CN110655571B - 从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法及筛选试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药工程技术领域，公开了一种从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，包括A、单克隆噬菌体抗体培养，并取培养上清液；B、定性分析：将步骤A中的培养上清液置于96孔板中，依次经DMEM培养基以及中和用病毒中和、BSR细胞悬液培养、预冷丙酮固定后，与稀释后的FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体共孵育，选择可明显抑制病毒感染的克隆测序，排除重复的序列，初步获得中和活性各不相同的抗狂犬病病毒抗体序列；C、定量分析：挑选不同序列有中和活性的各个克隆，重新制备噬菌体抗体颗粒，纯化并稀释一定倍数后采用RFFIT法测定体外中和活性；以及D、全分子抗体瞬时表达和活性分析。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法及抗体筛选试剂盒。
背景技术
狂犬病是一种严重的致死性疾病，人和所有温血动物均易感染。狂犬病属弹状病毒科，主要分为7个基因型。狂犬病病毒为RNA病毒，其编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、依赖RNA的RNA多聚酶(L)和糖蛋白(G)五种结构蛋白，其中糖蛋白(Glycoprotein，G)为跨膜蛋白，构成病毒表面的突起，是主要保护性抗原，可以诱导保护性抗体产生。糖蛋白主要由3个主要抗原表位及其他次要表位组成，表位I位于AA226-331，是一个线性表位；表位II是由AA34-42和AA198-200组成的一个构象表位；表位III是由AA330-338构成的构象表位；G5表位是一个线性表位，由AA261-264组成；G1表位由AA341-343构成。
狂犬病目前仍然缺乏有效的治疗手段，一旦发病几乎100％死亡，对狂犬病的预防主要使用狂犬病病毒疫苗进行，由于疫苗接种到产生抗体需要一定时间，因此，对于III级以上暴露必须同时使用抗狂犬病病毒免疫球蛋白。目前市场上的抗狂犬病病毒免疫球蛋白均存在一定问题或限制，如由于血源来源问题而无法大量生产、潜在的疾病传播风险或血清病等。抗狂犬病病毒单克隆抗体克服了上述产品的缺点，是非常有希望的升级替换产品。噬菌体抗体库技术是获得抗体序列的主要技术之一，广泛应用于抗体的筛选。
噬菌体抗体库的初步筛选通常使用ELISA法进行，首先筛选与抗原结合的阳性克隆并对阳性克隆测序分析，然后构建原核表达质粒，大肠杆菌表达scFv后进行活性验证，最后构建全分子抗体进行性质分析，该种筛选方法缺点明显如下：
首先，该方法只能评价抗体与抗原的结合活性而无法评价抗体的中和活性，因此阳性克隆中中和抗体所占比例较低，大部分为不具备中和活性。如de KruifJ等使用灭活病毒或重组糖蛋白从人特免库中筛选获得147个序列中，仅39个有活性，其中21个构建为ScFv表达，14个活性大于500IU/mg(de Kruif J,Bakker A B,Marissen W E,et al.A humanmonoclonal antibody cocktail as a novel component of rabies postexposureprophylaxis[J].Annu Rev Med,2007,58:359-368.)，考虑到抗体scFv形式的比活通常高于其全分子形式，因此14个抗体只有部分表达为全分子抗体后活性可以达到500IU/mg。SunL等在另一个实验中，使用aG株病毒为抗原对1000个克隆进行ELISA分析，其中260个克隆为阳性，免疫荧光分析表明其中70个与表达aG株糖蛋白的293T细胞结合，序列分析表明其中11个为独特序列，RFFTI分析确定其中5个具有中和活性，3个体外抗狂犬病病毒中和活性大于500IU/mg(Sun L,Chen Z,Yu L,et al.Generation and characterization ofneutralizing human recombinant antibodies against antigenic site II of rabiesvirus glycoprotein[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,96(2):357-366)。
其次，传统筛选方式中ELISA有三种抗原可以选择，即灭活的病毒颗粒、原核表达的糖蛋白和真核表达的糖蛋白。其中灭活的病毒颗粒可以获得针对全部中和表位的中和抗体；但由于具有中和表位的糖蛋白只占其中一小部分，因此筛选获得的抗体大部分不针对中和表位；原核表达的糖蛋白则由于缺乏糖基化修饰，影响空间构象的形成，可能无法获得针对构象表位的中和抗体，同时也存在大量针对非中和表位的抗体；真核表达的糖蛋白可以筛选到针对全部中和表位的抗体，但仍然存在大量与糖蛋白非中和表位结合的抗体，中和抗体所占比例仍然很低；同时，狂犬病病毒糖蛋白真核表达纯化比较困难，很多实验室并不具备相关技术能力。
另外，传统筛选方法面临的另一个困难时如何对筛选获得的抗体进行初步活性验证，由于筛选获得的抗体中具备中和活性的序列所占比例较低，因此通常需要对数百个序列进行验证，以获得较高体外中和活性的抗体。该验证一般是调取ScFv序列并在大肠杆菌中表达、纯化后进行体外抗狂犬病病毒中和活性分析。由于部分蛋白在大肠杆菌表达为包涵体形式，而包涵体复性较为困难，因此通常的策略是将以包涵体形式表达的抗体序列废弃，这可能导致部分高中和活性的抗体在此步骤中被剔除；同时，由于序列众多，该验证过程需要投入大量资源、时间进行。
因此，传统的噬菌体抗体库的初步筛选方法筛选效率低，投入大，每一步都只有少量抗体能够进入一下步分析，且存在因为scFv不能成功表达或产生沉淀丢失很多阳性克隆，而且最后得到的全分子抗体中和活性难以保证，急需另辟蹊径探求一种高效地抗狂犬病病毒中和抗体筛选方法。
发明内容
本发明的目的在于，依托上述研究背景，克服从噬菌体抗体库中应用传统ELISA法筛选存在的缺点，另辟蹊径提供了一种新的从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，以及根据该方法制备的抗狂犬病病毒中和抗体筛选试剂盒。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法。
该筛选和验证方法摒弃了现有ELISA筛选方法中的思路，在噬菌体抗体颗粒水平上使用免疫荧光灶法(RFFIT)通过定性分析和定量分析两部直接进行抗体筛选和功能验证，实现了抗体筛选验证的高通量，主体思路如下：
1)定性分析：以抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库进行系列稀释后涂板，从中挑选单克隆于96孔板中培养，制备相应单克隆的噬菌体抗体颗粒；取噬菌体抗体颗粒15倍稀释后进行荧光灶抑制试验(RFFIT)，选择可明显抑制病毒感染的克隆测序，排除重复的序列，初步获得具有中和活性各不相同的抗体序列。2)定量分析：挑选不同序列有中和活性的各个克隆，重新制备噬菌体抗体颗粒，纯化后进行RFFIT分析；选择噬菌体抗体颗粒比活大于0.5IU/ml的克隆，扩增抗体可变区基因，构建真核瞬时表达质粒，瞬转HEK293EBNA1细胞，培养上清经Mabselect SuRe亲和纯化后测定抗体比活。
具体筛选步骤如下：
A、单克隆噬菌体抗体培养，并取培养上清液；
B、定性分析：RFFIT法初步筛选有中和活性的抗体
将步骤A中的培养上清液置于96孔板中，依次经DMEM培养基以及中和用病毒中和、BSR细胞悬液培养、预冷丙酮固定后，与稀释后的FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体共孵育，选择可明显抑制病毒感染的克隆测序，排除重复的序列，初步获得中和活性各不相同的抗狂犬病病毒抗体序列；
C、定量分析：单克隆噬菌体抗体颗粒活性测定
挑选不同序列有中和活性的各个克隆，重新制备噬菌体抗体颗粒，纯化并稀释一定倍数后采用RFFIT法测定体外中和活性；
D、全分子抗体瞬时表达和活性分析
选择噬菌体抗体颗粒活性大于0.5IU/ml的克隆，扩增抗体可变区基因，构建真核瞬时表达质粒，瞬转HEK 293EBNA1细胞，培养上清经Mabselect SuRe亲和纯化后测定抗狂犬病病毒抗体比活，得到抗狂犬病病毒中和抗体。
优选的，步骤A中进行单克隆噬菌体抗体培养，并取培养上清液的具体制备方法如下：将经过三轮筛选后的噬菌体抗体加入E.coli TG1菌液中混匀，室温静置感染30～40min；菌液涂布于2YT-A平板、30℃过夜培养后，挑取克隆至含2YT-A的96孔板中过夜培养；而后培养物在新鲜2YT-A培养基中220rpm，37℃培养1.5h，然后加入MK1307辅助噬菌体，混匀，室温静置感染30～40min，离心后重悬细胞于2YT-A/K培养基中，培养过夜后离心收集含有单克隆噬菌体抗体颗粒的上清液。
优选的，步骤B中，RFFIT法初步筛选单克隆噬菌体抗体颗粒的具体方法如下：
取上述上清液置于96孔板中，每孔加入14～15倍体积DMEM培养基和15～16倍体积稀释好的中和用病毒，37℃中和1h后，加入15～16倍体积、1.0×106个/mL的BSR细胞悬液，5％CO2，37℃培养24h后弃去上清，PBS清洗细胞并用60～70倍体积的80％预冷丙酮固定，而后弃去丙酮，室温静置15min；
FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，加入每孔中，37℃孵育1h，弃去液体，使用PBS洗涤，荧光显微镜下观察和记录各孔感染比例，对病毒生长有明显抑制的孔被标记为阳性孔；
从阳性孔对应的96孔板中取菌液，加入2YT-A培养基，37℃、220rpm过夜培养后测序，选取正确的scFv序列并选取序列不重复的克隆进入步骤C。噬菌体抗体的测序引物序列为CGAAGGAGACAGTCATAATG(SEQ NO.1)所示。
优选的，步骤C的具体步骤如下：
挑选不同序列有中和活性的各个克隆，按照步骤A进行单克隆噬菌体抗体培养，并取培养上清液；在获得的上清液中加入1/5体积的20％PEG-8000+2.5mol/LNaCl溶液，混匀，静止冰浴中1h，10000g离心20min，沉淀即为噬菌体抗体颗粒，
将获得的噬菌体抗体颗粒15倍稀释后，分别加入96孔细胞培养板中，每孔加入同等体积中和用病毒，37℃中和1h后，加入同等体积的1.0×106个/mL的BSR细胞悬液，5％CO2，37℃培养24h就，弃去上清；PBS清洗细胞后，加入四倍体积预冷的80％丙酮-30℃固定10min，而后弃去丙酮，室温静置15min；FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，每孔加入两倍体积，37℃孵育1h后弃去液体，而后使用PBS洗涤；荧光显微镜下观察和记录各孔感染比例并按狂犬病免疫球蛋白效价测定法中公式计算抗体活性。
优选的，在计算抗体活性时，若某个样品中作为最高浓度孔的150倍稀释孔中被感染细胞数超过50％，则认为该样品不具有明显的抗狂犬病病毒中和活性，其噬菌体抗体活性结果被记为0IU/mL。
优选的，步骤D中，构建真核瞬时表达质粒的方法如下：比对抗体可变区序列，确定抗体亚型；分别使用对应的κ、λ轻链载体构建对应轻链表达质粒，所有序列均使用相同的重链载体构建各自的重链表达质粒；使用SEQ NO.2～7所示的瞬时表达引物从具有中和活性的噬菌体颗粒对应的克隆中扩增抗体轻、重链可变区，然后将PCR产物构建入质粒中，挑取克隆测序鉴定，选择测序结果符合预期的克隆并抽提质粒。
| 引物类型 | 引物5’端酶切位点 | 序号 |
| κ轻链上游 | GGTCTCAGTGC+18～22 | SEQNO.2 |
| κ轻链下游 | GGTCTCATTCG | SEQNO.3 |
| λ轻链上游 | GGTCTCAGGCC | SEQNO.4 |
| λ轻链下游 | GGTCTCAGACC | SEQNO.5 |
| 重链上游 | GGTCTCAGTGT | SEQNO.6 |
| 重链下游 | GGTCTCACACT | SEQNO.7 |
在本发明中的筛选方法中，定性分析获得的噬菌体抗体颗粒(包含定性分析中低活性序列)与全分子抗体体外中和活性显著相关；剔除低活性序列后，活性高于0.5IU/ml的噬菌体抗体颗粒与其全分子抗体体外中和活性之间无显著相关；所有纯化后噬菌体抗体颗粒活性大于0.5IU/ml的序列其全分子抗体体外中和活性均大于500IU/ml。
本发明的第二方面提供了一种从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的试剂盒，包括单克隆噬菌体抗体颗粒制备系统；RFFIT法测定抗体体外中和活性系统；瞬时表达质粒构建提取系统；以及全分子抗体瞬时表达和纯化系统。
本发明的有益保障及效果：
本发明的抗狂犬病病毒中和抗体筛选方法无需抗体ScFv原核表达，使用噬菌体即可即筛选获得具有高体外抗狂犬病病毒中和活性的抗体，获得的抗体在全分子抗体水平具有非常高的体外抗狂犬病病毒活性，满足抗狂犬病病毒单克隆抗体对抗体活性的要求。
与传统抗狂犬病病毒噬菌体抗体库筛选技术相比，本发明在初步定性筛选中使用可以直接检测抗狂犬病病毒中和活性的方法替代ELISA法，大大提高了快速获得中和抗体的效率；同时定量分析中使用噬菌体抗体颗粒替代scFv进行抗体的体外中和活性分析，省却了原核构建、表达的过程，不会因为蛋白表达问题造成遗漏抗体现象，且该方法分析结果与全分子抗体活性具有较大相关性，可以预测序列构建为全分子抗体后活性。
此外，传统方法获得的阳性克隆大部分为非中和活性抗体，需要经过原核表达进一步进行活性分析，后续步骤操作繁杂、花费时间长，且部分抗体为非可溶表达，影响了抗体序列的全面评价，本发明克服了从噬菌体抗体库中应用传统ELISA法筛选存在的缺点。
综上，本发明建立的人抗狂犬病病毒噬菌体抗体库的筛选方法，克服了传统筛选方法中的诸多问题，其优点在于：1.使用灭活全病毒颗粒在噬菌体抗体库中进一步筛选即可获得中和抗体，抗原易于制备；2.初步定量筛选使用RFFIT法，排除了非中和抗体，获得的克隆均具备中和活性，大大提高了筛选效率，减少了后期验证工作；3.抗体在噬菌体水平活性与全分子水平活性正相关，在早期即可排除低中和活性的抗体。筛选获得的阳性克隆表达为全分子抗体形式后，比活均大于500IU/ml，满足抗狂犬病病毒单克隆抗体对活性的要求；4.简化筛选流程，无需原核表达ScFv进行活性验证，简化了筛选流程。5.避免了ScFv表达中存在无法表达、非可溶性表达等问题。
附图说明
图1为本发明与传统噬菌体抗体库中筛选抗狂犬病病毒中和抗体流程对比图。
具体实施方式
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
一、材料与方法
1.1细胞、病毒和噬菌体抗体库
幼仓鼠肾细胞(baby hamster kidney,BSR)及狂犬病病毒标准攻击毒株(challenge virus standard,CVS)均来自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所；pGP5-con瞬时表达载体购自杭州天演生物有限责任公司；HEK-293EBNA1购自北京协和细胞资源中心；经筛选的狂犬病病毒噬菌体库由兰州生物制品研究所第四研究室提供，该库使用纯化、灭活的CVS-11作为抗原，三轮筛选后获得。
1.2主要试剂及设备
引物委托由上海生工生物工程有限公司合成；Vent DNA聚合酶购自NEB公司；限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自Promega公司；质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司；聚醚酰亚胺(Polyetherimide,PEI)和辣根过氧化物酶标记的抗兔抗人Fc抗体购自Sigma公司；人抗狂犬病病毒免疫球蛋白国家标准品购自中国食品药品检定研究院；异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体购自北京康思尔泰医学研究中心；DMEM、FreeStyle F17和新生牛血清均购自Thermo公司；辅助噬菌体M13K07由兰州生物制品研究所有限责任公司提供；Mabselect SuRe亲和纯化介质均购自GE公司产品。荧光显微镜购自奥林巴斯IX71；毛细管电泳仪及PA 800plus SDS-MW analysis kit试剂盒购自贝克曼公司；高效液相色谱仪购自沃特世公司；ImageQuant凝胶成像系统购自GE公司。
1.3引物序列
噬菌体测序引物序列为CGA AGGAGACAGTCATAATG(SEQ NO.1)。瞬时表达抗体可变区引物依据测序结果确定，从可变区序列上游第一个碱基或下游最后一个碱基开始，截取约18～22个核苷酸，使Tm值在58～62℃，按表1规则在引物两端增加酶切位点。
表1扩增抗体可变区引物5’端增加碱基序列
| 引物类型 | 引物5’端酶切位点 | 序号 |
| κ轻链上游 | GGTCTCAGTGC+18～22 | SEQNO.2 |
| κ轻链下游 | GGTCTCATTCG | SEQNO.3 |
| λ轻链上游 | GGTCTCAGGCC | SEQNO.4 |
| λ轻链下游 | GGTCTCAGACC | SEQNO.5 |
| 重链上游 | GGTCTCAGTGT | SEQNO.6 |
| 重链下游 | GGTCTCACACT | SEQNO.7 |
1.4抗狂犬病病毒体外活性分析
1.4.1中和用病毒稀释度测定
待检测狂犬病病毒CVS-11使用含10％小牛血清的DMEM培养基3倍连续稀释，取50μL稀释后病毒加入96孔板中，每个稀释度2孔作为平行，加入1.0×106个/mL的BSR细胞悬液50μL，而后每个检测孔中补充50μL培养基，5％CO2，37℃培养24h，离心弃去上清；PBS清洗细胞1次，加入200μL预冷的80％丙酮固定10min，弃去丙酮，室温静置15min。FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育1h，弃去液体，使用PBS洗涤3次。荧光显微镜下观察不同稀释度细胞感染比例。
以80％～95％细胞被病毒感染的病毒稀释度为中和用病毒稀释度。
1.4.2 RFFIT法测定体外中和活性
将待测样品、狂犬病人免疫球蛋白国家标准品从10倍开始进行1:3倍比稀释，共8个稀释度，使用培养基作为阴性对照。待检测样品、标准品和阴性对照各取50μL加入96孔细胞培养板中，每孔加入50μL中和用病毒，37℃中和1h后，加入1.0×106个/mL的BSR细胞悬液50μL，5％CO2，37℃培养24h。离心弃去上清，并用PBS清洗细胞1次，加入200μL预冷的80％丙酮-30℃固定10min，弃去丙酮，室温静置15min。
FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育1h，弃去液体，使用PBS洗涤3次。荧光显微镜下观察和记录各孔感染比例。按2015年版《中华人民共和国药典》(三部)中狂犬病免疫球蛋白效价测定法中公式计算抗体活性。
二、抗狂犬病病毒中和抗体筛选和验证
图1显示了本发明与传统筛选方法的流程，两种筛选方法在前期噬菌体抗体培养以及后期的抗体性质验证存在重叠，区别集中在中和抗体的筛选步骤中，本发明采用了完全不同的一种方法。
2.1定性分析：RFFIT法分析初步筛选单克隆噬菌体抗体颗粒
2.1.1单克隆噬菌体抗体培养
取100μL经过三轮筛选后的噬菌体，加入1ml E.coli TG1菌液中(OD600＝0.5～0.7)，混匀，室温静止感染30min。将菌液涂布于4个150mm 2YT-A平板，30℃过夜。挑选克隆进行培养，每个克隆加入含100μL 2YT-A的96孔板中，37℃，220rpm过夜培养。取10μL培养物与加入140μL新鲜2YT-A培养基中，220rpm，37℃培养1.5h，加入15μL MK1307辅助噬菌体，混匀，室温静置感染30min。4℃，4000g离心10min，重悬细胞于150μL的2YT-A/K培养基中，30℃220rpm培养过夜；4℃，4000g离心20min，收集上清。
2.1.2 RFFIT法分析单克隆噬菌体抗体颗粒
取3.3μL培养上清，加入46.7μL DMEM培养基和稀释好的中和用病毒50μL，37℃中和1h后，加入1.0×106个/mL的BSR细胞悬液50μL，5％CO2，37℃培养24h，离心弃去上清。PBS清洗细胞1次，加入200μL预冷的80％丙酮固定10min；弃去丙酮，室温静置15min。
FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育1h，弃去液体，使用PBS洗涤3次。荧光显微镜下观察和记录各孔感染比例，对病毒生长有明显抑制的孔标记为阳性孔。
从阳性孔对应的96孔板中取菌液50μL，加入1ml 2YT-A培养基，37℃，220rpm过夜培养。取300μL菌液，加入300μL高压灭菌的甘油，-70℃保存；另取300μL菌液送测序。测序结果使用Vbase2在线比对，确定是否为正确的scFv序列；正确的序列使用DNASTAR 7.1进行比对，选择序列不重复的克隆进入下一步试验。
2.2定量分析：单克隆噬菌体抗体颗粒的纯化和活性测定
取保存的菌液15μL加入到1.5mL 2YT-A G培养基中，按2.1.1进行噬菌体抗体培养。在获得的上清中加入1/5体积的20％PEG-8000+2.5mol/L NaCl溶液，混匀，静止冰浴中1h，10000g离心20min，沉淀即为噬菌体抗体颗粒。1.0ml PBS-1％BSA重悬沉淀，12000rpm离心5min，弃掉沉淀，-70℃冻存。
获得的噬菌体抗体颗粒15倍稀释后按1.4.2项测定体外中和活性。如果某个样品的最高浓度孔中被感染细胞数超过50％，则认为该样品不具有明显的抗狂犬病病毒中和活性，其噬菌体抗体活性结果被记为0IU/ml。
2.3全分子抗体瞬时表达和活性分析
2.3.1瞬时表达质粒构建和提取
使用vbase2比对抗体可变区序列，确定抗体亚型。分别使用表1中对应的κ、λ轻链载体构建对应轻链表达质粒；所有序列使用相同的重链载体构建各自的重链表达质粒。使用瞬时表达引物从具有中和活性的噬菌体颗粒对应的克隆中扩增抗体轻、重链可变区。使用BSAI酶切PCR产物和质粒，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收，酶切后抗体轻、重链片段大小约350bp。回收产物与酶切后的抗体轻、重链载体使用BsaI酶按照产品说明书酶切后，T4 DNA连接酶按说明书过夜连接，采用10μl连接体系，含T4 DNA连接酶0.1μl，缓冲液1μL，转染大肠杆菌Top10，涂布含卡那霉素的LB琼脂平板，挑取克隆测序鉴定。选择测序结果符合预期的克隆，扩增培养后使用PlasmidMaxi Kit按说明书抽提质粒。
2.3.2全分子抗体瞬时表达、纯化和活性测定
HEK 293EBNA1细胞使用培养基稀释至1.0×106个/mL。取轻链质粒0.4μg、重链质粒0.2μg，加入100μL培养基中，混匀后加入2.37μg PEI，混匀，室温静置15min，加入1ml稀释好的细胞中，5％CO2，37℃，220r/min培养120h；而后10000g离心10min，取上清，使用Mabselect SuRe介质纯化表达的抗体；使用PBS溶液洗杂后，用pH 3.5的乙酸钠溶液洗脱，获得纯化的抗狂犬病病毒全分子单克隆抗体。纯化的抗体使用GE NanoVue微量分光光度计测定蛋白质浓度。
纯化后抗体使用细胞培养基150倍稀释后按1.4.2项测定体外中和活性。如果某个样品的最高浓度孔(150倍稀释孔)中被感染细胞数超过50％，则认为该样品不具有明显的抗狂犬病病毒中和活性，其体外抗狂犬病病毒中和活性结果被记为0IU/ml。
2.4噬菌体抗体颗粒RFFIT结果与瞬时表达全分子抗体体外中和活性的相关性分析
噬菌体抗体活性和瞬时表达全分子抗体活性之间的相关性使用SPSS软件进行分析，分析方法为双变量相关分析，单侧显著性水平α＝0.05；同时，对噬菌体抗体颗粒活性为“0”的数据剔除后分析剩余样品二者之间的相关性，分析方法为双变量相关分析，单侧显著性水平α＝0.05。
3结果
3.1定性分析---单克隆噬菌体抗体颗粒RFFIT初步筛选
本发明初步筛选了约564个克隆，其中阳性克隆180个，测序结果表明所有阳性克隆均为正确的抗体可变区序列，序列比对结果表明获得35个不同的抗体可变区序列，结果汇总如表2所示：
表2阳性克隆测序结果
| 验证克隆数 | 阳性克隆数 | 正确的scFv数 | 正确率 | 不同可变区克隆数 |
| 564 | 180 | 180 | 100％ | 35 |
3.2定量分析：单克隆噬菌体抗体颗粒制备、纯化和活性测定
每个不同可变区序列挑取一个克隆制备噬菌体抗体颗粒，并测定其滴度和体外抗狂犬病病毒活性，结果见表3。
表3噬菌体抗体活性汇总
*：活性0IU/ml代表15倍稀释的噬菌体在RFFIT试验中未表现对等体积80％细胞被感染剂量的狂犬病病毒CVS-11的明显抑制。
3.3全分子抗体瞬时表达和活性测定
3.3.1全分子抗体的表达和纯化
从噬菌体抗体颗粒RFFIT阳性结果的克隆中调取抗体轻重链可变区序列，构建真核顺势表达质粒，共计构建35对质粒。
3.3.2全分子抗体体外中和活性的测定
全分子抗体纯化后体外抗狂犬病病毒活性检测结果见表4。
表4抗狂犬病病毒全分子抗体比活
*：活性0IU/mg代表150倍稀释的抗体在RFFIT试验中未表现对等体积80％细胞被感染剂量狂犬病病毒CVS-11的明显抑制。
3.4噬菌体抗体RFFIT结果与全分子抗体体外中和活性的相关性
双变量相关分析表明，噬菌体活性与全分子抗体比活二者在单侧α＝0.05水平显著相关，sig＝0.339，p＝0.025；剔除噬菌体活性为零的数据后进行双变量相关分析，二者在单侧α＝0.05水平不具有显著相关性，sig＝0.083，p＝0.361。
通过上述方法和结果可知，本实施例方法对约564个克隆进行筛选，其中180个为阳性克隆，获得35个独特序列，其中22个序列在全分子抗体形式下中和活性大于500IU/mg，本方法在中和抗体筛选上具有明显优势。
定性分析获得的噬菌体抗体颗粒(包含定性分析中低活性序列)与全分子抗体体外中和活性显著相关；剔除低活性序列后，活性高于0.5IU/ml的噬菌体抗体颗粒与其全分子抗体体外中和活性之间无显著相关；所有纯化后噬菌体抗体颗粒活性大于0.5IU/ml的序列其全分子抗体体外中和活性均大于500IU/ml。因此，本发明构建的从抗狂犬病病毒噬菌体库中筛选验证中和抗体的方法，无需针对每个序列进行抗体的原核表达和验证即可获得具有中和活性的抗狂犬病病毒抗体，实现了高通量。
此外，通过对噬菌体抗体颗粒活性和全分子抗体活性的分析，确定二者具有显著相关关系。对噬菌体抗体活性为阳性的样品进行分析表明，抗体在噬菌体水平的活性与其全分子水平活性并不具有相关关系，因此，本发明的方法只适用于对噬菌体抗体库的前期筛选和初步活性验证，用于剔除非中和抗体和低中和活性的抗体。在噬菌体水平活性被标记为“－”的抗体共有13个，其中9个构建为全分子抗体后中和活性仍然未被检测到，3个具有较低体外抗狂犬病病毒活性，分别为57、12及18IU/ml；在噬菌体水平上有22个活性大于0.5IU/ml的抗体在构建为全分子抗体后中均表现出了较高的体外抗狂犬病病毒活性(>500IU/mg)。
综上，本发明描述了一种在噬菌体抗体库中筛选抗狂犬病病毒中和抗体的方法，该方法无需抗体ScFv原核表达，使用噬菌体即可即筛选获得具有高体外抗狂犬病病毒中和活性的抗体，获得的抗体在全分子抗体水平具有非常高的体外抗狂犬病病毒活性，满足抗狂犬病病毒单克隆抗体对抗体活性的要求。
根据图1，与传统抗狂犬病病毒噬菌体抗体库筛选技术相比，本方法在初步定性筛选中使用可以直接检测抗狂犬病病毒中和活性的方法替代ELISA法，大大提高了快速获得中和抗体的效率；同时定量分析中使用噬菌体抗体颗粒替代scFv进行抗体的体外中和活性分析，省却了原核构建、表达的过程，不会因为蛋白表达问题造成遗漏抗体现象，且该方法分析结果与全分子抗体活性具有较大相关性，可以预测序列构建为全分子抗体后活性。
序列表
<110> 兰州生物制品研究所有限责任公司
<120> 从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法及筛选试剂盒
<130> 说明书
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
cgaaggagac agtcataatg 20
<210> 2
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ggtctcagtg c 11
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggtctcattc g 11
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ggtctcaggc c 11
<210> 5
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ggtctcagac c 11
<210> 6
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ggtctcagtg t 11
<210> 7
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ggtctcacac t 11
Claims (5)
1.一种从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、单克隆噬菌体抗体培养，并取培养上清液；
B、定性分析：RFFIT法初步筛选有中和活性的抗体
将步骤A中的培养上清液置于96孔板中，每孔加入14~15倍体积DMEM培养基和15~16倍体积稀释好的中和用病毒，37℃中和1h后，加入15~16倍体积、1.0×106个/mL的BSR细胞悬液，5% CO2，37 ℃培养24 h后弃去上清，PBS清洗细胞并用60~70倍体积的80%预冷丙酮固定，而后弃去丙酮，室温静置15 min，
FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，加入每孔中，37 ℃孵育1h，弃去液体，使用PBS洗涤，荧光显微镜下观察和记录各孔感染比例，对病毒生长有明显抑制的孔被标记为阳性孔，
从阳性孔对应的96孔板中取菌液，加入2YT-A培养基，37℃、220rpm过夜培养后测序，选取正确的scFv序列并选取序列不重复的克隆进入步骤C；
C、定量分析：单克隆噬菌体抗体颗粒活性测定
挑选不同序列有中和活性的各个克隆，按照步骤A进行单克隆噬菌体抗体培养，并取培养上清液；在获得的上清液中加入1/5体积的20% PEG-8000 + 2.5mol/L NaCl溶液，混匀，静置冰浴中1h，10000g离心20min，沉淀即为噬菌体抗体颗粒，
将获得的噬菌体抗体颗粒15倍稀释后，分别加入96孔细胞培养板中，每孔加入同等体积中和用病毒，37 ℃中和1 h后，加入同等体积的1.0×106个/mL的BSR细胞悬液，5% CO2，37℃培养24 h后，弃去上清；PBS清洗细胞后，加入四倍体积预冷的80%丙酮，30℃固定10 min，而后弃去丙酮，室温静置15 min；FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，每孔加入两倍体积，37 ℃孵育1 h后弃去液体，而后使用PBS洗涤；荧光显微镜下观察和记录各孔感染比例并按狂犬病免疫球蛋白效价测定法中公式计算抗体活性；
D、全分子抗体瞬时表达和活性分析
选择噬菌体抗体颗粒活性大于0.5IU/ml的克隆，扩增抗体可变区基因，构建真核瞬时表达质粒，瞬转HEK 293EBNA1细胞，培养上清经Mabselect SuRe亲和纯化后测定抗狂犬病病毒抗体比活，得到抗狂犬病病毒中和抗体。
2.根据权利要求1所述的从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，其特征在于：
其中，步骤A中进行单克隆噬菌体抗体培养，并取培养上清液的具体制备方法如下：
将经过三轮筛选后的噬菌体抗体加入E.coli TG1菌液中混匀，室温静置感染30~40min；菌液涂布于2YT-A平板、30℃过夜培养后，挑取克隆至含2YT-A的96孔板中过夜培养；而后培养物在新鲜2YT-A培养基中220rpm，37℃培养1.5h，然后加入MK1307辅助噬菌体，混匀，室温静置感染30~40min，离心后重悬细胞于2YT-A/K培养基中，培养过夜后离心收集含有单克隆噬菌体抗体颗粒的上清液。
3.根据权利要求1所述的从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，其特征在于：
其中，噬菌体抗体的测序引物序列如SEQ NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，其特征在于：
其中，在计算抗体活性时，若某个样品中作为最高浓度孔的150倍稀释孔中被感染细胞数超过50%，则认为该样品不具有明显的抗狂犬病病毒中和活性，其噬菌体抗体活性结果被记为0IU/mL。
5.根据权利要求1所述的从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，其特征在于：
步骤D中，构建真核瞬时表达质粒的方法如下：
比对抗体可变区序列，确定抗体亚型；分别使用对应的κ、λ轻链载体构建对应轻链表达质粒，所有序列均使用相同的重链载体构建各自的重链表达质粒；使用SEQ NO.2~7所示的瞬时表达引物从具有中和活性的噬菌体颗粒对应的克隆中扩增抗体轻、重链可变区，然后将PCR产物构建入质粒中，挑取克隆测序鉴定，选择测序结果符合预期的克隆并抽提质粒。
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| CN103954777A (zh) * | 2014-05-20 | 2014-07-30 | 北京凯思百奥科技发展有限公司 | 一种狂犬病病毒单克隆抗体及其应用 |
| CN104193823A (zh) * | 2014-08-22 | 2014-12-10 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗狂犬病病毒特异性人源抗体及应用 |
-
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- 2019-09-26 CN CN201910916834.XA patent/CN110655571B/zh active Active
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| WO2012054502A1 (en) * | 2010-10-19 | 2012-04-26 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Identification of antibodies specific for lyssaviruses and methods of their use |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证;房世娣等;《微生物学免疫学进展》;20190710;第47卷(第4期);摘要，正文第8页右栏第7段-第9页右栏第1段 * |
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