CN112608386A

CN112608386A - 阻断异嗜性人IgM反应性的单克隆抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN112608386A
Application number: CN202011519659.XA
Authority: CN
Inventors: 李哲; 刘宏伟; 周淼
Original assignee: J & W Beijing Biotech Co ltd
Current assignee: J & W Beijing Biotech Co ltd
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112608386B

Abstract

本发明公开了一种阻断异嗜性人IgM反应性的单克隆抗体VH的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:1‑3所示的氨基酸序列，VL的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:5‑7所示的氨基酸序列。并公开了其制备方法。本发明通过噬菌体展示的方法筛选出一种全新的高效封闭异嗜性人IgM反应性的抗体。一方面得到的抗体序列可读，可以通过亲和力成熟的方法再次提高结合力和稳定性，另一方面利用CHO细胞高密度悬浮培养生产重组抗体产量高、成本低、批间差小、尤其是与以往的封闭剂都需要使用大量小鼠生产腹水进行生产相比具有明显的动物福利优势。并且为后期开发复合Fc亚型的主被动混合型的高效封闭异嗜性人IgM反应性的抗体提供了序列基础。

Description

阻断异嗜性人IgM反应性的单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种阻断异嗜性人IgM反应性的单克隆抗体及其制备方法，属于医学免疫领域。

背景技术

异嗜性抗体(HA)是由已知的或未知的抗原物质刺激人体产生的一类具有足够滴度、能与多个物种的免疫球蛋白发生相对弱的结合的多重特异性的免疫球蛋白。异嗜性抗体的产生通常是由于人类直接接触到动物、污染的食品、未经高温消毒的鲜奶和免疫疗法或者接种来源于动物血清或组织的疫苗产品后产生。据研究证实，在健康人群中，约3％～15％体内含异嗜性抗体，这些异嗜性抗体经常引起测值的假阳性，严重干扰免疫检测试剂的结果。

常见的异嗜性抗体有人自身类风湿因子(RF)和人抗小鼠抗体(HAMA)等。

人自身类风湿因子(RF)可以与人自身的免疫球蛋白(IG)结合，同时也可以与动物免疫球蛋白交叉反应，从而引起RF干扰。RF因子分为IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型，其中70～80％为IgM型。

人抗小鼠抗体(HAMA)可以特异性的结合小鼠抗体。目前免疫诊断试剂中的单克隆抗体基本都是小鼠来源，所以HAMA引起的干扰非常普遍。HAMA抗体中IgM型是五聚体十价抗体，能够形成大量非特异性的捕获抗体-HAMA-标记抗体的免疫复合物，严重影响结果的准确性。因此如何有效阻断异嗜性人IgM反应性是各类免疫类抗原检测系统所必须解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种阻断异嗜性人IgM反应性的单克隆抗体，该抗体可以有效阻断异嗜性抗体的干扰，可用于胶乳比浊等体外诊断方法，提高检测准确性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种阻断异嗜性人IgM反应性的单克隆抗体，其特征在于：VH的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列，VL的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:5-7所示的氨基酸序列。

优选的，所述VH具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述VL具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

本发明还提供了上述的阻断异嗜性人IgM反应性的单克隆抗体的制备方法，其步骤包括：

(1)表达人IgM CH1抗原：构建表达人IgM CH1抗原的质粒，转染到大肠杆菌菌株中，选择阳性克隆，大量表达后回收菌体，超声裂解后通过镍柱纯化出His tag-人IgM CH1抗原；

(2)免疫小鼠：取小鼠，先免疫His tag-人IgM CH1抗原，再免疫天然人IgM，取全血并取脾脏；

(3)构建抗人IgMCH1的噬菌体抗体展示库：提取小鼠脾脏RNA，并用IgG恒定区C末端部分的反向特异性引物合成抗体cDNA库，以小鼠抗体重链可变区N末端正向引物和重链可变区C末端反向引物PCR扩增小鼠抗体VH部分基因、以小鼠抗体轻链可变区N末端正向引物和可变区C末端反向引物PCR扩增小鼠抗体VL部分基因、并通过预先设计的引物接头部分序列将VH和VL重叠延伸扩增出VH-linker-VL基因，以SfiI和NotI酶切VH-linker-VL片段并纯化，将该片段连接到预先准备好的噬菌体展示载体；

(4)筛选与IgM特异性反应的噬菌体抗体：人IgM包被到免疫管后封闭，封闭后的噬菌体与免疫管反应，使抗原特异性噬菌体与包被在免疫管壁上的人IgM充分结合，洗脱特异性结合的噬菌体，感染生长期的大肠杆菌细胞，筛选重复多次，浓缩得到特异性抗人IgM噬菌体抗体库；

(5)筛选特异性阻断IgM反应性的单克隆抗体：从噬菌体抗体库中挑取多个单克隆菌落，ELISA确认每个克隆对IgM的反应性，对与IgM特异性反应的克隆进行测序，确认抗体的种类，对得到的抗体，以将过量噬菌体抗体添加到样品稀释缓冲液的方法，进行RF阳性样品阻断实验，最终得到高效阻断IgM反应性的单克隆抗体。

本发明通过噬菌体展示的方法筛选出一种全新的高效封闭异嗜性人IgM反应性的抗体。一方面得到的抗体序列可读，可以通过亲和力成熟的方法再次提高结合力和稳定性，另一方面利用CHO细胞高密度悬浮培养生产重组抗体产量高、成本低、批间差小、尤其是与以往的封闭剂都需要使用大量小鼠生产腹水进行生产相比具有明显的动物福利优势。并且为后期开发复合Fc亚型的主被动混合型的高效封闭异嗜性人IgM反应性的抗体提供了序列基础。

附图说明

图1为人IgM CH1抗原表达载体示意图。

图2为纯化后的His tag-人IgM CH1抗原SDS-PAGE结果。

图3:噬菌体展示载体示意图

图4:3次筛选富集后噬菌体抗体的ELISA结果。

图5:阻断RF阳性样品实验结果。

具体实施方式

步骤1:表达人IgM CH1抗原设计引物PCR扩增人IgM恒定区(CH1区)序列，在引物两端加上NdeI和XhoI酶切位点。

正向引物pF：GGAATTCCATATGGGGAGTGCATCCGCCCCAACC

反向引物pR：TGTCAACTCGAGCTATTACACTGGAAGAGGCACGTTCTTTTC

根据NCBI Gene ID:3507的序列，人工合成的人IgM恒定区序列作为模板，通过PCR扩增目的片段，并通过琼脂糖凝胶电泳确认片段大小与预期一致，进一步切胶纯化目的片段。用NdeI和XhoI酶切目的片段，并纯化酶切产物。

用T4连接酶将酶切纯化后的目的片段连接到已用NdeI和XhoI酶切处理过的pET28a载体，并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。

将测序正确的质粒(图1)转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，挑取两个克隆加IPTG少量诱导表达，并通过SDS-PAGE确认有目的蛋白表达。下一步取其中一个克隆作为工作菌种，IPTG浓度0.5mM，30度6小时，进行1L体系的大量表达。回收全部菌体，超声裂解后通过镍柱纯化出His tag-人IgM CH1抗原。用SDS-PAGE确认目的蛋白纯度(图2)。

步骤2:免疫小鼠

选8只4-6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫5次。

第一次免疫 20ug/只 His-hIgMCH1；

第二次免疫 20ug/只 His-hIgMCH1；

第三次免疫 20ug/只 His-hIgMCH1；

第四次免疫 20ug/只天然人IgM；

第五次免疫 20ug/只天然人IgM。

免疫结束，取全血并摘取脾脏液氮速冻保存。

步骤3:构建抗人IgMCH1的噬菌体抗体展示库

Trizol法提取小鼠脾脏RNA，并用IgG恒定区C末端部分的反向特异性引物合成抗体cDNA库，引物序列为：

[mJH1]TGAGGARACGGTGACCG

[mJH2]TGAGGAGACTGTGAGAGWGG

[mCKR]ACACTCATTCCTGTTGAAGC。

以小鼠抗体重链可变区N末端(V区)正向引物和重链可变区C末端(J区)反向引物PCR扩增小鼠抗体重链可变区(VH)部分基因、以小鼠抗体轻链可变区N末端(V区)正向引物和可变区C末端(J区)反向引物PCR扩增小鼠抗体轻链可变区(VL)部分基因、并通过预先设计的引物接头部分序列将VH和VL重叠延伸扩增出VH-linker-VL基因。重链可变区扩增用正向引物：

[mVH01]gcggcccagccggccatggcagakgtgcagcttcaggagtcagg

[mVH02]gcggcccagccggccatggcacaggtgcagctgaaggagtcagg

[mVH03]gcggcccagccggccatggcacaggtgcagctgaagcagtcagg

[mVH04]gcggcccagccggccatggcagaggtccagctgcarcartctgg

[mVH05]gcggcccagccggccatggcagaggttcagctgcagcagtctgg

重链可变区扩增用反向引物：

[mJH01]actacctccaccacctgaacctccaccacctgaacctccaccacctgaacctccaccacctgaggaracggtgaccgtgg

[mJH02]actacctccaccacctgaacctccaccacctgaacctccaccacctgaacctccaccacctgaggagactgtgagagwggt gc

轻链可变区扩增用正向引物：

[mVK01]ggtggtggaggtagtgacattgtgatgacacagtctcc

[mVK02]ggtggtggaggtagtgacattgtgatgtcacagtctcc

[mVK03]ggtggtggaggtagtgatgttgtgatgacccaaactcc

[mVK04]ggtggtggaggtagtgatgttttgatgacccaaactcc

[mVK05]ggtggtggaggtagtgatattgtgatgackcaggctgc

[mVK06]ggtggtggaggtagtgatattgtgataacccaggatga

轻链可变区扩增用反向引物：

[mJK01]ggtgactcagtggcgcgccgatttkatttccagcttggtsccycc

[mJK02]ggtgactcagtggcgcgccgattttatttccarcttkgtccccgakc

其中兼并碱基

R＝A,G

W＝A,T

S＝G,C

Y＝C,T

K＝G,T

以SfiI和NotI酶切VH-linker-VL片段并纯化，将该片段连接到预先准备好的噬菌体展示载体。(图3)将载体通过电转化仪转入TG1大肠杆菌感受态细胞，测得库容为2.4×109。步骤4:筛选与IgM特异性反应的噬菌体抗体

人IgM包被到2ml免疫管，并用1％BSA封闭。1％脱脂奶粉、1％BSA、0.1mg/ml人IgG、0.1mg/ml人IgA封闭后的噬菌体与免疫管反应4小时，使抗原特异性噬菌体与包被在免疫管壁上的人IgM充分结合，并用0.05％Tween/PBS清洗10次。2ml pH3.0甘氨酸缓冲液洗脱噬菌体，用pH8.0 Tris缓冲液中和，感染生长期的TG1大肠杆菌细胞。以上筛选重复3次，浓缩得到特异性抗人IgM噬菌体抗体库。通过噬菌体ELISA确认3次噬菌体抗体的滴度依次升高(图4)，说明成功富集到特异性抗人IgM噬菌体抗体。

步骤5:筛选特异性阻断IgM反应性的单克隆抗体

从第3次富集的噬菌体抗体库中挑取192个单克隆菌落，ELISA确认每个克隆对IgM的反应性，对与IgM特异性反应的克隆进行测序，确认抗体的种类。对得到的17种抗体，以将过量噬菌体抗体添加到样品稀释缓冲液的方法，进行RF阳性样品阻断实验。最终得到1株高效阻断IgM反应性的抗体，将此克隆命名为Z1。对该抗体的测序结果，表明VH(重链可变区)具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，VL(轻链可变区)具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，其中VH的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列，VL的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:5-7所示的氨基酸序列。

步骤6:建立稳定表达抗体的CHO细胞系

将Z1抗体可变区序列通过重叠延伸PCR的方法连接信号肽序列及小鼠IgG1恒定区序列，得到完整的抗体表达基因序列。将抗体序列连接到谷氨酰胺合成酶系统高效表达载体并转入到CHO细胞，通过加压筛选的方法得到高效表达抗体的细胞株。用补料培养的方法大量培养CHO细胞，回收上清，ProteinA亲和纯化得到目的抗体。

步骤7:验证对人IgM阻断效果

RF因子对PG2胶乳比浊检测试剂的干扰实验中，预先在血清样品稀释R1缓冲液里添加注射用水(DW)、100ug/ml进口IgM封闭剂、100ug/ml Z1、50ug/ml Z1、25ug/ml Z3，再按正常操作顺序检测RF样品。结果显示Z1能有效阻断引起RF干扰反应的人异嗜性IgM，并在同等添加浓度下达到或超过进口封闭剂，如图5所示。

序列表

<110> 捷和泰(北京)生物科技有限公司

<120> 阻断人IgM反应性的单克隆抗体制备方法及其序列

<130> 1

<141> 2020-12-21

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Ala Arg Ala Pro Ser Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Ser Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

1 5

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Asn Ala Lys

1

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Gln His His Phe Gly Thr Tyr Thr

1 5

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Ile Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Phe Gly Thr Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种阻断异嗜性人IgM反应性的单克隆抗体，其特征在于：VH的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列，VL的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:5-7所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的阻断异嗜性人IgM反应性的单克隆抗体，其特征在于：所述VH具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述VL具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

3.权利要求1或2所述的阻断异嗜性人IgM反应性的单克隆抗体的制备方法，其步骤包括：