JP2009504136A

JP2009504136A - 慢性リンパ性白血病治療のためのｃｄ５２に対するモノクローナル抗体産生のための組み換え法

Info

Publication number: JP2009504136A
Application number: JP2008512942A
Authority: JP
Inventors: パテルビルーモラワラ、
Original assignee: アベスタゲンリミテッド
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2009-02-05
Also published as: IL187400A0; CN101238150A; US20090220520A1; AU2006250887A1; KR20080039843A; AP2007004250A0; WO2006126068A3; ZA200711007B; MX2007014672A; RU2007147414A; CA2609480A1; EP1883653A2; BRPI0610304A2; WO2006126068A2

Abstract

本発明は、ＣＤ５２に結合する可溶性形態のモノクローナル抗体産生のために使用される組み換え法に関する。本発明の手順は、抗ＣＤ５２をコードする核酸配列の新規合成、構築された核酸配列のコンピテント細菌中への形質転換、および所望タンパク質発現のための該配列の哺乳類発現ベクター中へのサブクローニングについて述べる。対象となる遺伝子に関連する制御要素を含むＤＮＡコンストラクトが開示される。対象となる核酸配列コドンが最適化されて、適切な哺乳類宿主細胞中での発現を可能にする。

Description

本発明は、ＣＤ５２に結合する可溶性形態モノクローナル抗体の産生のために使用される組み換え法に関する。本発明の手順は、抗ＣＤ５２をコードする核酸配列の新規合成、構築された核酸配列のコンピテント細菌中への形質転換、および所望タンパク質発現のための該配列の哺乳類発現ベクター中へのサブクローニングについて述べる。対象となる遺伝子に関連する制御要素を含むＤＮＡコンストラクトが開示される。対象となる核酸配列はコドン最適化されて、適切な哺乳類の宿主細胞中での発現を可能にする。

抗体は我々の免疫系の一部である。抗原（病原菌中の異質タンパク質など）が身体に侵入すると、身体は天然抗体を作ってそれと戦う。これらの抗体は抗原に付着して、それを我々の免疫系による破壊のためにマークする。抗体または免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって互いに結合する２本の重鎖および２本の軽鎖を含み、各軽鎖はジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖と結合する。各重鎖は一端に可変領域（ＶＨ）を有し、いくつかの定常領域（ＣＨ１、２、３）がそれに続く。各軽鎖は一端に可変領域（ＶＬ）、もう一端に定常領域（ＣＬ）を有し、重鎖（ＶＨ）の軽鎖可変領域および軽鎖定常領域は、重鎖の第１の定常領域と整列する。軽鎖および重鎖中の定常領域（Ｆｃ）は、抗体抗原結合に直接関与しない。

軽鎖および重鎖の各対の可変領域（Ｆａｂ）は、抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎖上の領域は同一の一般構造を有し、各領域は４個のフレームワーク領域を含み、その配列は比較的保存され、３個の相補領域（ＣＤＲ）によってつながる。４個のフレームワーク領域は概してβシート構造を取り、ＣＤＲはループ連結を形成して、場合によってはβシート構造の一部を形成する。ＣＤＲはフレームワーク領域に近接しており、もう一方の領域のＣＤＲと共に抗原結合部位の形成に寄与する。

１９７５年に主要な進展があり、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、２５６、４９５〜４９７頁）が、抗原で免疫されたマウスからの脾臓細胞とマウスの骨髄腫系細胞との融合に成功したことを報告した。結果として得られるハイブリドーマと命名された雑種細胞は、脾臓細胞に由来する抗体産生特性と、骨髄腫細胞に由来する連続的増殖特性とを有する。各ハイブリドーマは、オリジナル抗原の特定の決定因子に対する単一抗体を合成して分泌する。培養物中の全細胞が同一であること、すなわちそれらがただ１つの抗体種の合成に必要な遺伝情報を含有することを確実にするために、細胞融合の結果として得られるハイブリドーマはクローニングおよびサブクローニングされる。このようにしてクローニングされたハイブリドーマは、均質な抗体すなわちモノクローナル抗体を産生する。細胞系の不死は、特に病的障害の診断および免疫療法をはじめとする多様な用途で使用するために、均質で良好に特性決定された抗体の無制限の供給が利用できることを保証する。不運なことに、開発されたモノクローナル抗体は臨床状況において有用でなく、ヒト抗マウス抗体の発生によって大幅に阻害され、治療を妨げまたはアレルギー性過敏症または免疫複合体過敏症を引き起こし得る。

完全な臨床使用のために十分な量の抗体を産生させるために、効率的な組み換え発現系を用いることが望ましい。骨髄腫細胞は、抗体の産生および分泌に特化した天然宿主に相当するので、これらに由来する細胞系が組み換え抗体発現のために使用されている。免疫グロブリン遺伝子制御因子に基づく複合体ベクター設計が必要とされることが多く、極めて変わりやすい最終発現レベルが報告されている（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８年、３３２、３２３〜３２７頁；ウェイドレ（Ｗｅｉｄｌｅ）ら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、６０、２０５〜２１６頁；ナカタニ（Ｎａｋａｔａｎｉ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ、１９８９年、７、８０５〜８１０頁；およびギリス（Ｇｉｌｌｉｅｓ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ、１９８９年、７、７９９〜８０４頁）。代替となる哺乳類発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の使用により提供される。これらの細胞の使用は、研究および臨床用途のために、いくつかの治療的タンパク質の大量生成を可能にした（カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、１９８５年、５、１７５０〜１７５９頁、およびツェトルマイスル（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ、１９８７年、５、７２０〜７２５頁）。しかし抗体発現のためのこれらの細胞の使用例はごくわずかであり、これまでに報告されているマウス抗体の発現レベルはほぼ０．０１〜０．１．μ／ｍｌ程度と低い（ウェイドレ（Ｗｅｉｄｌｅ）ら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、５１、２１〜２９頁；およびフェイス（Ｆｅｙｓ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９８８年、２、２６〜２７頁）。

ＣＤ５２は実質的にすべてのヒトリンパ球および単球上で強力に発現するが、ヘール（Ｈａｌｅ）ら、Ｂｌｏｏｄ、１９８３年、６２、８７３〜８８２頁によって述べられる抗原である造血幹細胞をはじめとするその他の血液細胞には存在しない。ＣＤ５２に特異的なマウスモノクローナル抗体ＹＴＨ６６．９が開発され、後にＣＤ５２に対するラットモノクローナル抗体ＹＴＨ３４．５ＨＬが開発された。臨床状況におけるこれらの抗体の使用は、抗グロブリン応答のために制限される。

ＣＤ５２は、正常および悪性のＢリンパ球およびＴリンパ球、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、および男性生殖器系組織の表面に発現する。本発明は、ＣＤ２５に結合する抗体が、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）治療に適応される方法に関する。抗体はまた、アルキル化剤で治療された患者、およびフルダラビン治療法に失敗した患者を治療するために使用できる。本発明の抗体は、ヒト可変フレームワークおよび定常領域と、マウス（ｒａｔ）モノクローナル抗体からの相補性決定領域とを有するＩｇＧ１ κである。抗体はおおよその分子量１５０Ｋｄを有する。

本発明は、抗ＣＤ５２活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組み換えベクターの組み込みによって、哺乳類発現ベクター系における抗ＣＤ５２の産生を可能にする。

抗ＣＤ５２抗体は、Ｂ−ＣＬＬとしても知られているＢ細胞慢性リンパ性白血病を治療するために使用される。この抗体はまた、その他の癌化学剤（例えばアルキル化剤、フルダラビン）を既に投与され、および／または反応しなかった患者を治療するために使用される。この抗体はまた、非ホジキンリンパ腫、いくつかの自己免疫疾患の治療、腎臓移植患者においても用途がある。

さらに別の態様では、抗ＣＤ５２抗体は、癌、特にリンパ腫があるヒトを治療するために、または免疫抑制目的のために使用される。

配列一覧：
配列番号１．抗ＣＤ５２抗体軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号２．抗ＣＤ５２抗体重鎖のヌクレオチド配列
配列番号３．抗ＣＤ５２抗体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号４．抗ＣＤ５２抗体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号５．抗ＣＤ５２抗体軽鎖のコドン最適化配列
配列番号６．抗ＣＤ５２抗体重鎖のコドン最適化配列

本発明は、モノクローナル抗体を安定発現するためのポリペプチド抗ＣＤ５２をコードする核酸配列のコンピテント細菌中への形質転換、および該核酸配列の哺乳類発現ベクター（より好ましくはＣＨＯ細胞中）へのサブクローニングに関する。

本発明の態様に従って、抗ＣＤ５２分子の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列が提供される。本発明のさらに別の態様に従って、核酸配列によってコードされる対応するアミノ酸配列が提供される。

本発明の特定の態様は、抗ＣＤ５２分子の重鎖および軽鎖の可変領域の新規合成に関する。対象となる核酸配列を有するベクターコンストラクトの構築、ベクターコンストラクトのコンピテント細菌への形質転換、および抗ＣＤ５２鎖の哺乳類発現ベクターへのサブクローニングがさらに開示される。

下記に概説する手順は、生物活性で組み換え型の可溶性抗ＣＤ５２抗体の産生に適する。

実施例１．
抗ＣＤ５２抗体のｃＤＮＡの新規合成は、次の構成成分を含む。
●コザック共通配列（ＧＣＣＡＣＣ）３とそれに続く開始コドン（ＡＴＧ）
●ｃＤＮＡの５’および３’末端の３つの「保護」ヌクレオチド
●発現ベクター中にクローニングするためのｃＤＮＡの５’および３’末端の適切な制限部位

抗ＣＤ５２抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１で記載される。

抗ＣＤ５２抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２で記載される。

抗ＣＤ５２抗体の重鎖のコーディングＤＮＡ配列中のコドンは、ＣＨＯＫ１およびＨＥＫ２９３などの哺乳類細胞系中における最適の組み換えタンパク質発現を確実にするために、コドン最適化過程の一部として改変された。それぞれのコドン最適化配列は、配列番号４および５で記載される。

実施例２．
発現系の選択：
組み換え抗ＣＤ５２抗体の発現のための哺乳類発現ベクターの設計は、市販されるベクターの１つに基づくことができ（例えばそれぞれインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＢＤバイオサイエンス（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのｐｃＤＮＡまたはｐＩＲＥＳ）、次の特徴を含むように改変される。
●天然シグナルペプチドに加えて、抗ＣＤ５２抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを挿入するための複数クローニング部位。抗ＣＤ５２抗体の軽鎖および重鎖は、異なる選択マーカーと共に２つの別々のプラスミドＤＮＡベクター中にクローニングされる。
●ベクターの設計はまた、軽鎖および重鎖双方の選択マーカーの非依存性（バイシストロニック）ＩＲＥＳ媒介同時発現に対応できる。
●発現ベクターの設計はまた、天然シグナルペプチドに加えて、抗ＣＤ５２抗体の軽鎖および重鎖双方の非依存性（バイシストロニック）ＩＲＥＳ媒介同時発現に対応できる。

実施例３．
抗ＣＤ５２抗体可変領域の新規合成
抗ＣＤ５２抗体の軽鎖および重鎖可変領域が、新規合成のためにエポック・ラボズＵＳＡ（Ｅｐｏｃｈｌａｂｓ，ＵＳＡ）に提供された。抗ＣＤ５２抗体鎖は定常領域と共に合成されなかった。代わりにκおよびＩｇＧ１定常領域を抗ＣＤ２０抗体鎖から切り取って、抗ＣＤ５２抗体の可変領域とライゲーションして全長抗体鎖を生じさせた。

抗ＣＤ５２抗体および抗ＣＤ２０抗体の定常領域は、非常に良く似ている。抗ＣＤ５２抗体のκ定常領域が抗ＣＤ２０抗体と１００％相同性であるのに対し、重鎖定常領域は２つのヌクレオチドが異なる。２つのヌクレオチド変化は、位置２４０においてバリンからアラニンへの変化をもたらす。

実施例４．
抗ＣＤ５２抗体の全長重鎖および軽鎖の構築
新規に合成された可変領域を、全長抗ＣＤ２０抗体重鎖および軽鎖を含有するｐＢＳＫベクター中にクローニングした。抗ＣＤ２０抗体の可変領域が抗ＣＤ５２抗体の可変領域で置換されて、全長抗ＣＤ５２抗体断片が生じた。

抗ＣＤ５２抗体の可変領域はｐＢＳＫＩＩ中のクローニング断片として得られ、得られたコンストラクトはｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＶＬＣと称された。ＤＮＡをＤＨ１０ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換して、アンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種した。プレートからのコロニーを液体培地に接種して、ＤＮＡミニプレップを実施した。可変領域の配列を配列決定によって確認した。

抗ＣＤ５２抗体の全長κ軽鎖の構築
ｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＶＬＣおよびｐＢＳＫＩＩ／ＲＴＸ−ＬＣ（抗ＣＤ２０抗体軽鎖を発現するコンストラクト）クローンをＢｇｌＩＩおよびＢｓｉＷＩ制限酵素で消化した（図５）。前者からのサイズ３９４ｂｐｓの挿入断片および後者からのベクター＋κ定常領域をゲル精製した。ベクターおよび挿入断片をライゲーションして、全長抗ＣＤ５２抗体κ軽鎖を生じさせた。熱ショックコンピテントＤＨ１０細胞を形質転換して得られたコロニーをＬＢＡｍｐ培地に接種して、ＤＮＡのミニプレップを行った。制限消化によって、クローンを抗ＣＤ５２抗体の全長軽鎖の存在についてチェックした（図６）。制限消化によって陽性が判明したクローンはまた、配列決定によっても確認された。

ｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＬＣクローンはまた、ＲＴＸ−ＬＣ含有クローンとＡＬＺ−ＬＣ挿入断片含有クローンとを識別するために、ＢａｍＨＩ制限酵素によっても消化された。ｐＢＳＫＩＩ／ＲＴＸ−ＬＣがベクター骨格として使用され、ＲＴＸ−ＬＣはＡＬＺ−ＬＣと同一サイズであるので、これは必須であった。制限酵素パターンは２本の軽鎖間で異なる。ＢａｍＨＩで消化するとｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＬＣクローンが単に線状化するのに対し、ｐＢＳＫＩＩ／ＲＴＸ−ＬＣクローンは７００ｂｐｓのフォールアウト断片を与える（図７）。クローン番号６、９、および１３は、ＲＴＸ−ＨＣクローンであった。

抗ＣＤ５２抗体の全長ＩｇＧ１重鎖の構築
抗ＣＤ５２抗体の可変重鎖を有するコンストラクトｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＶＨＣ、および抗ＣＤ２０抗体重鎖を有するコンストラクトｐＢＳＫＩＩ／ＲＴＸ−ＨＣクローンをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限酵素で消化した。前者からのサイズ４２６ｂｐｓの挿入断片、および後者からのベクター＋ＩｇＧ１定常領域をゲル精製した。ベクターおよび挿入断片をライゲーションして、全長抗ＣＤ５２抗体のＩｇＧ１重鎖を生じさせた。熱ショックコンピテントＤＨ１０細胞を形質転換して得られたコロニーをＬＢＡｍｐ培地に接種してＤＮＡのミニプレップを行い、制限消化によって、クローンを抗ＣＤ５２抗体の全長重鎖の存在についてチェックした（図８）。制限消化によって陽性が判明したクローンはまた、配列決定によっても確認された。

ｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＨＣクローンの部位特異的変異誘発
抗ＣＤ５２抗体重鎖断片の定常領域は、抗ＣＤ２０抗体重鎖断片とは定常領域の２つのヌクレオチドが異なる。配列検証後に抗ＣＤ２０抗体重鎖の定常領域でスプライシングした抗ＣＤ５２抗体の可変領域を含有するクローンに、部位特異的変異誘発を施した。

材料および方法：
酵素および試薬：
Ｐｆｕ高忠実度Ｔａｑポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））
ＤｐｎＩ制限酵素（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））
ＤＮＡテンプレート
ＰＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＨＣ−クローン（ａ）
プライマー

すべての合成オリゴヌクレオチドは、シグマ（ＳＩＧＭＡ）によって合成された。合成オリゴヌクレオチドは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）によってＨＰＬＣ上で２回精製され、アベスタゲン（Ａｖｅｓｔｈａｇｅｎ）に搬送された。下の表に列挙したオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応のために使用した。

突然変異ストランド合成反応（サーマルサイクリング）：
次の構成成分／試薬を下記に示す順序で無菌の０．２ｍｌＰＣＲ管に入れた。すべてのＰＣＲ反応の最終容積は５０μｌであった。

クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的変異誘発方法のための循環パラメーター：
ステップ１（１サイクル）９５℃／３０秒
ステップ２９５℃／３０秒
ステップ３５５℃／３０秒
ステップ４６８℃／７分
ステップ５ステップ２に戻り、ステップ２〜４を１６回繰り返す

増幅生成物のＤｐｎＩ消化：
１μｌのＤｐｎＩ（１０Ｕ／μｌ）を増幅反応に添加した。反応混合物を穏やかにかつ完全に混合して遠沈し、３７℃で１時間インキュベーションした。

ＤＨ１０ｂコンピテント細胞の形質転換：
製造業者（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））が推奨するようにして、形質転換を実施した。４μｌのＰＣＲ反応を形質転換のために使用した。

結果：
抗ＣＤ２０抗体重鎖（ＲＴＸ−ＨＣ）と部位特異的変異誘発を受けた抗ＣＤ５２抗体重鎖（ＡＬＺ−ＨＣ）クローンとの配列比較。ＣＡからＴＴへの変化は青色で強調表示される。

抗ＣＤ２０抗体重鎖（ＲＴＸ−ＨＣ）と部位特異的変異誘発を受けた抗ＣＤ５２抗体重鎖（ＡＬＺ−ＨＣ）クローンとの配列比較。図９に示される。

哺乳類発現ベクター中の抗ＣＤ５２抗体鎖のサブクローニング
全長抗ＣＤ５２抗体の軽鎖および重鎖を哺乳類発現ベクターｐＣＡＩＮおよびｐＣＡＩＤ中にそれぞれサブクローニングした。

ｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＬＣクローンおよびｐＣＡＩＮベクターをＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、得られたコンストラクトをｐＣＡＩＮ／ＡＬＺ−ＬＣと称する。前者からの挿入断片（７００ｂｐ）および後者からのベクター骨格をゲル精製してライゲーションした（図１０）。ライゲーション混合物を熱ショックコンピテントＤＨ１０ｂ細胞に形質転換して、選択用抗生物質としてアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種した。数個の形質転換体を選択し、ＤＮＡミニプレップを実施した。クローンを制限酵素消化によってチェックした（図１１）。

ｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＨＣ−ＳＤＭクローン（Ｉ．４）およびｐＣＡＩＤベクターをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。得られたコンストラクトをｐＣＡＩＤ／ＡＬＺ−ＨＣと称する。前者からの挿入断片（１４２９ｂｐ）および後者からのベクター骨格をゲル精製してライゲーションした（図１２）。ライゲーション混合物を熱ショックコンピテントＤＨ１０ｂ細胞に形質転換して、選択用抗生物質としてアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種した。数個の形質転換体を選択し、ＤＮＡミニプレップを実施した。クローンを制限酵素消化によってチェックした（図１３）。

ＤＮＡ配列決定および分析：
ｐＣＡＩＤおよびｐＣＡＩＮ哺乳類発現ベクター中にそれぞれクローニングしたＡＬＺ−ＨＣおよびＡＬＺ−ＬＣの最終クローンを配列決定して、それらの配列精度を確認した。配列分析の配列比較が示された。

ｐＣＡＩＤ／ＡＬＺ−ＨＣのクローンｂをＤＮＡヌクレオチド配列決定によって確認した。３つの異なるプライマー（ｃａｍｐ２４６、５２３、およびＣＨＣ８４５）を配列決定反応のため使用した。すべての配列はテンプレート配列（Ｃ２）に一致することが分かった。

６．抗ＣＤ５２抗体の精製：
抗ＣＤ５２抗体は細胞上清中に分泌されるヒト化抗体である。規制当局のガイドラインに従った汚染物質フリーの所望の組み換えタンパク質を過剰発現する細胞培養系の確立に引き続いて、抗ＣＤ５２抗体タンパク質の精製は、透析濾過とアフィニティークロマトグラフィーを含むカラムクロマトグラフィー手順とを伴う一連のステップを使用して実行できる。溶出した抗体を回収して、生体内活性を最大化する。

７．抗ＣＤ５２抗体の生体外活性および生体内活性のアッセイ：
下記を使用して抗ＣＤ５２抗体の生体外結合活性を検出するための生物検定を実行する。
●抗ＣＤ５２抗体ＥＬＩＳＡアッセイ
●Ｂ細胞リンパ性白血病細胞（Karpas ４２２細胞）の補体媒介溶解
●目下入手できるデータに基づいて、以前アルキル化剤で治療されてフルダラビン治療に失敗したＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）があるヒト患者において、抗ＣＤ５２抗体の生体内有効性試験を実施した。

精製手順の最適化：
上述の推奨される機能性／結合アッセイに従った再現可能な生物活性の確立に引き続いて、精製手順を最適化する努力がなされる。精製ストラテジーは、主要目的として、プロセス経済、製品を市場に出すまでの時間の短縮、拡張性(scalability)、再現性、ならびに機能安定性および構造完全性を有する生成物の最大純度を目指す。この趣旨で、濾過（通常濾過および接線流濾過）およびクロマトグラフィーの双方によるコンビナトリアルアプローチが探索される。工程適格要件および合格基準の研究は３つのバッチで行われる。

したがって本発明は、精製工程において以下のステップを想定する。
ａ．ＣＯＨＣ／Ａ１ＨＣ／０．４５μデプス型フィルターを使用した初期浄化。
ｂ．接線流濾過に基づくＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬＢｉｏｍａｘ５０ｋＤａカットオフフィルターを使用した濃縮。
ｃ．クロモステップ−Ｉ：血清ベース（２％ウシ胎仔血清［ＦＣＳ］）の培養上清のためのＰｒｏｓｅｐＶＡＵｌｔｒａ／および血清フリー培養上清のためのＰｒｏｓｅｐＶＡを使用したアフィニティークロマトグラフィー。
ｄ．クロモステップ−ＩＩ：ＳＰセファロースなどの強陽イオン交換体。
ｅ．クロモステップ−ＩＩＩ：宿主細胞タンパク質および核酸除去のためのセルファイン（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）Ｑ（セルロースベースの培地）などの通過ベースの(flow through based)強陰イオン交換体。
ｆ．サイズ排除濾過を使用したウイルス除去およびセルファイン（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）サルフェートを使用したプロテインＡ濾過(leached protein A)。
ｇ．無菌濾過。
ｈ．レムトックス（Ｒｅｍｔｏｘ）／セルファイン（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）ＥＴクロマトグラフィーのどちらかを使用した内毒素除去。
ｈ．配合。

図１は、抗ＣＤ５２抗体軽鎖をコードするＤＮＡヌクレオチド配列の非最適化およびコドン最適化バージョンのペアワイズ配列比較である。図２は、抗ＣＤ５２抗体重鎖をコードするＤＮＡヌクレオチド配列の非最適化およびコドン最適化バージョンのペアワイズ配列比較である。図３は、抗ＣＤ２０抗体（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）および抗ＣＤ５２抗体（Ｃａｍｐａｔｈ）の軽鎖定常領域の配列比較である。図４は、抗ＣＤ２０抗体（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）および抗ＣＤ５２抗体（Ｃａｍｐａｔｈ）の重鎖定常領域の配列比較である。図５は、ｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＶＬＣ（レーン３）およびｐＢＳＫＩＩ／ＲＴＸ−ＬＣ（レーン１）クローンのＢｇｌＩＩＢｓｉＷＩによる制限消化である。レーン２は１ｋｂのＤＮＡラダーである。図６は、挿入断片含有形質転換体を同定するためのｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＬＣクローンのＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩによる制限消化である。試験されたすべてのクローンでＡＬＺ−ＬＣ抗体断片のサイズに対応するフォールアウト断片が観察された。図７は、ＲＴＸ−ＬＣ含有クローンとＡＬＺ−ＬＣ挿入断片含有クローンとを識別するためのｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＬＣクローンのＢａｍＨＩによる制限消化である。図８は、挿入断片の存在を確認するためのｐＢＳＫＩＩ／ＡＬＺ−ＶＨＣの全長クローンの制限消化である。図９は、抗ＣＤ２０抗体重鎖（ＲＴＸ−ＨＣ）と部位特異的変異誘発を受けた抗ＣＤ５２抗体重鎖（ＡＬＺ−ＨＣ）クローンとの配列比較である。ＣＡからＴＴへの変更が青色で強調表示される。図１０は、ライゲーション反応のための制限消化されかつゲル精製されたＡＬＺ−ＬＣおよびｐＣＡＩＮである。図１１は、挿入断片含有形質転換体の同定のためのｐＣＡＩＮ／ＡＬＺ−ＬＣクローンのＢｇＨＩおよびＥｃｏＲＩによる制限消化である。試験されたすべてのクローンでＡＬＺ−ＬＣ抗体断片のサイズ（約７００ｂｐ）に対応するフォールアウト断片が観察された。図１２は、ライゲーション反応のための制限消化されかつゲル精製されたＡＬＺ−ＨＣおよびｐＣＡＩＤである。図１３は、挿入断片含有形質転換体の同定のためのｐＣＡＩＤ／ＡＬＺ−ＨＣクローンのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによる制限消化である。試験されたすべてのクローンでＡＬＺ−ＨＣ抗体断片のサイズ（約１４２０ｂｐ）に対応するフォールアウト断片が観察された。図１４は、ｐＣＡＩＤ／ＡＬＺ−ＨＣのクローンｂがＤＮＡヌクレオチド配列決定によって確認された。３つの異なるプライマー（ｃａｍｐ２４６、５２３、およびＣＨＣ８４５）が配列決定反応のために使用された。全配列はテンプレート配列（Ｃ２）に一致することが分かった。

Claims

抗ＣＤ５２モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖を新規合成するステップと、
抗ＣＤ５２抗体の全長κ軽鎖を構築するステップと、
抗ＣＤ５２抗体の全長ＩｇＧ１重鎖を構築するステップと、
抗ＣＤ５２分子の軽ポリペプチド鎖および重ポリペプチド鎖をコードする核酸配列を含むベクターを構築するステップと、
生物学的に活性な抗体分子の産生のために、哺乳類発現ベクター中に抗ＣＤ５２抗体鎖をサブクローニングするステップ
とを含む、生体内で生物学的に活性な抗ＣＤ５２モノクローナル抗体を調製する方法。
抗ＣＤ５２抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号１で記載される、請求項１に記載の方法。
抗ＣＤ５２抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号２で記載される、請求項１に記載の方法。
抗ＣＤ５２抗体軽鎖のアミノ酸配列が配列番号３で記載される、請求項１に記載の方法。
抗ＣＤ５２抗体重鎖のアミノ酸配列が配列番号４で記載される、請求項１に記載の方法。
抗ＣＤ５２重鎖をコードする核酸断片を含むベクターが部位特異的変異誘発を受ける、請求項１に記載の方法。
全長抗ＣＤ５２重鎖および軽鎖が哺乳類ベクターｐＣＡＩＮおよびｐＣＡＩＤにそれぞれサブクローニングされる、請求項１に記載の方法。
宿主細胞を図のベクターコンストラクトで形質転換するステップと、前記生成物を前記宿主細胞またはその増殖培地から単離するステップとを含む、生体内で生物学的に活性な抗ＣＤ５２モノクローナル抗体を調製する方法。
培養物中で増殖させた哺乳類細胞から精製された治療的に有効量の抗ＣＤ５２抗体、および薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントまたは担体を含む医薬組成物。