CN114277079B - 一种清除类风湿因子免疫干扰的主动阻断剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种清除类风湿因子免疫干扰的主动阻断剂及其制备方法，属于生物技术药物技术领域，通过杂交瘤技术获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩增培养，收集细胞后用无血清培养基重悬，接种到发酵罐进入哺乳动物细胞发酵模式进行发酵，纯化获得活性抗体，换液至PBS缓冲液中，用滤膜进行无菌过滤，收集无菌过滤的滤液，获得主动阻断剂，‑20℃的条件下保存；该主动阻断剂针对IgA‑RF、IgM‑RF均表现出良好的亲和力，可以同时阻断两种类型RF，表现出更广泛的应用范围，并且主动阻断剂在使用20ug/mL的低浓度情况下，依然能够起到良好的免疫阻断效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术药物技术领域，具体涉及一种清除类风湿因子免疫干扰的主动阻断剂及其制备方法。
背景技术
类风湿因子(rheumatoid factor,RF)是以变性IgG的Fc片段为靶抗原的自身抗体。RF不仅与人和动物的变性IgG分子反应，也与自身lgG或异体lgG分子反应，还可与其他抗原(如核蛋白)发生交叉反应。RF可分为IgA-RF、IgG-RF、IgM-RF、IgD-RF和IgE-RF共5种类型。在临床上，使用免疫诊断试剂检测人体液样本时，常常因为RF的干扰，检测出现假阳(或假阴)性结果，导致误判，消除RF的干扰是免疫诊断试剂开发不可缺少的步骤。本发明提供了一种用于消除RF免疫干扰的主动阻断剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种清除类风湿因子免疫干扰的主动阻断剂及其制备方法，以解决背景技术中的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：一种清除类风湿因子免疫干扰的主动阻断剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：通过杂交瘤技术获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩增培养至5×105个/mL，收集细胞后用无血清培养基重悬，接种到5L发酵罐中，补加无血清培养基至800mL；
步骤二：进入哺乳动物细胞发酵模式；24小时后计数1.5×106个/mL，细胞活率90％，补加1000mL无血清培养基；48小时后计数2.0×106个/mL，细胞活率90％，补加1000mL无血清培养基；72小时后计数3.5×106个/mL，细胞活率90％，补加2000mL无血清培养基、3g/L大豆水解物200mL；96小时后计数4.5×106个/mL，细胞活率70％，停止补料；
步骤三：待细胞活率降到40％，收集培养物离心去除细胞，得到发酵液；
步骤四：将发酵液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到样品；将快速蛋白纯化系统的纯化柱平衡，将样品注入样品环，进样完毕后，使用PBS缓冲液平衡至电导参数及UV参数处于基线，接入洗脱液收集纯化产物，并立即用1M Tris缓冲液中和，得到纯化后的活性抗体；
步骤五：纯化后的活性抗体用规格为15mL、30K的超滤管换液浓缩，最终换液至PBS缓冲液中，在超净台内用孔径为0.22μm的滤膜进行无菌过滤，收集无菌过滤的滤液，获得主动阻断剂，-20℃保存；
进一步地，纯化柱的平衡操作为：AKTA PURE开机UV冲至基线，调零，将Protein A纯化柱接入柱阀，使用PBS缓冲液平衡至电导参数及UV参数处于基线；
进一步地，洗脱液为pH值为2.0的0.1M甘氨酸溶液；
进一步地，主动阻断剂包括活性抗体2-5mg/mL、KH2PO4 2mM、NaCl 137mM、Na2HPO48-13mM、KCl 2.7mM，余量为去离子水；
进一步地，无血清培养基购买于上海源培生物科技有限公司，货号为H630KJ；
进一步地，PBS缓冲液包括KH2PO4 2mM、NaCl 137mM、Na2HPO4 8-13mM、KCl 2.7mM，余量为去离子水。
本发明的有益效果：
该主动阻断剂针对IgA-RF、IgM-RF均表现出良好的亲和力，可以同时阻断两种类型RF，表现出更广泛的应用范围，并且主动阻断剂在使用20ug/mL的低浓度情况下，依然能够起到良好的免疫阻断效果。主动阻断剂采用无血清发酵的生产方式，批次间性能差异很小。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是本发明主动阻断剂与IgM-RF的亲和力检测图；
图2是本发明主动阻断剂与IgA-RF的亲和力检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
制备主动阻断剂，包括如下步骤：
步骤一：通过杂交瘤技术获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩增培养至5×105个/mL，收集细胞后用无血清培养基重悬，接种到5L发酵罐中，补加无血清培养基至800mL；
步骤二：进入哺乳动物细胞发酵模式；24小时后计数1.5×106个/mL，细胞活率90％，补加1000mL无血清培养基；48小时后计数2.0×106个/mL，细胞活率90％，补加1000mL无血清培养基；72小时后计数3.5×106个/mL，细胞活率90％，补加2000mL无血清培养基、3g/L大豆水解物200mL；96小时后计数4.5×106个/mL，细胞活率70％，停止补料；
步骤三：待细胞活率降到40％，收集培养物离心去除细胞，得到发酵液；
步骤四：将发酵液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到样品；将AKTA PURE开机UV冲至基线，调零，将Protein A纯化柱接入柱阀，使用PBS缓冲液平衡至电导参数及UV参数处于基线，将样品注入样品环；进样完毕后，使用PBS缓冲液平衡至电导参数及UV参数处于基线，接入洗脱液收集纯化产物，并立即用1M Tris缓冲液中和，得到纯化后的活性抗体；
步骤五：纯化后的活性抗体用规格为15mL、30K的超滤管换液浓缩，最终换液至PBS缓冲液中，在超净台内用孔径为0.22μm的滤膜进行无菌过滤，收集无菌过滤的滤液，取样进行SDS-PAGE电泳验证其纯度，使用超微量分光光度计检测抗体浓度，获得包括活性抗体2mg/mL、KH2PO4 2mM、NaCl 137mM、Na2HPO4 8mM、KCl 2.7mM的主动阻断剂，-20℃保存。
实施例2
制备主动阻断剂，包括如下步骤：
步骤一：通过杂交瘤技术获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩增培养至5×105个/mL，收集细胞后用无血清培养基重悬，接种到5L发酵罐中，补加无血清培养基至800mL；
步骤二：进入哺乳动物细胞发酵模式；24小时后计数1.5×106个/mL，细胞活率90％，补加1000mL无血清培养基；48小时后计数2.0×106个/mL，细胞活率90％，补加1000mL无血清培养基；72小时后计数3.5×106个/mL，细胞活率90％，补加2000mL无血清培养基、3g/L大豆水解物200mL；96小时后计数4.5×106个/mL，细胞活率70％，停止补料；
步骤三：待细胞活率降到40％，收集培养物离心去除细胞，得到发酵液；
步骤四：将发酵液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到样品；将AKTA PURE开机UV冲至基线，调零，将Protein A纯化柱接入柱阀，使用PBS缓冲液平衡至电导参数及UV参数处于基线，将样品注入样品环；进样完毕后，使用PBS缓冲液平衡至电导参数及UV参数处于基线，接入洗脱液收集纯化产物，并立即用1M Tris缓冲液中和，得到纯化后的活性抗体；
步骤五：纯化后的活性抗体用规格为15mL、30K的超滤管换液浓缩，最终换液至PBS缓冲液中，在超净台内用孔径为0.22μm的滤膜进行无菌过滤，收集无菌过滤的滤液，取样进行SDS-PAGE电泳验证其纯度，使用超微量分光光度计检测抗体浓度，获得包括活性抗体3mg/mL、KH2PO4 2mM、NaCl 137mM、Na2HPO4 10mM、KCl 2.7mM的主动阻断剂，-20℃保存。
实施例3
制备主动阻断剂，包括如下步骤：
步骤一：通过杂交瘤技术获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩增培养至5×105个/mL，收集细胞后用无血清培养基重悬，接种到5L发酵罐中，补加无血清培养基至800mL；
步骤二：进入哺乳动物细胞发酵模式；24小时后计数1.5×106个/mL，细胞活率90％，补加1000mL无血清培养基；48小时后计数2.0×106个/mL，细胞活率90％，补加1000mL无血清培养基；72小时后计数3.5×106个/mL，细胞活率90％，补加2000mL无血清培养基、3g/L大豆水解物200mL；96小时后计数4.5×106个/mL，细胞活率70％，停止补料；
步骤三：待细胞活率降到40％，收集培养物离心去除细胞，得到发酵液；
步骤四：将发酵液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到样品；将AKTA PURE开机UV冲至基线，调零，将Protein A纯化柱接入柱阀，使用PBS缓冲液平衡至电导参数及UV参数处于基线，将样品注入样品环；进样完毕后，使用PBS缓冲液平衡至电导参数及UV参数处于基线，接入洗脱液收集纯化产物，并立即用1M Tris缓冲液中和，得到纯化后的活性抗体；
步骤五：纯化后的活性抗体用规格为15mL、30K的超滤管换液浓缩，最终换液至PBS缓冲液中，在超净台内用孔径为0.22μm的滤膜进行无菌过滤，收集无菌过滤的滤液，取样进行SDS-PAGE电泳验证其纯度，使用超微量分光光度计检测抗体浓度，获得包括活性抗体5mg/mL、KH2PO4 2mM、NaCl 137mM、Na2HPO4 13mM、KCl 2.7mM的主动阻断剂，-20℃保存。
实施例4
通过免疫比浊平台对主动阻断剂进行验证：对筛选出的47例临床假阳性血清样本进行检测，用Myo临床诊断试剂盒做标准对照，用商用Myo抗体对检测假阳性样本，结果见表1。
表1
由表1可以得出，不加阻断剂的Myo检测值明显偏高，加主动阻断剂(终浓度50μg/mL)后，对47例含类风湿因子干扰的样本均有显著的消除干扰作用。
实施例5
利用Biacore T200测定主动阻断剂与IgA-RF、IgM-RF的亲和力，主动阻断剂作为配体固定至芯片表面，纯化的IgM-RF、IgA-RF作为分析物加入流动相中。
请参阅图1和图2，SRP结果显示主动阻断剂与IgA-RF、IgM-RF均有较高的亲和力。
实施例6
对活性抗体进行基因测序，包括如下步骤：
步骤S1：取实施例3中步骤二中最后一次发酵培养的杂交瘤细胞，用无血清培养基培养24h，收集细胞，每个细胞株收集的细胞数量为1×106个，进行基因测序。
步骤S2：每个细胞样品加入1mL TRIzol试剂，室温放置5min；离心后吸取上清液，加入200μL氯仿混匀后室温放置15min；离心后吸取上层上清液，加入500μL异丙醇，室温放置10min；离心弃上清，沉淀中加入1mL质量分数为75％的乙醇溶液将沉淀重悬，获得重悬液；将重悬液离心弃上清，沉淀在室温下干燥后加入50μL的超纯水溶解，获得提取的杂交瘤细胞总RNA，取5μL用cDNA反转录试剂盒将获得的RNA反转录成cDNA。
步骤S3：设计合成重、轻链可变区扩增引物，将引物溶解后进行混合，每条引物终浓度为10μM。
重链可变区扩增引物序列如下：
VH/forward：
5'-ATGGRATGGASCKKIRTCTTTMTCT-3'；
5'-ATGRASTSKGGYTMARCTKGRTT-3；
5'-ATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT-3'。
VH/back：
5'-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATRACIGRTGG-3'。
轻链可变区扩增引物序列如下：
VL/forward：
5'-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3'；
5'-AGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3'；
5'-ATGRAGWCACAKWCYCAGTCTT-3'。
VL/back：
5'-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAATGGA-3'。
步骤S4：对步骤S3中的重、轻链可变区基因进行PCR扩增，采用20μL的PCR扩增体系，具体包括cDNA 1μL、混合引物1μL、2×PCR Mix 10μL、ddH2O 8μL，根据表2的扩增体条件进行扩增。
表2
将扩增产物经凝胶电泳回收后连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态，使用M13-F及RV-M通用引物进行菌落PCR鉴定，对阳性克隆菌株进行测序，测序结果利用IMGT/V-QUEST数据库进行分析。结构如下：
活性抗体轻链可变区基因序列：
GATATTGTGATGAGCCAGAGCCCGAGCAGCCTGGCGGTGAGCGTGGGCGAAAAAGTGATTCTGAGCTGCAAAAGCAGCCAGAGCCTGCTGTATAGCAGCAACGCGACCAACTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGAAACTGCTGATTTATTGGGGCAGCACCCGCGAAAGCGGCGTGCCGGATCGCCTGACCGGCAGCGGCAGCAGCACCGAATTTACCCTGACCATTAGCAGCGTGAAAGCGGAAGATCTGGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATGCGCGCTATCCGCCGACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAA
对应氨基酸序列：
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVILSCKSSQSLLYSSNATNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWGSTRESGVPDRLTGSGSSTEFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYARYPPTFGAGTKLELK
CDR1区基因序列：CAGAGCCTGCTGTATAGCAGCAACGCGACCAACTAT，CDR1区氨基酸序列：QSLLYSSNATNY
CDR2区基因序列：TGGGGCAGC，CDR2区氨基酸序列：WGS
CDR3区基因序列：CAGCAGTATGCGCGCTATCCGCCGACC，CDR3区氨基酸序列：QQYARYPPT
活性抗体重链可变区基因序列：
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCGGAACTGGTGAAACCGGGCGCGAGCGTGAAACTGAGCTGCAAAACCAGCGGCTTTGATTTTACCAGCGCGTATCTGTATTGGGTGCGCCAGCGCCCGGGCCAGGGCCTGGAACCGATTGGCGAAATTAACCCGAACGAAGATTATACCAAATTTAACGAAAAATTTAAAAACCGCGCGACCCTGACCGTGGATAAAAGCAGCGGCACCACCAACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGGTGTATTATTGCAGCCGCGCGAGCTATGATAGCAGCGGCGCGTGGGAAGTGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCG
对应氨基酸序列：
QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKTSGFDFTSAYLYWVRQRPGQGLEPIGEINPNEDYTKFNEKFKNRATLTVDKSSGTTNMQLSSLTSEDSAVYYCSRASYDSSGAWEVYWGQGTLVTVSA
CDR1区基因序列：GGCTTTGATTTTACCAGCGCGTAT；CDR1区氨基酸序列：GFDFTSAY
CDR2区基因序列：ATTAACCCGAACGAAGATTATACC；CDR2区氨基酸序列：INPNEDYT
CDR3区基因序列：AGCCGCGCGAGCTATGATAGCAGCGGCGCGTGGGAAGTGTAT；CDR3区氨基酸序列：SRASYDSSGAWEVY
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (1)
1.一种清除类风湿因子免疫干扰的主动阻断剂，其特征在于，主动阻断剂包括活性抗体 2-5mg/mL、KH2PO4 2mM、NaCl 137mM、Na2HPO4 8-13mM、KCl 2.7mM，余量为去离子水；
活性抗体轻链可变区氨基酸序列如下：DIVMSQSPSSLAVSVGEKVILSCKSSQSLLYSSNATNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWGSTRESGVPDRLTGSGSSTEFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYARYPPTFGAGTKLELK；
活性抗体重链可变区氨基酸序列如下：QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKTSGFDFTSAYLYWVRQRPGQGLEPIGEINPNEDYTKFNEKFKNRATLTVDKSSGTTNMQLSSLTSEDSAVYYCSRASYDSSGAWEVYWGQGTLVTVSA。
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- 2021-12-30 CN CN202111655325.XA patent/CN114277079B/zh active Active
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Also Published As
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