CN116003589A

CN116003589A - 一种应用于肿瘤标志物ca242的重组抗体的制备方法

Info

Publication number: CN116003589A
Application number: CN202211629299.8A
Authority: CN
Inventors: 李永刚; 李娜
Original assignee: Nanjing Genstars Biotech Co ltd
Current assignee: Nanjing Genstars Biotech Co ltd
Priority date: 2022-12-16
Filing date: 2022-12-16
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明公开了一种应用于肿瘤标志物CA242的重组抗体的制备方法，所述抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述抗体重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述抗体重链的CDR1、CDR2、CDR3可变区序列如SEQ ID NO.5~7所示，所述抗体轻链的CDR1、CDR2、CDR3可变区序列如SEQ ID NO.8~10所示。一种核酸分子，其编码所述的抗CA242抗体。本发明提供的抗体活性高、抗体批间稳定。本发明对于进一步实现抗CA242抗体的稳定表达和规模化生产具有重要意义。

Description

一种应用于肿瘤标志物CA242的重组抗体的制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种应用于肿瘤CA242的重组抗体的制备方法。

背景技术

CA242(糖链抗原242)是一种唾液酸化的鞘糖脂类抗原，该抗原在健康人群中含量极低，在胰腺癌、结直肠癌、胃癌患者体内血清水平显著升高，是胰腺癌、结直肠癌的肿瘤标志物。相较于CA199、CA50等肿瘤标志物，CA242在临床诊断恶性肿瘤时具有更高的灵敏性，CA242与CA199、CEA等多种肿瘤标记物的联合检测，对于恶性肿瘤的预防及治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的抗CA242抗体及其应用。本发明提供的抗体活性高、抗体批间稳定。本发明对于进一步实现抗CA242抗体的稳定表达和规模化生产具有重要意义。

本发明采用的技术方案如下：

一种抗C242抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有至少一个选自SEQ ID NO：5、6、7的重链CDR结构域和/或至少一个选自SEQ ID NO：8、9、10的轻链CDR结构域。

本发明的抗C724抗体或其抗原结合片段，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2和SEQ ID NO：7所示的CDR3；所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO：8所示的CDR1，SEQID NO：9所示的CDR2和SEQ ID NO：10所示的CDR3。

所述的抗CA242抗体，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的抗CA242抗体，其重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种核酸分子，其编码所述的抗CA242抗体。

抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；抗体轻链核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。

一种载体，其包含上述的核酸分子。

一种宿主细胞，其包含核酸分子或上述载体。

一种抗体偶联物，其为由所述的抗CA242抗体与载体或药物偶联得到，或者由所述的抗体与经化学或生物标记得到。

一种用于检测C724蛋白的试剂盒，包含所述的抗CA242抗体。

所述的抗体或核酸分子在制备用于诊断癌症的诊断剂或检测CA242的产品中的应用。

有益效果

本发明提供了一种新的抗CA242抗体，活性较高，稳定性好，加速七天稳定性降幅在20％以内，所述抗体能够很好地识别CA242，并具有高亲和力和特异性，为C242检测提供了一种新的选择。

附图说明

图1CA242细胞株上清SDS-PAGE电泳胶图，其中泳道1为还原条带，泳道2为非还原条带。

图2是抗CA242抗体纯度色谱图。

具体实施方式

实施例1抗体获取

1.1抗原免疫过程

抗原准备过程：用CA242蛋白作为免疫原，将抗原稀释至1mg/mL，首次免疫取50μL抗原溶液、与50μL细胞因子佐剂白介素-2；后续免疫取50μL抗原溶液、50μL细胞因子佐剂。用两只2mL注射器分别吸取抗原溶液与佐剂，尽可能排掉注射器中的空气并用三通链接，先将抗原推入佐剂中，在反复推动连接好的注射器约20min-40min，直至乳化后的抗原在水中不扩散为止。

免疫小鼠过程：选择健康的实验鼠，体表无明显外伤，积极进食，活泼，6至8周龄的老鼠为宜。采用腹腔注射方法，每21天免疫一次，当免疫两次之后，每次免疫后7天断尾取血检测效价，当效价达到要求时即可停止免疫，进行融合。

1.2细胞融合过程

材料准备：

配制HAT培养基，分装DMEM及PEG；手术器械、50mL塑料离心管、50mL玻璃离心管灭菌。提前一周复苏SP2/0细胞，培养并使之处于良好的生长状态。提前一天用HAT培养基采饲养细胞并铺板，融合一只老鼠需要铺5块饲养细胞版。

融合：

处理SP2/0：吹散，转移至50mL塑料离心管，1000r离心5min，弃上清，加DMEM，吹散，1000r离心5min，加DMEM至10mL左右，吹散，计数，备用。

提取脾细胞：

小鼠眼窝取血，脱颈处死，血样留作阳性对照。分离出小鼠脾脏，先用DMEM冲洗脾脏外部，再DMEM冲洗脾脏内部，收集冲洗液并转移至10mL玻璃离心管，计数。

1000r离心5min，弃上清，加DMEM吹散并转移至50mL玻璃离心管，将之前处理的SP2/0同时转移至50mL玻璃离心管，1000r离心5min，弃上清，在手背上磨匀。37℃温水浴，1min内加入1mL PEG，边加边摇，静置90s。1min内加1mL DMEM，30s内加1mL DMEM，逐渐加速，加DMEM至40～50mL，37℃静置10min，800r离心6min，弃上清，加HAT铺板。3天之后半换液，一周之后全换液，换HAT培养基培养。

1.3亚克隆挑选过程

观察细胞状态，当96孔内有肉眼可观察到的细胞团后，进行整板检测，挑选阳性较高的孔进行亚克隆，一个阳性孔一块板。

当6孔内有肉眼可观察到的细胞团后，进行亚克隆挑拣，每块板选择12个单个细胞团的孔进行亚克隆挑拣，选择阳性高，细胞状态好的细胞进行下一步亚克隆，至少进行三次亚克隆，最后挑选出阳性高、细胞状态好单克隆细胞团定株。

将挑出来的细胞团转移至24孔培养，待24孔细胞长好后转移至小方瓶培养。待小方瓶内细胞长好之后，进行冻存及制备腹水。

1.4腹水制备过程

提前一周给老鼠注射石蜡，每只老鼠0.5mL。待小方瓶内细胞长好之后，吹散，转移至10mL玻璃离心管，1000r离心5min，弃上清，加1mLDMEM，计数，按每只老鼠注射0.8×10⁶个细胞，每只老鼠注射0.5mL的量进行稀释，然后给老鼠腹腔注射细胞。观察老鼠状态，待小鼠腹部明显涨大即可开始抽取腹水并收集。

1.5抗体纯化过程

试剂准备：平衡/透析缓冲液：10mM PB(pH7.5)+100mM NaCl

100％饱和硫酸铵

柱清洗液：20mM Tris(pH8.0)+1.5M NaCl

设备准备：Q柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵、核酸蛋白检测仪。

33％硫酸铵沉淀

样品准备：冷冻的腹水25℃恒温水浴融化，用滤纸过滤去除油脂。

量取腹水120mL，加入1倍腹水体积的10mM PB(pH7.5)+100mM NaCl混匀；再加入1倍腹水体积体积饱和硫酸铵溶液，20-25℃搅拌沉淀10min，此时硫酸铵饱和度为33％；9000rpm，5℃离心10min，留取沉淀，弃上清；将沉淀按2/3倍腹水体积的10mM PB(pH7.5)+100mM NaCl悬起、混匀；

透析除盐：用10mM PB(pH7.5)+100mM NaCl透析液透析两次，透析比为1：50，每次透析时间不低于5h，不超过25h。透析后回收抗体，用滤纸过滤去除杂质备用。柱纯化：装填50mL Q柱，用2倍柱体积的0.1M NaOH清洗，再用5倍柱体积的超纯水洗涤备用；用5倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱，柱平衡好后将蛋白紫外检测仪显示值调整为0，作为基线；将透析后样品上样，上样速度为5-6mL/min，全程收集Q柱流穿液，A280检测值大于0.2时开始收集，直至检测值降至0.2停止收集，分管收集，此为目的蛋白；蛋白收集结束后，用3倍柱体积的20mM Tris(pH8.0)+1.5MNaCl清洗柱至无蛋白流出；用5倍柱体积超纯水冲洗填料，再用5倍柱体积的10mM PB(pH7.5)+100mM NaCl平衡柱准备第二次过Q柱；

第一次Q柱样上样，收集目的蛋白同步骤同上；

蛋白收集结束后，用3倍柱体积的20mM Tris(pH8.0)+1.5MNaCl清洗柱至无蛋白流出，再用5倍柱体积超纯水冲洗填料，柱长期不用则填充20％乙醇于5-8℃保存；抗体处理：量取收集的抗体体积，立即用5M NaCl将保存液NaCl浓度调为300mM；用10mM PB(pH7.5)+300mM NaCl缓冲液稀释，调整抗体浓度为3mg/mL，加100％Proclin300至终浓度为0.1％，0.22μm滤膜过滤除菌，按要求分装送检入库。

1.6抗体测序过程

将样品反转录后获得cDNA；扩增并获得重链和轻链可变区；将可变区基因分别克隆至pMD18-T载体后测序；使用IMGT/V-QUEST进行测序结果比对，之后得到全部序列，抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。抗体重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例2重组表达与大规模培养表达

2.1CHO细胞培养

使用添加1mM～10mM谷氨酰胺的CD CHO培养基复苏CHO细胞，置于转速120-150rpm，温度为37℃，二氧化碳为5％-8％的摇床中培养，定时计数并传代培养，保证细胞处于对数生长期。

2.2重组质粒电转CHO细胞

调节CHO细胞密度至1～3×10⁷cells/ml，将细胞置于离心管中，30-50μg无内毒素重组CA242质粒与700μl细胞吹打混合均匀，转入电转杯，电转，次日计数，按照活细胞数1.0×10⁴cells/孔铺96孔板。

2.3稳转细胞株加压筛选

使用20-50μmol/L MSX的筛选压力加压培养约14-25天，显微镜下筛选标记长出细胞团的孔，并记录汇合度，3-5天后转入24孔板培养，3-5天后转入6孔板培养，3-5天后取细胞上清液，SDS-PAGE电泳检测目的抗体表达情况，结果如图1所示。筛选抗体表达量较高的细胞孔扩增至30ml培养基中，细胞密度达到1.5-3.0×10⁶cells/ml时冻存细胞作为阳性细胞株。

2.4亚克隆细胞株筛选

复苏阳性细胞株，置于转速120-150rpm/min，温度为37℃，二氧化碳为5％-8％的二氧化碳摇床中培养，细胞密度达到1.5-3.0×10⁶cells/ml时传代，保证传代接种密度为2.0-5.0×10⁵cells/ml。传代两次后，使用培养基稀释细胞，以0.5cells/孔接种至96孔板静置培养。显微镜下挑选单细胞孔并作标记。10-20天后使用培养基将亚克隆细胞株逐步扩培至24孔板、6孔板和培养瓶，ELISA方法筛选IgG高表达细胞株。细胞密度达到1.5-3.0×10⁶cells/ml时冻存亚克隆细胞株。

2.5抗体的大量制备和纯化

复苏亚克隆细胞，传代两次至细胞状态稳定，使用摇瓶或发酵罐扩大培养至所需体系，期间添加葡萄糖等补料。14天后收集细胞上清，使用葡萄球菌A蛋白(ProteinA)进行亲和层析柱纯化，即可得到纯度大于90％的抗CA242抗体(图2)。

实施例3CA242抗体活性检测

采用罗氏CA242单抗作为对照抗体(罗氏CA242单抗为CA242抗体行业标杆，以此作为对照抗体)。将对照样品与抗体原样作为包被搭配罗氏CA242抗体标记样品，检测本发明CA242抗体活性结果，以下为考核校准盘(S0-S5)与2例罗氏定值血样检测结果：

3.1将提前包被好的板子和提前配制好的酶工作液、以及标杆定值样本取出恢复室温，做好实验布局的标注。

3.2加样：分别加25μL定值血样和100μL/孔的CA242标记样品，酶工作液是酶稀释液稀释的酶标样品，37℃温育60min。留有对照孔和空白孔。

3.3洗板：用PBST洗板5遍，扣干。

3.4发光读数：将发光底物A和B(A和B是外购试剂盒厂家的半成品，A大致成分是0.1％的鲁米诺(Tris缓冲液)，B大致成分是0.01％的双氧水(LM缓冲液))，等比例混匀(现配现用)后加入50uL/孔；1-5min内，用发光仪测发光值。结果如下表：

	对照抗体	CA242抗体原样
			S0	9777	44013
S1	82791	98956
			S2	207440	220089
S3	389201	456881
			S4	700319	1181351
S5	1612959	2248249
			31.0	375599	411289
99.65	1112280	1284997

由检测结果可知，与对照抗体相比，本发明CA242抗体活性相对较高，因此，本发明产生的CA242抗体活性检测合格。

实施例4CA242抗体稳定性检测

按照实施例2的方法制备三批CA242重组抗体，分别取100mg样品置于37℃培养箱，七天后将样本取出作为加速样本。将抗体原样、加速样本作为待检测样本，与实施例3的标记样品搭配组成检测试剂，检测不同浓度CA242重组抗体的活性(S0-S5)，比对样本稳定性。结果如下表：

由检测结果可知，三批加速样品活性与原样无显著差异，样品加速稳定性验证合格。抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO.1:

LIFVFLVEMGFHHVVRLVLNSGVLNSDFIEWACQRLHTHVSVHSVYVYIKYVYVYIYIFINLYHTHT

PILCAISTTLSAGLQATTAPGLNRILKGLTTVFWNLPQDWGTGPGWGKERRGKPAASLIHLPWPPM

TTAGHPNQPAFECKKSGGQGRVSLGTQSICRCWVKKSTEREASWDYRHATPHGRQLPYKMRLRPE

FSASQASIAIRQVNAQSMGTWHKNAFLLRGLLKNLLSTAYCHFMASLYRHPTSPFPNPGTVNNCQL

FPRWCLGDMEAGDRQGDAGGQAGMGYTNTSQKLIVRPSELNKDCID

轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

AVVTKGSPRSTVHPEYNMSGRWRDSLREIHRGFVNQICCGTNRQFSCTEGEVVRGTGENGLQRAL

ECSGAISAHCNHGHGDTAFSNCWVSLSSGTTGECHHARLIFCIFSTDGQASLGPQPGCWRKTDLDL

GLSSSIPLVGPLPRNRTGRLEYLNGVVFCLFFLLDRVSLRHPGWSAVQGMISAHLTSASWVQFSCLC

ATHRAQLTSWTLGIFSNFFFDG

抗体重链的可变区氨基酸序列SEQ ID NO.3：

LIFVFLVEMGFHHVVRLVLNSGVLNSDFIEWACQRLHTHVSVHSVYVYIKYVYVYIYIFINLYHTHT

PILCAISTTLSAGLQATTAPGLNR

抗体轻链的可变区氨基酸序列SEQ ID NO.4：

AVVTKGSPRSTVHPEYNMSGRWRDSLREIHRGFVNQICCGTNRQFSCTEGEVVRGTGENGLQRALECSGAISAHCNHGHGDTAFSNC

抗体重链的CDR1、CDR2、CDR3

SEQ ID NO.5：抗体重链的CDR1可变区序列：VEMGFHHV

SEQ ID NO.6：抗体重链的CDR2可变区序列：SDFIEWAC

SEQ ID NO.7：抗体重链的CDR3可变区序列：VYIKYV

轻链的CDR1、CDR2、CDR3

SEQ ID NO.8：抗体轻链的CDR1可变区序列：TKGSPR

SEQ ID NO.9：抗体轻链的CDR2可变区序列：EIHRGF

SEQ ID NO.10：抗体重链的CDR3可变区序列：RGTGENGL

抗体重链的核苷酸序列SEQ ID NO.11：

CTAATTTTTGTATTTTTAGTGGAGATGGGGTTTCATCATGTTGTCAGGCTGGTCTTGAATTCCTGAGGGGTGCTTTGAAATTCGGATTTTATTGAGTGGTGAGCATGCCAACGGCTACATACACATGTATCTGTACACAGTGTGTATGTTTATATAAAATATGTATATGTATACATATATATCTTCATCTAAAATCTATATCACACACATACCCCTATATTATGTGCTATATCTACCACACTAAGTGCTGGGTTACAGGCGTGAACCACCGCACCTGGCCTGAACAGAATTTTAAAAGGCTTAACAACTGTTTGATTTTAGTAATGGAATCTCCCCCAGGATTGGGGAACAGGGCCTGGCTGGGGAAAGGAGAGGCGAGGAAAGCCTGCAGCCTCACTGATCCACCTGCCTTGGCCGCCCATGTAAACCACAGCAGGGCACCCCAATCAACCTGCCTTTTAAGAGTGCAAAAAGAGTGGGGGCCAGGGGAGGGTCTCACTGGGGACACAGAGCATCTGCAGATGTTGGGTGAAAAAAAGCACTGAAAGGGAGGCTAGCTGGGATTACAGGCATGCAACACCACACGGGAGGCAGTTGCCATATAAAATGAGGCTGCGCCCAGAGTTCAGTGCGTCACAGGCGTAATCTATAGCAATACGGCAGGTTAACGCTCAGAGCATGGGAACATAATGGCATAAGAACGCTTTCCTCCTCAGAGGCCTTTTAAAGAATCTACTTTCCACAGCTTACTGTCATTTTATGGCCAGTTTATACAGGCACCCCACAAGCCCTTTTCCCAATCCTGGGACCTAGTAAGTGAACAACTGTCAGTTATTTCCGCGGTGGTGTCTGGGTGACATGGAAGCAGGGGACAGGCAGGGTGATGCTGGTGGCCAGGCAGGAATGGGATATACTAACACTTCCCAGTAAAAACTATGAATAGTTAGACCCAGTGAGTTAAATAAAGATTGTATTGAT

抗体轻链核苷酸序列SEQ ID NO.12：

GCAGTTGTGACGAAGGGGTCACCGCGGAGCACTGTTCATCCAGAATACAACATGAGCTGAGGC

AGGTGGAGGGATAGCCTCAGGGAGATTCACAGAGGCTTTGTCAACCAATGAATTTGTTGTGGA

ACAAACAGACAATTCTCCTGTACAGAGGGAGAGGTGGTGAGGTAAGGGACTTGAGGGGAAAA

TGGGCTGCAGCGGTAGGCACTGGAGTGCAGTGGCGCAATCTCGGCTCACTGCAACCATGGGCA

TGGGGATACAGCCTTTAGCTGAAACTGTTGGGTCAGCCTGAGTAGCGGGACTACAGGCGAGTG

CCACCACGCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTACAGATGGGCAGGCCAGCCTGGGGCCACAG

CCAGGGTGCTGGAGAAAGACGGACCTGGACTTAGGTCTCAGTTCTTCCATTCCACTATAGTAAG

TGGGGCCGCTGCCACGCAACAGGACAGGGAGACTTGAGTATCTGAACGGAGTTGTTTTTTGTT

TGTTTTTTCTTTTGGACAGAGTCTCGCTTCGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTTCAAGGCATGAT

CTCAGCTCATTTAACCTCTGCTTCCTGGGTTCAATGATTTTCCTGCCTTTGTGCCACCCATAGGG

CCCAACTGACTAGCTGGACATTGGGCATATTTTCAAATTTTTTTTTTTGAGATGGAG。

Claims

1.一种抗CA242抗体，其特征在于，所述抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的抗CA242抗体，其特征在于，所述抗体重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的抗CA242抗体，其特征在于，所述抗体重链的CDR1、CDR2、CDR3可变区序列如SEQ ID NO.5～7所示，所述抗体轻链的CDR1、CDR2、CDR3可变区序列如SEQ IDNO.8～10所示。

4.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的抗CA242抗体。

5.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，抗体重链的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；抗体轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

6.一种载体，其包含权利要求4所述的核酸分子。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求4的核酸分子或权利要求6的载体。

8.一种抗体偶联物，其特征在于，其为由权利要求1所述的抗CA242抗体与载体或药物偶联得到，或者由权利要求1所述的抗体与经化学或生物标记得到。

9.一种用于检测C724蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-2任一项所述的抗CA242抗体。

10.权利要求1所述的抗体或权利要求4所述的核酸分子在制备用于诊断癌症的诊断剂或检测CA242的产品中的应用。