CN116114657B - 一种红斑狼疮样小鼠模型的构建方法 - Google Patents

一种红斑狼疮样小鼠模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：对小鼠施用抗RCP抗体，得到红斑狼疮样小鼠模型。本发明提供的红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，通过施用抗RCP抗体，即得红斑狼疮样小鼠模型，操作简单，造模时间短；通过本发明提供的红斑狼疮样小鼠模型的构建方法构建所得红斑狼疮样小鼠，有助于对红斑狼疮的机理的研究，能够应用于红斑狼疮的机理研究、及在制备和/或筛选治疗红斑狼疮药物中的应用。

Description

一种红斑狼疮样小鼠模型的构建方法
技术领域
本发明属于小鼠模型技术领域，具体涉及一种红斑狼疮样小鼠模型的构建方法。
背景技术
系统性红斑狼疮(SLE)是一种累及全身多系统的疾病，可以表现为皮疹，关节痛，蛋白尿，具有很强的异质性。同时，SLE的疾病特点主要表现为体内大量凋亡细胞不能被清除，巨噬细胞作为吞噬凋亡细胞的主力军，其吞噬功能下降可能为致病原因之一。大量凋亡细胞的堆积，导致自身抗原的增加，从而引发自身抗体的产生，目前比较典型的抗体，包括抗核抗体和抗双链抗体。而且新的抗体仍然在不断被发现。已经有报道在疾病发病的前5年甚至是10年，就出现了自身抗体产生，这些自身抗体可以进一步引起器官的损伤，所以抗体的存在对于SLE的研究具有重要的意义。
初发SLE患者中存在抗RCP抗体，并且与正常人相比显著升高，为了进一步研究抗RCP抗体与红斑狼疮发病机质之间的关系，本发明提供了一种红斑狼疮样小鼠模型，用于研究抗RCP抗体和巨噬细胞与红斑狼疮之间的关系，有助于对红斑狼疮的机理的研究。
发明内容
本发明提供了一种抗RCP抗体，为具有生物活性的抗RCP抗体，可以减弱巨噬细胞吞噬功能，本发明中的RCP抗体可用于构建狼疮样小鼠。
本发明提供了一种红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：对小鼠施用抗RCP抗体，得到红斑狼疮样小鼠模型。
在本发明的一实施例中，所述小鼠为C57BL/6小鼠。
在本发明的一实施例中，所述小鼠为10周大小的C57BL/6小鼠。
在本发明的一实施例中，所述RCP抗体的施用方式为腹腔注射。
在本发明的一实施例中，所述RCP抗体的注射量为200ug。
在本发明的一实施例中，所述RCP抗体的注射持续时间为6个月，每周注射两次。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明实施例提供的红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，通过施用抗RCP抗体，即得红斑狼疮样小鼠模型，操作简单，造模时间短；通过本发明实施例提供的红斑狼疮样小鼠模型的构建方法构建所得红斑狼疮样小鼠，有助于对红斑狼疮的机理的研究，能够应用于红斑狼疮的机理研究、及在制备和/或筛选治疗红斑狼疮药物中的应用。
附图说明
图1为重组FIP蛋白的SDS-PAGE鉴定分析结果图；
图2为纯化抗RCP抗体的SDS-PAGE分析结果图；
图3为抗RCP抗体和Isotype组干预RAW264.7后吞噬功能的变化结果图；
图4A为小鼠模型构建模式图；其中，图4B为抗RCP抗体注射小鼠与对照(Isotype)小鼠血清中抗核抗体(ANA)的比较，图4C为抗RCP抗体注射小鼠与对照小鼠血清中抗双链DNA抗体(抗dsDNA抗体)的比较，图4D为抗RCP抗体注射小鼠与对照小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的比较，图4E为图4D图的流式细胞图，图4F为抗RCP抗体注射小鼠与对照小鼠尿液白蛋白比肌酐水平的比较，图4G为抗RCP抗体注射小鼠与对照小鼠尿液肾脏HE染色和PAS染色的比较，图4H为抗RCP抗体注射小鼠与对照小鼠尿液肾脏IgG和C3沉积的免疫荧光图。
具体实施方式
在本文中，由「一数值至另一数值」表示的范围，是一种避免在说明书中一一列举该范围中的所有数值的概要性表示方式。因此，某一特定数值范围的记载，涵盖该数值范围内的任意数值以及由该数值范围内的任意数值界定出的较小数值范围，如同在说明书中明文写出该任意数值和该较小数值范围一样。
在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。在多个从属权利要求的情况下，仅仅在替代方案中使用“或”引用一个以上的前述独立或从属权利要求。
除非另外指明，正如根据本公开所使用的，以下术语应理解为具有以下含义：
需要说明的是，本发明中所使用的科学和技术术语及其缩略语具有本领域技术人员通常理解的含义。以下列举了本发明中使用的部分术语和缩略语：
抗体：antibody，重链：heavy chain(HC)，轻链：light chain(LC)，重链可变区：heavy chain variable domain(VH)，重链恒定区：heavy chain constant domain(CH)，轻链可变区：light chain variable domain(VL)，轻链恒定区：light chain constantdomain(CL)；
“抗体”是指至少包含重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3并且至少包含轻链的CDR1、CDR2和CDR3的分子，其中该分子能够与抗原结合。抗体这一术语包括但不限于能够结合抗原的片段，例如Fv，单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、和(Fab’)2。术语抗体还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体和各种物种如小鼠、人、食蟹猴、羊驼等的抗体。
“互补决定区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明第一方面提供了一种抗RCP抗体，一种抗RCP抗体，所述抗RCP抗体包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区HCDR1，
由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区HCDR2，
由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区HCDR3；
所述轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的轻链互补决定区LCDR1，
由WAS氨基酸序列组成的轻链互补决定区LCDR2，
由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成的轻链互补决定区LCDR3。
本发明第二方面提供了一种抗RCP抗体的制备方法，包括以下步骤：
对RCP isoform 2蛋白进行原核表达，收集表达的融和蛋白RCP-ECD-His并纯化；
将纯化后的融和蛋白RCP-ECD-His用于免疫小鼠；
获取免疫小鼠的外周血淋巴细胞的总RNA，并进行反转录扩增得到cDNA序列，特异性扩增小鼠轻链抗体可变区基因、轻链抗体恒定区基因、重链抗体可变区基因、重链抗体恒定区基因；
将所述小鼠轻链抗体可变区基因、轻链抗体恒定区基因、重链抗体可变区基因、重链抗体恒定区基因与载体连接得到连接产物，将所述连接产物进行转化构建噬菌体展示文库；
从所述噬菌体展示文库淘选获得抗RCP抗体序列；
利用所述抗RCP抗体序列构建抗体蛋白表达载体，并进行诱导表达和纯化，得到抗RCP抗体。
本发明第三方面提供了一种红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：对小鼠施用抗RCP抗体，得到红斑狼疮样小鼠模型。其中，每次200ug每周腹腔注射2次注射C57BL/6小鼠(约10周大小)，6个月后测血清抗核抗体，抗dsDNA抗体，尿液白蛋白比肌酐，肾脏HE染色，PAS染色和免疫荧光IgG和C3。
实施例1
本实施例提供了一种抗RCP抗体，所述抗RCP抗体包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区HCDR1，
由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区HCDR2，
由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区HCDR3；
所述轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的轻链互补决定区LCDR1，
由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成的轻链互补决定区LCDR2，
由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的轻链互补决定区LCDR3。
氨基酸序列
本实施例提供的抗RCP抗体的轻链可变区碱基序列(LC-NT)(如SEQ IDNO:7所示)如下：
GACATTCAGATGACTCAGTCTCCAGTCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGGTGCAACAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT。
本实施例提供的抗RCP抗体的轻链可变区氨基酸序列(LC-AA)(如SEQ ID NO:8所示)如下：
DIQMTQSPVSLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYGATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGTPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。
本实施例提供的抗RCP抗体的重链可变区碱基序列(HC-NT)(如SEQ ID NO:9所示)如下：
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGATATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATAGTGGTGGTGTTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACGCCCTATACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGGCCCCCTGGTAACTCGGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGT。
本实施例提供的抗RCP抗体的重链可变区碱基序列(HC-AA)(如SEQ ID NO:10所示)如下：
QVQLKESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKRLEWVATINSGGVYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNALYLQMSSLKSEDTAMYYCARPPGNSAWFTYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC。
本实施例中上述抗RCP抗体通过以下方法构建：
1.抗原制备、鉴定和小鼠免疫
在RCP的胞外区段RCP isoform2-ECD融合6*his，通过ExpiCHO系统进行瞬转表达。表达上清离心后，进行亲和纯化，得到的蛋白样品再通过SDS-PAGE进行纯度和浓度测定，当抗原纯度达到95％以上且抗原和抗体呈现良好的结合后才能用于后续动物免疫和抗体筛选。
其中，对于抗原的瞬转表达和纯化，其具体操作如下：
质粒制备过程：根据融合6*his和RCP isoform2-ECD基因序列合成全长基因，合成时在上下游引入双酶切位点序列，获得基因片段，2％琼脂糖凝胶纯化回收目的片段，经EcoRI:G/AATTC,HindIII:A/AGCTT双酶切后分别克隆到相同酶切处理的pcDNA3.4表达载体上，转化大肠杆菌后，筛选单克隆菌株，提取质粒用于测序验证，验证准确的质粒供下一步转染ExpiCHO-S细胞用；
转染当天，ExpiCHO-S细胞(购自Thermo Fisher，Cat No.A29127)密度为7×106至1×107个活细胞/mL，细胞活率>98％，此时用37℃预热的新鲜ExpiCHO表达培养基25mL将细胞调整到终浓度为6×106个细胞/mL。用4℃预冷的OptiPRO SFM 1mL稀释制备的质粒(共25μg)，同时用920μL OptiPRO SFM稀释80μL ExpiFectamine CHO，再将两者混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamine CHO/质粒DNA混合液。混合液室温孵育1-5min之后转移到准备好的细胞悬液中，缓慢加入并同时轻轻摇晃细胞悬液，最后置于细胞培养摇床中，在37℃，5％CO2条件下培养。在转染后18-22个小时内添加ExpiCHO Enhancer和ExpiCHO Feed，摇瓶放置于32℃摇床和5％CO2条件下继续培养，在转染后第5天，添加相同体积的ExpiCHOFeed，缓慢加入的同时轻轻混匀细胞混悬液。转染12-15天后，将细胞表达上清高速离心(15000g，10min)，所得His标签蛋白表达上清通过Ni Smart Beads 6FF(常州天地人和生物科技有限公司，SA036050)进行亲和纯化，然后采用梯度浓度的咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。最后所得蛋白通过浓缩管(Millipore，UFC901096)置换至PBS缓冲液当中。
将纯度鉴定合格的RCP-ECD-His用于小鼠免疫，具体操作如下：
购买C57BL/6小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司)，6-8周龄，雌性。免疫时采取皮下多点免疫的方式，每次皮下免疫50μg,每两星期免疫一次，共免疫四次；免疫四次后通过ELISA测定免疫的效价，其中ELISA抗原包板采用RCP-ECD-His。测定结果显示免疫效价达到1：600,000，此时采用100μgRCP-ECD-His进行加强免疫，2到3天后取脾脏，分离脾脏B淋巴细胞,用于后续免疫抗体库的构建。
2.免疫抗体库构建和筛选
分离按照上述步骤1所得经免疫的小鼠脾脏中的B淋巴细胞，抽取其RNA，并通过反转录试剂盒(TaKaRa，6210A)反转录成cDNA。设计一系列的引物分别扩增轻链和重链的可变区以及第一个恒定区，并且在重链CH1的C端融合M13噬菌体GIII蛋白，构建至噬菌体展示用载体上，最终构建的免疫库以Fab的形式展示在M13噬菌体的外壳蛋白上。
其中具体操作如下：
根据小鼠中所有轻链和重链的V基因和第一个恒定区基因分别设计含有NcoI和AscI、SfiI和NotI酶切位点的简并引物，PCR得到含有可变区和恒定区的区段，通过双酶切和连接反应将目的抗体基因片段插入至噬菌体展示用载体上，其中在Fab的重链部分的C端融合了GIII基因。连接产物通过回收试剂盒(Omega，D6492-02)回收，然后通过电转仪(BioRad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌SS320细胞(Lucigen,MC1061 F)中，复苏1小时后，涂布于具有氨苄抗性的2-YT固体平板(由胰蛋白胨1.5％，酵母提取物1％，NaCl0.5％，琼脂1.5％，按质量/体积(g/mL)配制而成)。为了计算库容，同时将1μL菌液进行稀释，而后在平板上进行涂布培养，通过长出的克隆数目进行推算，计算将所有电转化产物形成的总克隆数，即库容容量。此免疫库的库容为1×109cfu。
基于库容容量，挑取50个OD(1个OD为5×108cfu)的以上构建的小鼠免疫库菌加入到新鲜的2-YT液体培养基中。置于37℃，220rpm培养至对数生长期，再以50倍于细菌数的数量(即感染复数MOI为50),加入VSCM13辅助噬菌体(购自Stratagene)，充分混匀，静置30min后，在220rpm的摇床中继续培养1小时。随后，将培养物以10000rpm的转速离心5min后，弃上清，将培养液替换为羧苄青霉素/卡那霉素双抗性的2-YT培养基，并于30℃，220rpm继续培养过夜。次日，菌液于13000g离心10min，收集上清后加入20％PEG/NaCl(由体积浓度为20％的PEG 6000和2.5M NaCl配制而成)使得PEG/NaCl最终浓度为4％，混匀，并置于冰上1小时，再以13000g的转速离心10min，将沉淀得到小鼠免疫库对应的噬菌体用PBS洗后保存并用于后续噬菌体筛选。
采用免疫管固相筛选的方式筛选针对RCP的抗体，具体方法如下：
第一轮筛选时，在免疫管中加入4mL的50μg/mL的RCP-His，4℃包被过夜，第二天弃去包被液，加入含5％奶粉的PBS封闭2h，PBS洗两次后加入制备好的噬菌体(总量为1012)，孵育2h。用PBS洗8遍，后用PBS-T洗2遍，以去除非特异性结合的噬菌体，然后向免疫管中加入0.8mL含0.05％EDTA的胰酶消化液，用于洗脱特异性结合目标抗原的噬菌体，接着将其侵染对数期的SS320菌体(Lucigen，60512-1)，37℃静置30min，然后220rpm条件下培养1h，再加入VSCM13辅助噬菌体，静置30min，继续在22 0rpm条件下培养1h。离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，并于30℃，220rpm环境下继续培养过夜。
第二天制备噬菌体：最终得到的噬菌体继续用于第二轮的筛选，如此反复，其中第二次和第三次筛选的抗原浓度分别5μg/mL和1μg/mL，除此之外，PBS洗强度也逐渐加大，PBS洗脱次数依次为12次和16次。同时对每轮随机挑选10个克隆进行序列分析。经过两到三轮的筛选，当富集较明显并且序列呈现较高多态性时，选择这一轮的菌进行单克隆涂布制备。通过将0.1mM IPTG诱导的单克隆诱导Fab上清进行ELISA，选择阳性克隆进行测序分析。实验发现，此次免疫库筛选得到了超过60个具有不同序列的阳性克隆。通过进一步将这些克隆制备的Fab与RAW264.7细胞进行孵育1小时。同时人T细胞系Jurkat细胞用星孢菌素(购自生工)诱导后成为凋亡细胞，用PHrodo(购自life technology)染上绿色荧光后，让RAW264.7进行吞噬后，流式检测吞噬功能。其中吞噬功能下降最明显的Fab即为目标Fab。
3.构建小鼠抗RCP抗体全长
通过以上构建的Fab段，连接上小鼠IgG1 Fc。并通过ExpiCHO瞬转表达系统(Thermo Fisher，A29133)进行表达以及后续的纯化,具体方法可以参见1。最后通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)将所得抗体置换至PBS缓冲液中。并通过超微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司，Nano-300)进行浓度测定，将经测定的A280数值除以抗体理论消光系数后的数值作为后续研究的抗体浓度值，分装并保存于-80℃。
4.抗RCP抗体可以影响巨噬细胞吞噬功能
抗RCP抗体与RAW264.7细胞进行孵育1小时。同时人T细胞系Jurkat细胞，用星孢菌素(购自生工)诱导后成为凋亡细胞，用PHrodo(购自life technology)染20分钟，染上绿色荧光后，然后让RAW264.7对其进行吞噬30分钟后，流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能。结果提示，与Isotype组相比，抗RCP抗体使巨噬细胞的吞噬功能下降。
其中，Isotype组购自BBI公司，型号为Mouse IgG BBI D110503-0010。
由图1可知，在非还原(NR)及还原(R)条件下，均可见110kDa及75kDa条带，由于FIP蛋白内部含5个N糖基化位点，推测两条带均为目的蛋白，其分子量差异来自于糖基化修饰。
图2中，左侧为非还原(NR)，右侧为还原(R)条件下，抗RCP抗体的表达。
由图3可知，相比于Isotype(同种型)，抗RCP抗体可以使得小鼠巨噬细胞吞噬功能下降，本发明中制备所得抗RCP抗体能够影响巨噬细胞吞噬功能。
实施例2
本实施例提供了一种红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)、使用实施例1中已经构建好的小鼠抗RCP抗体，腹腔注射C57BL/6小鼠(选取10周左右的雌性小鼠)，每周注射2次，每次200ug，一共注射6个月。
(2)、摘除眼球取血，然后10000rpm离心10分钟得到血清。采用小鼠抗核抗体试剂盒及抗双链抗体试剂盒(购自上海语纯生物)。按照说明书进行测试，读取OD450值。
(3)、1.5毫升离心管留取小鼠尿液，检测尿白蛋白与肌酐(购自南京建成生物)，按照说明书进行测试，在分光光度计上读取数值。
(4)、检测小鼠腹腔来源的巨噬细胞的吞噬功能：拉颈处死小鼠，在75％酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸5ml无菌PBS液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。小心拔出针头，把液体注入离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入完全培养液重悬。贴壁4小时后，弃去未贴壁细胞，得到腹腔巨噬细胞。然后人T细胞系Jurkat细胞用星孢菌素(购自生工)诱导后成为凋亡细胞，用PHrodo(购自life technology)染上绿色荧光后，让巨噬细胞进行吞噬后，流式检测吞噬功能。
(5)、留取小鼠双侧肾脏，并放在4％多聚甲醛中保存。后续进行HE和PAS染色。
(6)、将小鼠肾脏进行IgG和C3的免疫荧光染色。
结果如图4A-图4H所示。
图4B为抗RCP抗体注射小鼠与对照(Isotype)小鼠血清中抗核抗体(ANA)的比较。由图4B可知，相比于Isotype注射小鼠，抗RCP抗体注射小鼠6个月，ANA显著升高(p<0.01)；
图4C为抗RCP抗体注射小鼠与对照小鼠血清中抗双链DNA抗体(抗dsDNA抗体)的比较。由图4C可知，相比于Isotype注射小鼠，抗RCP抗体注射小鼠6个月，抗dsDNA显著升高(p<0.01)；
图4D为抗RCP抗体注射小鼠与对照小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的比较。由图4D可知，抗RCP抗体注射小鼠6个月后，腹腔来源的巨噬细胞吞噬功能下降(p<0.01)；
图4E为图4D图的流式细胞图；
图4F为抗RCP抗体注射小鼠与对照小鼠尿液白蛋白比肌酐水平的比较。由图4F可知，相比于Isotype注射小鼠，抗RCP抗体注射小鼠6个月，尿白蛋白比肌酐显著升高(p<0.01)；
图4G为抗RCP抗体注射小鼠与对照小鼠尿液肾脏HE染色和PAS染色的比较。相比于Isotype注射小鼠，抗RCP抗体注射小鼠肾脏HE和PAS染色提示抗RCP抗体注射小鼠的肾脏病理提示肾小球系膜基质增多，伴系膜细胞增生，部分小球节段毛细血管腔内细胞增多；
图4H为抗RCP抗体注射小鼠与对照小鼠尿液肾脏IgG和C3沉积的免疫荧光图。肾脏免疫荧光提示抗RCP抗体注射小鼠系膜区IgG和C3荧光强度增加。
综上，本实施例中所构建小鼠模型出现了狼疮样表现。
以上公开的仅为本发明优选实施例。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属领域技术人员能很好地利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
基因序列表

Claims (6)

1.一种红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：对小鼠施用抗RCP抗体，得到红斑狼疮样小鼠模型；
所述抗RCP抗体包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区HCDR1，
由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区HCDR2，
由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区HCDR3；
所述轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的轻链互补决定区LCDR1，
由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成的轻链互补决定区LCDR2，
由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的轻链互补决定区LCDR3。
2.根据权利要求1所述的红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠为C57BL/6小鼠。
3.根据权利要求2所述的红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠为10周大小的C57BL/6小鼠。
4.根据权利要求1所述的红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述RCP抗体的施用方式为腹腔注射。
5.根据权利要求1所述的红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述RCP抗体的注射量为200ug。
6.根据权利要求1所述的红斑狼疮样小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述RCP抗体的注射持续时间为6个月，每周注射两次。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008008841A2 (en) * 2006-07-14 2008-01-17 Avanir Pharmaceuticals Use of benzimidazole derivatives for the treatment and/or prevention of autoimmune disorders
CN107693542A (zh) * 2017-09-05 2018-02-16 中山大学附属第三医院 一种系统性红斑狼疮动物模型的构建方法及其应用
CN111149767A (zh) * 2020-02-24 2020-05-15 中南大学湘雅二医院 一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型及其构建方法和应用
CN113308476A (zh) * 2021-05-12 2021-08-27 广东药康生物科技有限公司 一种FcRn基因人源化动物模型的构建方法
CN113322276A (zh) * 2021-05-24 2021-08-31 中国海洋大学 一种石斑鱼病毒性神经坏死病双顺反子dna疫苗

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008008841A2 (en) * 2006-07-14 2008-01-17 Avanir Pharmaceuticals Use of benzimidazole derivatives for the treatment and/or prevention of autoimmune disorders
CN107693542A (zh) * 2017-09-05 2018-02-16 中山大学附属第三医院 一种系统性红斑狼疮动物模型的构建方法及其应用
CN111149767A (zh) * 2020-02-24 2020-05-15 中南大学湘雅二医院 一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型及其构建方法和应用
CN113308476A (zh) * 2021-05-12 2021-08-27 广东药康生物科技有限公司 一种FcRn基因人源化动物模型的构建方法
CN113322276A (zh) * 2021-05-24 2021-08-31 中国海洋大学 一种石斑鱼病毒性神经坏死病双顺反子dna疫苗

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MiR-106b在2型糖尿病db/db小鼠骨骼肌中的表达及生物信息学分析;张莹;高春林;夏正坤;高远赋;樊忠民;蔡晓懿;刘梦原;;医学研究生学报;20130315(第03期);第232-238页 *

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