主要存在于直肠，结肠癌组织和胚胎肠粘膜上；因这种抗原也存在于2～6个月胚胎的胃肠、肝脏和胰腺组织中，故名癌胚抗原。癌胚抗原在多种肿瘤中表达，是一个广谱性肿瘤标志物，目前在临床主要用辅助恶性肿瘤的诊断、判断肿瘤分期和病变程度、监测治疗和预报复发等。
以往把CEA作为早期诊断结肠癌和直肠癌的特异性标志物，经大量的临床实践，发现不仅胃肠道的恶性肿瘤CEA值可以升高，在乳腺癌、肺癌及其他恶性肿瘤的血清中也有升高。因此，癌胚抗原是一种广谱肿瘤标志物，虽然不能作为诊断某种恶性肿瘤的特异性指标，但在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、疗效评价等方面，仍有重要临床价值。
目前，检测CEA的方法较多，包括酶联免疫法(elisa)、化学发光(clia)免疫分析法、胶乳免疫比浊法等。采用酶联免疫法检测癌胚抗原的主要缺点是检测过程中需要手动操作，耗时长，结果重现性较差；采用胶乳免疫比浊法具有操作简单，但癌胚抗原胶乳免疫比浊试剂监测灵敏度低；采用化学发光法检测癌胚抗原准确性和可重复性都较好，所以一对灵敏度高，特异性强，稳定性高的抗体对是至关重要的。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种抗癌胚抗原的特异性抗体或其抗原结合片段。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种抗癌胚抗原的特异性抗体或其抗原结合片段，所述特异性抗体或其抗原结合片段包括第一可变区和第二可变区，其中所述第一可变区是抗体重链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所示；其中所述第二可变区是抗体轻链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：9，SEQ ID NO:10及SEQ ID NO：11所示。
在本发明中使用的术语“抗体”或“抗体分子”是指免疫球蛋白分子(包括IgG、IgE、IgA、IgM、IgD)和/或免疫球蛋白分子的免疫活性部分即包含抗体结合部位或互补位并能结合抗原的分子。“抗体结合部位”、“抗体结合片段”、“抗原结合片段”或“抗原结合部位”是特异结合抗原的包含重链和轻链可变区和高可变区(CDR)的抗体分子的结构部分。如本领域已知，抗体的特定特性涉及免疫球蛋白同种型。抗体或片段还可以来自包括鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等)和哺乳动物(例如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫等)种的任何来源的物种。
在本发明中使用的术语“特异性抗体”或“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体得到的抗体，即群体中包含的单个抗体是相同的，除了少量存在的天然发生突变的可能性以外。
进一步，所述特异性抗体或其抗原结合片段还包括重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4，轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中，重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：4、5、6、7所示氨基酸序列至少90％序列一致性；轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：12、13、14、15所示氨基酸序列至少90％序列一致性。
进一步，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列至少90％序列一致性；所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列至少90％序列一致性。
进一步，所述特异性抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。
在某些具体的实施方案中，本发明提供的特异性抗体或其抗原结合片段与本发明列出的CDR序列具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性但仍保持以类似于或高于其亲本抗性的水平与癌胚抗原结合的CDR序列。
在某些具体的实施方案中，本发明提供的特异性抗体或其抗原结合片段与本发明中列出的重链/轻链可变区序列具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性但仍保持在类似于或高于其亲本抗体对于癌胚抗原的特异性结合亲和力的水平的一个或多个可变区序列。在一个具体的实施例中，突变可发生在CDR区以外的区域，如在FR区发生突变。
本发明还提供了如下任一项所述的物质：
1)一种分离的多核苷酸分子或包含其的载体，所述多核苷酸分子编码前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段；
进一步，所述多核苷酸分子包括DNA或mRNA；
2)一种抗癌胚抗原的特异性抗体或其抗原结合片段的抗体衍生物，所述抗体衍生物包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段直接或间接的偶联到可检测标记物形成的复合物；
3)一种经过改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，所述改造的宿主细胞包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或前面所述的多核苷酸分子或包含其的载体；
4)一种检测癌胚抗原的产品，所述产品包含前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、前面所述的抗体衍生物，或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体；
5)一种检测癌症的产品，所述产品包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、前面所述的抗体衍生物，或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体；
6)组合物，所述组合物包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体，或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体。
在某些具体的实施方案中，本发明提供的抗体涵盖其抗原结合片段，如本发明所述使用的术语“抗原结合片段”是指作为全长抗体或抗体链的局部或部分的片段，其包含比完整或完全抗体少的氨基酸残基，同时保留抗原结合活性。术语“抗原结合片段”意图涵盖以下的抗体片段：抗体轻链可变结构域(VL)；抗体重链可变结构域(VH)；单链抗体(scFv)；F(ab')2片段；Fab片段；Fd片段；Fv片段；单臂(单价)抗体；通过这样的抗原结合片段的组合、组装或缀合而形成的双体抗体、三体抗体、四体抗体或任何抗原结合分子。如本文所用的术语“抗原结合片段”还可以涵盖以下各项组成的组中的抗体片段：单抗体；结构域抗体；和纳米抗体。片段可以经由对完整、完全抗体或抗体链进行化学、酶处理或通过重组手段获得。
进一步，所述载体包括质粒常规载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、piggyBac载体或Sleeping Beauty转座载体。
本发明中所使用的术语“载体”是指将转基因转移到宿主细胞中的多核苷酸序列。术语“载体”包括质粒、小染色体、噬菌体、裸DNA等。一种类型的载体是“质粒”，它是指环状双链DNA环，其中连接了另外的DNA片段。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体能够在导入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“载体”。通常，在重组DNA技术中有用的载体通常是质粒的形式。在本发明中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等同功能的这些其它形式的载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
载体还可以含有一个或多个标志物序列，其适用于鉴定已经转化或转染了载体的细胞或尚未转化或转染了载体的细胞。标志物包括编码增加或降低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码其活性通过本领域已知的标准测定可检测的酶(例如，β-半乳糖苷酶、荧光素酶或碱性磷酸酶)的基因，和可见地影响转化或转染的细胞、宿主、集落或斑块的表型的基因(例如，绿色荧光蛋白)。在某些实施方案中，本发明所用的载体能够自主复制和表达存在于DNA片段中与其可操作地连接的结构基因产物。
本发明中所使用的术语“可检测标记物”是指该部分通过与该部分偶联的分子状态的光学、电学或其它物理指标的改变生成可测定信号的物质。此类物理指标包括光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学和化学手段，例如但不限于荧光、化学荧光和化学发光等。在关于经标记的检测剂使用时，“直接标记物”是通过任何手段附着至检测剂的可检测标记物。在关于经标记的检测剂使用时，“间接标记物”是特异性结合检测剂的可检测标记物。因此，间接标记物包括下述部分：其是检测剂的部分的特异性结合部分。生物素和亲和素是所采用的此类部分的实例，例如通过使生物素化抗体与经标记的亲和素的接触以产生间接标记的抗体来应用。
进一步，所述改造的宿主细胞包括原核细胞中细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体，真核细胞中哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
进一步，所述改造的宿主细胞包括杂交瘤细胞。
本发明中所使用的术语“宿主细胞”指包装细胞系，其中载体由生产质粒产生。在替代方案中，术语“宿主细胞”可以指其中需要转基因表达的任何靶细胞。因此，“宿主细胞”是指含有已经以任何手段，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、转化、病毒感染、转染、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合引入细胞中的外源性或异源性核酸序列的原核或真核细胞。
在本文中的某些实施例中，术语“宿主细胞”是指用于体外生产本文中所描述的组合物的培养物。在本文中的其它实施例中，术语“宿主细胞”是指用于产生和包装病毒载体或重组病毒的细胞。另一具体实施例中，术语“宿主细胞”意图指针对如本文中所描述的抗体在活体内或活细胞生产的靶细胞。
进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、核酸膜条、芯片、系统、或装置。
进一步，所述产品或组合物还包括一种抗癌胚抗原的特异性抗体或其抗原结合片段，所述特异性抗体或其抗原结合片段包括第一可变区和第二可变区，其中所述第一可变区是抗体重链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：17，SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19所示；其中所述第二可变区是抗体轻链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25，SEQ ID NO:26及SEQID NO：27所示。
进一步，所述组合物包括药物组合物。
进一步，所述组合物包括药学上可接受的载体或赋形剂。
进一步，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。
进一步，所述特异性抗体或其抗原结合片段还包括重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4，轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中，重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：20、21、22、23所示氨基酸序列至少90％序列一致性；轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：28、29、30、31所示氨基酸序列至少90％序列一致性。
进一步，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列至少90％序列一致性；所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列至少90％序列一致性。
进一步，所述特异性抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。
进一步，所述产品包括能够辅助检测癌胚抗原的试剂。
进一步，所述产品包括收取受试者样本的用具。
进一步，所述受试者包括人或非人哺乳动物。
进一步，所述样本包括血液或血液组分、唾液、尿液、粪便、脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液、汗液、母乳、滑液、粘液、泪液、胆汁、胃液、组织间液、组织的活检或上皮细胞、房水、羊水、胸膜液或受试者的呼气。
本发明还提供了如下任一种方法，所述方法包括：
1)一种特异性地抑制癌胚抗原的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或前面所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体导入到生物体细胞中，通过表达前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段抑制癌胚抗原的活性；
2)一种生产前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括如下步骤：
a)提供前面所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体；
b)用步骤a)所述的载体转化宿主细胞；
c)在合适条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；
d)从宿主细胞培养液中分离纯化获得前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段；
3)一种制备前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或前面所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体导入到宿主细胞中；
4)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中癌胚抗原或其片段的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或将待测样品与前面所述的抗体衍生物接触，检测癌胚抗原或其片段与前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段的复合物的形成，或检测癌胚抗原或其片段与前面所述的抗体衍生物的复合物的形成。
本发明还提供了如下任一项所述的应用：
1)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、前面所述的抗体衍生物、或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在检测癌胚抗原或其片段中的应用；
2)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、前面所述的抗体衍生物、或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在检测癌症中的应用；
3)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备诊断癌胚抗原的产品中的应用；
4)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备诊断癌症的产品中的应用；
5)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备条件癌胚抗原活性或水平的药物中的应用。
附图说明
图1是血清浓度0-3141ng/ml时化学荧光检测图；
图2是血清浓度0-2621ng/ml时化学荧光检测图；
图3是血清浓度0.1570ng/ml时化学荧光检测图；
图4是血清浓度<5ng/ml时化学荧光检测图；
图5是优化后的化学荧光检测图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应该理解的是，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1小鼠的免疫
小鼠的免疫过程如表1所示：
表1小鼠的免疫过程
实施例2小鼠尾血效价检测
通过ELISA检测方法进行阳性孔筛选，首先进行抗原包被：抗原稀释至2ug/ml后加入100ul，25℃，2h；洗板，使用1％BSA封闭液200ul进行封闭，25℃，1h；洗板，加入细胞上清液50ul，25℃，30min或稀释抗体(腹水)100ul，25℃，30min；洗板，加入二抗：二抗稀释浓度为10000x，100ul，25℃，30min；洗板加入显色液：100ul，25℃，显色15min；加入终止液：50ul，酶标仪下进行读数，效价检测结果如表2所示。
表2小鼠尾血效价检测结果
结果显示，小鼠尾血效价达到融合标准，可以用于融合。
实施例3小鼠细胞融合和融合母克隆筛选结果
1、小鼠细胞融合
用极速猝死法杀死小鼠，与75％酒精中完全浸泡3分钟；超净台中剪取小鼠脾脏及腿部淋巴结细胞；超净台中充分研磨脾脏及淋巴结，使细胞充分释放；静置收集上清，尽量去除大的杂质，1000r/min，离心3min，去上清液，收集淋巴细胞；加入5ml红细胞裂解液，轻轻吹打细胞5次，使细胞均匀悬浮，去掉细胞中的红细胞。加入等体积的DMEM培养基，1000r/min，离心3min，去上清，收集淋巴细胞，再用DMEM洗3遍，离心收集细胞；取骨髓瘤细胞，使骨髓瘤细胞与淋巴细胞的比例在1：(3-5)，充分混匀，用DMEM洗3遍离心收集细胞；融合：加PEG1ml，1min加完，然后补加9ml DMEM培养基，5min加完(融合过程中轻轻震荡离心管)；离心收集杂交瘤细胞，补加HAT培养基，滴加到提前做好的饲养细胞中(一只小鼠铺4板)。
2、小鼠细胞融合母克隆筛选
通过ELISA检测方法进行阳性孔筛选，首先进行抗原包被：抗原稀释至0.1ug/ml后加入100ul，25℃，2h；洗板，使用1％BSA封闭液200ul进行封闭，25℃，1h；洗板，加入细胞上清液50ul/孔，25℃，30min；洗板，加入二抗：二抗稀释浓度为10000×，100ul，25℃，30min；洗板，加入显色液：100ul，25℃，显色20min；加入终止液：50ul，酶标仪下双波长进行读数，结果如表3、表4所示。
表3细胞1(C1)融合母克隆筛选结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 0.131 | 0.784 | 0.67 | 0.253 | 0.398 | 1.259 | 1.809 | 0.207 | 0.566 | 1.729 | 0.266 | 0.207 |
| B | 0.186 | 0.141 | 1.721 | 1.082 | 0.292 | 0.245 | 0.357 | 0.205 | 0.163 | 0.451 | 0.141 | 0.331 |
| C | 0.205 | 0.207 | 1.431 | 0.141 | 0.268 | 0.127 | 0.216 | 0.116 | 0.127 | 0.259 | 0.092 | 0.251 |
| D | 0.202 | 0.122 | 1.147 | 0.169 | 0.762 | 0.172 | 0.251 | 0.111 | 0.107 | 0.165 | 0.139 | 0.208 |
| E | 1.377 | 0.229 | 0.507 | 0.16 | 1.588 | 0.127 | 0.115 | 0.122 | 0.092 | 0.145 | 0.094 | 0.257 |
| F | 2.258 | 0.163 | 1.559 | 0.134 | 0.836 | 0.139 | 0.178 | 0.16 | 0.089 | 0.142 | 0.117 | 0.354 |
| G | 1.041 | 0.131 | 0.387 | 0.138 | 0.289 | 0.202 | 0.107 | 0.15 | 0.128 | 0.117 | 0.145 | 0.442 |
| H | 0.558 | 0.435 | 0.419 | 0.578 | 0.431 | 2.037 | 0.257 | 0.306 | 0.3 | 0.32 | 0.257 | 1.767 |
注：F1为选定母克隆细胞，为阳性对照细胞。
表4细胞8(C8)融合母克隆筛选结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 0.205 | 0.422 | 0.222 | 0.195 | 0.238 | 0.557 | 0.154 | 1.489 | 1.903 | 0.156 | 0.214 | 2.06 |
| B | 0.241 | 0.218 | 0.203 | 0.16 | 0.227 | 0.191 | 0.451 | 0.578 | 0.636 | 0.098 | 0.172 | 0.825 |
| C | 0.299 | 0.164 | 0.123 | 0.118 | 0.103 | 0.192 | 0.17 | 0.131 | 0.185 | 0.211 | 0.114 | 0.467 |
| D | 0.152 | 0.092 | 0.135 | 0.148 | 0.154 | 0.152 | 1.822 | 0.1 | 0.126 | 0.101 | 0.138 | 0.934 |
| E | 0.101 | 0.118 | 0.116 | 0.166 | 0.165 | 0.146 | 0.723 | 0.124 | 0.113 | 0.097 | 0.118 | 0.206 |
| F | 0.147 | 0.144 | 0.179 | 0.128 | 0.834 | 0.193 | 0.287 | 0.14 | 0.159 | 0.21 | 0.159 | 0.413 |
| G | 2.183 | 0.116 | 0.218 | 0.196 | 0.192 | 0.096 | 0.232 | 0.108 | 0.152 | 0.141 | 0.086 | 0.132 |
| H | 0.863 | 0.213 | 0.168 | 0.152 | 0.295 | 0.237 | 0.265 | 0.945 | 0.209 | 0.122 | 0.235 | 1.963 |
注：A12为选定母克隆细胞，为阳性对照细胞。
结果显示，最终选择了C1F1和C8A12作为选定的母克隆细胞株。
实施例4制备亚克隆及对应检测结果
通过ELISA检测方法进行阳性孔筛选，首先进行抗原包被：抗原稀释至2ug/ml后加入100ul，25℃，2h；洗板，使用1％BSA封闭液200ul进行封闭，25℃，1h；洗板，加入细胞上清液50ul/孔，25℃，30min；洗板，加入二抗：二抗稀释浓度为10000×，100ul，25℃，30min；洗板，加入显色液：100ul，25℃，显色20min；加入终止液：50ul，酶标仪下双波长进行读数，结果如表5、表6所示。
表5细胞1(C1F1)亚克隆检测结果
| 序号 | 名称 | OD值 | 备注 |
| 1 | C1F1 | 4.296 | 细胞注射 |
| 2 | CON- | 0.132 | 1×PBS |
| 3 | CON+ | 4.257 | 1000×血清 |
表6细胞8(C8A12)亚克隆检测结果
| 序号 | 名称 | OD值 | 备注 |
| 1 | C8A12 | 4.191 | 细胞注射 |
| 2 | CON- | 0.132 | 1×PBS |
| 3 | CON+ | 4.369 | 1000×血清 |
实施例5纯化抗体检测
通过ELISA检测方法进行阳性孔筛选，首先进行抗原包被：抗原稀释至0.1ug/ml后加入100ul，25℃，2h；洗板，使用1％BSA封闭液200ul进行封闭，25℃，1h；洗板，先将纯化抗体稀释到1mg，然后对抗体进行稀释，达到抗体上样浓度，100ul/孔，25℃，30min；洗板，加入二抗：二抗稀释浓度为10000×，100ul，25℃，30min；洗板，加入显色液：100ul，25℃，显色20min；加入终止液：50ul，酶标仪下双波长进行读数，具体结果如表7所示。
表7纯化抗体检测结果
试验筛选抗体C1F1和C8A12，序列如表8所示。
表8抗体序列
实施例6化学发光检测
对筛选出的特异性抗体C1F1和C8A12进行化学发光检测，结果如图1、图2、图3、图4所示，结果表明，在血清浓度范围为0-3141ng/ml时得到结果总结出公式为y＝1532.6x+144209，R2＝0.939；在血清浓度范围为0-2621ng/ml时得到结果总结出公式为y＝1729.1x+106886，R2＝0.9546；在血清浓度范围为0-1570ng/ml时得到结果总结出公式为y＝1867.2x+83747，R2＝0.9457；在血清浓度范围为<5ng/ml时得到结果总结出公式为y＝2421.8x+501.58，R2＝0.9446；将结果进行优化后得到结果如图5所示，结果显示，特异性抗体C1F1和C8A12优化后的线性公式为y＝2764x+43976，R2＝0.9938，显示两者之间存在很强的正相关性。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种抗癌胚抗原的特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述特异性抗体或其抗原结合片段包括第一可变区和第二可变区，其中所述第一可变区是抗体重链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2及SEQID NO：3所示；其中所述第二可变区是抗体轻链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：9，SEQ ID NO:10及SEQ ID NO：11所示。
2.根据权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述特异性抗体或其抗原结合片段还包括重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4，轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中，重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列具有与SEQ IDNO：4、5、6、7所示氨基酸序列至少90％序列一致性；轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：12、13、14、15所示氨基酸序列至少90％序列一致性。
3.根据权利要求1或2任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列至少90％序列一致性；所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列至少90％序列一致性。
4.根据权利要求1或2所述的特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述特异性抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。
5.如下任一项所述的物质：
1)一种分离的多核苷酸分子或包含其的载体，其特征在于，所述多核苷酸分子编码权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述多核苷酸分子包括DNA或mRNA；
2)一种抗癌胚抗原的特异性抗体或其抗原结合片段的抗体衍生物，其特征在于，所述抗体衍生物包括权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段直接或间接的偶联到可检测标记物形成的复合物；
3)一种经过改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，其特征在于，所述改造的宿主细胞包括权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或权利要求5中1)所述的多核苷酸分子或包含其的载体；
优选地，所述改造的宿主细胞包括原核细胞中细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体，真核细胞中哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞；
优选地，所述改造的宿主细胞包括杂交瘤细胞；
4)一种检测癌胚抗原的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求5中1)所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、权利要求5中2)所述的抗体衍生物，或权利要求5中3)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体；
5)一种检测癌症的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求5中1)所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、权利要求5中2)所述的抗体衍生物，或权利要求5中3)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体；
6)组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求5中1)所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体，或权利要求5中3)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体。
6.根据权利要求5所述的物质，其特征在于，所述载体包括质粒常规载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、piggyBac载体或Sleeping Beauty转座载体。
7.根据权利要求5中4)、5)任一项所述的产品，其特征在于，所述产品还包括一种抗癌胚抗原的特异性抗体或其抗原结合片段，所述特异性抗体或其抗原结合片段包括第一可变区和第二可变区，其中所述第一可变区是抗体重链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19所示；其中所述第二可变区是抗体轻链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO：25，SEQ ID NO:26及SEQ ID NO：27所示；
优选地，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列至少90％序列一致性；所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列至少90％序列一致性；
优选地，所述特异性抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和轻链恒定区；
优选地，所述产品包括试剂盒、试纸、核酸膜条、芯片、系统、或装置；
优选地，所述产品包括能够辅助检测癌胚抗原的试剂；
优选地，所述产品包括收取受试者样本的用具；
优选地，所述受试者包括人或非人哺乳动物；
优选地，所述样本包括血液或血液组分、唾液、尿液、粪便、脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液、汗液、母乳、滑液、粘液、泪液、胆汁、胃液、组织间液、组织的活检或上皮细胞、房水、羊水、胸膜液或受试者的呼气。
8.根据权利要求5中6)所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括一种抗癌胚抗原的特异性抗体或其抗原结合片段，所述特异性抗体或其抗原结合片段包括第一可变区和第二可变区，其中所述第一可变区是抗体重链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19所示；其中所述第二可变区是抗体轻链可变区，其抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：25，SEQ ID NO:26及SEQ ID NO：27所示；
优选地，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列至少90％序列一致性；所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列至少90％序列一致性；
优选地，所述特异性抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和轻链恒定区；
优选地，所述组合物包括药物组合物；
优选地，所述组合物包括药学上可接受的载体或赋形剂；
优选地，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。
9.如下任一种方法，其特征在于，所述方法包括：
1)一种特异性地抑制癌胚抗原的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或权利要求5中1)所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体导入到生物体细胞中，通过表达权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段抑制癌胚抗原的活性；
2)一种生产权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a)提供权利要求5中1)所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体；
b)用步骤a)所述的载体转化宿主细胞；
c)在合适条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；
d)从宿主细胞培养液中分离纯化获得权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段；
3)一种制备权利要求5中3)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或权利要求5中1)所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体导入到宿主细胞中；
4)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中癌胚抗原或其片段的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待测样品与权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或将待测样品与权利要求5中2)所述的抗体衍生物接触，检测癌胚抗原或其片段与权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段的复合物的形成，或检测癌胚抗原或其片段与权利要求5中2)所述的抗体衍生物的复合物的形成。
10.如下任一项所述的应用：
1)权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求5中1)所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、权利要求5中2)所述的抗体衍生物、或权利要求5中3)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在检测癌胚抗原或其片段中的应用；
2)权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求5中1)所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、权利要求5中2)所述的抗体衍生物、或权利要求5中3)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在检测癌症中的应用；
3)权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求5中1)所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、或权利要求5中3)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备诊断癌胚抗原的产品中的应用；
4)权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求5中1)所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、或权利要求5中3)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备诊断癌症的产品中的应用；
5)权利要求1-4任一项所述的特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求5中1)所述的分离的多核苷酸分子或包含其的载体、或权利要求5中3)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备条件癌胚抗原活性或水平的药物中的应用。
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